ES2755398T3 - Andamios multiméricos específicos de TRAIL R2 - Google Patents

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ES2755398T3 ES11769481T ES11769481T ES2755398T3 ES 2755398 T3 ES2755398 T3 ES 2755398T3 ES 11769481 T ES11769481 T ES 11769481T ES 11769481 T ES11769481 T ES 11769481T ES 2755398 T3 ES2755398 T3 ES 2755398T3
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Thomas Thisted
Jeffrey Swers
David Tice
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MedImmune LLC
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Abstract

Un andamio multimérico recombinante específico de TRAIL R2 que comprende seis andamios de monómero de Tn3 específico de TRAIL R2, en el que (a) cada andamio de monómero de Tn3 comprende siete hebras beta designadas A, B, C, D, E, F, y G, ligadas a seis regiones de bucles designadas AB, BC, CD, DE, EF, y FG, en las que el bucle AB consiste de la SEQ ID NO: 5 35, el bucle BC consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 97, 98, y 168, el bucle CD consiste de la SEQ ID NO: 37, el bucle DE consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 102, 103, y 179, el bucle EF consiste de la SEQ ID NO: 39, y el bucle FG consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 106, 108, 109, 169, y 170, en el que la hebra A beta consiste de IEV, la hebra B beta consiste de ALITW, la hebra C beta consiste de CELX1YGI, la hebra D beta consiste de TTIX2L, la hebra E beta consiste de YSI, la hebra F beta consiste de YEVSLIC, y la hebra G beta consiste de KX3TFTT, en la que X1 representa el residuo de aminoácidos A o T, en el que X2 representa el residuo de aminoácidos D o G, y en el que X3 representa el residuo de aminoácidos E o G; (b) los andamios de monómero de Tn3 se conectan en un formato tándem lineal; y (c) en el que el andamio de monómero de Tn3 comprende al menos un enlace de disulfuro intramolecular de origen no natural, en el que el enlace estabiliza el andamio de monómero.

Description

DESCRIPCIÓN
Andamios multiméricos específicos de TRAIL R2
Antecedentes
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere en general al campo de los miméticos de anticuerpos, específicamente unos andamios multiméricos basados en el dominio de fibronectina tipo III (Fn3) útil, por ejemplo, para la generación de productos que tienen características de unión novedosas. En particular, la divulgación se refiere a andamios multiméricos específicos de TRAIL R2 derivados del tercer dominio FnIII de Tenascina C humana y su uso para la detección y modulación del receptor TRAIL R2 de la función mediada por TRAIL R2, tal como el tratamiento del cáncer y otros trastornos.
Técnica antecedente
Las biomoléculas capaces de unirse específicamente a un epítopo objetivo deseado son de gran importancia como herramientas terapéuticas, de investigación y de diagnóstico médico. Un ejemplo bien conocido de esta clase de moléculas es el anticuerpo. Se pueden seleccionar anticuerpos que se unan específicamente y con afinidad a casi cualquier epítopo estructural. Sin embargo, los anticuerpos clásicos son moléculas heterotetraméricas estructuralmente complejas y son difíciles de expresar en sistemas eucariotas simples. Como resultado, la mayoría de los anticuerpos se producen utilizando sistemas de expresión de células de mamíferos complejos y costosos. Las proteínas que tienen estructuras tridimensionales relativamente definidas, comúnmente denominadas andamios de proteínas, se pueden utilizar como reactivos para el diseño de productos de ingeniería. Un área particular en la que dichos andamios son útiles es el campo del diseño mimético de anticuerpos. Los miméticos de anticuerpos, es decir, pequeños productos terapéuticos de proteínas sin anticuerpos, aprovechan las ventajas de los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos, tales como la unión de alta afinidad de los objetivos y la baja inmunogenicidad y toxicidad, mientras evitan algunas de las deficiencias, tales como la tendencia a los fragmentos de anticuerpos para agregar y ser menos estables que las IgG de longitud completa.
Estos inconvenientes se pueden abordar al utilizar fragmentos de anticuerpos creados mediante la eliminación de partes del pliegue nativo de anticuerpos. Sin embargo, esto a menudo provoca agregación cuando los residuos de aminoácidos que normalmente estarían enterrados en un entorno hidrófobo, como una interfaz entre el dominio variable y el dominio constante, se exponen al solvente. Un ejemplo de un mimético de anticuerpos basado en andamios se basa en la estructura de un módulo de fibronectina de tipo III
(FnIII), un dominio que se encuentra ampliamente en las clases de filamentos y proteínas, como en la sangre de mamíferos y proteínas estructurales. El documento WO 2009/058379 describe ciertos andamios de proteínas que se unen específicamente a un objetivo y métodos para preparar, detectar, diseñar por ingeniería y utilizar dichos andamios de proteínas. En particular, esta solicitud de patente describe andamios que incluyen el tercer dominio FnIII de tenascina C (también conocido como el dominio “Tn3”).
El TRAIL (ligando que induce apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral, también denominado Apo2L y TNFSF10 en la literatura) pertenece a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) y se ha identificado como un activador de la muerte celular programada, o apoptosis, en células de tumor. Las formas de TRAIL unidas a la membrana y solubles pueden desencadenar la apoptosis a través de la interacción con los receptores TRAIL ubicados en las células objetivo. En humanos, se ha identificado que cinco receptores tienen actividad de unión para TRAIL. Al unirse TRAIL a TRAIL R1 o TRAIL R2, se desencadena la muerte celular relacionada con la caspasa. A la luz de esta actividad de muerte celular, se están siguiendo enfoques terapéuticos basados en TRAIL. Se han desarrollado varios enfoques terapéuticos basados en los anticuerpos agonistas humanos TRAIL o TRAIL R1 o R2, sin embargo, TRAIL tiene una vida muy corta, se une a los receptores señuelo y el gran tamaño de los anticuerpos puede limitar su penetración tumoral. De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad de nuevas moléculas que puedan unirse a los receptores TRAIL, composiciones farmacéuticas que comprendan esas moléculas, métodos para el cribado de dichas moléculas y métodos para utilizar dichas moléculas en el tratamiento terapéutico de una amplia variedad de cánceres.
El documento WO 2009/058379 divulga andamios multiméricos que comprenden al menos dos andamios que se unen específicamente a TRAIL-R2.
Resumen
La presente divulgación proporciona un andamio multimérico recombinante específico de TRAIL R2 que comprende dos andamios de monómero de Tn3, en los que (a) cada andamio de monómero de Tn3 comprende siete hebras beta designadas A, B, C, D, E, F, y G, y seis regiones de bucles designadas AB, BC, CD, d E, EF, y FG, (b) los andamios de monómero de Tn3 se conectan en tándem, y (c) el andamio multimérico recombinante se une específicamente a TRAIL R2. También se divulga en el presente documento un andamio multimérico específico de TRAIL R2 que comprende 3, 4, 5, 6, 7, o 8 andamios de monómero de Tn3. También se divulga en el presente documento un andamio de monómero en el que todos los andamios de monómero de Tn3 en un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgados en el presente documento están en tándem.
También se divulga en el presente documento cuando al menos un andamio de monómero de Tn3 de un andamio multimérico específico de TRAIL R2 se conecta directamente, por un ligador, o por una fracción heteróloga a 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 de otros andamios de monómero de Tn3. También se divulga en el presente documento cuando al menos dos andamios de monómero de Tn3 de un andamio multimérico específico de TRAIL R2 se conectan directamente sin un ligador interpuesto entre los andamios de monómero de Tn3. También se divulga en el presente documento cuando al menos dos andamios de monómero de Tn3 de un andamio multimérico específico de TRAIL R2 se conectan por un ligador. También se divulga en el presente documento cuando el ligador comprende un ligador de péptido. También se divulga en el presente documento cuando el ligador de péptido es un ligador de péptido flexible. También se divulga en el presente documento cuando el ligador de péptido comprende una secuencia (GxS)y en la que x e y son enteros, en los que x = 1, 2, 3 o 4, y en los que y = 1,2, 3, 4, 5, 6, o 7.
También se divulga en el presente documento cuando la unión de un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento a TRAIL R2 se mejora sobre aquel de un andamio de monómero de Tn3 específico de TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando la unión del andamio multimérico específico de TRAIL R2 a TRAIL R2 mejora la acción sobre el objetivo sobre el de un andamio de monómero de Tn3 específico de TRAIL R2.
También se divulga en el presente documento cuando la mejora en la unión de un andamio específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento a TRAIL R2 sobre el de un andamio de monómero de Tn3 específico de TRAIL R2 es una mejora en la afinidad de unión y/o una mejora en la avidez de unión. También se divulga en el presente documento cuando la afinidad de unión para TRAIL R2 y la estabilidad de proteína se mejoran sobre aquellos de un andamio de monómero de Tn3 específico de TRAIL r2. También se divulga en el presente documento cuando la avidez de unión para TRAIL R2 y estabilidad de proteína se mejoran sobre aquellos de un andamio de monómero de Tn3 específico de TRAIL R2.
También se divulga en el presente documento cuando un andamio multimérico específico de TRAIL R2 contiene un ligador que comprende una fracción funcional. También se divulga en el presente documento cuando la fracción funcional es una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. También se divulga en el presente documento cuando la inmunoglobulina o fragmento de la misma se selecciona del grupo que consiste de: un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fd, un fragmento Fd', un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento F(ab')2, un scFv, un diacuerpo, un anticuerpo lineal, un anticuerpo de longitud completa, una región Fc, y una combinación de dos o más de dichas fracciones. También se divulga en el presente documento cuando la inmunoglobulina o fragmento de la misma comprende un dominio Fc y una región de bisagra de una IgG. También se divulga en el presente documento cuando la inmunoglobulina o fragmento de la misma comprende adicionalmente un dominio CH1. También se divulga en el presente documento cuando la inmunoglobulina o fragmento de la misma comprende un dominio C-kappa o un dominio C-lambda de una IgG.
También se divulga en el presente documento cuando al menos uno de los andamios de monómero de Tn3 de un andamio multimérico específico de TRAIL R2 se fusiona a una fracción heteróloga. También se divulga en el presente documento cuando la fracción heteróloga comprende una composición seleccionada del grupo que consiste de: una proteína, un péptido, un dominio de proteína, un ligador, un fármaco, una toxina, un agente citotóxico, un agente de formación de imágenes, un radionúclido, un compuesto radiactivo, un polímero orgánico, un polímero inorgánico, un polietilenglicol (PEG), biotina, una albúmina en suero humana (HSA), una porción de unión de HSA FcRn, un anticuerpo, un dominio de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo de dominio, un dominio de unión a la albúmina, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, un andamio no-FnIII, una etiqueta de epítopo, un polímero de polipéptido recombinante, una citoquina, y una combinación de dos o más de dichas fracciones.
También se divulga en el presente documento cuando un andamio multimérico específico de TRAIL R2 se conjuga a PEG. También se divulga en el presente documento cuando más de dos de los andamios de monómero de Tn3 se conectan mediante ligadores y en los que al menos un ligador es estructuralmente y/o funcionalmente diferente de otros ligadores.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de monómero de Tn3 en un andamio multimérico específico de TRAIL R2 se conectan en un formato ramificado. También se divulga en el presente documento cuando algunos andamios de monómero de Tn3 en un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento se conectan en un formato tándem lineal y algunos andamios de monómero de Tn3 se conectan en un formato ramificado. También se divulga en el presente documento cuando al menos dos andamios de monómero de Tn3 en un andamio multimérico específico de TRAIL R2 son idénticos. También se divulga en el presente documento cuando al menos dos andamios de monómero de Tn3 en un andamio multimérico específico de TRAIL R2 son diferentes.
También se divulga en el presente documento cuando un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento se une a al menos un objetivo adicional, que el separador un antígeno de célula T. También se divulga en el presente documento cuando este antígeno de célula T es CD40L.
También se divulga en el presente documento cuando un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento es un agonista de receptor. También se divulga en el presente documento cuando al menos dos andamios de monómero de Tn3 en un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento se unen al mismo epítopo sobre TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando al menos dos andamios de monómero de Tn3 en un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento se unen a diferentes epítopos sobre TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando los diferente epítopos TRAIL R2 son epítopos no superpuestos. También se divulga en el presente documento cuando los diferentes epítopos TRAIL R2 son epítopos superpuestos.
También se divulga en el presente documento cuando las hebras beta de al menos dos andamios de monómero de Tn3 en un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento tienen al menos 90% de identidad de secuencia con las hebras beta de la SEQ ID NO: 1. También se divulga en el presente documento cuando al menos dos andamios de monómero de Tn3 en un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento comprenden la secuencia de aminoácidos:
IEV(XAB)nALITW(XBo)nCELX1YGI(XoD)nTTIX2L(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKX3TFTT en la que Xab, Xbc, Xcd, Xde, XEF, y XFG representan los residuos de aminoácidos presentes en los bucles AB, BC, CD, DE, EF, y FG, respectivamente, en los que X1 representa el residuo de aminoácidos A o T, en el que X2 representa el residuo de aminoácidos D o G, en el que X3 representa el aminoácido E o G, y en el que la longitud del bucle n es un entero entre 2 y 26. También se divulga en el presente documento cuando el bucle AB comprende la SEQ ID NO: 35, el bucle CD comprende la SEQ ID NO: 37, y el bucle EF comprende la SEQ ID NO: 39. También se divulga en el presente documento cuando el bucle Bc comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 97, 98, o 168. También se divulga en el presente documento cuando el bucle DE comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las s Eq ID NOs: 102, 103, y 179. También se divulga en el presente documento cuando el bucle FG comprende una secuencia seleccionada de los grupos que consisten de las SEQ ID NOs: 106, 108, 109, 169 y 170. También se divulga en el presente documento cuando el bucle BC comprende la SEQ ID NO: 97, el bucle DE comprende la SEQ ID NO: 179, y el bucle FG comprende la SEQ ID NO: 170. También se divulga en el presente documento cuando un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento comprende la SEQ ID NO: 209 o 204.
También se divulga en el presente documento cuando un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento se une a un receptor TRAIL R2 con una afinidad (Kd) de 1 pM o menos. También se divulga en el presente documento cuando un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento se une a un receptor TRAIL R2 con una afinidad (Kd) de 500 nM o menos. También se divulga en el presente documento cuando un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento se une a un receptor TRAIL R2 con una afinidad (Kd) de 100 nM o menos.
La presente divulgación también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica cualquiera de los andamios multiméricos descritos anteriormente. También se divulga en el presente documento cuando un vector de expresión comprende el ácido nucleico. También se divulga en el presente documento cuando una célula anfitriona puede comprender el vector.
La presente divulgación también proporciona un método para producir un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento que comprende cultivar una célula anfitriona bajo condiciones en las que se expresa el andamio multimérico codificado por la molécula de ácido nucleico. La presente divulgación también proporciona una composición que comprende un andamio multimérico específico de TRAIL R2 recombinante divulgado en el presente documento en un excipiente farmacéuticamente aceptable. La presente divulgación también proporciona un método de prevenir, tratar, aliviar, o manejar cáncer en un paciente en necesidad del mismo al administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento. También se divulga en el presente documento cuando el cáncer se selecciona de cáncer de pulmón, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer de colón, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, y mieloma múltiple.
La presente divulgación también proporciona un método para diagnosticar o formar imagen de una enfermedad en un paciente con una composición que comprende un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento. También se proporciona un método para inducir apoptosis en una célula que expresa TRAIL R2 que comprende poner en contacto la célula con un andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento. También se divulga en el presente documento cuando el método de prevenir, tratar, aliviar, o manejar cáncer en un paciente en necesidad del mismo comprende adicionalmente una terapia adicional, en la que dicha terapia es inmunoterapia, terapia biológica, quimioterapia, terapia de radiación, o terapia de fármaco de molécula pequeña.
También se divulga en el presente documento cuando el andamio multimérico específico de TRAIL R2 se une específicamente a TRAIL r2 humano. También se divulga en el presente documento cuando el andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento se une a TRAIL R2 y (a) agoniza el receptor TRAIL R2, (b) imita la unión de TRAIL al receptor TRAIL R2, (c) facilita la dimerización u oligomerización del receptor TRAIL R2, (d) induce la apoptosis, (e) reduce o inhibe la viabilidad celular, o (f) una combinación de actividades (a), (b), (c), (d) y (e).
La presente divulgación también proporciona un método para alterar una actividad en una célula que expresa TRAIL R2 que comprende poner en contacto la célula con el andamio multimérico específico de TRAIL R2 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-47, en la que el andamio multimérico se une a TRAIL R2 y (a) agoniza el receptor TRAIL R2, (b) imita la unión de TRAIL al receptor TRAIL R2, (c) facilita la dimerización u oligomerización del receptor TRAIL R2, (d) induce la apoptosis, (e) reduce o inhibe la viabilidad celular, o (f) una combinación de actividades (a), (b), (c), (d) y (e).
También se divulga en el presente documento cuando el PEG se conjuga al andamio multimérico específico de TRAIL R2 divulgado en el presente documento en el N terminal o el C terminal.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra formatos lineales, similares a anticuerpos y fusión de andamios de Tn3 multivalentes. Los andamios de Tn3 multivalentes contienen dos o más módulos Tn3 unidos mediante un separador indicado por un bloque octagonal negro, en el que el separador puede ser, por ejemplo, un ligador.
La Figura 2 muestra andamios de Tn3 multivalentes específicos de TRAIL R2, designados como A2 a A9, que se generaron de acuerdo con los tres formatos moleculares diferentes mostrados en la Figura 1 con valencias (número de módulos de Tn3) que varían de 2 a 8.
La Figura 3 muestra un análisis SDS-PAGE no reductor de medios bacterianos crudos (gel derecho) y muestras purificadas por afinidad (gel izquierdo) correspondientes a construcciones en tándem lineales designadas A1 a A5, con valencias que varían de 1 a 8, expresadas en E. coli.
La Figura 4 muestra un ELISA de competición que mide la unión de andamios de Tn3 monovalentes (A1) y multivalentes (A2, A3) a TRAIL R2.
La Figura 5 muestra un histograma de citometría de flujo del andamio multivalente A9 específico de TRAIL R2 que se une a células H2122 en comparación con un andamio de control cognado (B9) que no se une a TRAIL R2.
La Figura 6A muestra el efecto de la valencia sobre la destrucción específica de la estirpe celular H2122 que expresa TRAIL R2 mediante andamios multivalentes.
La Figura 6B muestra la especificidad de la destrucción de células tumorales H2122 mediante andamios multivalentes específicos de TRAIL R2.
La Figura 7A muestra el efecto del formato molecular sobre la destrucción de células H2122 mediante andamios multivalentes específicos de TRAIL R2 que comprenden 4 módulos de Tn3.
La Figura 7B muestra el efecto del formato molecular sobre la destrucción de células H2122 mediante andamios multivalentes específicos de TRAIL R2 que comprenden 8 módulos de Tn3.
La Figura 8A muestra la destrucción específica de las células Colo205 de la estirpe celular de adenocarcinoma colorrectal que expresan TRAIL R2 mediante andamios de Tn3 específicos de TRAIL R2 tetra-(A3) y octavalente (A5) fusionados linealmente.
La Figura 8B muestra la destrucción específica de la estirpe leucémica de células Jurkat que expresan TRAIL R2 mediante andamios de Tn3 específicos de TRAIL R2 tetra-(A3) y octavalente (A5) fusionados linealmente.
La Figura 9A muestra el diseño de andamios de Tn3 bivalentes en tándem específicos de CD40L de murino (construcciones M13).
La Figura 9B muestra el análisis SDS-PAGE de una construcción M13 monovalente purificada (construcción de Tn3 específica de CD40L), o andamios bivalentes en tándem con ligadores que contienen 1, 3, 5 o 7 unidades Gly4Ser (denotadas como GS) que unen dos módulos de M13. La construcción de M13 monovalente se ejecutó en el carril 2, la construcción C1 en los carriles 3 y 7, la construcción C2 en los carriles 4 y 8, la construcción C3 en los carriles 5 y 9, y la construcción C4 en los carriles 6 y 10. Las muestras se procesaron en condiciones no reducidas (carriles 2-6) o en condiciones reducidas (carriles 7-10).
La Figura 9C muestra la inhibición competitiva de la unión de MuCD40L al receptor CD40 de murino inmovilizado sobre un chip biosensor por andamios en tándem monovalentes (M13) o bivalentes específicos de MuCD40L. Se indica la mitad de la concentración inhibidora máxima (IC50) para las diversas construcciones.
La Figura 9D muestra el efecto inhibidor de andamios en tándem monovalentes (M13) de Tn3, bivalentes específico de MuCD40L o anticuerpo MR1 (un anticuerpo anti-MuCD40L) en la expresión de CD86 inducida por MuCD40L sobre células B.
La Figura 10 muestra los niveles de expresión construcciones de andamio de Tn3 bivalente en tándem biespecífico de TRAIL R2/CD40 y monovalente solubles expresadas recombinantemente en E. coli analizadas por SDS-PAGE de los medios de cultivo bacteriano. Los andamios monovalentes, A1 y 79 se muestran en los carriles 2 y 3, respectivamente. Las construcciones de andamios en tándem que comprenden A1 y 79, unidas en tándem por un ligador de aminoácidos Gly4Ser de longitud creciente (afines a las construcciones C5, C6, C7 y C8) se muestran en los carriles 4-7. Las construcciones expresadas se indican en el gel teñido con un asterisco.
La Figura 11A muestra la unión de andamios de Tn3 biespecíficos de TRAIL R2 ensayados utilizando ELISA de captura.
La Figura 11B muestra la unión de andamios de T n3 biespecíficos a CD40L humano ensayados utilizando ELISA de captura.
La Figura 12 muestra la unión simultánea de andamios de Tn3 en tándem biespecíficos C5, C6, C7 y C8 a TRAIL R2 y CD40L ensayados utilizando un ensayo AlphaScreen™.
La Figura 13 muestra la estabilidad de los andamios de Tn3 en el presente de guanidina-HCl. Se indica el Cm (valor del punto medio) para cada andamio probado.
La Figura 14 muestra la termoestabilidad de tres andamios de Tn3 diferentes con diferentes secuencias de bucle, pero el mismo bucle FG de longitud (nueve aminoácidos) en comparación con el andamio de Tn3 progenitor que tiene un bucle FG más largo analizado por calorimetría diferencial de barrido (DSC).
La Figura 15 muestra el aumento de la estabilidad en presencia de guanidina-HCl de andamios de Tn3 que tienen un bucle FG de nueve aminoácidos de longitud (P1C01, A6 y 71) en comparación con el andamio de Tn3 (WT) progenitor.
La Figura 16A muestra una representación esquemática y expresión de un andamio de Tn3 triespecífico/trivalente. El andamio D1-1E11-79 contiene un dominio de unión Synagis® (D1), seguido por un dominio de unión TRAIL R2-Fc (1E11) y un dominio Tn3 C-terminal específico a CD40L humano (79). Un ligador flexible (Gly4Ser)3 separa cada dominio.
La Figura 16B muestra un gel de SDS-PAGE (4-12% de Bis-Tris) del andamio D1-1E11-79 expresado y purificado. El peso molecular esperado de esta construcción es aproximadamente 34.081 Dalton.
La Figura 17A muestra la unión simultánea del andamio de Tn3 triespecífico/trivalente D1-1E11-79 a huCD40L y TRAIL R2-Fc utilizando análisis de unión AlphaScreen. La señal AlphaScreen (ASS) se muestra como una función de la concentración de TrailR2-Fc.
La Figura 17B muestra la unión simultánea del andamio de Tn3 triespecífico/trivalente D1-1E11-79 a huCD40L y Synagis® utilizando el análisis de unión AlphaScreen. La señal AlphaScreen (ASS) se muestra como una función de la concentración de Synagis®.
La Figura 18 muestra la unión simultánea del andamio de Tn3 triespecífico/trivalente D1-1E11-79 a TRAIL R2-Fc y Synagis® utilizando ELISA.
La Figura 19 muestra una alineación de secuencia del clon de unión a TRAIL R2 progenitor 1C12 y sus derivados madurados por afinidad. La posición del enlace disulfuro diseñado se resalta, la flecha indica la ubicación de la mutación de un marco, y los cambios en los bucles que surgen durante la maduración por afinidad se muestran en los bloques resaltados A, B, C y D.
La Figura 20 muestra un ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo del clon 1C12 y sus derivados madurados por afinidad.
La Figura 21 muestra la concentración de tándems G6 en función del tiempo en suero de ratón.
La Figura 22A muestra una alineación de secuencia correspondiente a la mejora de ingeniería de la reactividad cruzada cyno para el clon F4. La característica común entre todos estos clones es una mutación desde D hasta G dos aminoácidos antes del bucle DE.
La Figura 22B muestra mediciones ELISA de la inhibición de la unión de TRAIL R2-Fc humano o cyno a placas recubiertas con F4mod1 mediante el monómero F4 o F4mod1.
La Figura 23A muestra una secuencia de alineación correspondiente a la germinación del clon F4mod1, específicamente una comparación de F4, F4mod1 y F4mod12 con la estirpe germinal de TN3.
La Figura 23B muestra mediciones ELISA de la inhibición de la unión de TRAIL-R2-Fc humano o cyno a placas recubiertas con F4mod1 por monómero F4, F4mod1 o F4mod12.
La Figura 23C muestra un ensayo de destrucción de células Colo205 que compara el tándem 6 de G6 con el tándem 6 de F4mod12.
La Figura 23D muestra un ensayo de destrucción de células Colo205 que compara el tándem 8 de G6 con el tándem 8 de F4mod12.
La Figura 24 muestra un ensayo de destrucción de células HT29 que compara la actividad del tándem 8 de G6 con el tándem 8 de F4mod12 en la estirpe celular resistente a TRAIL hT29.
La Figura 25 muestra una alineación de secuencia correspondiente a los clones probados en Análisis de Onmunogenicidad Antitope EpiScreen. Se resaltan las diferencias con respecto al clon F4mod12.
La Figura 26A muestra trazas de SEC de tándem 8 de G6 no purificadas con SEC.
La Figura 26B muestra trazas de SEC de tándem 8 de G6 purificadas con SEC.
La Figura 27 muestra cambios en el volumen tumoral en modelos de xenoinjerto de cáncer colorrectal Colo205 en respuesta a diferentes dosis de los agonistas de T n3 TRAIL R2 tándem 6 de G6 y tándem 8 de G6.
La Figura 28 muestra cambios en el peso corporal en modelos de xenoinjerto colorrectal Colo205 en respuesta a diferentes dosis de los agonistas de T n3 TRAIL R2 tándem 6 de G6 y tándem 8 de G6.
Descripción detallada
Definiciones
Se debe entender que esta divulgación no está limitada a composiciones específicas o etapas del proceso, ya que tales pueden variar. Se debe notar que, como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Los términos “un” (o “una”), así como los términos “uno o más” y “al menos uno” se pueden utilizar indistintamente en el presente documento.
Adicionalmente, “y/o” cuando se utiliza en el presente documento debe tomarse como una divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por lo tanto, el término “y/o” como se utiliza en una frase como “A y/o B” en el presente documento pretende incluir “A y B”, “A o B”, “A”, (solo) y “B” (solo). Asimismo, el término “y/o” como se utiliza en una frase tal como “A, B y/o C” pretende abarcar cada uno de los siguientes escenarios: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica con el que se relaciona la presente divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, proporcionan una experticia con un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta divulgación.
Las unidades, los prefijos y los símbolos se denotan en su formato aceptado Systeme International de Unites (SI). Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi. Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la divulgación, que se pueden obtener haciendo referencia a la especificación en su conjunto. De acuerdo con lo anterior, los términos definidos a continuación se definen más completamente por referencia a la especificación en su totalidad.
Los aminoácidos se mencionan en el presente documento ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Los nucleótidos, del mismo modo, se conocen por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
El término “epítopo”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un determinante de proteína capaz de unirse a un andamio de la presente divulgación. Los epítopos generalmente consisten en agrupaciones de moléculas químicamente activas en la superficie, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero, pero no al último se pierde en presencia de solventes desnaturalizantes.
Los términos “dominio de fibronectina tipo III (FnIII)” y “dominio FnIII” se refieren a polipéptidos homólogos al dominio de fibronectina humana tipo III que tienen al menos 7 hebras beta que se distribuyen entre dos láminas beta, que se empaquetan entre sí para formar el núcleo de la proteína, y además contiene bucles expuestos a solventes que conectan las hebras beta entre sí. Se presentan al menos tres de estos bucles en cada borde del emparedado de lámina beta, en el que el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las hebras beta. También se divulga en el presente documento cuando un dominio FnIII comprende 7 hebras beta designadas A, B, C, D, E, F y G unidas a seis regiones de bucles designadas AB, BC, CD, DE, EF y FG, en las que una región de bucle conecta cada cadena beta
El término “ADN” se refiere a una secuencia de dos o más desoxirribonucleótidos unidos covalentemente, de origen natural o modificados.
El término “proteína de fusión” se refiere a la proteína que incluye (i) uno o más andamios de la presente divulgación unidos a (ii) una segunda proteína diferente (es decir, una proteína “heteróloga”).
El término “fracción heteróloga” se utiliza en el presente documento para indicar la adición de una composición a un andamio divulgado en el presente documento en el que la composición normalmente no es parte de un dominio FnIII. Las fracciones heterólogas de ejemplo incluyen proteínas, péptidos, dominios de proteínas, ligadores, fármacos, toxinas, agentes de formación de imágenes, compuestos radiactivos, polímeros orgánicos e inorgánicos, y cualquier otra composición que pueda proporcionar una actividad que no sea inherente al dominio FnIII, que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), un agente citotóxico, un radionúclido, agente de formación de imágenes, biotina, un dominio de dimerización (por ejemplo dominio de cremallera de leucina), albúmina de suero humano (HSA) o una porción de unión a FcRn del mismo, un dominio o fragmento de un anticuerpo (por ejemplo, dominio variable de anticuerpo, un dominio CH1, un dominio Ckappa, un dominio Clambda, un dominio CH2 o CH3), un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo de dominio, un dominio de unión a albúmina, una molécula de IgG, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, un andamio no FnIII, una etiqueta de epítopo, un polímero polipeptídico recombinante, un citoquinas y similares.
El término “ligador”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier ensamble molecular que une o conecta dos o más andamios. El ligador puede ser una molécula cuya función es actuar como un “separador” entre módulos en un andamio, o también puede ser una molécula con función adicional (es decir, una “fracción funcional”). Una molécula incluida en la definición de “fracción heteróloga” también puede funcionar como un conector.
Los términos “ligado” y “fusionado” se utilizan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos o más andamios, fracciones heterólogas o ligadores por cualquier medio, que incluye la conjugación química o los medios recombinantes.
Los términos “multímero”, “andamio multimérico” y “andamio multivalente” se refieren a una molécula que comprende al menos dos andamios FnIII en asociación. Los andamios que forman un andamio multimérico se pueden ligar a través de un ligador que permite que cada andamio funcione independientemente. “Multimérico” y “multivalente” se pueden utilizar indistintamente en el presente documento. Un andamio multivalente puede ser monoespecífico o biespecífico.
Los términos “dominio” o “dominio de proteína” se refieren a una región de una proteína que puede plegarse en una estructura tridimensional estable, a menudo independientemente del resto de la proteína, y que puede estar dotada de una función particular. Esta estructura mantiene una función específica asociada con la función del dominio dentro de la proteína original, por ejemplo, actividad enzimática, creación de un motivo de reconocimiento para otra molécula, o para proporcionar los componentes estructurales necesarios para que una proteína exista en un entorno particular de proteínas. Tanto dentro de una familia de proteínas como dentro de las superfamilias de proteínas relacionadas, los dominios de proteínas pueden ser regiones conservadas evolutivamente. Al describir el componente de un andamio multimérico, los términos “dominio”, “Andamio monomérico” y “módulo” se pueden utilizar indistintamente. Por “dominio FnIII nativo” se entiende cualquier dominio FnIII no recombinante que está codificado por un organismo vivo.
Una “secuencia de proteínas” o “secuencia de aminoácidos” significa una representación lineal de los constituyentes de aminoácidos en un polipéptido en una dirección de terminal amino a terminal carboxilo en la cual los residuos que están próximos entre sí en la representación son contiguos en la estructura primaria del polipéptido.
