BRPI0609100A2 - conjugado para alvejamento de fármaco, método de produzir o referido conjugado, bem como composição contendo o mesmo - Google Patents

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Verena Gafner
Cornelia Halin
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Philogen Spa
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Abstract

CONJUGADO PARA ALVEJAMENTO DE FáRMACO, MéTODO DE PRODUZIR O REFERIDO CONJUGADO, BEM COMO COMPOSIçãO CONTENDO O MESMO. A presente invenção refere-se a um conjugado para alvejar agente ou fármaco terapêutico ou diagnóstico para células ou tecidos em um corpo, por exemplo, áreas de crescimento neoplástico ou angiogênese. Uso de conjugado para diagnose ou terapia ín vivo, por exemplo, inibindo crescimento de tumor ou metástase, inibindo angiogênese e/ou tratando câncer. O conjugado compreende agente terapêutico ou diagnóstico como proteína oligomérica, por exemplo, proteína heteroclimérica, em que as primeira e segunda subunidades de proteína são, cada uma, conjugadas com um membro de ligação específicos, por exemplo, um fragmento de anticorpo como scFv. Subunidades de oligómero podem ser conjugadas com membros de ligação específicos como proteínas de fusão. Conjugados podem compreender heterodímero de IL-12 tendo duas subunidades, cada subunidade fundida com L19 de scFv ou INII para alvejar IL-12 para componentes de matriz extracelular associados ao crescimento neoplástico ou angiogênese.

Description

A presenteinvenção refere-se ao alvejamento de um fármaco emum sítio in vivo desejado através de conjugação com um membro de ligação específico alvo-específico. A invenção é especialmente direcionada aos con-jugados entre moléculas de IL12 e de anticorpo para aplicações terapêuticascomo inibição de angiogenese patológica, incluindo tratamento de câncer eoutros tumores, artrite reumatóide, retinopatia diabética, degeneração mus-cular relacionada à idade e angiomas.
A interleucina-12 de citocina heterodimérica (IL12) é um media-
dor fundamental de imunidade inata e celular com atividade antitumor e an-timetastática potente [4-6]. Ela está correntemente (primavera de 2005) sen-do testada em experimentações clínicas de Fase II para o tratamento decâncer e doenças infecciosas. IL12 age primariamente em células T e NK,
estimulando sua atividade e a secreção de interferona-y (IFN-y) [7]. Comocom muitas outras citocinas, porém, a administração de IL12 humana re-combinante está associada à toxicidade severa, até mesmo em doses tãobaixas quanto 1 uxj/kg/dia [8, 9], impedindo seu desenvolvimento como umfármaco anticâncer.
Uma liberação alvejada de IL12 ao ambiente de tumor pode ser
usada para aumentar o índice terapêutico da citocina.
Cientistas em Lexigen descreveram a fusão de citocinas comoIL2 e IL12 com imunoglobulinas para especificamente alvejar a citocina [17,49-51]. Porém os inventores, acreditam que há limitações para tais métodos.
Reconhece-se que fusões de IgG-citocina são na realidade proteínas multi-funcionais, e assim além da atividade de ligação de antígeno e de citocina,estas proteínas de fusão com base em IgG podem ativar o complemento einteragir com receptores Fc. Em nossa opinião esta é uma propriedade índe-sejada das fusões de IgG-citocina, visto que as citocinas podem ser trazidas em proximidade das células (como macrófago, neutrófilos e células assassi-nas naturais) carregando receptores Fc, desse modo impedindo o alveja-mento do tumor e levando à ativação de células não-específicas. Conside-ra-se mais desejável usar uma molécula de anticorpo carecendo de Fc, co-mo um fragmento de anticorpo de Fv de cadeia simples (scFv), em vez daimunoglobulina total.
Previamente foi demonstrado em modelos roedores de câncer ' que o potencial terapêutico de IL12 pode ser aumentado consideravelmentefundindo um polipeptídeo de cadeia simples que seqüencialmente codificaas subunidades p40 e p35 da IL12 de citocina murina ("sclL12") com o frag-mento de anticorpo de Fv de cadeia simples humano L19 ("scFv(L19)").ScFv(L19) foi mostrado ser capaz de alvejamento tumor-seletivo em pacien-
tes com câncer [16]. L19 especificamente liga o domínio de ED-B da isofor-ma de fibronectina B-FN que é um dos melhores marcadores de angiogêne-se conhecidos [14, 25]. ED-B é um domínio extra de 91 aminoácidos encon-trados na isoforma de B-FN e é idêntico em camundongo, rato, coelho, ca-chorro e no homem. B-FN acumula-se ao redor das estruturas neovascula-
res em tumores agressivos e outros tecidos que sofrem angiogênese, comoo endométrio na fase proliferativa e algumas estruturas oculares em condi-ções patológicas, mas é do contrário indetectável em tecidos adultos nor-mais [1-3].
A proteína de fusão sclL12-scFv(L19) exibiu um índice terapêuti- co bem superior à sclL12 fundida com um scFv de especificidade irrelevanteem camundongo, e à IL12 murina recombinante. Estes experimentos clara-mente demonstraram o potencial das proteínas de fusão com base em anti-corpo da citocina como uma via para melhorar o potencial terapêutico deIL12 [15]. O potencial terapêutico destes resultados é considerável. Alvejamento de IL12 no nível de vasos sangüíneos de tumor,
como usando L19, é terapeuticamente benéfico por várias razões. Primeiro,a neovasculatura de tumor é mais acessível a agentes terapêuticos intrave-nosamente administrados do que as células tumorais, que ajuda a evitarproblemas associados à hipertensão intersticial de tumores sólidos [10]. Se- gundo, angiogênese (o crescimento de vasos capilares novos de vasos san-güíneos preexistentes) é um aspecto característico da maior parte de tumo-res sólidos agressivos [11]. Alvejando IL12 para a neovasculatura permitiriaa imunoterapia de uma variedade de tipos de tumor diferentes. Terceiro,IL12 mostra uma atividade antiangiogênica, conferida por seu mediador ajusante IP-10 [12, 13].
Foi extensivamente estudado o desempenho de alvejamento de tumor de sclL12-scFv(L19), e também o de scFv(L19) fundido com outra ci-tocina antitumor, IL2 ("scFv(L19)-IL2") [18]. ScFv(L19)-IL2 exibe um desem-penho de alvejamento de tumor excelente em camundongos portando tumor,com razoes de tumonsangue e tumor:órgão tão alta quanto 30:1 vinte e qua-tro horas após injeção intravenosa. Em contraste, a habilidade de alvejamen-
to de tumor de scll_12-scFv(L19) nos mesmos modelos animais é mais mo-desta, com razões de tumonsangue e tumor:órgão em geral piores que 10:1em 24 h, e com razões de tumonfígado e tumonbaço ruins [15]. Estes resul-tados de alvejamento foram não obstante superiores comparados a uma pro-teína de "fusão de scll_12-scFv(HyHEL10), específica para a lisozima de ovo
de galinha mas destituída de reconhecimento antígeno-específico no ca-mundongo.
As propriedades de alvejamento de tumor de scFv(L19) forammostradas ser melhoradas quando scFv(L19) foi dimerizada através de umdomínio de CH4 de IgE humana, construindo uma estrutura de minianticor- po, também denominada "proteína imune pequena" ou SIP. As propriedadesde alvejamento de tumor de SIP(L19) foram previamente descritas [21].
A presente invenção é com base no trabalho em que nós, osinventores, compararam as habilidades de alvejamento de tumor de trêsconjugados de IL12 e scFv(L19) cada um tendo um formato diferente da ci- tocina e/ou do anticorpo, e descobrimos que a habilidade de alvejamento detumor de sclLÍ2-scFv(L19) poderia ser melhorada alterando o formato doconjugado de um modo particular.
Um formato que foi testado foi sclL12-scFv(L19), ilustrado naFigura 1A. Este conjugado mostrou habilidade de alvejamento de tumor mo- desta, consistente com as descobertas da técnica anterior.
Outro formato utilizou a construção dimérica SIP(L19) mencio-nada acima para criar um homodímero de sclL12-SIP(L19), ilustrado na Fi-gura 1B. Porém, apesar da indicação da técnica anterior que as proprieda-des de alvejamento de tumor de L19 poderiam ser melhoradas usando oformato de SIP, não foi observada uma absorção de tumor aumentada desteconjugado.
' Outro formato foi um heterodímero de subunidades p40 e p35 de
IL12 em que cada subunidade foi fundida com scFv(L19), formando um hete-rodímero de scFv(L19)-p35/p40-scFv(L19) como ilustrado na Figura 1C.Com este formato heterodimérico foi alcançada uma melhoria notável naabsorção de tumor do conjugado.
