BRPI0514778B1 - Meio para cultivar células tronco embrionárias - Google Patents

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Abstract

meio e cultivo das células tronco embriônica. os métodos prévios para cultivação das células tronco embriônica humana tem requerido ou células alimentadoras do fibroblasto ou um meio, que tem sido exposto às células aumentadoras do fibroblasto, a fim de manter as células tronco em um estado não diferenciado. agora tem agora sido constatado que se os níveis elevados do fator de crescimento do fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, lítio e transformando o fator de crescimento beta são adicionados ao meio em que as células são cultuvadas, as células tronco permanecerão indefinidamente não diferenciadas através das múltiplas passagens, ainda sem células alimentadoras ou meio de condicionado.

Description

(54) Título: MEIO PARA CULTIVAR CÉLULAS TRONCO EMBRIONÁRIAS (51) Int.CI.: C12N 5/00; C12N 5/02 (30) Prioridade Unionista: 08/09/2004 US 60/608,040 (73) Titular(es): WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION (72) Inventor(es): JAMES A. THOMSON; TENNEILLE LUDWING
1/14 “MEIO PARA CULTIVAR CÉLULAS TRONCO EMBRIONÁRIAS”
Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados [001]Este pedido reivindica prioridade do pedido de patente Provisional U.S. número de série 60/608.040, depositado em 08 de setembro de 2004.
Desenvolvimento ou Pesquisa Patrocinada Federalmente de Reparação Relativa a Declaração [002]Esta invenção foi produzida com o apoio do Governo dos Estados Unidos, concedida pelas seguintes agências: NIH RR017721. Os Estados unidos têm certos direitos nesta invenção.
Antecedente da Invenção [003]As células tronco são definidas como células que são capazes de diferenciação em muitos outros tipos de células diferenciadas. As células tronco embrionárias são células tronco dos embriões que são, na maioria, capazes de diferenciação, se não todas, dos tipos de células diferenciadas de um corpo adulto. As células tronco são referidas como pluripotente, as quais descrevem esta capacidade em muitos tipos de células. Uma categoria de célula tronco pluripotente, de interesse elevado para a comunidade de pesquisa é a célula tronco embrionária humana, abreviada aqui como célula ES humana, a qual é uma célula tronco embrionária derivada de uma fonte embrionária humana. As células tronco embrionárias humanas são de grande interesse científico, porque elas são capazes de proliferação indefinida no cultivo e são, desse modo, capazes, pelo menos no princípio, de fornecer tecidos e células para substituição de tecido humano faltando ou defeituoso. A existência no cultivo das células tronco embrionárias humanas oferece o potencial de quantidades ilimitadas de tecidos e células humanas para uso em uma variedade de protocolos terapêuticos para assistir na saúde humana. É previsto que no futuro as células tronco embrionárias humanas serão proliferadas e direcionadas para diferenciar em linhagens específicas de modo a desenvolver os tecidos ou células diferenciados que podem se transplantados nos corpos humanos para propósitos terapêuticos. As células tronco embrionárias humanas e as células diferenciadas que
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2/14 podem ser derivados destas são também tarifas cientificas poderosas para o estudo dos sistemas de desenvolvimento e celular humano.