El término “ácido nucleico” se refiere a dos o más nucleótidos o análogos o derivados de nucleótidos unidos covalentemente. Como se utiliza en el presente documento, este término incluye, sin limitación, ADN, ARN y ANP. “Ácido nucleico” y “polinucleótido” se utilizan indistintamente en el presente documento.
El término “polinucleótido” pretende abarcar un ácido nucleico singular, así como ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN de plásmido (ADNp). El término ácido nucleico o polinucleótido “aislado” se refiere a una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha eliminado de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica, por ejemplo, un andamio divulgado en el presente documento contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente divulgación. Ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células anfitrionas heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente divulgación. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente divulgación incluyen adicionalmente dichas moléculas producidas sintéticamente. Adicionalmente, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, un sitio de unión al ribosoma o un terminador de la transcripción.
El término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a un compuesto o proteína que puede administrarse a un animal (por ejemplo, un mamífero) sin consecuencias médicas adversas significativas.
El término “portador fisiológicamente aceptable” se refiere a un portador que no tiene un impacto perjudicial significativo sobre el anfitrión tratado y que conserva las propiedades terapéuticas del compuesto con el que se administra. Un vehículo fisiológicamente aceptable de ejemplo es la solución salina fisiológica. Otros portadores fisiológicamente aceptables y sus formulaciones son conocidos por un experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (18a edición), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa.
Por “polipéptido” se entiende cualquier secuencia de dos o más aminoácidos ligados linealmente por enlaces amida (enlaces peptídicos) independientemente de la longitud, la modificación posterior a la traducción o la función. “Polipéptido”, “péptido” y “proteína” se utilizan indistintamente en el presente documento. Por lo tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos u oligopéptidos se incluyen dentro de la definición de “polipéptido”, y el término “polipéptido” puede utilizarse en lugar de, o de manera intercambiable con cualquiera de estos términos. El término “polipéptido” también pretende referirse a los productos de modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, que incluyen, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, división proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede derivarse de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología recombinante, pero no necesariamente se traduce de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar un polipéptido de cualquier manera, incluso mediante síntesis química.
También se incluyen como polipéptidos de la presente divulgación fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores, y cualquier combinación de los mismos. Las variantes pueden ocurrir naturalmente o no ser de origen natural. Se pueden producir variantes de origen no natural utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en la materia. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. También se incluyen como “derivados” aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos estándar.
Por “aleatorizado” o “mutado” se entiende que incluye una o más alteraciones de aminoácidos, que incluyen supresión, sustitución o adición, en relación con una secuencia de plantilla. Por “aleatorización” o “mutación” se entiende el proceso de introducción, en una secuencia, de dicha alteración de aminoácidos. La aleatorización o mutación se puede lograr a través de una variación de secuencia intencional, ciega o espontánea, generalmente de una secuencia de codificación de ácidos nucleicos, y puede ocurrir por cualquier técnica, por ejemplo, PCR, PCR propensa a errores o síntesis química de ADN. Los términos “aleatorización”, “aleatorizado”, “mutación”, “mutado” y similares se utilizan indistintamente en el presente documento.
Por “cognado” o “proteína cognada, no mutada” se entiende una proteína que es idéntica en secuencia a una proteína variante, excepto por las mutaciones de aminoácidos introducidas en la proteína variante, en la que la proteína variante es aleatorizada o mutada.
Por “ARN” se entiende una secuencia de dos o más ribonucleótidos unidos de forma covalente, de origen natural o modificados. Un ejemplo de un ARN modificado incluido en este término es el ARN de fosforotioato.
Los términos “andamio de la presente divulgación” o “andamios de la presente divulgación” o “andamio divulgado en el presente documento” o “andamios divulgados en el presente documento” como se utilizan en el presente documento, se refieren a andamios multiméricos, así como unod andamios monoméricos FnIII. El término “objetivo” se refiere a un compuesto reconocido por un andamio específico de la divulgación. Los objetivos típicos incluyen proteínas, polisacáridos, polinucleótidos y moléculas pequeñas. Los términos “objetivo” y “antígeno” se utilizan indistintamente en el presente documento. El término “especificidad” como se utiliza en el presente documento, por ejemplo, en los términos “se une específicamente” o “unión específica”, se refiere a la afinidad relati va mediante la cual un andamio de la presente divulgación se une a uno o más antígenos a través de uno o más dominios de unión a antígeno, y esa unión implica cierta complementariedad entre uno o más dominios de unión a antígeno y uno o más antígenos. De acuerdo con esta definición, se dice que un andamio de la presente divulgación se “une específicamente” a un epítopo cuando se une a ese epítopo más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo aleatorio no relacionado.
El término “afinidad”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un cierto andamio de la presente divulgación a un epítopo individual.
El término “avidez”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la estabilidad global del compl ejo entre una población de andamios de la presente divulgación y un cierto epítopo, es decir, la fuerza funcionalmente combinada de la unión de una pluralidad de andamios con el antígeno. La avidez está relacionada tanto con la afinidad de los dominios de unión a antígeno individuales con epítopos específicos, como también con la valencia del andamio de la presente divulgación.
El término “acción sobre el objetivo” se refiere a la unión de un andamio multimérico de la presente divulgación a uno o más objetivos y a los efectos biológicos resultantes de dicha unión. A este respecto, múltiples unidades de unión a antígeno en un andamio multimérico pueden interactuar con una variedad de objetivos y/o epítopos y, por ejemplo, acercar físicamente dos objetivos, desencadenar cascadas metabólicas a través de la interacción con objetivos distintos, etc. Con referencia a TRAIL R2, “acción sobre el objetivo” se refiere al efecto logrado, por ejemplo, mediante la mejora, estimulación o activación, de una o más actividades biológicas de TRAIL R2.
El término “valencia”, como se utiliza en el presente documento, se refiere al número de módulos potenciales de unión a antígeno, por ejemplo, el número de módulos FnIII en un andamio de la presente divulgación. Cuando un andamio de la presente divulgación comprende más de un módulo de unión a antígeno, cada módulo de unión puede unirse específicamente, por ejemplo, al mismo epítopo o un epítopo diferente, en el mismo objetivo o diferentes objetivos.
El término “enlace disulfuro” como se utiliza en el presente documento incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o puente con un segundo grupo tiol.
Los términos “módulo de Tn3” y “andamio de Tn3” como se utilizan en el presente documento, se refieren a un andamio FnIII en el que la hebra A beta comprende la SEQ ID NO: 42, la hebra B beta comprende la SEQ ID NO: 43, la hebra C beta SEQ ID NO: 45 o 131, la hebra D beta comprende la SEQ ID NO: 46, la hebra E beta comprende la SEQ ID NO: 47, la hebra F beta comprende la SEQ ID NO: 49, y la hebra G beta comprende la SEQ ID NO: 52, en la que al menos un bucle es una variante de origen no natural de los bucles en el “andamio de Tn3 de tipo silvestre”. También se divulga en el presente documento cuando una o más de las hebras beta de un módulo de Tn3 comprenden al menos una sustitución de aminoácidos, excepto que los residuos de cisteína en la hebra C beta (por ejemplo, la cisteína en SEQ ID NOs: 45 o 131) y las hebras F beta (SEQ ID NO: 49) no se sustituyen.
El término “andamio de Tn3 de tipo silvestre”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un andamio de FnIII que comprende la SEQ ID NO: 1, es decir, un andamio de FnIII de ingeniería derivado del 3er FnIII de tenascina humana C.
El término “inmunoglobulina” y “anticuerpo” comprende varias clases amplias de polipéptidos que se pueden distinguir bioquímicamente. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon. Es la naturaleza de esta cadena la que determina la “clase” del anticuerpo como IgG, Ig, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las versiones modificadas de cada una de estas clases son fácilmente discernibles para el experto en la técnica. Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo” incluye, pero no se limita a un anticuerpo intacto, un anticuerpo modificado, un dominio VL o VL de anticuerpo, un dominio CHI, un dominio Ckappa, un dominio Clambda, un dominio Fc (ver arriba), un dominio CH2, o CH3.
Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo modificado” incluye formas sintéticas de anticuerpos que se alteran de manera que no se producen naturalmente, por ejemplo, anticuerpos que comprenden al menos dos porciones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (como, por ejemplo, anticuerpos o minicuerpos eliminados dominio); formas multiespecíficas de anticuerpos (por ejemplo, biespecíficos, triespecíficos, etc.) alterados para unirse a dos o más antígenos o a diferentes epítopos de un solo antígeno). Adicionalmente, el término “anticuerpo modificado” incluye formas multivalentes de anticuerpos (por ejemplo, trivalentes, tetravalentes, etc., anticuerpos que contra tres o más copias del mismo antígeno). (Véase, por ejemplo, Antibody Engineering, Kontermann & Dubel, eds., 2010, Springer Protocols, Springer).
El término “semivida in vivo” se utiliza en su significado normal, es decir, el momento en que 50% de la actividad biológica de un polipéptido todavía está presente en el cuerpo/órgano objetivo, o el momento en que la actividad del polipéptido es el 50% de su valor inicial. Como alternativa a la determinación de la semivida funcional in vivo, se puede determinar la “semivida en suero”, es decir, el momento en que el 50% de las moléculas de polipéptido circulan en el plasma o en el torrente sanguíneo antes de depurarse. La determinación de la semivida en suero es a menudo más simple que determinar la semivida funcional in vivo y la magnitud de la semivida en suero suele ser una buena indicación de la magnitud de la semivida funcional in vivo. Los términos alternativos a la vida media en suero incluyen la vida media en plasma, la vida media circulante, la vida media circulatoria, la depuración en suero, la depuración en plasma y la semivida de depuración. La funcionalidad a retener se selecciona normalmente de la actividad procoagulante, proteolítica, unión de cofactores, de unión a receptor u otro tipo de actividad biológica asociada con la proteína particular.
El término “aumentado” con respecto a la vida media in vivo funcional o la vida media en plasma se utiliza para indicar que la vida media relevante del polipéptido aumenta estadísticamente significativamente en relación con la de una molécula de referencia (por ejemplo, un polipéptido no modificado), según lo determinado bajo condiciones comparables.
El término “expresión” como se utiliza en el presente documento se refiere a un proceso mediante el cual un gen produce un bioquímico, por ejemplo, un andamio de la presente divulgación o un fragmento del mismo. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula, que incluye, sin limitación, la eliminación de genes, así como la expresión transitoria y la expresión estable. Incluye, sin limitación, la transcripción del gen en uno o más ARNm, y la traducción de dichos ARNm en uno o más polipéptidos. Si el producto final deseado es un bioquímico, la expresión incluye la creación de ese bioquímico y cualquier precursor.
Un “producto de expresión” puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen o un polipéptido. Los productos de expresión descritos en el presente documento incluyen adicionalmente ácidos nucleicos con modificaciones posteriores a la transcripción, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones posteriores a la traducción, por ejemplo, metilación, glucosilación, la adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteínas, división proteolítica y similares.
El término “vector” o “vector de expresión” se utiliza en el presente documento para significar vectores utilizados de acuerdo con la presente divulgación como un vehículo para introducir y expresar un producto de expresión deseado en una célula anfitriona. Como saben aquellos expertos en la técnica, dichos vectores pueden seleccionarse fácilmente del grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente divulgación comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación del ácido nucleico deseado y la capacidad de entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas. El término “células anfitrionas” se refiere a células que albergan vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un producto de expresión. En las descripciones de procesos para el aislamiento de un producto de expresión de anfitriones recombinantes, los términos “célula” y “cultivo celular” se utilizan indistintamente para indicar la fuente del producto de expresión a menos que se especifique claramente lo contrario, es decir, la recuperación del producto de expresión de las “células” significa la recuperación de células enteras centrifugadas o la recuperación del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas. Los términos “tratar” o “tratamiento”, como se utilizan en el presente documento, se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado en un sujeto, tal como la progresión de una enfermedad o afección inflamatoria Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (es decir, sin empeoramiento), retraso o desaceleración de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable.
El término “tratamiento” también significa prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la afección o trastorno, así como aquellos propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que se debe prevenir la afección o trastorno.
Los términos “sujeto”, “individuo”, “animal”, “paciente” o “mamífero” se refieren a cualquier individuo, paciente o animal, en particular un sujeto mamífero, para quien se desea el diagnóstico, el pronóstico o la terapia. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, animales de granja y animales de zoológico, deportes o mascotas, tales como perros, gatos, conejillos de indias, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, etc.
El término “receptor TRAIL”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína que se une a TRAIL y, al unirse a TRAIL, activa la muerte celular programada (apoptosis) en células tumorales. Un ejemplo no limitante de un receptor TRAIL incluye el receptor TRAIL-R2.
Los términos “TRAIL R2” o “receptor TRAIL R2” se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a la secuencia del receptor TRAIL de longitud completa y a las formas de dominio extracelular solubles del receptor descrito en Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), Patentes Estadounidenses Nos. 6,072,047 y 6,342,369: PCT Publ. Nos. WO98/51793, WO98/41629, WO98/35986, WO99/02653, WO99/09165, WO98/46643, y WO99/11791; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997). Las secuencias representativas del receptor TRAIL de longitud completa están disponibles en Acceso de GenBank Nos. AAC51778.1 y 014763.2. El término “agonista del receptor TRAIL” o “agonista” se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que realce, estimule o active parcial o totalmente una o más actividades biológicas de TRAIL R2, y variantes de los mismos biológicamente activas, in vitro, en in situ o in vivo. Ejemplos de dichas actividades biológicas incluyen la apoptosis, así como los que se reportan adicionalmente en la literatura. Un agonista puede funcionar de manera directa o indirecta. Por ejemplo, un agonista del receptor TRAIL puede funcionar para potenciar, estimular o activar parcial o totalmente una o más actividades biológicas de uno o más receptores TRAIL R2, o uno o más receptores TRAIL R2 y otros objetivos, in vivo, in vitro o in situ, como resultado de su unión a TRAIL R2 que provoca la activación del receptor o la transducción de señales.
“TRAIL” o “polipéptido TRAIL” se refiere a un ligando que se une a uno o más receptores TRAIL, incluyendo TRAIL R2, así como fragmentos biológicamente activos de los mismos. Secuencias de TRAIL representativas están disponibles en Acceso de GenBank Nos. AAH32722.1 y P50591.1. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, secuencias que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 10 a 20 residuos, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 20 residuos de aminoácidos de una secuencia de polipéptidos TRAIL. Opcionalmente, el péptido TRAIL consiste de no más de 25 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 25, 23, 21, 19, 17, 15 o menos residuos de aminoácidos).
Los términos “apoptosis” y “actividad apoptótica” se utilizan en un sentido amplio y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que generalmente se acompaña de uno o cambios celulares característicos, incluida la condensación de citoplasma, pérdida de microvellosidades de la membrana en plasma, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial. Esta actividad puede determinarse y medirse utilizando métodos conocidos de la técnica, por ejemplo, mediante ensayos de viabilidad celular, análisis FACS o electroforesis de ADN, unión a anexina V, fragmentación de ADN, contracción celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (cuerpos apoptóticos).
Introducción
La proteína TRAIL-R2 se codifica por un miembro del gen de la superfamilia de receptores de TNF y contiene un dominio de muerte intracelular. En algunos casos, también se puede conocer como TNFRSF10B; CD262, DR5, KILLER, KILLER/DR5, TRAILR2, TRICK2, TRICK2A, TRICK2B, TRICKB o ZTNFR9. Este receptor puede activarse mediante el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNFSF 10/TRAIL/APO-2L) y transduce una señal apoptótica. Adicionalmente, la apoptosis inducida por TRAIL-R2 implica caspasas y la molécula adaptadora intracelular FADD/MORT1 (Walczak et al. EMBOJ, (1997), 16, 5386-97).
Aunque varios tipos de células normales expresan TRAIL R2, la señalización de apoptosis a través de este receptor parece estar restringida principalmente a las células tumorales, que se vuelven más susceptibles a la apoptosis mediada por el receptor de la muerte en el contexto de su transformación por oncogenes como Myc o Ras (Wang et al. al., Cancer Cell 5: 501-12 (2004); Nesterov y col., Cancer Res. 64:3922-7 (2004)). La TRAIL-R2 se expresa con frecuencia por estirpes celulares de cáncer humano, así como por tumores primarios.
La presente divulgación proporciona una familia de estructuras de proteínas recombinantes, de origen no natural, capaces de unirse a TRAIL R2. En particular, las proteínas descritas en el presente documento se pueden utilizar para mostrar bucles definidos que son análogos a las regiones determinantes de la complementariedad (“CDR”) de una región variable de anticuerpo. Estos bucles pueden estar sujetos a aleatorización o evolución restringida para generar diversidad capaz de unirse a una multitud de compuestos objetivo. Las proteínas pueden ensamblarse en andamios multiespecíficos capaces de unirse a TRAIL R2 y a diferentes objetivos.
La presente divulgación también proporciona aglutinantes específicos de TRAIL-R2 que son útiles para prevenir la mejora, detección, diagnóstico o monitorización de enfermedades, tales como, pero no se limita a, cáncer. Los andamios de unión específicos de TRAIL-R2 de la presente divulgación son útiles para el tratamiento de cánceres en los que las células cancerosas expresan TRAIL-R2. Los cánceres pueden incluir, pero no se limitan a, cáncer de pulmón, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas y mieloma múltiple. La presente divulgación también proporciona métodos para utilizar los andamios para agotar una población celular. Los métodos de la divulgación son útiles en el agotamiento de los siguientes tipos de células: eosinófilos, basófilos, neutrófilos, células T, células B, mastocitos, monocitos y células tumorales.
Los andamios de la presente divulgación son andamios multiméricos que comprenden andamios monoméricos derivados del tercer dominio FnIII de la tenascina C humana, en los que se ha diseñado al menos un enlace disulfuro intramolecular de origen no natural. Los andamios de Tn3 que forman los andamios multiméricos de la presente divulgación se pliegan correctamente independientemente uno del otro, conservan su especificidad y afinidad de unión, y cada uno de los andamios monoméricos conserva sus propiedades funcionales. Cuando los andamios de Tn3 que forman los andamios multiméricos de la presente divulgación presente se ensamblan en andamios multiméricos de alta valencia, por ejemplo, los andamios hexavalentes u octavalentes, los andamios de monómero se pliegan correctamente independientemente uno del otro, conservan su especificidad y afinidad de unión, y cada uno de los andamios de monómero conserva sus propiedades funcionales.
Los andamios de Tn3 multiméricos, que incluyen los andamios de alta valencia (por ejemplo, hexavalente u octavalente), se pliegan correctamente incluso cuando la topología de la construcción no es lineal, por ejemplo, cuando los andamios monoméricos Tn3 o multimérico Tn3 se ensamblan en estructuras ramificadas complejas (por ejemplo, construcciones de fusión Fc o construcciones de tipo anticuerpo).
Los dominios FnIII nativos, como el décimo dominio FnIII de fibronectina humana y la gran mayoría de los dominios FnIII naturales, no contienen enlaces disulfuro ni cisteínas libres. Cuando las proteínas multidominio se modifican por ingeniería mediante la introducción de múltiples cisteínas, falta de expresión de proteínas, precipitación de las proteínas resultantes o la producción de proteínas no funcionales, son ocurrencias comunes. Estos efectos nocivos se deben a la formación incorrecta de enlaces disulfuro intradominio y/o interdominio intramoleculares, y/o la formación incorrecta de enlaces disulfuro intermoleculares, que dan como resultado un plegamiento de proteínas incorrecto. Estos efectos generalmente se intensifican cuando aumenta el número de dominios de cisteínas y/o proteínas.
Por ejemplo, un andamio multimérico lineal que comprende 8 andamios de Tn3 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) contendría 16 cisteínas a lo largo de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido único. También se divulga en el presente documento cuando una construcción similar a un anticuerpo que comprende 4 módulos de Tn3, en los que dos módulos de Tn3 están unidos a cadenas pesadas de IgG y dos Tn3 están unidos a cadenas ligeras de IgG, comprendería 8 cisteínas distribuidas entre 4 cadenas de polipéptidos diferentes. Los andamios multiméricos de la presente divulgación, tales como los que contienen 4, 6 u 8 módulos lineales de Tn3, que comprenden tal número de cisteínas y tal complejidad estructural, se pliegan correctamente y muestran estabilidad mejorada y propiedades de unión al objetivo en comparación con sus respectivos monómeros.
Cuando los andamios de Tn3 que comprenden uno o más puentes disulfuro diseñados se ensamblan en formatos multiméricos de alta valencia, cada andamio monómero individual se pliega correctamente conservando su especificidad y afinidad de unión, así como sus propiedades funcionales. Adicionalmente, los andamios monoméricos son capaces de formar andamios multiméricos estables, funcionales y plegados correctamente.
Una ventaja de los andamios multiméricos de la presente divulgación es su capacidad para unirse a múltiples epítopos, por ejemplo, (i) unirse a múltiples epítopos en un solo objetivo, (ii) unirse a un solo epítopo en múltiples objetivos, (iii) unirse a múltiples epítopos ubicados en diferentes subunidades de un objetivo, o (iv) unirse a múltiples epítopos en múltiples objetivos, aumentando de esta manera la avidez.
Adicionalmente, debido a la flexibilidad de los andamios multiméricos y a la posibilidad de variar la distancia entre múltiples monómeros de Tn3 a través de ligadores, los andamios multiméricos de Tn3 son capaces de unirse a múltiples moléculas objetivo en una superficie (ya sea en la misma célula/superficie o en diferentes células/superficies).
Como resultado de su capacidad para unirse simultáneamente a más de un objetivo, los andamios multiméricos de la presente divulgación se pueden utilizar para modular múltiples rutas, receptores de entrecruzamiento en una superficie celular, unir receptores de la superficie celular en células separadas y/o unir moléculas objetivo o células a un sustrato.
Del análisis de secuencia anterior de dominios FnIII, se observaron grandes variaciones en los bucles BC y FG, lo que sugiere que estos bucles no son cruciales para la estabilidad (véase, por ejemplo, la publicación PCT No: WO 2009/058379). La presente divulgación proporciona andamios de Tn3 que tienen una estabilidad mejorada, que varían en la secuencia de aminoácidos pero que comprenden un bucle FG que tiene una longitud más corta que la del bucle FG correspondiente del tercer FnIII de tenascina C humana. Se ha observado que acortando los bucles FG dan como resultado un andamio de Tn3 mutado que ha aumentado la estabilidad. En consecuencia, la presente divulgación proporciona variantes del andamio de Tn3 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) que tiene una mayor estabilidad de la proteína.
También se divulga en el presente documento cuando un andamio de monómero de Tn3 de la presente divulgación comprende un bucle FG que tiene 9 aminoácidos y una mayor estabilidad en comparación con un andamio que comprende el tercer dominio FnIII nativo de tenascina C humana que tiene una longitud de bucle FG de 10 aminoácidos. Adicionalmente, la presente divulgación proporciona bibliotecas de diversos andamios de Tn3 que tienen longitudes de bucle FG especificadas que son útiles para aislar andamios de Tn3 que tienen una mayor estabilidad.
Adicionalmente, la presente divulgación proporciona andamios multiespecíficos que pueden unirse a TRAIL R2 y uno o más objetivos adicionales, los andamios de afinidad madurada en los que la afinidad de un andamio por un objetivo específico se modula por mutación, y andamios cuya inmunogenicidad y/o reactividad cruzada entre especies animales se modula por mutación. También, la presente divulgación proporciona métodos para producir los andamios divulgados en la presente descripción, así como métodos para diseñar andamios con propiedades fisicoquímicas, farmacológicas o inmunológicas deseables. Adicionalmente, la presente divulgación proporciona usos para dichos andamios y métodos para uso terapéutico, profiláctico y diagnóstico.
El motivo estructural de FnIII
Los andamios de Tn3 de la presente divulgación se basan sobre la estructura de un módulo de fibronectina de tipo III (FnIII), un dominio que se encuentra ampliamente en los tres dominios de la vida y los virus, y en multitud de clases de proteínas.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación se derivan del tercer dominio FnIII de la tenascina C humana (SEQ ID NO: 4). También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un módulo de Tn3. El pliegue tridimensional general de este dominio está estrechamente relacionado con aquel del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada (VH), que en los anticuerpos de dominio único de camellos y camélidos (por ejemplo, llamas) comprende todo el reconocimiento de antígeno unidad.
Los andamios monoméricos Tn3 de la divulgación y el dominio FnIII nativo de la tenascina C se caracterizan por la misma estructura tridimensional, es decir, una estructura beta-intercalada con tres hebras beta (A, B y E) en un lado y cuatro hebras beta (C, D, F y G) en el otro lado, conectados por seis regiones de bucle. Estas regiones de bucle se designan de acuerdo con las hebras beta conectadas a los terminales N y C de cada bucle. De acuerdo con lo anterior, el bucle AB se encuentra entre las hebras beta A y B, el bucle BC se encuentra entre las hebras B y C, el bucle CD se encuentra entre las hebras beta C y D, el bucle DE se encuentra entre las hebras beta D y E. El bucle EF se encuentra entre las hebras beta E y F, y el bucle FG se encuentra entre las hebras beta F y G. Los dominios FnIII poseen bucles expuestos a solventes y son tolerantes a la aleatorización, lo que facilita la generación de diversos conjuntos de andamios de proteínas capaces de unirse a objetivos específicos con gran afinidad.
La presente divulgación también divulga que los dominios Tn3 se utilizan como andamios que están sujetos a una evolución dirigida diseñada para aleatorizar uno o más de los bucles que son análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de anticuerpo. Dicho enfoque de evolución dirigida da como resultado la producción de moléculas similares a anticuerpos con altas afinidades por objetivos de interés, por ejemplo, TRAIL R2. Adicionalmente, los andamios descritos en el presente documento se pueden utilizar para mostrar bucles expuestos definidos (por ejemplo, bucles previamente aleatorizados y seleccionados sobre la base de la unión al objetivo) para dirigir la evolución de las moléculas que se unen a dichos bucles introducidos. Este tipo de selección se puede llevar a cabo para identificar moléculas de reconocimiento para cualquier bucle similar a CDR individual o, alternativamente, para el reconocimiento de dos o los tres bucles similares a CDR combinados en una fracción de unión a epítopo no lineal.
Los andamios de la presente divulgación son moléculas basadas en el tercer dominio FnIII del motivo estructural de tenascina C humana descrito en la publicación PCT No: WO 2009/058379. Un conjunto de tres bucles (designados BC, DE y FG), que pueden conferir un enlace objetivo específico, se ejecutan entre las hebras B y C; las hebras D y E, y las hebras beta F y G, respectivamente. Los bucles BC, DE y Fg del tercer dominio FnIII de la tenascina C humana tienen una longitud de 9, 6 y 10 residuos de aminoácidos, respectivamente. La longitud de estos bucles cae dentro del rango estrecho de los bucles de reconocimiento de antígenos afines encontrados en las cadenas pesadas de anticuerpos, es decir, 7-10, 4-8 y 4-28 aminoácidos de longitud, respectivamente. Del mismo modo, un segundo conjunto de bucles, los bucles AB, Cd y EF (7, 7 y 8, aminoácidos de longitud respectivamente) se ejecutan entre las hebras beta A y B; las hebras beta C y D; y las hebras beta E y F, respectivamente.
Una vez aleatorizado y seleccionado para la unión de alta afinidad a un objetivo, los bucles en el dominio Tn3 puede hacer contactos con objetivos equivalentes a los contactos de los bucles CDR afines en los anticuerpos. De acuerdo con lo anterior, también se divulgan los bucles AB, CD y EF se asignan al azar y se seleccionan para la unión de alta afinidad a uno o más objetivos, por ejemplo, TRAIL R2. También se divulga en el presente documento este proceso de aleatorización y selección puede realizarse en paralelo con la aleatorización de los bucles BC, DE y FG, mientras que este proceso de aleatorización y selección se realiza en serie.
Andamios monoméricos
La presente divulgación proporciona andamios FnIII recombinantes, de origen no natural, que comprende una pluralidad de dominios de cadena beta unidos a una pluralidad de regiones de bucle, en el que una o más de dichas regiones de bucle varían por supresión, sustitución o adición de al menos un aminoácido de los bucles afines en el tipo silvestre Tn3 (SEQ ID NO: 1).
Para generar módulos de Tn3 mejorados con características de unión novedosas, un Tn3 de tipo silvestre se somete a adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos. Se entenderá que, al comparar la secuencia de un andamio mejorado con la secuencia de Tn3, se utiliza la misma definición de las cadenas y bucles beta. Se pueden generar andamios de Tn3 mejorados utilizando el tercer dominio FnIII de tenascina C humana, un andamio de Tn3 de tipo silvestre o un andamio de Tn3 mejorado previamente. También se divulga en el presente documento cuando los andamios monoméricos de la presente divulgación comprenden la secuencia de aminoácidos:
IEV(XAB)nALITW(XBo)nCELX1YGI(XoD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT, en el que Xab, Xbc, Xcd, Xde, XEF, y XFG representan los residuos de aminoácidos presentes en los bucles AB, BC, CD, DE, EF, y FG, respectivamente, en los que X1 representa el residuo de aminoácidos A o T, y en el que n = 2-26.
También se divulga en el presente documento cuando Xab consiste de la SEQ ID NO: 35. También se divulga en el presente documento cuando Xbc consiste de la SEQ ID NO: 36. También se divulga en el presente documento cuando Xcd consiste de la SEQ ID NO: 37. También se divulga en el presente documento cuando Xde consiste de la SEQ ID NO: 38. También se divulga en el presente documento cuando Xef consiste de la SEQ ID NO: 39. También se divulga en el presente documento cuando Xfg consiste de la SEQ ID NO: 40.
También se divulga en el presente documento cuando Xab comprende la SEQ ID NO: 35. También se divulga en el presente documento cuando Xbc comprende la SEQ ID NO: 36. También se divulga en el presente documento cuando Xcd comprende la SEQ ID NO: 37. También se divulga en el presente documento cuando Xde comprende la SEQ ID NO: 38. También se divulga en el presente documento cuando Xef comprende la SEQ ID NO: 39. También se divulga en el presente documento en el que Xfg comprende la SEQ ID NO: 40.
También se divulga en el presente documento cuando Xab consiste de la SEQ ID NO: 35, Xcd consiste de la SEQ ID NO: 37, y Xef consiste de la SEQ ID NO: 39. También se divulga en el presente documento cuando Xbc consiste de la SEQ ID NO: 36, Xde consiste de la SEQ ID NO: 38, y Xfg consiste de la SEQ ID NO: 40.
También se divulga en el presente documento cuando Xab comprende la SEQ ID NO: 35, Xcd comprende la SEQ ID NO: 37, y Xef comprende la SEQ ID NO: 39. También se divulga en el presente documento cuando Xbc comprende la SEQ ID NO: 36, Xde comprende la SEQ ID NO: 38, y Xfg comprende la SEQ ID NO: 40.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios monoméricos de la presente divulgación comprenden un módulo de Tn3. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un módulo de Tn3 (SEQ ID NO: 1), en el que hebra beta C de un tercer dominio FnIII de tenascina humana C (SEQ ID NO; 4) se reemplaza por una hebra beta C variante (SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO; 131) que comprende una cisteína N-terminal y en el que hebra F beta de un tercer dominio FnIII de tenascina humana C (s Eq ID NO: 48) se reemplaza por una hebra F beta variante (SEQ ID NO: 49) que comprende un cisteína C-terminal. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un módulo de Tn3 en el que una o más de las hebras beta comprende al menos una sustitución de aminoácidos excepto que no se pueden sustituir los residuos de cisteína en la hebra C y F beta (SEQ ID NOs: 45 o 131; y SEQ ID NO: 49, respectivamente).
