BRPI0608369A2 - processo para a produção de um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico - Google Patents
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Abstract
PROCESSO PARA A PRODUçãO DE UM PRODUTO DE FERMENTAçãO A PARTIR DE MATERIAL LIGNOCELULóSICO. A presente invenção fornece um processo de produção de um produto de fermentação que compreende as etapas de i) pré-tratar o material lignocelulósico para a liberação ou separação de celulose, hemi-celulose e/ou lignina, ii) submeter o material pré-tratado a uma celulase, iii) fermentar na presença de um organismo de fermentação, em que a xilose isomerase é adicionada na etapa ii) e/ou etapa iii).
Description
"PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DEFERMENTAÇÃO A PARTIR DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito aos processos enzimáticospara a produção de produtos de fermentação a partir de materiallignocelulósico.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Como as fontes mundiais de óleo, petróleo e gás natural estãogradualmente se esgotando existe um desejo de fornecer fontes de energiaalternativas.
O etanol combustível é hoje produzido em quantidadessignificativas mediante a fermentação de material contendo amido. Aprodução de etanol a partir de material lignocelulósico também foi sugeridocomo tal material, é uma fonte econômica e renovável de carbono. O materiallignocelulósico (freqüentemente referido como biomassa) e o principalcomponente estrutural da maioria das plantas e contém celulose, hemicelulosee lignina.
A WO 2004/099381 diz respeito a levedura geneticamentemodificada transformada com um gene de xilose isomerase exógena queintensifica a capacidade de levedura de fermentar xilose em etanol e outrosprodutos de fermentação desejados.
Chandrakant, P et al. Appl Microbiol Biotechnol (2000)53:301-309 divulga a isomerização simultânea e co-fermentação de glicose exilose por Saccharomyces cerevisiae. A levedura que fermenta a glicosetambém fermenta a xilulose sendo produzida como um resultado da ação dexilose isomerase sobre a xilose.
De modo a economicamente explorar materiaislignocelulósicos é necessário eficientemente converter a xilose em etanol ououtros produtos de fermentação desejáveis. Portanto, existe ainda umanecessidade de melhorar os processos para a produção de produtos defermentação a partir de material lignocelulósico.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece processos para a produção de umproduto de fermentação, especialmente etanol, a partir de materiallignocelulósico.
No primeiro aspecto, a invenção diz respeito a um processopara a produção de um produto de fermentação a partir de materiallignocelulósico, em que o processo compreende as etapas de:
i) pré-tratar o material lignocelulósico para a liberação ouseparação de celulose, hemi-celulose e/ou lignina,
ii) submeter o material pré-tratado a uma celulase,
iii) fermentar na presença de um organismo de fermentação,em que a xilose isomerase é adicionada na etapa ii) e/ou etapa
iii).
O processo da invenção pode ser usado para a produção de umvasto número de produtos de fermentação incluindo álcoois (por exemplo,etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácidoacético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glicônico); cetonas (por exemplo,acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); furfurol, gases (porexemplo, H2 e CO2), e compostos mais complexos, incluindo, por exemplo,antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (porexemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); hormônios, e outros compostos quesão difíceis de produzir sinteticamente. O produto de fermentação podetambém ser um álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), laticínio(por exemplo, na produção de iogurte e queijo), couro, e industrias de tabaco.
BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO
A Fig. 1 mostra a perda de CO2 que é proporcional aorendimento de etanol, de testes com e sem a adição de xilose isomerase àforragem de milho pré-tratada (PCS) contendo tanto glicose quanto xilose.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece processos para a produção de umproduto de fermentação a partir de material lignocelulósico.
Processos de Fermentação da Invenção
Um processo da invenção geralmente compreende quatroetapas principais: pré-tratamento, hidrólise do material pré-tratado,fermentação, e opcionalmente recuperação do produto de fermentação emquestão, tal como etanol.
No primeiro aspecto a invenção se refere a um processo deprodução de um produto de fermentação a partir do material lignocelulósico,em que o processo compreende as etapas de:
i) pré-tratar o material lignocelulósico para a liberação ouseparação de celulose, hemi-celulose e/ou lignina,
ii) submeter o material pré-tratado a uma celulase,
iii) fermentar na presença de um organismo de fermentação,em que a xilose isomerase é adicionada na etapa ii) e/ou etapa iii).
Em uma forma de realização o pré-tratamento na etapa (ii) érealizado usando uma combinação de celulose e xilose isomerase. Em umaoutra forma de realização, a etapa de fermentação iii) é realizada na presençade um organismo de fermentação e xilose isomerase.
Pré-tratamento - etapa i)
De acordo com a invenção o material lignocelulósico é pré-tratado de modo a melhorar a taxa de hidrólise de enzima e ainda aumentar osrendimentos do produto de fermentação. O pré-tratamento na etapa i) érealizado para separar e/ou liberar celulose, hemicelulose e lignina. O materiallignocelulósico pode durante o pré-tratamento estar presente em umaquantidade entre 10 a 80% em peso, preferivelmente entre 20 a 50% em peso.O objetivo é destruir o selo de lignina e romper a estrutura cristalina domaterial lignocelulósico. A estrutura do material lignocelulósico é alterada eos constituintes especialmente poliméricos são produzidos mais acessíveis àhidrólise de enzima nas etapas de processo posteriores onde os polímeros decarboidrato (isto é, celulose e hemicelulose) são convertidos em hexosefermentável e açúcares de pentose. O pré-tratamento na etapa i) pode serrealizado em qualquer meio adequado para separar e/ou liberar a celulose,hemicelulose e/ou lignina.
Exemplos de métodos de pré-tratamentoadequados são descritos por Schell et al. (2003) Appl. Biochem and Biotechn.Vol. 105-108, ρ 69-85, e Mosier et al. Bioresource Technology 96 (2005)673-686, que são aqui incorporados por referência. Em uma forma derealização preferida o material lignocelulósico é tratado química e/oumecanicamente.
Tratamento Químico e/ou Mecânico
Nas formas de realização preferidas da presente invenção otratamento químico e o tratamento mecânico - este freqüentemente referidocomo tratamento físico - são usados isoladamente ou em combinação cometapas enzimáticas subseqüentes ou simultâneas para promover a separaçãoe/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina a partir do materiallignocelulósico.
Preferivelmente, os processos de tratamento químico e/oumecânico são realizados, antes dos processos enzimáticos, em uma etapa depré-tratamento de modo a melhorar as etapas enzimáticas aqui descritas.
