BRPI0514068B1 - anticorpo anti-cd20, e, composição farmacêutica - Google Patents

anticorpo anti-cd20, e, composição farmacêutica Download PDF

Info

Publication number
BRPI0514068B1
BRPI0514068B1 BRPI0514068A BRPI0514068A BRPI0514068B1 BR PI0514068 B1 BRPI0514068 B1 BR PI0514068B1 BR PI0514068 A BRPI0514068 A BR PI0514068A BR PI0514068 A BRPI0514068 A BR PI0514068A BR PI0514068 B1 BRPI0514068 B1 BR PI0514068B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
region
variant
antibody
polypeptide
amino acid
Prior art date
Application number
BRPI0514068A
Other languages
English (en)
Inventor
Allan Barrett
Dean Watkins Jeffry
Jiang Weidong
Tang Ying
Original Assignee
Applied Molecular Evolution Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Molecular Evolution Inc filed Critical Applied Molecular Evolution Inc
Priority to BR122018016031A priority Critical patent/BR122018016031B8/pt
Publication of BRPI0514068A publication Critical patent/BRPI0514068A/pt
Publication of BRPI0514068B1 publication Critical patent/BRPI0514068B1/pt
Publication of BRPI0514068B8 publication Critical patent/BRPI0514068B8/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

polipeptídeo, anticorpo monoclonal, processos para produzir um anticorpo monoclonal variante e um polipeptídeo variante, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, anticorpo anti-cd2o a presente invenção fornece polipeptídeos, particularmente anticorpos terapêuticos, compreendendo uma nova região fc variante. além disso a invenção fornece regiões fc variantes que conferem uma função efetora alterada ou meia vida no soro alterada em um polipeptídeo ao qual ela é operavelmente ligada.