Los bucles que conectan las varias hebras beta de los andamios de la presente divulgación se pueden aleatorizar para longitud y/o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación tienen al menos un bucle que se aleatoriza para longitud y/o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles de un andamio se aleatorizan para longitud y/o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando al menos un bucle de los andamios de la presente divulgación se mantiene constante mientras al menos un bucle adicional se aleatoriza para longitud y/o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando al menos una, al menos dos, o todos los tres de bucles AB, CD, y EF se mantienen constantes mientras al menos uno, al menos dos, o todos los tres de bucles BC, DE, y FG se aleatorizan para longitud o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando al menos uno, al menos dos, o al menos todas tres de bucles AB, CD, y EF se aleatorizan mientras que al menos uno, al menos dos, o todos los tres de bucles BC, DE, y FG se aleatorizan para longitud y/o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando al menos uno, al menos dos, al menos tres de bucles, al menos 4, al menos cinco, o todos los seis de bucles AB, CD, EF, BC, DE, y FG se aleatorizan para longitud o diversidad de secuencia.
También se divulga en el presente documento cuando uno o más residuos dentro de un bucle se mantienen constantes mientras que otros residuos se aleatorizan para longitud y/o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando uno o más residuos dentro de un bucle se mantienen a un número predeterminado y limitado de diferentes aminoácidos mientras que otros residuos se aleatorizan para longitud y/o diversidad de secuencia. De acuerdo con lo anterior, los andamios de la presente divulgación pueden comprender uno o más bucles que tienen una secuencia consenso degenerada y/o uno o más residuos de aminoácidos invariantes. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle AB que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: K-X-X-X-X-X-a, en la que X representa asparagina, ácido aspártico, histidina, tirosina, isoleucina, valina, leucina, fenilalanina, treonina, alanina, prolina, o serina, y en la que (a) representa serina, treonina, alanina, o glicina. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle AB que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: K-X-X-X-X-X-X-X-a, en la que X representa asparagina, ácido aspártico, histidina, tirosina, isoleucina, valina, leucina, fenilalanina, treonina, alanina, prolina, o serina, y en la que (a) representa serina, treonina, alanina, o glicina.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle BC que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: S-X-a-X-b-X-X-X-G, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (a) representa prolina o alanina y en la que (b) representa alanina o glicina. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle BC que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: S-P-c-X-X-X-X-XX-T-G, en la que X representa cualquier aminoácido y en la que (c) representa prolina, serina o glicina. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle BC que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (d) representa prolina, glutamato o lisina, en la que (e) representa asparagina o glicina, y en la que (f) representa serina o glicina.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle CD que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: Xn, en la que X representa cualquier aminoácido, y en la que n= 6, 7, 8, 9, o 10. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle CD que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: Xn, en la que X representa asparagina, ácido aspártico, histidina, tirosina, isoleucina, valina, leucina, fenilalanina, treonina, alanina, prolina, o serina, y en la que n= 7, 8, o 9.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle DE que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: X-X-X-X-X-X, en la que X representa cualquier aminoácido.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle EF que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: X-b-L-X-P-X-c-X, en la que X representa asparagina, ácido aspártico, histidina, tirosina, isoleucina, valina, leucina, fenilalanina, treonina, alanina, prolina, o serina, en la que (b) representa asparagina, lisina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, o glicina, y en la que (c) representa isoleucina, treonina, serina, valina, alanina, o glicina
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle FG que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: X-a-X-X-G-X-X-X-b, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (a) representa asparagina, treonina o lisina, y en la que (b) representa serina o alanina. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle FG que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: X-X-X-XX-X-X-X-X (X9), en la que X representa cualquier aminoácido. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle FG que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: X-a-X-X-X-X-b-N-P-A, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (a) representa asparagina, treonina o lisina y en la que (b) representa serina o glicina. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle FG que se aleatoriza con la siguiente secuencia de consenso: X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A, en la que X representa cualquier aminoácido, y en la que (a) representa asparagina, treonina o lisina.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle FG que se mantiene por ser al menos un residuo de aminoácidos más corto que el bucle FG afín del tercer dominio FnIII de tenascina humana C y se aleatoriza adicionalmente en una o más posiciones.
También se divulga en el presente documento cuando al menos uno de los bucles BC, DE, y FG se aleatoriza, en los que la hebra A beta comprende la SEQ ID NO:41 o 42, la hebra B beta comprende la SEQ ID NO:43, la hebra C beta comprende la SEQ ID No :44, la hebra D beta comprende la SEQ ID NO:46, la hebra E beta comprende la SEQ ID NO:47, la hebra F beta comprende la SEQ ID NO:48, 49, 50, o 51, y la hebra G beta comprende la SEQ ID NO:52 o 53, el bucle AB comprende la SEQ ID NO:35, el bucle CD comprende la SEQ ID NO:37 y el bucle EF comprende la SEQ ID NO:39.
También se divulga en el presente documento cuando al menos uno de los bucles AB, CD, y EF se aleatorizan, en los que la hebra A beta comprende la SEQ ID NO:41 o 42, la hebra B beta comprende la SEQ ID NO:43, la hebra C beta comprende la SEQ ID NO:44 o 45, la hebra D beta comprende la SEQ ID NO:46, la hebra E beta comprende la SEQ ID NO:47, la hebra F beta comprende la SEQ ID NO:48, 49, 50, o 51, y la hebra G beta comprende la SEQ ID NO:52 o 53, el bucle BC comprende la SEQ ID NO:36, el bucle DE comprende la SEQ ID NO:38 y el bucle FG comprende la SEQ ID NO:40.
Estabilidad del andamio mejorada
Enlaces de disulfuro de origen no natural
La estabilidad de los andamios de Tn3 de la presente divulgación puede incrementarse mediante muchos enfoques diferentes. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación se pueden estabilizar al alargar las regiones N y/o C-terminales. Las regiones N y/o C-terminales pueden alargarse con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 aminoácidos. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación pueden estabilizarse al introducir una alteración que aumenta la vida media en suero, como se describe en el presente documento. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación comprenden una adición, supresión o sustitución de al menos un residuo de aminoácido para estabilizar el núcleo hidrófobo del andamio.
Los andamios de Tn3 de la presente divulgación pueden estabilizarse eficazmente mediante ingeniería de enlaces disulfuro de origen no natural. Dichos andamios diseñados pueden expresarse eficientemente como parte de andamios multiméricos. La correcta formación de los enlaces disulfuro y el correcto plegado del andamio diseñado por ingeniería genética se evidencian por la preservación de la actividad biológica del andamio. El hecho de que un andamio diseñado por ingeniería que comprende enlaces disulfuro de origen no natural pueda unirse simultáneamente al menos a dos objetivos (véase, por ejemplo, Ejemplo 8) o tres objetivos (véase, por ejemplo, Ejemplo 12) proporciona evidencia de que la estructura tridimensional del andamio no es alterada significativamente por los enlaces disulfuro diseñados por ingeniería y que se preservan las posiciones relativas de los bucles de unión al objetivo. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden enlaces disulfuro de origen no natural, como se describe en la publicación PCT no: WO 2009/058379.
Se puede utilizar un enfoque bioinformático para identificar posiciones candidatas adecuadas para enlaces disulfuro diseñados por ingeniería.
También se divulga en el presente documento cuando un andamio de monómero de Tn3 de la presente divulgación comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o al menos cinco enlaces disulfuro intramoleculares de origen no natural. También se divulga en el presente documento cuando la presente divulgación proporciona un método para obtener un andamio de Tn3 que tiene una mayor estabilidad en comparación con el tercer dominio FnIII de la tenascina C humana que comprende dos, tres, cuatro o más enlaces disulfuro intramoleculares diseñados por ingeniería.
También se divulga en el presente documento cuando un andamio de monómero de Tn3 de la presente divulgación comprende al menos un enlace disulfuro intramolecular de origen no natural, en el que dicho al menos un enlace disulfuro de origen no natural estabiliza un andamio de monómero.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios multiméricos de la presente divulgación comprenden al menos un enlace disulfuro de origen no natural, en donde el enlace está ubicado entre dos andamios monoméricos distintos en el mismo andamio multimérico. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden al menos un enlace disulfuro de origen no natural, en el que el enlace está ubicado entre dos andamios multiméricos distintos, es decir, el enlace disulfuro es un enlace disulfuro intermolecular. Por ejemplo, un enlace disulfuro puede unir andamios distintos (por ejemplo, dos andamios de monómero de Tn3 aislados, un andamio de monómero de Tn3 aislado y un andamio multimérico, o dos andamios multiméricos), un andamio de Tn3 y un ligador, un andamio de Tn3 y un dominio Fn, o un andamio de Tn3 y un anticuerpo o fragmento del mismo. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden al menos un enlace disulfuro intermolecular de origen no natural que une un andamio y una fracción heteróloga aislado, un andamio y una fracción heteróloga fusionado o conjugado al mismo andamio, o un andamio y una fracción heteróloga fusionado o conjugado a un andamio diferente.
También se describe aquí donde los armazones de la presente divulgación comprenden un enlace disulfuro que forma un andamio multimérico de al menos 2, al menos 3, al menos 4 o más andamios.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación pueden comprender un alargamiento de las regiones de N y/o C terminal. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden una alteración para aumentar la semivida en suero, como se describe en el presente documento. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden una adición, supresión o sustitución de al menos un residuo de aminoácidos para estabilizar el núcleo hidrofóbico del andamio.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprende al menos un enlace de disulfuro intramolecular de origen no natural, en el que el dominio de la hebra A beta comprende la SEQ ID NO:42, la hebra B beta comprende la SEQ ID NO:43, la hebra C beta comprende la SEQ ID NO:45, la hebra D beta comprende la SEQ ID NO:46, la hebra E beta comprende la SEQ ID NO:47, la hebra F beta comprende la SEQ ID NO:49, y la hebra G beta comprende la SEQ ID NO:52.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprende al menos un enlace de disulfuro intramolecular de origen no natural, en el que el dominio de la hebra A beta consiste de la SEQ ID NO:42, la hebra B beta consiste de la SEQ ID NO:43, la hebra C beta consiste de la SEQ ID NO:45, la hebra D beta consiste de la SEQ ID NO:46, la hebra E beta consiste de la SEQ ID NO:47, la hebra F beta consiste de la SEQ ID NO:49, y la hebra G beta consiste de la SEQ ID NO:52.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprende al menos un enlace de disulfuro intramolecular de origen no natural, en el que el dominio de la hebra A beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO:42, la hebra B beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO:43, la hebra C beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO:45, la hebra D beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO:46, la hebra E beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO:47, la hebra F beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO:49, y la hebra G beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO:52.
Estabilidad mejorada del andamio: longitud del bucle FG
Los inventores han descubierto que la longitud del bucle FG cumple una función en la estabilidad de los andamios de Tn3. En particular, los andamios de Tn3 que comprenden bucles FG variantes de origen no natural que son al menos un aminoácido más corto que los encontrados en el bucle FG de un FOI muestran tener una estabilidad mejorada. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación comprenden un bucle FG variante que no se produce de forma natural que es al menos un residuo de aminoácido más corto que el bucle FG del tercer dominio FnIII de la tenascina C.
También se divulga en el presente documento cuando la estabilidad de un andamio de Tn3 se mejora por supresión de al menos un aminoácido en el bucle FG. También se divulga en el presente documento cuando la estabilidad de un andamio de Tn3 se puede mejorar mediante la supresión de al menos 1, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o al menos 7, o al menos 8, o al menos 9, o al menos 10 aminoácidos en el bucle FG. Se contempla específicamente que el andamio estabilizado de Tn3 puede comprender al menos un enlace disulfuro de origen no natural.
También se divulga en el presente documento cuando la variante de andamio de Tn3 también comprende al menos un bucle, (es decir, AB, bC, CD, DE, EF, y/o FG) que se ha aleatorizado para longitud y/o secuencia. Se contempla específicamente que la variante de andamio de Tn3 puede comprender al menos un enlace disulfuro de origen no natural.
También se divulga en el presente documento cuando un andamio de variante de Tn3 comprende un bucle FG que es al menos uno, o al menos dos, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o al menos 7, o al menos 8, o al menos 9, o al menos 10 residuos de aminoácidos más corto que el bucle FG de un andamio de Tn3 de tipo silvestre, en el que la variante de andamio de Tn3 comprende adicionalmente al menos un aminoácido sustitución. Mediciones de estabilidad
El aumento de la estabilidad de los andamios estabilizados de FnIII de la presente divulgación, aislados o como parte de un andamio multimérico, se puede medir fácilmente mediante técnicas bien conocidas en la materia, tales como la desnaturalización térmica (Tm) y caotrópica (tal como el tratamiento con urea, o sales de guanidina), tratamiento con proteasa (tal como tratamiento con termolisina) u otra metodología aceptada en la técnica para determinar la estabilidad de la proteína. Se puede encontrar una revisión exhaustiva de las técnicas utilizadas para medir la estabilidad de las proteínas, por ejemplo, en “Current Protocols in Molecular Biology" and “Current Protocols in Protein Science" by John Wiley and Sons. 2007.
Andamios multiméricos
La presente divulgación también proporciona andamios multiméricos que comprenden al menos dos andamios de monómero de Tn3 de la presente divulgación unidos en tándem. Dichos andamios multiméricos se puede ensamblar en múltiples formatos. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de monómero de Tn3 se ensamblan en formatos lineales mientras que los andamios también se pueden ensamblar formatos ramificados (véase, por ejemplo, Figura 1). También se divulgan en el presente documento andamios multiméricos, en los que al menos dos andamios de Tn3 se conectan en tándem a través de un ligador de péptido. También se divulga en el presente documento cuando un andamio de Tn3 en los andamios multiméricos de la presente divulgación se une a TRAIL R2, mientras que un segundo andamio de Tn3 se une a un objetivo diferente, demostrando de esta manera múltiples funciones, y/o al mismo objetivo, aumentando de esta manera la valencia y/o avidez de la unión de objetivo, otra acción de los objetivos. También se divulga en el presente documento cuando el aumento en la valencia y/o avidez de unión de objetivo se logra cuando múltiples andamios se unen al mismo objetivo. También se divulga en el presente documento cuando el aumento en la valencia mejora una acción específica sobre el objetivo, como aumentar la dimerización de una proteína objetivo.
También se divulga en el presente documento cuando el andamio multimérico de la presente divulgación comprende al menos dos andamios de Tn3 de la presente divulgación conectados en tándem, en los que cada andamio de Tn3 une al menos un objetivo, y en el que cada andamio de Tn3 comprende una pluralidad de hebras beta ligadas a una pluralidad de regiones de bucle, en las que al menos un bucle es una variante de origen no natural del bucle cognado en un dominio Tn3 de tipo silvestre.
Andamios en tándem multiméricos
También se divulga en el presente documento cuando los andamios multiméricos de la presente divulgación comprenden dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho o más s andamios de monómero de Tn3 de la presente divulgación. También se divulga en el presente documento cuando algunos de los andamios de monómero de Tn3 se conectan en tándem. También se divulga en el presente documento cuando algunos de los andamios de monómero de Tn3 se conectan en tándem y algunos de los andamios de monómero de Tn3 no se conectan en tándem. También se divulga en el presente documento cuando los andamios multiméricos de la presente divulgación comprenden dos, o tres, o cuatro, o cinco, o seis, o siete, o ocho, o nueve, o diez, o más andamios de la presente divulgación se conectan en tándem (véase, por ejemplo, Figura 1 y Figura 2).
También se divulga en el presente documento cuando los andamios multiméricos se generan a través de la unión covalente entre andamios de monómero de Tn3, por ejemplo, al ligar directamente los andamios de Tn3, o mediante la inclusión de un ligador, por ejemplo, un ligador peptídico. En ejemplos particulares, los andamios unidos covalentemente se generan mediante la construcción de genes de fusión que codifican los andamios de Tn3 monoméricos o, alternativamente, mediante la ingeniería de codones para residuos de cisteína en andamios de Tn3 monoméricos y permitiendo la formación de enlaces disulfuro entre los productos de expresión.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios multiméricos de la presente divulgación comprenden al menos dos andamios de Tn3 que se conectan directamente entre si sin aminoácidos de intervención adiciónales. También se divulga en el presente documento cuando los andamios multiméricos de la presente divulgación comprenden al menos dos andamios de Tn3 que se conectan en tándem a través de un ligador, por ejemplo, un ligador de péptido. También se divulga en el presente documento cuando los andamios multiméricos de la presente divulgación comprenden al menos dos andamios de Tn3 que se conectan en tándem a través de un ligador de péptido, en el que el ligador de péptido comprende 1 a aproximadamente 1000, o 1 a aproximadamente 500, o 1 a aproximadamente 250, o 1 a aproximadamente 100, o 1 a aproximadamente 50, o 1 a aproximadamente 25, aminoácidos. También se divulga en el presente documento cuando los andamios multiméricos de la presente divulgación comprenden al menos dos andamios de Tn3 que se conectan en tándem a través de un ligador de péptido, en el que el ligador de péptido comprende 1 a aproximadamente 20, o 1 a aproximadamente 15, o 1 a aproximadamente 10, o 1 a aproximadamente 5, aminoácidos.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios multiméricos de la presente divulgación comprenden al menos dos andamios de Tn3 que se conectan en tándem a través de un ligador, por ejemplo, un ligador de péptido, en el que el ligador es una fracción funcional. La fracción funcional se seleccionará con base en la función deseada y/o características del andamio multimérico. Por ejemplo, una fracción funcional útil para purificación (por ejemplo, una etiqueta de histidina) se puede utilizar como un ligador. Fracciones funcionales útiles como ligadores incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), un agente citotóxico, un radionúclido, agente de formación de imágenes, biotina, un dominio de dimerización, albúmina en suero humana (HSA) o una porción de unión a FcRn de la misma, un dominio o fragmento de un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo de dominio, un dominio de unión a la albúmina, una molécula de IgG, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, un andamio de no Tn3, una etiqueta de epítopo, un polímero de polipéptido recombinante, una citoquina, y similares. Los ligadores de péptido específicos y fracciones funcionales que se pueden utilizar como ligadores se divulgan infra.
También se divulga en el presente documento cuando el andamio de Tn3 multimérico comprende al menos dos andamios de Tn3 que se conectan a través de uno o más ligadores, en los que los ligadores interpuestos entre cada andamio de Tn3 pueden ser los mismos ligadores o diferentes ligadores. También se divulga en el presente documento cuando un ligador puede comprender múltiples ligadores, que pueden ser el mismo ligador o diferentes ligadores. También se divulga en el presente documento cuando se conectan una pluralidad de ligadores, algunos o todos los ligadores pueden ser fracciones funcionales.
Estequiometría de unión al andamio multimérico
También se divulga en el presente documento cuando el andamio de Tn3 multimérico comprende andamios que son específicos para TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando los andamios multiméricos de la presente divulgación comprenden andamios que son específicos para diferentes epítopos, que pueden ser diferentes epítopos sobre TRAIL R2 o sobre objetivos diferentes.
También se divulga en el presente documento cuando el andamio de Tn3 multimérico puede unir dos o más diferentes epítopos (por ejemplo, epítopos no superpuestos) sobre la misma molécula de TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando el andamio de Tn3 multimérico puede unir dos o más diferentes epítopos sobre TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando el andamio de Tn3 multimérico puede unir dos o más diferentes epítopos sobre el TRAIL R2 y adicionalmente, unir al menos un epítopo sobre una o más moléculas diferentes. También se divulga en el presente documento cuando el andamio de Tn3 multimérico se puede unir al mismo epítopo sobre un dímero TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando el andamio de Tn3 multimérico se puede unir al mismo epítopo sobre al menos dos moléculas de TRAIL R2s. También se divulga en el presente documento cuando el andamio de Tn3 multimérico puede unir el mismo epítopo sobre dos o más copias de la molécula de TRAIL R2 sobre una superficie celular adyacente. También se divulga en el presente documento cuando el andamio de Tn3 multimérico se puede unir al mismo epítopo o diferentes epítopos sobre TRAIL R2 o sobre objetivos diferentes con las mismas o diferentes afinidades de unión y/o avidez.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de monómero en un andamio de Tn3 multimérico se puede unir a epítopos sobre una o más copias de TRAIL R2 de acuerdo con un patrón de unión específico designado para alcanzar o mejorar (por ejemplo, sinérgicamente) una acción deseada sobre el objetivo, por ejemplo, dimerización de objetivo. Por ejemplo, los andamios de Tn3 en un andamio multimérico lineal se puede unir a un único TRAIL R2 o a múltiples TRAIL R2 de acuerdo con un cierto patrón, por ejemplo, los andamios de Tn3 en un andamio lineal multivalente de 6 módulos se puede unir a dos Objetivos A y B TRAIL R2 de acuerdo con un patrón AAABBB, un patrón AABBAA, un patrón ABABAB, un patrón AAAABB, etc.; a tres objetivos de acuerdo con un patrón AABBCC, un patrón ABCABC, y patrón ABCCBA, etc.; a cuatro objetivos de acuerdo con un patrón ABCDDA, patrón ABCADA, etc.; etc. Adicionalmente, cuando un andamio multimérico de la presente divulgación comprende una pluralidad de andamios diseñados por ingeniería (por ejemplo, disulfuro diseñado por ingeniería, bucle diseñado por ingeniería, o tanto disulfuro como bucle diseñado por ingenierías) y no diseñados por ingeniería, dichos andamios monoméricos se pueden disponer de acuerdo con un cierto patrón para lograr o mejorar un cierto efecto biológico. Dichas combinaciones de andamios monoméricos de Tn3 pueden ser ensambladas combinatoriamente y posteriormente evaluadas utilizando métodos conocidos en la técnica.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos en construcciones ramificadas, por ejemplo, los andamios multiméricos en una fusión Fc o formato similar a anticuerpo, también se pueden unir a un único objetivo de TRAIL R2 o a múltiples objetivos de TRAIL R2 de acuerdo con un cierto patrón.
Por ejemplo, también se divulga en el presente documento cuando un andamio de Tn3 de formato lineal fusionado a las cadenas pesadas de IgG en un andamio multimérico de Tn3 de formato similar a anticuerpo se puede unir a un primer objetivo mientras que un andamio lineal de Tn3 multivalente fusionado a las cadenas ligeras de IgG en un andamio de Tn3 de formato similar a anticuerpo se puede unir a un segundo objetivo. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de formato lineal fusionados a las cadenas pesadas de IgG de un andamio de Tn3 de formato similar a anticuerpo se pueden unir a un objetivo con una cierta afinidad mientras que los andamios de formato lineal fusionados a las cadenas ligeras de IgG de un andamio de formato similar a anticuerpo se pueden unir al mismo objetivo con una diferente afinidad. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 se fusionados a las cadenas en el brazo izquierdo de la “Y” de un anticuerpo se puede unir a un primer objetivo, mientras que los andamios de Tn3 se fusionados a las cadenas del derecho de la “Y” de un anticuerpo se puede unir a un segundo objetivo.
Fusiones
La presente divulgación proporciona adicionalmente andamios de Tn3 multiméricos que comprenden al menos dos andamios de monómero de Tn3, en los que al menos un andamio de monómero de Tn3 se puede fusionar a una fracción heteróloga. En este contexto la fracción heteróloga no se utiliza para ligar los andamios como un separador, pero puede proporcionar funcionalidad adicional al andamio de Tn3 multimérico. Por ejemplo, también se divulga en el presente documento cuando un andamio de Tn3 multimérico que se une a TRAIL R2 se puede fusionar a un agente citotóxico para facilitar destrucción celular específica a objetivo. También se divulga en el presente documento cuando una fracción heteróloga puede funcionar como un ligador.
La presente divulgación abarca el uso de andamios de Tn3 multiméricos conjugados o fusionados a uno o más fracciones heterólogas, que incluyen, pero no se limitan a, péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas. La presente divulgación abarca el uso de andamios de Tn3 multiméricos fusionados recombinantemente o químicamente conjugados con una proteína o polipéptido heterólogo o fragmento del mismo. La conjugación incluye conjugación covalente y no covalente. También se divulga en el presente documento cuando un andamio de Tn3 multimérico se puede fusionar o conjugar químicamente con un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 500 o al menos 1000 aminoácidos) para generar proteínas de fusión.
La fusión o conjugación de un andamio de Tn3 multimérico a uno o más fracciones heterólogas puede ser directa, es decir, sin un ligador interpuesto entre un andamio de Tn3 y una fracción heteróloga, o mediante una o más secuencias ligadoras descritas en el presente documento. También se divulga en el presente documento cuando los andamios se pueden utilizar para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos de células particulares, ya sea in vitro o in vivo, al fusionar o conjugar los andamios de Tn3 con anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particulares en las células objetivo, tal como TRAIL R2. Los andamios de Tn3 multiméricos fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos también se pueden utilizar en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 93/21232; Patente Europea No. EP 439,095; Naramura et al. Immunol. Lett. 39:91-99, 1994; Patente de Estados Unidos No.
5,474,981; Gillies et al., PNAS 89:1428-1432, 1992; y Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452, 1991.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos pueden integrarse con la respuesta inmunitaria humana al fusionar o conjugar un andamio con una inmunoglobulina o dominio de la misma que incluye, pero no se limita a, la región constante de una IgG (Fc), por ejemplo, a través del N o C-terminal. Del mismo modo, una fusión entre un andamio y una proteína del complemento, como Clq, se puede utilizar para las células objetivo. Se puede utilizar una fusión entre un andamio de Tn3 multimérico y una toxina para destruir específicamente las células que portan un antígeno particular como se describe en el presente documento.
Diversas publicaciones describen métodos para obtener moléculas fisiológicamente activas cuyas semividas se modifican mediante la introducción de un polipéptido de unión a FcRn en las moléculas (véase, por ejemplo, WO 97/43316; Patente de Estados Unidos No. 5,869,046; Patente de Estados Unidos No. 5,747,035; WO 96/32478; y WO 91/14438), al fusionar las moléculas con anticuerpos cuyas afinidades de unión a FcRn se conservan pero las afinidades por otros receptores de Fc se han reducido considerablemente (véase, por ejemplo, WO 99/43713), o al fusionar las moléculas con dominios de unión a FcRn de anticuerpos (véase, por ejemplo, WO 00/09560; Patente de Estados Unidos No. 4,703,039). También se pueden encontrar técnicas y métodos específicos para aumentar la semivida de las moléculas fisiológicamente activas en la Patente de Estados Unidos No. 7,083,784. Específicamente, se contempla que los andamios de Tn3 multiméricos se puedan fusionar a una región Fc desde una IgG, en la que la región Fc comprende mutaciones de residuos de aminoácidos M252Y/S254T/T256E o H433/N434F/Y436H, en los que las posiciones de aminoácidos se designan de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat. También se divulga en el presente documento cuando la semivida del andamio Tn3 multimérico se puede aumentar al fusionar genéticamente el andamio Tn3 multivalente con un polipéptido recombinante intrínsecamente no estructurado (por ejemplo, un polipéptido XTEN™) o mediante conjugación con polietilenglicol (PEG).
También se divulga en el presente documento cuando el andamio de Tn3 multimérico se puede fusionar con moléculas que aumentan o extienden la semivida in vivo o en suero. También se divulga en el presente documento cuando el andamio se puede fusionar o conjugar con albúmina, tal como albúmina de suero humano (HSA), un fragmento de unión al receptor Fc neonatal (FcRn) del mismo, PEG, polisacáridos, anticuerpos, complemento, hemoglobina, un péptido de unión, lipoproteínas y Otros factores para aumentar su semivida en el torrente sanguíneo y/o su penetración en el tejido. Cualquiera de estas fusiones puede generarse mediante técnicas estándar, por ejemplo, mediante la expresión de la proteína de fusión a partir de un gen de fusión recombinante construido utilizando secuencias de genes disponibles públicamente.
Más aún, los andamios de la presente divulgación pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. También se divulga en el presente documento cuando la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de poli-histidina (His-tag), por ejemplo, una octa-histidina-tag (His-8-tag) o hexa-histidina-tag (His-6)-tag tal como la etiqueta proporcionada en un vector de expresión pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, California, 91311), entre otros vectores, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989, por ejemplo, la polihistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, entre otras, una etiqueta de hemaglutinina (“HA”), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína de la hemaglutinina de la gripe (véase, por ejemplo, Wilson et al., Cell 37: 767, 1984), una etiqueta FLAG, una Strip-tag, una myc-tag, una etiqueta V5, una GFP-tag, una AU1-tag, una AU5-tag, ECS-tag, GST-tag o una etiqueta OLLAS.
Se pueden generar proteínas de fusión adicionales que comprenden andamios de la presente divulgación a través de las técnicas de combinación aleatoria de genes, combinación aleatoria de motivos, combinación aleatoria de exones y/o combinación aleatoria de codones (denominadas colectivamente “combinación aleatoria de ADN”). La combinación aleatoria de ADN puede emplearse para alterar la acción de los andamios de Tn3 sobre el objetivo (por ejemplo, generar andamios con afinidades más altas y tasas de disociación más bajas, o andamios con mayor capacidad para dimerizar TRAIL R2). Los andamios de Tn3 pueden alterarse mediante mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a errores, inserción de nucleótidos aleatoria u otros métodos antes de la recombinación. Una o más porciones de un polinucleótido que codifica un andamio, que se unen a un objetivo específico pueden recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
Andamios multiméricos similares a anticuerpos
También se divulga en el presente documento cuando el andamio multimérico de la presente divulgación comprende al menos dos andamios de Tn3, en los que al menos un andamio de Tn3 se fusiona a un dominio o fragmento de un anticuerpo (por ejemplo, una IgG), que incluye, pero no se limita a un anticuerpo intacto, un dominio variable de anticuerpo, un dominio CHI, un dominio C-kappa, un dominio C-lambda, un dominio Fc, un dominio CH2, o CH3. También se divulga en el presente documento cuando un andamio de Tn3 se puede fusionar a un dominio o fragmento de un anticuerpo. El dominio o fragmento de un anticuerpo puede mejorar adicionalmente la avidez y/o afinidad del andamio multimérico al proporcionar, de manera similar al dominio Fc descrito a continuación, un dominio de dimerización o multimerización que facilita la formación de andamios multiméricos de la presente divulgación. Adicionalmente, el dominio o fragmento de un anticuerpo puede mejorar adicionalmente la acción del andamio sobre el objetivo, por ejemplo, dimerizar o multimerizar más eficientemente un objetivo.
También se divulga en el presente documento cuando solo un andamio en tándem de Tn3 multimérico que comprende dos dominios Tn3 se conjuga o se fusiona a un dominio o fragmento de un anticuerpo. Por ejemplo, un andamio en tándem multimérico único se puede ser fusionar al N terminal de un polipéptido de un dominio o fragmento de un anticuerpo (por ejemplo, una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo). También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos se crean al fusionar o conjugar uno o más andamios de Tn3 al N terminal y/o al C terminal un polipéptido de un dominio o fragmento de un anticuerpo (por ejemplo, una cadena pesada y/o una cadena ligera de un anticuerpo. También se divulga en el presente documento cuando algunos o todos los andamios de Tn3 se fusionados a un dominio o fragmento de un anticuerpo son idénticos. También se divulga en el presente documento cuando algunos o todos los andamios de Tn3 se fusionados a un dominio o fragmento de un anticuerpo son diferentes.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 en tándem utilizados para generar un andamio de Tn3 multivalente similar a anticuerpo puede contener el mismo número de módulos Tn3. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 en tándem utilizados para generar un andamio de Tn3 multivalente similar a anticuerpo puede contener un diferente número de módulos Tn3. Por ejemplo, un andamio de Tn3 tetravalente se puede formar, por ejemplo, al fusionar un andamio de Tn3 tetravalente de formato lineal a una posición único, o al fusionar un andamio de monómero de Tn3 en una posición y in andamio de Tn3 de formato lineal trimérico a otra posición, o al fusionar dos andamios de formato lineal de Tn3 dimérico a dos diferentes posiciones, o al fusionar 4 andamios de monómero de Tn3, cada uno a una única posición.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos de la presente divulgación comprende cuatro andamios de Tn3 lineales multiméricos se fusionan a un dominio o fragmento de un anticuerpo en los que cada andamio de Tn3 lineal multimérico comprende dos andamios de monómero de Tn3 que se conectan en tándem a través de un ligador (Figura 1). También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos de la presente divulgación comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete o al menos ocho andamios de Tn3 monoméricos o multiméricos de la presente divulgación se fusiona a un dominio o fragmento de un anticuerpo.