Alternativamente, os processos de tratamento químicos e/ou mecânicos sãorealizados simultaneamente com etapa(s) enzimática(s), tais comosimultaneamente com a adição de uma ou mais hemicelulases para liberarxilose e outros açúcares de hemicelulose. A etapa de pré-tratamento podetambém ser realizada simultaneamente com a etapa ii) (ver abaixo) com ousem a adição de hemicelulase(s).Tratamento Químico
Como usado na presente invenção, "tratamento químico" serefere a qualquer processo de tratamento químico que pode ser usado parapromover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina apartir de material lignocelulósico. Exemplos de processos de tratamentoquímicos adequados incluem, por exemplo, tratamento de ácido e base, ácidodiluído, cal e pré-tratamento de amônia, oxidação a úmido, e tratamento desolvente.
Preferivelmente, o processo de tratamento químico é umprocesso de tratamento ácido, mais preferivelmente, um tratamento de ácidodiluído ou suave contínuo, tal como, tratamento com ácido sulfürico, ou umoutro ácido orgânico, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico,ácido succínico, ou misturas dos mesmos. Outros ácidos podem também serusados. O tratamento de ácido suave significa no contexto da invenção que opH de tratamento se situa na faixa de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 3. Em umaforma de realização específica a concentração de ácido está na faixa de 0,1 a2,0% em peso, de ácido sulfurico. O ácido é misturado ou colocado emcontato com o material lignocelulósico e a mistura é mantida em umatemperatura na faixa de 160 a 220°C, tal como de 165 a 195°C, por períodosvariando de minutos a segundos, por exemplo, 1 a 60 minutos, tal como de 2 a30 minutos ou 3 a 12 minutos. A adição de ácido sulfurico pode ser aplicadapara remover a hemicelulose. Isto intensifica a capacidade de digestão dacelulose.
O tratamento químico alcalino com base, por exemplo, NaOHou Na2CO3, é também contemplado de acordo com a invenção.
O tratamento solvente de celulose foi mostrado de converter90% de celulose em glicose e ainda mostrou que a hidrólise de enzima podeser grandemente intensificada quando a estrutura de biomassa for rompida.H2O2 alcalino, ozônio, organosolv (utiliza ácidos de Lewis, FeCl2, (A1)2S04em álcoois aquosos), glicerol, dioxano, fenol, ou etileno glicol estão entre ossolventes conhecidos de romper a estrutura de celulose e promover a hidrólise(Moiser et al. Bioresource Technology 96 (2005), ρ 673-686).
As técnicas de oxidação a úmido envolvem o uso de agentesoxidantes, tais como; agentes oxidantes com base em sulfito e outros mais.Exemplos de tratamentos de solvente incluem tratamento com DMSO(Sulfóxido de Dimetila) e outros mais. Os processos de tratamento químicosão geralmente realizados durante cerca de 5 a cerca de 10 minutos, mas podeser realizado por períodos de tempo mais curtos ou mais longos.
Tratamento mecânico
Como usado na presente invenção, o termo "tratamentomecânico" se refere a qualquer processo de tratamento mecânico ou físico quepode ser usado para promover a separação e/ou liberação de celulose,hemicelulose e/ou lignina a partir do material lignocelulósico. O tratamentomecânico inclui trituração (redução mecânica do tamanho particulado dabiomassa), explosão de vapor e hidrotermólise. A trituração inclui moagem debolas a seco e a úmido e vibratória. Preferivelmente, um processo detratamento mecânico envolve um processo que utiliza pressão elevada e/outemperatura elevada (explosão de vapor). No contexto da invenção pressãoelevada significa pressão na faixa de 300 (2068 kPa) a 600 (4137 kPa),preferivelmente de 400 (2758 kPa) a 500 (3447 kPa), tal como em torno de450 psi (3103 kPa). No contexto da invenção temperatura elevada significatemperaturas na faixa de cerca de 100 a 300°C, preferivelmente de cerca de140 a 235°C. Em uma forma de realização específica, a impregnação érealizada em uma pressão de cerca de 450 psi (3103 kPa) e em umatemperatura de cerca de 235 °C. Mais preferivelmente, o processo mecânico éum processo de batelada, sistema hidrolisador de pistola de vapor que utilizapressão elevada e temperatura elevada, tal como usando o Sunds Hydrolyzer(disponível da Sunds Defibrator AB (Sweden).Tratamento Químico e Mecânico Combinado
Nas formas de realização preferidas, tratamentos tantoquímicos quanto mecânicos são realizados que envolvem, por exemplo, tantotratamento de ácido diluído ou suave quanto tratamento de temperatura epressão elevadas. Os tratamentos químicos e mecânicos podem ser realizadosseqüencial ou simultaneamente, como desejado.
Conseqüentemente, em uma forma de realização preferida, oprocesso compreende a etapa de pré-tratamento de material lignocelulósicousando o tratamento tanto químico quanto mecânico para promover aseparação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.
Em uma forma de realização preferida, a etapa de pré-tratamento i) é realizada como uma etapa de explosão de vapor de ácidodiluído ou suave. Em uma outra forma de realização preferida a etapa de pré-tratamento i) é realizada como uma etapa de explosão de fibra de amônia (ouetapa de pré-tratamento AFEX).
Em uma forma de realização da invenção a capacidade defermentação de, por exemplo, ácido diluído hidrolisado, o materiallignocelulósico, tal como forragem de milho, é melhorado mediante aextração de vapor de modo a desintoxicar o material.
Hidrólise - etapa ii)
Como mencionado acima o material é pré-tratado em celulose,hemicelulose e/ou lignina separada e/ou liberada. Na etapa ii) os polímeros decarboidrato são convertidos em açúcares monoméricos.
A celulose pode ser hidrolisada enzimaticamente usando umacelulose (ver seção de "Celulase" abaixo) ou quimicamente (ver a seção"tratamento químico" acima) em glicose..
Os polímeros de hemicelulose podem ser esgotados pelashemicelulases ou hidrólise de ácido para liberar seus componentes de açúcarde cinco e seis carbonos. Os açúcares de seis carbonos (hexoses), tais comoglicose, galactose e manose, podem facilmente ser fermentados em, porexemplo, etanol, acetona, butanol, glicerol, ácido cítrico e ácido fumárico, porum organismo de fermentação adequado incluindo levedura. Preferível para afermentação de etanol é a levedura da espécie Saccharomyces eerevisiae, queé resistente com respeito aos níveis elevados de etanol, isto é, até, porexemplo, cerca de 10 a 15% em vol. ou mais de etanol.
No entanto, os cinco açúcares de carbono (pentoses), tais comoxilose, que geralmente é compreendida de quantidades significativas dematerial lignocelulósico, tal como madeira de lei, resíduos agrícolas, e pastos,podem apenas ser fermentados em, por exemplo, etanol, por pocuosorganismos de fermentação e com rendimentos baixos.