Description

(54) Título: ANTICORPO ANTI-CD20, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA (73) Titular: APPLIED MOLECULAR EVOLUTION, INC., Sociedade Norte Americana. Endereço: 3520 Dunhill Street San Diego 92121 CA, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: BARRETT ALLAN; WEIDONG JIANG; YING TANG; JEFFRY DEAN WATKINS.
Código de Controle: EE61BB6B085B6369 A57ACB72DEB08D59
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 27/11/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 27/11/2018
Assinado digitalmente por:
Alexandre Gomes Ciancio
Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados
1/161 “ANTICORPO ANTI-CD20, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”
CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção se refere a polipeptídeos compreendendo uma nova região Fc variante. Especificamente, uma nova região Fc variante da presente invenção compreende pelo menos uma substituição de aminoácido descrita neste lugar que confere uma função efetora alterada ou meia vida no soro alterada em uma imunoglobulina compreendendo a região Fc variante quando comparado à imunoglobulina originária carecendo daquela substituição de aminoácido. Além disso, a invenção fornece um método para alterar uma função efetora de um anticorpo monoclonal ou estender a meia vida no soro de um polipeptídeo ao qual uma região Fc variante da invenção é operavelmente ligada. Usos terapêuticos de polipeptídeos, proteínas, particularmente anticorpos monoclonais, compreendendo uma região Fc variante da invenção são descritos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] Existem pelo menos dezessete anticorpos monoclonais atualmente aprovados nos Estados Unidos para uso como terapêuticos humanos. Adicionalmente, existem diversas centenas de anticorpos monoclonais em experimentações clínicas e milhares em teste pré-clínico para tratamento de várias doenças ou desordens incluindo, e.g., rejeição de transplante, câncer, doenças inflamatórias, sepse, nefrite, mal de Alzheimer, alergias, diabetes, doenças autoimunes, artrite, esclerose múltipla, e doenças infecciosas. O campo de anticorpos monoclonais terapêuticos é localizado para crescimento rápido nos anos seguintes. Depois de vacinas, anticorpos (ou imunoglobulinas, “Ig”) constituem o segundo tipo mais comum de agente biofarmacêutico sendo testado clinicamente (Stockwin, L.H. et al. Biochemical Society Transactions, 31:433-436, 2003).
[0003] Engenharia genética contribuiu substancialmente para crescimento do campo de anticorpos monoclonais terapêuticos. A efetividade de um anticorpo monoclonal terapêutico potencial irá freqüentemente variar com mudanças modestas para a seqüência de proteínas do anticorpo. Uma única mudança de aminoácido na região variável de um anticorpo monoclonal tem o potencial de alterar a afinidade
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 9/174
2/161 com a qual o anticorpo se liga ao epítopo antigênico, assim como propriedades de anticorpo tal como taxa de Kon ou taxa de Κο«- Tais mudanças de aminoácido podem determinar o sucesso ou fracasso de um anticorpo monoclonal como um terapêutico. Similarmente, mudanças modestas na seqüência de aminoácidos da região Fc de um anticorpo monoclonal pode produzir profundas mudanças nas propriedades de função efetora de anticorpo ou na meia vida de uma proteína à qual a região Fc é operavelmente ligada.
[0004] A região Fc de um anticorpo (i.e., os términos carboxi-terminais das cadeias pesadas de um anticorpo medindo domínios CH2, CH3 e uma porção da região de dobradiça (veja Fig. 1)), é limitada em variabilidade e é envolvida em efetuar os papéis fisiológicos desempenhados pelo anticorpo. As funções efetoras atribuíveis à região Fc de um anticorpo variam com a classe e subclasse do anticorpo e incluem (i) ligação do anticorpo através da região Fc a um receptor de Fc específico (“FcR”) em uma célula que desencadeia várias respostas biológicas incluindo, e.g., fagocitose e destruição de partículas revestidas com anticorpo, depuração de complexos imuno, liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária do anticorpo e controle de produção de imunoglobulina, (ii) citotoxicidade complemento-dependente (“CDC”) na qual a região Fc se liga ao componente C1q de complemento e por causa disso inicia a via clássica de ativação de complemento que leva à lise do alvo, (iii) citotoxicidade célula-mediada dependente de anticorpo (“ADCC”) na qual certas células do sistema imune humano, e.g., fagócitos e células NK, através de um receptor Fcy, se liga à região Fc de um anticorpo através de receptores de ligação de anticorpo específicos nas células imunes e subseqüentemente destruição de sinal da entidade à qual o anticorpo é ligado, e, (iv) ligação a células masto, basófilos, e eosinófilos. A afinidade com a qual uma região Fc pode se ligar a um FcR particular (e.g., FcRn), ou o nível com o qual uma região Fc pode mediar atividade de CDC ou ADCC são fatores importantes para determinar a eficácia e meia vida de proteínas terapêuticas, particularmente anticorpos monoclonais.
[0005] Modificações particularizadas de aminoácidos na região Fc de IgG
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 10/174
3/161 humana é uma área de estudo ativa produzindo informação de relação estruturafunção relevante para desenvolvimento de proteínas terapêuticas, particularmente anticorpos monoclonais (veja, e.g., Patente Norte-Americana 6.165.745 e Publicação de PCT No. W02004/035752 considerando alteração de meia vida no soro de um polipeptídeo operavelmente ligado a uma região Fc e Patente Norte-Americana 6.737.056 e Publicação de PCT No. W02004/029207 considerando alteração de uma função efetora de um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc modificada).
[0006] O desenvolvimento de novas proteínas terapêuticas, particularmente anticorpos monoclonais, iria se beneficiar da habilidade para racionalmente projetar uma região Fc com modificações de aminoácido particulares que conferem uma propriedade benéfica desejada no anticorpo de interesse. Todos os anticorpos monoclonais não seriam esperados para serem melhorados como um terapêutico devido à mesma modificação de aminoácido particular na região Fc. Um anticorpo monoclonal terapêutico que se liga a um antígeno alvo pode se beneficiar de um aumento em uma função efetora particular enquanto um anticorpo monoclonal terapêutico diferente que se liga a um antígeno alvo diferente pode se beneficiar de um aumento em uma função efetora diferente, ou mesmo uma diminuição. Um anticorpo monoclonal terapêutico pode se beneficiar da habilidade de se ligar a um receptor de Fc particular com maior afinidade enquanto outro anticorpo pode ser melhorado como um terapêutico ligando aquele receptor de Fc em uma menor afinidade e portanto sendo limpo do corpo a uma taxa mais rápida. Além disso, uma modificação ou substituição de aminoácido de região Fc particular e efeito resultante que iria beneficiar um anticorpo terapêutico pode depender do alvo antigênico ao qual o anticorpo se liga e/ou da doença ou desordem a ser melhorada pelo anticorpo.
[0007] Métodos e composições que alteram funções efetoras particulares associadas com a região Fc de um anticorpo são necessários para melhorar as propriedades de anticorpos terapêuticos existentes assim como para gerar novos anticorpos terapêuticos com propriedades desejadas. Anticorpos monoclonais com
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 11/174
4/161 regiões Fc variantes podem ser usados para tratar várias doenças ou desordens incluindo, e.g., desordens inflamatórias, câncer, desordens auto-imunes, desordens de sinalização celular a doenças infecciosas. Adicionalmente, métodos e composições que alteram a meia vida no soro de uma proteína terapêutica, ou aumentando a meia vida e por isso permitindo menores doses ou diminuindo a meia vida e por isso permitindo depuração mais rápida do corpo, iriam beneficiar a geração de anticorpos terapêuticos assim como outras proteínas terapêuticas.
[0008] O que é necessário a fim de melhorar a eficácia de uma proteína terapêutica, particularmente um anticorpo monoclonal, são regiões Fc variantes com propriedades melhoradas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0009] A presente invenção fornece regiões Fc variantes, i.e., regiões Fc compreendendo uma substituição de aminoácido descrita neste lugar (e.g., veja Tabela 1), que conferem propriedades benéficas em polipeptídeos compreendendo ditas regiões Fc variantes.
[0010] Posições Fc de uma região Fc originário na qual qualquer substituição de aminoácido pode ser feita para gerar uma região Fc variante da invenção incluem posições 279, 341,343 e 373 da região Fc, em que a numeração dos resíduos, i.e., seus números de posição, na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat (veja Fig. 2 neste lugar). A presente invenção fornece regiões Fc variantes compreendendo uma substituição de aminoácido na posição 279, 341, 343 ou 373 de uma região Fc originário, ou qualquer combinação destas. A região Fc originário pode opcionalmente ter resíduos de aminoácidos não nativos em outras posições do que 279, 341,343 e 373. Os resíduos de aminoácidos nativos nestas posições para IgG humana são valina (279), glicina (341), prolina (343) e tirosina (373).
[0011] Em formas de realização preferidas ao longo da presente invenção, o resíduo de aminoácido substituído por aquele presente na região Fc originário é um resíduo de aminoácido naturalmente ocorrente. A menos que de outra maneira determinado, a região Fc originário pode ser uma região Fc nativa ou não nativa, preferivelmente de origem humana ou substancialmente de origem humana. A
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 12/174
5/161 seqüência de aminoácidos da região Fc originário é preferivelmente aquela como mostrado em SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4. Preferivelmente a região Fc originário tem um resíduo de aminoácido nativo presente na posição que é para ser substituída para gerar uma região Fc variante da invenção. Além disso, do começo ao fim, é entendido que uma região Fc variante é uma região Fc originário modificada para compreender pelo menos uma substituição de aminoácido como descrito neste lugar. Adicionalmente, é entendido que uma região Fc originário pode ser uma Fc de comprimento completo ou uma porção desta compreendendo o resíduo de aminoácido a ser substituído para gerar a região Fc variante.
[0012] A presente invenção fornece adicionalmente polipeptídeos, preferivelmente anticorpos monoclonais, compreendendo uma região Fc variante (ou um fragmento funcional desta) compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido em posição 279, 341, 343 ou 373 quando comparado à região Fc originário. A região Fc variante compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido em posição de Fc 279, 341, 343 ou 373 pode compreender adicionalmente pelo menos uma substituição de aminoácido adicional na região Fc quando comparada ao resíduo de aminoácido presente na região Fc nativa do mesmo tipo que a região Fc variante.
[0013] Em uma forma de realização, uma região Fc variante (i.e. uma variante de uma região Fc originário) compreende pelo menos 1, 2, 3 ou mais substituições de aminoácidos selecionadas das seguintes: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 256I, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279F, 279G, 279H, 279I, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 13/174
6/161
288Ν, 288Ρ, 292Ε, 292F, 292G, 292Ι, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 332S, 332V, 332W, 339D, 339E, 339F, 339G, 339H, 339I, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341 D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373G, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 376I, 376K, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380D, 380N, 380S, 380T, 382D, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 439Q, 440D, 440E, 440F, 440G, 440H, 440I, 440K, 440L, 440M, 440Q, 440T, 440V ou 442K.
[0014] Em uma forma de realização preferida, uma região Fc variante compreende pelo menos 1,2, 3 ou mais substituições de aminoácidos selecionadas das seguintes: 235G, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 256I, 256K, 256L, 256W, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283H, 283K, 283M, 283R, 283W, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292G, 292I, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315L, 315P, 316F, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339D, 339F, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 14/174
7/161
339Υ, 341 D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373G, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373W, 375R, 376G, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378D, 378N, 379N, 379Q, 379T, 380N, 380S, 380T, 382D, 382F, 382I, 382K, 382L, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R, 432S, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 440D, 440I ou 440L.
[0015] As regiões Fc variantes da presente invenção são preferivelmente caracterizadas usando um ou mais dos métodos experimentais descritos neste lugar. Tais regiões Fc variantes conferem uma função efetora alterada ou meia vida no soro alterada em um anticorpo monoclonal que compreende a região Fc variante ou uma meia vida no soro alterada em um polipeptídeo ao qual a região Fc variante é operavelmente ligada.
[0016] Preferivelmente a região Fc originário de uma região Fc variante da invenção é uma região Fc nativa ou codificada por linhagem germinativa de origem humana selecionada do grupo consistindo de IgG, IgA, IgE, IgM e IgD ou uma variante polimórfica destas, ou um fragmento funcional destas. Preferivelmente a região Fc originário é uma região Fc de IgG, e mais preferivelmente uma região Fc de lgG1, lgG3, ou lgG4. A região Fc originário pode opcionalmente compreender uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais quando comparada à região Fc nativa, outras do que aquelas descritas neste lugar (i.e. aquelas substituições listadas na Tabela 1), particularmente uma ou mais substituições de aminoácidos conhecidas na arte ou como descrito em Patentes Norte-Americanas 6.165.745 ou 6.737.056; ou Publicação de PCT Nos. W02004/035752 ou W02004/029207 (todos os quais são incorporados neste lugar em sua totalidade); tais substituições de aminoácidos, se presentes na região Fc originário, iriam então também estar presentes na região Fc variante da invenção e em um polipeptídeo compreendendo
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 15/174
8/161 uma região Fc variante da invenção, a menos que elas fossem em uma posição subseqüentemente substituída para gerar a região Fc variante.
[0017] A invenção fornece um polipeptídeo, preferivelmente um anticorpo monoclonal, compreendendo uma região Fc variante da invenção, ou um fragmento funcional desta. Em uma forma de realização preferida, um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante da invenção é um anticorpo quimérico. Em uma forma de realização mais preferida, um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante da invenção é um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano no qual seqüência de estrutura e seqüência de região constante presentes no anticorpo são substancialmente de origem humana. O anticorpo quimérico, humanizado ou humano é preferivelmente um anticorpo de comprimento completo ou um anticorpo de cadeia única. Quando um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante da invenção é para ser usado como um terapêutico humano, a região Fc é preferivelmente substancialmente de origem humana.
[0018] Preferivelmente um polipeptídeo compreendendo, ou operavelmente ligado a, uma região Fc variante da invenção (i.e., “polipeptídeo variante”) tem pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc variante quando comparado à região Fc originário, e manifesta uma função efetora alterada ou meia vida no soro alterada quando comparado àquela do polipeptídeo compreendendo a região Fc originário de dita região Fc variante, caracterizado pelo fato de que “pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc variante” é (i) qualquer substituição de aminoácido na posição 279, 341, 343 ou 373 da região Fc ou (ii) pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na região Fc: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 256I, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279F, 279G, 279H,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 16/174
9/161
279Ι, 279Κ, 279L, 279Μ, 279Ν, 279Q, 279R, 279S, 279Τ, 279W, 279Υ, 280Τ, 283F, 283G, 283Η, 283Ι, 283Κ, 283L, 283Μ, 283Ρ, 283R, 283Τ, 283W, 283Υ, 285Ν, 286F, 288Ν, 288Ρ, 292Ε, 292F, 292G, 292Ι, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 332S, 332V, 332W, 339D, 339E, 339F, 339G, 339H, 339I, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341 D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373G, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 376I, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380D, 380N, 380S, 380T, 382D, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 439Q, 440D, 440E, 440F, 440G, 440H, 440I, 440K, 440L, 440M, 440Q, 440T, 440V ou 442K, ou (iii) pelo menos duas substituições de aminoácidos como listado em (i) ou (ii) acima, ou (iv) pelo menos 1,2 ou 3 substituições de aminoácidos como listado em (i) ou (ii) acima em adição à pelo menos uma substituição de aminoácido de região Fc não listada em (i) ou (ii) acima. Preferivelmente a função efetora alterada é um aumento em ADCC, uma diminuição em ADCC, um aumento em CDC, uma diminuição em CDC, um aumento em afinidade de ligação de C1q, uma diminuição em afinidade de ligação de C1q, um aumento em afinidade de ligação de FcR (preferivelmente FcRn), uma diminuição em afinidade de ligação de FcR (preferivelmente FcRn) quando comparado a dito polipeptídeo carecendo da substituição de aminoácido na região Fc (i.e., região Fc originário).
[0019] A invenção fornece um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante compreendendo pelo menos uma das seguintes substituições de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 17/174
10/161 aminoácidos na região Fc: 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 249E, 249Y, 254F, 254M, 254Y, 256A, 258D, 279A, 283A, 283I, 283K, 283M, 283R, 288N, 292A, 311 A, 311 D, 311N, 311T, 311V, 311Y, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 332T, 332V, 339D, 339F, 339G, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 380N, 380S, 382A, 382I, 385E, 427N, 429M, 434W, 436I, 440G, 440H, 440I ou 440L, [preferivelmente 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 258D, 279A, 283M, 288N, 292A, 311 D, 311N, 311T, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 339D, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 376A, 376V, 377K, 379N, 380N, 382A, 440I ou 440L], caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante manifesta ADCC realçada quando comparado ao anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário.
[0020] A invenção fornece um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante compreendendo pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na região Fc: 235Q, 235R, 235S, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249P, 250K, 250M, 250R, 251H, 2511, 251W, 252Y, 254L, 254P, 254Q, 254T, 254V, 256V, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 260S, 262L, 264S, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 267I, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272H, 272K, 272L, 272N, 272R, 279D, 279K, 279L, 279W, 283D, 283F, 283G, 283H, 283L, 283W, 283Y, 285N, 288P, 292E, 292F, 292G, 292I, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 311F, 3111, 311K, 311S, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 315F, 315P, 316F, 317P, 317T, 327T, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, 332W, 341 D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373A, 373D, 373E, 373F, 373G, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376E, 376F, 376G, 376H, 376W, 376Y, 379Q, 382D, 382S, 430H, 430K, 430N, 430Q, 430R, 430W, 432R, 432S, 434I, 440D, 440T, 440V ou 442K, [preferivelmente 235R, 236F, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 250K, 251 Η, 254T, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 267I,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 18/174
267Κ, 269Ν, 269Q, 270Α, 270G, 270Κ, 270Μ, 270Ν, 271Τ, 272Ν, 272R, 288Ρ, 292Ε, 301W, 304Ε, 316F, 317Ρ, 327Τ, 328V, 329Υ, 332Κ, 332R, 341F, 3411, 341 Μ, 341Ρ, 341Q, 341R, 341 Τ, 341W, 341Υ, 343W, 373Α, 373Ε, 373G, 373S, 376Α, 376W, 432R ou 432S], caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante manifesta ADCC diminuída quando comparado ao anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário.
[0021] A invenção fornece um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante compreendendo pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na região Fc: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307E, 307M, 311 A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341 Ρ, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 376I, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K ou 442K, [preferivelmente 245R, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 430I, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 438K, 438L ou 438W], caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante manifesta afinidade de ligação de FcRn realçada quando comparado ao anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 19/174
12/161 [0022] A invenção fornece um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante compreendendo pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na região Fc: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256I, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 267I, 268D, 268K, 270A, 270M, 279I, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 311 D, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341 D, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 439Q, 440A, 440D, 440E, 440F ou 440M, [preferivelmente 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 265Y, 280T, 292G, 292I, 311 D, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341 D, 341E, 341F, 3411, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P ou 432S], caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante manifesta afinidade de ligação de FcRn diminuída quando comparado ao anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário.
[0023] A invenção fornece um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante compreendendo pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na região Fc: 236Y, 244L, 247A, 247D, 247E, 247G, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 256I, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 256Y, 260S, 268D, 279Q, 279S,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 20/174
13/161
279W, 279Υ, 280Κ, 280Τ, 283F, 283G, 283Η, 283Ι, 283Κ, 283L, 283Μ, 283Ν, 283Ρ, 283R, 283S, 283W, 292L, 307Α, 307Μ, 311F, 3111, 311Κ, 311L, 311 Μ, 311Τ, 311V, 311W, 311Υ, 312Ρ, 314F, 3141, 314V, 314W, 314Υ, 315F, 315Κ, 315L, 315Ρ, 315R, 316Κ, 317Ρ, 317Τ, 318Ν, 318Τ, 332Α, 332D, 332Ε, 332F, 332G, 332L, 332Μ, 332Q, 332S, 332Τ, 332V, 332W, 332Υ, 339D, 339F, 339G, 339Η, 339Ι, 339Κ, 339Ν, 339Q, 339R, 339S, 339Τ, 339W, 339Υ, 341D, 341Ε, 341F, 341 Η, 3411, 341Κ, 341L, 341 Μ, 341Ν, 341Ρ, 341Q, 341R, 341S, 341Τ, 341V, 341W, 341Υ, 343Α, 343D, 343Ε, 343G, 343Η, 343Κ, 343L, 343Μ, 343Ν, 343Q, 343R, 343S, 343Τ, 343W, 343Υ, 373D, 373Ε, 373F, 373Η, 373Ι, 373Κ, 373L, 373Μ, 373Ν, 373Q, 373R, 373Τ, 373V, 373W, 375R, 376Α, 376F, 376G, 376Η, 376L, 376Ν, 376Ρ, 376Q, 376R, 376S, 376Τ, 376V, 377Ρ, 379Ν, 379Q, 379S, 379Τ, 380Α, 380Ν, 380S, 380Τ, 382Ι, 382L, 382Q, 382V, 386Κ, 426D, 426L, 429Α, 429F, 429Μ, 430Α, 430D, 430F, 430G, 430Η, 430Ι, 430Κ, 430L, 430Μ, 430Ν, 430Ρ, 430R, 430S, 430Τ, 430V, 430W, 430Υ, 431 Η, 431Ρ, 432R, 432S, 434W, 434Υ, 438L, 438W, 440Q ou 440Υ, [preferivelmente 236Υ, 248F, 248Ρ, 248Q, 248W, 249Ε, 249L, 249Μ, 249Ν, 249Υ, 251 Η, 2511, 251W, 254F, 254Κ, 254L, 254Μ, 254R, 254Υ, 255Κ, 256Α, 256G, 256Ι, 256L, 256Μ, 256Ρ, 256Q, 256W, 260S, 280Κ, 283W, 307Μ, 311F, 3111, 311 Κ, 311L, 311 Μ, 311Τ, 311V, 311W, 311Υ, 3141, 314V, 314W, 314Υ, 315Ρ, 317Ρ, 332D, 332L, 332Μ, 332S, 332W, 339D, 339F, 339Ι, 339Κ, 339Ν, 339S, 339W, 339Υ, 341D, 341 Ε, 341F, 341 Η, 3411, 341Κ, 341L, 341Μ, 341Ν, 341Ρ, 341Q, 341R, 341S, 341Τ, 341V, 341W, 341Υ, 343D, 343Ε, 343G, 343Η, 343Κ, 343Ν, 343Q, 343R, 343S, 343Τ, 343W, 343Υ, 373Ε, 373F, 373Η, 373Ι, 373Κ, 373L, 373Q, 373R, 373Τ, 373W, 376Α, 376G, 376Η, 376Ν, 376Ρ, 376Q, 376R, 376S, 376Τ, 376V, 377Ρ, 379Ν, 379Q, 379Τ, 382Ι, 382L, 386Κ, 426D, 426L, 429F, 429Μ, 430Α, 430D, 430F, 430G, 430Η, 430Ι, 430Κ, 430L, 430Μ, 430Ν, 430Ρ, 430R, 430S, 430Τ, 430V, 430W, 430Υ, 431 Η, 431 Ρ, 434Υ, 438L ou 440Υ], caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante manifesta atividade de CDC realçada quando comparado ao anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário.
[0024] A invenção fornece um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante compreendendo pelo menos uma das seguintes substituições de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 21/174
14/161 aminoácidos na região Fc: 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247H, 247I, 247L, 247T, 247Y, 250M, 252Y, 254D, 254E, 254I, 254P, 254Q, 254T, 254V, 255N, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 262L, 264S, 265H, 265Y, 267G, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 272L, 272N, 292A, 293S, 301W, 307E, 311E, 311S, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 330K, 330R, 332E, 332M, 343I, 373S, 378D, 380D, 382D, 382F, 382N, 382P, 382R, 382S, 382W, 382Y, 385E, 385P, 423N, 424H, 424M ou 427N [preferivelmente 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247I, 247L, 247T, 250M, 257A, 257I, 257M, 262L, 264S, 267G, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271T, 272H, 301W, 311S, 327T, 329Y, 330K, 378D, 385E, 423N ou 424H], caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante manifesta atividade de CDC diminuída quando comparado ao anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário.
[0025] A invenção incorpora adicionalmente um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante da invenção, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo especificamente se liga a um antígeno alvo humano. Preferivelmente o antígeno alvo é selecionado do grupo consistindo de CD3, CD20, CD25, TNFa, Her2/neu, CD33, Cd52, EGFR, EpCAM, MUC1, GD3, CEA, CA125, HLA-DR, TGFp, VEGF, GDF8, GDF11, grelina, ou qualquer precursor ou fragmento funcional destes. [0026] A invenção fornece um polipeptídeo variante compreendendo uma região Fc variante da invenção compreendendo pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na região Fc: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307E, 307M, 311 A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 376I, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 22/174
15/161
380Ν, 380S, 380Τ, 382F, 382Η, 382Ι, 382Κ, 382L, 382Μ, 382Ν, 382Q, 382R, 382S, 382Τ, 382V, 382W, 382Υ, 423Ν, 427Ν, 430Α, 430F, 430G, 430Η, 430Ι, 430Κ, 430L, 430Μ, 430Ν, 430Q, 430R, 430S, 430Τ, 430V, 430Υ, 431 Η, 431Κ, 434F, 434G, 434Η, 434W, 434Υ, 436Ι, 436L, 436Τ, 438Κ, 438L, 438Τ, 438W, 440Κ ou 442Κ, [preferivelmente 245R, 252Υ, 256Ρ, 257Α, 257Ι, 257Μ, 257Ν, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 279Α, 279D, 279G, 279Η, 279Ν, 279Q, 279S, 279Τ, 279W, 279Υ, 283F, 283Η, 283Κ, 283R, 285Ν, 286F, 307Ε, 307Μ, 3111, 311 Κ, 311L, 311 Μ, 312Ρ, 318Ν, 318Τ, 332S, 339W, 343Ε, 343Η, 343Κ, 343Q, 343R, 375R, 377Κ, 378D, 378Ν, 380S, 380Τ, 382F, 382Κ, 382Q, 382R, 382S, 382Τ, 382V, 382W, 382Υ, 423Ν, 427Ν, 430Α, 430F, 430Η, 430Ι, 430L, 430Μ, 430Ν, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Υ, 431 Η, 431 Κ, 434F, 434G, 434Η, 434W, 434Υ, 436Ι, 436L, 438Κ, 438L ou 438W], caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo variante manifesta meia vida no soro realçada quando comparado ao polipeptídeo originário (i.e., um polipeptídeo idêntico ao polipeptídeo variante mas carecendo da substituição de aminoácido listada neste lugar acima).
[0027] A invenção fornece um polipeptídeo variante compreendendo uma região Fc variante da invenção compreendendo pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos na região Fc: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256I, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 267I, 268D, 268K, 270A, 270M, 279I, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 311 D, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341 D, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G,
373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W,
376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S,
439Q, 440A, 440D, 440E, 440F ou 440M, [preferivelmente 237R, 247D, 247E, 247F,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 23/174
16/161
247Η, 247Ι, 247L, 247Μ, 247Ν, 247Q, 247W, 247Υ, 248Α, 248F, 248Ρ, 248Q, 248W, 249L, 249Μ, 249Υ, 251 Η, 2511, 251W, 254D, 254Ε, 254F, 254G, 254Η, 254Ι, 254Κ, 254Μ, 254Ν, 254Ρ, 254Q, 254R, 254Τ, 254V, 254W, 254Υ, 255Κ, 255Ν, 256F, 256Η, 256Κ, 256Μ, 256R, 256W, 256Υ, 265Υ, 280Τ, 292G, 292Ι, 311 D, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 3411, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P ou 432S], caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo variante manifesta meia vida no soro diminuída quando comparado ao polipeptídeo originário (i.e., um polipeptídeo idêntico ao polipeptídeo variante mas carecendo da substituição de aminoácido listada neste lugar acima).
[0028] Em uma forma de realização a invenção fornece um método para aumentar a atividade de ADCC de um anticorpo monoclonal, preferivelmente um anticorpo monoclonal terapêutico (ou fragmento funcional deste), compreendendo engenheirar um ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico codificando uma região Fc variante compreendendo pelo menos umas das seguintes substituições de aminoácidos: 247A, 247F, 247H, 247I, 247L, 247M, 247T, 247V, 247Y, 249E, 249Y, 251F, 254F, 254M, 254Y, 256A, 256M, 258D, 268D, 268E, 279A, 280A, 280K, 283A, 283I, 283K, 283M, 283R, 288N, 292A, 311 A, 311 D, 311N, 311T, 311V, 311Y, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 330K, 332T, 332V, 339D, 339F, 339G, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 380N, 380S, 382A, 382I, 385E, 427N, 429M, 434W, 436I, 440G, 440H, 440I ou 440L, [preferivelmente 247A, 247F, 247M, 247T, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 258D, 279A, 283M, 288N, 292A, 311 D, 311N, 311T, 315L, 318N, 318P, 318T, 318V, 339D, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 376A, 376V, 377K, 379N, 380N, 382A, 440I ou 440L]. A molécula de ácido nucleico codificando a região Fc variante pode ser engenheirada (e.g. a partir de uma molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc originário ou uma região Fc nativa) para compreender pelo menos uma substituição de aminoácido como listado acima ou enquanto a molécula de ácido nucleico é operavelmente ligada a ácido nucleico adicional codificando anticorpo, (e.g. a seqüência de ácidos nucleicos codificando o restante da cadeia pesada de Ig), ou o
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 24/174
17/161 método pode adicionalmente compreender subseqüentemente operavelmente ligar o ácido nucleico codificando a região Fc variante (i.e., depois de introdução de pelo menos uma substituição de aminoácido listada acima) a ácido nucleico adicional codificando anticorpo. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário. O método pode adicionalmente compreender medir atividade de ADCC do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante e do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário por qualquer método disponível na arte ou como descrito neste lugar. O método pode adicionalmente compreender selecionar um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante com atividade de ADCC maior do que aquela do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário (i.e., realçada, preferivelmente em pelo menos 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% ou mais). A invenção incorpora adicionalmente um anticorpo monoclonal, ou fragmento funcional deste, compreendendo uma região Fc variante produzido pelo método.
[0029] Em uma forma de realização a invenção fornece um método para diminuir a atividade de ADCC de um anticorpo monoclonal, preferivelmente um anticorpo monoclonal terapêutico (ou fragmento funcional deste), compreendendo engenheirar um ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico codificando uma região Fc variante compreendendo pelo menos umas das seguintes substituições de aminoácidos: 235Q, 235R, 235S, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249P, 250K, 250M, 250R, 251H, 2511, 251W, 252Y, 254L, 254P, 254Q, 254T, 254V, 256V, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 260S, 262L, 264S, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 267I, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272H, 272K, 272L, 272N, 272R, 279D, 279F, 279K, 279L, 279W, 283D, 283F, 283G, 283H, 283L, 283T, 283W, 283Y, 285N, 288P, 292E, 292F, 292G, 292I, 293S, 293V, 301W, 304E, 307A, 307E, 307M, 311F, 3111, 311K, 311S, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 315F, 315P, 316F, 317P, 327T, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, 332W, 341 D, 341E, 341F,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 25/174
18/161
341Η, 3411, 341Κ, 341L, 341Μ, 341Ν, 341Ρ, 341Q, 341R, 341S, 341Τ, 341W, 341Υ, 343Α, 343D, 343Ε, 343F, 343G, 343Η, 343L, 343Μ, 343Ν, 343Q, 343R, 343S, 343Τ, 343V, 343W, 343Υ, 373Α, 373D, 373Ε, 373F, 373G, 373Ι, 373Κ, 373L, 373Μ, 373Ν, 373Q, 373R, 373S, 373Τ, 373V, 373W, 375R, 376Α, 376Ε, 376F, 376G, 376Η, 376W, 376Υ, 379Q, 382D, 382S, 429Α, 429F, 430Η, 430Κ, 430Ν, 430Q, 430R, 430W, 432R, 432S, 434Ι, 440D, 440Τ, 440V ou 442K, [preferivelmente 235R, 236F, 236R, 236Y, 237E, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 249P, 250K, 251 Η, 254T, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 265H, 265K, 265S, 267G, 267H, 267I, 267K, 269N, 269Q, 270A, 270G, 270K, 270M, 270N, 271T, 272R, 288P, 292E, 301W, 304E, 316F, 317P, 327T, 329Y, 332K, 332R, 341F, 3411, 341M, 341P, 341Q, 341R, 341T, 341W, 341Y, 343W, 373A, 373E, 373G, 373S, 376W, 429A, 432R ou 432S]. A molécula de ácido nucleico codificando a região Fc variante pode ser engenheirada (e.g. a partir de uma molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc originário ou uma região Fc nativa) para compreender pelo menos uma substituição de aminoácido como listado acima ou enquanto a molécula de ácido nucleico é operavelmente ligada a ácido nucleico adicional codificando anticorpo, (e.g. a seqüência de ácidos nucleicos codificando o restante da cadeia pesada de lg), ou o método pode adicionalmente compreender subseqüentemente operavelmente ligar o ácido nucleico codificando a região Fc variante (i.e., depois de introdução de pelo menos uma substituição de aminoácido listada acima) a ácido nucleico adicional codificando anticorpo. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário. O método pode adicionalmente compreender medir atividade de ADCC do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante e do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário por qualquer método disponível na arte ou como descrito neste lugar. O método pode adicionalmente compreender selecionar um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante com atividade de ADCC menor do que aquela do anticorpo monoclonal compreendendo a
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 26/174
19/161 região Fc originário (i.e., diminuída, preferivelmente em pelo menos 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% ou mais). A invenção incorpora adicionalmente um anticorpo monoclonal, ou fragmento funcional deste, compreendendo uma região Fc variante produzido pelo método.
[0030] Em uma forma de realização a invenção fornece um método para aumentar a afinidade de ligação de FcRn de um anticorpo monoclonal, preferivelmente um anticorpo monoclonal terapêutico (ou fragmento funcional deste), compreendendo engenheirar um ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico codificando uma região Fc variante compreendendo pelo menos umas das seguintes substituições de aminoácidos: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307A, 307E, 307M, 311 A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N, 318T, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332R, 332S, 332W, 339N, 339T, 339W, 341P, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 343T, 343Y, 375R, 376G, 376I, 376M, 376P, 376T, 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380T, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 436T, 438K, 438L, 438T, 438W, 440K ou 442K, [preferivelmente 245R, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 262L, 279A, 279D, 279G, 279H, 279N, 279Q, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283F, 283H, 283K, 283R, 285N, 286F, 307A, 307E, 307M, 3111, 311K, 311L, 311M, 312P, 318N, 318T, 332S, 339W, 343E, 343H, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380T, 382F, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430A, 430F, 430H, 430I, 430L, 430M, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431H, 431K, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 438K, 438L ou 438W], A molécula de ácido nucleico codificando a região Fc variante pode ser engenheirada (e.g. a partir de uma molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc originário ou uma região
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 27/174
20/161
Fc nativa) para compreender pelo menos uma substituição de aminoácido como listado acima ou enquanto a molécula de ácido nucleico é operavelmente ligada a ácido nucleico adicional codificando anticorpo, (e.g. a seqüência de ácidos nucleicos codificando o restante da cadeia pesada de Ig), ou o método pode adicionalmente compreender subseqüentemente operavelmente ligar o ácido nucleico codificando a região Fc variante (i.e., depois de introdução de pelo menos uma substituição de aminoácido listada acima) a ácido nucleico adicional codificando anticorpo. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário. O método pode adicionalmente compreender medir afinidade de ligação de FcRn do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante e do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário por qualquer método disponível na arte ou como descrito neste lugar. O método pode adicionalmente compreender selecionar um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante com afinidade de ligação de FcRn maior do que aquela do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário (i.e., realçada, preferivelmente em pelo menos 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% ou mais). A invenção incorpora adicionalmente um anticorpo monoclonal, ou fragmento funcional deste, compreendendo uma região Fc variante produzido pelo método.
[0031] Em uma forma de realização a invenção fornece um método para aumentar a meia vida no soro in vivo de um polipeptídeo, preferivelmente um polipeptídeo terapêutico, compreendendo engenheirar um ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico codificando uma região Fc variante compreendendo pelo menos umas das seguintes substituições de aminoácidos: 238L, 244L, 245R, 249P, 252Y, 256P, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279G, 279H, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 283A, 283D, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283N, 283P, 283Q, 283R, 283S, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 293V, 307A, 307E, 307M, 311A, 3111, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312P, 316K, 317P, 318N,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 28/174
21/161
318Τ, 332F, 332Η, 332Κ, 332L, 332Μ, 332R, 332S, 332W, 339Ν, 339Τ, 339W, 341Ρ, 343Ε, 343Η, 343Κ, 343Q, 343R, 343Τ, 343Υ, 375R, 376G, 376Ι, 376Μ, 376Ρ, 376Τ, 376V, 377Κ, 378D, 378Ν, 380Ν, 380S, 380Τ, 382F, 382Η, 382Ι, 382Κ, 382L, 382Μ, 382Ν, 382Q, 382R, 382S, 382Τ, 382V, 382W, 382Υ, 423Ν, 427Ν, 430Α, 430F, 430G, 430Η, 430Ι, 430Κ, 430L, 430Μ, 430Ν, 430Q, 430R, 430S, 430Τ, 430V, 430Υ, 431 Η, 431Κ, 434F, 434G, 434Η, 434W, 434Υ, 436Ι, 436L, 436Τ, 438Κ, 438L, 438Τ, 438W, 440Κ ou 442Κ, [preferivelmente 245R, 252Υ, 256Ρ, 257Α, 257Ι, 257Μ, 257Ν, 257S, 257V, 258D, 262L, 279Α, 279D, 279G, 279Η, 279Ν, 279Q, 279S, 279Τ, 279W, 279Υ, 283F, 283Η, 283Κ, 283R, 285Ν, 286F, 307Α, 307Ε, 307Μ, 3111,311 Κ, 311L, 311 Μ, 312Ρ, 318Ν, 318Τ, 332S, 339W, 343Ε, 343Η, 343Κ, 343Q, 343R, 375R, 377Κ, 378D, 378Ν, 380S, 380Τ, 382F, 382Κ, 382Q, 382R, 382S, 382Τ, 382V, 382W, 382Υ, 423Ν, 427Ν, 430Α, 430F, 430Η, 430Ι, 430L, 430Μ, 430Ν, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Υ, 431 Η, 431 Κ, 434F, 434G, 434Η, 434W, 434Υ, 436Ι, 436L, 438Κ, 438L ou 438W]. A molécula de ácido nucleico codificando a região Fc variante pode ser operavelmente ligada a uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína terapêutica. A molécula de ácido nucleico codificando a região Fc variante pode ser engenheirada (e.g. a partir de uma molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc originário ou uma região Fc nativa) para compreender pelo menos uma substituição de aminoácido como listado acima ou enquanto a molécula de ácido nucleico é operavelmente ligada a ácido nucleico adicional codificando polipeptídeo, (e.g. a seqüência de ácidos nucleicos codificando a região não Fc da proteína de fusão), ou o método pode adicionalmente compreender subseqüentemente operavelmente ligar o ácido nucleico codificando a região Fc variante depois de introdução de pelo menos uma substituição de aminoácido listada acima a ácido nucleico codificando um parceiro de fusão não Fc. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do polipeptídeo compreendendo a região Fc variante. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do polipeptídeo compreendendo a região Fc originário. O método pode adicionalmente compreender medir meia vida no soro in vivo do polipeptídeo compreendendo a região Fc variante e do polipeptídeo compreendendo
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 29/174
22/161 a região Fc originário por qualquer método disponível na arte ou como descrito neste lugar. O método pode adicionalmente compreender selecionar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem meia vida no soro in vivo aumentada quando comparado àquela do polipeptídeo compreendendo a região Fc originário (i.e., realçada, preferivelmente em pelo menos 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% ou mais). A invenção incorpora adicionalmente um polipeptídeo (i.e., um polipeptídeo de fusão) compreendendo uma região Fc variante produzido pelo método.
[0032] Em uma forma de realização a invenção fornece um método para diminuir a afinidade de ligação de FcRn de um anticorpo monoclonal, preferivelmente um anticorpo monoclonal terapêutico (ou fragmento funcional deste), compreendendo engenheirar um ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico codificando uma região Fc variante compreendendo pelo menos umas das seguintes substituições de aminoácidos: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249Y, 251F, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256I, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 267I, 268D, 268K, 270A, 270M, 279I, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 311 D, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341 D, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M, 343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 434I, 439Q, 440A, 440D, 440E, 440F ou 440M, [preferivelmente 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254M, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 292I, 311 D, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341 D,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 30/174
23/161
341 Ε, 341F, 3411, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P ou 432S]. A molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc variante pode ser engenheirada (e.g. a partir de uma molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc originário ou uma região Fc nativa) para compreender pelo menos uma substituição de aminoácido como listado acima ou enquanto a molécula de ácido nucleico é operavelmente ligada a ácido nucleico adicional codificando anticorpo, (e.g. a seqüência de ácidos nucleicos codificando o restante da cadeia pesada de Ig), ou o método pode adicionalmente compreender subseqüentemente operavelmente ligar o ácido nucleico codificando a região Fc variante depois de introdução de pelo menos uma substituição de aminoácido listada acima a ácido nucleico adicional codificando anticorpo. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário. O método pode adicionalmente compreender medir afinidade de ligação de FcRn do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante e do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário por qualquer método disponível na arte ou como descrito neste lugar. O método pode adicionalmente compreender selecionar um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante com afinidade de ligação de FcRn menor do que aquela do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário (i.e., diminuída, preferivelmente em pelo menos 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% ou mais). A invenção incorpora adicionalmente um anticorpo monoclonal (compreendendo uma região Fc variante) produzido pelo método.
[0033] Em outra forma de realização a invenção fornece um método para diminuir a meia vida no soro in vivo de um polipeptídeo, preferivelmente um polipeptídeo terapêutico, compreendendo engenheirar um ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico codificando uma região Fc variante compreendendo pelo menos umas das seguintes substituições de aminoácidos: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238E, 238G, 238H, 238W, 247A, 247D, 247E, 247F,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 31/174
24/161
247G, 247Η, 247Ι, 247L, 247Μ, 247Ν, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Υ, 248Α, 248F, 248Ρ, 248Q, 248W, 249Ε, 249L, 249Μ, 249Υ, 251F, 251 Η, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256I, 256K, 256M, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 267I, 268D, 268K, 270A, 270M, 279I, 279K, 279L, 280T, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 311 D, 311E, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315P, 316F, 317T, 326W, 327T, 339E, 339G, 339L, 339R, 341 D, 341E, 341F, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343M,
343V, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373S, 373T,
373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M,
430D, 430W, 431P, 432R, 432S, 434I, 439Q, 440A, 440D, 440E, 440F ou 440M, [preferivelmente 237R, 247D, 247E, 247F, 247H, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248A, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249Y, 251H, 2511, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254M, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256H, 256K, 256M, 256R, 256W, 265Y, 280T, 292G, 292I, 311 D, 311E, 311G, 311N, 315F, 315P, 316T, 317T, 327T, 341D, 341E, 341F, 3411, 341L, 341Y, 343W, 373A, 373G, 373M, 373Q, 376W, 376Y, 424M, 424V, 430D, 430W, 431P ou 432S]. O ácido nucleico codificando a região Fc variante pode ser operavelmente ligado a ácido nucleico codificando uma proteína terapêutica. A molécula de ácido nucleico codificando a região Fc variante pode ser engenheirada (e.g. a partir de uma molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc originário ou uma região Fc nativa) para compreender pelo menos uma substituição de aminoácido como listado acima ou enquanto a molécula de ácido nucleico é operavelmente ligada a ácido nucleico adicional codificando polipeptídeo, (e.g. a seqüência de ácidos nucleicos codificando a região não Fc da proteína de fusão), ou o método pode adicionalmente compreender subseqüentemente operavelmente ligar o ácido nucleico codificando a região Fc variante depois de introdução de pelo menos uma substituição de aminoácido listada acima a ácido nucleico codificando um parceiro de fusão não Fc. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do polipeptídeo compreendendo a região Fc variante. O
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 32/174
25/161 método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do polipeptídeo compreendendo a região Fc originário. O método pode adicionalmente compreender medir meia vida no soro in vivo do polipeptídeo compreendendo a região Fc variante e do polipeptídeo compreendendo a região Fc originário por qualquer método disponível na arte ou como descrito neste lugar. O método pode adicionalmente compreender selecionar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem meia vida no soro in vivo diminuída quando comparado àquela do polipeptídeo compreendendo a região Fc originário (i.e., diminuída, preferivelmente em pelo menos 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% ou mais). A invenção incorpora adicionalmente um polipeptídeo (i.e., um polipeptídeo de fusão) compreendendo uma região Fc variante produzido pelo método.
[0034] Em outra forma de realização a invenção fornece um método para aumentar a atividade de CDC de um anticorpo monoclonal, preferivelmente um anticorpo monoclonal terapêutico, compreendendo construir a região Fc do anticorpo para compreender pelo menos umas das seguintes substituições de aminoácidos: 236Y, 244L, 247A, 247D, 247E, 247G, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249E, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 250K, 250R, 251F, 251H, 2511, 251W, 254A, 254F, 254K, 254L, 254M, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 256I, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 256Y, 260S, 268D, 279Q, 279S, 279W, 279Y, 280K, 280T, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283W, 292L, 307A, 307M, 311F, 3111, 311K, 311L, 311M, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312P, 314F, 3141, 314V, 314W, 314Y, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316K, 317P, 317T, 318N, 318T, 332A, 332D, 332E, 332F, 332G, 332H, 332L, 332M, 332N, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 339D, 339F, 339G, 339H, 339I, 339K, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339T, 339W, 339Y, 341 D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373T, 373V, 373W, 375R, 376A, 376F, 376G, 376H, 376L, 376N, 376P, 376Q, 376R,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 33/174
26/161
376S, 376Τ, 376V, 377Ρ, 379Ν, 379Q, 379S, 379Τ, 380Α, 380Ν, 380S, 380Τ, 382Ι, 382L, 382Q, 382V, 386Κ, 426D, 426L, 429Α, 429F, 429Μ, 430Α, 430D, 430F, 430G, 430Η, 430Ι, 430Κ, 430L, 430Μ, 430Ν, 430Ρ, 430R, 430S, 430Τ, 430V, 430W, 430Υ, 431 Η, 431Ρ, 432R, 432S, 434W, 434Υ, 438L, 438W, 440Q ou 440Υ, [preferivelmente 236Υ, 248F, 248Ρ, 248Q, 248W, 249Ε, 249L, 249Μ, 249Ν, 249Υ, 250Κ, 250R, 251 Η, 2511, 251W, 254Α, 254F, 254Κ, 254L, 254Μ, 254R, 254Υ, 255Κ, 256Α, 256G, 256Ι, 256L, 256Μ, 256Ρ, 256Q, 256W, 260S, 280Κ, 283W, 307Μ, 311F, 3111, 311 Κ, 311L, 311M, 311T, 311V, 311W, 311Y, 3141, 314V, 314W, 314Y, 315P, 317P, 332D, 332L, 332M, 332S, 332W, 339D, 339F, 339I, 339K, 339N, 339S, 339T, 339W, 339Y, 341 D, 341E, 341F, 341H, 3411, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343D, 343E, 343G, 343H, 343K, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373H, 373I, 373K, 373L, 373Q, 373R, 373T, 373W, 376A, 376G, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379T, 382I, 382L, 386K, 426D, 426L, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431P, 432R, 434Y, 438L ou 440Y]. A molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc variante pode ser engenheirada (e.g. a partir de uma molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc originário ou uma região Fc nativa) para compreender pelo menos uma substituição de aminoácido como listado acima ou enquanto a molécula de ácido nucleico é operavelmente ligada a ácido nucleico adicional codificando anticorpo, (e.g. a seqüência de ácidos nucleicos codificando o restante da cadeia pesada de Ig), ou o método pode adicionalmente compreender subseqüentemente operavelmente ligar o ácido nucleico codificando a região Fc variante depois de introdução de pelo menos uma substituição de aminoácido listada acima a ácido nucleico adicional codificando anticorpo. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário. O método pode adicionalmente compreender medir atividade de CDC do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante e do anticorpo
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 34/174
27/161 monoclonal compreendendo a região Fc originário por qualquer método disponível na arte ou como descrito neste lugar. O método pode adicionalmente compreender selecionar um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante com atividade de CDC maior do que aquela do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário (i.e., realçada, preferivelmente em pelo menos 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% ou mais). A invenção incorpora adicionalmente um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante produzido pelo método.
[0035] Em outra forma de realização a invenção fornece um método para diminuir a resposta de CDC de um anticorpo monoclonal, preferivelmente um anticorpo monoclonal terapêutico, compreendendo construir a região Fc do anticorpo para compreender pelo menos umas das seguintes substituições de aminoácidos: 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247H, 247I, 247L, 247T, 247Y, 250M, 252Y, 254D, 254E, 254I, 254P, 254Q, 254T, 254V, 255N, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 262L, 264S, 265H, 265Y, 267G, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271 Τ, 272H, 272L, 272N, 292A, 293S, 301W, 307E, 311E, 311S, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 330K, 330R, 332K,339K, 339M, 343I, 373S, 378D, 380D, 382D, 382F, 382N, 382P, 382R, 382S, 382W, 382Y, 385E, 385P, 423N, 424H, 424M ou 427N [preferivelmente 235G, 235S, 236R, 237E, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247I, 247L, 247T, 250M, 257A, 257I, 257M, 262L, 264S, 267G, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, 271 Τ, 272H, 301W, 311S, 327T, 329Y, 330K, 330R, 378D, 385E, 423N ou 424H], A molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc variante pode ser engenheirada (e.g. a partir de uma molécula de ácido nucleico codificando uma região Fc originário ou uma região Fc nativa) para compreender pelo menos uma substituição de aminoácido como listado acima ou enquanto a molécula de ácido nucleico é operavelmente ligada a ácido nucleico adicional codificando anticorpo, (e.g. a seqüência de ácidos nucleicos codificando o restante da cadeia pesada de Ig), ou o método pode adicionalmente compreender subseqüentemente operavelmente ligar o ácido nucleico codificando a região Fc variante depois de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 35/174
28/161 introdução de pelo menos uma substituição de aminoácido listada acima a ácido nucleico adicional codificando anticorpo. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante. O método pode adicionalmente compreender expressão e purificação do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário. O método pode adicionalmente compreender medir atividade de CDC do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante e do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário por qualquer método disponível na arte ou como descrito neste lugar. O método pode adicionalmente compreender selecionar um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante com atividade de CDC menor do que aquela do anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário (i.e., diminuída, preferivelmente em pelo menos 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% ou mais). A invenção incorpora adicionalmente um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante produzido pelo método.
[0036] Em outra forma de realização, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região Fc variante da invenção ou um fragmento funcional desta. Mais preferivelmente a molécula de ácido nucleico isolada compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção. Preferivelmente o polipeptídeo de região Fc variante codificado por dito ácido nucleico tem uma substituição de aminoácido como mostrado em Tabela 1 quando comparado à região Fc originário da variante. Preferivelmente, o polipeptídeo é um anticorpo monoclonal, e ainda mais preferivelmente, o anticorpo monoclonal é um anticorpo de comprimento completo ou um anticorpo de cadeia simples. O anticorpo monoclonal pode ser quimérico, humanizado ou anticorpo monoclonal humano.
[0037] Em outra forma de realização, a invenção fornece um vetor, preferivelmente (mas não limitado a) um plasmídeo, um vetor de expressão recombinante, um vetor de expressão de levedura, ou um vetor de expressão retroviral compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo de região Fc variante da invenção.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 36/174
29/161 [0038] Em outra forma de realização, a invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de ácido nucleico da presente invenção. Preferivelmente uma célula hospedeira da invenção compreende um ou mais vetores ou construtos compreendendo uma molécula de ácido nucleico da presente invenção. A célula hospedeira da invenção é uma célula na qual um vetor da invenção foi introduzido (e.g., através de transformação, transdução, infecção, transfecção, eletroporação e os semelhantes), dito vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo de região Fc variante da invenção. Opcionalmente, o vetor pode ser estavelmente incorporado no cromossomo da célula hospedeira. Os tipos de célula hospedeira incluem células de mamíferos, bacterianas, vegetais e de levedura. Preferivelmente a célula hospedeira é uma célula CHO, uma célula COS, uma célula SP2/0, uma célula NOS, uma célula de levedura ou uma derivada ou progenia de qualquer tipo de célula preferido.
[0039] Em outra forma de realização, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção, ou um fragmento funcional deste. Preferivelmente o polipeptídeo é um anticorpo monoclonal, ainda mais preferivelmente, um anticorpo monoclonal terapêutico. O anticorpo monoclonal pode ser um anticorpo monoclonal quimérico, humanizado, ou humano. Alternativamente, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo outro do que um anticorpo que se beneficia de uma meia vida no soro alterada conferida no polipeptídeo sendo operavelmente ligado a, e co-expresso com, uma região Fc variante da invenção. A composição farmacêutica da invenção pode adicionalmente compreender um portador farmaceuticamente aceitável. Em dita composição farmacêutica, o polipeptídeo compreendendo a região Fc variante é o ingrediente ativo. Preferivelmente a composição farmacêutica compreende uma população homogênea ou substancialmente homogênea de anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante da invenção. A composição farmacêutica para uso terapêutico é preferivelmente estéril e pode ser liofilizada.
[0040] A invenção fornece um método de inibir atividade de uma proteína em um
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 37/174
30/161 mamífero, preferivelmente um humano, com necessidade desta compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva, ou quantidade profilaticamente efetiva de um polipeptídeo (preferivelmente um anticorpo monoclonal) compreendendo uma região Fc variante da invenção para dito mamífero. Preferivelmente, o polipeptídeo compreendendo a região Fc variante é um parceiro de ligação da proteína a ser inibida. A invenção fornece adicionalmente um método de tratar ou prevenir uma doença ou desordem melhorada pela inibição de transdução sinal resultando da ligação de um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante da invenção ao seu epítopo antigênico que compreende administrar a um paciente (e.g., um humano) com necessidade de tal tratamento ou prevenção uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente efetiva de um anticorpo monoclonal da invenção.
[0041] A invenção incorpora um artigo de fabricação compreendendo um material de embalagem e um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo de região Fc variante da invenção contido dentro de dito material de embalagem. A invenção incorpora adicionalmente composições compreendendo anticorpos monoclonais e polipeptídeos heterólogos que compreendem uma região Fc variante descritos neste lugar e um portador ou diluente fisiologicamente ou farmaceuticamente aceitável.
[0042] Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo compreendendo: i) uma região de estrutura (“FR”) humana não modificada (e.g. nenhuma alteração foi feita em uma estrutura humana naturalmente ocorrente), e ii) uma região Fc variante. Em certas formas de realização a estrutura humana não modificada é uma estrutura humana de linhagem germinativa. Em outras formas de realização, a presente invenção fornece composições compreendendo um polipeptídeo, caracterizadas pelo fato de que o polipeptídeo compreende: i) pelo menos uma seqüência CDR aleatorizada e ii) uma região Fc variante da invenção. Em formas de realização adicionais, a presente invenção fornece composições compreendendo um polipeptídeo, caracterizadas pelo fato de que o polipeptídeo compreende: i) uma estrutura humana não modificada (e.g.,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 38/174