También se divulga en el presente documento cuando un andamio de Tn3 tetravalente se puede generar al fusionar un al N terminal de cada una de las cadenas ligeras y cadenas pesadas de un dominio o fragmento de un anticuerpo (véase, por ejemplo, construcción A9 en la Figura 2).
Un andamio de Tn3 multivalente de formato similar a anticuerpo se puede generar al fusionar cualquier combinación de andamios de Tn3 a un dominio o fragmento de un anticuerpo o anticuerpo modificado. Ejemplos de anticuerpos modificados incluyen dominio anticuerpos suprimidos, minicuerpos (véase, por ejemplo, Patente Estados Unidos No.
5,837,821), minicuerpos tetravalentes, anticuerpos tetravalentes (véase, por ejemplo, Coloma & Morrison, Nature Biotechnol. 15:159-163, 1997; Publicación PCT No. WO 95/09917), anticuerpos estabilizados térmicamente, anticuerpos humanizados, etc.
Cada uno de los andamios de Tn3 lineales de la presente divulgación utilizados para generar un andamio de Tn3 multivalente similar a anticuerpo de acuerdo con la Figura 1 puede contener los mismos ligadores y distribuciones de ligador, o diferentes ligadores y diferentes distribuciones de ligador.
Andamios multiméricos de Fusión Fc
También se divulga en el presente documento cuando un andamio de Tn3 multimérico de la presente divulgación comprende una pluralidad de andamios de Tn3 monoméricos o multiméricos conectados a un dominio Fc. La fusión de un andamio de Tn3 multimérico de la presente divulgación a un fragmento de anticuerpo que comprende un dominio Fc mejora adicionalmente la avidez y/o actividad del andamio FnIII multimérico al proporcionar un dominio de dimerización que facilita la formación de dímeros de los andamios de Tn3 multiméricos.
También se divulga en el presente documento cuando solo un andamio de Tn3 multimérico se fusiona a un dominio Fc. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos de la presente divulgación comprende dos andamios de Tn3 multiméricos se fusiona a un dominio Fc en el que cada andamio de Tn3 multimérico comprende dos o más andamios de Tn3 que se conectan a través de uno o más ligadores (Figura 1). También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos se fusionan al dominio Fc son andamios de formato lineal.
También se divulga en el presente documento cuando dos andamios de Tn3 de formato lineal que comprenden dos dominios Tn3 en tándem se fusionan a un dominio Fc para proporcionar un andamio de Tn3 multimérico con una valencia de 4 (véase, por ejemplo, construcción A7 en la Figura 2). También se divulga en el presente documento cuando dos andamios de formato lineal, cada uno de ellos comprenden cuatro andamios de monómero de Tn3 se fusionan a un dominio Fc para proporcionar un andamio de Tn3 multimérico con una valencia de 8 (véase, por ejemplo, construcción A8 en la Figura 2).
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 se fusionados al dominio Fc comprende el mismo número de módulos Tn3. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 se fusionados al dominio Fc comprende un diferente número de módulos Tn3. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 se fusionados al dominio Fc comprende los mismos ligadores. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 se fusionados al dominio Fc comprende diferentes ligadores.
También se divulga en el presente documento cuando diferentes andamios de Tn3 multiméricos de la presente divulgación puede ser dimerizado por el uso de mutaciones de dominio Fc que favorece la formación de heterodímeros. Se conoce en la técnica que las variantes de la región Fc (por ejemplo, sustituciones y/o adiciones y/o supresiones de aminoácido) mejoran o disminuyen función efectora del anticuerpo y puede alterar las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, semivida) del anticuerpo. Por lo tanto, también se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiespecífico de la presente divulgación comprende dominio(s) Fc que comprenden una región Fc alterada en la que una o más alteraciones se han hecho en la región Fc con el fin de cambiar las propiedades funcionales y/o farmacocinéticas del andamio de Tn3 multimérico.
También se conoce que la glucosilación de la región Fc se puede modificar para aumentar o reducir la función efectora y/o actividad antiinflamatoria. También se divulga en el presente documento cuando las regiones Fc de los andamios FnIII multiméricos de la presente divulgación comprende glucosilación de residuos de aminoácidos alterado con el fin de cambiar propiedades citotóxicas y/o antiinflamatorias de los andamios multiméricos.
Topologías de andamio multimérico
Un experto en la técnica puede apreciar que los andamios multiméricos discutidos anteriormente, en la Figura 1 y la Figura 2, y a través de la especificación son solo ejemplos ilustrativos. Las topologías de construcción o formatos mostrados en la Figura 1 y la Figura 2 ilustran que los andamios de la presente divulgación se pueden fusionar al N-terminal de los polipéptidos constituyentes de dominios Fc y anticuerpos. Los andamios de la presente divulgación se pueden fusionar al C terminal del dominios Fc, cadenas ligeras de anticuerpo, y cadenas pesadas de anticuerpo en cualquier disposición espacial adecuada. También se divulga en el presente documento cuando un andamio tetravalente se puede crear al fusionar un andamio de monómero FnIII al N terminal de cada cadena pesada y un andamio de monómero FnIII al C terminal dominio de cada cadena ligera de un anticuerpo, al fusionar un andamio de monómero FnIII al N terminal de cada cadena ligera y un andamio de monómero FnIII al C terminal de cada cadena pesada de un anticuerpo, o al fusionar un andamio de monómero FnIII al N terminal de cada cadena pesada y un andamio de monómero FnIII al N terminal de cada cadena ligera de un anticuerpo. Los andamios FnIII monoméricos y/o multiméricos se pueden fusionar a cadenas pesada y/o ligera de longitud completa que comprenden tanto regiones variables como regiones constantes. Alternativamente, los andamios de monómero y/o multímero FnIII se pueden fusionar a cadenas pesada y/o ligera truncadas que comprenden solo regiones constantes (por ejemplo, como en la construcción a 9 mostrada en la Figura 2).
Los andamios de Tn3 multiméricos se pueden crear al utilizar los formatos mostrados en la Figura 1 como los bloques de construcción. Por ejemplo, los formatos similares a anticuerpo y fusión Fc sin combinaciones que comprenden módulos de Tn3 de formato lineal más simple. También se divulga en el presente documento cuando más formatos de andamios de Tn3 multiméricos complejos se puede crear al combinar los bloques de construcción mostrados en la Figura 1.
Las Figuras 1 y 2 también ilustran que los andamios de Tn3 multiméricos pueden ser lineales o ramificados y exhiben niveles diferentes de ramificación. Por ejemplo, el formato Fc proporciona un ejemplo de formato ramificado de primer orden, mientras que el formato similar a anticuerpo proporciona un ejemplo de un formato ramificado de segundo orden. Las construcciones ramificadas de más alto orden se pueden obtener al reemplazar los bloques de construcción de formato lineal en el formato similar a anticuerpo o el formato de fusión Fc con fusión bloques de construcción de formato Fc o bloques de construcción similares a anticuerpo, y conectarlos a ya sea el C-terminal o N-terminal de los polipéptidos constituyentes del Fc o anticuerpo.
Las Figuras 1 y 2, y TABLA 1 ilustran el hecho de que los ligadores en un andamio de Tn3 multimérico puede ser estructural o funcionalmente diverso y puede proporcionar una pluralidad de puntos de adhesión. Por ejemplo, todos los módulos Tn3 en las construcciones A4 y A5 se conectan por ligadores (Gly4Ser)3Ala, excepto para el 4to y 5to módulos Tn3, que se conectan por un ligador (Gly4Ser)2GlyThrGlySerAlaMetAlaSer (Gly4Ser)1Ala. Por ejemplo, en la construcción A7, el primer y segundo dominios Tn3 y el tercer y cuarto dominio Tn3 se conectan mediante ligadores (Gly4Ser)3Ala, mientras que el segundo y tercer dominios Tn3 se conectan por un dominio Fc como un ligador de fracción funcional.
La fusión Fc mostrada en la Figura 1 ejemplifica que los andamios de Tn3 monoméricos o multiméricos se puede fusionar al N-terminal de los polipéptidos del ligador de fracción funcional. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 monoméricos o multiméricos de la presente divulgación se puede fusionar fácilmente al C terminal del dominio Fc en una construcción de formato de fusión Fc.
Del mismo modo, el anticuerpo o anticuerpo modificado en un formato similar a construcción de anticuerpo también es un ligador de fracción funcional. En este caso, en lugar de dos puntos de adhesión como en un ligador (Gly4Ser)3Ala o en un ligador (Gly4Ser)2GlyThrGlySerAlaMetAlaSer (Gly4Ser)1Ala, o cuatro posibles puntos de fijación como en el caso de dominio Fc, el anticuerpo mostrado en el ejemplo similar a anticuerpo de la Figura 1 proporciona 6 posibles puntos de adhesión. El formato similar a anticuerpo mostrado en la Figura 1 ejemplifica que solo los puntos de adhesión de N-terminal en el jugador de fracción funcional se pueden ocupar por andamios de Tn3. En una construcción de formato similar a anticuerpo algunos o todos los andamios de Tn3 de la presente divulgación se pueden fusionar fácilmente al C-terminal de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de un anticuerpo o dominio de anticuerpo modificado. Se pueden aplicar otras estequiometrías de fusión, es decir, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, o más andamios de Tn3 de la presente divulgación se pueden fusionar a un anticuerpo o anticuerpo modificado.
Las Figuras 1 y 2 también ilustra que los andamios de Tn3 multiméricos se pueden generar al combinar otros Andamios de Tn3 multiméricos. Por ejemplo, los andamios de formato Fc A6, A7, y A8 de la Figura 2 son andamios de Tn3 homodiméricos en los que el andamio de Tn3 multimérico se forma por dos cadenas de polipéptidos, cada una que comprende un andamio de Tn3 de formato lineal se fusiona a un dominio Fc, que a su vez se conecta a través de enlaces de disulfuro intermoleculares. El andamio similar a anticuerpo de las Figuras 1 y 2 ejemplifica un andamio de Tn3 heterotetramérico en el que 4 polipéptidos que corresponden a dos diferentes tipos de andamios (2 andamios de Tn3 formados al fusionar un andamio de monómero de Tn3 a una región de cadena ligera de IgG, y 2 andamios de Tn3 formados al fusionar un andamio de monómero de Tn3 a una región CH1-bisagra-región-Fc de una IgG) se conectan a través de enlaces de disulfuro intermoleculares.
Generación de andamios
Los andamios de Tn3 descritos en el presente documento se pueden utilizar en cualquier técnica para desarrollar proteínas de unión a objetivos nuevas o mejoradas. En un ejemplo particular, el objetivo se inmoviliza sobre un soporte sólido, tal como una resina de columna o bien una placa de microtitulación, y el objetivo se pone en contacto con una biblioteca de proteínas de unión basadas en andamios candidatos. Dicha biblioteca puede consistir en clones construidos de un andamio de Tn3, mediante la aleatorización de la secuencia y/o la longitud de los bucles de tipo CDR.
A este respecto, la presentación de bacteriófagos (fagos) es una técnica bien conocida que permite cribar grandes bibliotecas de oligopéptidos para identificar miembros de esas bibliotecas que son capaces de unirse específicamente a un objetivo. La presentación de fagos es una técnica mediante la cual los polipéptidos variantes se visualizan como proteínas de fusión a la proteína de recubrimiento en la superficie de las partículas de bacteriófagos (Scott, J. K. y Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). Se puede emplear un enfoque bioinformático para determinar la longitud del bucle y las preferencias de diversidad de los dominios FnIII de origen natural. Utilizando este análisis, las preferencias para la longitud del bucle y la diversidad de secuencia pueden emplearse para desarrollar un enfoque de “aleatorización restringida”. En esta aleatorización restringida, la longitud relativa del bucle y las preferencias de secuencia se incorporan al desarrollo de una estrategia de biblioteca. La integración del análisis de la longitud del bucle y la diversidad de secuencias en el desarrollo de la biblioteca da como resultado una aleatorización restringida (es decir, ciertas posiciones dentro del bucle aleatorizado están limitadas en qué aminoácidos podrían residir en esa posición).
La presente divulgación también proporciona bibliotecas recombinantes que comprenden diversas poblaciones de andamios de Tn3 de origen no natural. También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas comprenden andamios de Tn3 de origen no natural que comprenden, una pluralidad de dominios de hebra beta ligados a una pluralidad de regiones de bucle, en los que uno o más de dichos bucles varían mediante supresión, sustitución o adición mediante al menos un aminoácido. También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas comprenden andamios de Tn3 derivados del andamio de Tn3 de tipo silvestre.
Como se detalló anteriormente, los bucles que conectan las varias hebras beta de los andamios se pueden aleatorizar para longitud y/o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios de Tn3 que tienen al menos un bucle que se aleatoriza para longitud y/o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles de los andamios de Tn3 se aleatorizan para longitud y/o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando al menos un bucle se mantiene constante mientras al menos un bucle adicional se aleatoriza para longitud y/o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando al menos uno, al menos dos, o todos los tres de bucles AB, CD, y EF se mantienen constantes mientras al menos uno, al menos dos, o todos los tres de bucles BC, DE, y FG se aleatorizan para longitud o diversidad de secuencia. También se divulga en el presente documento cuando al menos uno, al menos dos, o al menos todos los tres de bucles AB, CD, y EF se aleatorizan mientras que al menos uno, al menos dos, o todos los tres de bucles BC, DE, y FG se aleatorizan para longitud y/o diversidad de secuencia.
Encontramos que los bucles FG que son al menos un aminoácido más corto que aquel encontrado en el bucle FG de un FOI muestra estabilidad mejorada. De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación proporciona bibliotecas que comprenden andamios de Tn3, en los que al menos un bucle se aleatoriza para longitud y/o diversidad de secuencia, excepto que la longitud de los bucles FG se mantienen por ser al menos un aminoácido más corto que el bucle FG afín del tercer dominio FnIII de tenascina humana C comprende 10 residuos de aminoácidos. También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios de Tn3, en los que cada andamio comprende siete hebras beta designadas A, B, C, D, E, F, y G ligadas a seis regiones de bucle, en las que una región de bucle conecta cada hebra beta y se designa AB, BC, CD, DE, EF, y FG; y en la que al menos un bucle es una variante de origen no natural de un andamio de Tn3 bucle silvestre, y en el que el bucle FG es al menos un aminoácido más corto que el bucle cognado en el andamio de Tn3 de tipo silvestre.
También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios FnIII, en los que la hebra A beta comprende la SEQ ID NO: 42, la hebra B beta comprende la SEQ ID NO: 43, la hebra C beta comprende la SEQ ID NO: 45, la hebra D beta comprende la SEQ ID nO: 46, la hebra E beta comprende la SEQ ID nO: 47, la hebra F beta comprende la SEQ ID NO: 49, y la hebra G beta comprende la SEQ ID NO: 52.
También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios FnIII, en los que la hebra A beta consiste de la SEQ ID NO: 42, la hebra B beta consiste de la SEQ ID NO: 43, la hebra C beta consiste de la SEQ ID NO: 45, la hebra D beta consiste de la SEQ ID NO: 46, la hebra E beta consiste de la SEQ ID NO: 47, la hebra F beta consiste de la SEQ ID NO: 49, y la hebra G beta consiste de la SEQ ID NO: 52.
También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios FnIII, en los que la hebra A beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO: 42, la hebra B beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO: 43, la hebra C beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO: 45, la hebra D beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO: 46, la hebra E beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO: 47, la hebra F beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO: 49, y la hebra G beta consiste esencialmente de la SEQ ID NO: 52. Como se detalló anteriormente, uno o más residuos dentro de un bucle se pueden mantener constantes mientras que otros residuos se aleatorizan para longitud y/o diversidad de secuencia. Opcionalmente o alternativamente, uno o más residuos dentro de un bucle se puede mantener en un número predeterminado y limitado de diferentes aminoácidos mientras que otros residuos se aleatorizan para longitud y/o diversidad de secuencia. De acuerdo con lo anterior, bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios de Tn3 que pueden comprender uno o más bucles que tienen una secuencia consenso degenerada y/o uno o más residuos de aminoácidos invariantes.
También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios de Tn3 que tienen bucles BC que se aleatorizan con la siguiente secuencia de consenso: S-X-a-X-b-X-X-X-G, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (a) representa prolina o alanina y en la que (b) representa alanina o glicina. También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios de Tn3 que tienen bucles BC que se aleatorizan con la siguiente secuencia de consenso: S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G, en la que X representa cualquier aminoácido y en la que (c) representa prolina, serina o glicina. También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios de Tn3 que tienen bucles BC que se aleatorizan con la siguiente secuencia de consenso: A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (d) representa prolina, glutamato o lisina, en la que (e) representa asparagina o glicina, y en la que (f) representa serina o glicina.
También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios de Tn3 que tienen bucles DE que se aleatorizan con la siguiente secuencia de consenso: X-X-X-X-X-X, en la que X representa cualquier aminoácido.
También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios de Tn3 que tienen bucles FG que se aleatorizan con la siguiente secuencia de consenso: X-a-X-X-G-X-X-X-b, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (a) representa asparagina, treonina o lisina, y en la que (b) representa serina o alanina. También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios FnIII que tienen bucles FG que se aleatorizan con la siguiente secuencia de consenso: X-X-X-X-X-X-X-X-X (X9 ), en la que X representa cualquier aminoácido.
También se divulga en el presente documento cuando las bibliotecas de la presente divulgación comprenden andamios, en los que los andamios comprenden la secuencia de aminoácidos: IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XoD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT, en la que Xab, Xbc, Xcd, Xde, XEF, y XFG representan los residuos de aminoácidos presentes en los bucles AB, BC, CD, DE, EF, y FG, respectivamente, en la que X1 representa el residuo de aminoácidos A o T, y en la que n = 2-26 y m = 1-9.
La presente divulgación proporciona adicionalmente métodos para identificar un andamio de Tn3 recombinante que se une a un a objetivo, por ejemplo, TRAIL R2, y tiene la estabilidad en aumento o acción mejorada sobre el objetivo, por ejemplo, TRAIL r2, según se compara a un andamio de Tn3 de tipo silvestre al cribar las bibliotecas de la presente divulgación.
También se divulga en el presente documento cuando el método para identificar un andamio de Tn3 recombinante que tiene estabilidad de proteína en aumento cuando se compara a un andamio de Tn3 de tipo silvestre, y que se une específicamente a un objetivo, comprende:
a. contactar el ligando objetivo con una biblioteca de la presente divulgación bajo condiciones adecuadas para formar un andamio: complejo de ligando objetivo;
b. obtener a partir del complejo, el andamio que une el ligando objetivo;
c. determinar si la estabilidad del andamio obtenido en la etapa (b) es mayor que aquel del andamio de Tn3 de tipo silvestre.
El mismo método se puede utilizar para identificar un andamio de Tn3 recombinante con afinidad de unión mejorada, avidez, etc. para el objetivo. También se divulga en el presente documento cuando en la etapa (a), la biblioteca de andamios de la presente divulgación se incuba con un objetivo inmovilizado. También se divulga en el presente documento cuando en la etapa (b), el complejo de andamio: ligando objetivo se lava para eliminar aglutinantes no específicos, y los aglutinantes más ajustados se eluyen bajo condiciones muy estrictas y se someten a PCR para recuperar la información de la secuencia. Se contempla específicamente que los aglutinantes y/o la información de secuencia obtenida en la etapa (b) se pueden utilizar para crear una nueva biblioteca utilizando los métodos divulgados en el presente documento o conocidos por un experto en la técnica, que se pueden utilizar para repetir el proceso de selección, con o sin mutagénesis adicional de la secuencia. También se divulga en el presente documento cuando se pueden realizar varias rondas de selección hasta que se obtengan aglutinantes de suficiente afinidad por el antígeno.
También se divulga en el presente documento una colección de moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una biblioteca que comprende los andamios de la presente divulgación y como se describió anteriormente.
Los andamios de la presente divulgación pueden someterse a maduración por afinidad. En este proceso aceptado en la técnica, una proteína de unión específica está sujeta a un esquema que selecciona una mayor afinidad por un objetivo específico (ver Wu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(11): 6037-42). Los andamios resultantes de la presente divulgación pueden exhibir características de unión al menos tan altas en comparación con los andamios antes de la maduración por afinidad.
La presente divulgación también proporciona métodos para identificar la secuencia de aminoácidos de un andamio de proteínas capaz de unirse al objetivo para formar un complejo de andamio: objetivo. También se divulga en el presente documento cuando el método comprende: a) poner en contacto una biblioteca de la divulgación con un objetivo inmovilizado o separable; b) separar los complejos de andamio: objetivo de los andamios libres; c) provocar la replicación de los andamios separados de (b) para dar como resultado una nueva biblioteca de presentación de polipéptidos que se distingue de la de (a) al tener una diversidad reducida y al enriquecerse en andamios mostrados capaces de unirse al objetivo; d) opcionalmente, repetir las etapas (a) y (b) con la nueva biblioteca de (c); y e) determinar la secuencia de ácido nucleico de la región que codifica el andamio presentado de una especie a partir de (d) y, por lo tanto, deducir la secuencia de péptidos capaz de unirse al objetivo.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación pueden aleatorizarse adicionalmente después de la identificación desde un cribado de biblioteca. También se divulga en el presente documento cuando los métodos de la divulgación comprenden aleatorizar adicionalmente al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles de un andamio identificado desde una biblioteca utilizando un método descrito en el presente documento. También se divulga en el presente documento cuando el andamio aleatorizado adicional se somete a un método posterior de identificación de un andamio capaz de unir un objetivo. Este método comprende (a) contactar dicho andamio aleatorizado adicional con un objetivo inmovilizado o separable, (b) separar los complejos de andamio aleatorizado adicional: objetivo de los andamios libres, (c) provocar la replicación de los andamios separados de (b), opcionalmente repetir las etapas (a)-(c) y (d) determinar la secuencia de ácido nucleico de la región que codifica dicho andamio aleatorizado más lejano y, por lo tanto, deducir la secuencia de péptidos capaz de unirse al objetivo.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios aleatorizados adicionales comprenden al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles aleatorios que se aleatorizaron previamente en la primera biblioteca. También se divulga en el presente documento cuando los andamios aleatorizados adicionales comprenden al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles aleatorios que no se aleatorizaron previamente en la primera biblioteca.
La presente divulgación también proporciona un método para obtener al menos dos andamios de Tn3 que se unen a al menos uno o más objetivos. Este método permite la detección de agentes que actúan cooperativamente para provocar una respuesta particular. Puede ser ventajoso utilizar un cribado de este tipo cuando se requiere una actividad agonista que requiera la cooperación de más de un andamio (por ejemplo, pero no se limita a, agonismo de un receptor que pertenece a la familia de receptores de TNF). Este método permite el cribado de agentes cooperativos sin reformatear la biblioteca para formar complejos multiméricos. También se divulga en el presente documento cuando el método de la presente divulgación comprende poner en contacto un ligando objetivo con una biblioteca de la divulgación bajo condiciones que permiten que se forme un complejo de andamio: ligando objetivo, enganchando dichos andamios con un agente de entrecruzamiento (definido como un agente que se une, en estrecha proximidad, al menos dos andamios idénticos o distintos) en el que el entrecruzamiento de los andamios provoca una respuesta detectable y la obtención del complejo, dichos andamios que se unen al objetivo. También se divulga en el presente documento cuando el agente de entrecruzamiento es un anticuerpo específico de andamio, o un fragmento del mismo, un anticuerpo específico de etiqueta de epítopo de un fragmento del mismo, un dominio de dimerización, tal como la región Fc, un motivo de bobina en espiral (por ejemplo, pero no limitado a, una cremallera de leucina), un entrecruzador químico u otro dominio de dimerización conocido en la técnica.
La presente divulgación también proporciona métodos para detectar un compuesto que utiliza los andamios de la presente divulgación. En función de las especificidades de unión de los andamios obtenidos mediante el cribado de la biblioteca, es posible utilizar dichos andamios en los ensayos para detectar el objetivo específico en una muestra, tal como para los métodos de diagnóstico. También se divulga en el presente documento cuando el método para detectar un compuesto comprende poner en contacto dicho compuesto en una muestra con un andamio de la presente divulgación, bajo condiciones que permitan que se forme un complejo de andamio: compuesto y detectar dicho andamio, detectando de ese modo dicho compuesto en una muestra. También se divulga en el presente documento cuando el andamio está marcado (es decir, etiqueta radiomarcada, fluorescente, ligada a enzimas o etiqueta colorimétrica) para facilitar la detección del compuesto.
La presente divulgación también proporciona métodos para capturar un compuesto utilizando los andamios de la presente divulgación. En base a las especificidades de unión de los andamios obtenidos mediante el cribado de la biblioteca, es posible utilizar dichos andamios en ensayos para capturar el objetivo específico en una muestra, tal como para los métodos de purificación. También se divulga en el presente documento cuando el método de capturar un compuesto en una muestra comprende poner en contacto dicho compuesto en una muestra con un andamio de la presente divulgación bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de compuesto: andamio y eliminar dicho complejo de la muestra, capturando así dicho compuesto en dicha muestra. También se divulga en el presente documento cuando el andamio se inmoviliza para facilitar la eliminación del complejo compuesto: andamio. También se divulga en el presente documento cuando los andamios aislados de bibliotecas de la divulgación comprenden al menos uno, al menos dos, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o más bucles aleatorios. También se divulga en el presente documento cuando las secuencias de bucle de andamio aisladas pueden intercambiarse de un andamio donante a cualquier bucle en un andamio receptor (por ejemplo, una secuencia de bucle FG de un andamio donante puede transferirse a cualquier bucle en un andamio receptor). También se divulga en el presente documento cuando una secuencia de bucle aislada puede transferirse al bucle cognado en el andamio receptor (por ejemplo, una secuencia de bucle FG de un andamio donante puede transferirse a un andamio receptor en la posición del bucle FG). También se divulga en el presente documento cuando las secuencias de bucle aisladas se pueden “mezclar y combinar” aleatoriamente con diversos andamios receptores.
También se divulga en el presente documento cuando las secuencias de andamios aisladas pueden identificarse mediante la secuencia de bucle. Por ejemplo, se utiliza una biblioteca para desplazarse contra un objetivo particular y se aísla una colección de aglutinantes específicos. Las secuencias de bucle aleatorizadas pueden caracterizarse como secuencias específicas independientemente del fondo del andamio (es decir, el andamio que se une al objetivo X en el que dicho andamio comprende una secuencia de bucle FG de SEQ ID NO: X). También se divulga en el presente documento cuando un andamio exhibe dos secuencias de bucle que se unen al objetivo X, las secuencias de bucle pueden caracterizarse como un objetivo de unión X en ausencia de la secuencia del andamio. En otras palabras, se contempla que los andamios aislados de una biblioteca que se unen a un objetivo particular se puedan expresar como secuencias de bucle variables que se unen a ese objetivo independientemente de la estructura principal del andamio. Este proceso sería análogo al concepto de CDR en regiones variables de anticuerpos.
Maduración de afinidad
El desarrollo de los andamios TRAIL R2 Tn3 puede implicar una o más etapas de maduración de afinidad in vitro o in vivo. Se puede emplear cualquier enfoque de maduración por afinidad que resulte en cambios de aminoácidos en un dominio Tn3 o un bucle de dominio Tn3 que mejore la unión del andamio de Tn3 al antígeno deseado.
Estos cambios de aminoácidos se pueden lograr, por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria, mutagénesis “walk -through” y mutagénesis “look-through”. Dicha mutagénesis se puede lograr utilizando, por ejemplo, PCR propensa a errores, cepas “mutantes” de levaduras o bacterias, incorporación de cambios de ácido nucleico aleatorios o definidos durante la síntesis inicial de todo o parte de una molécula de unión basada en FnIII. Los métodos para realizar la maduración por afinidad y/o mutagénesis se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 5,922,545; 5,830,721; 5,605,793, 5,830,650; 6,194,550; 6,699,658; 7,063,943; 5,866,344 y Publicación PCT WO06023144.
Dichos métodos de maduración por afinidad pueden requerir además que la rigurosidad del ensayo de cribado de unión a antígeno se incremente para seleccionar andamios de Tn3 con afinidad mejorada por un antígeno. En el presente documento se pueden utilizar métodos reconocidos en la técnica para aumentar la rigurosidad de un ensayo de interacción proteína-proteína. También se divulga en el presente documento cuando se varían una o más de las condiciones de ensayo (por ejemplo, la concentración de sal del tampón de ensayo) para reducir la afinidad del andamio de Tn3 por el antígeno deseado. También se divulga en el presente documento cuando se reduce el tiempo permitido para que el andamio de Tn3 se una al antígeno deseado.
También se divulga en el presente documento cuando se puede agregar una etapa de unión competitiva al ensayo de interacción proteína-proteína. Por ejemplo, al andamio de Tn3 se le puede permitir primero unirse al antígeno inmovilizado deseado. Luego se agrega una concentración específica de antígeno no inmovilizado que sirve para competir por la unión con el antígeno inmovilizado de tal manera que los andamios de Tn3 con la afinidad más baja por el antígeno se eluyen del antígeno inmovilizado, lo que resulta en la selección de andamios de Tn3 con afinidad de unión al antígeno mejorada. La rigurosidad de las condiciones del ensayo se puede aumentar aún más al aumentar la concentración de antígeno no inmovilizado que se agrega al ensayo.
Los métodos de cribado también pueden requerir múltiples rondas de selección para enriquecer uno o más andamios de Tn3 con una unión de antígeno mejorada. También se divulga en el presente documento cuando en cada ronda de selección se introducen mutaciones de aminoácidos adicionales en el andamio de Tn3. También se divulga en el presente documento cuando en cada ronda de selección, la rigurosidad de la unión al antígeno deseado se incrementa para seleccionar andamios de Tn3 con mayor afinidad para antígeno.
También se divulga en el presente documento cuando la maduración por afinidad se realiza mediante mutagénesis de saturación de porciones de los bucles BC, DE y FG de Tn3. También se divulga en el presente documento cuando la mutagénesis de saturación se realiza utilizando la mutagénesis de Kunkel. También se divulga en el presente documento cuando la mutagénesis de saturación se realiza utilizando PCR.
También se divulga en el presente documento cuando se aplican al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más de cinco rondas de maduración por afinidad. También se divulga en el presente documento cuando la mutagénesis de saturación se aplica a un solo bucle, mientras que algunas veces, solo se muta un bucle o una parte de un bucle durante una ronda de maduración por afinidad. También se divulga en el presente documento cuando más de un bucle o porciones de uno o más bucles se mutan durante la misma ronda de maduración por afinidad.
También se divulga en el presente documento cuando los bucles BC, DE y FG mutaron simultáneamente durante la misma ronda de maduración por afinidad.
En el caso de los andamios de Tn3 para ensamblar en andamios multiméricos que se unen a diferentes epítopos del mismo objetivo o en el caso de andamios de Tn3 biespecíficos, cada especificidad de unión se puede cribar independientemente. También se divulga en el presente documento cuando una primera pantalla para identificar moléculas de unión a Tn3 individuales que se unen a un primer objetivo, por ejemplo, TRAIL R2, se realiza utilizando una primera biblioteca de andamios de Tn3, donde se altera uno o más aminoácidos en uno o más bucles. También se divulga en el presente documento cuando se pueden realizar cribados adicionales para identificar moléculas de Tn3 individuales que se unen a un objetivo diferente o a un epítopo diferente del mismo objetivo.
También se divulga en el presente documento cuando los bucles se aleatorizan utilizando una biblioteca de presentación de fagos. También se divulga en el presente documento cuando la unión de un andamio de Tn3 a un objetivo deseado puede determinarse utilizando métodos reconocidos en la técnica. También, las secuencias de aminoácidos de los andamios de Tn3 identificados en los cribados se pueden determinar utilizando métodos reconocidos en la técnica.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios maduros de afinidad monomérica de la presente divulgación exhiben una afinidad aumentada por TRAIL R2 de al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 40 veces, al menos 60 veces, al menos 80 veces, o al menos 100 veces o más en comparación con el mismo andamio de Tn3 antes de la maduración por afinidad, medido por la resonancia de plasmón superficial o por otros ensayos conocidos en la técnica. También se divulga en el presente documento cuando los andamios maduros de afinidad monomérica de la divulgación tienen una constante de disociación (Kd) de menos de 5 pM, menos de 1 pM, menos de 500 pM, menos de 250 pM, menos de 100 pM o menos de 50 pM, medido por la resonancia de plasmón superficial o por otros ensayos conocidos en la técnica.
