BRPI0608859A2

BRPI0608859A2 - polipeptìdeo isolado, seqüência de ácido nucleico isolada, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira de bacillus recombinante, uso de polipeptìdeo, métodos para produzir um polipeptìdeo, para melhorar a taxa de conversão de ração para animal, e para modular a microflora intestinal de animal, aditivo de ração animal, e, composto de ração animal

Info

Publication number: BRPI0608859A2
Application number: BRPI0608859-7A
Authority: BR
Inventors: Lene Nonboe Andersen; Aurelia Seon; Carlos Simoes-Nunes; Anna Maria Klunter; Bjorn Eggert Christensen; Peter Rahbek Oestergaard; Maria Leonardo De
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2005-03-22
Filing date: 2006-03-22
Publication date: 2010-02-02
Also published as: PL1863834T3; US20100285171A1; DE602006015444D1; JP5091109B2; DK1863834T3; AU2006226729A1; US20120295000A1; MX2007011479A; WO2006099871A1; JP2008533976A; EP1863834B1; CA2603140A1; EP1863834A1; ATE473999T1; PT1863834E; US20090142802A1; AU2006226729B2

Abstract

POLIPEPTìDEO ISOLADO, SEQüêNCIA DE áCIDO NUCLEICO ISOLADA, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSãO RECOMBINANTE, CéLULA HOSPEDEIRA DE BáCILLUS RECOMBINANTE, USO DE POLIPEPTìDEO, MéTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTìDEO, PARA MELHORAR A TAXA DE CONVERSãO DE RAçãO PARA ANIMAL, E PARA MODULAR A MICROFLORA INTESTINAL DE ANIMAL, ADITIVO DE RAçãO ANIMAL, E, COMPOSIçãO DE RAçãO ANIMAL. A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados e seqúéncias de ácido nucleico isoladas que codificam os polipeptídeos, assim como a métodos para produzir e usar os polipeptídeos em ração para animal. Um exemplo de um polipeptídeo da invenção é a chamada proteína L12 de Bacilius licheniformis ATCC 14580 que melhora a Taxa de Conversão de ração (FCR) e/ou atua como um modulador da microflora intestinal. A invenção além disso diz respeito ao uso probiótico de cepas de Bacilius que produzem proteínas relacionadas com L12.

Description

"POLIPEPTÍDEO ISOLADO, SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICOISOLADA, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DEEXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA DEBACILLUS RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMPOLIPEPTÍDEO, PARA MELHORAR A TAXA DE CONVERSÃO DERAÇÃO, E PARA MODULAR A MICROFLORA INTESTINAL, USOS DEUM POLIPEPTÍDEO, E DE UMA CEPA DE BACILLUS, ADITIVO DERAÇÃO PARA ANIMAL, COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO PARA ANIMAL,E, MICROORGANISMO"

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados eseqüências de ácido nucléico isoladas que codificam os polipeptídeos. Ainvenção também diz respeito a construções de ácido nucléico, vetores ecélulas hospedeiras que compreendem as seqüências de ácido nucléico, assimcomo métodos para produzir e usar os polipeptídeos em ração de animal, porexemplo para melhorar a Taxa de Conversão de Ração (FCR) e/ou para amodulação da microflora intestinal. Um exemplo de um polipeptídeo dainvenção é a chamado de proteína L12 de Bacillus licheniformis ATCC14580, que tem a seqüência de aminoácido dos aminoácidos de +1 a +85 daSEQ ID NO: 2 aqui contida (em que segue os aminoácidos 1 a 85 da SEQ IDNO: 2). A invenção também diz respeito ao uso probiótico em ração deanimal de cepas de Bacillus que produzem proteínas relacionada com a LI2.Fundamentos da InvençãoFundamentos da Técnica

A WO 03/093453 divulga, no Exemplo 1, o planejamento deuma célula hospedeira de Bacillus licheniformis melhorada que não produzuma proteína extracelular pequena codificada pelos nucleotídeos de 601 a 978da SEQ ID NO: 133 da WO 03/093453, a proteína tendo a seqüência deaminoácido dos aminoácidos de 1 a 126 da SEQ ID NO: 134 da WO03/093453. As SEQ ID NOs 133 e 134 da WO 03/093453 são incluídas napresente listagem de seqüência como as SEQ ID NOs 3 e 4, respectivamente,a seqüência de aminoácidos de 1 a 126 da SEQ ID NO: 4 aqui contida éidêntica aos aminoácidos de -41 a +85 da SEQ ID NO: 2 aqui contida. A WOO3/093453 não divulga um polipeptídeo isolado tendo os aminoácidos de 1 a85 da SEQ ID NO: 2. A WO 03/093453 também não divulga uma seqüênciade ácido nucléico isolada tendo os nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1.

GenPept acesso no. YP_081375 é uma proteína BL00275hipotética de Bacillus licheniformis ATCC 14580. GenPept acesso no.YP_081375 é idêntico aos aminoácidos de -41 a +85 da SEQ ID NO: 2 aquicontida. A seqüência da proteína BL00275 hipotética de Bacilluslicheniformis ATCC 14580 também foi entrada no UniProtKB/TrEMBL como acesso primário número Q65CU4. Esta seqüência também é idêntica aosaminoácidos de -41 a +85 da SEQ ID NO: 2 aqui contida.

A seqüência de nucleotídeo que codifica YP_081375 temacesso do Banco de Gene no. NC 006270. O acesso do Banco de Gene no.NC_006270 é idêntico aos nucleotídeos de 1 a 381 da SEQ ID NO: 1 aquicontida.

Surpreendentemente verificou-se que os polipeptídeosrelacionados com parte desta seqüência hipotética de Bacillus licheniformis, asaber os aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2, têm um potencial enormepara o uso em ração de animal.

SWISSPROT acesso no. Q8DQM5 é uma proteína spr0600hipotética de 115 aminoácidos de Streptococcus pneumoniae (cepa ATCCBAA-255 / R6). A seqüência também é divulgada em "Genome of thebacterium Streptococcus pneumoniae strain R6" por Hoskins et al, J.Bacteriol. 183: 5709 (2001). Q8DQM5 não compreende uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos 33% de identidade aos aminoácidos de 1 a85 da SEQ ID NO: 2.

Martinez et al, Microbiology (1999), vol. 145, pp. 3155-3161divulga, na Fig. 3, a seqüência de 91 aminoácidos deduzida da pré-bacteriocina lactococina 972 com uma porção madura de terminal C de 66aminoácidos prognosticada. A porcentagem de identidade de cada um dospré-polipeptídeo e o polipeptídeo maduro para os aminoácidos de 1 a 85 daSEQ ID NO: 2 está abaixo de 33%.

Uma pesquisa de bases de dados de nucleotídeo comnucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1 (que codifica os aminoácidos de1 a 85 da SEQ ID NO: 2) revelou um fragmento de DNA de 47% deidentidade aos nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1. Este fragmento éparte de uma seqüência que resulta de um projeto de seqüenciamento aindaem andamento. O organismo a partir do qual o fragmento deriva é chamadode Bacillus (Geobacillus) stearothermophilus cepa 10. O trabalho deseqüenciamento é feito no University of Oklahoma (http://www.genome.ou.edu/bstearo.html). Não existe nenhuma publicação denenhuma das seqüências de aminoácido que potencialmente correspondem aeste fragmento de DNA e portanto também nenhuma indicação de qualquerutilidade potencial de qualquer seqüência de aminoácido codificada.

Um produto probiótico em ração designado BioPlus®2B éoferecido para venda pelo Chr. Hansen NS, 10-12 Boege Al 16, DK-2970Hoersholm, Dinamarca. O produto contém uma cepa de Bacilluslicheniformis que entretanto não produz uma proteína relacionada com L12(ver o Exemplo 6 aqui contido).

É um objetivo da presente invenção fornecer polipeptídeos,ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos, cepas especiais de Bacillus,assim como métodos para o uso dos polipeptídeos e das cepas de Bacillus emração de animal.

Sumário da InvençãoA presente invenção diz respeito a polipeptídeos isoladosselecionados do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo que compreendeuma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade aosaminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 33%; (b) umpolipeptídeo que é codificado por uma seqüência de ácido nucléico quehibridiza sob condições de severidade baixa com (i) nucleotídeos de 124 a378 da SEQ ID NO: 1, (ii) uma subseqüência de (i) de pelo menos 100nucleotídeos ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); (c) umavariante do polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido dosaminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 que compreendem uma substituição,deleção, extensão, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos; (d) umavariante alélica de (a) ou (b); e (e) um fragmento de (a), (b), (c) ou (d); com acondição de que o polipeptídeo não seja os aminoácidos de 1 a 126 da SEQ ID NO: 4.

A presente invenção também diz respeito às seqüências deácido nucléico isoladas que codificam os polipeptídeos e às construções deácido nucléico, vetores e células hospedeiras que compreendem as seqüênciasde ácido nucléico assim como métodos para produzir e usar os polipeptídeosdentro de ração de animal.

A presente invenção além disso diz respeito ao uso em raçãode animal de uma cepa de Bacillus que é positiva no teste do Exemplo 6 aquicontido, a saber o DNA da qual, quando colhido e usado como um padrão deDNA em uma reação de PCR com as SEQ ID NOs: 6 e 7 como iniciadores,leva à geração de um fragmento de PCR de um tamanho de aproximadamente0,4 kb.

Descrição Detalhada da Invenção

O Polipeptídeo, suas Características e Uso

Em um primeiro aspecto, a invenção diz respeito a umpolipeptídeo isolado selecionado do grupo que consiste de: (a) umpolipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido que tem um graude identidade aos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos33%; (b) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições de severidade baixa com (i) nucleotídeosde 124 a 378 da SEQ ID NO: 1, (ii) uma subseqüência de (i) de pelo menos100 nucleotídeos ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); (c) umavariante do polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido dosaminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 que compreendem uma substituição,deleção, extensão, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos; (d) umavariante alélica de (a) ou (b); e (e) um fragmento de (a), (b), (c) ou (d); com acondição de que o polipeptídeo não seja os aminoácidos de 1 a 126 da SEQID NO: 4.

a invenção também diz respeito ao uso em ração de animal dospolipeptídeos definidos acima, e/ou de um polipeptídeo tendo os aminoácidosde 1 a 126 da SEQ ID NO: 4, assim como o uso de qualquer um destes napreparação de uma composição para o uso em ração de animal. Estespolipeptídeos melhoram a utilização da ração de animal pela melhora da Taxade Conversão de Ração (FCR), e/ou modulando a microflora do intestino.

As condições acima (que o polipeptídeo não seja osaminoácidos de 1 a 126 da SEQ ID NO: 4) serve para negar os aminoácidosde 1 a 126 da SEQ ID NO: 134 da WO 03/093453, ver a seção Fundamentosda Técnica. A condição é opcional; em formas de realização alternativas desta(i) o polipeptídeo não inclui uma parte de peptídeo de sinal, (ii) o polipeptídeonão inclui uma parte de propeptídeo, e/ou (iii) o polipeptídeo é umpolipeptídeo maduro. Em outras formas de realização alternativas, opolipeptídeo compreende, na alternativa tem ou consiste (essencialmente) de,50 a 120 aminoácidos, preferivelmente de 55 a 115, 60 a 110, 65 a 105, 70 a100, 75 a 95 ou mais preferivelmente de 80 a 90 aminoácidos.

em uma primeira forma de realização particular o polipeptídeotem, consiste essencialmente de ou consiste de uma seqüência de aminoácidoque tem um grau de identidade aos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2de pelo menos 33%, tal como, por exemplo, o polipeptídeo de aminoácidos de1 a 85 da SEQ ID NO: 2. Outros exemplos específicos são os polipeptídeos deaminoácidos de 1 a 85 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 8, 9 e 10(identificadas como similar a LI2 com base no teste de PCR do Exemplo 6aqui contido).

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser umpolipeptídeo bacteriano ou fungico. Em uma segunda forma de realizaçãoparticular, o polipeptídeo é um Polipeptídeo bacteriano Gram positivo talcomo um polipeptídeo de Bacillus ou uma variante deste, por exemplo umpolipeptídeo de Bacillus licheniformis por exemplo derivado de Bacilluslicheniformis ATCC 14580, que é a cepa tipo de Bacillus licheniformis edisponível sob requisição da American Type Culture Collection, ATCC. Ascepas preferidas de Bacillus licheniformis são positivas no teste do Exemplo 6aqui contido, tal como as seguintes cepas de Bacillus licheniformis: ATCC14580 (=NCIB 9375), NCIMB 6346 (=DSM 8785), NCTC 1024, NCTC1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689e ATCC 53757.

Em uma terceira forma de realização, o polipeptídeo melhora autilização de ração de animal pela melhora da Taxa de Conversão de Ração(FCR), e/ou modulando a microflora do intestino. Em formas de realizaçãoalternativas, o polipeptídeo melhora a digestibilidade da ração de animal, e/oumantém a saúde animal ajudando na digestão apropriada e/ou sustentando afunção do sistema imune.

A FCR pode ser determinada com base em um teste decrescimento de frango que compreendem um primeiro tratamento em que opolipeptídeo é adicionado à ração de animal em uma concentração de 5 mgpor kg de ração e um segundo tratamento (controle) sem nenhuma adição dopolipeptídeo à ração de animal, cada tratamento que consiste de 8 grupos de 6frangos machos, o frango sendo alimentado com pelotas de uma dieta demilho/SBM48 ad libitum, a FCR sendo calculada como a ingestão de raçãoem g/ave em relação ao ganho de peso em g/ave para os dias 8 a 29 do teste, aFCR para o primeiro tratamento sendo melhorada em relação à FCR dosegundo tratamento. Em uma forma de realização particular o teste decrescimento é um teste de gaiola. Para mais detalhes, ver o Exemplo 5.

A FCR também pode ser determinada com base em um testede crescimento de frango que compreende um primeiro tratamento em que opolipeptídeo é adicionado à ração de animal em uma concentração de (i) 2,5,(ii) 5,0 ou (iii) 7,5 mg por kg de ração e um segundo tratamento (controle)sem nenhuma adição do polipeptídeo à ração de animal, cada tratamento queconsiste de 10 grupos de 6 frangos machos, o frango sendo alimentado compelotas de uma dieta de milho/SBM48 ad libitum, a FCR sendo calculadacomo a ingestão de ração em g/ave em relação ao ganho de peso em g/avepara os dias 8 a 29 do teste, a FCR para o primeiro tratamento sendomelhorado em relação à FCR do segundo tratamento. Em uma forma derealização particular o teste de crescimento é um teste de gaiola. Para maisdetalhes, ver o Exemplo 9.

A FCR também pode ser determinada com base em um testede crescimento de frango que compreende um primeiro tratamento em que opolipeptídeo é adicionado à ração de animal em uma concentração de 7,5 mgpor kg de ração e um segundo tratamento (controle) sem nenhuma adição dopolipeptídeo à ração de animal, cada tratamento consistindo de 12 grupos de20 frangos (6 grupos de 20 fêmeas, 6 grupos de 20 machos), os frangos sendoalimentados com pelotas de uma dieta com base de farinha de trigo, centeio esoja ad libitum, a FCR sendo calculada como a ingestão de ração em g/ave emrelação ao ganho de peso em g/ave para os dias de 1 a 36 do teste, a FCR parao primeiro tratamento sendo melhorada em relação à FCR do segundotratamento. Em uma primeira forma de realização particular os frangos sãoalojados em galinheiros com cama de serragem. Em uma segunda forma derealização particular os frangos são alimentados com uma dieta iniciadora noperíodo do dia 1 a 22 e uma dieta de crescimento rápido no período do dia 22a 36, ambas com base em farinha de trigo, centeio e soja e com umacomposição como mostrado na Tabela 9. Para mais detalhes, ver o Exemplo 12.

Como é no geral conhecido, uma FCR melhorada é mais baixado que a FCR de controle. Em formas de realização particulares, a FCR émelhorada (isto é, reduzida) quando comparada ao controle em pelo menos1,0%, preferivelmente pelo menos 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%,2,1%>, 2,2%), 2,3%), 2,4%) ou pelo menos 2,5%. Em outras formas de realizaçãoparticulares, a FCR é melhorada (isto é reduzida) quando comparada aocontrole em pelo menos 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9% ou pelo menos 3,0%. Aindaem outras formas de realização particulares, a FCR é melhorada (isto é,reduzida) quando comparada ao controle em pelo menos 3,1%, 3,2%, 3,3%>,3,4%, 3,5%, 3,6%, 3,7% ou pelo menos 3,8%.

O termo "intestino" como aqui usado designa o tratogastrointestinal ou digestivo (também aludido como o canal alimentar) e omesmo se refere ao sistema de órgãos dentro de animais multicelulares queingere o alimento, o digere para extrair energia e nutrientes e expele o resíduoremanescente. O intestino pode ser dividido em trato gastrointestinal superiore inferior, o primeiro compreendendo a boca e o estômago e o últimocompreendendo os intestinos. Os intestinos podem ser divididos em intestinodelgado e grosso. Os componentes básicos do intestino delgado, entretantocom diferenças entre as espécies de animal, são duodeno, jejuno e íleo. Oscomponentes básicos do intestino grosso são ceco, cólon e reto (cloaca).

O termo "microflora" intestinal como aqui usado refere-se àsculturas microbianas naturais que residem no intestino e mantêm a saúdeajudando na digestão apropriada e/ou sustentação da função do sistemaimune.

O termo "modular" como aqui usado em conexão com amicroflora intestinal no geral significa mudar, manipular, alterar ou ajustar asua função ou situação em um animal saudável e normalmente em atividade,isto é um uso não terapêutico. A modulação é em resposta aos polipeptídeose/ou às cepas de Bacillus da invenção.

