BRPI0513078B1 - ANTICORPO IgG QUE SE LIGA A IL-17 HUMANA E COMPOSIÇÃO LÍQUIDA - Google Patents

ANTICORPO IgG QUE SE LIGA A IL-17 HUMANA E COMPOSIÇÃO LÍQUIDA Download PDF

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Abstract

anticorpos antagonísticos de il-17. a presente invenção refere-se a uma molécula de ligação de il-17, em particular um anticorpo para il-17 humana, mais preferivelmente um anticorpo humano para il-17 humana é fornecida, em que as regiões hiper-variáveis das cadeias pesadas e leves têm seqüências de aminoácido como definido, para o uso no tratamento de uma doença ou distúrbio mediados por il-17, por exemplo, artrite reumatóide.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO IgG QUE SE LIGA A IL-17 HUMANA E COMPOSIÇÃO LÍQUIDA.
[001] A presente invenção se refere a uma molécula de ligação de IL-17, em particular um anticorpo para IL-17 humana, mais preferivelmente um anticorpo humano para IL-17 humana (também chamado IL-17A) e ao uso de tais anticorpos no tratamento de doenças e distúrbios mediados por IL-17.
[002] A IL-17, uma citocina derivada de célula T presente por exemplo, em artrite reumatóide (RA), age como uma citocina próinflamatória, particularmente em combinação com IL-1 e TNF-α (Chabaud M & Miossec P (1999) Arthritis Rheum 42, 963-970; Awane M et al (1999) J. Immunol 162, 5337-5344). A IL-17 induz a produção de MMP e infrarregula TIMP (Jovanovic DV et al (2001) J. Rheumatol. 28, 712-718), e o bloqueio de IL-1 e IL-17 tem um efeito sinergístico na inflamação e destruição óssea in vivo (Chabaud M & Miossec (2001) Arthritis Rheum 44, 1293-1303). A produção inapropriada ou excessiva de IL-17 está associada com a patologia de várias doenças e distúrbios, tais como artrite reumatóide (Witowski et al., 2004 Cell Mol Life Sci 61:567-579), osteoartrite, afrouxamento de implantes ósseos, rejeição aguda a transplante (Antonysamy et al., 1999, J Immunol 162, 577-584; van Kooten et al., 1998, J Am Soc Nephrol 9, 1526-1534), septicemia, choque séptico ou endotóxico, alergias, asma (Molet et al., 2001, J Allergy Clin Immunol 108, 430-438), perda óssea, psoríase (Teunissen et al., 1998, J Invest Dermatol 111, 645-649), isquemia, esclerose sistêmica (Kurasawa et al., 2000, Arthritis Rheum 43, 2455-2463), acidente vascular cerebral, e outros distúrbios inflamatórios. Os anticorpos para IL-17 foram propostos para o uso no tratamento de doenças e distúrbios mediados por IL-17; ver por exemplo, WO
Petição 870180160934, de 10/12/2018, pág. 12/193
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95/18826 e o debate na introdução desta.
[003] Preparou-se agora anticorpos melhorados para IL-17 humana adequada para o uso no tratamento de doenças e distúrbios mediados por IL-17.
[004] Consequentemente a invenção fornece uma molécula de ligação de IL-17 que compreende um sítio de ligação de antígeno compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a dita CDR1 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1 (N-Y-W-M-N), a dita CDR2 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2 (A-I-N-Q-D-G-S-E-K-Y-Y-V-G-S-V-K-G), e a dita CDR3 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 3 (D-YY-D-I-L-T-D-Y-Y-I-H-Y-W-Y-F-D-L); ou equivalentes de CDR diretos destas.
[005] Consequentemente a invenção também fornece uma molécula de ligação de IL-17 compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1', CDR2' e CDR3', a dita CDR1' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 4 (R-A-S-Q-S-V-S-S-SY-L-A), a dita CDR2' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 5 (G-A-S-S-R-A-T) e a dita CDR3' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 6 (Q-Q-Y-G-S-S-P-C-T) ou equivalentes de CDR' diretos destas.
[006] Em uma outra modalidade da invenção, a invenção fornece uma molécula de ligação de IL-17 que compreende um sítio de ligação de antígeno compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1-x, CDR2-x e CDR3-x, a dita CDR1-x tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 11 (G-F-T-F-S-N-Y-W-M-N), a dita CDR2-x tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 12 (A-I-N
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Q-D-G-S-E-K-Y-Y), e a dita CDR3-x tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 13 (C-V-R-D-Y-Y-D-I-L-T-D-Y-Y-I-H-Y-W-Y-F-D-L-W-G); ou equivalentes de CDR-x diretos destas.
[007] Além disso, a invenção também fornece uma molécula de ligação de IL-17 compreendendo domínios variáveis tanto de cadeia pesada (VH) quanto leve (VL); a dita molécula de ligação de IL-17 compreende pelo menos um sítio de ligação de antígeno compreendendo: [008] um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a dita CDR1 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1, a dita CDR2 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2, e a dita CDR3 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 3 ou equivalentes de CDR diretos destas; e [009] um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1', CDR2' e CDR3', a dita CDR1' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 4, a dita CDR2' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 5, e a dita CDR3' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 6 ou equivalentes de CDR' diretos destas.
[0010] Além disso, a invenção também fornece uma molécula de ligação de IL-17 compreendendo domínios variáveis tanto de cadeia pesada (VH) quanto leve (VL); a dita molécula de ligação de IL-17 compreende pelo menos um sítio de ligação de antígeno compreendendo: [0011] um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1-x, CDR2-x e CDR3-x, a dita CDR1-x tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 11, a dita CDR2-x tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 12, e a dita CDR3-x tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 13 ou equivalentes de CDR-x diretos destas; e [0012] um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL)
4/72 que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1', CDR2' e CDR3', a dita CDR1' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 4, a dita CDR2' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 5, e a dita CDR3' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 6 ou equivalentes de CDR' diretos destas.
[0013] A menos que de outro modo indicado, qualquer cadeia de polipeptídeo é aqui descrita como tendo uma sequência de aminoácido iniciando na extremidade de terminal N e terminando na extremidade de terminal C. Quando o sítio de ligação de antígeno compreende os domínios tanto VH quanto VL, estes podem ser localizados na mesma molécula de polipeptídeo ou, preferivelmente, cada domínio pode estar em uma cadeia diferente, o domínio VH sendo parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina ou fragmento desta e o VL sendo parte de uma cadeia leve de imunoglobulina ou fragmento desta.
[0014] Por molécula de ligação de IL-17 é significado qualquer molécula capaz de ligar-se ao antígeno de IL-17 sozinho ou associado com outras moléculas. A reação de ligação pode ser mostrada por métodos padrão (ensaios qualitativos) incluindo, por exemplo, um ensaio de ligação, ensaio de competição ou um bioensaio para determinar a inibição da ligação de IL-17 ao seu receptor ou qualquer tipo de ensaios de ligação, com referência a um teste de controle negativo em que um anticorpo de especificidade não relacionada mas do mesmo isótipo, por exemplo, um anticorpo anti-CD25, é usado (ver também o Exemplo 1).
[0015] Os exemplos de moléculas de ligação de antígeno incluem anticorpos como produzidos por células B ou hibridomas e anticorpos quiméricos, enxertados em CDR ou humanos ou qualquer fragmento destes, por exemplo, fragmentos F(ab')2 e Fab, assim como anticorpos de cadeia única ou domínio único.
[0016] Um anticorpo de cadeia única consiste nos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves de um anticorpo covalentemente li
5/72 gado por um ligador de peptídeo usualmente consistindo de 10 a 30 aminoácidos, preferivelmente de 15 a 25 aminoácidos. Portanto, uma tal estrutura não inclui a parte constante das cadeias pesadas e leves e acredita-se que o espaçador de peptídeo pequeno deve ser menos antigênico do que uma parte constante total. Por anticorpo quimérico é significado um anticorpo em que as regiões constantes das cadeias pesadas ou leves ou ambas são de origem humana enquanto que os domínios variáveis das cadeias tanto pesadas quanto leves são de origem não humana (por exemplo, murino) ou de origem humana mas derivados de um anticorpo humano diferente. Por anticorpo enxertado em CDR é significado um anticorpo em que as regiões hipervariáveis (CDRs) são derivadas de um anticorpo doador, tal como um anticorpo não humano (por exemplo, murino) ou um anticorpo humano diferente, enquanto que todas ou substancialmente todas as outras partes da imunoglobulina por exemplo, as regiões constantes e as partes altamente conservadas dos domínios variáveis, isto é, as regiões de estrutura, são derivadas de um anticorpo aceitante, por exemplo, um anticorpo de origem humana. Um anticorpo enxertado em CDR entretanto podem conter alguns aminoácidos da sequência doadora nas regiões de estrutura, por exemplo nas partes das regiões de estrutura adjacentes às regiões hipervariáveis. Por anticorpo humano é significado um anticorpo em que as regiões constantes e variáveis tanto das cadeias pesadas quanto leves são todas de origem humana, ou substancialmente idênticas às sequências de origem humana, não necessariamente do mesmo anticorpo e inclui anticorpos produzidos por camundongos em que os genes da parte variável e constante de imunoglobulina de murino foram substituídos por suas contrapartes humanas, por exemplo, como descrito em termos gerais na EP 0546073 B1, USP 5545806, USP 5569825, USP 5625126, USP 5633425, USP 5661016, USP 5770429, EP 0 438474 B1 e EP 0 463151 B1.
6/72 [0017] As moléculas de ligação de IL-17 particularmente preferidas da invenção são anticorpos humanos, especialmente o anticorpo AIN457 como em seguida descrito nos Exemplos 1 e 2.
[0018] Assim em anticorpos quiméricos preferidos os domínios variáveis de cadeias tanto pesadas quanto leves são de origem humana, por exemplo aqueles do anticorpo AIN457 que são mostrados na SEQ ID NO: 10 (= domínio variável de cadeia leve, isto é, aminoácido 1 a 109 da SEQ ID NO: 10) e SEQ ID NO: 8 (= domínio variável de cadeia pesada, isto é, aminoácido 1 a 127 da SEQ ID NO: 8). Os domínios de região constante preferivelmente também compreendem domínios de região constante humanos adequados, por exemplo como descrito em Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat E.A. et al, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health.
[0019] As regiões hipervariáveis podem estar associadas com qualquer tipo de regiões de estrutura, ainda que preferivelmente sejam de origem humana. As regiões de estrutura adequadas são descritas em Kabat E.A. et al, ibid. A estrutura de cadeia pesada preferida é uma estrutura de cadeia pesada humana, por exemplo aquela do anticorpo AIN457. Ela consiste na sequência por exemplo, de regiões FR1 (aminoácido 1 a 30 da SEQ ID NO: 8), FR2 (aminoácido 36 a 49 da SEQ ID NO: 8), FR3 (aminoácido 67 a 98 da SEQ ID NO: 8) e FR4 (aminoácido 117 a 127 da SEQ ID NO: 8). Tomando em consideração as regiões hipervariáveis determinadas de AIN457 por análise de raio X, uma outra estrutura de cadeia pesada preferida consiste na sequência das regiões FR1-x (aminoácido 1 a 25 da SEQ ID NO: 8), FR2-x (aminoácido 36 a 49 da SEQ ID NO: 8), FR3-x (aminoácido 61 a 95 da SEQ ID NO: 8) e FR4 (aminoácido 119 to 127 da SEQ ID NO: 8). Em uma maneira similar, a estrutura de cadeia leve consiste, na sequência, das regiões FR1' (aminoácido 1 a 23 da SEQ ID NO: 10),
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FR2' (aminoácido 36 a 50 da SEQ ID NO: 10), FR3' (aminoácido 58 a 89 da SEQ ID NO: 10) e FR4' (aminoácido 99 a 109 da SEQ ID NO: 10).
[0020] Conseqüentemente, a invenção também fornece uma molécula de ligação de IL-17 que compreende pelo menos um sítio de ligação de antígeno compreendendo um primeiro domínio tendo uma sequência de aminoácido substancialmente idêntica àquela mostrada na SEQ ID NO: 8 iniciando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 127 ou um primeiro domínio como descrito acima e um segundo domínio tendo uma sequência de aminoácido substancialmente idêntica àquela mostrada na SEQ ID NO: 10, iniciando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 109.
[0021] Os anticorpos monoclonais incitados contra uma proteína naturalmente encontrados em todos os seres humanos são tipicamente desenvolvidos em um sistema não humano por exemplo, em camundongos, e como tal são tipicamente proteínas não humanas. Como uma consequência direta disto, um anticorpo xenogênico como produzido por um hibridoma, quando administrado aos seres humanos, evoca uma resposta imune indesejável que é predominantemente mediada pela parte constante da imunoglobulina xenogênica. Isto limita claramente o uso de tais anticorpos visto que eles não podem ser administrados durante um período prolongado de tempo. Portanto é particularmente preferido usar anticorpos de cadeia única, domínio único, quiméricos, enxertados em CDR, ou especialmente humanos que não são prováveis para evocar uma resposta alogênica substancial quando administrados aos seres humanos.
[0022] Em vista do antecedente, uma molécula de ligação de IL-17 mais preferida da invenção é selecionada de um anticorpo anti IL-17 humano que compreende pelo menos
8/72 [0023] uma cadeia pesada de imunoglobulina ou fragmento desta que compreende (i) um domínio variável compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 ou equivalentes de CDR diretos destas e (ii) a parte constante ou fragmento desta de uma cadeia pesada humana; a dita CDR1 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1, a dita CDR2 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2, e a dita CDR3 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 3; e [0024] uma cadeia leve de imunoglobulina ou fragmento desta que compreende (i) um domínio variável compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis e opcionalmente também as regiões hipervariáveis CDR1', CDR2', e CDR3' ou equivalentes de CDR' diretos destas e (ii) a parte constante ou fragmento desta de uma cadeia leve humana, a dita CDR1' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 4, a dita CDR2' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 5, e a dita CDR3' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 6.
[0025] Alternativamente, uma molécula de ligação de IL-17 da invenção pode ser selecionada de uma molécula de ligação de cadeia única que compreende um sítio de ligação de antígeno compreendendo [0026] um primeiro domínio compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 ou equivalentes de CDR diretos destas, a dita CDR1 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1, a dita CDR2 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2, e a dita CDR3 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 3; e [0027] um segundo domínio compreendendo as regiões hipervariáveis CDR1', CDR2' e CDR3' ou equivalentes de CDR' diretos destas, a dita CDR1' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 4, a dita CDR2' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 5, e a dita CDR3' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 6; e
9/72 [0028] um ligador de peptídeo que é ligado à extremidade de terminal N do primeiro domínio e à extremidade de terminal C do segundo domínio ou à extremidade de terminal C do primeiro domínio e à extremidade de terminal N do segundo domínio.
