BRPI0609675A2 - método para produzir uma proteìna - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEìNA. Cultivando-se uma bactéria que assimile metanol tendo uma construção de DNA contendo uma seqúência promotora que funcione na bactéria que assimila metanol e uma seqúência de nucleotídeo que codifique um polipeptídeo contendo uma seqúência de sinal e uma seqúéncia de proteína objeto, que são conectadas à seqúéncia promotora tal que possam ser expressadas, em um meio líquido contendo metanol como uma fonte principal de carbono, a bactéria é deixada para secretar a proteína objeto e a proteína objeto secretada é recuperada.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA"

Campo Técnico

A presente invenção diz respeito a um método de produção secretora de uma proteína que inclui uma enzima industrialmente útil ou uma proteína biologicamente ativa pelo uso de uma bactéria que assimile metanol.

Técnica Fundamental

Metanol é um material fermentativo que é disponível em uma quantidade grande a um custo baixo e é extremamente útil como uma fonte de carbono. Foi desenvolvido um método para produzir um L-aminoácido por uma bactéria que assimile metanol usando metanol como uma fonte principal de carbono (Documento de Patente 1) e um método para produzir um polissacarídeo usando uma bactéria que assimile metanol (Documento de Patente 2).

Também, até agora foi conhecido um exemplo de produção de IacZ em células bacterianas usando um promotor de um gene da álcool oxidase (AOX) pela indução com metanol em levedura Pichia (Documento Que Não de Patente 1) e um exemplo de secreção de aprotinina (inibidor da tripsina pancreática derivada de bovino) em um sobrenadante de cultura como um tipo ativo (Documento Que Não de Patente 2).

Além disso, é conhecido um exemplo de acúmulo de uma proteína fluorescente (GFP) em uma célula de uma bactéria não forçada que assimila metanol, Metilobacterium extorquens, que é uma das bactérias que assimilam metanol (Documento de Patente 3 e Documento Que Não de Patente 3). Entretanto, não foi conhecido um exemplo de secreção de uma proteína fora das células de uma bactéria que assimila metanol forçada.

Documento de Patente 1: EP 1.188.822 Documento de Patente 2: JP 11-56384 A Documento de Patente 3: WO 2003/046226 Al Documento Que Não de Patente 1: Nucleic Acids Res. 11 de maio de 1987; 15(9): 3859-76.

Documento Que Não de Patente 2: J Ind Microbiol. Abril de 1991; 7(3): 197-201.

Documento Que Não de Patente 3: FEMS Microbiol Lett. 15 de dezembro de 2000; 193(2): 195-200

Divulgação da Invenção

E um objetivo da presente invenção fornecer um método de produção secretora eficiente de uma proteína que é difícil de ser produzida por meios secretores pelo uso de uma bactéria Escherichia coli ou semelhante.

Os inventores da presente invenção prestaram uma atenção a um promotor e seqüências de sinal derivadas de uma bactéria que assimila metanol e fizeram estudos extensivos. Como um resultado, eles descobriram que a produção secretora de uma proteína pode ser eficientemente realizada cultivando-se uma bactéria que assimila metanol tendo uma construção de DNA contendo uma seqüência promotora que funcione na bactéria que assimila metanol e uma seqüência de nucleotídeo que codifique uma seqüência de sinal e uma proteína alvo em um meio líquido contendo metanol como uma fonte principal de carbono, assim realizaram a presente invenção.

Isto é, a presente invenção é como segue.

(1) Um método para produzir uma proteína, que compreende cultivar uma bactéria que assimila metanol tendo uma construção de DNA que contenha uma seqüência promotora que funcione na bactéria que assimila metanol e uma seqüência de nucleotídeo que codifique um polipeptídeo contendo uma seqüência de sinal e uma seqüência da proteína alvo que está operavelmente conectada à seqüência promotora, em um meio líquido contendo metanol como uma fonte principal de carbono para permitir que a bactéria secrete a proteína alvo e recuperar a proteína alvo secretada.

(2) O método de acordo com (1), em que a seqüência promotora que funciona na bactéria que assimila metanol é selecionada do grupo que consiste de um promotor da metanol desidrogenase, um promotor tac, um promotor σΕ e um promotor de proteína ribossômica.

(3) O método de acordo com (1), em que a seqüência promotora é uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 11, 12, 21, ou 22.

(4) O método de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que a seqüência de sinal é uma seqüência de sinal de uma proteína selecionada da metanol desidrogenase, fitase e fosfatase ácida.

(5) O método de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que a seqüência de sinal tem uma seqüência de aminoácido selecionada da SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20.

(6) O método de acordo com qualquer um de (1) a (5), em que a bactéria que assimila metanol é uma bactéria selecionada do grupo que consiste de bactérias pertencentes aos gêneros Metilophilus, Metilobacillus,

Metilophaga, Achromobacter, Pseudomonas, Protaminobaeter, Methanomonas, Microeyelus e Metilobaeterium.

(7) O método de acordo com qualquer um de (1) a (6), em que a proteína é selecionada do grupo que consiste de fitase, interleucina, transglutaminase, interferon, insulina, fosfatase ácida e peptídeo sintase.

(8) O método de acordo com qualquer um de (1) a (7), em que a bactéria que assimila metanol é uma bactéria que assimila metanol forçada.

(9) O método de acordo com (8), em que a bactéria que assimila metanol forçada é selecionada do grupo que consiste de bactérias pertencentes aos gêneros Metilophilus, Metilobacillus e Metilophaga.

Descrição das Formas de Realização Preferidas

O método de produção da presente invenção compreende cultivar uma bactéria que assimila metanol tendo uma construção de DNA contendo uma seqüência promotora que funciona na bactéria que assimila metanol e uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo contendo uma seqüência de sinal e uma seqüência da proteína alvo que está operavelmente conectada à seqüência promotora, em um meio líquido contendo metanol como uma fonte principal de carbono para permitir que a bactéria secrete a proteína alvo; e recuperar a proteína alvo secretada. Aqui, o termo "secretar" refere-se à excreção ou liberação de uma proteína alvo fora das células bacterianas e não abrange o acúmulo da proteína alvo dentro das células.

Isto é, a bactéria que assimila metanol produz um polipeptídeo contendo uma seqüência de sinal e uma proteína alvo e depois a proteína alvo é transferida a um periplasmo pela clivagem da seqüência de sinal, sendo deste modo secretada fora das células bacterianas. A proteína secretada é recuperada para se obter a produção da proteína alvo. Depois disso, a produção de uma proteína permitindo-se que uma bactéria secrete a proteína e recuperar a proteína é aludido como "produção secretora de uma proteína".

É no geral conhecido que uma proteína secretora é traduzida como um prepeptídeo ou um prepropeptídeo e é convertida em uma proteína madura. Isto é, é no geral conhecido que uma proteína secretora é traduzida como um prepeptídeo ou um prepropeptídeo e é convertida em um peptídeo maduro ou um propeptídeo pela clivagem da porção pré e o propeptídeo é ainda convertido em uma proteína madura pela clivagem da porção pro com uma protease. Uma tal protease que cliva um peptídeo de sinal é no geral aludido como peptidase de sinal.

Na presente invenção, a proteína alvo pode ser secretada como uma proteína madura ou um propeptídeo e no caso onde a proteína alvo é secretada como um propeptídeo, o propeptídeo pode ser convertido em uma proteína madura tratando-se o propeptídeo com uma protease apropriada depois recuperação.

Nesta descrição, o termo "seqüência de sinal" refere-se a uma seqüência que esteja presente no terminal N de um tipo precursor de uma proteína secretora e é reconhecido quando a proteína é secretada e o termo "peptídeo de sinal" refere-se a um peptídeo que consiste dos resíduos de aminoácido.

Nesta descrição, uma proteína tendo tanto uma pré-seqüência e uma porção pro, isto é, um produto traduzido primário pode ser aludido como "preproproteína", enquanto que uma proteína que não tem nenhuma pré- seqüência e tendo uma porção pro pode ser aludida como "proproteína". A porção pro de uma proproteína pode ser aludida como "porção pro-estrutura" ou simplesmente como "pro-estrutura" e nesta descrição, o termo "porção pro-estrutura/pro-estrutura" de uma proteína é usado intercambiavelmente com o termo "porção pro" de uma proteína.

Uma bactéria a ser usada no método de produção da presente invenção pode ser obtido pela introdução de uma construção de DNA contendo uma seqüência promotora que funciona em uma bactéria que assimila metanol e uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo contendo uma seqüência de sinal e uma seqüência da proteína alvo que está operavelmente conectada à seqüência promotora, em uma bactéria que assimila metanol.