Os seguintes são exemplos particulares não limitantes doefeito de modulação da microflora intestinal obtido pelo polipeptídeo dainvenção (mudanças quando comparadas a um controle sem o polipeptídeo dainvenção) - para mais detalhes, ver o Exemplo 8:

(i) um aumento no número de bactérias anaeróbicasfacultativas totais in vivo, por exemplo em leitões e/ou frangos,preferivelmente determinado depois do cultivo de conteúdos íleo-retais e/oucecal, respectivamente, em Brucela ágar suplementado com 5% vol/vol desangue de ovelha depois da incubação em uma cabina anaeróbica a 37 °C porcinco dias;

(ii) um aumento no número de Escherichia coli in vivo, porexemplo em leitões e/ou frangos, preferivelmente determinado depois docultivo dos conteúdos ileo-retais e/ou cecais, respectivamente, no meiocromogênico Coli-ID, aerobicamente, a 37° C por 24 horas;

(iii) nenhuma mudança substancial ou um aumento, nasbactérias de ácido láctico total in vivo, por exemplo em leitões e/ou frangos,preferivelmente determinados depois do cultivo dos conteúdos íleo-retais e/oucecais, respectivamente, em MRS ágar, em uma cabina anaeróbica, a 37° Cpor 48 horas;

(iv) nenhuma mudança substancial no LactoBacillus spp. totalin vivo, por exemplo em leitões, preferivelmente determinada depois docultivo dos conteúdos íleo-retais em Rogosa ágar, em uma cabine anaeróbicaa 37° C por 48 horas;

(v) uma diminuição no número de outras Enterobacteriaceae(outra que não a E. colí) in vivo, por exemplo em leitões, preferivelmentedeterminada depois do cultivo dos conteúdos íleo-retais em um meiocromogênico Coli-ID, aerobicamente, a 37° C por 24 horas;

(vi) uma diminuição no número de Enterococcus spp. in vivo,por exemplo em leitões, preferivelmente determinada depois do cultivo dosconteúdos íleo-retais em um Enterococos ágar, aerobicamente, a 37° C por 48horas; e/ou

(vii) uma diminuição na freqüência com que Clostridiumperfringens ocorre in vivo, por exemplo em leitões, preferivelmentedeterminada depois do cultivo dos conteúdos íleo-retais em TSN ágar depoisde aquecer a amostra a 80° C durante 10 min, em uma cabine anaeróbica a46° C por 24 horas.

Ainda mais, também em relação ao efeito modulador damicroflora intestinal e com referência a um controle sem o polipeptídeo dainvenção, o polipeptídeo da invenção preferivelmente:

(iix) é mais ativo in vitro contra cocos Gram positivos do quebactérias Gram negativas, a saber exibindo uma redução mais forte doprimeiro, por exemplo para cocos Gram positivos e bactérias Gram negativasisoladas dos conteúdos intestinais de leitão e/ou frango;

(ix) é mais ativo in vitro contra Clostridium spp., por exemploClostridium perfringens, do que as bactérias Gram negativas bactéria, a saberexibindo uma redução mais forte do primeiro, por exemplo para Clostridiumperfringens e bactérias Gram negativas isoladas dos conteúdos intestinais deleitão e/ou frangos;

(x) não influencia substancialmente o crescimento in vitro demicroorganismos benéficos, tais como bactérias, por exemplo como isoladasde conteúdos intestinais de leitão e/ou frangos; e/ou(xi) não influencia substancialmente, por exemplo reduz, ocrescimento in vitro de microorganismos nocivos, tais como bactérias, porexemplo como isoladas de conteúdos intestinais de leitão e/ou frangos.

Para detalhes em relação às formas de realização (iix)-(xi),favor ver a última parte do Exemplo 8.

Em formas de realização (x), os microorganismos benéficossão preferivelmente selecionados de LactoBacillus spp., tal comoLactoBacillus salivarius DSM 18070, para o qual o MIC90 é pelo menos 1000microgramas/ml, preferivelmente pelo menos 2000, 3000, 4000, 4500, 5000,5500, 6000 ou pelo menos 7000 microgramas/ml, em particular pelo menos4170 microgramas/ml.

Conseqüentemente, o polipeptídeo da invenção tem um MIC90contra LactoBacillus salivarius DSM 18070 de pelo menos 1000microgramas/ml, preferivelmente pelo menos 2000, 3000, 4000, 4500, 5000,5500, 6000 ou pelo menos 7000 microgramas/ml, em particular pelo menos4170 microgramas/ml.

Em formas de realização (xi), os microorganismos nocivos sãopreferivelmente selecionados de Enterococcus, Staphylococcus, Clostridium(preferivelmente Clostridium perfringens); tal como Enterococcus faecalisDSM 18047, para a qual o MIC90 está abaixo de 4000 microgramas/ml,preferivelmente abaixo de 3000, 2000, 1000, 800, 600, 500, 400, 300, 200,100, 90, 80 ou abaixo 70 microgramas/ml, preferivelmente um MIC90 de 50 a80, mais preferivelmente de 60 a 70 microgramas/ml.

Conseqüentemente, o polipeptídeo da invenção tem um MIC90contra Enterococcus faecalis DSM 18047 abaixo de 4000 microgramas/ml,preferivelmente abaixo 3000, 2000, 1000, 800, 600, 500, 400, 300, 200, 100,90, 80 ou abaixo 70 microgramas/ml, preferivelmente um MIC90 de 50 a 80,mais preferivelmente de 60 a 70 microgramas/ml.

MIC90 designa a Concentração Inibidora Mínima requeridapara inibir o crescimento de 90% dos organismos. Para os presentespropósitos, MIC90 é definida como aquela concentração do polipeptídeo dainvenção que é requerida para reduzir a densidade da cultura, determinadacomo OD595, em 90% em relação a um controle sem o polipeptídeo dainvenção. A OD595 é determinada depois da incubação sob condições deincubação apropriadas (que dependem do organismo em questão, comomostrado na Tabela 5 do Exemplo 8). A determinação de MIC90 pode ser feitapor um método de diluição de caldo de micro titulação, usandoaproximadamente IO5 CFU/ml das bactérias puras em caldo de soja tríptico,adicionando o polipeptídeo da invenção em diluição de 2 vezes em série,usando água como controle. Para mais detalhes, ver o Exemplo 8. A MIC90 éaqui no geral indicada na unidade de micrograma do polipeptídeo puro por ml(micrograma/ml).

Ainda em outras formas de realização particulares, opolipeptídeo da invenção:

(xii) tem um MIC90 para uma bactéria Gram negativa, tal comouma cepa de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis,Salmonella typhimurium ou Proteus mirabilis, que é pelo menos 50% maisalta do que um MIC90 para um coco Gram positivo, tal como uma cepa deEnterococcus ou Staphylococcus, por exemplo Enterococcus faecalis,preferivelmente Enterococcus faecalis DSM 18047 - em suas sub-formas derealização preferidas, a MIC90 do primeiro é preferivelmente de pelo menos100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450% ou pelo menos 500%mais alta do que a MIC90, do último.

Em uma quarta forma de realização particular (ver o Exemplo11 para detalhes), o polipeptídeo da invenção, na sua forma nativa (isto é nãodesnaturada), não é degradada por (i) pepsina (pH 3,5, 40° C, 2 horas); (ii)pancreatina (pH 7,0, 40° C, 4 horas); e/ou (iii) pepsina seguida porpancreatina (pepsina no pH 3,5, 40° C, 2 horas - seguida pela pancreatina nopH 7,0, 40° C, 4 horas) - para todas as formas de realização de (i) a (iii) comojulgado pela SDS-PAGE (ver o Exemplo 10).

Em uma quinta forma de realização particular (ver o Exemplo7 para detalhes), o polipeptídeo da invenção tem as seguintes temperaturas dedesnaturação, como determinado pela Calorimetria de Varredura Diferencial(DSC): (i) pelo menos 54° C no pH 2,5, (ii) pelo menos 68° C no pH 4,0, e/ou(iii) pelo menos 59° C no pH 7,0; preferivelmente (iv) 55° C no pH 2,5; (v)69° C no pH 4,0; e/ou (vi) 60° C no pH 7,0.

Identidade e Hibridização, Fragmentos e Variantes

A relacionabilidade entre duas seqüências de aminoácido édescrita pelo parâmetro "identidade".

Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento deduas seqüências de aminoácido é determinada usando-se o programa Needledo pacote EMBOSS (http: //emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needleimplementa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B.e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matriz de substituiçãousada é BLOSUM62, penalidade de abertura de intervalo é 10 e a penalidadede extensão de intervalo é 0,5.

O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácido dapresente invenção ("seqüência da invenção"; por exemplo aminoácidos de 1 a85 da SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido diferente ("seqüênciaestranha") é calculado como o número de emparelhamentos exatos em umalinhamento das duas seqüências, dividido pelo comprimento da "seqüênciada invenção" ou pelo comprimento da "seqüência estranha", seja qual formais curta. O resultado é expressado em identidade percentual.

Um emparelhamento exato ocorre quando a "seqüência dainvenção" e a "seqüência estranha" têm resíduos de aminoácido idênticos nasmesmas posições da sobreposição (no exemplo de alinhamento abaixo isto érepresentado por "I"). O comprimento de uma seqüência é o número deresíduos de aminoácido na seqüência (por exemplo o comprimento deaminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 é 85).

No exemplo de alinhamento puramente hipotético abaixo, asobreposição é a seqüência de aminoácido "HTWGER-NL" da seqüência 1;ou a seqüência de aminoácido "HGWGEDANL" da seqüência 2. No exemploum intervalo é indicado por um

Exemplo de alinhamento hipotético:

Seqüencial: ACMSHTWGER- NL

Seqüência 2: HGWGEDANL AMNPS

Em uma forma de realização particular, a porcentagem deidentidade de uma seqüência de aminoácido de um polipeptídeo com ou para,aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 é determinada i) alinhando as duasseqüências de aminoácido usando o programa de Needle, com a matriz desubstituição BLOSUM62, uma penalidade de abertura de intervalo de 10 euma penalidade de extensão de intervalo de 0,5; ii) contando-se o número deemparelhamentos exatos no alinhamento; iii) dividindo-se o número deemparelhamento exatos pelo comprimento da mais curta das duas seqüênciasde aminoácido e iv) convertendo o resultado da divisão de iii) emporcentagem. No exemplo hipotético acima, o número de emparelhamentosexatos é de 6, o comprimento da mais curta das duas seqüências deaminoácido é 12, conseqüentemente a porcentagem de identidade é de 50%.

Na alternativa, o grau de identidade entre as duas seqüênciasde aminoácido, assim como o grau de identidade entre as duas seqüências denucleotídeo, é determinada pelo programa "align" que é um alinhamento deNeedleman-Wunsch (isto é um alinhamento global). O programa é usado parao alinhamento de seqüências de polipeptídeo, assim como de nucleotídeo. Amatriz de contagem padrão BLOSUM50 é usado para os alinhamentos depolipeptídeo e a matriz de identidade padrão é usada para alinhamentos denucleotídeo. A penalidade para o primeiro resíduo de um intervalo é -10 parapolipeptídeos e -16 para nucleotídeos. As penalidades para outros resíduos deum intervalo são -2 para polipeptídeos e -4 para nucleotídeos. "Align" é partedo pacote FASTA versão v20u6 (ver W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988),"Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448 eW. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison withFASTP e FASTA," Methods in Enzymology 183: 63-98). Os alinhamentos deproteína FASTA usam o algoritmo de Smith-Waterman sem nenhumalimitação no tamanho do intervalo (ver o "algoritmo de Smith-Waterman", T.F. Smith e M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197). Ver tambémMyers e Miller, CABIOS (1989) 4: 11-17.

em formas de realização preferidas, o grau de identidade aosaminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 é de pelo menos 35% ou pelo menos37%, 40%, 42%, 45%, 47%, 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%,70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97% ou pelomenos 99%. Os polipeptídeos com qualquer um destes graus de identidadeaos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 são aludidos como polipeptídeoshomólogos. Em uma forma de realização alternativa, o grau de identidade aosaminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 é 32%.

Em formas de realização particulares, os polipeptídeos dainvenção compreendem (ou têm ou consistem de) uma seqüência deaminoácido que difere em (i) 57, 55, 50, 45, 40, 35, 30 ou 25 aminoácidos dosaminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2; ou em (ii) 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14,13, 12 ou 11 aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2; ouem (iii) 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ IDNO: 2. Em uma outra forma de realização particular, os polipeptídeoscompreendem (ou têm ou consistem de) uma seqüência de aminoácido quedifere em 4, 3 ou 2 aminoácidos ou em 1 aminoácido dos aminoácidos de 1 a85 da SEQ ID NO: 2.Um fragmento, por exemplo, dos aminoácidos de 1 a 85 daSEQ ID NO: 2 é um polipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos deletados dotérmino amino e/ou carboxila destas seqüências de aminoácido. Em umaforma de realização um fragmento contém pelo menos 30, 35, 40, 45, 50 oupelo menos 55 aminoácidos. Em uma outra forma de realização um fragmentocontém pelo menos 65 resíduos de aminoácido ou pelo menos 70 resíduos deaminoácido ou pelo menos 75 resíduos de aminoácido ou pelo menos 80resíduos de aminoácido ou pelo menos 81 resíduos de aminoácido ou pelomenos 82 resíduos de aminoácido ou pelo menos 83 resíduos de aminoácidoou pelo menos 84 resíduos de aminoácido.

Uma variante alélica denota qualquer uma de duas ou maisformas alternativas de um gene que ocupam o mesmo local cromossômico. Avariação alélica surge naturalmente através da mutação e pode resultar empolimorfismo dentro das populações. As mutações de gene podem sersilenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podemcodificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácido alteradas. Umavariante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por umavariante alélica de um gene.

A presente invenção também diz respeito a polipeptídeosisolados que são codificados pelas seqüências de ácido nucléico quehibridizam sob condições de severidade muito baixa ou baixa ou média oumédia-alta ou alta ou muito alta com uma sonda de ácido nucléico quehibridiza sob as mesmas condições com (i) nucleotídeos de 124 a 378 da SEQID NO: 1, (ii) uma subseqüência de (i) ou (iii) um filamento complementar de(i) ou (ii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning,A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, nova Iorque). Em umaforma de realização particular a sonda de ácido nucléico é selecionada dentreas seqüências de ácido nucléico de (i), (ii) ou (iii) acima.

A subseqüência de nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO:1 pode ser de pelo menos 100 nucleotídeos ou em uma outra forma de realização pelo menos 50, 150 ou 200 nucleotídeos.

A seqüência de ácido nucléico dos nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1 ou uma subseqüência deste, assim como a seqüência de aminoácido dos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 ou um fragmento deste, podem ser usadas para planejar uma sonda de ácido nucléico para identificar e clonar polipeptídeos que codificam DNA tendo um potencial para o uso em ração de animal a partir das cepas de gêneros ou espécies diferentes de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para a hibridização com o DNA genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos de manchamento de Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí contido. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a seqüência inteira, mas devem ter pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 25 e mais preferivelmente pelo menos 35 nucleotídeos no comprimento. As sondas mais longas também podem ser usadas. Tanto sondas de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são abrangidas pela presente invenção.

Assim, uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outros organismos pode ser tríada quanto ao DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e que codificam um polipeptídeo tendo a atividade desejada. O DNA genômico ou outro DNA de tais outros organismos pode ser separado pela eletroforese em gel de agarose ou gel de poliacrilamida ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado podem ser transferidos para e imobilizados em nitrocelulose ou outro material carregador adequado, de modo a identificar um clone ou DNA que seja homólogo com a SEQ ID NO: 1 ou uma subseqüência desta, omaterial carregador é usado em um Southern blot. para os propósitos da presente invenção, a hibridização indica que a seqüência de ácido nucléico hibridiza com uma sonda de ácido nucléico rotulada correspondendo à seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 1, seu filamento complementar ou uma subseqüência desta, sob condições de severidade muito baixas a muito altas. As moléculas às quais a sonda de ácido nucléico hibridiza sob estas condições são detectadas usando película de raio X.

Em uma forma de realização particular, a sonda de ácido nucléico é uma seqüência de ácido nucléico que codifica aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 ou subseqüências destes. Em uma outra forma de realização, a sonda de ácido nucléico tem nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1 (a região codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1).

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos no comprimento, as condições de severidade muito baixas a muito altas são definidas como pré hibridização e hibridização a 42° C em 5X SSPE, 0,3% de SDS, 200 ug/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e 25% de formamida para as severidades muito baixas e baixas, 35% de formamida para as severidades médias e médias-altas ou 50% de formamida para as severidades altas e muito altas, seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão.

Para sondas mais longas de pelo menos 100 nucleotídeos no comprimento, o material carregador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutes usando 2 x SSC, 0,2% de SDS preferivelmente pelo menos a 45° C (severidade muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50° C (severidade baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55° C (severidade média), mais preferivelmente pelo menos a 60° C (severidade média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65° C (severidade alta) e mais preferivelmente pelo menos a 70° C (severidade muito alta).

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70nucleotídeos no comprimento, as condições de severidade são definidas como pré hibridização, hibridização e lavagem pós-hibridização de 5o C a 10° C abaixo da Tm calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5% de NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de fosfato monobásico de sódio, 0,1 mM de ATP e 0,2 mg de RNA de levedura por ml seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão.

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos no comprimento, o material carregador é lavado uma vez em 6X SSC mais 0,1% de SDS por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando 6X SSC de 5o C a 10° C abaixo da Tm calculada.

A presente invenção também diz respeito a variantes do polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido de aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 que compreendem uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos.

A seqüência de aminoácidos dos polipeptídeos variantes podem diferir da seqüência de aminoácido dos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 por uma inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácido e/ou a substituição de um ou mais resíduos de aminoácido pelos resíduos de aminoácido diferentes. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza menor, que são substituições de aminoácido conservativas que não afetam significantemente a dobra e/ou a atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões de terminal amino ou carboxila pequenas, tais como um resíduo de metionina de terminal amino; um peptídeo de ligador pequeno de até cerca de 20 a 25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilite a purificação pela mudança da carga líquida ou uma outra função, tal como um trato de poli-histidina.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro dogrupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Conseqüentemente, por exemplo, a invenção diz respeito a um polipeptídeo tendo ou compreendendo, uma seqüência como apresentada na SEQ ID NO: 2, preferivelmente a parte madura desta, em que as substituições de aminoácido conservativas compreendem substituições, recíprocas, entre os aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), entre os aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), entre os aminoácidos polares (glutamina e asparagina), entre os aminoácidos hidrofóbicos (alanina, leucina, isoleucina e valina), entre os aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e entre os aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina) ou qualquer combinação destes ou fragmentos ativos destes.

Como aqui definido, um polipeptídeo "isolado" ou "puro" é um polipeptídeo que é essencialmente livre de outros polipeptídeos, por exemplo, pelo menos 80% puro, preferivelmente pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou pelo menos 90% puro, mais preferivelmente pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ou pelo menos 96% puro, como determinado pela SDS-PAGE (por exemplo, pelo tingimento com coomassie e varredura subseqüente pelos métodos conhecidos na técnica - ver os Exemplos 2 e 4). A pureza também pode ser determinada pela HPLC, preferivelmente RP-HPLC (por exemplo, usando uma coluna Waters p-Bondapak Cl8, Fase móvel A: 0,1% de TF A, Fase móvel B: Acetonitrila + 0,1% de TF A, detectando a 280 nm -ver o Exemplo 10). A pureza pela SDS-PAGE, assim como a pureza pela HPLC, refere-se à quantidade do polipeptídeo da invenção, em relação à quantidade de proteína total. Em formas de realização alternativas, o polipeptídeo pode ser pelo menos 20%, 40%, 60% ou pelo menos 70% puro.A quantidade de proteína total pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo o método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC) e a quantidade do polipeptídeo da invenção pode ser determinada pela SDS-PAGE e varredura subseqüente, também pelos métodos conhecidos na técnica.