[0029] Como é bem conhecido, mudanças menores em uma sequência de aminoácido tais como supressão, adição ou substituição de um, alguns ou ainda vários aminoácidos pode levar a uma forma alélica da proteína original que tem propriedades substancialmente idênticas.
[0030] Assim, pelo termo equivalentes de CDR diretos destas são significados as moléculas de ligação de IL-17 compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1i, CDR2i, e CDR3i, (ao invés de CDR1, CDR2, e CDR3), em que [0031] a região hipervariável CDR1i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável CDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 1; e [0032] a região hipervariável CDR2i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável CDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 2; e [0033] a região hipervariável CDR3i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável CDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 3; e [0034] uma tal molécula compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1i, CDR2i, e CDR3i é capaz de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos.
[0035] Similarmente, pelo termo equivalentes de CDR-x diretos
10/72 destas são significados as moléculas de ligação de IL-17 compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1i-x, CDR2i-x, e CDR3i-x, (ao invés de CDR1-x, CDR2-x, e CDR3-x), em que [0036] a região hipervariável CDR1i-x difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável CDR1x como mostrado na SEQ ID NO: 11; e [0037] a região hipervariável CDR2i-x difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável CDR2-x como mostrado na SEQ ID NO: 12; e [0038] a região hipervariável CDR3i-x difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável CDR3-x como mostrado na SEQ ID NO: 13; e [0039] uma tal molécula compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1i-x, CDR2i-x, e CDR3i-x é capaz de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos.
[0040] Similarmente, pelo termo equivalentes de CDR' diretos destas é significado um domínio compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1'i, CDR2'i, e CDR3'i, em que [0041] a região hipervariável CDR1'i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável CDR1' como mostrado na SEQ ID NO: 4; e [0042] a região hipervariável CDR2'i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável CDR2' como mostrado na SEQ ID NO: 5; e [0043] a região hipervariável CDR3'i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável CDR3'
11/72 como mostrado na SEQ ID NO: 6; e [0044] uma tal molécula compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1'i, CDR2'i, e CDR3'i é capaz de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos.
[0045] Alternativamente, uma molécula de ligação de IL-17 da invenção pode ser uma molécula de ligação de IL-17 que compreende pelo menos um sítio de ligação de antígeno compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende em sequência [0046] regiões hipervariáveis CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2) e CDR3 (SEQ ID NO: 3); ou [0047] regiões hipervariáveis CDR1i, CDR2i, CDR3i, a dita região hipervariável CDR1i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 1, a dita região hipervariável CDR2i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 2; e a dita região hipervariável CDR3i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 3; e [0048] a dita molécula de ligação de IL-17 compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1x, CDR2x, e CDR3x é capaz de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibro12/72 blastos dérmicos humanos.
[0049] Similarmente, uma molécula de ligação de IL-17 da invenção podem ser uma molécula de ligação de IL-17 que compreende pelo menos um sítio de ligação de antígeno compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende em sequência [0050] regiões hipervariáveis CDR1-x (SEQ ID NO: 11), CDR2-x (SEQ ID NO: 12) e CDR3-x (SEQ ID NO: 13); ou [0051] regiões hipervariáveis CDR1i-x, CDR2i-x, CDR3i-x, a dita região hipervariável CDR1i-x difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR1-x como mostrado na SEQ ID NO: 11, a dita região hipervariável CDR2i-x difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR2-x como mostrado na SEQ ID NO: 12; e a dita região hipervariável CDR3i-x difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR3-x como mostrado na SEQ ID NO: 13; e [0052] a dita molécula de ligação de IL-17 compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1i-x, CDR2i-x, e CDR3i-x é capaz de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos.
[0053] Similarmente, uma molécula de ligação de IL-17 da invenção pode ser uma molécula de ligação de IL-17 que compreende pelo menos um sítio de ligação de antígeno compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende em sequência [0054] regiões hipervariáveis CDR'1 (SEQ ID NO: 4), CDR'2 (SEQ
13/72
ID NO: 5) e CDR'3 (SEQ ID NO: 6); ou [0055] regiões hipervariáveis CDR1'i, CDR2'i, CDR3'i, a dita região hipervariável CDR'1i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR'1 como mostrado na SEQ ID NO: 4, a dita região hipervariável CDR'2i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR'2 como mostrado na SEQ ID NO: 5; e a dita região hipervariável CDR'3i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR'3 como mostrado na SEQ ID NO: 6; e [0056] a dita molécula de ligação de IL-17 compreende em sequência as regiões hipervariáveis CDR'1i, CDR'2i, e CDR'3i é capaz de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos.
[0057] Alternativamente, uma molécula de ligação de IL-17 da invenção pode ser uma molécula de ligação de IL-17 compreendendo domínios variáveis tanto de cadeia pesada (VH) quanto leve (VL) e a dita molécula de ligação de IL-17 compreende pelo menos um sítio de ligação de antígeno compreendendo:
[0058] um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2) e CDR3 (SEQ ID NO: 3); e [0059] um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1' (SEQ ID NO: 4), CDR2' (SEQ ID NO: 5) e CDR3' (SEQ ID NO: 6); ou [0060] um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1i, CDR2i,
14/72 e CDR3i, as ditas regiões hipervariáveis da região hipervariável CDR1,, CDR2,, CDR3i, a dita região hipervariável CDR1i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 1, a dita região hipervariável CDR2i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 2; e a dita região hipervariável CDR3i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 3; e [0061] um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1’i, CDR2’i, CDR3’i, a dita região hipervariável CDR’1i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR’1 como mostrado na SEQ ID NO: 4, a dita região hipervariável CDR’2i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR’2 como mostrado na SEQ ID NO: 5; e a dita região hipervariável CDR’3i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR’3 como mostrado na SEQ ID NO: 6; e [0062] a dita molécula de ligação de IL-17 definida em b) compreende em sequência as regiões hipervariáveis CDR1i, CDR2i, CDR3i, CDR’1 CDR’2h e CDR’3i é capaz de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos.
[0063] Alternativamente, uma molécula de ligação de IL-17 da invenção pode ser uma molécula de ligação de IL-17 compreendendo domínios variáveis tanto de cadeia pesada (VH) quanto leve (VL) e a dita molécula de ligação de IL-17 compreende pelo menos um sítio de
15/72 ligação de antígeno compreendendo:
[0064] um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1-x (SEQ ID NO: 11), CDR2-x (SEQ ID NO: 12) e CDR3-x (SEQ ID NO: 13); e [0065] um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1' (SEQ ID NO: 4), CDR2' (SEQ ID NO: 5) e CDR3' (SEQ ID NO: 6); ou [0066] um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1i-x, CDR2i-x, e CDR3i-x, as ditas regiões hipervariáveis da região hipervariável CDR1i-x, CDR2i-x, CDR3i-x, a dita região hipervariável CDR1i-x difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR1-x como mostrado na SEQ ID NO: 11, a dita região hipervariável CDR2i-x difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR2-x como mostrado na SEQ ID NO: 12; e a dita região hipervariável CDR3i-x difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR3-x como mostrado na SEQ ID NO: 13; e [0067] um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende em sequência regiões hipervariáveis CDR1'i, CDR2'i, CDR3'i, a dita região hipervariável CDR'1i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR'1 como mostrado na SEQ ID NO: 4, a dita região hipervariável CDR'2i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR'2 como mostrado na SEQ ID NO: 5; e a dita região hipervariável CDR'3i difere por 3, preferivelmente 2, mais preferivelmente 1 aminoácido(s) da região hipervariável de CDR'3 como mostrado na SEQ ID NO: 6; e
16/72 [0068] a dita molécula de ligação de IL-17 definida em b) compreende em sequência as regiões hipervariáveis CDR1h CDR2i,CDR3i, CDR’Í, CDR’2h e CDR’3i é capaz de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos.
[0069] A inibição da ligação de IL-17 ao seu receptor pode ser convenientemente testada em várias ensaios incluindo tais ensaios são descritos em seguida no texto. Pelo termo na mesma extensão é significado que a referência e as moléculas equivalentes exibem, em uma base estatística, atividade inibitória de IL-17 essencialmente idêntica em um dos ensaios referidos aqui (ver Exemplo 1). Por exemplo, as moléculas de ligação de IL-17 da invenção tipicamente têm IC50s para a inibição de IL-17 humana na produção de IL-6 induzida por IL17 humana em fibroblastos dérmicos humanos que estão dentro de +/x5, isto é, abaixo de 10 nM, mais preferivelmente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 nM daquela, preferível e substancialmente da mesma como, a IC50 da molécula de referência correspondente quando analisada como descrito no Exemplo 1.
[0070] Alternativamente, o ensaio usado pode ser um ensaio de inibição competitiva de ligação de IL-17 por receptores de IL-17 solúveis (por exemplo, as construções de R/Fc de IL-17 humana do Exemplo 1) e as moléculas de ligação de IL-17 da invenção.
[0071] O mais preferivelmente, o anticorpo de IL-17 humana compreende pelo menos [0072] uma cadeia pesada que compreende um domínio variável tendo uma sequência de aminoácido substancialmente idêntica àquela mostrada na SEQ ID NO: 8 iniciando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 127 e a parte constante de
17/72 um cadeia pesada humana; e [0073] uma cadeia leve que compreende um domínio variável tendo uma sequência de aminoácido substancialmente idêntica àquela mostrada na SEQ ID NO: 10 iniciando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 109 e a parte constante de um cadeia leve humana.
[0074] A parte constante de uma cadeia pesada humana pode ser do tipo γ1, γ2, γ3, γ4, μ, α1, α2, δ ou ε, preferivelmente do tipo γ, mais preferivelmente do tipo γ1, ao passo que a parte constante de uma cadeia leve humana pode ser do tipo κ ou λ (que inclui os subtipos λ1, λ2 e λ3) mas é preferivelmente do tipo κ. As sequências de aminoácido de todas estas partes constantes são fornecidas em Kabat et al (supra).
[0075] Os conjugados das moléculas de ligação da invenção, por exemplo conjugados de enzima ou toxina ou radiosótopo, são também incluídos dentro do escopo da invenção.
[0076] Polipeptídeo, se não de outro modo especificado aqui, inclui qualquer peptídeo ou proteína compreendendo aminoácidos unidos entre si por ligações de peptídeo, tendo uma sequência de aminoácido iniciando na extremidade de terminal N e terminando na extremidade de terminal C. Preferivelmente o polipeptídeo da presente invenção é um anticorpo monoclonal, mais preferido é um anticorpo monoclonal quimérico (também chamado enxertado em V) ou humanizado (também chamado enxertado em CDR), mais preferido um anticorpo inteiramente humano obtenível por exemplo, pela tecnologia exemplificada no Exemplo 1. O anticorpo monoclonal humanizado (enxertado em CDR) ou inteiramente humano podem incluir ou não outras mutações introduzidas nas sequências de estrutura (FR) do anticorpo aceitante.
[0077] Um derivado funcional de um polipeptídeo como usado aqui inclui uma molécula tendo uma atividade biológica qualitativa em co
18/72 mum com um polipeptídeo à presente invenção, isto é, tendo a capacidade para ligar-se à IL-17 humana. Um derivado funcional inclui fragmentos e análogos de peptídeo de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção. Os fragmentos compreendem regiões dentro da sequência de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica. O termo derivado é usado para definir variantes de sequência de aminoácido, e modificações covalentes de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica. Os derivados funcionais de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica, por exemplo, da região hipervariável da cadeia leve e pesada, preferivelmente têm pelo menos cerca de 65 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75 %, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85 %, o mais preferivelmente pelo menos cerca de 95, 96, 97, 98, 99 % de homologia de sequência global com a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica, e substancialmente mantêm a capacidade para ligar a IL-17 humana ou por exemplo, neutralizam a produção de IL-6 de fibroblastos dérmicos humanos induzidos por IL-17.
[0078] O termo modificação covalente inclui modificações de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica; ou um fragmento deste com um agente de derivação orgânico proteináceo ou não proteináceo, fusões às sequências de polipeptídeo heterólogo, e modificações pós traducionais. Os polipeptídeos modificados covalentes, por exemplo, de uma sequência específica, ainda têm a capacidade para ligar a IL-17 humana ou por exemplo, neutralizam a produção de IL-6 de fibroblastos dérmicos humanos induzidos por IL-17 por reticulação. As modificações covalentes são tradicionalmente introduzidas reagindo-se os resíduos de aminoá
19/72 cido alvejados com um agente orgânico de derivação que é capaz de reagir com lados selecionados ou resíduos terminais, ou aproveitandose mecanismos de modificações pós traducionais que funcionam em células hospedeiras recombinantes selecionadas. Certas modificações pós traducionais são o resultado da ação de células hospedeiras recombinantes no polipeptídeo expressado. Os resíduos de glutaminila e asparaginila são freqüentemente e pós traducionalmente desamidados aos resíduos de glutamila e aspartila correspondentes. Alternativamente, estes resíduos são desaminados sob condições suavemente ácidas. Outras modificações pós traducionais inclui hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila, tirosina ou treonila, metilação dos grupos α-amino de cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina, ver por exemplo, T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., São Francisco, páginas 79-86 (1983). As modificações covalentes por exemplo, incluem proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica e suas variantes de sequência de aminoácido, tais como imunoadesinas, e fusões de terminal N às sequências heterólogas de sinal.
[0079] Homologia com respeito a um polipeptídeo nativo e seu derivado funcional é definido aqui como a porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos com os resíduos de um polipeptídeo nativo correspondente, depois de alinhar as sequências e intervalos de introdução, se necessário, para obter a homologia percentual máxima, e não considerando nenhuma substituição coservativa como parte da identidade de sequência. Nenhuma das extensões de terminal N ou C nem as inserções devem ser interpretadas como reduzindo a identidade ou homologia. Os métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos.
[0080] Aminoácido(s) referem-se a todos os L-a-aminoácidos
20/72 que ocorrem naturalmente, por exemplo, e incluindo D-aminoácidos. Os aminoácidos são identificados pelas designações de letra única ou letra tripla bem conhecidas.
[0081] O termo variante de sequência de aminoácido se refere as moléculas com algumas diferenças em suas sequências de aminoácido quando comparado a um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica. As variantes de sequência de aminoácido de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica, ainda têm a capacidade para ligar a IL-17 humana ou por exemplo, neutralizam a produção de IL-6 de fibroblastos dérmicos humanos induzidos por IL17. As variantes substitucionais são aquelas que têm pelo menos um resíduo de aminoácido removido e um aminoácido diferente inserido em seu lugar na mesma posição em um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica. Estas substituições podem ser únicas, onde somente um aminoácido na molécula foi substituído, ou elas podem ser múltiplas, onde dois ou mais aminoácidos foram substituídos na mesma molécula. As variantes insercionais são aquelas com um ou mais aminoácidos inseridos imediatamente adjacente a um aminoácido em uma posição particular em um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica. Imediatamente adjacente a um aminoácido significa conectado ao grupo funcional α-carbóxi ou α-amino do aminoácido. As variantes de supressão são aquelas com um ou mais aminoácidos em um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência específica, removida. Comumente, as variantes de supressão terão um ou dois aminoácidos suprimidos em uma região particular da molécula.