Estos métodos de maduración por afinidad se pueden aplicar para desarrollar andamios de Tn3 con propiedades de unión mejoradas deseables, como mayor afinidad u otras características deseables, tales como propiedades farmacocinéticas favorables, alta potencia, baja inmunogenicidad, reactividad cruzada aumentada o disminuida con receptores TRAIL R2 de otros organismos etc.
Generación de repeticiones en tándem
La unión de construcciones en tándem puede generarse mediante la ligadura de oligonucleótidos en sitios de restricción utilizando enzimas de restricción conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a las enzimas de restricción de tipo II y tipo IIS.
Los andamios de Tn3 multiméricos de la presente divulgación pueden comprender un ligador en el C terminal y/o el N terminal y/o entre dominios como se describe en el presente documento. Adicionalmente, los andamios de la presente divulgación que comprenden al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 o los andamios de polipéptidos pueden fusionarse o conjugarse a un dominio de dimerización, que incluye, pero no se limita a una fracción de anticuerpo seleccionado de:
(i) un fragmento Fab, que tiene dominios VL, CL, VH y CH1;
(ii) un fragmento Fab', que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteína en el C terminal del dominio CHI;
(iii) un fragmento Fd que tiene dominios VH y CH1;
(iv) un fragmento Fd' que tiene dominios VH y CH1 y uno o más residuos de cisteína en el C terminal del dominio CH1;
(v) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo;
(vi) un fragmento dAb que consiste en un dominio VH;
(vii) regiones CDR aisladas;
(viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra;
(ix) moléculas de anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, cadena simple Fv; scFv);
(x) un “diacuerpo” con dos sitios de unión a antígeno, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos;
(xi) un “anticuerpo lineal” que comprende un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno;
(xii) un anticuerpo de longitud completa; y
(xiii) una región Fc que comprende CH2-CH3, que puede comprender adicionalmente toda o una porción de una región bisagra y/o una región CH1. Varios esquemas de valencia, afinidad y orientación espacial se ejemplifican a continuación en los Ejemplos.
Producción de andamios
La expresión recombinante de un andamio de la presente divulgación requiere la construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique el andamio. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica un andamio, el vector para la producción del andamio puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Por lo tanto, los métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el andamio se describen en el presente documento. Los métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica se pueden utilizar para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de polipéptidos de andamio y señales de control transcripcionales y traduccionales apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La presente divulgación, por lo tanto, proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un andamio de la presente divulgación, operativamente ligado a un promotor.
El vector de expresión se transfiere a una célula anfitriona mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan luego mediante técnicas convencionales para producir un andamio de la presente divulgación. Por lo tanto, la presente divulgación incluye células anfitrionas que contienen un polinucleótido que codifica un andamio de la presente divulgación, operativamente ligado a un promotor heterólogo. Las células anfitrionas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis).
Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión del anfitrión para expresar los andamios de la presente divulgación. Dichos sistemas de expresión del anfitrión representan vehículos mediante los cuales las secuencias de codificación de interés pueden ser producidas y posteriormente purificadas, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiadas, expresar un andamio de la presente divulgación in situ. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con ADN de bacteriófagos recombinantes, ADN plasmídico o vectores de expresión de ADN cósmido que contienen secuencias de codificación de andamios o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NSO y 3T3).
Los métodos útiles para la producción de andamios de la presente divulgación se describen, por ejemplo, en la Publicación No: WO 2009/058379. Una vez que se ha producido un andamio de la presente divulgación mediante expresión recombinante, se puede purificar por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una proteína.
La producción de los andamios de la presente divulgación en el laboratorio de investigación se puede ampliar para producir andamios en reactores a escala analítica o reactores a escala de producción, como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos No. US 2010-0298541 A1.
Producción escalable de andamios secretados
Los andamios de Tn3 de la presente divulgación pueden producirse intracelularmente o como una forma secretada. También se divulga en el presente documento cuando los andamios secretados están plegados adecuadamente y son completamente funcionales. Los andamios de Tn3 de la presente divulgación se pueden producir mediante un proceso escalable. También se divulga en el presente documento cuando los andamios se pueden producir mediante un proceso escalable de la divulgación en el laboratorio de investigación que se puede ampliar para producir los andamios de la presente divulgación en biorreactores de escala analítica (por ejemplo, pero sin limitarse a biorreactores de 5L, 10L, 15L, 30L o 50L). También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 pueden producirse mediante un proceso escalable de la presente divulgación en el laboratorio de investigación que puede ampliarse para producir los andamios de Tn3 de la presente divulgación en biorreactores a escala de producción (por ejemplo, pero sin limitarse a 75L, 100L, 150L, 300L o 500L). También se divulga en el presente documento cuando el proceso escalable de la divulgación da como resultado una reducción pequeña o nula en la eficiencia de producción en comparación con el proceso de producción realizado en el laboratorio de investigación.
Ligadores
Los andamios de Tn3 en un andamio multimérico se pueden conectar mediante ligadores de proteínas y/o no proteicos, en el que cada ligador se fusiona con al menos dos andamios de Tn3 de la presente divulgación. Un ligador adecuado puede consistir en un ligador de proteínas, un ligador no proteico y combinaciones de los mismos. Las combinaciones de ligadores pueden ser homoméricas o heteroméricas. También se divulga en el presente documento cuando un andamio de Tn3 multimérico de la divulgación comprende una pluralidad de andamios de Tn3 monoméricos en los que los ligadores son idénticos. También se divulga en el presente documento cuando un andamio de Tn3 multimérico comprende una pluralidad de andamios de Tn3 monoméricos en los que al menos uno de los ligadores es funcional o estructuralmente diferente del resto de los ligadores. También se divulga en el presente documento cuando los ligadores pueden contribuir ellos mismos a la actividad de un andamio FnIII multimérico participando directa o indirectamente en la unión a un objetivo.
También se divulga en el presente documento cuando el ligador de proteínas es un polipéptido. El polipéptido ligador debe tener una longitud, que sea adecuada para unir dos o más andamios de monómero de la divulgación o dos o más andamios multiméricos de la presente divulgación de tal manera que asuman la conformación correcta entre sí para que retengan la deseada actividad.
También se divulga en el presente documento cuando el ligador de polipéptido comprende de 1 a aproximadamente 1000 residuos de aminoácidos, de 1 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos, de 1 a 25 residuos de aminoácidos, de 1 a 20 residuos de aminoácidos, de 1 a 15 residuos de aminoácidos, de 1 a 10 aminoácidos residuos, 1-5 residuos de aminoácidos, 1-3 residuos de aminoácidos. La presente divulgación proporciona adicionalmente ácidos nucleicos, tales como ADN, ARN o combinaciones de ambos, que codifican la secuencia ligadora de polipéptidos. Los residuos de aminoácidos seleccionados para su inclusión en el ligador de polipéptidos deben exhibir propiedades que no interfieran significativamente con la actividad o función del andamio de Tn3 multimérico de la presente divulgación. Por lo tanto, un ligador polipeptídico en general no debe presentar una carga que sea inconsistente con la actividad o función del andamio multimérico de la presente divulgación, o interfiera con el plegamiento interno, o forme enlaces u otras interacciones con residuos de aminoácidos en uno o más de los dominios de monómero Tn3 que impedirían seriamente la unión del andamio multimérico de la presente divulgación a TRAIL R2.
El uso de enlaces de péptido de origen natural y artificiales para conectar polipéptidos en nuevos polipéptidos de fusión unidos es bien conocido en la literatura. De acuerdo con lo anterior, los ligadores que fusionan dos o más andamios de la presente divulgación son ligadores naturales, ligadores artificiales o combinaciones de los mismos. También se divulga en el presente documento cuando las secuencias de aminoácidos de todos los ligadores de péptidos presentes en un andamio multimérico de la presente divulgación son idénticas. También se divulga en el presente documento cuando las secuencias de aminoácidos de al menos dos de los enlaces de péptidos presentes en un andamio multimérico de la presente divulgación son diferentes.
También se divulga en el presente documento cuando un ligador de polipéptido posee flexibilidad conformacional. También se divulga en el presente documento cuando una secuencia ligadora de polipéptidos comprende una secuencia de aminoácidos (G-G-G-G-S)x en la que x es un número entero positivo. También se divulga en el presente documento cuando un ligador de polipéptido es un polipéptido natural o artificial inherentemente no estructurado (véase, por ejemplo, Schellenberger et al., Nature Biotechnol. 27: 1186-1190, 2009; véase también, Sickmeier et al., Nucleic Acids Res. 35:D786-93, 2007).
El ligador de péptido puede modificarse de tal manera que se introduzca un residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para una fracción no polipeptídica. Ejemplos de dichos residuos de aminoácidos pueden ser un residuo de cisteína (al que luego se une la fracción de no polipéptido) o la secuencia de aminoácidos puede incluir un sitio de N-glucosilación in vivo (uniendo así una fracción de azúcar (in vivo) al péptido ligador).
También se divulga en el presente documento cuando las secuencias de aminoácidos de todos los enlaces de péptidos presentes en el multímero polipeptídico son idénticas. Alternativamente, las secuencias de aminoácidos de todos los enlaces de péptidos presentes en el multímero polipeptídico pueden ser diferentes.
Marcado o conjugación de andamios
Los andamios de la presente divulgación se pueden utilizar en forma no conjugada o conjugada con al menos uno de una variedad de fracciones heterólogas para facilitar la detección de objetivos o para formación de imágenes o terapia. Los andamios se pueden marcar o conjugar antes o después de la purificación, cuando se realiza la purificación.
Muchas fracciones heterólogas carecen de grupos funcionales adecuados a los que se pueden ligar los andamios de la presente divulgación. Por lo tanto, también se divulga en el presente documento cuando la molécula efectora se une al andamio a través de un ligador, en el que el ligador contiene grupos reactivos para la conjugación. También se divulga en el presente documento cuando la fracción heteróloga conjugada con un andamio de la presente divulgación puede funcionar como un ligador. También se divulga en el presente documento cuando la fracción se conjuga al andamio a través de un ligador que puede ser dividible o no dividible. También se divulga en el presente documento cuando la molécula ligadora dividible es una molécula ligadora dividible redox, de modo que la molécula ligadora se puede dividir en entornos con un potencial redox más bajo, tal como el citoplasma y otras regiones con mayores concentraciones de moléculas con grupos sulfhidrilo libres. Ejemplos de moléculas de enlace que pueden dividirse debido a un cambio en el potencial redox incluyen aquellas que contienen disulfuros.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación están diseñados por ingeniería para proporcionar grupos reactivos para la conjugación. En dichos andamios, el N terminal y/o el C terminal también pueden servir para proporcionar grupos reactivos para la conjugación. También se divulga en el presente documento cuando el N terminal puede conjugarse con una fracción (tal como, pero no limitado a PEG) mientras que el C terminal está conjugado con otra fracción (tal como, pero sin limitarse a biotina), o viceversa. El término “polietilenglicol” o “PEG” significa un compuesto de polietilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento, fracciones de acoplamiento o de activación (por ejemplo, con fracción tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, N-hidroxisuccinimida o una maleimida). El término “PEG” está destinado a indicar polietilenglicol de un peso molecular entre 500 y 150.000 Da, que incluyen análogos del mismo, en los que, por ejemplo, el grupo OH terminal ha sido reemplazado por un grupo metoxi (denominado mPEG).
Los andamios de la presente divulgación pueden derivatizarse con polietilenglicol (PEG). El PEG es un polímero lineal, soluble en agua de unidades de repetición de óxido de etileno con dos grupos hidroxilo terminales. Los PEG se clasifican por sus pesos moleculares, que normalmente varían de aproximadamente 500 daltons a aproximadamente 40.000 daltons. También se divulga en el presente documento cuando los PEG empleados tienen pesos moleculares que varían de 5.000 daltons a aproximadamente 20.000 daltons. Los PEG acoplados a los andamios de la presente divulgación pueden ser ramificados o no ramificados. Véase, por ejemplo, Monfardini, C. et al. 1995 Bioconjugate Chem 6: 62-69. Los PEG están disponibles comercialmente en Nektar Inc., Sigma Chemical Co. y otras compañías. Dichos PEG incluyen, pero no se limitan a, monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenglicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenglicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), monometoxipolietilenglicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenglicol-tresilato (MePEG-TRES) y monometoxipolietilenglicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM).
En resumen, el polímero hidrófilo que se emplea, por ejemplo, PEG, está cubierto en un extremo por un grupo no reactivo tal como un grupo metoxi o etoxi. Posteriormente, el polímero se activa en el otro extremo por reacción con un agente de activación adecuado, tal como haluros cianúricos (por ejemplo, cloruro, bromuro o fluoruro cianúrico), carbonildiimidazol, un reactivo anhídrido (por ejemplo, un anhídrido dihalo succínico, tal como anhídrido dibromosuccínico), acil azida, p-diazoniumbencil éter, 3-(p-diazoniofenoxi)-2-hidroxopropiléter) y similares. El polímero activado se hace reaccionar luego con un polipéptido como se describe en el presente documento para producir un polipéptido derivatizado con un polímero. Alternativamente, un grupo funcional en los andamios de la presente divulgación puede activarse para la reacción con el polímero, o los dos grupos pueden unirse en una reacción de acoplamiento concertada utilizando métodos de acoplamiento conocidos. Se apreciará fácilmente que los polipéptidos de la presente divulgación pueden derivatizarse con PEG utilizando una miríada de otros esquemas de reacción conocidos y utilizados por aquellos expertos en la técnica. Un PEG se puede acoplar a un andamio de la presente divulgación en uno o más grupos funcionales en cualquier extremo del andamio o dentro del andamio. También se divulga en el presente documento cuando el PEG está acoplado en el N terminal o en el C terminal. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación, los análogos o derivados de los mismos pueden conjugarse con un agente de diagnóstico o detectable. Dichos andamios pueden ser útiles para monitorizar o pronosticar el desarrollo o la progresión de una enfermedad como parte de un procedimiento de prueba clínica, tal como determinar la eficacia de una terapia particular.
La presente divulgación abarca adicionalmente usos de andamios conjugados con una fracción terapéutica. Un andamio puede conjugarse con una fracción terapéutica tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ión metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.
Andamios de ensayo
La afinidad de unión y otras propiedades de unión de un andamio a un antígeno pueden determinarse mediante una variedad de métodos de ensayo in vitro conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) o cinética (por ejemplo, Análisis BIACORe®) y otros métodos, como ensayos de unión indirecta, ensayos de unión competitiva, electroforesis en gel y cromatografía (por ejemplo, Filtración en gel). Estos y otros métodos pueden utilizar una etiqueta en uno o más de los componentes que se examinan y/o emplear una variedad de métodos de detección que incluyen, pero no se limitan a, etiquetas cromogénicas, fluorescentes, luminiscentes o isotópicas. Se puede encontrar una descripción detallada de las afinidades de unión y la cinética en Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999).
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación se unen específicamente al objetivo con cinéticas específicas. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación pueden tener una constante de disociación o Kd (k¡nact¡va/kact¡va) de menos de 1x10-2M, 1x10-3M, 1x10-4M, 1x10-5M, 1x10-6M, 1x10-7M, 1x10-8M, 1x10-9M, 1x10-10M, 1x10-11M, 1x10-12M, 1x10-13M, 1x10-14M o menos de 1x10-15M. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación tienen un Kd de 500 pM, 100 pM, 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM o menos según se determina por un BIAcore assay® o por otros ensayos conocidos en la técnica. También se divulga en el presente documento cuando la afinidad de los andamios de la presente divulgación se describe en términos de la constante de asociación (Ka), que se calcula como la relación kactiva/kinactiva, de al menos 1x102M-1, 1x103M-1, 1x104M-1, 1x105M-1, 1x106M-1, 1x107M-1, 1x108M-1, 1x109M-1, 1x1010M-11x1011M-11x1012M-1, 1x1013M-1, 1x1014M-1, 1x1015M-1, o al menos 5 X 1015 M-1. También se divulga en el presente documento cuando la tasa en la que los andamios de la presente divulgación disociados de un epítopo objetivo pueden ser más relevantes que el valor de la Kd o la Ka. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación tienen una kinactiva de menos de 10-3 s-1, menos de 5x10-3 s-1, menos de 10-4 s-1, menos de 5x10-4 s-1, menos de 10-5 s-1, menos de 5x10-5 s-1, menos de 10-6 s-1, menos de 5x10-6 s-1, menos de 10-7 s-1, menos de 5x10-7 s-1, menos de 10-8 s-1, menos de 5x10-8 s-1, menos de 10-9 s-1, menos de 5x10-9 s-1, o menos de 10-10 s-1. También se divulga en el presente documento cuando la tasa en la que los andamios de la presente divulgación asociados con un epítopo objetivo pueden ser más relevantes que los valores de la Kd o la Ka. En esta instancia, los andamios de la presente divulgación se unen a un objetivo con una tasa de kactiva de al menos 105 M-1s-1, al menos 5x105 M-1s-1, al menos 106 M-1s-1, al menos 5 x 106 M-1s-1, al menos 107 M-1s-1, al menos 5 x 107 M-1s-1, o al menos 108 M-1s-1, o al menos 109 M-1s-1.
Los andamios de la presente divulgación también se pueden unir a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno objetivo. Dichos soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
Andamios de Tn3 específicos de TRAIL R2
La proteína TRAIL R2 se codifica por un miembro del gen de la superfamilia del receptor de TNF y contiene un dominio de muerte intracelular. En algunos casos, también puede conocerse como TNFRSFIOB; CD262, DR5, KILLER, KILLER/DR5, TRAILR2, TRICK2, TRICK2A, TRICK2B, TRICKB o ZTNFR9. Este receptor puede activarse mediante el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNFSF 10/TRAIL/APO-2L) y transduce una señal apoptótica. Adicionalmente, la apoptosis inducida por TRAIL R2 implica caspasas y la molécula adaptadora intracelular FADD/MORT1 (Walczak et al. EMBOJ, (1997), 16, 5386-97).
La presente divulgación proporciona andamios de Tn3 que se unen específicamente a TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación se unen específicamente a TRAIL R2 humano. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación se unen a los homólogos de TRAIL R2 de ratón, pollo, rhesus, cinomolgo, rata o conejo. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación se unen a un epítopo expuesto de TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando TRAIL R2 expresado endógenamente en células y/o células transfectadas para expresar ectópicamente el receptor.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación reconocen epítopos presentados en un TRAIL R2 monomérico. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación reconocen epítopos mostrados en una forma homodimérica de TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación se unen a TRAIL R2 monomérico y facilitan la dimerización u oligomerización de 2 o más moléculas de TRAIL R2 (por ejemplo, pero sin limitarse a andamios multiméricos). También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación reducen o inhiben la interacción de TRAIL r2 con el ligando TRAIL. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación imitan la interacción del ligando TRAIL con TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación agonizan la señalización celular por TRAIL-R2.
La presente divulgación también proporciona métodos para modular la actividad de TRAIL R2 utilizando los andamios de Tn3 descritos en el presente documento. También se divulga en el presente documento cuando los métodos de la presente divulgación comprenden poner en contacto una célula que expresa TRAIL R2 con andamios específicos de TRAIL R2 y bloquear la interacción con el ligando TRAIL. También se divulga en el presente documento cuando los métodos de la presente divulgación comprenden poner en contacto una célula que expresa TRAIL R2 con un andamio Tn3 específico de TRAIL R2 e imitar la interacción del ligando TRAIL con TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando los métodos de la presente divulgación comprenden agonizar TRAIL R2 poniéndose en contacto con un andamio de Tn3 específico de TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando los métodos de la presente divulgación comprenden dimerizar u oligomerizar TRAIL R2 poniendo en contacto un monómero de TRAIL R2 expresado en células con un andamio específico de TRAIL R2 y facilitando la dimerización u oligomerización. También se divulga en el presente documento cuando la dimerización de TRAIL R2 se puede lograr mediante, por ejemplo, pero sin limitarse a, andamios de Tn3 multiméricos que: imitan dímeros TRAIL R2, estabilizan la formación de dímeros TRAIL R2, desestabilizan monómeros TRAIL R2 o solo reconocen TRAIL R2 dímeros mostrados sobre las células.
También se divulga en el presente documento cuando la dimerización u oligomerización de TRAIL R2 se puede lograr mediante el uso de andamios monoméricos de Tn3 acoplados con agentes de dimerización o oligomerización de andamio. Dichos agentes de dimerización u oligomerización de andamios pueden incluir, por ejemplo, pero sin limitación, un anticuerpo anti-andamio, el uso de andamios con etiquetas de epítopo junto con anticuerpos a la etiqueta de epítopo, o la incorporación de diversos motivos de dimerización de proteínas u oligomerización descritos en el presente documento y conocidos en la técnica. También se divulga en el presente documento cuando los dímeros u oligómeros TRAIL R2 pueden inducirse mediante la administración de andamios monoméricos seguidas de la administración de un agente de dimerización u oligomerización de andamio.
También se divulga en el presente documento cuando los métodos de la presente divulgación comprenden la administración de un andamio específico de TRAIL R2 que reduce la viabilidad celular medida por ensayos de rutina conocidos en la técnica. También se divulga en el presente documento cuando la reducción en la viabilidad celular es la activación de la apoptosis medida por ensayos conocidos en la técnica. También se divulga en el presente documento cuando la reducción en la viabilidad celular es la inhibición de la división celular medida por métodos aceptados en la técnica. También se divulga en el presente documento cuando la viabilidad celular se reduce en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, a al menos 90% o más en comparación con la viabilidad celular en ausencia de tratamiento.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 que se unen a TRAIL R2 de la presente divulgación agonizan TRAIL R2 con actividad similar al ligando a TRAIL R2, conocido como TRAIL. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 que se unen a TRAIL R2 de la presente divulgación son capaces de activar suficientemente TRAIL R2 para dar como resultado la activación de una o más rutas de señalización intracelular, que incluyen la activación de caspasa 3, caspasa 8, caspasa 10 o FADD. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 que se unen a TRAIL R2 de la presente divulgación activan la apoptosis en al menos un tipo de célula cancerosa. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 que se unen a TRAIL R2 de la presente divulgación demuestran una activación mejorada de apoptosis en al menos un tipo de célula en comparación con TRAIL.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 que se unen a TRAIL R2 de la presente divulgación pueden unirse o competir con la unión por el mismo epítopo en TRAIL R2 que TRAIL (ligando). También se divulga en el presente documento cuando los andamios de unión de TRAIL R2 son capaces de bloquear la inhibición de la interacción de TRAIL R2 con TRAIL en al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o más que se puede determinar en un ensayo competitivo in vitro utilizando el ligando TRAIL soluble (tal como el fragmento 114-281 del ligando TRAIL), estudios cristalográficos u otros estudios in vivo o in vitro conocidos.
Métodos para utilizar andamios específicos de TRAIL R2 de Tn3 en terapia
Se sabe que TRAIL R2 media la señalización de apoptosis. Aunque varios tipos de células normales expresan TRAIL R2, la señalización de apoptosis a través de este receptor parece estar restringida principalmente a las células tumorales, que se vuelven más susceptibles a la apoptosis mediada por el receptor de la muerte en el contexto de su transformación por oncogenes como Myc o Ras (Wang et al. al, Cancer Cell 5: 501-12 (2004); Nesterov et al, Cancer Res. 64:3922-7 (2004)). El TRAIL R2 se expresa con frecuencia por estirpes celulares de cáncer humano, así como por tumores primarios.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios específicos de TRAIL R2 de la presente divulgación se administran a un sujeto que necesita tratamiento (es decir, un paciente con cáncer). En estos casos, se administra una composición estéril, libre de pirógenos que comprende un andamio específico de TRAIL R2 a un sujeto en necesidad del mismo. La eficacia del tratamiento puede medirse utilizando una variedad de ensayos in vitro e in vivo bien conocidos en la técnica, tales como, pero no se limitan a la actividad apoptótica, utilizando la activación de caspasas de la unión de anexina V, así como una reducción en la carga tumoral o volumen.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios específicos de TRAIL R2 de la presente divulgación son útiles para el diagnóstico y detección de cáncer u otras enfermedades asociadas a TRAIL R2. En estos casos, los andamios específicos de TRAIL R2 de la presente divulgación se ligan a un agente de detección, tal como, pero sin limitación, un marcador radioisotópico, fluorescente o quimioluminiscente. Dichos aglutinantes ligados son útiles en métodos que detectan o diagnostican cáncer o enfermedades asociadas a TRAIL R2 en un sujeto, o una muestra tomada de dicho sujeto. Adicionalmente, los andamios específicos de TRAIL R2 son útiles en el diagnóstico y el tratamiento de otras afecciones patológicas asociadas a TRAIL R2, tales como las enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario en mamíferos, que incluyen los humanos.
Secuencias de unión de TRAIL R2 específicas
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de monómero de Tn3 específicos de TRAIL R2 de la presente divulgación comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, o al menos seis secuencias de bucle que se unen a TRAIL R2.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 específicos de TRAIL R2 comprenden al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, o al menos seis secuencias de bucle de andamio de clones de monómero de unión a TRAIL R2 seleccionados de: 1C12 (SEQ ID NO: 132), G3 (SEQ ID NO: 133), 1E11 (SEQ ID NO: 134), C4 (SEQ ID NO: 135), C11 (SEQ ID NO: 136), F4 (SEQ ID NO: 137), y G6 (SEQ ID NO: 138).
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de monómero de Tn3 específicos de TRAIL R2 comprenden al menos una secuencia de bucles seleccionada de las secuencias de bucle enumeradas en la TABLA 4. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de monómeros específicos de TRAIL R2 comprenden al menos una secuencia de bucles BC seleccionada de las secuencias de bucle BC enumeradas en la TABLA 4. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de monómeros específicos de TRAIL R2 comprenden al menos una secuencia de bucle DE seleccionada de las secuencias de bucle DE enumeradas en la TABLA 4. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de monómeros específicos de TRAIL R2 comprenden al menos una secuencia de bucle FG seleccionada de las secuencias de bucle FG enumeradas en la TABLA 4.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de monómero de Tn3 específicos de TRAIL R2 comprenden un bucle BC secuencia seleccionada de las secuencias de bucle BC enumeradas en la TABLA 4; y una secuencia de bucle DE seleccionada de las secuencias de bucle DE enumeradas en la TABLA 4. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de monómeros específicos de TRAIL R2 comprenden una secuencia de bucle BC seleccionada de las secuencias de bucle BC enumeradas en la TABLA 4; y una secuencia de bucle FG seleccionada de las secuencias de bucle FG enumeradas en la TABLA 4. También se divulga en el presente documento cuando los andamios específicos de TRAIL R2 comprenden una secuencia de bucle DE seleccionada de las secuencias de bucle DE enumeradas en la TABLA 4; y una secuencia de bucle FG seleccionada de las secuencias de bucle FG enumeradas en la TABLA 4. También se divulga en el presente documento cuando un andamio de monómero de Tn3 específico de TRAIL R2 comprende secuencias de bucle que corresponden a secuencias de bucle de uno, dos o tres clones de Tn3 diferentes.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos específicos de TRAIL R2 son multímeros lineales, por ejemplo, dímeros tales como el andamio 2 en tándem 1E11 de la SEQ ID NO: 139, tetrámeros tales como el andamio 4 en tándem 1E11 de la SEQ ID NO: 140 o el andamio 2 en tándem G6 de la SEQ ID NO: 143, hexámeros tales como el andamio 6 en tándem 1E11 de la SEQ ID NO: 141, el andamio 2 en tándem G6 de la SEQ ID NO: 144 o el tándem 6 de F4mod12 de la SEQ ID NO: 167, o octámeros tales como el andamio 8 en tándem 1E11 de la SEQ ID NO: 142, el andamio 8 en tándem G6 de la SEQ ID NO: 145, o el andamio 8 en tándem F4mod12 de la SEQ ID NO: 166.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos específicos de TRAIL R2 son fusiones Fc, por ejemplo, la fusión Fc 1C12 de la SEQ ID NO: 149, la fusión Fc G3 de la SEQ ID NO: 150, la fusión Fc 1E11 de la SEQ ID NO: 151, la fusión Fc C4 de la SEQ ID NO: 152, o la fusión Fc G6 de la SEQ ID NO: 153.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos específicos de TRAIL R2 son fusiones similares a anticuerpo, por ejemplo, el andamio que resulta de la asociación del andamio de región constante de cadena pesada de IgG1 1C12 de la SEQ ID NO: 154 con el andamio de cadena ligera kappa 1C12 de la SEQ ID NO: 155, el andamio que resulta de la asociación del andamio de cadena pesada de IgG1 G3 de la SEQ ID NO: 156 con el andamio de cadena ligera kappa G3 de la SEQ ID NO: 157, el andamio que resulta de la asociación del andamio de cadena pesada de IgG1 1E11 de la SEQ ID NO: 158 con el andamio de cadena ligera kappa 1E11 de la SEQ ID NO: 159, el andamio que resulta de la asociación del andamio de cadena pesada de IgG1 C4 de la SEQ ID NO: 160 con el andamio de cadena ligera kappa C4 de la SEQ ID NO: 161, o el andamio que resulta de la asociación del andamio de cadena pesada de IgG1 G6 de la SEQ ID NO: 162 con el andamio de cadena ligera kappa G6 de la SEQ ID NO: 163.
También se divulga en el presente documento cuando el andamio multimérico específico de TRAIL R2 combinan un formato de fusión Fc con un formato lineal, por ejemplo, la fusión Fc 2 en tándem 1E11 de la SEQ ID NO: 164, o la fusión Fc 4 en tándem 1E11 de la SEQ ID NO: 165.
También se divulga en el presente documento, cuando la TRAIL R2 secuencia de andamio multimérico Tn3 específico a TRAIL R2 contiene un ligador y/o una etiqueta de Histidina en el C terminal de la secuencia, este ligador C-terminal y/o etiqueta de Histidina se puede eliminar, la secuencia de aminoácidos correspondiente que de esta manera contiene una supresión del ligador de C-terminal y secuencias de etiqueta His.
También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 multiméricos específicos de TRAIL R2 se conjugan a PEG. También se divulga en el presente documento cuando los andamios en tándem 6 de F4mod12 (SEQ ID NO: 167) o el tándem 8 de F4mod12 (SEQ ID NO: 166) se conjugan a PEG. También se divulga en el presente documento cuando el PEG se conjuga en cualquiera del N terminal o el C terminal de la molécula de andamio multimérico.
Composiciones farmacéuticas
La presente divulgación proporciona una composición, por ejemplo, pero sin limitación, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de andamios o andamios multiméricos de la presente divulgación, formulada junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir una o una combinación de, por ejemplo, pero sin limitación, dos o más andamios diferentes de la presente divulgación. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la presente divulgación puede comprender una combinación de andamios que se unen a diferentes epítopos sobre el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias. También se divulga en el presente documento cuando una composición farmacéutica comprende un andamio multimérico de la presente divulgación.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden administrarse en terapia de combinación, tal como, combinada con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un andamio de la presente divulgación combinado con al menos otra terapia en la que la terapia puede ser inmunoterapia, quimioterapia, tratamiento de radiación o terapia de fármacos. Los compuestos farmacéuticos de la divulgación pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables.
Dosificación y administración farmacéutica
Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles que incluyen un andamio de Tn3 de la presente divulgación, se mezcla un andamio con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. La selección de un régimen de administración para un producto terapéutico depende de varios factores, que incluyen la tasa de recambio en suero o tejido de la entidad, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad de la entidad y la accesibilidad de las células objetivo en la matriz biológica. También se divulga en el presente documento cuando un régimen de estación de administración maximiza la cantidad de terapia administrada al paciente consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser tóxico para el paciente El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente divulgación empleadas, o el éster, sal o amida de los mismos, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción de compuesto particular empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, el estado de salud general y el historial médico previo del paciente tratado, y como factores bien conocidos en las técnicas médicas.