O polipeptídeo codificado pelas seqüências de ácido nucléico da presente invenção também incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveis em que um outro polipeptídeo é fundido no terminal N ou no terminal C do polipeptídeo ou fragmento deste. Um polipeptídeo fundido é produzido pela fusão de uma seqüência de ácido nucléico (ou um porção deste) que codifica um outro polipeptídeo a uma seqüência de ácido nucléico (ou uma porção deste) da presente invenção. As técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidos na técnica e incluem ligar as seqüências codificadoras que codificam os polipeptídeos de modo que as mesmas estejam na matriz e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle do mesmo promotor(s) e terminador.

Em uma forma de realização específica, o polipeptídeo é uma variante alergênica baixa, planejada para invocar uma resposta imunológica reduzida quando exposta aos animais, incluindo o ser humano. O termo resposta imunológica deve ser entendida como qualquer reação pelo sistema imune de um animal exposto ao polipeptídeo. Um tipo de resposta imunológica é uma resposta alérgica que leva a níveis aumentados de IgE no animal exposto. As variantes alergênicas baixas podem ser preparadas usando técnicas conhecidas no ramo. Por exemplo o polipeptídeo pode ser conjugado com porções que protegem porções poliméricas ou epítopos do polipeptídeo envolvido em uma resposta imunológica. A conjugação com polímeros pode envolver a ligação química in vitro de polímero ao polipeptídeo, por exemplo como descrito na WO 96/17929, WO98/30682, WO98/35026, e/ouWO99/00489. A conjugação pode além disso ou alternativamente a isto envolver a ligação in vivo de polímeros ao polipeptídeo. Tal conjugação pode ser obtida pelo engenheiramento genético da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Um outro modo de fornecer variantes alergênicas baixas é o engenheiramento genético da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de modo a fazer com que os polipeptídeos se auto-oligomerizem, fazendo com que os monômeros de polipeptídeo possam proteger os epítopos de outros monômeros de polipeptídeo e diminuindo deste modo a antigenicidade dos oligômeros. Tais produtos e a sua preparação é descrita por exemplo na WO 96/16177. Os epítopos envolvidos em uma resposta imunológica podem ser identificados pelos vários métodos tais como o método de demonstração de fago descrito na WO 00/26230 e WO 01/83559 ou o método aleatório descrito na EP 561907. Uma vez que um epítopo tenha sido identificado, a sua seqüência de aminoácido pode ser alterada para produzir propriedades imunológicas alteradas do polipeptídeo pelas técnicas de manipulação de gene conhecidas tais como a mutagênese direcionada ao sítio (ver por exemplo a WO 00/26230, WO 00/26354 e/ou WO 00/22103) e/ou a conjugação de um polímero pode ser feita em proximidade suficiente ao epítopo para o polímero proteger o epítopo.

Cepas Bacterianas; Cepas de Bacillus probióticas

Em um segundo aspecto, a invenção diz respeito ao uso em ração de animal de uma cepa de Bacillus, o DNA da qual, quando colhido e usado como um padrão de DNA em uma reação de PCR com as SEQ ID NOs: 6 e 7 como iniciadores, leva à geração de um fragmento de PCR de um tamanho de aproximadamente 0,4 kb. Este teste serve para identificar cepas com um gene como LI2, ver o Exemplo 6 aqui contido. Estas cepas de Bacillus também podem ser usadas na preparação de uma composição para o uso em ração de animal. Estes usos são, por exemplo, com uma vista para melhorar a Taxa de Conversão de Ração (FCR), e/ou modulando a microflorado intestino.

Em uma primeira forma de realização particular, a cepa de Bacillus é um microorganismo probiótico. O termo "probiótico" no geral refere-se a uma bactéria não patogênica alimentada aos animais, incluindo as aves, como um meio de prevenir a colonização pelas bactérias patogênicas. O conceito básico é encorajar a colonização de superfícies mucósicas como um meio de bloquear a colonização pelos patógenos sérios. Os probióticos também podem ser definidos como microorganismos vivos ou com que se pode conviver, que beneficamente afetam o equilíbrio intestinal de humanos e animais saudáveis e que funcionam normalmente, aumentando preferivelmente deste modo o ganho de peso vivo e/ou melhorando a conversão da ração.

Em uma segunda forma de realização particular, a cepa de Bacillus é usada na forma de esporos. Os esporos podem ser exosporos ou, preferivelmente, endosporos. Um endosporo é qualquer esporo que é produzido dentro de um organismo (usualmente uma bactéria). Os endosporos podem sobreviver por períodos de estresse ambiental e são portanto capazes de sobreviver a passagem do ambiente agressivo (ácido) do trato gastro intestinal superior, enquanto que apenas exerce seu efeito uma vez que atinja os intestinos, onde as células vegetativas normais serão formadas.

Em uma terceira forma de realização, o fragmento de PCR, quando purificado e seqüenciado codifica uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 33% de identidade aos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2. As formas de realização particulares do primeiro aspecto da invenção (o polipeptídeo e seu uso em ração de animal) também são aplicáveis a este aspecto da invenção.

Em outras formas de realização particulares, a cepa de Bacillus é uma cepa de Bacillus licheniformis, preferivelmente selecionados das seguintes cepas de Bacillus licheniformis: ATCC 14580 (=NCIB 9375),NCIMB 6346 (=DSM 8785), NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689 e ATCC 53757. Um subgrupo preferido inclui Bacillus licheniformis ATCC 14580 (=NCIB 9375) e Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785).

Ainda em outras formas de realização particulares, as cepas de Bacillus para o uso de acordo com a invenção (i) não é Bacillus licheniformis DSMZ 5749, (ii) não é Bacillus subtilis DSMZ 5750, e/ou (iii) não é Bacillus licheniformis FERM BP-266. As cepas de (i) e (ii) são incluídas no produto BioPlus®2B, ver, por exemplo, a EP 1472933. A cepa de (iii) é descrita na GB 2138023.

Para uma classificação taxonômica e identificação de bactérias referência é feita ao Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1986), vol 2, ISBNO-683-0783; ver por exemplo p 1104 seção 13, Endospore forming Gram positive rods and cocei; p. 1105 Genus Bacillus; pp. 1105-1129 description of the genus; pp. 1130-1138 description of the individual Bacillus species, por exemplo na p. 1132 Bacillus licheniformis). Na alternativa, a análise de seqüência 16SrRNA bem conhecida pode ser usada (ver por exemplo Johansen et al, Int. J. Syst. Bacteriol, 1999, 49, 1231-1240, em particular a seção de Métodos na p. 1233, 2acoluna); ou peritos em taxonomia podem ser consultados, por exemplo da DSMZ ou outros institutos depositários reconhecidos.

As cepas de Bacillus, tais como as cepas de Bacillus licheniformis, são conhecidas na técnica e disponível, por exemplo, de coleções de cultura como ATTC mencionada acima ou podem ser isoladas da natureza. As preparações de células de Bacillus, vivas ou com que se pode conviver, podem ser preparadas como é conhecido na técnica. Os exemplos de tais células são células vegetativas e esporos tais como endosporos. Em uma forma de realização um extrato de fermentação da cepa de Bacillus é usada, por exemplo na forma de um líquido de fermentação seca pulverizado.O teste do Exemplo 6 é uma reação de PCR, neste exemplo conduzido com DNA isolado de várias cepas de Bacülus licheniformis. Em uma forma de realização particular deste teste, o DNA usado como padrão para a reação de PCR é o DNA cromossômico que pode ser isolado pelos métodos conhecidos na técnica. O resultado do teste do Exemplo 6 é positivo quando um fragmento de PCR do tamanho correto é obtido. No Exemplo 6, o tamanho correto é indicado como 0,4 kb. Em uma forma de realização particular, o tamanho correto está entre 0,35 kb e 0,44 kb (=350 pares de base a 440 pares de base). Em formas de realização alternativas, o tamanho correto é de 330 a 430 pares de base, de 340 a 420 pares de base, de 350 a 410 pares de base, de 360 a 400 pares de base, de 370 a 390 pares de base ou de 385 a 395 pares de base. O tamanho da seqüência codificadora (CDS) da SEQ ID NO: 1 é de aproximadamente 380 pares de base (a saber de 378 pares de base).

Seqüências de Ácido Nucléico

A invenção também diz respeito a uma seqüência de ácido nucléico isolada que compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica polipeptídeo, que (a) codifica o polipeptídeo da invenção; (b) hibridiza sob condições de severidade muito baixa com (i) os nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1, (ii) uma subseqüência de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos, e/ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); e/ou (c) tem um grau de identidade aos nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 48%; com a condição de que a seqüência de ácido nucléico não seja (iv) a SEQ ID NO: 3 e não (v) os nucleotídeos de 601 a 978 da SEQ ID NO: 3 e não (vi) os nucleotídeos de 1 a 381 da SEQ ID NO: 1. A presente invenção além disso diz respeito às seqüências de ácido nucléico isoladas que codificam um polipeptídeo da invenção.

Com respeito às condições acima, referência é feita à seção Fundamentos da Técnica aqui contida. Conseqüentemente, a negação (iv)refere-se à SEQ ID NO: 133 da WO 03/093453, negação (v) aos nucleotídeos de 601 a 978 desta e negação (vi) ao acesso do Banco de Gene no. NC_006270. Estas negações são opcionais; em formas de realização alternativas desta a seqüência de ácido nucléico codifica um polipeptídeo que (i) não inclui uma parte de peptídeo de sinal, (ii) não inclui uma parte de propeptídeo, e/ou (iii) é um polipeptídeo maduro. Em outras formas de realização alternativas, a seqüência de ácido nucléico compreende, na alternativa tem ou consiste (essencialmente) de, 150 a 360 nucleotídeos, preferivelmente de 165 a 345, 180 a 330, 195 a 315, 210 a 300, 225 a 285 ou mais preferivelmente de 240 a 270 aminoácidos.

A identidade e hibridização são definidas em uma seção anterior.

Em uma primeira forma de realização particular, a seqüência de ácido nucléico codifica um polipeptídeo que melhora a utilização da ração de animal pela melhora da Taxa de Conversão de Ração (FCR), e/ou modulando a microflora do intestino.

Uma seqüência de ácido nucléico particular da invenção é os nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1, o último correspondendo à região que codifica o polipeptídeo maduro. Outras seqüências de ácido nucléico particulares da invenção são aquelas que codificam o polipeptídeo de 185 aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 8, 9 e 10.

A presente invenção também abrange as seqüências de ácido nucléico que compreendem uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido dos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2, que diferem das partes correspondentes da SEQ ID NO: 1 em virtude da degenerescência do código genético. A presente invenção também diz respeito a subseqüências da SEQ ID NO: 1 que codificam fragmentos da SEQ ID NO: 2.

Uma subseqüência da SEQ ID NO: 1 é uma seqüência deácido nucléico abrangida pela SEQ ID NO: 1 exceto que um ou mais nucleotídeos das extremidades 5' e/ou 3' foram deletados. Preferivelmente, uma subseqüência contém pelo menos 150 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 165, 180, 195, 210, 225, 240, 270, 285, 300, 315, 330 ou mais preferivelmente pelo menos 345 nucleotídeos.

A presente invenção também diz respeito a seqüências de nucleotídeo que compreendem uma seqüência de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo e que têm um grau de identidade aos nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 48%. para determinar o grau de identidade de nucleotídeo, o programa "align" é usado que é aludido acima.

Em formas de realização preferidas, o grau de identidade aos nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1 é de pelo menos 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%>, 90%, 92%, 95%, 97% ou pelo menos 99%. Em formas de realização alternativas, o grau de identidade aos nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1 é de pelo menos 32% ou de pelo menos 35%, 37%, 40%, 42%, 45% ou pelo menos 47%.

A presente invenção também diz respeito a seqüências de ácido nucléico mutantes que compreendem pelo menos uma mutação nos nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1, em que a seqüência de ácido nucléico mutante codifica um polipeptídeo que (i) consiste dos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 ou (ii) é uma variante da seqüência de (i), em que a variante compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos ou (iii) é uma variante alélica da seqüência de (i), ou (iv) é um fragmento da seqüência de (i).

As técnicas usadas para isolar ou clonar uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo são conhecidos na técnica e incluem a isolação de DNA genômico, preparação de cDNA ou uma combinação destes. A clonagem das seqüências de ácido nucléico da presenteinvenção a partir de tal DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, pelo uso da reação da cadeia da polimerase bem conhecida (PCR) ou triagem de anticorpo de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonado com características estruturais compartilhadas. Ver, por exemplo, 5 Innis et ai., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucléico tais como a reação da cadeia de ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação com base na seqüência de ácido nucléico (NASBA) podem ser usados. A seqüência de ácido nucléico pode ser clonada a partir de 10 uma cepa de Bacillus, preferivelmente Bacillus licheniformis ou uma outra ou organismo relacionado e assim, por exemplo, pode ser uma variante alélica ou de espécie da região que codifica o polipeptídeo da seqüência de ácido nucléico.

O termo "seqüência de ácido nucléico isolada" como aqui 15 usado refere-se a uma seqüência de ácido nucléico que seja essencialmente livre de outras seqüências de ácido nucléico, por exemplo, pelo menos cerca de 20% puro, preferivelmente pelo menos cerca de 40% puro, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% puro e mais preferivelmente pelo menos cerca de 20 90% puro como determinado pela eletroforese em agarose. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico isolada pode ser obtida pelos procedimentos de clonagem padrão usados no engenheiramento genético para relocar a seqüência de ácido nucléico da sua localização natural para um sítio diferente onde será reproduzida. Os procedimentos de clonagem podem envolver a 25 excisão e a isolação de um fragmento de ácido nucléico desejado que compreenda a seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo, a inserção do fragmento em uma molécula de vetor e a incorporação do vetor recombinante em uma célula hospedeira onde cópias múltiplas ou clones da seqüência de ácido nucléico será replicado. A seqüência de ácido nucléicopode ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética ou quaisquer combinações destes.

Modificação de uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessário para a síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo "substancialmente similar" ao polipeptídeo refere-se às formas que não ocorrem naturalmente do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir de algum modo engendrado a partir do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo, variantes que diferem em termoestabilidade, estabilidade de pH, estabilidade contra enzimas digestivas, alergenicidade ou semelhante. A seqüência variante pode ser construída com base na seqüência de ácido nucléico apresentada como o polipeptídeo que codifica parte da SEQ ID NO: 1, por exemplo, uma subseqüência desta, e/ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que não dão origem a uma outra seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucléico, mas que correspondem ao uso de códon do organismo hospedeiro intencionado para a produção do polipeptídeo ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que podem dar origem a uma seqüência de aminoácido diferente. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo ver, por exemplo, Ford et ai, 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. Polipeptídeos alergênicos baixos por exemplo podem ser preparados como descrito acima.

A presente invenção também diz respeito a seqüências de ácido nucléico isoladas que compreendem uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo e que hibridiza sob condições de severidade muito baixas, preferivelmente condições de severidade baixa, mais preferivelmente condições de severidade média, mais preferivelmente condições de severidade média-alta, ainda mais preferivelmente condições de severidade alta e mais preferivelmente condições de severidade muito altacom uma sonda de ácido nucléico que hibridiza sob as mesmas condições com a seqüência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 1 ou seu filamento complementar; ou variantes alélicas e subseqüências destas (Sambrook et ai., 1989, supra), como aqui definido.

A presente invenção também diz respeito às seqüências de ácido nucléico isoladas produzidas (a) hibridizando-se um DNA sob condições de severidade muito baixa, baixa, média, média-alta, alta ou muito alta com (i) nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1, (ii) uma subseqüência de (i) ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); e (b) isolando-se a seqüência de ácido nucléico. A subseqüência é preferivelmente uma seqüência de pelo menos 100 nucleotídeos tal como uma seqüência que codifica um fragmento de polipeptídeo.

A presente invenção diz respeito ainda a métodos para produzir uma seqüência de ácido nucléico mutante, que compreende introduzir pelo menos uma mutação na seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou uma subseqüência deste, em que a seqüência de ácido nucléico mutante codifica um polipeptídeo que consiste de aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2; ou um fragmento deste.

A introdução de uma mutação na seqüência de ácido nucléico para trocar um nucleotídeo por um outro nucleotídeo pode ser realizada pela mutagênese direcionada ao sítio usando qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. Particularmente útil é o procedimento que utiliza um vetor de DNA superespiralado, de filamento duplo com um inserto de interesse e dois iniciadores sintéticos contendo a mutação desejada. Os iniciadores de oligonucleotídeo, cada um complementar aos filamentos opostos do vetor, estendem-se durante a ciclagem de temperatura por meio da Pfu DNA polimerase. Na incorporação dos iniciadores, um plasmídeo mutado contendo entalhes escalonados é gerado. A seguir da ciclagem da temperatura, o produto é tratado com Dpnl que é específico para DNA metilado ehemimetilado para digerir o padrão de DNA precursor e para selecionar quanto o DNA sintetizado contendo a mutação. Outros procedimentos conhecidos na técnica também podem ser usados.

Construções de ácido nucléico

A presente invenção também diz respeito às construções de ácido nucléico que compreendem uma seqüência de ácido nucléico da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais seqüências de controle que direcionam a expressão da seqüência codificadora em um hospedeiro de expressão adequado. Os hospedeiros de expressão adequados são células hospedeiras de Bacillus, o DNA das quais, quando colhidos e usados como um padrão de DNA em uma reação de PCR com as SEQ ID NOs: 6 e 7 como iniciadores, como descrito no Exemplo 6, leva à geração de um fragmento de PCR de um tamanho de aproximadamente 0,4 kb.

Os exemplos de células hospedeiras adequadas são mencionados na seção abaixo intitulada "Células Hospedeiras".

A expressão será entendida incluir qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a, transcrição, modificação pós-transcricional, translação, modificação pós-transcricional e secreção.

A "construção de ácido nucléico" é aqui definida como uma molécula de ácido nucléico, de filamento único ou duplo, que é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou que foi modificada para conter segmentos de ácido nucléico combinados e justaposto em uma maneira que de outro modo não poderia existir na natureza. O termo construção de ácido nucléico é sinônimo com o termo cassete de expressão quando a construção de ácido nucléico contém todas as seqüências de controle requeridas para a expressão de uma seqüência codificadora da presente invenção. O termo "seqüência codificadora" é aqui definida como uma seqüência de ácido nucléico que diretamente especifica a seqüência de aminoácido do seu produto de proteína.Os limites da seqüência codificadora são no geral determinados por um sítio de ligação de ribossoma (procariotas) ou pelo códon de início de ATG (eucariotas) localizados exatamente a montante da matriz de leitura aberta na extremidade 5' do mRNA e uma seqüência terminadora de transcrição localizada exatamente a montante da matriz de leitura aberta na extremidade 3' do mRNA. Uma seqüência codificadora pode incluir, mas não é limitada a, DNA, cDNA e seqüências de ácido nucléico recombinantes.

Uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulada em uma variedade de modos para fornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação da seqüência de ácido nucléico antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar seqüências de ácido nucléico utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

O termo "seqüências de controle" é aqui definido para incluir todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode ser nativa ou estranha à seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo. Tais seqüências de controle incluem, mas não são limitadas a, um líder, seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo, promotor, seqüência de peptídeo de sinal e terminador de transcrição. Em um mínimo, as seqüências de controle incluem um promotor e sinais de parada transcricional e traducional. As seqüências de controle podem ser fornecidas com ligadores com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das seqüências de controle com a região codificadora da seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo. O termo "operavelmente ligado" é aqui definido como uma configuração em que uma seqüência de controle é apropriadamente colocada em uma posição em relação à seqüência codificadora da seqüência de DNA tal que a seqüência de controle direcione aexpressão de um polipeptídeo.

A seqüência promotora, isto é uma seqüência de ácido nucléico que é reconhecida por uma célula hospedeira para a expressão da seqüência de ácido nucléico, contém seqüências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer seqüência de ácido nucléico que mostre atividade transcricional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, trancados e híbridos e podem ser obtidos a partir de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição das construções de ácido nucléico da presente invenção em uma célula hospedeira de Bacillus licheniformis que é positiva no teste do Exemplo 6 aqui contido são os promotores obtidos do gene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene da amilase maltogênica de Bacillus stearoutromophilus (amyM), gene da alfa-amilase de Bacillus amiloliquefaciens (amyQ), um promotor de CrylIIA (ver WO 99/43835), assim como o promotor endógeno LI2 de cada uma das células hospedeiras de Bacillus licheniformis específicas mencionadas abaixo.

A seqüência terminadora de transcrição, isto é uma seqüência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição, é operavelmente ligada ao terminal 3' da seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras de Bacillus licheniformis supracitadas são os terminadores do gene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL) e o terminador L12 endógeno de cada uma destas células hospedeiras.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líderadequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A seqüência líder é operavelmente ligada ao terminal 5' da seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo. Qualquer seqüência líder que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

A região codificadora de peptídeo de sinal codifica uma seqüência de aminoácido ligada ao terminal amino de um polipeptídeo que direciona o polipeptídeo codificado no caminho secretor da célula. Em uma forma de realização preferida, a região codificadora de peptídeo de sinal tem os nucleotídeos de 1 a 123 da SEQ ID NO: 1 que codificam os aminoácidos de -41 a-1 da SEQ ID NO: 2.

De acordo com o software SignalP Versão 3.0, o peptídeo de sinal prognosticado da SEQ ID NO: 2 tem os aminoácidos de -41 a -2. Isto significa que a proteína madura prognosticada começa no aminoácido -1 da SEQ ID NO: 2, a saber Ala. Entretanto, de acordo com o Exemplo 2 aqui contido, o terminal N da proteína madura começa com o aminoácido +1 da SEQ ID NO: 2, a saber Trp, que significa que a parte do peptídeo de sinal vai do aminoácido -41 ao -1 da SEQ ID NO: 2, que é um aminoácido mais longo do que o prognosticado.

Portanto os aminoácidos de -1 a +85 da SEQ ID NO: 2 é uma forma madura alternativa da proteína LI2, que também é parte da presente invenção. Conseqüentemente, qualquer reivindicação e qualquer relato aqui contidos que se refiram aos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 podem portanto também ou alternativamente, referir-se aos aminoácidos de -1 a +85 da SEQ ID NO: 2. O mesmo é o caso para qualquer reivindicação e qualquer relato aqui contidos que se refiram à parte correspondente da SEQ ID NO: 1: Nucleotídeos 121 a 378 da SEQ ID NO: 1 podem ser aludidos além ou na alternativa aos, nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1.

Do mesmo modo, qualquer referência aqui contida à parte desinal da SEQ ID NO: 2 também pode ou na alternativa, ser para os aminoácidos de -41 a -2 da SEQ ID NO: 2. A parte correspondente da SEQ ID NO: 1 tem os nucleotídeos d 1 a 120 da SEQ ID NO: 1. Qualquer reivindicação e qualquer relato aqui contidos que se refiram à parte de peptídeo de sinal podem portanto também ou alternativamente, se referir aos nucleotídeos de 1 a 120 da SEQ ID NO: 1.

O método do SignalP V. 3.0 é descrita em Bendtsen et al em Journal of Molecular Biology 2004, 340(4), pp. 783-95. Ver também Nielsen et al em Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, pp 122-130, 1998 (V. 2.0); e Nielsen et al em Protein Engineering 10, 1-6 (1997) (V. 1.1). Vetores de Expressão

A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinantes que compreendem uma construção de ácido nucléico da invenção, tal como vetores de expressão recombinantes que compreendem uma seqüência de ácido nucléico da presente invenção, um promotor e sinais de parada transcricional e traducional. As várias seqüências de ácido nucléico e de controle descritas acima podem ser unidas entre si para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição da seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, a seqüência de ácido nucléico da presente invenção pode ser expressada pela inserção da seqüência de ácido nucléico ou uma construção de ácido nucléico que compreende a seqüência em um vetor apropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a seqüência codificadora está localizada no vetor de modo que a seqüência codificadora esteja operavelmente ligada com as seqüências de controle apropriadas para a expressão.O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e possa realizar a expressão da seqüência de ácido nucléico. A escolha do vetor tipicamente dependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor deva ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados.

O vetor pode ser um vetor que replique autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação da qual é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossoma ou um cromossoma artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a auto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido dentro da célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) o mesmo foi integrado. Além disso, um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon pode ser usado.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a seleção fácil de células transformadas. Um marcador selecionável é um gene o produto do qual fornece resistência a biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxótrofos e outros. Os exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis ou marcadores que conferem resistência a antibiótico tal como resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um elemento ou elementos que permitem a integração estável do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentedo genoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode contar com a seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para a integração estável do vetor no genoma pelas recombinações homólogas ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter seqüências de ácido nucléico adicionais para direcionar a integração pela recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira. As seqüências de ácido nucléico adicionais permitem que o vetor seja integrado no genoma da célula hospedeira em um local ou locais precisos no(s) cromossoma(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos integracionais devem preferivelmente conter um número suficiente de ácidos nucléicos, tais como 100 a 1.500 pares de base, preferivelmente de 400 a 1.500 pares de base e mais preferivelmente de 800 a 1.500 pares de base, que são altamente homólogos com a seqüência alvo correspondente para realçar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer seqüência que seja homóloga com a seqüência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser seqüências de ácido nucléico não codificadoras ou codificadoras. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira pela recombinação não homóloga.

Para a replicação autônoma, o vetor pode compreender ainda uma origem de replicação que permita que o vetor replique autonomamente na célula hospedeira em questão. Os exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 que permitem a replicação na E. coli e pUBUO, pE194, pTA1060 e pAM(31 que permitem a replicação em Bacillus. A origem de replicação pode ser uma tendo uma mutação que a faça ter a função de sensibilidade à temperatura na célula hospedeira (ver, por exemplo, Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).Mais do que uma cópia de uma seqüência de ácido nucléico da presente invenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produto de gene. Um aumento no número de cópia da seqüência de ácido nucléico pode ser obtido pela integração de pelo menos uma cópia adicional da seqüência no genoma da célula hospedeira ou pela inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com a seqüência de ácido nucléico onde as células contendo as cópias amplificadas do gene marcador selecionável e por meio deste cópias adicionais da seqüência de ácido nucléico, podem ser selecionadas cultivando-se as células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al, 1989, supra).

O polipeptídeo da invenção também pode ser co-expressado junto com pelo menos um outro componente de interesse para ração de animal, tal como um polipeptídeo com uma atividade enzimática desejada para o uso em ração de animal. O polipeptídeo da invenção e o pelo menos um outro polipeptídeo podem ser co-expressados a partir de vetores diferentes, a partir de um vetor ou usando uma mistura de ambas as técnicas. Células Hospedeiras

A invenção além disso diz respeito a uma célula hospedeira de Bacillus recombinante que compreende uma construção de ácido nucléico da invenção e/ou um vetor de expressão da invenção. O DNA da célula hospedeira, quando colhido e usado como um padrão de DNA em uma reação de PCR com as SEQ ID NOs: 6 e 7 como iniciadores, leva à geração de um fragmento de PCR de um tamanho de aproximadamente 0,4 kb.

Em uma forma de realização particular, o fragmento de PCR, quando purificado e seqüenciado codifica uma seqüência de aminoácido quetem pelo menos 33% de identidade aos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2.

As formas de realização particulares do primeiro aspecto da invenção (em particular aqueles divulgados nas seções intituladas "The Polypeptide, its Characteristics and Use" e "Identity and Hybridization, Fragments and Variants") também são aplicáveis às células hospedeiras da invenção. Por exemplo, em outras formas de realização particulares da célula hospedeira de Bacillus da invenção, o fragmento de PCR, quando purificado e seqüenciado, codifica uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade aos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 35% ou pelo menos 37%, 40%, 42%, 45%, 47%, 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97% ou pelo menos 99%.

Ainda em outras formas de realização particulares, a célula hospedeira de Bacillus é uma célula hospedeira de Bacillus licheniformis, preferivelmente selecionada das seguintes cepas de Bacillus licheniformis: ATCC 14580 (=NCIB 9375), NCIMB 6346 (=DSM 8785), NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689 e ATCC 53757. Um subgrupo preferido inclui Bacillus licheniformis ATCC 14580 (=NCIB 9375) e Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785).

Estas células hospedeiras são vantajosamente usadas na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor que compreende uma seqüência de ácido nucléico da presente invenção é introduzida na célula hospedeira de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômico auto-replicante como descrita mais no princípio. O termo "célula hospedeira" abrange qualquer progênie da célula precursora que não é idêntica à célula precursora devido às mutações que ocorrem durante a replicação.A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, ser efetuada pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

Métodos de Produção

A invenção também diz respeito a um método para produzir um polipeptídeo da invenção, o método compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da invenção para produzir um sobrenadante que compreenda o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A invenção além disso diz respeito a um método para produzir um polipeptídeo da invenção, o método compreendendo (a) cultivar uma cepa de Bacillus, o DNA da qual, quando colhido e usado como um padrão de DNA em uma reação de PCR com SEQ ID NOs: 6 e 7 como iniciadores, leva à geração de um fragmento de PCR de um tamanho de aproximadamente 0,4 kb; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Os exemplos de células hospedeiras são mencionados na seção acima intitulada "Células Hospedeiras".

A presente invenção também diz respeito a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção que compreendem (a) cultivar uma célula hospedeira de Bacillus licheniformis ATCC 14580 (=NCIB 9375) ou de Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785) recombinante sob condições condutivas à produção do polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma seqüência de ácido nucléico mutante que compreende pelo menos uma mutação nos nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1, em quea seqüência de ácido nucléico mutante codifica um polipeptídeo que (i) consiste dos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 ou (ii) é uma variante da seqüência de (i), em que a variante compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos ou (iii) é uma variante alélica da seqüência de (i) ou (iv) é um fragmento da seqüência de (i).

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada pelo cultivo em fermentação de frasco agitado, em escala pequena ou escala grande (incluindo as fermentações contínuas, por lote, lote alimentado, lote alimentado repetido ou de estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industrial realizados em um meio adequado e sob condições que permitam que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreenda fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não é secretado, o mesmo pode ser recuperado a partir de Usados de célula.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos; a análise em gel de SDS-PAGE revelando uma faixa de um peso molecular relativo, Mr, de cerca de 12 kDa; e/ou a determinação da seqüência de terminal N, em amostras purificadas e/ou na faixa de um Mr de 12 kDa, como corte do gel de SDS-PAGE. No último caso, o terminal N deve preferivelmente ter uma identidade com a SEQ ID NO: 5 de pelo menos 33% ou pelo menos 35%,37%, 40%, 42%, 45%, 47%, 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97% ou pelo menos 99%, a identidade sendo determinada como no geral descrito acima).

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado pelos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutriente pelos procedimentos convencionais incluindo, mas não limitado a, centrifugação, filtração (tal como ultrafiltração e/ou diafiltração), extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purifícation, J.-C. Janson and Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989). Composições e Usos

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito às composições que compreendem um polipeptídeo e/ou uma cepa de Bacillus da presente invenção.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou um seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Os exemplos particulares de composições da invenção são os seguintes:

Uma ração de animal aditiva que compreenda (a) i) umpolipeptídeo tendo os aminoácidos de 1 a 126 da SEQ ID NO: 4 e/ou ii) um polipeptídeo da invenção; e (b) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, (c) pelo menos uma vitamina solúvel em água, (d) pelo menos um traço de mineral, e/ou (e) pelo menos um mineral macro;

uma composição de ração de animal tendo um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e que compreende i) um polipeptídeo tendo os aminoácidos de 1 a 126 da SEQ ID NO: 4 e/ou ii) um polipeptídeo da invenção;

um aditivo de ração de animal que compreende (a) uma cepa de Bacillus como definida na seção intitulada "Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probióticas"; e (b) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, (c) pelo menos uma vitamina solúvel em água, (d) pelo menos um traço de mineral, e/ou (e) pelo menos um mineral macro; e

uma composição de ração de animal tendo um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e que compreende uma cepa de Bacillus como definida na seção intitulada "Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probióticas".

As chamadas pré misturas são exemplos de aditivos de ração de animal da invenção. Uma pré mistura designa uma mistura preferivelmente uniforme de um ou mais micro-ingredientes com diluente e/ou carregador. As pré misturas são usadas para facilitar a dispersão uniforme de micro-ingredientes em uma mistura maior.

Os exemplos de usos preferidos de acordo com a invenção são dados acima (nas seções intituladas "O Polipeptídeo, suas Características e Uso" e "Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probióticas") e mais detalhado abaixo.

Ração de animal

O termo animal inclui todos os animais. Os exemplos de animais são não ruminantes e ruminantes. Os animais ruminantes incluem, por exemplo, animais tais como ovelha, cabra e gado, por exemplo vaca talcomo gado de corte e vacas leiteiras. Em uma forma de realização particular, o animal é um animal não ruminante. Os animais não ruminantes incluem os animais mono-gástricos, por exemplo porco ou suíno (incluindo, mas não limitado a, leitões, porcos em crescimento e porcas); aves domésticas tais como perus, patos e galinhas (incluindo mas não limitado a frango, galinhas poedeiras); peixe (incluindo mas não limitado a salmão, truta, tilápia, peixe e carpa); e crustáceos (incluindo mas não limitado a camarão e pitu).

O termo ração ou composição de ração significa qualquer composto, preparação, mistura ou composição adequados para ou intencionados para a ingestão por um animal.

No uso de acordo com a invenção o polipeptídeo e/ou a cepa de Bacillus podem ser alimentado ao animal antes, depois ou simultaneamente com a dieta. O último é preferido.

Em uma forma de realização particular, o polipeptídeo, na forma em que o mesmo é adicionado à ração ou quando é incluído em um aditivo de ração, é bem definido. O termo bem definido significa que a preparação de polipeptídeo é pelo menos 50% pura, determinada como anteriormente descrito ou pela cromatografia de exclusão de tamanho (ver o Exemplo 12 da WO 01/58275). Em outras formas de realização particulares a preparação de polipeptídeo bem definida é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 ou pelo menos 95% pura.

Uma preparação de polipeptídeo bem definida é vantajosa. Por exemplo, é muito mais fácil dosar corretamente à ração um polipeptídeo que é essencialmente livre de outros polipeptídeos interferentes ou contaminantes. O termo dosar corretamente refere-se em particular ao objetivo de obter resultados compatíveis e constantes e a capacidade de otimizar a dosagem com base no efeito desejado.

Para o uso em ração de animal, entretanto, o polipeptídeo não precisa ser aquele puro; o mesmo pode incluir por exemplo outrospolipeptídeos tais como enzimas de ração de animal, caso este em que o mesmo poderia ser chamado de uma preparação de polipeptídeo.

A preparação de polipeptídeo pode ser (a) adicionada diretamente à ração (ou usada diretamente em um processo de tratamento de proteínas) ou (b) a mesma pode ser usada na produção de uma ou mais composições intermediárias tais como aditivos de ração ou pré misturas que são subseqüentemente adicionadas à ração (ou usadas em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima refere-se à pureza da preparação de polipeptídeo original, seja usado de acordo com (a) ou (b) acima.

As preparações de polipeptídeo com purezas desta ordem de magnitude são em particular obteníveis usando métodos recombinantes de produção, ao passo que eles não são assim facilmente obtidos e também submetidos a uma variação de lote para lote muito maior quando o polipeptídeo é produzido pelos métodos de fermentação tradicionais.

No presente contexto, o termo Taxa de Conversão de Ração ou FCR, é usado como sinônimos com o termo conversão de ração. A FCR é calculada como a ingestão de ração em g/animal em relação ao ganho de peso em g/animal, ver por exemplo a Tabela 2 no Exemplo 5.

O polipeptídeo pode ser adicionado à ração em qualquer forma, seja como um polipeptídeo relativamente puro ou em mistura com outros componentes intencionados para a adição à ração de animal, isto é na forma de aditivos de ração de animal, tal como as chamadas pré-misturas para ração de animal.

Além do polipeptídeo e/ou da cepa de Bacillus da invenção, os aditivos de ração de animal da invenção contêm pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um traço de mineral, e/ou pelo menos um mineral macro.

Além disso, os ingredientes de aditivo de ração, opcionais são agentes corantes, por exemplo carotenóides tais como beta-caroteno,astaxantina e luteína; compostos de aroma; estabilizadores; peptídeos antimicrobianos; ácidos graxos poliinsaturados; espécies que geram oxigênio reativo; e/ou pelo menos uma enzima selecionada dentre fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26), xilanase (EC 3.2.1.8), galactanase (EC 3.2.1.89), alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22), protease (EC 3.4.-.- ), fosfolipase Al (EC 3.1.1.32), fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4), lisofosfolipase (EC 3.1.1.5), fosfolipase C (EC 3.1.4.3), fosfolipase D (EC 3.1.4.4), amilase tal como. por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1), e/ou beta-glicanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6). Em uma forma de realização particular estas outras enzimas são bem definidas (como definido acima para as preparações de polipeptídeo).