[0082] Uma molécula de ligação de IL-17 da invenção pode ser produzida por técnicas de DNA recombinantes. Em vista disto, uma ou
21/72 mais moléculas de DNA que codificam a molécula de ligação devem ser construídas, colocadas sob sequências de controle apropriadas e transferidas em um organismo hospedeiro adequado para a expressão.
[0083] Em uma maneira muito geral, são conseqüentemente fornecidos [0084] moléculas de DNA que codificam uma molécula de ligação de IL-17 de domínio único da invenção, uma molécula de ligação de IL-17 de cadeia única da invenção, uma molécula de ligação de IL-17 compreendendo uma cadeia pesada e leve como definido aqui, ou fragmentos de uma molécula de ligação de IL-17 da invenção; e [0085] o uso das moléculas de DNA da invenção para a produção de uma molécula de ligação de IL-17 da invenção por meios recombinantes.
[0086] Conseqüentemente, a invenção fornece uma molécula de DNA que codifica uma molécula de ligação de IL-17 como descrito acima.
[0087] Além disso, a invenção fornece uma construção de DNA compreendendo uma molécula de DNA que é substancialmente homóloga a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9.
[0088] Além disso, a invenção fornece uma construção de DNA compreendendo duas moléculas de DNA das quais uma é substancialmente homóloga a SEQ ID NO: 7 ou é um equivalente de DNAH direto desta e a outra substancialmente homóloga a SEQ ID NO: 9, ou é um equivalente de DNAL direto desta.
[0089] O presente estado da técnica é tal que o trabalhador versado na técnica é capaz de sintetizar as moléculas de DNA da invenção dada a informação fornecida aqui, isto é, as sequências de aminoácido das regiões hipervariáveis e as sequências de DNA que codificam elas. Um método para construir um gene de domínio variável é por e
22/72 xemplo descrito na EPA 239 400 e pode ser brevemente resumido como segue: um gene que codifica um domínio variável de um MAb de qualquer que seja a especificidade é clonado. Os segmentos de DNA que codificam as regiões de estrutura e hipervariáveis são determinados e os segmentos de DNA que codificam as regiões hipervariáveis são removidos de modo os segmentos de DNA que codificam as regiões de estrutura são fundidos juntos com sítios de restrição adequados nas junções. Os sítios de restrição podem ser gerados nas posições apropriadas por mutagênese da molécula de DNA por procedimentos padrão. Os cassetes de CDR sintéticos de filamento duplo são preparados por síntese de DNA de acordo com as sequências que codificam a SEQ ID NO: 1 (CDR1), SEQ ID NO: 2 (CDR2), SEQ ID NO: 3 (CDR3), SEQ ID NO: 4 (CDR1’), SEQ ID NO: 5 (CDR2’), SEQ ID NO: 6 (CDR6’), SEQ ID NO: 11 (CDR1-x), SEQ ID NO: 12 (CDR2-x), SEQ ID NO: 13 (CDR3-x),. Estes cassetes são fornecidos com extremidades pegajosas de modo que eles possam ser ligados nas junções da estrutura.
[0090] Além disso, não é necessário ter acesso ao mRNA de uma linhagem de célula que produz hibridoma de modo a obter uma construção de DNA que codifica as moléculas de ligação de IL-17 da invenção. Assim, o pedido PCT WO 90/07861 fornece instruções totais para a produção de um anticorpo por técnicas de DNA recombinante fornecidas apenas a informação escrita como à sequência de nucleotídeo do gene. O método compreende a síntese de vários oligonucleotídeos, sua amplificação pelo método de PCR, e sua união para fornecer a sequência de DNA desejada.
[0091] Os vetores de expressão compreendendo um promotor adequado ou genes que codificam partes constantes de cadeia pesada e leve são publicamente disponíveis. Assim, uma vez que uma molécula de DNA da invenção é preparada ela pode ser convenientemente
23/72 transferida em um vetor de expressão apropriado. As moléculas de DNA que codificam os anticorpos de cadeia única também podem ser preparadas por métodos padrão, por exemplo, como descrito na WO 88/1649.
[0092] Em analogia ao caso para os equivalentes de CDR, o termo equivalentes de DNAH direto deste é significado representar uma primeira construção de DNA que codifica uma cadeia pesada ou fragmento desta de uma molécula de ligação de IL-17 da invenção e compreende:
[0093] uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo alternativamente regiões de estrutura e hipervariáveis, as ditas regiões hipervariáveis sendo em sequência CDR1i, CDR2i e CDR3i, a dita CDR1i é pelo menos 50 % homóloga, preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 85, ou 90 % homóloga, mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga à região hipervariável CDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 1, a dita CDR2i é pelo menos 50 % homóloga, preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 85, ou 90 % homóloga, mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga à região hipervariável CDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 2, e CDR3i é pelo menos 50 % homóloga, preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 85, ou 90 % homóloga, mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga à região hipervariável CDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 3; esta primeira parte iniciando com um códon que codifica o primeiro aminoácido do domínio variável e terminando com um códon que codifica o último aminoácido do domínio variável; e [0094] uma segunda parte que codifica uma parte constante de cadeia pesada ou fragmento desta que inicia com um códon que codifica o primeiro aminoácido da parte constante da cadeia pesada e termina com um códon que codifica o último aminoácido da parte constante ou fragmento desta, seguido por um códon de parada; e
24/72 [0095] a dita construção de DNA que codifica um polipeptídeo que é capaz sozinho ou em combinação com um outro polipeptídeo de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos.
[0096] Similarmente, o termo equivalentes de DNAH-x direto deste é significado representar uma primeira construção de DNA alternativa que codifica uma cadeia pesada ou fragmento desta de uma molécula de ligação de IL-17 da invenção e compreende:
[0097] uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo alternativamente regiões de estrutura e hipervariáveis, as ditas regiões hipervariáveis sendo em sequência CDR1i-x, CDR2i-x e CDR3i-x, a dita CDR1i-x é pelo menos 50 % homóloga, preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 85, ou 90 % homóloga, mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga à região hipervariável CDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 11, a dita CDR2i-x é pelo menos 50 % homóloga, preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 85, ou 90 % homóloga, mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga à região hipervariável CDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 12, e CDR3i-x é pelo menos 50 % homóloga, preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 85, ou 90 % homóloga, mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga à região hipervariável CDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 13; esta primeira parte iniciando com um códon que codifica o primeiro aminoácido do domínio variável e terminando com um códon que codifica o último aminoácido do domínio variável; e [0098] uma segunda parte que codifica uma parte constante de cadeia pesada ou fragmento desta que inicia com um códon que codifica o primeiro aminoácido da parte constante da cadeia pesada e ter
25/72 mina com um códon que codifica o último aminoácido da parte constante ou fragmento desta, seguido por um códon de parada; e [0099] a dita construção de DNA que codifica um polipeptídeo que é capaz sozinho ou em combinação com uma outro polipeptídeo de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos.
[00100] Preferivelmente, estas construções de DNA codificam um domínio variável compreendendo alternativamente regiões de estrutura e hipervariáveis, as ditas regiões hipervariáveis sendo em sequência CDR1, CDR2 e CDR3, a dita CDR1 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1, a dita CDR2 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2, e a dita CDR3 tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 3. Mais preferivelmente, estas construções de DNA codificam um domínio variável compreendendo alternativamente regiões de estrutura e hipervariáveis, as ditas regiões hipervariáveis sendo em sequência CDR1-x, CDR2-x e CDR3-x, a dita CDR1-x tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 11, a dita CDR2-x tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 12, e a dita CDR3-x tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 13. Mais preferivelmente, esta primeira parte codifica um domínio variável tendo uma sequência de aminoácido substancialmente idêntica à sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 8 iniciando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 127. Mais preferivelmente a primeira parte tem a sequência de nucleotídeo como mostrado na SEQ ID NO: 7 iniciando com o nucleotídeo na posição 1 e terminando com o nucleotídeo na posição 381. Também preferivelmente, a segunda parte codifica a parte constante de uma cadeia pesada humana, mais
26/72 preferivelmente a parte constante da cadeia γ1 humana. Esta segunda parte pode ser um fragmento de DNA de origem genômica (compreendendo introns) ou um fragmento de cDNA (sem introns).
[00101] Similarmente, o termo equivalentes de DNAL direto deste é significado representar uma segunda construção de DNA que codifica uma cadeia leve ou fragmento desta de uma molécula de ligação de IL-17 da invenção e compreende:
[00102] uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo alternativamente regiões de estrutura e hipervariáveis; as ditas regiões hipervariáveis sendo CDR3i' e opcionalmente CDR1i' e CDR2i', a dita CDR1i' é pelo menos 50 % homóloga, preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 85, ou 90 % homóloga, mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga à região hipervariável CDR1' como mostrado na SEQ ID NO: 4, a dita CDR2i' é pelo menos 50 % homóloga, preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 85, ou 90 % homóloga, mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga à região hipervariável CDR2' como mostrado na SEQ ID NO: 5, e a dita CDR3i' é pelo menos 50 % homóloga, preferivelmente pelo menos 60, 70, 80, 85, ou 90 % homóloga, mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga à região hipervariável CDR3' como mostrado na SEQ ID NO: 6; esta primeira parte iniciando com um códon que codifica o primeiro aminoácido do domínio variável e terminando com um códon que codifica o último aminoácido do domínio variável; e [00103] uma segunda parte que codifica uma parte constante da cadeia leve ou fragmento desta que inicia com um códon que codifica o primeiro aminoácido da parte constante da cadeia leve e termina com um códon que codifica o último aminoácido da parte constante ou fragmento desta seguido por um códon de parada; e [00104] a dita construção de DNA que codifica um polipeptídeo que é capaz sozinho ou em combinação com um outro polipeptídeo de ini
27/72 bir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos.
[00105] Preferivelmente, esta segunda construção de DNA codifica um domínio variável compreendendo alternativamente regiões de estrutura e hipervariáveis, as ditas regiões hipervariáveis sendo em sequência CDR1', CDR2' e CDR3', a dita CDR1' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 4, a dita CDR2' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 5, e a dita CDR3' tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 6. Mais preferivelmente, esta primeira parte da segunda construção de DNA codifica um domínio variável tendo uma sequência de aminoácido substancialmente idêntica à sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 10 iniciando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 109. Mais preferivelmente, a primeira parte tem a sequência de nucleotídeo como mostrado na SEQ ID NO: 9 iniciando com o nucleotídeo na posição 1 e terminando com o nucleotídeo na posição 327. Também preferivelmente a segunda parte codifica a parte constante de uma cadeia leve humana, mais preferivelmente a parte constante da κ humana.
[00106] Preferivelmente, a primeira e segunda construção de DNA serão usadas juntas, mas também podem ser usadas separadamente. [00107] A invenção também inclui moléculas de ligação de IL-17 em que um ou mais dos resíduos de aminoácido de CDR1, CDR2, CDR3, CDR1-x, CDR2-x, CDR3-x, CDR1', CDR2' ou CDR3' ou as estruturas, tipicamente apenas algumas (por exemplo, 1 a 4), são mudadas; por exemplo por mutação por exemplo, mutagênese dirigida ao sítio das sequências de DNA correspondentes. A invenção inclui as sequências de DNA que codificam tais moléculas de ligação de IL-17 mudadas. Em
28/72 particular a invenção inclui moléculas de ligação de IL-17 em que um ou mais resíduos de CDR1' ou CDR2' foram mudados dos resíduos mostrados na SEQ ID NO: 4 (para CDR1’) e SEQ ID NO: 5 (para CDR2’).
[00108] No primeiro e segundo constructos de DNA, a primeira e segunda partes podem ser separadas por um intron, e, um realçador pode ser convenientemente localizado no intron entre a primeira e segunda partes. A presença de um tal realçador que é transcrito mas não traduzido, pode auxiliar na transcrição eficiente. Em modalidades particulares o primeiro e segundo constructo de DNA compreendem o realçador de um gene de cadeia pesada vantajosamente de origem humana.
[00109] Cada uma das construções de DNA são colocadas sob o controle de sequências de controle adequadas, em particular sob o controle de um promotor adequado. Qualquer tipo de promotor pode ser usado, contanto que ele seja adaptado ao organismo hospedeiro em que a construções de DNA serão transferidas para a expressão.
[00110] O anticorpo desejado pode ser produzido em uma cultura de célula ou em um animal transgênico. Um animal transgênico adequado pode ser obtido de acordo com métodos padrão que inclui micro injetar nos óvulos a primeira e segunda construções de DNA colocadas sob sequências de controle adequadas transferindo os óvulos assim preparados nas fêmeas pseudoprenha apropriadas e selecionando um descendente que expressa o anticorpo desejado.
[00111] Quando as cadeias de anticorpo são produzidas em uma cultura de célula, as construções de DNA primeiro devem ser inseridas em um único vetor de expressão ou em dois vetores de expressão separados mas compatíveis, a última possibilidade sendo preferida.
[00112] Conseqüentemente, a invenção também fornece um vetor de expressão capaz de replicar em uma linhagem de célula procariótica ou eucariótica que compreende pelo menos um dos constructos de
29/72
DNA acima descritas.
[00113] Cada vetor de expressão contendo uma construção de DNA depois é transferido em um organismo hospedeiro adequado. Quando os constructos de DNA são inseridos separadamente nos dois vetores de expressão, elas podem ser transferidas separadamente, isto é, um tipo de vector por célula, ou co-transferidas, esta última possibilidade sendo preferida. Um organismo hospedeiro adequado pode ser uma bactéria, uma levedura ou uma linhagem de célula de mamífero, esta última sendo preferida. Mais preferivelmente, a linhagem de célula de mamífero é de origem linfóide, por exemplo, um mieloma, hibridoma ou uma célula B imortalizada normal, que convenientemente não expressa nenhuma cadeia pesada ou leve de anticorpo endógeno. [00114] Para a expressão em células de mamífero é preferido que a sequência de codificação da molécula de ligação de IL-17 seja integrada no DNA da célula hospedeira dentro de um loco que permite ou favorece a expressão de nível alto da molécula de ligação de IL-17. As células em que a sequência de codificação da molécula de ligação de IL-17 é integrada em tais locos favoráveis podem ser identificadas e selecionadas na base dos níveis da molécula de ligação de IL-17 que elas expressam. Qualquer marcador selecionável adequado pode ser usado para preparação de células hospedeiras contendo a sequência de codificação da molécula de ligação de IL-17; por exemplo, um gene dhfr/metotrexato ou sistema de seleção equivalente pode ser usado. Os sistemas alternativos para a expressão das moléculas de ligação de IL-17 da invenção incluem sistemas de amplificação/ seleção com base em GS, tais como aqueles descritos na EP 0256055 B, EP 0323997 B e pedido de patente Europeu 89303964.4.
