BRPI0515929B1 - método para modificar morfologia em uma planta, ácido nucleico, gene quimérico, dna recombinante, métodos para regular a expressão de um gene em uma planta e para modificar o metabolismo de uma célula de uma planta transgênica, e, usos de um ácido nucleico e de um gene quimérico - Google Patents

Abstract

"método para modificar morfologia em uma planta, ácido nucleico, gene quimérico, dna recombinante, planta, célula vegetal, métodos para regular a expressão de um gene em uma planta, e para modificar o metabolismo dentro de uma célula de uma planta transgênica, e, usos de um ácido nucleico e de um gene quimérico". a presente invenção se refere a um método para modificar morfologia em uma planta compreendendo introduzir em uma planta pelo menos um gene quimérico compreendendo uma seqüência promotora operativamente associada com uma seqüência de ácidos nucleicos, a seqüência promotora sendo operável para direcionar expressão em células específicas da planta,e a seqüência de ácidos nucleicos codificando pelo menos um produto de gene capaz de alterar o metabolismo de ou causar morte das células específicas e/ou células vizinhas. em particular, a seqüência promotora é operável para direcionar expressão em gema lateral ou broto lateral e o ácido nucleico codificando pelo menos um produto de gene capaz de interromper o metabolismo de ou causar a morte da gema lateral ou broto lateral ou células vizinhas. preferivelmente a seqüência promotora compreende a seqüência mostrada como seq id no. 1 ou seq id no. 7 ou seq id no. 4, ou uma parte destas capaz de regular expressão de um gene, ou uma seqüência tendo pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 75%, de homologia com seq id no. 1 ou seq id no. 7 e sendo capaz de regular expressão de um gene.

Description

“MÉTODO PARA MODIFICAR MORFOLOGIA EM UMA PLANTA, ÁCIDO NUCLEICO, GENE QUIMÉRICO, DNA RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA REGULAR A EXPRESSÃO DE UM GENE EM UMA PLANTA E PARA MODIFICAR O METABOLISMO DE UMA CÉLULA DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, E, USOS DE UM ÁCIDO NUCLEICO E DE UM GENE QUIMÉRICO” CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a um método para modificar o desenvolvimento e morfologia de uma planta. A invenção adicionalmente se refere ao uso de uma seqüência de DNA para regular expressão exógena de gene em tecidos de uma planta. A invenção ainda adicionalmente se refere a uma seqüência de DNA identificada que atua como um promotor que é operável para direcionar expressão em células específicas de uma planta. FUNDAMENTO DA TÉCNICA O controle de morfologia vegetal é de suma importância na produção comercial de plantas para propósitos de agricultura ou horticultura, para aumentar produtividade e rendimento, para melhorar a eficiência de agricultura e colheita, e para atingir conveniência estética. Características que requerem controle ou modificação podem incluir a morfologia da flor, fruto ou tubérculo, a quantidade de flores, fruto, semente ou tubérculos, a extensão de raízes primárias e laterais, a forma dos brotos aéreos ou tronco, e a presença de espinhos ou pêlos urticantes. Outras características que podem ser desejavelmente controladas incluem o adiantamento ou retardamento de abscisão de folhas, flores ou fruto, a liberação de sementes, e a produção de órgãos de armazenamento ou glândulas secretoras.

Mudanças morfológicas freqüentemente ocorrem como um resultado de impacto ambiental na planta, incluindo dano físico, predação por herbívoro, infecção por patógeno, frio, calor, e seca. Elas freqüentemente podem ser ocasionadas deliberadamente por intervenção humana, ou fisicamente (podando, curvando, amarrando, fortificando, ou excisando órgãos ou estmturas particulares) ou quimicamente (aplicação de agroquímicos e substâncias de crescimento vegetal). Qualquer que seja o agente causador, mudanças morfológicas são decretadas por expressão de genes dentro das células da planta por si só. No início da mudança, o início de expressão de um ou mais genes ocorre naqueles tecidos particulares onde crescimento, proliferação, desenvolvimento ou neerose celular é requerido para culminar na mudança física total. A expressão de um gene é dependente de sua sequência de DNA sendo transcrita para RNA pela ação de RNA polimerase. Para atingir, RNA polimerase deve reconhecer e se ligar a uma região de seqüência de DNA localizada antes da (i.e. 5' a) seqüência de codificação de gene a fim de que transcrição seja iniciada. Uma tal região é denominada o promotor do gene. A natureza intrínseca da seqüência promotora determina as circunstâncias e a maneira na qual o gene é expresso.

Existem, falando amplamente, quarto tipo de promotores encontrados em tecidos vegetais; constitutivo, tecido específico, regulado por desenvolvimento, e induzível/reprimível, embora deva ser entendido que estes tipos não são mutuamente exclusivos.

Um promotor constitutivo dirige a expressão de um gene ao longo das várias partes de uma planta continuamente durante desenvolvimento de planta, embora o gene não possa ser expresso no mesmo nível em todos os tipos de célula. Exemplos de promotores constitutivos conhecidos incluem aqueles associados com o transcrito 35S do vírus do mosaico da couve-flor (Odell et ai, 1985), o gene de actina 1 do arroz (Zhang et al, 1991) e o gene de ubiquítma 1 do milho (Comejo et al, 1993).

Um promotor tecido específico é um que dirige a expressão de um gene em uma (ou poucas) parte de uma planta, normalmente por todo o tempo de vida daquelas partes vegetais. A categoria de promotor tecido específico comumente também inclui promotores cuja especificidade não é absoluta, i.e. eles também podem direcionar expressão em um nível inferior em outros tecidos do que o tecido preferido, Exemplos de promotores tecido específicos conhecidos na arte incluem aqueles associados com o gene de patatina expresso em tubérculo de batata e o gene de glutenina de alto peso molecular expresso em endosperma de trigo, cevada ou milho.

Um promotor regulado por desenvolvimento dirige uma mudança na expressão de um gene em uma ou mais partes de uma planta em um momento específico durante desenvolvimento de planta. O gene pode ser . expresso naquela parte da planta em outros momentos em um nível diferente (normalmente inferior), e também pode ser expresso em outras partes da planta.

Um promotor induzível é capaz de direcionar a expressão de um gene em resposta a um indutor. Na ausência do indutor o gene não será expresso. 0 indutor pode atuar diretamente na seqüência promotora, ou pode atuar agindo contra o efeito de uma molécula repressora. O indutor pode ser um agente químico tal como um metabólito, uma proteína, um regulador de crescimento, ou um elemento tóxico, um estresse fisiológico tal como calor, ferimento, ou pressão osmótica, ou uma consequência indireta da ação de um patógeno ou peste. Um promotor regulado por desenvolvimento pode ser descrito como um tipo específico de promotor induzível respondendo a um indutor endógeno produzido pela planta ou a um estímulo ambiental em um ponto particular do ciclo de vida da planta. Exemplos de promotores induzíveis conhecidos incluem aqueles associados com resposta à ferida, tal como descrito por Warner et al (1993), resposta à temperatura como descrito por Benfey & Chua (1989), e quimicamente induzido, como descrito por Gatz (1995).

Uma seqüência promotora pode compreender diversos domínios definidos necessários para sua função. Um primeiro destes compreende aproximadamente 70 pares de bases localizada imediatamente anterior ao (isto é, 5’ a) gene estrutural e forma a região promotora. A região promotora contém as caixas CAAT e TATA e define o sítio de início de transcrição para o gene. Uma série de seqüências reguladoras anteriores ao promotor nuclear constituem o remanescente da seqüência promotora e determinam os níveis de expressão, os padrões espacial e temporal de expressão, e a resposta a indutores. Em adição alguns promotores contêm elementos de seqüência que atuam para aumentar o nível de expressão, por exemplo aquele do promotor de plastocianina de ervilha como descrito em Publicação de Patente Internacional No. WO 97/20056.

Modificação genética de plantas depende da introdução de genes quiméricos em células vegetais e sua expressão controlada sob a direção de um promotor. Promotores podem ser obtidos a partir de diferentes fontes incluindo animais, plantas, fungos, bactérias, e vírus, c promotores diferentes podem trabalhar com diferentes eficiências em diferentes tecidos. Promotores também podem ser constmídos sinteticamente.

Pode ser frequentemente desejável expressar genes introduzidos em diversos tecidos diferentes dentro de uma planta. Por exemplo a expressão de uma resistência a um patógeno ou peste, ou tolerância a extremos de temperatura pode ser melhor expressa ao longo de todos os tecidos em uma planta. Similarmente pode ser desejável assegurar a expressão dos transgenes em todos os momentos ao longo do desenvolvimento da planta. Também, um promotor que é expresso em uma maneira que é imune à influência de indutores e repressores resultando de estímulo ambiental inesperado também pode ser útil para assegurar a expressão continuada de uma característica. Para estes propósitos, o uso de um promotor "constitutivo" seria desejável. Exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor CaMV 35S. Para cereais o promotor de ubiquitina é um promotor constitutivo de escolha (Christensen & Quail, 1996).

Entretanto, em algumas instâncias é mais desejável controlar a localização de expressão de gene em uma planta transgênica. Isto pode aumentar o efeito de expressão de gene assegurando que expressão ocorra preferencialmente naqueles tecidos onde o efeito do produto de gene é mais eficaz. Pelo mesmo argumento, expressão modulada pode reduzir perda potencial de rendimento limitando o consumo de recurso na planta. Vantagens adicionais incluem limitar a expressão de genes deletérios geralmente ainda agronomicamente úteis a tecidos específicos por localização e compartimentalização de expressão de gene em casos onde o produto de gene deve ser restrito a, ou excluído de, certos tecidos. Por exemplo, expressão antera específica dos genes de inibidor de suc (Mariani et al, 1990) foi usada em sistemas de esterilidade masculina, ao passo que expressão em outras partes da planta iria resultar em toxicidade, Um sistema de morte celular similar é descrito em Pedido de Patente Internacional WO 89/10396 onde uma proteína RNAse é usada em combinação com um promotor antera específico para causar necrose das células da antera e conferir esterilidade masculina na planta.

Em Pedidos de Patentes Internacionais WO 02/33106 e WO 02/33107 são descritos sistemas vegetais de morte celular fornecendo resistência à infecção por nematóide pela expressão de uma proteína de inativação de ribossomo (Proteína de inativação de ribossomo de milho, proteína antiviral de erva-dos-cancros) sob a regulação de promotores específicos de sítio de alimentação de nematóide. Nestes casos a especificidade de expressão do gene deletério é realçada pelos promotores sendo tecido específicos e responsivos à invasão de nematóide.

Em algumas instâncias dois ou mais transgencs podem ser expressos em uma planta em localizações similares ou diferentes. Cada transgene pode ser expresso sob o controle de um promotor diferente que expressa em mais do que uma região da planta. Os promotores podem ser selecionados de forma que exista uma sobreposição em seus respectivos sítios de expressão em uma ou mais localizações desejadas. Este(s) sítio(s) de sobreposição dá(ao) aumentada especificidade e direcionamento de expressão de gene. Por seleção criteriosa do produto de gene codificado por cada transgene, a expressão sobreposta de ambos transgenes pode levar a um efeito aditivo ou realçado nos tecidos alvos, ao passo que expressão de apenas um ou outros dos transgenes em outras localizações pode não causar nenhum efeito na planta. Por exemplo em Pedido de Patente Internacional WO 02/33106 dois domínios peptídicos separados derivados de Proteína Inibidora de Ribossomo de Milho (RIP) são expressos sob a regulação de dois promotores tecido específicos diferentes, tendo diferentes perfis de expressão mas que todavia têm um sítio em comum, resultando na produção de uma proteína ativa no sítio de sobreposição.

Inversamente, os dois transgenes podem codificar uma molécula efetora e uma molécula agonista ou protetora. Neste caso, a molécula efetora irá afetar a planta em todas as localizações onde ela é expressa, exceto aquelas onde o sítio de expressão sobrepõe com aquele de expressão da molécula agonista ou protetora. Em NZ 260511 um sistema vegetal de morte celular é proposto com especificidade de tecido aumentada. Este sistema compreende a expressão de uma molécula citotóxica (sob o controle de um primeiro promotor, cujo primeiro promotor causa expressão em células alvo específicos e em um ou mais outros sítios na planta), em conjunção com uma molécula protetora (sob o controle de um segundo promotor, cujo segundo promotor causa expressão em todos os sítios onde o primeiro promotor é ativo exceto as células alvo específicos), Exemplos de moléculas citotóxicas e protetoras adequadas são proteases e inibidores de protease, respectivamente, ou nucleases e inibidores de nuclease, respectivamente. WO 93/10251 descreve o uso de uma molécula citotóxica de ribonuclease Bamase junto com a molécula protetora de inibidor Barstar.

Outro exemplo de um sistema transgênico de dois componentes é fornecido em Pedido de Patente Internacional No. W098/44138. Este sistema compreende a expressão de um produto de gene sob o controle de um promotor, cujo promotor e produto de gene são selecionados de forma que exista uma sobreposição em seus respectivos sítios de expressão e efetor em uma localização desejada. O promotor dirige expressão nas células específicas e também em um ou mais outros sítios na planta, enquanto que o alvo molecular do produto de gene ocorre em uma segunda variação de células também incluindo as células alvo específicas. Este(s) sítio(s) de sobreposição dá(ao) especificidade e direcionamento de expressão de gene aumentados para as células na localização desejada. Por seleção criteriosa do produto de gene codificado pelo transgene, a expressão em células não alvo não causa nenhum efeito na planta.