Os exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP's) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina e Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos divulgados na WO 03/044049 e WO 03/048148, assim como variantes ou fragmentos do acima que retenham a atividade antimicrobiana.

Os exemplos de polipeptídeos antifungicos (AFP's) são os peptídeos de Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, assim como variantes e fragmentos destes que retenham a atividade antifungica, como divulgado na WO 94/01459 e WO 02/090384.

Os exemplos de ácidos graxos poliinsaturados são Cl8, C20 e C22 ácidos graxos poliinsaturados, tais como ácido araquidônico, ácido docosoexanóico, ácido eicosapentanóico e ácido gamalinoléico.

Os exemplos de espécies que geram oxigênio reativo são produtos químicos tais como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas tais como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

Usualmente as vitaminas solúveis em gordura e água, assim como minerais traço formam parte de uma chamada pré mistura intencionada para a adição à ração, ao passo que os minerais macros são usualmenteadicionados em separado à ração. Cada um destes tipos de composição, quando enriquecidos com um polipeptídeo ou uma cepa de Bacillus da invenção, é um aditivo de ração de animal da invenção.

Em uma forma de realização particular, o aditivo de ração de animal da invenção é intencionado a ser incluído (ou prescrito como tendo que ser incluído) em dietas ou ração de animal em níveis de 0,01 a 10,0%; mais particular de 0,05 a 5,0%; ou 0,2 a 1,0% (% significando g de aditivo por 100 g de ração). Isto é assim em particular para as pré misturas.

As seguintes são listas não exclusivas de exemplos destes componentes:

Os exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina A, vitamina D3, vitamina E e vitamina K, por exemplo vitamina K3.

Os exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina BI2, biotina e colina, vitamina BI, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo Ca-D-pantotenato.

Os exemplos de minerais traço são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio e cobalto.

Exemplos de minerais macro são cálcio, fósforo e sódio.

As exigências nutricionais destes componentes (exemplificados com aves domésticas e leitões/porcos) são listados na Tabela A da WO 01/58275. Exigência nutricional significa que estes componentes devem ser fornecidos na dieta nas concentrações indicadas.

Na alternativa, o aditivo de ração de animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A da WO 01/58275. Pelo menos um significa cada um de, um ou mais de, um ou dois ou três ou quatro e assim por diante até todos treze ou até todos quinze componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invenção em uma tal quantidade como para fornecer uma concentração na ração dentro da faixaindicada na coluna quatro ou coluna cinco ou coluna seis da Tabela A.

As composições ou dietas de ração de animal têm um teor relativamente alto de proteína. As dietas de aves domésticas e porco podem ser caracterizadas como indicado na Tabela B da WO 01/58275, colunas 2 a 3. As dietas de peixe podem ser caracterizadas como indicado na coluna 4 desta Tabela B. Além disso tais dietas de peixe usualmente têm um teor de gordura bruto de 200 a 310 g/kg.

A WO 01/58275 corresponde à US 09/779334 que é por meio deste incorporada por referência.

Uma composição de ração de animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e além disso compreende pelo menos um polipeptídeo e/ou pelo menos uma cepa de Bacillus como aqui descrita e/ou reivindicada.

Além disso ou na alternativa (para o teor de proteína bruta indicada acima), a composição de ração de animal da invenção tem um teor de energia metabolizável de 10 a 30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1 a 200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1 a 200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1 a 100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1 a 150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5 a 50 g/kg.

Em formas de realização particulares, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina está dentro de qualquer uma das faixas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B da WO 01/58275 (R. 2-5).

A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator de 6,25, isto é Proteína bruta (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Offícial Methods of Analysis 14a ed., Association of Offícial Analytical Chemists, Washington DC).

A energia metabolizável pode ser calculada com base napublicação NRC Nutrient requirements in swine, nona edição revisada 1988, subcomittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6 e a European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Bee kbergen, The Netherlands. Grafisch bedríjf Ponsen & looijen by, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

O teor dietético de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos nas dietas de animal completas é calculado com base nas tabelas de ração tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

Em uma forma de realização particular, a composição de ração de animal da invenção contém pelo menos uma proteína vegetal ou fonte de proteína. Esta também pode conter proteína animal, tal como Carne e Farinha de Osso e/ou Farinha de Peixe, tipicamente em uma quantidade de 0 a 25%. O termo proteínas vegetais como aqui usado refere-se a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclua pelo menos uma proteína derivada de ou que se origine de um vegetal, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteína. Em formas de realização particulares, o teor de proteína das proteínas vegetais é de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50 ou 60% (p/p)-

As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, tal como legumes e cereais, por exemplo materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae e Poaceae, tais como farinha de feijão de soja, farinha de tremoços e farinha de colza.

Em uma forma de realização particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplosoja, tremoço, ervilha ou feijão.

Em uma outra forma de realização particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo beterraba, beterraba açucareira, espinafre ou quinoa.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são colza, semente de girassol, semente de algodão e repolho.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz, triticale e sorgo.

Ainda em outras formas de realização particulares, a composição de ração de animal da invenção contém de 0 a 80% de milho; e/ou de 0 a 80% de sorgo; e/ou de 0 a 70% de trigo; e/ou de 0 a 70% de cevada; e/ou de 0 a 30% de aveia; e/ou de 0 a 30% de centeio; e/ou de 0 a 40% de farinha de soja; e/ou de 0 a 25% de farinha de peixe; e/ou de 0 a 25% de carne e farinha de osso; e/ou de 0 a 20% de soro de leite.

As dietas de animal por exemplo podem ser fabricadas como ração em pasta (mão pelotizada) ou ração pelotizada. Tipicamente, os gêneros alimentícios moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminas essenciais e minerais são adicionados de acordo com as especificações para a espécie em questão. O(s) polipeptídeo(s) e/ou a cepa de Bacillus podem ser adicionadas como formulações sólidas ou líquidas. Por exemplo, uma formulação de polipeptídeo sólida é tipicamente adicionada antes ou durante a etapa de mistura; e uma preparação de polipeptídeo líquida é tipicamente adicionada depois da etapa de pelotização. O polipeptídeo também pode ser incorporado em um aditivo de ração ou pré mistura.

A concentração de polipeptídeo final na dieta está dentro da faixa de 0,01 a 200 mg de proteína por kg de dieta, por exemplo na faixa de 0,1 a 20 mg de proteína por kg de dieta de animal.

O polipeptídeo e/ou a cepa de Bacillus naturalmente deve seraplicada em uma quantidade eficaz, isto é em uma quantidade adequada para melhorar a conversão de ração.

É no presente considerado que o polipeptídeo é administrado em uma ou mais das seguintes quantidades (faixas de dosagem): 0,01 a 200; 0,01 a 100; 0,5 a 100; 1 a 50; 5 a 100; 10 a 100; 0,05 a 50; 1 a 10; ou 0,10 a 10, todas estas faixas estando em mg de proteína de polipeptídeo por kg de ração (ppm). Em uma forma de realização particular, a faixa de dosagem é de 1 a 9, 1 a 8, 2 a 7, 2 a 6 ou 2 a 5 ppm. Os exemplos de faixa de dosagem particularmente preferida são; 0,5 a 15,0, 1,0 a 12,5, 1,5 a 10,0 e 2,5 a 7,5 ppm. A quantidade do polipeptídeo é determinada como descrito para a proteína L12 no Exemplo 10.

É no presente considerado que a cepa de Bacillus é administrada em uma ou mais das seguintes quantidades (faixas de dosagem): 10 E2-14, 10 E4-12, 10 E6-10, 10 E7-9, preferivelmente 10 E8 CFU/g de ração (a designação E significa expoente, a saber, por exemplo, 10 E2-14 significa IO2 a IO14).

Para determinar mg de proteína de polipeptídeo por kg de ração, o polipeptídeo é purificado da composição de ração e a dosagem em mg de proteína de polipeptídeo por kg de ração é calculada, por exemplo como descrito no Exemplo 10. Os mesmos princípios aplicam-se para a determinação de mg de proteína de polipeptídeo em aditivos de ração.

Depósito de Material biológico

Os seguintes materiais biológicos, que foram isolados de conteúdos intestinais de frangos, como descrito no Exemplo 8, foram depositados sob os termos do Tratado de Budapeste com a DSMZ (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha) e dados os seguintes números de acesso:

Depósito Número de Acesso Data do DepósitoEnterococcus faecalis DSM 18047 10 de março de 2006

LactoBacillus salivarius DSM 18070 16 de março de 2006

Os depósitos foram feitos pela Novozymes NS, Krogshoejvej 36, DK-2880, Dinamarca. Estas cepas foram depositadas sob condições que garantam que o acesso às culturas estarão disponíveis durante a pendência deste pedido de patente a uma pessoa determinada pelo Representante de Patentes e Marcas Registradas a ser designado para isso sob 37 C.F.R. §1,14 e 35 U.S.C. §122. Os depósitos representam uma cultura substancialmente pura das cepas depositadas. Os depósitos estão disponíveis como requerido pelas leis de patente estrangeiras nos países em que as contrapartes do presente pedido ou sua progênie são depositadas. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para a prática da invenção objeto em detrimento dos direitos de patente outorgados por ação governamental.

A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada no escopo pelas formas de realização específicas aqui contidas divulgadas, visto que estas formas de realização são intencionadas como ilustrações de diversos aspectos da invenção. Quaisquer formas de realização equivalentes são intencionadas a estarem dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas aqui mostradas e descritas tornar-se-ão evidentes àqueles habilitados na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também são intencionadas a cair dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente divulgação incluindo as definições comandarão.

Várias referências são aqui citadas, as divulgações das quais são incorporadas por referência em suas totalidades. Exemplos

Exemplo 1: Fermentação em frasco agitado de Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis ATCC 14580 foi propagado durante anoite a 37° C em meio de TY ágar (caldo TY solidificado com 2% de ágar) e inoculado em um frasco agitado contendo 100 ml de caldo TY com a seguinte composição: Triptona: 20 g/litro, Extrato de levedura: 5 g/litro, FeCl2.4H20: 7 mg/litro, MnCl2.4H20: 1 mg/litro, MgS04.7H20: 15 mg/litro, pH 7,3. O frasco agitado foi incubado a 37° C por 20 horas com uma velocidade de agitação de 225 rpm. As células foram removidas pela centrifugação.

A eletroforese em gel de SDS poliacrilamida do sobrenadante revelou uma faixa de um peso molecular relativo de 12 kDa que corresponde ao polipeptídeo desejado. O polipeptídeo da invenção é designado "a proteína LI2," devido ao seu peso molecular relativo de 12 kDa, pela SDS-PAGE (entretanto, o peso molecular teórico pode ser calculado a 9591,56 Da). Exemplo 2: Purificação da fermentação em frasco agitado de Bacillus licheniformis

O caldo de fermentação do Exemplo 1 foi centrifugada (20000 x g, 20 min) e os sobrenadantes foram cuidadosamente decantados dos precipitados. Os sobrenadantes combinados foram filtrados através de uma placa Seitz EKS de modo a remover as células de Bacillus. O filtrado de EKS foi ultrafiltrado e diafiltrado em cartuchos de corte Filtron 3k de modo a concentrar as proteínas e reduzir a condutividade no filtrado Seitz EKS. O concentrado Filtron foi filtrado através de uma outra placa Seitz EKS.

O pH do concentrado foi ajustado ao pH 4,5 com 20% de CH3COOH. Alguma coisa (não a proteína LI2) na solução precipitou pelo ajuste do pH e este precipitado foi removido pela fiítração através de uma placa Seitz K-250. O filtrado K-250 foi aplicado a uma coluna de SP-sepharose FF de 100 ml equilibrada em 20 raM de CH3COOH, 50 mJVI de H3BO3, 1 mM de CaCl2, ajustado ao pH 4,5 com NaOH. Depois de lavar a coluna extensivamente com o tampão de equilíbrio, a proteína L12 foi eluída com um gradiente de NaCl linear (0 —» 0,5M) no mesmo tampão. As frações contendo a proteína L12 foram identificadas pela análise de SDS-PAGE eestas frações foram reunidas e diluídas 10 vezes com água desmineralizada para reduzir a condutividade da combinação. A combinação foi aplicada a uma coluna SOURCE S de 8 ml equilibrada no mesmo tampão de equilíbrio (20 mM de CH3COOH, 50 mM de H3BO3, 1 mM de CaCl2, ajustado ao pH 4,5 com NaOH) e depois de lavar a coluna extensivamente com o tampão de equilíbrio, a proteína L12 foi eluída com um gradiente linear de NaCl (0 —» 1,0 M) no mesmo tampão.

As frações da coluna foram analisadas pela análise de SDS-PAGE e as frações contendo a proteína L12 foram reunidas, o pH foi ajustado ao pH 8 com 3% de NaOH e a combinação foi deixada no ambiente frio até o dia seguinte. O ajuste ao pH 8 fez com que a proteína L12 precipitasse e no dia seguinte o precipitado L12 foi coletado pela centrifugação (5000 x g, 10 min).

O precipitado da proteína L12 foi lavado com 20 mM de Tris/HCl, pH 8 para aumentar a pureza da proteína L12 precipitada. Depois de uma segunda centrifugação (5000 x g, 10 min) o precipitado da proteína L12 foi dissolvido em um volume mínimo de (20 mM de CH3COOH, 50 mM de H3BO3, 1 mM de CaCl2, 100 mM de NaCl ajustado ao pH 4,5 com NaOH) e aplicado a uma coluna de exclusão por tamanho Superdex 75 de 300 ml equilibrada no mesmo tampão.

A coluna Superdex 75 foi eluída com o mesmo tampão e as frações da coluna foram analisadas pela análise de SDS-PAGE. As frações, onde apenas uma faixa foi observada no gel de SDS-PAGE tingido com coomassie, foram combinados como a preparação de proteína L12 purificada. Glicerol foi adicionado às frações LI2 combinadas a 50% (p/p) de concentração final.

A proteína LI2 formulada com glicerol foi armazenada fria em um refrigerador. A preparação foi essencialmente pura como determinada em um gel de SDS-PAGE tingido com coomassie (uma faixa).Características:

O peso molecular relativo como determinado pela SDS-PAGE foi:Mr= 12kDa.

A seqüência de terminal N foi: WVNPGYHYQYPSEGG (SEQ ID NO: 5)

Exemplo 3: Fermentação pela retroalimentação de Bacillus licheniformis

Um processo de fermentação pela retroalimentação de Bacillus licheniformis ATCC 14580 foi conduzida como descrito abaixo. Todos os meios foram esterilizados pelos métodos conhecidos na técnica. A menos que de outro modo descrito, água de torneira foi usada. As concentrações de ingredientes aludidas nas receitas abaixo são antes de qualquer inoculação. Meios

LB ágar: 10 g/litro de peptona de caseína (tal como, o no. de catálogo da Fluke no. 95039, digestão tríptica da caseína); 5 g/litro de extrato de levedura (fabricado pela autolise de Saccharomyces cerevisiae, por exemplo catálogo no. 9512 da Organotechnie S.A., 27, avenue Jean Mermoz, F-93120 La Courneuve, França); 10 g/litro de cloreto de sódio; 12 g/litro de Bacto-ágar (LB-ágar (Miller), catálogo Merck no. 110283) ajustado ao pH 7,0 +/- 0,2.

Tampão M-9: Dihidrogeno fosfato de sódio. 2H2O 8,8 g/litro; diidrogeno fosfato de potássio 3 g/litro; cloreto de sódio 4 g/litro; sulfato de magnésio. 7H20 0,2 g/litro (água deionizada é usado neste tampão).

PRK-50: 110 g/litro de farinha grossa de soja; Dihidrogeno fosfato de sódio. 2H20 5 g/litro; antiespumante (tal como, por exemplo, Struktol SB2121, Schill & Seilacher, Hamburg, Alemanha) 1 ml/litro; pH ajustado a 8,0 com NaOH/H3P04 antes da esterilização.

Meio de composição: Triptona (Hidrolisado de caseína tal como, por exemplo, digestão pancreática de Bacto® Triptona de caseínacatálogo no. 211699) 30 g/litro; sulfato de magnésio. 7H20 4 g/litro; dihidrogeno fosfato de potássio 7 g/litro; dihidrogeno fosfato de sódio, 2H20 7 g/litro; di-sulfato de amônio 4 g/litro; ácido cítrico 0,78 g/litro; vitaminas (dicloreto de tiamina 34,2 mg/litro; riboflavina 2,9 mg/litro; ácido nicotínico 23 mg/litro; D-pantotenato de cálcio 28,5 mg/litro; piridoxal-HCl 5,7 mg/litro; D-biotina 1,1 mg/litro; ácido fólico 2,9 mg/litro); metais traço (MnS04. H20 39,2 mg/litro; FeS04. 7H20 157 mg/litro; CuS04, 5H20 15,6 mg/litro; ZnCl2 15,6 mg/litro); Antiespumante (Struktol SB2121, ver acima) 1,25 ml/litro; pH ajustado a 6,0 com NaOH/H3P04 antes da esterilização. Monopropileno glicol (MPG) 24 ml/litro foi adicionado 28 e 47 horas depois da inoculação (isto é depois de aproximadamente 1 e 2 dias, respectivamente), no total 48 ml/litro de MPG foram adicionados.

Meio de alimentação: Glicose. 1H20 820 g/litro Procedimento de Fermentação:

Bacillus licheniformis ATCC 14580 foi cultivado em inclinações de LB ágar por um dia a 37° C. O ágar foi depois lavado com tampão M-9 e a densidade ótica (OD) a 650 nm da suspensão de célula resultante foi medida. O frasco de inóculo agitado (com 100 ml de meio PRK-50) foram inoculados com um inóculo de OD (650 nm) x ml de suspensão de célula = 0,1 (que significa que a quantidade requerida de inóculo em ml é encontrada dividindo-se 0,1 pela OD (650 nm) da suspensão de célula de inóculo). Os frascos agitados foram incubados a 37° C a 300 rpm por 20 horas.

Os fermentadores usados foram fermentadores de laboratório padrão equipados com um sistema de controle de temperatura, controle de pH com água amoniacal e ácido fosfórico, eletrodo de oxigênio dissolvido para medir >20% de saturação de oxigênio através da fermentação inteira.

A fermentação no fermentador principal (tanque de fermentação) foi iniciada pela inoculação do fermentador principal com acultura em crescimento de um frasco de inóculo agitado. O volume inoculado foi de 10% do meio de composição (80 ml para 720 ml de meio de composição, resultando em 800 ml de caldo inicial depois da inoculação).

Os parâmetros de fermentação foram: Temperatura 41° C; pH entre 6,8 e 7,2 (usando água amoniacal e ácido fosfórico, controle 6,8 (água amoniacal), 7,2 ácido fosfórico). Aeração: 1,5 litro/min/kg de peso do caldo de fermentação, agitação: 1500 rpm.