31/161 estrutura humana de linhagem germinativa), ii) pelo menos uma seqüência CDR aleatorizada, e iii) uma região Fc variante da invenção.
[0043] A presente invenção contempla usos terapêuticos e diagnósticos para polipeptídeos heterólogos de anticorpos monoclonais que compreendem uma região Fc variante da invenção, descritos neste lugar.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0044] Figura 1 mostra uma representação esquemática de uma molécula de IgG com as várias regiões e seções marcadas.
[0045] Figura 2 mostra um alinhamento de várias seqüências de aminoácidos de Fc originárias, incluindo lgG1 humana ((SEQ ID NO: 1) com alótipos não a e a mostrados), lgG2 humana (SEQ ID NO: 2), lgG3 humana (SEQ ID NO: 3), lgG4 humana (SEQ ID NO: 4), lgG1 murina (SEQ ID NO: 5), lgG2A murina (SEQ ID NO: 6), lgG2B murina (SEQ ID NO: 7) e lgG3 murina (SEQ ID NO: 8).
[0046] Figura 3 mostra várias seqüências de aminoácidos, incluindo a região CH2 (SEQ ID NO: 9), e região CH3 (SEQ ID NO: 10) de lgG1 humana, assim como uma seqüência de lgG1 humana alótipo f (SEQ ID NO: 11) e uma, alótipo z (SEQ ID NO: 12) que incluem as regiões CH1, dobradiça, CH2 e CH3.
[0047] Figura 4 mostra várias seqüências de aminoácidos compreendidas dentro de: (a) a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) de anticorpo anti-CD20 (I) (SEQ ID NO: 13); (b) a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) de anticorpo anti-CD20 (I) (SEQ ID NO: 14); (c) LCVR de anticorpo anti-CD20 (II) (SEQ ID NO: 15); e (d) HCVR de anticorpo anti-CD20 (II) (SEQ ID NO: 16). Fig. 4e mostra seqüências de aminoácidos compreendidas dentro da região variável de um anticorpo anti-CD20. (veja pedido provisório de Patente Norte-Americana 60/471.958, depositado em 20 de Maio de 2003 e Patente Norte-Americana 5.843.439, ambos incorporados neste lugar).
[0048] Figura 5a mostra a seqüência de aminoácidos de cadeia leve completa para o anticorpo anti-CD20 AME 133. Figura 5b mostra a seqüência de ácidos nucleicos de cadeia leve completa para AME 133.
[0049] Figura 6 mostra seqüências de aminoácidos e ácidos nucleicos para a
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 39/174
32/161 cadeia pesada completa de três variantes preferidas do anticorpo anti-CD20 AME 133. Especificamente, Figura 6a mostra a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada completa da variante 247I/339Q. Figura 6b mostra a seqüência de ácidos nucleicos da cadeia pesada completa da variante 247I/339Q. Figura 6c mostra a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada completa da variante 247I/339D. Figura 6d mostra a seqüência de ácidos nucleicos da cadeia pesada completa da variante 247I/339D. Figura 6e mostra a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada completa da variante 378D. Figura 6f mostra a seqüência de ácidos nucleicos da cadeia pesada completa da variante 378D.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0050] Do começo ao fim do presente relatório e reivindicações, a numeração dos resíduos de aminoácidos em uma cadeia pesada de imunoglobulina (região Fc) é aquela do índice EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). O “índice EU como em Kabat” se refere à numeração de resíduo do anticorpo de IgG humana e é refletido neste lugar na Fig. 2. Por exemplo, na posição 438, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 humanas e lgG3 murina todas têm um aminoácido Q, enquanto lgG1 murina tem um aminoácido I, lgG2a murina tem um aminoácido T, e lgG2B murina tem um aminoácido K. Além disso, substituições são denominadas neste lugar pelo número de posição de aminoácido na qual a substituição ocorre seguida pelo aminoácido substituído por aquele presente na região Fc originário na mesma posição (e.g., 249G indica um resíduo de glicina substituído por aquele presente na posição 249 da região Fc originário). O número se refere à posição em lgG1 humana indiferente se a região Fc originário é ou não lgG1 humana; se a região Fc originário não é lgG1 humana, o número se refere à posição homóloga na região Fc originário se esta fosse alinhada com lgG1 humana nesta posição.
[0051] Como usado neste lugar, os termos “sujeito” e “paciente” se referem a qualquer animal no qual um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção pode ser usado terapeuticamente, incluindo um humano assim como
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 40/174
33/161 outros mamíferos (tal como e.g., animais domésticos (e.g., canino, felino), animais de esporte (e.g., eqüino) e animais fonte de alimento (e.g., bovino, suíno e ovino)) que podem se beneficiar de tal terapia.
[0052] Como usado neste lugar, “tratar ou prevenir” se refere a uma doença ou desordem associada com níveis anormais de uma proteína ou beneficiada alterando uma atividade ou nível de uma proteína.
[0053] O termo “isolado” quando usado em relação a um ácido nucléico é um ácido nucléico que é identificado e separado de pelo menos um ácido nucléico contaminante com o qual ele é habitualmente associado em sua fonte natural. Ácido nucléico isolado é de alguma forma ou ajuste diferente daquele no qual é encontrado na natureza. Moléculas de ácidos nucleicos isoladas portanto são distinguidas da molécula de ácido nucléico como elas existem em células naturais. Uma molécula de ácido nucléico isolada inclui uma molécula de ácido nucléico contida em células que habitualmente expressam o polipeptídeo codificado nessa onde, por exemplo, a molécula de ácido nucléico está em um plasmídeo ou localização cromossômica diferente daquela de células naturais. A molécula de ácido nucléico isolada pode estar presente em forma de fita simples ou fita dupla. Quando uma molécula de ácido nucléico isolada é para ser utilizada para expressar uma proteína, o oligonucleotídeo ou polinucleotídeo irá conter no mínimo a fita sentido ou de codificação, mas pode conter ambas as fitas sentido e anti-sentido (i.e., pode ser de dupla fita).
[0054] Uma molécula de ácido nucléico é “operavelmente ligada” ou “operavelmente unida” quando ela é colocada em uma relação funcional com outra molécula de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor ou reforçador é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação de ácido nucléico se ele afeta a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação de ácido nucléico se ele é posicionado de forma a facilitar tradução. Uma molécula de ácido nucléico codificando uma região Fc variante é operavelmente ligada a uma molécula de ácido nucléico codificando uma proteína heteróloga (i.e., uma proteína ou fragmento funcional desta que não,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 41/174
34/161 como ela existe na natureza, compreende uma região Fc) se ela é posicionada de forma que a proteína de fusão expressa compreende a proteína heteróloga ou fragmento funcional desta unida ou acima ou abaixo do polipeptídeo de região Fc variante; a proteína heteróloga pode ser imediatamente adjacente ao polipeptídeo de região Fc variante ou pode ser separada deste por uma seqüência conectora de qualquer comprimento e composição. Da mesma maneira, uma molécula de polipeptídeo (usado sinonimamente neste lugar com “proteína”) é “operavelmente ligada” ou “operavelmente unida” quando ela é colocada em uma relação funcional com outro polipeptídeo.
[0055] Como usado neste lugar o termo “fragmento funcional” quando em referência a um polipeptídeo ou proteína (e.g., uma região Fc variante, ou um anticorpo monoclonal) se refere a fragmentos daquela proteína que retêm pelo menos uma função do polipeptídeo de comprimento completo. Os fragmentos podem variar em tamanho de seis aminoácidos até a seqüência de aminoácidos inteira do polipeptídeo de comprimento completo menos um aminoácido. Um fragmento funcional de um polipeptídeo de região Fc variante da presente invenção retém pelo menos uma “substituição de aminoácido” como neste lugar definido. Um fragmento funcional de um polipeptídeo de região Fc variante retém pelo menos uma função conhecida na arte por ser associada com a região Fc (e.g., ADCC, CDC, ligação de receptor de Fc, ligação de C1q, regulação para baixo de receptores de superfície celular ou pode, e.g., aumentar a meia vida in vivo ou in vitro de um polipeptídeo ao qual ele é operavelmente ligado).
[0056] O termo “purificado” ou “purificar” se refere à remoção substancial de pelo menos um contaminante de uma amostra. Por exemplo, um anticorpo antígenoespecífico pode ser purificado por remoção completa ou substancial (pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, ou mais preferivelmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99%) de pelo menos uma proteína não imunoglobulina contaminante; ele também pode ser purificado pela remoção de proteína imunoglobulina que não se liga ao mesmo antígeno. A remoção de proteínas não imunoglobulina e/ou a remoção de imunoglobulinas que não se ligam ao antígeno particular resulta em um
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 42/174
35/161 aumento no percentual de imunoglobulinas antígeno-específicas na amostra. Em outro exemplo, um polipeptídeo (e.g., uma imunoglobulina) expresso em células hospedeiras bacterianas é purificado pela remoção completa ou substancial de proteínas de célula hospedeira; o percentual do polipeptídeo é por causa disso aumentado na amostra.
[0057] O termo “nativo” ao se referir a um polipeptídeo (e.g., região Fc) é usado neste lugar para indicar que o polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácidos consistindo da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo como comumente ocorre na natureza ou um polimorfismo naturalmente ocorrente deste. Um polipeptídeo nativo (e.g., região Fc nativa) pode ser produzido por meio recombinante ou pode ser isolado de uma fonte naturalmente ocorrente.
[0058] O termo “vetor de expressão” como usado neste lugar se refere a uma molécula de DNA recombinante contendo uma seqüência de codificação desejada e seqüências de ácidos nucleicos apropriadas necessárias para a expressão da seqüência de codificação operavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular.
[0059] Como usado neste lugar, o termo “célula hospedeira” se refere a qualquer célula eucariótica ou procariótica (e.g., células bacterianas tal como E. coli, células CHO, células de levedura, células de mamífero, células de ave, células de anfíbio, células vegetais, células de peixe, e células de inseto), quer localizada in vitro ou in situ, ou in vivo. Por exemplo, células hospedeiras podem ser localizadas em um animal transgênico.
[0060] Como usado neste lugar um “polipeptídeo originário” é um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos que pode ser trocada ou alterada (e.g., uma substituição de aminoácido) para produzir uma variante (i.e., polipeptídeo variante). Em formas de realização preferidas, o polipeptídeo originário compreende pelo menos uma porção de uma região Fc nativa ou não nativa, i.e., uma região Fc naturalmente ocorrente ou uma região Fc com pelo menos uma modificação de seqüência de aminoácidos. Em algumas formas de realização, variantes que são mais curtas ou mais compridas do que o polipeptídeo originário são especificamente
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 43/174
36/161 contempladas. Em formas de realização particularmente preferidas, o polipeptídeo originário difere em função (e.g., realçada ou diminuída função efetora, ligação de receptor, meia vida in vivo ou in vitro, etc.) quando comparado à variante.
[0061] Como usado neste lugar, o termo “variante de um polipeptídeo originário” se refere a um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos que difere daquela do polipeptídeo originário por pelo menos uma substituição de aminoácido. Em certas formas de realização, a variante compreende pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% ou mais preferivelmente pelo menos 95%, 97% ou 99% de uma região Fc (i.e., uma “porção” da região Fc). Em formas de realização preferidas, a região Fc variante de um polipeptídeo originário compreende pelo menos uma substituição de aminoácido do polipeptídeo originário, a substituição sendo na região Fc. O polipeptídeo originário pode ser ou não ser um polipeptídeo nativo.
[0062] Como usado neste lugar, o termo “região Fc” se refere a uma região Cterminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina (e.g., como mostrado na Fig. 1). A “região Fc” pode ser uma região Fc de seqüência nativa ou uma região Fc variante. Embora os limites geralmente aceitos da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é normalmente definida para esticar a partir de um resíduo de aminoácido na posição Cis226, ou a partir de Pro230, para o término carboxílico desta. A região Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, CH2 e CH3, como mostrado, e.g., na Fig. 1. Em algumas formas de realização, variantes tendo um ou mais dos domínios constantes são contempladas. Em outras formas de realização, variantes sem tais domínios constantes (ou apenas com porções de tais domínios constantes) são contempladas.
[0063] O “domínio CH2” de uma região Fc de IgG humana (também referido como domínio “Ογ2”) normalmente se estende a partir de cerca de aminoácido 231 a cerca de aminoácido 340 (veja Fig. 2). O domínio CH2 é único por não ser proximamente pareado com outro domínio. Duas cadeias ramificadas de carboidrato N-conectadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 44/174
37/161 nativa intacta.
[0064] O “domínio CH3” de uma região Fc de IgG humana (também referido como domínio “Ογ3”) geralmente é o esticamento de resíduos C-terminais para um domínio CH2 em uma região Fc se estendendo de cerca de aminoácido 341 a cerca de aminoácido 447 (veja Fig. 2).
[0065] Uma “região Fc funcional” possui uma “função efetora” de uma região Fc de seqüência nativa. Pelo menos uma função efetora de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da presente invenção pode ser realçada ou diminuída com respeito a um polipeptídeo compreendendo uma região Fc nativa ou a região Fc originário da variante. Exemplos de funções efetoras incluem, mas não são limitados a: ligação de Clq; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor de Fc; citotoxicidade célula-mediada dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação para baixo de receptores de superfície celular (e.g., receptor de célula B; BCR), etc. Tais funções efetoras podem requerer que a região Fc seja operavelmente ligada a um domínio de ligação (e.g., um domínio variável de anticorpo) e podem ser verificadas usando vários ensaios (e.g., ensaio de ligação de Fc, ensaios de ADCC, ensaios de CDC, depleção de célula alvo de amostras de sangue inteiras ou fracionadas, etc.).
[0066] Uma “região Fc de seqüência nativa” ou “região Fc tipo selvagem” se refere a uma seqüência de aminoácidos que é idêntica à seqüência de aminoácidos de uma região Fc comumente encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de seqüência nativa exemplares são mostradas na Figura 2 e incluem uma região Fc de lgG1 humana de seqüência nativa (alótipos f e a,z, i.e., alótipos não A e A); região Fc de lgG2 humana de seqüência nativa; região Fc de lgG3 humana de seqüência nativa; e região Fc de lgG4 humana de seqüência nativa assim como variantes naturalmente ocorrentes destas. Regiões Fc murinas de seqüência nativa também são mostradas na Figura 2.
[0067] Uma “região Fc variante” compreende uma seqüência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de seqüência nativa (ou fragmento desta) por virtude de pelo menos uma “substituição de aminoácido” como definido neste lugar.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 45/174
38/161
Em formas de realização preferidas, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada com uma região Fc de seqüência nativa ou na região Fc de um polipeptídeo originário, preferivelmente 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos na região Fc de seqüência nativa ou na região Fc de um polipeptídeo originário. Em uma forma de realização alternativa, uma região Fc variante pode ser gerada de acordo com os métodos neste lugar descritos e esta região Fc variante pode ser fusionada a um polipeptídeo heterólogo de escolha, tal como um domínio variável de anticorpo ou um polipeptídeo não anticorpo, e.g., ligando domínio de um receptor ou ligante.
[0068] Como usado neste lugar, o termo “derivado” no contexto de polipeptídeos se refere a um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos que foi alterada por introdução de uma substituição de resíduo de aminoácido. O termo “derivado” como usado neste lugar também se refere a um polipeptídeo que foi modificado pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao polipeptídeo. Por exemplo, mas não de maneira a limitar, um anticorpo pode ser modificado, e.g., por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, divagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. Um polipeptídeo derivado pode ser produzido por modificação química usando técnicas conhecidas por aqueles de verso na arte, incluindo, mas não limitadas à divagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Ademais, um polipeptídeo derivado possui uma função similar ou idêntica que o polipeptídeo do qual ele é derivado. É entendido que um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da presente invenção pode ser um derivado como definido neste lugar, preferivelmente a derivação ocorre dentro da região Fc.
[0069] “Substancialmente de origem humana” como usado neste lugar em referência a um polipeptídeo (e.g., uma região Fc ou um anticorpo monoclonal), indica que polipeptídeo tem uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou ainda mais preferivelmente pelo menos 95%,96%, 97%, 98% ou 99% homóloga àquela de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 46/174
39/161 um polipeptídeo amino humano nativo.
[0070] Os termos “receptor de Fc” ou “FcR” são usados para escrever um receptor que se liga a uma região Fc (e.g., a região Fc de um anticorpo). O FcR preferido é um FcR de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo de IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas processadas destes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um “receptor ativador”) e FcyRIIB (um “receptor inibidor”), que têm seqüências de aminoácidos similares que diferem primariamente nos domínios citoplasmáticos destas. FcRs são revistos em Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capei, et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcR preferidos incluem o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são abrangidos pelo termo “FcR” neste lugar.
[0071] A frase “citotoxicidade célula-mediada dependente de anticorpo” e “ADCC” se refere a uma reação célula-mediada na qual células citotóxicas não específicas (e.g., não específicas) que expressam FcRs (e.g., células exterminadoras naturais (“NK”), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado em uma célula alvo e subseqüentemente causam a lise das células alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, ao passo que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII.
[0072] Como usado neste lugar, a frase “células efetoras” se refere a leucócitos (preferivelmente humanos) que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferivelmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora ADCC. Exemplos de leucócitos que mediam ADCC incluem PBMC, células NK, monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa (e.g. de sangue ou PBMCs).
[0073] Um polipeptídeo variante com afinidade de ligação de FcRn “alterada” é um que tem afinidade de ligação de FcRn ou realçada (i.e., aumentada, maior ou
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 47/174
40/161 superior) ou diminuída (i.e., reduzida, decrescida ou menor) comparado ao polipeptídeo originário de variante ou a um polipeptídeo compreendendo uma região Fc nativa quando medido em pH 6,0. Um polipeptídeo variante que manifesta ligação aumentada ou afinidade de ligação aumentada com um FcRn, se liga a FcRn com maior afinidade do que o polipeptídeo originário. Um polipeptídeo variante que manifesta ligação diminuída ou afinidade de ligação diminuída com um FcRn, se liga a FcRn com menor afinidade do que o polipeptídeo originário. Tais variantes que manifestam ligação diminuída com um FcRn podem possuir pequena ou nenhuma ligação apreciável com um FcRn, e.g., 0-20% de ligação ao FcRn comparado com um polipeptídeo originário. Um polipeptídeo variante que se liga a um FcRn com “afinidade realçada” quando comparado ao seu polipeptídeo originário, é um que se liga a FcRn com maior afinidade de ligação do que o polipeptídeo originário, quando as quantidades de polipeptídeo variante e polipeptídeo originário em um ensaio de ligação são essencialmente as mesmas, e todas as outras condições são idênticas. Por exemplo, um polipeptídeo variante com afinidade de ligação de FcRn realçada pode manifestar de cerca de 1,10 vez a cerca de 100 vezes (mais tipicamente de cerca de 1,2 vez a cerca de 50 vezes) de aumento em afinidade de ligação de FcRn comparado com o polipeptídeo originário, onde afinidade de ligação de FcRn é determinada, por exemplo, em um ensaio ELISA ou outro método disponível para um de habitual verso na arte.
[0074] Como usado neste lugar, uma “substituição de aminoácido” se refere à reposição de pelo menos um resíduo de aminoácido existente em uma dada seqüência de aminoácidos com outro diferente resíduo de aminoácido “de reposição”. O resíduo ou resíduos de reposição podem ser “resíduos de aminoácidos naturalmente ocorrentes” (i.e., codificados pelo código genético) e selecionadas de: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gin); ácido glutâmico (Glu), glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (lie); leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); e valina (Vai). Substituição com um ou mais resíduos de aminoácidos não naturalmente
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 48/174
41/161 ocorrentes é também abrangida pela definição de uma substituição de aminoácido neste lugar. Um “resíduo de aminoácido não naturalmente ocorrente” se refere a um resíduo, outro do que aqueles resíduos de aminoácidos naturalmente ocorrentes listados acima, que é capaz de se ligar covalentemente ao(s) resíduo(s) de aminoácido adjacente(s) em uma cadeia de polipeptídeo. Exemplos de resíduos de aminoácidos não naturalmente ocorrentes incluem norleucina, omitina, norvalina, homoserina e outros análogos de resíduo de aminoácido tal como aqueles descritos em Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991).
[0075] O termo “sinal de ensaio” se refere à produção de qualquer método de detectar interações proteína-proteína, incluindo mas não limitado a, medidas de absorbância a partir de ensaios calorimétricos, intensidade de fluorescência, ou desintegrações por minuto. Formatos de ensaios podem incluir ELISA, facs, ou outros métodos. Uma mudança no “sinal de ensaio” pode refletir uma mudança em viabilidade de célula e/ou uma mudança na taxa-off cinética, na taxa-on cinética, ou ambas. Um “sinal de ensaio superior” se refere ao número de produção medido sendo maior do que outro número (e.g., uma variante pode ter um número medido superior (maior) em um ensaio ELISA quando comparado ao polipeptídeo originário). Um sinal de ensaio “inferior” se refere ao número de produção medido sendo menor do que outro número (e.g., uma variante pode ter um número medido inferior (menor) em um ensaio ELISA quando comparado ao polipeptídeo originário).
[0076] O termo “afinidade de ligação” se refere à constante de dissociação de equilíbrio (expressa em unidades de concentração) associada com cada interação receptor de Fc-ligação de Fc. A afinidade de ligação é diretamente relacionada com a proporção da constante de dissociação cinética (geralmente relatada em unidades de tempo inverso, e.g., segundos-1) dividida pela constante de associação cinética (geralmente relatada em unidades de tempo, e.g., molar/segundo). Em geral não é possível determinar inequivocamente se mudanças em constantes de dissociação de equilíbrio são devido a diferenças em constantes de associação, constantes de dissociação ou ambas a menos que cada um destes parâmetros sejam experimentalmente determinados (e.g., por medidas BIACORE ou SAPIDYNE).
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 49/174
42/161 [0077] Como usado neste lugar, o termo “região de dobradiça” se refere ao esticamento de aminoácidos em lgG1 humana esticando de Glu216 a Pro230 de lgG1 humana. Regiões de dobradiça de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a seqüência de IgG colocando o primeiro e último resíduo de cisteína formando ligações S-S entre cadeias pesadas nas mesmas posições.
[0078] “Clq” é um polipeptídeo que inclui um sítio de ligação para a região Fc de uma imunoglobulina. Clq junto com duas serina proteases, Clr e CIs, formam o complexo Cl, o primeiro componente da via de CDC.
[0079] Como usado neste lugar, o termo “anticorpo” é usado permutavelmente com “imunoglobulina” ou “Ig”, é usado no mais amplo sentido e especificamente cobre anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multi-específicos (e.g. anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica ou atividade funcional desejada. Anticorpos de cadeia simples, e anticorpos quiméricos, humanos, humanizados ou primatizados (CDRtransplantado), assim como anticorpos quiméricos ou CDR-transplantado de cadeia simples, e os semelhantes, compreendendo porções derivadas de diferentes espécies, também são abrangidos pela presente invenção e o termo “anticorpo”. As várias porções destes anticorpos podem ser unidas quimicamente por técnicas convencionais, sinteticamente, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua usando técnicas de engenharia genética. Por exemplo, ácidos nucleicos codificando uma cadeia quimérica ou humanizada podem ser expressas para produzir uma proteína contígua. Veja, e.g., Patente Norte-Americana No. 4.816.567; Patente Européia No. 0.125.023 B1; Patente Norte-Americana No. 4.816.397; Patente Européia No. 0.120.694 B1; WO 86/01533; Patente Européia No. 0.194.276 B1; Patente Norte-Americana No. 5.225.539; Patente Européia No. 0.239.400 B1 Patente Norte-Americana Nos. 5.585.089 e 5.698.762. Veja também, Newman, R. et al. BioTechnology, 10:1455-1460, 1993, considerando anticorpo primatizado, e Ladner et al., Patente Norte-Americana No. 4.946.778 e Bird, R.E. et al., Science, 242:423-426, 1988, considerando anticorpos de cadeia simples. É entendido que
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 50/174
43/161 todas as formas dos anticorpos compreendendo uma região Fc (ou porção desta) são abrangidas neste lugar dentro do termo “anticorpo”. Além disso, o anticorpo pode ser marcado com uma marca detectável, imobilizado em uma fase sólida e/ou conjugado com um composto heterólogo (e.g., uma enzima ou toxina) de acordo com métodos conhecidos na arte.
[0080] Como usado neste lugar, o termo “fragmentos de anticorpos” se refere a uma porção de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não são limitados a, anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; peptídeos Fc ou Fc', Fab e fragmentos Fab, e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Os fragmentos de anticorpos preferivelmente retêm pelo menos parte da dobradiça e opcionalmente a região CH1 de uma cadeia pesada de IgG. Em outras formas de realização preferidas, os fragmentos de anticorpos compreendem pelo menos uma porção da região CH2 ou a região CH2 inteira.
[0081] Como usado neste lugar, o termo “fragmento funcional”, quando usado em referência a um anticorpo monoclonal, é pretendido para se referir a uma porção do anticorpo monoclonal que ainda retém uma atividade funcional. Uma atividade funcional pode ser, por exemplo, atividade ou especificidade de ligação de antígeno, atividade ou especificidade de ligação de receptor, atividade de função efetora e as semelhantes. Fragmentos funcionais de anticorpo monoclonal incluem, por exemplo, cadeias pesadas ou leves individuais e fragmentos destas, tal como VL, VH e Fd; fragmentos monovalentes, tal como Fv, Fab, e Fab'; fragmentos bivalentes tal como F(ab')2; Fv de cadeia simples (scFv); e fragmentos Fc. Tais termos são descritos em, por exemplo, Harlowe and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., ell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) e em Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). O termo fragmento funcional é pretendido para incluir, por exemplo, fragmentos produzidos por digestão ou redução
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 51/174
44/161 de protease de um anticorpo monoclonal e por métodos de DNA recombinante conhecidos por aqueles versados na arte.
[0082] Como usado neste lugar, o termo “fragmento” se refere a um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 5, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 90, 100 ou mais resíduos de aminoácidos contíguos da seqüência de aminoácidos de outro polipeptídeo. Em uma forma de realização preferida, um fragmento de um polipeptídeo retém pelo menos uma função do polipeptídeo de comprimento completo.
[0083] Como usado neste lugar, o termo “anticorpo quimérico” inclui imunoglobulinas monovalentes, desalentes ou polivalentes. Um anticorpo quimérico monovalente é um dímero formado por uma cadeia quimérica pesada associada através de pontes dissulfeto com uma cadeia quimérica leve. Um anticorpo quimérico divalente é um tetrâmero formado por dois dímeros de cadeia pesadacadeia leve associada através de pelo menos uma ponte dissulfeto. Uma cadeia quimérica pesada de um anticorpo para uso em humanos compreende uma região de ligação de antígeno derivada da cadeia pesada de um anticorpo não humano, que é ligada a pelo menos uma porção de uma região constante de cadeia pesada humana, tal como CH1 ou CH2. Uma cadeia quimérica leve de um anticorpo para uso em humanos compreende uma região de ligação de antígeno derivada da cadeia leve de um anticorpo não humano, ligada a pelo menos uma porção de uma região constante de cadeia leve humana (CL). Anticorpos, fragmentos ou derivados tendo cadeias quiméricas pesadas e cadeias leves da mesma ou diferente especificidade de ligação de região variável, também podem ser preparados por associação apropriada das cadeias individuais de polipeptídeo, de acordo com etapas de método conhecido. Com esta abordagem, hospedeiros expressando cadeias quiméricas pesadas são cultivados separadamente de hospedeiros expressando cadeias quiméricas leves, e as cadeias de imunoglobulina são separadamente recuperadas e então associadas. Alternativamente, os hospedeiros podem ser co-cultivados e as cadeias permitidas para se associar espontaneamente no meio de cultura, seguido por recuperação da imunoglobulina reunida ou
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 52/174
45/161 fragmento ou ambas as cadeias pesadas e leves podem ser expressas na mesma célula hospedeira. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na arte (veja, e.g., Patente Norte-Americana Nos.: 6.284.471; 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397).
[0084] Como usado neste lugar, formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (e.g., murina) (i.e., anticorpos humanizados) são anticorpos que contêm mínimo de seqüências, ou nenhuma seqüência, derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo destinatário) nas quais resíduos de uma região hiper variável do receptivo são repostos por resíduos de uma região hiper variável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em algumas instâncias, resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são repostos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptivo ou no anticorpo doador. Estas modificações são geralmente feitas para adicionalmente refinar performance de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos as alças hiper variáveis (CDRs) correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os resíduos FR são aqueles de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Um método exemplar usado para gerar anticorpos humanizados é descrito em Patente Norte-Americana No. 5.225.539.
[0085] Como usado neste lugar, o termo “imunoadesina” designa moléculas tipo anticorpo que combinam o domínio de ligação de uma proteína “adesina” heteróloga (e.g., um receptor, ligante ou enzima) com um domínio constante de imunoglobulina. Estruturalmente, imunoadesinas compreendem uma fusão da seqüência de aminoácidos de adesina com a especificidade de ligação desejada que é outra do
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 53/174
46/161 que o sítio de reconhecimento e ligação de antígeno (sítio de combinação de antígeno) de um anticorpo (i.e., é “heterólogo”) com uma seqüência de domínio constante de imunoglobulina.
[0086] Como usado neste lugar, o termo “domínio de ligação de receptor” se refere a qualquer receptor nativo ou qualquer região ou derivado deste retendo pelo menos uma habilidade qualitativa de ligação de ligante de um receptor nativo correspondente. Em certas formas de realização, o receptor é de um polipeptídeo de superfície celular tendo um domínio extracelular que é homólogo a um membro da supergenefamília de imunoglobulina. Outros receptores, que não são membros da supergenefamília de imunoglobulina mas são contudo especificamente cobertos por esta definição, são receptores para citocinas, e em particular receptores com atividade de tirosina quinase (tirosina quinases de receptor), membros das superfamílias de receptor de hematopoietina e fator de crescimento de nervo, e moléculas de adesão de célula (e.g., E-, L-, e P-seletinas).
[0087] Como usado neste lugar, o termo “domínio de ligação de receptor” se refere a qualquer ligante nativo para um receptor, incluindo, e.g., moléculas de adesão de célula, ou qualquer região ou derivado de tal ligante nativo retendo pelo menos uma habilidade qualitativa de ligação de receptor de um ligante nativo correspondente.
[0088] Como usado neste lugar, o termo “quimera anticorpo-imunoadesina” compreende uma molécula que combina pelo menos um domínio de ligação de um anticorpo com pelo menos uma imunoadesina. Exemplos incluem, mas não são limitados a, quimeras CD4-lgG biespecíficas descritas em Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) e Charnow et al., J. Immunol., 153:4268 (1994).
[0089] Como usado neste lugar, um polipeptídeo “isolado” é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente em seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que iriam interferir em usos diagnósticos ou terapêuticos para o polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em certas formas de realização, o polipeptídeo isolado é purificado (1) para mais do que
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 54/174
47/161
95% em peso de polipeptídeos como determinado pelo método de Lowry, e preferivelmente, mais do que 99% em peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácidos N-terminal ou internai por uso de um seqüenciador de alta rotação, ou (3) para homogeneidade por SDS-page sob condições redutoras ou não redutoras usando corante azul de Coomassie ou prata. Polipeptídeo isolado inclui o polipeptídeo in situ dentro de células recombinantes desde que pelo menos um componente do ambiente natural de polipeptídeo não esteja presente. Habitualmente, entretanto, polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[0090] Como usado neste lugar, o termo “tratamento” se refere a ambos tratamentos terapêutico e profilático ou medidas preventivas. Aqueles sujeitos ou pacientes com necessidade de tratamento incluem aqueles já com a desordem assim como aqueles nos quais a desordem está para ser prevenida.
[0091] Como usado neste lugar, os termos “desordem” e “doença” são usados permutavelmente para se referir a qualquer condição que iria se beneficiar de tratamento com um polipeptídeo variante (um polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção), incluindo desordens ou doenças crônicas e agudas (e.g., condições patológicas que predispõem um paciente a uma desordem particular). Em certas formas de realização, o termo “doença auto-imune” é usado permutavelmente com o termo “desordem auto-imune” para se referir a uma condição em um sujeito caracterizado por injúria celular, de tecido e/ou órgão causada por uma reação imunológica do sujeito para suas próprias células, tecidos e/ou órgãos. O termo “doença inflamatória” é usado permutavelmente com o termo “desordem inflamatória” para se referir a uma condição em um sujeito caracterizado por inflamação. Desordens auto-imunes podem ou não ser associadas com inflamação. Além disso, inflamação pode ou não ser causada por desordem autoimune. Certas desordens podem ser caracterizadas como ambas desordens autoimunes e inflamatórias.
[0092] Como usado neste lugar, os termos “câncer” e “canceroso” se referem a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 55/174
48/161 por crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de célula esquamosa, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma esquamoso de pulmão, câncer de peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de colo, câncer coloretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireóide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço. Como usado neste lugar, o termo “marca” se refere a um composto ou composição detectável que é conjugado diretamente ou indiretamente a um polipeptídeo. A marca pode por si própria ser detectável (e.g. marcas de radioisótopos ou marcas fluorescentes) ou, no caso de uma marca enzimática, pode catalisar alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.
[0093] Como usado neste lugar, o termo “receptor” se refere a um polipeptídeo capaz de se ligar à pelo menos um ligante. O receptor preferido é um receptor de superfície celular ou solúvel tendo um domínio extracelular de ligação de ligante e, opcionalmente, outros domínios (e.g., domínio transmembrana, domínio intracelular e/ou âncora de membrana). Um receptor a ser avaliado em um ensaio descrito neste lugar pode ser um receptor intacto ou um fragmento ou derivado deste (e.g. uma proteína de fusão compreendendo o domínio de ligação do receptor fusionado a um ou mais polipeptídeos heterólogos). Além disso, receptor a ser avaliado para suas propriedades de ligação pode estar presente em uma célula ou isolado e opcionalmente revestido em uma placa de ensaio ou alguma outra fase sólida ou marcado diretamente e usado como uma sonda.
[0094] Como usado neste lugar, o termo “doença responsiva a anticorpo” se refere a qualquer doença ou condição médica que é mostrada ser tratável, pelo menos em parte, com terapia de anticorpo. Exemplos de tais doenças e condições
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 56/174
49/161 médicas incluem, mas não são limitados a, linfoma (mostrado ser tratável com RITUXAN), doença infecciosa (vírus sincial respiratório mostrado ser tratável com SYNAGIS), transplante de rim (ZENAPAX mostrou ser útil), doença de Crohn e artrite reumatóide (mostrado ser tratável com REMICADE), carcinoma de mama (mostrado ser tratável com HERCEPTIN), e câncer de colo (mostrado ser tratável com EDRECOLOMAB). Como usado neste lugar, o termo “doença responsiva a imunoadesina”, se refere a qualquer doença ou condição médica que é mostrada ser tratável, pelo menos em parte, com terapia de imunoadesina.
[0095] Como usado neste lugar um polipeptídeo variante que “media citotoxicidade célula-mediada dependente de anticorpo (ADCC) na presença de células efetoras humanas mais efetivamente” do que um anticorpo originário é um que in vitro ou in vivo é substancialmente mais efetivo em mediar ADCC, quando as quantidades usadas de polipeptídeo variante e anticorpo originário no ensaio são essencialmente as mesmas. Por exemplo, uma tal variante causa uma quantidade superior de lise de célula alvo em um dado ensaio de ADCC do que o polipeptídeo originário em um ensaio de ADCC idêntico. Tais variantes podem ser identificadas, por exemplo, usando um ensaio de ADCC, mas outros ensaios e métodos para determinar atividade de ADCC também podem ser empregados (e.g., modelos animais). Em formas de realização preferidas, o polipeptídeo variante é de cerca de 1,2, 1,3 ou 1,4 vez, 1,5 vez, 50 vezes, 100 vezes, cerca de 500 vezes, ou cerca de 1000 vezes mais efetivo em mediar ADCC do que o polipeptídeo originário.
[0096] O termo “sintomas de uma doença responsiva a anticorpo ou imunoadesina” se refere àqueles sintomas geralmente associados com uma doença particular. Por exemplo, os sintomas geralmente associados com a doença de Crohn incluem: dor abdominal, diarréia, sangramento retal, perda de peso, febre, perda de apetite, desidratação, anemia, distensão, fibrose, intestinos inflamados e desnutrição. A frase “sob condições tais que os sintomas são reduzidos” se refere a qualquer grau de redução qualitativa ou quantitativa em sintomas detectáveis de qualquer doença responsiva a anticorpo ou imunoglobulina, incluindo mas não limitados a, um impacto detectável na taxa de recuperação de doença (e.g., taxa de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 57/174
50/161 ganho de peso), ou a redução de pelo menos um dos sintomas normalmente associados com a doença particular (e.g., se a doença responsiva a anticorpo ou imunoglobulina fosse doença de Crohn, uma redução de pelo menos um dos seguintes sintomas: dor abdominal, diarréia, sangramento retal, perda de peso, febre, perda de apetite, desidratação, anemia, distensão, fibrose, intestinos inflamados e desnutrição).
Anticorpos Monoclonais e Receptores [0097] Um anticorpo de comprimento completo (“Imunoglobulina” ou “Ig”) como ele existe naturalmente é uma molécula de imunoglobulina compreendida por quatro cadeias de peptídeo, duas cadeias pesadas (H) (cerca de 50-70 kDa quando de comprimento completo) e duas cadeias leves (L) (cerca de 25 kDa quando de comprimento completo) interconectadas por pontes dissulfeto. A porção amino terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100-110 ou mais aminoácidos primariamente responsável por reconhecimento de antígeno. A porção carboxi terminal de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável por função efetora.
[0098] Cadeias leves são classificadas como capa ou lâmbda e caracterizadas por uma região constante particular. Cadeias pesadas são classificadas como gama, um, alfa, delta, ou epsilon, e definem os isotipos de anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectivamente. Cada tipo de cadeia pesada é caracterizado por uma região constante particular.
[0099] Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (neste lugar “HCVR”) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios (CH1, CH2, e CH3) para IgG, IgD, e IgA; e 4 domínios (CH1, CH2, CH3, e CH4) para IgM e IgE. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (neste lugar “LCVR”) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios. As regiões HCVR e LCVR podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hiperatividade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), transpostas com regiões que são
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 58/174
51/161 mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada HCVR e LCVR é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas do término amino para o término carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A designação de aminoácidos para cada domínio é em conformidade com convenções bem conhecidas [e.g., Kabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]. A habilidade funcional de um anticorpo para se ligar a um antígeno particular é determinada coletivamente pelos seis CDRs. Entretanto, mesmo um domínio variável único compreendendo apenas três CDRs específico para um antígeno pode ter a habilidade para reconhecer e se ligar ao antígeno, embora com uma menor afinidade do que um Fab completo.
[0100] Anticorpos monoclonais da invenção podem ser produzidos usando e.g., técnicas de hibridoma bem conhecidas na arte, assim como tecnologias recombinantes, tecnologias de manifestação de fago, tecnologias sintéticas ou combinações de tais tecnologias prontamente conhecidas na arte. O termo “anticorpo monoclonal” como usado neste lugar não é limitado a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. “Anticorpo monoclonal” se refere a um anticorpo que é derivado de uma cópia única ou clone, incluindo e.g. qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago, e não ao método pelo qual é produzido. Um “anticorpo monoclonal” pode ser um anticorpo intacto (completo ou de comprimento completo), um anticorpo substancialmente intacto, um fragmento funcional de um anticorpo, ou ele pode ser um anticorpo quimérico, anticorpo humano, ou anticorpo humanizado.
[0101] Uma população de “anticorpos monoclonais” se refere a uma população de anticorpos homogênea ou substancialmente homogênea (ou pura) (i.e., pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% ou 98% ou mais preferivelmente pelo menos 99% dos anticorpos na população são idênticos e iriam competir em um ensaio ELISA pelo mesmo antígeno ou epítopo).
[0102] O termo “se liga especificamente” ou “se liga preferencialmente” como usado neste lugar se refere à situação na qual um membro de um par de ligação
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 59/174
52/161 específico não se liga significantemente a outras moléculas do que seu parceiro de ligação específico. O termo também é aplicável onde e.g., um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo da invenção é específico para um epítopo particular que é carregado por diversos antígenos, em cujo caso o anticorpo específico carregando o domínio de ligação de antígeno irá ser capaz de se ligar aos vários antígenos carregando o epítopo.
[0103] A região Fc se refere à porção de um anticorpo intacto, e.g., IgG, gerada por digestão com a enzima papaína (veja Fig. 1). A região Fc é um homodímero com cada cadeia sendo compreendida de uma porção da região de dobradiça assim como os domínios CH2 e CH3. A região Fc é um dímero devido a pontes dissulfeto entre cadeias formadas entre as regiões de dobradiça e ligações não covalentes múltiplas entre os domínios CH3. IgG é a classe mais abundante de lg no corpo, constituindo aproximadamente 75% da imunoglobulina total e distribuída igualmente dentro das combinações intravascular e extravascular. Muito pouca IgG é produzida durante os estágios anteriores da resposta primária a antígeno mas é a principal forma de anticorpo produzida durante a resposta secundária.
[0104] Como descrito acima, anticorpos têm regiões, primariamente as regiões CH2 e CH3, que são envolvidas em funções de ligação de não antígeno. Juntas, estas regiões e uma porção da seqüência de conexão são geralmente conhecidas como a região Fc, e têm diversas funções efetoras mediadas por ligação de moléculas efetoras.
[0105] As funções efetoras mediadas pela região Fc de anticorpo podem ser divididas em duas categorias: (1) funções efetoras que operam depois da ligação de anticorpo a um antígeno (estas funções envolvem, por exemplo, a participação da cascata de complemento ou células transportando receptor de Fc (FcR)); e (2) funções efetoras que operam independentemente de ligação de antígeno (estas funções conferem, por exemplo, persistência na circulação e a habilidade de ser transferido através de barreiras celulares por transcitose). Por exemplo, ligação do componente Clq de complemento a anticorpos, ativa o sistema de complemento. Seguindo opsonização, ativação de complemento é importante na lise de patógenos
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 60/174
53/161 de célula. A ativação de complemento também estimula a resposta inflamatória e também pode estar envolvida em hipersensibilidade auto-imune. Ademias, anticorpos se ligam a células através da região Fc, com um sítio de ligação de receptor de Fc na região Fc de anticorpo se ligando a um Fc em uma célula. Existem diversos FcRs que são específicos para diferentes classes de anticorpo, incluindo IgG, IgE, IgA e IgM. Enquanto a presente invenção não é limitada por um mecanismo particular, ligação de anticorpo a FcR em superfícies celulares desencadeia várias importantes e diversas respostas biológicas incluindo englobamento e destruição de partículas revestidas com anticorpo, depuração de complexos imunes, lise de células alvo revestidas com anticorpo por células assassinas (ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle de produção de imunoglobulina.
[0106] Diversas funções efetoras de anticorpo são mediadas por FcRs, que se ligam à região Fc de um anticorpo. FcRs são definidos por sua especificidade para isotipos de imunoglobulina; receptores de Fc para anticorpos IgG são referidos como FcyR, para IgE com FceR, para IgA como FcaR e assim por diante. Três subclasses de FcyR foram identificadas: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16).
[0107] Pelo fato de cada subclasse de FcyR ser codificada por dois ou três genes, um processamento alternativo de RNA leva a transcritos múltiplos, existe uma ampla diversidade de isoformas de FcyR. Os três genes codificando a subclasse FcyRI (FcyRIA, FcyRIB e FcyRIC) são agrupados na região I q21.1 do braço longo de cromossomo 1; os genes codificando isoformas de FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB e FcyRIIC) e os dois genes codificando FcyRIII (FcyRIIIA e FcyRIIIB) são agrupados na região 1q22. Estes diferentes subtipos de FcR são expressos em diferentes tipos de célula (e.g., Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9? 457-492 (1991)). Por exemplo, em humanos, FcyRIIIB é encontrado apenas em neutrófilos, ao passo que FcyRIIIA é encontrado em macrófagos, monócitos, células NK, e uma subpopulação de células-T. Notavelmente, FcyRIIIA está presente em células NK, um dos tipos celulares implicados em ADCC.
[0108] Receptor FcyRIIIA humano (CD16) tem um polimorfismo comum em
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 61/174
54/161 posição 158 em seu domínio extracelular codificando ou uma fenilalanina ou valina nesta posição. O alelo V de FcyRIIIA tem afinidade superior à lgG1 humana do que o alelo F. O alelo V158 também media ADCC mais eficientemente. Dados clínicos mostraram uma correlação entre o genótipo de receptor FcyRIIIA em pacientes passando por tratamento com Rituxan e resposta terapêutica. Ambas as respostas clínica e molecular e tempo para progressão foram mostrados serem superiores em pacientes homozigotos para o genótipo FcyRIIIA-158V (aproximadamente 20% da população). Em contraste, pacientes heterozigotos ou homozigotos para o genótipo de afinidade inferior FcyRIIIA-158F (aproximadamente 80% da população) respondem mais insuficientemente. Estes dados sugerem que mutações de Fc que realçam atividade de ADCC dos portadores de 158F podem realçar a eficácia clínica de terapia de câncer baseada em anticorpo. Um polimorfismo genético também está presente em receptor FcyRIIA humano (CD32) em posição 131 em seu domínio extracelular codificando ou uma histidina (H) ou arginina (R) nesta posição. O polimorfismo na posição 131 foi encontrado afetar sua habilidade para se ligar a IgG humana. Dados recentes também mostram uma correlação entre o polimorfismo de posição 131 de FcyRIIA e resposta clínica a Rituxan. Pacientes homozigotos para o alelo H131 tiveram uma taxa de resposta significantemente maior do que os outros 2 grupos.
[0109] FcyRI, FcyRII e FcyRIII são receptores de superfamília de imunoglobulina (IgSF); FcyRI tem três domínios IgSF em seu domínio extracelular, enquanto FcyRII e FcyRIII têm apenas dois domínios IgSF em seus domínios extracelulares. Outro tipo de receptor de Fc é o receptor de Fc neonatal (FcRn). FcRn é estruturalmente similar ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC) e consiste de uma cadeia-α ligada não covalentemente a 32-microglobulina.
Regiões Fc Variantes [0110] A presente invenção fornece polipeptídeos variantes, seqüências de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos variantes, e métodos para gerar polipeptídeos variantes. Preferivelmente, os polipeptídeos variantes da presente invenção diferem de um polipeptídeo originário por pelo menos uma modificação de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 62/174
55/161 aminoácido, preferivelmente uma substituição de aminoácido. Um polipeptídeo “originário”, “tipo selvagem”, “inicial” ou “não variante” preferivelmente compreende pelo menos uma porção de uma região Fc de anticorpo e a substituição de aminoácido no polipeptídeo variante ocorre dentro da região Fc. Um polipeptídeo originário compreendendo uma região Fc pode ser preparado usando técnicas disponíveis na arte para gerar polipeptídeos compreendendo uma região Fc ou porção desta. Em formas de realização preferidas, o polipeptídeo originário é um anticorpo. Entretanto, o polipeptídeo originário pode ser qualquer outro polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção de uma região Fc (e.g., uma imunoadesina). A porção de região Fc no polipeptídeo originário pode ser de uma seqüência nativa ou não nativa, preferivelmente ela é uma seqüência nativa de origem humana. Em certas formas de realização, uma região Fc variante pode ser gerada (e.g. de acordo com os métodos descritos neste lugar) e pode ser fusionada a um polipeptídeo heterólogo de escolha, tal como um domínio variável de anticorpo ou domínio de ligação de um receptor ou ligante, ou qualquer polipeptídeo terapêutico.
[0111] Em formas de realização preferidas, o polipeptídeo originário compreende uma região c ou porção funcional desta. Geralmente, a região Fc do polipeptídeo originário irá compreender uma região Fc de seqüência nativa, e preferivelmente uma região Fc de seqüência nativa humana. Entretanto, a região Fc do polipeptídeo originário pode ter uma ou mais alterações ou modificações pré-existentes de seqüência de aminoácidos (e.g., uma substituição de aminoácido) de uma região Fc de seqüência nativa. Por exemplo, a atividade de ligação de Clq da região Fc pode ter sido previamente alterada ou a afinidade de ligação de FcyR da região Fc pode ter sido alterada. A região Fc variante desejada ou ácido nucleico codificando a região Fc variante de interesse podem ser construídos enquanto não operavelmente ligados ao parceiro de fusão desejado da região Fc variante, (e.g., uma região variável de anticorpo, uma proteína heteróloga) e então subseqüentemente engenheirados para serem operavelmente ligados a este. Em formas de realização adicionais, a região Fc de polipeptídeo originário é conceituai (e.g., pensamento
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 63/174
56/161 mental ou uma representação visual em um computador ou em papel) e, enquanto eles não existem fisicamente, o engenheiro de anticorpo pode decidir por uma seqüência de aminoácidos de região Fc variante desejada e gerar um polipeptídeo compreendendo tal seqüência ou um DNA codificando a seqüência de aminoácidos de região Fc variante desejada. Entretanto, em formas de realização preferidas, um ácido nucleico codificando uma região Fc de um polipeptídeo originário é disponível e esta seqüência de ácidos nucleicos pe alterada para gerar uma seqüência de ácidos nucleicos variante codificando a região Fc variante.
[0112] Ácido nucleico codificando uma variante do polipeptídeo originário (ou simplesmente uma região Fc variante) pode ser preparado por métodos conhecidos na arte usando a orientação do presente relatório para seqüências particulares. Estes métodos incluem, mas não são limitados a, preparação por mutagênese sítiodirigida (ou mediada poroligonucleotídeo), mutagênese por PCR (e.g., Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)), e mutagênese de gaveta (e.g., Wells et al., Gene 34:315-323 (1985)) de um ácido nucleico anteriormente preparado codificando o polipeptídeo. Mutagênese sítio-dirigida é um método preferido para preparar variantes. Esta técnica é bem conhecida na arte (veja, e.g., Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) e Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488 (1987)).
[0113] Alternativamente, ou adicionalmente, a seqüência de aminoácidos desejada codificando um polipeptídeo variante pode ser determinada, e uma seqüência de ácidos nucleicos codificando tal seqüência de aminoácidos do polipeptídeo variante (i.e., polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante compreendendo uma substituição de aminoácido como descrito neste lugar) podem ser geradas sinteticamente. Isto é ainda considerado como sendo uma região Fc variante de uma região Fc originário mesmo embora a região Fc originário não tenha sido o precursor molecular da região Fc variante mas foi ao invés a seqüência de aminoácidos da região Fc presente na originária na ausência da substituição de aminoácido desejada.
[0114] A seqüência de aminoácidos do polipeptídeo originário pode ser
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 64/174
57/161 modificada a fim de gerar uma região Fc variante com afinidade ou atividade alterada de ligação de receptor de Fc in vitro e/ou in vivo; e/ou atividade de ADCC alterada in vitro e/ou in vivo; e/ou atividade de CDC alterada in vitro e/ou in vivo. A seqüência de aminoácidos do polipeptídeo originário também pode ser modificada a fim de gerar uma região Fc variante com propriedades alteradas de ligação de complemento e/ou meia vida de circulação.
[0115] Modificações substanciais nas propriedades biológicas da região Fc podem ser realizadas selecionando substituições de aminoácidos que diferem significantemente em seus efeitos ao alterar (a) a estrutura do polipeptídeo primário na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou de hélice, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou o corpo da cadeia lateral, (d) interação com carboidrato ou (e) flexibilidade de movimento de domínio. Resíduos naturalmente ocorrentes são divididos em classes baseados em propriedades comuns de cadeia lateral:
(1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;
(2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr;
(3) ácido: asp, glu;
(4) básico: asn, gin, his, lys, arg;
(5) resíduos que influenciam orientação de cadeia: gly, pro; e (6) aromático: trp, tyr, phe.
[0116] Substituições não conservativas irão acarretar em trocar um membro de uma destas classes por um membro de outra classe. Substituições conservativas irão acarretar em trocar um membro de uma destas classes por outro membro da mesma classe.
[0117] Como é demonstrado nos Exemplos abaixo, alguém pode engenheirar uma região Fc variante com atividade alterada (função(ões) efetora(s) e/ou farmacocinética). Alguém pode, por exemplo, modificar um ou mais resíduos de aminoácidos da região Fc a fim de alterar (e.g., aumentar ou diminuir) atividade de ADCC ou atividade de CDC ou afinidade de ligação de FcRn. Em formas de realização preferidas, uma modificação é uma substituição como listado na Tabela 1
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 65/174
58/161 neste lugar. Geralmente, alguém irá fazer uma substituição de aminoácido em um ou mais dos resíduos de regiáo Fc identificados neste lugar como afetando atividade de ADCC a fim de gerar tal regiáo Fc variante. Em formas de realização preferidas, náo mais do que um a cerca de dez resíduos de regiáo Fc seráo substituídos. As regiões Fc neste lugar compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos iráo preferivelmente reter pelo menos cerca de 80%, e preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, da seqüência de regiáo Fc originário ou de uma seqüência de regiáo Fc humana nativa.
[0118] Introduzindo a(s) modificação(ões) de seqüência de aminoácidos apropriada(s) em uma regiáo Fc originário, alguém pode gerar uma regiáo Fc variante que (quando comparada à regiáo Fc originário) (a) media ADCC na presença de células efetoras humanas mais ou menos efetivamente e/ou (b) media CDC na presença de complemento humano mais ou menos efetivamente e/ou (c) se liga a Clq com uma afinidade desejada e/ou (d) se liga a um receptor gama de Fc (FcyR) ou receptor neonatal de Fc (FcRn) com uma afinidade desejada. Tais regiões Fc variantes iráo geralmente compreender pelo menos uma modificação de aminoácido na regiáo Fc. Preferivelmente a modificação é uma substituição de aminoácido, mais preferivelmente uma substituição de aminoácido como listado nas Tabelas 1-9 neste lugar.
[0119] Em formas de realização preferidas, a regiáo Fc de polipeptídeo originário é uma regiáo Fc humana ou fragmento funcional desta, e.g., uma lgG1 humana de regiáo Fc humana nativa (alótipos f e a,z), lgG2, lgG3, lgG4, e todos os alótipos conhecidos ou descobertos de qualquer espécie. Tais regiões têm seqüências nativas tal como, e.g., aquelas mostradas na Fig. 2 (SEQ ID NOs: 1-8) e Fig. 3 (SEQ ID NOs: 9-12) neste lugar.
[0120] Em certas formas de realização, a fim de gerar uma regiáo Fc variante com atividade de ADCC realçada, o polipeptídeo originário preferivelmente tem atividade de ADCC pré-existente (e.g. o polipeptídeo originário compreende uma regiáo Fc de lgG1 humana ou lgG3 humana). Em algumas formas de realização, uma variante tem atividade de ADCC realçada (e.g., níveis maiores quando
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 66/174
59/161 comparado ao originário de acordo com um ensaio de ADCC descrito neste lugar) quando comparado ao polipeptídeo originário, i.e., um anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante tem atividade de ADCC realçada quando comparado sob circunstâncias idênticas a um anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário ou uma seqüência nativa de região Fc de lgG1 ou lgG3 mas de outra maneira idêntico ao anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante.
