BRPI0514201B1 - Bactéria, e, método para produzir um metabólito útil - Google Patents

Bactéria, e, método para produzir um metabólito útil Download PDF

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Akito Chinen
Hiroshi Izui
Yoshihiko Hara
Hisashi Yasueda
Konstantin Vyacheslavovich Rybak
Ekaterina Aleksandrovna Slivinskaya
Joanna Yosifovna Katashkina
Yury Ivanovich Kozlov
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Abstract

bactéria, e, método para produzir um metabólito útil a presente invenção proporciona uma bactéria que apresenta uma capacidade de produzir um metabólito útil derivado de acetil-coenzima a, como ácido l-glutâmico, l-glutamina, l-prolina, l-arginina, l-leucina, l-cisteína, succinato, e poli-hidroxibutirato, sendo que referida bactéria é modificada de forma a incrementar as atividades de d-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou ftutose-6-fosfato fosfocetolase. a presente invenção também proporciona um método de produzir o metabólito útil usando a bactéria.

Description

Fundamentos da invenção Campo da invenção
[001] A presente invenção refere-se a um método de produzirmetabólitos úteis, particularmente aqueles derivados de acetil-coenzima A (acetil-CoA). A presente invenção refere-se também a bactérias inéditas úteis no método de produção.
Breve descrição da técnica relacionada
[002] Convencionalmente, metabólitos úteis, como aminoácidos L,seus intermediários, e outros químicos do metabolismo bacteriano são produzidos por meio de métodos em que cepas bacterianas isoladas de fontes naturais, ou mutantes das mesmas, foram modificadas para incrementar sua produtividade.
[003] Açúcar é a fonte principal de carbono em um microorganism que é vantajosa para fermentação. As vias de Embden-Meyerhof e fosfato de pentose (pentose-P) são as duas vias preliminares do metabolismo intermediário do açúcar em um microorganismo. Uma terceira via, a via de Entner-Doudoroff, também é conhecida, são algumas das conexões com vias do ácido carboxílico. Durante a glicólise, glucose é metabolizada a compostos intermediários principais, como fosfoenolpiruvato, piruvato, e acetil- coenzima A, que são usadas como constituintes na formação de muitos compostos celulares, como aminoácidos L, purinas e pirimidinas, vitaminas etc. Da mesma forma, geração de energia (ATP e NADH) ocorre durante a glicólise. Piruvato formado após a glicólise é freqüentemente convertido de volta a fosfoenolpiruvato (PEP) por meio de fosfoenolpiruvato sintase codificada pelo gene pps, ou a acetil-CoA por meio de piruvato desidrogenase codificada pelo gene pdh etc. Um dos compostos mencionados acima, acetil- CoA, é formado de piruvato via piruvato desidrogenase, e é acompanhado da liberação de CO2.Esta perda de um átomo de carbono resulta em produçãodiminuída, dando compostos úteis derivados de acetil-CoA.
[004] Reportou-se acerca de duas enzimas da via bifidum, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase (também conhecida como “fosfocetolase”) e frutose-6-fosfato fosfocetolase.D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase (EC 4.1.2.9) catalisa a conversão consumidora de fosfato de xilulose-5-fosfato a gliceraldeído-3-fosfato e acetilfosfato, com a liberação concomitante de uma molécula de água. Frutose-6-fosfato fosfocetolase (EC 4.1.2.22) catalisa a conversão consumidora de fosfato de frutose-6-fosfato a eritrose-4-fosfato e acetilfosfato, com a liberação concomitante de uma molécula de água. Ambas as enzimas formam acetilfosfato, o precursor de acetil-CoA, sem perder carbono via CO2. D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase (EC 4.1.2.9) foi reportada em bactérias pertencentes ao gênero Acetobacter (Schramm, M. et al, J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)), Bifidobacterium (Sgorbati, B. et al, Antonie Van Leeuwenhoek. 42(1-2), 49-57 (1976); Grill, J.P. et al Curr Microbiol., 31(1), 49-54 (1995)), Lactobacillus (Posthuma, C.C. et al, Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002)), Thiobacillus (Greenley, D.E. e Smith, D.W., Arch. Microbiol., 122, 257-261 (1979)), em leveduras pertencentes aos gêneros Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Pichia, Yarrowia, Hansenula, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Trichosporon, Wingea (Evans, C.T. e Ratledge, C., Arch. Microbiol., 139, 48- 52 (1984); Ratledge, C. e Holdsworth, J.E., Appl. Microbiol. Biotechnol., 22, 217-221 (1985)). Frutose-6-fosfato fosfocetolase (EC 4.1.2.22) foi reportada em bactérias, como Acetobacter xylinum (Schramm, M. et al, J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)), Bifidobacterium globosum e Bifidobacterium dentium (Sgorbath, B.et al, Antonie Leeuwenhoek, 42, 49-57 (1976)), Bifidobacterium bifidum, Gardnerella vaginalis (Gavini, F. et al, Anaerobe, 2, 191-193 (1996)), e leveduras, como Rhodotorula graminis, Rhodotorula glutinis, Candida sp., Candida tropicalis, Saccharomyces pastorianus (Whitworth, D.A. e Ratledge, C., J. Gen. Microbiol., 102, 397-401 (1977)). Reportou-se que, em alguns organismos, ambas as atividades são representadas por uma enzima (ver, por exemplo, os artigos de Schramm, M. et al (J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)); Sgorbati, B. et al (Antonie Van Leeuwenhoek. 42(1- 2), 49-57 (1976)); Meile, L. et al (J. Bacterial., 183(9), 2929-36 (2001))).
[005] Genes de fosfocetolase de duas espécies foram clonadas e suasseqüências determinadas. Estes são o gene xfp que codifica D-xilulose-5- fosfato fosfocetolase/frutose-6-fosfato fosfocetolase de Bifidobacterium lactis (Meile, L. et al, J. Bacterial., 183(9), 2929-36 (2001)), e o gene xpkA que codifica D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase de Lactobacillus pentosus (Posthuma, C.C. et al, Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002)). Uma busca no banco de dados do Microbial Genome proporcionada pelo National Center para informação de biotecnologia(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/entrez/query .fcgi?CMD=&DB=genome) revelou vários genes que codificam fosfocetolases putativas.
[006] Métodos de aperfeiçoar a capacidade da levedura em produziretanol de xilose por meio de introdução de genes para xilose redutase, xilitol desidrogenase e, adicionalmente, fosfocetolase, são conhecidos (W02003078643). No entanto, efeitos do uso do gene de fosfocetolase para a eliminação de dióxido de carbono nunca foram reportados.
Sumário da invenção
[007] Um objeto da presente invenção consiste em incrementar aprodução de metabólitos úteis por meio de cepas de bactérias que apresentam a capacidade de produzir os metabólitos e também proporcionar um método de produzir os metabólitos usando estas cepas.
[008] É um objeto da presente invenção proporciona uma bacteria apresentando uma capacidade de produzir um metabólito útil, em que a bactéria é modificada de forma a apresentar uma atividade incrementada de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase.
[009] É um objeto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria descrita acima, sendo que o metabólito útil é derivado de acetil- coenzima A.
[0010] É um objeto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria descrita acima, sendo que o metabólito útil é selecionado do grupo que consiste de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L- leucina, L-cisteína, succinato, e poli-hidroxibutirato.
[0011] É um objeto da presente invenção proporcionar uma bactéria apresentando uma capacidade de produzir um metabólito útil, sendo que a bactéria não apresenta inerentemente uma atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase ou frutose-6-fosfato fosfocetolase, e sendo que referida bactéria foi transformada com um fragmento de DNA codificando para xilulose-5- fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase.
[0012] É um objeto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria descrita acima, sendo que o metabólito útil é derivado de acetil- coenzima A.
[0013] É um objeto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria descrita acima, sendo que o metabólito útil é selecionado do grupo que consiste de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L- leucina, L-cisteína, succinato, e poli-hidroxibutirato.
[0014] É um objeto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria descrita acima, sendo que a bactéria é selecionada do grupo que consiste da família de Enterobacteriaceae, bactéria Coryneform, e bactéria Bacillus.
[0015] É um objeto adicional da presente invenção proporcionar a bactéria descrita acima, sendo que a bactéria pertence ao gênero Escherichia ou Pantoea.
[0016] É um objeto adicional da presente invenção proporcionar um método para proporcionar um metabólito útil, compreendendo cultivar a bactéria em um meio de cultura, e coletar o metabólito útil do meio de cultura.
[0017] É um objeto adicional da presente invenção proporcionar o método descrito acima, sendo que o metabólito útil é derivado de acetil- coenzima A.
[0018] É um objeto adicional da presente invenção proporcionar o método descrito acima, sendo que o metabólito útil é selecionado do grupo que consiste de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L- leucina, L-cisteína, succinato, e poli-hidroxibutirato.
[0019] Estes objetos foram obtidos por meio do incremento de uma atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase ou frutose-6-fosfato fosfocetolase em uma bactéria que apresenta a capacidade de produzir um metabólito útil, particularmente um derivado de acetil-CoA, que tornou possível usar carbono mais eficientemente e incrementar a produção do metabólito útil pela bactéria. Assim, completou-se a presente invenção.
[0020] A presente invenção é descrita detalhadamente abaixo.
Breve descrição dos desenhos
[0021] Figura 1 mostra o alinhamento de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolases de L. pentosus e L. plantarum (identidade de 98,5%).
[0022] Figura 2 mostra o procedimento de construção do plasmídeo pBS3.
[0023] Figura 3 mostra o procedimento de construção do plasmídeo pBS4S.
[0024] Figura 4 mostra o procedimento de construção do plasmídeo pBS5T.
[0025] Figura 5 mostras as curvas de crescimento das cepas amplificadas com o gene de fosfocetolase e uma cepa de controle, em um meio mínimo contendo acetato.
[0026] Figura 6 mostras as curvas de crescimento de cepas amplificadas com o gene de fosfocetolase e uma cepa de controle em um meio mínimo.
[0027] Figura 7 (fotografia) mostra a eletroforese de extratos de células contendo proteína de fosfocetolase.
[0028] Figura 8 mostra a produção de ácido L-glutâmico usando cepas amplificadas com o gene de fosfocetolase em condições suficientes para biotina.
[0029] Figura 9 mostra a produção de ácido L-glutâmico usando cepas amplificadas com gene de fosfocetolase com a adição de penicilina.
[0030] Figura 10 mostra a produção de ácido L-glutâmico usando uma cepa em que um gene de fosfocetolase é introduzido e a atividade de 6- fosfofrutoquinase é reduzida.
[0031] Figura 11 mostra a produção de ácido L-glutâmico usando um estiramento em que um gene de fosfocetolase é introduzido e a atividade de 6- fosfofrutoquinase é reduzida na presença de penicilina.
[0032] Figura 12 mostra a produção de L-glutamina (Gin) usando uma cepa amplificada com o gene de fosfocetolase.
Descrição das concretizações preferidas
[0033] A bactéria da presente invenção compreende uma bactéria que apresenta uma capacidade de produzir um metabólito útil, sendo que a bactéria foi modificada de forma a incrementar a atividade de D-xilulose-5- fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase.
[0034] A bactéria da presente invenção inclui tanto uma bactéria que não apresenta inerentemente uma atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose-6-fosfato fosfocetolase e uma bactéria que apresenta inerentemente uma atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose- 6-fosfato fosfocetolase. Por meio da introdução de um gene que codifica D- xilulose-5-fosfato fosfocetolase ou frutose-6-fosfato fosfocetolase em uma bactéria do tipo referido, a produtividade de acetil-CoA é incrementada na bactéria, levando à produção incrementada de metabólitos úteis.
[0035] Na bactéria da presente invenção, uma ou ambas as atividades de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase ou frutose-6-fosfato fosfocetolase pode ser incrementada.
[0036] Na presente invenção, o termo “fosfocetolase” inclui ambas, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose-6-fosfato fosfocetolase.
[0037] Na presente invenção, a expressão “atividade de D-xilulose-5- fosfato fosfocetolase” significa uma atividade que catalisa a reação de conversão consumidora de fosfato de xilulose-5-fosfato a gliceraldeído-3- fosfato e acetilfosfato com a liberação concomitante de uma molécula de água. Esta atividade pode ser medida por meio do método descrito por Goldberg, M. et al (Methods Enzymol., 9, 515-520 (1966) ou L. Meile (J. Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936).
[0038] Na presente invenção, a expressão “atividade de frutose-6- fosfato fosfocetolase” significa uma atividade que catalisa a reação de conversão consumidora de fosfato de frutose-6-fosfato a eritrose-4-fosfato e acetilfosfato com a liberação concomitante de uma molécula de água. A atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase pode ser medida por meio do método descrito por Racker, E. (Methods Enzymol., 5, 276-280 (1962) ou L. Meile (J. Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936).
[0039] A atividade de fosfocetolase em bactérias que apresentam inerentemente atividade de fosfoacetolase pode ser incrementada mais do que aquela de uma cepa de tipo selvagem ou não-modificada, de preferência, não menos de 1,5 vez, mais preferivelmente não menos de 2 vezes, e, da forma mais preferível, não menos de 3 vezes de uma cepa de tipo selvagem ou não- modificada. Adicionalmente, nesta invenção, uma bactéria que, inerentemente, não apresenta atividades de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose-6-fosfato fosfocetolase pode ser usada como uma cepa parental. A atividade de fosfocetolase na bactéria que, inerentemente, não apresenta atividade de fosfocetolase, pode ser incrementada transformando-se a bactéria com um fragmento de DNA que codifica para D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase. Se uma bactéria parental inerentemente apresentar atividade de fosfocetolase ou não, pode ser medido por meio do mesmo método descrito acima.
[0040] Se a atividade de fosfocetolase foi introduzida, pode ser confirmado usando-se uma cepa defectiva para piruvato desidrogenase (PDH). Cepas defectivas para PDH são auxotróficas para acetato.Por outro lado, caso se introduza fosfocetolase, uma cepa defectiva para cepa defectiva para PDH não será mais auxotrófica para acetato. Assim, a introdução do gene que codifica fosfocetolase pode ser confirmada com base em compensação pela cepa hospedeira com base em auxotrofia de acetato. Como uma cepa defectiva para PDH, é possível usar a cepa ΔaceE como descrito nos Exemplos.
[0041] “D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase” pode ser uma enzima derivada daquelas bactérias apresentando uma atividade de D-xilulose-5- fosfato fosfocetolase, incluindo bactéria do ácido láctico, bactéria assimiladora de metanol, bactéria assimiladora de metano, bactéria de Streptococcus, e, particularmente, aquelas bactérias pertencentes aos gêneros Acetobacter, Bifidobacterium, Lactobacillus, Thiobacillus, Streptococcus, Methylococus, Butyrivibrio, Fibrobacter, e/ou levedura pertencente aos gêneros Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Pichia, Yarrowia Hansenula, Kluyveromyces Saccharomyces, Trichosporon, Wingea ou análogos.
[0042] “Frutose-6-fosfato fosfocetolase” pode ser uma enzima derivada daquelas bactérias apresentando uma atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase que pertencem aos gêneros Acetobacter, Bifidobacterium, Chlorobium, Brucella, Methylococus, Gardnerella, e/ou levedura pertencente a Rhodotorula, Candida, Saccharomyces ou análogos.
[0043] Também é possível que ambas as atividades sejam representadas por uma enzima, D-xilulose-5-fosfato/frutose-6-fosfatofosfocetolase.
[0044] A seqüência de nucleotídeos do gene xpkA codificando D- xilulose-5-fosfato fosfocetolase de Lactobacillus pentosus MD363 foi registrada no banco de dados EMBL/GenBank sob o número de acesso AJ309011 (Posthuma, C.C. et al, Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002)) e é mostrada como SEQ ID NO: 1. A seqüência de nucleotídeos do gene xpkl que codifica D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase de Lactobacillus plantarum foi registrada no banco de dados EMBL/GenBank sob o número de acesso NC_004567 região: complemento (2362936..2365302) (Kleerebezem, M., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 1990-1995 (2003)) e é mostrada como SEQ ID NO: 3. As seqüências de nucleotídeos dos genes homólogos xpk e xpk são mostrados na Tabela 1 e na Listagem de Seqüências. O alinhamento dasseqüências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 2 e 4 é mostrado na Figura 1.Tabela 1
Figure img0001
[0045] A seqüência de nucleotideos do gene xfp que codifica D- xilulose-5-fosfato/frutose-6-fosfato fosfocetolase de Bifidobacterium lactis foi registrada no banco de dados EMBL/GenBank sob o número de acesso AJ293946 (Meile, L. et al, J. Bacteriol., 183(9), 2929-36 (2001)) e é mostrada como SEQ ID NO: 5, e a seqüência de aminoácidos codificada pelo gene xfp é mostrada como SEQ ID NO: 6. As seqüências de nucleotideos dos geneshomólogos xfp e xfp são mostradas na Tabela 2 e na Listagem de Seqüências. Tabela 2
Figure img0002
[0046] Genes XpkA, xpkl, e xfp podem ser, todos, obtidos por meio de PCR (reação em cadeia de polimerase; referir a White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) usando iniciadores projetados com base na seqüência de nucleotideos dos genes conhecidos. Os genes contendo uma unidade repetitiva de fosfocetolase pode ser obtida usando pfam e motif (http://pfam.wustl.edu/, http://www.genome.jp/dbget-bin/www bget?pfam+ XFP). O gene xpkl de Lactobacillus pode ser obtido com o uso de iniciadores mostrados na SEQ ID No.7 e No. 8. O gene xfp de Bifidobacterium pode ser obtido por meio do uso dos iniciadores mostrados na SEQ ID No.11 e No.12.O gene xpkA de Lactobacillus pode ser obtido com o uso de iniciadores mostrados nas SEQ ID No. 19 e No.24.
[0047] A atividade de fosfocetolase pode ser incrementada transformando-se uma cepa parental com um DNA codificando fosfocetolase. Transformação de uma bactéria com um DNA que codifica fosfocetolase pode ser realizada por meio de métodos convencionais usando-se um DNA que codifica fosfocetolase como descrito acima.
[0048] Um DNA que codifica D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase pode ser um DNA que codifica uma variante de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase, que pode ser encontrado em diferentes cepas de bactérias, de acordo com a diversidade natural. O DNA que codifica referidas variantes pode ser obtido por meio de isolamento de um DNA que hibridiza com o gene xpkA (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou 3), ou parte do gene, nas condições estringentes, e que codifica para uma proteína apresentando a atividade de D-xilulose-5- fosfato fosfocetolase. O termo “condições estringentes” como usado aqui inclui condições sob as quais o assim-chamado híbrido é formado, e em que um híbrido não-específico não é formado. Por exemplo, condições estringentes podem incluir condições sob as quais DNAs apresentando alta homologia, por exemplo, DNAs apresentando homologia não inferior a 70% entre si, de preferência, 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, da forma mais preferível 95% ou mais, são hibridizados. Alternativamente, as condições estringentes são exemplificadas por condições que compreendem condições ordinárias de lavagem em hibridação Southern, por exemplo, 60°C, 1 x SSC, 0,1% de SDS, de preferência, 60°C, 0,1 x SSC, 0,1% de SDS. A duração da lavagem depende do tipo de membrana usada para manchamento, e, como regra, é recomendada pelo fabricante. Por exemplo, a duração de lavagem recomendada depende da membrana de nylon Hybond™ N+ (Amersham) em condições estringentes é de 15 minutos. Como uma sonda para seleção de um gene variante xpkA é possível usar uma seqüência parcial da seqüência de nucleotídeos divulgada na Tabela 1. É possível preparar uma sonda por meio de PCR usando-se oligonucleotídeos baseados na seqüência de nucleotídeos divulgada na Tabela 1 como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeos divulgada na Tabela 1 como um modelo. Quando um fragmento de DNA apresentando um comprimento de cerca de 300 bp é usado como uma sonda, é possível realizar lavagem após a hibridação nas condições a seguir: 50°C, 2 x SSC, e 0,1% de SDS pelo menos duas vezes.