O meio de alimentação foi adicionado como segue: Taxa de alimentação inicial 0,05 g/min/kg no início da fermentação, aumentando linearmente para 0,16 g/ming/kg depois de 8 horas e permanecendo a 0,16 g/min/kg até o final da fermentação (por referência ao peso de partida do caldo de fermentação, exatamente depois da inoculação).

Depois de 3 dias (70 horas) o caldo de fermentação foi colhido e purificado como descrito no Exemplo 4 abaixo.

Exemplo 4: Purificação da fermentação pela retroalimentação de Bacillus licheniformis

O caldo de fermentação do Exemplo 3 foi centrifugado (20000 x g, 20 min) e os sobrenadantes foram cuidadosamente decantados dos precipitados. Os sobrenadantes combinados foram filtrados através de uma placa Seitz K-250 e depois através de uma placa Seitz EKS de modo a remover o resto das células hospedeiras de Bacillus. A condutividade do filtrado EKS foi de 10 mS/cm. 100 ml de filtrado de EKS foi diluído lOx em 20 mM de CH3COOH, 50 mM de H3BO3, 1 mM de CaCl2, ajustado ao pH 4,5 com NaOH e o pH do filtrado EKS diluído foi ajustado ao pH 4,5 com 20% de CH3COOH. O filtrado de EKS diluído foi aplicado a uma coluna de 19 ml de SP-sepharose FF equilibrada em 20 mM de CH3COOH, 50 mM de H3BO3, 1 mM de CaCl2, ajustado ao pH 4,5 com NaOH. Depois de lavar a coluna extensivamente com o tampão de equilíbrio, a proteína L12 foi eluída com um gradiente de NaCl linear (0 -> 0,5 M) no mesmo tampão. As frações contendoa proteína LI2 foram identificadas pela análise de SDS-PAGE e combinadas e diluída 10 vezes com água desmineralizada para reduzir a condutividade da combinação. A combinação foi aplicada a uma coluna SOURCE S de 8 ml equilibrada no mesmo tampão de equilíbrio (20 mM de CH3COOH, 50 mM de H3BO3, 1 mM de CaCl2, ajustado ao pH 4,5 com NaOH) e depois de lavar a coluna extensivamente com o tampão de equilíbrio, a proteína L12 foi eluída com um gradiente de NaCl linear (0 -> 1,0 M) no mesmo tampão. As frações da coluna foram analisadas pela análise de SDS-PAGE e as frações contendo a proteína LI2 foram combinadas e aplicadas a uma coluna de exclusão de tamanho Superdex 75 de 120 ml equilibrada em 20 mM de CH3COOH, 50 mM de H3BO3, 100 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, ajustado ao pH 4,5 com NaOH. A coluna Superdex 75 foi eluída com o mesmo tampão e as frações da coluna foram analisadas pela análise de SDS-PAGE. As frações que dão origem a uma faixa forte a 12 kDa no gel de SDS-PAGE tingido com coomassie foram combinadas como a preparação da proteína L12 purificada. A preparação foi pelo menos 90% pura julgada a partir de um gel de SDS-PAGE tingido com coomassie e o peso molecular relativo como determinado pela SDS-PAGE foi de Mr = 12 kDa. A seqüência de terminal N foi: WNVPGYHYQY (aminoácidos de 1 a 10 da SEQ ID NO: 5).

Exemplo 5: Desempenho em ração de animal in vivo (teste de gaiola)

O desempenho da proteína LI2 em ração de animal foi avaliada em um teste de crescimento de frango com os seguintes parâmetros:

Teste de crescimento: Dia 8 ao dia 29 (dia 0 = dia do choco)

Tratamentos: A: Controle; B: 5 mg de proteína L12 purificada por kg de ração

Dietas: dieta de Milho / SBM48 (ver a composição de ração, Tabela 1)

Depois de misturar a ração foi pelotizada em cerca de 70° C (3 x 25 mM). A proteína L12 foi diluída em 500 ml de água e pulverizada sobreas pelotas. Para o tratamento de controle a mesma quantidade de água foi pulverizada sobre as pelotas.

Réplicas: 8 grupos de 6 frangos machos, ROSS PM3, por tratamento

Alimentação: Pelotas ad libitum

Tabela 1: Composição de ração da dieta experimental

<table>table see original document page 60</column></row><table>

1TÍO2 como marcador indigerível foi incluído na mistura de ração

2 Comercialmente disponível da DSM Nutritional Products NV, Dorpsstraat 4, B-9800 Deinze, Bélgica e incluindo Lasalocid Sódico

3 Calculado com equação EC (EEC (1986) Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la mêthode de calcul de la valeur energetique des aliments composes destines a la volaille; Journal Officiel des Communautês Europeennes, L 130, 53-54)

4 Matéria-prima para gêneros alimentícios; disponível da Moulin Moderne Hirsingue, Hirsingue, França

5 Farinha de soja, resíduos da fabricação de óleo, matéria-prima para gêneros alimentícios; disponível da Moulin Moderne Hirsinque, Hirsinque, FrançaTabela 2: Desempenho de frangos machos; média ± desvio padrão

<table>table see original document page 61</column></row><table>

compartilham um sobrescrito comum, são significantemente diferentes (p < 0,05)

Exemplo 6: Cepas de Bacillus com genes equivalentes a L12, como identificadas pela PCR

Os genes similares ao gene que codifica a proteína L12 (SEQ ID NO: 1) foram identificados em várias outras cepas de Bacillus licheniformis pela PCR. O DNA para o uso como um padrão para a reação de PCR foi isolada de onze cepas de Bacillus licheniformis diferentes cultivadas durante a noite a 37° C em placas de TY ágar (para a receita, ver o Exemplo 1). Um tubo de inoculação com células de cada cepa foi colocado em suspensão em 0,1 ml de H2O e fervido por 10 min, centrifugado e 5 microlitros de sobrenadante de cada um foi usado como padrão de DNA nas reações de PCR como descrito abaixo.

As reações de PCR foram conduzidas em "Puro Taq® Ready-T0G0® PCR Beads" da Amersham Biosciences: 5 microlitros de padrão de DNA + 2x1 microlitro de iniciador Pep481 (SEQ ID NO: 6) e Pep482 (SEQ ID NO: 7) + 18 microlitros de H20.

Programa de PCR: 1) 95° C 3 min; 2) 95° C 10 segundos; 3)65° C 30 segundos -Io C pr. ciclo; 4) 72° C 1 min; 5) Ir Para 2) 9 vezes; 6) 95° C 10 segundos; 7) 55° C 30 segundos; 8) 72° C 1 min; 9) Ir Para 6) 19 vezes; 10) 72° C 5 min; 11) 4o C continuamente, que significa que na etapa 10) seguinte a temperatura é diminuída para 4 oC.

Iniciadores:

Pep481 AATTACGCGTGTTGGTGCGATAGTAGTAACG-3' (SEQ ID NO: 6)

Pep482 TTAAGAATTCGAATGAAAGAGGAGGAATG -3' (SEQ ID NO: 7)

O fragmento de PCR de 0,4 kb resultante das cinco cepas positivas (positivo significando dar a faixa de DNA do tamanho correto) foi purificado e usado em um experimento de seqüenciamento de DNA, usando de novo como iniciadores de seqüência os iniciadores Pep481 (SEQ ID NO: 6) e Pep482 (SEQ ID NO: 7).

Três das cinco cepas positivas deram a mesma seqüência de DNA: Bacillus licheniformis ATCC 14580, Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785) e Bacillus licheniformis cepa 712, resultando na seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Na cepa 470 de Bacillus licheniformis as mudanças de DNA resultaram em duas mudanças de aminoácido (SEQ ID NO: 9), entretanto nenhuma no peptídeo maduro. Na cepa 009 de Bacillus licheniformis as mudanças de DNA resultaram em quinze mudanças de aminoácido (SEQ ID NO: 8), oito das quais no peptídeo maduro. Além disso, uma seqüência de consenso (SEQ ID NO: 10) foi derivada das SEQ ID NOs: 2, 8 e 9.

Observe que, neste experimento, os nucleotídeos que codificam os sete aminoácidos de terminal C da SEQ ID NO: 2 são incluídos no iniciador Pep481 (SEQ ID NO: 6) e os sete resíduos de aminoácido de terminal C das SEQ ID NOs: 8 e 9 podem não ser portanto corretos. Entretanto a correção das SEQ ID NOs: 8 e 9 foi mais tarde confirmada.Uma cepa de Bacillus licheniformis que foi isolada do produto probiótico na ração designada BioPlus®2B (oferecida por Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Alie, DK-2970 Hoersholm, Dinamarca) foi incluída entre as onze cepas testadas mas foi negativa.

Além disso, 44 outras cepas de Bacillus licheniformis foram testadas como descrito acima. Uma resposta de PCR positiva foi encontrada em 27 destas cepas. Os exemplos de cepas adicionais publicamente disponíveis de Bacillus licheniformis descobertos serem positivos em L12 têm os seguintes números de depósito: NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689, ATCC 53757. NCTC é a National Collection of Type Cultures. ATCC é a American Type Culture Collection. NCIMB é a National Collection of Industrial, Marine and Food Bactéria.

Exemplo 7: Termoestabilidade

A Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foi usada para determinar a estabilidade da temperatura da proteína L12 no pH 2,5, 4,0 e 7,0. L12 purificado em uma concentração de cerca de 2 mg/ml foi dialisado durante a noite a 4o C contra tampão apropriado e conduzido em um instrumento VP-DSC (MicroCal) com uma razão de varredura constante de 1,5° C/min de 20 a 90° C. o manuseio dos dados foi realizado usando o software MicroCal Origin (versão 4.10) e a temperatura de desnaturação foi definida como a temperatura no ápice do pico de entalpia. Em 10 mM de ácido cítrico, 50 mM de cloreto de sódio, pH 2,5, L12 verificou-se ter uma temperatura de desnaturação de 55° C. Em 10 mM de acetato de sódio, 50 mM de NaCl, pH 4,0, L12 desnaturou a 69° C e em 10 mM de fosfato de sódio, 50 mM de NaCl, pH 7,0 a temperatura de desnaturação foi de 60° C. Exemplo 8: Modulação da microflora intestinal in vivo e in vitro

A influência da proteína L12 sobre a microflora intestinal foi avaliada a) in vivo, em leitões e frangos; e b) in vitro, em microorganismosisolados da microflora intestinal.

Estudo de Leitão

Este estudo, que foi realizado de acordo com as regulamentações legais francesas sobre experimentos com animais vivos, foi realizado para avaliar o efeito de 5 ppm de L12 (5 mg de L12 purificado por kg de ração) na microflora intestinal de leitões.

Dez leitões (híbridos de Large-White, Landrace e Piêtrain, obtidos da GAEC Leclerc, Ostheim, França) de um peso corporal inicial de 25,3 ±1,3 kg foram submetidos a uma anastomose íleo-retal (conectando o íleo terminal à extremidade do reto, desviando o ceco e o cólon). Em tais porcos, a microflora do íleo terminal pode ser coletada ao nível do ânus e é representativa da população bacteriana de todas as partes digestivas consecutivas dos intestinos. Depois da cirurgia, durante a recuperação da cirurgia e durante o período experimental os animais foram colocados em gaiolas metabólicas permitindo uma amostragem fácil dos conteúdos íleo-retais.

Durante o período experimental de seis semanas, os leitões foram alimentados cada um e alternativamente (em um planejamento de quadrado latino duplo, para reduzir o efeito da variação individual e também qualquer influência potencial da seqüência dos tratamentos) uma dieta basal suplementada ou não com os compostos de teste, as dietas foram compostas como segue:

Dieta A: KLIBA, disponível da Provimi-Kliba, Kaiseraugst, Suíça, com 18% de farinha de soja, 53% de milho, 13% de cevada, 6% de farinha de aveia, 5,4% de farelo de trigo, 1% de óleo de soja, 3,6% de minerais, vitaminas e aminoácidos sintéticos (p/p).

Dieta E: Dieta A com a adição de 5 mg/kg da proteína LI2.

As Dietas B, C e D incluíram outros compostos de teste sem nenhuma relevância para a presente invenção.Os compostos de teste (incluindo LI2) foram incorporados nas dietas em um misturador de Buhler (Buhler, Aschwill, Suíça). As dietas experimentais foram preparadas e administradas aos animais em uma forma pastosa.

As dietas experimentais foram deixadas para os animais no nível de 2 kg por dia distribuídos em duas farinhas iguais às 8:00 e 15:30.

Os conteúdos íleo-retais foram amostrados a partir de cada animal nos dois últimos dias de cada período de tratamento e as concentrações de matéria seca e dos constituintes diferentes da microflora foram determinados.

Os animais não mostram quaisquer sintomas de toxicose ou de enfermidade durante o experimento. Seu ganho de peso diário durante a observação foi de 1,14 ± 0,1 kg que é um desempenho zootécnico muito bom. No final dos experimentos os animais foram eutanizados por injeção letal depois da tranquilização.

Os conteúdos de matéria seca das amostras foram determinados depois da secagem durante a noite a 105° C, 1 g de amostra, de acordo com o procedimento padrão da Association of Official Analytical Chemists (AOAC) (1009) (Association of Official Analytical Chemists. (1990). (Official methods of analysis. 15a edição. Association of Official Analytical Chemists. Arlington).

A análise da microflora foi realizada como segue:

Imediatamente depois da emissão, 10 g de conteúdos íleo-retais foram transferidos e homogeneizados em frascos contendo 100 ml de caldo de cloreto de sódio peptona (Merck, Darmstadt, Alemanha, catálogo no. 10582). Menos do que 5 min passados entre as emissões e a remoção dos conteúdos íleos que foram rapidamente transferidos para uma câmara anaeróbica (AES Cheminex, Combourg, França). Subseqüentemente, as amostras foram diluídas em série em etapas de 10 vezes usando caldo decloreto de sódio peptona de IO'1 a IO"8 (p/vol). Todas as contagens bacterianas foram obtidas com duas placas duplicadas.

As contagens anaeróbicas facultativas totais representam o número médio de colônias que cresceram em Brucella ágar (Merck, Darmstadt, Alemanha, catálogo no. 10490) suplementado com sangue de ovelha (5% vol/vol, fornecido pela AES Cheminex, Combourg, França). As placas foram incubadas em uma cabine anaeróbica a 37° C durante 5 dias.

As bactérias de ácido láctico foram enumerados em MRS ágar (Merck, Darmstadt, Alemanha, catálogo no. 110660) e LactoBacillus spp. em Rogosa ágar (Merck, Darmstadt, Alemanha, catálogo no. 105413). Ambas as placas foram incubadas em uma cabine anaeróbica a 37° C durante 48 horas.

As Enterobacteriaceae foram contadas em V.R.B.D ágar (Merck, Darmstadt, Alemanha, catálogo no. 110275). Escherichia coli e outras Enterobacteriaceae foram analisadas em um meio cromogênico Coli-ID (BioMerieux, Marcy PEtoile, França, catálogo no. 42017). Este meio contém dois substratos cromogênicos: Um para a detecção de beta-D-glicuronidase (E. coli) que produz colônias rosas e um para a detecção de galactosidase (outra Enterobacteriaceae) que produz colônias azuis. Ambas as placas foram incubadas aerobicamente a 37° C durante 24 horas.

Enterococcus spp. foram avaliados em Enterococo ágar (Merck, Darmstadt, Alemanha, catálogo no. 65009) e Staphilococcus spp. em Baird Parker ágar (AES Cheminex, Combourg, França, catálogo no. AEB150302) depois da incubação aeróbica a 37° C durante 48 horas.

Depois de aquecer a amostra em um banho de água a 80° C durante 10 min, Clostridium perfringens foi isolado usando TSN ágar (BioMerieux, Marcy 1'Etoile, França, catálogo n° 51048) incubado em uma câmara anaeróbica a 46° C durante 24 horas.

As identidades de colônias representativas foram além disso confirmadas pela examinação microscópica depois do tingimento de Gram e oteste bioquímico usando o sistema API apropriado (BioMárieux, Marcy 1'Etoile, França).

Para cada grupo de teste, a análise estatística dos dados envolvidos no cálculo da média e desvio padrão da média assim como uma análise de variação seguida pelo teste "t" de Student para avaliar a significância de diferenças inter-grupo.

As respectivas contagens bacterianas (número de unidades formadoras de colônia (CFU) por grama de conteúdo íleo de matéria seca (DM), ± o desvio padrão (SD) são apresentados na Tabela 3 abaixo, que também mostra a melhora nas respectivas contagens bacterianas causadas pela adição de 5 ppm de LI2, em relação ao controle.

Tabela 3: Teor bacteriano da microflora íleo-retal de leitões

<table>table see original document page 67</column></row><table>bacterianas foram encontradas, apenas efeitos numéricos foram observados, mas algumas vezes eles foram muito fortes.

Um efeito positivo de L12 foi observado na média de bactérias anaeróbicas facultativas totais, onde as contagens foram aumentadas em 49% em relação ao controle.

Um efeito neutro de L12 foi observado nas bactérias de ácido láctico totais e LactoBacillus spp. totais, que são representativos das bactérias benéficas do microbiota intestinal. O mesmo é o caso para a Enterobacteriaceae total. O componente principal da população de Enterobacteriaceae na microflora de leitão, Escherichia coli, foi aumentada em 19% ao passo que o grupo de outras Enterobacteriaceae (outras que não E.coli) que são potencialmente patogênicas foi fortemente reduzida.

Um efeito negativo de L12 foi observado na população de Enterococcus spp.

Clostridium perfringens foi verificado em treze das vinte amostras de controle (Dieta A), ao passo que a mesma foi encontrada apenas em seis das vinte amostras com dieta suplementada por L12 (Dieta E). Esta população de bactérias patogênicas foi portanto fortemente reduzida (em 99%) com LI2.

Estudo de frango

No teste de crescimento de frango descrito no Exemplo 5, o efeito de L12 (5 mg de L12 purificado por kg de ração) na microflora intestinal de frango também foi avaliada.

A análise da microflora de doze animais por grupo foi realizada como descrito acima (o estudo de leitão), usado o conteúdo fecal, depois do sacrifício do frango, como material de partida.

Os resultados das contagens da população bacteriana nos conteúdos cecais do frango são mostrados na Tabela 4.Tabela 4: Teor bacteriano da microflora cecal de frango

<table>table see original document page 69</column></row><table>

Um efeito positivo de L12 foi observado na flora anaeróbica facultativa total que aumentou de modo estatisticamente signifícante em 178%.

Esta variação pode ser explicada pelo aumento (numérico) observado de bactérias do ácido láctico total observadas no grupo suplementado com LI2. As bactérias do ácido láctico totais representam a população principal da flora anaeróbica facultativa total e são compostas principalmente de espécies de LactoBacillus que desempenham um papel importante nos benefícios comunicados pelos microbiotas normais para a saúde do hospedeiro.