[00115] Em um outro aspecto da invenção é fornecida um processo para o produto de uma molécula de ligação de IL-17 que compreende (i) cultivar um organismo que é transformado com um vetor de expres
30/72 são como definido acima e (ii) recuperar a molécula de ligação de IL17 da cultura.
[00116] Para os propósitos da presente descrição um anticorpo é capaz de inibir a ligação de IL-17 como AIN457 se o anticorpo fosse capaz de inibir a ligação de IL-17 ao seu receptor substancialmente na mesma extensão como o anticorpo AIN457, em que na mesma extensão tem significado como definido acima.
[00117] O anticorpo AIN457 tem afinidade de ligação para IL-17 que é mais alta do que as afinidades previamente relatadas para anticorpos anti IL-17, em particular a quaisquer anticorpos anti IL-17 humana. Assim
AIN457 tem uma constante de equilíbrio de dissociação KD para ligar a IL-17 de cerca de 0,188 ± 0,036 nM (determinado por BIAcore, por exemplo, como mostrado no Exemplo 2). Esta afinidade alta de ligação torna o anticorpo AIN457 particularmente adequado para aplicações terapêuticas.
[00118] Na presente descrição a frase doença mediada por IL-17 abrange todas as doenças e condições medicinais em que IL-17 desempenha um papel, se direta ou indiretamente, na doença ou condição medicinal, incluindo a causa, desenvolvimento, progresso, persistência ou patologia da doença ou condição.
[00119] Na presente descrição os termos tratamento ou tratar referem-se a ambos os tratamentos profiláticos ou preventivos assim como tratamento curativo ou modificador de doença, incluindo tratamento de paciente em risco de contrair a doença ou suspeito de ter contraído a doença assim como pacientes que estão doentes ou foram diagnosticados como sofrendo de uma doença ou condição medicinal, e inclui a supressão de reincidência clínica.
[00120] As moléculas de ligação de IL-17 como definido acima que têm especificidade de ligação para IL-17 humana, em particular os an
31/72 ticorpos que são capazes de inibir a ligação de IL-17 ao seu receptor; e anticorpos para IL-17 que são capazes de inibir a atividade de IL-17 humana 1 nM (= 30 ng/mL) em uma concentração de 50 nM, preferivelmente 20 nM, mais preferivelmente 10 nM, mais preferivelmente 5 nM da dita molécula em 50 %, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos, são aqui referidas como Anticorpos da Invenção.
[00121] Preferivelmente os Anticorpos da Invenção são anticorpos humanos, o mais preferivelmente o anticorpo AIN457 ou equivalentes diretos deste.
[00122] Os Anticorpos da Invenção bloqueiam os efeitos de IL-17 em suas células alvo e assim são indicados para o uso no tratamento de doenças e distúrbios mediados por IL-17. Estas e outras atividades farmacológicas dos Anticorpos da Invenção podem ser demonstradas em métodos de teste padrão por exemplo como descrito abaixo: [00123] Neutralização da produção dependente de IL-17 de interleucina-6 por fibroblastos humanos primários: A produção de IL-6 em fibroblastos humanos primários (dérmicos) é dependente de IL-17 (Hwang SY et al., (2004) Arthritis Res Ther; 6:R120-128.
[00124] Em resumo, os fibroblastos dérmicos humanos são estimulados com IL-17 recombinante na presença de várias concentrações de anticorpo da invenção ou receptor de IL-17 humana com parte Fc. O anticorpo quimérico anti-CD25 Simulect® (basiliximab) é usado como um controle negativo. O sobrenadante é tomado depois de 16 h de estimulação e analisado quanto a IL-6 por ELISA. Os Anticorpos da Invenção tipicamente têm IC50s para a inibição da produção de IL-6 (na presença de IL-17 humana 1 nM) de cerca de 50 nM ou menos (por exemplo, de cerca de 0,01 a cerca de 50 nM) quando testados como acima, isto é, a dita atividade inibitória é medida na produção de IL-6 induzida por hu-IL-17 em fibroblastos dérmicos humanos. Preferi
32/72 velmente, os Anticorpos da Invenção têm uma IC50 para a inibição da produção de IL-6 como definido acima de cerca de 20 nM ou menos, mais preferivelmente de cerca de 10 nM ou menos, mais preferivelmente de cerca de 5 nM ou menos, mais preferivelmente de cerca de 2 nM ou menos, mais preferivelmente de cerca de 1 nM ou menos. [00125] Como indicado no ensaio acima os Anticorpos da Invenção potentemente bloqueiam os efeitos de IL-17. Conseqüentemente, os Anticorpos da Invenção têm utilidade farmacêutica como segue: [00126] Os Anticorpos da Invenção são úteis para a profilaxia e tratamento de doenças ou condições medicinais mediadas por IL-17, por exemplo, condições inflamatórias, alergias e condições alérgicas, reações de hipersensibilidade, doenças autoimunes, infecções severas, e rejeição ao transplante de órgão ou tecido.
[00127] Por exemplo, os Anticorpos da Invenção podem ser usados para o tratamento de receptores de transplantes de coração, pulmão, coração-pulmão combinado, fígado, rim, pancreático, pele ou corneano, incluindo rejeição ao aloenxerto ou rejeição ao xenoenxerto, e para a prevenção de doença do enxerto versus hospedeiro, tal como seguindo transplante de medula óssea, e transplante de órgão associado a arteriosclerose.
[00128] Os Anticorpos da Invenção são particularmente úteis para o tratamento, prevenção, ou melhora de doença autoimune e de condições inflamatórias, em particular condições inflamatórias com uma etiologia incluindo um componente autoimune tal como artrite (por exemplo artrite reumatóide, artrite crônica progressiva e artrite deformante) e doenças reumáticas, incluindo condições inflamatórias e doenças reumáticas envolvendo perda óssea, dor inflamatória, espondiloartropatias incluindo espondilite ancilosante, síndrome de Reiter, artrite reativa, artrite psoriática, e artrite enteropática, hipersensibilidade (incluindo tanto hipersensibilidade das vias aéreas quanto hipersensibilidade
33/72 dérmica) e alergias. As doenças autoimunes específicas para que os Anticorpos da Invenção possam ser utilizados incluem distúrbios hematológicos autoimune (incluindo por exemplo, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia eritrocítica pura e trombocitopenia idiopática), lúpus eritematoso sistêmico, distúrbios inflamatórios musculares, policondrite, esclerodermia, granulomatose de Wegener, dermatomiosite, hepatite ativa crônica, miastenia grave, psoríase, síndrome de Steven-Johnson, espru idiopático, doença inflamatória intestinal autoimune (incluindo por exemplo, colite ulcerativa, doença de Crohn e Síndrome do Intestino Irritável), oftalmopatia endócrina, doença de Graves, sarcoidose, esclerose múltipla, cirrose biliar primária, diabete juvenil (diabete melito tipo I), uveíte (anterior e posterior), ceratoconjuntivite seca e ceratoconjuntivite vernal, fibrose pulmonar intersticial, artrite psoriática e glomerulonefrite (com e sem síndrome nefrótica, por exemplo, incluindo síndrome nefrótica idiopática ou nefropatia de mudança mínima), tumores, esclerose múltipla, doença inflamatória da pele e córnea, miosite, afrouxamento de implantes ósseos, distúrbios metabólicos, tais como aterosclerose, diabete, e dislipidemia.
[00129] Os Anticorpos da Invenção também são úteis para o tratamento, prevenção, ou melhora de asma, bronquite, pneumoconiose, enfisema pulmonar, e outras doenças obstrutivas ou inflamatórias das vias aéreas.
[00130] Os Anticorpos da Invenção são úteis para tratar reações inflamatórias agudas e hiperagudas indesejáveis que são mediadas por IL-17 ou envolvem a produção de IL-17, ou a promoção da liberação de TNF por IL-17, por exemplo, infecções agudas, por exemplo choque séptico (por exemplo, choque endotóxico e síndrome da angústia respiratória em adulto), meningite, pneumonia; e queimaduras severas; e para o tratamento de caquexia ou síndrome debilitante associada com liberação de TNF mórbida, conseqüente à infecção, câncer, ou disfun
34/72 ção de órgão, especialmente caquexia relacionada à AIDS, por exemplo, associada com ou conseqüente à infecção por HIV.
[00131] Os Anticorpos da Invenção são particularmente úteis para tratar doenças de metabolismo ósseo incluindo osteoartrite, osteoporose e outras artrítides inflamatórias, e perda óssea no geral, incluindo perda óssea relacionada à idade, e em particular doença periodontal. [00132] Para estas indicações, a dosagem apropriada, certamente, variará dependendo, por exemplo, do Anticorpo particular da Invenção a ser utilizado, do hospedeiro, do modo de administração e da natureza e severidade da condição que é tratada. Entretanto, no uso profilático, os resultados satisfatórios no geral são indicados ser obtidos em dosagens de cerca de 0,05 mg a cerca de 10 mg por quilograma de peso corporal mais usualmente de cerca de 0,1 mg a cerca de 5 mg por quilograma de peso corporal. A freqüência de dosagem para usos profiláticos normalmente estará na faixa de cerca de uma vez por semana até cerca de uma vez a cada 3 meses, mais usualmente na faixa de cerca de uma vez a cada 2 semanas até cerca de uma vez a cada 10 semanas, por exemplo, uma vez a cada 4 a 8 semanas. O Anticorpo da Invenção é convenientemente administrado parenteral, intravenosamente, por exemplo, na veia antecubital ou outra periférica, intramuscular, ou subcutaneamente. Um tratamento profilático tipicamente compreende administrar o Anticorpo da Invenção uma vez por mês a uma vez a cada 2 a 3 meses, ou menos freqüentemente.
[00133] Os Anticorpos da Invenção podem ser administrados como o único ingrediente ativo ou em combinação com, por exemplo, como um adjuvante para ou em combinação a, outros fármacos por exemplo, agentes imunossupressores ou de imunomodulação ou outros agentes anti-inflamatórios, por exemplo, para o tratamento ou prevenção de doenças mencionadas acima. Por exemplo, os Anticorpos da Invenção podem ser usados em combinação com DMARD, por exem
35/72 plo, sais de Gold, sulfasalazina, antimalárias, metotrexato, Dpenicilamina, azatioprina, ácido micofenólico, ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, minociclina, leflunomida, glicocorticóides; um inibidor calcineurina, por exemplo, ciclosporina A ou FK 506; um modulador de recirculação linfocítica, por exemplo, análogos de FTY720 e FTY720; um inibidor de mTOR, por exemplo, rapamicina, 40-O-(2-hidroxietil)rapamicina, CCI779, ABT578, AP23573 ou TAFA-93; uma ascomicina tendo propriedades imunossupressivas, por exemplo, ABT-281, ASM981, etc.; corticosteróides; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetil; 15-desoxispergualina ou um homólogo imunossupressor, análogo ou derivado destes; anticorpos monoclonais imunossupressores, por exemplo, anticorpos monoclonais para receptores de leucócito, por exemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 ou seus ligandos; outros compostos imunomoduladores, por exemplo, uma molécula de ligação recombinante tendo pelo menos uma porção do domínio extracelular de CTLA4 ou um mutante deste, por exemplo, pelo menos uma porção extracelular de CTLA4 ou um mutante deste unida a uma sequência de proteína que não CTLA4, por exemplo, CTLA4Ig (por exemplo designado ATCC 68629) ou um mutante deste, por exemplo, LEA29Y; inibidores da molécula de adesão, por exemplo, antagonistas de LFA-1, antagonistas de ICAM-1 ou -3, antagonistas de VCAM-4 ou antagonistas de VLA-4; ou um agente quimioterapêutico, por exemplo, paclitaxel, gencitabina, cisplatina, doxorrubicina ou 5-fluorouracila; agentes anti TNF, por exemplo, anticorpos monoclonais para TNF, por exemplo, infliximab, adalimumab, CDP870, ou constructos de receptor para TNF-RI ou TNF-RII, por exemplo, Etanercept, PEG-TNF-RI; bloqueadores de citocinas pró-inflamatórias, bloqueadores de IL-1, por exemplo, Anakinra ou captura de IL-1, AAL160, ACZ 885, bloqueadores de IL-6; bloquea
36/72 dores de quimiocinas, por exemplo inibidores ou ativadores de proteases, por exemplo, metaloproteases, anticorpos anti-IL-15, anticorpos anti-IL-6, anticorpos anti-CD20, NSAIDs, tais como aspirina ou um agente anti-infeccioso (lista não limitada ao agente mencionado).
[00134] De acordo com o antecedente a presente invenção fornece ainda em um outro aspecto:
[00135] Um método como definido acima compreendendo a coadministração, por exemplo, concomitantemente ou em sequência, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação de IL-17, por exemplo, um Anticorpo da Invenção, e pelo menos uma segunda substância de fármaco, a dita segunda substância de medicamento sendo um fármaco imunossupressor/imunomodulador, quimioterapêutico anti-inflamatório ou anti-infeccioso, por exemplo, como indicado acima.
[00136] Ou, uma combinação terapêutica, por exemplo, um kit, compreendendo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de a) uma molécula de ligação de IL-17, por exemplo, um Anticorpo da Invenção, e b) pelo menos uma segunda substância selecionada de um medicamento imunossupressor/imunomodulador, quimioterapêutico anti-inflamatório ou anti-infeccioso, por exemplo, como indicado acima. O kit pode compreender instruções para sua administração.
[00137] Onde os Anticorpos da Invenção são administrados em combinação com outra terapia imunossupressora/imunomoduladora, quimioterapêutica anti-inflamatória ou anti-infecciosa, as dosagens do composto de combinação coadministrado certamente variarão dependendo do tipo de co-fármaco utilizado, por exemplo, se ele é um DMARD, anti-TNF, bloqueador de IL-1 ou outros, no medicamento específico utilizado, na condição que é tratada e assim por diante.
[00138] As composições farmacêuticas da invenção podem ser fabricadas em maneira convencional. Uma composição de acordo com a
37/72 invenção é preferivelmente fornecida na forma liofilizada. Para a administração imediata ela é dissolvida em um veículo aquoso adequado, por exemplo água estéril para injeção ou solução salina fisiológica tamponada estéril. Se for considerado desejável preparar uma solução de volume grande para administração por infusão preferivelmente como uma injeção de bolo, é vantajoso incorporar albumina sérica humana ou o sangue heparinizado do próprio paciente na solução salina no momento da formulação. Alternativamente, a formulação é fornecida subcutaneamente. A presença de um excesso de tal proteína fisiologicamente inerte impede a perda de anticorpo por adsorção nas paredes do recipiente e tubulação usados com a solução de infusão. Se a albumina for usada, uma concentração adequada é de 0,5 a 4,5 % em peso da solução salina. Outras formulações compreendem formulação líquida ou liofilizada.
