BRPI0608805A2 - métodos para detectar a presença de um analito em uma amostra e para determinar o sexo de um embrião de ave em um ovo - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA DETECTAR A PRESENçA DE UM ANALITO EMUMA AMOSTRA E PARA DETERMINAR O SEXO DE UM EMBRIãODE AVE EM UM OVO A presente invenção fornece métodos de medir analitos de uma amostra por imunoensajo competitivo, empregando microscopia de fluorescência. Em formas de realização particulares, a invenção fornece um método para determinar o gênero de um embrião de ave in ovo, pela determinação da presença de um composto esteróide estrogênico em umaamostra de fluido embriónico (por exemplo, fluido ou sangue alantóico) do ovo da ave.

Description

"MÉTODOS PARA DETECTAR A PRESENÇA DE UM ANALITO EMUMA AMOSTRA E PARA DETERMINAR O SEXO DE UM EMBRIÃODE AVE EM UM OVO"

INFORMAÇÃO DE PEDIDO RELACIONADO

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dosEstados Unidos No. de Série 60/679.717, depositado em 11 de maio de 2005;cuja descrição é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se genericamente a métodos demedir analitos em uma amostra, mais particularmente a métodos de mediranalitos empregando um imunoensaio competitivo de partículas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A discriminação entre ovos de aves domésticas com base emalguma qualidade observável é uma prática bem conhecida e há muito usadana indústria de aves domésticas. "Inspeção por vela" é um nome comum parauma tal técnica, um termo que tem suas raízes na prática original de inspeçãode um ovo empregando-se a luz de uma vela. Como é sabido por aquelesfamiliares com ovos, embora as cascas de ovo pareçam opaca sob ascondições de mais iluminação, eles são em realidade um tanto translúcidos e,quando colocados em frente de uma luz direta, o conteúdo do ovo pode serobservado.

No controle de incubadora, pode ser desejável separarem-seaves com base em várias características, tais como sexo, doenças, traçosgenéticos etc. Por exemplo, pode ser desejável inocularem-se aves machascom uma vacina particular e inocularem-se aves fêmeas com uma diferentevacina. A separação de sexo das aves na ninhada pode ser importante poroutras razões também. Por exemplo, os perus são convencionalmentesegregados por sexo por causa da diferença da taxa de crescimento eexigências nutricionais dos perus machos e fêmeas. Na indústria de ovos degalinha poedeira ou de mesa, é desejável manter-se somente fêmeas. Naindústria de ave para assar, é desejável segregarem-se as aves em sexo, paraobter-se eficiência de alimentação, melhorar a uniformidade doprocessamento e reduzir os custos de produção.

Infelizmente, métodos convencionais de determinar o seco deaves pode ser caro, de intensa mão-de-obra e tipicamente requerem pessoaltreinado com habilidades especializadas. Os métodos convencionais dedeterminar o sexo das aves incluem determinar o sexo pelas penas, determinaro sexo pelo orifício e determinar o sexo pelo DNA ou sangue. Cerca e três mil(3.000) pintos podem ter seu sexo determinado por hora em um custo de cercade 0,7 a 2,5 cents por pinto. Cerca de mil e quinhentos (1.500) pintos podemter seu sexo determinado por orifício por hora, em um custo de cerca de 3,6 a4,8 cents por pinto. A determinação de seco pelo DNA ou sangue é realizadaanalisando-se uma pequena amostra de sangue coletado de uma ave.

Seria desejável identificar o sexo das aves, bem como outrascaracterísticas das aves, antes da incubação. A identificação do sexo pré-incubação poderia reduzir custos significativamente para vários membros daindústria de aves domésticas. Embora técnicas de inspeção por velaconvencionais possam discriminar um tanto eficazmente entre ovos vivos enão-vivos, estas técnicas de inspeção por vela convencionais podem não sercapazes de confiavelmente determinar o sexo e outras características das avesnão incubadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Como um aspecto, a presente invenção fornece um métodopara detectar a presença de um analito em uma amostra, compreendendo:

misturar juntas uma amostra, uma pluralidade demicropartículas tendo moléculas competidoras ligadas nelas, e uma proteínade ligação rotulada fluorescentemente, que especificamente liga-se a umanalito.colocar a mistura em um receptáculo por um período de temposuficiente para permitir que as micropartículas sedimentem-se; e

determinar a presença do analito na amostra via microscopiade fluorescência, detectando-se o número de micropartículas precipitadas quesão fluorescentemente rotuladas em um ou mais campos e comparar o númerode micropartículas fluorescentemente rotuladas com um valorpredeterminado, em que um número abaixo do valor predeterminado indicaque o analito está presente acima de um nível limiar da amostra.

A invenção também fornece um método para determinar osexo de um embrião de ave de um ovo, compreendendo:

misturar entre si uma amostra de fluido alantóico de um ovo deave, com uma pluralidade de micropartículas tendo moléculas competidorasligadas nelas, e uma proteína de ligação fluorescentemente ligada, queespecificamente se ligue a um composto esteróide estrogênico.

colocar a mistura em um receptáculo por um período de temposuficiente para permitir que as partículas se precipitem; e

determinar a presença do composto esteróide estrogênico naamostra, detectando-se as micropartículas precipitadas fluorescentementerotuladas, via microscopia de fluorescência, em que a presença do compostoesteróide estrogênico na amostra, acima de uma quantidade limiar, indica queo embrião da ave é fêmea.

Como ainda outro aspecto, a invenção fornece um método paradetectar a presença de um analito em uma amostra, compreendendo:

misturar juntas uma amostra de líquido, uma pluralidade demicropartículas flutuantes, tendo moléculas competidoras ligadas nelas, e umaproteína de ligação fluorescentemente rotulada, que especificamente se ligue a um analito.

colocar a mistura líquida em um receptáculo por um períodode tempo suficiente para permitir que as micropartículas flutuantes flutuempróximo da superfície da mistura líquida; e

determinar a presença do analito na amostra via microscopiade fluorescência, detectando-se o número de micropartículas que sãofluorescentemente rotuladas e comparação do número de micropartículasfluorescentemente rotuladas com um predeterminado valor, em que umnúmero abaixo do predeterminado valor indica que o analito está presenteacima de uma quantidade limiar da amostra líquida.

Estes e outros aspectos da invenção são expostos maisdetalhadamente na descrição da invenção que segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um fluxograma que ilustra métodos de determinara presença de um analito em uma amostra de acordo com formas derealização da presente invenção.