[0049] Um DNA que codifica para frutose-6-fosfato fosfoletolase pode ser obtido por meio de procedimentos similares como descrito acima usando-se a seqüência de nucleotídeos divulgada na Tabela 2 como uma sonda.
[0050] E de conhecimento geral que existem alguns viéses de distribuição de códons sinônimos entre os 61 códons de aminoácidos encontrados na população de moléculas de mRNA, e o nível de tRNA cognato mostra-se diretamente proporcional à freqüente do uso de códon (ver, por exemplo, Kane, J.F., Curr. Opin.Biotechnol., 6(5), 494-500(1995)). Deste ponto de vista, é fácil predizer problemas de tradução com espécies de mRNA abundantes que contêm um excesso de códons raros de tRNA. Uma situação do tipo referido poderia originar-se após o início de transcrição de um gene heterólogo clonado em, por exemplo, o hospedeiro de E. coli. Estudos recentes sugerem que aglomerados de códons AGG/AGA, CUA, AUA, CGA ou CCC podem reduzir, tanto a qualidade como também a quantidade da proteína sintetizada. Adicionalmente, é provável que um excesso de qualquer um destes códons, mesmo sem aglomerados, poderia criar problemas de tradução. Assim, quando um DNA heterólogo que codifica para uma proteína de interesse é transferida para a bactéria, é desejável substituir códons raros por códons mais freqüentemente usados de forma a evitar estes problemas de tradução. A freqüência do uso de códon em mais de 11.000 organismos é apresentada no "banco de dados de uso de códon” (http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).
[0051] Além disso, o gene que codifica fosfocetolase da presente invenção não se limita a um gene de tipo selvagem, mas pode ser um gene mutante ou modificado artificialmente apresentando modificações nas seqüências de nucleotídeos mostradas na Tabela 1 e 2. As proteínas codificadas podem incluir substituições, deleções, ou inserções, de um ou vários radicais de aminoácidos em um ou mais posições nas seqüências de aminoácidos mostradas na Tabela 1 e 2, desde que a função da proteína fosfocetolase codificada seja mantida. Embora o número de "vários" radicais de aminoácidos referido aqui difira dependendo da posição na estrutura tridimensional ou dos tipos de radicais de aminoácidos, ele pode ser de 2 a 20, de preferência, de 2 a 10, mais preferivelmente de 2 a 5. Referidas substituições de aminoácidos incluem mutações de sentido funcionalmente neutras, e são, de preferência, mutações conservativas. No caso de aminoácidos aromáticos, substituições conservativas incluem phe, trp, e tyr intercambiavelmente entre si. No caso de aminoácidos hidrofóbicos, substituições conservativas incluem leu, ile, e vai intercambiavelmente entre si. No caso de aminoácidos polares, substituições conservativas incluem gin e asn intercambiavelmente entre si. No caso de aminoácidos básicos, substituições conservativas incluem arg, lys e his intercambiavelmente entre si. No caso de aminoácidos ácidos, substituições conservativas incluem asp e glu intercambiavelmente entre si. No caso de aminoácidos contendo grupo hidroxila, substituições conservativas incluem ser e thr intercambiavelmente entre si. As substituições conservativas também incluem substituição de ser ou thr por ala, substituição de gin, his ou lys por arg, substituição de glu, gin, lys, his ou asp por asn, substituição de asn, glu ou gin por asp, substituição de ser ou ala por cys, substituição de asn, glu, lys, his, asp ou arg por gin, substituição de gly, asn, gin, lys ou asp por glu, substituição de pro por gly, substituição de asn, lys, gin, arg ou tyr por his, substituição de leu, met, vai ou phe por ile, substituição de ile, met, vai ou phe por leu, substituição de asn, glu, gin, his ou arg por lys, substituição de ile, leu, vai ou phe por met, substituição de trp, tyr, met, ile ou leu por phe, substituição de thr ou ala por ser, substituição de ser ou ala por thr, substituição de phe ou tyr por trp, substituição de his, phe ou trp por tyr e substituição de met, ile ou leu por vai. Mutações que causam referida substituição, deleção, ou inserção de um ou vários aminoácidos como descrito acima também incluem mutações naturalmente ocorrentes provenientes de diferenças individuais, e diferenças entre espécies de microorganismos que abrigam o gene de fosfocetolase (mutante ou variante). A região a ser substituída pode ser selecionada por meio de pesquisa da região preservada (unidade repetitiva) em PKT com MOTIF e Pfam.
[0052] Referidos genes podem ser obtidos modificando-se uma seqüência de nucleotídeos mostrada na Tabela 1 ou 2, por exemplo, por meio de metagênese específica para sítio, de forma que uma ou mais substituições, deleções, ou inserções são introduzidas em um sítio específico da proteína codificada pelo gene.
[0053] Adicionalmente, referidos genes também podem ser obtidos por meio de tratamentos de metagênese convencionais, como aqueles mencionados abaixo. Exemplos de tratamentos de metagênese incluem tratar um gene apresentando uma seqüência de nucleotídeos mostrada na Tabela 1 ou 2 ou uma seqüência de nucleotídeos com números de nucleotídeos de 49 a 948 na SEQ ID NO: 1 in vitro com hidroxilamina, e tratar uma bactéria, como uma bactéria de Escherichia abrigando o gene, com irradiação de raios ultravioletas ou com um agente de metagênese usado em tratamentos de mutação típicos, como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou EMS (etil metanossulfonato).
[0054] A expressão do gene de fosfocetolase (referido a seguir como um gene pkt, incluindo gene xpk ou xfp) pode ser incrementada por meio de, por exemplo, incremento do número de cópias do gene pkt em células usando técnicas de recombinação genética. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado ligando-se um fragmento de gene contendo o gene pkt a um vetor, de preferência, um vetor de cópias múltiplas, que pode replicar-se na bactéria hospedeira, e introduzindo-se o vetor resultante na bactéria hospedeira.
[0055] Quando se usa o gene xfp de Bifidobacterium animalis, este pode ser obtido, por exemplo, por meio do método de PCR (reação em cadeia de polimerase, referir a White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) usando-se iniciadores projetados com base na seqüência de nucleotídeos do gene xfp de Bifidobacterium animalis (SEQ ID NO: 9 ou 11), por exemplo, iniciadores apresentando, cada um, uma seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou 14, e usando um DNA cromossômico de Bifidobacterium animalis como um modelo. O gene pkt de outros microorganismos também pode ser usado, e pode ser obtido de seu DNA cromossômico ou de sua biblioteca de DNA cromossômico por meio de PCR usando iniciadores de oligonucleotídeos projetados com base em uma seqüência de seu gene pkt ou uma seqüência homóloga do mesmo, ou por meio de hibridação usando uma sonda de oligonucleotídeo preparada com base em uma informação de seqüência do tipo referido como mostrado na Tabela 1 ou 2. Um DNA cromossômico a ser usado como um doador de DNA pode ser preparado como um doador de DNA a partir de um microorganismo, por exemplo, por meio do método de Saito e Miura (referir a H. Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 12, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japão, pp.97-98, Baifukan, 1992). Em seguida, o gene pkt é ligado a um DNA de vetor operável na bactéria hospedeira para preparar um DNA recombinante. De preferência,usa-se vetores replicáveis de forma autônoma na bactéria hospedeira.
[0056] Exemplos de vetores replicáveis autonomamente em Escherichia coli incluem pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG e pACYC são obteníveis da Takara Bio), RSF1010, pBR322, pMW118, pMW219 (pMW é obtenível da Nippon Gene), etc. Também é possível usar vetores de fagos, como 11059, IBF101, M13mp9.
[0057] Exemplos de vetores que são replicáveis autonomamente em bactérias Coryneform incluem pAM330 (EP 0077548B), pHM1519 (EP 0078537), pGAl (EP10977998), e pYM2 (US6,905,819).
[0058] Além disso, também é possível usar um assim-chamado vetor de transporte replicável autonomamente em Escherichia coli e bactérias Coryneform, por exemplo, pVK9, pVK7 (US2003-0175912), pSFK6 (JP2000-262288A), e pHK4 (JP5-007491A).
[0059] O pVK9 é um vetor de transporte de E. coZz-corineforme obtido por meio de excisão de um fragmento BamHI-Kpnl contendo a origem replicável de pHK4 (JP-A-5-007491) e introduzindo o mesmo no sítio Avail de pHSG299 (produto da Takara-Bio).
[0060] Com o fim de preparar um DNA recombinante por meio de ligação do gene pkt e qualquer um dos vetores mencionados acima, o vetor e um fragmento contendo o gene pkt são ligados, usualmente por meio do uso de uma ligase, como uma T4 DNA ligase.
[0061] Para introduzir um DNA recombinante preparado como descrito acima em uma bactéria, é possível empregar qualquer método de transformação de que até aqui se tem conhecimento. Por exemplo, é possível empregar um método de tratar células recipientes com cloreto de cálcio de forma a incrementar a permeabilidade do DNA, que foi reportado para Escherichia coli (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), e um método de usar células competentes preparadas a partir de células em desenvolvimento para introduzir um DNA, que foi reportado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. e Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Adicionalmente a estes métodos, é possível empregar um método de introduzir um DNA recombinante em células recipientes similares a protoplasto ou esferoplasto, que foram reportados como sendo aplicáveis a Bacillus subtilis, actinomicetos, e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)). Adicionalmente, também é possível realizar a transformação de bactérias Coryneform por meio do método de pulso elétrico (Sugimoto et al., JP2-207791 A).
[0062] O gene pkt pode ser introduzido por meio de integração de uma cópia única ou de cópias múltiplas do gene em um DNA cromossômico de uma bactéria. Adicionalmente, o número de cópias do gene pkt também pode ser incrementado integrando-se cópias múltiplas do gene em um DNA cromossômico de uma bactéria. Para integrar uma ou mais cópias do gene pkt em um DNA cromossômico de uma bactéria, é possível realizar recombinação homóloga por meio de objetivação de uma seqüência que existe em cópias múltiplas em um DNA cromossômico. É possível usar DNA repetitivo e repetições invertidas em uma ponta de um transposon como uma seqüência que existe em um DNA cromossômico em cópias múltiplas. Alternativamente, como divulgado na JP2-109985A, também é possível incorporar o gene pkt em um transposon, e permitir transferi-lo de tal forma que o gene é integrado no DNA cromossômico. Adicionalmente, o incremento da expressão gênica pode ser realizado por meio de transposição, como integração de Mu. Por exemplo, um ciclo de integração de Mu permite a introdução em um cromossomo bacteriano com até 3 cópias do gene. É possível usar transposons, como Mu, TnlO e Tn5. A integração do gene pkt no cromossomo pode ser confirmada por meio de hibridação Southern usando uma sonda apresentando uma seqüência parcial do gene pkt.
[0063] O incremento da expressão do gene pkt também pode ser obtido, quer substituindo-se uma seqüência reguladora de expressão, incluindo um promotor do gene pkt, em um DNA cromossômico ou em um plasmídeo com um mais forte, como descrito no WOOO/18935, amplificando- se um fator regulador que incrementa a expressão do gene pkt, ou deletando ou atenuando um fator regulador que reduz a expressão do gene pkt. Além disso, também é possível introduzir várias substituições de nucleotídeos em uma região promotora do gene pkt de tal forma que o promotor seja mais potente. Um método para avaliar a potência do promotor, e exemplos de promotores potentes são divulgados em Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128). Adicionalmente, como é de conhecimento geral que uma seqüência espaçadora entre o sítio de ligação de ribossoma (RBS) e códon de iniciação de tradução, particularmente, vários nucleotídeos imediatamente a montante do códon de iniciação, apresentam uma grande influência sobre a eficiência de tradução, esta seqüência pode ser modificada. Seqüências reguladoras de expressão do gene pkt podem ser identificadas usando-se um vetor para identificação de promotor ou programa de análise genética, como GENETYX.
[0064] Exemplo de referidos promotores fortes incluem o promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR, promotor pL do fago lambda, promotor tet, promotor amyE, promotor spac, etc. Um exemplo de um promotor forte para corynebacterium inclui o promotor PS2 (Appl Environ Microbiol, janeiro de 2003; 69(1 ):358-66; Mol Microbiol., julho de 1993; 9(l):97-109; WO93/03158), promotor trc, promotor tac, promotor lacUV5, promotor araBAD. A força do promotor é definida como a freqüente de atos da iniciação de síntese de RNA. Métodos para avaliar a intensidade de um promotor encontram-se descritos, por exemplo, por Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J., 5, 2987- 2994 (1986)).
[0065] A expressão do gene pkt é acentuada por meio de uma referida substituição ou modificação de um promotor. A substituição de uma seqüência reguladora de expressão também pode ser obtida, por exemplo, por meio do uso de um plasmídeo sensível a temperatura. Exemplos de um plasmídeo sensível a temperatura para bactérias Coryneform incluem p48K e pSFKT2 (JP2000-262288A), pHSC4 (referir à Publicação Divulgada da Patente Francesa n° 2667875, 1992 e JP5-7491A), pBS5T etc. Estes plasmídeos podem replicar-se autonomamente pelo menos a uma temperatura de 25°C, porém não podem replicar-se autonomamente a uma temperatura de 37°C em bactérias Coryneform. A modificação da seqüência reguladora de expressão pode ser combinada com o incremento do número de cópias do gene pkt.
[0066] O método de usar levansucrase que é letal para corynebacterium como um marcador de recombinação homóloga também é vantajoso. O gene sacB que codifica levansucrase pode ser usado para selecionar a cepa em que o vetor é deletado efetivamente do cromossomo. (Schafer, A. et al. Gene 145 (1994)69-73). E possível usar o gene sacB e gene homólogo de sacB descrito abaixo. Bacillus subillus: sacB número de acesso GenBank X02730 (SEQ ID NO:40) Bacillus amyloliqufaciens: sacB número de acesso GenBank X52988 Zymomonas mobilis: sacB número de acesso GenBank L33402 Bacillus stearothermophilus'. surB número de acesso GenBank U34874 Lactobacillus sanfranciscensis: frfA número de acesso GenBank AJ508391 Acetobacter xylinus: IsxA número de acesso GenBank AB034152 Gluconacetobacter diazotrophicus: IsdA número de acesso GenBankL41732
[0067] Preparação de DNA de plasmídeo, digestão e ligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador e análogos podem ser realizados por meio de métodos ordinários bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Referidos métodos são descritos, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E.F., e Maniatis, T., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
[0068] As bactérias da presente invenção incluem não só uma bactéria que não apresenta inerentemente uma atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose-6-fosfato fosfocetolase, mas também uma bactéria que apresenta inerentemente uma atividade destas proteínas e que foi modificada de tal forma que a atividade é incrementada. De preferência, usa-se a primeira.
[0069] Exemplos específicos da bactéria usada na presente invenção incluem bactérias pertencentes à família Enlerohacleriaceae, como o gênero Escherichia, Pantoea, bactéria Coryneform, como Corynebacterium glutamicum, bactéria Bacillus, como Bacillus subtilis, etc. No entanto, a bactéria da presente invenção não é limitada a estes exemplos.
[0070] A família de Enterobacteriaceae inclui bactérias pertencentes aos gêneros Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella etc. Particularmente, E possível usar aqueles classificados nas Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l &unlock). Prefere-se uma bactéria pertencente ao gênero de Escherichia ou Pantoea.
[0071] É possível usar bactérias Escherichia reportadas em Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabela 1), como Escherichia coli. Exemplos de cepas de tipo selvagem de Escherichia coli incluem, embora sem limitação, a cepa K12 e derivados da mesma, cepa MG1655 (ATCC n° 47076), e cepa W3110 (ATCC n° 27325). Estas cepas encontram-se disponíveis junto à American Type Culture Collection (ATCC, endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América).
[0072] O termo “uma bactéria pertencente ao gênero Pantoea” significa que a bactéria é classificada como o gênero Pantoea de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na técnica da microbiologia, e também inclui algumas espécies de Enterobacter agglomerans recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou análogos, baseado na análise de seqüências de nucleotídeos de rRNA 16S etc.
[0073] Na presente invenção, bactérias Coryneform incluem bactérias classificadas como bactéria Coryneform de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na técnica da microbiologia, bactérias que foram classificadas até aqui no gênero Brevibacterium, mas que foram agora reclassificadas no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)), e também bactérias pertencentes ao gênero Brevibacterium, que é um parente próximo do gênero Corynebacterium. Exemplos de referidas bactérias Coryneform encontram-se listados abaixo. Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corynebacterium ammoniagenes Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbactéria ammoniaphilum Particularmente compreende-se as seguintes cepas: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium aceto glut amicum ATCC 15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, 13032, 13060 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP- 1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum (Corynebacteriumglutamicum) ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium sac char olyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872 Brevibacterium album ATCC 15111 Brevibacterium cerium ATCC 15112 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
[0074] Estas cepas podem ser obtidas, por exemplo, da American Type Culture Collection (ATCC, endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Cada cepa recebe um número de registro, e é possível requisitar uma provisão de cada cepa por seu número de registro. O número de registro para cada cepa é indicado no catálogo da American Type Culture Collection. A cepa AJ12340 foi depositada em 27 de outubro de 1987 no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, a agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba- shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-5466)) sob as disposições do Tratado de Budapeste, e receberam um número de acesso de FERM BP-1539. A cepa AJ12418 foi depositada em 5 de janeiro de 1989 no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry sob as disposições do Tratado de Budapeste e receberam um número de acesso de FERM BP- 2205.
[0075] O termo “bactéria Bacillus” meio que a bactéria classificada como o gênero Bacillus de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na técnica da microbiologia. Na presente invenção, a bactéria Bacillus inclui, embora sem limitação, a cepa de Bacillus subtilis 168 Marburg (ATCC 6051/ cepa de Bacillus subtilis PY79 (Plasmid, 1984, 12, 1 - 9) etc, e exemplos de Bacillus amyloliquefaciens incluem, embora sem limitação, cepa de Bacillus amyloliquefaciens T (ATCC 23842/ cepa de Bacillus amyloliquefaciens N (ATCC 23845) etc.
[0076] A bactéria da presente invenção pode ser obtida por meio de introdução do DNA previamente indicado (gene pkt) em uma bactéria que já apresenta uma capacidade de produzir um metabólito útil. Alternativamente, a bactéria da presente invenção pode ser obtida conferindo-se a capacidade de produzir um metabólito útil para a bactéria em que o gene pkt foi introduzido. Neste último caso, a introdução do gene pkt e a conferência da capacidade de produzir o metabólito útil pode ser realizada em qualquer ordem.