Aqui, o termo "bactéria que assimila metanol" refere-se a uma bactéria que pode crescer em um meio contendo metanol como uma fonte de carbono principal e seus exemplos incluem bactérias pertencentes aos gêneros Metilophilus, Metilobacillus, Metilophaga, Achromobacter, Pseudomonas (JP 45-25273 A), Protaminobacter (JP 49-125590 B), Metanomonas (JP 50-25790 A), Microcyclus (JP 52-18886 A) e Metilobactéria. Entre estas, preferível é uma bactéria que assimila metanol forçada que não pode crescer ou pode crescer levemente em um meio contendo glicose como uma única fonte de carbono. Os exemplos específicos de uma tal bactéria que pode crescer em um meio contendo metanol como uma fonte de carbono mas não pode crescer ou pode crescer levemente em um meio contendo glicose como uma única fonte de carbono incluem bactérias Metilophilus, bactérias Metilobacillus e bactérias Metilophaga. Um exemplo da bactéria Metilophilus inclui Metilophilus metílotrophus e exemplos da bactéria Metilobacillus incluem Metilobacillus glyeogenes e Metilobacillus flagellatus e os exemplos da bactéria Metilophaga incluem Metilophaga thalassiea, Metilophaga marina e Metilophaga alealiphila (Biology of Metilotrophus; Editada por Israel Goldberg e J.Stefan Roken e publicada por Butterworth-Heinemann). Além disso, as bactérias tendo uma função para secretar a metanol desidrogenase (MDH) fora das células bacterianas também são preferíveis.

Os exemplos de Metilophilus metilotrophus incluem a cepa ASl (NCIMB 10515), W3A1 (cepa NCIMB 11348) e a cepa ATCC 53528. Metilophilus metilotrophus cepa ASl (NCIMB 10515) e W3AI (cepa NCIMB 11348) são disponíveis da National Collections of Industrial and Marine Bactéria, endereço: NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Reino Unido).

Os exemplos de Metilobacillus glyeogenes incluem cepa T-Il (NCIMB 11375), cepa ATCC 21276, cepa ATCC 21371, cepa ATCC 29475, cepa ATR80 (descrita em Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994), vol. 42, p67- 72) e cepa A513 descrita em Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994), vol. 42, p67-72). Metilobacillus glyeogenes cepa NCIMB 11375 está disponível da National Collections of Industrial and Marine Bactéria, endereço: NCIMB Lts., Tony Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Reino Unido).

Os exemplos de Metilobacillus flagellatus incluem a cepa ATCC 51484, cepa KT (descrita em N.I. Govorukhina et al., Microbiology (Rússia) 56 (1987), pp.849-854) e cepa VKM B-1610. Metilobacillus flagellatus cepa VKM B-1610 está disponível da ALL-RUSSIAN COLLECTION OF MICROORGANISMS (Rússia, 142290, Moscow Region, Pushchino, pr. Nauki, 5, IBPM). Metilophilus metilotrophus cepa ATCC 53528, Metilobacillus glycogenes cepa ATCC 21276, cepa ATCC 21371, cepa ATCC 29475, Metilobacillus flagellatus cepa ATTC 51484 pode ser obtido da American Type Culture Collection (ATCC) (endereço ATCC, Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America).

Os exemplos de Metilophaga thalassica incluem a cepa ATTC 33145 e a cepa ATTC 33146. Um exemplo de Metilophaga marina inclui a cepa ATCC 35842. Um exemplo de Metilophaga alcaliphila inclui ATCCBAA-297®. Metilophaga thalassica cepa ATTC 33145 e cepa ATTC 33146 podem ser obtidos da American Type Culture Collection (ATCC) (endereço ATCC, Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America).

O termo "promotor que funciona em uma bactéria que assimila metanol" contido em uma construção de DNA a ser introduzida na bactéria que assimila metanol refere-se a um promotor tendo atividade promotora na bactéria que assimila metanol, mas o promotor não é limitado a um derivado de uma bactéria que assimila metanol e pode ser derivado de um outro microorganismo. Além disso, o "promotor que funciona em uma bactéria que assimila metanol" inclui tanto um promotor indutível por metanol quanto um promotor não indutível. Os exemplos do promotor indutível por metanol incluem um promotor de um gene da metanol desidrogenase, um promotor de um gene da diidroxiacetona sintase e um promotor de um gene da formiato desidrogenase.

Os exemplos específicos do promotor que funciona em uma bactéria que assimila metanol incluem, mas não são limitados a, um promotor indutível por metanol de um gene da metanol desidrogenase (SEQ ID NO: 11), promotor tae que é um promotor de alta expressão derivado da Eseherichia eoli (SEQ ID NO: 12), promotor σΕ (SEQ ID NO: 21) e promotor de proteína ribossômica (SEQ ID NO: 22). Também, a seqüência promotora não é limitada a um promotor do tipo selvagem e pode ser um promotor obtido pela modificação de uma seqüência do tipo selvagem de modo que um gene objeto seja altamente expressado. Por exemplo, a seqüência pode ser obtida pela modificação da seqüência promotora do tipo selvagem de modo a se ter uma substituição, deleção, adição, ou inserção de diversos nucleotídeos contanto que o promotor tenha atividade promotora nas bactérias mencionadas acima. Além disso, de modo a aumentar a atividade promotora, o promotor pode ser modificado na região -35 ou região -10, ou modificado ajustando-se o comprimento de uma região espaçadora entre a região -35 e a região -10. Os exemplos do método de modificar as regiões -35 e -10 incluem o método descrito na EP 1.033.407 e o método descrito em Nucleic Acids Res. 15 de dezembro de 1999; 27(24): 4768-74.

A atividade promotora é definida pela freqüência de iniciação da síntese de RNA. Os exemplos de um método de avaliar a atividade promotora e promotores fortes que podem ser usados na presente invenção são descritos em Goldstein et ai. {Prokaryotic promotors in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128) ou semelhante. Além disso, como divulgado na WO 00/18935, o promotor pode ser modificado em um promotor mais forte pela introdução de uma substituição de nucleotídeo de diversos nucleotídeos na região promotora de um gene objeto.

Em uma construção de DNA a ser introduzida em uma bactéria que assimila metanol, uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo contendo uma seqüência de sinal e uma proteína alvo é operavelmente conectada à jusante do promotor.

A "seqüência de sinal que funciona em uma bactéria que assimila metanol" significa uma seqüência que pode ser reconhecida pela bactéria que assimila metanol de modo a secretar a proteína alvo quando a mesma está conectada a uma proteína alvo. A seqüência de sinal pode ser derivada de uma proteína diferente de uma proteína alvo ou contida em uma proteína precursora de uma proteína alvo. Entretanto, a seqüência de sinal é preferivelmente derivada de uma proteína secretora de uma bactéria hospedeira que assimila o metanol a ser usado. Uma seqüência de sinal que pode ser usada para a presente invenção pode conter uma parte de uma seqüência de aminoácido lateral de terminal N de uma proteína alvo junto com a seqüência de sinal em uma proteína precursora a partir da qual a seqüência de sinal é derivada.

Quando a origem de uma seqüência de sinal é diferente daquela de uma proteína alvo, uma preproproteína pode ser aludida como "preproproteína de fusão heteróloga". Por exemplo, quando a proteína é insulina, a mesma é aludida como "preproinsulina de fusão heteróloga" em contraste à "preproinsulina" ou "proinsulina".

A seqüência de sinal não é particularmente limitada contanto que a mesma funcione em uma bactéria que assimila metanol e possa ser usada uma seqüência de sinal derivada de uma proteína secretada de uma bactéria que assimila metanol ou uma seqüência de sinal derivada de uma proteína secretada de outras bactérias, leveduras, plantas, animais, etc. Um exemplo específico da seqüência de sinal inclui uma seqüência de sinal da metanol desidrogenase (MDH) derivada de Metilophilus metilotrophus (seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 18). Também, os exemplos de uma seqüência de sinal derivada de uma outra bactéria incluem uma seqüência de sinal de fitase codificada por um gene appA de Escherichia coli (seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 20) e uma seqüência de sinal da fosfatase ácida de Morganella morganii (posições 1 a 20 da SEQ ID NO: 26). As seqüências de nucleotídeo que codifica estas seqüências de aminoácido são mostradas nas SEQ ID NOs: 17, 19e25.

Uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de sinal pode ser uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de sinal do tipo selvagem ou uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de sinal do tipo selvagem pode ser substituída de modo que os códons sejam adequadamente usados por uma bactéria que assimila metanol que secrete e produza uma proteína.

A "proteína alvo" que pode ser secretada e recuperada pelo método da presente invenção não é particularmente limitado contanto que a mesma possa ser secretada pelo uso de uma bactéria que assimile metanol quando a mesma está conectada à seqüência de sinal que funcione na bactéria que assimila metanol e esta inclui várias proteínas tais como proteínas secretoras e proteínas intracelulares derivadas de animais, plantas e microorganismos. O método da presente invenção pode ser aplicado a uma proteína que não pode ser obtida pela produção secretora em uma bactéria gram negativa tal como uma bactéria Escherichia. A "proteína alvo" é preferivelmente uma proteína heteróloga que é derivada de uma origem diferente de uma bactéria hospedeira que assimile metanol.