Em uma forma de realização da invenção o materiallignocelulósico pré-tratado está presente em quantidades em torno de 10 a50% em peso, preferivelmente em torno de 15 a 35% em peso, especialmenteem torno de 20 a 30% em peso, na etapa ii).
Em uma forma de realização a etapa de pré-tratamento ii) podeser realizada na presença de celulase ou uma combinação de celulase e xiloseisomerase. A xilose isomerase pode também estar presente durante a seguinteetapa de fermentação iii). Em uma forma de realização preferida o materiallignocelulósico pré-tratado na etapa i) é inicialmente tratado com umahemicelulase, preferivelmente uma xilanase, esterase, celobiase, oucombinação destes. Alternativamente, a etapa ii) é realizada na presença deuma combinação de hemicelulase e/ou celulase e/ou xilose isomerase. Ahemicelulase pode ser adicionada para fornecer açúcares de xilose e outrosdisponíveis, incluindo glicose, a partir da fração de hemicelulose. No entanto,o tratamento de hemicelulose não é obrigatório de acordo com a invenção.
A celulase hidrolisa celulose em glicose. A xilose isomeraseconverte xilose em xilulose, que pode ser convertida no produto defermentação desejado, tal como etanol, durante a fermentação por leveduras,tais como Saccharomyces eerevisiae. Acredita-se que a adição de xiloseisomerase na etapa ii) e/ou iii) resulta na inibição de xilose reduzida de açãode celulase. Em outras palavras, mediante a conversão de xilose em xilulose,a inibição da celulase é reduzida.
Em uma forma de realização preferida a xilose isomerase éadicionada antes da celulase. Em uma forma de realização preferida a xilose écontinuamente convertida em xilulose e depois fermentada. Mediante aredução do teor de xilose através da isomerização em xilulose a taxa deconversão de celulose pode ser aumentada. Isto reduz o tempo de processopara a produção do produto de fermentação desejado, tal como etanol. Alémdisso, a matéria prima lignocelulósica é utilizada mais eficientemente, vistoque o material lignocelulósico, tal como forragem de milho, contémaproximadamente cerca de 35% em peso de celulose e 25% de xilano.
O tratamento enzimático é realizado em um ambiente aquosoadequado sob condições que podem facilmente ser determinadas por umapessoa qualificada na técnica. Em uma forma de realização preferida a etapaii) é realizada em condições ideais para a celulase e/ou xilose isomerase emquestão.
As condições de tempo, temperatura e pH do processoadequadas podem facilmente ser determinadas por uma pessoa qualificada natécnica da presente invenção. Preferivelmente, a etapa ii) é realizada em umatemperatura entre 30 e 70°C, preferivelmente entre 40 e 60°C, especialmenteem torno de 5O0C. Preferivelmente, a etapa ii) é realizada em um pH na faixade 3 a 8, preferivelmente pH de 4 a 6, especialmente ao redor do pH 5.Preferivelmente, a etapa ii) é realizada entre 8 e 72 horas, preferivelmenteentre 12 e 48 horas, especialmente em torno de 24 horas.
Fermentação - etapa iii)
A etapa iii) é uma etapa de fermentação e inclui, semlimitação, métodos ou processos de fermentação usados para produzirqualquer produto de fermentação, incluindo álcoois (por exemplo, etanol,metanol, butanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético,ácido itacônico, ácido láctico, ácido glicônico); cetonas (por exemplo,acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo,H2 e CO2); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas;vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Aetapa iii) pode também ser uma etapa de fermentação usada na indústria deálcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínio (porexemplo, produtos de leiteria fermentados), indústria de couro e industria detabaco. Em uma forma de realização preferida a etapa de fermentação iii) éum processo de fermentação de álcool. Preferivelmente a etapa defermentação iii) é anaeróbica.
Em uma forma de realização uma ou mais das enzimas, isto é,hemicelulase, celulase, xilose isomerase, adicionadas durante a etapa ii)também serão ativas durante a fermentação. No entanto, é tambémcontemplado adicionar mais hemicelulase, celulase, xilose isomerase, ou umacombinação destas, durante a etapa de fermentação iii). Em outras palavras, aetapa iii) pode em uma forma de realização ser realizada como uma etapa deisomerização e fermentação simultânea, de modo que a xilose isomeraseconverte xilose em xilulose e o organismo de fermentação, tal como levedura,fermenta a xilulose no produto de fermentação desejado, tal como etanolOrganismo de Fermentação
O termo "organismo de fermentação" se refere a qualquerorganismo, incluindo organismos bacterianos e íungicos, adequado para aprodução de um produto de fermentação desejado. Os organismos defermentação especialmente adequados de acordo com a invenção são capazesde fermentar, isto é, converter, açúcares, tais como xilulose e/ou glicose,direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado. Exemplos deorganismos de fermentação incluem organismos fungicos, tais como levedura.A levedura preferida inclui cepas de Saccharomyces spp., em particular umacepa de Saccharomyees eerevisiae ou Saccharomyees uvarum\ uma cepa dePiehia, preferivelmente Piehia stipitis, tal como Piehia stipitis CBS 5773;cepa de Candida, em particular uma cepa de Candida utilis, Candida didensil,ou Candida boidinii, que são capazes de fermentar tanto a glicose quanto axilulose em etanol. Outra levedura contemplada inclui ceás de Zymomonas\Hansenula, em particular H. anômala; Klyveromyees, em particular K.fragilis', e Schizosaccharomyces, em particular S. pombe.
As leveduras comercialmente disponíveis incluem. Porexemplo, RED STAR®/Lesaffre Ethanol Red (disponível da RedStar/Lesaffre, USA) FALI (disponível da Fleischmann's Yeast, uma divisãoda Burns Philp Food Inc., USA), SUPERSTART (disponível da Alltech),GERT STRAND (disponível da Gert Strand AB, Sweden) e FERMIOL(disponível da DSM Specialties).
Hidrólise e fermentação simultâneas
Em uma forma de realização a xilose isomerase usada em umprocesso da invenção possui atividade significativa em volta de temperaturasadequadas para o organismo de fermentação. Em tal caso a hidrólise e afermentação das etapas ii) e iii) podem ser realizadas simultaneamente.