[0121] Em formas de realização preferidas, substituições de aminoácidos são introduzidas nos domínios CH2 e/ou CH3 de uma região Fc. Em formas de realização preferidas, a região Fc originário usada como modelo para gerar tais variantes compreende uma região Fc de IgG humana.
[0122] Em certas formas de realização, a fim de gerar uma região Fc variante com atividade de CDC realçada, o polipeptídeo originário preferivelmente tem atividade de CDC pré-existente. Em algumas formas de realização, uma variante tem atividade de CDC realçada (e.g., níveis maiores quando comparado ao originário de acordo com um ensaio de CDC descrito neste lugar) quando comparado ao polipeptídeo originário, i.e., um anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante tem atividade de CDC realçada quando comparado sob circunstâncias idênticas a um anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc originário ou uma seqüência nativa de região Fc de lgG1 ou lgG3 mas de outra maneira idêntico ao anticorpo monoclonal compreendendo a região Fc variante.
[0123] Os polipeptídeos variantes descritos neste lugar podem ser sujeitos a modificações adicionas, dependendo do uso desejado ou pretendido do polipeptídeo. Tais modificações podem envolver, por exemplo, alteração adicional da seqüência de aminoácidos (substituição, inserção e/ou deleção de resíduos de aminoácidos), modificações de carboidrato, fusão a polipeptídeo(s) heterólogo(s) e/ou modificações covalentes. Tais modificações adicionais podem ser feitas antes de, simultaneamente com, ou seguindo, as modificações de aminoácido descritas neste lugar que resultam em uma alteração de ligação de receptor de Fc e/ou atividade de ADCC e/ou atividade de CDC.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 67/174
60/161 [0124] Alternativamente ou adicionalmente, pode ser útil combinar modificações de aminoácidos com uma ou mais modificações de aminoácidos que alteram ligação de Clq e/ou função de CDC da região Fc. Por exemplo, o polipeptídeo inicial pode ser incapaz de se ligar a Clq e/ou mediar CDC e pode ser modificado de acordo com os ensinamentos neste lugar de forma que ele adquira estas funções efetoras adicionais. Além disso, polipeptídeos com atividade de ligação de Clq pré-existente, opcionalmente adicionalmente tendo a habilidade para mediar CDC, podem ser modificados de forma que uma ou ambas destas atividades são realçadas (ou alternativamente, são diminuídas). Certas modificações de aminoácidos de região Fc que alteram ligação de Clq e/ou modificam atividade de CDC são descritas neste lugar (veja Tabelas 2, 7, 8 e 10) e, por exemplo, em W00042072.
[0125] Como descrito acima, alguém pode projetar uma região Fc ou porção desta com função efetora alterada, e.g., modificando atividade de CDC e/ou atividade de ADCC. Por exemplo, alguém pode gerar uma região Fc variante com melhorada atividade de CDC e melhorada atividade de ADCC. Alternativamente, onde alguém deseja que uma função efetora seja reduzida ou desgastada, alguém pode engenheirar uma região Fc variante com reduzida atividade de CDC e/ou reduzida atividade de ADCC. Em outras formas de realização, alguém pode aumentar apenas uma destas atividades, e opcionalmente também reduzir a outra atividade, e.g., para gerar uma região Fc variante com melhorada atividade de ADCC, mas reduzida atividade de CDC e vice versa. Adicionalmente, alguém pode engenheirar uma região Fc variante com modificada afinidade de ligação a FcRn, proteína A, e/ou outras proteínas de ligação de Fc.
[0126] Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece composições compreendendo uma variante de um polipeptídeo originário, caracterizada pelo fato de que o originário compreende uma região Fc (ou porção desta) e caracterizada pelo fato de que a variante compreende pelo menos uma modificação de resíduo de aminoácido de superfície dentro da região Fc (veja, e.g., Deisenhofer, Biochemistry, 20:2361-70, April 1981, e W00042072). Em outras formas de realização, a presente invenção fornece composições compreendendo
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 68/174
61/161 uma variante de um polipeptídeo originário tendo uma região Fc, caracterizada pelo fato de que o originário compreende uma região Fc (ou porção desta) e caracterizada pelo fato de que a variante compreende pelo menos uma modificação de resíduo de aminoácido de não superfície na região Fc. Em formas de realização adicionais, a presente invenção compreende uma variante de um polipeptídeo originário tendo uma região Fc, caracterizada pelo fato de que a variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido de superfície e pelo menos uma modificação de aminoácido de não superfície, ambas na região Fc. Variantes de Combinação [0127] Em algumas formas de realização, uma região Fc variante da presente invenção compreende duas ou mais modificações de aminoácidos (e.g., substituições). Tais variantes de combinação podem ser produzidas, por exemplo, selecionando duas ou mais das substituições de aminoácidos detalhadas acima (e.g., veja Tabela 1), ou uma ou mais substituições de aminoácidos como listado na Tabela 1 em adição a uma substituição conhecida na arte.
[0128] As variantes de combinação mostradas na Tabela 10 e outras variantes de combinação (tal como aquelas substituições descritas em usos de W00042072 em combinação com aquelas descritas neste lugar) podem ser testadas para uma dada atividade (e.g., atividade de ligação de FcRn, atividade de ADCC, e atividade de CDC) em uma variedade de ensaios (veja exemplos abaixo). Sob esse aspecto, variantes de combinação úteis podem ser identificadas.
[0129] Em certas formas de realização preferidas, as múltiplas substituições de aminoácidos presentes em uma região Fc variante da presente invenção têm uma substituição de aminoácido que aumenta atividade de ADCC, e uma modificação de aminoácido que aumenta afinidade de ligação de receptor de Fc neonatal (FcRn) (e.g., em pH 6,0) do polipeptídeo compreendendo a região Fc variante. Em outras formas de realização, as variantes de combinação da presente invenção têm um aminoácido de superfície em uma região Fc variante da presente invenção, e uma modificação de aminoácido de não superfície. Variantes de combinação adicionais nas regiões Fc variantes da presente invenção podem ser geradas combinando
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 69/174
62/161 duas ou mais das substituições de aminoácidos descritas neste lugar, ou pelo menos uma das substituições de aminoácidos descritas neste lugar com aquelas descritas em e.g., W00042072.
Ensaios de Polipeptídeo Variante [0130] A presente invenção fornece vários ensaios para selecionar regiões Fc ou polipeptídeos variantes compreendendo uma região Fc variante da invenção. Ensaios de seleção podem ser usados para encontrar ou confirmar variantes úteis. Por exemplo, variantes de combinação (veja, e.g., Tabela 10) podem ser selecionadas para encontrar variantes com ligação de FcR alterada, e/ou ADCC alterada e/ou atividade de CDC alterada (e.g, atividade de ADCC ou CDC aumentada ou diminuída) e/ou habilidade modificada para reduzir células alvo (células B, por e.g.) de todo sangue. Também, como descrito abaixo, os ensaios da presente invenção podem ser empregados para encontrar ou confirmar variantes que têm atividade terapêutica benéfica em um sujeito (e.g., tal como um humano com sintomas de uma doença responsiva a anticorpo ou imunoadesina). Uma variedade de tipos de ensaio pode ser empregada para avaliar qualquer mudança em uma variante comparado com o polipeptídeo originário (ensaios de seleção fornecidos e.g., em W00042072). Ensaios exemplares adicionais são descritos abaixo.
[0131] Em formas de realização preferidas, um polipeptídeo variante (i.e., polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da presente invenção ou porção funcional deste) é um anticorpo monoclonal que essencialmente retém a habilidade para se ligar especificamente a um antígeno (através de uma região de ligação de antígeno não modificada ou região de ligação de antígeno modificada) quando comparado com o polipeptídeo originário (e.g., a capacidade de ligação é preferivelmente menos do que 20 vezes, 10 vezes, 7 vezes, ou menos do que cerca de 5 vezes diferente do que aquela do polipeptídeo originário). A capacidade de ligação do polipeptídeo variante a antígeno pode ser determinada usando técnicas tais como ELISA, análise classificação de célula ativada por fluorescência (FACS), ou radioimunoprecipitação (RIA), por exemplo ensaios de ligação de FcR podem ser
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 70/174
63/161 empregados para avaliar as variantes da presente invenção. Por exemplo, ligação de receptores de Fc tal como FcyRI, FcvRIla, FcvRIlb, FcyRIII, FcRn, etc., pode ser medida por titulação de um polipeptídeo variante e medindo polipeptídeo variante ligado usando um anticorpo que se liga ao polipeptídeo variante em um formato ELISA (veja Exemplos abaixo). Por exemplo, uma variante que compreende um anticorpo pode ser selecionada em um ensaio ELISA padrão para determinar ligação a um FcRn em pH 6,0 e pH 7,0 ou pH 7,4. Uma superfície sólida revestida com estreptavidina ou neutravidina pode ser usada para capturar FcRn marcado com biotina de qualquer espécie, tal como camundongo ou humano. Depois de bloqueio, o receptor de captura pode ser incubado com vários polipeptídeos variantes (e.g., anticorpos) diluídos em tampões em pH 6,0 ou pH 7,0. Na etapa seguinte uma molécula específica para anticorpos humanos é adicionada (Fab anti-humano de cabra (Fab')2 conjugado com uma enzima). Depois disso um substrato pode ser adicionado a fim de determinar a quantidade de ligação do polipeptídeo variante ao FcRn imobilizado em pH 6,0 ou pH 7,0 ou pH 7,4. Os resultados deste ensaio podem ser comparados com a habilidade de polipeptídeo originário (não variante) para se ligar ao mesmo FcR. Em outras formas de realização preferidas, os componentes para realizar um ELISA (e.g., com FcRn) para selecionar variantes são empacotados em um kit (e.g., com instruções para uso).
[0132] Um ensaio de ADCC também pode ser empregado para selecionar as variantes da presente invenção. Ensaios de ADCC podem ser realizados in vitro ou in vivo. Para verificar atividade de ADCC de um polipeptídeo variante um ensaio de ADCC in vitro pode ser realizado usando proporções variantes de efetora:alvo. Um ensaio de ADCC exemplar poderia usar uma linhagem de célula alvo expressando qualquer dos seguintes antígenos alvo: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, receptor de EGF, receptor de her-2, antígeno de membrana próstata-específico, carboidrato de LewisY, gangliosídeos GD2 e GD3, lamp-i, CO-029, L6, e ephA2. Células efetoras podem ser obtidas a partir de um doador saudável (e.g., no dia do experimento) e PMBC purificado usando Histopaque (Sigma). Células alvo são então pré-incubadas com uma IgG compreendendo uma região Fc variante da
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 71/174
64/161 invenção em, por exemplo, 0,1 - 1.000 ng/ml por cerca de 30 minutos antes de misturar com células efetoras em proporções efetora:alvo de, por exemplo, 40:1, 20:1 e 10:1. Atividade de ADCC pode então ser medida colorimetricamente usando um Kit de Detecção de Citotoxicidade (Roche Molecular Biochemicals) para a quantificação de morte e lise de célula com a medição de atividade de lactato desidrogenase (LDH) liberada do citosol de células danificadas no sobrenadante. Atividade de ADCC também pode ser medida, para ensaios de célula alvo carregada com cromo, medindo o cromo 51 liberado resultante. Citotoxicidade celular independente de anticorpo pode ser determinada medindo a atividade de LDH de células alvo e efetoras na ausência de anticorpo. Liberação total pode ser medida seguindo a adição de 1% de Triton X-100 à mistura de células alvo e efetoras. Incubação das células alvo e efetoras pode ser realizada por um período de tempo otimizado (0,54-18 horas) a 37 SC em 5,0% de CO2 e então ser seguida por centrifugação das placas de ensaio. Os sobrenadantes podem então ser transferidos para placas de 96 poços e incubados com reagente de detecção de LDH por 30 minutos a 25 SC. A absorbância da amostra pode então ser medida a 490 nm usando um leitor de microplaca. A citotoxicidade percentual pode então ser calculada usando a seguinte equação: % citotoxicidade = valor experimental controle baixo /controle alto - controle baixo X 100%. A citotoxicidade percentual de anti-CD20 e variantes pode então ser comparada diretamente com igual quantidade de RITUXAN para fornecer uma medida de efetividade relativa. Um ensaio de ADCC exemplar poderia empregar células SKW6.4 sobre-expresando o antígeno CD20 (e.g., adquirido da American Type Culture Collection) como a fonte de células alvo. Muitas variações deste ensaio são conhecidas na arte (e.g. Zuckerman et al., CRC Crit RevMicrobiol 1978;7(1 ):1-26).
[0133] Células efetoras úteis para tais ensaios incluem, mas não são limitadas à, células NK, macrófagos, e outros PBMC. Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC dos polipeptídeos variantes da presente invenção pode ser verificada in vivo, e.g., em um modelo animal tal como aqueles descritos em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 72/174
65/161 [0134] As variantes da presente invenção também podem ser selecionadas para ativação de complemento. Para verificar ativação de complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (Veja, e.g., Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)). Por exemplo, várias concentrações do polipeptídeo variante e complemento humano podem ser diluídas com tampão. Células que expressam o antígeno ao qual o polipeptídeo variante se liga podem ser diluídas para uma densidade de 1 χ 106 células/ml. Misturas de polipeptídeo variante, complemento humano diluído e células expressando o antígeno podem ser adicionadas a uma placa de 96 poços de fundo plano de cultura de tecido e permitidos para incubar por 2 horas a 37 SC e 5,0% de CO2 para facilitar lise de célula mediada por complemento. Cinqüenta microlitros de azul de alamar (Accumed International) podem ser adicionados a cada poço e incubados durante a noite a 37 SC. A absorbância pode ser medida usando um fluorímetro de 96 poços com excitação em 530 nm e emissão em 590 nm. Os resultados podem ser expressos em unidades de fluorescência relativa (RFU). As concentrações de amostras podem ser computadas a partir de uma curva padrão e a atividade percentual quando comparada a polipeptídeo não variante pode ser relatada para o polipeptídeo variante de interesse.
[0135] Em certas formas de realização, polipeptídeos variantes da presente invenção não ativam complemento ou ativam complemento fracamente. Por exemplo, um polipeptídeo variante manifesta cerca de 0-10% de atividade de CDC neste ensaio comparado com um anticorpo controle tendo uma região Fc de lgG1 não mutada. Preferivelmente a variante não aparenta ter qualquer atividade de CDC (e.g. acima de conhecimento) no ensaio de CDC acima. Em outras formas de realização, um polipeptídeo variante da presente invenção é encontrado tendo CDC realçada comparado com um polipeptídeo originário (e.g., preferivelmente manifestando cerca de 1,1, 1,5, 1,7, ou 2 vezes a cerca de 100 vezes (ou maior) de realçamento em atividade de CDC in vitro ou in vivo quando os valores de IC50 são comparados).
[0136] Polipeptídeos variantes da presente invenção também podem ser
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 73/174
66/161 selecionados por depleção de células alvo em um ensaio de todo o sangue. Por exemplo, várias concentrações do polipeptídeo variante com especificidade de alvo CD20 podem ser selecionadas para a depleção de células B em um ensaio de todo o sangue usando facs (Vugmeyster et al., 2003 Cytcmetry 52A, 101-109). Sangue frescamente contraído é incubado com várias concentrações do polipeptídeo variante a 37 SC e 5,0% de CO2 por 4 horas (tempo pode ser variado). Seguindo a incubação, células vermelhas de sangue são Usadas por direções de fabricante com um reagente de cloreto de amónio (Beckton-Dickinson cat. #555899) e células B são detectadas por facs usando um anticorpo fluorescente-marcado específico para células B (anti-CD 19, por exemplo). Os resultados põem ser expressos como depleção percentual de células B relativa a ou uma amostra não tratada ou uma amostra incubada com um anticorpo irrelevante (não-redutor).
[0137] Em formas de realização preferidas, um polipeptídeo variante reduz células B mais efetivamente do que o polipeptídeo originário. Um polipeptídeo variante pode reduzir células B, por exemplo, para cerca de 2 vezes ou maior grau do que o polipeptídeo originário, e preferivelmente cerca de 5 vezes ou mais. Também, uma variante pode manifestar maior potência em reduzir células B. Por exemplo, uma variante pode reduzir a mesma porcentagem de células B em relação ao polipeptídeo originário, mas utilizar cerca de 5 vezes menos, e preferivelmente cerca de 10 vezes menos anticorpo. Redução de célula alvo mediada por variantes pode ser cerca de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes a cerca de 1000 vezes ou maior, e preferivelmente de cerca de 5 vezes a cerca de 1000 vezes melhorada comparado com o polipeptídeo originário.
[0138] As variantes da presente invenção também podem ser selecionadas in vivo. Qualquer tipo de ensaio in vivo pode ser empregado. Um exemplo particular de um tipo de ensaio é fornecido abaixo. Este ensaio exemplar permite avaliação préclínica de variantes de Fc in vivo. Uma variante a ser testada pode ser incorporada à região Fc de um anticorpo particular conhecido por ter alguma atividade. Por exemplo, uma variante pode ser incorporada à região Fc de uma IgG anti-CD20 por mutagênese. Isto permite que uma IgG originário e IgG de variante de Fc sejam
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 74/174
67/161 comparadas diretamente com RITUXAN (conhecido por promover regressão de tumor). A avaliação pré-clínica pode ser feita em 2 fases (uma fase farmacocinética e farmacodinâmica). O objetivo dos estudos farmacocinéticos de Fase I é determinar se existem diferenças na taxa de depuração entre uma IgG de variante de Fc e o anticorpo com conhecida atividade in vivo (e.g., RITUXAN). Diferenças em taxa de depuração podem causar diferenças no nível de estado constante de IgG no soro. Desta forma, se diferenças em concentrações de estado constante são detectadas estas devem ser normalizadas para permitir que comparações acuradas sejam feitas. O objetivo dos estudos farmacodinâmicos de Fase II é determinar o efeito das mutações de Fc sobre, neste caso, crescimento de tumor. Estudos prévios com RITUXAN usaram uma dose única que inibiu completamente crescimento de tumor. Pelo fato disto não permitir que diferenças quantitativas sejam medidas, uma variação de dose deveria ser empregada.
[0139] Pode ser realizada comparação farmacocinética de Fase I de uma variante de Fc, do Fc originário tipo selvagem, e de RITUXAN, e.g., da seguinte maneira. Primeiro, 40 pg (ou outra dose a ser testada) por animal podem ser injetados intravenosamente e o nível de plasma da IgG quantificado em 0, 0,25, 0,5, 1,24, 48, 72, 96, 120, 168, e 336 hrs. Os dados podem ser ajustados, por exemplo, usando um programa farmacocinético (WinNonLin) usando um modelo farmacocinético de compartimento de zero defasagem dois para obter a taxa de depuração. Taxa de depuração pode ser usada para definir nível de plasma de estado constante com a seguinte equação: C = Dose/(Taxa de depuração X t), onde T é o intervalo entre doses e C é o nível de plasma de estado constante. Experimentos farmacocinéticos podem ser realizados em camundongos transportando não tumor com, por exemplo, um mínimo de 5 camundongos por ponto de tempo.
[0140] Um modelo animal exemplar pode ser empregado para a próxima fase da seguinte maneira. O flanco direito de camundongos CB17-SCID pode ser implantado com 106 células Raji subcutaneamente. Injeção intravenosa única do anticorpo de Fc variante, do anticorpo de Fc tipo selvagem, e RITUXAN pode ser iniciada
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 75/174
68/161 imediatamente depois de implantação e continuada até que tamanho do tumor seja maior do que 2 cm de diâmetro. Volume de tumor pode ser determinado a cada Segunda-feira, Quarta-feira e Sexta-feira medindo o comprimento, largura, e profundidade do tumor usando um compasso de calibre (volume de tumor = W x L x D). Uma representação gráfica de volume de tumor verso tempo irá fornecer a taxa de crescimento de tumor para o cálculo farmacodinâmico. Um mínimo de cerca de 10 animais por grupo deve ser usado.
[0141] Pode ser realizada comparação farmacodinâmica de Fase II ao anticorpo de Fc variante, do anticorpo de Fc tipo selvagem, e de RITUXAN, e.g., da seguinte maneira. Baseado em dados publicados, RITUXAN a 10 pg/g semanalmente inibiu completamente crescimento de tumor in vivo (Clynes et al., Nat. Med. 6:443-6, 2000). Portanto, uma variação de dose semanal de 10 pg/g, 5 pg/g, 1 pg/g, 0,5 pg/g e 0 pg/g pode ser testada. O nível de plasma de estado constante no qual taxa de crescimento de tumor é inibida em 50% pode ser graficamente determinado pela relação entre nível de plasma de estado constante e efetividade. O nível de plasma de estado constante pode ser calculado como descrito acima. Se necessário, τ pode ser ajustado por conseguinte para cada anticorpo de Fc variante e o anticorpo de Fc tipo selvagem dependendo de suas propriedades farmacocinéticas para atingir nível de plasma de estado constante comparável com RITUXAN. Valores farmacodinâmicos estatisticamente melhorados do anticorpo de Fc variante em comparação com o polipeptídeo originário (e.g., anticorpo de Fc tipo selvagem) e RITUXAN irá geralmente indicar que o anticorpo de Fc variante confere melhorada atividade in vivo.
[0142] Comparações farmacodinâmicas adicionais de anticorpos de Fc variantes, anticorpos de Fc tipo selvagem, e RITUXAN podem ser realizadas em macacos ‘cynomolgous’ como descrito previamente (Reff et al., Blood 83, 435-445, 1994). Uma resposta de dose para depleção de células B periféricas e células B de linfonodo pode ser usada para comparar as potências relativas das variantes de Fc com Fc tipo selvagem e RITUXAN administrado intravenosamente e/ou subcutaneamente. Valores farmacodinâmicos estatisticamente melhorados da
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 76/174
69/161 variante de Fc em comparação com o polipeptídeo originário (e.g., Fc tipo selvagem) e RITUXAN irá geralmente indicar que o anticorpo de Fc variante confere melhorada atividade in vivo.
[0143] Em formas de realização adicionais, as variantes (i.e., polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção, ou porção funcional deste) da presente invenção são selecionadas de forma que variantes que são úteis para uso terapêutico em pelo menos duas espécies são identificadas. Tais variantes são referidas neste lugar como “variantes melhoradas de espécies duais”, e são particularmente úteis para identificar variantes que são terapêuticas em humanos, e também demonstram (ou são prováveis para demonstrar) eficácia em um modelo animal. Sob esse aspecto, a presente invenção fornece métodos para identificar variantes que têm uma grande chance de serem aprovadas para testagem clínica em humana uma vez que dados de modelo animal irão provavelmente suportar quaisquer aplicações de testagem humano feita para agências reguladoras governamentais (e.g., U.S. Food and Drug Administration).
[0144] Em certas formas de realização, variantes melhoradas de espécies duais são identificadas primeiro pela realização de um ensaio de ADCC usando células efetoras humanas para encontrar variantes melhoradas, e então realizando um segundo ensaio de ADCC usando células efetoras de camundongo, rato, ou primata não humano para identificar um subconjunto das variantes melhoradas que são variantes melhoradas de espécies duais. Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos para identificar variantes melhoradas de espécies duais, compreendendo: a) fornecer: i) células alvo, ii) uma composição compreendendo uma variante candidata de um polipeptídeo originário tendo pelo menos uma porção de uma região Fc, caracterizada pelo fato de que a variante candidata compreende pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc, e caracterizada pelo fato de que a variante candidata media citotoxicidade de célula alvo na presença de células efetoras de uma primeira espécie (e.g., humana) mais efetivamente do que o polipeptídeo originário, e iii) células efetoras de segunda espécie (e.g., camundongo, rato, ou primata não humano), e b) incubar a
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 77/174
70/161 composição com as células alvo sob condições de forma que a variante candidata se liga a células alvo por causa disso gerando células alvo ligadas à variante candidata, c) misturar as células efetoras de segunda espécie com as células alvo ligadas à variante candidata, e d) medir citotoxicidade de célula alvo mediada pela variante candidata.
[0145] Em certas formas de realização, o método compreende adicionalmente etapa e) determinar se a variante candidata media citotoxicidade de célula alvo na presença de células efetoras de segunda espécie mais efetivamente do que o polipeptídeo originário. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente etapa f) identificar uma variante candidata como uma variante melhorada de espécie dual que media citotoxicidade de célula alvo na presença de células efetoras de segunda espécie mais efetivamente do que o polipeptídeo originário. Em formas de realização preferidas, as variantes de espécies duais identificadas são então selecionadas in vivo em um ou mais ensaios animais.
[0146] Em certas formas de realização, variantes melhoradas de espécies duais são identificadas primeiro pela realização de um ensaio de todo o sangue usando sangue humano para encontrar variantes melhoradas, e então realizando um segundo ensaio de todo o sangue usando sangue de camundongo, rato, ou primata não humano para identificar um subconjunto das variantes melhoradas que são variantes melhoradas de espécies duais. Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos para identificar variantes melhoradas de espécies duais, compreendendo: a) fornecer: i) células alvo, ii) uma composição compreendendo uma variante candidata de um polipeptídeo originário tendo pelo menos uma porção de uma região Fc, caracterizada pelo fato de que a variante candidata compreende pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc, e caracterizada pelo fato de que a variante candidata media depleção de célula alvo na presença de sangue de uma primeira espécie (e.g., humana) mais efetivamente do que o polipeptídeo originário, e iii) sangue de segunda espécie (e.g., camundongo, rato, ou primata não humano), e b) incubar a composição com as células alvo sob condições de forma que a variante candidata se liga a células alvo
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 78/174
71/161 por causa disso gerando células alvo ligadas à variante candidata, c) misturar o sangue de segunda espécie com as células alvo ligadas à variante candidata, e d) medir depleção de célula alvo mediada pela variante candidata. Em certas formas de realização, o método compreende adicionalmente etapa e) determinar se a variante candidata media depleção de célula alvo na presença do sangue de segunda espécie mais efetivamente do que o polipeptídeo originário. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionalmente etapa f) identificar uma variante candidata como uma variante melhorada de espécie dual que media depleção de célula alvo na presença do sangue de segunda espécie mais efetivamente do que o polipeptídeo originário. Em formas de realização preferidas, as variantes de espécies duais identificadas são então selecionadas in vivo em um ou mais ensaios animais.
[0147] Em certas formas de realização, variantes melhoradas de espécies duais são identificadas realizando qualquer dos ensaios acima usando componentes humano (e.g., células humanas, FcR humano, etc.) para identificar variantes melhoradas, e então correndo o mesmo ensaio (ou um ensaio diferente) com componentes animais não humanos (e.g., células de camundongo, FcR de camundongo, etc.). Sob esse aspecto, um subconjunto de variantes que realizam bem de acordo com um dado critério em ambos os ensaios baseados em humanos e ensaios baseados m segunda espécie pode ser identificado.
[0148] Um processo exemplar para identificar variantes melhoradas de espécies duais é como segue. Primeiro, uma seqüência de ácidos nucleicos codificando pelo menos uma porção de uma região Fc de IgG é mutada de forma que a seqüência de aminoácidos expressa tem pelo menos uma mudança de aminoácido, por causa disso gerando uma variante. Esta variante expressa de IgG é então caracterizada em um ensaio de ADCC usando PBMCs humanos ou um subconjunto (células NK ou macrófagos, por exemplo). Se atividade de ADCC é encontrada realçada, então a variante é selecionada em um segundo ensaio de ADCC usando PBMCs de camundongo ou rato. Alternativamente, ou em adição, um ensaio pode ser realizado com a variante para ligação a receptores ou linhagens celulares de roedores clonados. Finalmente, se a variante é encontrada ser melhorada no segundo ensaio,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 79/174
72/161 a tornando uma variante melhorada dual, então a variante é selecionada in vivo em camundongos ou ratos.
Moléculas Exemplares Contendo Região Fc Variante [0149] As regiões Fc variantes da presente invenção podem ser parte de moléculas maiores. As moléculas maiores podem ser, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpo biespecíficos, imunoadesinas, etc. Adicionalmente, uma região Fc variante da invenção pode ser operavelmente ligada a um polipeptídeo não anticorpo no o qual ela pode conferir meia vida alterada (aumentada ou diminuída). Desta forma, é evidente que existe uma ampla variação de aplicações para as regiões Fc variantes da presente invenção.
Anticorpos Contendo Regiões Fc Variantes [0150] Em formas de realização preferidas, a molécula contendo região Fc variante (e.g., polipeptídeo) é um anticorpo. Técnicas para produzir anticorpos são descritas abaixo:
(i) Seleção e preparação de antígeno [0151] Geralmente, quando a molécula contendo região Fc variante é um anticorpo, o anticorpo é direcionado contra um antígeno de interesse. Preferivelmente, o antígeno é um polipeptídeo e administração do anticorpo para um mamífero sofrendo de uma doença ou desordem que seria beneficiado por uma diminuição na quantidade ou atividade da molécula antigênica pode resultar em um benefício terapêutico neste mamífero. Entretanto, anticorpos direcionados contra antígenos não polipeptídeo (tal como antígenos de glicolipídio associados com tumor; veja Patente Norte-Americana No. 5.091.178), também podem ser empregados.
[0152] Antígenos exemplares incluem, mas não são limitados à, moléculas tal como renina; um hormônio de crescimento, incluindo hormônio de crescimento humano e hormônio de crescimento bovino; fator de liberação de hormônio de crescimento; hormônio de paratireóide; hormônio estimulante de tireóide; lipoproteínas, anitripsina-alfa-i; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina;
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 80/174
73/161 proinsulina; hormônio estimulante de folículo; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores coagulantes tal como fator VIIIC, fator IX, fator de tecido (TF), e fator de von Willebrands; fatores anticoagulantes tal como Proteína C; fator natriurético atrial; surfactante de pulmão; um ativador de plasminogênio, tal como uroquinase ou urina humana ou ativador de plasminogênio tipo tecido (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hematopoiético; fator de necrose de tumor alfa e beta; encefalinase; RANTES (regulado em ativação de célula-T normalmente expressa e secretada); proteína inflamatória de macrófago humano (ΜΙΡ-1-alfa); uma albumina de soro tal como albumina de soro humana; substância Muelleriana-inibidora; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; prorelaxina; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; Dnase; IgE; um antígeno citotóxico associado a linfócito-T (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; proteína A ou D; fatores reumatóides; um fator neurotrófico tal como fator neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervos; fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fator de crescimento de fibroblasto tal como um FGF e FGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento transformante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF beta, incluindo TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, ou TGF-5; fator de crescimento tipo insulina I e II (IGF-I e IGF-II); dês (1-3)-IGF-l (IGF-I de cérebro); proteínas ligando fator de crescimento tipo insulina; proteínas CD tal como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; fatores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética de osso (BMP); um fator de diferenciação de crescimento (e.g., GDF8), um interferon tal como interferon-alfa, beta e gama; fatores estimulantes de colônia (CSFs), e.g., M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs), e.g., IL-I a IL25; superóxido dismutase; receptores de célula T-25; proteínas de superfície de membrana, fator acelerador de decaimento; antígeno viral tal como, por exemplo, uma porção do envelope de AIDS; proteínas de transporte; receptores de residência; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas tal como CD11a, CD11b, CD11c,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 81/174
74/161
CD18, e ICAM, VLA4 e VCAM; um antígeno associado a tumor tal como receptor de HER2, HER3 ou HER4; grelina; um membro de uma via de apoptose; e fragmentos ou precursores de qualquer dos polipeptídeos acima listados.
[0153] Antígenos preferidos incluem, mas não são limitados à, proteínas CD tal como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 e CD34; membros da família de receptor ErbB tal como o receptor de EGF, receptor de HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular tal como LFA-1, Macl, ρ I50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina a4/p7, e integrina Xv/p3 incluindo ou um 5 ou subunidades deste (e.g., anticorpos anti-CDI Ia, anti-CD18 oi anti-CDI Ib); fatores de crescimento tal como VEGF; fator de tecido (TF); interferon-alfa (IFN-α); fatores de diferenciação de crescimento, e.g., GDF8; uma interleucina, tal como IL-9; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor fIk2/fIt3; receptor de obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C e grelina.
[0154] Antígenos solúveis ou fragmentos destes, opcionalmente conjugados com outras moléculas, podem ser usados como imunogenes para gerar anticorpos. Para moléculas transmembrana tal como receptores, fragmentos destes (e.g., o domínio extracelular de um receptor) podem ser usados como o imunogene. Alternativamente, células expressando a molécula transmembrana podem ser usadas como o imunogene. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (e.g., linhagens de células cancerosas) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembrana. Outros antígenos e formas deste úteis para preparar anticorpos serão aparentes para aqueles na arte.
(ii) Anticorpos Policlonais [0155] A presente invenção fornece anticorpos policlonais com regiões Fc variantes. Por exemplo, um repertório de imunoglobulina humana contendo regiões constantes de IgG modificadas pode ser transplantado em camundongos imunoglobulina-inativados, resultando em camundongos expressando um repertório de IgG contendo regiões Fc modificadas (veja, e.g., Mendez, MJ et al., Nature Genetics 15:146 (1997)). Anticorpos policlonais são preferivelmente criados em animais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 82/174
75/161 relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante com uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada (e.g., hemocianina de caramujo Megathura crenulata, albumina de soro, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja) usando um agente bifuncional ou acilante (e.g., maleimidobenzoil sulfosuccinamida éster para conjugação através de resíduos de cisteína, Nhidroxisuccinamida para conjugação através de resíduos de lisina, glutaraldeído, anidrido succínico, SOCL2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são diferentes grupos alquila.
[0156] Exemplos de um protocolo geral de imunização para um coelho e camundongo são como segue. Animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos, ou derivados combinando, por exemplo, 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (e.g., para um coelho ou camundongo respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução intradermicamente em múltiplos sítios. Um mês depois os animais são estimulados com 1/5 ou 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos sítios. Sete a quatorze dias depois os animais são sangrados no soro e ensaiados para título de anticorpo. Animais são estimulados até que título atinja platô. Preferivelmente, o animal é estimulado com um conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado a uma proteína diferente e/ou através de um diferente reagente de ligação cruzada. Conjugados também podem ser feitos em cultura de célula recombinante como fusões de proteína. Em adição, agentes agregadores tal como alume são adequadamente usados para realçar a resposta imune.
(iii) Anticorpos Monoclonais [0157] A presente invenção fornece anticorpos monoclonais com regiões Fc variantes. Anticorpos monoclonais podem ser feitos de diversas maneiras, incluindo usar o método de hibridoma (e.g., como descrito por Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975), ou por métodos de DNA recombinante (e.g., Patente Norte-Americana No. 4.816.567).
[0158] No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 83/174
76/161 apropriado, tal como um hamster ou macaco símio, é imunizado para extrair linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão se ligar especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitos então são fusionados com células de mieloma usando um agente fusionante adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma. As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e crescidas em um meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células originárias de mieloma não fusionadas. Por exemplo, se as células originárias de mieloma carecem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente irá incluir hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células HGPRT-deficientes.
[0159] Células de mieloma preferidas são aquelas que se fusionam eficientemente, suportam estável alto-nível de produção de anticorpo pelas células produtoras de anticorpos selecionadas, e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Dentre estas, linhagens de célula de mieloma preferidas são linhagens murinas de mieloma, tal como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-1 I disponíveis a partir do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia USA, e células SP-2 ou X-63-Ag8-653 disponíveis a partir da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Linhagens de células de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (e.g., Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)).
[0160] Meio de cultura no qual células de hibridoma estão crescendo é ensaiado para produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como RIA ou ELISA. Depois são identificadas células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 84/174
77/161 desejada, os clones podem ser subclonados limitando procedimentos de diluição e crescidos por métodos padrão. Meios de cultura adequados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Em adição, as células de hibridoma podem ser crescidas in vivo como tumores de ascites em um animal. Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite, ou soro por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tal como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise, ou cromatografia de afinidade.
[0161] DNA codificando os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (e.g., usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tal como células de E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster Chinês (CHO), ou células de mieloma que de outra maneira não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Produção recombinante de anticorpos é descrita em mais detalhe abaixo.
[0162] Em algumas formas de realização, anticorpos ou fragmentos de anticorpo são isolados a partir de bibliotecas de anticorpo de fagos geradas usando as técnicas descritas em, por exemplo, McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicações subseqüentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (extensão nM) por embaralhamento de cadeias (Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)), assim como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fagos muito grandes (e.g., Waterhouse et al, Nuc. Acids
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 85/174
78/161
Res., 21: 2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas, e técnicas similares, são alternativas viáveis para técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpo monoclonal bem conhecidas na arte para isolamento de anticorpos monoclonais. Também, o DNA pode ser modificado, por exemplo, substituindo a seqüência de codificação por domínios constantes de cadeia pesada e leve humana no lugar das seqüências murinas homólogas (e.g., Patente Norte-Americana No. 4.816.567, e Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sei USA, 81: 6851 (1984)), ou ligando covalentemente à seqüência de codificação de imunoglobulina toda ou parte da seqüência de codificação para um polipeptídeo náo imunoglobulina.
[0163] Tipicamente tais polipeptídeos náo imunoglobulina sáo substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo, ou eles sáo substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo quimérico bivalente compreendendo um sítio de combinação de antígeno tendo especificidade por um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno tendo especificidade por um antígeno diferente.
(iv) Anticorpos humanizados e humanos [0164] A presente invenção fornece anticorpos humanizados e humanos com Regiões Fc variantes da invenção. Em formas de realização preferidas, um anticorpo humanizado compreende seqüências de aminoácidos de anticorpo humano junto com resíduos de aminoácidos que náo sáo do anticorpo humano. Em algumas formas de realização, as seqüências humanas em um anticorpo humanizado compreendem as regiões de estrutura (“FRs”) e as seqüências e resíduos que náo sáo de um anticorpo humano compreendem um ou mais CDRs. É válido observar que FRs e CDRs podem ser definidos baseado em numeração de resíduo de aminoácido nas regiões pesadas e VL. O termo CDR é pretendido para significar os sítios náo contíguos de combinação de antígeno encontrados dentro da regiáo variável de ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Estas regiões foram definidas por Kabat et al. (J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977) e Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991); “Kabat”, Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); “Chothia” and MacCalium et al (J. Mol. Biol. 262:732Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 86/174
79/161
745 (1996); “MacCalIum”, onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparado contra cada outro. Contudo, a aplicação de qualquer destas definições, sozinha (por exemplo, a definição de Kabat) ou em combinação (para meio de exemplo apenas, a definição combinada de Kabat e Chothia), para se referir a um CDR de um anticorpo (incluindo um anticorpo humanizado), é pretendida para estar dentro do escopo do termo como definido e usado neste lugar.
[0165] Também, o termo “estrutura” quando usado em referência a uma região variável de anticorpo é pretendido para significar todos os resíduos de aminoácidos fora das regiões de CDR dentro da região variável de um anticorpo. Portanto, uma estrutura de região variável é de entre cerca de 100-120 aminoácidos de comprimento mas é pretendida para se referenciar apenas àqueles aminoácidos fora dos CDRs. O termo “região de estrutura” é pretendido para significar cada domínio da estrutura que é separado pelos CDRs. Portanto, para o exemplo específico de uma região VH e para os CDRs como definido por Kabat, região de estrutura 1 (FRI) corresponde a um domínio da região variável abrangendo aminoácidos 1-30; região de estrutura 2 (FR2) corresponde ao domínio da região variável abrangendo aminoácidos 36-49; região 3 (FR3) corresponde ao domínio da região variável abrangendo aminoácidos 66-94; e região 4 (FR4) corresponde ao domínio da região variável a partir do aminoácido 103 até o final da região variável. Os FRs para a cadeia leve são similarmente separados por cada um dos CDRs de região variável de cadeia leve. Similarmente, usando a definição de CDRs por Chothia ou MacCullam, ou qualquer combinação de definições de CDR, os limites de estrutura são separados pelos términos de CDR respectivo como descrito acima. Sem prejuízo do disposto, as múltiplas definições de CDRs, em algumas formas de realização é preferido usar a definição de Kabat a definir CDRs.
[0166] Os resíduos em um anticorpo humanizado que não são de um anticorpo humano podem ser resíduos ou seqüências importados de ou derivados de outras espécies (incluindo mas não limitadas a camundongo), ou estas seqüências podem ser seqüências de aminoácidos aleatórias (e.g., geradas a partir de seqüências de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 87/174
80/161 ácidos nucleicos aleatorizadas), que são inseridas na seqüência de anticorpo humanizado. Como observado acima, as seqüências humanas de aminoácidos em um anticorpo humanizado são preferivelmente os FRs, enquanto os resíduos que não são de um anticorpo humano (quer derivado de outra espécie ou seqüências de aminoácidos aleatórias) preferivelmente correspondem aos CDRs. Entretanto, em algumas formas de realização, um ou mais FRs podem conter um ou mais resíduos de aminoácidos não humanos. Em casos de alterações ou modificações (e.g., por introdução de um resíduo não humano) para estrutura de outra maneira humana, é possível para a FR alterada ou modificada ser adjacente a um CDR modificado de outra espécie ou uma seqüência de CDR aleatória, enquanto em outras formas de realização, uma FR alterada não é adjacente a uma seqüência de CDR alterada de outra espécie ou uma seqüência de CDR aleatória. Em algumas formas de realização, as seqüências de estrutura de um anticorpo humanizado são inteiramente humanas (i.e., nenhuma mudança de estrutura é feita à estrutura humana). Em formas de realização preferidas, as seqüências de estrutura de um anticorpo humanizado são inteiramente de linhagem germinativa humana (i.e., nenhuma mudança de estrutura é feita à estrutura de linhagem germinativa humana).
[0167] Resíduos de aminoácidos não humanos de outra espécie, ou uma seqüência aleatória, são freqüentemente referidos como resíduos “importados”, que são tipicamente tiradas de um domínio variável “importado”. Humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e co-autores (e.g., Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), substituindo CDRs ou seqüências de CDR de roedor (ou outro mamífero) pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Também, anticorpos caracterizados pelo fato de que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana também podem ser gerados (e.g., Patente Norte-Americana No. 4.816.567). Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos no quais alguns
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 88/174
81/161 resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores, ou, como observado acima, nos quais seqüências de CDR foram substituídas por seqüências aleatórias. De maneira a não limitar exemplo apenas, métodos para conferir afinidade de ligação de CDR doador em uma estrutura de região variável destinatária de anticorpo são descritos em WO 01/27160 A1, e em pedidos de patente Norte-Americana números de série 09/434.870 e 09/982.464.
[0168] A escolha de domínios variáveis humanos, ambos os leves e pesados, a serem usados para fazer os anticorpos humanizados é importante para reduzir antigenicidade. De acordo com o assim chamada método “de melhor ajuste”, a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor a ser humanizado é selecionada contra a biblioteca inteira de seqüências humanas de domínio variável conhecidas. A seqüência humana que é mais próxima daquela do roedor é então aceita como a estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (e.g., Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993), e Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro método usa uma estrutura particular derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (e.g., Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
[0169] Em outras formas de realização, não existe nenhuma necessidade de préselecionar uma estrutura particular de anticorpo humano (i.e., não existe nenhuma necessidade de selecionar uma estrutura humana com a mais próxima homologia ou identidade de seqüência com um dado anticorpo candidato a ser humanizado). Nestas formas de realização, uma estrutura humana comum ou universal pode ser usada para aceitar um ou mais CDRs não humanos. Na forma de realização preferida, uma estrutura única universal completamente humana é usada como a estrutura para todos os anticorpos a serem humanizados, independente de sua homologia com a(s) seqüência(s) de estrutura(s) dos anticorpos candidatos. Sob esse aspecto, anticorpos humanizados podem ser gerados sem fazer quaisquer
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 89/174
82/161 mudanças na região de estrutura. Esta estrutura universal completamente humana pode então aceitar uma ou mais seqüências de CDR. Em uma forma de realização, a uma ou mais seqüências de CDR são seqüências de CDR de um anticorpo de outra espécie (e.g., camundongo ou rato) que foram modificadas em comparação com o CDR correspondente no anticorpo intacto da outra espécie (i.e. existe simultânea introdução do CDR e modificação do CDR sendo introduzido na estrutura universal humana). A modificação corresponde a uma ou mais mudanças de aminoácidos (no CDR modificado) em comparação com o CDR correspondente no anticorpo intacto de outra espécie. Em uma forma de realização, todos os resíduos de aminoácidos no CDR são incluídos em uma biblioteca, enquanto em outras formas de realização, nem todos os resíduos de aminoácidos no CDR são incluídos em uma biblioteca. Em outra forma de realização, a uma ou mais seqüências de CDR são seqüências aleatórias, que substituem seqüências de CDR.
[0170] Em formas de realização preferidas, anticorpos são humanizados com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Em algumas formas de realização, a afinidade do anticorpo humanizado pelo antígeno é superior do que a afinidade do anticorpo não humanizado correspondente ou fragmento ou porção deste (e.g., o anticorpo candidato de roedor). Sob esse aspecto, em algumas formas de realização, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências originárias e vários produtos humanizados conceituais, usando modelos tridimensionais das seqüências originárias e humanizada. Modelos tridimensionais de imunoglobulinas são comumente disponíveis e são familiares para aqueles versados na arte. São disponíveis programas de computador que ilustram e manifestam prováveis estruturas tridimensionais conformacionais de seqüências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. Inspeção destas manifestações permite análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise de resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candidata para se ligar a seu antígeno. Desta maneira, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências destinatária e
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 90/174
83/161 importada de forma que a característica desejada de anticorpo, tal como aumentada afinidade pelo(s) antígeno(s) alvo, é atingida. Em geral, os resíduos de CDR são diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar ligação de antígeno. [0171] Uma variedade de métodos específicos, bem conhecidos por um de verso na arte, pode ser empregada para introduzir CDRs de anticorpo (ou seqüências aleatórias substituindo CDRs de anticorpo) em estruturas de anticorpo (veja, por exemplo, pedidos de Patente Norte-Americana 09/434.879 e 09/982.464). Em algumas formas de realização, oligos sobrepostos podem ser usados para sintetizar um gene de anticorpo, ou porção deste (por exemplo, um gene codificando um anticorpo humanizado). Em outras formas de realização, mutagênese de um modelo de anticorpo pode ser realizada usando os métodos de Kunkel (abaixo), por exemplo para introduzir um CDR modificado ou uma seqüência aleatória para substituir um CDR. Em algumas formas de realização, regiões variáveis de cadeia leve e pesada são humanizadas separadamente, e então co-expressas como uma região variável humanizada. Em outras formas de realização, regiões variáveis humanizadas fazem a região variável de um anticorpo intacto. Em algumas formas de realização, a região Fc do anticorpo intacto compreendendo uma região variável humanizada foi modificada (e.g. pelo menos uma modificação de aminoácido foi feita na região Fc). Por exemplo, um anticorpo que foi humanizado com CDR aleatorizado e nenhuma mudança de estrutura pode compreender pelo menos uma modificação de aminoácido na região Fc.
[0172] Em outra forma de realização, são empregados animais transgênicos (e.g., camundongos) que são capazes, com imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção endógena de imunoglobulina. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota de gene da região de união de cadeia pesada de anticorpo (JH) em camundongos mutantes quiméricos e de linhagem germinativa resulta em inibição completa de produção endógena de anticorpo. Transferência do conjunto de gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana em tais camundongos mutantes de linhagem germinativa irá resultar na produção de anticorpos humanos sobre desafio de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 91/174
84/161 antígeno (Veja, e.g., Jakobovits et al., Proc. Batl. Acad. Sei. USA 90: 2551 (1993), e Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993)). Anticorpos humanos também podem ser derivados de bibliotecas de manifestação de fago (e.g., Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991), e Vaughan et al., Nature Biotech 14: 309 (1996)).
[0173] A presente invenção fornece métodos para gerar anticorpos humanizados (e fragmentos de anticorpo) que compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido como listado na Tabela 1 neste lugar, na região Fc (quando comparado a um polipeptídeo originário compreendendo uma região Fc sem a substituição de aminoácido). São discutidos abaixo métodos adicionais para gerar tais anticorpos humanizados. A presente invenção também fornece composições compreendendo os anticorpos e fragmentos de anticorpo gerados por este método. Importantemente, os métodos de humanização discutidos abaixo, e outros métodos de humanização (e.g., discutidos acima), podem ser combinados com as regiões Fc variantes da presente invenção. Sob esse aspecto, anticorpos humanizados com regiões Fc únicas alteradas podem ser construídos de acordo com a presente invenção.
[0174] Em algumas formas de realização, um método de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é fornecido, compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VH doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VH destinatária compreendendo FRs; b) sintetizar primeiros oligonucleotídeos codificando porções dos FRs da região VH doadora, caracterizados pelo fato de que as porções das FRs quando comparadas com a segunda seqüência de referência não são modificadas; e uma população de segundos oligonucleotídeos, cada codificando i) pelo menos uma porção de um primeiro CDR que foi modificada, o primeiro CDR selecionado do grupo consistindo de HCDR1, HCDR2 e HCDR3, caracterizado pelo fato de que o primeiro CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 92/174
85/161 comparado com os CDRs doadores correspondentes da primeira seqüência de referência e ii) uma ou mais porções de FRs não modificadas que são capazes de hibridizar com os primeiros oligonucleotídeos; c) misturar os primeiros oligonucleotídeos com a população de segundos oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é construída, caracterizada pelo fato de que as FRs codificadas pelos ácidos nucleicos codificando região VH alterada não são modificadas com respeito à segunda seqüência de referência.
[0175] Em outras formas de realização, um método de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é fornecido, compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL destinatária compreendendo FRs; b) sintetizar primeiros oligonucleotídeos codificando porções dos FRs da região VH doadora, caracterizados pelo fato de que as porções das FRs quando comparadas com a segunda seqüência de referência não são modificadas; e uma população de segundos oligonucleotídeos, cada codificando i) pelo menos uma porção de um primeiro CDR que foi modificada, o primeiro CDR selecionado do grupo consistindo de LCDR1, LCDR2 e LCDR3, caracterizado pelo fato de que o primeiro CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com os CDRs doadores correspondentes da primeira seqüência de referência e ii) uma ou mais porções de FRs não modificadas que são capazes de hibridizar com os primeiros oligonucleotídeos; c) misturar os primeiros oligonucleotídeos com a população de segundos oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é construída, caracterizada pelo fato de que as FRs codificadas pelos ácidos
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 93/174
86/161 nucleicos codificando região VL alterada não são modificadas com respeito à segunda seqüência de referência.
[0176] Em algumas formas de realização, um método de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é contemplado, compreendendo: A) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VH doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VH destinatária compreendendo FRs; B) sintetizar uma população de primeiros oligonucleotídeos, cada codificando pelo menos uma porção de um primeiro CDR selecionado do grupo consistindo de HCDR1, HCDR2 e HCDR3, caracterizada pelo fato de que o primeiro CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com os CDRs doadores correspondentes da primeira seqüência de referência; e segundos oligonucleotídeos codificando i) porções das FRs da região VH destinatária, caracterizadas pelo fato de que as porções das FRs quando comparadas com a seqüência de referência não são modificadas e ii) uma ou mais porções de FRs não modificadas que são capazes de hibridizar com os primeiros oligonucleotídeos; C) misturar a população de primeiros oligonucleotídeos com os segundos oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e D) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é construída, caracterizada pelo fato de que as FRs codificadas pelos ácidos nucleicos codificando região VH alterada não são modificadas com respeito à segunda seqüência de referência.
[0177] Em outras formas de realização, um método de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é fornecido, compreendendo: A) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 94/174
87/161
CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL destinatária compreendendo FRs; B) sintetizar a) uma população de primeiros oligonucleotídeos, cada codificando pelo menos uma porção de um primeiro CDR selecionado do grupo consistindo de LCDR1, LCDR2 e LCDR3, caracterizada pelo fato de que o primeiro CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com os CDRs doadores correspondentes da primeira seqüência de referência; e b) segundos oligonucleotídeos codificando i) porções das FRs da região VL destinatária, caracterizadas pelo fato de que as porções das FRs quando comparadas com a seqüência de referência não são modificadas e ii) uma ou mais porções de FRs não modificadas que são capazes de hibridizar com os primeiros oligonucleotídeos; C) misturar a população de primeiros oligonucleotídeos com os segundos oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e D) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é construída, caracterizada pelo fato de que as FRs codificadas pelos ácidos nucleicos codificando região VL alterada não são modificadas com respeito à segunda seqüência de referência.
[0178] Em algumas formas de realização, a representação de primeiras e segundas seqüências de referência é em forma eletrônica. Em algumas formas de realização, o método adicionalmente compreende a etapa de (e) co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada com um ácido nucleico codificando região variável de cadeia leve de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas. Em algumas formas de realização, a sintetização compreende sintetizar quimicamente. Em algumas formas de realização, o destinatário é humano. Em algumas formas de realização, o tratamento de etapa (d) compreende extensão por uma polimerase.
[0179] Em outras formas de realização, um método de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é contemplado, compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de referência compreendendo a seqüência de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 95/174