Desse modo, foi descoberto que um novo formato de proteína de
fusão de anticorpo-IL12, consistindo em dois fragmentos de scFv heterodi-merizados por meio das subunidades p40 e p35 de IL12, retém atividade deIL12 total e exibe uma habilidade de alvejamento de tumor excelente.
Estes resultados têm implicações terapêuticas significativas para
alvejamento melhorado de IL12 para tumores e para outros sítios patológi-cos de angiogênese, por exemplo para tratar artrite reumatóide, retinopatiadiabética, degeneração muscular relacionada à idade e angiomas. A utilida-de desta invenção não só estende-se à fusão de IL12 com scFv(L19), mastambém para conjugados entre outros membros de ligação específicos e
outros fármacos e substâncias. Por exemplo, conjugados podem ser cons-truídos com os membros de ligação específicos diferentes de scFv(L19) con-jugados com as subunidades de IL12, como outros fragmentos de anticorpoespecífico para antígenos associados a tumor por exemplo isoformas de te-nascina-C, e usados para alvejamento de tumor e terapia de câncer. As im-
plicações mais amplas também incluem uma variedade de outras aplicaçõesenvolvendo alvejamento de substâncias in vivo, incluindo métodos diagnósti-cos como também a prevenção e tratamento de doenças e outras condiçõespatológicas.
A invenção em vários aspectos diz respeito aos conjugados no- vos, métodos de produzi-los, ácidos nucléicos que codificam os conjugadosou componentes destes, composições farmacêuticas contendo os conjuga-dos, e uso dos conjugados em métodos de tratamento.Em um aspecto, a invenção é um conjugado compreendendouma proteína que tem primeira e segunda subunidades, em que as primeirae segunda subunidades são, cada uma, conjugadas com um membro deligação específico.
A proteína é em geral dimérica, preferivelmente heterodimérica,
e tipicamente compreende um agente biologicamente ativo ou fármaco,normalmente um agente terapêutico ou diagnóstico.
Desse modo, o conjugado tem normalmente o formato a seguir:[membro de ligação específico] - [primeira subunidade] - [segunda subunida- de] - [membro de ligação específico]
Os membros de ligação específicos normalmente são moléculasde anticorpo, preferivelmente Fv de cadeia simples (scFv). Moléculas de an-ticorpo Fv de cadeia simples (scFv) são particularmente preferidas na pre-sente invenção devido a seu tamanho pequeno que prove vantagens fisioló- gicas e terapêuticas para uso in vivo dos conjugados. Além disso, scFv ca-rece de uma região de Fc, reduzindo potencialmente as reações anti-idiotípicas e também minimizando as propriedades indesejáveis relativas àativação de complemento e interação com receptores de Fc que podem im-pedir alvejamento de tumor e causar ativação de célula não-específica. Desse modo, um formato preferido do conjugado é:
[ScFv] - [primeira subunidade] - [segunda subunidade] - [ScFv]Alternativamente, o membro de ligação específico pode ser umanticorpo de domínio simples, e/ou um fragmento de anticorpo. Os membrosde ligação específicos e moléculas de anticorpo são descritos em mais deta- lhes abaixo.
O conjugado pode ser ou compreender uma proteína de fusão,isto é um polipeptídeo que é um produto de translação resultante da fusãode dois ou mais genes ou seqüências de codificação de ácido nucléico emuma estrutura de leitura aberta (ORF). Os produtos de expressão fundidos dos dois genes ou ORFs podem ser conjugados por um ligante de peptídeo(uma extensão de resíduo de aminoácidos curta de 2 -20, preferivelmente 2 -15). Em uma modalidade o ligante de peptídeo é uma seqüência de 6 resí-duos GSADGG (SEQ ID NO: 15). A proteína de fusão pode compreenderseqüência de peptídeo sinal, normalmente localizada a montante (5') domembro de ligação e subunidade específicos.
Nos conjugados da invenção, as primeira e segunda subunida- des são em geral ligadas, por exemplo elas podem ser covalentemente li-gads, por exemplo através de uma qu mais ligações de dissulfeto. A proteínapode ser oligomériea (por exemplo dimérica, preferivelmente heterodiméri-ca), e pode ocorrer naturalmente em forma oligomériea, e desse modo asprimeira e segunda subunidades no conjugado podem se associar entre si
em seu modo natural. A invenção portanto permite o uso e manutenção deum formato natural da proteína no conjugado. Isto evita alguma necessidadede construir ou usar de uma variante de cadeia simples do fármaco e maxi-miza o potencial para o fármaco reter sua atividade total no conjugado. Alémdisso, conjugação entre as subunidades permite o conjugado ser convenien-
temente construído e montado permitindo as primeira e segunda subunida-des associarem-se (por exemplo dimerizarem) no oligômero. Desse modo,tipicamente as primeira e segunda subunidades podem, cada uma, ser con-jugadas com um membro de ligação específico, formando um par de cons-truções de membro-subunidade de ligação específico (por exemplo hetero-
dímeros) que associaram-se através das subunidades. Em uma modalidadepreferida, a primeira subunidade é conjugada com um membro de ligaçãoespecífico como uma primeira proteína de fusão, e a segunda subunidade éconjugada com um membro de ligação específico como uma segunda prote-ína de fusão.
Preferivelmente, o conjugado tem um peso molecular de 250
kDa ou menos, mais preferivelmente 200 kDa, 150 kDa, 125 kDa, 120 kDaou 115 kDa ou menos (isto é um Mr de ou menos que 250 000, 200 000, 150000, 125 000, 120 000 ou 115 000). Este pode ser o peso molecular medidoreal (com ou sem glicosilação), ou um valor estimado com base por exemplo
no peso molecular esperado do conjugado (com ou, normalmente, sem) gli-cosilação. Um tamanho relativamente pequeno do conjugado aumenta suahabilidade para penetrar tecidos e acessar o sítio alvo (por exemplo sítio deangiogênese, tumor ou doença), desse modo aumentando sua eficácia terapêutica e reduzindo a dosagem requerida, ao mesmo tempo ainda alcançando um ligando multivalente (em geral bivalente) do conjugado para o alvo.
Em geral, a proteína e o membro de ligação específico são sele-
cionados de acordo com o uso intencionado do conjugado. Em uma modalidade preferida, a proteína é IL12. Como debatido acima, IL12 é adequada para tratar câncer, inibindo o crescimento de tumor e metástase, e para tratar outras condições associadas à angiogênese patológica. Um ou ambos os
membros de ligação específicos em um conjugado podem especificamente ligar um marcador associado ao crescimento neoplástico (especialmente tumor) e/ou angiogênese, por exemplo um marcador localizado no sítio de crescimento neoplástico e/ou angiogênese. Componentes de matriz éxtrace-lulares podem ser marcadores de crescimento neoplástico e/ou angiogêne-
se, porque a matriz extracelular é remodelada durante estes processos.
Um exemplo é a isoforma de B-FN de fibronectina que, como explicado acima, contém um domínio extra ED-B. Um membro de ligação específico da invenção de preferência especificamente liga a ED-B da isoforma de fibronectina B-FN. O membro de ligação específico pode ter uma
seqüência de aminoácido que compreende as seqüências de ÇDR1 de VH (SEQ ID NO: 25), CDR2 de VH (SEQ ID NO: 26) e/ou CDR3 de VH (SEQ ID NO: 27) de L19 e/ou as seqüências de CDR1 de VH (SEQ ID NO: 28), CDR2 de VL (SEQ ID NO: 29) e/ou CDR3 de VL (SEQ ID NO: 30) de L19. Por e-xemplo, o membro de ligação específico pode ser um scFv que tem um do-
mínio de VH com uma seqüência de aminoácido compreendendo CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de L19, e um domínio de VL com uma seqüência de aminoácido compreendendo CDR1 de VH, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de L19. Um membro de ligação específico pode compreender um domínio de VH que tem uma seqüência de aminoácido com pelo menos
60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácido do domínio de VH de L19 como exposto na SEQ ID NO: 22, e/ou compreende um domínio de VL que temuma seqüência de aminoácido com pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácido do domínio de VL de L19 como exposta na SEQ ID NO: 23. Pre-ferivelmente o membro de ligação específico é um scFv(L19) compreenden-5 ' do um domínio de VH de L19 (SEQ ID NO: 22) e um domínio de VL de L19 (SEQ ID NO: 23). Em uma modalidade preferida, o membro de ligação específico é scFv(L19) tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 5 (Figura 10).
Outro exemplo é tenascina-C (TnC) que existe em várias isofor-10 mas. Em tecidos neoplásticos domínios adicionais contendo TnC são expressados mais amplamente que em tecidos normais, especialmente isofor-mas contendo domínio C (cTN-C) [33]. Desse modo, um membro de ligação específico nos conjugados da invenção especificamente pode ligar isoformas de tenascina-C associadas a tecidos neoplásticos, especialmente cTN-C. O 15 membro de ligação específico pode ser scFv de TN11 tendo uma seqüência como exposta na SEQ ID NO: 21 (Figura 11) [33].