Uma aplicação principal da expressão localizada de um gene deletério para um tecido particular, seria na modificação de morfologia vegetal, por exemplo pela necrose controlada ou prevenção de desenvolvimento de certos tecidos ou órgãos, tal como estruturas de florescimento, corpos de frutificação, tecidos de armazenamento, brotos, tecidos foliares, tecidos de raiz, zonas de abscisão, glândulas secretoras, células urticantes, tricomas, ou espinhos.

Uma aplicação particular de expressão localizada de um gene deletério para modificar morfologia vegetal seria na prevenção de crescimentos de broto lateral a partir de meristemas axilares de folha. A anatomia de meristemas axilares e gemas laterais são descritas em Esau (1960). Crescimento de brotos laterais surge mais comumente quando a dominância do broto apical é removida ou reduzida; por exemplo quando o broto apical é danificado ou removido, ou acidentalmente através de dano físico ou predação por herbívoros, ou como parte de prática agrícola e.g. brotação de cepas. Outras mudanças que modificam por exemplo a produção, transporte, detecção, ou metabolismo de substâncias endógenas de crescimento vegetal também podem causar crescimento a partir de meristemas axilares. Brotos laterais, ou "brotos secundários", podem ser indesejáveis por razões puramente estéticas, podem produzir uma planta com morfologia inutilizável, ou podem ter um efeito metabólico prejudicial na planta como um todo atuando como uma fonte ou dreno adicional para vários metabólitos ou substâncias de crescimento vegetal.

Um exemplo onde crescimento de gema lateral ocorre é no cultivo comercial de tabaco, onde o broto apical compreendendo a inflorescência e folhas mais superiores é removido em um momento específico durante o crescimento da planta, em um processo chamado "poda de topo", para estimular crescimento e desenvolvimento das folhas remanescentes, para aumentar crescimento de raiz, e para encorajar a redistribuiçao de metabólitos e compostos secundários para as folhas da planta. A desvantagem para o processo de poda de topo é que ele também estimula o crescimento de brotos laterais o que através disso compensa a desejada redistribuiçao de metabólitos. Este efeito é comumente conquistado pela remoção física dos brotos laterais o que é trabalho altamente intensivo ou pela aplicação de supressores químicos de broto tal como hidrazida maleica, o que é custoso em termos de materiais e pode resultar na retenção de resíduos químicos na planta colhida. Um sistema que previne tal "formação de brotos secundários" direcionando especificamente a divisão daquelas células envolvidas em crescimento de gema lateral, iria portanto fornecer um grande benefício para o cultivo de tabaco.

Proteínas de inativação de ribossomo (RIPs) é um grupo de proteínas vegetais tóxicas que cataliticamente inativam ribossomos eucarióticos (Stirpe e Barbieri 1986). Função de RIPs como N-glicosidases para remover uma adenina específica em uma alça conservada do rRNA. grande, e através disso prevenir ligação de Fator de Alongamento 2, assim bloqueando síntese de proteína celular. Três formas de RIPs foram descritas. RIPs tipo 1 tal como proteína antiviral de erva-dos-cancros e inibidor de tradução de cevada são cada compreendidos de uma cadeia de polipeptídeo única, cada com um valor Mr aproximado de 30.000. RIPs tipo 2 tal como ricina, abrina e modecina compreendem cada duas cadeias de polipeptídeo, uma com atividade de RIP ligada por uma ponte dissulfeto à outra cadeia de lectina de ligação de galactose. RIPs tipo 3 tal como RIP de milho compreendem uma cadeia de polipeptídeo única que subsequentemente passa por clivagem proteolítica para liberar dois domínios peptídicos ativos.

Erva-dos-cancros (Phytolacca americana) produz três proteínas antivirais distintas, em outras palavras PAP', PAPII e PAP-S que aparecem em folhas de primavera, folhas de verão e sementes, respectivamente. Similaridades de aminoácidos entre estas três proteínas foram observadas. Como usado neste lugar 'PAP' cobre todas as três destas proteínas antivirais.

Patente Norte-Americana 6 015 940 descreve a preparação de um clone de cDNA de PAP' preparado a partir de folhas de primavera de erva-dos-cancros, e o uso deste sob o controle de um promotor constitutivo (ou promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor ou o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária) na produção de plantas transgênicas de tabaco e batata resistentes à infecção pelos vírus PVX e PVY.

Plantas transgênicas contendo a forma de folha de verão de PAP, PAP-Π, foram descritas em WO 99/60843. Diversas sequências de comprimento completo e truncadas de gene PAP-II foram tríadas a fim de identificar aquelas proteínas PAP-II variantes que mantiveram atividade antiviral mas não exibiram nenhuma fitotoxicidade. Plantas transgênicas exibiram atividade antiviral e antifungica. O gene PAP é expresso em vivo em folhas inicialmente para produzir uma proteína Pro-PAP inativa. É conhecido que seguindo tradução, a molécula de proteína Pro-PAP' é direcionada para a parede celular. Em algum momento durante este processo as extensões N e C-terminais da molécula de Pro-PAP' são clivadas para produzir uma molécula de PAP1 ativada (PAP’ maduro). No caso de PAP-S (expresso em sementes) a localização celular não é conhecida. Entretanto, a região N-terminal processada de PAP-S parece ter propriedades similares a seqüências sinal para direcionamento. A estrutura da proteína PAP-S madura, i.e. com extensões N e C-terminais removidas, pode ser descrita em termos de dois domínios separados, correspondendo aos dois domínios de RIPS Tipo 3, ou os dois polipeptídeos de RIPs Tipo 2, i.e. o domínio de ligação de ribossomo e o domínio catalítico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto a presente invenção fornece um método para modificar morfologia em uma planta compreendendo introduzir em uma planta pelo menos um gene quimérico compreendendo uma seqüêncía promotora operativamente associada com uma seqüêncía de ácidos nucléicos, a seqüêncía promotora sendo operável para direcionar expressão em células específicas da planta, e a seqüêncía de ácidos nucléicos codificando pelo menos um produto de gene capaz de alterar o metabolismo das células específicas e/ou células vizinhas.

Em uma forma de realização o produto de gene pode ser capaz de realçar o metabolismo de ou promover vigor das células específicas e/ou células vizinhas.

Em outra forma de realização preferível, o produto de gene é capaz de interromper o metabolismo de ou causar morte das células específicas e/ou células vizinhas.

Em um aspecto adicional a presente invenção fornece um método para modificar morfologia em uma planta compreendendo introduzir em uma planta pelo menos um gene quimérico compreendendo uma seqüência promotora operativamente associada com uma seqüência de ácidos nucléicos, a seqüência promotora sendo operável para direcionar expressão substancíalmente especificamente em uma gema lateral e/ou broto lateral, preferivelmente uma célula de início de gema lateral, e o ácido nucléico codificando pelo menos um produto de gene capaz de alterar o metabolismo da gema lateral e/ou células de início e/ou células vizinhas de gema lateral.

Em uma forma de realização o produto de gene pode ser capaz de aumentar o metabolismo de ou promover vigor das células específicas e/ou células vizinhas.

Em outra forma de realização preferida, o produto de gene é capaz de interromper o metabolismo de ou causar morte das células específicas e/ou células vizinhas. O termo "substancíalmente especificamente" como usado neste lugar significa que o promotor de acordo com a presente invenção é operável para direcionar expressão predominantemente na gema lateral e/ou broto lateral. O promotor de acordo com a presente invenção pode em adição a ser operável para direcionar expressão na gema lateral e/ou broto lateral também pode ser operável para direcionar expressão em outro(s) tipo(s) de célula ou tecido(s) dentro da planta contanto que a expressão predominante (i.e. maior do que pelo menos 51% da expressão geral (total) na planta) ocorra dentro de gema lateral e/ou broto lateral. O promotor de acordo com a presente invenção pode em adição a ser operável para direcionar expressão na gema lateral e/ou broto lateral também pode ser operável para direcionar expressão em outro(s) tipo(s) de célula ou íecido(s) dentro da planta contanto que a expressão geral na planta afete apenas (ou afete significantemente) crescimento a partir de meristemas. O promotor de acordo com a presente invenção pode em adição a ser operável para direcionar expressão na gema lateral e/ou broto lateral também pode ser operável para direcionar expressão em outro(s) tipo(s) de célula ou tecido(s) dentro da planta contanto que a expressão geral não mate a planta.

Preferivelmente, o termo "substancialmente especificamente" como usado neste lugar significa que o promotor de acordo com a presente invenção é operável para direcionar expressão predominantemente em gemas laterais e/ou brotos laterais de uma planta tal que, por exemplo, uma seqüência de ácidos nucléícos operativamente associada com dito promotor é expressa predominantemente em gemas laterais e/ou brotos laterais com menos do que 50%, preferivelmente menos do que 25%, preferivelmente menos do que 10%, mais preferivelmente menos do que 5% do nível de expressão total de dita seqüência de ácidos nucléícos sendo em qualquer outro tecido vegetal ou célula da planta.

Por exemplo, uma seqüência de ácidos nucléícos expressa sob o controle do promotor de acordo com a presente invenção pode ser predominantemente expressa na gema lateral e/ou broto lateral com menos do que 25%, preferivelmente menos do que 10%, mais preferivelmente menos do que 5% do nível de expressão total em qualquer outro tecido. A seqüência promotora pode compreender a seqüência mostrada em SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 7 ou SEQ ID No.4, ou uma parte funcional desta, ou uma seqüência tendo pelo menos 60% de identidade com esta.

Preferivelmente a seqüência promotora é a seqüência mostrada em SEQ ID No.l, SEQ ID No. 7 ou SEQ ID No.4, ou uma parte funcional desta, ou uma seqüência tendo pelo menos 60% de identidade com esta.

Preferivelmente, a seqüência promotora compreende a seqüência mostrada em SEQ ID No.l ou uma parte funcional desta ou uma seqüência que é pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 97%, idêntica a esta.

Preferivelmente, a sequência promotora compreende a seqüência mostrada em SEQ ID No. 7 ou uma parte funcional desta ou uma seqüência que é pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 97% idêntica a esta.

Em uma forma de realização da invenção a morfologia de uma planta é afetada por um ou mais produtos de genes, preferivelmente um produto de gene. .

Em uma forma de realização adicional da invenção a morfologia de uma planta é afetada por dois ou mais produtos de genes. Preferivelmente a seqüência de ácidos nucléícos codifica dois ou mais produtos de genes. Assim, para citar um exemplo apenas um gene quimérico pode ser introduzido na planta, cujo gene quimérico compreende uma seqüência de ácidos nucléícos codificando dois ou mais produtos de genes. Altemativamente dois ou mais genes quimérícos podem ser introduzidos na planta, cada gene quimérico compreendendo uma seqüência de ácidos nucléícos codificando um produto de gene. Apenas para citar um exemplo, dois ou mais genes quimérícos podem ser introduzidos na planta, cada gene quimérico compreendendo uma seqüência de ácidos nucléícos codificando um ou mais produtos de genes. Assim, por exemplo, um gene quimérico pode compreender uma seqüência de ácidos nucléícos codificando um produto de gene e um gene quimérico adicional pode compreender uma seqüência de ácido nucléico codificando produtos de genes múltiplos, i.e. 2, 3 ou 4 produtos de genes. Altemativamente, ambos genes quimérícos podem compreender seqüêncía(s) de ácidos nucléícos codificando produtos de genes múltiplos. Preferivelmente os dois ou mais produtos de genes funcionam independentemente um do outro para efetuar interrupção do metabolismo das células por um efeito aditivo. Altemativamente os dois ou mais produtos de genes interagem um com o outro para efetuar interrupção do metabolismo das células por um efeito sinergístíco ou antagonístico.

Preferivelmente o crescimento de brotos laterais é modificado. O crescimento de brotos laterais pode ser realçado. Adequadamente o crescimento de brotos laterais pode ser prevenido ou reduzido e/ou atrasado.

Preferivelmente o crescimento de brotos laterais é modificado interrompendo metabolismo ou causando morte de células envolvidas em desenvolvimento de gema lateral. Células envolvidas no desenvolvimento de gema lateral podem incluir aquelas do pro-meristema, protoderme, epiderme, estômatos, células guarda, endodenne, periderme, parênquima de córtex, células urticantes, células de armazenamento, endosperma de óvulo, pólen, zona de abscisão, tricomas, células secretoras, felema, felogênio, feloderme, procâmbio, câmbio, protoxilema, xilema, feixes, protofloema, íloema, colênquima, esclerênquima, parênquima, clorênquima, túnica, corpo, córtex, estruturas de profilo, e estruturas foliares. O termo "células específicas" como usado neste lugar é pretendido para significar aquelas células nas quais o promotor é predominantemente expresso, preferivelmente aquelas células nas quais o promotor é expresso substancialmente especificamente. O termo "células específicas da planta" inclui gema lateral e/ou células de broto lateral, i.e. aquelas células envolvidas em início de gema lateral e/ou desenvolvimento.

Em uma forma de realização preferivelmente as "células específicas da planta" são a gema lateral e/ou células de broto lateral.

Em uma fomia de realização as células específicas de uma planta podem ser uma célula de um ou mais dos: promeristema, protoderme, epiderme, estômatos, células guarda, endodenne, periderme, parênquima de córtex, células urticantes, células de armazenamento, endosperma de óvulo, pólen, zona de abscisão, tricomas, células secretoras, felema, felogêmo, feloderme, procâmbio, câmbio, protoxilema, xilema, feixes, protofloema, floema, colênquima, esclerênquima, parênquima, clorênquima, túnica, corpo, córtex, estruturas de profilo, e estruturas foliares. O termo "predominantemente expresso” como usado neste lugar significa que o promotor de acordo com a presente invenção é operável para direcionar expressão principalmente (i.e >51% ad expressão total) nas células específicas da planta (tal como a gema lateral e/ou células de broto lateral), embora níveis inferiores de expressão possam ser encontrados em outro(s) tipo(s) de célula ou tecido(s).