88/161 uma região VH doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs, a segunda seqüência de referência compreendendo uma região VH; b) sintetizar uma população de seqüências de genes de anticorpo de região VH alterada, caracterizada pelo fato de que as FRs das regiões VH alteradas são idênticas às FRs da segunda seqüência de referência e pelo menos um primeiro CDR das regiões variáveis de anticorpo alteradas foi modificado, caracterizado pelo fato de que o primeiro CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com o CDR doador correspondente da primeira seqüência de referência.
[0180] Em algumas formas de realização, um método de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é contemplado, compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs; a segunda seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL destinatária compreendendo FRs; b) sintetizar uma população de seqüências de genes de anticorpo de região VL alterada, caracterizada pelo fato de que as FRs das regiões VL alteradas são idênticas às FRs da segunda seqüência de referência e pelo menos um primeiro CDR das regiões variáveis de anticorpo alteradas foi modificado, caracterizado pelo fato de que o primeiro CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com o CDR doador correspondente da primeira seqüência de referência.
[0181] Em algumas formas de realização, a representação de primeiras e segundas seqüências de referência é em forma eletrônica. Em algumas formas de realização, o método adicionalmente compreende a etapa de co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada com um ácido nucleico codificando região VH de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas. Em algumas formas de realização, o destinatário é humano. Em algumas formas de realização, a sintetização envolve o
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 96/174
89/161 uso de oligonucleotídeos sobrepostos.
[0182] Em ainda outras formas de realização, um método de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é contemplado, compreendendo: a) fornecer uma representação de uma seqüência de aminoácidos de referência, a seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VH doadora compreendendo FRs; b) sintetizar uma população de seqüências de genes de anticorpo de região VH alterada, caracterizada pelo fato de que as FRs das regiões VH alteradas são idênticas a FRs da seqüência de referência e pelo menos um primeiro CDR das regiões variáveis de anticorpo alteradas compreende uma seqüência de aminoácidos aleatória.
[0183] Em outras formas de realização, um método de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é contemplado, compreendendo: a) fornecer uma representação de uma seqüência de aminoácidos de referência, a seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora compreendendo FRs; b) sintetizar uma população de seqüências de genes de anticorpo de região VL alterada, caracterizada pelo fato de que as FRs das regiões VL alteradas são idênticas a FRs da seqüência de referência e pelo menos um primeiro CDR das regiões variáveis de anticorpo alteradas compreende uma seqüência de aminoácidos aleatória.
[0184] Em ainda outras formas de realização, um método de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é contemplado, compreendendo: a) fornecer uma representação de uma seqüência de aminoácidos de referência, a seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VH doadora humana compreendendo FRs; b) sintetizar uma população de seqüências de genes de anticorpo de região VH alterada, caracterizada pelo fato de que as FRs das regiões VH alteradas são idênticas a FRs da seqüência de referência humana e pelo menos um primeiro CDR das regiões variáveis de anticorpo alteradas compreende uma seqüência de aminoácidos aleatória. Em algumas formas de realização, a representação da seqüência de referência humana é em forma eletrônica.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 97/174
90/161 [0185] Em outras formas de realização, um método de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é contemplado, compreendendo: a) fornecer uma representação de uma seqüência de aminoácidos de referência, a seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora humana compreendendo FRs; b) sintetizar uma população de seqüências de genes de anticorpo de região VL alterada, caracterizada pelo fato de que as FRs das regiões VL alteradas são idênticas a FRs da seqüência de referência humana e pelo menos um primeiro CDR das regiões variáveis de anticorpo alteradas compreende uma seqüência de aminoácidos aleatória.
[0186] Em algumas formas de realização, a representação da seqüência de referência é em forma eletrônica. Em algumas formas de realização, o método adicionalmente compreende a etapa de co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada com um ácido nucleico codificando região VH de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas. Em algumas formas de realização, o destinatário é humano. Em algumas formas de realização, a sintetização envolve o uso de oligonucleotídeos sobrepostos. Em algumas formas de realização, os CDRs são definidos pela definição de Kabat.
[0187] Em algumas formas de realização, uma ou mais FRs são modificadas simultaneamente com a introdução de uma ou mais CDRs modificadas. Em outras formas de realização, as estruturas modificadas são adjacentes aos CDRs modificados.
[0188] Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada, compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VH doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VH destinatária
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 98/174
91/161 compreendendo FRs; b) sintetizar a) uma primeira população de oligonucleotídeos, compreendendo oligonucleotídeos codificando uma FR da região VH modificada, ou porção desta, caracterizada pelo fato de que a FR da região VH modificada, ou porção desta, contém uma pluralidade de aminoácidos trocados em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de região de estrutura destinatária, caracterizados pelo fato de que as posições de estrutura que são trocadas são selecionadas dentre as posições de estrutura destinatária da segunda seqüência de referência que diferem na posição correspondente comparado com as posições de estrutura doadora da primeira seqüência de referência; e b) uma segunda população de oligonucleotídeos, cada codificando i) pelo menos um CDR modificado, ou porção deste, caracterizado pelo fato de que o CDR modificado, ou porção deste, compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de aminoácidos de CDR doador correspondente e ii) uma ou mais porções de FRs adjacentes que são capazes de hibridizar com a primeira população de oligonucleotídeos; e c) misturar as primeiras e segundas populações de oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é construída. Em certas formas de realização, a representação de primeiras e segundas seqüências de referência é em forma eletrônica. Em outras formas de realização, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de (e) co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada com um ácido nucleico codificando região VL de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas. Em formas de realização adicionais, a sintetização compreende sintetizar quimicamente. Em algumas formas de realização, o destinatário é humano. Em formas de realização preferidas, uma ou mais da população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas são parte de um anticorpo compreendendo uma região Fc, caracterizado pelo fato de que a região Fc compreende pelo menos uma substituição de aminoácido quando comparado a um polipeptídeo originário tendo uma região Fc.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 99/174
92/161 [0189] Em outras formas de realização, a presente invenção fornece métodos de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada, compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VL destinatária compreendendo FRs; b) sintetizar a) uma primeira população de oligonucleotídeos, compreendendo oligonucleotídeos codificando uma FR da região VL modificada, ou porção desta, caracterizada pelo fato de que a FR da região VL modificada, ou porção desta, contém uma pluralidade de aminoácidos trocados em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de região de estrutura destinatária, caracterizados pelo fato de que as posições de estrutura que são trocadas são selecionadas dentre as posições de estrutura destinatária da segunda seqüência de referência que diferem na posição correspondente comparado com as posições de estrutura doadora da primeira seqüência de referência; e b) uma segunda população de oligonucleotídeos, cada codificando i) pelo menos um CDR modificado, ou porção deste, caracterizado pelo fato de que o CDR modificado, ou porção deste, compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de aminoácidos de CDR doador correspondente e ii) uma ou mais porções de FRs adjacentes que são capazes de hibridizar com a primeira população de oligonucleotídeos; e c) misturar as primeiras e segundas populações de oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é construída. Em outras formas de realização, a representação de primeiras e segundas seqüências de referência é em forma eletrônica. Em formas de realização adicionais, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de (e) co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada com um ácido nucleico codificando região variável de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 100/174
93/161 cadeia leve de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas.
[0190] Em algumas formas de realização, os métodos compreendem: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VH doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VH destinatária compreendendo FRs; b) sintetizar a) uma primeira população de oligonucleotídeos, compreendendo oligonucleotídeos codificando uma FR da região VH modificada, ou porção desta, caracterizada pelo fato de que a FR da região VH modificada, ou porção desta, contém uma pluralidade de aminoácidos trocados em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de região de estrutura destinatária, caracterizados pelo fato de que as posições de estrutura que são trocadas são selecionadas dentre as posições de estrutura destinatária da segunda seqüência de referência que diferem na posição correspondente comparado com as posições de estrutura doadora da primeira seqüência de referência; e b) uma segunda população de oligonucleotídeos, cada codificando i) pelo menos um CDR modificado, ou porção deste, caracterizado pelo fato de que o CDR modificado, ou porção deste, compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de aminoácidos de CDR doador correspondente e ii) uma ou mais porções de FRs adjacentes que são capazes de hibridizar com a primeira população de oligonucleotídeos; e c) misturar as primeiras e segundas populações de oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) estender os oligonucleotídeos sobrepostos com uma DNA polimerase sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é construída.
[0191] Em ainda outras formas de realização, a presente invenção fornece métodos de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada, compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 101/174
94/161 seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VL destinatária compreendendo FRs; b) sintetizar a) uma primeira população de oligonucleotídeos, compreendendo oligonucleotídeos codificando uma FR da região VL modificada, ou porção desta, caracterizada pelo fato de que a FR da região VL modificada, ou porção desta, contém uma pluralidade de aminoácidos trocados em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de região de estrutura destinatária, caracterizados pelo fato de que as posições de estrutura que são trocadas são selecionadas dentre as posições de estrutura destinatária da segunda seqüência de referência que diferem na posição correspondente comparado com as posições de estrutura doadora da primeira seqüência de referência; e b) uma segunda população de oligonucleotídeos, cada codificando i) pelo menos um CDR modificado, ou porção deste, caracterizado pelo fato de que o CDR modificado, ou porção deste, compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de aminoácidos de CDR doador correspondente e ii) uma ou mais porções de FRs adjacentes que são capazes de hibridizar com a primeira população de oligonucleotídeos; e c) misturar as primeiras e segundas populações de oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) estender os oligonucleotídeos sobrepostos com uma DNA polimerase sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é construída.
[0192] Em algumas formas de realização, uma ou mais modificações são introduzidas na estrutura, simultaneamente com a introdução de um ou mais CDRs modificados. Os CDRs modificados podem compreender uma ou mais alterações de aminoácidos em comparação com o CDR correspondente de uma seqüência de referência. Em certas formas de realização, os métodos de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada, compreendem: a) fornecer uma
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 102/174
95/161 representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma regiáo VH doadora, a regiáo variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma regiáo VH destinatária compreendendo FRs; b) sintetizar i) uma primeira população de oligonucleotídeos, cada compreendendo pelo menos um CDR modificado, caracterizado pelo fato de que o CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de aminoácidos de CDR doador correspondente; e ii) uma segunda população de oligonucleotídeos, compreendendo oligonucleotídeos codificando porções modificadas de uma estrutura de regiáo VH, a porçáo modificada contendo uma pluralidade de aminoácidos trocados em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de regiáo de estrutura destinatária, caracterizados pelo fato de que as posições de estrutura que sáo trocadas sáo selecionadas dentre as posições de estrutura destinatária da segunda seqüência de referência que diferem na posiçáo correspondente comparado com as posições de estrutura doadora da primeira seqüência de referência; e c) misturar as primeiras e segundas populações de oligonucleotídeos sob condições tal que pelo menos uma porçáo dos oligonucleotídeos hibridiza de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando regiáo VH alterada é construída. Em certas formas de realização, a representação de primeiras e segundas seqüências de referência é em forma eletrônica. Em formas de realização adicionais, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de (e) co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando regiáo VH alterada com um ácido nucleico codificando regiáo VL de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas. Em outras formas de realização, o destinatário é humano. [0193] Em outras formas de realização, a presente invenção fornece métodos de construir uma população de ácidos nucleicos codificando regiáo VL alterada,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 103/174
96/161 compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VL destinatária compreendendo FRs; b) sintetizar i) uma primeira população de oligonucleotídeos, cada compreendendo pelo menos um CDR modificado, caracterizado pelo fato de que o CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de aminoácidos de CDR doador correspondente; e ii) uma segunda população de oligonucleotídeos, compreendendo oligonucleotídeos codificando porções modificadas de uma estrutura de região VL, a porção modificada contendo uma pluralidade de aminoácidos trocados em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de região de estrutura destinatária, caracterizados pelo fato de que as posições de estrutura que são trocadas são selecionadas dentre as posições de estrutura destinatária da segunda seqüência de referência que diferem na posição correspondente comparado com as posições de estrutura doadora da primeira seqüência de referência; e c) misturar as primeiras e segundas populações de oligonucleotídeos sob condições tal que pelo menos uma porção dos oligonucleotídeos hibridiza de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é construída.
[0194] Em certas formas de realização, podem ser gerados os anticorpos ou fragmentos de anticorpos compreendendo uma variante de Fc e uma região variante de cadeia pesada alterada. Por exemplo, em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VH doadora, a
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 104/174
97/161 região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VH destinatária compreendendo FRs; B) sintetizar A) primeiros oligonucleotídeos codificando porções das FRs da região VH destinatária, caracterizadas pelo fato de que as porções das FRs quando comparadas com a seqüência de referência não são modificadas; e B) uma população de segundos oligonucleotídeos, cada codificando i) pelo menos uma porção de um primeiro CDR que foi modificado, o primeiro CDR selecionado do grupo consistindo de HCDR1, HCDR2 e HCDR3, caracterizado pelo fato de que o primeiro CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com os CDRs doadores correspondentes da primeira seqüência de referência e ii) uma ou mais porções de FRs não modificadas que são capazes de hibridizar com os primeiros oligonucleotídeos; c) misturar os primeiros oligonucleotídeos com uma população de segundos oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é construída, caracterizada pelo fato de que as FRs codificadas pelos ácidos nucleicos codificando região VH alterada não são modificadas com respeito à segunda seqüência de referência. Em algumas formas de realização, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada com um ácido nucleico codificando região VL de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas.
[0195] Em outras formas de realização, a presente invenção fornece métodos de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada, compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de referência compreendendo a
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 105/174
98/161 seqüência de uma região VL destinatária compreendendo FRs; b) sintetizar a) primeiros oligonucleotídeos codificando porções dos FRs da região VL doadora, caracterizados pelo fato de que as porções das FRs quando comparadas com a segunda seqüência de referência não são modificadas; e b) uma população de segundos oligonucleotídeos, cada codificando i) pelo menos uma porção de um primeiro CDR que foi modificada, o primeiro CDR selecionado do grupo consistindo de LCDR1, LCDR2 e LCDR3, caracterizado pelo fato de que o primeiro CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com os CDRs doadores correspondentes da primeira seqüência de referência e ii) uma ou mais porções de FRs não modificadas que são capazes de hibridizar com os primeiros oligonucleotídeos; c) misturar os primeiros oligonucleotídeos com a população de segundos oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é construída, caracterizada pelo fato de que as FRs codificadas pelos ácidos nucleicos codificando região VL alterada não são modificadas com respeito à segunda seqüência de referência.
[0196] Em outras formas de realização, a presente invenção fornece métodos de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada, compreendendo: A) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VH doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VH destinatária compreendendo FRs; B) sintetizar a) uma população de primeiros oligonucleotídeos cada codificando i) pelo menos uma porção de um primeiro CDR que foi modificado, o primeiro CDR selecionado do grupo consistindo de HCDR1, HCDR2 e HCDR3, caracterizado pelo fato de que o primeiro CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com os CDRs doadores correspondentes da primeira
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 106/174
99/161 seqüência de referência; e b) segundos oligonucleotídeos codificando i) porções das FRs da região VH destinatária, caracterizadas pelo fato de que as porções das FRs quando comparadas com a seqüência de referência não são modificadas e ii) uma ou mais porções de um CDR que são capazes de hibridizar com os primeiros oligonucleotídeos; C) misturar a população de primeiros oligonucleotídeos com os segundos oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é construída, caracterizada pelo fato de que as FRs codificadas pelos ácidos nucleicos codificando região VH alterada não são modificadas com respeito à segunda seqüência de referência.
[0197] Em certas formas de realização, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada com um ácido nucleico codificando região VL de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas.
[0198] Em outras formas de realização, a presente invenção fornece métodos de construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada, compreendendo: A) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora, a região variável doadora compreendendo i) FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de referência compreendendo a seqüência de uma região VL destinatária compreendendo FRs; B) sintetizar a) uma população de primeiros oligonucleotídeos, cada codificando pelo menos uma porção de um primeiro CDR que foi modificado, o primeiro CDR selecionado do grupo consistindo de LCDR1, LCDR2 e LCDR3, caracterizado pelo fato de que o primeiro CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com os CDRs doadores correspondentes da primeira seqüência de referência; e b) segundos oligonucleotídeos codificando i) porções das FRs da região VL destinatária, caracterizadas pelo fato de que as porções das FRs quando
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 107/174
100/161 comparadas com a seqüência de referência não são modificadas e ii) uma ou mais porções de um CDR que são capazes de hibridizar com os primeiros oligonucleotídeos; C) misturar a população de primeiros oligonucleotídeos com os segundos oligonucleotídeos de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e D) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é construída, caracterizada pelo fato de que as FRs codificadas pelos ácidos nucleicos codificando região VL alterada não são modificadas com respeito à segunda seqüência de referência.
[0199] Em outras formas de realização, a presente invenção fornece métodos de melhorar a afinidade de ligação de uma região variável mutada de anticorpo humanizado, compreendendo: a) fornecer uma seqüência de ácidos nucleicos codificando uma primeira região variável mutada de anticorpo humanizado, a região variável mutada compreendendo (i) uma estrutura de anticorpo humano tipo selvagem, (ii) três CDRs de cadeia pesada não humanos, e (iii) três CDRs de cadeia leve não humanos, caracterizada pelo fato de que os CDRs são definidos pelas definições combinadas de Kabat e Chothia, caracterizados pelo fato de que pelo menos um dos CDRs de cadeia leve é um CDR de cadeia leve contendo mutação pelo menos um aminoácido diferente em pelo menos uma posição quando comparado com o CDR não humano tipo selvagem correspondente, e caracterizada pelo fato de que a primeira região variável mutada de anticorpo tem uma afinidade de ligação maior do que a região variável de anticorpo não mutada correspondente; b) mutar a seqüência de ácidos nucleicos codificando a primeira região variável mutada de anticorpo sob condições tal que uma segunda região variável mutada de anticorpo humanizado é codificada, a segunda região variável mutada de anticorpo humanizado compreendendo pelo menos um aminoácido diferente adicional em pelo menos uma posição no CDR de cadeia leve contendo mutação, a mutação adicional em combinação com a primeira mutação resultando em maior afinidade de ligação. Em algumas formas de realização, o CDR de cadeia leve contendo mutação da primeira região variável mutada de anticorpo humanizado é CDR3 (LCDR3).
[0200] Em outras formas de realização, pelo menos um dos CDRs de cadeia
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 108/174
101/161 pesada da primeira região variável mutada de anticorpo humanizado compreende uma mutação, tal que um aminoácido diferente é codificado em pelo menos uma posição quando comparado com o CDR não humano tipo selvagem correspondente. Em formas de realização adicionais, a mutação de CDR de cadeia pesada é em HCDR3.
[0201] Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece métodos de simultaneamente modificar pelo menos um CDR e pelo menos uma FR enquanto construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada, compreendendo: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VH doadora, a região variável doadora compreendendo i) quatro FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VH destinatária compreendendo quatro FRs; b) sintetizar i) para cada FR a ser modificada, uma população de oligonucleotídeos, cada codificando uma FR modificada, ou porção desta, a FR modificada ou porção desta, contendo uma pluralidade de aminoácidos trocados em uma ou mais posições quando comparado com a região de estrutura correspondente na seqüência de referência de região VH destinatária, caracterizadas pelo fato de que as posições de FR que são trocadas são selecionadas dentre as posições de estrutura destinatária da segunda seqüência de referência que diferem na posição correspondente comparado com as posições de região de estrutura doadora da primeira seqüência de referência; e ii) para cada CDR a ser modificado, uma população de oligonucleotídeos, cada codificando um CDR modificado, ou porção deste, caracterizado pelo fato de que o CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de aminoácidos de CDR doador correspondente e iii) para cada de quaisquer FRs remanescentes e não modificadas, oligonucleotídeos codificando a FR, ou porção desta, tendo a mesma seqüência da FR correspondente da segunda seqüência destinatária de referência; e iv) para cada de quaisquer
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 109/174
102/161
CDRs remanescentes e não modificados, oligonucleotídeos codificando o CDR, ou porção deste, tendo a mesma seqüência do CDR correspondente da primeira seqüência doadora de referência, caracterizados pelo fato de que oligonucleotídeos individuais de (i) até (iv) que codificam porções adjacentes da região VH têm seqüências sobrepostas em seus términos; e c) misturar os oligonucleotídeos e populações de oligonucleotídeos sintetizados em etapa b) sob condições tal que as seqüências sobrepostas de oligonucleotídeos individuais hibridizem de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VH alterada é formada. Em certas formas de realização, a representação de primeiras e segundas seqüências de referência é em forma eletrônica. Em formas de realização adicionais, a região de estrutura a ser modificada é selecionada do grupo consistindo de HCDR1, HCDR2 e HCDR3. Em outras formas de realização, o CDR a ser modificado é HCDR3. Em outras formas de realização, o método compreende adicionalmente a etapa de e) co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando região VH com um ácido nucleico codificando região VL de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas. Em diferentes formas de realização, o método compreende adicionalmente a etapa de e) co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando região VH com uma população de ácidos nucleicos codificando região VL de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas.
[0202] Em outras formas de realização, são empregados os métodos de simultaneamente modificar pelo menos um CDR e pelo menos uma FR enquanto construir uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada, caracterizados pelo fato de que dito método compreende: a) fornecer uma representação de primeiras e segundas seqüências de aminoácidos de referência, a primeira seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de uma região VL doadora, a região variável doadora compreendendo i) quatro FRs e ii) três CDRs como definido pelas definições combinadas de Kabat e Chothia; a segunda seqüência de aminoácidos de referência compreendendo a seqüência de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 110/174
103/161 uma região VL destinatária compreendendo quatro FRs; b) sintetizar i) para cada FR a ser modificada, uma população de oligonucleotídeos, cada codificando uma FR modificada, ou porção desta, a FR modificada ou porção desta, contendo uma pluralidade de aminoácidos trocados em uma ou mais posições quando comparado com a região de estrutura correspondente na seqüência de referência de região VL destinatária, caracterizadas pelo fato de que as posições de FR que são trocadas são selecionadas dentre as posições de estrutura destinatária da segunda seqüência de referência que diferem na posição correspondente comparado com as posições de região de estrutura doadora da primeira seqüência de referência; e ii) para cada CDR a ser modificado, uma população de oligonucleotídeos, cada codificando um CDR modificado, ou porção deste, caracterizado pelo fato de que o CDR modificado compreende um aminoácido diferente em uma ou mais posições quando comparado com a seqüência de referência de aminoácidos de CDR doador correspondente e iii) para cada de quaisquer FRs remanescentes e não modificadas, oligonucleotídeos codificando a FR, ou porção desta, tendo a mesma seqüência da FR correspondente da segunda seqüência destinatária de referência; e iv) para cada de quaisquer CDRs remanescentes e não modificados, oligonucleotídeos codificando o CDR, ou porção deste, tendo a mesma seqüência do CDR correspondente da primeira seqüência doadora de referência, caracterizados pelo fato de que, oligonucleotídeos individuais de (i) até (iv) que codificam porções adjacentes da região VL têm seqüências sobrepostas em seus términos; e c) misturar os oligonucleotídeos e populações de oligonucleotídeos sintetizados em etapa b) sob condições tal que as seqüências sobrepostas de oligonucleotídeos individuais hibridizem de forma a criar oligonucleotídeos sobrepostos; e d) tratar os oligonucleotídeos sobrepostos sob condições tal que uma população de ácidos nucleicos codificando região VL alterada é formada. Em certas formas de realização, o método compreende adicionalmente a etapa de co-expressar a população de ácidos nucleicos codificando região VL com uma população de ácidos nucleicos codificando região VH de forma a produzir uma população diversa de regiões variáveis heteroméricas alteradas.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 111/174
104/161 (V) Anticorpos multiespecíficos [0203] A presente invenção fornece anticorpos multiespecíficos compreendendo uma região Fc variante. Anticorpos multiespecíficos têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Enquanto tais moléculas normalmente irão se ligar a apenas dois antígenos (i.e., anticorpos biespecíficos, BsAbs), anticorpos com especificidades adicionais tal como anticorpos triespecíficos são abrangidos por esta expressão quando usada neste lugar. Exemplos de BsAbs incluem, mas não são limitados a, aqueles com um braço direcionado contra um antígeno de célula de tumor e o outro braço direcionado contra uma molécula que desencadeia citotoxicidade tal como anti-FcvRI/anti-CD 15, anti-pl 85HER2/FcyRIII (CD 16), anti-CD3/anti- malignidade de célula B (D100), anti-CD3/antipl 85HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de célula renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D I (anti-carcinoma de colo), anti-CD3/anti-análogo de hormônio estimulante de melanócito, anti receptor de EFG/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAI, anti-CD3/anti-CD 19, anti-CD3/Mo V 18, anti-molécula de adesão de célula neural (NCAM)/anti-CD3, anti-proteína de ligação de folato (FBP)/anti-CD3, antígeno associado a anti-carcinoma pan (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs com um braço que se liga especificamente a um antígeno de tumor e um braço que se liga especificamente a uma toxina tal como anti-saporina/anti-id-1, antiCD22/antisaporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-ricina A, anti-interferon-α (IFN-a)/anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEA/anti-alcalóide vinca; BsAbs para converter pró-fármacos ativados por enzima tal como anti-CD30/antifosfatase alcalina (que catalisa conversão de pró-fármaco de fosfato de mitocina para álcool de mitocina); BsAbs que podem ser usados como agentes fibrinolíticos tal como anti-fibrina/anti-ativador de plasminogênio de tecido (tPA), anti-fibrina/antiativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA); BsAbs para direcionar complexos imunes para receptores de superfície celular tal como anti-lipoproteína de baixa densidade (LDL)/anti-FcR (e.g., FcyRI, FcyRII ou FcyRIII); BsAbs para uso em terapia de doenças infecciosas tal como anti-CD3/anti-vírus de herpes simplex, anticomplexo receptor de célula T: CD3/anti-influenza, anti-FcYR/anti-HIV; BsAbs para
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 112/174
105/161 detecção de tumor in vitro ou in vivo tal como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/antiDPTA, anti-pl85HER2/anti-hapteno; BsAbs como adjuvantes de vacina; BsAbs como ferramentas de diagnóstico tal como anti-lgG de coelho/anti-ferritina, anti-peroxidase de rábano (HRP)/anti-hormônio, anti-somatostatina/anti-substância P, anti-HRP/antiFITC, anti-CEA/anti-p-galactosidase.
[0204] Exemplos de anticorpos triespecíficos incluem, mas não são limitados a, anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 e anti-CD3/antiCD8/anti-CD37. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpos (e.g., anticorpos biespecíficos de F(ab')2)· Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. Produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento completo é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm diferentes especificidades (e.g., Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Por causa do agrupamento aleatório de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez diferentes moléculas de anticorpo, das quais apenas uma tem a correta estrutura biespecífica. Purificação da molécula correta pode ser realizada por etapas de cromatografia de afinidade. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829, e Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
[0205] Em outras formas de realização, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antígeno) são fusionados a seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é preferivelmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2, e CH3. É preferido ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs codificando as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são co-transfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isto sustenta grande flexibilidade ao ajustar as proporções mutuais dos três fragmentos de polipeptídeo
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 113/174
106/161 em formas de realização quando proporções desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção fornecem rendimentos ótimos. É, entretanto, possível inserir as seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeo em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em iguais proporções resulta em altos rendimentos ou quando as proporções não são de nenhuma significância particular. Em uma forma de realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada híbrida de imunoglobulina com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um par híbrido de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço (veja, e.g., WO 94/04690). De acordo com outra abordagem descrita em WO96/27011 a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser engenheirada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados de cultura celular recombinante. Anticorpos específicos também incluem anticorpos ligados cruzados ou “heteroconjugado”. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina.
B. Moléculas de Imunoadesina [0206] A presente invenção também fornece moléculas de imunoadesina compreendendo uma região Fc variante. Um tipo de projeto de imunoadesina combina o(s) domínio(s) de ligação da adesina (e.g., o domínio extracelular (ECD) de um receptor) com a região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina (e.g., uma região Fc variante). Habitualmente, ao preparar as imunoadesinas da presente invenção, ácido nucleico codificando o domínio de ligação da adesina será fusionado C-terminalmente ao ácido nucleico codificando o término N de uma seqüência de domínio constante de imunoglobulina, entretanto fusões N-terminais também são possíveis.
[0207] Tipicamente, em tais fusões o polipeptídeo quimérico codificado irá reter pelo menos funcionalmente ativos dobradiça, domínios CH2 e CH3 da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Fusões também são feitas ao término C da região Fc de um domínio constante, ou imediatamente N-terminais ao
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 114/174
107/161
CH1 da cadeia pesada ou à região correspondente da cadeia leve. O sítio preciso no qual a fusão é feita não é crítico; sítios particulares são bem conhecidos e podem ser selecionados a fim de otimizar a atividade biológica, secreção, ou características de ligação da imunoadesina.
[0208] Em algumas formas de realização, a seqüência de adesina é fusionada ao término N da região Fc variante de imunoglobulina G1. É possível fusionar a região constante de cadeia pesada inteira à seqüência de adesina. Entretanto, em formas de realização preferidas, é usada na fusão uma seqüência começando na região de dobradiça justo acima do sítio de divagem de papaína que define Fc de IgG quimicamente (i.e., resíduo 216, tomando o primeiro resíduo de região constante de cadeia pesada como sendo 114), ou sítios análogos de outras imunoglobulinas. Em certas formas de realização preferidas, a seqüência de aminoácidos de adesina é fusionada (a) à região de dobradiça e CH2 e CH3 ou (b) à CH1, dobradiça, domínios CH2 e CH3, de uma cadeia pesada de IgG. Em algumas formas de realização, as imunoadesinas são biespecíficas. Alternativamente, as seqüências de adesina podem ser inseridas entre seqüências de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina, tal que uma imunoglobulina compreendendo uma cadeia pesada quimérica é obtida. Em tais formas de realização, as seqüências de adesina podem ser fusionadas à extremidade 3' de uma cadeia pesada de imunoglobulina em cada braço de uma imunoglobulina, ou entre a dobradiça e o domínio CH2, ou entre os domínios CH2 e CH3 (veja, e.g., Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991).
[0209] Embora a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina não seja requerida nas imunoadesinas da presente invenção, uma cadeia leve de imunoglobulina pode estar presente ou covalentemente associada a um polipeptídeo de fusão de adesina-cadeia pesada de imunoglobulina, ou diretamente fusionada a adesina. No caso anterior, DNA codificando uma cadeia leve de imunoglobulina é tipicamente co-expesso com o DNA codificando a proteína de fusão de adesinacadeia pesada de imunoglobulina. Em secreção, uma cadeia pesada híbrida e a cadeia leve irão ser covalentemente associadas para fornecer uma estrutura tipo
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 115/174
108/161 imunoglobulina compreendendo dois pares dissulfeto-ligados de cadeia pesadacadeia leve de imunoglobulina. Métodos adequados para a preparação de tais estruturas são, por exemplo, descritos em Patente Norte-Americana No. 4.816.567. [0210] Em formas de realização preferidas, imunoadesinas são construídas fusionando a seqüência de cDNA codificando a porção de adesina em quadro com uma seqüência de cDNA de imunoglobulina. Entretanto, fusão a fragmentos de imunoglobulina genômica também pode ser usada. Geralmente, o último tipo de fusão requer a presença de seqüências reguladoras de Ig para expressão. CDNAs codificando regiões constantes de cadeia pesada de IgG podem ser isolados baseado em seqüências publicadas de bibliotecas de cDNA derivadas de baço ou linfócitos de sangue periférico, por hibridização ou por técnicas de PCR. Os cDNA s codificando a “adesina” e as partes de imunoglobulina da imunoadesina podem ser inseridos sequencialmente em um vetor plasmídeo que direciona expressão eficiente nas células hospedeiras escolhidas.
Meia Vida Alterada de Polipetídeos Variantes [0211] O receptor de Fc neonatal “FcRn” é um homólogo de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) que não apenas entrega IgGs através da barreira maternofetal durante gestação, mas também é envolvido na regulação de meia vida no soro de IgG. Para uma recente revisão de FcRn veja Ghetie, V and E.S. Ward, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766, 2000. FcRn se liga de uma maneira pH dependente com ligação ocorrendo em pHs levemente ácidos e pouca ou nenhuma ligação detectável em pH 7,4. É postulado que IgGs são absorvidas por células expressando FcRn e entram endossomos ácidos onde a interação FcRn-lgG ocorre. Então as IgGs são transportadas para a superfície celular e liberadas em pH próximo de neutro. IgGs que não se ligam a FcRn depois de consumo em células entram em compartimentos lisossômicos e são degradadas. Consistente com este modelo é a hipótese de que polipeptídeos compreendendo uma região Fc variante que se liga a FcRn com aumentada afinidade têm uma meia vida no soro maior do que aquelas com uma afinidade menor.
[0212] O papel de FcRn como um transportador de IgG indica que as regiões Fc
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 116/174
109/161 variantes com alterada afinidade com FcRn podem ter utilidade terapêutica ou no contexto de um anticorpo monoclonal ou quando operavelmente ligadas a uma proteína heteróloga, i.e., um não anticorpo. Polipeptídeos terapêuticos que seriam beneficiados sendo limpos rapidamente do sujeito ou paciente ou não sendo transportado através de uma membrana placentária, e.g., polipeptídeos radiomarcados, seriam beneficiados sendo operavelmente ligados a uma região Fc que manifesta diminuída afinidade de ligação de FcRn. Alternativamente, polipeptídeos que seriam beneficiados por terem uma meia vida no soro maior e portanto necessidade de serem administrados menos vezes ou sendo transportados através de uma membrana placentária iriam preferencialmente ser operavelmente ligados a uma região Fc que manifesta realçada afinidade de ligação de FcRn (veja Tabelas 2, 5 e 6). Numerosas combinações de características de Fc são contempladas, e.g., uma região Fc com realçada afinidade de ligação de FcRn mas com pouca ou nenhuma atividade de CDC ou ADCC pode ser gerada incorporando uma ou mais substituições de aminoácidos de Fc que aumentam afinidade de ligação de FcRn como listado na Tabela 2 em, e.g., uma região Fc originário de lgG4, ou em uma região Fc originário de lgG1 em combinação com substituição de aminoácido que diminui atividade de CDC e ADCC.
[0213] Polipeptídeos preferidos que seriam beneficiados a partir de uma meia vida no soro aumentada sendo operavelmente ligados a uma região Fc variante da invenção que manifesta aumentada afinidade de ligação de FcRn quando comparado com o polipeptídeo originário são polipeptídeos terapêuticos de mamífero incluindo moléculas tal como, e.g., renina; um hormônio de crescimento; hormônio de crescimento humano; hormônio de crescimento bovino; fator de liberação de hormônio de crescimento; grelina; hormônio de paratireóide; hormônio estimulante de tireóide; lipoproteína; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; anitripsina-a1; PAI-1; proinsulina; trombopoietina; hormônio estimulante de folículo; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagons; fatores coagulantes tal como fator VIIIC, fator IX, fator de tecido (TF), e fator de von Willebrands; fatores anticoagulantes tal como Proteína C; fator natriurético atrial; surfactante de pulmão;
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 117/174
110/161 um ativador de plasminogênio, tal como uroquinase ou urina humana ou ativador de plasminogênio tipo tecido (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hematopoiético; interleucinas, e.g., IL-1 a IL-10; IL-20; fator de necrose de tumor alfa e beta; encefalinase; uma albumina de soro tal como albumina de soro humana; substância Muelleriana-inibidora; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; prorelaxina; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; Dnase; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; integrina; proteína A ou D; fatores reumatóides; um fator neurotrófico tal como fator neurotrófico derivado de cérebro (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervos tal como NGF-beta; cardiotrofinas (fator de hipertrofia cardíaca) tal como cardiotrofina-1 (CT-1); fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fator de crescimento de fibroblasto tal como um aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF) ou seu receptor; fator de crescimento transformante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF beta, incluindo TGF-βΙ, ΤΘΡ-β2, ΤΘΡ-β3, ΤΘΡ-β4, ou TGF-βδ; fator de crescimento tipo insulina I e II; des (1-3)-IGF-l (IGF-I de cérebro); proteínas ligando fator de crescimento tipo insulina; proteínas CD tal como CD-3, CD-4, CD-8, e CD-19; eritropoietina; fatores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética de osso (BMP); um fator de diferenciação de crescimento (e.g., GDF8), um interferon tal como interferon-alfa, beta e gama; fatores estimulantes de colônia (CSFs), e.g., M-CSF, GM-CSF, e GCSF; um anticorpo anti-HER-2 sem uma região FC nativa de uma IgG; um anticorpo anti-RSV sem uma região FC nativa de uma IgG; superóxido dismutase; receptores de célula T; proteínas de superfície de membrana, fator acelerador de decaimento; antígeno viral tal como, por exemplo, uma porção do envelope de AIDS; proteínas de transporte; receptores de residência; adressinas; proteínas reguladoras; anticorpos sem uma região FC nativa de uma IgG; e fragmentos ou precursores de qualquer dos polipeptídeos acima listados.
[0214] A região Fc variante compreendendo uma substituição de aminoácido da invenção que confere uma alterada meia vida no soro no polipeptídeo (i.e.,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 118/174 aumentada afinidade de ligação de FcRn) ao qual ela é operavelmente ligada é preferivelmente operavelmente ligada ao término carboxi ou amino do polipeptídeo de interesse por causa disso gerando uma proteína de fusão.
Seqüências de Ácidos Nucleicos Codificando Regiões Fc Variantes [0215] A presente invenção também fornece seqüências de ácidos nucleicos codificando regiões Fc variantes, assim como composições, vetores, e células hospedeiras compreendendo seqüências de ácidos nucleicos codificando regiões Fc variantes. A presente invenção também fornece métodos recombinantes para produzir região Fc variante.
[0216] Geralmente, para produção recombinante de variantes, ácido nucleico codificando a variante é isolado e inserido em um vetor. Células hospedeiras podem ser transfectadas com o vetor, por causa disso permitindo que a seqüência de ácidos nucleicos seja amplificada, e/ou o peptídeo variante produzido. Seqüências de ácidos nucleicos codificando as variantes de peptídeos da presente invenção podem ser isoladas e seqüenciadas usando procedimentos convencionais (e.g., usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a um ácido nucleico codificando a variante). Geralmente, a seqüência de ácidos nucleicos codificando a variante é operavelmente ligada a outros elementos, tal como uma seqüência sinal (e.g., seqüências sinal secretoras), uma origem de replicação, pelo menos um marcador de gene, um reforçador, um promotor, ou um terminador de transcrição. Em certas formas de realização, células hospedeiras são estavelmente transfectadas com ácido nucleico codificando uma variante para gerar uma linhagem celular expressando uma variante particular. Em formas de realização preferidas, as variantes são expressas em células CHO, NOS, Sp2/0, PER.C6, ou HEK293. Métodos recombinante são bem conhecidos na arte.
[0217] Seqüências de ácidos nucleicos podem ser mutadas de forma que regiões Fc variantes possam ser produzidas. Por exemplo, uma seqüência de ácidos nucleicos codificando uma região Fc originário (e.g., SEQ ID NOs: 1-12) pode ser mutada de forma que pelo menos um de aminoácido muda resultados quando a seqüência de ácidos nucleicos é expressa. Também, seqüências de ácidos
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 119/174
112/161 nucleicos codificando pelo menos uma porção de uma região Fc originário podem ser mutadas para produzir seqüências de aminoácidos compreendendo pelo menos uma porção de uma região Fc variante.
[0218] Em certas formas de realização, síntese baseada em códon é empregada para gerar seqüências mutadas. Exemplos de síntese baseada em códon incluem, por exemplo, aquelas descritas em Patente Norte-Americana Nos. 5.264.563, 5.523.388 e 5.808.022. Resumidamente, síntese baseada em códon pode ser realizada acoplando seqüencialmente monômeros em suportes separados para formar pelo menos dois diferentes tupletos. O acoplamento pode ser realizado em reatores separados, então misturando os suportes dos reatores, e repetindo as etapas de acoplamento, mistura e divisão uma ou mais vezes nos reatores, terminando com uma etapa de mistura ou divisão. Adicionalmente, os oligonucleotídeos podem ser clivados a partir dos suportes.
Usos e Formulações Terapêuticas [0219] Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece formulações terapêuticas compreendendo as variantes descritas neste lugar. Não é pretendido que a presente invenção seja limitada pela natureza particular da composição terapêutica. Por exemplo, tais composições podem incluir um polipeptídeo variante (ou porção desta), fornecido junto com líquidos, géis, portadores sólidos, diluentes, adjuvantes e excipientes fisiologicamente toleráveis, e combinações destes (Veja, e.g., Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition. Osol, A. Ed. (1980)).
[0220] Em adição, polipeptídeos variantes podem ser usados junto com, antes de, ou subseqüente a outros agentes terapêuticos, incluindo, mas não limitados a, salicatos, esteróides, imunossupressores, anticorpos ou antibióticos. Agentes terapêuticos particulares que podem ser usados com as variantes da presente invenção incluem, mas não são limitados a, os seguintes agentes: compostos de azobenzeno (Patente Norte-Americana No. 4.312.806), derivados de rodamina benzil-substituídos (Patente Norte-Americana No. 5.216.002), sais de L-carnosina de zinco (Patente Norte-Americana No. 5.238.931), 3-fenil-5-carboxipirazóis e isotiazóis
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 120/174
113/161 (Patente Norte-Americana No. 5.294.630) IL-10 (Patente Norte-Americana No. 5.368.854), inibidores de síntese de leucotrieno de quinolina (Patente NorteAmericana No. 5.391.555), 2’-halo-2’-desoxiadenosina (Patente Norte-Americana No. 5.506.213), compostos de fenol e benzamida (Patente Norte-Americana No. 5.552.439), tributirina (Patente Norte-Americana No. 5.569.680), certos peptídeos (Patente Norte-Americana No. 5.756.449), ácidos polinsaturados de ômega-3 (Patente Norte-Americana No. 5.792.795), bloqueadores de VLA-4 (Patente NorteAmericana No. 5.932.214), metasulfobenzoato de prednisolona (Patente NorteAmericana No. 5.834.021), agentes contendo citocina (Patente Norte-Americana No. 5.888.969) e nicotina (Patente Norte-Americana No. 5.889.028).
[0221] Polipeptídeos variantes podem ser usados junto com agentes que reduzem a viabilidade ou potencial de proliferação de uma célula. Agentes que reduzem a viabilidade ou potencial de proliferação de uma célula podem funcionar de uma variedade de maneiras incluindo, por exemplo, inibindo síntese de DNA, inibindo divisão celular, induzindo apoptose, ou induzindo morte celular não apoptótica. Exemplos específicos de agentes citotóxicos e citostáticos, incluem mas não são limitados a, proteína antiviral de caruru-de-cacho, abrina, ricina, e cada de suas cadeias A, doxorubicina, cisplastina, iodo-131, ítrio-90, rênio-188, bismuto-212, taxol, 5-fluoroacil, VP-16, bleomicina, metotrexato, vindesina, adriamicina, vincristina, vinblastina, BCNU, mitomicina e ciclofosfamida e certas citocinas tal como TNF-α e TNF-β. Assim, agentes citotóxicos e citostáticos podem incluir, por exemplo, radionuclídeos, drogas quimioterapêuticas, proteínas, e lectinas.
[0222] Composições terapêuticas podem conter, por exemplo, tais aditivos normalmente empregados como ligantes, cargas, portadores, conservantes, agentes estabilizantes, emulsificantes, tampões e excipientes como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, e os semelhantes. Estas composições tipicamente contêm 1%-95% de ingrediente ativo, preferivelmente 2%-70% de ingrediente ativo.
[0223] Os polipeptídeos variantes da presente invenção também podem ser misturados com diluentes ou excipientes que são compatíveis e fisiologicamente
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 121/174
114/161 toleráveis. Diluentes e excipientes adequados sáo, por exemplo, água, salina, dextrose, glicerol, ou os semelhantes, e combinações destes. Em adiçáo, se desejado, as composições podem conter quantidades mínimas de substâncias auxiliares tal como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes estabilizantes ou de tamponamento de pH.
[0224] Em algumas formas de realização, as composições terapêuticas da presente invenção sáo preparadas ou como soluções ou suspensões líquidas, como pulverizações, ou em formas sólidas. Formulações orais normalmente incluem tais aditivos normalmente empregados como ligantes, cargas, portadores, conservantes, agentes estabilizantes, emulsificantes, tampões e excipientes como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, e os semelhantes. Estas formulações assumem a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação sustentada, ou pós, e tipicamente contêm 1%-95% de ingrediente ativo, preferivelmente 2%-70% de ingrediente ativo. Um exemplo de uma composição oral útil para entregar as composições terapêuticas da presente invenção é descrito em Patente Norte-Americana No. 5.643.602.
[0225] Formulações adicionais que sáo adequadas para outros modos de administração, tal como administração tópica, incluem ungüentos, tinturas, cremes, loções, esparadrapos transdermais, e supositórios. Para ungüentos e cremes, ligantes, portadores e excipientes tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos. Um exemplo de um método de entrega tópica é descrito em Patente Norte-Americana No. 5.834.016. Outros métodos de entrega lipossômica também podem ser empregados (Veja, e.g., Patente Norte-Americana Nos. 5.851.548 e 5.711.964).
[0226] As formulações também podem conter mais do que um composto ativo como necessário para a indicação particular sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividade complementar que náo afetam adversamente um ao outro. Tais moléculas sáo adequadamente presentes em combinação com quantidades que sáo efetivas para o propósito pretendido.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 122/174
115/161 [0227] Preparações de liberação sustentada também podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o polipeptídeo variante, cujas matrizes são na forma de artigos com forma, e.g., filmes, ou microcápsula. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem, mas não são limitados a, poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato), ou poli (vinilálcool)), polilactídeos, colpolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copolímeros degradáveis de ácido lácticoácido glicólico tal como o LUPRON DEPOT (microsferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e poli-D-(-)-3ácido hidroxibutírico. Enquanto polímeros tal como acetato de etileno-vinil e ácido láctico-ácido glicólico possibilitam liberação de moléculas por volta de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos.
[0228] Os polipeptídeos variantes da presente invenção podem ser usados para tratar um sujeito. Tal tratamento pode ser administrado a um sujeito com uma doença, ou pode ser administrado profilaticamente a um sujeito (e.g., a um sujeito predisposto à doença). Exemplos de condições que devem ser tratadas incluem, mas não são limitados a, câncer (e.g., onde o polipeptídeo variante se liga ao receptor HER-2, CD20 ou fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)); condições alérgicas tal como asma (com um anticorpo anti-lgE); e desordens mediadas por LFA-1 (e.g., onde o polipeptídeo variante é um anticorpo anti-LFA-l ou anti-ICAM-l) etc.
[0229] Em formas de realização preferidas, as variantes de polipeptídeos usadas para tratar sujeitos compreendem anticorpos ou imunoadesinas. Também em formas de realização preferidas, as doenças tratadas são doenças responsivas a anticorpo ou imunoadesina. Exemplos de doenças responsivas a anticorpo incluem doenças e condições médicas tal como: linfoma (mostrado ser tratável com RITUXAN, e anticorpo anti-CD20), doença infecciosa (mostrado ser tratável com SYNAGIS, e anticorpo direcionado para a proteína F de vírus sincial respiratório), transplante de rim (ZENAPAX, e anticorpo anti-receptor de IL-2, mostraram serem úteis), doença
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 123/174
116/161 de Crohn e artrite reumatóide (mostrado sertratável com REMICADE, uma anticorpo anti-TNF-α), carcinoma de mama (mostrado ser tratável com HERCEPTIN, um anticorpo anti-20 HER2), e câncer de colo (mostrado ser tratável com EDRECOLOMAB, um anticorpo anti-17-1A). Polipeptídeos variantes usados para tratar câncer deveríam preferivelmente compreender uma substituição de aminoácido de região Fc da invenção que confere aumentada atividade de ADCC e ou aumentada atividade de CDC no polipeptídeo.
[0230] Em algumas formas de realização, um polipeptídeo variante com melhorada atividade de ADCC é empregado no tratamento de doenças ou desordens onde destruição ou eliminação de tecido ou microorganismos estrangeiros é desejada. Por exemplo, a variante pode ser usada para tratar câncer; desordens inflamatórias; infecções (e.g., infecções bacterianas, virais, fúngicas ou de levedura); e outras condições (tal como bócio) onde remoção de tecido é desejada. Em outras formas de realização, o polipeptídeo variante tem atividade de ADCC diminuída. Tais variantes podem ser usadas para tratar doenças ou desordens onde um polipeptídeo contendo região Fc com meia vida longa é desejado, mas o polipeptídeo preferivelmente não tem função(ões) efetora(s) indesejada(s). Por exemplo, o polipeptídeo contendo região Fc pode ser um anticorpo anti-fator de tecido (TF); anticorpo anti-lgE; e anticorpo anti-integrina (e.g., um anticorpo anti-a 437). O mecanismo de ação desejado de tais polipeptídeos contendo região Fc pode ser bloquear pares de ligação ligante-receptor. Além disso, o polipeptídeo contendo região Fc com atividade de ACC diminuída pode ser um anticorpo agonista.
[0231] Polipeptídeos variantes usados para tratar câncer deveríam preferivelmente compreender uma substituição de aminoácido de região Fc da invenção (veja, e.g., Tabela 2 neste lugar) que confere aumentada atividade de ADCC e ou aumentada atividade de CDC no polipeptídeo.
[0232] Os polipeptídeos variantes da presente invenção podem ser administrados por qualquer meio adequado, incluindo administração parenteral, subcutânea, tópica, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, intralesional (e.g.,
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 124/174
117/161 para tratamento imunossupressor local). Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, ou subcutânea. Em adição, a variante de polipeptídeo é adequadamente administrada por infusão de pulso, particularmente com doses declinantes do polipeptídeo variante. Preferivelmente, a dosagem é dada por injeções, mais preferivelmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é resumida ou crônica.
[0233] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de variante de polipeptídeo irá depender do tipo de doença a ser tratada, da severidade e curso da doença, se o polipeptídeo variante é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, do histórico clínico de paciente e resposta à variante de polipeptídeo, e da discreção do clínico atendente. O polipeptídeo variante é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou por uma série de tratamentos.
[0234] Por exemplo, dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 0,1 pg/kg a 15 mg/kg (e.g., 0,120 mg/kg) de polipeptídeo variante é uma dosagem inicial candidata para administração para o paciente, quer, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas por diversos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que sintomas sejam suficientemente reduzidos ou eliminados. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais, e pode ser usado para ajustar dosagem para atingir um efeito terapêutico.
[0235] Estas quantidades sugeridas de polipeptídeo variante são sujeitas a um grande negócio de discreção terapêutica. O fator chave para selecionar uma dose e programação é o resultado obtido. Fatores para consideração neste contexto incluem a desordem particular sendo tratada, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa da desordem, o sítio de entrega do anticorpo, o tipo particular de anticorpo, o método de administração, a programação de administração, e outros fatores conhecidos por praticantes médicos.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 125/174