O membro de ligação específico em conjugados da invenção pode alternativamente ligar outros antígenos associados ao tumor, isto é antígenos mais prevalecentes em um ambiente de tumor (como em uma cé-20 lula de tumor) que em um ambiente celular normal (como em células de não-tumor).
Normalmente, os dois membros de ligação específicos em um conjugado são idênticos, ou são pelo menos ambos específicos para o mesmo alvo, antígeno ou epitopo. 25 Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, o
conjugado compreende um heterodímero de IL12 humana conjugado e entre dois membros de ligação específicos, preferivelmente scFv(L19); em que
o heterodímero tem uma primeira subunidade (normalmente p40) e uma segunda subunidade (normalmente p35); 30 a primeira subunidade ou p40 é conjugada com um primeiro
membro de ligação específico como uma primeira proteína de fusão;
a segundo subunidade ou p35 é conjugada com um segundomembro de ligação específico como uma segunda proteína de fusão.
Como observado acima, as primeira e segunda subunidades são tipicamente covalentemente ligadas por exemplo dissulfeto ligado.
Preferivelmente, a primeira subunidade ou p40 é fundida N-5 terminal com o membro de ligação específico, isto é, a subunidade está a montante do membro de ligação específico na proteína de fusão e no ácido nucléico que a codifica. Nesta forma, o N-término de p40 pode ser portanto livre (não-fundido) que é acreditado maximizar sua atividade.
Preferivelmente, a segunda subunidade p35 é fundida C-terminal 10 com o membro de ligação específico, isto é, a subunidade está a jusante do membro de ligação específico na proteína de fusão e no ácido nucléico que a codifica. Isto pode intensificar a expressão da proteína de fusão, porque o membro de ligação específico, especialmente com um peptídeo sinal N-terminal a montante, pode ser facilmente expresso e desse modo permitir 15 expressão eficiente da proteína de fusão.
Preferivelmente, a primeira proteína de fusão tem a seqüência de aminoácido de p40-scFv(L19) como mostrado na SEQ ID NO: 1. Preferivelmente, a segunda proteína de fusão tem o aminoácido de scFv(L19)-p35 como mostrado na SEQ ID NO: 2. 20 Os conjugados da invenção podem ser produzidos em qualquer
método disponível, por exemplo usando técnicas recombinantes, por exemplo expressando todo ou parte do conjugado como uma proteína de fusão.
Por exemplo, um conjugado pode ser produzido em um método compreendendo:
25 expressar uma primeira proteína de fusão compreendendo a
primeira subunidade e um membro de ligação específico;
expressar uma segunda proteína de fusão compreendendo a segunda subunidade e um membro de ligação específico; e
conjugar as primeira e segunda subunidades entre si. 30 Normalmente o método compreende purificar as primeira e se-
gunda proteínas de fusão após expressão.
Normalmente a expressão é executada em uma célula hospedei-ra contendo ácido nucléico que codifica a proteína de fusão, por exemplouma célula eucariótica cultivada como HEK ou uma célula de CHO, ou umacélula bacteriana como Escherichia coli. Expressão pode compreender culti-var portanto uma tal célula hospedeira. Onde as primeira e segunda proteí- nas de fusão forem expressas na mesma célula (por exemplo uma célula co-transfeccionada com ou contendo ácidos nucleicos que codificam as duasproteínas de fusão), heterodimerizaçao ou oligomerizaçao das subunidadespodem ocorrer na célula ou durante a purificação das proteínas de fusão dacélula. Em outros casos, as primeira e segunda proteínas de fusão podem
ser expressadas separadamente (por exemplo em células diferentes) e de-pois reunidas (combinadas) de modo que as primeira e segunda subunida-des heterodimerizam-se ou do contrário se associam.
Conjugar as subunidades entre si pode ser um processo ativo oupassivo. Conjugação pode compreender expor ou submeter as primeira e
segunda proteínas de fusão a condições em que as primeira e segunda su-bunidades são conjugadas entre si (por exemplo se associarem ou se oligo-merizarem/heterodimerizarem). Conjugação pode compreender formação deligação de dissulfeto entre as subunidades, ou formação de outra ligaçãocovalente. Conjugação como formação de ligação de dissulfeto pode ocorrer
sob condições não-redutoras, e portanto conjugação pode compreender ex-por as primeira e segunda proteínas de fusão a condições de não-redução.
Métodos adequados para expressar as proteínas de fusão eproduzir conjugados de acordo com a invenção são dados em detalhes nosExemplos abaixo.
Como uma etapa adicional, o método pode compreender formu-
lar o conjugado em uma composição farmacêutica. Em geral isto envolvepurificar o conjugado e combiná-lo com um veículo fisiologicamente aceitá-vel. Composições farmacêuticas são descritas em mais detalhes abaixo.
Moléculas de ácido nucléico que codificam os conjugados e par-
tes destas (por exemplo codificando proteínas de fusão) também fazem par-te da invenção.
Em um aspecto a invenção é uma composição compreendendo:uma primeira molécula de ácido nucleico compreendendo umaseqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína de fusão, em que a pro-teína de fusão compreende um membro de ligação específico e uma primei-ra subunidade de proteína; e uma segunda molécula de ácido nucleico compreendendo uma
seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína de fusão, em que a pro-teína de fusão compreende um membro de ligação específico e uma segun-da subunidade de proteína.
A molécula de ácido nucleico pode codificar um ligante de peptí-
deo entre o membro de ligação específico e a subunidade, de modo que naproteína de fusão o membro de ligação específico e subunidade são unidospelo ligante de peptídeo. Proteínas de fusão, subunidades, membro de liga-ção específico e ligadores particulares que podem ser codificados em outrolugar são descritos em mais detalhes aqui. Em uma modalidade preferida as
primeira e segunda subunidades são subunidades heterodiméricas de IL12(tipicamente subunidades p40 e p35), respectivamente, e preferivelmente omembro de ligação específico é um scFv, especialmente scFv(L19). Em umamodalidade a primeira molécula de ácido nucleico codifica a seqüência deaminoácido de IL12p40-scFv(L19) como exposta na SEQ ID NO: 1 e/ou a
segunda molécula de ácido nucleico codifica a seqüência de aminoácido dèscFv(L19)-IL12p35 como exposta na SEQ ID NO: 2.
A molécula de ácido nucleico pode ser um vetor, por exemploum plasmídeo adequado para expressão da seqüência de nucleotídeo. Des-se modo, as primeira e segunda moléculas de ácido nucleico podem ser
25 primeiro e segundo vetores. Normalmente a seqüência de nucleotídeo é o-peravelmente ligada a um elemento regulador como um promotor paratranscrição.
As primeira e segunda moléculas de ácido nucleico podem sercontidas em uma célula hospedeira que pode ser uma célula co-trans- feccionada com as moléculas de ácido nucleico ou uma filha de tal uma célu-la. Células, células especialmente eucarióticas por exemplo células de HEKe CHO, ou células bacterianas por exemplo Escherichia coli, contendo asmoléculas de ácido nucléico também fazem parte da invenção.
Após expressão dos ácidos nucléicos, as proteínas de fusão po-dem ser conjugadas através das subunidades para formar os conjugados dainvenção, como descrito em outro lugar aqui. ' Conjugados de acordo com a invenção podem ser usados em
um método de tratamento do corpo humano ou animal, como um método detratamento (que pode incluir tratamento profiláctico) de uma doença ou dis-túrbio em um paciente (tipicamente um paciente humano) compreendendoadministrar o conjugado ao paciente.
Condições tratáveis usando os conjugados incluem câncer, ou-
tros tumores e condições neoplásticas. Os conjugados podem ser usadospara inibir angiogenese e assim tratar artrite reumatóide, retinopatia diabéti-ca, degeneração muscular relacionada à idade, angiomas e tumores, inclu-indo câncer. Tratamento pode incluir tratamento profiláctico. Os conjugados
podem também ser administrados em métodos diagnósticos, por exemploalvejamento e diagnose de angiogenese, que pode ser associado a qualqueruma das condições acima. Outras doenças e condições podem também serdiagnosticadas e tratadas, de acordo com a natureza do agente terapêuticoou diagnóstico da proteína contido no conjugado, e da especificidade do
membro de ligação específico.
Conseqüentemente, aspectos adicionais da invenção fornecemmétodos de tratamento compreendendo administrar um conjugado da inven-ção, composições farmacêuticas compreendendo um tal conjugado e uso deum tal conjugado na fabricação de um medicamento para tratamento de uma
condição ou doença, por exemplo em um método de fazer um medicamentoou composição farmacêutica compreendendo formular o conjugado com umveículo ou excipiente fisiologicamente aceitável.