Por exemplo, foi encontrado que o promotor de acordo com a presente invenção é operável para predominantemente direcionar expressão na gema lateral e/ou broto lateral mas que também pode haver expressão em outro tecido ou tipo de célula. Por exemplo, também pode haver expressão em tecido de ferida e/ou caule e/ou tecido foliar, Adequadamente o crescimento da gema lateral ou broto lateral pode ser prevenido ou reduzido e/ou atrasado. Preferivelmente o crescimento da gema lateral ou broto lateral é modificado interrompendo metabolismo ou causando morte de células envolvidas em desenvolvimento de gema lateral e/ou broto lateral. O termo "tecido de gema lateral" como usado neste lugar incluí células de gema lateral e/ou células de broto lateral.

Preferivelmente o produto de gene da seqüência de ácidos nucléicos capaz de interromper o metabolismo ou de causar morte de células específicas e/ou células vizinhas é um produto deletério, adequadamente uma molécula citotóxica.

Preferivelmente o produto de gene da seqüência de ácidos nucléicos capaz de interromper o metabolismo ou de causar morte de células específicas e/ou células vizinhas é uma proteína de inativação de ribossomo (RIP) ou uma variante ou parte funcional desta. Por exemplo, o RIP pode ser um RIP Tipo 1 e/ou um RIP Tipo 2 e/ou um RIP Tipo 3 ou uma variante ou parte' funcional deste. Preferivelmente o produto de gene é uma proteína antivíral de erva-dos-cancros (PAP) ou uma variante ou parte funcional desta, O produto de gene pode ser PAP' ou PAPII ou uma variante ou parte funcional deste. Mais preferivelmente o produto de gene é proteína antivíral S de erva-dos-cancros (PAP-S) ou uma variante ou parte funcional desta. A presente invenção também fornece um ácido nucléico compreendendo uma seqüência promotora, a seqüência promotora sendo como mostrado em SEQID No. 1, ou parte funcional deste, ou uma seqüência tendo pelo menos 65% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 75% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 97% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade com esta, o mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade com esta e sendo capaz de regular expressão de um gene. A presente invenção também fornece um ácido nucléico compreendendo uma seqüência promotora, a seqüência promotora sendo como mostrado em SEQ ID No. 7. ou parte funcional deste, ou uma seqüência tendo pelo menos 65% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 75% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 97% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade com esta, o mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade com esta e sendo capaz de regular expressão de um gene, A presente invenção também fornece um gene quimérico compreendendo uma seqüêncía promotora operativamente associada com uma seqüêncía de ácidos nucléicos sendo a seqüência promotora como mostrado em SEQID No. 1, ou parte funcional deste, ou uma seqüência tendo pelo menos 65% de identidade com esta mais preferivelmente pelo menos 75% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 97% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade com esta, o mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade com esta e sendo capaz de regular expressão de um gene. A presente invenção também fornece um gene quimérico compreendendo uma seqüência promotora operativamente associada com uma seqüência de ácidos nucléicos sendo a seqüência promotora como mostrado em SEQ ID No. 7, ou parte funcional deste, ou uma seqüência tendo pelo menos 65% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 75% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 97% de identidade com esta, mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade com esta, o mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade com esta e sendo capaz de regular expressão de um gene. A presente invenção também fornece um gene quimérico compreendendo uma seqüêncía promotora operativamente associada com uma seqüência de ácidos nucléicos sendo a seqüência promotora como mostrado em SEQ ID No. 4, ou uma parte funcional desta, ou uma seqüência tendo pelo menos 65% de identidade com esta e sendo capaz de regular expressão de um gene.

Preferivelmente a seqüência de ácidos nucléicos e/ou o ácido nucléico de acordo com a presente invenção e/ou o gene quimérico de acordo com a presente invenção é uma seqüência de DNA, Em uma forma de realização o gene quimérico de acordo com a presente invenção é obtenível, preferivelmente obtido, a partir do clone pBNP 085-0501-001 (NCIMB 41343).

Preferivelmente a seqüência de ácidos nucléicos é capaz de regular expressão de uma seqüência adicional. Adequadamente a seqüência adicional codifica uma proteína ou RNA, uma seqüência de co-supressão, uma seqüência anti-sentido ou uma seqüência de inibição de dsRNA (RNA de dupla fita).

Preferivelmente a seqüência adicional é obtenível, preferivelmente obtida, a partir de uma planta. A planta pode ser um membro da família Solanaceae. Preferivelmente a planta pode ser um membro da subfamília Cestroideae. Mais preferivelmente a planta é uma ou mais de tomate, batata, berinjela, Petunia ou tabaco. Mais preferivelmente a planta é do gênero Nicotiana. Mais preferivelmente a planta é Nicotiana tahacum. E preferido que a seqüência adicional seja capaz de interromper o metabolismo de ou causar morte das células específicas e/ou células vizinhas. É preferido que a seqüência adicional codifique uma proteína antiviral de erva-dos-cancros ou parte funcional desta. A seqüência de ácidos nucléicos e/ou ácido nucleico e/ou o gene quimérico referidos neste lugar podem ser seqüências isoladas ou, altemativamente, podem ser seqüências sintetizadas. A presente invenção fornece adicionalmente um DNA recombinante compreendendo DNA de vetor e uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção e/ou um ácido nucléico de acordo com a presente invenção e/ou uma seqüência promotora de acordo com a presente invenção e/ou um gene quimérico de acordo com a presente invenção. O DNA recombinante pode adequadamente compreender adicionalmente uma seqüência de codificação de um gene. Preferivelmente o DNA de vetor compreende um piasmídeo, cosmídeo, víms ou fago. Adequadamente o DNA recombinante pode compreender um promotor para direcionar expressão de um gene marcador selecionável.

Preferivelmente o DNA recombinante reside em uma célula hospedeira. Adequadamente a célula hospedeira pode permitir transcrição e tradução do DNA recombinante. A presente invenção fornece adicionalmente uma planta produzida de acordo com o método da presente invenção. A presente invenção fornece adicionalmente uma planta modificada geneticamente compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos e/ou um ácido nucléico e/ou uma seqüência promotora e/ou um gene quimérico de acordo com a invenção. Preferivelmente o ácido nucléico e/ou uma seqüência promotora é operativamente associada com uma seqüência de codificação de um gene.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção é fornecida uma planta compreendendo um DNA recombinante de acordo com a presente invenção. A planta de acordo com a presente invenção pode ser de interesse para a indústria de horticultura, a indústria de floricultura, a indústria de silvicultura e/ou a indústria de agricultura. A planta pode ser uma planta que é crescida para o propósito de fornecer flores cortadas. A planta pode ser tomate, pepino, Petunia, Dianthus, Pi cea, Pinus, Eucalyptus, Populus, uma espécie dicotiledônea tal como batata, tabaco, algodão, alface, berinjela, melão, abóbora, ervilha, canola, soja, beterraba açucareira ou girassol, ou uma espécie monocotiledônea tal como trigo, cevada, centeio, arroz, ou milho. Mais preferivelmente a planta é da família Solanaceae. Mais preferivelmente a planta é da subfamília Cestroideae. Mais preferivelmente a planta é uma ou mais de tomate, batata, berinjela, Petunia ou tabaco. Mais preferivelmente a planta é do gênero Nicotiana. O mais preferivelmente a planta é Nicotiana tabacum. A presente invenção fornece ainda adicionalmente uma célula vegetal de uma planta produzida de acordo com o método da presente invenção, a célula vegetal tendo um metabolismo alterado. A célula vegetal produzida de acordo com o método da presente invenção pode ter um metabolismo que é alterado para aumentar seu metabolismo. Preferivelmente, a célula vegetal produzida de acordo com a presente invenção tem um metabolismo interrompido. A presente invenção também fornece uma célula vegetal modificada geneticamente compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção. Preferivelmente o ácido nucléico de acordo com a presente invenção e/ou a seqüência promotora de acordo com a presente invenção é operativamente associada com uma seqüência de codificação de um gene.

Em um aspecto ainda adicional da presente invenção é fornecida uma célula vegetal compreendendo um DNA recombmante de acordo com a presente invenção. Preferivelmente o ácido nucléico de acordo com a presente invenção e/ou a seqüência promotora de acordo com a presente invenção é operativameníe associada com uma seqüência de codificação de um gene. A presente invenção também fornece um método para regular a expressão de um gene em uma planta, o método compreendendo introduzir na planta um ácido nucléico de acordo com a presente invenção e/ou uma seqüência promotora de acordo com a presente invenção operativamente associados com uma seqüência de codificação de um gene a expressão de cujo gene está para ser regulada. A presente invenção fornece adicionalmente um método para modificar o metabolismo dentro de uma célula de uma planta transgênica, o método compreendendo introduzir em uma planta um ácido nucléico de acordo com a presente invenção e/ou uma seqüência promotora de acordo com a presente invenção e/ou um gene quimérico de acordo com a presente invenção. Preferivelmente o método compreende introduzir um ácido nucléico de acordo com a presente invenção e/ou uma seqiiência promotora de acordo com a presente invenção e/ou um gene quimérico de acordo com a presente invenção na célula. Preferivelmente o ácido nucléico ou a seqüência promotora de acordo com a presente invenção é operativamente associada com uma seqüência de codificação de um gene. Vantajosamente o gene é envolvido em uma via metabólica. Preferivelmente um produto metabólico é aumentado ou diminuído na célula. A presente invenção fornece ainda adicionalmente um método de alterar produção de um produto de gene dentro de uma célula vegetal compreendendo introduzir um ácido nucléico de acordo com a presente invenção e/ou uma seqüência promotora de acordo com a presente invenção operativamente associados com uma seqüência de codificação de um gene, a produção do produto de gene de cujo gene está para ser alterada. Preferivelmente produção do produto de gene é aumentada. Preferivelmente o produto de gene é uma molécula de RNA que pode interagir com o processo de expressão de gene através do mecanismo de RNAi, anti-sentido, ou co-supressão, ou que pode ser traduzida em um produto de gene protéico. Preferivelmente o produto de gene protéico é uma protease, endonuclease de restrição, proteína de transporte em membrana, ribonuclease ou proteína de inativação de ribossomo. Preferivelmente a proteína de inativação de ribossomo é proteína antiviral de erva-dos-cancros (PAP). A PAP pode ser PAP' ou PAPII. Mais preferivelmente a proteína antiviral de erva-dos-cancros é PAP-S ou uma variante ou parte funcional desta.

Adicionalmente fornecido pela presente invenção é o uso de um ácido nucléico compreendendo uma seqüência promotora como mostrado em SEQ ID No.l ou SEQ ID No. 7, ou parte funcional desta, ou uma seqüência tendo pelo menos 60% de identidade com esta para regular expressão de um gene em uma planta.

Também fornecido pela presente invenção é o uso de uma seqüència de ácidos nucléicos compreendendo a seqüência promotora mostrada em SEQID No. 1 ou parte funcional desta ou uma seqüência tendo pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 97%, de identidade com esta, para regular a expressão de um gene em uma planta.

Também fornecido pela presente invenção é o uso de uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo a seqüência promotora mostrada em SEQ ID No. 7 ou parte funcional desta ou uma seqüência tendo pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 97%, de identidade com esta, para regular a expressão de um gene em uma planta.

Também fornecido pela presente invenção é o uso de um ácido nucléico compreendendo uma seqüência promotora como mostrado em SEQ IDNo.l ou SEQ ID No.7 ou SEQ ID No.4, ou parte funcional destas, ou uma seqüência tendo pelo menos 60% de identidade com esta para alterar metabolismo dentro de uma célula vegetal.

Também fornecido pela presente invenção é o uso de uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo uma seqüência promotora como mostrado em SEQ ID No. 1 ou parte funcional desta ou uma seqüência que é pelo menos 75%. preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 97%, idêntica a esta para alterar metabolismo dentro de uma célula vegetal.

Também fornecido pela presente invenção é o uso de uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo uma seqüência promotora como mostrado em SEQ ID No. 7 ou parte funcional desta ou uma seqüência que é pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80%. preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 97%, idêntica a esta para alterar metabolismo dentro de uma célula vegetal. A presente invenção fornece ainda adicionalmente o uso de um ácido nucléico compreendendo uma seqüência promotora como mostrado em SEQ ID No.l ou SEQ ID No. 7 ou SEQ ID No,4, ou parte funcional destas, ou uma seqüência tendo pelo menos 60% de identidade com esta para alterar produção de um produto de gene dentro de uma célula vegetal.

Também fornecido pela presente invenção é o uso de uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo uma seqüência promotora mostrada como SEQ ID No. 1 ou parte funcional desta ou uma seqüência que é pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 97%, idêntica a esta para alterar produção de um produto de gene dentro de uma célula vegetal.