As contagens de Escherichia coli foram numericamente, mas não estatisticamente significantes, aumentaram no grupo suplementado com LI2. Isto é compatível com o aumento nas contagens de outros dois grupos de microorganismos. Todos os animais envolvidos neste experimento tiveram a microflora cecal saudável e equilibrada e nenhuma doença diarréica nos animais foi observada durante o teste, sugerindo que foram as cepas de Escherichia coli comensais que podem ter sido aumentadas. Modulação da microflora intestinal in vitro

O efeito de L12 sobre a microflora foi ainda avaliado in vitro. As bactérias representativas de microorganismos benéficos e nocivos dos microbiotas intestinais foram isolados dos conteúdos intestinais de leitão efrango. As suas identidades foram confirmadas pela examinação microscópica depois do tingimento de Gram e teste bioquímico usando o sistema API apropriado (BioMOrieux, Marcy 1'Etoile, França).

O efeito de L12 sobre o crescimento bacteriano destas bactérias foi determinado pelo método da diluição de caldo de micro título medindo a absorbância a 595 nm. Todos estes ensaios in vitro foram realizados em placas de 96 reservatórios esterilizada (placas de microtítulo Falcon 353072, Becton Dickinson Labware, Meilan, França) em um volume final de 110 microlitros como segue: 100 microlitros de suspensão contendo aproximadamente 105 CFU/ml das bactérias puras em caldo de soja tríptico (Merck, Darmstadt, Alemanha, catálogo no. 105459) foram adicionados a 10 microlitros de água contendo L12 em diluições de 2 vezes em série ou a 10 microlitros de água como controle. A inibição de crescimento foi determinada medindo-se a absorbância a 595 nm com um Multiskan Ascent (ThermoLabsystems, Helsinki, Finlândia) depois do tempo apropriado de incubação na temperatura apropriada para o crescimento ótimo das bactérias puras, ver a Tabela 5.

Tabela 5: Condições de incubação

<table>table see original document page 70</column></row><table>

A redução na densidade da cultura foi determinada subtraindo-se a OD595 da cultura de teste depois de 24 ou 48 horas (de acordo com a Tabela 5) da OD595 da cultura de controle. A redução na densidade da cultura foi normalizada expressando-a como uma porcentagem da OD595 da cultura decontrole e da MIC90 correspondeu à concentração de L12 requerida para reduzir a densidade da cultura em 90%, que significa inibir o crescimento de 90% dos organismos testados (MIC90 sendo definido como a Concentração Inibidora Mínima requerida para inibir o crescimento de 90% dos organismos).

Os resultados destas avaliações são mostrados na Tabela 6. Tabela 6: MlCon contra bactérias isoladas de conteúdo intestinal de leitão e frango.

<table>table see original document page 71</column></row><table>

L12 é mais ativo contra cocos Gram positivos e clostridiaisolados de conteúdos de porco e frango do que as bactérias Gram negativas isoladas dos mesmos.

Estes resultados pelo menos parcialmente explicaram a influência de L12 sobre os microbiotas gastro-intestinais:

O efeito observado de L12 in vitro sobre Enterococcus faecalise Enterococcus faecium confirmaram a redução observada em Enterococcus spp. observada in vivo em leitões.

O efeito observado de L12 in vitro nas espécies de LactoBacillus confirmaram a descoberta dos estudos in vivo de leitão e frango que o L12 não tem nenhuma influência negativa in vivo sobre as espécies de LactoBacillus do suíno e aves domésticas.

O efeito observado de L12 in vitro sobre Clostridium perfringens isolado do conteúdo intestinal de frango confirmou a forte redução desta população observada in vivo em leitões.

Exemplo 9: Desempenho em ração de animal in vivo (teste de gaiola) -várias dosagens

O desempenho da proteína L12 em ração de animal foi avaliada em um teste de crescimento de frango com os seguintes parâmetros:

Teste de crescimento: Dia 8 ao dia 29 (dia 0 = dia do choco)

Tratamentos: A: Controle; B: 2,5, 5,0 e 7,5 mg de proteína L12 purificada por kg de ração

Dietas: Dieta de milho / SBM48 (ver composição de ração, Tabela 7)

Depois de misturar a ração foi pelotizada em cerca de 70° C (3 x 25 mM). A proteína L12 foi dissolvida em 500 ml de água e pulverizada sobre as pelotas. Para o tratamento de controle a mesma quantidade de água foi pulverizada sobre as pelotas.

Réplicas: 10 grupos de 6 frangos machos, ROSS PM3, por tratamento

Alimentação: Pelotas ad libitum

Tabela 7: Composição de ração da dieta experimental <table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>

TÍO2 como marcador indigerível foi incluído na mistura de ração 2 Comercialmente disponível da DSM Nutritional Products NV, Dorpsstraat 4,

B-9800 Deinze, Bélgica, e incluindo Lasalocid Sódico

3 Calculado com a equação EC (EEC (1986) Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la mêthode de calcul de la valeur enêrgetique des aliments composes destines a la volaille; Journal Officiel des Communautes Europeennes, L 130, 53-54)

5 Farinha de soja, resíduos da fabricação do óleo, matéria-prima para gêneros alimentícios; disponível da Moulin Moderne Hirsinque, Hirsinque, França

Tabela 8: Desempenho de frangos machos; média ± desvio padrão

<table>table see original document page 73</column></row><table>Teste de Newman-Keuls: A média dentro de uma fileira, que não compartilham um sobrescrito comum, são significantemente diferentes (p < 0,05)

Exemplo 10: Determinação de concentração

Uma preparação de proteína L12 purificada foi usada como um padrão de proteína LI2. A mesma foi preparada como descrito no Exemplo 4 e foi formulada com glicerol como descrito no Exemplo 2. A pureza foi acima de 96%, como medido pela HPLC (usando um módulo de separação Waters 2690 e um detector de UV Waters 2487, que detecta a 280 nm, usando colunas ACE Cl8 5 um 100A 150 x 3,0 mM e Waters p-Bondapak Cl8 20 x 3,9 mM (coluna de proteção), uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min, um volume de injeção de 10 microlitros, fase móvel A: H20 18 MQ + 0,1% de TF A (Ácido Tri-Fluoro Acético), fase móvel B Acetonitrila + 0,1% de TF A).

A concentração de LI2 do padrão foi 3,6 mg de proteína pura/ml, como determinada pela Análise de Aminoácido (como descrito abaixo).

A pureza e concentração de várias outras amostras L12 foram determinadas por um método em gel de SDS-PAGE como também descrito abaixo, por referência ao seu padrão.

Análise de Aminoácido (AAA) - concentração de padrão de proteína L12

As ligações de peptídeo da amostra de padrão de proteína L12 foram submetidas à hidrólise ácida, seguida pela separação e quantificação dos aminoácidos liberados em um Analisador de Aminoácido Biochrom 20 Plus, comercialmente disponível da Bie & Berntsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Dinamarca, de acordo com as instruções do fabricante. Para a hidrólise ácida, a amostra de proteína foi secada em uma centrífuga a vácuo, dissolvida em 18,5% (vol/vol) de HC1 + 0,1% (vol/vol) de fenol e incubada por 16 horas a 110° C. Depois da incubação, a amostra foinovamente secada na centrífuga a vácuo, dissolvida em tampão de carga (0,2 M de Na-Citrato, pH 2,2) e carregada no Analisador de Aminoácido Biochrom 20 Plus.

Para a quantificação, a amostra hidrolisada foi carregada em uma coluna da resina de troca catiônica UltroPac no. 8, forma Sódica, que é comercialmente disponível da Bie & Berntsen A/S, catálogo no. 80-2104-15. Os tampões de pH variável (pH 1 a pH 8) e concentração iônica foram bombeada através da coluna de acordo com as instruções do fabricante aludido acima, para separar os vários aminoácidos. A temperatura da coluna foi acuradamente controlada, também de acordo com as instruções do fabricante (de 53° C a 92° C e de volta para 53° C) de modo a garantir a separação requerida. O eluente da coluna foi misturado com reagente de ninhidrina (Bie & Berntsen, catálogo no. 80-2038-07) e a mistura passada através da espiral de reação em alta temperatura do Analisador de Aminoácido. Na espiral de reação, a ninhidrina reagiu com os aminoácidos para formar compostos coloridos, a quantidade dos quais foi diretamente proporcional à quantidade de aminoácido presente.

Concentração de amostras de proteína L12

A concentração de várias amostras L12 foi determinada pelos seguintes procedimentos (todos os produtos Novex aludidos são comercialmente disponíveis da Invitrogen, ver www.invitrogen.com):

50 microlitros de solução de LI2 (0,1 a 1,0 mg de LI2 por ml) foram misturados com 5 microlitros de EDTA a 1% (p/v) + 10 microlitros de PMSF a 6% + 10 microlitros de DTT 0,5 M + 25 microlitros de tampão de amostra NuPage LDS (NP0007 da NOVEX) em um tubo de Eppendorf e o tubo foi aquecido a 95° C por 5 minutos. 10 microlitros de amostra foram aplicados a um gel de pré moldagem de Tris-Bis a 10% (NP0301 BOX da NOVEX). A eletroforese foi realizada com um tampão de condução MES (MÊS = ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; NP0002 da NOVEX) +antioxidante (NP0005 da NOVEX) a uma voltagem constante de 200 V de acordo com as instruções do fabricante. Depois da eletroforese, o gel foi suavemente agitado em ácido acético a 10% + 50% de EtOH por 10 minutos. O gel foi depois suavemente agitado com solução de tingimento de Azul Coloidal (46-7016 da NOVEX) por mínimo de três horas e lavado agitando-se suavemente por 2 a 4 horas com água destilada com diversas mudanças de água destilada. O gel úmido foi escaneado com um Densitômetro Calibrado BioRad GS-800 equipado com o software Quantity One (versão 4.6.0, BioRad) e a proteína L12 foi quantificada de acordo com as instruções do fabricante. O padrão de LI2 descrito acima foi usado como um padrão, a saber em três a quatro diluições dentro da faixa de 0,1 a 1,0 mg/ml.

Exemplo 11: Estabilidade para pepsina e pancreatina

L12 Nativa: Proteína LI2 purificada, diluída a 1 mg/ml em 10 mM de tampão de Tris/CH3COOH pH 4,5.

L12 desnaturada: Uma amostra de L12 purificada (1 mg/ml em 10 mM de tampão de Tris/CH3COOH pH 4,5) foi fervida por 5 minutos de modo a desnaturar a proteína.

Pepsina: Pepsina porcina (Sigma P-7000, 453 unidades/mg de sólido). 30000 unidades/ml foram dissolvidas em 10 mM de ácido succínico pH 3,0.

Pancreatina: Pancreatina porcina (Sigma P-7545, 8 x USP). 80 mg/ml foram colocados em suspensão em 0,5 M de tampão de Na-fosfato pH 7,0.

Tampão de pH 3: 10 mM de ácido succínico pH 3,0.

Tampão de pH 7: 0,5 M de tampão de Na-fosfato pH 7,0. As seguintes amostras foram preparadas:

l) L12 incubada com Pepsina e Pancreatina 278 microlitros de L12 nativa ou desnaturada + 100 microlitros de solução de pepsina +122 microlitros de tampão de pH 3 foramincubados por 2 horas a 40° C com agitação, o pH foi medido a 3,5. Depois 400 microlitros de tampão de pH 7 + 100 microlitros de suspensão de pancreatina foram adicionados e seguidos pela incubação por 4 horas a 40° C com agitação, o pH foi medido a 7,0.

2) L12 incubada com Pepsina

278 microlitros de L12 nativa ou desnaturada + 100 microlitros de solução de pepsina + 122 microlitros de tampão de pH 3 foram incubados por 2 horas a 40° C com agitação (o pH 3,5 foi medido). Depois 500 microlitros de tampão de pH 7 foram adicionados (o pH 7,0 foi medido).

3) L12 incubada com Pancreatina

278 microlitros de L12 nativo ou desnaturado + 222 microlitros de tampão de pH 3 foram incubados por 2 horas a 40° C com agitação. Depois 400 microlitros de tampão de pH 7+100 microlitros de suspensão de pancreatina foram adicionados e seguidos pela incubação por 4 horas a 40° C com agitação.

4) Amostra de controle de L12

278 microlitros de L12 nativo ou desnaturado + 100 microlitros de solução de pepsina +122 microlitros de tampão de pH 3 + 400 microlitros de tampão de pH 7 + 100 microlitros de suspensão de pancreatina foram misturados em gelo e mantidos frio.

5) Amostra de controle de Pepsina

100 microlitros de solução de pepsina + 400 microlitros de tampão de pH 3 foram incubados por 2 horas a 40° C com agitação (o pH 3,5 foi medido). Depois 500 microlitros de tampão de pH 7 foram adicionados.

6) Amostra de controle de pancreatina

500 microlitros de tampão de pH 3 + 400 microlitros de tampão de pH 7+100 microlitros de suspensão de pancreatina foram incubados por 4 horas a 40° C com agitação (o pH 7,0 foi medido).7) amostra de controle de Pepsina + Pancreatina 100 microlitros de solução de pepsina + 400 microlitros de tampão de pH 3 foram incubados por 2 horas a 40° C com agitação (o pH 3,5 foi medido). Depois 400 microlitros de tampão de pH 7 + 100 microlitros de suspensão de pancreatina foram adicionados e seguidos pela incubação por 4 horas a 40° C com agitação (o pH 7,0 foi medido).

Todas as amostras foram analisadas pela SDS-PAGE como descrito no Exemplo 10. Julgada pela SDS-PAGE, a L12 nativa não foi degradada pelo tratamento com pepsina, pancreatina ou pepsina seguida pela pancreatina. A L12 desnaturada foi extensivamente degradada pelo tratamento com pepsina, pancreatina ou pepsina seguida pela pancreatina visto que nenhuma faixa de L12 foi detectável no gel de SDS nas amostras correspondentes.

Exemplo 12: Desempenho de ração de animal in vivo (teste do galinheiro)

Este exemplo avalia os efeitos da proteína L12 sobre o desempenho de crescimento de frangos em um ciclo de crescimento completo de 36 dias.

Um teste de desempenho de crescimento com frangos foi realizados do dia 1 ao dia 36.

Os animais foram alojados em chiqueiros com cama de serragem. Durante o período iniciador (dias 1 a 22) e durante o período de crescimento (dia 22 a 36) os frangos receberam uma dieta com base em farinha de trigo, centeio e soja (composição ver a Tabela 9). Além de um tratamento de controle não suplementado, a proteína L12 foi incluída em uma dosagem de 7,5 mg de proteína por kg de ração.

Teste de crescimento: Dia 1 ao dia 36 (dia 0 = dia do choco)

Dietas: Dieta de trigo / centeio / SBM48 (ver a composição de ração na Tabela 9)

Alimentação: Pelotas ad libitumDepois de misturar, a ração foi pelotizada a cerca de 70° C (3 x 25 mM). A proteína L12 foi dissolvida em 800 ml de água para a ração iniciadora e 1200 ml de água para a ração de crescimento, respectivamente e pulverizada sobre as pelotas. Para o tratamento de controle a mesma quantidade de água sem a proteína L12 foi pulverizada sobre as pelotas, respectivamente.

Tratamentos: Controle, 7,5 mg de proteína L12 por kg de ração

Réplicas: 6 grupos de 20 frangos por sexo e tratamento (6 grupos de 20 fêmeas, 6 grupos de 20 machos)

Tabela 9: Composição de ração da dieta experimental

<table>table see original document page 79</column></row><table>

1 Ti02 como marcador indigerível foi incluído na mistura de ração

3 Calculado com a equação EC (EEC (1986) Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la mêthode de calcul de la valeur energetique des aliments composes destines a la volaille; Journal Officiel des Communaute's Européennes, L 130, 53-54)4 Matéria-prima para gêneros alimentícios; disponível da Moulin Moderne Hirsinque, Hirsingue, França

5 Farinha de soja, resíduos da fabricação do óleo, matéria-prima para gêneros alimentícios; disponível da Moulin Moderne Hirsinque, Hirsinque, França Tabela 10: Desempenho de frangos; média ± desvio padrão

<table>table see original document page 80</column></row><table>

Teste de Newman-Keuls: Média dentro de uma fileira, que não compartilha um sobrescrito comum, são significantemente diferentes (p < 0,05)

* uma gaiola excluída devido a problemas técnicos A proteína L12 melhorou o ganho de peso dos frangos levemente (Tabela 10), entretanto este efeito não foi significante. A ingestão de ração dos frangos que receberam a proteína L12 não foi diferente daquela dos frangos de controle. A Taxa de Conversão de Ração (FCR) foi significantemente melhorada pela proteína L12 comparada ao controle, a saber em 2,7%.

Exemplo 13: Ração de animal e aditivo

Aditivo de Ração de Animal

Um aditivo de ração de animal é preparado adicionando-se 25 g de um granulado T revestido compreendendo a proteína L12 purificada em uma quantidade de 20 g/kg (preparada como descrito no Exemplo 3 da EP569468 BI, entretanto com um revestimento de aprox. 7% de óleo de palma hidrogenado e aprox. 13% de CaC03) às seguintes pré misturas (por quilo de pré mistura):

1100000 IE de Vitamina A

300000 IE de Vitamina D3

4000 IE de Vitamina E

250 mg de Vitamina BI

800 mg de Vitamina B2

1200 mg de Ca-D-Pantotenato

500 mg de Vitamina B6

2,5 mg de Vitamina B12

5000 mg de Niacina

10000 mg de Vitamina C

300 mg de Vitamina K3

15 mg de Biotina

150 mg de Ácido fólico

50004 mg de Cloreto de colina

6000 mg de Fe 3000 mg de Cu

5400 mg de Zn 8000 mg de Mn

124 mg de I

60 mg de Co

29,7 mg de Se

9000 mg de Lasalocid Sódico (Avatec)

17,3% de Ca

0,8% de Mg

11,7% de NaRação de animal

Uma dieta de desenvolvedora de frango tendo a seguinte composição (%, p/p) é preparada misturando-se os ingredientes. Trigo, centeio e SBM 48 são disponíveis da Moulin Moderne Hirsinque, Hirsinaue. França. Depois de misturar a ração é pelotizada em uma temperatura desejada, por exemplo, de cerca de 70° C (3 x 25 mM).

Trigo 46,00

Centeio 15,00

Farinha de feijão de soja (SBM 48) 30,73

Óleo de soja 4,90

DL-Metionina 0,04

DCP (Fosfato de Di-Cálcio) 1,65

Calcário 0,43

Sal 0,15

Ti02 0,10

Aditivo de ração de animal (acima) 1,00

A ração de animal resultante compreende 5,0 mg de proteína L12 purificada por kg (5 ppm).