Una composición de la presente divulgación también se puede administrar a través de una o más rutas de administración utilizando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación pueden formularse para asegurar una distribución adecuada in vivo.
Métodos de uso de andamios
Los andamios de Tn3 de la presente divulgación tienen utilidades diagnósticas y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de trastornos.
También, muchos receptores de la superficie celular se activan o desactivan como consecuencia del entrecruzamiento de subunidades. Los andamios de Tn3 de la presente divulgación se pueden utilizar para estimular o inhibir una respuesta en una célula objetivo mediante el entrecruzamiento de receptores de la superficie celular tales como TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación se pueden utilizar para bloquear la interacción de múltiples receptores de la superficie celular con antígenos. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación se pueden utilizar para fortalecer la interacción de múltiples receptores de la superficie celular con antígenos. También se divulga en el presente documento cuando puede ser posible entrecruzar homo- o heterodímeros de un receptor de superficie celular utilizando los andamios de Tn3 de la presente divulgación que contienen dominios de unión que comparten especificidad para el mismo antígeno, o se unen a dos antígenos diferentes. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación podrían utilizarse para suministrar un ligando, o análogo de ligando a un receptor específico de la superficie celular.
La presente divulgación también proporciona métodos para dirigir epítopos que no se logran fácilmente con anticuerpos tradicionales. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación se pueden utilizar para dirigir primero a un antígeno adyacente y mientras se une, otro dominio de unión puede enganchar el antígeno críptico.
La presente divulgación también proporciona métodos para utilizar los andamios de Tn3 de la presente divulgación para reunir distintos tipos de células. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de la presente divulgación pueden unirse a una célula objetivo con un dominio de unión y reclutar otra célula a través de otro dominio de unión. También se divulga en el presente documento cuando la primera célula puede ser una célula cancerosa y la segunda célula es una célula efectora inmunitaria tal como una célula NK. También se divulga en el presente documento cuando los andamios de Tn3 de la presente divulgación se pueden utilizar para fortalecer la interacción entre dos células distintas, tales como una célula presentadora de antígeno y una célula T para posiblemente estimular la respuesta inmunitaria.
La presente divulgación también proporciona métodos para utilizar los andamios de Tn3 para mejorar, tratar o prevenir el cáncer o síntomas del mismo. También se divulga en el presente documento cuando la presente divulgación proporciona un método para utilizar los andamios de Tn3 de la presente divulgación para agotar las poblaciones celulares resistentes a TRAIL. A este respecto, los andamios de Tn3 de la presente divulgación se pueden utilizar para tratar algunos tipos de cánceres resistentes a la terapia.
La presente divulgación también proporciona métodos para utilizar andamios de Tn3 para agotar una población celular. También se divulga en el presente documento cuando los métodos de la presente divulgación son útiles en el agotamiento de los siguientes tipos de células: eosinófilos, basófilos, neutrófilos, células T, células B, mastocitos, monocitos y células tumorales. La presente divulgación también proporciona métodos para utilizar andamios para inactivar, inhibir o agotar las citoquinas. La presente divulgación también proporciona métodos para utilizar proteínas de andamios de Tn3 como reactivos de diagnóstico. También se divulga en el presente documento cuando la unión de los andamios de Tn3 de la presente divulgación a los receptores TRAIL R2 se puede utilizar de forma diagnóstica para detectar células que expresan TRAIL R2. También se divulga en el presente documento cuando la capacidad de los andamios de Tn3 de la presente divulgación para diferenciar entre poblaciones celulares resistentes a TRAIL pero sensibles a los miméticos TRAIL, y poblaciones celulares resistentes a TRAIL y también a los miméticos TRAIL (véase, por ejemplo, el Ejemplo 19) puede utilizarse para fines de diagnóstico Los andamios de Tn3 de la presente divulgación pueden ser útiles en kits o reactivos en los que diferentes antígenos necesitan ser capturados eficientemente de manera concurrente. También se contempla que los cánceres provocados por aberraciones en la apoptosis también pueden tratarse mediante los métodos y composiciones de la presente divulgación.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir, controlar, tratar o mejorar el cáncer. El andamio de Tn3 multimérico específico de TRAIL R2 se puede utilizar para tratar el cáncer, por ejemplo, cáncer de pulmón, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas y mieloma múltiple. El tratamiento del cáncer con Tn3 multimérico específico de TRAIL R2 puede comprender adicionalmente una terapia adicional, tal como inmunoterapia, terapia biológica, quimioterapia, terapia de radiación o terapia de fármaco de molécula pequeña.
Los métodos para tratar el cáncer pueden comprender la administración a un sujeto que lo necesite de una dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de uno o más andamios de Tn3 de la presente divulgación en combinación con cirugía, solo o en combinación adicional con la administración de una quimioterapia estándar o experimental, una terapia hormonal, una terapia biológica/inmunoterapia y/o una terapia de radiación. Los andamios de Tn3 de la presente divulgación se pueden utilizar para prevenir, controlar, tratar o mejorar el cáncer, enfermedades autoinmunitarias, inflamatorias o infecciosas o uno o más síntomas o uno o más síntomas de los mismos pueden o no estar conjugados o fusionados a una fracción (por ejemplo, agente terapéutico o fármaco). TABLA 1. Secuencias y. SEQ ID Nos. de componentes moleculares para ensamblar andamios representativos:
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Ejemplos
Ejemplo 1
Diseño de varios formatos multivalentes de Tn3
Se han diseñado formatos multivalentes del andamio de Tn3. Los formatos multivalentes contienen uno o más módulos de Tn3 fusionados entre sí, fusionados con otros motivos de proteínas que pueden oligomerizarse, o fusionados entre sí y con otros motivos de proteínas que pueden oligomerizarse se muestran en la Figura 1. En cada caso, la entidad molecular resultante contiene al menos 2 módulos de Tn3. Los ligadores de polipéptidos que conectan los módulos de Tn3 entre sí o con otros motivos de proteína pueden estar estructurados o no estructurados y con o sin una función. Se proporcionan específicamente tres clases de ejemplo de proteínas de andamio de Tn3 multivalentes: (i) proteínas multivalentes lineales (L) que contienen módulos de Tn3 fusionados entre sí a través de un ligador de polipéptido; (ii) proteínas multivalentes similares a anticuerpos (Ig) que contienen uno o más módulos de Tn3 fusionados linealmente fusionados a las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y (iii) proteínas multivalentes que contienen Fc que contienen uno o más módulos de Tn3 fusionados linealmente fusionados a una región Fc de anticuerpo (Figura 1).
Ejemplo 2
Expresión y purificación de proteínas que contienen Tn3 específicas de TRAIL R2 multivalentes
Se preparó una serie de ocho módulos multivalentes de Tn3 que contienen proteínas de andamio (también denominadas “proteínas Tn3” o “andamios de Tn3”) con especificidad de unión a TRAIL R2 humano. Se prepararon ejemplos a partir de cada uno de los tres formatos multivalentes descritos en el Ejemplo 1, y todas estas proteínas presentaron 2 o más del módulo A1 de unión a TRAIL R2 Tn3 (clon 1E11, G6 o 1C12). Para varias proteínas Tn3 multivalentes específicas de TRAIL R2, también se generó una proteína Tn3 de control correspondiente (clon D1, un dominio Tn3 específico para el anticuerpo Synagis®) que no se unía a TRAIL R2, que difiere solo en la secuencia y especificidad de unión de los módulos componentes Tn3. El clon Tn3 D1 es una proteína Tn3 en la que los bucles BC, DE y FG de un clon 1E11 se reemplazan con bucles alternativos con secuencias correspondientes a SEQ ID NO: 99, 38 y 107, respectivamente (véase TABLA 4). Los números de identidad de secuencia de las construcciones de proteínas Tn3 multivalentes que se expresaron se muestran en la TABLA 2, y todas las construcciones posibles se representan esquemáticamente en la TABLA 3 y la Figura 2. Las secuencias de bucle para los clones se proporcionan en la TABLA 4.
TABLA 2. Nombres, formatos, valencias y especificidades de proteínas expresadas que contienen Tn3
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TABLA 3. Representación esquemática de construcciones de andamios de Tn3
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TABLA 4 Secuencias de bucle de clones de Tn3 utilizados en estos estudios
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Preparación de construcciones de expresión: Las enzimas utilizadas eran de New England Biolabs (Ipswich, MA), los kits de purificación de ADN eran de Qiagen (Germantown, MD), y los cebadores de ADN eran de IDT (Coralville, IA). La preparación de construcciones de expresión que codifican 2 o más módulos de Tn3 fusionados linealmente fue como sigue. El ADN que codifica un módulo de Tn3 específico de TRAIL R2 (por ejemplo, 1E11; SEQ ID NO: 134; G6, SEQ ID NO: 138; etc.) se amplificó por PCR con los cebadores “módulo de Tn3 gly4ser1 directo” (SEQ ID NO: 112) y “módulo de Tn3 gly4ser2 inverso” (SEQ ID NO: 113) (TABLA 5).
Después de la limpieza del producto de PCR, el ADN amplificado se dividió en dos, con una mitad digerida con Bpml y la otra mitad digerida con Acul. Las muestras digeridas se purificaron utilizando un kit de limpieza de PCR y se ligaron con ADN ligasa T4 para hacer un producto de ADN que codifica dos módulos de Tn3 (A2). Este material se purificó por electroforesis en gel de agarosa y nuevamente se dividió en dos. La digestión con NcoI y KpnI seguido del ligamiento en pSec-oppA (L25M) digerido con NcoVKprA (descrito en WO 2009/058379 A2, Ejemplo 18) produjo la construcción de expresión bacteriana para la proteína A2. El ligamiento del producto no digerido en el vector pCR 2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) proporcionó material genético para la generación de fusiones de orden superior. Para hacer un fragmento de a Dn que codifique cuatro módulos de Tn3 (A3), el ADN A2 clonado con TOPO se amplificó por PCR con cebadores “módulo de amp directo” (SEQ ID NO: 114) y “módulo de amp inverso” (SEQ ID NO: 115) (TABLA 5), purificado y dividido en dos para la digestión con Ac1 o Bpml. El resto del proceso para hacer la construcción de expresión A3 fue el mismo que el utilizado para hacer la construcción A2, en el que el ADN que codifica A3 se ensambló a partir de bloques de construcción A2. Nuevamente, la clonación concurrente de ADN A3 ensamblado en pCR 2.1 -TOPO proporcionó material genético para la generación de fusiones de orden superior.
Para la preparación de construcciones de expresión bacteriana A4 y A5, se introdujo un módulo adaptador en el extremo 3' de la secuencia de codificación multi-Tn3 dentro de la construcción de expresión A3. Para hacer esto, el vector de expresión A3 se digirió primero con KpnI y EcoRl, y el fragmento extirpado se reemplazó con un casete dúplex que contiene los oligonucleótidos “inserto de BamHI en pSec directo” (SEQ ID NO: 116) e “inserto de BamHI en pSec inverso” (SEQ ID NO: 117) (TABLA 5). La amplificación por PCR de las secuencias A2 y A3 a partir de las construcciones TOCR pCR 2.1 correspondientes se realizó con los cebadores “inserto de módulo BamHI directo” (SEQ ID NO: 118) y “módulo amp inverso” (SEQ ID NO: 115) (TABLA 5). Los productos amplificados se digirieron doblemente con BamHI/KpnI y se clonaron en una construcción de expresión A3 digerida de manera similar.
Las proteínas A6-A9 se expresaron por transfección transitoria de células 293F, como se describe en el Ejemplo 16 del documento WO 2009/058379 A2. En resumen, los vectores de expresión se generaron mediante PCR amplificando el módulo (o módulos) Tn3 a partir de las construcciones de expresión bacteriana, y clonándolos en vectores internos que codifican la región Fc, la región constante de la cadena ligera kappa y/o las regiones constantes de cadena pesada CH1-bisagra-CH2-CH3 para la expresión de proteínas de fusión o anticuerpos Fc. Para la proteína A9, un módulo de Tn3 reemplaza las regiones variables del anticuerpo en la cadena pesada de IgG1 humana y la cadena ligera kappa. En la TABLA 5 se muestran los cebadores que agregan sitios NheI y KasI compatibles para realizar fusiones Fc de las construcciones en tándem.
TABLA 5. Secuencias de cebadores utilizados en la construcción de proteínas multivalentes de Tn3
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Expresión y purificación de proteínas: las proteínas Tn3 monovalentes o lineales se expresaron en BL21(DE3) E. coli (EMü/Novagen, Gibbstown, NJ) y las proteínas etiquetadas con His se purificaron de los medios de cultivo utilizando resina Ni NTA Superflow (Qiagen). Sorprendentemente, a pesar de las grandes diferencias en los pesos moleculares, todas estas construcciones se expresaron en niveles medios a altos en E. coli y se secretaron eficientemente en los medios (TABLA 6 y Figura 3).
Para expresar la fusión Fc y las proteínas similares a anticuerpos (A6-A9), las células 293F se transfectaron transitoriamente con las construcciones de expresión apropiadas. Las cosechas de sobrenadante se realizaron los días 6 y 10 y la proteína se purificó por cromatografía de afinidad de proteína A.
Todas las proteínas purificadas se analizaron por SDS-PAGE en NuPage Novex 4-12% bis tris geles en tampón MES sin agente reductor, y se visualizaron utilizando SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA). La cromatografía de exclusión por tamaño también se utilizó para analizar proteínas purificadas y, cuando fue necesario, el material agregado se eliminó en una columna Superdex 75 10/300GL o Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Piscataway, NJ), hasta un nivel final inferior al 10% de la proteína total. Se utilizó una unidad Acrodisc con una membrana Mustang E (Pall Corporation, Port Washington, NY) según lo indicado por el fabricante para eliminar la endotoxina de las preparaciones de proteínas expresadas bacterianamente.
TABLA 6. Rendimiento después de la purificación de formatos representativos de proteínas Tn3 multivalentes
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Ejemplo 3
Afinidad de unión de TRAIL R2 para proteínas Tn3 mono y polivalentes
Para medir el efecto de la valencia de Tn3 sobre la afinidad de unión para una serie de proteínas Tn3 específicas de TRAIL R2, se realizó un experimento ELISA de competición. Una placa NUNC MaxiSorp de 96 pozos (Thermo Fisher, Rochester, NY), se recubrió con A9 (1C12) (SEQ ID NO: 154 SEQ ID NO: 145) un andamio específico TRAIL R2 en un formato similar a un anticuerpo, en PBS a 2 pg/ml durante la noche a 4°C. Las placas fueron bloqueadas con PBS 0.1% Tween 20 10 mg/ml BSA. Se incubaron diluciones de A1 (monómero 1E11) y andamios multiméricos de formato lineal A2 (1E11 bivalente) o A3 (1E11 tetravalente) en la placa recubierta con 0.75 nM de TRAIL R2-Fc biotinilado durante dos horas a temperatura ambiente en PBS 0.1% Tween 20 1 mg/ml de BSA, lavado. El TRAIL R2 Fc biotinilado unido se detectó con estreptavidina HRP, TMB y se neutralizó con ácido. La absorbancia se leyó a 450 nm. Los datos se muestran en la Figura 4) Las afinidades de unión (IC50) se muestran en la TABLA 7 y se calcularon como la concentración de proteína competitiva requerida para reducir la unión máxima de TRAIL R2-Fc biotinilado en un 50%.
Los valores de IC50 para A2 y A3 fueron al menos 30 veces más bajos que los del monómero A1 y están en el límite de este ensayo (es decir, aproximadamente igual a la concentración de TRAIL R2-Fc biotinilado). La unión de TRAIL R2-Fc biotinilado para inmovilizar Tn3 específico de TRAIL R2 fue desplazada por las construcciones de unión TRAIL R2.
En relación con la proteína A1 monomérica, las proteínas bi- y tetravalentes A2 y A3 se unen a TRAIL R2-Fc con una afinidad 30-40 veces mayor, lo que es una indicación de que los múltiples módulos de Tn3 retienen su actividad de unión y contribuyen a una mayor afinidad a través de un efecto de avidez. La verdadera diferencia en la afinidad entre las proteínas Tn3 mono y bi o tetravalentes puede ser mayor de 30-40 veces dado que los valores de IC50 para A2 y A3 fueron aproximadamente iguales a la concentración de TRAIL R2-Fc biotinilada utilizada en el ensayo (0.75 nM).
TABLA 7. Valores IC50 para la inhibición de la unión de TRAIL R2-Fc a proteína de Tn3 de unión de TRAIL R2 A9 (1C12)
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Ejemplo 4
Citometría de flujo para confirmar la unión celular
Se utilizó citometría de flujo para confirmar la especificidad de la unión de una proteína de Tn3 específica de TRAIL R2 multivalente a TRAIL R2 endógeno expresada en la superficie celular de las células H2122. Las células H2122 adherentes (una estirpe celular de adenocarcinoma de cáncer de pulmón de células no pequeñas) se separaron de los matraces de cultivo de tejidos utilizando Accutase (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA). Las células se enjuagaron con medio completo (medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%) y se resuspendieron en PBS/FBS al 2% a aproximadamente 2 x 106 células/mL. La proteína A9 Tn3 (1E11) (SEQ iD NO: 158 SEQ ID NO: 159), un andamio multimérico de formato similar a un anticuerpo tetravalente, o la proteína T9 de control de formato similar B9 (clon D1), se prepararon a concentraciones de 40 nM PBS/BS al 2% F.
Las células se sembraron en placas de fondo de U de 96 pozos a 75 pl por pozo, y se agregaron muestras de proteínas a 25 pl por pozo (a una concentración final de 10 nM). La placa se incubó a 4°C durante aproximadamente 1 hora, luego se lavó 3 veces con PBS/FBS al 2%. Se agregó anticuerpo secundario conjugado IgG anti-IgG Alexa Fluor 488 humano (100 pl/pozo), y la placa se incubó a 4°C durante aproximadamente 30 minutos y se lavó como se describió anteriormente. Las células se resuspendieron en 100 pl de PBS/ FBS al 2%, y el análisis de citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro BD LSR II (BD Biosciences, San José, CA). Un cambio (aumento) en las células H2122 marcadas con fluorescencia cuando se incuban con la proteína Tn3 específica de TRAIL R2 en relación con el control confirmó que la proteína Tn3 específica de TRAlL R2 podría unirse al TRAIL R2 celular (Figura 5).
Ejemplo 5
Efecto de la valencia y el formato sobre la apoptosis de las células H2122 por las proteínas Tn3 específicas de TRAlL R2
La muerte celular apoptótica se puede inducir en estirpes celulares de cáncer mediante el entrecruzamiento de la superficie celular TRAIL R2. Este efecto puede determinarse en ensayos celulares que miden el número de células viables. Con este fin, las células de las estirpes celulares de carcinoma de pulmón H2122 se sembraron en placas de 96 pozos a una densidad de 10.000 células/pozo en 75 pl de medio completo (medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%). Después de la incubación durante la noche a 37°C, los medios se suplementaron con 25 pl de medios adicionales que contenían una dilución en serie de proteínas Tn3 específicas de TRAlL R2 (clon 1E11) o de control negativo (clon D1). Todos los tratamientos se realizaron en pozos duplicados. El ligando TRAlL disponible comercialmente (Chemicon/Millipore, Billerica, MA) se utilizó como control positivo para la muerte celular inducida por el receptor TRAlL. Después de 72 horas, se utilizó el kit CellTiter-Glo de Promega (Madison, Wl) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para ensayar los niveles de ATP, que es una medida del número de células viables en el cultivo. La luminiscencia del ensayo se midió en un lector de placas Envision (PerkinElmer, Waltham, MA). La inhibición de la viabilidad celular se determinó al dividir los valores de luminiscencia para las células tratadas por la luminiscencia promedio para las células viables no tratadas. Se generaron gráficos de respuesta a la dosis de inhibición frente a la concentración del compuesto, y se determinó la potencia de muerte celular (EC50) como la concentración de proteína requerida para inhibir el 50% de la viabilidad celular.
Para probar el efecto de la valencia en la actividad proapoptótica de las proteínas Tn3 específicas de TRAlL R2 multivalente, las células H2122 se trataron con la proteína A1 monovalente Tn3 (clon 1E11), y la serie de proteínas Tn3 fusionadas linealmente A2-A5 (cada clon 1E11) que contienen 2, 4, 6 u 8 módulos de Tn3. Mientras que las proteínas Tn3 mono y bivalentes mostraron una actividad de destrucción nula o insignificante, las proteínas que contienen 4, 6 y 8 módulos de Tn3 inhibieron potentemente la viabilidad celular H2122, aumentando la potencia en función de la valencia (Figura 6A; TABLA 8). La proteína A3 (tetravalente) tenía una potencia similar a TRAlL, el ligando TRAlL R2 natural, mientras que las proteínas A4 (hexavalente) y A5 (octavalente) eran 1-2 logs más potentes. Está claro a partir de este ensayo que, para un formato molecular dado, la destrucción celular mejora con una mayor valencia, hasta un punto en el que el ensayo ya no puede discriminar.
TABLA 8. Valores EC50 para la destrucción de H2122 por construcciones multivalentes
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Para demostrar que la inhibición de la viabilidad celular depende de la unión de TRAIL R2, se incubaron 100 pM de proteína A5 (clon G6) (es decir, 167x la EC50) con células H2122 en presencia de proteína soluble TRAIL R2-Fc. La represión dependiente de la dosis de la destrucción celular por TRAIL R2-Fc soluble es una indicación de que la destrucción celular depende de la unión de la proteína a 5 a TRAIL R2 de superficie celular (Figura 6B). Se observaron resultados similares con la proteína A5 que comprende bucles del clon 1E11 (datos no mostrados).
Además del número de módulos de unión, la actividad de las proteínas Tn3 multivalentes también puede verse afectada por el formato molecular utilizado para presentar las unidades de unión individuales. Para probar el efecto del formato molecular sobre la actividad, las células H2122 se trataron con diferentes proteínas Tn3 específicas de TRAIL R2 que presentan el mismo número de módulos de unión a Tn3. La capacidad de las proteínas tetravalentes A3, A7 y A9 (cada clon 1E11) para inducir la muerte de las células H2122 se probó en el ensayo de viabilidad celular, al igual que el par de proteínas octavalentes de Tn3 A5 y A8 (cada clon 1E11). Las proteínas mono y bivalentes inactivas se incluyeron como controles negativos y TRAIL como control positivo (Figura 7; TABLA 9 y TABLA 10). En la Figura 7A, para las tres construcciones probadas con una valencia de cuatro, es evidente que A3 (formato lineal) y A7 (formato de fusión Fc) son similares en su actividad de destrucción celular y son más potentes para matar células H2122 que A9 (formato de fusión similar a anticuerpo). Esto muestra claramente que la orientación espacial de los módulos de Tn3 puede tener un efecto considerable sobre la bioactividad, en el que A3 es aproximadamente 150 veces más potente que la proteína A9 en la inhibición de la viabilidad celular H2122 (TABLA 9). La Figura 7B muestra que ambos formatos de proteínas Tn3 de unión a TRAIL R2 octavalentes, A5 (lineal) y A8 (fusión Fc), tienen una eficacia similar en la inhibición de la viabilidad de las células H2122. Los datos de EC50 para estas construcciones se muestran en la TABLA 9. La capacidad de ajustar la afinidad, la valencia y la orientación espacial ofrece una gran flexibilidad en términos de la capacidad de diseñar con precisión el resultado terapéutico deseado.
TABLA 9. Valores de EC50 para la destrucción de H2122 por construcciones multivalentes con una valencia de cuatro
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TABLA 10. Valores EC50 para la destrucción de H2122 por construcciones multivalentes con una valencia de ocho
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Ejemplo 6
Destrucción de células dependiente de la dosis en las estirpes celulares Colo205 y Jurkat
Para demostrar que las proteínas Tn3 específicas de TRAIL R2 multivalentes podrían destruir estirpes celulares cancerosas que no sean H2122, también se analizaron otras estirpes celulares que expresan TRAIL R2. La estirpe celular de adenocarcinoma colorrectal Colo205 (Figura 8A) y la estirpe de leucemia de células T Jurkat (Figura 8B) se probaron para determinar su capacidad de ser destruidas por las proteínas A3 (tetravalente, formato lineal) (SEQ ID NO: 143) y A5 (octavalente, formato lineal) (SEQ ID NO: 145) (cada clon G6). Cada estirpe celular se incubó con A3, A5, el TRAIL de control positivo o una proteína de control negativo B5 (SEQ ID NO: 148) que no se une a TRAIL R2, y el ensayo de viabilidad celular se realizó como se describe para H2122. En cada una de estas estirpes celulares, A5 muestra una inhibición extremadamente potente de la viabilidad celular. La proteína A3 de valencia más baja también induce la destrucción celular, aunque con una potencia más baja que A5. Por lo tanto, la construcción de valencia superior muestra una mayor actividad. Como se esperaba, TRAIL también podría inhibir la viabilidad celular, pero no la proteína B5 de control negativo octavalente, que no se une a TRAIL R2.
TABLA 11. Valores EC50 para la eliminación de Colo205 por construcciones lineales en tándem
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TABLA 12. Valores EC50 para la eliminación de células Jurkat por construcciones lineales en tándem
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Las células se analizaron mediante el ensayo CellTiter-Glo como en el Ejemplo 5.
Ejemplo 7
Diseño, expresión y actividad de andamios en tándem bivalentes específicos de CD40L de ratón
Se prepararon proteínas Tn3 específicas de CD40L de murino bivalentes (TABLA 13) al fusionar un par de módulos de Tn3 idénticos. M13 es una proteína Tn3 que se une específicamente a CD40L murino. La secuencia de M13 corresponde a la secuencia de Tn3 en la que las secuencias de los bucles BC, DE y FG se reemplazan con bucles alternativos con secuencias correspondientes a SEQ ID NO: 100, 104 y 110, respectivamente (véase TABLA 4). Se utilizaron ligadores que contenían 1 (Construcción C1 (M13)), 3 (Construcción C2 (M13)), 5 (Construcción C3 (M13)) o 7 (Construcción C4 (M13)) copias de la unidad Gly4Ser (GS) longitudes totales de ligador entre 13 y 43 aminoácidos (véase Figura 9A y TABLA 3).
TABLA 13. Nombres, valencias y especificidades de las proteínas que contienen Tn3 expresadas
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En resumen, las construcciones de expresión se generaron de la siguiente manera: el fragmento A se generó mediante amplificación por PCR del aglutinante CD40L murino pSec-M13 clonado en el vector pSec- oppA (L25M) descrito en el ejemplo 1 con un cebador específico para el vector pSec en dirección ascendente del Tn3 gen y cebador “ligador 1-3 GS inverso” (SEQ ID NO: 123) (véase TABLA 14 para secuencias de cebadores específicos de Tn3 utilizados). Los fragmentos BIGS y B3GS se generaron mediante amplificación por PCR de la misma plantilla con los cebadores “ligador 1 GS” (SEQ ID NO: 121) o “ligador 3 GS” (SEQ ID NO: 122), respectivamente, y un cebador específico para el pSec vector en dirección descendente del gen Tn3. Tras la purificación en gel de los fragmentos, el Fragmento A y B1GS o el Fragmento A y B3GS se mezclaron, y las construcciones en tándem se generaron mediante PCR solapada en una reacción de PCR con los dos cebadores específicos de vector pSec. Los productos se digirieron con NcoI y KpnI y se clonaron nuevamente en el vector pSec-oppA (L25M) como se describe en el Ejemplo 1, dando las dos construcciones: C1(M13) y C2(M13). Para generar las construcciones de ligador 5 y 7 GS, insertos de ligador generados por amplificación por PCR de los oligonucleótidos “ligador 5 GS” (SEQ ID NO: 124) y “ligador 7 GS” (SEQ ID NO: 125), respectivamente, con cebadores “GS L Amp directo” (SEQ iD NO: 126) y “GS L Amp inverso” (SEQ ID NO: 127) se digirieron con Pstl y Xmal y se clonaron en un fragmento de vector generado al cortar pSecM13-1GS-M13 con PstI y XmaI produciendo las construcciones C3 (M13) y C4 (M13).
TABLA 14. Secuencias de cebadores utilizadas en la construcción de construcciones específicas de MuCD40L bivalente en tándem
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Las construcciones en tándem monovalentes y bivalentes que comprenden andamios de Tn3 idénticos se expresaron y purificaron de forma recombinante a partir de E. coli como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 9B representa un análisis SDS-PAGE de las preparaciones de proteínas purificadas bajo condiciones reductoras y no reductoras.
Para probar las eficiencias de unión de las construcciones bivalentes en tándem M13-M13 y compararlas con el andamio monovalente M13, se probó su inhibición competitiva de la unión de CD40L murino al receptor CD40 murino inmovilizado en un chip biosensor.
En resumen, se inmovilizó un fragmento del receptor CD40 de murino en forma de fusión quimérica con la región Fc de IgG1 en un chip GLC (Bio-Rad) a una densidad de aproximadamente 3000 unidades de respuesta. Para los ensayos de unión competitiva, se incubaron diluciones en serie de 3 veces de M13 monovalente o las construcciones bivalentes en tándem de M13 con diferente longitud del ligador durante 20 minutos con una concentración fija de CD40L se murino recombinante producido por E. coli (0.5 pg/ml) en PBS que contiene 0.1% (v/v) de Tween-20 y 0.5 mg/mL de BSA. Luego, estas muestras se inyectaron sobre el chip GLC a una tasa de flujo de 30 pL/min durante 300 segundos y el nivel de CD40L unido se registró en un punto de tiempo fijo dentro del sensorgrama y se comparó con el nivel correspondiente de proteína unida en ausencia de cualquier competidor. Después de cada medición de unión, el CD40L residual se desorbió de la superficie del chip al inyectar glicina-HCl 10 mM (pH 2.0). Los efectos de unión no específicos se corrigieron al restar los sensorgramas de los puntos intermedios del chip. Los valores de IC50 correspondientes a las concentraciones de construcciones de Tn3 requeridas para desplazar el 50% de CD40L murino se calcularon utilizando GraphPad Prism.
Como se muestra en la Figura 9C, la concentración inhibidora media máxima (IC50) para el monómero M13 fue de 71 nM mientras que la IC50 para la construcción bivalente en tándem C1 (M13) fue de 29 nM. Se obtuvieron valores de IC50 similares de 5 o 6 nM para las construcciones bivalentes que contienen ligadores más largos (construcciones C2 (M13), C3 (M13) y C4 (M13), respectivamente). Debido a la concentración de CD40L utilizada en el ensayo, esto está en el límite inferior de las IC50 que se puede observar en este ensayo. Todas las construcciones bivalentes tenían un valor IC50 más bajo en comparación con la construcción monovalente, lo que indica una actividad de unión mejorada de las construcciones en tándem bivalentes en comparación con un único módulo M13 Tn3. La longitud del ligador en estas construcciones bivalentes exhibe algún efecto sobre la potencia del ensayo, con la construcción de longitud del ligador más corta que tiene una potencia intermedia, mientras que las construcciones con ligadores de 23 o más aminoácidos son equivalentes en este ensayo.
Para probar la actividad de las construcciones de Tn3 en tándem bivalente en una actividad basada en células y compararlas con el andamio de M13 monovalente, se probó la inhibición de la expresión de CD86 inducida por CD40L murino en células B. Como control, se probó en paralelo el anticuerpo específico anti-murino CD40L (MR1) disponible en el mercado.
El ensayo utiliza PBMC preparada a partir de sangre de voluntarios sanos. En resumen, se recogió sangre recién extraída en un tubo de preparación de células BD Vacutainer® CPT™ con heparina. Después de la centrifugación, la capa celular que contenía PBMC se recogió y se lavó dos veces con PBS y una vez con medio RPMI 1640. Las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 completo (suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, P/S al 1 %) a una concentración de 5 X 106 células/ml.
La estirpe celular Th2 que expresa CD40L de murino D10. G4.1 se lavó y se resuspendió en medio RPMI 160 completo a una concentración de 1 x 106 células/ml.