Também fornecido pela presente invenção é o uso de uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo uma seqüência promotora mostrada como SEQ ID No. 7 ou parte funcional desta ou uma seqüência que é pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 97%, idêntica a esta para alterar produção de um produto de gene dentro de uma célula vegetal. A presente invenção também fornece uma sonda de oligonucleotídeo que seletivamente hibrídiza com uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção. A presente invenção também pode fornecer uma parte de SEQ ID No. 1, caracterizada pelo fato de que a parte é de nucleotídeo 1 a nucleotídeo 1321 de SEQ ID No.l ou uma parte desta. A parte de nucleotídeo 1 a nucleotídeo 1321 pode ser uma "parte funcional" de SEQ ID No. 1. A presente invenção também pode fornecer uma parte de SEQ ID No. 7, caracterizada pelo fato de que a parte é de nucleotídeo 1 a nucleotídeo 1309 de SEQ ID No. 7 ou uma parte desta, A parte de nucleotídeo 1 a nucleotídeo 1309 pode ser uma "parte funcional" de SEQ ID No. 7.

Por "parte funcional" queremos dizer que a parte é operável para direcionar expressão em células específicas de uma planta.

Qualquer aspecto da presente invenção pode se referir a apenas uma, ou mais do que uma, das seqüências referidas neste lugar. O termo “gene quimérico” como usado neste lugar significa qualquer molécula de ácido nucleico híbrida formada quando seqüências de ácidos nucléicos de diferentes fontes são ligadas juntas.

Na presente invenção "células vizinhas" são aquelas células que são suficíentemente perto das células específicas que elas são afetadas por expressão nas células específicas, i.e. "células vizinhas" podem ser definidas como células que podem se diferenciar em tecido de gema lateral (i.e. uma vez que células de início de gema lateral tenham sido alteradas em conformidade com a presente invenção), ou células que auxiliam o crescimento da gema lateral e/ou broto lateral. IDENTIFICADORES DE SEQÜÊNCIAS Na listagem de seqüências: SEQ ID No. 1 mostra a seqüência de DNA de um promotor isolado da presente invenção. SEQ ID No. 2 mostra o Oligonucleotídeo S2PCLOFWD de PCR. SEQ ID No. 3 mostra o Oligonucleotídeo S2PCLOREV de PCR. SEQ ID No.4 mostra a seqüência de DNA de um promotor isolado adicional da presente invenção (conhecido neste lugar como o "promotor ATC 023"). SEQ ID No. 5 mostra o Oligonucleotídeo AT4G29190L de PCR. SEQ ID No. 6 mostra o Oligonucleotídeo AT4G29190R de PCR. SEQ ID No. 7 mostra a seqüência de DNA de um promotor isolado da presente invenção (conhecido neste lugar como o "promotor ATC 085").

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A fim de a invenção possa ser prontamente efetivada será feita agora referência, para citar um exemplo, das seguintes ilustrações nas quais;

Figura 1 mostra o alinhamento de SEQ ID No. 1 com o promotor Sar8.2b (acesso no Genbank U648116).

Figura 2 mostra o alinhamento da seqüência promotora ATC 023 com o genoma de Arabidopsis thaliana ao redor do locus AT4g29190 (Cromossomo 4: 14396379-14392944 orientação reversa). A região anterior 5' do gene AT4g29190 έ mostrada em itálico, e as regiões 5' e 3' não traduzidas são mostradas em letras minúsculas. Caixas indicam os códons de início e término do gene AT4g29190. Os sítios de iniciador usados para clonar o promotor ATC 023 são sublinhados, Mudanças de nucleotídeo são mostradas com duplo sublinhado.

Figura 3 mostra a localização de expressão do gene repórter GUS dirigida pelo promotor ATC 085 em seções de caule de tabaco, (a) - (c) mostram seções através de caule na região de início de gema lateral; (d) mostra três seções em série através da mesma região de início de gema lateral; e (e) mostra uma seção vertical através de uma axila foliar.

Figura 4a mostra o efeito de expressão da proteína antiviral de erva-dos-cancros dirigida pelo promotor ATC 085 no crescimento de gemas laterais 17 e 18 em tabaco seguindo poda de topo comparado com plantas de controle (NCC).

Figura 4b mostra o efeito de expressão da proteína antiviral de erva-dos-cancros dirigida pelo promotor ATC 085 promoter no crescimento de gema lateral 16 em tabaco seguindo poda de topo comparado com plantas de controle (NCC).

Figura 5 mostra o crescimento de brotos laterais em tabaco com poda de topo, e o efeito de transformação com ATC 085-PAP; (a) mostra uma planta de controle não transformada, mostrando crescimento alongado de brotos laterais; (b) mostra uma planta transgênica ATC085-PAP não mostrando nenhum crescimento de gema visível.

Figura 6 mostra a localização de expressão do gene repórter GUS dirigida pelo promotor ATC 023 em seções de caule de tabaco seguindo poda de topo. (a) mostra uma seção através de caule de uma planta na região de início de gema lateral; (b) e (c) mostra seções em série através de duas regiões de início de gema lateral tomadas de plantas diferentes; e (d) mostra uma seção vertical através de uma axila foliar.

Figura 7 mostra a localização de expressão do gene repórter GUS dirigida pelo promotor ATC 023 em seções de caule de Arabidopsis, (a) mostra expressão no ponto de crescimento de gema no começo de desenvolvimento da gema, e (b) - (d) mostra expressão subseqüente em gemas em desenvolvimento e tecidos vizinhos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Adequadamente, a seqüência promotora de acordo com a presente invenção compreende uma seqüência de nucleotídeos que tem pelo menos 65%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 97% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade, o mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade com qualquer uma das seqüências mostrada s como SEQ ÍD No. 1 ou SEQ ID No. 7 ou uma parte funcional destas. O termo "promotor" como usado neste lugar é usado no sentido normal da arte, e.g. um sítio de ligação de RNA polimerase.

Como usado neste lugar, "alterar o metabolismo" de uma célula significa afetar a função metabólica de uma célula de uma maneira a mudar o metabolismo de funcionamento normal da célula, resultando em função normal da célula ou realçada ou inibida.

Como usado neste lugar, o termo "interromper o metabolismo" significa alterar a função metabólica de uma célula de uma maneira a interferir no metabolismo de funcionamento normal da célula, resultando na morte ou inibição da função normal da célula.

Como usado neste lugar, o termo "realçar o metabolismo" de uma célula significa alterar a função metabólica de uma célula de uma maneira a aumentar o crescimento ou viabilidade da célula.

Como usado neste lugar, "célula de início de gema lateral" significa uma célula associada com o início do crescimento de uma gema lateral.

Como usado neste lugar, "modificar morfologia" significa alterar o hábito de crescimento normal de urna planta o que se manifesta como uma mudança física para parte ou toda a planta. O crescimento dos brotos laterais de uma planta pode ser realçado, por exemplo. Preferivelmente o crescimento dos brotos laterais da planta é inibido ou prevenido. De qualquer forma a estrutura física geral e/ou aparência de uma planta pode ser mudada.

Uma seqüência de DNA vegetal pode ser recuperada a partir das células do hospedeiro natural, ou ela pode ser sintetizada diretamente in vitro. Extração a partir do hospedeiro natural possibilita o isolamento de novo de seqüências novas, ao passo que síntese de DNA in vitro geralmente requer informação pré-existente de seqüência. Síntese química direta in vitro pode ser atingida por síntese manual sequencial ou por procedimentos automatizados. Seqüências de DNA também podem ser construídas por técnicas padrão de anelar e ligar fragmentos, ou por outros métodos conhecidos na arte. Exemplos de tais procedimentos de clonagem são dados em Sambrook et al (1989), A seqüência de DNA da presente invenção pode ser isolada por clonagem direta de segmentos de DNA genômico de planta. Segmentos adequados de DNA genômico podem ser obtidos por fragmentação usando endonucleases de restrição, sonicação, poda física, ou outros métodos conhecidos na arte. Usando seleção predítiva da seqüência de DNA do segmento clonado para a presença de motivos de seqüências de codificação (Baxevanis, 2001) características de seqüências promotoras conhecidas podem ser encontradas anteriormente a uma tal seqüência diagnostica. A identificação do segmento clonado como uma seqüência promotora pode altemativamente ser atingida verificando funcionalidade, por exemplo ligando o segmento clonado com uma seqüência de codificação derivada a partir de um gene repórter e introduzir o construto quimérico em uma célula hospedeira ou sistema livre de célula caracterizado pelo fato de que expressão do gene repórter pode ser avaliada. Este processo pode formar parte de outra estratégia de isolamento de seqüência denominada aprisionamento de promotor, caracterizada pelo fato de que fragmentos de DNA genômico são clonados diretamente em "vetores de expressão" compreendendo uma região de codificação de gene repórter e outras seqüências necessárias para expressão em uma célula hospedeira ou sistema livre de célula. A expressão pode ou não requerer integração do construto quimérico no DNA cromossômico de hospedeiro.

Um método alternativo de obter uma seqüência de DNA da presente invenção é pela identificação e isolamento de uma seqüência de codificação de DNA que é conhecida por ser expressa e subsequentemente usando esta seqüência para obter a seqüência promotora contígua, o que é por definição direcionar a expressão da seqüência de codificação. Altemativamente uma seqüência de DNA pode ser obtida por identificação de uma seqüência que é conhecida por ser expressa em um organismo diferente, e então isolar a seqüência de codificação homóloga e subsequentemente sua seqüência promotora associada a partir do organismo de escolha. Uma seqüência de codificação pode ser obtida pelo isolamento de RNA mensageiro (mRNA ou poliA- RNA) de tecido vegetal ou isolamento de uma proteína e realizando "retrotradução" de sua seqüência. O tecido usado para isolamento de RNA é selecionado com base na crença de que sequências adequadas de codificação de gene são expressas naquele tecido em níveis ótimos para isolamento. Vários métodos para isolar mRNA a partir de tecido vegetal são bem conhecidos por aqueles versados na arte, incluindo por exemplo usar um oligonucleotídeo oligo-dT imobilizado em uma matriz inerte. O mRNA isolado pode ser usado para produzir sua seqüência de DNA complementar (cDNA) por uso da enzima transcriptase reversa (RT) ou outras enzimas tendo atividade de transcriptase reversa. Isolamento de uma seqüência de cDNA individual a partir de uma combinação de cDNAs pode ser atingido por clonagem em vetores bacterianos ou virais, ou empregando a reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores de oligonucleotídeos selecionados. A produção e isolamento de um cDNA específico a partir de mRNA podem ser atingidos por uma combinação das etapas de transcrição reversa e PCR em um processo conhecido como RT-PCR. Vários métodos podem ser empregados para melhorar a eficiência de isolamento da seqüência desejada através de métodos de enriquecimento ou seleção incluindo o isolamento e comparação de mRNA (ou do cDNA de fita simples ou fita dupla resultante) a partir de mais do que uma fonte a fim de identificar aquelas seqüências expressas predominantemente no tecido dc escolha. Numerosos métodos de seleção diferencial, hibridização, ou clonagem são conhecidos por aqueles versados na arte incluindo cDNA-AFLP, hibridização em cascata, e kits comerciais para clonagem seletiva ou diferencial.

Na presente invenção, uma seqüência de cDNA para uma proteína SAR 8.2j (Número de Acesso EMBL Ü64812) foi utilizada para isolar uma seqüência promotora nova. Exemplos de outros genes de proteína SAR são dados em Nos. de Acesso EMBL U64S16, U64807, U64808, U64809, U64810, U64811, U64813, U64814, U6481. Uma segunda seqüência de sDNA para um Fator de Transcrição de Dedo de Zinco (Número de Acesso EMBL AL096692) também foi utilizada para isolar uma seqüência promotora. O cDNA selecionado pode então ser usado para avaliar as características genômicas de seu gene de origem, por uso como uma sonda de hibridizaçao em um Southern blot de DNA genômíco de planta para revelar a complexidade do genoma com respeito àquela seqüência. Altemativamente, informação de seqüência do cDNA pode ser usada para imaginar oligonucleotídeos e estes podem ser usados da mesma maneira como sondas de hibndização; para iniciadores de PCR para produzirem sondas de hibridizaçao, ou para iniciadores de PCR para serem usados em análise direta de genoma.

Similarmente o cDNA selecionado pode ser usado para avaliar o perfil de expressão de seu gene de origem, por uso como uma sonda de hibridizaçao em um Northern blot de RNA extraído a partir de vários tecidos vegetais, ou a partir de uma série de desenvolvimento ou temporal. Mais uma vez informação de seqüência do cDNA pode ser usada para imaginar oligonucleotídeos que podem ser usados como sondas de hibridizaçao, para produzir sondas de hibridizaçao, ou diretamente para RT-PCR. O cDNA selecionado, ou oligonucleotídeos derivados, podem então ser usados como uma sonda de hibridizaçao para desafiar uma biblioteca de fragmentos clonados de DNA genômíco e identificar seqüências de DNA sobrepostas. Por este meio um promotor contíguo pode ser identificado e isolado.

Pela natureza do método de isolamento, um cDNA isolado normalmente compreende o término 3' da região de codificação e se estende na direção do término 5'. Ele pode não compreender a sequência de codificação de comprimento completo. É preferível assegurar que a seqüência 5' está presente se o cDNA é para ser usado para identificar o promotor contíguo. Isto pode ser atingido por extensão da seqüência de cDNA clonada na direção 5' por um processo denominado 5' RACE (amplificação rápida de extremidades de cDNA).

Se a análise de seqüência do cdna clonado identifica uma seqüência homóloga já relatada na literatura científica, esta informação pode fornecer uma seqüência candidata adequada para o término 5'. Entretanto, a possibilidade de existirem diferentes membros da mesma família gênica com regiões de codificação similares, mas regiões de íntron. seqüências promotoras e perfis de expressão diferindo, pode levar à seleção de uma seqüência promotora incorreta e inadequada.