Uma "atividade significativa" significa pelo menos 50% daatividade obtida em condições de fermentação ideais, preferivelmente pelomenos 60% de atividade, mais preferivelmente pelo menos 70% de atividade,mais preferivelmente pelo menos 80% de atividade, ainda maispreferivelmente pelo menos 90% de atividade, ainda mais preferivelmentepelo menos 95% da atividade em condições de fermentação ideais. Ascondições de fermentação ideais em uma forma de realização preferida sãotemperatura de 28 e 40°C, preferivelmente em torno de 32°C, e em um pH de3 a 7, preferivelmente em torno de 3,5 em torno de 5.
Em geral, se a xilose isomerase requer condiçõessignificativamente diferentes das quais são as ideais para o organismo defermentação, a etapa de hidrólise é finalizada antes da fermentação seriniciada.
Em casos onde a xilose isomerase for derivada de Candidaboidinii, preferivelmente Candida boidinii Kloeckera, especialmente Candidaboidinii CKloeckera 2201) (DSM70034 ou ATCC48180) (mencionada abaixo)o processo de hidrólise e fermentação simultânea pode ser realizada em tornode 28 até em torno de 40°C, preferivelmente em torno de 30 até em torno de38°C, especialmente em torno de 32°C, e em um pH em torno de 3 até emtorno de 7, preferivelmente em torno de 3,5 até em torno de 5.
Material lignocelulósico
Os materiais lignocelulósicos são complexos heterogêneos depolímeros de carboidrato (celulose e hemicelulose) e lignina.
A celulose, como amido, é um polímero homogêneo deglicose. No entanto, ao contrário de amido, a estrutura específica de celulosefavorece a ordenação das cadeias poliméricas em estruturas firmementeacondicionadas altamente cristalinas, que são insolúveis em água e resistentesà despolimerização. A hemicelulose é, dependendo da espécie, um polímeroramificado de glicose ou xilose, substituída com arabinose, xilose, galactose,furose, manose, glicose ou ácido glicurônico (Mosier et ai. BioresourceTechnology 96 (2005) 673-686). A lignina é um material de peso molecularelevado insolúvel de álcoois aromáticos que fortalece o materiallignocelulósico. Em geral a lignina contém três álcoois aromáticos (álcoolconiferílico, sinapila e p-cumarila). Além disso, grama e dicot lignina tambémcontêm grandes quantidades de ácidos fenólicos tais como ácido p-cumárico eferúlico, que são esterificados em grupos de álcool um do outro e em outrosálcoois tais como álcoois sinapílicos e p-cumarílicos. A lignina é ainda ligadatanto a hemicelulose quanto a celulose que forma um selo físico ao redor dosúltimos dois componentes o qual é uma barreira impenetrável que impede apenetração de soluções e enzimas (Howard R.L. et al. (African Journal ofBiotechnology VoL 2(12) pp. 602-619, Dezembro de 2003).
Qualquer material lignocelulósico adequado pode ser usado deacordo com a presente invenção. Exemplos de materiais lignocelulósicoscontemplados adequados para uso em um processo da invenção, incluemforragem, sabugos, pedículos, palhas de milho, farelo, sementes, cascas,caroços de fruta, vagens, bagaço, estrume, resíduos de madeira, cascas deárvore, folhas, lascas de madeira, fitas de madeira, serragem, resíduo de fibra,jornais, papel de escritório, papelão, pasto etc. Em uma forma de realizaçãopreferida da invenção o material lignocelulósico compreende forragem demilho, fibra de milho, madeira de pinho, lascas de madeira, popular, palha detrigo, grama flexível, e papel, ou misturas dos mesmos.
ENZIMAS
Hemicelulase
Em uma forma de realização da invenção o materiallignocelulósico pré-tratado é tratado com uma hemicelulase. Qualquerhemicelulase adequada para uso na hidrolisação de hemicelulose em xilosepode ser usada. As hemicelulases preferidas para uso em um processo dapresente invenção incluem xilanases, arabinofuranossidases, acetil xilanesterase, feruloil esterase, glucuronidases, endo-galactanase, manases, endoou exo arabinases, exo-galactanses, e misturas dos mesmos. Preferivelmente,a hemicelulase para uso na presente invenção é uma hemicelulase exo-atuante, e mais preferivelmente, a hemicelulase é uma hemicelulase exo-atuante que possui a capacidade de hidrolisar a hemicelulose sob condiçõesacídicas abaixo do pH 7, preferivelmente pH de 3 a 7. Um exemplo dehemicelulase adequada para uso na presente invenção inclui VISCOZYME™(disponível da Novozymes A/S, Denmark). A hemicelulase é adicionada emuma quantidade eficaz para hidrolisar a hemicelulose em xilose, tal como, emquantidades de cerca de 0,001 a 0,5% em peso de sólidos totais (TS), maispreferivelmente de cerca de 0,05 a 0,5% em peso de TS.
Celulase
Qualquer celulase que seja capaz de hidrolisar a celulose emglicose pode ser usada de acordo com a presente invenção. A atividade decelulase de acordo com a invenção pode ser derivada de qualquer origemadequada; preferivelmente, a celulase é de origem microbiana, tal comoderivável de uma cepa de um fungo filamentoso (por exemplo, Aspergillus,Trichoderma, Humicola, Fusarium, Thielavià). Preferivelmente, acomposição de celulase atua em material tanto celulósico quantolignocelulósico. As celulases preferidas para uso na presente invençãoincluem celulases exo-atuantes e celobiases, e combinações destas. Maispreferivelmente, o tratamento envolve a combinação de uma celulase exo-atuante e uma celobiase. Preferivelmente, as celulases possuem a capacidadede hidrolisar a celulose ou a lignocelulose sob condições acídicas abaixo dopH 7. Exemplos de celulases adequadas para uso na presente invençãoincluem, por exemplo, CELLULCLAST™ (disponível da Novozymes A/S),NOVOZYM™ 188 (disponível da Novozymes A/S). Outras preparaçõescomercialmente disponíveis compreendendo celulase que podem ser usadasincluem CELLUZYME™, CEREFLO™ e ULTRAFLO™ (Novozymes A/S),LAMINEX™ e SPEZYME™ CP (Genencor Intermediários.) eROHAMENT™ 7069 W (da Rohm GmbH).
A(s) enzima(s) de celulase é/são adicionada(s) na etapa ii) emquantidades eficazes para hidrolisar a celulose a partir de materiallignocelulósico pré-tratado em glicose, tal como, para fornecer um nível deatividade na faixa de 0,1 a 100 FPU por grama de sólidos totais (TS),preferivelmente de 0,5 a 50 FPU por grama de TS, especialmente de 1 a 20FPU por grama de TS ou em uma quantidade de 0,1 a 100 mg de proteínaenzimática por grama de sólidos totais (TS), preferivelmente de 0,5 a 50 mgde proteína enzimática por grama de TS, especialmente de 1 a 20 mg deproteína enzimática por grama de TS.