De acordo com a invenção, composições fornecidas podem seradministradas a um paciente. Administração é preferivelmente em uma
"quantidade terapeuticamente eficaz", esta sendo suficiente para mostrarbenefício ao paciente. Tal benefício pode ser pelo menos para melhora depelo menos um sintoma. A quantidade real administrada, e taxa e curso detempo de administração, dependerão da natureza e severidade do que estásendo tratado. Prescrição de tratamento, por exemplo decisões sobre dosa-gem etc; está dentro da responsabilidade dos médicos gerais e outros médi-cos. Doses apropriadas de anticorpo são bem-conhecidas na técnica [26, 27]. Conjugados da invenção, incluindo aqueles compreendendo um
domínio de ligação de antígeno anticorpo, podem ser administrados a umpaciente em necessidade de tratamento por meio de qualquer rota adequa-da, usualmente por injeção na circulação sangüínea e/ou diretamente nosítio a ser tratado, por exemplo tumor ou vasculatura do tumor. A dose preci- sa e sua freqüência de administração dependerão de vários fatores, da rotade tratamento, do tamanho e localização da área a ser tratado (por exemplotumor), da natureza precisa do anticorpo (por exemplo molécula de scFv), eda natureza de qualquer marcação detectável ou outra molécula contida noconjugado.
Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combi-
nação com outros tratamentos, ou simultânea ou seqüencialmente depen-dendo da condição a ser tratada. Outros tratamentos podem incluir a admi-nistração de doses adequadas de fármacos de alívio de dor como fármacosantiinflamatórios não-esteróides (por exemplo aspirina, paracetamol, ibupro-
feno ou cetoprofeno) ou opiáceos como morfina, ou antiemético.
Desse modo composições farmacêuticas de acordo com a pre-sente invenção, e para o uso de acordo com a presente invenção, podemcompreender, além do ingrediente ativo (conjugado), um excipiente farma-ceuticamente aceitável, veículo, tampão, estabilizante ou outros materiais
bem-conhecidos àqueles versados na técnica. Tais materiais deveriam sernão-tóxicos e não deveriam interferir com a eficácia do ingrediente ativo. Anatureza precisa do veículo ou outro material dependerá da rota de adminis-tração que pode ser oral ou através de injeção, por exemplo intravenosa.Para injeção intravenosa, ou injeção no sítio de aflição, o ingrediente ativo
será na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é livrede pirogênio e tem pH adequado, isotonicidade e estabilidade.
Em conjugados da invenção, a proteína normalmente compre-ende primeira e segunda subunidades de polipeptídeo recombinantementeproduzidas. As subunidades podem ser glicosiladas, e o grau e natureza detal glicosilação podem ser controlados mediante seleção de uma célula hos-pedeira apropriada onde expressar as subunidades. A proteína pode com- ' preender um agente biologicamente ativo, isto é um agente que afeta a es-trutura ou funcionamento de um organismo em questão ao qual é adminis-trado. Normalmente a proteína compreende um agente diagnóstico ou tera-pêutico. Por exemplo, pode compreender uma substância usada em diagno-se, prevenção ou tratamento de uma doença ou condição patológica. A pro-
teína pode compreender um marcador ou agente de marcação por exemplopara diagnose. No contexto desta invenção a proteína normalmente com-preende uma substância terapêutica para tratar ou impedir uma condiçãopatológica, especialmente angiogênese, por exemplo em tratamento de cân-cer e outros tumores, artrite reumatóide, retinopatia diabética, degeneração
muscular relacionada à idade e angiomas. Ela pode por exemplo compreen-der uma toxina, enzima ou um mediador de imunidade como uma citocina.
A proteína pode ser interleucina-12 nativa ou recombinante(IL12). IL12 útil na invenção pode ser derivada de qualquer animal, por e-xemplo ser humano, roedor (por exemplo rato, camundongo), cavalo, vaca,
porco, ovelha, cachorro, etc. IL12 humana é preferida em conjugados paraadministração em seres humanos. IL12 ocorre naturalmente como uma pro-teína heterodimérica composta de uma subunidade de 40 kDa (p40) e umasubunidade de 35 kDa (p35). Os pesos moleculares reais das subunidadespodem variar, por exemplo quando expressos em espécies diferentes e de-
pendendo se a proteína é glicosilada e no padrão de glicosilação. Os termos"p40" e "p35" portanto não implicam que as subunidades têm pesos molecu-lares de exatamente 40 e 35 kDa respectivamente. Do contrário, estes ter-mos são usados para identificar e distinguir as duas subunidades heterodi-méricas de IL12 que podem ser definidas mais precisamente em termos de
suas seqüências de aminoácido. IL12 heterodimérica compreende uma pri-meira e uma segunda subunidade de polipeptídeo homóloga ou idêntica ou asubunidade p40 e a subunidade p35 de IL12 humana, respectivamente. Tipi-camente, primeira subunidade de IL12 compreende uma seqüência de ami-noácido que tem pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%ou 100% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácido desubunidade p40 de IL12 humana como exposta na SEQ ID NO: 3. Tipica- mente, a segunda subunidade de IL12 compreende uma seqüência de ami-noácido que tem pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%ou 100% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácido dasubunidade p35 de IL2 humana como exposta na SEQ ID NO: 4. IL12 emconjugados da invenção retém uma atividade biológica de IL12, por exemplo
uma capacidade de agir como um fator de crescimento para células TeNKativadas, para intensificar a atividade lítica das células assassinas ativadaspor NK/linfocina, para estimular a produção de IFN-y por PMBC em repouso,para inibir angiogênese (por exemplo através do mediador IP-10 a jusante),e/ou para inibir crescimento de tumor e/ou metástase.
Um membro de ligação específico é um membro de um par de
moléculas que têm especificidade de ligação entre si. Os membros de umpar de ligação específico podem ser naturalmente derivados ou completa-mente ou parcialmente de forma sintética produzidos. Um membro do par demoléculas tem uma área em sua superfície, ou uma cavidade que especifi-
camente liga e é portanto complementar a uma organização espacial e polarparticular do outro membro do par de moléculas. Desse modo os membrosdo par têm a propriedade de especificamente ligar um ao outro.
O membro de ligação específico normalmente compreende umamolécula que tem um sítio de ligação de antígeno. Por exemplo, um membro
de ligação específico pode ser uma molécula de anticorpo ou uma proteínade não-anticorpo compreendendo um sítio de ligação de antígeno. Um sítiode ligação de antígeno pode ser fornecido por meio de arranjo de regiões dedeterminação de complementaridade (CDRs) em andaimes de proteína denão-anticorpo como fibronectina ou citocromo B etc. [29, 30, 31], ou rando-
mizando ou mutando resíduos de aminoácido de uma alça dentro de um an-daime de proteína para conferir especificidade de ligação para um alvo dese-jado. Os andaimes para criar sítios de ligação novos em proteínas foram re-visados em detalhes [31]. Andaimes de proteína para mímicos de anticorpoforam descritos [32], incluindo proteínas (mímicos de anticorpo) que incluemum domínio de tipo III de fibronectina tendo pelo menos uma alça randomi-zada. Um andaime adequado ao qual se enxerta uma ou mais CDRs, por ' exemplo um conjunto de HCDRs, pode ser fornecido por qualquer membrode domínio da superfamília de gene de imunoglobulina. O andaime pode seruma proteína humana ou não-humana.
Uma vantagem de um andaime de proteína de não-anticorpo éque ele pode fornecer um sítio de ligação de antígeno em uma molécula de
andaime que é menor e/ou mais fácil de produzir que pelo menos algumasmoléculas de anticorpo. Tamanho pequeno de um membro de ligação espe-cífico pode conferir propriedades fisiológicas úteis como uma habilidade paraentrar nas células, penetrar profundamente em tecidos ou alcançar o alvodentro de outras estruturas, ou ligar dentro das cavidades de proteína do
antígeno alvo.
Uso de sítios de ligação de antígeno em andaimes de proteínade não-anticorpo é revisado em [34]. Típicas são proteínas tendo uma ca-deia principal estável e uma ou mais alças variáveis em que a seqüência deaminqácido da alça ou alças é específica ou fortuitamente mutada para criar
um sítio de ligação de antígeno que tem especificidade para ligar o antígenoalvo. Tais proteínas incluem os domínios de ligação de IgG da proteína A deS. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por exemplo 10Q domíniodo tipo III de fibronectina) e lipocalinas. Outros métodos incluem sintético"Microbodies" (Selecore GmbH) que é com base em ciclotídeos - proteínas
pequenas que têm ligações de dissulfeto intra-moleculares.
Embora, como observado, CDRs podem ser carregadas atravésde andaimes como fibronectina ou citocromo B [29, 30, 31], a estrutura paracarregar uma CDR ou um conjunto de CDRs da invenção preferivelmenteserá de uma seqüência de anticorpo de cadeia pesada ou leve ou porção
substancial desta em que a CDR ou conjunto de CDRs está localizado emuma localização que corresponde à CDR ou conjunto de CDRs de domíniosvariáveis de anticorpo de VH e de VL de ocorrência natural codificados atra-vés de genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e localizaçõesdos domínios variáveis da imunoglobulina podem ser determinadas em refe-rência a Kabat et al. [35], e atualizações desta, agora disponível na Internet(http://immuno.bme.nwu.edu ou achado "Kabat" usando qualquer utilitário de pesquisa).