Uma vez que o término 5' da seqüência de codificação tenha sido identificado, a região anterior contígua contendo o promotor pode ser identificada se presente nos bancos de dados públicos de Nucleotídeo. Altemativamente o promotor pode ser isolado, por extensão adicional na direção 5'. Isto pode ser atingido por métodos incluindo PCR de ligação de vetor, caminhamento de genoma, PCR inversa, e outros métodos, Se necessário o processo pode ser repetido com um novo iniciador complementar ao término 5' do primeiro fragmento promotor para assegurar que todas as seqüências de controle dos promotores sejam isoladas. A presente invenção também sustenta o uso de uma seqüência de DNA como mostrado em SEQ, ID. No: 4, a seqüência codificando um promotor (e referido neste lugar como "ATC 023"), a seqüência sendo capaz de controlar a expressão de uma proteína de fator de transcrição de dedo de Zinco, e que pode ser usada como um promotor vegetal. Esta seqüência é identificada no banco de dados de Seqüência de Nucleotídeo TAIR no Locus AT4g29190. A presente invenção também inclui seqüêncías de DNA que controlam a expressão de outros genes de proteína de fator de transcrição de dedo de Zinco e que têm algumas regiões de homologia com a seqüência de DNAdeSEQ.E>. No: 4.

Homologia pode ser determinada com base em identidade percentual entre duas sequências de DNA (ou de polipeptídeos). Em geral as duas seqüências a serem comparadas são alinhadas para gerar uma correlação máxima entre a seqüências. O alinhamento das duas seqüências é avaliado e o número de posições dando uma correspondência exata de nucleotídeo (ou aminoácido) entre as duas seqüências é determinado, dividido pelo comprimento do alinhamento e multiplicado por 100 para gerar uma figura de identidade percentual. Esta figura de identidade percentual pode ser determinada sobre todo o comprimento das seqüências a serem comparadas, o que é particularmente adequado para seqüências de comprimentos iguais ou muitos similares e que são altamente homólogas, ou sobre comprimentos definidos mais curtos, o que é mais adequado para seqüências de comprimentos desiguais ou que têm um nível inferior de homologia. Métodos para comparar a identidade de duas ou mais seqüências são bem conhecidos na arte. Assim por exemplo, programas disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package. version 9.1 (Devereux J. et al, 1984) (disponível a partir de Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA), por exemplo os programas BESTFIT e GAP, podem ser usados para determinar a identidade percentual entre dois polinucleotídeos e a identidade percentual entre duas seqüências de polipeptídeos. BESTFIT usa o algoritmo de "homologia local" de Smith e Waterman (1981) e encontra a melhor região única de similaridade entre duas seqüências. BESTFIT é mais apropriado para comparar dois polinucleotídeos ou duas seqüências de polipeptídeos qne são desiguais em comprimento, o programa assumindo que a seqüência mais curta representa uma porção da mais longa. Em comparação, GAP alinha duas seqüências encontrando uma "similaridade máxima" de acordo com o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970). GAP é mais apropriado para comparar seqüências que são aproximadamente do mesmo comprimento e um alinhamento é esperado sobre o comprimento inteiro. Preferivelmente os parâmetros "Peso de Lacuna" e "Peso de Comprimento" usados em cada programa são 50 e 3 para seqüências de polinucleotídeos e 12 e 4 para seqüências de polipeptídeos, respectívamente, Preferivelmente, identidades percentuais e similaridades são determinadas quando as duas seqüências sendo comparadas estão otimamente alinhadas.

Outros programas para determinar identidade e/ou similaridade entre seqüências também são conhecidos na arte, por exemplo a família de programas BLAST (Karlin & Altschul, 1990,Proc. Natl Acad. Sei. USA 87:2264-2268, modificada como em Karlin & Altschul, 1993, Proc.Natl Acad. Sei. USA 90:5873-5877, disponível a partir do National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Maryland, USA e acessível através da página virtual do NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov). Estes programas exemplificam um exemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas seqüências. Um tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul, et al, 1997, J. Mol. Biol 215:403-410. Buscas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST para obter seqüências de nucleotídeos homólogos a uma molécula de ácido nucléico da invenção, Buscas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, para obter seqüências de aminoácídos homólogos a uma molécula de proteína da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et αί, 1991, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Altemativamente, PSI-Blastpode ser usado para realizar uma busca repetida que detecta relações distantes entre moléculas (Id.). Ao utilizar programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (e.g, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Veja http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Outro exemplo não limitaníe preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, 1988, CABIOS 4:11-17. Um tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de aplicativo computacional para alinhamento de seqüência GCG.

Outro exemplo não límitante de um programa para determinar identidade e/ou similaridade eníre seqüências conhecido na arte é FASTA (Pearson W.R. e Lipman D.J., Proc. Nat. Acac. Sei., USA, 85:2444-2448, 1988, disponível como parte do Wisconsin Sequence Analysis Package). Preferivelmente a matriz de substituição de aminoácido BLOSUM62 (Henikoff S. e Henikoff J.G., Proc. Nat. Acad. Sei, USA, 89:10915-10919, 1992) é usada em comparações de seqüência de polipeptídeos incluindo onde seqüências de nucleotídeos são primeiro traduzidas em seqüências de aminoácidos antes de comparação. A identidade percentual entre duas seqüências pode ser determinada usando técnicas similares àquelas descritas acima, com ou sem permitir lacunas. Ao calcular identidade percentual, paridades tipicamente exatas são contadas.

Preferivelmente o programa BESTFIT é usado para determinar a identidade % de um polinucleotídeo de entrada ou uma seqüência de polipeptídeos com respeito a um polinucleotídeo ou uma seqüência de polipeptídeos da presente invenção, a seqüência de entrada e a de referência sendo otimamente alinhadas e os parâmetros do programa ajustados no valor padrão.

No contexto da presente invenção seqüências substancialmente homólogas são aquelas que têm pelo menos 50% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 60%, 65% ou 70% de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, ou 94% de identidade de seqüência e o mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou acima de identidade de seqüência.

Como usado neste lugar, o termo "homólogo" significa uma entidade tendo uma certa homologia com as seqüências de aminoácidos sujeito e as seqüências de nucleotídeos sujeito. Aqui, o termo "homologia" pode ser igualado com "identidade".

Embora homologia também possa ser considerada em termos dc similaridade (i.e. resíduos de aminoácidos tendo propriedades/funções químicas similares), no contexto da presente invenção é preferido expressar homologia em termos de identidade de seqüência.

No contexto da presente invenção o termo utilizar inclui, entre outros, usar, introduzir e expressar uma seqüência ou gene. A presente invenção também inclui seqüências de DNA que hibridizam com as seqüências de DNA dos promotores acima, incluindo seqüências parciais e seqüências complementares. Condições sob as quais tais seqüências irão assim hibridizar pode ser determinada de uma maneira de rotina.

Hibridização pode ser realizada sob condições de baixa, média ou alta estringência. As condições sob as quais hibridização e/ou lavagem podem ser realizadas podem variar de 42°C a 68 °C e o tampão de lavagem pode compreender de 0,1 x SSC, 0,5 % dc SDS a 6 x SSC, 0,5 de SDS. Tipicamente, hibridização pode ser realizada durante a noite a 65Τ (condições de alta estringência), 60°C (condições de média estringência), ou 55°C (condições de baixa estringência). Os filtros podem ser lavados por 2 x 15 minutos com 0,1 x SSC, 0,5 % de SDS a 65°C (lavagem de alta estringência). Os filtros podem ser lavados por 2 x 15 minutos com 0,1 x SSC, 0,5 % de SDS a 63°C (condições de média estríngêncía). Para lavagem de baixa estríngêncía, os filtros sào lavados a 60°C por 2 x 15 minutos em 2 x SSC, 0,5% de SDS. A presente invenção também incluí seqüências de DNA que hibridizam com sondas de oligonucleotídeos. Preferivelmente as seqüências de DNA hibridizam com sondas de oligonucleotídeos sob condições estringentes. Em instâncias caracterizadas pelo fato de que as moléculas de ácido nucléico são oligonucleotídeos ("oligos"), condições altamente estringentes podem se referir, por exemplo, a lavagem em 6x SSC /0,05% de pirofosfato de sódio a 37°C (para 14 oligo bases), 48°C (para 17 oligo bases), 55°C (para 20 oligo bases), e 60°C (para 23 oligo bases). Em uma busca BLAST contra o Banco de Dados de Sequência de Nucleotídeo EMBL, comunicado 77 (Kulikova et al, 2004), o promotor ATC 085 tem uma identidade maior do que 90% sobre suas últimas 220 bases com seqüências conhecidas antes do códon de início de tradução de outros genes SAR tal como 8.2h e 8.2k. A única seqüência mostrando quaisquer outras regiões de homologia ao longo do comprimento do promotor a região do promotor Sar 8.2b (promotor SAR 8.2b, acesso no Genbank U64816, bases 1 a 1907).

Figura 1 mostra o alinhamento entre SEQ ID No. 1 (bases 1 a 1566) e a região do promotor SAR 8.2b com homologia (bases 704 a 1907 da seqüência de Genbank). Identidade é mostrada por pontos entre as seqüências alinhadas. A partir da Figura 1 pode ser visto que SEQ ID No. 1 tem uma identidade de 61% com o promotor SAR 8.2b correspondente em geral.

Figura 2 mostra o alinhamento entre a seqüência do promotor ATC 023 (bases 1 a 1904) e a região da seqüência de Arabidopsis thaliana sequence ao redor do locus AT4g29190 (em orientação reversa). A partir da Figura 2 pode ser visto que o promotor ATC 023 promotor quando clonado tem mais do que 99% de identidade com a seqüência genômica relatada. A seqüência de codificação de gene que é usada sob o controle do promotor e empregada em realizar a presente invenção pode ser ativa em alguns ou todos os tecidos vegetais. A seqüência empregada pode codificar uma proteína ou uma unidade de RNA. Através de técnicas de DNA recombinante a seqüência pode codificar uma variante sintética de uma proteína ou RNA, uma seqüência parcial, ou uma seqüência composta compreendendo regiões de um ou mais genes. Por exemplo, o gene quimérico pode codificar uma poliproteína. A seqüência também pode compreender seqüências repetidas, truncadas, invertidas ou complementares, para atingir interrupção da transcrição e tradução de um gene ou genes endógenos por, por exemplo, tecnologia de anti-sentido, co-supressão, ou inibição de RNA.

Muitos genes vegetais, bacterianos e virais podem ser ativamente expressos sob o controle do promotor. Preferivelmente tais genes codificam: (i) Enzimas GUS, GFP e luciferase que podem ser usadas como genes repórteres para função de promotor. (ii) Genes para componentes estruturais produtores de enzimas da planta tal como celulose, hemiceluloses, pectinas e lignina. (iii) Seqüências de DNA projetadas para alterar o metabolismo em plantas e células vegetais. Tais genes incluem aqueles para metabolismo de carboidrato, metabolismo de amido, metabolismo de aminoácido e proteína, metabolismo de ácido nucleico e metabolismo de lipídio. (iv) Seqüências reguladoras de DNA que podem ter efeitos no controle de metabolismo ou desenvolvimento, tal como florescimento ou arquitetura de planta, incluindo aqueles genes envolvidos no metabolismo ou transporte de substâncias de crescimento vegetal. (v) Seqüências de DNA codificando produtos tal como enzimas de restrição, proteases, inibidores de proteinase e proteína de inativação de ribossomos que podem ser usados para prejudicar deliberadamente função celular. (vi) Resistência a estresse ambiental, ou a patógenos ou a pestes. O promotor da presente invenção é preferivelmente operável para direcionar expressão em meristemas laterais e/ou auxiliares. O promotor de acordo com a presente invenção pode em adição a ser operável para direcionar expressão em gemas laterais e/ou brotos, ser operável para direcionar expressão em outros tecidos e/ou células da planta. Por exemplo, alguma expressão pode ser observada em tecido ferido, e/ou no caule e/ou nas folhas da planta. Entretanto, o promotor é operável para direcionar expressão substancialmente especificamente (como definido neste lugar) em um gema lateral e/ou broto lateral. O perfil de expressão dos promotores da presente invenção pode ser determinado por aqueles versados na arte usando uma variedade de métodos que são preferivelmente: (í) Expressão transiente onde o promotor é conectado a um gene repórter tal como GUS, GFP ou luciferase em um construto apropriado e introduzido em tecido vegetal por transformação por bombardeamento. Expressão promotora é detectada pela presença ou ausência do produto de gene repórter em diferentes tecidos vegetais. (ii) Expressão transiente onde o promotor é conectado a um gene repórter tal como GUS, GFP ou luciferase em um construto binário apropriado e introduzido em tecido vegetal por Agrobacterium. Expressão promotora é detectada pela presença ou ausência do produto de gene repórter em diferentes tecidos vegetais. A atividade de GUS pode ser detectada visualmente usando substratos apropriados como uma linhagem, ou usando um colorímetro ou espectrofotômetro; luciferase e proteínas marcadoras fluorescentes podem ser detectadas por olho ou fotograficamente, ou em um filme ou meio digital, ou quantitativamente usando um luminômetro ou fluorômetro. Genes marcadores também podem ser detectados usando sistemas baseados em anticorpo. (iii) Transformação e regeneração de planta. Expressão promotora é detectada pela presença ou ausência do gene repórter em diferentes tecidos vegetais, (iv) Transformação e regeneração de planta, Expressão promotora é detectada pela presença ou ausência de um produto de gene específico produzido por um gene efetor em diferentes tecidos vegetais, O produto de gene da presente invenção pode ser produzido por técnicas recombinantes, caracterizadas pelo fato de que os clones de DNA genômico ou clones de cDNA para a sequência de codificação de DNA são produzidos, isolados, proliferados, e incorporados em um vetor de transformação de planta da presente invenção. O presente relatório é a primeira vez que um promotor que é capaz de expressar um gene substancialmente especificamente em gema lateral e/ou brotos laterais foi apresentado.