[0077] A expressão “uma bactéria apresentando uma capacidade de produzir um metabólito útil" significa uma bactéria, que não apresenta uma capacidade de produzir e causar acúmulo do metabólito útil em um meio quando a bactéria da presente invenção é cultivada no meio. A capacidade de produzir o metabólito pode ser conferida ou incrementada por meio de desenvolvimento, incluindo tratamento com metagênese e modificação genética.A expressão “bactéria apresenta capacidade de produzir metabólito útil” meio que a bactéria é capaz de produzir e causar acúmulo do metabólito em um meio numa quantidade maior do que a cepa de tipo selvagem ou a cepa não-mutada. A expressão “bactéria apresenta capacidade de produzir um metabólito útil” como usada aqui também significa uma bactéria que é capaz de produzir e causar acúmulo em um meio com uma quantidade não inferior a 0,5 g/1, mais preferivelmente não inferior a 1,0 g/1 do metabólito-alvo.
[0078] A expressão “metabólito útil" significa um metabólito primário, como um L-aminoácido, ácido orgânico, vitamina, sacarídeo e/ou intermediário de Embden-Meyerhof, vias de fosfato de pentose (pentose-P), via de Entner-Doudoroff, ciclo do citrato, e biossíntese de aminoácido. O aminoácido L a ser produzido na presente invenção não é particularmente limitado, e inclui L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-citrulina, L- isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina, e L-glicina, L-treonina, L-serina, L-prolina, L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano, L-cisteína, L-cistina, L- metionina, L-ornitina, ácido L-glutâmico, ácido L-aspártico, L-glutamina, e L-asparagina. Mais preferivelmente, a bactéria da presente invenção é uma bactéria apresentando uma capacidade de produzir um metabólito derivado de acetil-CoA. Um metabólito do tipo referido é selecionado do grupo que consiste de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, L-cisteína, succinato, e poli-hidroxibutirato.
[0079] Daqui em diante, exemplos de cepas dotadas de uma capacidade de produzir metabólitos úteis e métodos de conferir referida capacidade serão explicados em detalhe.
[0080] Daqui em diante, serão explicados métodos de conferir uma capacidade de produzir metabólitos úteis para uma cepa parental como mencionado acima.
[0081] Para conferir uma capacidade de produzir metabólitos úteis, é possível usar métodos usados convencionalmente para desenvolvimento de bactérias produtoras de metabólitos úteis pertencentes ao gênero Escherichia ou bactéria Coryneform, etc. Por exemplo, métodos para obter uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente análoga, ou cepa mutante de regulação metabólica apresentando uma capacidade de produzir metabólitos úteis, e métodos para criar uma cepa recombinante apresentando atividade incrementada de uma enzima biossintética de metabólitos úteis (“Fermentação de aminoácidos”, a Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], Ia edição, publicada em 30 de maio de 1986, pp. 77-100). Quando se desenvolvimento de bactérias produtoras de metabólitos úteis usando estes métodos, é possível conferir uma ou mais propriedades, incluindo auxotrofia, resistência a análogos, e mutação de regulação metabólica.
[0082] Quando se cria uma cepa recombinante, é possível incrementar a atividade de enzimas biossintéticas de metabólitos úteis simples ou múltiplos. Adicionalmente, métodos que conferem propriedades de auxotrofia, resistência a análogos, e mutação de regulação metabólica, podem ser combinados com métodos para incrementar uma atividade de uma enzima biossintética de metabólito útil.
[0083] Uma cepa mutante auxotrófica, metabólitos úteis, como uma cepa resistente a análogo de aminoácido L, ou cepa mutada com regulação metabólica apresentando uma capacidade produtora de metabólito útil pode ser obtida submetendo-se uma cepa parental ou de tipo selvagem a um tratamento típico de metagênese, como irradiação de raios-X ou ultravioleta, tratamento com um agente de metagênese, como N-metil-N’-nitro-N- nitrosoguanidina (NTG). Em seguida, é possível selecionar das cepas mutadas uma cepa auxotrófica, cepa resistente a análogo ou cepa mutante de regulação metabólica que apresenta uma capacidade de produzir metabólitos úteis pode ser selecionada das cepas mutadas.
[0084] Métodos de conferir Capacidade de produzir ácido L- glutâmico às bactérias como descrito acima incluem, por exemplo, modificar as bactérias de tal forma que a expressão de um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de ácido L-glutâmico é incrementada e/ou superexpressa. Exemplos de enzimas envolvidas na biossíntese de ácido L- glutâmico incluem glutamato desidrogenase (também referida a seguir como “GDH”), glutamina sintetase, glutamato sintase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase (também referida a seguir como “CS”), fosfoenolpiruvato carboxilase (também referida a seguir como “PEPC”), piruvato carboxilase, piruvato desidrogenase, piruvato quinase, fosfoenolpiruvato sintase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato quinase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, frutose bisfosfato aldolase, fosfofrutoquinase, glucose fosfato isomerase, etc. Destas enzimas, é preferível que a atividade de um ou mais de CS, PEPC, e GDH seja incrementada, e é mais preferível que as atividades de todas estas três enzimas sejam incrementadas.
[0085] Exemplos de bactérias modificadas por meio do método como descrito acima para que a expressão do gene CS, gene PEPC e/ou gene GDH seja incrementada incluem as bactérias divulgadas em US6,197,559, US6,331,419, e Publicações de Patentes Européias n° 0999282 e n° 1078989.
[0086] A modificação de uma bactéria para conferir capacidade de produzir ácido L-glutâmico pode ser realizada reduzindo-se ou inativando-se a atividade de uma enzima que catalisa uma reação que ramifica da via biossintética do ácido L-glutâmico, e produzindo um composto diferente de ácido L-glutâmico. Exemplos de enzimas que catalisam uma reação que ramifica da via biossintética do ácido L-glutâmico e produzindo um composto diferente de ácido L-glutâmico incluem 2-oxoglutarato desidrogenase, isocitrato liase, glutamato descarboxilase, 1-pirrolina desidrogenase, etc. Destas enzimas, é preferível reduzir ou eliminar a atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase.
[0087] Para reduzir ou inativar as atividades das enzimas previamente indicadas, é possível introduzir mutações para reduzir ou inativar atividades intracelulares das enzimas por meio de tratamento usual de metagênese ou por meio de manipulação genética. Exemplos de tratamento de metagênese incluem irradiação com raios-X ou raios ultravioletas, tratamento com um agente de metagênese, como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, etc. Exemplos de métodos para reduzir ou eliminar a atividade intracelular de uma enzima incluem mutar ou deletar um gene que codifica a enzima em células de um microorganismo de tal forma a reduzir ou eliminar a atividade intracelular em comparação com uma cepa não-mutada. Exemplos de métodos para mutar ou deletar um gene incluem modificação de seqüências reguladoras de expressão, como seqüências promotoras e seqüências de Shine-Dalgarno (SD), introdução de mutações sem sentido, mutações não- sentido, ou mutações de desvio de matriz, em uma matriz de leitura aberta, e deleção de uma porção do gene (./. Biol. Chem. 1997 272(13):8611 -7). É possível introduzir um gene mutado em um microorganismo por meio do uso de uma técnica de recombinante homóloga em que um gene de tipo selvagem em um cromossomo é substituído pelo gene mutado, ou por meio do uso de um transposon ou fator IS. Técnicas de recombinação homóloga incluem métodos usando DNA linear, um plasmídeo sensível a temperatura, e plasmídeo não-replicável. Estes métodos encontram-se descritos em Proc Natl Acad Sei U S A. Junho de 20006; 97(12):6640-5, Patente dos Estados Unidos n° 6303383, JP05-007491 A, e análogos.
[0088] A atividade intracelular da enzima-alvo e o grau de diminuição na atividade podem ser confirmadas medindo-se a atividade de enzima usando um extrato de células ou uma fração purificada do mesmo obtida de uma cepa candidata, e comparando-se a mesma com uma cepa candidata e comparando- se com a atividade de uma cepa de tipo selvagem ou não-modificada. Por exemplo, a atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase pode ser medida por meio do método de Reed et al. (Reed L.J. e Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, pp. 55-61, 1969). Exemplos de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia com deficiência de α-cetoglutarato desidrogenase ou apresentando reduzida atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e métodos para obter as mesmas encontram-se descritos nas Patentes dos Estados Unidos nums. 5,378,616 e 5,573,945. Especificamente, estas cepas incluem as seguintes: E. co li W3110sucA::Kmr E. coli AJ12624 (FERM BP-3853) E. coli AJ12628 (FERM BP-3854) E. coli AJ 12949 (FERM BP-4881)
[0089] E. coli W3110sucA::Kmr foi obtida disrompendo-se o gene de α-cetoglutarato desidrogenase (referido a seguir como “gene swcA”) em E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente de α-cetoglutarato desidrogenase.
[0090] Bactérias Corineformes em que gene sucA é rompido usando recombinação homóloga são explicadas detalhadamente no WO95/34672 e na Patente dos Estados Unidos n° 5,977,331.
[0091] Outros exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem aquelas que pertencem ao gênero Escherichia e que apresentam resistência a um antimetabólito de ácido aspártico. Estas cepas também podem ser deficientes de atividade de ácido alfa-cetoglutárico desidrogenase e incluem, por exemplo, cepa AF13199 (FERM BP-5807) (Patente dos Estados Unidos n° 5,908,768), ou cepa FFRM P-12379, que é modificada adicionalmente de forma a apresentar uma menor capacidade de decomposição de ácido L-glutâmico (Patente dos Estados Unidos n° 5,393,671); E. coli cepa AJ13138 (FERM BP-5565) (Patente dos Estados Unidos n° 6,110,714) e análogos.
[0092] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico pertencentes ao gênero Pantoea, incluem cepa mutantes com deficiência de a- cetoglutarato desidrogenase atividade ou com atividade diminuída de a- cetoglutarato desidrogenase, e podem ser obtidos como descrito acima. Referidas cepas incluem Pantoea ananatis AJ13356 ou AJ13601 (Patente dos Estados Unidos n° 6,331,419). Pantoea ananatis AJ 13356 foi depositado no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science e Technology, Ministry of International Trade e Industry (correntemente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 19 de fevereiro 1998 e receberam um número de acesso de FERM P-16645. Isto foi convertido então a um depósito internacional nas condições do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6615. Pantoea ananatis AJ13601 foi depositado no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 18 de agosto de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM P-17516. Em seguida, isto foi convertido a um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 6 de julho de 2000 e recebeu um número de acesso de FERM BP-7207. As cepas de Pantoea ananatis AJ13356 e AJ13601 apresentam deficiência de atividade de a-KGDH como um resultado do rompimento do gene que codifica a subunidade El de aKGDH (gene sucA). As cepas acima foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando elas foram isoladas e depositadas como as cepas de Enterobacter agglomerans AJ13356, e AJ13601, respectivamente. No entanto, eles foram recentemente reclassificados como Pantoea ananatis com base no seqüenciamento de nucleotídeos de rRNA 16S etc. Embora, AJ 13356, AJ 13601 e sua cepa parental, AJ13355 (FERM BP-6614), foram, todas, depositadas no depositório previamente indicado como Enterobacter agglomerans, sendo descritas como Pantoea ananatis para os fins desta descrição.
[0093] Exemplos adicionais de bactérias Coryneform apresentando capacidade de produzir ácido L-glutâmico incluem um mutante resistente a análogo de ácido orgânico, e mutante resistente a escletina (JP56-1889A, JP56140895A, JP5702689A, JP88994A).
[0094] Exemplos de bactérias Coryneform produtoras de ácido L- glutâmico resistentes a análogo incluem as seguintes cepas:Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM P-5007, JP56-1889A) Brevibacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-P-5020, JP56-1889A)Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318, JP57-2689A) Brevibacterium flavum AJ11218 (FERM-P 4319, JP57-2689A) Brevibacterium flavum AJ11564 (FERM P-5472, JP56-140895A) Brevibacterium flavum AJ11439 (FERM P-5316, JP56-35981A) Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004, JP56- 151495A)
[0095] Exemplos de bactérias produtoras de L-glutamina que podem ser usadas como uma cepa parental a ser modificada para apresentar atividade incrementada de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase incluem uma bactéria Coryneform produtora de L-glutamina que é modificada para apresentar atividade incrementada de glutamato desidrorogenase, atividade de glutamina sintetase (EP 1229121 A), ou para apresentar atividade de glutaminase (EP 1424397A). Da mesma forma, é possível usar uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia e que abriga uma glutamina sintetase mutante em que o radical de aminoácido tirosina correspondente à posição 397 em uma glutamina sintetase de tipo selvagem é substituído por qualquer radical de aminoácido.
[0096] Método de conferir resistência a 6-diazo-5-oxo-norleucina (JP3-232497A), resistência a análogos de purina, resistência a sulfóxido de metionina (JP 61-202694A), região de resistência ao ácido a-cetomalínico (JP56-151495) pode ser usado para conferir ou incrementar a capacidade de produção de L-glutamina por meio de desenvolvimento. Exemplos específicos de bactérias Coryneform apresentando capacidade de produção de L-glutamina incluem, embora sem limitação:Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492, JP56-161495A) Brevibacterium flavum AJ11576 (FERMBP-10381, JP56-161495A) Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, JP61-202694A)
[0097] Exemplos de bactérias produtoras de L-prolina úteis como uma cepa parental a ser modificada para apresentar atividade incrementada de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase incluem uma bactéria produtora de L-prolina pertencente ao gênero Escherichia que abriga y-glutamila quinase des sensibilizada em inibição de feedback com L-prolina, e/ou em que o sistema de degradação de L-prolina é destruído. Um método para desenvolvimento de a bactéria apresentando y- glutamila quinase des sensibilizada com relação a inibição de feedback por meio de L-prolina é exemplificado com introdução de um DNA que codifica para y-glutamila quinase dessensibilizada com relação a inibição de feedback por meio de L-prolina em células (Dandekar, A.M., Uratsu, S.L., J. Bacterial., 170, 12, 5943-5 (1988)). Um método para destruir o sistema de degradação de L-prolina é exemplificado por meio da introdução de uma mutação em um gene de prolina desidrogenase para que a prolina desidrogenase ativa não seja expressa. Também, uma bactéria em que o sistema de degradação de L- prolina é destruído pode ser obtido por meio de obtenção de uma cepa com deficiência de capacidade de assimilação de L-prolina e seleção de uma cepa que superproduz L-prolina extracelularmente por meio do uso de auxotrofia de L-prolina como um índice. As bactérias produtoras de L-prolina pertencentes ao gênero Escherichia incluem cepas de E. coli NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente britânica GB 2075056), VKPM B-8012 (Publicação Divulgada de Patente dos Estados Unidos n° 2002-0058315), e mutantes de plasmídeo descritos na patente DE 3127361, mutantes de plasmídeo descritos por Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) e análogos podem ser usadas para obter referidas cepas.
[0098] Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina que podem ser usados como uma cepa parental a ser modificada para apresentar atividade incrementada de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase incluem bactérias produtoras de L-arginina pertencentes ao gênero Escherichia, por exemplo, E. coli cepa 237 (VKPM B-7925) e suas cepas derivadas apresentando N-acetilglutamato mutante (Publicação Divulgada de Patente dos Estados Unidos n° 2002-0034793), uma cepa produtora de arginina em que se introduz um gene argA que codifica N- acetilglutamato sintetase (JP57-5693A) e análogos.
[0099] Outros exemplos de uma bactéria produtora de L-arginina é uma cepa que apresenta genes amplificados codificando para enzimas biossintéticas de L-arginina, como N-acetilglutamato sintase (argA), N- acetilglutamila fosfato redutase (argC), ornitina acetiltransferase (argJ), N- acetilglutamato quinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), acetilornitina deacetilase (argE), ornitina carbamoiltransferase (argF), argininossuccinato sintase (argG), argininossuccinato liase (argH), e carbamoil-fosfato sintase (carAB). Os nomes dos genes que codificam estas enzimas são dados em parênteses após os nomes das enzimas, respectivamente.
[00100] Exemplos de bactéria produtora de L-leucina que podem ser usados como uma cepa parental a ser modificada para apresentar atividade incrementada de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase incluem as bactérias produtoras de L-leucina pertencentes ao gênero Escherichia, como E. coli cepas H-9068 (ATCC 21530), H-9070 (FERM BP-4704) e H-9072 (FERM BP-4706) resistentes a 4-azaleucina ou 5,5,5-trifluoroleucina (Patente dos Estados Unidos n° 5,744,331), cepas de E. coli em que a inibição de feedback de isopropilmalato sintase por meio de L- leucina é dessensibilizada (EP1067191B), cepa de E. coli AJ11478 resistente a β-2-tienilalanina e β-hidroxileucina (Patente dos Estados Unidos n° 5,763,231), cepa 57 de E. coli (VKPM B-7386, patente Russa n° 2140450), e análogos.
[00101] Exemplos de bactérias produtoras de L-cisteína que podem ser usadas como uma cepa parental a ser modificada para apresentar atividade incrementada de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase incluem as bactérias produtoras de L-cisteína pertencentes ao gênero Escherichia, como a cepa de E. coli JM15 que é transformada com diferentes alelos de cysE codificando para serina acetiltransferases resistentes a feedback (Patente dos Estados Unidos n° 6,218,168); E. coli cepa W3110 superexpressando um gene que codifica uma proteína vantajosa para secretar substâncias citotóxicas (Patente dos Estados Unidos n° 5,972,663); cepas de E. coli apresentando atividade diminuída de cisteína dessulfoidrase (JP11- 155571A2); E. coli cepa W3110 usando atividade incrementada de regulador transcricional positivo para régulon de cisteína codificado pelo gene cysB (W001/27307A1) e análogos.
[00102] Exemplos de bactérias produtoras de succinato que podem ser usadas como uma cepa parental a ser modificada para apresentar atividade incrementada de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase incluem as bactérias produtoras de succinato pertencentes ao gêneros de bactérias Escherichia e Coryneform, como Brevibacterium flavum cepa MJ233Δldh (JP11-206385A), e Brevibacterium flavum cepa MJ233/pPCPYC (WOOl/27258).
[00103] Exemplos de uma bactéria produtora de L-lisina que podem ser usados como uma cepa parental a ser modificada para apresentar atividade incrementada de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase incluem mutantes de cepa resistentes a S-(2-aminoetil)cisteína (a seguir “AEC”) de Brevibacterium lactofermentum AJ 11082 (NRRL B- 11470) (descrito em JP56-1914B, JP56-1915B, JP57-14157B, JP57-14158B, JP57-30474B, JP58-10075B, JP59-4993B, JP61-35840B, JP62-24074B, JP62-36673B, JP5-11958B, JP7-112437B e JP7-112438B), cepas mutantes auxotróficas para um aminoácido, como L-homosserina (JP48-28078B e JP56-6499B), cepas mutantes resistentes a AEC e auxotróficas para um aminoácido, como L-leucina, L-homosserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina, e L-valina (Patentes dos Estados Unidos nums. 3,708,395 e 3,825,472), cepas mutantes produtoras de L-lisina resistentes a DL-a-amino- ε-caprolactama, α-amino-lauril-lactama, análogo de ácido aspártico, droga sulfa, quinóide, e N-lauroil-leucina, cepas mutantes produtoras de L-lisina resistentes a inibidor de oxaloacetato descarboxilase ou um inibidor de enzima do trato respiratório (JP50-53588A, JP50-31093A, JP52-102498A, JP53-9394A, JP53-86089A, JP55-9783A, JP55-9759A, JP56-32995A, JP56- 39778A, JP53-43591B e JP53-1833B), cepas mutantes produtoras de L-lisina auxotróficas para inositol ou ácido acético (JP55-9784A e JP56-8692A), cepas mutantes produtoras de L-lisina que são suscetíveis a ácido fluoropirúvico a uma temperatura de 34°C ou maior (JP55-9783A e JP53- 86090A), cepas mutantes produtoras de L-lisina de bactérias Brevibacterium ou Corynebacterium resistentes a etileno glicol (Patente dos Estados Unidos n° 4,411,997), etc.