Uma molécula de anticorpo é uma imunoglobulina quer naturalquer em parte ou completamente sinteticamente produzida. O termo tambémabrange qualquer polipeptídeo ou proteína compreendendo um sítio de liga-ção de antígeno anticorpo.
É possível tomar os anticorpos monoclonais e outros e usar as
técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorposou moléculas quiméricas retendo a especificidade do anticorpo original. Taistécnicas podem envolver introduzir DNA que codifica a região variável daimunoglobulina, ou as CDRs, de um anticorpo para as regiões constantes,
ou regiões constantes mais regiões de estrutura, de uma imunoglobulinadiferente [37, 38, 39]. Um hibridoma ou outra célula que produz um anticorpopode estar sujeita à mutação genética ou outras alterações que podem ounão alterar a especificidade de ligação de anticorpos produzidos.
Como os anticorpos podem ser modificados de vários modos, o
termo "molécula de anticorpo" deveria ser interpretado como abrangendoqualquer membro de ligação específico ou substância tendo um sítio de liga-ção de antígeno anticorpo com a especificidade requerida. Desse modo, es-te termo abrange fragmentos de anticorpo e derivados, incluindo qualquerpolipeptídeo que compreende um sítio de ligação de antígeno anticorpo,
quer natural ou completamente ou parcialmente sintético. Moléculas quimé-ricas que compreendem um sítio de ligação de antígeno anticorpo, ou equi-valente, fundido com outro polipeptídeo são portanto incluídas. Clonagem eexpressão de anticorpos quiméricos são bem-conhecidas [40, 41].
Outras técnicas disponíveis na técnica de engenharia de anti-
corpo tornaram possível isolar os anticorpos humanos e humanizados. Porexemplo, hibridomas humanos podem previamente ser feitos como descritos[36]. Exibição de fago, outra técnica estabelecida para gerar os membros deligação específicos, foi descrita em detalhes [36, 42]. Camundongos trans-gênicos em que os genes de anticorpos de camundongo são inativados efuncionalmente substituídos com genes de anticorpos humanos deixandooutros componentes intactos do sistema imune de camundongo, podem ser ' usados para isolar os anticorpos humanos [43]. ■
Moléculas de anticorpo sintéticas podem ser criadas através deexpressão de genes gerados por meio de oligonucleotídeos sintetizados epodem ser montadas dentro de vetores de expressão adequados [44, 45].
Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo inteiro podem e-
xecutar a função de ligar antígenos. Fragmentos de anticorpo são preferidosem conjugados da invenção devido a seu tamanho pequeno e interação mi-nimizada com outras moléculas e receptores (por exemplo receptor de Fc).Particularmente preferido são moléculas de Fv de cadeia simples (scFv), emque um domínio de VH e um domínio de VL são ligados por um ligante de
peptídeo que permite os dois domínios âssociarem-se para formar um sítio deligação de antígeno [46, 47]. scFv podem ser estabilizadas pela incorporaçãode ligação em pontes de dissulfeto que ligam os domínios de VH e VL [48].
Outro fragmento de anticorpo de ligação de antígeno pequeno éum dAB (anticorpo de domínio), a saber a região variável de uma cadeia pe-
sada ou cadeia do anticorpo [28]. dAbs de VH ocorrem naturalmente emcamelídeos (por exemplo camelo, lhama) e podem ser produzidos imunizan-do um camelídeo com um antígeno alvo, isolando as células B antígeno-específicas e diretamente clonando genes de dAB das células B individuais.dAbs são também produzíveis em cultura de célula. Seu tamanho pequeno,
solubilidade boa e estabilidade de temperatura os torna em particular fisiolo-gicamente úteis e adequados para seleção e maturação de afinidade.
Membros de ligação específicos de domínio simples, especial-mente anticorpos de domínio simples tais como dAbs, podem ser usados nainvenção, e estão comercialmente disponíveis, por exemplo de Domantis,
Phylos, Pieris e Affibody.
Um sítio de ligação de antígeno é a parte de uma molécula queliga e é complementar a todo ou parte do antígeno alvo. Em um anticorpo,molécula é referida como o sítio de ligação de antígeno anticorpo, e compre-ende a parte do anticorpo que especificamente liga e é complementar a todoou parte do antígeno alvo. Onde um antígeno for grande, um anticorpo podeapenas ligar a uma parte particular do antígeno cuja parte é denominada um epitopo. Um sítio de ligação de antígeno anticorpo pode ser fornecido por umou mais domínios variáveis de anticorpo. Preferivelmente, um sítio de liga-ção de antígeno anticorpo compreende uma região variável de anticorpo decadeia leve (VL) e uma região variável de anticorpo de cadeia pesada (VH).
O termo "específico" pode ser usado para referir à situação em que um membro de um par de ligação específico não mostrará qualquer li-gação significativa às moléculas diferentes de seu par(es) de ligação especí-fico(s). O termo é também aplicável onde por exemplo um sítio de ligação deantígeno é específico para um epitopo particular que é carregado por váriosantígenos em cujo caso o membro de ligação específico que carrega o sítio
de ligação de antígeno poderá ligar aos vários antígenos que carregam oepitopo.
L19 é um anticorpo recombinante humano específico para o do-mínio de ED-B da isoforma de fibronectina B-FN. Este anticorpo e sua se-qüência foram descritos previamente [20]. Fv de cadeia simples de L19 foi
também descrito, e é empregado preferencialmente em conjugados da in-venção. ScFv(L19) é um scFv que compreende um domínio de VH de L19 eum domínio de VL de L19, em que as VH e VL são unidas em uma cadeiade polipeptídeo simples por uma seqüência de ligante de peptídeo. O domí-nio de VH contém CDR1 de VH, seqüências de CDR2 e CDR3, e o domínio
de VL contém seqüências de CDR1, CDR2 e de CDR3 de VH, como mos-trado na Figura 10. As seqüências de CDR de L19 são:CDR1 de VH SFSMS SEQID NO: 25
CDR2 de VH SISGSSGTTYYADSVKG SEQ ID NO: 26
CDR3 de VH PFPYFDY SEQ ID NO: 27
CDR1 de VL RASQSVSSSFLA SEQ ID NO: 28
CDR2 de VL YASSRAT SEQ ID NO: 29
CDR3 de VL QQTGRIPPT SEQ ID NO: 30O domínio de VH pode ter uma seqüência de aminoácido comoexposta na SEQ ID NO: 22, e o domínio de VL pode ter uma seqüência deaminoácido como exposta na SEQ ID NO: 23 (Figura 10). Os domínios deVH e de VL normalmente são unidos por um ligante de peptídeo como o li- gante de 12 resíduos SEQ ID NO: 24 (Figura 10). Preferivelmente, oscFv(L19) tem a seqüência de aminoácido como exposta na SEQ ID NO: 5.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1 (A) mostra sclL12-scFv(L19); (B) mostra sclL12-SIP(L19) homodímero; (C) mostra heterodímero de p40-scFv(L19)/scFv(L19)- p35.
Figura 2 (A) mostra análise de SDS-PAGE do sclL12-scFv(L19)proteína de fusão sob condições redutoras e não-redutoras; (B) mostra perfilde filtração de gel do sclL12-scFv(L19) proteína de fusão sob condições na-tivas que mostram dímeros.
Figura 3 mostra alvejando in wVo.de sclL12-scFv(L19) avaliou
com experimentos de biodistribuição. Acumulação é expressada em % doseinjetada por grama de tecido (% ID/g) após (A) 4 e (B) 24h. Os tecidos re-presentados são (da esquerda para a direita): tumor, baço, fígado, pulmão,coração, intestino, sangue e rim.
Figura 4 (A) mostra análise de SDS-PAGE da proteína de fusão
sclL12-SIP(L19) sob condições redutoras e não-redutorás; (B) mostra perfilde filtração de gel da proteína de fusão sclL12-SIP(L19) sob condições nati-vas mostrando-o ser um dímero.
Figura 5 mostra alvejamento in vivo de sclL12-SIP(L19) avaliado
com experimentos de biodistribuição e a acumulação expressa em % de do-se injetada por grama de tecido (% ID/g) após (A) 4 e (B) 24 h. Os tecidosrepresentados são (da esquerda para a direita): tumor, baço, fígado, pulmão,coração, intestino, sangue e rim.
Figura 6 (A) mostra análise de SDS-PAGE da proteína de fusão
de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 sob condições redutoras e não-redutoras;(B) mostra perfil de filtração em gel da proteína de fusão de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 sob condições nativas que mostram ser um díme-ro.