Adequadamente, o promotor de acordo com a presente invenção é um "promotor induzido", i.e. um que é ativado em resposta a um estímulo. Assim, da mesma maneira que o promotor sendo operável para direcionar expressão em células específicas da planta, o promotor também pode ser considerado como um promotor induzível.

Preferivelmente, o promotor de acordo com a presente invenção é induzido por poda de topo na planta, i.e. removendo o gema ou broto apical da planta.

Sem desejar ser limitada por teoria, uma possível maneira na qual o promotor da presente invenção pode ser "ativado" é que ele pode ser ativado ou induzido por um sinal que pode ser estimulado pela remoção da gema apical, assim depois de poda de topo. Por exemplo, o sinal pode ser um hormônio de crescimento vegetal. Para citar um exemplo apenas o sinal pode ser uma citocinina(s).

Altemativamente, de novo sem desejar ser limitado por teoria, pode ser possível que a gema apical libere um sinal inibidor que previne crescimento de meristema lateral e/ou a ativação do promotor da presente invenção. Neste caso, por exemplo, a remoção da gema apical, e.g por poda de topo, pode resultar na perda do sinal inibidor e assim a ativação do promotor da presente invenção. Por exemplo, apenas para citar um exemplo, o sinal inibidor pode ser uma auxina(s).

ISOLADA

Em um aspecto, preferivelmente a seqüência está em uma forma isolada. O termo "isolada" significa que a seqüência é pelo menos substancialmente livre de pelo menos um outro componente com o qual a seqüência é naturalmente associada na natureza e como encontrada na natureza.

PURIFICADA

Em um aspecto, preferivelmente a seqüência está em uma forma purificada. O termo "purificada" significa que a seqüência está em uma estado relativamente puro - e.g. pelo menos cerca de 90% pura, ou pelo menos cerca de 95% pura ou pelo menos cerca de 98% pura.

SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS O termo "seqüência de nucleotídeos" como usado neste lugar é sinônimo de "seqüência de ácidos nucléicos" e se refere a uma seqüência de oligonucleotídeos ou seqüência de polinucleotídeos, e variantes, homólogos, fragmentos e derivados destas (tal como porções destas). A seqüência de nucleotídeos pode ser de origem genômica ou sintética ou recombinante, a qual pode ser de dupla fita ou fita simples quer representando a fita sentido ou anti-sentido. O termo "seqüência de nucleotídeos" ou "ácido nucléico" em relação à presente invenção incluí DNA genômico, cDNA, DNA sintético, e RNA. Preferivelmente significa DNA, mais preferivelmente seqüência de cDNA codificando para a presente invenção.

Devido à degenerescência no código genético, podem ser prontamente produzidas seqüências de nucleotídeos na quais a utilização do códon de trinca, para alguns ou todos os aminoácidos codificados pela seqüência de nucleotídeos original, foi trocada através disso produzindo uma seqüência de nucleotídeos com baixa homologia com a seqüência de nucleotídeos original mas que codifica a mesma seqüência de aminoácidos, ou uma variante, do que codificada pela seqüência de nucleotídeos original. Por exemplo, para a maioria dos aminoácidos a degenerescência do código genético está na terceira posição do códon de trinca (posição de oscilação) (para referência veja Stcenteior, Lubert, Biochemistry, Third Edition, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7) portanto, a seqüência de nucleotídeos na qual todos os códons tripletos foram "oscilados" na terceira posição seria cerca de 66% idêntica à seqüência de nucleotídeos original entretanto, a seqüência de nucleotídeos corrigida iria codificar para a mesma seqüência de aminoácidos primária, ou uma variante, que a seqüência de nucleotídeos original, Portanto, a presente invenção se refere adicionalmente a qualquer seqüência de nucleotídeos que tem uma utilização alternativa de códon de trinca para pelo menos um aminoácido codificando códon de trinca, mas que codifica a mesma seqüência de polipeptídeos, ou uma variante, que a seqüência de polipeptídeos codificada pela seqüência de nucleotídeos original, Além disso, organismos específicos tipicamente têm uma tendência de que códons de trinca sejam usados para codificar aminoácidos. Tabelas de utilização de códons preferida são amplamente disponíveis, e podem ser usadas para preparar genes de códons otimizados. Tais técnicas de otimização de códon são rotineiramente usadas para otimizar expressão de transgenes em um hospedeiro heterólogo.

Tipicamente, a sequência de nucleotídeos codificando polipeptídeos tendo as propriedades específicas como definido neste lugar é preparada usando técnicas de DNA recombinante (i.e. DNA recombinante). Entretanto, em uma forma de realização alternativa da invenção, a seqüência de nucleotídeos podería ser sintetizada, inteira ou em parte, usando métodos químicos bem conhecidos na arte (veja Caruthers Mil et al (1980) Nuc Acíds Res Symp Ser 215-23 e Hom T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225232).

EVOLUÇÃO MOLECULAR

Uma vez uma seqüência de nucleotídeos codificando promotor tenha sido isolada, ou uma seqüência de nucleotídeos codificando promotor hipotético tenha sido identificada, pode ser desejável modificar a seqüência de nucleotídeos selecionada, por exemplo pode ser desejável mutar a seqüência a fim de para preparar um produto de gene em conformidade com a presente invenção.

Mutações podem ser introduzidas usando oligonucleotídeos sintéticos. Estes oligonucleotídeos contêm seqüências de nucleotídeos flanqueando os sítios de mutação desejados.

Um método adequado é descrito em Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, p646-649). Outro método de introduzir mutações em seqüências de nucleotídeos é descrito em Nelson e Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151).

Ao invés de mutagênese sítio dirigida, tal como descrito acima, alguém pode introduzir mutações aleatoriamente por exemplo usando um kit comercial tal como o kit GeneMorph PCR mutagenesis de Stratagene, ou o kit Diversify PCR random mutagenesis de Clontech. Patente Européia 0 583 265 se refere a métodos de otimizar mutagênese baseada em PCR, o que também pode ser combinado com o uso de análogos de DNA mutagênico tal como aqueles descritos em Patente Européia 0 866 796.

Um terceiro método para obter seqüências novas é fragmentar seqüências de nucleotídeos não idênticas, ou usando qualquer número de enzimas de restrição ou uma enzima tal como Dnase I, e reunindo de novo seqüências de nucleotídeos completas codificando para proteínas funcionais. Altemativamente alguém pode usar uma ou múltiplas seqüências de nucleotídeos não idênticas e introduzir mutações durante a reunião da seqüência de nucleotídeos completa. Métodos adequados para realizar 'embaralhamento' podem ser encontrados em Patente Européia 0 752 008, Patente Européia 1 138 763, Patente Européia 1 103 606. Embaralhamento também pode ser combinado com outras formas de mutagênese de DNA como descrito em Patente Norte-Americana 6.180.406 e WO 01/34835.

Assim, é possível produzir numerosas mutações sítio dirigidas ou aleatórias em uma seqüência de nucleotídeos, ou in vivo ou in vitro, e subseqüentemente selecionar por funcionalidade melhorada do polipeptídeo codificado por várias maneiras. Usando métodos de recombinação in silica e exo mediado (veja WO 00/58517, Patente Norte-Americana 6.344.328, Patente Norte-Americana 6.361.974), por exemplo, evolução molecular pode ser realizada onde a variante produzida retém homologia muito baixa com proteínas conhecidas. Tais variantes obtidas através disso podem ter analogia estrutural significante com proteínas conhecidas, mas têm homologia de seqüência de aminoácidos muito baixa.

Como um exemplo não limitante, em adição, mutações ou variantes naturais de uma seqüência de polinucleotídeos podem ser recombinadas ou com o tipo selvagem ou outras mutações ou variantes naturais para produzir novas variantes. Tais novas variantes também podem ser selecionadas por funcionalidade melhorada do polipeptídeo codificado.

VETORES DE TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA

Vetores de transformação de planta da presente invenção irão conter "cassetes de expressão" compreendendo 5' -3' na direção de transcrição, uma seqüência promotora como descrito na presente invenção, uma seqüência de codificação de gene como discutido acima e, opcionalmente uma seqüência de terminação 3' não traduzida, incluindo um sinal de parada para RNA polimerase e um sinal de poliadenilação para poliadenilase. A seqüência promotora pode estar presente em uma ou mais cópias, e tais cópias podem ser idênticas ou variantes da seqüência promotora como descrito acima. Tais cópias também podem ser seqüências completas ou parciais como descrito acima. A seqüência de terminação pode ser obtida a partir de genes vegetais, bacteríanos ou virais. Seqüências de terminação adequadas são a seqüência de terminação rbcS E9 de ervilha, a seqüência de terminação nos derivada do gene de nopalina sintase de Agrobacterium tumefacíens e a seqüência de terminação 35S do vírus do mosaico da couve-flor, por exemplo. Uma pessoa versada na arte estará prontamente ciente de outras seqüências de terminação adequadas. O cassete de expressão também pode compreender um mecanismo de reforçar expressão de gene para aumentar a força do promotor. Um exemplo de um tal elemento reforçador é aquele derivado de uma porção do promotor do gene de plastocianina de ervilha, e que é sujeito de Pedido de Patente Internacional No. WO 97/20056.

Estas regiões reguladoras podem ser derivadas do mesmo gene que a seqüência de DNA promotora da presente invenção ou podem ser derivadas de genes diferentes, de Nicotiana tabacum ou outros organismos, por exemplo de uma planta da família Solanaceae, ou da subfamília Cestroideae. Todas as regiões reguladoras devem ser capazes de operar nas células do tecido a ser transformado. A seqüência de codificação dc gene pode ser derivada do mesmo gene que a seqüência de DNA promotora da presente invenção ou pode ser derivada de um gene diferente, de Nicotiana íahacum, ou outro organismo, por exemplo de uma planta da família Solanaceae, ou da subfamília Cestroideae. · O cassete de expressão pode ser incorporado em um vetor de transformação de planta básico, tal como pBIN 19 Plus, pBI 101, ou outros vetores de transformação de planta adequados conhecidos na arte. Em adição ao cassete de expressão, o vetor de transformação de planta irá conter tantas seqüências quanto são necessárias para o processo de transformação. Estas podem incluir os genes vir de Ágrobacterium, uma ou mais seqüências de limite de T-DNA, e um marcador selecionável ou outras maneiras de identificar células vegetais transgênicas. O termo "vetor de transformação de planta" significa um construto capaz de expressão in vivo ou in vitro.

Preferivelmente, o vetor de expressão é incorporado no genoma do organismo. O termo "incorporado" preferivelmente cobre incorporação estável no genoma.

Os vetores da presente invenção podem ser transformados em uma célula hospedeira adequada como descrito abaixo para sustentar expressão de um polipeptídeo tendo as propriedades específicas como definido neste lugar. A escolha de vetor, e.g. vetor plasmídeo, cosmídeo, vírus ou fago, irá frequentemente depender da célula hospedeira na qual ele está para ser introduzido.

Os vetores podem conter um ou mais genes marcadores selecionáveis — tal como um gene que confere resistência a antibiótico e.g. ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou resistência à tetraciclina. Altemativamente, a seleção pode ser realizada por co-transformação (como descrito em W091/17243), Vetores podem ser usados in vitro, por exemplo para a produção de RNA ou usados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira. O termo "operativamente associado" se refere a uma justaposição caracterizada pelo fato de que os componentes descritos estão em uma relação que permite que eles funcionem em sua maneira pretendida. Uma seqüência reguladora "operativamente associada" com uma seqüência de codificação é ligada de uma maneira tal que expressão da seqüência de codificação é atingida sob condições compatíveis com as seqüências de controle.

CÉLULAS HOSPEDEIRAS O termo "célula hospedeira" - em relação à presente invenção inclui qualquer célula que compreende um ácido nucléico, uma seqüência promotora ou um gene quimérico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão como descrito acima.

Assim, uma forma de realização adicional da presente invenção fornece células hospedeiras transformadas ou transfectadas com um ácido nucléico, uma seqüência promotora ou um gene quimérico da presente invenção. As células serão escolhidas para serem compatíveis com o dito vetor e podem por exemplo ser procarióticas (por exemplo bacterianas), fúngicas, levedura ou células vegetais. Preferivelmente, as células hospedeiras são células não humanas.

Exemplos de organismos hospedeiros bacterianos adequados são bactérias gram negativas ou bactérias gram positivas.