[004]As técnicas básicas para criar e cultivar as células tronco embrionárias humanas têm sido descritas. As técnicas previamente reportadas fazem o trabalho, porém aqui são limitações e desvantagens para muitos dos procedimentos atualmente empregados para cultivar as células tronco embrionárias humanas. Uma limitação é de particular preocupação. A maioria das linhas de célula tronco embrionária humana existente têm sido, para um degrau ou outro, exposta diretamente as células de rato ou para um meio no qual as células de rato tenham sido previamente cultivadas. O fato de que algumas células ES de linhas de célula existente foram encontradas para exibir resíduo siálico Neu5Gc, que não é normalmente produzido por células humanas, recebeu muita mais atenção na prensa. As técnicas originais para a geração e cultivo de células tronco embrionárias humanas requerendo o uso das células alimentadoras de fibroblasto embrionário de rato (MEF) como uma camada alimentadora na qual as células tronco embrionárias humanas podem ser cultivadas. As células alimentadoras de fibroblasto agem, através de algum, até agora, mecanismo incompletamente entendido, para encorajar as células tronco à permanecerem em um estado não diferenciado. Mais tarde, foi descoberto que o mesmo fenômeno poderia ser obtido se as células trono fossem expostas a “meio condicionado”. O meio condicionado é um meio de cultivo da célula tronco com o qual as células alimentadoras, tais como MEF's, foram previamente cultivadas. Ou as células alimentadoras transmitiram algum fator para os meios ou removeram alguns fatores dos meios, porém o resultado é que o meio condicionado pode ser empregado para cultivar as células tronco sem diferenciação. Ou a condição de cultivo, o crescimento direto de ES humana em células alimentadoras de rato, ou o uso de meio condicionado, aumentam a preocupação de um ou mais agentes tal como um vírus que poderia transmitir das células do rato para as células ES humanas. Se um dos objetivos dos cultivos da célula tronco embrionária humana é criar tecidos os quais podem finalmente ser transplantados em um corpo humano, é altamente desejável que as
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3/14 células tronco nunca tenham sido expostas às células de outras espécies ou a meios que tenham sido empregados para cultivar as células de outras espécies. Consequentemente, definindo a condição de cultivo, que permitirá a proliferação e cultivo de células tronco embrionárias humanas sem uma camada alimentadora de fibroblasto, é de grande interesse no desenvolvimento continuado das técnicas do cultivo à longo prazo de células tronco embrionárias humanas.
[005]Um traço característico das células tronco embrionárias humanas em cultivo é que se as condições são menores do que o ideal, as células têm uma tendência para diferenciar. É fácil induzir as células ES humanas para diferenciar, ao mesmo tempo em que é exigente para manter as células ES humanas em estado não diferenciado no cultivo. A maioria das condições de cultivo resultará em algum nível de diferenciação não desejada, particularmente em volta da periférica do crescimento da colônia de célula ES. Ao mesmo tempo em que as células podem ser cultivadas com algum degrau de diferenciação não desejado, o objetivo é definir uma condição de cultivo que permite o cultivo para permanecer tanto não diferenciado quanto possível, isto é, com tantas poucas células diferenciadas quanto possíveis. Acreditamos que temos empregado particularmente padrões estritos para definir as condições que suportarão o cultivo indefinido dos cultivos de célula ES não diferenciados.
[006]Os vários meios de formulações permitirão que as células ES humanas permaneçam não diferenciadas por algum tempo, porém esse estado muitas vezes mantém-se. Em particular, definimos o crescimento das células ES humanas de um cultivo de semente inicial em um recipiente de cultivo em um recipiente de cultivo para confluência no mesmo recipiente de cultivo como “passagem.” Temos encontrado vários meios de formulações que permitem o cultivo das células ES humanas para um ou duas passagens sem grave diferenciação, porém então as células diferenciam-se rapidamente sob passagens subsequentes. Temos visto para acreditar que, em consequência, por um meio para verdadeiramente suportar a proliferação indefinida das células ES humanas sem diferenciação, sem o meio condicionado ou
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4/14 células alimentadoras do fibroblasto, o meio deve ser demonstrado para suportar o cultivo das células ES humanas em um estado não diferenciado e substancialmente uniforme para pelo menos cinco passagens. É também importante que os cultivos permaneçam relativamente homogêneos e não diferenciados em todo o período de cultivo e retenha todas as características importantes das células ES humanas.
[007]O estado de diferenciação de um cultivo de célula tronco pode ser avaliado mais facilmente julgar as características morfológicas das células. As células tronco não diferenciadas têm uma característica morfológica, isto é, células compactas e pequenas com limites das células claramente definidos, uma morfologia que pode ser facilmente vista por exame de um cultivo de célula tronco sobre um microscópio. Em contraste, as células que têm grande aparência diferenciada e mais difunde-se com limites indistintos. Ao mesmo tempo em que algumas células diferenciadas podem, e normalmente fazem, aparecer na margem das colônias das células não diferenciadas, o cultivo da célula tronco ideal é um que se prolifera no recipiente de cultivo com somente os números mínimos das células na periferia do cultivo mostrando-se ser diferenciado. Com experiência, um pode decidir o status de diferenciação e saúde dos cultivos de célula ES humana visualmente com boa exatidão. Um marcador bioquímico que é empregado para rastrear o status das células ES como não diferenciadas é a presença do fator de transcrição Oct4, que tenha surgido para ser considerado como o marcador mais seguro do status das células ES, e que é um dos primeiros marcadores perdidos como células não diferenciadas começadas para diferenciar.