LAs construcciones bivalentes en tándem M13, M13-M13 C1-C4 o anticuerpo MR1 (BioLegend Cat. No: 106508) se diluyeron en serie (1:3) en medio RPMI 1640 completo. Se agregó una muestra de 50 pl de cada dilución a los pozos en una placa de cultivo de tejido con fondo U de 96 pozos. Cada pozo recibió 50 pl de células D10.G4.1 (5x104), y después de mezclar, las placas se incubaron a 37°C durante 1 hora. A continuación, se agregaron 100 pl de PBMC resuspendidos (5 x 105 células) a cada pozo y se incubaron a 37°C durante 20-24 h.
Se recogieron PBMC y se tiñeron con CD86 anti-humano APC (BD bioscience, Cat# 555660) y CD19 anti-humano FITC (BD bioscience, Cat# 555412) en tampón FACS (PBS pH 7.4, BSA al 1%, azida de sodio al 0.1%) a 4°C durante 30 minutos en la oscuridad. Después de dos lavados en tampón FACS, las muestras fueron analizadas por FACS LSRII (Becton Dickinson). Se evaluó la expresión de CD86 en células B activadas con CD 19. El análisis de la expresión de CD86 en función de la proteína de prueba se realizó utilizando el software GraphPad Prism.
Como se muestra en la Figura 9D, las construcciones bivalentes en tándem M13-M13 inhiben toda la expresión de CD86 con una IC50 de 100 a 200 pM, comparable a la IC50 del anticuerpo MR1 (100 pM) y aproximadamente 3 registros más potentes que el andamio monovalente M13 en sí mismo. En contraste con el ensayo bioquímico, no se observó ningún efecto de la longitud del ligador en este ensayo basado en células, y las construcciones bivalentes con ligadores que varían de 13 a 43 aminoácidos de longitud todos muestran una capacidad equivalente de potencia mejorada en relación con la proteína monovalente.
Ejemplo 8
Expresión de andamios en tándem biespecíficos
Para generar construcciones de Tn3 biespecíficas con especificidad a TRAIL R2 y CD40L humanas (HuCD40L), dos módulos de Tn3, uno con especificidad a TRAIL R2 (clon 1E11) y otro con especificidad para CD40L humano (clon 79), se fusionaron con ligadores de longitud variable que separan los dos módulos (TABLA 3 y TABLA 15). La secuencia de la proteína del clon 79 (SEQ ID NO: 184) corresponde a la secuencia de un módulo de Tn3 en el que los bucles BC, DE y EF se han reemplazado por bucles alternativos correspondientes a las SEQ ID NO: 101, 105 y 111, respectivamente. Las construcciones de expresión para los andamios biespecíficos en tándem que contienen ligadores con 1 y 3 repeticiones Gly4Ser (GS) (construcciones C6 y C8, respectivamente) se generaron como se describe en el Ejemplo 7, excepto que los plásmidos que llevan las variantes Tn3 A1 y 79 se utilizaron inicialmente como plantillas de PCR. Las construcciones C5 (que contienen un ligador corto derivado de la secuencia natural que une los segundo y tercero dominios FnIII en la tenascina C humana, que puede considerarse parte de la hebra A beta del tercer dominio FnIII aunque no es necesario para la unión del andamio) y la construcción C7 se generaron de manera similar a C6 y C8, utilizando los cebadores adicionales enumerados en la TABLA 16, excepto que se utilizó “ligador 0 GS inverso” en lugar de “ligador 1 -3 GS inverso” para C5.
TABLA 15. Nombres, valencias y especificidades de las proteínas que contienen Tn3 expresadas
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TABLA 16. Secuencias de cebadores adicionales utilizadas en la construcción de construcciones en tándem biespecíficas
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Los andamios de Tn3 biespecíficos monovalentes y en tándem se expresaron de forma recombinante en medios de E. coli como se describe en el Ejemplo 2. Los niveles de expresión de las construcciones solubles se analizaron utilizando SDS-PAGE. La Figura 10 demuestra niveles de expresión aceptables para las construcciones probadas.
Ejemplo 9
Unión específica de andamios biespecíficos en tándem
Para medir la unión de construcciones de Tn3 biespecíficas a CD40L y TRAIL R2, se empleó un ensayo ELISA de captura. En resumen, las construcciones de proteínas etiquetadas con His 8X: Al, 79, C5, C6, C7 o C8 (véase TABLA 15 para más detalles) se capturaron de los medios de E. coli en los pozos recubiertos con anticuerpo anti-His de la siguiente manera. Una placa MaxiSorb de 96 pozos se recubrió con anticuerpo anti-His Qiagen a 2 pg/ml durante la noche. La placa revestida se bloqueó con PBS que contenía 0.1% v/v de Tween-20 y 4% p/v de leche descremada en polvo (PBST 4% de leche) durante 1.5 horas. La placa revestida se lavó con PBSt y se agregaron medios bacterianos diluidos (diluidos 30 veces) que contenían proteínas expresadas solubles y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar con PBST, los pozos que contenían las construcciones capturadas se incubaron durante 1.5 horas con concentraciones variables de TRAIL R2 biotinilado (Figura 11A) o un complejo generado por preincubación de E. coli produjo HuCD40L marcado con His con anticuerpo anti-His biotinilado. (Figura 11B). Después de lavar con PBST, se detectó el complejo TRAIL R2 o HuCD40L/anticuerpo anti-His con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (RPN1231V; GE Healthcare; dilución de trabajo 1000x) durante 20 minutos, lavado con PBST y detección colorimétrica mediante la adición de sustrato TMB (Pierce). La absorbancia se leyó a 450 nm.
Unión de los andamios biespecíficos específicos a TRAIL R2-HuCD40L para TRAIL R2, y la unión de los andamios biespecíficos TRAIL R2-HuCD40L específicos a HuCD40L se representan en la Figura 11A y la Figura 11B, respectivamente. Los andamios en tándem biespecíficos, designados C5 a C8, que comprenden un dominio Tn3 específico de TRAIL R2 fusionado con un dominio Tn3 específico de HuCD40L unido a TRAIL R2 y HuCD40L; sin embargo, las construcciones monoméricas/monoespecíficas de Tn3 A1 y 79 se unieron a TRAIL R2 o HuCD40L de acuerdo con sus especificidades conocidas, pero no con ambos objetivos.
Unión simultánea de construcciones específicas de TRAIL R2-HuCD40L en tándem para TRAIL R2 y HuCD40L se determinaron utilizando un ensayo AlphaScreen™. Las diluciones de los medios de E. coli que contienen proteínas A1, 79, C5, C6, C7 y C8 se incubaron con proteína de fusión TRAIL R2-Fc 10 nM, HuCD40L biotinilado 50 nM (producido en E. coli), perlas donadoras de estreptavidina AlphaScreen (0.02 mg/ml) y perlas aceptoras de proteína A AlphaScreen (0.02 mg/ml) en PBS Tween al 0.01% BSA al 0.1%. Las muestras fueron incubadas 1 h en la oscuridad antes de la lectura en un lector PerkinElmer Envision. La población de perlas de donantes se excitó con un láser a 680 nm, lo que provocó la liberación de oxígeno singlete. El oxígeno singlete tiene una vida útil limitada, lo que le permite viajar hasta 200 nm por difusión antes de volver al estado fundamental. El oxígeno singlete excita las perlas aceptoras provocando emisión de luz entre 520-620 nm, que se mide por el lector Envision. Solo cuando las perlas donadoras y aceptoras están próximas se genera una señal. Por lo tanto, se observa un aumento en la señal cuando los dos tipos de perlas se unen mediante moléculas que interactúan con los dos objetivos simultáneamente. En ausencia de unión a cualquiera de los objetivos, no se debe detectar ninguna señal.
Como se muestra en la Figura 12, las construcciones biespecíficas en tándem se unen simultáneamente TRAIL R2 y HuCD40L que generan una fuerte señal AlphaScreen; sin embargo, los andamios monovalentes de Tn3, A1 y 79, no generaron una señal que indicara que no podían acercar las perlas donantes y aceptoras uniendo simultáneamente ambos objetivos.
Ejemplo 10
Mayor estabilidad de los andamios de Tn3 que tienen un bucle FG de 9 aminoácidos de longitud
Para medir el efecto de la longitud del bucle FG en la estabilidad de Tn3, el despliegue de seis andamios de Tn3 específicos de HuCD40L mediante clorhidrato de guanidina (GuHCl) a pH 7.0 se evaluaron mediante fluorescencia intrínseca de triptófano. Estos andamios monoméricos de Tn3 contenían longitudes de bucle FG de 9, 10 u 11 aminoácidos. Se prepararon muestras de andamio de Tn3 de 0.05 mg/mL que contenían diferentes concentraciones de clorhidrato de guanidina en fosfato de sodio 50 mM, pH 7.0. Los espectros de emisión de fluorescencia se adquirieron en un espectrofluorómetro Horiba Fluoromax-4 a una longitud de onda de excitación de 280 nm. La intensidad de emisión de fluorescencia relativa a 360 nm se graficó en función de la concentración de GuHCl para cada proteína. Cada andamio contenía secuencias de bucle BC, DE y FG únicas. Los clones A3 (SEQ ID NO: 185; tenga en cuenta que el andamio monomérico A3 en este ejemplo es distinto de la construcción designada A3 como se proporciona en la Tabla 3), 71 (SEQ ID NO: 186), 79 (SEQ ID NO: 184), 127 (SEQ ID NO: 187), 252 (SEQ ID NO: 188) y 230 (SEQ ID NO: 189) se desplegaron más del 50% en GuHCl 3.0M a pH 7.0, que es la concentración de GuHCl requerida para efectuar el despliegue del 50% (Cm) de Tn3 progenitor. Los valores de Cm para los clones A3, 79, 127, 252 y 230 fueron 2.2M, 2.7M, 2.4M, 2.7M, 2.4M, respectivamente. La longitud del bucle FG para estos clones es de 11, 11, 11, 10 y 11 aminoácidos respectivamente, mientras que la longitud del bucle FG para Tn3 progenitor es de 10 aminoácidos. Sorprendentemente, el clon 71, la única variante que tiene una longitud de bucle FG de 9 aminoácidos, exhibió un Cm de 4.2 M, una estabilidad significativamente mayor que el andamio de Tn3 progenitor o las otras cinco variantes probadas. Los resultados se muestran en la Figura 13)
Para determinar si la estabilidad mejorada del clon 71 de Tn3 era intrínseca a su secuencia, o una consecuencia de la longitud reducida de los bucles FG, este clon y dos proteínas de andamio Tn3 monoméricas adicionales, (A6 (SEQ ID NO: 190; tenga en cuenta que el monómero A6 el andamio en este ejemplo es distinto de la construcción designada A6 como se proporciona en la Tabla 3) y P1C01 (SEQ ID NO: 191)) con una longitud de bucle FG de 9 aminoácidos (pero diferentes secuencias de bucle BC, DE y FG) se analizaron mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) y se compara con el andamio de Tn3 progenitor que contiene un bucle FG de 10 aminoácidos de largo. Se analizaron muestras de proteína Tn3 a 1 mg/ml en PBS pH 7.2. En todos los casos, el punto medio del despliegue térmico fue mayor para los clones con los bucles FG de 9 residuos en comparación con Tn3 progenitor (WT), que tiene un bucle FG de 10 residuos. El despliegue térmico fue reversible, o parcialmente reversible (clon A6) como se evidencia por termogramas superponibles cuando la misma muestra fue enfriada y recalentada. Como se muestra en la Figura 14, la temperatura de fusión (Tm) para Tn3 progenitor fue de 72.1°C, para P1C01 la Tm fue de 75.2°C, para A6 la Tm fue de 77.5°C, y para 71 la Tm fue de 74.4°C.
Estos hallazgos se corroboraron probando las mismas variantes de proteína Tn3 en un experimento de estabilidad con clorhidrato de guanidina. El desdoblamiento de Tn3, P1C01, A6 y 71 progenitores (WT) por clorhidrato de guanidina (GuHCl) a pH 7.0 se evaluó mediante fluorescencia intrínseca de triptófano como se describió anteriormente. Como se muestra en la Figura 15, de acuerdo con los datos DSC en la Figura 14, los clones Tn3 A6, 71 y P1C01 tienen puntos medios de despliegue a concentraciones de GuHCl significativamente más altas que el andamio de Tn3 progenitor (WT), lo que indica que se mejora la estabilidad de las proteínas Tn3 que tienen bucles FG que tienen 9 aminoácidos de longitud, es decir, más cortos que eso en el andamio de Tn3 progenitor.
Ejemplo 11
Análisis de estabilidad de la longitud del bucle FG
Como se describió anteriormente, el análisis preliminar indicó que las moléculas Tn3 que tienen una longitud del bucle FG de 9 residuos es significativamente más estable que aquellos que tienen bucles FG más largos. En estos estudios, realizamos un análisis de estabilidad en un conjunto de Tn3 aleatorios para evaluar el efecto de la longitud de bucle FG sobre la estabilidad térmica.
Se subclonó una biblioteca Tn3 en el vector de expresión pSEC. Esta biblioteca codifica Tn3s con bucles BC, DE y FG de secuencia variable, así como de longitud variable pero definida. El bucle FG, que es el foco de estos estudios, puede tener 9, 10 u 11 residuos de largo. El bucle BC puede tener 9, 11 o 12 residuos de largo. El bucle DE en esta biblioteca tiene una longitud fija de 6 residuos. La biblioteca subclonada se utilizó para transformar células competentes DH5a, de las cuales se purificó un conjunto de plásmidos y se utilizó para transformar células BL21 (DE3). Las colonias BL21 se secuenciaron para identificar 96 clones que codificaron Tn3 de longitud completa. Los 96 clones finales se cultivaron en una placa de 96 pozos profundos a una escala de 500 pl utilizando la expresión estándar de Magic Media (agitación a 37°C durante 24 horas después de la inoculación) y se analizaron en SDS-PAGE. Se escalaron 29 clones aleatorios que tenían niveles de expresión de moderados a altos hasta una escala de expresión de 50 mL y se purificaron utilizando cromatografía de afinidad con metal inmovilizado estándar. Las identidades de todas las proteínas se confirmaron por espectrometría de masas.
Los clones aleatorios se analizaron para determinar la estabilidad mediante DSC. En resumen, las mediciones de DSC se realizaron en un VP-Capilar DSC (MicroCal). Las proteínas se intercambiaron en PBS (pH 7.2) a través de una extensa diálisis, y se ajustaron a una concentración de 0.25-0.5 mg/ml para el análisis DSC. Las muestras se exploraron de 20-95°C a una tasa de exploración de 90°C/hora, sin repetir la exploración. Los resultados se muestran en la TABLA 17.
TABLA 17. Comparación de los valores de Tm de T n3s con FG9 vs FG10/11
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En este estudio, se comparó la estabilidad térmica de Tn3s con longitud de bucle FG9 o FG10 y 11. La tendencia muestra que los dominios Tn3 que tienen un bucle FG de longitud 9 son más termoestables que aquellos con una longitud de bucle FG10 u 11. Un dominio T n3 de tipo silvestre, de control (con un bucle FG de 10 residuos) tenía una Tm de 72°C cuando se ejecutó en paralelo con las muestras anteriores. El rango de valores de Tm visto con cada longitud de bucle indica que otros factores también juegan una función en la determinación de la termoestabilidad del dominio Tn3.
Ejemplo 12
Generación y caracterización de un Tn3 triespecífico
En estos experimentos, se generó y caracterizó una molécula de Tn3 que tenía especificidad de unión para tres objetivos diferentes. D1, el dominio Tn3 específico para el anticuerpo Singáis®, se unió a 1E11, un dominio Tn3 específico para el receptor TRAIL 2, y 79, un dominio Tn3 específico para CD40L, respectivamente (Figura 16A). La construcción se expresó en células BL21 (DE3) de E. coli y se purificó utilizando métodos estándar (véase Figura 16B).
Para confirmar que las construcciones triespecíficas eran capaces de unir pares de los tres objetivos simultáneamente, se realizaron experimentos AlphaScreen y ELISA. Para los experimentos AlphaScreen, Tn3 triespecífico, subconjuntos de dos de las tres moléculas objetivo totales (una biotinilada y la otra que contiene una región Fc de anticuerpo), las perlas donadoras de proteína A y las perlas aceptoras de estreptavidina se combinaron en un Optiplate blanco de 384 pozos, como se describió anteriormente. La señal AlphaScreen solo se puede observar cuando la perla donadora de estreptavidina y la perla aceptora de proteína A están cerca una de la otra (200 nm el uno del otro), lo que en este ensayo se logra a través de un puente mediante la molécula triespecífica. AlphaScreen confirmó la capacidad de D1-1E11-79 para unir simultáneamente huCD40L y TRAIL R2-Fc (Figura 17A) y para unir simultáneamente huCD40L y Synagis® (Figura 17B) de la siguiente manera: en un pozo de 384 pozos Optiplate blanco, los siguientes componentes se combinaron en un volumen total de 30 pl: D1-1E11-79 purificado 20 mM, biotinilado-huCD40L 50 mM, (0, 1, 2.5, 5, 10 o 42 nM) TrailR2-Fc (Figura 18A) o (0, 1, 2.5, 5, 10 o 42 nM) Synagis (Figura 18B), 5 pl cada una de 1/50 diluciones de perlas aceptoras de proteína A AlphaScreen y perlas de donador de estreptavidina. Después de 1 hora de incubación en la oscuridad, la placa se leyó sobre un lector de placas Envision en modo AlphaScreen.
Debido a que Synagis® y TRAIL R2-Fc contienen un dominio Fc, el ensayo AlphaScreen no pudo utilizarse para demostrar la unión simultánea de estas moléculas a la construcción triespecífica. En lugar de esto, se realizó un experimento ELISA. Las placas MaxiSorp se revistieron con TRAIL R2-Fc (100 pl a 1 pg/ml), se bloquearon con leche al 4%, y luego se agregaron concentraciones variables de la construcción triespecífica. Se agregó Synagis biotinilado, el segundo ligando objetivo, y se detectó mediante la adición de estreptavidina HRP (Figura 18). También se demostró que D1-1E11-79 era capaz de unir TRAIL R2-Fc y Synagis® simultáneamente, como se indica por los resultados de ELISA en la Figura 18) Por lo tanto, podemos concluir que esta construcción puede unir los tres pares de sus objetivos simultáneamente.
Ejemplo 13
Aislamiento principal
El primer paso en el desarrollo de un agonista Tn3 es aislar un monómero Tn3 que puede unirse a TRAIL R2 y cuando está ligado a un formato multivalente puede unir dos o más dominios extracelulares de TRAIL R2 de una manera que se una a la ruta apoptótica. Como no todos los aglutinantes pueden actuar como agonistas, decidimos aislar primero un panel de aglutinantes y luego detectar agonismo en un ensayo secundario de destrucción celular in vitro. Primero seleccionamos una gran biblioteca de Tn3 con fagos con variación en los bucles BC, DE y FG sobre TRAIL R2-Fc recombinante para aislar un panel inicial de aglutinantes. El andamio de Tn3 elegido como base para esta biblioteca no era un 3er dominio FnIII nativo de la tenascina C sino una versión que tenía un disulfuro diseñado por ingeniería para mejorar la estabilidad. Se construyó una biblioteca interna de presentación de fagos fusionados Tn3/gen 3 que contenía aleatorización en los bucles BC, DE y FG. Se encontraron múltiples aglutinantes mediante un ELISA de fagos en el que TRAIL R2 se recubrió directamente en una placa y se detectó la unión de fagos diluidos 1:3 en PBS Tween 20 al 0.1% (PBST) 1% de leche mediante anticuerpo conjugado con anti-M13 -peroxidasa (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ). La mayoría de los aglutinantes tenían una cisteína libre indeseable en uno de los bucles y no fueron elegidos para su posterior estudio. Un subconjunto de los clones que carecen de una cisteína desapareada se clonó en vectores de expresión que generan una fusión de Fc o una construcción similar a un anticuerpo (Figura 1) y se analizaron en la estirpe celular tumoral H2122 para la destrucción celular (datos no mostrados). Aunque el formato de fusión Fc no pudo matar las células independientemente de su Tn3 fusionada, el formato similar al anticuerpo provocó una respuesta para más de un aglutinante.
Ejemplo 14
Maduración de afinidad
El clon 1C12 (SEQ ID NO: 132) (véase Figura 19) mostró la mejor destrucción celular en los ensayos de detección iniciales y, por lo tanto, se eligió para la maduración por afinidad. La maduración por afinidad se realizó mediante mutagénesis de saturación de porciones de los bucles utilizando mutagénesis unkel o PCR con oligonucleótidos que contienen aleatorización, ensamblaje y ligamiento en el vector de presentación en fagos. La ronda uno y tres consistieron en mutagénesis de saturación en partes de los bucles BC y FG, respectivamente, y la ronda 2 combinó la mutagénesis de saturación de partes de los tres bucles por separado, el barrido, la combinación de genes y el barrido de los mutantes mezclados para obtener el clon de salida de mayor afinidad. Los grupos de clones maduros por afinidad se recuperaron después de la selección por PCR directamente del fago o al preparar el ADN de hebra sencilla utilizando un kit Qiagen (Qiagen, Valencia, cA) y luego PCR. Los productos de pCr se digirieron de NcoI a KpnI (New England Biolabs, Ipswich, MA) y se clonaron en nuestro vector de expresión interno pSEC. Los clones se expresaron en MagicMedia (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se ejecutaron sobre un gel para verificar que la expresión no difería mucho entre los clones. Los clones mejorados se identificaron mediante un ELISA de competición en el que las placas se recubrieron con 1C12 tetravalente, similar a un anticuerpo (SEQ ID NO: 154 y 155), y la inhibición en la unión de biotina TRAIL R2 0.75 nM en presencia de diluciones de Tn3 en MagicMedia se midió utilizando estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ). Se agregó TMB (KPL, Gaithersburg, Md ) y se neutralizó con ácido. La absorbancia se leyó a 450 nm.
Las mediciones de afinidad se realizaron en el sistema de matriz de interacción de proteínas ProteOn XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA) con chip sensor GLC a 25°C. Se utilizó solución salina tamponada con fosfato de ProteOn con Tween 20 al 0.005%, pH 7.4 (PBS/Tween) como tampón continuo. TRAIL R2 se inmovilizó en el chip y una dilución en serie doble de 12 puntos de los aglutinantes Tn3 (1C12 (SEQ ID NO: 132), 1E11 (SEQ ID NO: 134), G3 (SEQ ID NO: 133), C4 (SEQ ID NO: 135) y G6 (SEQ ID NO: 138)) se prepararon en PBS/Tween/0.5mg/ml BSA, pH 7.4 a concentraciones iniciales que varían de 36 pM a 700 nM. Se inyectaron muestras de cada concentración en los seis canales de analito a una tasa de flujo de 30 pl/min. por 300 segundos la Kd se determinó utilizando la configuración de análisis de equilibrio dentro del software ProteOn. Las secuencias de los mejores clones de cada ronda se muestran en la Figura 19) La mejora total en la afinidad después de tres rondas de maduración de afinidad fue de casi dos órdenes de magnitud con los mejores clones con afinidades en el rango de 40-50 nM (TABLA 18). TABLA 18: Constantes de unión en equilibrio de los mejores clones monoméricos a partir de la maduración por afinidad del clon principal 1C12 medido por la Resonancia de Plasma de Superficie (SPR).
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Ejemplo 15
Efecto de la afinidad de Tn3 sobre la potencia en formato similar a anticuerpo
Con el fin de evaluar el efecto de la afinidad de la subunidad TN3 individual sobre la potencia, todos los clones en la TABLA 18 se formatearon en la construcción similar a un anticuerpo representada en la Figura 1) Para expresar las proteínas similares a anticuerpos, las células 293F se transfectaron transitoriamente con las construcciones de expresión apropiadas. Las cosechas de sobrenadante se realizaron los días 6 y 10 y la proteína se purificó por cromatografía de afinidad de proteína A. Todas las proteínas purificadas se analizaron por SDS-PAGE en NuPage Novex 4-12% bis tris geles en tampón MES sin agente reductor, y se visualizaron utilizando SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA).
La cromatografía de exclusión por tamaño también se utilizó para analizar proteínas purificadas y, cuando fue necesario, el material agregado se eliminó en una columna Superdex 75 10/300GL o Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Piscataway, NJ), hasta un nivel final inferior al 10% de proteína total. Se utilizó una unidad Acrodisc con una membrana Mustang E (Pall Corporation, Port Washington, NY) según lo indicado por el fabricante para eliminar la endotoxina de las preparaciones de proteínas expresadas bacterianamente.
Las células H2122 se probaron luego para determinar la sensibilidad a las construcciones agonísticas similares a anticuerpos utilizando un ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo. En este ensayo, la luminiscencia es directamente proporcional a los niveles de ATP dentro de un pozo dado de una placa de 96 pozos, que a su vez es directamente proporcional a la cantidad de células viables metabólicamente activas. Para la estirpe celular H2122, las células se sembraron en placas de 96 pozos a una densidad de 10.000 células/pozo en 75 pl de medio completo (medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%). Después de la incubación durante la noche a 37°C, los medios se suplementaron con 25 pl de medios adicionales que contenían una dilución en serie de proteínas de control específicas de TRAIL R2 o negativas. Todos los tratamientos se realizaron en pozos duplicados. El ligando TRAIL disponible comercialmente (Chemicon/Millipore, Billerica, MA) se utilizó como control positivo para la muerte celular inducida por el receptor TRAIL.
Después de 72 horas, se utilizó el kit CellTiter-Glo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La luminiscencia del ensayo se midió sobre un lector de placas Envision (PerkinElmer, Waltham, MA). La inhibición de la viabilidad celular se determinó dividiendo los valores de luminiscencia para las células tratadas por la luminiscencia promedio para las células viables no tratadas.
Dos variables determinan la potencia: la concentración a la cual una construcción inhibe la viabilidad de las células en un 50% (EC50) y la inhibición máxima de la viabilidad celular. La Figura 20 muestra que, como tendencia general, una mayor afinidad del monómero Tn3 conduce a una EC50 más baja de las construcciones similares a anticuerpos ya que G6 tiene una EC50 más baja que 1E11 y 1E11 tiene una EC50 más baja que 1C12.
Ejemplo 16
Farmacocinética de Tn3 lineal
Para determinar la semivida de los tándems lineales de Tn3 en función del número de Los módulos de Tn3 por tándem, el monómero G6 (SEQ ID NO: 138), tándem 4 de G6 (SEQ ID NO: 143), tándem 6 de G6 (SEQ ID NO: 192) y tándem 8 de G6 (SEQ ID NO: 145) se inyectaron en un ratón y la concentración en suero de Tn3s se monitorizó mediante un ELISA. La ruta de administración fue la inyección intraperitoneal (IP). El diseño experimental se muestra en la TABLA 19. Los ratones fueron desangrados 150 pL por punto de tiempo. Se detectaron Tn3 en suero mediante un ELISA en el que las placas recubiertas con TRAIL R2 producidas internamente se incubaron con suero diluido en leche PBST al 1%. Los ELISA iniciales se realizaron para determinar para un punto de tiempo dado el rango de dilución correcto para que la señal esté dentro del rango dinámico del ensayo. La Tn3 unida se detectó con una dilución 1 en 1.000 de suero policlonal anti-Tn3 de conejo en leche PBST al 1% (Covance, Princeton, NJ) seguido de una dilución 1 en 10.000 en leche PBST al 1% de HRP anti-conejo de burro (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Para cada construcción, se realizó una curva estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando un programa estadístico interno.
El término “concentración en plasma máxima” (“Cmax”) se refiere a la concentración más alta observada de Tn3 en tándem en plasma después de la administración del material de prueba al paciente.
El término “Tmax” se refiere al tiempo hasta la concentración en plasma máxima Cmax.
El término “área bajo la curva” (“AUC”) es el área bajo la curva en un gráfico de la concentración de Tn3 en tándem en plasma frente al tiempo. El AUC puede ser una medida de la integral de las concentraciones en plasmas instantáneas (Cp) durante un intervalo de tiempo y tiene las unidades de masa*tiempo/volumen. Sin embargo, AUC generalmente se da para el intervalo de tiempo cero a infinito. Por lo tanto, como se utiliza en el presente documento “AUCinf” se refiere a un AUC de un período de tiempo infinito.
El término “semivida biológica” (“T1/2”) se define como el tiempo requerido para que la concentración en plasma de Tn3 en tándem alcance la mitad de su valor original.
El término “CL/F” se refiere a la depuración corporal total aparente calculada como Dosis/AUCinf.
La semivida biológica de Tn3 (T1/2) aumenta con el número creciente de Tn3 en tándem por molécula lineal. Agregar siete Tn3 para hacer un tándem 8 a partir de un monómero aumentó la semivida en casi un 50%. Los aumentos en la valencia no afectaron la Tmax. Sin embargo, los aumentos en la valencia de 1 a 8 resultaron en aumentos de aproximadamente 10 y 7 veces en Cmax y AUCinf, respectivamente. Adicionalmente, cuando la valencia aumenta de 1 a 8, se observó una disminución de aproximadamente 7 veces en la depuración (CL/F).
TABLA 19: Diseño experimental del ensayo farmacocinético en tándem lineal anti-TRAIL R2.
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TABLA 20: Propiedades farmacocinéticas de Tn3 en tándem
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Ejemplo 17
Mejora de ingeniería de la reactividad cruzada de cyno
Para las pruebas de toxicidad preclínica en monos cynomolgus (Macaca fascicularis), es deseable desarrollar un anti-TRAIL R2-Tn3 que reaccione de forma cruzada con cynomolgus TRAIL R2 (TRAIL R2 de cyno). Nuestros clones principales madurados por afinidad inicial tenían poca reactividad cruzada con TRAIL R2 de cyno, aunque la homología con TRAIL R2 humano es del 88%. La reactividad cruzada se mejoró haciendo una biblioteca basada en el clon F4 (SEQ ID NO: 137), que fue el clon con la mejor reactividad cruzada cyno entre los clones que resultó de la maduración por afinidad.
Se crearon dos bibliotecas por mutagénesis de saturación: una con diversidad en el bucle FG solo y otra con diversidad en los bucles BC y FG. También se utilizó una PCR mutagénica de baja tasa de error para permitir mutaciones fuera de los bucles que pueden ser beneficiosas para la unión mejorada de TRAIL R2 de cyno. Se realizaron cuatro rondas de cribado de fagos en TRAIL R2 de cyno producido internamente, y las salidas se clonaron en el vector de expresión pSEC. Para el cribado de los éxitos iniciales en un formato ELISA, se secretaron Tn3 en MagicMedia (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se capturaron del sobrenadante utilizando un anticuerpo anti-his (R y D Systems, Minneapolis, MN).
La unión de humano o TRAIL R2 de cyno-Fc en solución a Tn3 capturado se detectó por anti-humano-Fc-HRP. Los clones que tenían una unión significativa a TRAIL R2 de cyno-Fc y no parecían perder la unión a TRAIL R2-Fc humano se seleccionaron para un ELISA de cribado posterior en el que se recubrió una placa con sobrenadantes Tn3 de TRAIL se titularon y luego detectaron con etiqueta anti-his h Rp . Debido a que el nivel de variación en los niveles de expresión de clon a clon era bajo, y también porque la avidez de tener TRAIL R2-Fc en solución no podía enmascarar las diferencias en la afinidad de Tn3, este ELISA permitió la discriminación por afinidad. Se descubrió que una mutación, una mutación de D a G dos aminoácidos antes del bucle DE, estaba presente en todos los clones de reacción cruzada de cyno diseñados (Figura 22A). Esta mutación D a G se manipuló en el F4 original para hacer un clon llamado F4mod1 (SEQ ID NO: 193) y la reactividad cruzada para cyno mejoró enormemente sin sacrificar la unión al TRAIL R2 humano (Figura 22B). En este ELISA, se midió la inhibición de la unión de 0.75 nM de humanos o TRAIL R2 de-Fc cyno a placas recubiertas con F4mod1 mediante F4 o F4mod1 purificado.