[00139] A invenção é descrita ainda por via de ilustração nos Exemplos seguintes.
Exemplos [00140] Os camundongos transgênicos engendrados para expressar o repertório de IgG/κ humano ao invés do repertório de imunoglobulina de murino (Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol., 14, 845-851) são usados para gerar anticorpos para IL-17 humana. As células B destes camundongos são imortalizadas por tecnologia de hibridoma padrão e as células de hibridoma de murino são obtidas que secretam o anticorpo de IgG1/K humano AIN457.
Exemplo 1: Geração do hibridoma, purificação dos anticorpos, seleção de anticorpo AIN457 [00141] Produção de IL-17 humana recombinante (huIL-17): A huIL17 recombinante é produzida em E. coli em corpos de inclusão e reduplicada por técnicas convencionais (produzida isenta de veículo interno (E. coli; Novartis Pharma, lote BM-E3141/98) ou adquirida (isenta de
38/72 veículo, E. coli; R&D Systems no 317-IL/CF)) ou como proteína secretada e parcialmente glicosilada em HEK.EBNA (huIL-17 recombinante, isenta de veículo (IL-17 APP-C6 de células HEK/EBNA trasfectadas; Novartis Pharma, lote En.E-3382/82; 0,28 mg/mL; huIL-17 recombinante, isenta de veículos (IL-17 APP-C4 de células HEK/EBNA trasfectadas; Novartis Pharma, lote En.E-3382/83; 0,29 mg/mL)). A última forma caracteriza uma extensão de 4 aminoácidos de terminal C para a purificação rápida dos sobrenadantes de cultura por cromatografia de imunoafinidade. Neste caso, os sobrenadantes de cultura são carregados em uma coluna de tamanho apropriado de um anticorpo antiidentificação imobilizado específico ligado à Sefarose 4B ativada por CNBr em uma densidade de 10 mg/mL de resina seguindo as instruções do fabricante (Pharmacia). Depois da lavagem de valor básico com PBS, a huIL-17 ligada é eluída com 100 mM de glicina, pH 2,7 e imediatamente neutralizada com NaOH diluído.
[00142] Ligação de huIL-17 à Hemocianina de Lapa Buraco de Fechadura (KLH): A huIL-17 produzida em E. coli ou HEK.EBNA é ligada a KLH pré ativada com um excesso do suberato de Dissuccinimidila de reticulador homobifuncional (DSS). Brevemente, 20 mg de Imject® Mariculture KLH liofilizada (Pierce no 77600) são reconstituídos com 2 mL de H2O para fornecer uma solução de 10 mg/mL contendo Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS), pH 7,2. A esta solução 400 pL de DSS a 250 mm em Sulfóxido de Dimetila (DMSO) são adicionados e a mistura agitada durante cerca de 1 hora na temperatura ambiente (nem todo o reagente dissolveu e algum precipitado formou-se). Depois de uma breve centrifugação e filtração (0,45 pm) a solução depois é dessalgada em Sephadex G25 Fine (Pharmacia) em PBS (taxa de fluxo de 2 mL/min) produzindo cerca de 11 mg de KLH ativado a 1,5 mg/mL (Bradford). 1 mL do KLH ativado (1,5 mg) é misturado com 1 mL de uma solução a 9 mg/mL em água de huIL-17 derivada de E. coli
39/72 liofilizada (lote BM-E3141/98). A solução permanece clara e é incubada durante 2 horas na temperatura ambiente. A concentração do complexo resultante é de 1,4 mg/mL (medida por Bradford). 1 mL do KLH ativado (1,5 mg) é misturado com 1 mL de huIL-17 de HEK.EBNA (cerca de 3 mg em água; lote En.E-3382/83). A solução permanece clara e é incubada durante 2 horas na temperatura ambiente. A concentração (Bradford) é de 2,9 mg/mL.
[00143] Imunização: O camundongo geneticamente engendrado 27340 (fêmea; MEDAREX Inc, Annandale, NJ) em que os genes da parte variável e constante de imunoglobulina de murino são funcionalmente substituídos por suas contrapartes humanas (Genótipo Tg código 221100-TgH (CMD)++; TgN(Hco7)11952+; TgH(JKD)++;
TgN(KCO5)9272+ (ver também Sherie L. Morrison, 1994, Nature, vol. 368, página 812-813; Nils Lonberg et al., 1994, Nature, vol. 368, página 856-859) é imunizado seguindo o esquema relatado na tabela 1.
Tabela 1. Programa de imunização
Dia Dados Imunógeno Dose e via de imunização
0 07.06.01 HuIL-17 (BM-E3141/98) ligada a KLH misturado 1:1 com huIL-17 (BM-E3141/98) em adjuvante Gerbu 25 pg de cada s.c. em dois pontos; volume total/camundongo com adjuvante de 100 pL
14 21.06.01 HuIL-17 (BM-E3141/98) ligada a KLH misturado 25 pg de cada s.c. em dois pontos; volume to-
(1o reforço) 1:1 com huIL-17 (En.E-3382/83) ligado a KLH em adjuvante Gerbu tal/camundongo com adjuvante de 100 pL
28 05.07.01 HuIL-17 (BM-E3141/98) misturada 1:1 com huIL-17 10 pg de cada s.c. em dois pontos; volume to-
(2o reforço) (En.E-3382/83) em adjuvante Gerbu tal/camundongo com adjuvante 100 pL
35 12.07.01 Soros coletados para ELISA
42 19.07.01 HuIL-17 (BM-E3141/98) misturada 1:1 com huIL-17 20 pg de cada s.c. em dois pontos; volume to-
(3o reforço) (En.E-3382/83) ligado a KLH em adjuvante Gerbu tal/camundongo com adjuvante de 100 pL
63 09.08.01 HuIL-17 (BM-E3141/98) ligada a KLH misturado 1:1 20 pg de cada s.c. em dois pontos; volume to-
(4o reforço) com huIL-17 (En.E-3382/83) ligado a KLH em adju- vante Gerbu tal/camundongo com adjuvante 100 pL
40/72
Tabela 1. -continuação-
Dia Dados Imunógeno Dose e via de imunização
91 06.09.01 HuIL-17 (BM-E3141/98) misturada 1:1 com huIL-17 20 pg de cada s.c. em dois pontos; volume to-
(5th reforço) (En.E-3382/83) em adjuvante Gerbu tal/camundongo com adjuvante de 100 pL
99 14.09.01 Soros coletados para ELISA
117 02.10.01 HuIL-17 (En.E-3382/83) 10 pg/camundongo i.v.
HuIL-17 (En.E-3382/83) ligada a KLH 10 pg/camundongo i.p.
118 03.10.01 HuIL-17 (En.E-3382/83) ligada a KLH 10 pg/camundongo i.p.
119 04.10.01 HuIL-17 (En.E-3382/83) ligada a KLH 10 pg/camundongo i.p.
120 05.10.01 fusão
41/72
42/72 [00144] As amostras de soros são obtidas 35 e 99 dias depois do início do protocolo de imunização, para medir os níveis de anticorpo anti-huIL17 pelo ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA).
[00145] Geração de hibridomas: No dia 120, o camundongo 27340 é morto por inalação de CO2. As células do baço totais (1 x 108) são fundidas com células PAI-0 (5 x 107 células) usando PEG 4000. As células fundidas são plaqueadas em 720 cavidades (1 mL/cavidades), contendo uma camada alimentadora de células peritoneais de camundongo (camundongos Balb/c), em meio HAT (RPMI 1640 contendo 2 g/l de Bicarbonato de Sódio, 5 x 10-5 M de β-Mercaptoetanol, 10-4 M de Hipoxantina, 1,6 x 10-5 M de Timidina, 4 x 10-7 M de Aminopterina, 10 % de FCS inativado por calor e 50 pg/mL de Gentamicina). No dia 14, o meio HAT é trocado com meio HT isto é, meio HAT sem Aminopterina. A triagem inicia no dia 10, e dura duas semanas. Dos 720 reservatórios iniciais plaqueados, 684 reservatórios (95 %) são positivos para o crescimento de hibridoma. Os sobrenadantes são coletados e triados quanto ao MAb reativo em huIL-17 em ELISA usando tanto a huIL-17 derivada de E. coli quanto de HEK/EBNA. Cinqüenta e duas cavidades primárias registram positivo quanto à presença de anticorpos anti-huIL17. Vinte e oito hibridomas são clonados e as unidades remanescentes são congelada. A clonagem é feita, em placas microtituladoras de 4 x 96 cavidades, em meio HT e uma camada alimentadora de células peritoneais de camundongo. Os hibridomas são plaqueados em 0,5 célula/100 pL por reservatório. Os reservatórios são triados microscopicamente quanto ao crescimento, e as unidades positivas são alimentadas com 100 pL de meio HT. No seguindo dia, os sobrenadantes são testados quanto à produção de anticorpo em um ELISA específico de huIL-17. Na clonagem, a maioria dos hibridomas clonados mantém a capacidade para secretar o Anticorpo Monoclonal específico anti-huIL17 (MAb).
43/72 [00146] Produção e purificação de anticorpo: Os clones selecionados são transferidos em meio isento de soro (5 mL) em frascos de 25 cm2 de TC (TC: cultura de tecido). Os hibridomas são progressivamente expandidos no meio isento de soro aos frascos de 75 cm2 de TC e frascos cilíndricos. Todo o MAb anti-hu-IL-17 diferente incluindo NVPAIN457-NX (340-110-28 isto é, número de camundongo-número de hibridoma-número de clone) são purificados por cromatografia por afinidade de Proteína A. Os sobrenadantes de cultura são ajustados ao pH 7,3 e carregados em uma coluna de tamanho apropriado de fluxo rápido de Proteína A Sepharose 4 (Pharmacia). Depois da lavagem de valor básico com 100 mM de tampão de fosfato, pH 7,3 os anticorpos ligados são eluídos com 50 mM de citrato, pH 2,7, 140 mM de NaCl. A fração eluída é imediatamente neutralizada (pH 7,0) e filtrada estéril. A concentração da proteína é determinada por absorção a 280 nm usando um fator de unidade de absorção de 1,35 (AU)/mg.
[00147] Atividade inibitória de MAb anti-huIL-17 na produção de IL-6 induzida por huIL-17 em fibroblastos dérmicos humanos: Os fibroblastos dérmicos humanos são cultivados em FBM suplementado com 2 % de FCS, insulina (5 pg/mL) huFGF-básica (0,1 pg/mL) e Gentamicina (50 pg/mL). Os fibroblastos são destacados do plástico usando uma solução de Tripsina/EDTA. Os fibroblastos são distribuídos em placas microtituladoras de 96 cavidades em uma densidade de 1 x 104 células/cavidades em FBM suplementado com 1 % de FCS. Os fibroblastos são deixados aderir às placas durante a noite. Na manhã seguinte o meio é removido e FBM fresco suplementado com 1 % de FCS, huIL-17 (concentrações diferentes variando de 30 a 500 ng/mL) e sobrenadantes de hibridoma (diluição final 1/5) ou anticorpos purificados são adicionados a um volume final de 200 pL. Os sobrenadantes de cultura são coletados depois de uma incubação de 24 h e a produção de huIL-6 é medida por ELISA.
44/72 [00148] ELISA para a detecção de anticorpos anti-huIL-17: As placas microtituladoras de ELISA são revestidas com huIL-17 recombinante (100 pL/cavidade a 3 pg/mL; lote BM-E3141/98 ou En.E3382/82) em PBS a 0,02 % de NaN3 e incubadas durante a noite na temperatura ambiente. No dia seguinte, as placas microtituladoras são bloqueadas com 300 pL de PBS/ 2 % de BSA/0,02 % de NaN3 durante 2 h a 37°C. As placas depois são lavadas 4 vezes co m PBS/0,05 % de Tween 20/0,02 % de NaN3. As diluições do soro de camundongo 27340 (faixa de diluição final no dia 35: 1/100 a 1/3200; faixa de diluição final no dia 99: 1/200 a 1/12800; 100 pL/cavidade) ou sobrenadantes de cultura de hibridomas (diluição final de 1:3; 100 pL/ reservatório) são adicionados. Depois de uma incubação durante a noite na temperatura ambiente, as placas são lavadas 4 vezes com PBS/0,05 % de Tween 20/0,02 % de NaN3. Um anticorpo específico de fragmento Fc, anti-hu-IgG de camundongo conjugado à biotina é adicionado em uma diluição final de 1/20000 (100 pL/reservatório). As amostras são deixadas reagir durante 4 h na temperatura ambiente. Depois da lavagem (4 vezes), estreptavidina conjugada à fosfatase alcalina é adicionada em uma diluição final de 1/8000 (100 pL/reservatório). Depois de 40 minutos na temperatura ambiente, as placas são lavadas novamente 4 vezes e o substrato (p-nitrofenilfosfato em tampão de dietilamino pH 9,8; 150 pL/reservatório) é adicionado. As placas são lidas depois de 30 ou 45 min dependendo do desenvolvimento da reação em um leitor de microtítulo (Bio-Rad) usando filtros de 405 e 490 nm.
[00149] ELISA para a detecção de isótipo de anticorpo: Para revelar o isótipo do MAb, os sobrenadantes de cultura (100 pL; diluição final 1/5) são adicionados aos reservatórios das placas microtituladoras revestidas com huIL-17 (ver acima), e incubados durante a noite na temperatura ambiente. Depois da lavagem (4 vezes), 100 pL/reservatório de MAbs de camundongo conjugado à biotina anti-IgG1 humana (dilui
45/72 ção final 1/1000), IgG2 (diluição final 1/1000), IgG3 (diluição final 1/1000) IgG4 (diluição final 1/2000) ou cadeia leve κ anti-humana (diluição final 1/1000) são adicionados durante 4 h na temperatura ambiente. Como um controle um MAb específico de cadeia leve anticamundongo λ1 e λ2 de rato conjugado à biotina é usado (diluição final 1/1000). Isto é seguido como previamente descrito por lavagem e adição de estreptavidina conjugada à fosfatase alcalina (100 pL; diluição final 1/8000). Depois da lavagem (4 vezes) o substrato (pnitrofenilfosfato em tampão de dietilamino; 100 pL) é adicionado. As placas são lidas depois de 30 ou 45 min dependendo do desenvolvimento da reação, em um leitor de microtítulo (Bio-Rad) usando filtros de 405 e 490 nm.