As composições de ração de animal e aditivo de ração adicionais são preparadas da mesma maneira, entretanto substituindo 25 g de granulado de L12 CT revestido por kg da pré mistura com 1018 Unidades Formadoras de Colônia (CFU), preferivelmente na forma de endosporos, de Bacillus licheniformis ATCC 14580, que resulta em uma ração de animal com aproximadamente 108 CFU por g da composição de ração.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Novozymes A/S

<120> Polypeptides

<130> 10799.204-WO

<160> 10

<170> Patentln Versão 3.3

<210> 1

<211> 381

<212> DNA

<213> Bacillus licheniforais ATCC 14580

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(378)

<220>

<221> mat_peptideo <222> (124)..(378)

<400> 1

atg aaa aat cat ttg tat gag aaa aaa aag agg aaa cct ttg act cgg 48

Met Lys Asn His Leu Tyr Glu Lys Lys Lys Arg Lys Pro Leu Thr Arg -40 -35 -30

aca att aaa gcg acg etc gcc gtg ttg Thr lie Lys Ala Thr Leu Ala Vai Leu -25 -20

gga ggc gct acg gtg cct tca ttt gea Gly Gly Ala Thr Vai Pro Ser Phe Ala -5 -1

tac cag tac cca tcg gaa ggt ggt aca Tyr Gln Tyr Pro Ser Glu Gly Gly Thr 10 15

aca atg tec ate gct ttg gtg 96 Thr Met Ser lie Ala Leu Vai -15 -10

tgg gtg aat ceg ggt tat cac 144 Trp Vai Asn Pro Gly Tyr His 1 5

tgg agg tat gga ttc gta aac 192 Trp Arg Tyr Gly Phe Vai Asn 20

gcc ggg etc cgt tca gag tac aac cac ceg aca aag gtc cac ggc tcg 240

Ala Gly Leu Arg Ser Glu Tyr Asn His Pro Thr Lys Vai His Gly Ser 25 30 35

aca gtg caa aag etc ate gat gga aaa gtg gat aaa acg aat aga agt 288

Thr Vai Gln Lys Leu lie Asp Gly Lys Vai Asp Lys Thr Asn Arg Ser 40 45 50 55

att gat acg gct gcg ggc cgc tac tct aat gcc tat gtc gga gcc ata 336

lie Asp Thr Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Asn Ala Tyr Vai Gly Ala lie 60 65 70

aac tca cct ggt ctt aag ggt cgt tac tac tat cgc acc aac taa 381 Asn Ser Pro Gly Leu Lys Gly Arg Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asn 75 80 85

<210> 2 <211> 126 <212> PRT<213> Bacillus licheniformis ATCC 14580 <400> 2

Met Lys Asn His Leu Tyr Glu Lys Lys Lys Arg Lys Pro Leu Thr Arg -40 -35 -30

Thr Ile Lys Ala Thr Leu Ala Vai Leu Thr Met Ser Ile Ala Leu Vai -25 -20 -15 -10

Gly Gly Ala Thr Vai Pro Ser Phe Ala Trp Vai Asn Pro Gly Tyr His -5 -11 5

Tyr Gln Tyr Pro Ser Glu Gly Gly Thr Trp Arg Tyr Gly Phe Vai Asn 10 15 20

Ala Gly Leu Arg Ser Glu Tyr Asn His Pro Thr Lys Vai His Gly Ser 25 30 35

Thr Vai Gln Lys Leu Ile Asp Gly Lys Vai Asp Lys Thr Asn Arg Ser 40 45 50 55

Ile Asp Thr Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Asn Ala Tyr Vai Gly Ala Ile 60 65 70

Asn Ser Pro Gly Leu Lys Gly Arg Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asn 75 80 85

<210> 3

<211> 1581

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<221> CDS

<222> (601).. (978)

<400> 3 gaattttccg gaagctgaaa cacccgtgat atatataacc ataaattaaa cagcataggc

ggattgtgcg agttcctcca cattcggagt atttctgaat gatagagcca cacggtccac

gttctcactg gctaaccgga tcaaatgatc ttcaggagtc agcataatac atccagttca

ggtagataag atttgaattt ggtgacttgc ttttgttctt cttctttcat tttctgacta

atccaaactg gaaaaagcag gtcttttaac agattaggag gtttctgaca tgcaccattc

ggtcactaac cgaatgcagt aaaggacact gtggtgcttg ccagccatta gggtattgag

gaggtgatca aaatgctagg tgacagtatt tcgtcgaagt ggacaagtcg tgaccaaatg

acctcggatc gagggttggt catggaggaa aaaattgatg tctggtgaca aagaggagtc

60 120 180 240 300 360 420 480atgatcatgg caccgccaac gagggaaaaa actcttcccg catcgacacg gtatgtgggc 540

ggtgacaaac taacttatag agtaaattta ttagtcgaat gaaagaggag gaatgaaata 600

atg aaa aat cat ttg tat gag aaa aaa aag agg aaa cct ttg act cgg 648 Met Lys Asn His Leu Tyr Glu Lys Lys Lys Arg Lys Pro Leu Thr Arg 15 10 15

aca att aaa gcg acg etc gcc gtg ttg aca atg tec ate gct ttg gtg 696 Thr lie Lys Ala Thr Leu Ala Vai Leu Thr Met Ser lie Ala Leu Vai 20 25 30

gga ggc gct acg gtg cct tca ttt gea tgg gtg aat ceg ggt tat cac 744 Gly Gly Ala Thr Vai Pro Ser Phe Ala Trp Vai Asn Pro Gly Tyr His 35 40 45

tac cag tac cca tcg gaa ggt ggt aca tgg agg tat gga ttc gta aac 792 Tyr Gln Tyr Pro Ser Glu Gly Gly Thr Trp Arg Tyr Gly Phe Vai Asn 50 55 60

gcc ggg etc cgt tca gag tac aac cac ceg aca aag gtc cac ggc tcg 840 Ala Gly Leu Arg Ser Glu Tyr Asn His Pro Thr Lys Vai His Gly Ser 65 70 75 80

aca gtg caa aag etc ate gat gga aaa gtg gat aaa acg aat aga agt 888 Thr Vai Gln Lys Leu lie Asp Gly Lys Vai Asp Lys Thr Asn Arg Ser 85 90 95

att gat acg gct gcg ggc ego tac tet aat gcc tat gtc gga gcc ata 936 lie Asp Thr Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Asn Ala Tyr Vai Gly Ala lie 100 105 110

aac tca cct ggt ctt aag ggt cgt tac tac tat cgc acc aac 978 Asn Ser Pro Gly Leu Lys Gly Arg Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asn 115 120 125

taatcaaagg gaaaacggtt gctgtcaacg gggctagcat ggcaagaccc agaaaagttc 1038

tgggagatcc cgctttgcat aagcgtatta tagtggatga cgcgggcttt gttgtttaca 1098

cttcttgcac ctgctgacgg caatcatccc tatctatgaa ategagattt cagcaggccg 1158

ttattttcga gagagttaaa tetatattea ttgtttttat tttggtaagg acataccgga 1218

ttttaggttt ggattaccgg tcgagttagc ttgtcttttc gcccactacc gtgtcgatgc 1278

gggagcaatt taccagaagc acttaccgat tgatagtttt ttattccggt gattgcaaag 1338

tttcataaac tctgagaatt caataggggt aataccccgc tttgaggggc gcggcatttt 1398

atgcgccccg agtatttatt cttaaaattt ttaaattaat gtatctatat aaaaaggaga 1458

tgctttcggt gtactgccaa agcatctcca caaaagatag tgcatatctg caggaaaaaa 1518

cataaaatgc aactaacatt tttttggaaa gcaataggtt tatttaattt tgtagtttta 1578

tet 1581

<210> 4

<211> 126

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis<400> 4

Met Lys Asn His Leu Tyr Glu Lys Lys Lys Arg Lys Pro Leu Thr Arg 15 10 15

Thr lie Lys Ala Thr Leu Ala Vai Leu Thr Met Ser lie Ala Leu Vai 20 25 30

Gly Gly Ala Thr Vai Pro Ser Phe Ala Trp Vai Asn Pro Gly Tyr His 35 40 45

Tyr Gln Tyr Pro Ser Glu Gly Gly Thr Trp Arg Tyr Gly Phe Vai Asn 50 55 60

Ala Gly Leu Arg Ser Glu Tyr Asn His Pro Thr Lys Vai His Gly Ser 65 70 75 80

Thr Vai Gln Lys Leu lie Asp Gly Lys Vai Asp Lys Thr Asn Arg Ser 85 90 95

lie Asp Thr Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Asn Ala Tyr Vai Gly Ala lie 100 105 110

Asn Ser Pro Gly Leu Lys Gly Arg Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asn 115 120 125

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis ATCC 14580

<220>

<221> MI SC_FE ATURE <223> N-terminal

<400> 5

Trp Vai Asn Pro Gly Tyr His Tyr Gln Tyr Pro Ser Glu Gly Gly 15 10 15

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador Pep 481

<220>

<221> misc_feature <223> Iniciador<400> 6

aattacgcgt gttggtgcga tagtagtaac g 31

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador Pep 482

<220>

<221> misc_feature <223> Iniciador

<400> 7

ttaagaattc gaatgaaaga ggaggaatg 29

<210> 8

<211> 125

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis strain 009

<220>

<221> mat_peptideo <222> (41)..(125)

<400> 8

Met Lys Asn Leu Leu Asn Lys Lys Lys Arg Lys Pro Leu Thr Arg Thr -40 -35 -30 -25

Ile Lys Ala Thr Phe Ala Vai Leu Thr Vai Ser Ile Gly Leu Vai Gly -20 -15 -10

Gly Ala Thr Vai Pro Ala Phe Ala Trp Vai Asn Pro Asp Tyr His Tyr -5 -11 5

Gln Tyr Pro Ser Glu Gly Gly Thr Trp Arg Tyr Gly Phe Vai Asn Leu 10 15 20

Gly Leu Arg Ser Glu Tyr Asn His Pro Lys Lys Vai His Gly Ser Thr 25 30 35 40

Vai Gln Lys Leu Ile Asp Gly Lys Vai Glu Lys Thr Asn Arg Ser Leu 45 50 55

Asp Thr Ala Pro Gly Arg Tyr Ser Asn Ala Tyr Vai Gly Vai Vai Asn 60 65 70

Ser Pro Gly Leu Lys Gly Arg Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asn75 80 85

<210> 9

<211> 126

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis strain 470

<220>

<221> mat_peptideo <222> (42)..(126)

<400> 9

Met Lys Asn Tyr Leu Tyr Glu Lys Lys Lys Arg Lys Pro Leu Thr Arg -40 -35 -30

Thr lie Lys Ala Thr Leu Ala Vai Leu Thr Met Ser lie Ala Leu Vai -25 -20 -15 -10

Gly Gly Ala Thr Vai Pro Ala Phe Ala Trp Vai Asn Pro Gly Tyr His -5 -11 5

Tyr Gln Tyr Pro Ser Glu Gly Gly Thr Trp Arg Tyr Gly Phe Vai Asn 10 15 20

Ala Gly Leu Arg Ser Glu Tyr Asn His Pro Thr Lys Vai His Gly Ser 25 30 35

Thr Vai Gln Lys Leu lie Asp Gly Lys Vai Asp Lys Thr Asn Arg Ser 40 45 50 55

lie Asp Thr Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Asn Ala Tyr Vai Gly Ala lie 60 65 70

Asn Ser Pro Gly Leu Lys Gly Arg Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asn 75 80 85

<210> 10

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de Consenso

<220>

<221> mat_peptideo

<222> (42)..(126)

<400> 10

Met Lys Asn His Leu Tyr Glu Lys Lys Lys Arg Lys Pro Leu Thr Arg-40 -35 -30

Thr lie Lys Ala Thr Leu Ala Vai Leu Thr Met Ser lie Ala Leu Vai -25 -20 -15 -10

Gly Gly Ala Thr Vai Pro Ala Phe Ala Trp Vai Asn Pro Gly Tyr His -5 -11 5

Tyr Gln Tyr Pro Ser Glu Gly Gly Thr Trp Arg Tyr Gly Phe Vai Asn 10 15 20

Ala Gly Leu Arg Ser Glu Tyr Asn His Pro Thr Lys Vai His Gly Ser 25 30 35

Thr Vai Gln Lys Leu lie Asp Gly Lys Vai Asp Lys Thr Asn Arg Ser 40 45 50 55

lie Asp Thr Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Asn Ala Tyr Vai Gly Ala lie 60 65 70

Asn Ser Pro Gly Leu Lys Gly Arg Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asn 75 80 85

Claims

1. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que éselecionado do grupo que consiste de:(a) um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácido que tem um grau de identidade aos aminoácidos de 1 a 85 da SEQID NO: 2 de pelo menos 33%;(b) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência deácido nucleico que hibridiza sob condições de baixa estringência com(i) nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1,(ii) uma subseqüência de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos, ou(iii) um filamento complementar de (i), ou (ii);(c) uma variante do polipeptídeo tendo uma seqüência deaminoácido dos aminoácidos de 1 a 85 da SEQ ID NO: 2 que compreendeuma substituição, deleção, extensão, e/ou inserção de um ou maisaminoácidos;(d) uma variante alélica de (a) ou (b); e(e) um fragmento de (a), (b), (c), ou (d);com a condição de que o polipeptídeo não é nenhum dos aminoácidos de 1 a 126 da SEQ ID NO: 4.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que melhora a utilização da ração animal pela melhora da Taxade Conversão de Alimento (FCR), e/ou pela modulação da microfloraintestinal.

3. Seqüência de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fatode que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codificapolipeptídeo, que(a) codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 1;(b) hibridiza sob condições de estringência muito baixas com(i) os nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1,(ii) uma subseqüência de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos, e/ou(iii) um filamento complementar de (i), ou (ii); e/ou(c) tem um grau de identidade com os nucleotídeos de 124 a 378 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 48%; com a condição de que aseqüência de ácido nucleico não é(iv) aSEQ ID NO: 3, e não(vi) os nucleotídeos de 601 a 978 da SEQ ID NO: 3, e não(vi) os nucleotídeos de 1 a 381 da SEQ ID NO: 1.

4. Seqüência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo de acordo com areivindicação 2.

5. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de quecompreende a seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 3 a 4 operavelmente ligado auma ou mais seqüências de controle que direcionam a produção dopolipeptídeo em uma célula hospedeira de Bacülus, célula hospedeira estacujo DNA, quando colhido e usado como um padrão de DNA em uma reaçãode PCR com as SEQ ID NOs: 6 e 7 como iniciadores, leva à geração de umfragmento de PCR de um tamanho de aproximadamente 0,4 kb.

6. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato deque compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 5.

7. Célula hospedeira de Bacülus recombinante, caracterizadapelo fato de que compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 5 ou o vetor como definido na reivindicação 6, célulahospedeira esta cujo DNA, quando colhido e usado como um padrão de DNAem uma reação de PCR com as SEQ ID NOs: 6 e 7 como iniciadores, leva àgeração de um fragmento de PCR de um tamanho de aproximadamente 0,4kb.

8. Método para produzir um polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de quecompreende (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante como definidona reivindicação 7 para produzir um sobrenadante que compreenda opolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

9. Método para produzir um polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 1 e 2, o método caracterizado pelo fato deque compreende (a) cultivar uma cepa de Bacillus, o DNA do qual, quandocolhido e usado como um padrão de DNA em uma reação de PCR com asSEQ ID NOs: 6 e 7 como iniciadores, leva à geração de um fragmento dePCR de um tamanho de aproximadamente 0,4 kb; e (b) recuperar opolipeptídeo.

10. Uso de i) um polipeptídeo tendo os aminoácidos de 1 a 126da SEQ ID NO: 4; e/ou ii) um polipeptídeo como definido em qualquer umadas reivindicações le 2, caracterizado pelo fato de ser em ração para animal.

11. Uso de i) um polipeptídeo tendo os aminoácidos de 1 a 126da SEQ ID NO: 4 e/ou ii) um polipeptídeo como definido em qualquer umadas reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de ser na preparação de umacomposição para o uso em ração para animal.

12. Método para melhorar a taxa de conversão de ração paraanimal (FCR), caracterizado pelo fato de que i) um polipeptídeo tendo osaminoácidos de 1 a 126 da SEQ ID NO: 4 e/ou ii) um polipeptídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, é adicionado à ração.

13. Método para modular a microflora intestinal de animal,caracterizado pelo fato de que i) um polipeptídeo tendo os aminoácidos de 1 a 126 da SEQ ID NO: 4 e/ou ii) um polipeptídeo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 e 2, são adicionados à ração.

14. Aditivo de ração para animal, caracterizado pelo fato deque compreende:(a) i) um polipeptídeo tendo os aminoácidos de 1 a 126 daSEQ ID NO: 4 e/ou ii) um polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 e 2; e(b) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura,(c) pelo menos vitamina solúvel em água,(d) pelo menos um traço de mineral, e/ou(e) pelo menos um mineral macro.

15. Composição de ração para animal, caracterizada pelo fatode que tem um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e que compreende i)um polipeptídeo tendo os aminoácidos de 1 a 126 da SEQ ID NO: 4 e/ou ii)um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 2.

16. Uso de uma cepa de Bacillus, cujo DNA, quando colhido eusado como um padrão de DNA em uma reação de PCR com as SEQ IDNOs: 6 e 7 como iniciadores, leva à geração de um fragmento de PCR de umtamanho de aproximadamente 0,4 kb, caracterizado pelo fato de ser em raçãopara animal

17.

18. Uso de uma cepa de Bacillus de acordo com areivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser na preparação de umacomposição para o uso em ração para animal.

19. Método para melhorar a taxa de conversão de ração (FCR),caracterizado pelo fato de que uma cepa de Bacillus como definido nareivindicação 16 é adicionada à ração para animal.

20. Método para modular a microflora intestinal, caracterizadopelo fato de que uma cepa de Bacillus como definida na reivindicação 16 éadicionada à ração para animal.

21. Aditivo de ração para animal, caracterizado pelo fato deque compreende(a) uma cepa de Bacillus como definida na reivindicação 16; e(b) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura,(c) pelo menos uma vitamina solúvel em água,(d) pelo menos um traço de mineral, e/ou(e) pelo menos um mineral macro.

22. Composição de ração para animal, caracterizada pelo fatode que têm um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e que compreende umacepa de Bacillus como definido na reivindicação 16.

23. Microorganismo, caracterizado pelo fato de ser Enterococcus faecalis DSM 18047.

24. Microorganismo, caracterizado pelo fato de ser LactoBacillus salivarius DSM 18070.