A Figura 2 é uma vista de topo de uma bandeja de amostraexemplificativa que pode ser usada para realizar as formas de realização dapresente invenção.

A Figura 3 é uma vista lateral de uma bandeja de amostraexemplificativa, ilustrando a variabilidade na elevação dos fundos de poço.

A Figura 4 é um fluxograma que ilustra métodos de determinara presença de um composto esteróide estrogênico em uma amostra de fluidoalantóico de um ovo de ave de acordo com as formas de realização dapresente invenção.

A Figura 5 é um fluxograma que ilustra métodos de determinara presença de um analito em uma amostra líquida, empregandomicropartículas flutuantes de acordo com as formas de realização da presenteinvenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção agora é descrita mais detalhadamente aseguir com referência aos desenhos anexos, em que formas de realizaçãopreferidas da invenção são mostradas. Esta invenção pode, entretanto, sercorporificada de muitas diferentes maneiras e não deve ser interpretada comolimitada pelas formas de realização expostas aqui; preferivelmente, estasformas de realização são fornecidas de modo que esta descrição seja completae totalmente transmita o escopo da invenção para aqueles hábeis na técnica.

Números iguais referem-se a elementos iguais do princípio aofim. Nas figuras, a espessura de certas linhas, camadas, componentes,elementos ou aspectos pode ser exagerada para clareza. As linhas tracejadasilustram aspectos ou operações opcionais, a menos que de outro modoespecificado.

A terminologia usada aqui é para fins de descrever formas derealização particulares somente e não é destinada a ser limitadora dainvenção. Como aqui usadas, as formas singulares "um", "uma" "o" e "a" sãodestinadas a incluírem as formas plurais também, a menos que o contextoclaramente indique de outro modo. Deve ser ainda entendido que os termos"compreendem", "compreende" e "compreendendo" e termos similares,quando usados nesta especificação, especificam a presença dos aspectos,inteiros, etapas, operações, elementos e/ou componentes citados, porém nãoimpedem a presença ou adição de um ou mais aspectos, inteiros, etapas,operações, elementos, componentes e/ou seus grupos. Como aqui usado, otermo "e/ou" inclui qualquer uma e todas as combinações de um ou mais dositens listados associados. Como aqui usado, as frases tais como "entre X e Y"e "entre cerca de X e Y" devem ser interpretadas como incluindo XeY.

Como aqui usadas, as frases tais como "entre cerca de X e Y" significam"entre cerca de e cerca de Y". Como aqui usadas, as frases tais como "decerca de X a Y" significam "de cerca de X a cerca de Y".

A menos que de outro modo definido, todos os termos(incluindo termos técnicos e científicos) usados aqui têm o mesmo significadocomo comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnicaa que esta invenção pertence. Será ainda entendido que os termos, tais comoaqueles definidos em dicionários comumente usados, devem ser interpretadoscomo tendo um significado que é consistente com seu significado no contextoda especificação e técnica pertinente e não devem ser interpretados em umsentido idealizado ou excessivamente formal, a menos que expressamenteassim definido aqui. As funções ou construções bem conhecidas não podemser descritas em detalhes para brevidade e/ou clareza.

Será entendido que, quando um elemento é referido comoestando "em", "sobre", "ligado" a, "conectado" a, "acoplado" com,"contatando", etc. outro elemento, ele pode estar diretamente sobre, ligado a,conectado com, acoplado com ou contatando o outro elemento ouintercalando elementos que podem também estar presentes. Ao contrário,quando um elemento é referido como estando, por exemplo, "diretamentesobre", "diretamente ligado" a, "diretamente conectado" a, "diretamenteacoplado" com ou "diretamente contatando" outro elemento, não háelementos intervenientes presentes. Será também observado por aqueleshábeis na técnica que referências a uma estrutura ou aspecto que é disposto"adjacente" a outro aspecto podem ter partes que se sobreponham ousubjacente o aspecto adjacente.

Termos espacialmente relativos, tais como "sob", "embaixo","inferior", "sobre", "superior" e similares, podem ser usados aqui parafacilidade de descrição para descrever um elemento ou relação de aspectoscom outro(s) elemento(s) ou aspecto(s), como ilustrado nas figuras. Deve serentendido que termos espacialmente relativos são destinados a abrangerdiferentes orientações do dispositivo em uso ou operação, além da orientaçãorepresentada nas figuras. Por exemplo, Se o dispositivo das figuras forinvertido, elementos descritos como "sob" ou "embaixo" de outros elementosou aspectos seriam então orientados "sobre" os outros elementos ou aspectos.Assim, o termo exemplificativo "sob" pode abranger tanto uma orientação de"sobre" como de "sob". O dispositivo pode ser de outro modo orientado(girado 90 graus ou em outras orientações) e as descrições espacialmenterelativas usadas aqui interpretadas correspondentemente. Similarmente, ostermos "para cima", "para baixo", "vertical", "horizontal" e similares sãousadas aqui para fins de explicação somente, a menos que especificamente deoutro modo indicado.

Deve ser entendido que, embora os termos "primeiro","segundo" etc. possam ser usados aqui para descrever vários elementos,componentes, regiões, camadas e ou seções destes elementos, componentes,regiões, camadas e/ou seções não devem ser limitados por estes termos. Estestermos são somente usados para distinguir um elemento, componente, região,camada ou seção de outro elemento, componente, região, camada ou seção.

Assim, um "primeiro" elemento, componente, região, camada ou seçãoexaminados abaixo poderiam também ser denominados um "segundo"elemento, componente, região, camada ou seção, sem desvio dosensinamentos da presente invenção. A seqüência de operações (ou etapas) nãoé limitada à ordem apresentada nas reivindicações ou figuras, a menos queespecificamente indicado de outro modo.

As formas de realização da presente invenção fornecemmétodos rápidos e baratos para a detecção de analitos. As formas derealização da presente invenção são compatíveis com automação de elevadaprodução, envolvendo manuseio e manipulação de amostra mínimos.

Com referência à Fig. 1, um método para detectar a presençade um analito em uma amostra, de acordo com algumas formas de realizaçãoda presente invenção, é ilustrado. Uma amostra de material é obtida (Bloco10) e então misturada junto com micropartícuias tendo moléculascompetidoras ligadas a elas e com uma proteína de ligação fluorescentementerotulada, que especificamente ligue-se a um analito (Bloco 20).