[00104] Exemplos adicionais de bactérias produtoras de L-lisina que podem ser usadas como uma cepa parental a ser modificada para apresentar atividade incrementada de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6- fosfato fosfocetolase incluem cepas mutantes resistentes a S-(2- aminoetil)cisteína (a seguir “AEC”) de Escherichia coli WC196 (WO96/17930). A cepa WC196 foi denominada Escherichia coli AJ13069, e depositada na agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, Japão, código postal: 305-8566) em 6 de dezembro de 1994 e recebeu um número de acesso de FERM P-14690. Em seguida, o depósito foi convertido a um depósito internacional nas condições do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995, e recebeu um número de acesso de FERM BP-5252.
[00105] Exemplos de microorganismos apresentando uma capacidade produtora de L-treonina incluem um mutante resistente a 6- dimetilaminopurina (JP5-304969A), uma cepa em que um gene para uma enzima biossintética de treonina apresentando uma mutação que incrementa a atividade enzimática é amplificada com um plasmídeo (JP1-29559B, JPO5- 227977A), uma cepa em que o operon de treonina é amplificado com um plasmídeo (JP2-109985A), uma cepa em que um gene que codifica piruvato carboxilase e um gene que codifica transidrogenase de nucleotídeo de nicotinamida são exemplificados (JP2002-51787A), etc.
[00106] A cepa de Escherichia coli VKPM B-3996 (Patente dos Estados Unidos n° 5,175,107) também pode ser usada como uma cepa produtora de L-treonina. VKPM B-3996 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika com um número de registro de VKPM B-3996 em 19 de novembro de 1987. A cepa VKPM B-3996 abriga plasmídeo pVIC40 (Publicação de Patente Internacional W090/04636), que é obtida inserindo-se um operon de treonina (thrABC) no plasmídeo pAYC32 que apresenta um gene marcador de resistência à estreptomicina (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167).Aspartoquinase I-homoserina desidrogenase I codificada por um gene thrA mutante contido no pVIC40 é liberada da inibição de feedback por meio de L-treonina.
[00107] A cepa de Escherichia coli VKPM B-5318 (EP 0593792B) também pode ser usada como uma cepa produtora de L-treonina. VKPM B- 5318 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika com um número de registro de VKPM B-5318 em 19 de novembro de 1987. A cepa VKPM B-5318 cepa é auxotrófica para L-isoleucina, e o operon de treonina que codifica a enzima de biossíntese de treonina está localizada a jusante do repressor sensível a temperatura Cl, o promotor PR e a ponta N-terminal da proteína Cro derivada de Xfago. Além disso, esta cepa contém DNA de plasmídeo foi construída de forma que a expressão do gene de biossíntese de treonina é regulada pelo promotor e repressor de kfago.
[00108] Adicionalmente, a cepa de Escherichia coli MG442 (US4,278,765) também pode ser usada como uma cepa produtora de L- treonina. A cepa MG442 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) como CMIMB-1628.
[00109] Exemplos de bactéria Escherichia apresentando uma capacidade de produzir L-fenilalanina incluem Escherichia coli AJ 12739 (tyrA::Tnl0, TyrR; VKPM B-8197) em que os genes tyrA e tyrR são rompidos, Escherichia coli HW1089 em que um pheA mutado foi introduzido (Patente dos Estados Unidos n° 5,354,672), e uma cepa de Escherichia coli em que os genes yddG e yedA foram amplificados (WO 03/044192). Exemplos de bactérias Coryneform apresentando uma capacidade de produzir L-fenilalanina incluem uma cepa que é auxotrófica para tirosina e resistente a L-fenilalanil-L-tiro sina (JP5-49489A).
[00110] Bactérias apresentando uma capacidade de produzir L- triptofano podem ser obtidas incrementando-se as atividades das enzimas biossintéticas de L-triptofano incluindo fosfoglicerato desidrogenase e antranilato sintase.Estas enzimas podem ser resistentes à inibição de feedback por L-triptofano ou L-serina. Por exemplo, uma bactéria apresentando estas enzimas resistentes a feedback podem ser obtidas introduzindo-se plasmídeo pGH5, que contém um gene ser A mutante codificando Fosfoglicerato desidrogenase resistente a L-triptofano na cepa SV164 de Escherichia coli que abriga um gene que codifica antranilato sintase resistente a L-serina (W094/08031).
[00111] Bactérias apresentando uma capacidade de produzir L- triptofano também podem ser obtidas incrementando-se as atividades de enzimas biossintéticas de L-triptofano codificadas pelo operon de triptofano.Referidas enzimas no operon de L-triptofano incluem triptofano sintase e antranilato sintase.Exemplos destas bactérias incluem uma cepa de Escherichia coli em que o operon de triptofano contendo um gene que codifica antranilato sintase de L-serina é introduzido (JP57-71397A, JP62- 244382A, e Patente dos Estados Unidos n° 4,371,614).
[00112] Adicionalmente, exemplos de bactérias apresentando uma capacidade de produzir L-triptofano incluem Escherichia coli AGX17(pGX44) (NRRL B-12263) que é auxotrófica para L-fenilalanina e L- tirosina, e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) que abriga plasmídeo pGX50 contendo o operon de triptofano (Patente dos Estados Unidos n° 4,371,614).
[00113] Exemplos de bactérias de Escherichia apresentando uma capacidade de produzir L-isoleucina incluem uma cepa mutante resistente a 6- dimetilaminopurina (JP5-304969A), uma cepa mutante resistente a L- isoleucina hidroxamato, tiaisoleucina, DL-etionina ou arginina hidroxamato (JP5-130882A), e uma cepa recombinante em que um gene que codifica treonina desaminase e ácido acetoidroxílico sintase foi amplificado com um plasmídeo (JP2-458A, JP2-42988A e JP8-47397A).
[00114] Bactérias apresentando uma capacidade de produzir L-valina podem ser obtidas incrementando-se atividades de enzimas biossintéticas de L-valina incluindo aquelas codificadas pelo operon ilvGMEDA, particularmente aceto-hidroxilato sintase codificada pelo gene ilvG (JP02- 748418B).Estas enzimas podem ser resistentes à inibição de feedback por L- valina.
[00115] Bactérias apresentando uma capacidade de produzir L-valina incluem aqueles que apresentam expressão diminuída do gene de acetolactato sintase III (gene ilvIH).
[00116] Bactérias apresentando uma capacidade de produzir L-valina podem ser resistentes a análogos de aminoácido. Exemplos de referidas bactérias incluem uma cepa mutante que é auxotrófica para L-isoleucina e L- metionina e é resistente a D-ribose, nucleosídeo de purina, ou ribonucleosídeo de pirimidina (FERM P-1841, P-5556; JP53-025034A), e uma cepa mutanteresistente a policetonóide (FERM P-9325; JP04-045314B).
[00117] Exemplos de bactérias apresentando uma capacidade de produzir L-alanina incluem uma cepa de bactéria Coryneform que apresenta deficiência de atividade de H+-ATPase (Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov;57(4):534-40) ou uma cepa de bactéria Coryneform em que o gene de ácido aspártico β-descarboxilase é amplificado (JP07-163383A).
[00118] Adicionalmente, é preferível que a bactéria da presente invenção seja modificada adicionalmente para apresentar reduzida atividade de 6-fosfofrutoquinase.A atividade de 6-fosfofrutoquinase pode ser medida por meio do método descrito, por exemplo, por Denise Kotlars e Henri Buc (Methods in Enzymology (1982) 90: 60-70). A atividade de 6- fosfofmtoquinase na bactéria da presente invenção é menos reduzida em comparação com a de uma cepa de tipo selvagem ou não-modificada, de preferência, menos de 90%, mais preferivelmente menos de 70%, e da forma mais preferível, não inferior a 50% de uma cepa de tipo selvagem ou não- modificada. A atividade de 6-fosfofrutoquinase pode ser reduzida mutando-se ou rompendo-se um gene que codifica esta enzima, sendo que referido método pode ser similar ao método usado para reduzir a atividade de a- cetoglutarato desidrogenase.
[00119] Na presente invenção, é possível produzir metabólitos úteis por meio de cultivo das bactérias mencionadas acima em um meio de cultura, permitindo acúmulo do metabólito útil no meio de cultura e/ou nas células bacterianas, e coletando-se referido metabólito útil do meio de cultura e/ou células bacterianas.
[00120] Cultura, coleta, e purificação de metabólitos úteis do meio, podem ser realizadas por meio de métodos de fermentação convencional em que um metabólito útil é produzido usando-se uma bactéria. O meio de cultura pode ser sintético ou natural, desde que o meio contenha uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e minerais, e, se necessário, quantidades apropriadas de nutrientes que a bactéria requer para crescer. A fonte de carbono inclui vários carboidratos, como glucose e sacarose, e vários ácidos orgânicos. Dependendo do modo de assimilação da bactéria selecionada, é possível usar álcool, incluindo etanol e glicerol. Como a fonte de nitrogênio, é possível usar amónia, sulfato de amónio, outros compostos de nitrogênio, como aminas, uma fonte de nitrogênio natural, como peptona, hidrolisado de soja e microorganismos fermentativos digeridos. Como minerais, é possível usar monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, e análogos. Nesta invenção, é mais desejável adicionar cloridrato de tiamina (vitamina Bl) no meio de cultura. A concentração de cloridrato de tiamina é acima de 10 pg/1, de preferência, acima de 10 mg/1, mais preferivelmente inferior a 100 mg/1.
[00121] A cultura é realizada, de preferência, em condições aeróbicas, como uma cultura agitada, e agitação da cultura com aeração, a uma temperatura de 20 a 42°C, de preferência, de 37 a 40°C. O pH do meio de cultura situa-se usualmente entre 5 e 9, de preferência, entre 6,5 e 7,2. O pH do meio de cultura pode ser ajustado com amónia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, e tamponadores. Usualmente, uma cultura de 1 a 5 dias é suficiente para o acúmulo do metabólito útil-alvo no meio líquido.
[00122] Após a cultura, é possível remover sólidos, como células, do meio líquido por meio de centrifugação ou filtração por membrana, e, depois, o metabólito útil-alvo pode ser coletado e purificado por meio de métodos de troca de íon, concentração, e cristalização, etc.
Exemplos
[00123] A presente invenção será explicada mais especificamente abaixo com referência aos Exemplos não-limitantes a seguir. Abreviaturas: Pyr - piruvato, PEP - fosfoenolpiruvato, GA-3P - gliceraldeídos-3-fosfato, AceCoA - acetil-CoA.
[00124] Rendimento em peso teórico (Y) é calculado comoY = (peso molecular do produto x moles) / (peso molecular do substrato x moles).
[00125] Equações são simplificadas e mostram apenas compostos de carbono e moléculas de energia.
Exemplo 1. Cálculo da formação de acetil-CoA por bactéria com ou sem atividades de fosfocetolases.
[00126] 1.Reações da via biossintética de acetil-CoA que não envolveatividades de fosfocetolases.
[00127] Sistema PTS seguido de glicólise dá a seguinte equação:Glucose = PEP + Pyr +ATP +2 NADH
[00128] Fosfoenolpiruvato carboxilase codificada por gene ppc catalisa a seguinte reação:PEP + CO2 = oxaloacetato
[00129] Piruvato desidrogenase codificada por gene pdh catalisa a seguinte reação:Pyr = acetil-CoA + CO2 + NADH
[00130] E equação final é:Glucose = acetil-CoA + oxaloacetato + ATP + 3 NADH (A)
[00131] 2. Reações de via biossintética de acetil-CoA que envolveatividades de fosfocetolases.
[00132] Sistema PTS seguido de glicólise dá a seguinte equação:Glucose + PEP = frutose-6-fosfato + Pyr
[00133] Fosfoenolpiruvato sintase catalisa a seguinte reação:Pyr + ATP = PEP
[00134] Fosfoenolpiruvato carboxilase codificada por gene ppc catalisa a seguinte reação:PEP + CO2 = oxaloacetato
[00135] Frutose-6-fosfato fosfocetolase:Fosfato + frutose-6-fosfato = H2O + eritrose-4-fosfato + acetil  fosfato
[00136] Transaldolase e transcetolase:frutose-6-fosfato + eritrose-4-fosfato = 2 xilulose-5-fosfato
[00137] D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase:Fosfato + xilulose-5-fosfato = gliceraldeído-3-fosfato + acetil fosfato
[00138] Glicólise:Gliceraldeído-3-fosfato = PEP + 2 ATP +2NADH
[00139] Fosfato acetiltransferase codificada por gene ptaAcetilfosfato = acetil-CoA
[00140] E equação final é:2 glucose + 2 CO2 = 3 acetil-CoA + 2 oxaloacetato + NADH (B)
[00141] Comparação de equações (A) e (B) mostra que, 0 uso dasatividades de fosfocetolases permite a geração de 1,5 moléculas de acetil-CoA a partir de 1 molécula de glucose e economiza 1 molécula de CO2 em contraste com a 1 molécula de acetil-CoA obtida de 1 molécula de glucose no metabolismo da glucose sem as atividades de fosfocetolases.
Exemplo 2. Cálculo do rendimento teórico da produção de ácido L-glutâmico usando bactéria com ou sem atividades de fosfocetolases.
[00142] 1. Reações de via biossintética do ácido L-glutâmico queenvolve PTS, glicólise, e o ciclo de TCA.
[00143] PTS + glicólise:glucose = acetil-CoA + oxaloacetato + ATP + 3NADH (A)
[00144] Ciclo de TCA:acetil-CoA + oxaloacetato = 2-oxoglutarato + NADPH + CO2
[00145] Glutamato desidrogenase:2-oxoglutarato + NH3 + NADPH = ácido glutâmico
[00146] Equação final:glucose = ácido glutâmico + ATP + 3 NADH + CO2 (C)
[00147] Rendimento em peso teórico de ácido L-glutâmico é 81,7 %
[00148] 2. Reações de via biossintética do ácido L-glutâmico que envolve glicólise, PPC não oxidativa, e D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase apenas
[00149] Glicólise e PPC não oxidativa: 5 glucose + 5 PEP = 5 frutose-6-fosfato + 5 Pyr, em que frutose-6-fosfato + ATP = 2 GA-3P 2 frutose-6-fosfato + 2 GA-3P = 2 xilulose-5-fosfato +2 eritrose-4-fosfato2 frutose-6-fosfato + 2 eritrose-4-fosfato = 4 xilulose-5-fosfato
[00150] Equação resumida: 5 glucose + 5 PEP +ATP = 6 xilulose-5-fosfato + 5 Pyr
[00151] Em seguida, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase: Xilulose-5-fosfato + fosfato = GA-3P + acetilfosfato
[00152] Glicólise e fosfato acetiltransferase: GA-3P = PEP + ATP + NADH Acetilfosfato = acetil-CoA
[00153] Equação resumida: 5 glucose = 6 acetil-CoA + PEP +5 ATP + 6 NADH + 5 PYR (1)
[00154] Fosfoenolpiruvato sintase PYR + 2 ATP = PEP + fosfato Presumindo que NADH = 2 ATP
[00155] Equação resumida: 5 glucose = 6 acetil-CoA + 6 PEP +7 ATP
[00156] Fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc): PEP + CO2 = oxaloacetato
[00157] Equação resumida: 5 glucose +6 CO2 = 6 acetil-CoA + 6 oxaloacetato +7 ATP (2)
[00158] Ciclo de TC A: Oxaloacetato + acetil-CoA = oxoglutarato + CO2 + NADPH
[00159] Equação resumida: 5 glucose = 6 oxoglutarato + 6NADPH +7ATP
[00160] Glutamato desidrogenase: Oxoglutarato + NADPH = ácido glutâmico
[00161] Equação final: 5 glucose = 6 ácido glutâmico + 7 ATP (D)
[00162] Rendimento de peso teórico de ácido L-glutâmico é de 98%
[00163] 3. Reações de via biossintética do ácido L-glutâmico que envolver glicólise, PPC não oxidativa, ambas fosfocetolases e desvio de glioxalato
[00164] PTS + glicólise: 2 glucose + 2 PEP = 2 frutose-6-fosfato + 2 PYR
[00165] frutose-6-fosfato fosfocetolase2: frutose-6-fosfato + fosfato = eritrose-4-fosfato + acetilfosfato
[00166] Transaldolase e transcetolase: frutose-6-fosfato + eritrose-4-fosfato = 2 xilulose-5-fosfato
[00167] Xilulose-5-fosfato fosfocetolase: 2 xilulose-5-fosfato + 2 fosfato = 2 GA-3P + 2 acetilfosfato
[00168] Equação resumida: 2glucose + 2PEP = 2 GA-3P + 3 acetilfosfato + 2 PYR
[00169] Glicólise: GA-3P = PEP + ATP + NADH
[00170] Equação resumida: 2 glucose = 3 acetilfosfato + 2 PYR + 2 ATP + 2 NADH (3)
[00171] Fosfoenolpiruvato sintase: PYR + 2 ATP = PEP
[00172] Fosfato acetiltransferase: Acetilfosfato = acetil-CoA
[00173] Equação resumida: 2 glucose = 3 acetil-CoA + 2 PEP + NADH
[00174] Fosfoenolpiruvato carboxilase: PEP + CO2 = oxaloacetato
[00175] Equação resumida: 2 glucose + 2 CO2 = 3 acetil-CoA + 2 oxaloacetato + NADH ou (4) 6 glucose + 6 CO2 = 9 acetil-CoA + 6 oxaloacetato + 3 NADH
[00176] Desvio de glioxalato: 2 Acetil-CoA = succinato + NADH
[00177] Ciclo de TCA: Succinato = oxaloacetato + ATP + NADH
[00178] Equação resumida: 6 glucose + 6 CO2 = 7 acetil-CoA + 7 oxaloacetato + ATP +5 NADH
[00179] Ciclo de TCA: Acetil-CoA + oxaloacetato = 2-oxoglutarato + NADPH + CO2
[00180] Glutamato desidrogenase: 2-oxoglutarato + NH3 + NADPH = ácido glutâmico
[00181] Equação final: 6 glucose = 7 ácido glutâmico + ATP + 5 NADH + CO2 ou 6 glucose = 7 ácido glutâmico +11 ATP + CO2 (E)
[00182] Rendimento de peso teórico de ácido L-glutâmico é de 95,3%
[00183] Comparação de equações (C), (D), e (E) mostra que usando-seas atividades de fosfocetolases incrementa significativamente o rendimento teórico de biossíntese de ácido L-glutâmico e permite a geração de mais 1 molécula de ácido L-glutâmico do que moléculas de glucose usadas e previne a liberação de CO2 em contraste a 1 molécula de ácido L-glutâmico obtida de 1 molécula de glucose no metabolismo da glucose sem as atividades de fosfocetolases.