Breve Sumário da Invenção [008]A presente invenção é resumida como um método para cultivar células tronco embrionárias humanas sem a necessidade das células alimentadoras ou meio condicionado, o método incluindo a etapa de cultivo de células tronco embrionárias humanas em um meio incluindo sais, vitaminas, aminoácidos, glicose, um fator de crescimento do fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, lítio e fator de transformação do crescimento beta, tudo em quantidade suficiente para
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5/14 manter as células tronco em um estado não diferenciado através múltiplas passagens de cultivo.
[009]A presente invenção está também direcionada para um cultivo de célula in vitro das células tronco embrionárias humanas em um meio incluindo níveis elevados de um fator de crescimento do fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, lítio e fator de transformação do crescimento beta a fim de que as células tronco possam ser cultivadas indefinidamente em um estado não diferenciado sem a necessidade de células alimentadoras do fibroblasto ou meio condicionado.
[010]É um objetivo da presente invenção definir as condições de cultivo à longo prazo para as células tronco embrionárias humanas que evitar o uso de ou exposição a células animais e proteínas animais, quer de células alimentadoras ou para condicionar o meio em que as células tronco são cultivadas.
[011]É outro objeto da presente invenção definir as condições de cultivo para as células tronco embrionárias humanas que são tão definidas quanto possível, ao mesmo tempo em que mantendo a proporção máxima de célula no cultivo como possível em um estado não diferenciado.
[012]Outros objetos, características e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes na seguinte especificação.
[013]Breve Descrição das Várias Considerações dos Desenhos [014]Fig. 1 apresenta os dados presentes do trabalho experimental descrevem na especificação abaixo de exibição que os componentes do meio reduzem a proporção de células diferenciadas no cultivo do crescimento das células ES neste.
[015]Fig. 2 apresenta uma apresentação gráfica dos dados exibindo que o meio com as proteínas da matriz humana resulta em células ES humanas cultivadas que não exibem um resíduo de ácido siálico de origem não humana.
[016]Fig. 3 é uma apresentação gráfica dos dados exibindo o nível elevado de células não diferenciadas no cultivo da célula tronco humanas.
[017]Fig. 4 é uma representação gráfica de dados exibindo que o meio descrito aqui resulta em forte crescimento dos cultivos de célula tronco.
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Descrição Detalhada da Invenção [018]Temos identificado múltiplos meios e condições de cultivo os quais permitem o cultivo indefinido e forte proliferação das células tronco embrionárias humanas em um estado não diferenciado e também na ausência completa de ambos células alimentadoras e meio condicionado. O desenvolvimento desse meio e condições de cultivo tornam possível a derivação e manutenção das linhas de células ES humanas, condições controladas e definidas sem exposição direta ou indireta das células animais de qualquer espécie. Este meio tem sido demonstrado suportar a proliferação de célula ES humanas não diferenciadas através das múltiplas passagens, pelo menos cinco, que é forte evidência de que suportará tais cultivos indefinidamente.
[019]Um meio humanizado e definido para o cultivo e proliferação das células ES humanas tipicamente inclui sais, vitaminas, uma fonte de glicose, minerais e aminoácidos. Para suplementar o meio e condições de fornecimento para suportar o crescimento da célula, inicialmente os meios de célula tronco incluindo soro de uma fonte ou outra. Também previamente tem sido relatado que a adição do fator de crescimento do fibroblasto mais uma substituição de soro aditivo permitirá o cultivo das células ES humanas sem soro. A substituição do soro pode ser um produto comercialmente disponível vendido com esse propósito ou pode ser uma mistura formulada de proteína, tal como albumina de soro, vitaminas, sais, minerais, uma transferrina ou um substituto de transferrina, e insulina ou um substituto de insulina. Este composto de substituição de soro pode também ser suplementado com selênio. Aqui é preferido que uma substituição de soro definida pode ser empregada no lugar do soro de qualquer fonte em cultivo de células ES humanas, além disso, evitar as emissões da variação em componentes de soro e para usar meios que são tão definidos quanto possíveis. Temos definido um meio suficiente, e todos os componentes do meio ensinados aqui são descritos na Tabela 1 apresentada abaixo, que lista todos os componentes de nosso meio, designado TeSR1, por concentração dos componentes. O meio TeSR1 é compreendido de uma base DMEM/DF12, suplePetição 870180035313, de 30/04/2018, pág. 14/28
7/14 mentada com albumina de sérica humana, vitaminas, antioxidantes, traços de minerais, lipídeos específicos, e fatores de crescimento clonados.