Uma amostra pode ser obtida de virtualmente qualquer fonte,incluindo materiais orgânicos e inorgânicos e, em particular, as formas derealização podem ser uma amostra biológica (por exemplo, de um indivíduoou um ovo de ave). Amostras biológicas exemplificativas abrangem fluidos etecidos biológicos, incluindo mas não limitados a urina, fezes, sangue,plasma, soro, linfa, fluido cerebroespinhal, leite, fluido alantóico, gema deovo, fluido amniótico, fluido subgerminal, tecido, homogeneizado de tecido esuas misturas. No caso de ovos de ave, materiais exemplo exemplificativospodem ser obtidos do fluido alantóico, sangue, fluido amniótico, tecido,homogeneizado de tecido e similares ou um extrato de qualquer um dosprecedentes.

Em outras formas de realização, a amostra pode ser umaamostra de sujeira, uma amostra de água, uma amostra de água de refugo esimilares, ou um extrato de qualquer um dos precedentes.

As formas de realização da presente invenção não sãolimitadas a ovos de ave em um dia particular (por exemplo, dia onza) duranteo período de desenvolvimento embriônico. De acordo com as formas derealização particulares da presente invenção, a amostra é de um ovo da últimametade, do terceiro quarto ou do quarto quarto de incubação in ovo (isto é, dodesenvolvimento embriônico). Por exemplo, para ovos de franco, a últimametade da incubação é de cerca do décimo ao vigésimo dia de incubação, oterceiro quarto de incubação in ovo é de cerca do décimo ao décimo-quartodia de incubação e o quarto quarto de incubação in ovo é de cerca do décimo-quinto ao vigésimo dia de incubação. Em formas de realização particulares, aamostra é de um ovo de galinha a cerca do décimo-oitavo ou décimo-nono diade incubação in ovo. Em outras formas de realização, as amostras são tiradasde ovos de peru aproximadamente no décimo quarto ao vigésimo-sétimo diade incubação, aproximadamente em cerca do vigésimo-primeiro a viségimo-sétimo dia de incubação, ou aproximadamente do vigésimo-quinto ouvigésimo sexto dia de incubação.Além disso, os métodos de acordo com as formas de realizaçãoda presente invenção, podem ser usados com qualquer tipo de ovo de ave,incluindo mas não limitado a galinha, peru, pato, ganso, codorna, faisão, grou,periquito, ovos de papagaio e similares.

A mistura da amostra, micropartículas e proteína de ligaçãopode ser realizada em várias etapas. Por exemplo, a amostra e a proteína deligação podem ser misturadas entre si primeiro e então as micropartículas sãoadicionadas à mistura da proteína de ligação da amostra. Entretanto, as formasde realização da presente invenção não são limitadas a qualquer ordemparticular de mistura dos componentes entre si.

A mistura pode ser armazenada por um período de tempo(Bloco 30), embora esta etapa não seja necessária em todas as formas derealização. De acordo com algumas formas de realização, a mistura pode serarmazenada entre cerca de um minuto e cerca de quarenta e cinco minutos. Deacordo com outras formas de realização, a mistura pode ser armazenada pormais do que sessenta minutos (por exemplo, cerca de duas a seis horas oucerca de três a quatro horas).

A mistura é então colocada em um receptáculo por um períodode tempo suficiente para permitir que as micropartículas precipitem-se nofundo da mistura (Bloco 40). Como aqui usados, os termos "precipitar","precipitando" e similares significam que as micropartículas sejamsubstancialmente depositada no fundo do receptáculo. O tempo requerido paraas micropartículas precipitarem-se é função das micropartículas e da amostra,como seria entendido por aqueles hábeis na técnica. Por exemplo, umamistura com alta viscosidade pode requerer um período de tempo mais longopara as micropartículas se precipitarem do que uma mistura tendo uma maisbaixa viscosidade.

A quantidade de mistura colocada em um receptáculo pode servirtualmente qualquer quantidade. Uma quantidade exemplificativa pode serentre cerca de 1 e 25, 50, 100 ou 250 μΐ.

O receptáculo pode ser virtualmente qualquer tipo de aparelhocapaz de reter a mistura. Receptáculos exemplificativos incluem mas não sãolimitados a lâminas de microscópio, poços de amostra e similares. Em formasde realização particulares, o receptáculo é um poço de uma placa de multi-poços, por exemplo, uma placa de 4-poços, 24-poços, 96-poços, 384 poços ou1536 poços. O método pode ser praticado para detectar a presença de umanalito em um receptáculo de uma vez ou, alternativamente, em múltiplosreceptáculos (por exemplo, dentro de uma placa de multi-poços).

Em razão de a mistura ser observada via microscopia defluorescência, como descrito abaixo, uma ou mais partes do receptáculo sãogeralmente opticamente transparentes. Por exemplo, se o receptáculo for umpoço, a parte do fundo do poço é tipicamente opticamente transparente, demodo que a mistura pode ser observada e/ou convertida em imagem atravésdo fundo do poço. Na situação em que a observação/formação de imagem éfeita através do topo do poço, o topo do poço deve ser opticamentetransparente.

Uma das vantagens da presente invenção é que ela pode serpraticada com microscopia de fluorescência convencional, desse modoevitando a necessidade de para equipamento dispendioso associado comoutras técnicas, tais como microscopia confocal. Assim, em formas derealização particulares, os métodos da invenção não utilizam microscopiaconfocal.

Como outra vantagem, de acordo com os métodos dainvenção, não há necessidade de separar-se a proteína de ligação rotulada não-ligada das micropartículas, além da separação que é conseguida permitindo-seque as micropartículas se precipitem como descrito acima.

Uma vez as micropartículas tenham-se precipitado, a presençade uma analito na amostra é determinada via microscopia de fluorescência,detectando-se a proteína de ligação rotulada fluorescentemente, ligada àsmicropartículas precipitadas (Bloco 50).

A determinação do analito, de acordo com as formas derealização da presente invenção, é mais quantitativa do que quantitativa pornatureza. Por exemplo, em formas de realização particulares, asdeterminações qualitativas de um composto(s) esteróide(s) estrogênico(s) deuma amostra podem ser usadas para determinar se um embrião de ave émacho ou fêmea, sem a necessidade de utilizarem-se técnicas de microscopiamais dispendiosas, a fim de quantificar a quantidade do(s) composto(s)esteróides estrogênicos na amostra.