Em uma forma de realização, hospedeiros eucarióticos tal como leveduras ou outros fungos podem ser preferidos. Em geral, células de levedura são preferidas a células fúngicas porque elas são mais fáceis para manipular. O uso de células hospedeiras adequadas, tal como células hospedeiras de levedura, fungicas e vegetais — pode sustentar modificações pós-traducionais (e.g. miristoilação, glicosilação, truncamento, lapidação e fosforilação de tirosina, serina ou treonina) como pode ser necessário para conferir atividade biológica ótima em produtos de expressão recombinante da presente invenção. A célula hospedeira pode ser uma linhagem deficiente em protease ou com menos protease. O termo "planta transgênica" em relação à presente invenção inclui qualquer planta que compreende um ácido nucléico, uma seqüência promotora ou um gene quimérico da presente invenção. Preferivelmente o ácido nucléico, seqüência promotora ou gene quimérico é incorporado no genoma da planta. O termo "planta transgênica" não cobre sequências de codificação de nucleotídeo nativo em seu ambiente natural quando elas estão sob o controle de seu promotor nativo que também está em seu ambiente natural. A presente invenção também abrange o uso de seqüências de nucleotídeos que são complementares às seqüências discutidas neste lugar, ou qualquer derivado, fragmento ou derivado destas. Se a seqüência é complementar a um fragmento destas então aquela seqüência pode ser usada como uma sonda para identificar seqüências de codificação similares em outros organismos etc. O termo "variante" como usado neste lugar significa uma proteína expressa a partir de um código genético não endógeno resultando em uma ou mais alterações de aminoácido (i.e. deleções, adições ou substituições de aminoácido) quando comparada com a seqüência natural ou tipo selvagem dentro da seqüência de proteína madura.

TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA Técnicas para transformar plantas são bem conhecidos dentro da arte e incluem transformação mediada por Agrobacterium, por exemplo. O princípio básico na construção de plantas geneticamente modificadas é inserir informação genética no genoma da planta de forma a obter uma manutenção estável do material genético inserido. Uma revisão das técnicas gerais pode ser encontrada em artigos por Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) e Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Março/Abril 1994 17-27).

Tipicamente, em transformação mediada por Agrobacterium um vetor binário carregando um DNA estrangeiro de interesse, í.e. um gene quiméríco, é transferido de uma linhagem apropriada de Agrobacterium para uma planta alvo pelo co-cultivo da Agrobacterium com explantes da planta alvo. Tecido vegetal transformado é então regenerado em meios de seleção, cujos meios de seleção compreendem um marcador selecionável e hormônios de crescimento vegetal. Uma alternativa é o método de banho floral (Clough & Bent, 1998) com o qual gemas florais de uma planta intacta são postas em contato com uma suspensão da linhagem de Agrobacterium contendo o gene quiméríco, e seguindo estabelecimento de semente, indivíduos transformados são germinados e identificados por crescimento em meios seletivos.

Infecção direta de tecidos vegetais por Agrobacterium é uma técnica simples que foi amplamente empregada e que é descrita em Butcher D.N. et ai, (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams e J.P. Helgeson, 203-208. Métodos de transformação adicionais adequados incluem transferência direta de gene em protoplastos usando polietilenoglicol ou técnicas de eletroporação, bombardeamento de partícula, micro-injeção e o uso de fibras de carbeto de silício por exemplo.

Transformar plantas usando transformação balística, incluindo a técnica de pêlo de carbeto de silício são pensadas em Frame BR, Drayton PR, Bagnaall SV, Lewnau CJ, Bullock WP, Wilson ITM, Dunwell JM, Thompson JA & Wang K (1994). Produção de plantas de milho transgênicas férteis por transformação mediada por pêlo de carbeto de silício é pensada em The Plant Journal 6: 941-948) e técnicas de transformação viral são pensadas em por exemplo Meyer P, Heidmann I & Niedenhof I (1992). O uso de vírus de mosaico de mandioca como um sistema de vetor para plantas é pensado em Gene 110; 213-217.

Ensinamentos adicionais em transformação de planta podem ser encontrados em Patente Européia-A-0449375.

Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um sistema de vetor que carrega uma seqüência de nucleotídeos ou construto de acordo com a presente invenção e que é capaz de introduzir a seqüência de nucleotídeos ou construto no genoma de um organismo, tal como uma planta. O sistema de vetor pode compreender um vetor, mas ele pode compreender dois vetores. No caso de dois vetores, o sistema de vetor é normalmente referido como um sistema de vetor binário. Sistemas de vetor binário são descritos em mais detalhe em Gynheung An et ai, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Blology Manual A3. 1-19.

Um sistema extensivamente empregado para transformação de células vegetais usa o plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefadens ou um plasmídeo Ri de Agrobacterium rhizogenes An et al, (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 e Butcher D.N. et al., (1980), Tissite Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrains and J.P. Helgeson, 203-208. Depois de cada método de introdução do promotor desejado ou construto ou seqüência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção nas plantas, a presença e/ou inserção de seqüências de DNA adicionais pode ser necessária. Se, por exemplo, para a transformação o plasmídeo Ti ou Ri das células vegetais é usado, pelo menos o limite direito e freqüentemente entretanto o limite direito e o esquerdo do T-DNA de plasmídeo Ti e Ri, como áreas de ílanqueamento dos genes introduzidos, podem ser conectados. O uso de T-DNA para a transformação de células vegetais foi intensivamente estudado e é descrito em Patente Européia-A-120516; Hoekema, in: The Bínary Plant Vector System Offset-drukkerij Ranters B.B., Alblasserdam, 19S5, Capítulo V; Fraley, et al„ Crit Rev. Plant Sei, 4:1-46; e An et al, EMBOJ. (1985) 4:277-284. Células vegetais podem ser crescidas e mantidas em conformidade com métodos de cultivo de tecido bem conhecidos tal como pelo cultivo das células em um meio de cultura adequado abastecido com os fatores de crescimento necessários tal como aminoácidos, hormônios vegetais, vitaminas, etc.

CULTIVO E PRODUÇÃO Células hospedeiras transformadas com o ácido nucléico, seqüência promotora ou gene químérico da presente invenção podem ser cultivadas sob condições propícias para o crescimento do hospedeiro. O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para crescer a célula hospedeira em questão.

PRODUÇÃO DO PRODUTO DE GENE

Expressão de uma seqüência de codificação de DNA ou seqüência de ácidos nucléicos célula hospedeira vegetal irá produzir um transcrito de RNA. Este transcrito pode ser uma molécula de RNA que não é subseqüentemente traduzida em um produto protéico, mas que pode interagir com o processo de expressão de gene através do mecanismo de RNAi, anti-sentido, ou co-supressão. Se a seqüência de codificação é derivada de um gene estrutural, o transcrito de RNA pode então ser traduzido em um produto de gene protéico. Se desejado, o produto de gene pode ser isolado por técnicas padrão para isolar proteínas de sistemas biológicos, tal como precipitação de sal, cromatografia de coluna, técnicas de imunoafinidade, eletroforese, recristalização, centrifugação, e tais semelhantes.

EXPRESSÃO DE UM PRODUTO DE GENE PREJUDICAL PARA CÉLULAS VEGETAIS

Se a seqüência de codificação de DNA ou sequência de ácidos nucléicos é traduzida em um produto de gene protéico que tem um efeito prejudicial na célula hospedeira vegetal, esta pode ser usada em um sistema de morte de célula vegetal, usando o promotor do promotor da presente invenção para direcionar expressão em células vegetais particulares. Proteínas adequadas tendo um efeito prejudicial poderíam incluir proteases, endonucleases de restrição, proteína de transporte em membranas, e ribonucleases tal como Bamase. Outros exemplos incluem proteína de inativação de ribossomos (RIPs) tal como a proteína RIP b-32 de milho, ricina, abrina, modecina, inibidor de tradução de cevada e proteína antiviral de erva-dos-cancros (PAP). Erva-dos-cancros (Phytolacca americana) produz três proteínas antivirais distintas, em outras palavras PAP', PAPII e PAP-S. Publicação de Patente Internacional No. W002/33107 demonstra o uso de variantes truncadas da proteína PAP-S em um sistema de morte celular. Por isso, o uso de uma proteína de inativação de ribossomo (RIP) tal como proteína antiviral de erva-dos-cancros (PAP) ou variantes destas iria fornecer um sistema de morte de célula vegetal. A invenção será agora descrita, apenas para citar um exemplo, com referência aos seguintes Exemplos. EXEMPLO 1.

Isolamento da região do promotor ATC 085 (SEQ ID No. 7), e produção de construtos de transformação.

DNA genômico de tecido foliar de tabaco foi isolado usando o Kit DNAeasy Plant Mmíprep (Qiagen) de acordo com as instruções de fabricante de material foliar de tabaco K326. Uma alíquota de lpL de uma preparação de DNA genômico 1:10 diluída foi usada para um PCR primário usando 1 pL de um iniciador de PCR S2PCLOFWD (SEQ ID No. 2) a 10 pM/juL e lpL de um iniciador de PCR S2PCLOREV (SEQ ID No. 3) a 10 pM/pL em uma reação de 25pL contendo 0,5 pL de Elongase Taq DNA

Polimerase (Gibco BRL), 1/zL de tampão de Elongase A, 4gL de tampão de Elongase B, lpL de dNTPs a 5mM cada, 15,5/xL de água bidestilada, As condições de reação de PCR foram: um ciclo inicial a 94°C por 2 minutos seguido por 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos e 68°C por 4 minutos, seguido por um ciclo final de 68°C por 10 minutos. A reação de PCR foi elctroforesada em um gel de agarose TBE a 1,2%, contendo traços de brometo de etídio, a 4V/cm por 2 horas. Dois produtos de PCR foram vistos. O produto maior de aproximadamente lóOObp foi excisado do gel e o DNA purificado usando o kit de extração de gel QiaQuick (Qiagen) seguindo os procedimentos de fabricante. O produto de PCR purificado foi clonado em vetor TOPO (Invitrogen) e transformado em E.coli Quimicamente Competente TOP 10 (Invitrogen) seguindo o procedimento padrão de fabricante. Uma alíquota da reação foi emplacada em ágar LB estéril contendo canamicina e as placas foram incubadas durante a noite a 37°C. Colônias foram tríadas por PCR usando as condições acima para identificar clones contendo o promotor. A seqüência foi adicionalmente confirmada por seqüenciamento. O promotor ATC085 foi excisado do vetor TOPO como um fragmento HindIII - BamHI e clonado no vetor de transformação de planta pBin 19 Mais vetor baseado empGPTV-Kan (Becker et al, 1992) derivado de pBIN19 (Bevan et al, 1984) na frente de três genes repórteres diferentes para gerar os construtos, GUS (vetor ATC pBNP085-0040- 001), GFP (vetor ATC pBNP085-0003-001), e Luciferase (vetor ATC pBNP085- 0017-001). O promotor também foi clonado na frente de um gene efetor, a forma ativa da proteína antiviral de erva-dos-cancros S de Phytolacca americana (vetor ATC pBNP085- 0501-001). pBNP085-0501-001 foi depositado por Advanced Technologies (Cambridge) Ltd, 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 OWA sob o Tratado de Budapeste na International Recognition of the Deposit of Microorganisms para os propósitos de Procedimento de Patente na National Collection of Industrial, Maríne and Food Bactéria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB em 20 de Setembro de 2005 sob o número de acesso NCIMB 41343. EXEMPLO 2.

Isolamento da região do promotor ATC 023 e produção de construto de transformação. O promotor ATC023 foi isolado por PCR de DNA genômico de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) usando DNA Polimerase PfuTurbo (Stratagene), e os iniciadores AT4G29190L (SEQ. ID. No. 5) e AT4g29190R (SEQ. ID. No. 6) contendo sítios de restrição para HindlII e BamHI respectivamente, em uma temperatura de anelamento de 63 °C. Os sítios de restrição foram então usados para clonar o fragmento isolado no vetor de transformação de planta pBIl 01 na frente de um gene repórter GUS para gerar o construto pBIlOl 023-0101-001. O construto foi então transformado em E.coli DH5a. EXEMPLO 3.

Produção de plantas de tabaco transformadas.

Os construtos produzidos acima foram transferidos para a linhagem LBA4404 de Agrobacterium tumefadens e plantas transgênicas de tabaco var. K326 foram obtidas por transformação in vitro de discos foliares usando o método de co-cultivo de Horsch et al (1985), Calos transformados e brotos de regeneração foram selecionados em meios de Agar MS contendo 100pg/ml de canamicina e cultivados na presença de Claforan para remover as células de Agrobacterium, Plantas foram então mantidas e multiplicadas in vitro em meios sem Claforan para confirmar ausência de Agrobacterium.

Plantas foram transferidas para solo na casa de vegetação para caracterização. As plantas mostraram características de crescimento indistinguíveis da planta de tabaco tipo selvagem na casa de vegetação. Análise por PCR foi conduzida para identificar plantas transgênicas.

Para a produção de gerações subseqüentes plantas podem ser , propagadas e semente coletada a partir de inflorescências maduras e armazenadas a 6°C. Proporções de segregação em progenia de plantas transgênicas propagadas podem ser usadas para selecionar lotes de semente que contêm sítios únicos de inserção baseado em uma proporção de 3:1. O número de insertos também pode ser determinado por hibridização Southern. A inserção no genoma de tabaco pode ser caracterizada por caminhamento de genoma. EXEMPLO 4.

Produção de plantas transgênicas de Arabidopsis.

Os construtos descritos acima foram transferidos para as linhagens LBA4404 e GV3103 de Agrobacterium tumefaciens, e usados para transformar Arabidopsis thaliana pelo método de banho floral de Clough e Bent (1998). Depois de coleta de semente a partir de plantas imersas, transformantes TI foram selecionados usando seleção em 40^g/m 1 canamicina em ATS/PhytagelTm ou 50/^g/ml canamicina em meios MS/Agar. Transformantes independentes foram isolados desta maneira e estes foram transferidos para solo e crescidos sob condições de dia longo.

Plantas foram permitidas para se autopolinizarem para gerar semente T2. Aproximadamente 60 sementes T2 das linhagens independentes foram selecionadas de novo em canamicina, e testes de qui-quadrado foram usados para determinar se a proporção de segregação observada foi consistente com um sítio único de inserção de transgene (3 resistente: 1 sensível). Múltiplas linhagens independentes com proporções consistentes com um sítio único de inserção foram identificadas, e as linhagens remanescentes foram descartadas. EXEMPLO 5.