118/161 [0236] Uma quantidade terapeuticamente efetiva de um polipeptídeo variante a ser administrada é o nível de dosagem requerido por um paciente tal que os sintomas da doença sendo tratada são reduzidos. Adicionalmente, uma quantidade terapeuticamente efetiva pode se referir à quantidade de agente terapêutico suficiente para atrasar ou minimizar ou prevenir o início de doença, e.g., atrasar ou minimizar ou prevenir o espalhamento de câncer. Uma quantidade terapeuticamente efetiva pode se referir à quantidade de agente terapêutico (e.g., polipeptídeo variante) também pode se referir à quantidade de agente terapêutico que fornece um benefício terapêutico no tratamento ou administração de uma doença em um sujeito. Ademais, uma quantidade terapeuticamente efetiva com respeito a um agente terapêutico da invenção se refere à quantidade de agente terapêutico sozinho, ou em combinação com outras terapias, que fornece um benefício terapêutico no tratamento ou administração de uma doença em um sujeito. O polipeptídeo variante não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar a desordem em questão. A quantidade efetiva de tais outros agentes depende da quantidade de polipeptídeo variante presente na formulação, do tipo de desordem ou tratamento, e de outros fatores discutidos acima. Um primeiro agente profilático ou terapêutico (e.g., polipeptídeo variante ou polipeptídeo compreendendo uma região Fc variante da invenção oi fragmento funcional desta) pode ser administrado antes de, concomitantemente com, ou subseqüente à administração de um segundo agente profilático ou terapêutico para um sujeito com uma desordem.
[0237] Agentes terapêuticos da invenção podem ser congelados ou liofilizados para armazenamento e reconstituídos em um portador estéril adequado antes de uso. Liofilização e reconstituição podem levar a graus variantes de perda de atividade de anticorpo. Dosagens podem ter que ser ajustadas para compensar. Geralmente, pH entre 6 e 8 é preferido.
[0238] O uso de um anticorpo monoclonal compreendendo uma região Fc variante da presente invenção para tratamento ou prevenção de pelo menos uma das desordens acima mencionadas (e.g., câncer) no qual o antígeno ao qual o
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 126/174
119/161 anticorpo monoclonal se liga é prejudicial ou que se beneficia de níveis diminuídos do antígeno é contemplado neste lugar. Adicionalmente, é contemplado o uso de um anticorpo compreendendo uma região Fc variante da presente invenção para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de pelo menos uma das desordens acima mencionadas.
[0239] Como usado neste lugar, os termos “tratamento”, “tratar”, e os semelhantes, se referem a obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completamente ou parcialmente uma doença ou sintoma desta e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. “Tratamento”, como usado neste lugar, inclui administração de um composto da presente invenção para tratamento de uma doença ou condição em um mamífero, particularmente em um humano, e inclui: (a) prevenir a doença de ocorrer em um sujeito que pode ser pré-disposto à doença mas ainda não foi diagnosticado com tendo ela; (b) inibir a doença, i.e., seqüestrar seu desenvolvimento, e (c) aliviar a doença, i.e. causar regressão da doença ou desordem ou aliviar sintomas ou complicações desta. Regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta ótima desejada (e.g., uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, uma injeção única pode ser administrada, diversas doses divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica.
Anticorpos Anti-CD20 [0240] Um anticorpo anti-CD20 compreendendo uma região Fc variante da presente invenção é contemplado para cair dentro do escopo da invenção (veja, e.g., Exemplo 4 e Figura 4 neste lugar). Em uma forma de realização, um anticorpo anti-CD20 compreende uma região Fc variante da invenção, ou porção desta compreendendo a substituição de aminoácido, como listado nas Tabelas 1-10 neste lugar, o anticorpo anti-CD20 pode adicionalmente compreender um peptídeo com a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 13, 14, 15 ou 16. Em outra forma de realização, um anticorpo anti-CD20 compreende uma região Fc variante da
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 127/174
120/161 invenção, ou porção desta compreendendo a substituição de aminoácido, como listado nas Tabelas 1-10 neste lugar, e adicionalmente compreende peptídeos com as seqüências mostradas em:
SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14;
SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16;
SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21 e 22; ou
SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28.
[0241] Mais preferivelmente, um anticorpo anti-CD20 da invenção compreende uma região Fc variante, ou porção desta, compreendendo substituição(ões) de aminoácido(s) selecionada(s) do grupo consistindo de:
247I e 339D;
247I e 339Q; e
378D;
[0242] e adicionalmente compreende uma região variável compreendendo polipeptídeos com as seqüências selecionadas do grupo consistindo de:
SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14;
SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16;
SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21 e 22; ou
SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28.
Usos Adicionais de Região Fc Variante [0243] As variantes, e seqüências de ácidos nucleicos codificando variantes, da presente invenção podem ser usadas de muitas maneiras. Por exemplo, variantes da presente invenção podem ser usadas em ensaios de seleção de fármaco. Por exemplo, compostos candidatos podem ser avaliados para sua habilidade para alterar ou interferir em funções efetoras de Fc pondo em contato uma variante com o composto candidato e determinando ligação do composto candidato à variante. A variante pode ser imobilizada usando métodos conhecidos na arte tal como ligar uma proteína de fusão GST-variante a um grânulo polimérico contendo glutationa. Um gene quimérico codificando uma proteína de fusão GST é construído fusionando DNA codificando a variante de interesse ao DNA codificando o término carboxil de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 128/174
121/161
GST (Veja, e.g., Smith et al., Gene 67:31 [1988]). O construto de fusão é então transformado em um sistema de expressão adequado (e.g., E. coli Xa90) no qual a expressão da proteína de fusão GST pode ser induzida com isopropil-f-Dtiogalactopiranosida (IPTG). Indução com IPTG deve produzir a proteína de fusão com um constituinte principal de proteínas celulares solúveis. As proteínas de fusão podem ser purificadas por métodos conhecidos por aqueles versados na arte, incluindo purificação por cromatografia de afinidade de glutationa. Ligação do composto candidato à variante é correlacionada com a habilidade do composto para interromper a uma ou mais funções efetoras.
[0244] Em outro método de seleção, ou a variante ou um FcR selecionado é imobilizado usando métodos conhecidos na arte, tal como adsorção em uma placa microtiter de plástico ou ligação específica de uma proteína de fusão GSTa um grânulo polimérico contendo glutationa. Por exemplo, variante de GST é ligada a grânulos de glutationa-Sefarose. A variante imobilizada é então posta em contato com um FcR e um composto candidato. Peptídeo não ligado é então removido e o complexo solubilizado e analisado para determinar a quantidade de peptídeo marcado ligado. Uma diminuição em ligação é uma indicação que o composto candidato inibe a interação de variante com o FcR. Este método de seleção é particularmente útil com variantes da presente invenção que mostram um nível aumentado de A variação deste método permite a seleção de compostos que são capazes de romper um complexo previamente formado de variante/receptor de Fc. Por exemplo, em algumas formas de realização um complexo compreendendo uma variante ligada a um FcR é imobilizado como descrito acima e contactado com um composto candidato. A dissolução do complexo pelo composto candidato se correlaciona com a habilidade do composto para disrupt ou inibir a interação entre a variante sendo testada e o ser de fcR. Sob esse aspecto, compostos com potencial terapêutico (e.g., em humanos) podem ser identificados (e.g., compostos úteis para tratar doença humana, tal como doenças auto-imunes).
[0245] Outra técnica para seleção de fármaco fornece alta seleção de produção para compostos tendo afinidade de ligação adequada com peptídeos variantes e é
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 129/174
122/161 descrita em detalhe em WO 84/03564. Resumidamente, grandes números de diferentes compostos de teste de peptídeos pequenos são sintetizados em um substrato sólido, tal como broches de plástico ou alguma outra superfície. Os compostos de teste de peptídeos são então reagidos com peptídeos variantes e lavados. Peptídeos variantes ligados são então detectados por métodos bem conhecidos na arte.
[0246] Outra técnica usa anticorpos direcionados para peptídeos variantes. Tais anticorpos capazes de se ligar especificamente a peptídeos variantes competem com um composto de teste para ligação a uma dada variante. Desta maneira, os anticorpos podem ser usados para detectar a presença de qualquer peptídeo que compartilha um ou mais determinantes antigênicos do peptídeo variante.
[0247] A presente invenção contempla muitos outros meios de selecionar compostos. Os exemplos fornecidos acima são apresentados meramente para ilustrar uma variação de técnicas disponíveis. Alguém de habitual verso na arte irá apreciar que muitos outros métodos de seleção podem ser usados.
[0248] Em particular, a presente invenção contempla o uso de linhagens celulares transfectadas com ácido nucleico codificando pelo menos uma região Fc variante para selecionar compostos para atividade, e em particular para seleção de alta produção de compostos de bibliotecas combinatórias (e,g„ bibliotecas contendo mais do que 104 compostos). As linhagens celulares da presente invenção podem ser usadas em uma variedade de métodos de seleção.
[0249] As variantes da presente invenção podem ser usadas como um agente de purificação de afinidade. Por exemplo, a variante pode ser imobilizada em uma fase sólida tal como uma resina de Sefadex ou papel de filtro, usando métodos bem conhecidos na arte. A variante imobilizada é então colocada em contato com uma amostra contendo o antígeno a ser purificado, que é ligado à variante de polipeptídeo imobilizada. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que irá liberar o antígeno do polipeptídeo variante.
[0250] O polipeptídeo variante também pode ser útil em ensaios diagnósticos
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 130/174
123/161 (e.g. para detectar expressão de um antígeno de interesse em células específicas, tecido ou soro). Para aplicações diagnosticas, a variante irá tipicamente ser marcada com uma unidade detectável (tais marcas também são úteis nos ensaios de região Fc descritos acima). Numerosas marcas são disponíveis, incluindo, mas não limitadas a, radioisótopos (e.g., 35S, 14C, 1251, 3H, e 1311), marcas fluorescentes (e.g., quelados terrosos raros (quelados de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, Lissamina, ficoeritrina e Vermelho Texas), e várias marcas enzima-substrato (veja, e.g., Patente Norte-Americana No. 4.275.149), e luciferase, luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano (HRPO), fosfatase alcalina, 3galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases (e.g., glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tal como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e os semelhantes). Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo: peroxidase de rábano (HRPO) com hidrogênio peroxidase como um substrato, caracterizado pelo fato de que a hidrogênio peroxidase oxida um precursor de corante (e.g., ortofenileno diamina (OPD) ou 3,3',5,5'-tetrametil benzidina hidrocloreto (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com para-nitrofenil fosfato como substrato cromogênico; e (iii) -D-galactosidase (R-D-Gai) com um substrato cromogênico ou substrato fluorogênico.
[0251] As variantes da presente invenção também podem ser usadas para ensaios diagnósticos in vivo. Por exemplo, o polipeptídeo variante é marcado com um radionuclídeo tal que o antígeno ou células expressando ele podem ser localizados usando imunocintilografia.
Tabelai Variantes de Fc (pg 101)
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 131/174
124/161
Posição*
Substituição de aminoácidos*
235 G, R
236 F, R, Ϊ
237 K. N, R
229 E, G, H, I, I·, V, W, Y
244 L
245 R
247 A, D, E, F, M, N, Q, R,
248 F, P, Q, W
249 L, Mr N, P, Y
251 ΗΓ I, W
254 D, B, F, G, H, I, K, L·,
255 Κ, N
256 Η, I, K, L, V, wr Ϊ
257 A, I, M, N, 3
253 D
260 3
262 L
264 S
265 K, S
267 Η,· I, K
268 K
265 N, Q
271 T
272 Ή, Kr L, R
279 A. D, Fd G, H, L K, L,
230 T
233 F, G, H, I. Kr L, M, F,
236 F
298 1?, p
292 E, Fr G, I, L
293 s, V
301 w
3D4 E
307 E, M
312 P
315 F, Kr L, p, R
316 F, K
317 p, T
318 N, P, T
332 F, G, U M, 8, V, W
339 D, Er F, G, H, I, K, L,
341 D, E, F, H, I, K, L, M,
343 A, Dd E, F< G, H, I, K,
373 D, E, F, G, H, I, K, L,
375 R
376 E, F, G, H, I, L, M, N,
377 G, K, P
378 D, N
379 N, Q, s, T
Μ,
Mr N, L»
M,
P,
Μ, Ν', P, Q, R, V, Wr Y
κ.
Ν,
Q,
R. S, T,
Τ, w,
N, P,
M,
H,
Q,
Q, Q, Nr Q,
Rj
R,
Q,
R, s,
s.
R, s,
R.
8.
T,
w. Y
T, V, W, Y
8, Tr V, w
T, V. w
V, W, Y
, Υ
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 132/174
125/161
330 D, N, s, T
332 D, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, Rr Ξ, T, V, Y
305 E, P
366 K
423 N
424 H, M, V
4Ξ6 D, L
427 N
429 A, F, M
430 A, D, Fr Gr H, I, K, L, M, Nr P, Gr R. Ξ, T, V, W, Y
431 H, K. P
43Ξ R, Ξ
439 G, K, L, T, W
439 E, H, Q
440 D, E, F, G, I, K, L, M, Qr τ r V
442 Κ + posição de aminoácido de Fc de acordo com numeração de EU • e.g., em posição 249: 249L, 249M, 249N ou 249Y.
Tabela 2 Variantes de Fc: mudanças de função efetora
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 133/174
126/161
Variante* ADCC realçado ADCC diminuído Ligação FcRn. realçada Ligação FcRn diminuída CDC realçado CDC diminuído
235G X
235Q X X
235 R X
235S X X
236F X
236R X X
23SY X X X
237E X X
237 K X X X
237N X X
237 R X X X
23BA X X
230 E X X X
236G X X X
23BH X X X
2301 X X
23SL X X X
236V X X
230W X X X
23BY X X X
244L X X
245R X X X
247A X X X
247D X X
247E X X
247F X X
247G X X X
247H X X X
2471 X X X
247L X X X
247M X X
247N X X
2470 X X
247R X X X
247S X X
247T X X
247V X
247W X X
Ξ47Υ X X X
243A X
248F X X
248P X X
248Q X X
248W X X
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 134/174
CDC CDC realçado diminuído
Variante*
ADCC realçado
ADCC diminuído
249E X
24SL
127/161
249M 249N 24SP 249Y 250K 2Ξ0Μ 250R 251 F 251H 2511 251W 252Y 254A 254D 254E 254F
2540 254H
2541 254K 254L 254M 254N 254P 2540
254 R Ξ54Τ 254V 254W 254Y 255K 255N 25SA 256F 256G 25€H 256J 256K 256L 256M 25ΘΡ 2560
255 R 2&6V
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Ligação FcRn realçada
X
X
Ligação FcRn diminuída
X
X X X
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
X
X X X
X
X X
X
X
X X X X X
X
X X X X
X
X X X
X
X
X
X
X X X
X
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 135/174
128/161
Variante* ADCC realçado ADCC diminuído Ligação FcRn realçada Ligação FcRn diminuída CDC realçado CDC diminuído
256W X X
256Y X X
257A X X X
2571 X X X
257M X X X
257N X X X
257S X X X
257V X X X
250D X X
250S X X X
262L X X X
264S X X X
Ξ65Η X X
265K X
E65S X X
2S5Y X X X
267G X X X
267H X X
2671 X X X
267K X X
256 D X X X
2ÊSE X X
268Κ X X
269N X X
269Q X X
270A X X X
270G X X
270K X X X
270M X X X
27ÜN X X
271T X X
272H X X X
Ξ72Κ X X
272L X X X
272N X X
272R X X
279A X X
279D X X
279F X
279G X
279H X
27&I X
279K X X
279L X X
279M X
Ξ79Ν X
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 136/174
129/161
Variante* ADCC realçado ADCC diminuído Ligaçao FcRn realçada Ligaçao FcRn diminuída CDC realçado CDC diminuído
279Q X X
279R X
379S X X
279T X
279W X X X
279Y X X
230A X X
2Θ0Κ X X
2Θ0Τ X X
2Θ3Α X X
2B3D X X
283F X X X
283G X X X
2G3H X X X
2831 X X X
283K X X X
233L X X X
283M X X
2B3N X X
2Θ3Ρ X X
2B3Q X
ΞΘ3Π X X X
283S X X
Ξ83Τ X
283W X X X
283Y X X
285 N X X
296F X
2Θ0Ν X X
2Θ8Ρ X X
2 92 A X X
292E X X
292F X X
292G X X
2921 X X
292 L X X
293S X X
293V X X
301W X X
3O4E X
307A X X X
307E X X X
3Ü7M X X X
311A X X
311D X X
311E X X
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 137/174
130/161
Variante* ADCC re alçado ADCC . diminuído Ligação FcRn realçada Ligação FcRn diminuída CDC realçado
311F X X X
311G X
3111 X X X
311K X X X
311L X X
311M X X
311R X X
311N X X
3118 X
31 IT X X
311V X X X
311W X X
311Y X X X
312P X X X
314F X X X
3141 X X
314 V X X X
314W X X X
314Y X
315F X X X
315K X X
315L X X
31 &P X X X
315Ft X
316F X X
316K X X
317P X X X
317T X X
31BN X X X
318P X
318T X X X
318V X
326W X X X
327T X X
328V X
329Y X
33OK X
330R
332A X
332 D X X
332Ê X X
332F X X
332G X
332H X X X
332K X X
332L X X X
CDC diminuído
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 138/174
131/161
ADCC
Variante* realçado
332M
332N
332 R
332S
ADCC diminuído
Ligação FcRn Ligação FcRn realçada d ϊ τ» ϊ ui ι í Ja
X
CDC realçado
X
X
X
CDC diminuído
33ΞΤX
332VX
332W
33ΞΎ
339 DX
339 E
339 FX
339GX
339H
339IX
339KX
339L
339MX
339NX
339QX
339RX
339SX
339TX
X
X
X X
X X
X X X X X
339W 339Y 341D 341E 541F 341H 3411 341K 341L 341M 341N 341P 341Q 341R 341S 341T 341V 341W 341Y 343A 343D 343E 343F
X X X X X X X X X X X X X X
X X X X X X
X
X X X X
X
X
X
X X X
X
X X X X X X X X X X X X
X
X X X X X X X X X X X X
X X
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 139/174
Variante*
ADCC realçado
ADCC diminuído
343GX
343HX
3431
34BK
343LX
343MX
343NX
343GX
343RX
3433X
343TX
343VX
343WX
343YX
373AX
373DX
373EX
373FX
373GX
373H
3731X
373 KX
373LX
373MX
373NX
373QX
373RX
373SX
373TX
373VX
373WX
375RX
376AX
376EX
376FX
S76GX
376HX
3761 376L B76M 376N 376P 37SQ 376R 376S 37ST
132/161
Ligaçao FcRn Ligação FcRn realçada diminuída
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Figure BRPI0514068B1_D0001
Figure BRPI0514068B1_D0002
Figure BRPI0514068B1_D0003
Figure BRPI0514068B1_D0004
Figure BRPI0514068B1_D0005
Figure BRPI0514068B1_D0006
Figure BRPI0514068B1_D0007
Figure BRPI0514068B1_D0008
Figure BRPI0514068B1_D0009
Figure BRPI0514068B1_D0010
Figure BRPI0514068B1_D0011
Figure BRPI0514068B1_D0012
Figure BRPI0514068B1_D0013
Figure BRPI0514068B1_D0014
Figure BRPI0514068B1_D0015
Figure BRPI0514068B1_D0016
Figure BRPI0514068B1_D0017
CDC CDC realçado diminuído
Figure BRPI0514068B1_D0018
Figure BRPI0514068B1_D0019
Figure BRPI0514068B1_D0020
Figure BRPI0514068B1_D0021
Figure BRPI0514068B1_D0022
Figure BRPI0514068B1_D0023
Figure BRPI0514068B1_D0024
Figure BRPI0514068B1_D0025
Figure BRPI0514068B1_D0026
Figure BRPI0514068B1_D0027
Figure BRPI0514068B1_D0028
Figure BRPI0514068B1_D0029
Figure BRPI0514068B1_D0030
Figure BRPI0514068B1_D0031
Figure BRPI0514068B1_D0032
Figure BRPI0514068B1_D0033
Figure BRPI0514068B1_D0034
Figure BRPI0514068B1_D0035
Figure BRPI0514068B1_D0036
Figure BRPI0514068B1_D0037
Figure BRPI0514068B1_D0038
Figure BRPI0514068B1_D0039
Figure BRPI0514068B1_D0040
Figure BRPI0514068B1_D0041
Figure BRPI0514068B1_D0042
Figure BRPI0514068B1_D0043
Figure BRPI0514068B1_D0044
Figure BRPI0514068B1_D0045
Figure BRPI0514068B1_D0046
Figure BRPI0514068B1_D0047
Figure BRPI0514068B1_D0048
Figure BRPI0514068B1_D0049
Figure BRPI0514068B1_D0050
Figure BRPI0514068B1_D0051
Figure BRPI0514068B1_D0052
Figure BRPI0514068B1_D0053
Figure BRPI0514068B1_D0054
Figure BRPI0514068B1_D0055
Figure BRPI0514068B1_D0056
Figure BRPI0514068B1_D0057
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 140/174
133/161
Vaiiajiie*
ADCC ADCC realçado diminuído
Ligação FcRn Ligação FcRn realçada diminuída
CDC CDC realçado diminuído
376VX
376W
376Y
377GX
377KX
377P
378D
37β N
379 NX
Figure BRPI0514068B1_D0058
Figure BRPI0514068B1_D0059
Figure BRPI0514068B1_D0060
Figure BRPI0514068B1_D0061
Figure BRPI0514068B1_D0062
Figure BRPI0514068B1_D0063
373Q
379S
379T
380A
380D
390NX
38üSX
3Θ0Τ
3Θ2ΑX
362 D
362FX
3β2Η
382IX
382K
332 L
3Θ2Μ
382N
362P
382Q
382P
382S
3S2T
392V
302W
3Θ2Υ
3Θ5Ε X
365P
386K
423N
424 H
424KI
424V
426D
42ÊL
427N X
429A
429 F
Figure BRPI0514068B1_D0064
Figure BRPI0514068B1_D0065
Figure BRPI0514068B1_D0066
Figure BRPI0514068B1_D0067
X X X X X
X
X
X
X X
X X X
X
X
X
X
X
X
X
X
Figure BRPI0514068B1_D0068
Figure BRPI0514068B1_D0069
Figure BRPI0514068B1_D0070
Figure BRPI0514068B1_D0071
Figure BRPI0514068B1_D0072
Figure BRPI0514068B1_D0073
Figure BRPI0514068B1_D0074
Figure BRPI0514068B1_D0075
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 141/174
134/161
ADCC ADCC Ligação FcRn Variante* realçado diminuído realçada
Ligação FcRn CDC CDC diminuída realçado diminuído
429MX
43ÜAX
43QD
43OFx
43QGχ
43DH Xx
430IX
430K Xx
430LX
430MX
43DN Xx
430P
430Q Xx
43QR XX
430SX
43OTX
430VX
43CWx
43OYX
431Hx
431KX
431P
432RX
432Sx
434GX
434HX
4341X
434W Xx
434YX
4361 XX
436LX
436TX
433G
433 KX
430LX
43ΘΤX
Figure BRPI0514068B1_D0076
Figure BRPI0514068B1_D0077
Figure BRPI0514068B1_D0078
Figure BRPI0514068B1_D0079
Figure BRPI0514068B1_D0080
Figure BRPI0514068B1_D0081
Figure BRPI0514068B1_D0082
Figure BRPI0514068B1_D0083
Figure BRPI0514068B1_D0084
Figure BRPI0514068B1_D0085
Figure BRPI0514068B1_D0086
Figure BRPI0514068B1_D0087
Figure BRPI0514068B1_D0088
Figure BRPI0514068B1_D0089
Figure BRPI0514068B1_D0090
Figure BRPI0514068B1_D0091
Figure BRPI0514068B1_D0092
Figure BRPI0514068B1_D0093
Figure BRPI0514068B1_D0094
Figure BRPI0514068B1_D0095
Figure BRPI0514068B1_D0096
Figure BRPI0514068B1_D0097
Figure BRPI0514068B1_D0098
Figure BRPI0514068B1_D0099
Figure BRPI0514068B1_D0100
Figure BRPI0514068B1_D0101
Figure BRPI0514068B1_D0102
Figure BRPI0514068B1_D0103
Figure BRPI0514068B1_D0104
Figure BRPI0514068B1_D0105
Figure BRPI0514068B1_D0106
Figure BRPI0514068B1_D0107
Figure BRPI0514068B1_D0108
Figure BRPI0514068B1_D0109
Figure BRPI0514068B1_D0110
Figure BRPI0514068B1_D0111
Figure BRPI0514068B1_D0112
Figure BRPI0514068B1_D0113
433W X
439E
433H
439Q
440A
44CDx
440E
440F
440GX
44CH XX
Figure BRPI0514068B1_D0114
Figure BRPI0514068B1_D0115
Figure BRPI0514068B1_D0116
Figure BRPI0514068B1_D0117
Figure BRPI0514068B1_D0118
Figure BRPI0514068B1_D0119
Figure BRPI0514068B1_D0120
Figure BRPI0514068B1_D0121
Figure BRPI0514068B1_D0122
Figure BRPI0514068B1_D0123
Figure BRPI0514068B1_D0124
Figure BRPI0514068B1_D0125
Figure BRPI0514068B1_D0126
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 142/174
135/161
ADCC ADCC
Variante* realçada diminuído 440I X
440K 44OL X
440M 440N 44QQ 440 R 440T 440V 44CW 440V 442 K
Ligação FcRn Ligação FcRn CDC realçada diminuída realçado
X
X
X
X
X
X
X
X X
CDC diminuído
XXX * Variantes testadas em anticorpo anti-CD20, região Fc de lgG1
Tabela 3 ADCC realçada
Posição* Substituição de aminoácidos*
247 A, F, Η, I, L. Μ, T, V, Y
249 E, Y
251 F
254 F, Μ, Y
256 Δ, M
258 □
268 D, E
279 A
290 A. K
293 A, I, Κ, M, R
266 N
292 A
311 A, D, N, T, V, Y
315 L·
313 N, Pr T, V
330 K
332 T, V
339 D, F, G, I, Κ, M, Nr Qr R, S
376 A, V
377 GP K
379 N
3B0 N, S
3B2 Ά, I
335 E
427 N
429 M
434 W
436 I
440 G. B. I, L
+ posição de aminoácido de Fc de acordo com numeração de EU
e.g., em posição 249: 249E ou 249Y.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 143/174
136/161
Tabela 4 ADCC diminuída
Posição* Substituição de aminoácidos*
235 Q, R, S
236 F, R, Y
237 E, K, N, R
233 E, G, H, I, L, , v
247 Gy R
249 L, P
250 K, M, R
251 H, I, W
252 Y
2Ξ4 L, P, Q, T, V
256 V
257 A, I, M, N, s. V
26Ü s
262 L
264 Ξ
265 H, K, s
267 G, Hr I, K
269 H, Ώ
270 A, G, K M, H
271 T
272 H, K, L, N, R
279 D, F, K, L, W
263 D, F( G, H, 13, T,
285 ΚΓ
288 P
292 E, F, G, I
2 93 Sj V
301 W
304 E
307 A, E, M
311 F, I, Rr s
312 P
314 F, I, v, w
315 Fj P
316 F
317 F
327 T
328 V
329 y
332 G, R, L, R, W
341 D, E, F, H, I, K,
343 A, D, E, F, G, H,
373 A, D, E, F, G, I,
375 R
376 A, E, F, 6, H, W,
379 Q
362 D, S
429 A, JF
430 H, K, M, Q, Rj w
432 Rr 2
434 I
440 D, T, V
442 K
Wr Y
W, Y
L, M, N, P, C2, R, s, Tr W, Ϊ
I·, M, Ny Q, R, s, T, v, W, Ϊ
K, L, M, N, G, R, s, T, V, T?
Y + posição de aminoácido de Fc de acordo com numeração de EU
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 144/174
137/161
Tabela 5 Afinidade de Ligação de FcRn realçada
Posição* Afinidade de ligação de FcRji realçada
236 Jj
244 L
245 R
249 P
252 Ϋ
25E P
257 A, I, Μ, N, S, V
258 D
260 S
262 L
270 K
272 L, R
279 A, D, G, », M, N, Q, R, S, T, N, ϊ
283 A, D, F( G, H, I, K, L, N, P, Q, R, s. T, W, Y
285 N
286 F
2BB N, P
293 V
307 A, E, M
311 A, I, K, L, 14, V, w
312 P
316 K
317 P
318 N, T
332 F, H, K, L, M, R, s, w
339 N, T, W
341 P
343 E, H, K, O, R, T, Y
375 R
376 G, I, Μ, P, T, V
377 K
378 D, 11
3BD N, S, T
382 F, H, I. Kj L, M, N, Q, R, Ξ, T, V, w, Y
423 N
427 N
430 Ai F, 0, Η, I, K, L, Μ, N, 0, R, s, T, v, Ϊ
431 H, K
434 F, G, H, W, Y
43 6 I, L, T
438 K, 1, T, w
440 K
442 K
+ posição de aminoácido de Fc de acordo com numeração de EU
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 145/174
138/161
Tabela 6
Afinidade de Ligação de FcRn diminuída
Posição*
Figure BRPI0514068B1_D0127
Ξ,
R,
Substituição de aminoácidos
237 K, R
236 E, G, H, W
Ξ47 ft. D, E, F, G, Η, I,
248 A, F, P, Qr W
Ξ49 E, Lr Μ, Y
251 F, Μ, I, W
254 D, E, F, G, Η, I, K,
255 K, N
256 F, Η, I, K, M, R, W,
264 Ξ
265 S, Y
267 G, I
263 o, K
270 A, M
279 I, Kj L
260 T
292 E, F, G, I, L·
311 D, E, F, Gr N, R, Y
315 Fr K, P
339 E, G, L, R
341 D, E, F, I, K, L, Μ, N, Q, R, Sr T
343 M, V, W
373 A, D, G, K, L, M, Nd Q, Sr Tr V, W
376 H, L, w, Y
V,
W, Y
T, V, W, ¥
W, ¥ + posição de aminoácido de Fc de acordo com numeração de EU Tabela 7 CDC realçada
Substituição de amijioãcidos
Posição*
236 244 247 Y L Q, R,
A, D, E, G, N,
248 F, p, Q, W
249 E, L, Μ, N, Pr Y
Ξ50 K, R
251 F, H, i, w
2 54 Αμ F, K, Ir, M, R, Y
255 K
256 A, Gr I, L, Mr F, Q,
2ÊD S
268 D
W, Y
S, W
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 146/174
139/161
279 Q, S, W, Y
280 K, T
283 F, G, Η, Γ, K, L, Mr N, P, Rr s. w
292 L
3 D7 A, M
311 F I K, L, M, T, V, W, Ϊ
312 P
214 P, I, v, W, Y
215 F, X, L, P, R.
316 K
317 P, T
31B N, T
332 A, D, E, F, Gf H, L, Μ, N, 0, Sr T, V, Wr Y
339 D, F, G, Η, I, K, N, Q, R, S, T, W, Y
241 D, E, F, I, Kr L, Μ, N, Pr Q, R, Sr Tr V, Wr Y
343 A, D, E, G, Hr K, L, Μ, N, Qr R, Ξ, Tr w, Ύ
373 D, E, Ρ, Η, I, K, Ιο Μ, N, Qr R, T, V, w
375 R
376 A, F, G, H, Ld N, P, Q, R, s. Tr V
377 P
379 N, Qr S, T
380 A, N, Ξ, T
382 I, L, Qr V
386 K
426 D, L
429 A, F, M
430 A, □, Fj G, H, Ir K, L, M, Nr p, R, S, T, Vr «r Y
431 Η, P
432 R, S
434 W, Y
438 L, W
44 0 Q, Y
+ posição de aminoácido de Fc de acordo com numeração de EU
Tabela 8 CDC diminuída (pg118)
Posição* Substituição de aminoácidos
2 3.5 G, S
236 R
237 E, K, N, R
238 A, E, G, Η, I, L, V
245 K
247 Η, I, L, Τ, Y
250 M
252 Y
254 D, Er I, P, Q, Τ, V
355 N
257 A, I, Μ, N, S, V
262 L
264 2
265 Η, Y
267 G, Η, I, K
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 147/174
140/161
268 K
269 N, Q
270 G, M( N
Ξ71 T
272 fl, L, N
2 92 A
2 93 Ξ
301 W
3 07 E
311 Er Ξ
316 F
318 P
327 T
328 V
329 Ϊ
330 K, R
332 Ε, M
343 I
373 Ξ
37B D
380 D
332 D, F, 1Γ, P, R, S, W, Ϊ
385 Ε, P
423 N
424 Ή, M
<22____ N
+ posição de aminoácido de Fc de acordo com numeração de EU
EXEMPLOS [0252] Os seguintes exemplos são fornecidos a fim de demonstrar e adicionalmente ilustrar certas formas de realização preferidas e aspectos da presente invenção e não são para serem construídos como limitando o escopo desta.
Exemplo 1 - Selecionando regiões Fc variantes em Ensaios de ADCC [0253] Este exemplo descreve como regiões Fc variantes, no contexto de um anticorpo (e.g., anti-DC20) são selecionadas em um ensaio de ADCC.
i. Isolamento de Célula Mononuclear de Sangue Periférico (PBMC) [0254] Cerca de 50 ml de sangue periférico são obtidos a partir de um doador saudável e diluídos 1:2 com salina tamponada com fosfato (PBS), Ph 7,0. As soluções são misturadas rodando suavente o tubo. Cerca de 12 ml de Histopaque1077 (Sigma Cat. No. 1077-1) são cuidadosamente dispostos debaixo da amostra
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 148/174
141/161 de sangue diluído seguido por centrifugação em uma centrifuga Sorvall RT6000B com rotor basculante a 1000 rpm por 10 min com freio motor. A fase superior do gradiente é descartada por aspiração e a interface de cor branca contendo PBMC coletada e lavada 3 vezes com Solução de Sal Equilibrada de Hanks (Gibco Cat. No. 14025-092). O pellet de célula lavado é suspenso em cerca de 20 ml de meios RPMI 1640 contendo 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) (Omega Scientific Cat No. FB-01). As PBMCs resuspensas são divididas em dois frascos de cultura T-175, e 30 ml de RPMI contendo 10% de FBS são adicionados a cada, seguido por incubação durante a noite em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 SC. No dia seguinte as PBMCs não aderentes são coletadas em tubos Falcon de 50 ml, centrifugadas como acima e resuspensas em RPMI contendo 1% de FBS carecendo de vermelho de fenol. Uma pequena porção das células resuspensas é diluída 10 vezes e contada usando um hemocitômetro. As PBMCs remanescentes são colocadas em uma incubadora até necessitado.
ii. Linhagem celular alvo (específica para ensaios de ADCC de anti-CD20) [0255] Linhagens Wil.2 e SKW6.4 de célula B expressando CD20 são obtíveis a partir de ATCC e crescidas como recomendado. Um dia antes de uso, as células são divididas 2 vezes. No dia seguinte o número de células é ajustado para 4 x 105 células/ml e alíquotas de 50 μΙ (20.000 células/poço) adicionadas a uma placa de cultura de tecido de 96-poços.
iii. Diluições de IgG [0256] Antes de seleção, IgG compreendendo uma variante de Fc da presente invenção é expressa, purificada e quantificada usando um ELISA padrão. Para seleção de ADCC primária de ponto único, variantes de IgG são diluídas para 40 ng/ml em meios RPMI contendo 1% de FBS carecendo de vermelho de fenol. A concentração final de IgG no ensaio é diluída por 4 vezes (i.e., concentração final de 10 ng/ml). Alíquotas de cinqüenta microlitros de IgG são adicionadas às células alvo e incubadas por cerca de 15 minutos a 37 SC antes de adicionar as células efetoras às células alvo opsonizadas.
[0257] Quando titulações de IgG são realizadas, concentração de IgG é variada
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 149/174
142/161 na extensão de cerca de 0,0001 a 1 pg/ml. Diluições de IgG são preparadas usando uma placa microtiter de 96-poços diluindo as amostras em RPMI contendo 1% de FBS carecendo de vermelho de fenol. As amostras de IgG diluídas são então adicionadas à placa de ensaio contendo as células alvo.
iv. Células efetoras [0258] As concentrações de PBMCs são ajustadas para que proporção de efetora para alvo seja na variação de 10-20:1 (i.e., 2-4 X 106 células/ml). Cem microlitros das PBMCs resuspensas são adicionados a cada poço das células alvo opsonizadas. As placas são então incubadas a 37 SC na presença de 5% de CO2 por 3-4 horas.
v. Detecção de liberação de lactato desidrogenase (LDH) [0259] Lise de célula alvo é medida detectando a liberação de enzima a partir do citoplasma de células danificadas no sobrenadante de cultura. Seguindo incubação das células alvo opsonizadas com as células efetoras, as placas de ensaio são centrifugadas a 2000 rpm por 5 minutos. Cerca de 75 μΙ do sobrenadante de cultura celular são cuidadosamente removidos enquanto as células peletizadas e detritos são evitados. Este sobrenadante é adicionado diretamente a uma placa microtiter e a esta são adicionados 75 μΙ de reagente de detecção de LDH (Roche Cat. No. 1 644 793). A placa é então incubada por aproximadamente 15-30 minutos e absorbância lida em 490 nm usando um Leitor de Vmax Cinética de Microplaca de Molecular Devices.
vi. Análise de Dados [0260] Todos os ensaios de seleção de ADCC são realizados em duplicata. Cada placa de ensaio contém controles para lise espontânea de alvo, lise espontânea de efetora mais alvo na ausência de IgG e lise total de célula alvo. Lise total de célula alvo é atingida por adição de 1% de Triton Χ-100 para as células alvo. Controles tipo selvagem são incluídos em cada placa de ensaio e calculada a média do sinal de ensaio de ADCC. O valor de fundo, obtido a partir dos controles de lise espontânea, é subtraído de cada amostra. O valor de fundo, obtido a partir da IgG diluída, é subtraído de cada amostra. Os dados são convertidos de valores de
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 150/174
143/161 absorbância para porcentagem de lise específica baseado nos controles de lise espontânea e total. A porcentagem de lise específica é calculada a partir da seguinte equação: porcentagem de lise específica = (A490 experimental - A490 de fundo)/ (A490 máximo - A490 de fundo) X 100, onde A490 de fundo é a soma do A490 obtido a partir das células efetoras e alvo na ausência de IgG e o fundo de IgG devido a LDH contaminante presente nos sobrenadantes brutos de IgG. A porcentagem da atividade de variante de Fc é normalizada em relação com a média dos controles tipo selvagem. A porcentagem da atividade normalizada para placas de ensaio duplicadas são averaged e o desvio padrão entre placas individuais de ensaio calculado para cada amostra.
vii. Resultados [0261] As atividades relativas específicas de ADCC são mostradas na Tabelas 9 (substituições únicas) e 10 (substituições combinatórias) abaixo. Os valores de CDC relatados na Tabela 9 são gerados como descrito no Exemplo 2 neste lugar e os valores de ensaio de ligação de FcRn relatados na Tabela 9 são gerados como descrito no Exemplo 3 neste lugar. Resultados são adicionalmente resumidos nas Tabelas 1 e 2 acima. Aquelas substituições combinatórias que produzem um valor de ADCC superior do que cada substituição única sozinha são: 247F,339D; 247I,339D; 247L,339D; 247L,339T; e 247I,339Q. Aquelas substituições combinatórias que produzem um valor de ADCC inferior do que 80% aquele de ADCC tipo selvagem mesmo embora elas tenham superior do que ADCC tipo selvagem quando testadas sozinhas são: 247A,339D; 247Y,339H; 2471,3391; 247T,339I; 247L,339N; 247A,339Q; e 247A,339R. Aquelas substituições combinatórias que produzem um valor de ADCC inferior do que 10% aquele de ADCC tipo selvagem mesmo embora elas tenham superior do que ADCC tipo selvagem quando testadas sozinhas são: 2471,3391; 247T,339I; e 247L,339N.
Tabela 9
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 151/174
144/161
Posição e
WT* Variantes* ADCC %cv FcRn pH6.0 %CV CDC %CV n=
WT (a,z) 100 100 100
L 235A 07 23.2 102 11.9 67 7.9 2
L 235E ao 17.4 87 16.2 48 35.8 2
L 235G 93 30.3 05 21.2 58 46.0 2
L 2350 8B 1.3 ai 14.4 98 25.1 2
L 235R 45 10.5 93 34.1 110 13.8 2
L 235S 92 2.0 85 40.0 0 262.9 2
G 236F 0 942,1 3B 7.9 0 283.3 2
G 236R 0 228.7 101 20.6 14 110.1 4
G 236Y 8 72.7 76 10.0 168 0.3 2
G 237E 0 89.2 93 35.0 36 28.8 4
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 152/174
145/161
Posição e
WT* Variantes* ADCC %CV FcRn pH6.0 %CV CDC %CV n=
G 237K 0 113.3 78 12.0 12 138.0 4
G 237N 0 107.5 91 16.3 22 31.5 4
G 237R 0 81.3 56 60.6 28 10.5 4
P 238A 0 205.5 90 9.6 29 49,5 4
P 238E 0 20.5 76 3.7 24 101.0 4
P 238G 0 92.5 66 6.9 23 120-5 4
P 23&H □ 48.9 72 11.4 11 206.3 4
P 2381 0 180.4 94 6.4 18 54.1 4
P 2381 0 37-4 115 13.6 34 50.1 4
P 230V 46 11.8 102 8.8 67 19.2 4
P 238W 0 65.6 67 5.4 23 103.4 4
P 238Y ΰ 34.0 74 15.8 16 288.8 4
P 244l_ 77 23.4 124 9.6 134 6.0 2
P 245R 52 15.0 188 7.2 42 5.3 2
P 247A 122 16.2 97 0.3 116 0.9 2
P 247D 05 23.4 54 2.8 131 1.1 2
P 247E 95 10.3 52 8.7 110 0.0 2
P 247F 144 18.8 6 1258.9 71 34.1 6
P 247G 82 1S.1 75 4.2 137 0.9 2
P 247H 145 11.2 35 252.4 79 7.5 8
P 2471 140 22.9 79 30.7 22 198.3 6
P 247L 144 101 57 33.7 0 722.7 18
P 247M 127 21.0 10 1590.0 114 7.2 6
P 247N 91 37.2 41 38.7 109 4.0 2
P 247Q 103 8.5 25 294.3 137 3.7 4
P 247R 58 15.5 72 1.2 127 4.9 2
P 247S 105 38.6 Θ1 15.0 130 2.6 2
P 247T 129 11.2 75 27.5 37 34.8 10
P 247V 120 13.5 Na na na na 2
P 247W 102 6.5 0 1314.2 122 0.5 2
P 247Y 143 8.4 7 na 88 7,1 6
K 248A 100 5,4 15 179.9 102 2.4 2
K 248F 107 18.0 0 559,4 202 4.0 2
K 248P 103 9,1 34 99.4 22S 1.3 2
K 243 Q 101 0.5 30 a9.3 174 17.9 2
K 248W 102 9.4 30 54.5 166 6.3 2
D 249 E 110 6.7 78 22.4 258 16.1 4
D 249L 7S 1.4 15 179.9 214 3.2 2
D 249M 101 9.5 50 4,5 163 1.2 2
D 249N 94 15.9 112 14.0 255 10.9 4
D 249P 56 4.0 130 21.0 119 0.2 2
D 249Y 110 8.8 41 20.3 170 6.S 2
T 250 K 38 27.1 95 30.1 199 13.5 6
T 250M 78 11.0 165 7.4 47 6.6 4
T 250R 84 0-7 62 34.0 258 13,9 4
L 251 F 125 6.0 64 47.6 160 16.6 10
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 153/174
146/161
Posição e
WT* Variantes* ADCC %CV FcRn pH6.0 %CV CDC %CV n=
L 251H 59 11.6 46 5.0 107 22.7 2
L 2511 64 9.8 7 333.3 190 18.& 2
L 251W 95 2.9 0 na 161 17,3 2
M 252Y 61 5.8 984 27.9 62 46.1 4
I 253A 103 6.1 0 12.0 81 23,9 4
s 254A 99 20.1 7 733.0 139 11.2 4
s 254 D 101 14.2 7 113,9 74 31.2 2
s 254E 102 3.0 6 107.9 72 35.2 2
s 254F 121 11.2 0 1087.4 208 14.4 6
s 264G 100 14.7 7 86.8 102 6 1 2
s 254H 108 20.0 0 74.3 Θ5 22.0 4
s 254I 99 2.5 25 64.3 80 11.5 4
s 254K 109 14-8 9 77.2 137 6,1 2
s 254L 89 9.3 74 12.6 227 12.1 6
5 254M 39 11.9 0 212.1 248 13.4 6
s 2S4N 90 13.3 8 5.6 76 34.6 2
s Ξ54Ρ 73 17.7 3 141.4 75 25.2 2
s 254Q 04 12.6 9 121.2 74 25.2 2
Ξ 254R 99 1.3 14 128.2 152 4.8 2
S 254T 54 51.9 32 34.7 75 12.1 2
S 254V 68 40.5 31 40.5 84 4.4 2
S 254W 98 6.0 0 116.1 188 7.7 Ê
S 254Y 117 9.4 0 129.1 211 15.7 6
R 255K 96 3.5 41 65.9 276 9.3 4
R 255N 84 17.7 27 162.7 81 18.1 2
T 256A 115 16.5 160 3.0 190 19.6 2
T 256D 97 5.3 544 10.6 86 23.2 6
T 256E 91 12.9 339 8.4 104 7.2 6
T 25EF 119 3.3 5 435.0 128 26.6 2
T 256G 95 20.0 16Ξ Θ.0 221 24.5 2
T 25SH 103 6.3 2B s.i 91 11,9 2
T 256I 93 11.5 72 3.7 157 16.2 4
T 2S6K 100 6.7 31 20.6 92 20,2 2
T 256L 93 3.9 76 60.5 267 22.7 4
T 25SM 122 17.4 35 78.9 200 14.® 10
T 256N 102 7.2 229 6.4 86 23.2 2
T 256P 1D& 11.6 190 6.1 260 11.8 8
T 256Q 100 17.2 64 14.2 152 11.3 4
T 256R 94 0.0 33 60.0 71 47.1 2
T 256S 103 5.3 169 3.1 101 15.9 2
T 256V 32 11.1 114 30.5 109 11.0 2
T 256W 96 8.5 14 84.5 170 14.4 4
T 25ÊY 97 7.2 66 iae 127 18.0 2
P 257A 86 11.5 319 15.0 34 53.7 4
P 257J &4 16.4 1022 14.5 46 22.4 6
P 257M 26 11.0 835 19.1 43 48.4 4
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 154/174
147/161
Posição e
WT‘ variantes* ADCC %cv FcRn pHB.O %CV CDC %CV
P 257N 27 13.1 667 15.7 62 31.4 4
P 257Ξ 20 2a.a 184 6.8 46 30.1 4
P 257V 16 97.9 447 41.5 37 143.5 2
E 258D 115 7.0 361 20.5 110 9.6 4
T 260S 93 5.6 124 7.4 171 17.1 2
V 262 L 61 2.9 525 15.1 30 48,0 2
V 264S 10 39.Θ 78 20.0 50 36.7 2
D 265H 6 11Θ.9 73 36.1 61 0.5 2
D 265K 10 146.2 107 34.3 84 46.4 2
D 265S 9 106.3 66 28.9 103 13.3 2
D 265Y 3 7.6 33 88.0 62 21.5 2
S 267G 29 Θ.6 86 0.9 60 18.1 4
S 367H 0 46.4 66 16,6 47 41.1 4
s 2671 0 76,0 G3 11.8 50 37.8 4
s 267K 0 73.3 102 14.2 20 47,1 4
H 266 D 110 7.a 66 32 4 122 10.7 6
H 26BE 110 8.3 126 17.6 100 8.4 8
H Ξ6ΘΚ 96 17.6 66 10.4 24 112.7 4
E 269N 23 74.0 92 17.0 30 69.4 4
E 269Q 47 3.6 95 3.5 22 82.8 4
D 270A 41 35.5 87 6.0 36 66.5 4
D 270G 0 102.2 106 16.5 37 21.8 4
D 270K 15 465.5 122 8.4 0 462.9 4
D 270M 49 19.2 81 5.2 25 606.9 4
D 27DN 20 1165.2 94 0.2 34 103.7 4
P 271T 26 53.9 96 20.4 32 89.1 4
E 272H 73 13.6 157 23.0 53 34.8 2
E 272K 70 6.9 320 20.4 110 28.7 4
E 272 L 78 21.1 129 3.9 71 3.1 2
E 272 N 90 7.5 110 33.0 71 34.6 2
E 272R 50 2.1 351 3.3 102 1.2 2
V 279A 114 14.0 214 5.0 106 21.2 2
V 279D 67 12.1 367 0,3 96 0.5 2
V 279F ai 4.8 113 14,3 108 10.0 2
V 279G 96 2.4 256 116 109 18.0 2
V 279H 79 28,1 173 23,6 127 22.7 6
V 2791 101 1.6 63 1.3 100 21,0 2
V 279K 01 1.5 79 26.1 106 0.7 2
V 279L 96 3.0 76 13.9 100 5.7 2
V 279M 107 8,3 122 3.5 91 10.3 2
V 279N 102 32.0 204 19.5 85 50.2 6
V 279Q 65 28.3 161 8.0 139 0.1 6
V 279 R 105 4.8 13Q 10.7 96 8.7 2
V 2795 94 29.8 242 16.3 122 16.7 6
V 279T 95 15.5 265 6.9 110 12.8 10
V 279W 68 24.0 162 22.Ç 125 10.5 6
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 155/174
148/161
Posição e
WT variantes* ADCC %CV FcRnpHe.O %CV CDC %cv n=
V 27&Y 02 26.6 139 0.6 144 13.2 6
D 2Θ0Α 111 44.9 55 50.1 135 26.7 2
D 20OK 137 47.6 120 27,2 192 33,5 2
D 280T 108 na 60 12.6 122 8.7 4
E 263A 107 2.1 126 0.2 96 17.9 2
E 283D 04 3.4 110 4.0 92 10.3 2
E 283F 74 0.1 168 30.6 127 20.4 2
E 283G 93 3.1 137 4.4 135 8.5 2
E 283H 37 6.1 206 8.5 123 15.9 2
E 2031 106 1.9 143 5.6 126 12.3 2
E 2S3K 109 5.3 246 5.1 133 6.0 2
E 2B3L 92 3.1 126 1.3 120 0.1 2
E Ξ83Μ 112 7.4 95 13.3 120 2.4 2
E 283N 102 3.0 119 7.4 135 23.4 6
E 263P 97 11.9 136 3.9 110 11.8 4
E 2330 95 5.3 117 8.0 122 22.9 2
E 283R 102 0.3 202 6.1 144 16.7 2
E 283S 91 1.5 143 11.1 119 12.3 2
E 283T 103 3.2 143 12.4 108 11.0 2
E 203W 9<J 2.3 117 2.1 159 1.3 2
E 20ΞΥ 01 6.7 142 4.1 136 17.2 2
H 28ΞΝ 93 2.6 202 19.8 113 21,1 4
N 206F 107 7.1 307 32.3 106 16.1 4
K 2Θ8Ν 110 8.7 162 13.2 118 19.1 4
K 266 P 45 1.1 119 3,0 116 15.7 a
R 292A 114 2.9 85 67.5 74 21.1 4
R 292E 35 21.4 65 48.5 92 32.1 2
R 292F 73 16.4 64 7.6 101 0.3 2
R 292G 94 2.S 60 35.9 119 326 2
R 2921 79 1.5 56 23,6 106 3.7 2
Ft 292L 96 3.9 63 40.0 123 7.2 2
E 293S 63 7.4 101 23.0 96 o,i 2
E 293V 73 12.5 127 13.0 107 24.0 2
R 301W 5 105.4 119 16 1 49 31.1 4
S 304 E 24 32,9 101 0.7 122 11.3 2
T 307A 37 4.4 233 14.5 115 6.5 4
T 307 E 06 7.9 492 34.6 31 2.4 4
T 307M 32 5.3 302 23.7 150 6.5 4
Q 31 IA 106 2.4 139 7.0 69 28.3 2
0 311D 111 6.0 38 22.2 83 13.6 2
Q 311E 102 1.7 46 17.7 78 0.7 2
Q 311F 39 6.9 64 7.5 212 2Ü.7 2
Q 311G 98 1.9 58 21.5 92 9.6 2
Q 3111 87 8.2 437 9.6 236 11.3 0
Q 311K 80 13.4 165 5.5 170 9.3 6
Q 311L 107 6,7 106 9.2 191 0.1 4
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 156/174
149/161
Posição e
WT* Variantes* ADCC %CV FcRn pH6.0 %cv CDC %cv n=
Q 311M 97 7.2 387 15.0 2S2 16.3 6
Q 311N 115 1.9 54 10.5 126 23.3 2
Q 311P 99 B.O 89 300.6 172 67.9 4
Q 311R 96 3.5 14 84.5 170 14.4 2
Q 3113 86 8.8 97 10.5 0 92.0 2
Q 311T 111 10.2 101 14.0 166 23.4 2
Q 311V 10Θ 1.7 556 1S.5 240 23.3 4
Q 311W 104 6.2 215 2.8 251 10.7 4
O 311Y 107 3.0 94 0.3 211 25.0 2
D 312P 97 1.4 54B 16.1 14S 11.6 2
L 314F 70 7.0 42 41.2 108 5.5 2
L 3141 33 13.0 86 22.7 134 14.2 4
L 314V 65 14.0 21 123.B 179 10.9 4
L 314W 79 11.0 5 60.2 190 2.0 4
L 314 Y 87 13.6 64 31.4 236 3.2 4
N 315F 83 12.8 51 33.3 140 15.3 2
N 315K 103 3.5 88 10.2 143 8.2 2
N 315L 112 6.2 103 10.5 145 5.5 2
N 315P 62 10.2 14 269.1 231 9.1 4
N 315R 96 24.4 71 38.3 135 0.4 Ξ
G 316F 54 26.0 34 72.4 81 10.0 2
G 316K 77 23.0 131 8.9 143 8.6 2
K 317P 54 21,5 145 1.B 190 4.7 4
K 317T 99 10.9 49 4.0 118 4.0 2
E 31SN 123 7.2 216 7.5 120 7.0 4
E 310P 120 10.3 75 27.1 79 17.0 4
E 31ΘΤ 109 5.7 304 56,8 110 10.5 4
E 318V 116 3.4 114 21.2 95 11.5 4
K 74 17.9 33 5.7 214 Θ.7 2
A 327T 4 13.4 54 19.5 7 206.2 2
L 328V 76 3.2 101 6.3 56 13.9 4
P 329Y 53 41.5 107 13.2 25 90.3 4
A 330K 134 9.3 100 51.4 43 23.9 6
A 330R 103 5.5 121 39.4 31 3S.6 6
1 332A 100 6.1 96 27.6 130 5.0 4
1 3320 143 3.1 75 33.7 151 11.5 6
F 332E 1SB 10.6 06 22.2 143 9.Θ 18
1 332 F 97 14.5 108 3.4 149 11.0 4
1 332G 74 19.8 94 1.4 121 11,5 2
1 332H 92 4.3 129 1.1 150 11.5 2
1 332K 12 114.5 140 7.0 67 15,5 2
1 332L 94 0.0 127 2.6 154 5.1 2
1 332 M 96 2.2 120 16.1 178 6.6 2
1 332N 96 15.3 92 16.1 137 6.1 4
1 3320 99 8.4 98 7,9 146 8.5 6
1 332R 12 135.5 114 7.2 80 30.0 2
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 157/174
150/161
Posição e
WT* Variantes* ADCC %CV FcRn ρΗβ.Ο %cv CDC %CV n=
í 332S 33 4.9 263 64.1 177 16.5 2
J 332T 112 7.5 100 5.3 124 4.5 4
1 332V 109 1.1 115 19.5 147 25.1 2
1 332W 81 16.e 123 3.7 150 9.7 2
1 332Y 93 13.1 93 12.3 152 5.3 2
A 339D 131 10.4 80 26.4 103 20.3 6
A 3S9E 100 0.4 75 4.2 91 0,1 2
A 339F 104 3.3 120 24.6 217 8.5 6
A 33SG 107 3.7 67 6,5 118 0.3 2
A 339H 114 23.4 107 10.0 136 0.5 2
A 3391 136 14.6 80 30.6 205 22.8 6
A 339K 129 24,2 Θ3 29,0 201 21.0 6
A 339L 97 S.7 93 9.3 104 8.7 2
A 33SM 115 6,6 111 7.2 57 0.8 2
A 339N 110 6.3 146 3.5 240 17.5 4
A 339Q 123 15.B 102 19.8 138 11.0 6
A 339R 117 14.4 82 13.4 128 2,1 2
A 3393 124 13.0 95 23.6 170 ΞΞ.5 6
A 339T 142 14.2 138 6.2 220 20.2 10
A 339W 92 13.4 156 11.4 243 10.6 6
A 339Y 97 17.0 92 19.8 265 21.9 10
G 341D 62 6.9 52 37.8 172 3.5 2
G 341E 73 6.9 50 18.1 161 3.8 2
G 341F 24 100.6 52 41.9 227 14.7 6
G 341H 54 9.3 65 63.7 245 16.0 6
G 3411 44 15.5 36 17,2 173 5.3 2
G 341K 77 3.9 67 16.9 161 2 B 2
G 341L 64 24.3 54 19.8 171 4,2 2
G 341M 55 39.8 79 9.7 232 11.1 6
G 341N 83 9.1 53 17.0 162 9.5 2
G 341P 35 47.2 127 9.9 £26 16.2 6
G 341Q 59 18.7 72 1,0 166 7.7 2
G 341R 59 14.0 78 7.4 168 7.5 2
G 341S 65 36.6 55 12.2 224 9.2 6
G 341T 0 666.0 68 54.0 176 10.0 2
G 341V 65 171.0 69 15.0 213 9.6 4
G 341W 14 25.Ê 76 6.9 170 8.7 2
G 341Y 26 24.5 54 5.2 104 14.3 2
P 343A 75 18.6 110 37.7 143 5.9 2
P 343D 69 11.5 102 7.9 157 1Θ.3 2
P 343E 65 34.9 345 6.4 157 17,6 2
P 343F 74 20.6 69 13.0 99 1058.4 4
P 343G 75 29,1 110 14.9 244 11,1 6
P 343H 78 33.8 191 1.2 159 3.1 2
P 343I 92 26.8 114 16.7 86 10.5 2
P 343K 74 37.7 232 2.6 185 9.1 2
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 158/174
151/161
Position and
WT* Vaidants* ADCC %CV FcRn ρΗβ.Ο %CV CDC %CV n-
P 343L 63 17.2 125 3.8 127 5.6 2
P 343M eo 35.1 63 13,7 134 18.7 4
P 343N 67 0,9 105 19.9 196 13.2 2
P 343Q 72 0.5 442 14.0 176 3.0 2
P 343R 94 1.3 198 10.4 179 9.9 4
P 343Ξ 84 7.5 101 14.3 207 11.9 6
P 343T 6® 4.2 126 16.1 151 4.4 2
P 343V 70 1.9 77 5.3 107 12.0 2
P 343W 48 22.3 56 6.4 194 17.9 2
P 343Y 63 9.9 112 7.2 270 14.4 6
Y 373A SÊ 3.7 33 15.0 121 28.7 2
Y 373D 74 17.7 74 32.5 227 10.2 6
Y 373 E 41 23.6 106 20,8 151 19.5 2
Y 373 F 76 2.6 110 12.7 117 1.0 2
Y 373G 39 21.6 38 25.4 75 33,7 2
Y 373H 79 34.Ξ 100 13.9 169 8.2 4
Y 3731 65 9.0 73 14.0 154 6.4 2
Y 373K 76 12 2 70 2,9 246 6.9 6
Y 373L 76 21.4 66 17.0 169 6.2 6
Y 373M 76 1.2 53 25.8 115 3.2 2
Y 373N 64 21.5 Ê1 23.3 148 12.1 2
Y 3730 63 11.0 55 24.7 158 17.7 2
¥ 373R ei 20.5 107 24.1 221 4.0 6
Y 373S 52 3.7 74 1.9 72 24.8 2
Y 373T 70 3.0 82 18.6 151 5.7 2
Y 373V 73 2.1 69 14.3 115 1.1 2
Y 373W 77 23.3 75 18.5 Ξ37 20.8 6
s 375R 69 10.9 595 15.9 1S6 1.1 2
□ 376A 111 18.2 155 26.7 100 5.2 2
D 376E 86 12.3 82 29.5 98 13.5 2
D 376F 84 7.3 116 12.6 119 8.6 2
D 376G 73 3.1 135 3.9 164 0.6 2
D 37ÊH 74 16.1 81 16.6 110 5.6 2
D 3761 100 14.1 144 7.2 101 50.5 10
D 378L 88 16.7 78 3.0 142 3.2 2
D 376NI 06 21.6 129 1.4 91 15.1 2
D 376N 93 14.5 94 24.2 173 14.9 4
D 376 P 35 15.1 203 12.9 153 19.6 6
□ 376Q 88 5.0 116 22,7 176 19,9 4
D 376R 95 6.0 103 12.3 166 4.6 2
D 376S 85 21.4 134 27.3 209 25.3 2
D 376T 102 20.0 160 11.2 224 10.1 6
D 376V 112 6,1 251 15.0 210 11.1 12
D 376W 53 22.0 1 1719.9 69 34.6 2
□ s?e¥ 78 4.2 53 25.8 96 39.9 2
1 377G 107 2.4 76 28.8 92 7.6 2
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 159/174
152/161
Posição e
wr Variantes* ADCC %CV FcRn pHe.D %cv CDC %CV n=
1 377K 117 10.0 167 27.7 90 11.3 4
J 377P 93 11.3 98 32.4 245 6.5 4
A 378D 98 6,6 103 13.9 19 91.9 6
A 37BN 101 7.1 100 3.0 90 30.7 2
V 373N 96 19.5 74 39.0 204 5.5 4
V 37BQ 113 3.2 85 27.3 210 4.1 4
V 379S 30 18.4 86 13.4 137 1.4 2
V S79T 101 16.8 109 14.9 237 8,2 4
E 3 80A 186 3.2 152 28.8 139 4.2 2
E 380D 162 2.1 73 44.2 78 0.7 2
E 380N 111 7,7 142 19.0 139 7,3 2
E 380S 11D 8.5 230 24.1 131 0.1 2
E 380T 100 1.2 172 11.0 115 4.8 2
E 3Θ2Α 110 6.0 103 7.0 82 29.6 2
E 382 D 95 0.8 73 25.7 00 34.2 2
E 382F 121 13.8 222 16.6 67 28.2 6
E 382H es 17.9 135 2.8 84 20.4 2
E 3021 109 6.4 131 6.2 219 5.4 6
E 382K 96 2.6 153 30.2 92 15.6 4
E 302L 93 16,5 126 11.1 156 7.7 2
E M2M 89 14.6 135 0.6 126 20.3 2
E 382N 99 1.1 137 5.2 69 4.5 2
E 382P 85 16.8 122 22.0 69 14.6 2
E 3820 105 122 162 12.0 140 19.3 2
E 382R 104 8.4 165 2.7 85 3.0 4
E 382S 85 2.9 151 10.0 75 4.1 2
E 382T 89 10.2 172 5.2 109 30.0 2
E 302V 03 32.5 173 6.2 167 0,4 2
E 362W 97 10.5 172 5.2 73 1.9 2
E 332Y 105 11.5 108 14,5 78 3.3 4
G 385 E 10Θ 5.5 98 10.8 0 1586.3 2
G 385P 100 3.2 101 23,2 82 15.0 2
Q 386K 96 S.S 115 4.6 266 1.6 4
F 423N 107 8.5 158 2.1 48 27.5 2
S 424H 116 29.8 97 7.3 58 9.3 2
S 4Ξ4Μ 91 3,5 60 60.0 75 14.4 2
s 424V 103 9.3 57 35.4 115 10.5 4
s 426D 105 24,3 65 10.0 318 12.7 4
s 426L 91 35.3 117 14.3 193 20.4 4
V 427 N 103 5.5 192 5.9 64 23.1 2
H 429A 44 01.7 61 11.4 147 1,9 2
H 429F 70 11.1 77 16.5 288 12.8 4
H 429M 103 0.7 83 12.2 173 3,2 2
E 430A 100 8.3 179 6.6 204 7.1 2
E 4300 96 8.2 44 25.5 190 4.6 4
E 430F 111 13.0 210 19.4 203 8.1 2
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 160/174
153/161
Posição e
WT* Variantes* ADCC %cv FcRn pHS.fl %cv CDC ?nCV n=
E 430G 97 7,8 131 10.6 252 7.5 Ê
E 430 H 91 7.7 192 B.O 227 4.2 6
E 4301 e? 19.3 306 6.5 297 17.2 6
E 43OK 66 9.5 131 12.6 203 16-0 4
E 430L 90 33.3 242 8.7 263 10.6 6
E 43OM 102 16.1 155 8.7 227 4.6 6
E 430N 82 24.6 171 13,0 162 2.2 2
E 430P 103 13.1 06 16.7 254 23.5 8
E 43OQ 79 8.3 320 12,8 97 4.3 8
E 430R 75 7.5 249 6.6 227 7.9 8
E 430S ae 39.1 153 3.4 221 18-5 2
E 43OT ΘΞ 22.9 137 23,7 249 8.2 6
E 430V 79 35.6 281 7.0 276 17.5 6
E 430W 78 8.3 11 95,0 171 5.4 2
E 430Y 77 44.5 126 12.5 231 na 2
A 431H 81 44.0 151 11.5 230 na 2
A 431K 98 26.6 176 4.4 113 25.0 2
A 431P 62 12.0 29 13.8 210 0.0 2
L 432 R 58 23,1 30 15.6 175 13.3 2
L 432S 58 55.4 70 3.6 124 0.2 2
N 434F na na 1000 1.4 na na 4
N 434G 105 17.9 356 20.2 26 128,9 4
N 434H 90 12.9 855 20.4 Ξ7 9.1 6
N 4341 81 9.3 6 725.4 73 8.9 2
N 434W 100 6.6 1335 18.8 138 1.7 2
hl 434Y 106 7.7 1615 30.0 291 15.5 4
Y 4361 119 18.0 194 24.2 35 8.7 2
Y 4361 112 27.2 172 8.1 90 16.3 4
Y 436T 90 35.0 115 7.2 48 20.3 2
Q 438G 93 32.1 98 14.4 68 26.2 2
Q 438K 99 31.7 169 12.3 116 43.0 2
Q 438L 94 32.5 200 14,7 190 5.5 4
Q 438T 96 37.4 126 9.5 56 26.8 2
Q 438W 93 32.5 164 8.2 126 1.7 2
K 439E 103 20.9 94 9.0 53 40.3 2
K 439H 91 37,3 99 0-9 77 17.8 2
K 4390 90 38.2 74 0.9 64 2S.S 2
s 440A 79 42,8 82 2.0 65 22.5 2
s 440 D 82 18.4 72 4.7 99 9.4 2
s 44QE 104 4,0 73 2.8 87 35.3 2
s 440F 111 16.1 87 B.2 73 18.5 2
s 440G 106 1,9 101 8.1 83 8,5 2
s 440H 106 2.1 110 2.1 96 18.3 2
s 4401 121 1.9 96 6.2 86 2.6 2
s 440 K 116 16.7 132 7.8 71 26.4 4
s 440L 112 6.4 126 2.2 77 4.5 4
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 161/174
154/161
Posição e
wr Variantes* ADCC %cv FcRn pH6.0 %cv CDC %cv n=
s 440M 84 51.0 80 0.2 01 20.6 2
s 44ÜN 70 34.3 82 25.4 108 15.8 2
s 44OQ 73 43.1 81 33.5 132 16.6 2
s 440R 31 11.3 00 16.2 85 29.0 2
s 440T 89 2.1 71 39.0 115 17.4 2
s 440V 85 11.3 98 1S.7 110 16.4 2
s 440W 114 17.5 85 13.Θ 132 14.8 2
s 44OY 109 6.B 100 14.2 224 14.1 16
s 442K ao 51.9 130 4.5 100 11.1 2
Na = não disponível ou não realizado *e.g., L235A indica uma Fc na qual a leucina presente no número 235 de aminoácido de Fc (de acordo com numeração de EU) foi substituída por um resíduo de alanina testado aqui: a região Fc é uma Fc de IgG 1, o anticorpo é anticorpo anti-
CD20 Tabela 10 Variantes de Combinação - ADCC
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 162/174
155/161
Variante ADCCCméüe come lej«(i CV% n=
I5ji(i fdvafffn 10C 2.42 2
247A.339D 71 .SC 0.50 2
247F.339D 134.95 2.54 2
247H,339D 118.45 8.46 4
247I.339D 197.21 20.45 2
247L,339D 156.73 3.30 2
247T,339D 126.46 4.71 2
247Y.339D 121.93 4.58 2
247A.339H 125.35 0.60 2
247F.339H 101,54 4.53 2
247H.339H 114.24 4.91 2
2471,339H 126.94 5.22 2
247L.339H 120.92 2.44 2
247T.339H 97.96 5.71 2
247Y,339H 74.75 2.43 2
247A,339l 96.95 3.05 2
247F.33S1 116.53 5.59 2
2471-1,3391 108.27 2.97 2
2471,3391 -4.07 -47.26 2
247L.339I 109.76 5.95 2
247T.339I 5.46 9.51 2
247Y,339l 100,84 9.58 2
247A.339K 86.90 13.51 2
247F.339K 105.85 10.11 2
247H.339K 97.59 7.67 2
247I.339K 9741 14.89 2
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 163/174
156/161
Vuririie ADCCCmélic· como ι:!·'ϋ lejeo . 07¾ ;n.
247L.339K W4.3e 7.0/ ?
247T.339K B3.QÍ 6.07 2
247Y.339K 95.7£ 3.66 2
332E 180.96 0.72 2
247A,339N 6B.6C 9.91 2
247F,339N 100.3B 6,95 2
247H,339N 80.70 7.62 2
247I.339N 110.62 13.07 2
247T,339N 114.38 4.83 4
247Yh339N 113.18 1-50 2
Ξ32Ε 107,19 9.53 2
247A,339Q 69.94] 6.45 2
247F.339Q 130.42 2.35] 2
247H.339Q 138.96 1.32 2
247I,33$Q 146.44 2.27 2
247L339Q 140.50 4.58 2
247T,339Q 119.70 4.03 2
247Y.339Q 103,40 2.24 2
247A,339R 68.57 6.33 2
247F.339R 114.36 11.85 2
247H,339R 105.46 9.89 2
247f,339R 124.96 16.31 2
247L.339R 119.77 12.03 2'
247T.339R 109.42Í 12.17 2
247Y.339R 90.56 13.09 2
247L.339T 146.48 7.00 4
wt = tipo selvagem
CV% = n = número de amostras medidas e usadas para cálculo de média
Tabela 11 Variantes de Combinação com realçamento de ADCC
Variante Fc ADCC ECSO (ns/ml)
Tipo selcagem 6.8
247L 2.2
330K 3.1
332E 1.5
339T Γ3.8
247L, 330K 1.5
247L, 332E 0.73
247L, 339T 2.0
33OK, 332E 0.73
330K, 339T 2.0
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 164/174
157/161
332E,339T 1,0
247L,332E,339T 0,75
247L· 330K, 332E 0,25
247L, 330K, 339T 1.5
33OK, 332B, 339T 0,25
247L, 330K, 332E, 339T 0.25
Atividades de ADCC foram calculadas a partir de curvas de titulação
Tabela 12 Variantes de Combinação
Mutação AUUU cv% FcRnfi.O CV% CDU CV%
Tipo selvagem 100 100 100
247H339D 110 0.5 N/D N/D N/D N/D
247L251F330R332E 134 13.3 50 5.9 43 1.3
247L251F376Í 77 29.7 61 8.7 124 11.3
247L332E 168 7.3 76 4.9 65 6.2
247L332E376I 137 0.1 74 8.0 70 4.3
247T339N 114 4.8 N/D N/D N/D N/D
251F332E 147 12.4 72 2.2 196 2.6
251F332E376I 136 15.9 6« 5.0 160 10.9
251F376Í 114 6.1 66 2.9 102 9.4
256P311II 107 0,2 263 1.2 357 10.0
256P314Y332E440Y 146 3,1 66 19.5 190 4.5
25BP314Y44QY 112 22.6 79 3.0 226 9.4
256P332E 174 1&.3 121 Θ.2 189 3.9
2&6PS32E440Y 134 26.4 117 6.6 230 10.0
256P430Q 109 2.6 150 5.3 354 3 3
256P434H 105 1.2 342 3.1 299 2,9
266P440Y 169 19.7 122 0.7 247 26.6
25713111 52 7.7 409 3.9 61 6.7
2571311I434H 43 12,2 553 4.9 75 8,6
257I430Q 23 8.1 304 0.6 55 12.9
257I434H 67 7.0 472 6.3 61 14.0
263D332E 137 12.4 92 13.7 128 4,1
268E332E 178 5.3 83 2.0 160 4.7
272R279L 56 0.2 156 1.2 72 5.1
279A268N 107 3.9 N/D N/D N/D N/D
279A2B8N311T318V 110 9.0 N/D N/D N/D N/D
279Α28ΘΝ31ΘΝ 110 5.4 N/D N/D N/D N/D
279A288N318T 116 5.1 N/D N/D N/D NWD
279A288N318V 118 8.8 N/D N/D N/D N/D
279Α311Τ31ΘΤ 110 7.9 N/D N/D N/D N/D
208N311T318T 115 9.9 N/D N/D N/D N/D
311T318T 107 5.3 N/D N/D N/D N/D
314Υ332Ε44ΏΥ 156 5.4 82 0.9 155 0.0
314Y440Y 125 12.7 70 8.5 108 2.6
330K332D 179 2.9 38 8.3 43 03
330K332E 202 5.6 94 0.0 42 1.0
330R 332D 152 6.3 &6 6.3 44 1.5
33OR332E 161 4.3 94 2.1 59 4.0
332E376I 132 8.6 102 7.6 193 52
332E376V 139 1.9 132 3.5 261 3.6
í-J M A2 &
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 165/174
158/161
33ΞΕ440Υ 203 13.0 94 5.7 169 5.9 4
343R 345D 121 16.0 143 1.6 291 3.3 2
376V430Q 92 1.5 212 4.2 Ξ56 12.2 4
376V430R 84 2.7 188 9.1 191 1.0 2
376V434H 97 3.3 332 3.3 9S 6.1 4
Tabela 13 Variantes de Combinação
Mutação FcRnB.O
Tipo selvagem 258D272R 100 382.8 8.2 2
258D283R 411.1 3.7 2
253D20GF 445.0 1.7 2
253D307E 237.1 4.8 2
258D311J 522.0 7.0 2
25BD376V 415.1 4.3 2
272R2B3R 439.3 21.7 2
272R2&6F 333.4 5.9 2
272R311I 396.1 14.4 2
272R376V 368.7 8.1 2
279D3C7E 522.4 8.8 2
283R307E 400.2 9.1 2
283R311I 531.3 6.1 2
203R376V 474.3 1.1 2
286F307E 431.2 3.6 2
286F311I 412.3 0.0 2
286F376V 348.9 1.5 2
307E376V 480.1 4.3 2
311137-&V 413.5 39.1 2
Exemplo 2 - Caracterização de Atividade de CDC de Variantes [0262] Este exemplo descreve como atividade de CDC de várias regiões Fc variantes é determinada.
[0263] Este ensaio é realizado usando complemento humano (Quidel Corp., cat#AI 13) em célula 15 Ramos (RA #1) (ATCC Catalog No. CRL-1596). Células Ramos são cultivadas em meios Gibco RPMI1640 contendo 10% de FBS a 37 SC e 5% de CO2. No dia antes do ensaio, células são semeadas a 1 x 106 células em um frasco T175. No dia seguinte, as células são resuspensas para 3,57 x 105 células/ml em RPMI1640 sem vermelho de fenol contendo 1% de FBS. Distribuir 70 μΙ de células por poço para uma placa de fundo plano Costar 3917. Para curva de titulação, IgG com uma região Fc variante é preparado em uma diluição em série de 3 vezes em meios RPMI1640. Para ensaio de seleção de biblioteca de ponto único, variante de IgG transientemente expressa em sobrenadante de cultura é
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 166/174
159/161 normalizada para 1 pg/ml em meios simulados. Trinta microlitros de IgG variante (i.e., concentração final de 200 ng/ml) e 50 pl de complemento humano (Qidel Corp., cat#A113) diluídos 1:5 em RPMI 1640 + 1% de FBS são adicionados à célula alvo e misturados bem por pipetagem suave. As placas são incubadas a 37 SC na presença de 5% de CO2 por 1,5 horas. Depois de adição de 15 μΙ/poço de Azul de Alamar (Serotec, cat#BUF 12B) a incubação continua durante a noite. Então o sinal fluorescente é medido por leitor de multimarca EnVision 2100 de PerkinElmer com excitação em 560 nm e emissão em 590 nm.
ii. Análise de Dados [0264] Todos os ensaio de ponto único são realizados em duplicata. Cada placa de ensaio contém controles para lise espontânea de célula alvo por complemento humano na ausência de IgG e lise máxima de célula alvo na presença de 1% de Triton X-100. Três controles tipo selvagem são incluídos em cada placa de ensaio e é calculada a média do sinal de ensaio de CDC. O valor de fundo, obtido a partir do controle de lise espontânea, é subtraído de cada amostra. O valor de fundo, obtido a partir da IgG diluída, é subtraído de cada amostra. Os dados são convertidos de sinais de fluorescência para porcentagem de lise específica baseado nos controles de lise espontânea e máxima. A porcentagem de lise específica é calculada a partir da seguinte equação: porcentagem de lise específica = (sinal de fluorescência experimental - sinal espontâneo)/ (sinal de lise máxima - sinal espontâneo) X 100. A porcentagem da atividade de variante de Fc sobre a média de três controles tipo selvagem é então calculada. É calculada a média da porcentagem das atividades sobre tipo selvagem para placas de ensaio duplicadas e o desvio padrão entre placas individuais de ensaio é calculado.
Exemplo 3 - Caracterização de Ligação com FcRn [0265] Este Exemplo descreve ensaios para ligação de receptor neonatal de Fc (FcRn) a IgG com uma região Fc variante.
[0266] Uma placa ELISA de 96-poços de fundo U é revestida (Costar) com 50 μΙ/poço de 2 pg/ml de Neutravidin (Pierce Biotechnology, Cat#3 1000) em 50 mM de tampo de Carbonato (pH 9,3) a 4 SC durante a noite. NeutraAvidina não ligada é
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 167/174
160/161 removida da placa e a placa é lavada três vezes com PBST (PBS contendoO,1% de Tween 20). Cinqüenta microlitros de FcRn solúvel marcado com biotina a 2,5 pg/ml em PBS são aplicados por poço e incubados a temperatura ambiente por 1 hr. Então 75 μΙ de tampão bloqueador de caseína (Pierce Biotechnology, Cat#37528) são adicionados à placa por 1 hora. A placa de ELISA é então lavada com PBST e incubada com 50 μΙ/poço de IgG variante. Para a curva de titulação, IgG a ser testada é preparada por uma diluição em série de 3 vezes em tampão de ligação de FcRn (100 mM de NaPO4, 0,05% de Tween-20, opcionalmente em diferentes pHs (de 6,0 a 7,4). Para seleção de ponto único, IgG variante transiente expressa em sobrenadante de cultura é normalizada para um concentração final de 50 ng/ml e pH ajustado para 6,0 com tampão de ligação de FcRn. Nas etapas seguintes, tampão de ligação de FcRn em pH correspondente é usado para lavar a placa e para diluir reagentes. A reação de ligação é realizada em temperatura ambiente por 1 hr. Depois de três lavagens, IgG ligada é detectada por conjugado de Fab anti-humano (Fab')2 de cabra-HRP por 1 hr. Atividade de HPR é desenvolvida em substrato de HRP de Pierce (Turbo TMB-ELISA, Cat#34022) por 5-30 minutos. A reação é parada por adição de 50 μΙ de 2 M de H2SO4 e a absorbância em 540 nm é lida com um leitor de VMAX de microplaca (Molecular Devices).
Exemplo 4 - Terapia Humana de variante de Fc de anti-CD20-l332E [0267] Estudos in vitro e modelos de tumor (Clynes RA, et al. Nat Med. 6:443 (2000)) fornecem evidência de que ADCC desempenha um papel nos efeitos antitumor de anticorpos anti-CD20, tal como RITUXAN. Pacientes humanos podem ser tratados com anticorpos de variante de Fc de anti-CD20-l332E ou RITUXAN, de uma maneira similar àquela descrita em Cartron et al., Blood 99:754 (2002). Por exemplo, pacientes apresentando doença de estágio II a IV de acordo com a classificação Ann-Arbor, tendo pelo menos um sítio de doença mensurável, e baixa carga de tumor de acordo com os critérios de GELF, poderíam ser tratados com um total de quatro doses de aproximadamente 375 mg/m2 de uma variante de Fc de anti-CD20 ou com RITUXAN administrado por infusão intravenosa (dias 1,8, 15, e 22). O ponto final de eficácia primária é a taxa de resposta objetiva, i.e., a proporção de pacientes
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 168/174
161/161 atingindo ou remissão completa (CR), CR não confirmada (Cru), ou resposta parcial (PR) de acordo com critérios recentemente propostos por um comitê especialista internacional. Resposta clínica pode ser avaliada em mês dois (M2). Pacientes também pode ser avaliados para progressão em 1 ano (M12).
[0268] As taxas de resposta objetiva em M2 e M12 para pacientes tratados com RITUXAN ou variante de Fc de anti-CD20 podem ser comparadas de forma que as melhoradas atividades de ADCC fornecidas por uma variante de Fc possam ser quantificadas. Este mesmo exemplo poderia ser repetido com outras variantes de anti-CD20 (veja, e.g., Tabelas 1-10 neste lugar).
[0269] Adicionalmente, a realçada potência das variantes pode permitir diferentes rotas de administração, injeções menos freqüentes, e/ou administração de doses menores. Todas as publicações e patentes mencionadas no relatório acima. Várias modificações e variações do método descrito e sistema da invenção serão perceptíveis por aqueles versados na arte sem se afastar do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com formas de realização preferidas específicas, a invenção como reivindicado não deve ser indevidamente limitada a tais formas de realização específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvias para aqueles versados em química, e biologia molecular ou campos relacionados são pretendidas para estarem dentro do escopo das reivindicações seguintes.
Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 169/174
1/2