Além disso, de acordo com a presente invenção, não énecessário quantificar fluorescência não-ligada (isto é, de fundo) e/ouquantificar fluorescência ligada e/ou determinar a relação ou a diferença entreestes dois valores. Assim, em formas de realização particulares, os métodosda presente invenção não quantificam fluorescência não ligada (isto é, defundo) e oxigênio não quantificam fluorescência ligada e/ou não determinama relação ou a diferença entre estes dois valores.

Como aqui usado, os termos dais como "quantificar","quantitativa" e termos semelhantes têm o significado genericamenteentendido na técnica, por exemplo, relativo à determinação de umaquantidade (por exemplo, peso e/ou concentração) de uma substânciaindicada.

Em formas de realização particulares, a presença do analito édeterminada por comparação com um valor de corte. A fluorescência acimado valor de corte indica que o analito não está presente ou está presente emuma baixa concentração e a fluorescência abaixo do valor de corte indica queo analito está presente acima de um valor limiar. Por exemplo, em métodos depraticar a invenção para determinar o sexo de um embrião de ave de um ovopela detecção de um composto(s) esteróide(s) estrogênico(s) em um fluidoembriônico (por exemplo, fluido de sangue ou alantóico), a fluorescênciaacima do valor de corte indica um embrião macho (isto é, baixos níveis do(s)composto(s) esteróide(s) estrogênico(s) no fluido embriônico) e fluorescênciaabaixo do valor de corte indica um embrião fêmea (isto é, relativamente altosníveis do(s) composto(s) esteróide(s) estrogênico(s) no fluido embriônico). Osmétodos da invenção podem ser usados para produzir outras determinaçõesqualitativas, por exemplo, a presença de contaminação, um patógeno ou umasubstância controlada acima de uma quantidade limiar de uma amostra.

Em outras formas de realização representativas, a invenção épraticada para determinar a presença de um patógeno em uma amostra, peladetecção de antígeno (por exemplo, antígeno de superfície) ou anticorpos queespecificamente ligam-se ao patógeno. Para ilustrar, o método pode serpraticado para detectar antígeno ou anticorpos no sangue, soro ou plasma oufluido embriônico de um ovo (por exemplo, gema, sangue, fluido amniótico,fluido alantóico), a fim de determinar a presença do patógeno e/ou exposiçãoanterior ao patógeno pelo indivíduo, por um parente maternal, tal como umagalinha poedeira (isto é, no caso de anticorpos maternais) e/ou por umamanada ou rebanho de indivíduos aviários ou animais, respectivamente.

Por exemplo, a presença de anticorpos (isto é, anticorposmaternais) contra influenza aviária pode ser detectada na gema de ovosaviários ou no sangue, plasma ou soro de indivíduos aviários pós-incubação,para determinar a presença de influenza aviária e/ou antes da exposição àinfluenza aviária por um indivíduo, uma galinha poedeira (isto é, no caso deanticorpos maternais) e/ou do bando.

Como outro exemplo, a presença de antígeno de superfície deinfluenza aviária pode ser detectada em amostras de água ou no sangue,plasma ou soro de aves pós-incubação ou aves in ovo, para determinar apresença de influenza aviária e/ou antes da exposição a influenza aviária porum indivíduo, uma galinha poedeira (isto é, no caso de anticorpos maternais)e/ou o bando.

O valor de corte pode ser determinado por qualquer meioconhecido na técnica e é opcionalmente um valor predeterminado. Em formasde realização particulares, o valor de corte é predeterminado no sentido de serfixo, por exemplo, baseado em determinações anteriores da presença dequantidades conhecidas do analito e/ou ensaios anteriores. Alternativamente,a expressão valor "predeterminado" pode também indicar que o método dechegar no valor de corte é predeterminado ou fixado mesmo se o valorparticular variar entre ensaios para o mesmo analito ou pode mesmo serdeterminado para cada ensaio realizado. Por exemplo, o valor de corte podeser determinado por uma amostra de controle negativo e/ou positivoconhecida.

Em uma forma de realização particular, o método paradeterminar a presença do analito compreende contar ou "classificar" o númerode micropartículas fluorescentemente rotuladas em um ou mais campos demicroscópio por microscopia de fluorescência. Uma micropartícula é contadaou classificada como positiva para fluorescência se o nível de fluorescênciafor acima do ajuste de detecção do microscópio e/ou for acima do nível dedetecção determinado por um sistema de processamento de imagem, que éusado para avaliar as imagens capturadas pelo microscópio. De acordo comesta forma de realização da invenção, não é necessário quantificar aquantidade de fluorescência (isto é, proteína de ligação rotulada) ligada a cadamicropartícula e/ou quantificar a quantidade de fluorescência de fundo não-ligada. Todas as micropartículas fluorescentes são classificadas comopositivas para fluorescência, independentemente da quantidade de proteína deligação rotulada ligada nelas ou a quantidade de proteína rotulada quepermanece não-ligada. Numerosas micropartículas fluorescentes acima de umvalor de corte indica que o analito não está presente ou está presente em umabaixa concentração (isto é, não está presente acima de uma quantidadelimiar). Um número de micropartículas fluorescentes abaixo de um valor decorte indica que o analito está presente na amostra acima de uma quantidadelimiar. Por exemplo, com respeito aos métodos de determinar o sexo de umembrião de ave in ovo pela determinação da presença de um composto(s)esteróide(s) estrogênico(s), se o número de micropartículas fluorescentes foracima do valor de corte, isso indica um baixo nível de compostos(s)esteróide(s) estrogênico(s) abaixo de uma quantidade limiar está presente eque o embrião é um macho. Se o número de micropartículas fluorescentes forabaixo do valor de corte, isso indica uma concentração relativamente elevadados compostos(s) esteróide(s) estrogênico(s) acima de uma quantidade limiarestá presente e que o embrião é uma fêmea. Assim, os métodos da invençãopodem ser usados em ensaios que suprem tipos sim/não de saída (porexemplo, para determinar se macho ou fêmea ou presença/ausência de umanalito acima de um limiar), sem necessidade de quantificar a quantidade defluorescência ligada e/ou sem a necessidade de quantificar a quantidade defluorescência não-ligada.

O método pode ser praticado de modo que numerosasmicropartículas fluorescentes situando-se no ou próximo do valor de cortepodem ser classificadas como indicando que o analito está presente acima ounão de uma quantidade limiar, dependendo do resultado final desejado. Porexemplo, no caso de sexo selecionando-se ovos aviários, os valores situando-se no ou muito próximo do valor de corte podem ser classificados comomachos se for mais vantajoso do que erroneamente classificar algumas avesfêmeas como machos, em vez de vice-versa.