Quando uma proteína secretada é usada como a "proteína alvo", uma proteína tendo uma seqüência obtida pela remoção de uma pré- seqüência e uma pró-seqüência de um precursor ou uma proteína tendo uma pró-seqüência pode ser usada. Entretanto, a "proteína alvo" pode ser uma proteína obtida pela remoção de pelo menos um aminoácido que constitui uma pré-porção e uma porção pro pela clivagem de uma ligação de peptídeo a partir de uma proteína precursora e esta inclui uma proteína tendo uma região de terminal N que completamente corresponde àquela de uma proteína madura natural, uma proteína tendo pelo menos um aminoácido extra derivado de uma pré-porção ou uma porção pro no terminal N quando comparada com uma proteína madura natural e uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido mais curta do que aquela de uma proteína madura natural.

A proteína alvo à qual o método de produção da presente invenção pode ser aplicado não é particularmente limitado e seus exemplos incluem proteínas maduras ou proproteínas das seguintes proteínas:

Fitase [EC: 3.1.3.2 3.1.3.26]

Interleucina 2 Humana (1L2: Acesso no Genbank Ns AAK26665, ÍL2 tipo madura: aminoácidos nas posições 21 a 153)

Glutaminase de Proteína

Trans glutaminase (Acesso no Genbank N2 AF531437)

Interferon

Insulina (JP 07-284394 A)

Fosfatase ácida

Sintetase de Peptídeo (WO 2004/011653, WO 2004/065610) Fator estimulador de Granulócito (GCSF)

Entre estas, as preferíveis são a fitase e a fosfatase ácida produzidas nos exemplos mostrados abaixo.

A Fitase (também aludida como fosfoanidrido fosforilase) é uma enzima que hidrolisa a fitina (também aludida como inositol hexacisfosfato ou ácido fítico) e é útil nos campos alimentícios, agrícolas e medicinais, etc. As seguintes podem ser usadas como fitase. A informação sobre a seqüência de aminoácido de cada fitase e a seqüência de nucleotídeo que codifica cada fitase pode ser obtida referindo-se ao Acesso no Genbank

Na de cada fitase.

A Fitase derivada de Escherichia coli: Acesso no Genbank N- AAC74065 (SEQ ID NO: 16), a proteína madura: aminoácidos nas posições 23 a 432

Fitase derivada de mofo: Acesso no Genbank N2 AAU93518, AAU93517 e AAG40885 e BAB40715

Fitase derivada de Bacillus: Acesso no Genbank N2 AAC38573, AAG 17903 e AAL 59320

Fitase derivada de levedura: Acesso no Genbank Ns CAB70441

YP 070934

ΑΑΜ23271

ΑΑΜ38967

Fitase derivada de Yersinia: Acesso no Genbank Ns

Fitase derivada de Klebsiella: Acesso no Genbank Ns

Fitase derivada de Xanthomonas: Acesso no Genbank Ns

Fitase derivada de Pseudomonas: Acesso no Genbank N2

AAN77879

Fitase derivada de cogumelo: Acesso no Genbank N2 CÀC48195, CAC48164 e CAC48234

Fitase derivada do milho: Acesso no Genbank N- AAB52233 Fitase derivada de soja: Acesso no Genbank N- AAK49438 Fitase derivada de batata doce: Acesso no Genbank Ns

AAF60315

Fitase derivada de rato: Acesso no Genbank N- AAA42305 Fosfatase ácida é uma enzima que catalisa uma reação de hidrolisação de um fosfato sob condições ácidas (EC 3.1.3.2) e é possível usar a seguinte fosfatase ácida derivada de Morganella morganii, fosfatase ácida descrita na WO 96/37603 e mutantes destas.

Fosfatase ácida derivada de Morganella morganii: Acesso no Genbank N- AB035805 (SEQ ID NO: 25) aminoácidos tipo maduro nas posição de 21 a 259

Um gene que codifica cada uma destas proteínas pode ser modificado dependendo de um hospedeiro a ser usado e/ou para obter uma atividade desejada e tal modificação inclui modificação para adicionar, deletar ou substituir pelo menos um aminoácido na seqüência de aminoácido a ser codificada. Uma tal tecnologia biológica molecular geral que inclui métodos de modificação, métodos de clonagem de gene e métodos de detecção das proteínas produzidas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, as tecnologias são descritas em Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, DNA cloning: A Practical Approach, Volumes I e II (D. N. Glover ed. 1985), F .M. Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994), PCR Technology: Principies and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Pres, etc. No caso de proteínas haterólogas, um gene pode ser modificado para ter substituição de códons com códons freqüentemente usados em um microorganismo para a produção secretora.

Um gene que codifica uma proteína pode ser obtido pela PCR ou semelhante usando iniciadores planejados com base em uma seqüência conhecida. Também, pode ser usado um gene que codifique uma proteína alvo obtido pela isolação de cromossomas de microorganismos, animais, plantas, etc. pela hibridização ou semelhante com base na homologia e um gene do qual a seqüência de nucleotídeo foi determinada. Alternativamente, um gene obtido pela síntese química com base em uma seqüência de nucleotídeo conhecida pode ser usado. A informação de seqüência está disponível a partir de uma base de dados tal como o Genbank.

Além disso, a proteína alvo pode ser uma proteína tendo substituição, deleção, inserção ou adição de um ou diversos aminoácidos em uma ou uma pluralidade de posições contanto que a mesma tenha a atividade da proteína alvo. Na presente invenção, dependendo da posição de resíduos de aminoácido na estrutura terciária ou tipos de uma proteína, o termo "um ou diversos" especificamente significa de 1 a 30, preferivelmente de 1 a 20 e mais preferivelmente de 1 a 10.

A substituição mencionada acima em uma proteína é a substituição conservativa para manter a atividade da proteína. A substituição é uma mudança para remover pelo menos um resíduo em uma seqüência de aminoácido e para inserir um outro resíduo neste lugar. Os exemplos de uma tal substituição de um aminoácido que é realizada para substituir um aminoácido original de uma proteína de enzima e é considerada como uma substituição conservativa incluem: substituição de Ser ou Thr no lugar de Ala; substituição de Gln, His ou Lys no lugar de Arg; substituição de Glu5 Gln5 Lys, His ou Asp no lugar de Asn; substituição de Asn, Glu ou Gln no lugar de Asp; substituição de Ser ou Ala no lugar de Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg no lugar de Gln; substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp no lugar de Glu; substituição de Pro no lugar de Gly; substituição de Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr no lugar de His; substituição de Leu, Met, Val ou Phe no lugar de lie; substituição de lie, Met, Val ou Phe no lugar de Leu; substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg no lugar de Lys; substituição de lie, Leu, Val ou Phe no lugar de Met; substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu no lugar de Phe; substituição de Thr ou Ala no lugar de Ser; substituição de Ser ou Ala no lugar de Thr; substituição de Phe ou Tyr no lugar de Trp; substituição de His, Phe ou Trp no lugar de Tyr; e substituição de Met, Ile ou Leu no lugar de VaL

Um DNA que codifica uma proteína substancialmente idêntica à proteína mencionadas acima pode ser obtido pela modificação de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma tal enzima, por exemplo, por uma mutação específica ao sítio, de modo que um resíduo de aminoácido em um sítio específico é substituído, deletado, inserido, adicionado ou invertido.

Além disso, o DNA modificado mencionado acima pode ser obtido por um tratamento mutacional convencionalmente conhecido. Os exemplos do tratamento mutacional incluem um método de tratar um DNA não mutado in vitro com hidroxilamina ou semelhante, um método de tratar um microorganismo que abriga um DNA não mutado, por exemplo, uma bactéria Escherichiai pela irradiação com raio ultravioleta ou pelo uso de um mutágeno que no geral é usado para um tratamento mutacional tal como N- metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nitroso, um método de causar artificialmente um erro aleatório pela conversão de uma razão de componente de desoxinucleotídeos em uma solução de reação de PCR de taxas iguais (geral) para taxas desiguais, isto é, uma PCR propensa a erro.

Um DNA que codifica uma proteína substancialmente idêntica pode ser obtida pela expressão de um DNA tendo uma tal mutação em uma célula apropriada e determinando a atividade do produto expresso a partir do DNA.

Também, um DNA que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeo complementar àquela de um gene do tipo selvagem ou com uma sonda tendo uma parte deste sob condições severas e codifica uma proteína tendo uma atividade de proteína alvo pode ser obtido a partir de um DNA que codifica uma proteína ou células mutadas contendo o DNA. Aqui, o termo "condições severas" refere-se a condições onde um híbrido chamado específico é formado e híbrido não específico não é formado. E difícil definir claramente as condições com valor numérico, mas os seus exemplos para hibridização incluem: condições onde DNAs com alta homologia, por exemplo, DNAs tendo homologia de não menos do que 70 %, preferivelmente homologia de não menos do que 80 %, mais preferivelmente homologia de não menos do que 90 %, de modo particularmente preferível homologia de não menos do que 95 % hibridizam entre si e DNAs com homologia menor do que 70 % não hibridizam entre si; e condições para lavagem no geral a hibridização de Southern, isto é, condições para lavagem em temperatura de 60°C e com concentrações salinas de Ix SSC, 0,1 % de SDS, preferivelmente O5IxSSC, 0,1 % de SDS.