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo anti-CD20, caracterizado pelo fato de compreender:
    a) sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve consistindo de SEQ ID NO: 13;
    b) sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada consistindo de SEQ ID NO: 14; e
    c) variante de uma região Fc originário em que a região Fc originário é uma região lgG1 Fc humana e em que a região Fc variante compreende uma substituição de aminoácido selecionada do grupo consistindo de 247I/339Q e 247I/339D.
  2. 2. Anticorpo anti-CD20, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região Fc originário é uma região IgG 1 Fc humana nativa.
  3. 3. Anticorpo anti-CD20, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a variante de Fc é 247I/339Q.
  4. 4. Anticorpo anti-CD20 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a variante de Fc é 247I/339D.
  5. 5. Anticorpo anti-CD20, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos de cadeia leve consistindo de SEQ ID NO: 29 e uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada consistindo de SEQ ID NO: 31.
  6. 6. Anticorpo anti-CD20, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve é codificada por uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO: 30 e a cadeia pesada é codificada por uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO: 32.
  7. 7. Anticorpo anti-CD20, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos de cadeia leve consistindo de SEQ ID NO: 29 e uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada consistindo de SEQ ID NO: 33.
  8. 8. Anticorpo anti-CD20, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve é codificada por uma sequência de ácido nucleico
    Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 170/174
    2/2 compreendendo SEQ ID NO: 30 e a cadeia pesada é codificada por uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO: 34.
  9. 9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo anti-CD20 tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
  10. 10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de compreender ainda um portador farmaceuticamente aceitável.
    Petição 870180067877, de 06/08/2018, pág. 171/174
    2/8
    B g £ £8 £ gggHã
    CJ to cu a
    CU Oi X X CU cu Eu
    J Eu > to cu cu
    Eu »4 tu > to —
    CU cu tu tu cn tu η (n m st> tn u> r- “ 60066062 qüqqqqqQ H H Η Η Η M H K < « HNmtrHrMMn οοσοοοοο ϋίϋίΟϋΙΟ'Ο'Ο'® wmmmmmhh seee^uuu 22222222 jsc: λ ε ε ê ê
    3/8
BRPI0514068A 2004-08-04 2005-07-18 anticorpo anti-cd20, e, composição farmacêutica BRPI0514068B8 (pt)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR122018016031A BR122018016031B8 (pt) 2004-08-04 2005-07-18 processo para produzir um anticorpo monoclonal variante com resposta de adcc realçada