De acordo com um método de determinação representativo,uma distribuição das classificações de fluorescência para uma pluralidade deamostras é determinada e o valor de corte pode ser determinado em qualquerponto dentro da distribuição, por exemplo, utilizando-se métodos conhecidosna técnica, tais como "análise de agrupamentos". Nas formas de realizaçãoparticulares, o corte é ajustado no ponto em que aproximadamente 50% dasamostras estão abaixo e aproximadamente 50% das amostras estão acima docorte. Esta forma de realização é particularmente adequada paradeterminações em que houver uma distribuição bifásica do analito. Adistribuição dos valores da amostra pode ser determinada por um métodoconhecido na técnica, por exemplo, pode ser baseada em reunião dosresultados de numerosas realizações de ensaio ou pode ser determinadainternamente, isto é, com base em cada realização de ensaio.

Análise de agrupamentos refere-se a uma variedade detécnicas multi-variadas, cuja finalidade é colocar objetos dentro de grupossugeridos pelos dados, de modo que os objetos dentro de um agrupamentosejam similares e objetos em diferentes agrupamentos sejam dissimilares. Aanálise de agrupamento não presume que o número ou associação de gruposseja conhecido antecipadamente, embora o número de grupos possa serespecificado ou exemplos da associação de grupos providos. A análise deagrupamernto pode ser usada para agrupar variáveis (tipicamenteempregando-se correlação de Pearson) ou casos (tipicamente empregando-sea distância Euclideana ao quadrado [soma das distâncias quadradas]). Osagrupamentos podem ser de sobreposição, desunidos, hierárquicos ouencrespados. A análise de agrupamento pode ser usada para analisar os dadosdo intervalo, dados de contagem ou dados binários e, se diferentes variáveisforem usadas, os dados podem ser padronizados antes da análise. Técnicas deagrupamento comumente usadas são (1) Agrupamento de meio-K: umprocesso iterativo, em que em cada etapa casos são agrupados dentro doagrupamento com o centro mais próximo e os centros dos agrupamentos sãorecalculados, continuando até não ocorrerem mais mudanças nos centros ouum número máximo de iterações ser alcançado; (2) agrupamento hierárquico:um processo aglomerativo, que começa combinando-se o par mais próximode objetos em um agrupamento e em cada etapa subseqüente unindo-se ospares dos objetos, pares de agrupamentos ou um objeto em um agrupamento,até todos os dados serem agrupados entre si em um dendrogama (árvore). Emformas de realização particulares, o agrupamento hierárquico com o métodode variância mínima de Ward (distância entre dois agrupamentos é a soma dedesvios ao quadrado dos pontos aos centróides; o objetivo é minimizar a somade quadrados dentro do agrupamento) é usado para selecionar o valor decorte.

A classificação das micropartículas fluorescentes pode serrealizada a olho ou, alternativamente, com software de formação de imagemdigital, que é bem conhecido na técnica (por exemplo, National InstrumentsImage Builder, NIH Image, Cognex VisionPro). Em formas de realizaçãoparticulares, a visão da máquina é usada para converter em imagem asmicropartículas fluorescente. A visão da máquina permite inspeção visualautomatizada e um sistema de visão de máquina inclui, convencionalmente,os seguintes componentes: um processador de visão (baseado em hospedeiroou embutido), um monitor de vídeo para exigir imagens, software de visãopara processar e analisar imagens, uma interface de usuário, uma câmera eiluminação. A visão de máquina é bem entendida por aqueles hábeis natécnica da presente invenção e não necessita ser descrita mais aqui.

Para ilustrar, quando utilizando-se o sistema CognexVisionPro, um algoritmo de encontro de bolha pode ser usado que procurabolhas de pixéis que são de um certo tamanho (em número de pixéis).Alternativamente, algoritmos de igualação de gabarito podem serempregados. Por exemplo, um gabarito de uma única conta pode serintroduzido e o algoritmo pode procurar uma imagem para regiões queigualem o gabarito.

Outros métodos de conversão em imagem podem ser usados,incluindo mas não limitado a técnicas Wavefront Coding (CMD Optics, Inc.,Boulder Colorado).De acordo com algumas formas de realização da presenteinvenção, determinar a presença de um analito em uma amostra, viamicroscopia de fluorescência compreende obter uma ou mais imagens damistura via formação de imagem por microscopia de fluorescência. Uma partede um receptáculo contendo a mistura é geralmente opticamente transparentepara permitir a formação de imagem. Por exemplo, se a amostra for colocadaem um poço, o fundo do poço é tipicamente opticamente transparente. Umaimagem da mistura dentro do poço é obtida em um plano focai no fundo dopoço. O nível de fluorescência de uma imagem pode ser determinado em ummodo automatizado, empregando-se software de análise de imagem, comodescrito acima. A fluorescência de micropartículas da imagem acima de umvalor de corte indica uma baixa concentração do analito abaixo de um nívellimiar da amostra. Contrariamente, a fluorescência de micropartículas daimagem abaixo de um valor de corte indica uma concentração do analitoacima de um nível limiar da amostra.

Alternativamente em outras formas de realização, em vez detécnicas de formação de imagem, determinar a presença de um analito emuma amostra por microscopia de fluorescência compreende o uso de qualquertécnica que possa determinar a distância entre as micropartículas depositadase a lente objetiva do microscópio e/ou mudar aquela distância para a distânciafocai do sistema de microscópio (isto é, um sistema de autofoco). Taismétodos incluem mas não são limitados a sistemas de determinação dadistância baseados em leiser (por exemplo, o Displacement Sensor série CD4da RAMCO Innovations USA).

De acordo com algumas formas de realização da presenteinvenção, as micropartículas são geralmente contas esféricas tendo umdiâmetro entre cerca de três mícrons e cerca de quinze mícrons (3 μ - 15 μ).De acordo com uma forma de realização particular, as micropartículas sãogeralmente contas esféricas, tendo um diâmetro de menos do que cerca de seismícrons (6 μ). Materiais microparticulados exemplificativos incluem mas nãosão limitados a poliestireno, melamina, náilon, metacrilato de polimetila(PMMA), sílica, ouro, óxidos de ferro e suas combinações.