Xilose isomerase
As xilose isomerases (D-xilose cetoiromerase) (E.C. 5.3.1.5.)são enzimas que catalisam a reação de isomerização reversível de D-xilose aD-xilulose. Algumas xilose isomerases também convertem a isomerizaçãoreversível de D-glicose em D-frutose. Portanto, a xilose isomerase é às vezesreferida como "glicose isomerase".
Uma xilose isomerase usada em um processo da invençãopode ser qualquer enzima tendo atividade de xilose isomerase e pode serderivada de quaisquer fontes, preferivelmente de origem bacteriana oufungica, tal como fungos e leveduras filamentosas. Exemplos de xiloseisomerase bacteriana incluem aquelas que pertencem aos gênerosStreptomyces, Actinoplanes, Bacillus e Flavobacterium, e Thermotoga,incluindo T. neapolitana (Vieille et al. Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61(5), 1867-1875) e T. marítima.
Exemplos de xilose isomerases fungicas são espéciesderivadas de Basidiomycetes.
Uma xilose isomerase preferida é derivada de uma cepa delevedura gênero Candida, preferivelmente uma cepa de Candida boidinii,especialmente a xilose isomerase de Candida boidinii divulgada, porexemplo, por Vongsuvanlert et al., (1988), Agric. Biol, Chem., 52(7): 1817-1824. A xilose isomerase pode preferivelmente ser derivada de uma cepa deCandida boidinii (.Kloeekera 2201), depositada como DSM 70034 e ATCC48180, divulgada em Ogata et al. Agric. Biol. Chem. Vol. 33, p. 1519-1520ou Vongsuvanlert et al. (1988) Agric. Biol. Chem., 52(2), p. 1519-1520.
Em uma forma de realização a xilose isomerase é derivada deuma cepa de Streptomyces, por exemplo, derivada de uma cepa deStreptomyces murinus (Patente U.S. n° 4.687.742); S. flavovirens, S. albus, S.achromogenus, S. echinatus, S. wedmorensis todas divulgadas na Patente U.S.η- 3.616.221. Outras xilose isomerases são apresentadas na Patente U.S. ns3.622.452, Patente U.S. n2 4.351.903, Patente U.S. n2 4.137.126, Patente U.S.n2 3.625.828, Patente HU n2 12.415, Patente DE 2.417.642, Patente JP no.69.28.473, e WO 2004/04129 (as quais são todas incorporadas porreferência).
A xilose isomerase pode estar na forma imobilizada ou líquida.A forma líquida é preferida.
A xilose isomerase é adicionada para fornecer um nível deatividade na faixa de 0,01 a 100 IGIU por grama de sólidos totais.
Exemplos de xilose isomerases comercialmente disponíveisincluem SWEETZYME™ T da Novozymes A/S, Denmark.Recuperação
Em uma forma de realização preferida o produto defermentação é recuperado, por exemplo, mediante o uso de qualquer métodode destilação conhecido na técnica. A mistura de fermentação pode serdestilada para extrair o produto de fermentação, em particular etanol. Oproduto final obtido pode de acordo com a invenção ser usado como, porexemplo, etanol combustível; etanol para beber, isto é, bebidas alcoólicasneutras potáveis; ou etanol industrial.
Outros detalhes como realizar a moagem, liquefação,sacarificação, fermentação, destilação, e recuperação de etanol são bemconhecidos para a pessoa versada.
Várias modificações da invenção aqui descrita se tornarãoevidentes para aqueles versados na técnica.Tais modificações são destinadas acair dentro do escopo das reivindicações anexas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Xilose isomerase: xilose isomerase imobilizada derivada deStreptomyces murinus e divulgada na Patente U.S. n2 4.687.742.
Xilose isomerase: derivada de Candida boidinii (Cloeekera2001 aka DSM 70034 aka ATCC 48180) descrita em Vongsuvanlert et al(1988) Agric Biol Chem. 52(2), p. 419-426.
Celulase: Complexo de celulase derivado da Trichodermareeseii e é comercialmente disponível da Novozymes A/S, Denmark, comoCELLUCLAST™ 1,5 L.
Celobiase: Celobiase derivada de Aspergillus niger edisponível como NOVOZYM™ 188 da Novozymes A/S, Denmark.
Levedura: Red Star™ disponível da Red Star/Lesaffre, USA.Métodos:
Ensaio de xilose/glicose isomerase (IGIU)
1 IGIU é a quantidade de enzima que converte glicose emfrutose em uma taxa inicial de 1 micromol per minuto nas condiçõesanalíticas padrão.
Condições Padrão:
Concentração de glicose: 45% p/p
pH: 7,5
Temperatura: 60°C
Concentração de Mg2+ 99 mg/l (1,0 g/l MgSO4 * 7 H2O)
Concentração de Ca2+ < 2 ppm
Ativador, concentração de S02: 100 ppm (0,18 g/l Na2S2O5)Tamponante, Na2COs, concentração: 2 mM Na2COs
Medição da Atividade de Celulase Usando Ensaio de Papel de Filtro (ensaioFPU)
1. Fonte de Método
1.1 O método é divulgado em um documento intitulado"Measurement of Celulase Activities" de Adney, B. and Baker, J. 1996.Laboratory Analytical Procedure, LAP-006, National Renewable EnergyLaboratory (NREL). Ele se baseia no método IUPAC para a medição deatividade de celulase (Ghose, T.K., Measurement of Celulase Activities, Purê& Appl. Chem. 59, pp. 257-268, 1987.
2. Procedimento
2.1 O método é realizado como descrito por Adney and Baker,1996, supra, exceto quanto ao uso de uma placa de 96 reservatórios paraleitura dos valores de absorção após o desenvolvimento de cor, como descritoabaixo.
2.2 Tubos de Ensaio de Enzima:
2.2.1 Uma tira de papel de filtro enrolada (#1 Whatman; 1x6cm; 50 mg) é adicionada ao fundo de um tubo de teste (13 χ 100 mm).
2.2.2 Ao tubo é adicionado 1,0 ml de tamponante de 0,05 MCitrato de Na (pH 4,80).
2.2.3 Os tubos contendo papel de filtro e tamponante sãoincubados 5 min. em 50°C (± 0,10C) em um banho de água em circulação.
2.2.4 Seguinte a incubação, 0,5 ml de diluição de enzima emtampão de citrato é adicionado ao tubo. As diluições de enzima sãodesignadas para produzir valores ligeiramente acima e abaixo do valor alvo de2,0 mg de glicose.