A proteína alvo anteriormente mencionada pode ser diretamente conectada a uma seqüência de sinal ou indiretamente conectada a uma seqüência de sinal por intermédio de uma seqüência ligadora. No caso de incluir uma seqüência ligadora, a seqüência ligadora pode ser qualquer seqüência contanto que a mesma não iniba a produtividade de um polipeptídeo ou a atividade de uma proteína alvo e por exemplo, uma seqüência para purificar uma proteína alvo, tal como poliistidina pode ser usada.

Uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo contendo uma seqüência de sinal e uma proteína alvo pode ser apropriadamente preparada pela conexão de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de sinal a uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína alvo com uma enzima de restrição ou semelhante.

Além disso, no caso de usar uma seqüência de sinal e uma proteína alvo que são derivadas da mesma proteína precursora, uma seqüência que codifica uma proteína precursor que inclui uma seqüência de sinal e uma proteína alvo pode ser amplificada pela PCR ou semelhante. Vários métodos de PCR modificados conhecidos podem ser usados e entre eles, a PCR de cruzamento é vantajosamente usado para a amplificação.

Uma construção de DNA a ser introduzida em uma bactéria que assimila metanol pode ser preparada conectando-se operavelmente uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo contendo uma seqüência de sinal e uma proteína alvo a um promotor. A frase "conectando operavelmente uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo contendo uma seqüência de sinal e uma proteína alvo a um promotor" significa que o mRNA que codifica um polipeptídeo é transcrito por um promotor de modo que o polipeptídeo seja produzido pela bactéria quando a construção é introduzida na bactéria.

A seqüência de nucleotídeo é preferivelmente conectada a um promotor na região exatamente a jusante de um códon de início de tradução em uma seqüência que codifica um polipeptídeo de modo que o mesmo inclua a região 5' não traduzida contendo um sítio de início de transcrição. A região 5' não traduzida pode ser uma região 5' não traduzida de uma seqüência a partir da qual um promotor é derivado tal como uma região 5' não traduzida de um gene MDH no caso de um promotor do gene MDH. Além disso, a região 5' não traduzida pode ser uma região 5' não traduzida de um gene a partir do qual uma seqüência que codifica uma seqüência de sinal é derivada tal como uma região 5' não traduzida de um gene da fitase no caso de usar uma seqüência de sinal da fitase.

É conhecido que a eficiência de tradução de mRNA é significantemente afetada pela substituição de diversos nucleotídeos em um espaçador entre um sítio de ligação de ribossoma (RBS) e um códon de início, em particular, em uma seqüência exatamente a jusante do códon de início no caso de usar a região 5' não traduzida e portanto uma região 5' não traduzida que inclui tal modificação pode ser usada.

Operações para a obtenção de uma tal construção de DNA pode ser realizada pelo uso de uma bactéria gram negativa que seja de modo fácil geneticamente modificada, tal como uma bactéria Escherichia ou pelo uso de um microorganismo que secrete uma proteína.

De modo a modificar uma bactéria que assimila metanol de modo a ter a construção de DNA mencionadas acima, por exemplo, um vetor que carrega a construção de DNA pode ser introduzido. Por exemplo, uma bactéria hospedeira que assimila metanol pode ser transformada: preparando- se um DNA recombinante pela conexão de um fragmento de gene que codifica a proteína a um vetor que funcione em uma bactéria que assimila metanol, preferivelmente a um vetor de cópia múltipla; e introduzindo o DNA recombinante.

Um promotor alvo, seqüência de sinal, seqüência de proteína podem ser obtidos, por exemplo, PCR (reação da cadeia da polimerase; White, T. J. et al, Trends Genet. 5, 185 (1989)) usando um DNA cromossômico de um animal, planta ou microorganismo tendo uma seqüência objeto como um padrão. O DNA cromossômico pode ser preparado a partir de uma bactéria que serve como um doador de DNA5 por exemplo, pelo método de Saito e Miura (H. Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Experiment Manual for Biotechnology, editado pela The Society for Biotechnology. Japão, p. 97-98, Baifukan Co., Ltd., 1992) ou semelhante. Os iniciadores de PCR podem ser preparados com base em seqüências de gene registradas em bases de dados conhecidas tais como Genbank ou com base na informação em uma região conservada entre os genes tendo seqüências conhecidas em uma outra bactéria ou semelhante.

Os exemplos de um vetor capaz de replicar autonomamente em uma bactéria que assimila metanol incluem plasmídeos capazes de replicar autonomamente, por exemplo, em uma bactéria Metilophilus ou Metilobacillus. Os exemplos específicos destas incluem um vetor de faixa de hospedeiro ampla RSF1010 e um derivado deste, tal como pAYC32 (Chistosterdov, A. Y., Tsygankov, Y D. Plasmid, 1986, 16, 161-167), pMFY42 (gene, 44, 53 (1990)), pRP301 ou pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)).

Também, pAYCTER3 usado nos Exemplos desta descrição é um vetor preferível. O pAYCTER3 é um plasmídeo obtido pela deleção da região a jusante de um gene resistente à estreptomicina de pAYC32 (strA e strB) e inserindo aí um sítio de clonagem múltipla de pUC19 e um terminador de um gene rrnB de E. coli. Isto é, o pAYCTER3 é um vetor de alta expressão que não expressa resistência à estreptomicina mas torna-se resistente à estreptomicina quando um DNA contendo uma seqüência promotora é inserido no sítio de clonagem múltipla em uma direção avançada em relação a strA.

De modo a preparar um DNA recombinante pela conexão da construção de DNA a um vetor que carrega um marcador que funciona em uma bactéria que assimila metanol, um vetor é clivado com uma enzima de restrição adequada para o final de um gene alvo. A ligação é no geral realizada com uma ligase tal como T4 DNA ligase.

A introdução de um DNA recombinante preparado como descrito acima em uma bactéria que assimila metanol pode ser realizada por um método de transformação que foi reportado. Os seus exemplos incluem um método que compreende preparar uma célula competente a partir de uma célula no estágio de proliferação e introduzir um DNA nesse lugar (Dubunau e Davidoff-Abelson5 J. Mol. Biol., 56, 209 (1971); Duncan, C. H., Wilson, GA e Young, R E, Gene, 1, 153 (1977)) e um método que compreende converter uma célula hospedeira em um protoplasto ou esferoplasto que facilmente receba um DNA recombinante e introduzir um DNA recombinante na bactéria receptora de DNA (Chang, S. e Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979)).

Além disso, uma bactéria que assimila metanol tendo uma construção de DNA da presente invenção pode ser construída pela introdução de uma cópia ou cópias múltiplas de uma construção de DNA em um DNA cromossômico de uma bactéria que assimila metanol. Uma cópia ou cópias múltiplas de uma construção de DNA da presente invenção pode ser introduzida em um DNA cromossômico de uma bactéria que assimila metanol pela recombinação homóloga usando uma seqüência que esteja presente em um DNA cromossômico em cópias múltiplas como um alvo ou pela inserção aleatória a um DNA cromossômico usando um fago ou semelhante. Como uma seqüência presente em um DNA cromossômico em cópias múltiplas, um transposon, uma seqüência repetitiva, uma repetição invertida presente no final de um elemento reversível ou semelhante podem ser usados. Além disso, a amplificação com um vetor e a formação de cópias múltiplas no cromossoma podem ser combinadas com a modificação mencionada acima de uma seqüência que regula a expressão.

Uma proteína pode ser produzida cultivando-se uma bactéria que assimila metanol obtido como descrita acima em um meio líquido contendo metanol como uma fonte de carbono para permitir que a bactéria secrete a proteína alvo e depois recuperar a proteína alvo secretada.

Nesta descrição, a "secreção" de uma proteína ou um peptídeo significa o transporte de uma molécula de proteína ou peptídeo fora das células bacterianas, que inclui não apenas um caso onde a proteína ou peptídeo esteja eventualmente em um estado completamente livre em um meio mas também um caso onde apenas uma parte desta esteja presente no lado de fora das células bacterianas assim como um caso onde a proteína ou peptídeo esteja presente na camada de superfície das células bacterianas.

Na presente invenção, uma proteína alvo é preferivelmente secretada a um grau tal que a mesma seja coletada de um meio ou células bacterianas.

A bactéria que assimila metanol é cultivada em um meio contendo metanol como uma fonte de carbono. Os exemplos do meio contendo metanol como uma fonte de carbono incluem um meio suplementado com 0,001 a 30 % de metanol. O meio pode conter uma fonte de carbono outra que não metanol, tal como: açúcares que incluem glicose, sacarose, lactose, galactose, frutose e um hidrolisado de amido; álcoois tais como glicerol e sorbitol; e ácidos orgânicos tais como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico.