Exemplo 3. Cálculo do rendimento teórico da produção de succinato usando uma bactéria com ou sem atividades de fosfocetolases.
[00184] 1.Reações de via biossintética de succinato que envolvem PTS, glicólise, e o ciclo de TCA.
[00185] PTS + glicólise: glucose = PEP + PYR + ATP + 2 NADH
[00186] Fosfoenolpiruvato carboxilase: PEP + CO2 = oxaloacetato
[00187] Piruvato desidrogenase: PYR = acetil-CoA + CO2 + NADH
[00188] Equação resumida: Glucose = oxaloacetato + acetil-CoA + ATP + 3 NADH
[00189] Ciclo de TCA: Oxaloacetato + acetil-CoA = succinato + NADPH + NADH + ATP + 2 CO2
[00190] Equação final: Glucose = succinato + NADPH + 4 NADH + 2 ATP + 2 CO2 ou presumindo que NADH = NADPH = 2 ATP Glucose = succinato +12 ATP + 2 CO2 (F)
[00191] Rendimento de peso teórico de succinato é de 65%.
[00192] 2. Reações de via biossintética de succinato que envolvem glicólise, PPC não oxidativa, e D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase apenas
[00193] Glicólise, PPC não oxidativa, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase, fosfato acetiltransferase e fosfoenolpiruvato carboxilase dá equação resumida (ver Exemplo 2, equação 2):  5 glucose + 6 CO2 = 6 acetil-CoA +6 oxaloacetato + 7 ATP
[00194] Ciclo de TCA: Oxaloacetato + acetil-CoA = succinato + NADPH + NADH + ATP + 2 CO2
[00195] Equação final: 5 glucose = 6 succinato + 6 CO2 +6 NADPH + 25 ATP ou presumindo que NADH = NADPH = 2ATP 5 glucose = 6 succinato + 6 CO2 + 37 ATP (G)
[00196] Rendimento de peso teórico de succinato é 79%
[00197] 3. Reações de via biossintética de succinato que envolvem glicólise, PPC não oxidativa, ambas as fosfocetolases e desvio de glioxalato
[00198] Glicólise, PPC não-oxidativa, frutose-6-fosfatofosfocetolase, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase, fosfato acetiltransferase, e fosfoenolpiruvato carboxilase dá equação resumida (ver Exemplo 2, equação4): 2 glucose + 2 CO2 = 3 acetil-CoA + 2 oxaloacetato + NADH ou 4 glucose + 4 CO2 = 6 acetil-CoA + 4 oxaloacetato + 2 NADH
[00199] Ciclo de TCA: Oxaloacetato + acetil-CoA = succinato + NADPH + NADH + ATP + 2 CO2
[00200] Equação resumida: 4 glucose = 4 succinato + 2 acetil-CoA + 4 CO2 + 4NADPH +6 NADH
[00201] Desvio de glioxilato: 2 acetil-CoA = succinato + NADH
[00202] Equação final: 4 glucose = 5 succinato + 4 CO2 + 4 NADPH + 7 NADH ou presumindo que NADH = NADPH = 2ATP  4 glucose = 5 succinato + 4 CO2 + 22 ATP (H)
[00203] Rendimento de peso teórico de succinato é Y = 82%
[00204] Comparação de equações (F), (G), e (H) mostra que usando-se as atividades de fosfocetolases aumenta significativamente 0 rendimento teórico de biossíntese de succinato e permite a geração de mais 1 molécula de succinato do que moléculas de glucose usadas, e previne a liberação de CO2 em contraste com 1 molécula de succinato obtida de 1 molécula de glucose no metabolismo da glucose sem as atividades de fosfocetolases.
Exemplo 4. Cálculo do rendimento teórico da produção de L-leucina usando- se bactéria com ou sem atividades de fosfocetolases.
[00205].1 Reações de via biossintética de L-leucina que envolve PTS eglicólise
[00206} Glicólise: glucose = 2 PYR + 2 ATP + 2 NADH
[00207] biossíntese de L-leucina: 2 PYR + NADPH = 2-ceto-isovalerato + CO2 2-ceto-isovalerato + acetil-CoA + ácido L-glutâmico = leucina + NADH + 2-oxoglutarato + CO2 ou 2-ceto-isovalerato + acetil-CoA = leucina + NADH – NADPH + CO2 em que NADPH é usado para regeneração de ácido L-glutâmico
[00208] Piruvato desidrogenase PYR = acetil-CoA + NADH + CO2
[00209] Equação resumida: 3 PYR = leucina +2 NADH -2 NADPH + 3 CO2
[00210] Equação final: 3 glucose = 2 leucina +4 NADH -4 NADPH + 6 CO2 + 6ATP + 6 NADH ou presumindo que NADH = NADPH = 2 ATP  3 glucose = 2 leucina +18 ATP + 6 CO2 (I)
[00211] Rendimento de peso teórico de L-leucina é Y = 48%
[00212] 2. Reações de via biossintética de L-leucina que envolve glicólise, PPC não oxidativa, e D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase apenas
[00213] Glicólise, PPC não oxidativa, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase, e fosfato acetiltransferase dá equação resumida (ver Exemplo 2, equação 1): 5 glucose = 6 acetil-CoA + PEP +5 ATP + 6 NADH + 5 PYR
[00214] Piruvato quinase: PEP = PYR + ATP
[00215] Equação resumida: 5 glucose = 6 acetil-CoA +6PYR + 6ATP +6NADH
[00216] Biossíntese de L-leucina: 2 PYR + acetil-CoA = leucina + NADH - 2 NADPH + 2 CO2
[00217] Equação resumida: 5 glucose = 3 leucina + + 3 acetil-CoA + 6 ATP + 9 NADH - 6 NADPH + 6 CO2 (5)
[00218] Outro ato de glicólise dá: 3 glucose = 6PYR + 18 ATP (6)
[00219] Adicionando equações 5 e 6: 3 glucose = 6 PYR + 18 ATP + 5 glucose = 3 leucina + + 3 acetil-CoA + 6 ATP + 9 NADH - 6 NADPH + 6 CO2 8 glucose = 3 leucina + (6 PYR + 3Ace-CoA) + 9 NADH - 6 NADPH + 24 ATP + 6 CO2
[00220] Equação final: 8 glucose = 6 leucina + 24 ATP + 12 NADH - 12 NADPH+ 12CÜ2 ou presumindo que NADH = NADPH 8 glucose = 6 leucina +12 CO2 + 24 ATP (J)
[00221] Rendimento de peso teórico de L-leucina é Y = 55%
[00222] 3.Reações de via biossintética de L-leucina que envolve glicólise, PPC não oxidativa, e ambas s fosfocetolases.
[00223] Glicólise, PPC não oxidativa, frutose-6-fosfatofosfocetolase, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase dá equação resumida (ver Exemplo 2, equação 3): 2 glucose = 3 acetilfosfato + 2 PYR + 2 ATP + 2 NADH
[00224] Fosfato acetiltransferase: Acetilfosfato = acetil-CoA
[00225] Equação resumida: 2 glucose = 3 acetil-CoA + 2 PYR + 2 ATP + 2 NADH
[00226] Biossíntese de L-leucina: 2 PYR + acetil-CoA = leucina + NADH - 2 NADPH + 2 CO2
[00227] Equação resumida: 2 glucose = leucina + 2 acetil-CoA + 2 ATP + 3 NADH - 2 NADPH + 2 CO2 (7)
[00228] Outro ato de glicólise dá: 2 glucose = 3 PYR + 12 ATP (8)
[00229] Adicionando equações 7 e 8: 2 glucose = leucina + 2 acetil-CoA + 2 ATP + 3 NADH- 2 NADPH + 2 CO2 + 2 glucose = 4 PYR + 12 ATP 4 glucose = leucina + (4 PYR + 2 acetil-CoA) +14 ATP + 3 NADH - 2 NADPH + 2 CO2
[00230] Biossíntese de L-leucina: 4 PYR + 2 acetil-CoA = 2 leucina + 2 NADH - 4 NADPH + 4 CO2
[00231] Equação final: 4 glucose = 3 leucina +14 ATP + 5 NADH - 6 NADPH + 6 CO2 ou presumindo que NADH = NADPH = 2 ATP 4 glucose = 3 leucina + 6 CO2 +12 ATP (K)
[00232] Rendimento de peso teórico de L-leucina é Y = 55%
[00233] Comparação de equações (I), (J), e (K) mostra que usando-se as atividades de fosfocetolases incrementa-se significativamente o rendimento teórico de biossíntese de L-leucina.
Exemplo 5. Clonagem do gene de fosfocetolase (xpkT) de Lactobacillus plantarum e avaliação do efeito da amplificação do gene xpkl sobre a produção de metabólitos úteis por E.coli.
[00234] O gene xpkl pode ser clonado de DNA cromossômico de Lactobacillus plantarum cepa 8PA3 (VKPM B-7495). Com base na seqüência de nucleotídeos reportada, é possível sintetizar os iniciadores ilustrados na SEQ ID No. 7 (iniciador 1) e n° 8 (iniciador 2) para amplificação do gene xpkl. O iniciador 1 contém um sítio de reconhecimento Hind\\\ introduzido na ponta 5’ do mesmo. O iniciador 2 contém sítio de reconhecimento EcoRI introduzido na ponta 5' do mesmo.
[00235] O DNA cromossômico de Lactobacillus plantarum cepa 8PA3 pode ser usado como um modelo para PCR e pode ser preparado por meio de um método ordinário. PCR pode ser realizada usando “Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2400” nas seguintes condições: desnaturação inicial de DNA a 95°C durante 5 min; então 30 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 segundos, recombinando a 55°C para 60 s e alongamento a 72°C para 120 s; a polimerização final para 7 min a 72°C usando Taq polimerase Fermentas (Fermentas, Lithuania). O fragmento de PCR obtido contendo gene xpkl com sua própria seqüência SD e sem uma seqüência promotora pode ser tratado com HinclLIL e Eco RI e inserido no vetor pMW119 previamente tratado com as mesmas enzimas. Assim, é possível obter o plasmídeo pMW- xpkl.
[00236] Transformação de uma cepa bacteriana produtora de metabólito útil com o plasmídeo pMW-xpkl pode ser realizada por meio de um método ordinário para se obter a cepa contendo gene xpkl amplificado.
Produção de ácido L-glutâmico por meio de E. coli cepa VL334thrC+-pMW- xpkl.
[00237] Transformação da cepa VL334thrC+ de E. coli produtora de ácido L-glutâmico (Publicação de Patente Européia n° 1172433) com o plasmídeo pMW-xpkl pode ser realizada por meio de um método ordinário para se obter a cepa VL334thrC+-pMW-xpkl.
[00238] Ambas as cepas, VL334thrC+ e VL334thrC+-pMW-xpkl, podem ser desenvolvidas durante de 18-24 horas a 37°C em placas de L-agar. Em seguida, uma alça das células pode ser transferida para tubos de ensaio contendo 2 ml de meio de fermentação. O meio de fermentação deveria conter 60 g/1 de glucose, 25 g/1 de sulfato de amónio, 2 g/1 de KH2PO4, 1 g/1 de MgSCU, 0,1 de mg/ml tiamina, 70 pg/ml de L-isoleucina e 25 g/1 de greda (pH 7,2). Glucose e greda deveriam ser esterilizados separadamente. O cultivo pode ser realizado a 30°C para 3 dias com agitação. Após cultivo, a quantidade acumulada de ácido L-glutâmico que se acumulou pode ser determinada por meio de cromatografia em papel (composição da fase líquida: butanol-ácido acético-água = 4:1:1) com subseqüente manchamento com ninidrina (1% solução em acetona) e eluição adicional de compostos em 50% de etanol com 0,5% de CdCL.
Produção de L-prolina por E. coli cepa 702ilvA-pMW-xpkl.
[00239] Transformação da cepa produtora de L-prolina de E. coli 702ilvA (VKPM B-8012, Pedido de patente russa 2000124295, Publicação de Patente Européia n° 1172433) com o plasmídeo pMW-xpkl pode ser realizada com um método ordinário para se obter a cepa 702ilvA-pMW-xpkl.
[00240] Ambas as cepas de E. coli 702ilvA e 702ilvA-pMW-xpkl podem ser desenvolvidas durante de 18-24 horas a 37°C em placas de L-agar. Em seguida, estas cepas podem ser cultivadas nas mesmas condições como descrito acima.
[00241] Produção de L-leucina por meio de cepa de E. coli 57-pMW- xpkl.
[00242] Transformação da cepa 57 produtora de L-leucina de E. coli (VKPM B-7386, Patente dos Estados Unidos n° 6,124,121) com o plasmídeo pMW-xpkl pode ser realizada por meio de um método ordinário para se obter a cepa 57-pMW-xpkl.
[00243] Ambas as cepas de E. coli, 57 e 57-pMW-xpkl, podem ser desenvolvidas durante de 18-24 horas a 37°C em placas de L-agar. Em seguida, estas cepas podem ser cultivadas nas mesmas condições como descrito acima sem adição de isoleucina no meio.
Produção de L-cisteína por E. coli cepa JM15(ydeD)-pMW-xpkl.
[00244] Transformação da cepa produtora de L-cisteína de E. coli JM15(ydeD) com o plasmídeo pMW-xpkl pode ser realizada por meio de um método ordinário para se obter a cepa JM15(ydeD)-pMW-xpkl.
[00245] Cepa de E. coli JM15(ydeD) é um derivado da cepa de E. coli JM15 (Patente dos Estados Unidos n° 6,218,168) que pode ser transformada com o DNA apresentando gene ydeD que codifica para uma proteína de membrana, que não está envolvida na via biossintética de qualquer L- aminoácido (Patente dos Estados Unidos n° 5,972,663).
[00246] Condições de fermentação para avaliação da produção de L- cisteína encontram-se descritas detalhadamente no Exemplo 6 da Patente dos Estados Unidos n° 6,218,168.
Produção de ácido L-glutâmico por Pantoea ananatis cepa AJ13356-xpkL
[00247] Transformação da cepa produtora de ácido L-glutâmico de Enterobacter agglomerans AJ 13356 (Patente dos Estados Unidos n° 6,331,419) (recentemente reclassificada como Pantoea ananatis} com o plasmídeo pMW-xpkl pode ser conduzida por meio de um método ordinário para se obter a cepa AJ13356-pMW-xpkl.
[00248] Cada uma das cepas AJ13356 e AJ13356-xpkl pode ser inoculada em um frasco com volume de 500 ml que contém 20 ml de um meio de cultura compreendendo 40 g/1 de glucose, 20 g/1 de sulfato de amónio, 0,5 g/1 de heptaidrato de sulfato de magnésio, 2 g/1 de di-hidrogeno fosfato de potássio, 0,5 g/1 de cloreto de sódio, 0,25 g/1 de heptaidrato de cloreto de cálcio, 0,02 g/1 de heptaidrato de sulfato ferroso, 0,02 g/1 de tetraidrato de sulfato de manganês, 0,72 mg/1 de diidrato de sulfato de zinco, 0,64 mg/1 de pentaidrato de sulfato de cobre, 0,72 mg/1 de hexaidrato de cloreto de cobalto, 0,4 mg/1 de ácido bórico, 1,2 mg/1 de diidrato de molibdato de sódio, 2 g/1 de extrato de levedura, 30 g/1 de carbonato de cálcio, 200 mg/1 de monocloridrato de L-lisina, 200 mg/1 de L-metionina e 200 mg/1 de ácido DL-a,£-diaminopimélico (DAP), e pode ser cultivada a 37°C com agitação até que a glucose contida no meio de cultura esteja completamente consumida. Após o completamento da cultura, ácido L-glutâmico que se acumulou no meio de cultura pode ser medido como acima.
Exemplo 6: Confirmação da atividade fisiológica do gene de fosfocetolase usando bactéria Coryneform (6-1) Clonagem do gene de fosfocetolase e construção do plasmídeo de expressão (1) Construção de pVK9-xfp
[00249] O gene xfp foi clonado a partir de DNA cromossômico da cepa de Bifidobacterium animalis JCM1190. Com base na seqüência de nucleotídeos reportada do gene xfp de Bifidobacterium animalis ATCC TI674 (n° de acesso GenBank. AY518213, SEQ ID No: 9), os iniciadores ilustrados na SEQ ID No: 13 e No: 14 podem ser sintetizados e usados para amplificação do gene xfp. Bifidobacterium animalis JCM1190 pode ser obtida da Japan Collection of Microorganisms (JCM).
[00250] A seqüência de DNA do gene xfp de B.animalis JCM 1190 é mostrada na SEQ ID No.l 1.
[00251] Para amplificar o gene xfp (SEQ ID NO: 11) a partir de Bifidobacterium animalis JCM 1190 e clonar o mesmo em um vetor de transporte pVK9 de E. coli-corineforme, DNA cromossômico de Bifidobacterium animalis JCM 1190 foi extraído usando o kit de purificação Wizard Genomic Purification Kit (Promega). O pVK9 é um vetor de transporte de E. coZz-coryneform, obtido por meio de digestão de pHK4 (JP 5- 007491 A) com BamHI e Kpnl para se obter a região incluindo sua origem replicável e introduzindo a região no sítio Avail de pHSG299 (produto da Takara Bio Inc). O fragmento de gene xfp incluindo uma região promotora foi amplificado com PCR usando-se o DNA cromossômico de B. animalis como um modelo e usando-se os iniciadores mostrados na SEQ ID NO: 13 e NO: 14 como iniciadores. PCR foi realizada por meio de um método convencional.
[00252] O produto de PCR resultante foi purificado de uma maneira convencional e digerido com Xba I. O produto de PCR digerido foi ligado com o uso do Kit de Ligação (produto da Takara Bio Inc) a pVK9 que havia sido digerido com Xba I. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes de Escherichia coli DH5a (produto da Takara Bio Inc).As células foram plaqueadas em meio LB (10 g de bacto-triptona, 5 g de extrato de bacto-levedura e 10 g de NaCI em 1 1) contendo 100 pM de IPTG, 40 mg/ml de X-Gal e 25 mg/ml de Km e cultivado de um dia para o outro. Em seguida, as colônias brancas que emergiram foram selecionadas e separadas em colônias simples para se obter transformantes. O plasmídeo-alvo pVK9- xfp contendo o gene xfp foi isolado dos transformantes.
(2) Construção de pVK9-PS2_xfp
[00253] Um fragmento de DNA, em que uma região promotora nativa do gene xfp de B. animalis foi substituído por um promotor PS2 (Peyret JL, Mol Microbiol., julho de 1993; 9(l):97-109,WO93/03158), foi obtido de acordo com o método de sobreposição de PCR (R.M. Horton, H.D. Hunts, S.N. Ho, J.K. Pullen, e L.R. Pease, Gene, 77, 61-68(1989)). O método é descrito especificamente abaixo.