[020]Para evitar a necessidade de uma camada alimentadora do fibroblasto, previamente suspeita de ser necessária para manter as células ES humanas em um estado não diferenciado, aqui é relatado que a combinação do uso de concentrações mais elevadas de FGF (10 a 1000 ng/ml) junto com o uso do GABA (ácido gamaaminobutírico), ácido pipecólico (PA), lítio (LiCl) e fator de transformação do crescimento beta (TGFj8), permitirão um meio de suportar o crescimento da célula tronco não diferenciada. A combinação destes aditivos tem sido constatada ser suficiente para manter o cultivo das células ES humanas em um estado não diferenciado indefinidamente sem a exposição a ou células alimentadoras ou meio condicionado. Estes aditivos ao demonstravelmente suficientes. Entretanto, todos deles podem não ser necessários para cada meio de formulação. Por apagamento seletivo destes aditivos, um ou mais destes componentes podem ser deletados resultando nos cultivos de célula Es humana que ainda crescerá em uma perda de pureza de status não diferenciado nos cultivos. Tais cultivos podem ou não podem permanecer estáveis sobre muitas passagens. Entretanto, é claro que a combinação é suficiente para permitir uma variedade de meio que suportará a proliferação e cultivo à longo prazo das células ES humanas não diferenciadas através de um número indefinido de passagens sem as células alimentadoras ou meio condicionado.
[021]Nosso subjetivo inicial protege destes fatores de crescimento individuais, escolhido por causa dos receptores expressados por células ES humanas, vários fatores identificados como tendo efeitos positivos na proliferação não diferenciada. Destes, bFGF, LiCl, ácido γ-aminobutírico (GABA), ácido pipecólico, e TGFp foram ultimamente incluídos em TeSR1. Para cada das quatro linhas de célula testadas, a taxa de proliferação e a porcentagem das células mantendo a expressão das características do marcador da célula ES humana foram mais elevadas em TeSR1 do que no controle das células cultivadas em meio condicionado do fibroblasto, e a remoção de cada um destes cinco fatores diminuíram a realização do cultivo.
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Alguns destes dados são ilustrados na Fig. 1, que mostra que os cultivos crescem no meio com qualquer um destes componentes omitidos exibiu uma porcentagem menor das células que permaneceram não diferenciadas quando comparadas aos cultivos com todos os quatro destes componentes do meio incluídos. Note que Oct4, SSEA-1, SSEA-4, Tra1-60 e Tra1-80 são todas os marcadores da superfície da célula ou fatores de transcrição (Oct4) que são empregados para rastrear o status de diferenciação das células tronco. A Fig. 4 ilustra as provas similares em que foi demonstrado que sobre múltiplas passagens da taxa de crescimento dos cultivos foi o mais elevado quando todos esses componentes juntos foram no meio do cultivo.
[022]É, além disso, útil para incluir nas condições de cultivo para as células ES humanas uma matriz biológica no recipiente de cultivo. Um tal material que tem sido empregado é Matrigel™, o qual é uma membrana basal artificial de origem da célula do rato, que é fornecida como um produto comercial livre das células do rato. Outro material de origem humana agora também conhecido para servir a um propósito similar é fibronectina, uma glicoproteina humana que é empregado nesta forma insolúvel para criar uma matriz de fibra também para servir como uma membrana basal para o cultivo da célula ES. Em nossas mãos uma matriz de fibronectina somente não foi suficiente. Entretanto, agora também foi constatado que um material de matriz humana pode ser produzido de uma combinação das proteínas de matriz humana de colágeno IV, fibronectina, laminina, e vitronectina e esta matriz basta para suportar as células ES humana indefinidamente em um estado não definido no meio TeSR1.