[00150] ELISA para a detecção da produção de huIL-6: As placas microtituladoras de ELISA são revestidas com um MAb de camundongo anti-huIL-6 (MAB206 de R&D system; 100 pL/reservatório a 4 pg/mL) em PBS a 0,02 % de NaN3 e incubadas durante a noite na temperatura ambiente. No dia seguinte, as placas microtituladoras foram bloqueadas com 300 pL de PBS/2 % de BSA/0,02 % de NaN3 durante 2 h a 37°C. As placas depois foram lavadas 4 vezes com PBS/0,05 % de Tween 20/0,02 % de NaN3. Os sobrenadantes de cultura de fibroblastos dérmicos humanos (diluição final 1:3; 100 pL/reservatório) foram adicionados. Para estabelecer uma curva de titulação huIL-6 (100 pL/reservatório) é titulada de 400 pg/mL a 3,1 pg/mL em etapas de diluição 1:2. Depois de uma incubação durante a noite na temperatura ambiente, as placas são lavadas 4 vezes com PBS/0,05 % de Tween 20/0,02 % de NaN3. Um anticorpo anti-huIL-6 de cabra conjugado à biotina (BAP206; R&D Systems) é adicionado (25 ng/mL; 100 pL/reservatório). As amostras são deixadas reagir durante 4 h na temperatura ambiente. Depois da lavagem (4 vezes), a estreptavidina conjugada à fosfatase alcalina é adicionada em uma
46/72 diluição final de 1/8000 (100 pL/reservatório). Depois de 40 minutos na temperatura ambiente, as placas são lavadas novamente 4 vezes e o substrato (p-nitrofenilfosfato em tampão de dietilamino pH 9,8; 150 pL/reservatório) é adicionado. As placas são lidas depois de 30 min em um leitor de microtítulo (Bio-Rad) usando filtros de 405 e 490 nm. [00151] Cálculos: Os valores são relatados como valores de O.D. originais ou como % de inibição calculada nas médias de valores duplicados. Os dados adicionais são relatados como Médias ± SEM. Uma curva padrão de huIL-6 foi usada para medir a concentração de huIL-6 em sobrenadantes de cultura usando-se uma ajuste de curva cúbico.
Resultados
Títulos do Soro de Camundongo 27340:
Tabela 2. Títulos do soro anti-huIL-17 (camundongo 27340)
Diluição do soro
Valores O.D. (Médias ± SEM)
Dia HulL-
17 lo- 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800
te*
1,795 1,524 1,167 0,854 0,615 0,378
35 E. coli ± ± 0,006 ± ± ± ±
0,022 0,015 0,013 0,005 0,032
2,180 1,875 1,577 1,313 1,031 0,728
HEK/E
± ± 0,005 ± 0,047 ± ± ±
BNA
0,041 0,016 0,011 0,003
2,130 1,913 1,635 1,494 1,125 0,810 0,559
99 E. coli ± 0,078 ± ± ± ± ± ± 0,021
0,075 0,041 0,066 0,001 0,070
47/72
HEK/E
BNA
2,029 1,925 1,716 1,524 ± 0,005 ± 0,030 ± ±
1,259
0,970 0,706
0,012 0,004
0,018 ± ± 0,002
0,036 [00152] As placas microtituladoras foram revestidas com huIL-17 (3 pg/mL) de células de E. coli (BM-E3141/98) ou HEK/EBNA (En.E3382/82).
[00153] O soro do camundongo 27340 é analisado em ELISA quanto à presença de anticorpos anti-huIL-17 nos dias 35 e 99 em duas preparações diferentes de huIL-17 (Tabela 2). Os resultados mostram que os títulos do soro de camundongo 27340 aumentam cerca de quatro vezes entre o dia 35 e dia 99 e que ambas as preparações de huIL17 são reconhecidas.
[00154] Ligação em ELISA de sobrenadantes de hibridoma: 684 sobrenadantes são testados em ELISA quanto à presença de anticorpos anti-huIL-17, usando duas preparações de huIL-17 recombinante, o anterior de E coli (BM-E3141/98) o último de células HEK/EBNA (En.E3382/82). Cinqüenta e dois sobrenadantes registram positivos quanto à presença de anticorpos anti-huIL-17 (Tabela 3). A ligação preferencial a uma ou à outra preparação de huIL-17 é observada em alguns casos. Os 28 hibridomas que são subseqüentemente clonados são sublinhados.
Tabela 3. Reatividade de ELISA dos sobrenadantes de cultura
Lote* de huIL-17
Lote de huIL-17
Hibridoma Valores O.D. Valores O.D. Hibridoma (No) Valores O.D. Valores O.D.
(No) de E. coli de HEK/EBNA de E. coli de HEK/EBNA
1 1,935/1,830 ND 386 1,780/1,812 2,002/1,905
3 1,928/1,928 2,026/1,956 435 2,194/2,139 2,221/2,169
5 1,386/1,471 2,099/2,042 439 1,180/1,236 1,442/1,470
59 1,917/2,078 2,342/2,384 444 1,034/1,066 1,166/1,138
66 1,629/1,619 ND 450 2,060/2,209 2,079/2,237
104 2,650/2,716 2,439/2,366 477 1,392/1,348 1,515/1,524
106 1,329/1,371 1,362/1,465 496 2,131/2,078 2,569/2,798
110 2,355/2,363 2,425/2,497 504 1,755/1,559 ND
112 0,789/0,857 1,154/1,208 543 2,332/2,455 2,370/2,381
116 1,656/1,652 ND 544 1,145/1,196 1,187/1,201
128 1,244/1,669 0,714/0,695 548 0,728/0,750 0,891/0,909
142 1,192/1,322 0,847/0,810 552 0,824/0,811 0,969/0,943
173 1,899/2,108 1,966/2,023 557 2,241/2,326 2,347/2,483
182 0,948/0,903 0,874/0,866 564 0,628/0,675 0,808/0,820
190 2,249/2,084 2,150/2,139 566 1,092/1,068 1,239/1,152
48/72
Tabela 3. -continuação-
Lote* de huIL-17 Lote de huIL-17
Hibridoma Valores O.D. Valores O.D. Hibridoma (No) Valores O.D. Valores O.D.
(No) de E. coli de HEK/EBNA de E. coli de HEK/EBNA
196 1,406/1,305 1,797/1,752 577 1,018/0,928 1,226/1,206
216 1,120/1,146 1,114/1,128 597 0,781/0,821 1,117/1,121
234 1,890/1,990 ND 612 1,935/1,777 2,033/1,989
277 1,674/1,640 ND 622 2,121/2,230 2,592/2,277
285 0,678/0,789 0,735/0,784 627 1,000/1,077 1,203/1,209
298 2,475/2,677 2,340/2,358 649 1,335/1,389 1,311/1,337
305 1,721/1,789 0,602/0,634 658 1,218/1,297 1,415/1,437
319 1,111/1,073 1,223/1,202 674 1,112/1,087 1,134/1,127
328 1,738/1,762 1,869/1,835 686 1,447/1,549 1,730/1,646
343 2,478/2,702 2,302/2,448 705 1,899/1,803 1,870/1,872
373 1,200/1,194 1,212/1,233 720 2,249/2,420 2,383/2,385
49/72 *As placas são revestidas com huIL-17 recombinante (3 pg/mL) de células de E. coli (BM-E3141/98) ou HEK/EBNA (En.E3382/82). Os sobrenadantes são testados na diluição final de 1.
50/72 [00155] Ligação em ELISA de sobrenadantes de cultura dos clones de hibridom a: A reatividade em ELISA dos sobrenadantes dos clones dos 11 hibridomas, que mantinha a melhor produção de MAb antihuIL-17, é mostrada na Tabela 4. Os clones, realçados em negrito, foram selecionados para produzir ~ 1 litro de sobrenadante em frascos cilíndricos para a purificação e análise dos anticorpos. Com a exceção dos clones derivados do hibridoma No 5, que produziram um anticorpo de huIgG3K, todos os outros clones produziram MAb de huIgG1K, como avaliado pelos anticorpos monoclonais específicos de isótipo.
Tabela 4. Reatividade de ELISA de sobrenadantes de cultura quanto a hu-IL-17.
Clone Valores O.D, Clone Valores O.D, Clone Valores O.D,
(No) de Sobrena- (No) de Sobrena- (No) de Sobrena-
dantes* dantes* dantes*
3-2 2,198/1,940 106-1 1,244/1,306 543-4 1,003/0,913
3-20 1,909/1,939 106,2 1,203/1,138 543-16 0,795/0,717
3-21 1,873/1,812 106-3 1,176/1,166 557-6 0,879/0,940
5-18 1,240/1,168 110-7 1,535/1,393 557-36 0,980/0,925
5-22 1,340/1,396 110-28 1,376/1,370 557-37 1,104/1,109
5.29 1,316/1,354 305-21 1,484/1,518 622-2 0,923/0,894
5.31 1,227/1,302 305-38 1,669/1,858 622-5 1,070/1,032
5-40 1,364/1,543 343-1 1,351/1,375 622-6 0,980/0,953
104-2 1,385/1,299 439-80 2,506/2,543 658-2 0,744/0,744
104-4 1,085/1,044 450-13 1,568/1,610 658-6 0,769/0,772
104-9 1,488/1,304 450-23 1,658/1,667 658-16 0,741/0,758
104- 1,670/1,380 543-1 1,074/0,991
[00156] As placas microtituladoras são revestidas com huIL-17 recombinante (3 pg/mL) de células HEK/EBNA (En.E-3382/82).
[00157] Atividade neutralizante de sobrenadantes de cultura: Os
51/72 sobrenadantes de cultura são testados quanto à inibição da produção de huIL-6 por fibroblastos dérmicos humanos estimulados com huIL-17 recombinante. Como mostrado na Tabela 5, a maioria dos sobrenadantes de cultura apresentam atividade inibitória.
Tabela 5. Inibição da produção de IL-6 induzida por huIL-17 em fibroblastos dérmicos humanos por sobrenadantes de cultura
Inibição da produção de IL-6 (%)
Clone (No) Quantidade de huIL-17 usada como estímulo (ng/mL)
62,5 125 250 500
3-20 86,3 75,0 33,1 23,2
5-40 23,3 41,4 20,3 19,0
104-11 47,7 48,5 22,2 16,3
106.1 61,6 19,8 5,7 9,8
110-28 99,8 92,5 88,6 61,3
305-38 47,2 47,1 36,6 23,7
343-1 96,8 102,4 90,5 66,4
450-23 51,7 48,5 47,5 26,6
543.4 -6,0 -12,0 -6,5 -7,1
622-2 34,0 23,2 20,3 18,4
658-16 34,4 27,7 12,7 18,8
[00158] Atividade neutralizante de AIN45: Seleção do clone 110-
para a produção do desenvolvimento de AIN457 candidato (modalidade preferida da invenção) é fundamentada na atividade neutralizante e medição da afinidade em BIACORE 2000 dos anticorpos purificados (ver o Exemplo 2 abaixo).
Exemplo 2: AIN457 liga-se com afinidade muito alta à IL-17 humana recombinante (huIL-17); a KD é 122 ± 22 pM (BIAcore) e neutraliza a produção de IL-6 humana induzida por huIL-17 em fibroblasto dérmico humano; IC50 é 2,1 ± 0,1 nM em uma concentração de 1,87 nM de
52/72 huIL-17
Métodos [00159] Reagentes: Os reagentes de laboratório gerais são adquiridos da Merck ou Sigma e são do grau de pureza mais alto disponível; as fontes de reagentes de especialização são detalhadas abaixo.
[00160] Proteínas: Os anticorpos monoclonais são gerados por camundongos transgênicos MEDAREX imunizantes com IL-17 humana recombinante, e depois seguindo o procedimento padrão para produzir as linhagens de célula, das quais o material secretado poderia ser purificado por cromatografia de Proteína A Sefarose [essencialmente como descrito no exemplo 1). O AIN457 é armazenado como uma solução filtrada estéril em 50 mM de citrato de Na, pH 7,0, 140 mm de NaCl a 4°C. O AIN457 humano recombinante (lote KB03 303A) é obtido em solução de estoque estéril de 20 mM de citrato de Na/40 mM de tampão de fosfato, pH 7, 150 mM de NaCl ou 20 mM de ácido acético pH 5,5 ajustado com 1 M de base Tris. As concentrações estão usualmente na faixa de 2 mg/mL e diluídas a uma concentração final de 5 pg/mL em tampão de BIA (20 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,05 % v/v de Tween-20) para os experimentos de Biacore.
[00161] A IL-17 humana recombinante é produzida internamente; lote En/E 3882/83; 0,29 mg/mL.
Medições de BIAcore [00162] A determinação dos parâmetros e níveis de ligação cinéticos de reatividade cruzada são feitos por medições de ressonância de plasmon de superfície usando o biossensor óptico BIAcore 2000 (BIAcore AB, Upsalla, Sweden, ver Lit. HS 1,2 para detalhes). Esta tecnologia permite a determinação isenta de rótulo das constantes de taxa microscópica para a ligação (kon) e dissociação (koff) de um ligando a um receptor. Portanto ela é especialmente apropriada para caracterizar as interações anticorpo-antígeno. Esta tecnologia complementa e é
53/72 em muitos aspectos superior às medições de ELISA (Van Regenmortel, Dev Biol (Basel). 2003; 112:141-51.). Os estudos de ligação de IL17 recombinante ao anticorpo AIN457 de IL-17 são realizados em dois modos. No protocolo padrão, o AIN457 é capturado por um anticorpo Fcy anti-humano (Jackson Immunochemicals; Cat. No 109-005-098) que é previamente imobilizado em um chip de sensor CM-5 BIAcore (Research grade). A ligação covalente do anticorpo de captura Fcy é feita com o ‘kit de ligação de Amina' fornecido por BIAcore (BIAcore, Cat. No BR-1000-50). Tipicamente, 3000 RUs de anticorpo de captura são ligados à superfície de dextrano ativada com uma solução de anticorpo anti-Fcy de 30 pg/mL em 10 mM de tampão de Ac, pH 4,5 em uma taxa de fluxo de 5 pL/min que leva a aproximadamente 250 RUs de imobilização de AIN457. Como uma diretriz, 1000 RUs correspondem a uma transferência de massa de 1 ng/mm2. Alternativamente, o anticorpo AIN457 de IL-17 (Seção 3.2; Tabela 4), é ligado diretamente à superfície do chip sem o anticorpo de captura. Os resultados são comparados ao protocolo descrito na Tabela 9 (ver abaixo). Resultados
Cinética de ligação do complexo de IL-17/AIN457 [00163] A constante de dissociação de equilíbrio KD permite algum julgamento sobre a estabilidade dos complexos, uma vez que formados in vivo. Portanto determinou-se as constantes cinéticas para a ligação de IL-17 humana ao anticorpo AIN457 imobilizado, e derivamos a KD para o processo a partir destes dados. A Tabela 3 mostra o resumo dos dados obtidos quando as curvas de 2 experimentos são ajustadas ao modelo de Langmuir usando o software BIAevaluation 3.0. Embora o anticorpo, certamente, seja bivalente, a ligação pode ser tratada como um evento 1:1, com os sítios de ligação de anticorpo individual exibidos na superfície que torna-se ocupada por moléculas de IL17 monoméricas.