[00254] Primeiramente, realizou-se PCR usando pPSTGl contendo o promotor PS2 (Y. Kikuchi, M. Date, K. Yokoyama, Y. Umezawa e H. Matsui, Appl. Environ.Microbiol. Appl.Environ.Microbiol 69, 358- 366(2003)) como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 15 e No: 16 como iniciadores para se obter um produto de purificação do promotor PS2. Em seguida, para se obter um produto de amplificação de uma seqüência do gene xfp (região codificante), realizou-se PCR usando o pVK9-xfp como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 17 e NO: 18 como iniciadores. SEQ ID NO: 16 e NO: 18 são complementares entre si.
[00255] Em seguida, para se obter um fragmento contendo o promotor PS2 e o gene xfp de B. animalis, os fragmentos de genes previamente indicados do promotor PS2 e do gene xfp de B. animalis foram misturados em quantidades substancialmente equimolares, e realizou-se PCR usando esta mistura como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 14 e NO: 19 como iniciadores.
[00256] O produto de PCR resultante foi purificado de uma maneira convencional e digerido com Xba I. O produto de PCR digerido foi ligado usando-se o Kit de Ligação (produto da Takara Bio Inc) a pVK9 que havia sido digerido com Xba I.A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes de Escherichia coli DH5a (produto da Takara Bio Inc).As células foram plaqueadas sobre meio LB (10 g de bacto-triptona, 5 g de extrato de bacto-levedura e 10 g de NaCl em 1 1) contendo 100 pM de IPTG, 40 mg/ml de X-Gal e 25 mg/ml de Km e cultivadas de um dia para o outro. Em seguida, as colônias brancas que emergiram foram selecionadas e separadas em colônias simples para se obter transformantes. O plasmídeo- objeto pVK9-PS2_xfp contendo o promotor PS2 e gene xfp foi isolado dos transformantes.
(3) Construção de pVK9-tac_xfp
[00257] Um fragmento de DNA em que a região promotora nativa do gene de B. animalis xfp foi substituída por um promotor tac foi obtido de acordo com o método de PCR de superposição (R.M. Horton, H.D. Hunt, S.N. Ho, J.K. Pullen e L.R. Pease, Gene, 77, 61-68(1989)). O método é descrito especificamente abaixo.
[00258] Primeiramente, realizou-se PCR usando o pKK223-3 (Pharmacia) como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 20 e NO: 21 como iniciadores para obter um produto de amplificação do promotor tac. Em seguida, para obter um produto de amplificação de uma seqüência do gene xfp (região codificante), realizou-se PCR usando o DNA cromossômico de B. animalis JCM1190 como um modelo e DNAs sintéticos SEQ ID NO: 14 e NO: 22 como iniciadores. As seqüências de nucleotídeos da SEQ ID NO: 20 e NO: 22 são complementares entre si.
[00259] Em seguida, para se obter um fragmento contendo o promotor tac e o gene xfp de B. animalis, os fragmentos de genes previamente indicados do promotor tac e o gene xfp de B. animalis foram misturados em quantidades substancialmente equimolares, e realizou-se PCR usando este mistura como um modelo e DNAs sintéticos SEQ ID NO: 14 e NO: 21 como iniciadores.
[00260] O produto de PCR resultante foi purificado de uma maneira convencional e digerido com Xba I. O produto de PCR digerido foi ligado com o uso do Kit de Ligação (produto da Takara Bio Inc) a pVK9 que havia sido digerido com Xba I. A mistura de ligação foi usada para transformer células competentes (produto da Takara Bio Inc.) de Escherichia coli DH5a.As células foram plaqueadas sobre meio LB (10 g de bacto-triptona, 5 g de extrato bacto-levedura e 10 g de NaCl em 1 1) contendo 100 pM de IPTG, 40 mg/ml de X-Gal e 25 mg/ml de Km e cultivadas de um dia para o outro. Em seguida, as colônias brancas que emergiram foram selecionadas e separadas em colônias simples para se obter transformantes. O plasmídeo-objeto pVK9- tac_xfp contendo o gene xfp e o promotor tac foi isolado dos transformantes.
[00261] (4) Construção de pVK9-PS2_xpkA
[00262] O gene xpkA foi clonado de DNA cromossômico da cepa de Lactobacillus pentosus JCM1558.Lactobacillus pentosus JCM1558 pode ser obtida da Japan Collection of Microorganisms (JCM). Para amplificar um gene xpkA codificando fosfocetolase (SEQ ID NO: 1; AJ309011: gi: 16605513) de Lactobacillus pentosus JCM1558 e clonar o mesmo em um vetor de transporte pVK9, o DNA cromossômico de Lactobacillus pentosus JCM1558 foi extraído usando-se um kig de purificação Wizard Genomic Purification Kit (Promega).
[00263] Obteve-se um fragmento de DNA por meio de substituição da região promotora do gene de L. pentosus xpkA codificando fosfocetolase com um promotor PS2 de acordo com o método de PCR de superposição. O método é descrito especificamente aqui.
[00264] Primeiramente realizou-se PCR usando pPSTGl contendo o promotor PS2 (Y. Kikuchi, M. Date, K. Yokoyama, Y. Umezawa e H. Matsui, Appl. Environ.Microbiol. Appl.Environ.Microbiol 69, 358- 366(2003)) como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 15 e No: 23 como iniciadores para obter um produto de amplificação do promotor PS2. Em seguida, para obter um produto de amplificação de uma seqüência do gene xpkA (região codificante), realizou-se PCR usando o DNA cromossômico de Lactobacillus pentosus JCM1558 como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 24 e NO: 25 como iniciadores. As seqüências de nucleotídeos da SEQ ID NO: 23 e NO: 25 são complementares entre si.
[00265] Em seguida, para se obter um fragmento contendo o promotor PS2 e o gene de L. pentosus xpkA, os fragmentos de gene previamente indicados do promotor PS2 e o gene de L. pentosus xpkA foram misturados em quantidades substancialmente equimolares, e realizou-se PCR usando esta mistura como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 19 e NO: 24 como iniciadores.
[00266] O produto de PCR resultante foi purificado de uma maneira convencional e digerido com Xba I. O produto de PCR digerido foi ligado usando-se o Kit de Ligação (produto da Takara Bio Inc) a pVK9 que havia sido digerido com Xba I.A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes (produto da Takara Bio Inc.) de Escherichia coli DH5a.As células foram plaqueadas sobre meio LB (10 g de bacto-triptona, 5 g de extrato bacto-levedura e 10 g de NaCI em 1 1) contendo 100 pM de IPTG, 40 mg/ml de X-Gal e 25 mg/ml de Km e cultivadas de um dia para o outro. Em seguida, as colônias brancas que emergiram foram selecionadas e separadas em colônias simples para se obter transformantes. O plasmídeo-objeto pVK9- PS2_xpkA contendo o promotor PS2 e xpkA foi isolado dos transformantes.
(6-2) Confirmação da atividade fisiológica in vivo de fosfocetolase (1) Construção da cepa ATCC13869Δαcβ£
[00267] Uma cepa defectiva para PDH é auxotrófica para acetato.Por outro lado, uma cepa defectiva para PDH (piruvato desidrogenase) em que o gene de fosfocetolase é introduzido não será mais auxotrófica para acetato. Assim, confirmou-se o efeito da introdução do gene xfp ou xpkA.
Construção de um vetor de rompimento de gene (A) Construção de pBS3
[00268] Com DNA cromossômico de Bacillus subtilis como um modelo para PCR e DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 42 e NO: 43 como iniciadores, obteve-se um gene sacB (SEQ ID NO: 40) por meio de PCR. A reação PCR foi conduzida, após 1 ciclo de manutenção a 94°C durante 5 minutos, repetição de 25 vezes cada ciclo de 94°C durante 30 segundos, 49°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos, usando LA taq (TaKaRa Bio). O produto de PCR foi digerido com BglII e BamHI e dessensibilizado após purificação por meio de um método ordinário. O produto de PCR resultante foi ligado com pHSG299 que havia sido digerido com Avail e dessensibilizado. O plasmídeo foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.), e, depois, os transformantes foram suspensos em meio LB contendo 25 mg/ml de canamicina e cultivados de um dia para o outro. As colônias foram colhidas e submetidas a isolamento de colônias individuais, obtendo-se com isso transformantes.
[00269] O plasmídeo-alvo pBS3 contendo o gene sacB foi isolado dos transformantes.
[00270] O procedimento de construção de pBS3 é ilustrado na FIG. 2.
(B) Construção de pBS4S
[00271] Por meio de PCR de superposição obteve-se um plasmídeo por meio de rompimento do sítio Smal na região codificante do gene resistente a canamicina no plasmídeo pBS3. Primeiramente, usando pBS3 como um modelo e DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 44 e NO: 45 como iniciadores, realizou-se PCR, e obteve-se o produto de PCR contendo a região N-terminal do gene resistente a canamicina. Por outro lado, para obter um produto de PCR contendo a região C-terminal do gene de resistência à canamicina, realizou-se PCR usando pBS3 como um modelo e DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 46 e NO: 47 como iniciadores. O produto de PCR pode ser obtido após 1 ciclo de tratamento com calor de tratamento com calor a 98°C durante 5 minutos, repetindo-se 25 vezes um ciclo de 98°C durante 10 segundos, 57°C durante 30 segundos, e 72°C durante 1 minuto, usando DNA Polimerase Pyrobest (Takara Bio Inc). As seqüências de nucleotídeos da SEQ ID NO: 45 e NO: 46 são parcialmente complementares entre si.
[00272] O sítio Smal desta seqüência foi rompido por meio de introdução de uma mutação sem causar uma substituição de aminoácido. Para obter um fragmento de gene mutante de resistência à canamicina em que o sítio Smal é rompido, a região N-terminal do produto gênico e a região C- terminal do produto gênico do gene de resistência à canamicina foram misturadas para formar uma mistura quase equimolar. Usando a mistura resultante como um modelo para PCR e DNA sintético da SEQ ID NO: 44 e NO: 47 como iniciadores, realizou-se PCR. Obteve-se o produto de PCR apresentando a mutação no gene de resistência à canamicina. O produto-alvo de PCR pode ser obtido após 1 ciclo de tratamento com calor a 98°C durante 5 minutos, repetindo-se 25 vezes um ciclo compreendendo de 98°C durante 10 segundos, 57°C para 30 segundos a 72°C para 1,5 minuto usando DNA Polimerase Pyrobest (Takara Bio Inc).
[00273] O produto de PCR foi digerido com BanII após purificação e inserido no sítio BanII do pBS3 descrito acima. O DNA obtido foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.), suspenso em meio LB contendo 25 mg/ml de canamicina e cultivado de um dia para o outro. As colônias foram colhidas e submetidas a um isolamento de colônias individuais, e obteve-se transformantes. O plasmídeo-objeto pBS4S foi isolado dos transformantes. O procedimento de construção de pBS4S é ilustrado na FIG. 3.
(C) Construção de pBS5T
[00274] Com os procedimentos a seguir construiu-se um plasmídeo pBS5T apresentando uma origem de replicação sensível a temperatura de bactéria coryneform.
[00275] A região de replicação sensível a temperatura foi obtida por meio de digestão de pHSC4 (US5616480A) com BamHI e Smal e dessensibilização do fragmento digerido, e, depois, esta região foi ligada ao sítio Ndel dessensibilizado de pBS4S. O DNA obtido foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (produto da Takara Bio Inc.), e transformantes foram suspensas em meio LB contendo 25 mg/ml de Km e cultivados de um dia para o outro. As colônias foram colhidas e submetidas a isolamento de colônias individuais, e, então, obteve-se transformantes. O plasmídeo-objeto pBS5T contendo o fragmento sacB e origem de replicação sensível a temperatura foi isolado dos transformantes. FIG. 4 ilustra o esquema de construção de pBS5T.
(2) Clonagem de um fragmento para rompimento de gene aceE
[00276] Um fragmento de DNA para aceE codificando rompimento de gene de piruvato desidrogenase (componente de piruvato desidrogenase El) foi obtido da ATCC13869 por meio do método de PCR de superposição usando como iniciadores DNAs sintéticos baseados na seqüência de nucleotideos reportada de gene aceE de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (número de acesso do banco de dados GenBank NC 003450; SEQ ID NO: 38).
[00277] Primeiramente, realizou-se PCR por meio do uso de um DNA cromossômico de C. glutamicum ATCC 13869 como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 26 e No: 27 como iniciadores para obter um produto de amplificação do lado N-terminal do gene aceE. Em seguida, para obter um produto de amplificação do lado C-terminal do gene aceE, realizou- se PCR usando o DNA cromossômico de C. glutamicum ATCC13869 como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 28 e NO: 29 como iniciadores. As seqüências da SEQ ID NO: 26 e NO: 28 são complementares entre si.
[00278] Em seguida, para obter um fragmento de aceE em que uma seqüência interna é deletada, os fragmentos de gene previamente indicados das pontas N e C foram misturados em quantidades substancialmente equimolares, e realizou-se PCR usando esta mistura como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 30 e NO: 31 como iniciadores.
[00279] O produto de PCR resultante foi purificado de uma maneira convencional e digerido com Sma I. O produto de PCR digerido foi ligado usando-se o Kit de Ligação (produto da Takara Bio Inc) ao pBS5T descrito acima que havia sido digerido com Sma I. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes de Escherichia coli DH5a (produto da Takara Bio Inc). As células foram plaqueadas sobre meio LB (10 g de bacto- triptona, 5 g de extrato bacto-levedura e 10 g de NaCl em 1 1) contendo 100 pM de IPTG, 40 mg/ml de X-Gal e 25 mg/ml de Km e cultivadas de um dia para o outro. Em seguida, as colônias brancas que emergiram foram selecionadas e separadas em colônias simples para se obter transformantes. O plasmídeo-objeto pBSôT-AaceE foi isolado dos transformantes.
(3) Construção de cepa rompida com aceE Gene aceE codifica componente piruvato desidrogenase El.
[00280] Primeiramente, a cepa ATCC13869 foi transformada com uma alta concentração de plasmídeo pESST-AαceE por meio do método de pulso elétrico, plaqueadas no meio CM-Dex (5 g/1 de glucose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2PO4, 0,4 g/1 de MgSO4*7H2O, 0,01 g/1 de FeSO4’7H2O, 0,01 g/1 de MnSO4«7H2O, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de hidrolisado de soja e 10 pg/1 de biotina, pH 7,5 (NaOH)) contendo 25 mg/ml de canamicina, e cultivadas a 25°C durante cerca de 60 horas, e colônias que emergiram foram isoladas como transformantes. Em seguida, os transformantes foram cultivados em um meio líquido CM-Dex a 34°C de um dia para o outro. Após diluição apropriada, o transformante cultivado foi suspenso em um meio CM-Dex contendo 25 mg/ml de canamicina e cultivadas a 34°C durante cerca de 30 horas. A cepa ΔaceE, que pode crescer neste meio e apresenta ambos, o gene resistente à canamicina e o gene sacB, derivados do plasmídeo no cromossomo, foi obtida como um resultado de recombinação homóloga de crossover simples entre o tipo rompido de gene aceE (ΔaceE) no plasmídeo e o gene aceE nativo no cromossomo.
[00281] Em seguida, a cepa ΔaceE obtida por meio de recombinação homóloga de crossover simples foi cultivada de um dia para o outro em um meio líquido CM-Dex a 31,5°C. Após diluição apropriada, a cepa ΔaceE recombinante homóloga de crossover simples foi suspensa em um meio Dex- S10 isento de canamicina e contendo 10% de sacarose (10 g/1 de sacarose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2PO4, 0,4 g/1 de MgSO4-7H2O, 0,01 g/1 de FeSO4«7H2O, 0,01 g/1 de MnSO4-4H2O, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de hidrolisado de soja, 10 y.g/1 de biotina e 2 g/1 de acetato de sódio, ajustando-se em pH 7,5 por meio de KOH). Cultura foi realizada a 34°C durante cerca de 30 horas. Como um resultado de segunda recombinação homóloga de crossover, obteve-se uma cepa que não apresenta o gene SacB cromossômico e não é sensível a sacarose.As cepas obtidas desta maneira incluem aquelas apresentando o tipo rompido de gene aceE e aquelas apresentando o gene aceE de tipo selvagem. Se o gene aceE é do tipo rompido ou do tipo selvagem foi confirmado por meio de uma reação PCR direta usando-se as células obtidas por meio de cultura em um meio de agar Dex-S10. A cepa contendo o tipo rompido de gene aceE foi selecionada e denominada “ATCC13869ΔaceE”.
(4) Avaliação de atividade fisiológica de fosfocetolase na cepa ΔaceE
[00282] pVK9 (plasmídeo para controle), pVK9-xfp (plasmídeo para amplificar gene xfp de Bifidobacterium animalis), pVK9-PS2_xfp (plasmídeo para amplificar gene xfp de Bifidobacterium animalis, em que seu promotor nativo é substituído por um promotor PS2), e pVK9-PS2_xpkA (plasmídeo para amplificar gene xpkA de Lactobacillus pentosus, em que seu promotor nativo é substituído por um promotor PS2) foram introduzidos, cada um, na cepa ATCC13869ΔαceE para se obter cepas expressando fosfocetolase, e introduziu-se pVK9 na cepa ATCC 13869 como o controle. Especificamente, a cepa ATCC13869Δαcβ£ e a cepa ATCC 13869 foram transformadas, cada uma, por meio do método de pulso elétrico, plaqueadas em um meio CM-Dex (5 g/1 de glucose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2PO4, 0,4 g/1 de MgSO4-7H2O, 0,01 g/1 de FeSO4-7H2O, 0,01 g/1 de MnSO4«7H2O, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de hidrolisado de soja e 10 ptg/1 de biotina, ajustando-se a pH 7,5 com NaOH) contendo 25 mg/ml de canamicina, e cultivadas a 31,5°C durante cerca de 30 horas. As colônias que emergiram foram isoladas como transformantes e denominadas ATCC 13869ΔαceE(p VK9), ATCC 13 869ΔαceE(pVK9-xfp),ATCC13869ΔαceE(pVK9-PS2_xfp), ATCC13869Δαce£(pVK9-PS2_xpkA) e ATCC1869(pVK9), respectivamente.
[00283] Estas cepas foram cultivadas em um micro-agitador (“Biophotorecorder TN-1506”, produto da ADVANTEC) enquanto se mede a OD em função do tempo. Emprega-se aqui dois meios, ou seja, um meio líquido mínimo (constituído de 10 g/1 de glucose, 2,5 g/1 de (NH4)2SO4, 0,5 g/1 de KH2PO4, 0,25 g/1 de MgSO4«7H2O, 0,01 g/1 de FeSO4«7H2O, 0,01 g/1 de MnSO4*7H2O, 2 g/1 de uréia, 50 jig/1 de Biotina, 100 ml de VB1-HC1, 15 mg/1 de ácido protocatechuico, 0,02 mg/1 de CuSO4, 10 mg/1 de CaCl2, e 40 g/1 de MOPS, ajustando-se em pH 7,0 com KOH) contendo 25 mg/ml de canamicina, e um meio líquido mínimo contendo acetato (2 g/1 de acetato de sódio). Os resultados da cultura no meio mínimo e os resultados da cultura no meio mínimo contendo acetato são ilustrados nas FIGS. 6 e 5, respectivamente. A cepa ATCC13869Δαce£,(pVK9) poderia desenvolver-se no meio mínimo contendo acetato, mas não poderia desenvolver-se no meio mínimo, e, assim, apresentou auxotrofia para acetato.