A proteína de ligação pode ser qualquer proteína ou peptídeoque especificamente ligue-se ao analito. Exemplos adequados incluem masnão são limitados a anticorpos, receptores, ligandos, substratos, antígenos,proteínas de transporte, citocromo P450, proteínas de ligação tais comoproteínas de ligação de fator de crescimento semelhante à insulina e qualqueroutro parceiro de ligação específico do analito, como sabido na técnica. Aseleção de uma proteína de ligação adequada é geralmente dependente danatureza do analito de interesse e está dentro do campo de ação daqueleshábeis na técnica.

De acordo com algumas formas de realização da presenteinvenção, um anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal,incluindo fragmentos de anticorpo. O anticorpo ou fragmento de anticorponão é limitado a qualquer forma particular e pode ser um anticorpo bi-específico, humanizado, quimerizado ou fragmento de anticorpo e pode aindaser um fragmento Fab, anticorpo de cadeia única e similares.

Receptores ilustrativos incluem receptores de hormônioprotéico, receptores de fator de crescimento, receptores da citocina, receptoresde hormônio esteróide (por exemplo, receptores de composto esteróideestrogênico), receptores de anticorpo e similares.

As proteínas de ligação que especificamente ligam-se acompostos esteróide estrogênicos incluem mas não são limitadas a anticorpos,receptores para compostos esteróides estrogênicos e aromatase. Os receptorespara compostos esteróides estrogênicos incluem receptores de estrogênio (porexemplo, ERa e/ou ERP).

A molécula competidora pode ser qualquer molécula quecompita com a ligação do analito para a proteína de ligação fluorescentementerotulada. Os ensaios de competição são bem conhecidos na técnica e sãogeralmente baseados na competição entre um analito de uma amostra e umamolécula conhecida (a(s) molécula(s) competidora(s) para ligação a umaproteína de ligação. A(s) molécula(s) competidoras e o analito não precisamser os mesmos, embora em forma de realização particulares eles o sejam,contanto que a molécula competidora ligue-se à proteína de ligação e, dessemodo, reduza a ligação do analito à proteína de ligação e vice-versa. Porexemplo, no caso de um anticorpo e/ou um receptor, o analito e as moléculascompetidoras podem ser diferentes, contanto que ambos se liguemespecificamente ao anticorpo ou receptor (embora não necessariamente com amesma afinidade ou avidez) e inibam a ligação do outro ao anticorpo oureceptor. Métodos de afixar ou ligar moléculas a micropartículas são bemconhecidos na técnica.

Assim, de acordo com a presente invenção, há competiçãoentre as moléculas competidoras ligadas às micropartículas e o analito daamostra para ligação à proteína de ligação fluorescentemente rotulada. Naausência de qualquer analito, a proteína de ligação rotulada ligar-se-á àsmoléculas competidoras ligadas às micropartículas e será detectada comofluorescência associada com as micropartículas. À medida que a concentraçãodo analito na amostra aumenta, a ligação da proteína de ligaçãofluorescentemente rotulada às micropartículas diminuirá devido à competiçãopara ligação à proteína de ligação rotulada. Assim, a quantidade defluorescência associada com as micropartículas é geralmente inversamenteproporcional à quantidade de analito da amostra.

Quaisquer corante(s) fluorescentes podem ser usados pararotular a proteína de ligação. De acordo com formas de realização da presenteinvenção, o corante fluorescente pode incluir uma ficobiliproteína (porexemplo, r-ficoeritrina, b-ficoeritrina, aloficocianina e/ou uma ficobilisoma),um corante de rodamina ou seu derivado, um corante de fluoresceína ou seusderivados, um corante Alexa Fluor , um corante BODIP Y®, um corante decianina ou seus derivados (por exemplo, Cy-5, Cy-5,5 e Cy7), Texas Red equalquer combinação dos precedentes. Métodos de fluorescentemente rotularuma proteína ou peptídeo, por exemplo, por ligação das moléculas de corantefluorescente à proteína de ligação, são bem conhecidos na técnica e podem serprontamente realizados por aqueles hábeis na técnica.

Como outra vantagem, a presente invenção não requerquantificação da fluorescência não ligada e/ou ligada e/ou determinação dadiferença entre proteína de ligação fluorescentemente rotulada ligada versusnão ligada. Assim, em formas de realização da invenção, não é necessárioseparar o rótulo livre durante a produção da proteína de ligaçãofluorescentemente rotulada, desse modo evitando-se este procedimentodispendioso e de intensa mão-de-obra e permitindo-se o uso de reagentesmenos dispendiosos.

Vários analitos de uma amostra podem ser detectadosempregando-se métodos de acordo com as formas de realização da presenteinvenção. Analitos exemplificativos de amostras biológicas incluem mas nãosão limitados a proteínas, peptídeos, citocinas, fatores de crescimento depeptídeo, hormônios esteróides, hormônios de proteína, patógenos (porexemplo, detectando-se antígeno de superfície e/ou toxinas), anticorpos esimilares.

Os hormônios esteróides incluem hormônios esteróidesestrogênicos, incluindo mas não limitado a estradiol, estradiol 17β, estrona,estriol e seus derivados conjugados. Derivados conjugados particularesincluem mas não são limitados a glicuronídeo e derivados de sulfato deestradiol, estradiol 17β e estrona, incluindo estradiol-3-glicuronídeo e/ouestrona-3-glicuronídeo. Os patógenos abrangem bactérias, protozoários,levedura, patógenos fungicos e virais, incluindo mas não limitado a Giardia,Salmonella, Costridia, Eímeria, E. coli, vírus da doença de Newcastle, vírusda doença de Marek, vírus da bronquite infecciosa, influenza (por exemplo,influenza aviária), vírus da doença Bursal e similares.

Analitos exemplificativos de fontes não-biológicas (isto é, nãode um indivíduo) incluem mas não são limitados a contaminantes ambientais(por exemplo, matéria fecal, patógenos, produtos químicos, hormôniosprotéicos, hormônios esteróides incluindo compostos esteróides estrogênicos,fatores de crescimento etc.), explosivos (por exemplo, TNT) e substânciascontroladas (por exemplo, narcóticos tais como opiatos, THC, e anfetaminasou substâncias aumentadoras do desempenho, tais como esteróides incluindoandrógenos e hormônio do crescimento).

Com referência à Fig. 2, uma bandeja de amostraexemplificativa 70, contendo uma pluralidade de poços de amostra 72formados nela em várias formações é ilustrada. Cada poço de amostra 72 éconfigurado para receber uma mistura de amostra como descrito acima. Asbandejas de amostra, tendo várias configurações e formações de poços deamostra, podem ser utilizadas de acordo com as formas de realização dapresente invenção. As bandejas de amostra podem ser formadas de váriosmateriais e via várias técnicas. A presente invenção não é limitada ao uso dabandeja de amostra ilustrada 70.