2.2.5 Os conteúdos do tubo são misturados por vórtice suavedurante 3 segundos.
2.2.6 Após o vórtice, os tubos são incubados durante 60 min. a50°C (± 0,1 °C) em um banho de água em circulação.
2.2.7 Imediatamente seguinte aos 60 min. de incubação, ostubos são removidos do banho de água, e 3,0 ml de reagente DNS sãoadicionados a cada tubo para interromper a reação.Os tubos são submetidos avórtice 3 segundos para misturar.
2.3 Esboço e Controles
2.3.1 Um esboço de reagente é preparado mediante a adição de1,5 ml de tampão de citrato a um tubo de teste.
2.3.2 Um controle de substrato é preparado mediante acolocação de uma tira de papel de filtro enrolada no fundo de um tubo deteste, e adição de 1,5 ml de tamponante de citrato.
2.3.3 Controles de enzima são preparados para cada diluiçãode enzima mediante a mistura de 1,0 ml de tampão de citrato com 0,5 ml dadiluição de enzima apropriada.
2.3.4 O esboço de reagente, controle de substrato, e controlesde enzima são experimentados da mesma maneira como os tubos de ensaio deenzima, e terminado juntamente com eles.
2.4 Padrões de Glicose
2.4.1 Uma solução de provisão de 100 ml de glicose (10,0mg/ml) é preparada, e 5 ml de alíquotas são congeladas. Antes do uso, asalíquotas são descongeladas e submetidas a vórtice para mistura.
2.4.2 As diluições da solução de provisão são feitas em tampãode citrato como se segue:
Gl = 1,0 ml de provisão + 0,5 ml de tampão = 6,7 mg/ml = 3,3 mg/0,5 mlG2 - 0,75 ml de provisão + 0,75 ml de tampão = 5,0 mg/ml = 2,5 mg/0,5 mlG3 = 0,5 ml de provisão + 1,0 ml de tampão = 3,3 mg/ml =1,7 mg/0,5 mlG4 = 0,2 ml de provisão + 0,8 ml de tampão = 2,0 mg/ml =1,0 mg/0,5 ml
2.4.3 Tubos padrão de glicose são preparados mediante aadição de 0,5 ml de cada diluição a 1,0 ml de tamponante de citrato.
2.4.4 Os tubos padrão de glicose são experimentados da mesmamaneira como os tubos de ensaio de enzima, e terminados juntamente com eles.
2.5 Desenvolvimento de Cor
2.5.1 Seguinte os 60 min. de incubação e adição de DNS, os tubossão todos submetidos a ebulição juntos durante 5 min. em um banho de água.
2.5.2 Após a ebulição, eles são imediatamente esfriados emum banho de gelo/água.
2.5.3 Quando se esfria, os tubos são concisamente submetidos avórtice, e a polpa é deixada sedimentar. Depois cada tubo é diluído mediante aadição de 50 microL do tubo à 200 microL de ddH20 em uma placa de 96reservatórios. Cada reservatório é misturado, e a absorção é lida em 540 nm.
2.6. Cálculos (os exemplos são dados no documento NREL)
2.6.1 Uma curva padrão de glicose é preparada mediante acolocação em gráfico da concentração de glicose (mg/0,5 ml) com relação aosquatro padrões (G1-G4) vs. A54O- Esta é ajustada usando uma regressão linear(Prism Software) e a equação para a linha é usada para determinar a glicoseproduzida para cada um dos tubos de ensaio de enzima.
2.6.2 Um gráfico de glicose produzida (mg/0,5 ml) vs. diluiçãode enzima total é preparado, com o eixo Y (diluição de glicose) sendo emuma escala log.
2.6.3 Uma linha é traçada entre a diluição de enzima queproduziu exatamente acima de 2,0 mg de glicose e a diluição que produziuexatamente abaixo deste. A partir desta linha, é determinada a diluição deenzima que teria produzido exatamente 2,0 mg de glicose.
2.6.4 As Unidades de Papel de Filtro/ml (FPU/ml) sãocalculadas como se segue:
FPU/ml = 0,37/diluição de enzima que produz 2,0 mg deglicose.
Determinação da Atividade de Celobiase (CBU)
A celobiase (beta-glicosidase EC 3.2.1.21) hidrolisa asligações de beta-1,4 na celobiase para liberar duas moléculas de glicose. Aquantidade de glicose liberada é determinada especifica e quantitativamenteusando o método de hexocinase como se segue:
[Hexocinase]
<formula>formula see original document page 21</formula>
O aumento na absorção é depois medido em 340 nm como ovalor de absorção para NADPH é elevado neste comprimento de onda.Condições de reação
Reação:
Temperatura : 40°C
pH : 5,0
Detecção:
Tempo de reação : 15 minutosComprimento de onda : 340 nm
Uma unidade de celobiase (CBU) é a quantidade de enzima,que libera 2 micromol de glicose por minuto sob as condições padrão acimacom celobiose como substrato.
Um arquivo (EB-SM-0175.02/02) que descreve o métodoanalítico com maiores detalhes é disponível sob pedido da Novozymes A/S,Denmarl, cujo arquivo é por meio desta incluído por referência.
Várias referências aqui citadas, cujas divulgações das quaissão incorporadas por referência em suas totalidades.
Purificação de Xilose Isomerase de Candida boidiniiA purificação de Candida boidinii é descrita emVongsuvanlert et al., (1998), Agric. Biol Chem. 52(7), p. 1817-1824.Descrição da cultura celular pode ser observada em Vongsuvanlert et al.,(1988), Agric. Biol Chem. 52(2), p. 419-426.
<table>table see original document page 22</column></row><table>Adicionar ddH2O para levar o volume a 100 ml para 4L
depois pH para pH 5,5
Inóculo
O inóculo é preparado pelo desenvolvimento de células deCandida boidinii (Kloeckera 2201 aka DSM 70034 aka ATCC 48180) em100 ml do meio basal contendo 1% p/p de D-glicose em um frasco dispensadodurante 24 horas em 28°C sob agitação a 200 rpm.Cultivo
A cultura de inóculo é adicionada em uma diluição de 5 ml decultura de inóculo per 500 ml de meio de crescimento a um meio de cultivoconsistindo de 500 ml do meio basel contendo 2% (p/v) D-xilose em umfrasco agitador dispensado de 2 L. O cultivo é feito em 28°C sob agitaçãorecíproca a 200 rpm, durante 48 horas.