Figura 7 mostra alvejamento in vivo de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 avaliado com experimentos de biodistribuição e a acumulação ex-pressa em % de dose injetada por grama de tecido (% ID/g) após (A) 4 e (B)24 h. Os tecidos representados são (da esquerda para a direita): tumor, ba-ço, fígado, pulmão, coração, intestino, sangue e rim.
Figura 8 mostra a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 1. Aseqüência contém, do término N para o C:
(i) um peptídeo sinal;
(ii) subunidade p40 de IL12 humana (mostrada com sublinha-do tracejado - SEQ ID NO: 3);
(iii) ligante de peptídeo (SEQ ID NO: 15);
(iv) scFv(L19) (mostrado sublinhado - SEQ ID NO: 5); e
(v) myc;
isto é, peptídeo sinal-p40 humana-ligante-L19-myc. Na seqüência de ácidonucléico de codificação que usamos, o marcador de myc foi seguido por trêscódons de parada.
Figura 9 mostra a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 2. Aseqüência contém, do término N para o C:
(i) um peptídeo sinal;
(ii) scFv(L19) (mostrado sublinhado - SEQ ID NO: 5);
(iii) ligante de peptídeo (SEQ ID NO: 15);
(iv) subunidade p35 de IL12 humana (mostrada em sublinhadotracejado - SEQ ID NO: 4); e
(v) marcador 6His;
isto é, peptídeo sinal-L19-ligante-p35 humana-6xHis. Na seqüência de ácidonucléico de codificação que usamos, as seis histidinas foram seguidas portrês códons de parada.
Figura 10 mostra a seqüência de aminoácido de scFv(L19) (SEQID NO: 5). Os domínios de VH e VL são mostrados separadamente (SEQ IDNO: 22 e SEQ ID NO: 23, respectivamente). As seqüências de CDR1, 2 e 3são mostradas no domínio de VH e de VL sublinhado. Os domínios de VH ede VL são separados por uma seqüência de ligante de peptídeo de 12 resí-duos (SEQ ID NO: 24).
Figura 11 mostra a seqüência de aminoácido de scFv de antite-nascina-C TN11 (SEQ ID NO: 21). ' Aspectos e modalidades da invenção serão agora exemplifica-
dos na seção experimental a seguir.;EXEMPLOS
Foi descrita a produção e caracterização de conjugados de IL12-L19 em três formatos diferentes, demonstrando a superioridade marcada do
formato como reivindicado aqui para alvejamento In vivo.
Os três formatos, como ilustrados na Figura 1 A, B e C, respecti-vamente, são scll_12-scFv(L19), homodímero de sclL12-SIP(L19) e hetero-dímero de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35.
sclL12-scFv(L19), descrito na Figura IA, é uma proteína de fu-
são de sclL12 e scFv(l_19). Este conjugado é monovalente devido ao sítio deligação de antígeno de scFv simples por molécula.
O homodímero de sclL12-SIP(L19), descrito na Figura 1B, é umhomodímero de duas proteínas de fusão, cada proteína de fusão contendosclL12, scFv(L19) e o domínio de CH4 de IgE humano, respectivamente. O
é dimerizado através de ligação de dissulfeto entre os dois domí-nios de CH4, formando um minianticorpo ou estrutura de SIP. Este conjuga-do é bivalente devido à presença de dois sítios de ligação de antígeno descFv(L19) por molécula.
O heterodímero de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35, ilustrado na
Figura 1C, é um heterodímero de duas proteínas de fusão diferentes. A pri-meira proteína de fusão contém a subunidade p40 de IL12 humana fundidaao término N de scFv(L19) através de um ligante de peptídeo de 6 aminoá-cidos GSADGG (SEQ ID NO: 15). A segunda proteína de fusão contémscFv(L19) fundido ao término N da subunidade p35 de IL12 humana através
de um ligante de peptídeo de 6 aminoácidos GSADGG (SEQ ID NO: 15). Asduas proteínas de fusão são heterodimerizadas através da ligação de dissul-feto entre a subunidade p40 e p35, para formar p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 heterodimérico. O conjugado é bivalente, devido à presença de dois sí-tios de ligação de antígeno de scFv(L19) por molécula.scll_12-scFv(L19) sem um marcador FLAG
Uma vez que a proteína de fusão original como previamente descrita [15] foi clonada com um marcador FLAG C-terminal ("sclL12-scFv(L19)-flag"), deveríamos considerar a possibilidade que o marcadorFLAG contendo tirosina pode contribuir para artefatos em experimentos debiodistribuição. Quando as tirosinas da proteína forem radiomarcadas, a tiro-sina exposta no solvente do marcador FLAG pode ser iodada também. O marcador FLAG pode ser proteolizado posterior in vivo. Para melhor estudaras propriedades de alvejamento de tumor desta proteína de fusão, foi clona-da e expressada proteína de fusão de sclL12-scFv(L19) sem um marcadorFLAG.
CLONAGEM E EXPRESSÃO DE sclL12-scFv(L19)
O fragmento de DNA para sclL12-scFv(L19) foi amplificado u-
sando o vetor de pCH33 contendo o gene para sclL12-scFv(L19)-flag [15]como um modelo. A reação de PCR foi executada com o preparadorsp40backEco (5' ccg gaattc atg tgt cct cag aag cta acc ate 3') (SEQ ID NO:6) que anela à seqüência de secreção endógena de p40 e anexa um sítio de
restrição para a endonuclease EcoR1 em sua terminação 5', e o iniciadorL19stopNotfor (5' ttt tec ttt t gcggccgc cta tca tca ttt gat ttc cac ctt ggt cec 3')(SEQ ID NO: 7) anexando 3 códons de parada seguidos por uma restriçãolateral para a endonuclease Not1 para a terminação 3' da proteína de fusãode sclL12-L19, e assim excluindo o marcador FLAG. O fragmento de DNA
foi clonado no vetor de expressão de célula mamífera pcDNA3.1(+) vetor(Invitrogen, Basel, Suíça), usando os sítios de restrição EcoR1 e Not1 dovetor.
Células de HEK 293 foram transfeccionadas com o vetor e ostransfectantes estáveis selecionados na presença de G418 (500 ug/ml). Clo- nes de células resistentes a G418 foram triados para a expressão da proteí-na de fusão por ELISA, usando domínio de ED-B recombinante de fibronec-tina humana como um antígeno. A proteína de fusão foi purificada do meiode cultura de célula através de cromatografia de afinidade em coluna de an-tígeno como previamente descrito [19, 20] e dessalgada através de diálisedurante noite a 4°C. A proteína de fusão foi congelada em alíquotas a -20°C.O tamanho da proteína de fusão sclL12-scFv(L19) foi analisado sob condi- ções redutoras e não-redutoras em SDS-PAGE e sob condições nativas porfiltração em gel de FPLC em uma; coluna de Superdex S-200 (AmershamPharmacia Biotech) (Figura 2). Ao contrário da proteína de fusão de sclL12-scFv(L19)-flag original monomérica, aproximadamente um terço da fração daproteína de IL12-L19 mostrou ser um dímero.
Caracterização de sclL12-scFv(L19)
O alvejamento in vivo de sclL12-scFv(L19) sem um marcadorFLAG foi avaliado com experimentos de biodistribuição. Portanto a fraçãomonomérica da proteína de fusão foi purificada através de filtração em gelde FPLC em uma coluna de Superdex S-200. A fração foi imediatamente
iodada após purificação e injetada em camundongos imunocompetentes de129SvEv portando tumores de teratocarcinoma murina de F9. Os camun-dongos foram sacrificados 4 e 24 horas após injeção, os órgãos foram pesa-dos e a radioatividade contada. A acumulação em órgãos representativos eo tumor foram expressos em % de dose injetada por grama de tecido (%
ID/g) (Figura 3). Após 24 horas não pôde ser observada nenhuma acumula-ção no sítio do tumor. Portanto foi considerado que o marcador flag não a-trapalhou os resultados de biodistribuição.Homodímero de sclL12-SIP(L19)
As propriedades de alvejamento de tumor de scFv(L19) foram
mostradas ser melhoradas quando scFv(L19) foi dimerizada graças ao do-mínio de CH4 de IgE humana, construindo uma estrutura de minianticorpo,também denominada "proteína imune pequena" ou SIP. As propriedades dealvejamento de tumor de SIP(L19) foram previamente descritas [21]. Portan-to, foi construído um homodímero de sclL12-SIP(L19) para testar se este
formato também melhorará o alvejamento de IL12 em tumores.
Foi construda a proteína de fusão de sclL12-SIP(L19) fundindo odomínio de CH4 de uma imunoglobulina de IgE humana com o término C daproteína de fusão de scll_12-scFv(L19)-flag [22].Clonagem e Expressão do Homodímero de sclL12-L19-SIP
A fusão do domínio de CH4 para o término C do fragmento desclL12-L19 foi executada por uma rodada de PCR e inserindo o fragmento de PCR em um vetor já contendo o domínio de CH4.