Como ilustrado na Fig. 3, as elevações do fundo dos poços 72de uma bandeja de amostra 70 podem variar. Os fundos dos poços ilustrados72 têm diferentes elevações (El, E2, E3) em relação entre si. Para compensarpor isto, uma elevação média do fundo de cada poço é determinada e entãopelo menos duas imagens da mistura em um poço são obtidas em planosfocais tendo respectivas elevações que são acima e abaixo da elevação média.As imagens são então analisadas quanto à fluorescência de micropartículascomo descrito acima. Este aspecto da invenção é particularmente útil combandejas de amostra menos dispendiosas, em que pode haver maisvariabilidade na elevação do fundo do poço (por exemplo, placas demultipoços de termoconformação).

De acordo com outras formas de realização da presenteinvenção, uma elevação mediana do fundo de cada poço é determinada. Pelomenos duas imagens da mistura no poço são obtidas em planos focais tendorespectivas elevações que são acima e abaixo da elevação média e umaimagem da mistura dentro do poço é obtida em um plano focai no fundo decada poço. As imagens são então analisadas quanto à fluorescência demicropartículas como descrito acima.

Nas formas de realização representativas, a invenção pode serpraticada para medir qualquer analito de interesse em uma amostra de um ovode ave (por exemplo, patógenos, anticorpos, hormônios, fatores decrescimento, proteínas, peptídeos e similares). As formas de realização dapresente invenção são particularmente adequadas para uso na determinaçãodo sexo de um embrião de um ovo de ave. Além disso, as formas derealização da presente invenção podem mitigar problemas associados com asatuais tecnologias identificadoras de sexo, incluindo, mas não limitados acustos dos reagentes, custos de descarte, custos de instrumentos,complexidade dos instrumentos e velocidade do ensaio.

Com referência à Fig. 4, um método para determinar o sexo deum embrião de ave in ovo de acordo com algumas formas de realização dapresente invenção é ilustrado. Uma amostra de fluido alantóico é obtida(Bloco 110) e então misturada junto com micropartículas (por exemplo, 5 μde contas de poliestireno) tendo moléculas competidoras (por exemplo, umcomposto esteróide estrogênico, tal como estradiol) ligadas nelas e com umaproteína de ligação fluorescentemente rotulada (por exemplo, rotuladaficoeritrina) (por exemplo, um anticorpo monoclonal) que especificamente seliga a composto(s) esteróide(s) estrogênico(s) (Bloco 120). A mistura pode serarmazenada por um período de tempo (Bloco 130) como descrito acima. Amistura é então colocada em um receptáculo (por exemplo, um poço debandeja de amostra como descrito acima) por um período de tempo suficientepara permitir que as micropartículas sedimentem-se no fundo da mistura(Bloco 140). Uma vez as micropartículas tenham-se sedimentado, a presençade composto(s) esteróide(s) estrogênico(s) na amostra é determinada viamicroscopia de fluorescência, detectando-se a proteína de ligaçãofluorescentemente rotulada ligada às micropartículas sedimentadas (Bloco150). Se houver um elevado nível de composto(s) esteróide(s) estrogênico(s)na amostra (isto é, um ovo fêmea), a proteína de ligação fluorescentementerotulada exibirá baixa ligação às contas. Se houver um baixo nível decomposto(s) esteróide(s) estrogênico(s) na amostra (isto é, um ovo macho), oanticorpo fluorescentemente rotulado exibirá alta ligação às contas.

Em métodos particulares de determinar o sexo de um embriãode ave in ovo de acordo com a presente invenção, numerosas micropartículassedimentadas, que são fluorescentemente rotuladas, são determinadas comodescrito acima e comparadas com um valor de corte, também como descritoacima. Numerosas partículas fluorescentemente rotuladas abaixo do valor decorte indicam que o composto esteróide estrogênico está presente acima deuma quantidade limiar da amostra e que o embrião é fêmea.

Nas formas de realização representativas de determinar o sexode um embrião de ave de um ovo, uma amostra de fluido alantóico do ovo émisturada junto com micropartículas (por exemplo, 5 μ de contas depoliestireno) tendo estradiol ligado nelas e com um anticorpo monoclonalfluorescentemente rotulado, que especificamente liga-se a estradiol.Alternativamente, o método pode utilizar um receptor de estrogêniofluorescentemente rotulado para detectar a concentração de compostosesteróides estrogênicos na amostra de fluido alantóico.

De acordo com formas de realização particulares, os métodosda invenção são muito sensíveis e podem detectar tão pouco quanto 500, 250,150,100, 50 pg/ml ou menos de composto(s) esteróide(s) estrogênico(s) emuma amostra.

Quando o analito é composto(s) esteróide(s) estrogênico(s), ométodo pode ainda compreender tratar a amostra para liberar o composto nãoderivado. Por exemplo, o tratamento enzimático (por exemplo, glicuronidasee/ou sulfatase) pode ser usado para liberar estradiol e estrona de glicuronídeode estradiol e estrona e derivados de sulfato, que são comumente encontrados,por exemplo, no fluido alantóico.

Com referência à Fig. 5, um método para detectar a presençade um analito em uma amostra, de acordo com algumas formas de realizaçãoda presente invenção é ilustrado. Uma amostra líquida de material é obtida(Bloco 210) e então misturada junto com micropartículas flutuantes, tendomoléculas competidoras ligadas nelas e com uma proteína de ligaçãofluorescentemente rotulada, que especificamente se liga a um analito (Bloco220). A mistura pode ser armazenada por um período de tempo (Bloco 230),como descrito acima. A mistura é então colocada em um receptáculo (porexemplo, um poço de bandeja de amostra como descrito acima) por umperíodo de tempo suficiente para permitir que as micropartículas flutuantesflutuem próximo da superfície da mistura líquida (Bloco 240). Uma vez asmicropartículas tenham flutuado próximo da superfície, a presença de umanalito na amostra é determinada via microscopia de fluorescência,detectando-se a proteína de ligação fluorescentemente rotulada, ligada amicropartículas (Bloco 250). Neste caso, a microscopia de fluorescência éconduzida via à extremidade de abertura de um receptáculo (por exemplo, umpoço de amostra).