Preparação de extrato livre de célula:
As células são coletadas por centrifugação e lavadas duasvezes com 50mM KHPO4, pH 7,0, com 0,25 mM DTT. A pasta de célula édepois colocada em suspensão no mesmo tampão na diluição de 1 ml detampão por grama de pasta de célula. A mistura é carregada em uma câmaraBioSpec Bead-Beater esfriada com gelo, a qual 0,52 mm de esferas de vidrosão adicionados na relação de 5 gramas de esferas por grama de pasta decélula. Uma quantidade pequena de inibidores de protease é adicionada edepois a mistura de célula-tampão-esfera é batida na BioSpec BeadBeater por4 ciclos de 1 minuto batendo depois 1 minuto de repouso em gelo. Aseparação das esferas, glóbulo de célula e sobrenadante é executada porcentrifugação a 4°C. Após a centrifugação, a solução de sobrenadanteresultante foi usada como o extrato livre de célula.
Purificação de xilose isomerase
Todas as etapas de purificação devem ser executados em 4°C ecom centrifugação a 20.000 χ g durante 20 minutos. O tampão é 50 mmKHPO4, pH 7,0, contendo 0,25 mM DTT, a não ser que de outra maneiramencionada. Qualquer concentração da enzima é por ultrafiltração Amiconcom uma membrana YM-30.
Etapa 1: Tratamento de sulfato de protamina. Um volume deum quinto de uma solução de sulfato de protamina foi adicionado porgotejamento ao extrato livre de célula, o pH sendo ajustado para 7,0 com 10%NH40H sob agitação, seguido por repouso durante 30 min. O precipitadoformado foi removido por centrifugação.
Etapa 2. Saturação de sulfato de amônio a 30%. Aosobrenadante resultante, sulfato de amônio sólido é adicionado com 30% desaturação (176 g/L) com agitação, o pH sendo ajustado para 7,0 com umasolução de NH40H a 10%. Após repouso durante 1 h, o precipitado formadoé removido por centrifugação e o sobrenadante usado na próxima etapa.
Etapa 3. Saturação de sulfato de amônio a 80%. Aosobrenadante resultante, sulfato de amônio sólido é adicionado com 80% desaturação com agitação, o precipitado formado foi coletado por centrifugaçãoe depois dissolvido em um volume mínimo de tamponante. O sobrenadantenão é usado em qualquer uma das etapas seguintes. É o grânulo colocadonovamente em suspensão que é o objeto de outra purificação. A solução degrânulo colocado novamente em suspensão é submetida a diálise em relação a50 mM KHPO4, pH 7,0, contendo 0,25 mM DTT durante a noite.
Etapa 4. Tratamento de MnCl2. A solução de proteínasubmetida a diálise é centrifugada e depois 1 M MnCl2-4H20 foi adicionadona concentração de 5% (p/v), com o pH sendo ajustado para 7,0 com 10%NH4OH sob agitação, seguido por repouso durante 30 minutos. O precipitadoformado foi removido por centrifugação e o sobrenadante resultante foiconcentrado.
A solução de proteína agora contém xilose isomerase depureza suficiente para os ensaios de atividade inicial. Outra purificação daamostra pode ser realizada por técnicas de cromatografia de coluna padrão.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Fermentação de Xilose de Forragem de Milho
O impacto da xilose isomerase sobre a fermentação deForragem de Milho Pré-tratada (PCS) contendo tanto glicose quanto xilose foiinvestigado.
A forragem de milho foi primeiro pré-tratada com cerca de0,5% de ácido sulfurico diluído e depois submetida a explosão de vapor. Omaterial pré-tratado não foi comprimido para remover os hidrolisatos eportanto continha todos os solúveis do pré-tratamento.
15% em peso de TS PCS foi hidrolisado em 50°C na presença decelulase de Trichoderma reeseii (5 FPU/g TS) suplementado com celobiase deAspergillus niger (1,5 CBU per FPU) e cerca de 13 IGIU por grama de xiloseisomerase imobilizada TS derivada de Streptomyees murinus em pH 5. Afermentação a 32°C foi iniciada após 48 horas de hidrólise mediante ainoculação com levedura (Saccharomyces eerevisiae - RED STAR™) em resinaa 10%, isto é, relação do propagado para o volume total, para garantir umacontagem de célula inicial elevada. Um meio de crescimento contendo extrato delevedura a 1% e peptona a 1% foi usado como um nutriente e fonte denitrogênio. A perda de CO2 foi determinada o que é proporcional à produção deetanol. A experiência foi também realizada sem a adição de xilose isomerase. Oresultado dos testes é apresentado na Fig. 1.
Exemplo 2
Isomeração e Fermentação de Xilose Simultânea
A forragem de milho foi primeiro pré-tratada com cerca de0,5% de ácido sulfurico diluído e depois submetida a explosão de vapor. Omaterial pré-tratado não foi comprimido ou lavado para remover oshidrolisatos líquidos e portanto continha todos os solúveis do pré-tratamento.Subseqüentemente, 15% em peso de TS PCS foi hidrolisadoem 5O0C na presença de celulase de Trichoderma reeseii (5 FPU/g TS)suplementado com celobiase de Aspergillus niger (1,5 CBU per FPU) em pH5. Finalmente, a fermentação é realizada na presença de cerca de 13 IGtU porgrama de TS xilose isomerase derivada de Candida boidinii (Kloeckera no.2201) em pH 5. A Fermentação em 32°C foi iniciada após 48 horas dehidrólise mediante a inoculação com levedura (Saceharomyces eerevisiae -RED STAR™) como o organismo de fermentação em resina a 10%, isto é,relação do propagado para o volume total, para garantir uma contagem decélula inicial elevada. Um meio de crescimento contendo extrato de leveduraa 1% e peptona a 1% é usado como um nutriente e fonte de nitrogênio. Asfermentações são monitoradas medindo xilose, xilulose, glicose e etanolusando HPLC-RI. Os controles são incluídos onde a xilose isomerase não foradicionada na fermentação para determinar a produção de etanol quando axilose não for utilizada.
Exemplo 3
Hidrólise, Isomerização e Fermentação de Xilose Simultânea
A forragem de milho é primeiro pré-tratada com cerca de 0,5%de ácido sulfurico diluído e depois submetida a explosão de vapor. O materialpré-tratado não foi comprimido para remover os hidrolisatos líquidos eportanto continha todos os solúveis do pré-tratamento.