[00284] As cepas ATCC13869ΔαcβE portando pvK9-xfp, pVK9- PS2_xfp, e pVK9-PS2_xpkA, respectivamente, poderiam desenvolver-se mesmo no meio mínimo, indicando que a introdução de xfp ou xpkA resulta em compensação pela auxotrofia para acetato da cepa defectiva para PDH. Assim, confirmou-se a atividade fisiológica de fosfocetolase que foi introduzida em C. glutamicum.
Exemplo 7. Confirmação da atividade de enzima fosfocetolase
[00285] A bactéria Coryneform pode produzir ácido L-glutâmico em condições em que biotina é limitada, ou em que penicilina ou tensoativo é adicionado no meio (referir ao WO95/34672). Por outro lado, é de conhecimento geral que a cepa que foi modificada para diminuir a atividade de a-cetoglutarato desidrogenase (El.2.4.2 sucA; 2-oxoglutarato desidrogenase) pode produzir ácido L-glutâmico mesmo que não nestas condições (Kimura E., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 79, 37-57(2003), “Metabolic engineering of glutamic acid production”). Assim, foi estudado o aperfeiçoamento no campo da fermentação do ácido L-glutâmico por meio da introdução de um gene de fosfocetolase usando uma cepa de C.glutamicum ATCC13869 com deficiência de sucA.
(7-1) Construção da cepa ATCC13869AsucA (1) Clonagem de um fragmento para rompimento de gene sucA
[00286] Um fragmento que teve sucA deletado, derivado da cepa de C. glutamicum ATCC13869, foi obtido por meio do método de PCR de superposição usando-se como iniciadores DNAs sintéticos projetados com base na seqüência de nucleotídeos do gene sucA de C. glutamicum ATCC13032 (Número de acesso do banco de dados GenBank NC_003450; SEQ ID NO: 48).
[00287] Primeiramente, realizou-se PCR usando um DNA cromossômico de C. glutamicum ATCC 13869 como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 32 e No: 33 como iniciadores para obter um produto de amplificação da ponta N do gene sucA. Em seguida, para obter um produto de amplificação da ponta C do gene sucA, realizou-se PCR usando o DNA cromossômico de C. glutamicum ATCC 13869 como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 34 e NO: 35 como iniciadores. As seqüências da SEQ ID NO: 33 e NO: 34 são complementares entre si.
[00288] Em seguida, para se obter um fragmento de sucA em que sua seqüência interna é deletada, os fragmentos de gene previamente indicados das pontas N e C foram misturados em quantidades substancialmente equimolares, e realizou-se PCR usando esta mistura como um modelo e os DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 36 e NO: 37 como iniciadores.
[00289] O produto de PCR resultante foi purificado de uma maneira convencional e digerido com BamHI. O produto de PCR digerido foi ligado usando-se o Kit de Ligação (produto da Takara Bio Inc) ao pBS3 descrito acima que havia sido digerido com BamHI. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes de Escherichia coli DH5a (produto da Takara Bio Inc). As células foram plaqueadas sobre meio LB (10 g de bacto- triptona, 5 g de extrato bacto-levedura e 10 g de NaCI em 1 1) contendo 100 pM de IPTG, 40 mg/ml de X-Gal e 25 mg/ml de Km e cultivadas de um dia para o outro. Em seguida, as colônias brancas que emergiram foram selecionadas e separadas em colônias simples para se obter transformantes. O plasmídeo-alvo pBS3AswcA foi isolado dos transformantes.
(2) Preparação de uma cepa rompida de sucA
[00290] O pBS3AswcA preparado em (A) não contém uma região autonomamente replicável nas células de bactéria coryneform. Portanto, se uma corinebactéria for transformada com este plasmídeo, uma cepa apresentando este plasmídeo integrado em seu cromossomo por meio de recombinação homóloga poderia ocorrer como um transformante embora isto ocorra com uma freqüência extremamente baixa. C. glutamicum ATCC 13869 foi transformado com uma alta concentração do plasmídeo pBS3A.vwcA por meio do método de pulso elétrico, plaqueado em meio CM-Dex (5 g/1 de glucose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2PO4, 0,4 g/1 de MgSO4«7H2O, 0,01 g/1 de FeSO4-7H2O, 0,01 g/1 de MnSO4-7H2O, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de hidrolisado de soja e 10 pg/1 de biotina, ajustando-se o pH em 7,5 com NaOH) contendo 25 mg/ml de canamicina, e cultivadas a 31,5°C durante cerca de 30 horas, e, depois, as colônias que emergiram foram isoladas como transformantes. Estes transformantes apresentam ambos, o gene de resistência à canamicina e o gene SacB, derivados do plasmídeo, como um resultado da recombinação homóloga entre o fragmento de gene sucA do plasmídeo e o gene nativo no cromossomo.
[00291] Em seguida, a primeira cepa recombinante obtida foi cultivada de um dia para o outro em um meio líquido CM-Dex isento de canamicina a 31,5°C. Após diluição apropriada, o transformante cultivado foi plaqueado no meio Dex-S10 isento de canamicina (10 g/1 de sacarose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2PO4, 0,4 g/1 de MgSO4*7H2O, 0,01 g/1 de FeSO4-7H2O, 0,01 g/1 de MnSO4-4H2O, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de hidrolisado de soja, e 10 pg/1 de biotina, ajustando-se o pH em 7,5 com KOH) contendo 10% de sacarose, cultivada a 31,5°C durante cerca de 30 horas, e a colônia que emergiu foi isolada como um transformante. Como um resultado da segunda recombinação homóloga de crossover, obteve-se uma cepa que perdeu o gene SacB do cromossomo e não é sensível a sacarose.
[00292] As cepas obtidas desta maneira incluem aquelas apresentando um tipo rompido de gene sucA e aquelas apresentando um gene sucA de tipo selvagem. Se o gene sucA for do tipo rompido ou do tipo selvagem foi confirmado por meio de uma reação PCR direta usando-se as células obtidas por meio de cultura em um meio de agar Dex-S10. Selecionou-se a cepa apresentando um tipo rompido de gene sucA.
[00293] A produção de ácido L-glutâmico por meio de uma cepa rompida com sucA foi avaliada no método a seguir. As células da cepa rompida com sucA obtidas por meio de cultura em um meio de plaqueamento CM2B foram inoculadas em um frasco contendo 80 g de glucose, 1 g de KH2PO4, 0,4 g de MgSO4, 30 g de (NH4)2SO4, 0,01 g de FeSO4-7H2O, 0,01 g de MnSO4«7H2O, 15 ml de solução de hidrolisado de soja, 200 mg de cloridrato de tiamina, 60 pg de biotina e 50 g de CaCCb em 1 1 de água pura (ajustando-se o pH em 8,0 com KOH) e cultivadas a 31,5°C com agitação até o açúcar consumir-se completamente. Após completamento da cultura, mediu-se a quantidade de ácido L-glutâmico acumulado no caldo de cultura. A cepa rompida com sucA que pode produzir um rendimento de fermentação maior de ácido L-glutâmico do que ATCC 13869 foi selecionada como a cepa de ATCC13869 rompida com sucA e denominada ATCC13869AswcÁ.
(7-2) Confirmação da expressão do gene de fosfocetolase e atividade de enzima em cepa ATCC 13869 rompida com sucA.
[00294] Expressão de um gene de fosfocetolase e sua atividade de enzima foi investigada com o uso da cepa que foi modificada para incrementar a expressão de fosfocetolase.
[00295] pVK9 (plasmídeo para controle), pVK9-xfp (plasmídeo para amplificar gene xfp de Bifidobacterium animalis), pVK9-tac_xfp (plasmídeo para amplificar gene xfp de Bifidobacterium animalis, em que seu promotor nativo situa-se por um promotor tac), pVK9-PS2_xfp (plasmídeo para amplificar gene xfp de Bifidobacterium animalis, em que seu promotor nativo é substituído por um promotor PS2), e pVK9-PS2_xpkA (plasmídeo para amplificar gene xpkA de Lactobacillus pentosus, em que seu promotor nativo é substituído por um promotor PS2) foram introduzidos, cada um, em C. glutamicum ATCC13869AswcÁ descrito acima para se obter cepas expressando fosfocetolase. Especificamente, a cepa ATCC13869Δ sucA foi transformada com cada um dos plasmídeos por meio do método de pulso elétrico, plaqueada em um meio CM-Dex (5 g/1 de glucose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2PO4, 0,4 g/1 de MgSO4-7H2O, 0,01 g/1 de FeSO4-7H2O, 0,01 g/1 de MnSO4*7H2O, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de hidrolisado de soja e 10 qg/1 de biotina, ajustando-se o pH em 7,5 com NaOH) contendo 25 mg/ml de canamicina e cultivadas a 31,5°C durante cerca de 30 horas. As colônias que emergiram foram isoladas como transformantes e denominadas ATCC13869AswcÁ(pVK9), ATCC13869ΔsWcA(pVK9-xfp), ATCC13869Δ<mcA(pVK9-tac_xfp), ATCC13869ΔsMcA(pVK9-PS2_xfp), e ATCC13869ΔsucA(pVK9- PS2_xpkA), respectivamente.
[00296] Para obter uma solução de enzima bruta, as células das cepas previamente indicadas obtidas cultivando-se cada cepa em um meio de plaqueamento CM-Dex foram inoculadas em um frasco contendo 30 g de glucose, 1 g de KH2PO4, 0,4 g de MgSCU, 15 g de (NI-L^SCU, 0,01 g de FeSO4*7H2O, 0,01 g de MnSCU’VI-bO, 13,7 ml de uma solução de hidrolisado de soja, 200 mg de cloridrato de tiamina, 300 pg de biotina, e 50 g de CaCCh em 1 1 de água pura (ajustando-se o pH em 8,0 com KOH) e cultivadas a 31,5°C com agitação. A cultura foi terminada quando a OD620 da concentração de células se tornou 15, conforme medido com “Hitachi Spectrophotometer U-2000A”. Após remoção do carbonato de cálcio com centrifugação moderada a 3000 rpm durante 30 segundos coletou-se as células. Os procedimentos a seguir foram realizados entre 0 a 4°C. As células coletadas foram lavadas duas vezes com uma solução de Nacl 0,85N e ressuspensas em 4 ml/g (peso úmido) de tamponador A (100 mM de KPO4 (pH 6,5), 30 mM de KC1, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de MgCl2, 0,2 mM de PMSF, 2 mM de DTT). As células foram rompidas com um rompedor ultra- sônico de células (“Bioruptor”).As células rompidas foram removidas por meio de centrifugação (15.000 g, 60 min) para se obter uma solução de enzimas bruta. A concentração de proteína na solução de enzima bruta foi quantificada com o uso de uma solução CBB (solução CBB de ensaio de proteína, produto da Nacalai Tesque) com albumina de soro bovino como uma amostra padrão.
[00297] Separou-se, com SDS-PAGE, a proteína na solução de enzima bruta. O procedimento específico da separação será descrito a seguir. A solução de enzima bruta foi misturada, após ajuste da concentração, com um tamponador de amostra (“Laemmli sample buffer”, produto da BIORAD) a 1:1. Após aquecimento a 95°C durante 2 minutos, a mistura resultante foi aplicada em “Ready Gel J 10%” (produto da BIORAD) de forma que a quantidade de proteína aplicada foi de 10 pg, seguido de eletroforese durante 40 minutos em um tanque de forese MiniProtean III Cell (produto da BIORAD) a uma voltagem constante de 200 V. Como um tamponador de eletroforese, usou-se tris/glicina/SDS (BIORAD). Para manchamento, usou-se azul Coomassie Brilliant Blue (“Bio Safe Coomassei”, BIORAD). Os resultados são mostrados abaixo na FIG. 7 (marcador: produto da BIORAD, precision plus protein standards (#161-0363)).
[00298] Faixas de 1 a 5 da Figura 7 mostram ATCC13869ΔswcA(pVK9), ATCC13869Δ.yucA(pVK9-xfp), ATCC13869ΔswcA(pVK9-tac_xfp), ATCC13869Δ.yucA(pVK9-PS2_xfp), e ATCC13869ΔswcA(pVK9-PS2_xpkA)), respectivamente. Em comparação com a banda de controle (pVK9), banda com aproximadamente 90 kD que corresponde àquela do produto gênico de fosfocetolase torna-se mais densa na cepa que foi modificada para incrementar a atividade de fosfocetolase. Isto sugere claramente que uma quantidade suficiente de expressão do gene de fosfocetolase ocorre na bactéria coryneform.
[00299] De acordo com o método de Meile (L. Meile, L.M. Rohr, T.A. Geissmann, M. Herensperger e M. Teuber, J. Bacterial. 183, 2929- 2936(2001)), mediu-se a atividade de enzima do gene de fosfocetolase. Após reação com 0,075 ml de uma solução de enzima bruta (33,3 mM de KPO4 (pH 6,5), adicionou-se 1,9 mM de cloridrato de L-cisteína, 23 mM de fluoreto de sódio, 8 mM de iodoacetato de sódio, e 27 mM de D-frutose 6-fosfato) a 37°C durante 30 minutos, 0,075 ml de cloridrato de hidroxilamina (2M, pH 6,5). A mistura foi deixada reagir durante 10 minutos à temperatura ambiente e, depois, manchada com 0,05 ml de 15% (peso/vol) de ácido tricloroacético, 0,05 ml de HCI 4M e 0,05 ml de FeCl3«6H2O (em HCI 0,1 M, 5% peso/vol). Após remoção de cristais por meio de separação centrífuga, mediu-se a OD505 usando um leitor de atividade de enzima (“Spectra max 190”, produto da Molecular Devices).
[00300] Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 3. Não se detectou atividade de enzima no controle (pVK9), enquanto que se detectou alguma atividade de enzima nas cepas em que se havia incrementado atividade de fosfocetolase.Tabela 3
Figure img0003
Exemplo 8: Avaliação da capacidade de produzir ácido L-glutâmico da bactéria apresentando atividade incrementada de fosfocetolase (8-1) Avaliação numa condição contendo uma quantidade suficiente de biotina
[00301] Usando a cepa de C. glutamicum ATCC13869 AsucA, avaliou- se o efeito da introdução de um gene de fosfocetolase sobre o efeito de fermentação de ácido L-glutâmico. As células das cepas ATCC13869AswcA(pVK9), ATCC13869AsucA (pVK9-xfp), ATCC13869AswcA(pVK9-PS2_xfp) e ATCC13869AsucA(pVK9-PS2_xpkA) obtidas por meio de cultura em um meio de plaqueamento CM-Dex foram inoculadas no frasco contendo 30 g de glucose, 1 g de KH2PO4, 0,4 g de MgSO4, 15 g de (NH4)2SO4, 0,01 g de FeSO4-7H2O, 0,01 g de MnSO4-7H2O, 13,7 ml de uma solução de hidrolisado de soja, 200 mg de cloridrato de tiamina, 300 pg de biotina, e 50 g de CaCCb em 1 1 de água pura (ajustando- se o pH em 8,0 com KOH) e cultivadas a 31,5°C com agitação até que o açúcar fosse completamente consumido. Após completamento da cultura, mediu-se a quantidade de ácido L-glutâmico acumulado e a OD no caldo de cultura. Os resultados são mostrados na FIG. 8. Os resultados mostram que todas as cepas em que gene xfp gene é amplificado apresentam elevado rendimento de ácido L-glutâmico em comparação com o controle.
(8-2) Avaliação quando se adiciona penicilina
[00302] Para avaliar sob a OD equalizada final, a proliferação de células foi interrompida com adição de penicilina G. O rendimento de ácido L-glutâmico foi comparado por meio de adição de penicilina G ao meio como descrito acima (1), de modo que sua concentração final foi de 4 U/ml em pontos de crescimento plurais quando a OD se enquadrou numa faixa de 10 a 14 após o início da cultura. Os resultados são mostrados na FIG. 9. Estes resultados mostram que, ainda que o rendimento de ácido L-glutâmico fosse comparado entre si em um ponto em que suas contagens de células finais fossem iguais, o rendimento de ácido L-glutâmico foi maior nas cepas amplificadas com genes xfp ou xpk, se comparado com a cepa de controle. Os resultados descritos acima mostram que a introdução de fosfocetolase é efetiva para aperfeiçoar o rendimento de fermentação de ácido L-glutâmico.
Exemplo 9. Efeito da expressão do gene xfp de B. animalis sobre o acúmulo de ácido L-glutâmico por cepa de Pantoea ananatis.
[00303] Plasmídeo pVK9-PS2-xfp expressando gene xfp de Bifidobacterium animalis e veto de transporte pVK9 de controle foram introduzidos em cepa produtora de ácido L-glutâmico NP106/RSFCPG por meio de electroporação usando Bio-Rad MicroPulser. Cepa NP106/RSFCPG foi obtida curando-se plasmídeo pSTVCB da cepa AJ13601 (FERM BP-7207; Publicação de patente européia 1078989) por meio de plaqueamento da cepa AJ13601 no meio que não contém cloranfenicol como um marcador de seleção.
[00304] Para transformar cepa NP106/RSFCPG com plasmídeo pVK9- PS2-xfp ou vetor pVK9, células obtidas por meio de cultura de um dia para o outro em meio LBG-M9 (triptona (10 g/1), extrato de levedura (5 g/1), NaCI (5 g/1), glucose (5 g/1), 0,5 x solução salina M9) com adição de tetraciclina (10 pg/ml) foram diluídas a 1:100 com meio LBG-M9 fresco e incubadas a 34°C com aeração até OD595 = 0,6. Células de 10 ml da cultura foram colhidas por meio de centrifugação, lavadas três vezes com água deionizada gelada e com glicerol a 10% gelado, e ressuspensas em 10% de glicerol. Adicionou-se 10 ng de DNA de plasmídeo à suspensão de células e aplicou-se pulso elétrico (E = 20kV/cm, t = 5 milissegundos). Adicionou-se imediatamente 1 ml de meio LBG-M9 imediatamente após eletroporação. Células foram incubadas a 34°C com aeração durante 2 horas e plaqueadas em meio LBG-M9 sólido contendo 40 pg/rnl de canamicina. Placas foram incubadas a 34°C durante 48 horas. Clones de crescimento foram inoculados em 2 ml de meio LBG-MES (triptona (10 g/1), extrato de levedura (5 g/1), NaCl (5 g/1), glucose (5g/1), MES 0,lM, pH 7,0) contendo 40 pg/ml de canamicina e 10 pg/ml de tetraciclina e incubadas a 34°C com aeração de um dia para o outro. 80 pl do meio cultivado de um dia para o outro contendo as células bacterianas foram inoculadas em 2 ml de meio de fermentação (glucose (40 g/1), MgSO47H2O (0,5 g/1), (NH4)2SO4 (16 g/1), KH2PO4 (0,3 g/1), KC1 (1,0 g/1), MES (10 g/1), betaína (1,0 g/1), FeSO47H2O (10 mg/1), MnSO45H2O (10 mg/1), lisina, metionina, e D AP 100 mg/1 de cada um de triptona (1 g/1), extrato de levedura (1 g/1), pantotenato de cálcio (10 mg/1), CaCCE (30 g/1)) em tubos de ensaio e incubadas durante 26 horas com aeração. A quantidade de ácido L-glutâmico acumulado foi determinada por meio do método de TLC. Dados médios de 4 experimentos independentes são representados na Tabela 4.Tabela 4
Figure img0004
[00305] Como se pode observar na Tabela 4, a cepa portando o plasmídeo pVK9-PS2-xfp apresentou acúmulo de ácido L-glutâmico aproximadamente 2,6 g/1 maior do que a cepa de controle transformada com vetor pVK9, o que corresponde a um aumento de rendimento de pelo menos 6%. Exemplo 10. Melhoramento do rendimento de fermentação de ácido L- glutâmico por meio de uma combinação do incremento da atividade de fosfocetolase e de redução da atividade de 6-fosfofrutoquinase (PFK)
10-1. Preparação de uma cepa duplamente rompida com sucA e PFK (1) Construção de um plasmídeo para rompimento do gene pfk
[00306] Fragmentos de gene que não apresentam a ORF de pfk derivada da cepa ATCC 13 869 foram obtidos por meio do método de PCR de superposição usando DNA sintético como iniciadores projetados baseados na seqüência de nucleotideos do gene correspondente de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (número de acesso do banco de dados GenBank NC_003450; SEQ ID NO: 61). Especificamente, os produtos de amplificação da região N-terminal do gene pfk foram obtidos por meio de um método de PCR convencional usando DNA cromossômico da cepa de C. glutamicum ATCC13869 como um modelo, e DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 50 e NO: 51 como iniciadores. Por outro lado, para se obter produtos de amplificação da região C-terminal do gene pfk, realizou-se uma PCR convencional usando DNA cromossômico da cepa ATCC 13869 como um modelo e DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 52 e NO: 53 como iniciadores. As seqüências da SEQ ID NO: 51 e NO: 53 são complementares entre si.