54/72 [00164] Este experimento mostra tanto, a associação extremamente rápida assim como a dissociação cinética muito lenta do complexo de anticorpo-quimiocina. O melhor ajuste de dados é obtido quando os sensorgramas são tratados individualmente (ao invés de globalmente, como é sugerido na BIAevaluation.) Assim, depois de combinar a série de titulação obteve-se valores médios de 12 sensorgramas de kon = (4,1 ± 0,1) x105 1/M s; koff = (3,8 ± 0,5) x10-4 1/s; e for KD = 122 ± 22 pM.
Tabela 3. Constantes cinéticas para a ligação 1:1 de IL-17 humana rec a NVP-AIN457
Conc [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] IL-314 Exp.
2 3,31E+05 3,36E-05 1,02E-10 Rodada 1
4 1,28E+05 3,78E-05 2,95E-10
8 3,79E+05 1,86E-05 4,90E-11
12 3,60E+05 3,00E-05 8,33E-11
16 3,52E+05 5,70E-05 1,62E-10
20 3,52E+05 4,15E-05 1,18E-10
2 1,23E+06 1,97E-05 1,60E-11 Rodada 2
4 4,11E+05 1,20E-05 2,92E-11
8 3,78E+05 4,54E-05 1,20E-10
12 3,46E+05 5,13E-05 1,48E-10
16 3,17E+05 5,95E-05 1,88E-10
20 3,34E+05 5,01E-05 1,50E-10
Média 4,10E+05 3,80E-05 1,22E-10 n = 12
SEM 7,73E+04 4,51E-06 2,21E-11
KD média calculada de entradas individuais (verticalmente), ao invés de aplicar a equação KD = koff/kon.
[00165] Para o AIN457 produzido em células recombinantes (KB03303A) as medições de afinidade são realizadas para as citocinas de IL-17 de ser humano, sagüi, macaco reso e cinomolgo, respectiva
55/72 mente. Os detalhes experimentais das medições de Biacore são os mesmos como descrito acima para o anticorpo MAB110-28. Duas rodadas independentes que testam 6 concentrações de IL-17 em cada rodada são realizadas. As concentrações para a IL-17 humana são de 2, 4, 8, 12, 16, 20 nM e 10, 20, 30, 40, 50, 60 nM para todas as outras espécies. A análise de dados completa produz n = 12 medições individuais para cada espécie de IL-17. A KD assim como SEM é relatada.
Tabela 4. Resumo: Constantes cinéticas para a ligação 1:1 de IL-17 humana rec, de sagüi, macaco reso e cinomolgo a NVP-AIN457 (KB03303A)
Espécie Média de KD [M] Rodada 1+2 SEM
Ser humano 0,227 nM +/- 0,03 nM
Sagüi 1,2 nM +/-0,1 nM
Macaco reso 9 nM +/-1 nM
Macaco cinomolgo 6 nM +/- 0,7 nM
[00166] Um conjunto completo de dados da análise BIAcore para o anticorpo KB03303A com kon, koff e KD e as espécies de IL-17 respectivas são dadas abaixo nas tabelas 5 a 8.
Tabela 5. Constantes cinéticas para a ligação 1:1 de IL-17 humana rec a AIN457 (KB03303A)
Cone [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] IL-366/IL-365 Exp.
2 3,37E+05 6,43E-05 1,91E-10 Rodada 1
4 2,59E+05 7,76E-05 2,99E-10
8 2,12E+05 5,21 E-05 2,46E-10
12 2,18E+05 7,38E-05 3,38E-10
16 2,02E+05 7,15E-05 3,54E-10
20 1.92E+05 8,04E-05 4,20E-10
2 5,50E+05 7,01 E-05 1.27E-10 Rodada 2
56/72
4 3,22E+05 3,30E-05 1,02E-10
8 2,85E+05 4,73E-05 1,66E-10
12 2,86E+05 4,84E-05 1,69E-10
16 2,61E+05 3,09E-05 1,18E-10
20 2,58E+05 4,90E-05 1,90E-10
Média 2,82E+05 5,82E-05 2,27E-10 n = 12
SEM 2,77E+04 4,91E-06 3,00E-11
Tabela 6. Constantes cinéticas para a ligação 1:1 de IL-17 de sagüi rec a AIN457 (KB03303A)
Conc [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] IL-366/IL-365 Exp.
10 nM 8,89E+04 7,96E-05 8,95E-10 Rodada 1
20 nM 1,11E+05 8,69E-05 7,82E-10
30 nM 9,82E+04 1,15E-04 1,17E-09
40 nM 9,92E+04 1,16E-04 1,17E-09
50 nM 9,81E+04 1,19E-04 1,21E-09
10 nM 8,83E+04 9,98E-05 1,13E-09 Rodada 2
20 nM 1,10E+05 1,28E-04 1,17E-09
30 nM 9,70E+04 1,52E-04 1,57E-09
40 nM 9,66E+04 1,31E-04 1,36E-09
50 nM 9,52E+04 1,59E-04 1,67E-09
Média 9,83E+04 1,19E-04 1,21E-09 n = 10
SEM 2,36E+03 8,09E-06 ±0,1
Tabela 7. Constantes cinéticas para a ligação 1:1 de IL-17 de macaco reso rec a AIN457 (KB03303A)
Conc [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] IL-366/IL-365 Exp.
10 1,70E+05 3,89E-04 2,28E-09 Rodada 1
20 6,73E+04 4,94E-04 7,34E-09
30 5,86E+04 3,54E-04 6,04E-09
40 3,27E+04 4,05E-04 1,24E-08
57/72
50 4,05E+04 4,55E-04 1,12E-08
60 3,50E+04 4,60E-04 1,31E-08
10 5,47E+04 3,85E-04 7,04E-09 Rodada 2
20 4,62E+04 2,74E-04 5,93E-09
30 4,30E+04 3,51E-04 8,16E-09
40 3,76E+04 3,66E-04 9,74E-09
50 3,60E+04 4,32E-04 1,20E-08
60 3,44E+04 4,24E-04 1,23E-08
Média 5,47E+04 3,99E-04 8,96E-09 n = 12
SEM 1,09E+04 1,72E-05 9,70E-10
Tabela 8. Constantes cinéticas para a ligação 1:1 de IL-17 de macaco cinomolgo rec a AIN457 (KB03303A)
Conc [nM] kon [1/Ms] koff [1/s] KD [M] IL-366/IL-365 Exp.
5 nM 3,27E+05 3,60E-04 1,10E-09 Rodada 1
10 nM 1,79E+05 4,02E-04 2,24E-09
15nM 1,03E+05 5,67E-04 5,50E-09
20 nM 1,10E+05 5,23E-04 4,75E-09
25 nM 9,23E+04 5,78E-04 6,26E-09
30 nM 9,05E+04 7,14E-04 7,89E-09
5 nM 7,18E+04 5,08E-04 7,08E-09 Rodada 2
10 nM 9,70E+04 6,69E-04 6,90E-09
15 nM 1,03E+05 7,66E-04 7,41E-09
20 nM 1,02E+05 7,32E-04 7,17E-09
25 nM 1,02E+05 7,47E-04 7,34E-09
30 nM 1,00E+05 8,34E-04 8,32E-09
Média 1,23E+05 6,17E-04 6,00E-09 n = 10
SEM 1,99E+04 4,34E-05 6,52E-10
[00167] Subsequentemente a atividade inibitória de AIN457 purificado (Lote En/E-10333/53; 0,54 mg/mL) em huIL-17 é avaliada. Os valores de IC50 são mostrados na Tabela 6. Nestes experimentos,
58/72 huIL-17R/Fc e um MAb de camundongo anti-huIL-17 são incluídos como controles positivos e Simulect como controle negativo.
Tabela 9. Neutralização de hu-IL-17 pelo MAb AIN457 anti-huIL-17
humano em comparação com IL-17R/Fc, e um MAb anti-huIL-17 de
camundongo (R&D System).
AIN457 IL-17 R/Fc MAB 317
IC50 ± SEM IC50 ± SEM IC50 ± SEM
(n = 3*) (n = 3) (n = 3)
huIL-17 recombi- 2,071 ± 0,116 1,713 ± 0,305 12,226 ± 2,050
nante @ 1,87 nM (30 ng/mL) nM nM nM
[00168] *As médias e SEM são calculados a partir de três experimentos diferentes e independentes.
[00169] Em conclusão, AIN457 anula a secreção dependente de IL17 de huIL-6 por fibroblastos dérmicos humanos. A potência é comparável àquela de huIL-17R/Fc e superior àquela de um MAb de camundongo anti-huIL-17 comercialmente disponível. É interessante notar que uma inibição mais completa é observada com AIN457 do que com IL-17R/Fc.
Exemplo 3: Pureza e sequências de aminoácido parciais de cadeia pesada e leve
Sequenciamento de aminoácido [00170] Sequências de aminoácido de terminal amino de regiões VL e VH: Os primeiros 48 resíduos de aminoácido da cadeia pesada e leve para dois anticorpos anti-IL-17A, clone 110-7 (ver a tabela 4) e 11028 (ver a tabela 4), são determinados por degradação de Edman. A sequência de aminoácido é idêntica para ambos os clones. O GeneBank é pesquisado por análise de explosão e a mais homóloga sequência de DNA encontrada é usada para designar os iniciadores de
59/72 clonagem.
[00171] Clonagem molecular das regiões VL e VH: O RNA total é preparado a partir de 2 x 107 células de hibridoma (clone 110-7, clone 110-28) com o Kit RNeasy Midi de acordo com o protocolo do vendedor (Quiagen Hilden Germany). O RNA total é eluído em 200 pL de água isenta de RNase e armazenado a -80°C. A primei ra síntese de cDNA de filamento é realizada com transcriptase reversa de M-MLV (Promega, Madison, WI), iniciador oligo-dT, mistura de nucleotídeo de PCR (dNTPs) e inibidor de RNAsin (Roche, Mannheim). Cinco pg de RNA total são misturados com 1 pL de iniciador oligo-dT (0,5pg/pL), e a água isenta de RNase é adicionada a um volume final de 36 pL. A mistura é incubada a 70°C durante 10 minutos e depois armazenada em gelo. Enquanto em gelo, os reagentes seguintes são adicionados: 10 pL 5x tampão de RT, 2 pL de dNTPs (10 mM cada), 2 pL de RNasin e 1 pL de transcriptase reversa de M-MLV. A reação é realizada a 42°C durante 1 hora.
[00172] A reação de PCR é montada usando 4 pL de padrão de cDNA, 2 pL de cada iniciador em 10 pM cada (ver abaixo e as Tabelas 10 e 11 para a visão geral) 20 pL de 2x Qiamix (contendo Tampão, dNTP's, TAQPolimerase) e 1 pL de Pwo DNA polimerase em um volume total de 40 pL. As condições de PCR são ajustadas para 35 ciclos de 94°C durante 15 segundos, 55°C durante 20 s egundos e 72°C durante 30 segundos. O produto de PCR é subclonado no vetor de clonagem pCR4-TOPO-Zero (Stragagene, La Jolla, Ca.). Vários clones são selecionados de cada reação e a sequência de nucleotídeo determinada por Solvias AG (Basel), usando os iniciadores MV432 (SEQ ID NO: 21), MV433 (SEQ ID NO: 22), MV434 (SEQ ID NO: 23), MV435 (SEQ ID NO: 14), e iniciadores padrão no DNA vetorial.
[00173] O cDNA que codifica a cadeia pesada é ampliado usando os pares de iniciador MV416 (SEQ ID NO: 15)/ no 265 (SEQ ID NO:
60/72
16) e MV418 (SEQ ID NO: 17)/no 265 (SEQ ID NO: 16). Os iniciadores envolvem as sequências de nucleotídeo correspondendo às posições de aminoácido seguintes da cadeia pesada: posição de MV416 -19/-13 (peptídeo de sinal); posição de MV418 +1/+7; posição no 265 +253/+259. A posição +1 é o primeiro aminoácido da proteína madura. [00174] O cDNA que codifica a cadeia leve é ampliado usando os pares de iniciador MV417 (SEQ ID NO: 18)/ no 223 (SEQ ID NO: 19) e MV419 (SEQ ID NO: 20)/ n2 223 (SEQ ID NO: 19). Os iniciadores envolvem as sequências de nucleotídeo correspondendo às posições de aminoácido seguintes da cadeia leve: posição de MV417 -20/-14 (peptídeo de sinal); posição de MV419 +1/+7; posição no 223 +210/+215. Este método permitiu fazer duas amplificações de PCR independentes para cada cadeia de imunoglobulina, resultando em duas sequências de DNA independentemente estabelecidas.
Resultados e Debate [00175] Os produtos de PCR clonados que codificam a cadeia pesada e leve dos dois hibridomas (110-7 e 110-28, ver a tabela 4 acima) são caracterizados pelo sequenciamento de DNA. Cinco e seis sequências independentes são usadas para montar as sequências de cadeia leve e pesada. Os cDNAs de cadeia leve são todos idênticos e envolvem a sequência de codificação inteira (posição de aminoácido 20 a +215). Os cDNAs de cadeia pesada tiveram 2 ligações imperfeitas diferentes em um cDNA cada. Estes são excluídos da sequência final, que estende-se do códon de iniciação à extremidade da região da dobradiça depois do domínio constante 1 (posição de aminoácido 19 a +238). As sequências para ambos os hibridomas são idênticas. O cDNA obtido do hibridoma 110-28 é selecionado e usado para todo o outro trabalho de expressão. SEQ ID NO: 7 (cDNA de cadeia pesada de AIN457), SEQ ID NO: 8 (sequência de aminoácido de cadeia pesada de AIN457), SEQ ID NO: 9 (cDNA de cadeia leve de AIN457) e
61/72
SEQ ID NO: 10 (sequência de aminoácido de AIN457) mostram a sequência de DNA que codifica a cadeia leve e pesada de AIN457, junto com a sequência de proteína e a posição dos iniciadores usados para a amplificação de PCR e sequenciamento de DNA. As sequências de DNA foram registradas em PlasNova, número de acesso NPL003689 para a cadeia pesada, e número de acesso NPL003690 para a cadeia leve.
[00176] A sequência de aminoácido encontrada pela clonagem de cDNA é idêntica àquela previamente obtida por degradação de Edman das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina purificada, indicando que o cDNA correto foi clonado.
Tabela 10: Sequência de nucleotídeo e aminoácido da cadeia leve [00177] A sequência de aminoácido que codifica o domínio variável está em negrito e sublinhado. Os iniciadores de oligonucleotídeo usados para a clonagem são indicados (sublinhado).