Caracterização da expressão de GUS do promotor ATC 085 em plantas de tabaco Sessenta plantas transformadas com o vetor pBNP085-0040-001 foram usadas para análise de GUS. Depois de aproximadamente 6-8 semanas de crescimento na casa de vegetação quando a gema apical havia atingido o estágio de "botão floral", as plantas foram ou podadas em topo usando um bisturi no intemódio acima da 18th folha (contando a partir da base), feridas excisando metade dos limbos de folhas 16, 17 e 18, ou deixadas não tratadas. Depois de 24 horas, várias amostras de tecidos foram tomadas, incluindo seções de caule na base de gemas laterais 14,15,16,17 e 18, seções intemodais de caule, brotos apicais florescentes onde presentes, limbo de folha e pecíolos, e raízes primárias e secundárias. Todos os tecidos coletados foram imediatamente imersos em 0,1 M de tampão de fosfato de potássio pH 7,0 contendo 0,1% de β- mercaptoetanol para prevenir douramento.

Solução corante foi preparada como segue: 300 mg de pó de X-gluc foram dissolvidos em 3ml de DMSO em um recipiente de vidro e ajustado para 1 L com 0,1M tampão de fosfato de potássio contendo 0,5mM de ferricíaneto de potássio, 0,5mM de ferrocianeto de potássio, lOmM de EDTA, 0,1% de Triton-X e 0,067% de Sarcosíl. Esta solução foi armazenada a 4°C no escuro.

Para corar as amostras de tecido, o tampão de fosfato de potássio / β- mercaptoetanol foi reposto com solução corante fresca assegurando que o tecido estava completamente submerso, e as amostras foram incubadas durante a noite a 37°C no escuro. A solução corante foi então reposta com etanol 70% e os tecidos foram armazenados no escuro em temperatura ambiente até que eles tivessem clareado. Algumas vezes foi necessário mudar o etanol pelo menos uma vez por material foliar. Uma vez que o tecido tivesse clareado, o etanol foi reposto com glicerol acidificado. Amostras foram observadas e fotografadas sob um microscópio.

Expressão de GUS foi detectada nas plantas depois de todos os três tratamentos (podadas no topo, ferida, ou não tratada) e isto foi localizado na base das gemas laterais e/ou no caule perto do ponto de início de gema lateral em todos os casos (Figura 3), Uma grande proporção das plantas exibiu expressão em todas as posições de gema amostradas. Expressão nos gemas laterais foi detectada independente do pré-tratamento (poda de topo, ferimento, ou não tratada). Na grande maioria de plantas, nenhuma expressão foi detectada em quaisquer outros tecidos — apenas em umas poucas plantas anômalas foram observados quaisquer outros sítios de expressão, predominantemente nas beiradas de cortes das folhas feridas. Por isso o promotor ATC085 foi mostrado ser um promotor direcionando substancialmente expressão específica em ou ao redor do ponto de início de gema lateral EXEMPLO 6, Caracterização da expressão de GFP do promotor ATC 085 em plantas Plantas transformadas com o vetor pBNP085-0003-001 foram usadas para análise de expressão de GFP. Plantas inteiras ou partes de planta, seções de plantas ou tecidos vegetais foram irradiados com luz azul e inspecionados para fluorescência verde ou por olho ou através de um microscópio. EXEMPLO 7, Caracterização da expressão de Luciferase do promotor ATC 085 em plantas Plantas transformadas com o vetor pBNP085-0017-001 foram usadas para análise de expressão de Luciferase. Plantas inteiras, partes de plantas ou seções de plantas ou tecidos vegetais foram hidratados ou pulverizados com lmM de luciferina (Sigma) e incubados no escuro por 15 minutos. Expressão de luciferase pôde então ser visualizada ou por auto-radiografia em filme de raio X, ou por fotografia usando uma câmera digital com um tempo de exposição longo ou usando um dispositivo de captura de fóton tal como um intensíficador de imagem conectado a um sistema de câmera. EXEMPLO 8.

Caracterização de expressão de PAP do promotor ATC 085 em plantas de tabaco Vinte e uma plantas transgênicas e cinco não transformadas de controle (não-co-cultivada ou NCC) foram crescidas na casa de vegetação, e depois de 6 a 8 semanas, as plantas foram podadas no topo usando um bísturi no intemódio acima da 18th folha para remover a inflorescência apical e folhas mais superiores como descrito acima. O crescimento de brotos laterais das axilas da lólh, 17th e 18th folha foi monitorado diariamente por 29 dias e pontuado no seguinte sistema de classes de tamanho: 0 = gema lateral adjacente ao caule principal 1 — gema lateral em caule lateral alongado (i.e. 1 intemódio) 2 = broto lateral com 2 intemódios 3 = broto lateral com 3 intemódios etc. A partir destes dados foi calculado crescimento médio das três posições de gema lateral em cada dia para as plantas transgênicas e não transformadas. Estes dados foram plotados na Figura 4, E evidente que a expressão localizada da proteína antiviral de erva-dos-cancros dirigida pelo promotor ATC085 causou um atraso significante no início de crescimento de brotos laterais estimulado com poda de topo e uma redução na quantidade de crescimento no Day29 quando comparado com as plantas de controle. O efeito foi particularmente marcado nas duas gemas mais superiores 17 e 18 (veja Figura 4a). Gema lateral 16 mostrou menos crescimento (Figura 4b) com poda de topo do que gemas 17 e 18, mas este foi adicionalmente reduzido por expressão do construto ATC 085-PAP.

Figura 5 mostra o crescimento reduzido de brotos laterais em plantas transgênicas com ATC 085-PAP comparado com plantas de controle, EXEMPLO 9.

Caracterização da expressão de GUS do promotor ATC 085 em plantas de Arabidopsis O construto pBNPOS5-0040-001 foi usado para transformar plantas de Arabidopsis íhaliana. Quarenta plantas TI foram usadas para análise de GUS. As plantas foram crescidas em solo sob condições de dia longo por 3-4 semanas até depois de transição floral quando o eixo primário se 'separou' a um comprimento entre 20 - 40mm. As plantas foram então decapitadas removendo o caule principal em um ponto aproximadamente lOmm da parte superior da roseta. Elas foram então permitidas para continuar crescendo por 24 horas antes de serem removidas do solo, lavadas exaustivamente em água destilada e ensaiadas para atividade de GUS. Tingimento de GUS foi conduzido como descrito acima para as plantas de tabaco, exceto que plantas inteiras foram usadas.

Expressão de GUS foi detectada nas plantas por tingimento altamente intenso na base da planta no sítio de formação de gema lateral e no caule ao redor. Entretanto, expressão também foi vista em outros tecidos em diversas das plantas, incluindo os tecidos foliares e veias, pecíolos, caule, e raízes primárias. EXEMPLO 10.

Caracterização da expressão de GUS do promotor ATC 023 em plantas de tabaco Quarenta e duas plantas de tabaco transformadas com o construto pBHOl 023-0101-001 foram crescidas na casa de vegetação e tratadas como descrito acima para análise de GUS.

Expressão de GUS foi detectada nos gemas laterais de 85% das plantas independente do tratamento (podada no topo, ferida, ou não tratada), e maioria das plantas exibiu expressão em todas as posições de gema amostradas. Em muitos casos expressão localizada também foi vista no caule próximo ao ponto de início de gema lateral. Expressão também foi detectada em outros tecidos em algumas plantas, predominantemente nos tecidos florais, mas ocasionalmente em raiz, caule, folha ou pecíolos.

Localização específica de expressão para as gemas laterais e o caule ao redor foi observada em 17% das plantas (Figura 6). Por isso o promotor ATC023 pode ser usado sozinho para fornecer expressão tecido específica. Ele também pode ser usado em combinação com outro promotor expressando gema lateral, tal como ATC 085, para fornecer perfis de expressão complementares com um sítio de ação sobreposto no tecido de gema lateral. EXEMPLOU.

Caracterização da expressão de GUS do promotor ATC 023 em plantas de Arabidopsis Cinco linhagens T2 transgênicas independentes carregando insertos únicos do cassete 023-0101-001 foram crescidos em solo, decapitadas e coradas para análise de GUS como descrito acima.

Expressão de GUS foi observada nas gemas axilares e caule adjacente, e tecidos florais (Figura 7). Expressão associada com as gemas menores foi a mais forte, e diminuiu prontamente com o desenvolvimento de gemas. Isto indica que o promotor ATC 023 é associado com início de gema lateral. Alguma expressão também foi detectada em outros tecidos em algumas plantas, incluindo os tecidos florais.

Todas as publicações mencionadas no relatório acima são neste lugar incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistema descritos da presente invenção serão evidentes para aqueles versados na arte sem se afastar do escopo da presente invenção, Embora a presente invenção tenha sido descrita em conexão com formas de realização preferidas específicas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais formas de realização especificas. De fato, várias modificações das maneiras descritas de realizar a invenção que são óbvias para aqueles versados em bioquímica e biotecnologia ou campos relacionados são pretendidas para estarem dentro do escopo das reivindicações seguintes.

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Claims (22)

1. Método para modificar morfologia em uma planta, caracterizado por compreender introduzir em uma planta pelo menos um gene quimérico compreendendo uma sequência promotora operacionalmente associado com uma sequência de ácidos nucleicos, a sequência promotora sendo operável para direcionar expressão em células específicas da planta e a sequência de ácidos nucleicos codificando pelo menos um produto de gene capaz de alterar o metabolismo de ou causar morte das células específicas e/ou células vizinhas, em que a sequência promotora é operável para direcionar expressão preferencial em um gema lateral e/ou um broto lateral de modo que menos do que 50% do nível de expressão total de dita sequência de ácidos nucleicos é em qualquer outro tecido vegetal ou célula da planta e que a sequência promotora consiste na sequência definida pela SEQ ID No* 1 ou SEQ ID No, 7.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto de gene da sequência de ácidos nucleicos é uma molécula citotóxica.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o produto de geue da sequência de ácidos nucleicos é uma proteína de inativação de ríbossomo (RIP) ou uma variante ou uma parte funcional desta.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o produto de gene da sequência de ácidos nucleicos é proteína antiviral de erva-dos-cancros ou uma variante ou parte funcional desta.

5. Método de acordo com reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteína antiviral de erva-dos-cancros (PAP) é proteína antiviral de erva-dos-cancros S (PAP-S) ou uma variante ou parte funcional desta.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que crescimento de uma gema lateral e/ou um broto lateral é modificado.

7. Método de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o crescimento de uma gema lateral e/ou um broto lateral é reduzido, prevenido ou atrasado.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o crescimento de uma gema lateral e/ou um broto lateral é modificado pela interrupção do metabolismo ou causando morte de células envolvidas em desenvolvimento de gema lateral.

9. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência promotora definida pela SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 7, capaz de regular a expressão de um gene, operacionalmente ligada a uma sequência heteróloga que codifica uma molécula citotóxica.

10. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência promotora SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 7, capaz de regular a expressão de um gene, operacionalmente ligada a uma sequência heteróloga que codifica uma proteína de inativação de ribossomo (RIP) ou uma variante ou uma parte funcional desta.

11. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência promotora SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 7, capaz de regular a expressão de um gene, operacionalmente ligada a uma sequência heteróloga que codifica uma proteína antiviral de erva-dos-cancros ou uma variante ou parte funcional desta.

12. Ácido nucleico de acordo com reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a proteína antiviral de erva-dos-cancros (PAP) é proteína antiviral de erva-dos-cancros S (PAP-S) ou uma variante ou parte funcional desta.

13. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência promotora definida pela SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 7, capaz de regular a expressão de um gene, operacionalmente ligada a uma sequência heteróloga que codifica uma molécula citotóxica.

14. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência promotora definida pela SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 7, capaz de regular a expressão de um gene, operacionalmente ligada a uma sequência heteróloga que codifica uma proteína de inativação de ribossomo (RIP) ou uma variante ou uma parte funcional desta.

15. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência promotora definida pela SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 7, capaz de regular a expressão de um gene, operacionalmente ligada a uma sequência heteróloga que codifica uma proteína antiviral de erva-dos-cancros ou uma variante ou parte funcional desta.

16. Gene quimérico de acordo com reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a proteína antiviral de erva-dos-cancros (PAP) é proteína antiviral de erva-dos-cancros S (PAP-S) ou uma variante ou parte funcional desta.

17. DNA recombinante, caracterizado pelo fato de compreender DNA de vetor e um ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 12 ou um gene quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 16.

18. Método para regular a expressão de um gene em uma planta, caracterizado por compreender a introdução de um ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 12.

19. Método para modificar o metabolismo de uma célula de uma planta transgênica, caracterizado por compreender a introdução de um ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 12 ou de um gene quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 16.

20. Uso de um ácido nucleico compreendendo uma sequência promotora tendo uma sequência como definida pela SEQID No. 1 ou SEQID No. 7, caracterizado pelo fato de ser para transformar uma planta para modificar a morfologia de uma planta.

21. Uso de um gene quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 16 ou de um ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de ser para transformar uma planta para modificar a morfologia de uma planta.

22. Uso de um ácido nucleico compreendendo uma sequência promotora tendo uma sequência como mostrado em SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 7, caracterizado pelo fato de ser para transformar uma célula vegetal para alterar metabolismo dentro de uma célula vegetal.