O fragmento de scll_12-scFv(L19) foi amplificado do vetor depCH33 contendo o gene para sclL12-scFv(L19)-flag [15]. Os sítios de restri-ção foram trocados com o preparador sp40backHind (5' ccgta aagctt atg tgtcct cag aag cta acc ate 3') (SEQ ID NO: 8) que anela na terminação 5' da
seqüência de secreção de p40 e altera o EcoR1 para um sítio de restriçãoHindlll, e o preparador LWforAgeIBsp (5' tgt ggg accggt ttt gat ttc cac ctt ggtcec 3') (SEQ ID NO: 9) anelando na terminação 3', excluindo o marcadorFLAG e introduzindo um sítio de restrição Age1 que fornece as terminaçõesaderentes com BspE1. Uma vez ligado o sítio de restrição de Age1/BspE1
não é mais reclivável com BspE1. Esta etapa é necessária porque a se-qüência de scll_12 contém um sítio de restrição de BspE1. Usando as endo-nucleases Hindlll e BspE1 o fragmento foi agora clonado em um vetor deexpressão de célula mamífera pcDNA3.1(+) já contendo um domínio de CH4com um sítio de restrição de BspE1 em sua terminação 5' [21].
O procedimento de transfecção, expressão e de purificação para
sclL12-SIP(L19) foi executado como descrito acima para a proteína de fusãosclL12-scFv(L19). O tamanho da proteína de fusão de IL12-SIP(L19) foitambém analisado sob condições redutoras e não-redutoras em SDS-PAGEe sob condições nativas por filtração em gel de FPLC em uma coluna de Su-
perdex S-200 (Figura 4).
Caracterização de Homodímero de sclL12-SIP(L19)
A proteína de sclL12-SIP(L19) foi purificada imediatamente emuma segunda etapa em uma coluna de filtração em gel Superdex S-200 e afração de dímero radioiodada após coleta. A proteína marcada foi injetada
em camundongos imunocompetentes de 129SvEv portando tumores de tera-tocarcinoma murinos de F9. Os camundongos foram sacrificados 4 e 24 ho-ras após injeção, os órgãos foram pesados e a radioatividade contada. Aacumulação em órgãos representativos e no tumor foi expressa em % dedose injetada por grama de tecido (% ID/g) (Figura 5). Embora a proteínasclL12-SIP(L19) exibisse uma ligação melhorada para ED-B em BI Açore,não pôde ser observada uma absorção de tumor aumentada e a absorção de tumor permaneceu ruim.
Heterodímero de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35
O heterodímero de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 consiste emduas subunidades. Uma contém um fragmento de scFv(L19), fundido na ex-tremidade N-terminal da subunidade p35 de IL12 (scFv(L19)-p35). No se-
gundo, a subunidade p40 de IL12 é fundida na extremidade N-terminal descFv(L19) (p40-scFv(L19)). As proteínas de fusão depois constróem o p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 heterodiméricó por meio das ligações de dissülfetoentre p40 e p35.
Este conjugado de proteína fusão de citocina de anticorpo hete-
rodimérico tem um tamanho de 114 kD quando desglicosilado. Devido aosestados de glicosilação diferentes, o peso molecular do conjugado pode va-riar de acordo com as espécies em que é expressado, devido aos padrõesde glicosilação diferentes. Tamanhos teóricos para as proteínas de fusão,com base em comprimento de seqüência de DNA sem glicosilação pós-
translacional, foram 65 kDa para p40-L19, 49 kDa para L19-p35 e 114 kDapara o heterodímero p40-L19/L19-p35.
CLONAGEM E EXPRESSÃO DE p40-scFv(L19VscFv(L19)-p35
As duas subunidades de p40-scFv(L19) e scFv(L19)-p35 foramclonadas separadamente em dois vetores diferentes, o primeiro contendo
um marcador myc durante a detecção e o segundo contendo um marcadorhis para detecção.
O fragmento de p40-scFv(L19)-myc foi produzido através demontagem de PCR usando como modelos o vetor de pCH33 contendo o ge-ne que codifica a proteína de sclL12-scFv(L19)-flag [15] e o vetor de pLB
contendo o gene que codifica o fragmento SIP(L19) [21]. Um primeiro frag-mento A contendo a metade de p40 foi construído usando pCH33 como ummodelo. A reação de PCR foi executada com um primeiro preparadorHindSp40back (5' ccc aagcft atg tgt cct cag aag cta acc ate 3') (SEQ ID NO: anelando à seqüência de secreção da subunidade p40 de IL12 que in-troduz um sítio de restrição para a endonuclease Hindlll em sua terminação e com um segundo preparador Sp40HaLifor (5' acc tec ate age gct tec gga tcg gac cct gea gg 3') (SEQ ID NO: 11) anelando à terminação 3' de p40,anexando uma parte do ligante (GSADGG) a ser fundido ao segundo frag-mento B. Este fragmento B que contribui para a metade de scFv(L19) foiconstruído em 2 rodadas de PCR usando o modelo pLB com um primeiropreparador LinkL19back (5' gga age gct gat gga ggt gag gtg cag ctg ttg gag
tc 3') (SEQ ID NO: 12) anelando à terminação 5' do scFvL19 que anexa umaparte do ligante (GSADGG) (SEQ ID NO: 15) e um segundo preparador emL19mycstoBamfor (5' att cag ate etc ttc tga gat gag ttt ttg ttc ttt gat ttc cac cttggt ccc ttg 3') (SEQ ID NO: 13) anelando à terminação 3' do scFv(L19) e a-nexando um marcador myc C-terminal. Este fragmento foi terminado em
uma segunda rodada de PCR usando o preparador LinkLWbacke um tercei-ro preparador mycstoBamfor (5' cgc ggatcc cta tca tca att cag ate etc ttc tgagat gag ttt 3') (SEQ ID NO: 14) anexando 3 códons de parada e um sítio derestrição para BamH1 à terminação 5' do fragmento B. Usando ambos osfragmentos como modelos uma montagem de PCR com os preparadores
HindSp40back e mycstoBamfor foi executado para fundir o fragmento de p40ao término N do fragmento de anticorpo scFv(L19) conectado pelo liganteflexível GSADGG que produz o fragmento p40-GSADGG-L19-myc. UsandoHindlll e BamH1 como sítios de restrição o fragmento foi depois clqnado emum vetor de expressão mamífero pcDNA3.1+/Hygro que prove uma resis-
tência à higromicina por seleção. Células de CHO foram transfeccionadascom o vetor e selecionados transfectantes estáveis com higromicina (500ug/ml). Clones positivos foram triados com ELISA usando ED-B recombinan-te como um antígeno e anticorpo de anti-myc para detecção. A proteína foiexpressada e purificada do meio de cultura de célula através de cromatogra-
fia de afinidade de antígeno como previamente descrito [19, 20] e dessalga-da através de diálise durante a noite a 4°C. A proteína de fusão gelada emalíquotas a -20°C. Uma análise de tamanho de SDS PAGE mostrou a prote-ína ser aproximadamente 50% de monômeros em dois estados de glicosila-ção diferentes e cerca de 50% de homodímero [23].
O fragmento de scFv(L19)-p35-his foi produzido por montagemde PCR como também usando os mesmos plasmídeos pCH33 e pLB como modelos. Um primeiro fragmento em C que corresponde à metade descFv(L19) foi construído do modelo; de pLB com um primeiro preparador E-coLonSU9back (5' ccg gaattc gct tgt cga cca tgg gct g 3') (SEQ ID NO: .16)anelando à seqüência de secreção do scFvLI 9 que introduz um sítio de res-trição para a endonuclease EcoR1 em sua terminação 5' e um segundo pre-
parador LWHaLifor (5' acc tcc ate age gct tec ttt gat ttc cac ctt ggt cec 3')(SEQ ID NO: 17) anelando à terminação 3' de scFv(L19), introduzindo umaparte do ligante (GSADGG). Um segundo fragmento D contendo a metadede p35 foi construído em duas rodadas de PCR usando o modelo pCH33com um primeiro preparador HaLip35back (5' gga age gct gat gga ggt agg
gtc att cca gtc tet gga 3') (SEQ ID NO: 18) anelando à terminação 5' da su-bunidade p35 madura que anexa uma parte do ligante (GSADGG) em suaterminação 5' e um segundo preparador p35hisfor(5' gtg atg gtg atg atg atgggc gga gct cag ata gcc 3') (SEQ ID NO: 19) anelando à terminação 3' dasubunidade p35 anexando um marcador his. Em uma segunda rodada de
PCR 3 códons de parada e um sítio de restrição para Not1 foram anexadosà terminação 3' do fragmento D usando o preparador HaLip35backe um ter-ceiro preparador p35hisstoNotlfor (5' ttt tcc ttt t gcggccgc cta tca tca gtg atggtg atg atg atg ggc 3') (SEQ ID NO: 20). A subunidade de citocina de p35 foiagora fundida ao término C do fragmento de scFv(L19) através da monta-
gem de PCR usando os preparadores EcoLonSU 9back e p35hisstoNotlforque produzem o L19-GSADGG-p35-his. O fragmento foi agora clonado emum vetor de expressão mamífero pcDNA 3.1 que fornece uma resistência àneomicina usando os sítio de restrição EcoR1 e Not1. Células de HEK 293foram transfeccionadas e os transfectantes estáveis selecionados com G418
(500 ug/ml). As células transfeccionadas foram tríadas para clones resisten-tes que expressam a proteína de fusão por ELISA, usando EDB recombinan-te humano como um antígeno e anticorpo de anti-hís para detecção. A prote-ína de fusão foi purificada do meio de cultura de célula através de cromato-grafia de afinidade em uma coluna de antígeno como previamente descrito[19, 20] dessalgada através de dialização durante noite a 4°C. Uma análisede SDS PAGE mostrou a expressão ser muito fraca e a proteína foi mostra- da consistir em monômeros, dímeros e oligômeros de ordem mais alta.