MV417 ACCATGGAAACCCCAGCGGAGCTTCCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACC
---------+---------+---------+---------+ +---------+ 60
TGGTACCTTTGGGGTCGCCTCGAAGGAAGGAGGACGATGAGACCGAGGGTCTATGGTGG
T M E T P A E L L
F L L L L W L
MV419 GGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCC
---------+---------+---------+---------+ +---------+ 120
CCTCTTTAACACAACTGCGTCAGAGTCCGTGGGACAGAAACAGAGGTCCCCTTTCTCGG
62/72
G E I V L T Q SP G T L SL SP G E
RA ACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGATGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAG
121 ---------+---------+---------++
- ++ 180
TGGGAGAGGACGTCCCGGTCAGTCTACAATCGTCGTCGATGAATCGGACCATGGTCGTC
T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y
Q Q AAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATC
181 ---------+---------+---------++
- ++ 240
TTTGGACCGGTCCGAGGGTCCGAGGGTAGATACCACGTAGGTCGTCCCGGTGACCGTAG
K P G Q A PR L L I Y G A S SR A T
GI CCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTG
241 ---------+---------+---------++
- ++ 300
GGTCTGTCCAAGTCACCGTCACCCAACCCTGTCTGAAGTGAGAGTGGTAGTCGTCTGAC
P D R F S G S G S G T D FT LT IS
RL 63/72
GAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTCTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGTGCACCTTC
01 — — — —---1— — — —---1— — — —---1---— — — —+
- ++ 360
CTCGGACTTCTAAAACGTCACATAA—
GACAGTCGTCATACCATCGAGTGGAGCGTGGAAG
E PE D F AV Y Y CQ Q Y G S S PC
TF —
GGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGAACTGTGGCTGCAC—
361 — — — —---1— — — —---1— — — —---1---— — — —+ — ++ 420
CCGGTTCCCTGTGCTGACCTCTAATTTGCTTGACACCGACGTGGTAGACA—
GAAGTAGAAG
G Q G T R L E I K R T V AA P S V F
I F —
CCGCCATCTGATGAG—
CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAAC
421 ---------+---------+---------+---------+ — +---------+ 480
GGCGGTAGACTACTCGTCAACTTTAGACCTTGACGGAGACAACACACGGAC—
P P S D E Q L K S G T A S V V C L L
N N —
64/72
TTCTATCC CAGAGAGGC CAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC
481 ---------+---------+---------+---------+
- +---------+ 540
AAGATAGGGTCTCTCCGGTTTCATGTCACCTTCCACCTATTGCGGGAGGTTAGCCCATTG
F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S
G N TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCA
GCAGCACC
541 ---------+---------+---------+---------+
- +---------+ 600
AGGGTCCTCTCACAGTGTCTCGTCCTGTCGTTCCTGTCGTGGATGTCGGAGT
CGTCGTGG
S Q E S V T E QD SK D S T Y S L S
S T CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCAT
601 ---------+---------+---------+---------+
-+---------+ 660
GACTGCGACTCGTTTCGTCTGATGCTCTTTGT*GTTTCAGATGCGGACGCTTCAGTGGGTA
L T L SK A D Y E K H K V Y A C E V
T H CAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
661 ---------+---------+---------+---------+-------+- 711
65/72 #223 GTCCCGGACTCGAGCGGGCAGTGTTQ G L SS P V T K SF N R G E C *
Tabela 11: Sequência de nucleotídeo e aminoácido da cadeia pesada [00178] A sequência de aminoácido que codifica o domínio variável está em negrito e sublinhado. Os iniciadores de oligonucleotídeo usados para a clonagem e sequenciamento são indicados.
MV416 ACCATGGAATTGGGGCTGAGCTGGGTTTCCTTGTTGCTATTTTAGAAGGTGTCCACTGT
---------+---------+---------+---------+ +---------+ 60
TGGTACCTTAACCCCGACTCGACCCAAAGGAACAACGATAAAATCTTCCACAGGTGACA
T M E LG L S W V F L V A I L E GV
H C MV418 GAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
---------+---------+---------++ ++ 120
CTCCACGTCAACCACCTCAGACCCCTCCGAACCAGGTCGGACCCCCCAGGGACTCTGAG
E V Q L V E S G G G L V Q P G G SL
RL TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTAGTAACTATTGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCT
121 ---------+---------+---------+---------+
66/72
- +---------+ 180
AGGACACGTCGGAGACCTAAGTGGAATCATTGATAACCTACTTGACCCAGGCGGTCCGA
S C A A S G F T F S N Y W M N W V R
Q A CCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTGGCGCCATAAACCAAGATGGAAGTGAGAAATACTAT
181 ---------+---------+---------++
- ++ 240
GCGGTATTTGGTTCTACCTTCACTCTTTATGATA
P G K G L E W VA A I N Q D G S EK
YY GTGGGCTCTGTGAAGGGCCGATTCACATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTAT
241 ---------+---------+---------++
- ++ 300
CACCCGAGACACTTCCCGGCTAAGTGTAGAGGTCTCTGTTGCGGTTCTTGAGTGACATA
V G S V K G R FT IS R D N A K N S
LY MV432 CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGGGACTAT
301 ---------+---------+---------+---------+
GACGTTTACTTGTCGGACTCTCAGC- +---------+ 360
67/72
CCTGTGCCGACACATAATGACACACTCCCTGATA
L Q M N S L R V E D T A V Y Y C V R DY TACGATATTTTGACCGATTATTACACCACTATTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGC
361 — — — —---1— — — —---1— — — —---1---— — — —+
- ++ 420
ATGCTATAAAACTGGCTAATAATGTGGTGATAACCATGAAGCTAGAGACCCCGGCACCG
Y D I LT DY Y I H Y W Y F D L W G
RG —
MV433 ACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGCCTCCAC —
CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCC
421 ---------+---------+---------++ — ++ 480
MV434 TGGGACCAGTGACAGAGGAGTCGGAGGTGGTTCCCGGGTAGCCAGAAGGGGGACCGTGGG
T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P —
TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG— GACTACTTC
481 —————————+—————————+—————————+—————————+ — +---------+ 540
AGGAGGTTCTCGTGGAGACCCCCGTGTCGCCGGGACCCGACGGAC—
CAGTTCCTGATGAAG
S SK S T S G G T AA L G C L V K D
Y F —
68/72
CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC
541 ---------+---------+---------+---------+
- +---------+ 600
GGGCTTGGCCACTGCCACAGCACCTTGAGTCCGCGGGACTGGTCGCCGCACGTGTGGAAG
P E P V T V S WN S G A L T S G V H
T F CCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC
601 ---------+---------+---------+---------+
-+---------+ 660
GGCCGACAGGATGTCAGGAGTCCTGAGATGAGGGAGTCGTCGCACCACTGGCACGGGAGG
P AV LQ SS G L Y S L SS VV T V
P S AGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAG
661 ---------+---------+---------+---------+
- +---------+ 720
MV435 TCGTCGAACCCGTGGGTCTGGATGTAGACGTTGCACTTAGTGTTCGGGTCGTTGTGGTTC
S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N
T K GTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA69/72
CATGCCCACCGTGCCCA
721 ---------+---------+---------+---------+
- +---------+ 780 #265 CACCTGTTCTCTCAACTCGGGTTTAGAACACTGTTTTGAGTGTGTACGGGTGGCACGGGT
V D K R V E P K S CD K TH T C P P
C P TAA
781 --- 783 *
Exemplo 4: Estrutura tridimensional do fragmento Fab do anticorpo monoclonal anti IL-17A humana AIN457 [00179] De modo a determinar a conformação das regiões que determinam complementaridade (CDR's) e a estrutura do sítio de ligação de antígeno de AIN457, o fragmento Fab é gerado, cristalizado e sua estrutura de raio X é determinada por cristalografia de proteína.
[00180] Método: O fragmento Fab de NVP-AIN457 é produzido por clivagem de papaína a partir do anticorpo total e purificado por cromatografia de proteína A seguido por cromatografia de exclusão de tamanho. O material purificado depois é concentrado por ultrafiltração a 20 mg/mL em 10 mM de Tris-HCl pH 7,4, 25 mM de NaCl, 5 mM de TCEP. Os cristais são cultivados por técnica de difusão de vapor em gotas de suspensão a 19°C, de 2,0 M de sulfato de amônio, 5 % de PEG 400, 0,1 M de Na MES pH 6,5. Eles estão em grupo de espaço P212121 com dimensões de célula unitária a = 90,3 A, b = 106,7 A, c = 131,4 A e 2 moléculas Fab por unidade assimétrica. Antes da coleta de dados de raio X, um único cristal de AIN457 Fab é reticulado com
70/72 glutaraldeído usando o método de Lusty (J. Appl. Cryst. (1999) 32, 106-112) e depois transferido a uma solução contendo 2,0 M de Li2SO4, 2 % de PEG 400, e 0,1 M de Na MES pH 6,5. O cristal é subsequentemente montado em uma crio-alça e congelado instantaneamente para a coleta de dados em 95K. 180 imagens de difração correspondendo à oscilação de 1,0 grau cada são registradas. Os dados de difração são processados com o conjunto de programa HKL. A estrutura é determinada à resolução de 2,5 A por substituição molecular. A estrutura depois é refinada por dinâmica de ângulo de torção e minimização de energia usando o programa CNX.
[00181] Resultados: Duas moléculas Fab de AIN457 estão presentes na unidade assimétrica do cristal, com a alça H-CDR3 de ambas as moléculas Fab envolvida em contatos de proteína-proteína à alça H-CDR3 de Fabs relacionados à simetria. As duas moléculas Fab apresentam diferente ângulos de cotovelo mas têm de outro modo conformações de alça de CDR essencialmente idênticas (ver a tabela 12 para a sequência de aminoácido das alças de CDR). A alça de HCDR1 adota a estrutura canônica de H1:1 esperada, enquanto que a conformação da alça de H-CDR2 iguala-se àquela da estrutura canônica H2:3A. A alça de H-CDR3 do anticorpo AIN457 é excepcionalmente longa, compreendendo 18 resíduos entre as posições de Kabat 94 (Arg H98) e 101 (Asp H115). Ela mostra a estrutura de torso abaulada típica estabilizada por uma ponte de sal entre a cadeia lateral de Arg na posição 94 (Arg H98) e o grupo carboxilado de Asp na posição H101 (Asp H115), e por uma interação ligada a H entre a cadeia lateral de Trp H117 e o grupo carbonila de cadeia principal de Phe H114. A cabeça da alça de H-CDR3 tem a estrutura de um grampo de cabelo em beta torcido, longo, com um segunda protuberância em beta em sua base e um giro beta tipo I' em seu pico. Uma característica notável da alça de AIN457 H-CDR3 é seu conteúdo muito alto em resíduos
71/72 aromáticos: 6 tirosinas, 2 triptofanos, 1 fenilalanina. Visto que todas as outras alças de CDR contribuem com 1 tirosina a mais cada, o sítio de combinação de antígeno de AIN457 possui 11 tirosinas no total. As conformações das alças de L-CDR1 e L-CDR2 correspondem às estruturas canônicas L1:6 e L2:1, respectivamente. Ao contrário de HCDR3, a alça de L-CDR3 é curta (6 resíduos) e mostra a estrutura canônica comumente observada L3:1, com uma cis-prolina em seu tip (Pro L96), uma glutamina na posição de Kabat 90 (Gln L91) e uma treonina na posição de Kabat 97 (Thr L98). Entretanto, uma característica muito incomum da alça de AIN457 L-CDR3 é a presença de um resíduo de cisteína depois da cis-prolina (Cys L97). A cadeia lateral de Cys L97 está no fundo de uma depressão rasa localizada na interface VL-VH e alinhada por resíduos Trp H112, Trp H47 e Tyr L92.
Tabela 12:
Cadeia leve
L-CDR1 definição de Kabat R-A-S-Q-S-V-S-S-S-Y-L-A
Chothia/ definição de raio X R-A-S-Q-S-V-S-S-S-Y-L-A
L-CDR2 definição de Kabat G-A-S-S-R-A-T
Chothia/ definição de raio X G-A-S-S-R-A-T
L-CDR3 definição de Kabat Q-Q-Y-G-S-S-P-C-T
Chothia/ definição de raio X Q-Q-Y-G-S-S-P-C-T
H-CDR1 definição de Kabat N-Y-W-M-N
Chothia/ definição de raio X g-f-t-f-s-n-y-w-m-n
H-CDR2 definição de Kabat A-I-N-Q-D-G-S-E-K-Y-Y-V-G- S-V-K-G
Chothia/ definição de A-I-N-Q-D-G-S-E-K-Y-Y
72/72
raio X
H-CDR3 definição de Kabat D-Y-Y-D-I-L-T-D-Y-Y-I-H-Y-W- Y-F-D-L
Chothia/ definição de raio X C-V-R-D-Y-Y-D-I-L-T-D-Y-Y-I- H-Y-W-Y-F-D-L-W-G
Tabela 1: As sequências de aminoácid o das regiões hipervariáveis dos
anticorpos monoclonais AIN457, com base na definição de Kabat e como determinado pela análise de raio X, usando o método de Chothia e colaboradores. O aminoácido realçado em negrito é parte das alças de CDR, enquanto que aqueles mostrados em estilo sem formatação são parte da estrutura do anticorpo.

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo IgG que se liga a IL-17 humana, caracterizado pelo fato de que compreende tanto uma cadeia pesada quanto uma cadeia leve, (a) em que a cadeia pesada compreende uma região constante de cadeia pesada e uma região variável de cadeia pesada (VH), em que VH compreende, em sequência:
    (i) as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, a referida CDR1 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2, e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, em que as referidas regiões hipervariáveis são de acordo com a definição de Kabat; ou (ii) as regiões hipervariáveis CDR1-x, CDR2-x e CDR3-x, a referida CDR1-x tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11, a referida CDR2-x tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12, e a referida CDR3-x tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13, em que as referidas regiões hipervariáveis são de acordo com a definição de Chothia; e (b) em que a cadeia leve compreende uma região constante e uma região variável de cadeia leve (VL), em que VL compreende, em sequência, regiões hipervariáveis CDR1', CDR2' e CDR3', a referida CDR1' tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, a referida CDR2' tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, e a referida CDR3' tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6.
  2. 2. Anticorpo anti-IL-17, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de é um anticorpo humano.
  3. 3. Anticorpo anti-IL-17, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreende uma VH tendo uma
    Petição 870180160934, de 10/12/2018, pág. 13/193
    2/3 sequência de aminoácidos como mostrada na SEQ ID NO: 8 e uma Vl tendo uma sequência de aminoácido como mostrada na SEQ ID NO:
    10.
  4. 4. Anticorpo anti-IL-17, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo IgG1/Capa humano compreendendo:
    (a) uma cadeia leve consistindo dos resíduos de aminoácidos
    E I V L T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D F A V Y Y C Q Q Y G S S P C T F G Q G T R L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T
    K S F N R G E c; e (b) uma cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácidos
    E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S N Y W M N W V R Q A P G K G L E W V A A I N Q D G S E K Y Y V G S V K G R F T I S R D N A K N S L Y L Q M N S L R V E D T A V Y Y C V R D Y Y D I L T D Y Y I H Y W Y F D L W G R G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C P .
    Petição 870180160934, de 10/12/2018, pág. 14/193
    3/3
  5. 5. Composição líquida, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-IL-17, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em combinação com um tampão.
    Petição 870180160934, de 10/12/2018, pág. 15/193
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