Se desea que la unión de un clon mejorado con reacción cruzada de cyno a TRAIL-R2-FC de cyno estará dentro de diez veces de su unión al TRAIL R2-Fc humano. Adicionalmente, se desea que la unión de un clon mejorado con reacción cruzada de cyno a TRAIL-R2-Fc de cyno esté dentro de diez veces de la unión de F4 a TRAIL R2-Fc humano. La IC50 para la unión de F4mod1 a TRAIL R2 de cyno difiere en menos de tres veces de la IC50 para la unión de F4mod1 a TRAIL R2 humano. Adicionalmente, la IC50 para la unión de F4mod1 a TRAIL R2 humano es seis veces más fuerte que la IC50 para la unión de F4 a TRAIL R2 humano. De acuerdo con lo anterior, F4mod1 cumple los requisitos de reactividad cruzada previstos.
Ejemplo 18
Ingeniería de estirpe germinal de clon reactivo cruzado de cyno mejorado
El clon F4mod1 se diseñó para eliminar mutaciones no esenciales de la estirpe germinal a fin de reducir el posible riesgo de inmunogenicidad. Se realizó un panel de doce modificaciones diferentes para determinar si había un efecto de una mutación dada en la unión a humanos y TRAIL R2 de cyno. La Figura 23a muestra una comparación del clon final F4mod12 (SEQ ID NO: 194), que incorpora todas las mutaciones probadas de la estirpe germinal que no afectan la unión, a otras construcciones, a saber, la estirpe germinal Tn3, el progenitor F4 y el clon F4mod1 (reacción cruzada de cyno mejorado inicial diseñada por ingeniería).
La secuencia de aminoácidos de F4mod12 comienza con la secuencia nativa de Tn3 SQ, termina con L, tiene una reversión de la mutación del marco 2 de A a T, y tiene una reversión de los dos aminoácidos finales del bucle DE de TA a NQ. La Figura 23B muestra que F4, F4mod1 y F4mod12 están todos dentro de seis veces uno del otro en su unión al TRAIL R2 humano. También muestra que F4mod1 y F4mod12 se duplican entre sí en su unión a TRAIL R2 de cyno.
F4mod12 se volvió a formatear en una construcción en tándem 6 (SEQ ID NO: 167) y en tándem 8 (SEQ ID NO: 166) y se probó para confirmar que no hay pérdida de potencia en relación con Tándem 6 de G6 (SEQ ID NO: 144) y en tándem 8 (s Eq ID NO: 145). La Figura 23C y la Figura 23D no muestra pérdida de potencia para los tándems F4mod12 de reacción cruzada mejorados diseñados por la estirpe germinal en comparación con los tándems G6 en la estirpe celular Colo205.
Ejemplo 19
Actividad del tándem 8 de G6 en estirpes celulares resistentes a TRAIL
Múltiples estirpes celulares son resistentes a la destrucción por TRAIL. Por lo tanto, evaluamos si la potencia mejorada de las construcciones tándem 8 de G6 en relación con TRAIL en estirpes celulares sensibles a TRAIL se traducirá en la potencia de tándem 8 de G6 en estirpes celulares resistentes a TRAIL. La sensibilidad a Apo2L/TRAIL en varias estirpes celulares de cáncer se determinó con el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI). En resumen, las células se sembraron en placas de 96 pozos, se dejaron adherir durante la noche y luego se trataron con diversas concentraciones de Apo2L/TRAIL humano recombinante y mimético Tándem 8 de G6 TRAIL en medio que contenía FBS al 10%. Después de un período de 48-72 h, la viabilidad celular se determinó siguiendo los protocolos del fabricante. La Figura 24 muestra que para la estirpe celular resistente a TRAIL HT29 tándem 8 de G6 muestra una potente actividad de destrucción celular mientras que TRAIL no. La TABLA 21 muestra que el tándem 8 de G6 tiene actividad de destrucción celular en muchas, pero no en todas las estirpes celulares resistentes a TRAIL probadas. La potencia mejorada puede deberse a la mayor valencia del tándem en relación con TRAIL, aunque la orientación espacial de los módulos de unión también puede tener un efecto.
TABLA 21: Actividad de tándem 8 de G6 y TRAIL en estirpes celulares resistentes a TRAIL
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
Ejemplo 20
Estudio de inmunogenicidad de monómeros de unión a TRAIL R2
La inmunogenicidad es un problema potencial para cualquier proteína terapéutica, incluso si es de origen humano. Las respuestas inmunogénicas pueden limitar la eficacia a través de anticuerpos neutralizantes que pueden provocar inflamación. Uno de los factores más importantes en el desarrollo de una respuesta inmune es la presencia de epítopos que pueden estimular la proliferación de células T CD4+ En la prueba EpiScreen (Antitope, Cambridge, Reino Unido), las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de células T CD8+ agotadas se incuban con proteínas de prueba y se monitoriza la proliferación de células T CD4+ y la secreción de IL-2 (véase, Baker & Jones, Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 10:219-227, 2007; Jaber & Baker, J. Pharma. Biomed. Anal. 43:1256-1261, 2007; Jones et al., J. Thrombosis and Haemostasis 3:991-1000, 2005; Jones et al., J. Interferon Cytokine Res. 24:560-72, 2004). Los PBMC se aíslan de un grupo de donantes que representan los alotipos HLA-DR expresados en la población mundial.
Los monómeros Tn3 mostrados en la Figura 25 fueron expresados (con una etiqueta de ligador GGGGHHHHHHHH-His), purificado y verificado como monomérico por SEC, y filtrado para la eliminación de endotoxinas como se describió anteriormente. Todos los clones de tipo no silvestre probados fueron de la ronda de ingeniería para mejorar la reactividad cruzada de cyno (Figura 22A). Sin embargo, estos clones tenían mutaciones en la estirpe germinal que se ha mostrado que no afectan la unión en el fondo F4mod1. Estos clones se probaron en un ELISA para verificar que las mutaciones de germinación no afectaron la unión. Tanto en el ensayo de proliferación de células T como en el ensayo de secreción de IL-2, se había establecido previamente un índice de estimulación (SI) de más de dos como respuesta positiva para un donante dado. El SI medio, o promedio del SI de la población que responde positivamente, es indicativo de la fuerza de la respuesta. En ambos ensayos se incluyó una proteína de control que se sabe que induce una fuerte respuesta, la hemocianina de lapa californiana (KLH).
La TABLA 22 muestra el SI medio para todas las proteínas de prueba, que son significativamente más bajas que para KLH y no fueron mucho más altas que el límite de 2 para un SI medio positivo. Adicionalmente, la frecuencia de respuesta para las proteínas de prueba fue muy baja (diez por ciento o menos para todas las proteínas analizadas, excepto para el control que tuvo una respuesta superior al 90%). Estudios previos realizados por Antitope han revelado que una respuesta EpiScreen de menos del 10% es indicativa de un bajo riesgo de inmunogenicidad clínica. Por lo tanto, nuestra observación de que todos los Tn3 probados tienen una frecuencia de respuesta del 10% o menos indica un bajo riesgo de inmunogenicidad clínica.
TABLA 22: Resultados del ensayo de inmunogenicidad Antitope EpiScreen. Los Tn3 probados se clasifican de 1 más inmunogénico) a 4 (menos inmunogénico).
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Ejemplo 21
Estado de agregación de Tn3 de tándem 8 de G6 no purificado y purificado
Se sabe en la técnica que las proteínas que contienen múltiples cisteínas, por ejemplo, una proteína compuesta de repeticiones en tándem que contiene un enlace disulfuro interno, a menudo no exhiben un emparejamiento disulfuro adecuado. La mezcla de disulfuros puede reducir o eliminar la expresión en los medios. Si la proteína se expresa en los medios, puede ser una mezcla de proteína plegada de manera inadecuada con pares de disulfuro intermoleculares e intramoleculares mal emparejados que conducen a la agregación. Nuestros datos de la SEC revelaron que la mayoría de las proteínas en tándem en los medios de expresión bacterianos estaban en un estado monomérico, debidamente plegado. Después de la purificación con Ni-NTA de la proteína en tándem 8 de G6 marcada con H, se agregó aproximadamente el 15% de la proteína. La agregación observada se redujo al 4% (Figura 26A) mediante reducción con DTT 2 mM, lo que indica que la mayor parte de la agregación estaba mediada por disulfuro. La mayoría de los agregados se eliminaron por purificación SEC (Figura 26B), como se describió anteriormente.
Ejemplo 22
Determinación de miméticos TRAIL, G6TN6 y G6TN8, inhibición del crecimiento tumoral de modelos de xenoinjerto de cáncer colorrectal Colo205
La actividad antitumoral de los miméticos TRAIL Tn3, tándem 6 de G6 (G6TN6) (SEQ ID NO: 144) y tándem 8 de G6 (G6TN8) (SEQ ID NO: 145), se evaluaron en Colo205, un modelo de xenoinjerto de carcinoma colorrectal humano. Las células Colo205 se mantuvieron como un cultivo monocapa semiadhesivo a 37°C bajo 5% de CO2 en medio Oswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contenía 10% de suero fetal bovino (FBS). Las células cosechadas por tripsinización se resuspendieron a una concentración final de 3x107 células/ml en solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Se inyectaron ratones desnudos hembra atímicos cada uno por vía subcutánea (SC) en el flanco derecho con 3 x 106 células Colo205. El estudio se inició cuando los tumores alcanzaron un promedio de ~177 mm. El diseño del estudio se resume en la TABLA 23. TRAIL se diluyó de la solución madre con Tris-HCl 20 mM Arginina-HCl 300 mM PH 7 y se administró por vía intravenosa (IV) a la dosis indicada en la TABLA 23, diariamente para un total de 5 dosis de acuerdo con el peso corporal (10 mL/kg). El tándem 6 de G6 (G6TN6) y tándem 8 de G6 (G6TN8) se diluyeron cada uno de una solución madre con PBS y se administraron por vía intravenosa (IV) a las dosis indicadas en la TABLA 23, diariamente para un total de 5 dosis de acuerdo con el peso corporal (10 mL/kg). Se registraron los volúmenes tumorales y las medidas de peso corporal. Las mediciones del tumor se realizaron con un calibrador electrónico y el volumen del tumor (mm3) se calculó con la fórmula volumen del tumor = [longitud (mm) X ancho (mm)2]/2. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó como porcentaje de TGI = (1 - T/C) x 100, en el que T = volúmenes tumorales finales de un grupo tratado después de la última dosis, y C = volúmenes tumorales finales del grupo control después de la última dosis.
Durante la fase de dosificación (DP) (Figura 27), 3 mg/kg y 30 mg/kg de G6TN6 dieron como resultado un TGI significativo del 92% (<0.0001) y 93% (<0.0001), respectivamente (TABLA 24). De manera similar, después del ajuste equimolar para la concentración final, 2.25 mg/kg y 25.5 mg/kg de G6TN8 resultaron en un TGI significativo de 93% (<0.0001) y 94% (p <0.0001), respectivamente (TABLA 24). 30 mg/kg de TRAIL dieron como resultado un TGI del 60% (<0.001), (TABLA 24).
Para el día 34 de la fase de recrecimiento (RP) (Figura 27), mientras que 3 mg/kg de G6TN6 no produjo ningún CR (CR; porcentaje de ratones en el grupo donde no se detectó tumor palpable para dos mediciones sucesivas), 2.25 mg/kg G6TN8 dio como resultado una RC del 90%. Con una dosis más alta de 30 mg/kg de G6TN6, se logró un CR del 50%. Por otro lado, 25.5 mg kg G6TN8 resultaron en 100% CR (TABLA 25). Los resultados de ambas dosis sugieren que G6TN8 resultó en una mayor eficacia en comparación con G6TN6. Sin embargo, tanto G6TN6 como G6TN8 mostraron eficacia a ciertas dosis. Más importante aún, ambas construcciones superaron significativamente TRAIL que no resultó en ningún PR o CR.
Como se muestra en la Figura 28, no se observó pérdida de peso corporal tanto para G6TN6 como para G6TN8 en todas las dosis durante la fase de dosificación y recrecimiento del estudio.
TABLA 23. Diseño del estudio para TRAIL y miméticos TRAIL (G6TN6 y G6TN8) en el modelo de xenoinjerto tumoral Colo205
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un andamio multimérico recombinante específico de TRAIL R2 que comprende seis andamios de monómero de Tn3 específico de TRAIL R2, en el que
(a) cada andamio de monómero de Tn3 comprende siete hebras beta designadas A, B, C, D, E, F, y G, ligadas a seis regiones de bucles designadas AB, BC, CD, DE, EF, y FG, en las que el bucle AB consiste de la SEQ ID NO: 35, el bucle BC consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 97, 98, y 168, el bucle CD consiste de la SEQ ID NO: 37, el bucle DE consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 102, 103, y 179, el bucle EF consiste de la SEQ ID NO: 39, y el bucle FG consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 106, 108, 109, 169, y 170, en el que la hebra A beta consiste de IEV, la hebra B beta consiste de ALITW, la hebra C beta consiste de CELX1YGI, la hebra D beta consiste de TTIX2L, la hebra E beta consiste de YSI, la hebra F beta consiste de YEVSLIC, y la hebra G beta consiste de KX3TFTT, en la que X1 representa el residuo de aminoácidos A o T, en el que X2 representa el residuo de aminoácidos D o G, y en el que X3 representa el residuo de aminoácidos E o G;
(b) los andamios de monómero de Tn3 se conectan en un formato tándem lineal; y
(c) en el que el andamio de monómero de Tn3 comprende al menos un enlace de disulfuro intramolecular de origen no natural, en el que el enlace estabiliza el andamio de monómero.
2. El andamio multimérico de la reivindicación 1, en el que el andamio multimérico comprende 7 o 8 andamios de monómero de Tn3 específico de TRAIL R2.
3. El andamio multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos dos andamios de monómero de Tn3 se conectan por un ligador.
4. El andamio multimérico de la reivindicación 3, en el que el ligador comprende un ligador de péptido.
5. El andamio multimérico de la reivindicación 4, en el que el ligador de péptido comprende una secuencia (GxS)y en la que:
x e y son enteros;
x = 1, 2, 3 o 4;
en la que y = 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7; y
opcionalmente x = 4 y y = 1.
6. El andamio multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el andamio se conjuga a PEG en el N terminal o C terminal.
7. El andamio multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el bucle BC consiste de la SEQ ID NO: 97, el bucle DE consiste de la SEQ ID NO: 179, y el bucle FG consiste de la SEQ ID NO: 170.
8. El andamio multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el andamio comprende las SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, o SEQ ID NO: 167.
9. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el andamio multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
10. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9.
11. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 10.
12. Un método para producir un andamio multimérico recombinante que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 11 bajo condiciones en las que se expresa el andamio multimérico codificado por la molécula de ácido nucleico.
13. Una composición que comprende el andamio multimérico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Uso de la composición de la reivindicación 13 en la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar, o aliviar cáncer en un paciente en necesidad del mismo.
15. La composición de la reivindicación 13 para uso en prevenir, tratar, o aliviar cáncer en un paciente en necesidad del mismo en la que la composición se administra en una cantidad efectiva.
16. El uso de la reivindicación 14, o la composición para uso de la reivindicación 15, en el que dicho cáncer se selecciona de cáncer de pulmón, linfoma no- Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer de colón, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, y mieloma múltiple.
17. El uso de la reivindicación 14 o 16, o la composición para uso de la reivindicación 15 o 16, en el que prevenir, tratar, aliviar, o manejar cáncer, comprende adicionalmente una terapia adicional, en la que dicha terapia es inmunoterapia, terapia biológica, quimioterapia, terapia de radiación, o terapia de fármaco de molécula pequeña.
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Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1711196A4 (en) 2003-12-05 2011-09-14 Bristol Myers Squibb Co INHIBITORS OF TYPE-2 VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR RECEPTORS
MX2009005466A (es) 2006-11-22 2009-08-17 Adnexus A Bristol Myers Sqibb Terapeuticos dirigidos a base de proteinas manipuladas para receptores de tirosina cinasas, incluyendo receptor de factor de crecimiento tipo insulina-i.
AU2009213141A1 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind EGFR
WO2009142773A2 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Multivalent fibronectin based scaffold domain proteins
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
WO2011130324A1 (en) * 2010-04-13 2011-10-20 Medimmune, Llc Fibronectin type iii domain-based multimeric scaffolds
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
JP6023703B2 (ja) 2010-05-26 2016-11-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 改善された安定性を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質
EP3415528B1 (en) 2011-04-13 2021-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements
EP2710382B1 (en) 2011-05-17 2017-10-18 Bristol-Myers Squibb Company Improved methods for the selection of binding proteins
EP2709669A1 (en) 2011-05-17 2014-03-26 Bristol-Myers Squibb Company Methods for maintaining pegylation of polypeptides
EP3753567A1 (en) 2011-10-11 2020-12-23 Viela Bio, Inc. Cd40l-specific tn3-derived scaffolds and methods of use thereof
JP2015504038A (ja) 2011-10-31 2015-02-05 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 低減した免疫原性を有するフィブロネクチン結合ドメイン
US9580509B2 (en) 2011-11-07 2017-02-28 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
WO2013070076A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 Umc Utrecht Holding B.V. Fusion protein comprising an interleukin 4 and interleukin
ES2984405T3 (es) 2012-09-13 2024-10-29 Bristol Myers Squibb Co Proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina que se unen a la miostatina
US9695228B2 (en) 2012-11-21 2017-07-04 Janssen Biotech, Inc. EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules
EP2951206A2 (en) * 2013-02-01 2015-12-09 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold proteins
EP2953968B1 (en) 2013-02-06 2018-07-25 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin type iii domain proteins with enhanced solubility
US10065987B2 (en) 2013-02-12 2018-09-04 Bristol-Myers Squibb Company High pH protein refolding methods
WO2014126871A1 (en) 2013-02-12 2014-08-21 Bristol-Myers Squibb Company Tangential flow filtration based protein refolding methods
EP2968587A2 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or a moiety binding thereto
WO2014159562A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of dr5 agonist and anti-pd-1 antagonist and methods of use
US10392611B2 (en) 2013-05-30 2019-08-27 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
US10364451B2 (en) 2013-05-30 2019-07-30 Duke University Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same
BR112016008125B1 (pt) * 2013-10-14 2023-11-21 Janssen Biotech, Inc. Domínio proteico isolado de fibronectina tipo iii modificado com cisteína, seu método de produção e método para produzir uma molécula isolada de de fibronectina tipo iii biespecífica modificada com cisteína
WO2015138638A1 (en) 2014-03-11 2015-09-17 Theraly Pharmaceuticals, Inc. Long acting trail receptor agonists for treatment of autoimmune diseases
CA2943228C (en) 2014-03-20 2023-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Stabilized fibronectin based scaffold molecules
ES2736127T3 (es) 2014-03-20 2019-12-26 Bristol Myers Squibb Co Dominios de tipo III de fibronectina de unión a seroalbúmina
WO2015148269A2 (en) * 2014-03-24 2015-10-01 Medimmune, Llc Stabilized tnfn3 scaffold proteins
NO2776305T3 (es) * 2014-04-23 2018-01-27
JP6655074B2 (ja) * 2014-06-20 2020-02-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド シャガシンに基づく足場組成物、方法及び使用
RU2715905C2 (ru) 2014-10-01 2020-03-04 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Способ конъюгации полипептида
CN107207379B (zh) 2014-11-25 2021-08-10 百时美施贵宝公司 用于生物制品的18f-放射性标记的方法和组合物
AU2016228806B2 (en) 2015-03-12 2020-10-22 Medimmune, Llc Method of purifying albumin-fusion proteins
US10385115B2 (en) 2015-03-26 2019-08-20 Duke University Fibronectin type III domain-based fusion proteins
EP3291836A4 (en) 2015-05-06 2018-11-14 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (psma) bispecific binding agents and uses thereof
EA037478B1 (ru) 2015-08-04 2021-04-01 Дьюк Юниверсити Генетически кодируемые внутренне неупорядоченные полимеры-"невидимки" для доставки и способы их применения
US11124791B2 (en) 2015-09-14 2021-09-21 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Generating recombinant affinity reagents with arrayed targets
CN108884147B (zh) 2015-09-23 2024-02-27 百时美施贵宝公司 结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基于纤连蛋白的支架分子
CN108290941A (zh) 2015-09-23 2018-07-17 百时美施贵宝公司 快解离速率的血清白蛋白结合性纤连蛋白iii型结构域
KR20180100302A (ko) * 2015-10-23 2018-09-10 우니베르지태트 트벤테 인테그린 결합 펩티드 및 그의 용도
US11007251B2 (en) 2015-12-17 2021-05-18 The Johns Hopkins University Ameliorating systemic sclerosis with death receptor agonists
US11752213B2 (en) 2015-12-21 2023-09-12 Duke University Surfaces having reduced non-specific binding and antigenicity
EA201892260A1 (ru) 2016-04-07 2019-03-29 Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити Композиции и способы для лечения панкреатита и боли с применением агонистов рецептора смерти
AR108377A1 (es) 2016-05-06 2018-08-15 Medimmune Llc Proteínas de unión biespecíficas y sus usos
CN105802970A (zh) * 2016-05-30 2016-07-27 东北师范大学 靶向沉默Gβ1的shRNA
US10994033B2 (en) 2016-06-01 2021-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18F-radiolabeled biologics
WO2017210476A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Duke University Nonfouling biosensors
MA45412A (fr) 2016-06-21 2021-05-26 Janssen Biotech Inc Molécules de liaison au domaine de fibronectine de type iii modifiées par la cystéine
WO2018053201A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Duke University Triblock polypeptide-based nanoparticles for the delivery of hydrophilic drugs
JP2020500150A (ja) 2016-09-23 2020-01-09 デューク ユニバーシティ 下限臨界溶液温度挙動を有する非反復かつ非構造的ポリペプチド
EP3554535A4 (en) 2016-12-14 2020-10-21 Janssen Biotech, Inc. PD-L1 BINDING FIBRONECTIN TYPE III DOMAINS
CN110225770B (zh) 2016-12-14 2022-04-26 杨森生物科技公司 结合cd8a的纤连蛋白iii型结构域
EP3554561B1 (en) 2016-12-14 2023-06-28 Janssen Biotech, Inc. Cd137 binding fibronectin type iii domains
WO2018132732A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Duke University Genetically encoded lipid-polypeptide hybrid biomaterials that exhibit temperature triggered hierarchical self-assembly
US10787499B2 (en) * 2017-02-13 2020-09-29 Regents Of The University Of Minnesota EpCAM targeted polypeptides, conjugates thereof, and methods of use thereof
WO2018213320A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Duke University Recombinant production of hybrid lipid-biopolymer materials that self-assemble and encapsulate agents
AR111963A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Univ California Método y moléculas
WO2019006374A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Duke University ORDER AND DISORDER AS A DESIGN PRINCIPLE FOR STIMULI-SENSITIVE BIOPOLYMER NETWORKS
WO2019147954A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Duke University Albumin binding peptide-drug (aibiped) conjugates and methods of making and using same
US11491206B1 (en) 2018-02-13 2022-11-08 Duke University Compositions and methods for the treatment of trail-resistant cancer
US11680091B2 (en) 2018-02-23 2023-06-20 The University Of Chicago Methods and composition involving thermophilic fibronectin type III (FN3) monobodies
EP3788343B1 (en) 2018-04-30 2024-03-27 Duke University Stimuli-responsive peg-like polymer-based drug delivery platform
KR102870868B1 (ko) 2018-06-01 2025-10-15 노파르티스 아게 Bcma에 대한 결합 분자 및 이의 용도
CN110724198B (zh) * 2018-07-17 2023-05-26 上海一宸医药科技有限公司 长效纤连蛋白iii型结构域融合蛋白
US11649275B2 (en) 2018-08-02 2023-05-16 Duke University Dual agonist fusion proteins
US12594347B2 (en) 2018-09-07 2026-04-07 Duke University Nanoparticulate drug delivery systems
EP3715376A1 (en) 2019-03-23 2020-09-30 Ablevia biotech GmbH Compound for the prevention or treatment of myasthenia gravis
US11986536B2 (en) 2019-03-23 2024-05-21 Ablevia Biotech Gmbh Compound for the sequestration of undesirable antibodies in a patient
EP3715374A1 (en) 2019-03-23 2020-09-30 Ablevia biotech GmbH Compound for the sequestration of undesirable antibodies in a patient
WO2020212598A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Synerkine Pharma B.V. A fusion protein comprising il13
US12037378B2 (en) 2019-05-21 2024-07-16 Novartis Ag Variant CD58 domains and uses thereof
JP7489407B2 (ja) 2019-05-21 2024-05-23 ノバルティス アーゲー Ｃｄ１９結合分子及びその使用
CN118994397A (zh) 2019-05-21 2024-11-22 诺华股份有限公司 针对bcma的三特异性结合分子及其用途
US11512314B2 (en) 2019-07-12 2022-11-29 Duke University Amphiphilic polynucleotides
WO2021009692A1 (en) 2019-07-15 2021-01-21 Medimmune Limited Tripartite systems for protein dimerization and methods of use
US11781138B2 (en) 2019-10-14 2023-10-10 Aro Biotherapeutics Company FN3 domain-siRNA conjugates and uses thereof
CN119119240A (zh) 2019-10-14 2024-12-13 Aro生物疗法公司 结合cd71的纤维粘连蛋白iii型结构域
WO2021076543A1 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Epcam binding fibronectin type iii domains
CN111217903B (zh) * 2020-02-25 2022-11-15 芜湖天明生物技术有限公司 一种重组人纤连蛋白ⅲ1-c及其制备方法和应用
WO2021174045A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Radiolabeled fibronectin based scaffolds and antibodies and theranostic uses thereof
US20230128499A1 (en) 2020-03-27 2023-04-27 Novartis Ag Bispecific combination therapy for treating proliferative diseases and autoimmune diseases
US11767353B2 (en) 2020-06-05 2023-09-26 Theraly Fibrosis, Inc. Trail compositions with reduced immunogenicity
CN111944204B (zh) * 2020-07-24 2022-03-08 南京理工大学 一种Fe3O4磁性细菌纤维素及其制备方法
CA3192744A1 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Oskar SMRZKA Compound for the sequestration of undesirable anti-peg antibodies in a patient
EP4216990A1 (en) 2020-09-23 2023-08-02 Ablevia biotech GmbH Compound for the sequestration of undesirable antibodies in a patient
EP4217402A1 (en) 2020-09-23 2023-08-02 Ablevia biotech GmbH Compound for the prevention or treatment of autoantibody-mediated conditions
CN116669755A (zh) 2020-09-23 2023-08-29 艾柏力维亚生技有限公司 用于增加因子viii替代疗法的效力的化合物
CN116547008A (zh) 2020-09-23 2023-08-04 艾柏力维亚生技有限公司 用于增加病毒载体的效力的化合物
US20230381328A1 (en) 2020-09-24 2023-11-30 Ablevia Biotech Gmbh Compound for the prevention or treatment of myasthenia gravis
IL302412A (en) 2020-11-06 2023-06-01 Novartis Ag Anti-CD19 and B-cell targeting agent combination therapy for the treatment of B-cell malignancies
CA3199095A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
EP4323008A4 (en) 2021-04-14 2026-02-25 Aro Biotherapeutics Company FN3-ARNSI DOMAIN CONJUGATES AND THEIR USES
CA3214552A1 (en) 2021-04-14 2022-10-20 Russell C. Addis Cd71 binding fibronectin type iii domains
US20250213707A1 (en) 2022-03-24 2025-07-03 Ablevia Biotech Gmbh Compound for increasing efficacy of oncolytic viruses
KR102459313B1 (ko) * 2022-04-11 2022-10-26 주식회사 대영방재산업 내구성이 개선된 소방용 수격 흡수기
WO2024261323A1 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Astrazeneca Ab Molecular switches
WO2025125630A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Medimmune Limited Method for bioprotac design

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10505750A (ja) 1994-09-16 1998-06-09 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 粘着および軸索の成長を刺激するサイトタクチン誘導体並びにその製造および使用方法
EP1958962A3 (en) 1997-06-12 2013-05-01 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
AU731758B2 (en) 1998-07-08 2001-04-05 Mitsui Chemicals, Inc. Method for secretory production of human growth hormone
US6624295B1 (en) * 1998-08-28 2003-09-23 Genentech, Inc. Human anti-factor IX/IXa antibodies
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
DK1137941T4 (da) 1998-12-10 2014-01-06 Brystol Myers Squibb Company Protein-scaffolds til antistof-mimetika og andre bindingsproteiner
AU2001277867B2 (en) 2000-07-11 2006-12-07 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
EP2141243A3 (en) 2000-10-16 2010-01-27 Brystol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
DK1495128T3 (da) 2002-03-29 2014-08-11 Genencor Int Forstærket proteinekspression i Bacillus
WO2003104418A2 (en) 2002-06-06 2003-12-18 Research Corporation Technologies, Inc. Reconstituted polypeptides
EP2500032A1 (en) 2002-06-24 2012-09-19 Genentech, Inc. APO-2 ligand/trail variants and uses thereof
EP1711196A4 (en) 2003-12-05 2011-09-14 Bristol Myers Squibb Co INHIBITORS OF TYPE-2 VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR RECEPTORS
WO2005056605A1 (ja) 2003-12-12 2005-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
GB0416651D0 (en) 2004-07-26 2004-08-25 Proteo Target Aps Polypeptide
UA97096C2 (ru) * 2005-08-31 2012-01-10 Емджен Інк. Выделенное антитело, которое специфически связывает рецептор-2 trail (tr-2)
US10183986B2 (en) 2005-12-15 2019-01-22 Industrial Technology Research Institute Trimeric collagen scaffold antibodies
JP2009526970A (ja) * 2006-02-13 2009-07-23 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 生物学的試料または化学的試料の処理方法
CN101074261A (zh) * 2006-04-30 2007-11-21 北京同为时代生物技术有限公司 Trail受体1和/或trail受体2特异性抗体及其应用
WO2008031098A1 (en) 2006-09-09 2008-03-13 The University Of Chicago Binary amino acid libraries for fibronectin type iii polypeptide monobodies
MX2009005466A (es) 2006-11-22 2009-08-17 Adnexus A Bristol Myers Sqibb Terapeuticos dirigidos a base de proteinas manipuladas para receptores de tirosina cinasas, incluyendo receptor de factor de crecimiento tipo insulina-i.
US8470966B2 (en) 2007-08-10 2013-06-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
WO2009023184A2 (en) 2007-08-10 2009-02-19 Protelix, Inc. Universal fibronectin type iii binding-domain libraries
US8633297B2 (en) * 2007-10-31 2014-01-21 Medimmune, Llc Protein scaffolds
WO2009083804A2 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Novartis Ag Improved fibronectin-based binding molecules and their use
EA201001734A1 (ru) 2008-05-02 2011-10-31 Новартис Аг Улучшенные связывающие молекулы на основе фибронектина и их применение
WO2009142773A2 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Multivalent fibronectin based scaffold domain proteins
JP2012504969A (ja) * 2008-10-10 2012-03-01 アナフォア インコーポレイテッド Ｔｒａｉｌ−ｒ１及びｔｒａｉｌ−ｒ２に結合するポリペプチド
ES2705714T3 (es) 2008-10-31 2019-03-26 Janssen Biotech Inc Métodos y usos de dominio de Fibronectina tipo III basado en estructuras de composiciones
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
BRPI1008532B1 (pt) 2009-02-12 2021-12-14 Janssen Biotech, Inc Arcabouço de proteína isolada, método para construção de uma biblioteca de arcabouço de proteína isolada, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de ácido nucleico isolado, célula hospedeira de bactéria ou fungo, composição, dispositivo médico e artigo de manufatura para uso farmacêutico ou de diagnóstico em seres humanos
WO2011020033A2 (en) 2009-08-13 2011-02-17 Massachusetts Institute Of Technology Engineered proteins including mutant fibronectin domains
WO2011130324A1 (en) * 2010-04-13 2011-10-20 Medimmune, Llc Fibronectin type iii domain-based multimeric scaffolds

Also Published As

Publication number Publication date
EP2558495A1 (en) 2013-02-20
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US9212231B2 (en) 2015-12-15
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AU2011240620A1 (en) 2012-10-18
RU2628699C2 (ru) 2017-08-21
JP2013523179A (ja) 2013-06-17
CN102906112A (zh) 2013-01-30
EP2560684A1 (en) 2013-02-27
BR112012026003A2 (pt) 2020-09-01
CA2796010A1 (en) 2011-10-20
BR112012026003B1 (pt) 2022-03-15

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