Como um componente do meio outro que não metanol, um componente de meio tal como uma fonte de nitrogênio ou um íon inorgânico usado na cultura geral pode ser adicionado. De modo a obter crescimento superior, um nutriente orgânico traço tal como uma vitamina e um aminoácido pode ser adicionado, se necessário. Como a fonte de nitrogênio, gás amoníaco, água amoniacal, sais de amônio, etc. podem ser usados. Como o íon inorgânico, íon cálcio, íon magnésio, íon fosfato, íon potássio, íon ferro, etc. podem ser apropriadamente usados, se necessário. Por exemplo, a cultura pode ser realizada no pH 5,0 a 9,0 e de 15°C a 45°C sob condições aeróbicas e um período de cultura pode ser cerca de 1 a 7 dias. Quando uma bactéria que assimila metanol é cultivada sob tais condições, uma proteína alvo é produzida em uma grande quantidade em células bacterianas e depois eficientemente secretadas.

Em um caso de usar um promotor indutível por metanol tal como um promotor do gene MDH5 a cultura pode ser realizada sob condições indutíveis para aumentar a produção de um polipeptídeo. A indução pode ser realizada de acordo com condições no geral usadas para induzir um promotor do gene MDH. No geral, quando uma bactéria que assimila metanol é cultivada em metanol, um promotor MDH podem funcionar sem requerer indução particular.

Uma proteína secretada em um meio pelo método da presente invenção pode ser separado e purificado a partir do meio depois da cultura de acordo com um método bem conhecido por uma pessoa habilitada na técnica.

Por exemplo, a proteína pode ser separada e purificada: removendo-se as células bacterianas pela centrifugação ou semelhante; e realizando-se um método apropriado conhecido tal como dessalinização, precipitação com etanol, ultrafiltração, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de coluna de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia líquida de média e alta pressão, cromatografia de fase reversa ou cromatografia hidrofóbica; ou combinação destes métodos. Quando um polipeptídeo compreende uma seqüência para purificação, a purificação pode ser realizada usando a seqüência.

Uma proteína secretada na camada de superfície de células bacterianas pelo método da presente invenção pode ser separada e purificada: solubilizando-se a proteína por um método conhecido por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, aumentando-se o teor salino, usando um tensoativo, etc.; e realizando-se os mesmos procedimentos como no caso onde a proteína é secretada em um meio. Também, em alguns casos, a proteína secretada na camada de superfície de células bacterianas pode ser usadas como, por exemplo, uma enzima imobilizada sem solubilizar a proteína. Exemplos

A presente invenção será descrita em mais detalhes com os seguintes exemplos, mas a mesma não é limitada a estes em qualquer sentido. Exemplo 1: Expressão secretora de beta-lactamase que é derivada de Escherichia coli Cepa K-12 em Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 (1) Construção de plasmídeo de expressão que funcione em bactéria que assimila metanol, pAYCTER3

Os DNAs sintéticos mostrados nas SEQ ID NOS: 3 e 4 que foram planejados para conter a seqüência do sítio de clonagem múltiplo de pUC19 foram recozidos por um método conhecido para preparar um poliligador. O poliligador foi planejado para ter as mesmas formas finais como aqueles obtidos pela clivagem com enzimas de restrição EcoRI e BglII. Além disso, os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 5 e 6 foram sintetizados e a região que codifica a seqüência terminadora de rrnB foi amplificada pela PCR com DNA cromossômico de Eseheriehia coli K-12 preparado pelo método convencional (método de Saito e Miura [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]). Uma seqüência reconhecida pela enzima de restrição BglII foi introduzida no iniciador da SEQ ID NO: 3 e uma seqüência reconhecida pela enzima de restrição BclI foi introduzida no iniciador da SEQ ID NO: 4. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA polimerase (fabricada por TAKARA BlO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Depois de digerir os fragmentos de PCR com as enzimas de restrição BglII e Bell, os fragmentos de PCR e o poliligador acima foram ligados juntos para preparar um fragmento de DNA de cerca de 400 pares de base. Um kit de ligação de DNA Ver. 2.1 (fabricado por TAKARA BIO INC.) foi utilizada na reação de ligação e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Subseqüentemente, os fragmentos de cerca de 9,2 kbp que foram cortados fora do plasmídeo pAYC32 conhecido (J. Gen. Microbiol., 137, 169-178 (1991)) com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI foram coletados e o fragmento de DNA acima foi aí inserido para construir um plasmídeo de expressão pAYCTER3 que funciona em M metilotrophus ATCC 53528. A estrutura do pAYCTER3 carece da seqüência a montante do lado 5' do gene strA incluído em pAYC32, mas o mesmo tem ao invés um sítio de clonagem múltipla pUC 19 e um terminador rrnB e inclui um gene da beta-lactamase derivado de E. coli.

(2) Expressão secretora de beta-lactamase em Metilophilus metilotrophus ATCC 53528

Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 foi transformado com pAYCTER3 construído em (1) acima e uma cepa que cresce em meio de SEIIA ágar (5 g de sulfato de amônio, 1,9 g de K2HPO4, 1,56 g de NaH2PO4 2H20, 200 mg de sulfato de magnésio, 72 mg de cloreto de cálcio, 5 μg de sulfato de cobre, 25 μg de sulfato de manganês, 23 μg de sulfato de zinco, 9,7 mg de tricloreto de ferro e 15 g de ágar foram dissolvidos em água até 1 L e a solução foi ajustada ao pH 7,0) contendo 25 mg/l de ampicilina e 1 % de metanol foi selecionada. Subseqüentemente, o M metilotrophus ATCC 53528 selecionado tendo pAYCTER3 foi cultivado em meio líquido SEIIA contendo 25 mg/l de ampicilina e 2 % de metanol a 37°C por 48 horas. Depois da conclusão da cultura, o sobrenadante de cultura das células bacterianas de M metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCTER3 foi submetido a SDS-PAGE, para detectar deste modo uma proteína tendo o mesmo peso molecular como beta-lactamase no sobrenadante de cultura.

A determinação da seqüência de terminal N da proteína usando um seqüenciador de proteína PPSQ-21A (fabricado pela Shimadzu Corporation) revelou que a seqüência foi uma seqüência madura de beta- lactamase e foi confirmado que a beta-lactamase foi secretada no sobrenadante de cultura.

Exemplo 2: Expressão secretora de fitase que é derivada de Escherichia Coli Cepa K-12 em Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 (1) Aquisição de gene da metanol desidrogenase derivada de Metilophilus metilotrophus ATCC 53528

A seqüência de um gene da metanol desidrogenase derivada de M metilotrophus cepa W3A1 já foi determinada [Acesso no Genbank N2 U41040]. Com base na seqüência, os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 1 e 2 foram sintetizados e uma região que codifica uma seqüência da metanol desidrogenase foi amplificada por um método de PCR a partir do DNA cromossômico da M metilotrophus ATCC 53528 preparado de acordo com o método de Saito e Miura. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA polimerase (fabricada por TAKARA BIO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante.

Subseqüentemente, o fragmento de DNA amplificado de cerca de 1,0 kb foi deixado reagir usando o Kit Random Primer DNA Labeling Ver. 2 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e [ot-32P]dCTP de acordo com o protocolo anexo ao kit, para criar deste modo uma sonda de DNA. A hibridização de Southern blot usando a sonda criada e DNA cromossômico de Mmetilotrophus ATCC 53528 de acordo com um método geral como descrito em Molecular Cloning 2a edição [J. Sambrook, E. F. Fritsch e T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9.31 (1989)] revelou que o fragmento de cerca de 5,5 kb que foi cortado fora com uma enzima de restrição PvuII incluiu um gene da metanol desidrogenase. Depois, fragmentos de cerca de 5,5 kb obtidos pela digestão do DNA cromossômico de M metilotrophus ATCC 53528 com PvuII foram recuperados depois da eletroforese em gel de agarose usando EASYTRAP Ver. 2 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e inserido no sítio SmaI em pUC18 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e o plasmídeo obtido foi introduzido em células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricadas pela TAKARA BIO ESTC.), para preparar deste modo uma biblioteca.

A triagem da biblioteca foi realizada pela hibridização de colônia descrita em Molecular Cloning 2a edição [J. Sambrook, E. F. Fritsch e T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ρ 1.90 (1989)] usando a sonda de DNA da metanol desidrogenase produzida como descrito acima, para produzir deste modo uma cepa tendo um plasmídeo em que um fragmento de gene da metanol desidrogenase foi clonado. Depois, o plasmídeo foi recuperado da cepa e foi nomeado pUMDH. A determinação da seqüência de nucleotídeo de um fragmento clonado em pUMDH revelou que o gene da metanol desidrogenase de Mmetilotrophus ATCC 53528 teve uma seqüência de nucleotídeo 95 % ou mais homóloga a um gene da metanol desidrogenase de M metilotrophus cepa W3A1 (SEQ ID NO: 13). A determinação da seqüência de nucleotídeo revelou que o fragmento PvuJI de cerca de 5,5 kb incluíram um gene de tamanho natural da metanol desidrogenase e uma região de cerca de 2,5 kb a montante do lado 5' do gene. A seqüência de nucleotídeo foi determinada usando um kit de seqüenciamento de ciclo terminador de pigmento (fabricado pela PE Applied Biosystems) e um seqüenciador de DNA 3 73A (fabricado pela PE Applied Biosystems).