As formas de realização da presente invenção podem nãorequerer manuseio de amostra após a adição de reagentes. Os resultados doensaio podem ser lidos diretamente de um receptáculo de amostra. Outravantagem é que, em formas de realização particulares, a instrumentação podeser equipamento de manutenção relativamente baixa: um sistema demicroscopia convencional com iluminação halógena ou LED.

O precedente é ilustrativo da presente invenção e não deve serinterpretado como limitando-a. Embora algumas formas de realizaçãoexemplificativas desta invenção tenham sido descritas, aqueles hábeis natécnica observarão prontamente que muitas modificações são possíveis nasformas de realização exemplificativas, sem materialmente desviarem-se dosnovos ensinamentos e vantagens desta invenção. Desta maneira, todas taismodificações são destinadas a serem incluídas dentro do escopo destainvenção, como definido nas reivindicações. A invenção é definida pelasseguintes reivindicações, com equivalentes das reivindicações a seremincluídos nelas.

Claims (29)

1. Método para detectar a presença de um analito em umaamostra, caracterizado pelo fato de compreender:misturar entre si uma amostra, uma pluralidade demicropartículas tendo moléculas competidoras ligadas nelas e uma proteínade ligação fluorescentemente rotulada, que especificamente se liga a umanalito;colocar a mistura em um receptáculo por um período de temposuficiente para permitir que as micropartículas se sedimentem; edeterminar a presença do analito na amostra, via microscopiade fluorescência, detectando-se o número de micropartículas sedimentadasque são fluorescentemente rotuladas em um ou mais campos e comparar onúmero de micropartículas fluorescentemente rotuladas com umpredeterminado valor, em que um número abaixo do valor predeterminadoindica que o analito está presente acima de um nível limiar da amostra.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato do receptáculo compreender uma lâmina de microscópio.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato do receptáculo compreender um poço, em que uma parte de fundo dopoço é opticamente transparente e em que as micropartículas se sedimentamno fundo do poço.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender ainda armazenar a mistura por um período de tempoantes da colocação da mistura em um receptáculo.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato da armazenagem compreender armazenar a mistura entre cerca de umminuto e cerca de quarenta e cinco minutos (1 min - 45 min).

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato da armazenagem compreender armazenar a mistura por mais do quecerca de sessenta minutos (60 minutos).

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato da amostra ser uma amostra biológica.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato da amostra biológica ser de um ovo de ave.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de compreender ainda obter a amostra biológica antes da etapa demistura.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato da amostra biológica compreender material selecionado do grupoconsistindo de fluido alantóico, gema de ovo, urina, fezes, sangue, plasma,soro, fluido amniótico, fluido subgerminal, linfa, fluido cerebroespinhal, leite,tecido, homogeneizado de tecido e uma mistura deles.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato das micropartículas compreenderem contas genericamente esféricas,tendo um diâmetro menor do que cerca de seis mícrons (6 μ).

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato das micropartículas compreenderem contas genericamente esféricas,tendo um diâmetro entre cerca de três mícrons e cerca de quinze mícrons (3 μ - 15 μ).

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato das micropartículas compreenderem material selecionado do grupoconsistindo de poliestireno, melamina, náilon, metacrilato de polimetila(PMMA), sílica, ouro e óxidos de ferro.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato da proteína de ligação ser um anticorpo.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato do anticorpo ser um anticorpo monoclonal.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato do anticorpo ser um anticorpo policlonal.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato da proteína de ligação ser um receptor.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato da proteína de ligação fluorescentemente rotulada ser rotulada comum corante fluorescente, selecionado do grupo consistindo de umaficobiliproteína, um corante de rodamina ou seu derivado, um corante defluoresceína ou seu derivado, um corante de Alexa Fluor®, um coranteBODIP Y®, um corante de cianina ou seu derivado e Texas Red.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato do analito ser selecionado do grupo consistindo de uma proteína, umpeptídeo, um fator de crescimento de peptídeo, uma citocina, um hormônioesteróide, um hormônio de proteína, um anticorpo, um patógeno, umcontaminante ambiental, um explosivo e uma substância ilegal.

20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato do analito ser um composto esteróide estrogênico, selecionado dogrupo consistindo de estradiol, estrona, um derivado conjugado de estradiol,um derivado conjugado de estrona e uma combinação deles.

21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato da etapa de mistura compreender primeiro misturar a amostra eproteína de ligação entre si e, subseqüentemente, adicionar as micropartículasà mistura de proteína de ligação de amostra.

22. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato da etapa de determinar a presença do analito na amostra, viamicroscopia de fluorescência, compreender obter uma ou mais imagens damistura via formação de imagem de microscopia de fluorescência.

23. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de determinar a presença do analito na amostra, via microscopia defluorescência, compreender:determinar uma elevação média do fundo do poço; eobter pelo menos duas imagens da mistura no poço em planosfocais, tendo respectivas elevações que ficam acima e abaixo da elevaçãomédia.

24. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de determinar a presença do analito na amostra, via microscopia defluorescência, compreender:determinar uma elevação média do fundo do poço;obter pelo menos duas imagens da mistura dentro do poço emplanos focais tendo respectivas elevações que ficam acima e abaixo daelevação média; eobter uma imagem da mistura dentro do poço em um planofocai no fundo do poço.

25. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de determinar a presença do analito na amostra, via microscopia defluorescência, compreender obter uma imagem da mistura dentro do poço emum plano focai no fundo do poço.

26. Método para determinar o sexo de um embrião de ave emum ovo, caracterizado pelo fato de compreender:misturar entre si uma amostra de fluido alantóico de um ovo deave com uma pluralidade de micropartículas, tendo moléculas competidorasligadas nelas e uma proteína de ligação fluorescentemente rotulada, queespecificamente liga-se a um composto esteróide estrogênico;colocar a mistura em um receptáculo por um período de temposuficiente para permitir que as micropartículas se sedimentem; edeterminar a presença do composto esteróide estrogênico naamostra, detectando-se as micropartículas sedimentadas fluorescentementerotuladas, via microscopia de fluorescência, em que a presença do compostoesteróide estrogênico na amostra acima de uma quantidade limiar indica que oembrião de ave é fêmea.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de um número de micropartículas sedimentadas que sãofluorescentemente rotuladas ser determinado e comparado com um valorpredeterminado, em que um número abaixo do valor predeterminado indicaque o composto esteróide estrogênico está presente acima de um quantidadelimiar da amostra.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato da proteína de ligação ser um anticorpo.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato da proteína de ligação ser um receptor para um composto esteróideestrogênico.