[023]A chegada nos meios do aditivo listado acima seguindo o exame metódico de mais que 80 fatores de crescimento individuais. Ao mesmo tempo em que alguns aditivos parecidos, pelo menos para umas poucas passagens, para suportar no crescimento das células ES humanas no cultivo, muitos fracassados em passagens subsequente para manter as células ES em um estado não diferenciado. Não foram identificadas outras combinações destes fatores que concedam os fatores dos
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9/14 meios aditivos descritos nos exemplos abaixo. Isto é para não dizer que os componentes não estão sujeitos a alguma variação. Por exemplo, o LiCl é usado no meio porque estimula a passagem do tipo áptero. Os tipos ápteros ou outros estimuladores desta passagem tal como activina poderia ser substituída como equivalentes para LiCl, ainda também o LiCl é provavelmente o maior agente econômico para este propósito. Similarmente, o GABA é acreditado para interagir com o receptor GABA, e a literatura científica inclui a identificação de várias moléculas que são agonistas e daquele mesmo receptor e poderia ser substituída por GABA no meio como um equivalente. É também acreditado que o PA também interaja como receptor GABA. Ao mesmo tempo em que ambos PA e GABA são constatados serem úteis no meio nas concentrações empregadas aqui, é também previsto que um ou outro destes componentes poderiam ser dramaticamente aumentados na concentração para remover a necessidade do outro.
[024]O fator de crescimento do fibroblasto em concentrações mais elevadas (40 a 100 nh/ml) aparece para precaver a necessidade das células alimentadoras. O FGF preferido é o FGF básico, também referido como bFGF e FGF2, porém outros FGFs incluindo pelo menos FGF4, FGF9, FGF17 e FGF18 bastarão igualmente para este propósito. Outros FGFs podem, além disso, trabalhar, ainda que em concentrações mais elevadas.
[025]A observação de que os cultivos da célula tronco embrionária (ES) humana tem previamente sido mantida em um estado não diferenciado somente quando cultivada na presença das células alimentadoras de fibroblasto ou em meio condicionado tem induzido para a especulação de que os fibroblastos liberam no meio um fator que age para inibir a diferenciação das células ES. Entretanto, qualquer um efeito que é mediado pelas células alimentadoras do fibroblasto, é agora claro que meio descrito abaixo substituirá aquele efeito. Os três meios definidos abaixo são definidos, não contém células animais, e permite o cultivo à longo prazo das células ES não diferenciadas em um estado diferenciado. Um exemplo também é apresentado por um meio no qual as proteínas no meio são todas humanas, para ter uma
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10/14 matriz e condições de cultivo para evitar qualquer possível preocupação a respeito dos produtos sub celulares de origem animal.
Exemplos [026]Os compostos do meio TeSR1, que foram empregados para todos os cultivos descritos aqui, a não ser de outro modo indicado, é apresentado na Tabela 1 abaixo. Nossos experimentos preliminares sugeriram que a proliferação da célula ES humana não diferenciada foi o máximo em um pH de 7,2, uma osmolaridade de 350 mOsMol, e uma atmosfera de 10 % de CO2/ 5% de O2. Estas condições foram empregadas para todos os cultivos subsequentes descritos aqui.
[027]As células de linhas de células ES humanas H1, H7, H9, e H14 tem proliferado tudo firmemente em TeSR1 para 11, 7, 25 e 17 passagens respectivamente (2-6 meses). Os cariótipos foram confirmados normais para a linha de células H14 após 7 passagens, e H9 após 8 e 21 passagens. A formação de teratoma foi confirmada por H1 e H9 após 11 e 20 passagens.
[028]Tem sido sugerido que os cultivos da célula ES anterior são menos do que o mais adequado por causa da presença de Neu5Gc, um ácido siálico não produzido por humanos. Porque a matriz humana de componentes de colágeno, fibronectina, laminina e vitronectina eliminou o produto animal final das condições de cultivo TeSR1 para células ES humanas, testado se Neu5Gc foi eliminado da existência das linhas de célula ES humana durante o cultivo neste meio. Confirmada a presença de Neu5Gc nas células ES humanas cultivadas em meio condicionada do fibroblasto, detectou uma reduzida, porém detectável quantidade nas células cultivadas em TeSR1 no Matrigel, e poderia não detectar qualquer Neu5Gc nas células ES cultivadas em TeSR1 empregando os quatro componentes da matriz humana. Estes dados são ilustrados na Fig. 2. Desse modo as células ES humanas cultivadas em TeSR1 e em uma matriz de proteínas humanas não exibem os resíduos de ácido siálico não humano constatado em células cultivadas em células alimentadoras de ratos.