(2) A aquisição do gene da fitase que é derivado de Eseheriehia coli Cepa K- 12 e construção de plasmídeo de secretor de expressão

A seqüência do gene da fitase derivada de Eseheriehia coli Cepa K-12 já foi determinada (Acesso no Genbank Ns AE000200: SEQ ID NO: 15). Com base na seqüência, os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 7 e 8 foram sintetizados e uma região que codifica uma seqüência da fitase (madura) foi amplificada por um método de PCR a partir do DNA cromossômico da Escherichia coli Cepa K-12 preparado de acordo com o método de Saito e Miura. A PCR foi realizada usando a Pyrobest DNA polimerase (fabricada por TAKARA BIO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante.

Subseqüentemente, a região promotora e região de seqüência de sinal da metanol desidrogenase foram amplificadas por um método de PCR usando os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 9 e 10 a partir de DNA cromossômico de M. metilotrophus ATCC 53528 preparado de acordo com o método de Saito e Miura. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA polimerase (fabricada pela TAKARA BIO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O iniciador mostrado na SEQ ID NO: 10 inclui uma seqüência que codifica a seqüência de aminoácido lateral de terminal N da fitase de modo a construir um gene de fusão com a fitase.

Em seguida, 1 μΐ de soluções de PCR de uma região que codifica a seqüência de fitase (tipo maduro) da Escherichia coli Cepa K-12 amplificada como descrito acima e a região promotora e a região de seqüência de sinal de Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 amplificada como descrito acima foram misturadas para preparar um padrão e a PCR cruzada foi realizada usando os iniciadores das SEQ ID NOS: 9 e 8 para amplificar um gene de fusão da fitase conectado ao promotor e seqüência de sinal de um gene da metanol desidrogenase de Metilophilus metilotrophus ATCC 53528. A eletroforese em gel de agarose detectou um fragmento amplificado de cerca de 2,4 kb. O fragmento foi recuperado do gel de agarose usando EASYTRAP Ver.2 (fabricado pela TAKARA 1310 INC.) e inserido no sítio SmaI em pHSG398 (fabricado pela TAKARA 1310 INC.), para produzir deste modo pHSGMappA. A determinação da seqüência de nucleotídeo do fragmento inserido confirmou a construção de um gene de fusão antecipado. Subseqüentemente, um fragmento BamHI-KpnI de pHSGMappA foi recuperado do gel de agarose usando EASYTRAP Ver.2 (fabricado por TAKARA BIO INC.) e as extremidades do fragmento foram feitos abruptos usando um kit DNA blunting (fabricado pela TAKARA 1310 ESTC.). Em seguida, um fragmento EcoRI de pAYCTER3 construído no Exemplo 1 (1) foi recuperado do gel de agarose usando EASYTRAP Ver.2 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e as extremidades do fragmento foram feitos abruptas usando um kit DNA blunting (fabricado pela TAKARA BIO INC.), seguido pela inserção do fragmento BamHI-KpnI abrupto, para produzir deste modo pAYCMappA. A determinação da seqüência de nucleotídeo do fragmento inserido confirmou a construção de um gene de fusão heterólogo antecipado. (3) Expressão do gene da fitase em Metilophilus metilotrophus ATCC 53528

Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 foi transformado com pAYCMappA (obtido pela conexão da seqüência promotora e seqüência de sinal da metanol desidrogenase derivada de Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 ao gene da fitase derivado de Escherichia coli Cepa K-12) construído acima (2) e com pAYCTER3 (controle), respectivamente e cepas que cresceram em meio de SEIIA ágar (5 g de sulfato de amônio, 1,9 g de K2HPO4, 1,56 g de NaH2PO4 2H20, 200 mg de sulfato de magnésio, 72 mg de cloreto de cálcio, 5 μg de sulfato de cobre, 25 μg de sulfato de manganês, 23 μg de sulfato de zinco, 9,7 mg de tricloreto de ferro e 15 g de ágar foram dissolvidos em água a 1 L e a solução foi ajustada ao pH 7,0) contendo 25 mg/l de ampicilina e 1 % de metanol foram selecionadas. Subseqüentemente, a M metilotrophus cepa ATCC 53528 selecionada tendo pAYCMappA ou pAYCTER3 foi cultivada em meio líquido SEIIA contendo 25 mg/l de ampicilina e 2 % de metanol a 37°C por 48 horas. Depois da conclusão da cultura, os sobrenadantes de cultura de células bacterianas de M. metilotrophus cepas ATCC 53528 tendo pAYCMappA ou pAYCTER3 foram submetidas à SDS-PAGE e como um resultado, uma proteína tendo um peso molecular objeto foi detectada apenas no sobrenadante de cultura da cepa tendo pAYCMappA. Subseqüentemente, os sobrenadantes de cultura das cepas foram usados como soluções de enzima bruta para determinar a atividade de fitase. A atividade enzimática foi determinada de acordo com o relato publicado (J AOAC Int. Maio-Junho de 1994; 77(3): 760-4.). Como um resultado, no caso de M metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCTER3, a atividade enzimática não foi detectada no sobrenadante de cultura, enquanto que no caso de M metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCMappA, a atividade enzimática foi detectada (60 FTU/ml, 37°C, pH 5,5) no sobrenadante de cultura, que revelou que a cepa secretou fitase no sobrenadante de cultura.

Exemplo 3: Expressão secretora de fosfatase ácida que é derivada de cepa de Morganella morganii em Metilophilus metilotrophus ATCC 53528

(1) Aquisição do gene da fosfatase ácida que é derivado de cepa da Morganella morganii e construção de um plasmídeo para a expressão secretora

A seqüência de um gene da fosfatase ácida derivada de cepa da Morganella morganii já foi determinada (Acesso no Genbank N2 AB035805: SEQ ID NO: 25). Com base na seqüência, os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 27 e 28 foram sintetizados e uma região que codifica uma seqüência da fosfatase ácida (tipo maduro) foi amplificada por um método de PCR a partir do DNA cromossômico de cepa da Morganella morganii preparada de acordo com o método de Saito e Miura. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA polimerase (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O iniciador mostrado na SEQ ID NO: 27 inclui uma seqüência que codifica a seqüência de aminoácido lateral do terminal C na seqüência de sinal da metanol desidrogenase de modo a construir um gene de fusão com a metanol desidrogenase de M metilotrophus.

Subseqüentemente, a região promotora e a região de seqüência de sinal da metanol desidrogenase foram amplificadas por um método de PCR usando os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 9 e 29 a partir de DNA cromossômico de Mmetilotrophus ATCC 53528 preparado de acordo com o método de Saito e Miura. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA polimerase (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante.

Em seguida, 1 μΐ das soluções de reação da PCR de uma região que codifica a seqüência da fosfatase ácida (madura) da cepa de Morganella morganíi amplificada como descrita acima e a região promotora e região da seqüência de sinal de Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 amplificadas como descrito acima foram misturadas para preparar um padrão e a PCR cruzada foi realizada usando os iniciadores das SEQ ID NOS: 9 e 28 para amplificar um gene de fusão da fosfatase ácida conectado ao promotor e seqüência de sinal de um gene da metanol desidrogenase de Metilophilus metilotrophus ATCC 53528. A Eletroforese em gel de agarose detectou um fragmento amplificado de cerca de 1,8 kb. O fragmento foi recuperado do gel de agarose usando EASYTRAP Ver.2 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e inserido no sítio SmaI em pHSG398 (fabricado pela TAKARA BIO INC.), para produzir deste modo pHS GMphoC. A determinação da seqüência de nucleotídeo do fragmento inserido confirmou a construção de um gene de fusão antecipado. A seqüência de nucleotídeo foi determinada usando um kit seqüenciador de ciclo terminador de pigmento (fabricado pela PE Applied Biosystems) e um Seqüenciador de DNA 373A (fabricado pela PE Applied Biosystems). Subseqüentemente, um fragmento BamHI-KpnI de pHSGMphoC foi recuperado do gel de agarose usando EASYTRAP Ver.2 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e as extremidades do fragmento foram terminadas abruptas usando um kit DNA blunting (fabricado pela TAKARA BIO INC.). Em seguida, um fragmento SmaI de pAYCTER3 construído no Exemplo 1 (1) foi recuperado do gel de agarose usando EASYTRAP Ver.2 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e seguido pela inserção do fragmento BamHI-KpnI terminado de modo abrupto, para produzir deste modo pAYCMphoC. A determinação da seqüência de nucleotídeo do fragmento inserido confirmou a construção de um gene de fusão heterólogo. (2) Expressão do gene da fosfatase ácida em Metilophilus metilotrophus ATCC 53528

Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 foi transformado com pAYCMphoC (obtido pela conexão da seqüência promotora e seqüência de sinal da metanol desidrogenase derivada de Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 ao gene da fosfatase ácida derivado da cepa de Morganella morganii) construído acima (1) e com pAYCTER3 (controle) e cepas que cresceram em meio SEIIA ágar contendo 25 mg/l de ampicilina e 1 % de metanol foram selecionados. Subseqüentemente, as cepas de M. metilotrophus ATCC 53528 selecionadas tendo pAYCMphoC ou pAYCTER3 foram cultivadas em meio líquido SEIIA contendo 25 mg/l de ampicilina e 2 % de metanol a 37°C por 48 horas. Depois da conclusão da cultura, os sobrenadantes de cultura de células bacterianas de cepas de M metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCMphoC ou pAYCTER3 foram submetidos à SDS- PAGE e como um resultado, uma proteína tendo um peso molecular objeto de cerca de 25 kDa foi detectada apenas no sobrenadante de cultura da cepa tendo pAYCMphoC. Subseqüentemente, os sobrenadantes de cultura das cepas foram usados como soluções de enzima bruta usando substrato pNPP para determinar a atividade de fosfatase. Como um resultado, no caso de M metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCTER3, a atividade enzimática não foi detectada no sobrenadante de cultura, enquanto que no caso de M metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCMappA, a atividade enzimática foi detectada no sobrenadante de cultura, que revelou que a cepa secretou fosfatase ácida no sobrenadante de cultura.