A co-transfecção de células HEK 293 com os dois vetores quecodificam para scFv(L19)-p35 e p40-scFv(L19) foi depois executada simulta-neamente. A seleção para transfectantes estáveis contendo ambas as prote-ínas de fusão foi executada com G418 (500 ug/ml) e higromicina (500 ug/ml).
As células foram tríadas para expressão de ambas as proteínas com ELISAusando EDB recombinante como um antígeno e anticorpo de anti-myc comotambém anticorpo de anti-his para detecção. As proteínas de fusão forampurificadas em uma primeira etapa através de cromatografia de afinidade emuma coluna de antígeno de ED-B como previamente descrito [19, 20] e des-
salgada através de diálise durante noite a 4o C. Esta primeira fração foi de-pois purificada ém uma segunda etapa em uma coluna de Ni2+ de 1 ml deHisTrap HP (Amersham Biosciences) lavando os fragmentos de p40-scFv(L19) livres não ligados no heterodímero (p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35). Para armazenamento, 0,1 % de Tween 80 foi adicionado à proteína que
foi depois congelada em alíquotas a -80° C. Uma análise de SDS PAGEmostrou sob condições não-reduzidas a proteína ser um dímero em dois es-tados de glicosilaçao e sob condições reduzidas os dois heteromonomerosde tamanhos diferentes onde do monômero de p40-L19 aparece em seusdois estados de glicosilaçao diferentes. Executando filtração em gel com uma coluna de Superdex S-200 a proteína mostrou ser um dímero puro sobcondições nativas (Figura 6).Caracterização de p40-scFv(L19VscFv(L19)-p35
O dobramento correto da proteína de fusão e construção dasligações de dissulfeto corretas foram determinados pela atividade de IL12 da
proteína heterodimérica purificada.
A atividade de IL-12 foi determinada executando um ensaio deproliferação de célula T [24]. Em resumo, monócitos de sangue periféricohumano em repouso (PBMC) foi cultivado com mitógeno (fito-hemaglutinina(PHA) e IL-2) durante 3 dias e depois incubados com diluições seriais deproteínas de fusão ou IL-12 comercialmente disponível, recombinante, muri-na como um padrão (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Reino Unido). ' Proliferação foi subseqüentemente medida por incorporação de [3H]timidina.
Os experimentos de biodistribuição foram executados com a pro-teína de p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 que foi purificada em uma coluna defiltração em gel de FPLC Superdex S-200 e radioiodada. A proteína marcadafoi injetada em camundongos imunocompetentes de 129SvEv portando tu-
mores de teratocarcinoma murino de F9. Os camundongos foram sacrifica-dos 4 e 24 horas após a injeção, os órgãos foram pesados e a radioatividadecontada. A acumulação em órgãos representativos e o tumor foram expres-sos em % de dose injetada por grama de tecido (% ID/g). Com o formatoheterodimérico foi alcançada uma absorção de tumor de quase 10% em 24
horas (Figura 7).Listagem de ReferênciasTodas as referências citadas são especificamente incorporadasaqui por referência.
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47

Claims (31)

1. Conjugado compreendendo uma proteína heterodimérica ten-do primeira e segunda subunidades, em que as primeira e segunda subuni-dades são, cada uma, conjugadas com um Fv de cadeia simples (scFv), e em que a proteína heterodimérica compreende um agente terapêutico oudiagnóstico.
2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, em que a primei-ra subunidade é conjugada com um scFv como uma primeira proteína defusão, e a segunda subunidade é conjugada com um scFv como uma se- gunda proteína de fusão.
3. Conjugado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que asprimeira e segunda subunidades da proteína heterodimérica são covalente-mente ligadas através de uma ligação de dissulfeto.
4. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 115 a 3, em que a proteína heterodimérica é IL12.
5. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que o conjugado tem um peso molecular de 250.000 oumenos.
6. Conjugado de acordo com a reivindicação 5, em que o conju- gado tem um peso molecular de 150.000 ou menos.
7. Conjugado de acordo com a reivindicação 6, em que o conju-gado tem um peso molecular de 120.000 ou menos.
8. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que os dois scFv são idênticos.
9. Conjugado de acordo com as reivindicações 1 a 8, compreen-dendo um heterodímero de IL12 humana conjugado e entre dois scFv; emqueo heterodímero de IL12 tem uma primeira e uma segunda subu-nidade; a primeira subunidade é conjugada com um scFv como umaprimeira proteína de fusão; ea segunda subunidade é conjugada com um scFv como umasegunda proteína de fusão.
10. Conjugado de acordo com a reivindicação 9, em que a primeira proteína de fusão tem uma seqüência de aminoacido como exposta na SEQIDNO:1.
11. Conjugado de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que asegunda proteína de fusão tem uma seqüência de aminoacido como exposta na SEQ ID NO: 2.
12. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que um ou ambos scFv especificamente ligam a um componente de matriz extracelular associado ao crescimento neoplástico e/ou angiogê-nese.
13. Conjugado de acordo com a reivindicação 12, em que o componente é fibronectina ED-B.
14. Conjugado de acordo com a reivindicação 13, em que o scFv 15 é scFv(L19) tendo um domínio de VH que compreende as seqüências deaminoacido da SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, e um domínio de VL que compreende as seqüências de aminoacido da SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.
15. Conjugado de acordo com a reivindicação 14, em que o scFv 20 é scFv(L19) tendo uma seqüência de aminoacido como exposta na SEQ IDNO: 5.
16. Conjugado de acordo com a reivindicação 12, em que o componente é uma isoforma de tenascina-C.
17. Conjugado de acordo com a reivindicação 16, em que o scFv 25 é scFv(TN11) tendo uma seqüência de aminoacido como exposta na SEQ IDNO: 21.
18. Método de produzir um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 17, compreendendo:expressar as primeira e segunda proteínas de fusão; e 30 conjugar as primeira e segunda subunidades para formar a pro-teína heterodimérica.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, compreendendoexpressar as primeira e segunda proteínas de fusão em uma célula contendo ácido nucléico que codifica ambas as proteínas de fusão.
20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, adicionalmente compreendendo formular o conjugado em uma composição farmacêu- tica.
21. Composição compreendendouma primeira molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende um scFv e uma primeira subunidade de uma proteína heterodimérica; euma segunda molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende um scFv e uma segunda subunidade de uma proteína heterodimérica.
22. Composição de acordo com a reivindicação 21, em que oscFv é como definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 17.
23. Composição de acordo com a reivindicação 21 ou 22, em que a primeira subunidade é uma subunidade p40 de IL12 e a segunda subunidade é uma subunidade p35 de IL12.
24. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 21, 22 ou 23, em que as primeira e segunda moléculas de ácido nucléico são primeiro e segundo vetores.
25. Célula hospedeira contendo uma primeira e uma segunda molécula de ácido nucléico como definidas em qualquer uma das reivindica- ções 21 a 24.
26. Composição farmacêutica compreendendo um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
27. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, para o uso no tratamento do corpo humano ou animal através de te- rapia.
28. Uso de um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 17, na fabricação de um medicamento para inibir angio-gênese e/ou crescimento neoplástico em um paciente.
29. Uso de acordo com a reivindicação 28, em que o medicamento é para tratar um tumor, artrite reumatóide, retinopatia diabética, dege-neração muscular relacionada à idade ou angioma.
30. Método de inibir crescimento neoplástico e/ou angiogêneseem um paciente, compreendendo administrar um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 17 ao paciente.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, compreendendo tratar um tumor, artrite reumatóide, retinopatia diabética, degeneração mus- cular relacionada à idade ou angioma inibindo angiogênese.
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