[029]Para testar as condições das colônias de célula ES e adequadamente
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11/14 do cultivo para manutenção a longo prazo dos cultivos da célula ES humana, o meio TeSRI foi comparado a melhor condição do meio anterior, que em nossas mãos é o uso do meio condicionado. Foi constatado que o meio TeSR1 foi capaz de manter as células ES humana em um tal estado não diferenciado de sobre 90% das células continuadas para teste positivo para Oct 4 até após o cultivo a longo prazo. Os resultados deste teste são apresentados no grafo da Fig. 3. Isto representa a primeira instância conhecida em que qualquer alimentadora livre e meio livre do meio condicionado tendo mantido um nível de crescimento não diferenciado das células ES para extensão sobre 90% das células na sobra do cultivo não diferenciado em todos os estágios.
[030]A curva de crescimento de análise de FACS das células H1 cultivadas durante 3 passagens foi medida no meio TeSR1 e no meio TeSR da qual cada dos seguintes componentes tem sido omitido: TGF^S, PA, LiCl, GABA e bFGF. Para iniciar os cultivos, 3 X 105 células de cada linha de célula foram chapeadas no Dia O da passagem 1. Os números de células foram contados de cavidades triplicadas para avaliar a ligação (dia 2-3) e número final de célula em passagem (dia 6-7). A densidade revestida inicial e tempos de amostra foram repetidos, quando possível, durante 5 passagens. As células foram analisadas no dia 6 da passagem 3 por FACS para os marcadores da superfície da célula SSEA1, SSEA4, Tra 1-60 e Tra 181 e para o fator de transcrição Oct4. Estes dados são apresentados graficamente na Fig. 1. Estes dados mostram que as células ES humana que podem ser cultivadas na falta do meio de cada destes componentes no custo de alguma diferenciação não desejada das células no cultivo, e que o nível mais elevado do cultivo não diferenciado poderia somente ser executada por empregar todos estes componentes. Os resultados similares foram obtidos com outras linhas de células como poço.
[031]A pluripotência das linhas de célula ES humana mantida no meio
TeSR1 foi testada. As células das linhas de célula iniciada novamente WA01 e
WA09, cultivadas em matriz TeSR1 Medium on Matrigel durante 11 e 20 passagens, respectivamente foram injetadas no rato beije-SCID. As teratomas exibindo o comPetição 870180035313, de 30/04/2018, pág. 19/28
12/14 plexo de diferenciação desenvolvido no rato de 6-8 semanas pos incubação. Tabela 1 Formulação Completa para Meios de TeSR1
SAIS INORGÂNICOS mM
Cloreto de cálcio (Anidro) 0,8232
HEPES 11,76
Cloreto de magnésio (Anidro) 0,2352
Sulfato de Magnésio (MgSO4) 0,319088
Cloreto de potássio (KCl) 3,26144
Bicarbonato de sódio (NaHCO3) 11,2112
Cloreto de sódio (NaCl) 94,55824
Fosfato de sódio, dibas (Anidro) 0,392
Fosfato de sódio, mono (NaH2PO4-H2O) 0,355152
MINERAIS DO TRAÇO
Nitrato Férrico (Fe(NO3)3-9H2O) 0,00009408
Sulfato férrico (FeSO4-7H2O) 0,001176
Sulfato Cúprico (CuSO4-5H2O) 4,0768E-06
Sulfato de zinco (ZnSO4-7H2O) 0,001176
Metavanadato de amônio 0,000056
Sulfato de Manganês 1,00592E-05
Molibdado de Amônio 1,00404E-05
NiSo4 6H20 4,94861 E-06
Meta Silicato de Sódio Na2SiO3 9H2O 0,004926108
SnCl2 5,32544E-06
CdCl2 6,21931E-05
CrCl3 9,41176E-06
Ag No3 5,00293E-06
AlCl3 6H2O 2,4855E-05
Ba (C2H3O2)2 4,99217E-05
CoCl2 6H2O 5,0021E-05
GeO2 2,5337E-05
KBr 5,04202E-06
KI 5,12048E-06
NaF 0,000500119
RbCl 5,00414E-05
ZrOCl2 8H2O 9,03834E-05