Exemplo 4: Expressão secretora de fitase que é derivada da Escherichia coli Cepa K-12 substituída na seqüência de sinal em Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 (1) Construção de plasmídeo secretor de expressão para a fitase que é derivada da Escherichia coli Cepa K-12 substituída na seqüência de sinal

A região promotora da metanol desidrogenase foi amplificada por um método de PCR usando os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 30 e 31 do DNA cromossômico de Mmetilotrophus ATCC 53528 preparado de acordo com o método de Saito e Miura. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA polimerase (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O iniciador mostrado na SEQ ID NO: 30 inclui uma seqüência de reconhecimento de uma enzima de restrição Hind III.

De modo a usar uma seqüência de sinal de fitase derivada da E. coli Cepa K-12, um gene da fitase que inclui uma seqüência de sinal foi amplificada por um método de PCR usando os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 32 e 33 de DNA cromossômico da E. coli Cepa K-12 preparados de acordo com o método de Saito e Miura. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA polimerase (fabricado pela TAKARA. BIO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O iniciador mostrado na SEQ ID NO: 32 inclui uma seqüência que codifica a seqüência de aminoácido lateral de terminal C na seqüência promotora da metanol desidrogenase de modo a construir um gene de fusão com a metanol desidrogenase de MmetUotrophus e o iniciador mostrado na SEQ ID NO: 33 inclui uma seqüência de reconhecimento de uma enzima de restrição KpnI.

Em seguida, 1 μl das soluções da reação de PCR de uma região que codifica a seqüência da fitase de Eseheriehia coli Cepa K-12 amplificada como descrito acima e a região promotora de Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 amplificada como descrito acima foram misturadas para preparar um padrão e a PCR cruzada foi realizada usando os iniciadores das SEQ ID NOS: 30 e 33 para amplificar um gene de fusão de uma seqüência de sinal e um gene maduro da fitase de E. coli que foi conectada ao promotor de um gene da metanol desidrogenase de Metilophilus metilotrophus ATCC 53528. A eletroforese em gel de agarose detectou um fragmento amplificado de cerca de 2,4 kb. O fragmento HindIII-KpnI foi recuperado do gel de agarose usando EASYTRAP Ver.2 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e inserido no sítio HindIII-KpnI em pAYCTER3 do Exemplo 1 (1), para produzir deste modo pAYCAappA. A determinação da seqüência de nucleotídeo do fragmento inserido confirmou a construção de um gene de fusão antecipado. A seqüência de nucleotídeo foi determinada usando um kit seqüenciador de ciclo terminador de pigmento (fabricado pela PE Applied Biosystems) e um Seqüenciador de DNA 373A (fabricado pela PE Applied Biosystems).

Por outro lado, de modo a usar uma seqüência de sinal da fosfatase ácida da cepa de Morganella morganii, um gene da fosfatase ácida que inclui uma seqüência de sinal foi amplificada por um método de PCR usando os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 34 e 28 a partir de DNA cromossômico da cepa de M. morganii preparada de acordo com o método de Saito e Miura. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA polimerase (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O iniciador mostrado na SEQ ID NO: 34 inclui uma seqüência que codifica a seqüência de aminoácido lateral de terminal C na seqüência promotora de metanol desidrogenase de modo a construir um gene de fusão com a metanol desidrogenase de M metilotrophus.

1 μl das soluções da reação de PCR do gene da fosfatase ácida amplificada como descrito acima e a região promotora mencionada acima da metanol desidrogenase foram misturados para preparar um padrão e a PCR cruzada foi realizada usando os iniciadores das SEQ ID NOS: 30 e 28 para amplificar um gene de fusão de uma seqüência de sinal e um gene maduro da fosfatase ácida de M. morganii que foi conectado ao promotor de um gene da metanol desidrogenase de M metilotrophus ATCC 53528. Além disso, o promotor do gene da metanol desidrogenase de M metilotrophus ATCC 53528 e a seqüência de sinal da fosfatase ácida de M morganii foram amplificados usando o gene de fusão como um padrão e usando os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 30 e 35. O iniciador mostrado na SEQ ID NO: 35 inclui uma seqüência que codifica a seqüência de aminoácido do lado de terminal N em uma seqüência madura da fitase de modo a construir um gene de fusão com a fitase da E. coli.

1 μl das soluções de PCR do gene de fusão da região promotora da metanol desidrogenase e a seqüência de sinal da fosfatase ácida amplificada como descrito acima e o gene da fitase amplificada no Exemplo 2 (2) foram misturados para preparar um padrão e a PCR cruzada foi realizada usando os iniciadores das SEQ ID NOS: 30 e 33 para amplificar um gene de fusão da seqüência de sinal da fosfatase ácida de M morganii e um gene maduro da fitase de E. coli que foi conectado ao promotor do gene da metanol desidrogenase de M metilotrophus ATCC 53528. A eletroforese em gel de agarose detectou um fragmento amplificado de cerca de 2,4 kb. O fragmento amplificado foi tratado com as enzimas de restrição HindIII e KpnI e o fragmento HindIII-KpnI foi recuperado do gel de agarose usando EASYTRAP Ver.2 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e inserido no sítio HindIII-KpnI em pAYCTER3 obtido no Exemplo 1 (1), para produzir deste modo pAYCCappA. A determinação da seqüência de nucleotídeo do fragmento inserido confirmou a construção de um gene de fusão antecipado. A seqüência de nucleotídeo foi determinada usando um kit seqüenciador de ciclo terminador de pigmento (fabricado pela PE Applied Biosystems) e um Seqüenciador de DNA 373A (fabricado pela PE Applied Biosystems). (2) Expressão da fitase madura de E. coli conectada à seqüência de sinal da fitase de E. coli e a seqüência de sinal da fosfatase ácida de M morganii em Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 M metilotrophus ATCC 53528 foi transformada com pAYCAappA construído em (1) acima (obtido pela conexão da seqüência promotora da metanol desidrogenase derivada de M metilotrophus ATCC 53528 e a seqüência de sinal da fitase derivada de E. coli a um gene de seqüência madura) e com pAYCCappA (obtido pela conexão da seqüência promotora da metanol desidrogenase derivada de M metilotrophus ATCC 53528 e a seqüência de sinal da fosfatase ácida derivada de Mmorganii ao gene da seqüência madura da fitase derivada de E. coli) e com pAYCTER3 (controle) e cepas que cresceram em meio SEIIA ágar contendo 25 mg/l de ampicilina e 1 % de metanol foram selecionadas. Subseqüentemente, as cepas de M. metilotrophus ATCC 53528 selecionadas tendo pAYCAappA, pAYCCappA ou pAYCTER3 foram cultivadas em meio líquido SEIIA contendo 25 mg/l de ampicilina e 2 % de metanol a 37°C por 48 horas. Depois da conclusão da cultura, os sobrenadantes de cultura de células bacterianas das cepas de M. metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCAappA, pAYCCappA ou pAYCTER3 foram submetidos à SDS-PAGE e como um resultado, uma proteína tendo um peso molecular objeto foi detectado apenas nos sobrenadantes de cultura da cepa tendo pAYCAappA e a cepa tendo pAYCCappA. Subseqüentemente, os sobrenadantes de cultura das cepas foram usados como soluções de enzima bruta para determinar a atividade da fitase. Como um resultado, no caso de M metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCTER3, a atividade enzimática não foi detectada no sobrenadante de cultura, enquanto que nos casos de M metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCAappA e pAYCCappA, as atividades enzimáticas foram detectadas nos sobrenadantes de cultura, que revelou que as cepas secretaram fitase no sobrenadante de culturas. A atividade enzimática foi determinada pelo mesmo método como descrito no Exemplo 2 acima.