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US59885504P 2004-08-04 2004-08-04
US60295304P 2004-08-19 2004-08-19
US60433904P 2004-08-25 2004-08-25
US60910104P 2004-09-10 2004-09-10
US63844204P 2004-12-23 2004-12-23
US64371805P 2005-01-13 2005-01-13
PCT/US2005/025276 WO2006020114A2 (en) 2004-08-04 2005-07-18 Variant fc regions

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BRPI0514068A BRPI0514068A (pt) 2008-05-27
BRPI0514068B1 true BRPI0514068B1 (pt) 2018-11-27
BRPI0514068B8 BRPI0514068B8 (pt) 2021-05-25

Family

ID=35276048

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR122018016031A BR122018016031B8 (pt) 2004-08-04 2005-07-18 processo para produzir um anticorpo monoclonal variante com resposta de adcc realçada
BRPI0514068A BRPI0514068B8 (pt) 2004-08-04 2005-07-18 anticorpo anti-cd20, e, composição farmacêutica

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR122018016031A BR122018016031B8 (pt) 2004-08-04 2005-07-18 processo para produzir um anticorpo monoclonal variante com resposta de adcc realçada

Country Status (16)

Country Link
US (1) US7740847B2 (pt)
EP (2) EP2213683B1 (pt)
JP (2) JP5055603B2 (pt)
KR (1) KR100864549B1 (pt)
CN (1) CN101001873B (pt)
AU (1) AU2005274905B2 (pt)
BR (2) BR122018016031B8 (pt)
CA (2) CA2779559A1 (pt)
DK (2) DK1776384T3 (pt)
EA (1) EA012464B1 (pt)
ES (2) ES2426816T3 (pt)
IL (1) IL180885A0 (pt)
MX (1) MX2007001345A (pt)
NO (1) NO339556B1 (pt)
PL (2) PL2213683T3 (pt)
WO (1) WO2006020114A2 (pt)

Families Citing this family (276)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2264166B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
WO2004093810A2 (en) * 2003-04-21 2004-11-04 Epeius Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for treating disorders
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
WO2002044394A2 (en) * 2000-11-29 2002-06-06 University Of Southern California Targetet retoviral vectors for cancer immunotherapy
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US8968730B2 (en) 2002-08-14 2015-03-03 Macrogenics Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US8946387B2 (en) 2002-08-14 2015-02-03 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090123428A1 (en) * 2003-04-21 2009-05-14 Hall Frederick L Pathotropic targeted gene delivery system for cancer and other disorders
US20070178066A1 (en) * 2003-04-21 2007-08-02 Hall Frederick L Pathotropic targeted gene delivery system for cancer and other disorders
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
NZ545776A (en) 2003-08-22 2009-05-31 Biogen Idec Inc Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
MXPA06012601A (es) 2004-05-10 2007-05-10 Macrogenics Inc Anticuerpos especificos de fcy riib humanizados y metodos de uso de los mismos.
WO2006085967A2 (en) * 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
CZ200755A3 (cs) 2004-07-26 2007-04-11 Biogen Idec Ma Inc. Peptidy protilátek anti-CD154
PL2213683T3 (pl) 2004-08-04 2013-10-31 Mentrik Biotech Llc WARIANTY REGIONÓW Fc
US7632497B2 (en) 2004-11-10 2009-12-15 Macrogenics, Inc. Engineering Fc Antibody regions to confer effector function
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) * 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EP2332985A3 (en) 2004-11-12 2012-01-25 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
WO2006105062A2 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Verenium Corporation Altered antibody fc regions and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
CA2605024C (en) 2005-04-15 2018-05-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US11254748B2 (en) 2005-04-15 2022-02-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
EP1899477A4 (en) * 2005-07-01 2010-01-20 Medimmune Inc INTEGRATED APPROACH FOR GENERATING MULTIDOMAIN PROTEIN THERAPEUTIC APPLICATIONS
US7557190B2 (en) 2005-07-08 2009-07-07 Xencor, Inc. Optimized proteins that target Ep-CAM
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
SI2573114T1 (sl) 2005-08-10 2016-08-31 Macrogenics, Inc. Identifikacija in inženiring protiteles z variantnimi fc regijami in postopki za njih uporabo
EP1943332A4 (en) 2005-10-14 2011-04-13 Medimmune Inc CELLULAR DISPLAY OF ANTIBODY LIBRARIES
CA2647846C (en) 2006-03-31 2016-06-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
CA2656224C (en) 2006-06-26 2018-01-09 Macrogenics, Inc. Combination of fc.gamma.riib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof
LT2029173T (lt) 2006-06-26 2016-11-10 Macrogenics, Inc. Fc riib specifiniai antikūnai ir jų panaudojimo būdai
WO2008140603A2 (en) 2006-12-08 2008-11-20 Macrogenics, Inc. METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASE USING IMMUNOGLOBULINS HAVING FC REGIONS WITH ALTERED AFFINITIES FOR FCγR ACTIVATING AND FCγR INHIBITING
AU2013202392B2 (en) * 2006-12-20 2016-02-25 Mmrglobal, Inc. Antibodies and methods for making and using them
BRPI0720565A2 (pt) 2006-12-20 2013-09-17 Mmr Information Systems Inc anticorpos e mÉtodos para a sua preparaÇço e seu uso
SI2125894T1 (sl) 2007-03-22 2019-05-31 Biogen Ma Inc. Vezavne beljakovine, vključno s protitelesi, derivati protiteles in fragmenti protiteles, ki specifično vežejo CD154, ter njihove uporabe
EP2737907A3 (en) 2007-05-07 2014-11-05 MedImmune, LLC Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
EP3656403B1 (en) 2007-08-17 2022-05-11 Purdue Research Foundation Preparation process of psma binding ligand-linker conjugates
RU2510400C9 (ru) 2007-09-26 2014-07-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Способ модификации изоэлектрической точки антитела с помощью аминокислотных замен в cdr
US8795667B2 (en) 2007-12-19 2014-08-05 Macrogenics, Inc. Compositions for the prevention and treatment of smallpox
JP5571567B2 (ja) 2007-12-21 2014-08-13 メディミューン リミテッド インターロイキン−４受容体α（ＩＬ−４Ｒα）−１７３に対する結合メンバー
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
DK2235059T3 (en) 2007-12-26 2015-03-30 Xencor Inc FC-VERSIONS OF MODIFIED BINDING TO FcRn
US20110033378A1 (en) 2008-01-18 2011-02-10 Medlmmune, Llc. Cysteine Engineered Antibodies For Site-Specific Conjugation
US12492253B1 (en) 2008-02-25 2025-12-09 Xencor, Inc. Anti-human C5 antibodies
SG189730A1 (en) 2008-04-02 2013-05-31 Macrogenics Inc Her2/neu-specific antibodies and methods of using same
CA2720365C (en) 2008-04-02 2019-01-15 Macrogenics, Inc. Bcr-complex-specific antibodies and methods of using same
TW201920257A (zh) * 2008-04-11 2019-06-01 日商中外製藥股份有限公司 重複結合複數個抗原的抗原結合分子
EP2280997A2 (en) * 2008-04-18 2011-02-09 Xencor, Inc. Human equivalent monoclonal antibodies engineered from nonhuman variable regions
BRPI0917204A2 (pt) * 2008-07-21 2015-12-01 Immunomedics Inc variantes estruturais de anticorpos para melhores características terapêuticas
KR101834999B1 (ko) * 2008-10-14 2018-03-06 제넨테크, 인크. 이뮤노글로불린 변이체 및 그의 용도
EP2358392B1 (en) 2008-11-12 2019-01-09 MedImmune, LLC Antibody formulation
WO2011005481A1 (en) 2009-06-22 2011-01-13 Medimmune, Llc ENGINEERED Fc REGIONS FOR SITE-SPECIFIC CONJUGATION
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CA2776385C (en) 2009-10-07 2019-04-09 Macrogenics, Inc. Fc region-containing polypeptides that exhibit improved effector function due to alterations of the extent of fucosylation, and methods for their use
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
US9951324B2 (en) 2010-02-25 2018-04-24 Purdue Research Foundation PSMA binding ligand-linker conjugates and methods for using
LT2542256T (lt) 2010-03-04 2019-10-25 Macrogenics Inc Su b7-h3 reaguojantys antikūnai, jų imunologiškai aktyvūs fragmentai ir jų naudojimas
PH12012501751A1 (en) 2010-03-04 2012-11-12 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
US20120100166A1 (en) 2010-07-15 2012-04-26 Zyngenia, Inc. Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof
CN103154025B (zh) 2010-08-02 2015-07-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
CA2808154A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Medimmmune Limited Monomeric polypeptides comprising variant fc regions and methods of use
WO2012022734A2 (en) 2010-08-16 2012-02-23 Medimmune Limited Anti-icam-1 antibodies and methods of use
WO2012032080A1 (en) 2010-09-07 2012-03-15 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H Stabilised human fc
WO2012034039A2 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Apexigen, Inc. Anti-il-1 beta antibodies and methods of use
RU2013122843A (ru) * 2010-10-20 2014-11-27 Морфотек, Инк. Гликоформы антитела против фолатного рецептора альфа
MX349057B (es) 2010-11-30 2017-07-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapeutico que induce citotoxicidad.
SG10201509790YA (en) 2010-11-30 2015-12-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-Binding Molecule Capable Of Binding To Plurality Of Antigen Molecules Repeatedly
CA3027071A1 (en) 2011-01-14 2013-07-19 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ror-1 protein and methods for use of same
US20140088019A1 (en) 2011-02-11 2014-03-27 Zyngenia, Inc. Monovalent and Multivalent Multispecific Complexes and Uses Thereof
SG10201609665PA (en) 2011-02-25 2017-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd FcɣRIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
RU2013144392A (ru) 2011-03-03 2015-04-10 Апексиджен, Инк. Антитела к рецептору il-6 и способы применения
US8609818B2 (en) 2011-03-10 2013-12-17 Omeros Corporation Generation of anti-FN14 monoclonal antibodies by ex-vivo accelerated antibody evolution
HUE041335T2 (hu) * 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
US9469676B2 (en) 2011-04-13 2016-10-18 Bristol-Myers Squibb Company Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements
CN106928362B (zh) 2011-04-29 2021-10-26 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
JP6145088B2 (ja) 2011-05-21 2017-06-07 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 脱免疫化血清結合ドメイン及び血清半減期を延長するためのその使用
ES2704038T3 (es) 2011-05-24 2019-03-13 Zyngenia Inc Complejos multiespecíficos multivalentes y monovalentes y sus usos
RU2641256C2 (ru) 2011-06-30 2018-01-16 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Гетеродимеризованный полипептид
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
EP2742067A4 (en) 2011-08-12 2015-03-04 Omeros Corp MONOCLONAL FZD10 ANTIBODIES AND METHOD FOR THEIR USE
US20140335089A1 (en) * 2011-09-30 2014-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for promoting elimination of antigens
NZ721184A (en) 2011-09-30 2018-08-31 Dana Farber Cancer Inst Inc Therapeutic peptides
TW201817745A (zh) * 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
SG11201401100UA (en) 2011-09-30 2014-07-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule inducing immune response to target antigen
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
MX359775B (es) 2011-10-31 2018-10-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula enlazada al antigeno que tiene conjugacion regulada entre cadena ligera y cadena pesada.
RU2014122184A (ru) 2011-11-02 2015-12-10 Апексиджен, Инк. Антитела к kdr и способы их применения
JP2014533249A (ja) 2011-11-07 2014-12-11 メディミューン，エルエルシー 多重特異性を持つ多価結合タンパク質およびその使用
CN113416257A (zh) * 2011-11-30 2021-09-21 中外制药株式会社 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物
CA3111357A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
KR102041412B1 (ko) * 2011-12-30 2019-11-11 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 Ｆｃ 단편 유도체
CN104204204A (zh) 2012-02-09 2014-12-10 中外制药株式会社 抗体的Fc区变异体
KR102219987B1 (ko) * 2012-02-24 2021-02-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩＢ를 매개로 항원의 소실을 촉진하는 항원 결합 분자
WO2013147153A1 (ja) 2012-03-29 2013-10-03 株式会社未来創薬研究所 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
EP2857419B1 (en) 2012-05-30 2021-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens
CN104487457B (zh) 2012-05-30 2018-01-26 中外制药株式会社 靶组织特异性抗原结合分子
PT2869845T (pt) * 2012-07-06 2019-12-09 Genmab Bv Proteína dimérica com mutações triplas
SG10201605703TA (en) * 2012-07-06 2016-09-29 Genmab Bv Dimeric protein with triple mutations
WO2014009465A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
US11236168B2 (en) 2012-08-24 2022-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse FcγammaRII-specific Fc antibody
TWI717591B (zh) 2012-08-24 2021-02-01 日商中外製藥股份有限公司 ＦｃγＲＩＩｂ特異性Ｆｃ區域變異體
CA2888763A1 (en) 2012-10-30 2014-05-08 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
RU2670943C9 (ru) 2012-11-08 2018-11-26 Илэвэн Байотерапьютикс, Инк. Антагонисты ил-6 и их применение
MX2015006109A (es) 2012-11-15 2016-02-05 Endocyte Inc Conjugados para el tratamiento de enfermedades causadas por celulas que expresan psma.
DK2928923T3 (da) 2012-12-10 2020-02-17 Biogen Ma Inc Antistoffer mod dendritisk celle-antigen 2 fra blod og anvendelser deraf
EP4119947A1 (en) 2012-12-21 2023-01-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
JP6433297B2 (ja) 2012-12-27 2018-12-05 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
US20150353636A1 (en) * 2013-01-10 2015-12-10 Genmab B.V. Human igg1 fc region variants and uses thereof
US10065987B2 (en) 2013-02-12 2018-09-04 Bristol-Myers Squibb Company High pH protein refolding methods
US10183967B2 (en) 2013-02-12 2019-01-22 Bristol-Myers Squibb Company Tangential flow filtration based protein refolding methods
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
PT2968520T (pt) 2013-03-14 2021-08-19 Macrogenics Inc Moléculas biespecíficas que são imunorreativas com células efetoras imunitárias que expressam um recetor de ativação
EA201591806A1 (ru) 2013-03-15 2016-01-29 Байоджен Ма Инк. Лечение и профилактика острой почечной недостаточности с применением анти-альфа-v-бета-5 антител
JP6397479B2 (ja) 2013-03-15 2018-09-26 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼＦｃコンジュゲート
CN105142668B (zh) 2013-03-15 2018-04-27 达纳-法伯癌症研究院公司 治疗性肽
WO2014144600A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Viktor Roschke Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
WO2014144466A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
WO2014143739A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
TWI636062B (zh) 2013-04-02 2018-09-21 中外製藥股份有限公司 Fc region variant
KR20160022354A (ko) 2013-06-24 2016-02-29 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 인간화 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제
US11384149B2 (en) 2013-08-09 2022-07-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof
UA116479C2 (uk) 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
AU2014312190A1 (en) 2013-08-28 2016-02-18 Bioasis Technologies Inc. CNS-targeted conjugates of antibodies
BR112016006999B1 (pt) 2013-10-02 2023-11-14 Medimmune, Llc Anticorpos neutralizantes antiinfluenza a seus usos, seu método de produção, composição que os compreendem, ácido nucleico e vetor
WO2015057939A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Biogen Idec Ma Inc. Anti-s1p4 antibodies and uses thereof
GEP20237497B (en) 2013-10-18 2023-04-10 Deutsches Krebsforsch Labeled inhibitors of prostate specific membrane antigen (psma), their use as imaging agents and pharmaceutical agents for the treatment of prostate cancer
EP3777898B1 (en) 2013-11-14 2025-01-01 Endocyte, Inc. Compounds for positron emission tomography
EP3078744B1 (en) 2013-12-04 2020-08-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
KR20160090904A (ko) 2013-12-06 2016-08-01 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 치료 펩티드
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
GB201403875D0 (en) 2014-03-05 2014-04-16 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
EP3925973A1 (en) 2014-03-14 2021-12-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccine compositions and methods for restoring nkg2d pathway function against cancers
SG11201607434WA (en) 2014-04-07 2016-10-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Immunoactivating antigen-binding molecule
AR100353A1 (es) 2014-05-08 2016-09-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Droga de direccionamiento a glipicano 3 (gpc3) que se administra a un paciente que responde a la terapia con drogas de direccionamiento a gpc3
EA201692287A1 (ru) 2014-05-13 2017-06-30 Чугаи Сеияку Кабушики Каиша Антигенсвязывающая молекула, перенаправляющая т-клетки на клетки, обладающие иммуносупрессорной функцией
WO2015175874A2 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Medimmune, Llc Molecules with altered neonate fc receptor binding having enhanced therapeutic and diagnostic properties
EP3151921B1 (en) 2014-06-06 2019-08-28 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
GB201413913D0 (en) 2014-08-06 2014-09-17 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
CN107108721B (zh) 2014-09-29 2021-09-07 杜克大学 包含hiv-1包膜靶向臂的双特异性分子
ES3051832T3 (en) 2014-11-07 2025-12-30 F Hoffmann La Roche Ltd Improved il-6 antibodies
KR102569813B1 (ko) 2014-11-21 2023-08-24 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Cd73에 대항한 항체 및 그의 용도
CN113929770A (zh) 2014-11-21 2022-01-14 百时美施贵宝公司 包含修饰的重链恒定区的抗体
KR102650420B1 (ko) 2014-12-19 2024-03-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
WO2016098356A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
EA039219B1 (ru) 2014-12-23 2021-12-20 Бристол-Майерс Сквибб Компани Антитела к tigit
US10188759B2 (en) 2015-01-07 2019-01-29 Endocyte, Inc. Conjugates for imaging
CN112142844B (zh) 2015-02-05 2025-07-25 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
CN107708720A (zh) 2015-04-06 2018-02-16 苏伯多曼有限责任公司 含有从头结合结构域的多肽及其用途
JP6797137B2 (ja) 2015-05-29 2020-12-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｏｘ４０に対する抗体およびその使用
JP2018524373A (ja) 2015-07-15 2018-08-30 ザイムワークス，インコーポレイテッド 薬物がコンジュゲートされた二重特異性抗原結合コンストラクト
AU2016323088B2 (en) 2015-09-18 2020-12-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha IL-8-binding antibodies and uses thereof
US11649293B2 (en) 2015-11-18 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for enhancing humoral immune response
US11660340B2 (en) 2015-11-18 2023-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
BR112018010172A2 (pt) 2015-11-19 2018-11-21 Bristol Myers Squibb Co anticorpos contra receptor de fator de necrose de tumor induzido por glicocorticoide (gitr) e usos dos mesmos
MX2018006333A (es) 2015-12-01 2018-08-01 Genmab Bv Anticuerpos anti-receptor de muerte 5 (dr5) y metodos de uso de los mismos.
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
AU2016381992B2 (en) 2015-12-28 2024-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
KR20180116359A (ko) 2016-02-23 2018-10-24 세센 바이오, 아이엔씨. 인터루킨-6의 길항제 제제 및 이의 용도
US20190284293A1 (en) 2016-03-04 2019-09-19 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy with anti-cd73 antibodies
KR20180116215A (ko) 2016-03-14 2018-10-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 암의 치료에 이용하기 위한 세포상해 유도 치료제
PL3430054T3 (pl) 2016-03-15 2022-05-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Sposoby leczenia nowotworów z zastosowaniem antagonistów wiązania z osią PD-1 i przeciwciał anty-GPC3
WO2017161173A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Engineered trail for cancer therapy
PE20190353A1 (es) 2016-04-15 2019-03-07 Macrogenics Inc Moleculas de union b7-h3 novedosas, conjugados anticuerpo-farmaco de los mismos y metodos de uso de los mismos
US10968279B2 (en) 2016-05-09 2021-04-06 Bristol-Myers Squibb Company TL1A antibodies and uses thereof
CN117683135A (zh) 2016-07-14 2024-03-12 百时美施贵宝公司 针对tim3的抗体及其用途
US20190330318A1 (en) 2016-07-25 2019-10-31 Biogen Ma Inc. Anti-hspa5 (grp78) antibodies and uses thereof
CA3032820A1 (en) 2016-08-02 2018-03-22 Visterra, Inc. Engineered polypeptides and uses thereof
MX2019001448A (es) 2016-08-05 2019-09-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion para profilaxis o tratamiento de enfermedades relacionadas con interleucina 8 (il-8).
CA3033661A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Janssen Biotech, Inc. Engineered antibodies and other fc-domain containing molecules with enhanced agonism and effector functions
WO2018044970A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus k envelope (herv-k) and uses thereof
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
GB201619652D0 (en) 2016-11-21 2017-01-04 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides
TN2019000164A1 (en) 2016-11-23 2020-10-05 Bioverativ Therapeutics Inc Mono- and bispecific antibodies binding to coagulation factor ix and coagulation factor x
JP7191833B2 (ja) 2017-01-30 2022-12-19 中外製薬株式会社 抗スクレロスチン抗体およびその使用
EA201991720A1 (ru) 2017-02-17 2020-01-20 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антитела к альфа-синуклеину и их применения
WO2018160683A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Seattle Genetics, Inc. Cysteine mutated antibodies for conjugation
AU2018227428A1 (en) 2017-02-28 2019-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Use of anti-CTLA-4 antibodies with enhanced ADCC to enhance immune response to a vaccine
WO2018185284A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Miltenyi Biotec Gmbh POLYPEPTIDES WITH MUTANT HUMAN IgG4
AU2018256435B2 (en) 2017-04-20 2025-03-13 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods for treating lung inflammation
US11168129B2 (en) 2017-05-15 2021-11-09 University Of Rochester Broadly neutralizing anti-influenza human monoclonal antibody and uses thereof
BR112019024419A2 (pt) 2017-05-25 2020-07-14 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos compreendendo regiões constantes pesadas modificadas
CA3065171A1 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 Janssen Biotech, Inc. Engineered multispecific antibodies and other multimeric proteins with asymmetrical ch2-ch3 region mutations
EP3456736B1 (en) * 2017-09-19 2021-04-07 Tillotts Pharma Ag Antibody variants
EP3684413A1 (en) 2017-09-20 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dosage regimen for combination therapy using pd-1 axis binding antagonists and gpc3 targeting agent
EP3694552A1 (en) 2017-10-10 2020-08-19 Tilos Therapeutics, Inc. Anti-lap antibodies and uses thereof
MX2020004933A (es) 2017-11-14 2021-01-08 Arcellx Inc Polipéptidos que contienen dominios d y sus usos.
EP3710589A4 (en) 2017-11-14 2021-11-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-C1S ANTIBODIES AND METHOD OF USING
KR102806145B1 (ko) 2017-11-14 2025-05-15 아르셀엑스, 인크. 다기능성 면역 세포 요법
AU2018393073B2 (en) 2017-12-19 2025-09-18 Surrozen Operating, Inc. Wnt surrogate molecules and uses thereof
EP3731867A4 (en) 2017-12-19 2022-04-06 Surrozen Operating, Inc. Anti-lrp5/6 antibodies and methods of use
WO2019126399A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Surrozen, Inc. Anti-frizzled antibodies and methods of use
WO2019126133A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Liquid formulations of anti-cd200 antibodies
US11802154B2 (en) 2017-12-20 2023-10-31 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Humanized anti-CD200 antibodies and uses thereof
KR102813913B1 (ko) 2018-01-12 2025-05-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tim3에 대한 항체 및 그의 용도
EP3743440A1 (en) * 2018-01-24 2020-12-02 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
JP2018138022A (ja) * 2018-02-23 2018-09-06 ゲンマブ ビー．ブイ． ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域変異体およびその使用
CN116327926A (zh) 2018-03-15 2023-06-27 中外制药株式会社 对寨卡病毒具有交叉反应性的抗登革热病毒抗体及使用方法
EP3768716A1 (en) 2018-03-21 2021-01-27 Five Prime Therapeutics, Inc. Antibodies binding to vista at acidic ph
BR112020018539A2 (pt) 2018-03-23 2020-12-29 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpos contra mica e/ou micb e usos dos mesmos
EA202092302A1 (ru) 2018-04-02 2021-02-02 Бристол-Майерс Сквибб Компани Антитела к trem-1 и их применения
WO2019204335A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Endocyte, Inc. Methods of treating cancer
EP3787678A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 University Of Rochester Anti-influenza neuraminidase monoclonal antibodies and uses thereof
US20210238308A1 (en) * 2018-06-04 2021-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule showing changed half-life in cytoplasm
DK3820906T3 (da) 2018-07-05 2025-12-15 Surrozen Operating Inc Multispecifikke wnt-surrogatmolekyler og anvendelser deraf
AU2019302454A1 (en) 2018-07-09 2021-02-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies binding to ILT4
CN112638948B (zh) 2018-07-11 2025-08-15 戊瑞治疗有限公司 在酸性pH下结合至VISTA的抗体
CN112512559B (zh) 2018-07-26 2025-02-28 Atyr医药公司 用于治疗nrp2相关疾病的组合物和方法
PE20210343A1 (es) 2018-08-10 2021-02-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno anti grupo de diferenciacion 137 (cd137) y su uso
WO2020076969A2 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Tilos Therapeutics, Inc. Anti-lap antibody variants and uses thereof
MA54052A (fr) 2018-10-29 2022-02-09 Hoffmann La Roche Formulation d'anticorps
US20220106400A1 (en) 2018-11-28 2022-04-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
JP7536294B2 (ja) 2018-12-05 2024-08-20 株式会社バイカ・セラピュティクス 抗体のＦｃ領域改変体
WO2020118011A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anti-alk2 antibodies and uses thereof
PH12021551783A1 (en) 2019-01-22 2022-05-30 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against il-7r alpha subunit and uses thereof
CN113613676A (zh) 2019-03-19 2021-11-05 中外制药株式会社 包含对抗原的结合活性因mta而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子及用于获得该抗原结合结构域的文库
WO2020210358A1 (en) 2019-04-08 2020-10-15 Biogen Ma Inc. Anti-integrin antibodies and uses thereof
CN113924118A (zh) 2019-04-18 2022-01-11 百时美施贵宝公司 在低ph下具有增强的结合特异性的伊匹单抗变体
AU2020275348A1 (en) 2019-05-15 2021-12-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha An antigen-binding molecule, a pharmaceutical composition, and a method
EP3972627A4 (en) 2019-05-20 2023-06-21 Endocyte, Inc. Methods for preparing psma conjugates
CR20220049A (es) 2019-07-10 2022-03-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moléculas de unión a claudina-6 y usos de las mismas
CN114144435B (zh) 2019-07-15 2024-06-25 百时美施贵宝公司 针对人trem-1的抗体及其用途
EP3999543A1 (en) 2019-07-15 2022-05-25 Bristol-Myers Squibb Company Anti-trem-1 antibodies and uses thereof
AU2020350689A1 (en) 2019-09-19 2022-03-31 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies binding to VISTA at acidic pH
EP4130270A4 (en) 2020-04-01 2024-10-23 Kyowa Kirin Co., Ltd. ANTIBODY COMPOSITION
WO2021202235A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 University Of Rochester Monoclonal antibodies against the hemagglutinin (ha) and neuraminidase (na) of influenza h3n2 viruses
EP4132971A1 (en) 2020-04-09 2023-02-15 Merck Sharp & Dohme LLC Affinity matured anti-lap antibodies and uses thereof
WO2021222935A2 (en) 2020-04-28 2021-11-04 The Rockefeller University Neutralizing anti-sars-cov-2 antibodies and methods of use thereof
WO2021231732A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
JP7048665B2 (ja) * 2020-05-22 2022-04-05 ゲンマブ ビー．ブイ． ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域変異体およびその使用
CN115702169A (zh) 2020-06-10 2023-02-14 株式会社梅花治疗 包含促红细胞生成素多肽的融合蛋白
CN119899259A (zh) * 2020-07-10 2025-04-29 因外泰克斯公司 用于延长治疗剂在猫科动物中的半衰期的组合物和使用方法
WO2022098870A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 The Rockefeller University Neutralizing anti-sars-cov-2 antibodies
WO2022127793A1 (zh) 2020-12-18 2022-06-23 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 呼吸道合胞病毒特异性结合分子
MX2023007611A (es) 2020-12-23 2023-07-12 Cantargia Ab Anticuerpo anti-il1rap.
WO2022155324A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 The Rockefeller University Neutralizing anti-sars-cov-2 antibodies
CA3212948A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 David M. Hilbert Multifunctional immune cell therapies
US20240376224A1 (en) 2021-04-02 2024-11-14 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
WO2022235867A2 (en) 2021-05-06 2022-11-10 The Rockefeller University Neutralizing anti-sars- cov-2 antibodies and methods of use thereof
WO2023056240A2 (en) 2021-09-28 2023-04-06 Frontaim Biomedicines, Inc. Multiple formats of molecular complexes
EP4469159A1 (en) 2022-01-27 2024-12-04 The Rockefeller University Broadly neutralizing anti-sars-cov-2 antibodies targeting the n-terminal domain of the spike protein and methods of use thereof
WO2023191766A1 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Intervexion Therapeutics, Llc ANTIBODIES WITH ALTERED FcRn AFFINITY
WO2024020579A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies binding to human pad4 and uses thereof
WO2024107749A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Attralus, Inc. Fusion proteins that bind amyloid and the transferrin receptor and uses thereof
WO2024196694A2 (en) * 2023-03-17 2024-09-26 Eli Lilly And Company Pd-1 agonist antibodies and methods of treating inflammatory or autoimmune skin diseases with a pd-1 agonist antibody
WO2024200573A1 (en) 2023-03-27 2024-10-03 LAVA Therapeutics N.V. Nectin-4 binding agents and methods of use
MX2025013209A (es) 2023-05-05 2026-02-03 Otsuka Pharma Co Ltd Anticuerpos anti-il1rap
WO2025012118A2 (en) 2023-07-07 2025-01-16 LAVA Therapeutics N.V. 5t4 binding agents and methods of use
WO2025024265A1 (en) 2023-07-21 2025-01-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods of assessing citrullination and activity of pad4 modulators
WO2025026282A1 (en) * 2023-07-29 2025-02-06 Shanghai Kaijin Biotechnology, Ltd Modified type e multi-specific antibodies
US20250109187A1 (en) 2023-09-28 2025-04-03 Novavax, Inc. ANTI-SARS-CoV-2 SPIKE (S) ANTIBODIES AND THEIR USE IN TREATING COVID-19
WO2025085489A1 (en) 2023-10-17 2025-04-24 Bristol-Myers Squibb Company Gspt1-degrading compounds, anti-cd33 antibodies and antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2025088546A1 (en) * 2023-10-25 2025-05-01 Ablynx N.V. Fc domain variants with enhanced fc receptor binding
WO2025155877A2 (en) 2024-01-18 2025-07-24 The Regents Of The University Of California Antibodies binding to pad4 and uses thereof
WO2025174974A1 (en) 2024-02-14 2025-08-21 Bristol-Myers Squibb Company Anti-cd33 antibodies and uses thereof
US20250361320A1 (en) 2024-02-27 2025-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
US12521446B2 (en) 2024-02-27 2026-01-13 Bristol-Myers Squibb Company Anti-CEACAM5 antibody drug conjugates
EP4653010A1 (en) 2024-05-14 2025-11-26 35Pharma Inc. Activin receptor type iib traps for use in improving body composition
WO2025245176A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Multispecific antibody constructs
US20250376536A1 (en) 2024-06-06 2025-12-11 Bristol-Myers Squibb Company Multispecific anti-cd40 / anti-fap antibodies and uses thereof
WO2025255405A1 (en) 2024-06-06 2025-12-11 Bristol-Myers Squibb Company Anti-fap antibodies and uses thereof

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5985599A (en) 1986-05-29 1999-11-16 The Austin Research Institute FC receptor for immunoglobulin
IL84285A (en) 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US4861579A (en) 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
GB8916400D0 (en) 1989-07-18 1989-09-06 Dynal As Modified igg3
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
JPH06501705A (ja) 1990-11-05 1994-02-24 ブリストル−マイアーズ　スクイブ　カンパニー 抗−腫瘍抗体及び生物学的活性剤の組合せによる相乗治療
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
PL174494B1 (pl) 1992-11-13 1998-08-31 Idec Pharma Corp Kompozycja farmaceutyczna do leczenia chłoniaka z limfocytów B i sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chłoniaka z limfocytów B
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5550362A (en) 1992-11-20 1996-08-27 Intermec Corporation Method and apparatus for calibrating a bar code scanner
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5417972A (en) 1993-08-02 1995-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM
GB9316989D0 (en) 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
ES2251723T3 (es) 1994-08-12 2006-05-01 Immunomedics, Inc. Inmunoconjugados y anticuerpos humanizados especificos para linfoma de celulas b y celulas de leucemia.
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
ES2300113T3 (es) 1996-08-02 2008-06-01 Bristol-Myers Squibb Company Un procedimiento para inhibir toxicidad inducida por inmunoglobulinas que resulta del uso de inmunoglobulinas en terapia y diagnostico in vivo.
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
DE19721700C1 (de) 1997-05-23 1998-11-19 Deutsches Krebsforsch Mutierter OKT3-Antikörper
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2292730C (en) 1997-06-13 2008-09-16 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
DE69840412D1 (de) 1997-10-31 2009-02-12 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
CN1320044A (zh) 1998-08-11 2001-10-31 Idec药物公司 包括施用抗－cd20抗体的b－细胞淋巴瘤联合疗法
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
PT2055313E (pt) 1998-11-09 2015-08-25 Biogen Idec Inc Tratamento de malignidades hematológicas associadas a células tumorais em circulação utilizando anticorpo quimérico anti-cd20
MY155913A (en) 1998-11-09 2015-12-15 Biogen Inc Chimeric anti-cd20 antibody treatment of patients receiving bmt or pbsc transpants
ES2301254T3 (es) 1998-11-18 2008-06-16 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos con una afinidad de union mayor en comparacion con los anticuerpos parentales.
GB9900009D0 (en) * 1999-01-04 1999-02-24 Ml Lab Plc Gene therapy
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
EP1637160A3 (en) 1999-05-07 2006-05-03 Genentech, Inc. Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to B cell surface markers
HK1046635B (en) 1999-06-09 2009-10-09 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
ITMI991299A1 (it) 1999-06-11 2000-12-11 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite
KR20080075044A (ko) 1999-07-12 2008-08-13 제넨테크, 인크. Ｃｄ20에 결합하는 길항제를 사용한 외래 항원에 대한 면역반응 차단 방법
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
EP1207906A4 (en) 1999-08-11 2005-07-06 Biogen Idec Inc TREATMENT OF NON-HODGKIN LYMPHOMA PATIENTS WITH BONE MARROW WITH INVOLVEMENT OF ANTI-CD20 ANTIBODIES
AU6929100A (en) 1999-08-23 2001-03-19 Biocrystal Limited Methods and compositions for immunotherapy of b cell involvement in promotion ofa disease condition comprising multiple sclerosis
DK1265928T3 (da) 2000-01-27 2010-11-15 Medimmune Llc RSV-neutraliserende antistoffer med ultra høj affinitet
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
CN1441677A (zh) 2000-03-31 2003-09-10 Idec药物公司 抗细胞因子抗体或拮抗剂与抗－cd20在b细胞淋巴瘤治疗中的联合应用
JP2003531149A (ja) 2000-04-13 2003-10-21 ザ・ロツクフエラー・ユニバーシテイ 抗体由来の免疫応答の増強
US20020009444A1 (en) 2000-04-25 2002-01-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas
WO2001097858A2 (en) 2000-06-20 2001-12-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Cold anti-cd20 antibody/radiolabeled anti-cd22 antibody combination
WO2002034790A1 (en) 2000-10-20 2002-05-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
AU2002248184C1 (en) 2000-12-12 2018-01-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2436092A1 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Modified antibodies and methods of use
CA2442801A1 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceutical Corporation Recombinant antibodies coexpressed with gntiii
WO2002078766A2 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Genentech, Inc. Combination therapy
WO2003061694A1 (en) 2001-05-10 2003-07-31 Seattle Genetics, Inc. Immunosuppression of the humoral immune response by anti-cd20 antibodies
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
WO2003068821A2 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Immunomedics, Inc. Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
AU2003262650B2 (en) 2002-08-14 2009-10-29 Macrogenics, Inc. FcgammaRIIB-specific antibodies and methods of use thereof
SI2345671T1 (sl) 2002-09-27 2016-03-31 Xencor Inc. Optimizirane Fc-variante in postopki za njihovo izdelavo
KR101348472B1 (ko) 2002-10-17 2014-01-07 젠맵 에이/에스 Ｃｄ20에 대한 인간 모노클로날 항체
CN103833854B (zh) 2002-12-16 2017-12-12 健泰科生物技术公司 免疫球蛋白变体及其用途
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
NZ587776A (en) 2003-04-09 2012-03-30 Genentech Inc Therapy of autoimmune disease in a patient with an inadequate response to a TNF-alpha inhibitor using anti-CD20 antibody
CN1802388B (zh) 2003-05-09 2011-01-05 杜克大学 Cd20特异抗体及使用它们的方法
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
US8147832B2 (en) 2003-08-14 2012-04-03 Merck Patent Gmbh CD20-binding polypeptide compositions and methods
LT2077282T (lt) 2003-11-05 2017-03-10 Roche Glycart Ag Antigeną surišančios molekulės su padidintu fc receptoriaus surišimo giminingumu ir efektoriaus funkcija
EP1701979A2 (en) * 2003-12-03 2006-09-20 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
PT1706424E (pt) * 2004-01-12 2009-10-01 Applied Molecular Evolution Variantes da região fc
WO2005103081A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
AU2005272993B2 (en) 2004-07-15 2010-02-11 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
PL2213683T3 (pl) 2004-08-04 2013-10-31 Mentrik Biotech Llc WARIANTY REGIONÓW Fc
GT200500283A (es) 2004-10-08 2006-05-08 Inmunoterapia de desordenes autoinmunes
EP2332985A3 (en) 2004-11-12 2012-01-25 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
FR2879204B1 (fr) 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
ZA200705459B (en) 2005-01-13 2008-09-25 Genentech Inc Treatment method
DOP2006000029A (es) 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
CA2602663A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties

Also Published As

Publication number Publication date
NO20071192L (no) 2007-03-05
PL2213683T3 (pl) 2013-10-31
JP2008511292A (ja) 2008-04-17
CN101001873B (zh) 2013-03-13
AU2005274905A1 (en) 2006-02-23
EA200700210A1 (ru) 2007-08-31
WO2006020114A3 (en) 2006-04-06
EA012464B1 (ru) 2009-10-30
KR20070038541A (ko) 2007-04-10
US7740847B2 (en) 2010-06-22
KR100864549B1 (ko) 2008-10-20
DK2213683T3 (da) 2013-09-02
EP2213683A1 (en) 2010-08-04
EP2213683B1 (en) 2013-06-05
BR122018016031B1 (pt) 2019-10-22
CA2779559A1 (en) 2006-02-23
IL180885A0 (en) 2007-07-04
JP2012136541A (ja) 2012-07-19
AU2005274905B2 (en) 2010-12-23
EP1776384A2 (en) 2007-04-25
DK1776384T3 (da) 2013-09-02
WO2006020114A2 (en) 2006-02-23
MX2007001345A (es) 2008-03-11
PL1776384T3 (pl) 2013-10-31
US20070224188A1 (en) 2007-09-27
ES2426816T3 (es) 2013-10-25
JP5055603B2 (ja) 2012-10-24
CA2573192C (en) 2013-09-10
EP1776384B1 (en) 2013-06-05
ES2426817T3 (es) 2013-10-25
NO339556B1 (no) 2017-01-02
BRPI0514068B8 (pt) 2021-05-25
BRPI0514068A (pt) 2008-05-27
CN101001873A (zh) 2007-07-18
JP5600697B2 (ja) 2014-10-01
BR122018016031B8 (pt) 2021-07-27
CA2573192A1 (en) 2006-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0514068B1 (pt) anticorpo anti-cd20, e, composição farmacêutica
EP1706424B1 (en) Fc region variants
US20070141052A1 (en) Fc region variants
CN115461366A (zh) 抗ox40抗体及其用途
JP2024527262A (ja) 二重特異性抗ＭｅｒＴＫ及び抗ＰＤＬ１抗体ならびにその使用方法
EA050740B1 (ru) Антитело к ox40 и варианты его применения
HK1108287A (zh) Fc區變體
EA051743B1 (ru) Антитело к ox40 и варианты его применения
HK40085373A (en) Anti-cd47 antibody and uses thereof
MXPA06007791A (en) Fc region variants

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 27/11/2018, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 18/07/2005 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF

B21F Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time

Free format text: REFERENTE A 17A ANUIDADE.

B24J Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12)

Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2679 DE 10-05-2022 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.