15% em peso de TS PCS é convertido em uma configuraçãode Sacarificação e Fermentação Simultânea usando celulase de Triehodermareeseii (5 FPU/g TS) suplementado com celobiase de Aspergillus niger (1,5CBU per FPU) e cerca de 13 IGIU por grama de TS xilose isomerase derivadade Candida boidinii (Kloeckera no. 2201). O tratamento e fermentação deenzima simultâneo é realizado em 32°C e pH 5 usando levedura(Saccharomyees eerevisiae - RED STAR™) como o organismo defermentação em resina a 10%, isto é, relação do propagado para o volumetotal, para garantir uma contagem de célula inicial elevada. Um meio decrescimento contendo extrato de levedura a 1% e peptona a 1% foi usadocomo um nutriente e fonte de nitrogênio. As fermentações são monitoradasmedindo xilose, xilulose, glicose e etanol usando HPLC-RL Os controles sãoincluídos onde a xilose isomerase não for adicionada na fermentação paradeterminar a produção de etanol quando a xilose não for utilizada.
Claims (33)
1. Processo para a produção de um produto de fermentação apartir de material lignocelulósico, caracterizado pelo fato de que compreendeas etapas de:i) pré-tratar o material lignocelulósico para a liberação ouseparação de celulose, hemi-celulose e/ou lignina,ii) submeter o material pré-tratado a uma celulase,iii) fermentar na presença de um organismo de fermentação,em que a xilose isomerase é adicionada na etapa ii) e/ou etapaiii).
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende as etapas de:i) pré-tratar o material lignocelulósico para a liberação ouseparação de celulose, hemi-celulose e/ou lignina,ii) submeter o material pré-tratado a uma combinação decelulase e xilose isomerase,iii) fermentar na presença de um organismo de fermentação.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende as etapas de:i) pré-tratar o material lignocelulósico para a liberação ouseparação de celulose, hemi-celulose e/ou lignina,ii) submeter o material pré-tratado a uma celulase,iii) fermentar na presença de um organismo de fermentação exilose isomerase.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o pré-tratamento na etapa i) é realizadopor submeter o material lignocelulósico ao tratamento químico e/outratamento mecânico.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de- 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o tratamento químico na etapa i) é umtratamento de ácido.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o tratamento de ácido na etapa i) é realizado usando um ácidoorgânico, preferivelmente ácido sulfurico, ácido acético, ácido cítrico, ácidotartárico, ácido succínico, e/ou misturas dos mesmos.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o pH se situa na faixa de 1 a 5,preferivelmente de 1 a 3.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 7, caracterizado pelo fato de que o material lignocelulósico é ácido tratadocom 0,1a 2,0% em peso de ácido sulfurico.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 8, caracterizado pelo fato de que o tratamento mecânico na etapa i)compreende o tratamento de material lignocelulósico em uma temperaturaelevada e/ou uma pressão elevada.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que o tratamento mecânico da etapa i) é realizado sob pressãoelevada na faixa de 300 psi (2068 kPa) a 600 psi (4137 kPa), preferivelmentede 400 psi (2758 kPa) a 500 psi (3447 kPa), tal como em torno de 450 psi(3103 kPa).
11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 10,caracterizado pelo fato de que o tratamento mecânico da etapa i) é realizadoem temperatura elevada na faixa de cerca de 100 a 3 00°C, preferivelmente decerca de 140 a 23 50C.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a etapa de pré-tratamento i) érealizada como uma explosão de vapor de ácido diluído, explosão de vapor,oxidação a úmido, ou explosão de fibra de amônia (ou pré-tratamento AFEX).
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o material lignocelulósico éselecionado do grupo compreendendo: forragem de milho, fibra de milho,madeira de pinho, lascas de madeira, popular, palha de trigo, grama flexível,papel de escritório.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o material lignocelulósico da etapaii) está presente em quantidades de 10 a 50% em peso, preferivelmente de 15a 35, especialmente de 20 a 30% em peso.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o material de celulose, hemicelulosee/ou lignina liberado ou separado obtido na etapa i) é tratado com umahemicelulase, preferivelmente xilanase, esterase e/ou celobiase para liberarxilose.
16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a etapa ii) é realizada na presença demais uma hemicelulase, preferivelmente xilanase, esterase e/ou celobiase.
17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a celulase é adicionada na etapa ii)para fornecer uma nível de atividade na faixa de 0,1 a 100 FPU por grama desólidos totais (TS), preferivelmente de 0,5 a 50 FPU por grama de TS),especialmente de 1 a 20 FPU por grama de TS.
18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a celulase é adicionada na etapa ii)em uma quantidade de 0,1 a 100 mg de proteína enzimática por grama desólidos totais (TS), preferivelmente de 0,5 a 50 mg de proteína enzimática porgrama de TS, especialmente de 1 a 20 mg de proteína enzimática por gramade TS.
19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a xilose isomerase é derivada delevedura, preferivelmente uma cepa do gênero Candida, mais preferivelmenteuma cepa de Candida boidinii, especialmente a cepa de Candida boidinii(Kloeckera).
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a xilose isomerase da etapa ii) ouetapa iii) fornece um nível de atividade na faixa de 0,01 a 100 IGIU porgrama de sólidos totais.
21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a etapa ii) é realizada em condiçõesideais para a celulase em questão.
22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a etapa ii) é realizada em umatemperatura entre 30 e 70°C, preferivelmente entre 40 e 60°C, especialmenteem torno de 50°C.
23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a etapa ii) é realizada em um pH nafaixa de 3 a 8, preferivelmente pH de 4 a 6, especialmente em torno de 5.
24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a etapa ii) é realizada entre 8 e 72horas, preferivelmente entre 12 e 48 horas, especialmente em torno de 24horas.
25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a etapa iii) é realizada durante 24 a192 horas, preferivelmente de 48 a 96 horas, especialmente em torno de 72horas.
26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a temperatura da etapa iii) está aoredor das condições de fermentação ideais para o organismo de fermentação.25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a temperatura na etapa iii) está entre28 e 40°C, preferivelmente 30 e 38°C, especialmente em torno de 32°C.26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o pH da etapa iii) está na faixa de 3 a 7, preferivelmente de 3,5 a 5, especialmente em torno de 4,5.
27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a etapa ii) e a etapa iii) são realizadassimultaneamente.
28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 27, caracterizado pelo fato de que as etapas ii) e iii) simultâneas sãorealizadas em condições ao redor das condições de fermentação ideais.
29. Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o processo simultâneo é realizado em um temperatura emtorno de 28 até em torno de 40°C, preferivelmente em torno de 30 até emtorno de 38°C, especialmente em torno de 32°C.
30. Processo de acordo com as reivindicações 28 ou 29,caracterizado pelo fato de que o processo simultâneo é realizado em um pHna faixa em torno de 3 até em torno de 7, preferivelmente em torno de 3,5 atéem torno de 5.
31. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o organismo de fermentação élevedura, preferivelmente Saccharomyces, especialmente Saccharomycescerevisciae.
32. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é etanol.
33. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 32, caracterizado pelo fato de que as etapas ii) e iii) são realizadassimultaneamente.
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