[00307] Em seguida, para se obter um fragmento de gene pfk em que sua seqüência interna é deletada, os produtos de amplificação previamente indicados das regiões N-terminal e C-terminal do pfk foram misturados em quantidades substancialmente equimolares, e obteve-se produtos gênicos de amplificação por meio de uma PCR convencional usando-se esta mistura como um modelo e DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 54 e NO: 55 como iniciadores. O produto de PCR foi purificado de uma maneira ordinária e, então, digerido com BamH I, e foi inserido no sítio BamH I do pBS5T descrito acima. Este DNA foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli DH5a (produto da Takara Bio Inc.), e as células foram plaqueadas e cultivadas de um dia para o outro em meio LB suplementado com 100 pM de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal, e 25 pg/ml de canamicina.Em seguida, colônias brancas que participaram foram coletadas e separadas em colônias individuais para se obter transformantes. Plasmídeos foram isolados dos transformantes obtidos, e o plasmídeo apresentando um inserto do produto de PCR-alvo foi selecionado e denominado pBS5T-Δpfk.
(2) Preparação de uma cepa rompida
[00308] A cepa ATCC13869ΔswcA previamente indicada foi transformada primeiro com uma alta concentração do plasmídeo pBS5T-Δpfk por meio do método de pulso elétrico, e plaqueada em meio CM-Dex (5 g/1 de glucose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2PO4, 0,4 g/1 de MgSO4 • 7H2O, 0,01 g/1 de FeSO4 • 7H2O, 0,01 g/1 de MnSO4 • 7H2O, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de hidrolisado de soja, e 10 11 g/1 de biotina, ajustando-se o pH em 7,5 com NaOH) suplementada com 25 ug/ml de canamicina, e cultivada para cerca de 60 horas a 25 °C. Os transformantes resultantes foram cultivados com agitação de um dia para o outro a 34°C, e, depois, diluídos apropriadamente, e plaqueados e cultivados durante 30 horas em meio CM-Dex suplementado com 25 pg/ml de canamicina. A cepa que pode crescer neste meio é uma cepa em que o gene de resistência à canamicina e o gene SacB derivado de referido plasmídeo são integrados em seu cromossomo, como um resultado de recombinação homóloga entre o fragmento de gene pfk em referido plasmídeo e o mesmo gene localizado no cromossomo da cepa ATCC13869.
[00309] Em seguida, os primeiros recombinantes foram cultivados de um dia para o outro em meio CM-Dex líquido isento de canamicina a 31,5°C, e, após uma diluição apropriada, eles foram plaqueados em meio Dex-S10 isento de canamicina e contendo 10% de sacarose (10 g/1 de glucose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2PO4, 0,4 g/1 de MgSO4«7H2O, 0,01 g/1 de FeSO4-7H2O, 0,01 g/1 de MnSO4«7H2O, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de hidrolisado de soja, 10 iig/l de biotina, e 2 g/1 de acetato de sódio, ajustados em pH 7,5 com KOH), e cultivados durante cerca de 30 horas a 34 °C. Como um resultado, obteve-se uma cepa que parece ter perdido o gene SacB e tornou-se insensível à sacarose devido à segunda recombinação homóloga.
[00310] As cepas obtidas incluem aquelas apresentando o tipo rompido de gene pfk derivado de pBS5T-Δpfk, e aquelas apresentando o gene pfk de tipo selvagem. Para confirmar se o gene pfk é de tipo rompido ou de tipo selvagem, realizou-se análise de PCR direta usando-se as células bacterianas cultivadas em um meio de agar Dex-10.A cepa apresentando apenas o tipo rompido de pfk foi selecionada e denominada ATCC 13869 ΔsucA Apfk. 8-2. Aquisição de genes pfk mutantes codificando PFK apresentando atividade reduzida
(1) PFK mutante apresentando atividade reduzida
[00311] Como PFK com atividade reduzida, obteve-se PFK* 1 (SEQ ID NO: 57) e PFK*2 (SEQ ID NO: 59). PFK*1 é gerado substituindo-se lisina por ácido glutâmico na posição 171 do PFK de tipo selvagem (SEQ ID NO: 61). PFK*2 é gerada substituindo-se arginina por ácido glutâmico na posição 171 do PFK de tipo selvagem (SEQ ID NO: 61). Estas seqüências podem ser obtidas por meio de PCR de crossover usando-se o gene pfk de tipo selvagem como um modelo e DNAs sintéticos para introduzir uma mutação do tipo referido como iniciadores.
(2) Construção de vetor de expressão para o gene de pfk mutante e o gene de fosfocetolase
[00312] Para construir um vetor de expressão de PFK, realizou-se uma PCR convencional usando-se DNA cromossômico da cepa C. glutamicum ATCC 13869 como um modelo, e DNAs sintéticos da SEQ ID NO: 54 e NO: 55 como iniciadores. O produto de PCR foi purificado de uma maneira ordinária e, depois, digerido com Xba I e Kpn I, e o fragmento de gene contendo o gene pfk foi inserido no sítio Xba I - Kpn I do pVK9 descrito acima. Este DNA foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli DH5α (produto da Takara Bio Inc.), e as células foram plaqueadas e cultivadas de um dia para o outro em meio LB suplementado com 100 pM de IPTG, 40 ug/ml de X-Gal, e 25 pg/ml de Km. Em seguida, colônias brancas que participaram foram coletadas e separadas em colônias individuais para se obter transformantes. Plasmídeos foram isolados dos transformantes obtidos, e o plasmídeo apresentando um inserto do gene-alvo foi selecionado de denominado pVK9-PFK.
[00313] Em seguida, para construir um plasmídeo que expressa ambos, o PFK mutante e a fosfocetolase, ao mesmo tempo, o pVK9-PS2_xfp mencionado acima foi digerido com Xba I, e, então, o fragmento de gene contendo o PS2_xfp foi purificado e inserido no sítio Xba I do pVK9-PFK. Este DNA foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli DH5a (produto da Takara Bio Inc.), e as células foram plaqueadas e cultivadas de um dia para o outro em meio LB suplementado com 100 pM de IPTG, 40 pg/ml de X-Gal, e 25 pg/ml de Km. Em seguida, colônias brancas que participaram foram coletadas e separadas em colônias individuais para se obter transformantes. Plasmídeos foram isolados dos transformantes obtidos, e o plasmídeo apresentando um inserto do PS2_xfp e pfk foi selecionado e denominado pVK9-PS2_xfp_PFK. Para construir um plasmídeo que expressa ambos, o gene pfk mutante e o gene de fosfocetolase, ao mesmo tempo, gerou-se pVK9-PS2_xfp_PFK* 1 e pVK9-PS2_xfp_PFK* de acordo com o mesmo procedimento empregado na construção de pVK9-PS2_xfp_PFK.
(3) Análise da atividade
[00314] Os plasmídeos de expressão previamente indicados para PFK e fosfocetolase (pVK9-PS2_xfp_PFK, pVK9-PS2_xfp_PFK* 1, e pVK9- PS2_xfp_PFK*2) foram usados para transformar a cepa ATCC 13869 AsucA Apfk previamente indicada para examinar a atividade enzimática de PFK. A transformação foi realizada por meio do método de pulso elétrico, e os transformantes foram obtidos por meio de plaqueamento das células bacterianas em meio CM-Dex (5 g/1 de glucose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2PO4, 0,4 g/1 de MgSO^VthO, 0,01 g/1 de FeSO4*7H2O, 0,01 g/1 de MnSCh’VI-bO, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de hidrolisado de soja, e 10 pg/1 de biotina, ajustando-se o pH 7,5 com NaOH) suplementado com 25 pg/ml de canamicina, e cultivando-se isto durante cerca de 30 horas a 31,5 °C.
[00315] Obteve-se, no dia seguinte, solução de enzima bruta. Coletou- se células bacterianas numa fase logarítmica, que foram lavadas com tamponador Kpi 100 mM (pH 8,2), e, depois, dissolvidas no mesmo tamponador, seguido de rompimento ultra-sônico. A fração solúvel foi separada por meio de ultracentrifugação (60000 rpm, 30 min) para se obter solução de enzima bruta. O procedimento para quantificar a concentração de proteína na solução de enzima bruta é mostrado abaixo. A solução de enzima bruta e a solução de BSA com concentração conhecida para gerar uma curva padrão foram reagidas, cada uma, com solução CBB (solução de ensaio de proteína CBB, Nacalai Tesque) para revelar cor, seguido de medição da OD595 nm usando-se espectros max 190 (Molecular Divices).
[00316] Em seguida, mediu-se a atividade de PFK de acordo com o método convencional (Denise Kotlars e Henri Buc, Methods in Enzymology (1982) 90: 60-70). O procedimento específico é mostrado abaixo. A atividade enzimática foi determinada por meio de adição de solução de enzima bruta a 100 mM de Tris-HCl (pH 8,2), 10 mM de MgCl2, 1 mM de ATP, 1 U/ml de glicerol-3-fosfato desidrogenase, 1 U/ml de triosefosfato isomerase, 1 U/ml de aldolase, 0,2 mM de NADH, e 10 mM de frutose-6-fosfato, seguido de medição de alterações ao longo do tempo em OD340 nm usando espectros max 190 (Molecular Divices). A atividade relativa do PFK reduzido quando a atividade de PFK de tipo selvagem é ajustada em 1, é mostrada na Tabela 5 a seguir. Tabela 5.
Figure img0005
10-3 Aumento do rendimento de ácido L-glutâmico por meio de redução da atividade de PFK (1) Avaliação numa condição contendo uma quantidade suficiente de biotina
[00317] Com o uso da cepa de C.glutamicum ATCC13869 AsucA Apfk avaliou-se o efeito da redução de atividade de PFK sobre o rendimento de fermentação do ácido L-glutâmico. Células de cada cepa obtidas por meio de cultivo da cepa em uma placa CM-Dex foram inoculadas em um meio contendo 3
[00318] 0 g de glucose, 1 g de KH2PO4, 0,4 g de MgSO4, 15 g de (NH4)2SO4, 0,01 g de FeSO4«7H2O, 0,01 g de MnSO4-7H2O, 13,7 ml de uma solução de hidrolisado de soja, 200 pg de cloridrato de tiamina, 300 pg de biotina, e 50 g de CaCCL em 1 1 água pura (ajustando-se o pH em 8,0 com KOH), e cultivadas a 31,5°C. Após o completamento da cultura mediu-se a quantidade de ácido L-glutâmico acumulador e a concentração de células bacterianas (OD) no caldo de cultura. O resultado é mostrado na Figura 10. O resultado mostra que a cepa que expressa o gene pfk mutante apresentou maior rendimento de L-glutâmico em comparação com a cepa expressando o gene pfk de tipo selvagem.
(2) Avaliação quando se adiciona penicilina
[00319] O rendimento de ácido L-glutâmico foi comparado com adição de penicilina G a uma concentração final de 4 U/ml ao meio descrito acima para interromper 0 crescimento celular para se obter uma quantidade bacteriana final equalizada, em pontos de crescimento plurais quando a OD entrou na faixa de 10 a 14 após o início da cultura. O resultado é mostrado na Figura 11. Os resultados descritos acima mostram que a redução da atividade de PFK em cepas introduzidas com fosfocetolase é efetiva para aperfeiçoar o rendimento de fermentação de ácido L-glutâmico.
Exemplo 11. Avaliação da produção de L-glutamina usando uma bactéria em que a atividade de fosfocetolase é incrementada.
[00320] Com o uso da cepa de B. flavum AJ11576 (JP56-16479A) avaliou-se o efeito da introdução de um gene de fosfocetolase sobre o aperfeiçoamento do rendimento de fermentação de L-glutamina.
[00321] A cepa AJ11576 é resistente a compostos que apresentam atividade de vitamina P. Esta cepa foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305- 8566, Japão) em 6 de maio de 1980 e recebeu um número de acesso de FERM P-05502. Isto foi convertido a um depósito internacional nas condições do Tratado de Budapeste, e recebeu um número de acesso de FERM BP-10381.
[00322] O pVK9 (plasmídeo para controle) e pVK9-PS2_xfp (plasmídeo para amplificar gene xfp de Bifidobacterium animalis, em que o promotor nativo é substituído por um promotor PS2) foram introduzidos, cada um, na cepa de B. flavum AJ11576 descrita acima para se obter cepas expressando fosfocetolase. Especificamente, a cepa foi transformada com cada um dos plasmídeos por meio do método de pulso elétrico, plaqueadas em um meio CM2G (5 g/1 de glucose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 5 g/1 de NaCl, ajustando-se em pH 7,0 com KOH) contendo 25 mg/ml de canamicina e cultivada a 31,5°C para cerca de 30 horas. As colônias que emergiram foram isoladas como transformantes e denominadas AJ 11576 (pVK9) e AJ11576 (pVK9-PS2_xfp), respectivamente.
[00323] As células das cepas AJ 11576 (pVK9) e AJ 11576 (pVK9- PS2_xfp) obtidas por meio de cultura em um meio de placa CM2G foram inoculadas no meio de cultura do frasco contendo 100 g de glucose, 2,5 g de KH2PO4, 0,4 g de MgSO4, 60 g de (NH4)2SO4, 0,01 g de FeSO4-7H2O, 5,7 ml de uma solução de hidrolisado de soja, 2 mg de cloridrato de tiamina, 4 pg de biotina, 0,02 ml de GD-113 e 50 g de CaCO3 em 1 1 de água pura (ajustando-se o pH em 6,8 com NaOH) e cultivadas a 31,5°C com agitação até o açúcar ser completamente consumido. Após completamento da cultura, mediu-se a quantidade de L-glutamina acumulada e a OD no caldo de cultura. Os resultados são mostrados na Figura 12. Revelou-se que todas as cepas amplificadas com gene xfp apresentaram alta produção de L-glutamina em comparação com a cepa de controle.
[00324] Embora a invenção tenha sido descrita detalhadamente com referência a concretizações preferidas da mesma, alguém com prática na técnica perceberá que é possível realizar várias alterações, e empregar equivalentes, sem afastar-se do escopo da invenção. Todas as referências aqui indicadas, incluindo os documentos de prioridade RU 2004124226 e US 60/644,562, são incorporadas como parte deste pedido, por referência.

Claims (8)

1. Método para produzir pelo menos um metabólito útil selecionado do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L- prolina e L-leucina, caracterizado pelo fato de compreender cultivar uma bactéria que inerentemente tem atividades de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase em um meio de cultura, e coletar dito metabólito útil a partir do meio de cultura e/ou da bactéria, em que dita bactéria tem uma capacidade de produzir dito metabólito útil, e em que a bactéria é modificada para aumentar as atividades de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase pelo aumento do número de cópias do respectivo gene, em que o gene tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1,3 ou 5, em que a bactéria é selecionada do grupo que consiste de Enterobacteriaceae, bactéria Corineforme, e bactéria Bacillus.
2. Método para produzir pelo menos um metabólito útil selecionado do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L- prolina e L-leucina, caracterizado pelo fato de compreender cultivar uma bactéria que inerentemente não tem atividades de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose-6-fosfato fosfocetolase em um meio de cultura, e coletar ditos metabólitos úteis da cultura e/ou da bactéria, em que dita bactéria tem uma capacidade de produzir dito metabólito útil, e em que dita bactéria é transformada com um fragmento de DNA tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5, em que a bactéria é selecionada do grupo que consiste de Enterobacteriaceae, bactéria Corineforme, e bactéria Bacillus.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a bactéria é modificada para apresentar uma atividade reduzida de 6-fosfofrutoquinase codificada por um gene tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 60.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria pertence ao gênero Escherichia ou Pantoea.
5. Bactéria apresentando uma capacidade de produzir pelo menos um metabólito útil selecionado do grupo consistindo de ácido L- glutâmico, L-glutamina, L-prolina e L-leucina, caracterizada pelo fato de que a bactéria é modificada para ter uma atividade aumentada de D-xilulose-5- fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase pelo aumento do número de cópias do respectivo gene, e é modificado para apresentar uma atividade reduzida de 6- fosfofrutoquinase codificada pelo gene tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 60, em que o gene tem a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5, em que a bactéria é selecionada do grupo que consiste de Enterobacteriaceae, bactéria Corineforme, e bactéria Bacillus.
6. Bactéria de acordo com a reivindicações 5, caracterizada pelo fato de que a bactéria pertence ao gênero Escherichia ou Pantoea.
7. Bactéria que inerentemente tem atividade de D-xilulose-5- fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase, caracterizada pelo fato de que dita bactéria tem uma capacidade de produzir um metabólito útil selecionado do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L- prolina, e L-leucina, e em que dita bactéria é modificada para aumentar a atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfocetolase pelo aumento do número de cópias do respectivo gene, em que o gene tem a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5, em que a bactéria é selecionada do grupo que consiste de Enterobacteriaceae, bactéria Corineforme, e bactéria Bacillus.
8. Bactéria que inerentemente não tem atividades de D- xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose-6-fosfato fosfocetolase, caracterizada pelo fato de que dita bactéria é transformada com um fragmento de DNA tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 3, e em que dita bactéria tem uma capacidade de produzir e causar acúmulo em um meio de uma quantidade de não menor que 0,5 g/L de pelo menos um metabólito útil selecionado do grupo que consiste de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L- prolina e L-leucina, em que a bactéria é selecionada do grupo que consiste de Enterobacteriaceae, bactéria Corineforme, e bactéria Bacillus
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