FATORES DE CRESCIMENTO
GABA 0,979
Ácido pipecólico 0,000984
bFGF 5,80E-06
LiCl 0,979
TGF beta 1 2,35E-08
LIPÍDEOS
Ácido linoléico 0,0070976
Ácido Lipóico 0,0039984
Ácido Araquidônico 0,001312
Colesterol 0,0113798
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13/14
DL-alfa tocoferol-acetato 0,02962
Ácido linolênico 0,007184
Ácido mirístico 0,008758
Ácido Oléico 0,00708
Ácido Palmitoléico 0,007862
Ácido esteárico 0,00703
AMINOÁCIDOS
L-Alanina 0,1392
L-Arginina cloridrato 0,5488
L-Asparagina H2O 0,1392
L-Ácido Aspártico 0,1392
L-Cisteina-HCI-H2O 0,0784
L-Cistina 2HCI 0,0784
L-Ácido Glutâmico 0,1392
L-Glutamina 2,96
Glicina 0,296
L-Hisitidina-HCI-H2O 0,1176
L-isoleucina 0,326144
L-leucina 0,353584
L-Lisina de cloridrato 0,391216
L-Metionina 0,090944
L-Fenilalanina 0,16856
L-Prolina 0,2176
L-Serina 0,296
L-Treonina 0,352016
L-Triptofan 0,0346528
L-Tirosina de 2Na de 2H2O 0,167776
L-Valina 0,354368
VITAMINAS
Ácido ascórbico 0,375
Biotina 1,12112E-05
Clorido de colina 0,0502544
D-cálcio pantotenato 0,0036064
Ácido Fólico 0,004704
i-Inositol 0,05488
Niacinamida 0,012936
Cloridrato de piridoxina 0,0076048
Riboflavina 0,0004704
Cloridrato de Tiamina 0,02460217
Vitamina B12 0,000392
SUBSTRATOS DE ENERGIA
D-Glicose 13,72784
Piruvato de Sódio 0,392
PROTEÍNAS
Insulina Humana 0,0034438
Holo-Transferrina Humana 0,14
Albumina Sérica Humana 199,7
OUTROS COMPONENTES
Glutationa (reduzida) 0,00592996
Hipoxantina Na 0,01176
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14/14
Fenol vermelho
Putrescina-2HCI
Timidina
2-mercaptoetanol Selênio Pluronico F-68 Entre 80
0,0159936
0,000394352
0,001176
0,1
0,000177304
0,238
0,3358
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1/1

Claims (4)

REIVINDICAÇÕES
1/4
FIG 1
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1. Meio para cultivar células tronco embrionárias, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio compreende sais, vitaminas, aminoácidos, glicose, um fator de crescimento do fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, lítio e fator de transformação do crescimento beta em quantidades suficientes para manter as células tronco embrionárias no meio em um estado não diferenciado através das múltiplas passagens de cultivo.
2/4
100π3
-Η υ
G <(ti
P
G o
ω
P (ti >
H (ti
-H υ
G <g
P
G
O ω
P
NeuSAe « comum (a)
NettSGcsNao humano
Mb) >”T“’ ’46
Tempo (min)
FIG 2
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2. Meio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio ainda compreende as proteínas selecionadas a partir do grupo consistido em albumina, insulina e transferrina.
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3/4 .ς.ςρΑζί
ΜΙ
F1G3
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4/4 o
ο φ
Ό
Ο
Αι
Φ
-ΪΘΡβ
-ΡΑ
-GABA
-LICI
-bFGF
J 1 Dia (0 Dia 2 Dia 6 Dia 0 Dia 2 Dia 7 Dia 0 Dia 3 Dia 7 —li— 1 **+a o,o 1 +A 0,1 17¼ 3,8 3+A 0,0 1+A 0,5 54 +/- 3,9 3+A Qt? S+A 0,9 41 +>· 4,1 3+A 0,0 1 +A 0,2 24 +A 2,0 3 +/- 0,0 2+/- 0,3 1 +/- 0,0 38'+A 3,U* 3 +A 0,0 8 -rA 0,5* 44- •tf*' 4,4 a+A o,o 1 +A 0,3 12 rA 0,7 Í2+A 3,4 3+A 0,0 30,0 45 +/- 1,9* 3+A 0,0 5+A o,e 23 +A 2,3' ‘31 +/ S,1‘ 3 47* 0,0 1 +A 0,2 Ί 47- 0,8 39 +/- 0,5* 3 a- 0,0 8 1À 1,2* -B- 3+A 0,0 1 +A 0,2 15+A 1,6 3 ,A 0,0 1 -pZ- 0/8 47 +A 2,8 3¼ Q,0 S +A 0,9* 32¼ 3,2’ 3+A 0,0 0+A 0,0' ';4+7- 0,4* g+A ο,ο ί +A 0,1 18, +A 1,7' 8 tA 2'+/- Q.4' 18 +A 1,6* Passagem 1 Passagem 2 Passagem 3
FIG 4
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