Exemplo 5: Expressão secretora de fitase que é derivada de Escherichia coli Cepa K-12 substituída por promotor em Metilophilus metilotrophus ATCC 53528

(1) Construção de plasmídeo secretor de expressão para a fitase que é derivada de Escherichia coli Cepa K-12 substituída por promotor

De modo a usar um promotor tac, uma região promotora tac foi amplificada por um método de PCR usando pKK223-3 (fabricado pela Pharmacia) como um padrão e usando os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 36 e 37. A seqüência do promotor tac é mostrado na SEQ ID NO: 12. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA polimerase (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o 10 protocolo recomendado pelo fabricante. O iniciador mostrado na SEQ ID NO: 36 inclui uma seqüência de reconhecimento de um enzima de restrição EcoRI.

Um gene de fusão de uma seqüência de sinal da metanol desidrogenase derivada de M metilotrophus e fitase derivada de E. coli (madura) foi amplificada por um método de PCR usando pAYCMappA obtido no Exemplo 2 (2) como um padrão e usando os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 38 e 39. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA polimerase (fabricado pela TAKARA, BIO INC.) e as condições de reação foram de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O iniciador mostrado na SEQ ID NO: 38 inclui uma seqüência parcial do promotor tac de modo que a construir um gene de fusão com o promotor tac, enquanto que o iniciador mostrado na SEQ ID NO: 39 inclui uma seqüência de uma enzima de restrição EcoRI.

Subseqüentemente, 1 μΐ das soluções de reação de PCR de uma região que codifica a seqüência promotora tac amplificada como descrita acima e uma região que codifica um gene de fusão de uma seqüência de sinal da metanol desidrogenase derivada de M metilotrophus e a fitase derivada de E. coli (madura) amplificada como descrito acima foram misturadas para preparar um padrão e a PCR cruzada foi realizada usando os iniciadores das SEQ ID NOS: 36 e 39 para amplificar um gene obtido pela fusão da seqüência de sinal da metanol desidrogenase derivada de M metilotrophus conectada ao promotor tac e o gene maduro da fitase derivada de E. coli. A eletroforese em gel de agarose detectou um fragmento amplificado de cerca de 1,6 kb. O fragmento amplificado foi tratado com EcoRI e o fragmento de EcoRI foi recuperado do gel de agarose usando EASYTRAP Ver.2 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e inserido no sítio EcoRI em pAYCTER3 obtido no Exemplo 1 (1), para produzir deste modo pAYCPtacMappA. A determinação da seqüência de nucleotídeo do fragmento inserido confirmou a construção de um gene de fusão antecipado. A seqüência de nucleotídeo foi determinada usando um kit seqüenciador de ciclo terminador de pigmento (fabricado pela PE Applied Biosystems) e um Seqüenciador de DNA 373A (fabricado pela PE Applied Biosystems).

(2) Expressão de fitase que é derivada de E. coli conectada ao promotor tac em Metilophilus metilotrophus ATCC 53528

M metilotrophus ATCC 53528 foi transformada com pAYCPtacMappA construído em (1) acima (obtido pela conexão da seqüência promotora tac e a seqüência de sinal da metanol desidrogenase derivada de Metilophilus metilotrophus ATCC 53528 ao gene da seqüência madura de fitase derivada de E. coli) e com pAYCTER3 (controle) e as cepas que cresceram em meio SEIIA ágar contendo 25 mg/l de ampicilina e 1 % de metanol foram selecionadas. Subseqüentemente, as cepas de M metilotrophus ATCC 53528 selecionadas tendo pAYCPtacMappA ou pAYCTER3 foram cultivadas em meio líquido SEIIA contendo 25 mg/l de ampicilina e 2 % de metanol a 37°C por 48 horas. Depois da conclusão da cultura, os sobrenadantes de cultura de células bacterianas das cepas de M metilotrophus. ATCC 53528 tendo pAYCPtacMappA ou pAYCTER3 foram submetidas a SDS-PAGE e como um resultado, uma proteína tendo um peso molecular objeto foi detectada apenas no sobrenadante de cultura da cepa tendo pAYCPtacMappA. Subseqüentemente, os sobrenadantes de cultura das cepas foram usados como soluções de enzima bruta para determinar a atividade da fitase. Como um resultado, no caso de M metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCTER3, a atividade enzimática não foi detectada no sobrenadante de cultura, enquanto que no caso de M. metilotrophus ATCC 53528 tendo pAYCPtacMappA, a atividade enzimática foi detectada no sobrenadante de cultura, que revelou que a cepa secretou fitase no sobrenadante de cultura. A atividade enzimática foi determinada pelos mesmos métodos como aqueles descritos no Exemplo 2 acima.

Exemplo 6: Expressão secretora de beta-lactamase que é derivada de Escherichia coli Cepa K-12 em Metilobacillus glycogenes ATCC 29475 (1) Construção de plasmídeo de expressão que funcione em Metilobacillus glycogenes ATCC 29475, pAYCTER-tet

A cepa de M glycogenes ATCC 29475 tem resistência à ampicilina e estreptomicina e tem sensibilidade à tetraciclina, assim um gene de resistência à tetraciclina foi introduzida no plasmídeo secretor de expressão pAYCTER3 produzido no Exemplo 1 (1). Isto é, um gene resistente à tetraciclina foi amplificado por um método de PCR usando pRK310 (descrito em Plasmid. Março de 1985; 13(2): 149-53) como um padrão e usando iniciadores das SEQ ID NOS: 23 e 24. A eletroforese em gel de agarose detectou um fragmento amplificado de cerca de 1,5 kb. O fragmento amplificado foi tratado com um enzima de restrição BamHI e recuperado do gel de agarose usando EASYTRAP Ver.2 (fabricado pela TAKARA BIO INC.) e inserido no sítio BamHI em pAYCTER3 obtido no Exemplo 1 (1), para produzir deste modo pAYCTER-tet. A determinação da seqüência de nucleotídeo do fragmento inserido confirmou a construção de um gene de fusão antecipado. Os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 23 e 24 incluem seqüências de reconhecimento da enzima de restrição BamHI e a seqüência de nucleotídeo foi determinada usando um kit seqüenciador de ciclo terminador de pigmento (fabricado pela PE Applied Biosystems) e um Seqüenciador de DNA 373A (fabricado pela PE Applied Biosystems).

(2) Expressão secretora de beta-lactamase em Metilobacillus glycogens

ATCC 29475

Metilobacillus glycogens ATCC 29475 foi transformada dentro de pAYCTER-tet construído em (1) acima e uma cepa que cresceu com meio de SEILA ágar (5 g de sulfato de amônio, 1,9 g de K2HPO4, 1,56 g de NaH2PO4^H2O, 200 mg de sulfato de magnésio, 72 mg de cloreto de cálcio, 5 μg de sulfato de cobre, 25 μg de sulfato de manganês, 23 μg de sulfato de zinco, 9,7 mg de tricloreto de ferro e 15 g de ágar foram dissolvidos em água até 1 L e a solução foi ajustada ao pH 7,0) contendo 5 mg/l de tetraciclina e 1 % de metanol foi selecionada. Subseqüentemente, a M glycogens ATCC 29475 selecionada tendo pAYCTER-tet foi cultivada em meio líquido SEIIA contendo 5 mg/l de tetraciclina e 2 % de metanol a 3O0C por 48 horas. Depois da conclusão da cultura, o sobrenadante de cultura das células bacterianas de M glycogens ATCC 29475 tendo pAYCTER-tet foi submetido a SDS-PAGE, para detectar deste modo uma proteína tendo o mesmo peso molecular como a beta-lactamase no sobrenadante de cultura.

A determinação da seqüência de terminal N da proteína usando um seqüenciador de proteína PP SQ-21A (fabricado pela Shimadzu Corporation) revelou que a seqüência foi uma seqüência madura de beta- lactamase e foi confirmado que a beta-lactamase foi secretada no sobrenadante de cultura.

Exemplo 7: Expressão secretora de fitase que é derivada de Escherichia coli Cepa K-12 em Metilobacillus glycogenes ATCC 29475 (1) Construção de plasmídeo secretor de expressão para a fitase que é derivada de Escherichia coli Cepa K-12 em Metilobacillus glycogenes ATCC 29475

De modo a realizar a expressão secretora de fitase derivada de E. coli na cepa de M glycogenes ATCC 29475, um fragmento tratado com BamHI do gene resistente à tetraciclina produzido no Exemplo 6 (1) foi inserido no sítio BamHI no plasmídeo secretor de expressão da fitase pAYCPtacMappA produzido no Exemplo 5 (1), para produzir deste modo pAYCPtacMappA-tet. A determinação da seqüência de nucleotídeo do fragmento inserido confirmou a construção de um gene de fusão antecipado. A seqüência de nucleotídeo foi determinada usando um kit seqüenciador de ciclo terminador de pigmento (fabricado pela PE Applied Biosystems) e um Seqüenciador de DNA 3 73A (fabricado pela PE Applied Biosystems).

Expressão da fitase que é derivada de E. coli em Metilobacillus glycogenes ATCC 29475

Metilobacillus glycogenes ATCC 29475 foi transformado com pAYCPtacMappA-tet construído em (1) acima ou com pAYCTER-tet criado no Exemplo 6 (2) (controle) e as cepas que cresceram em meio de SEIIA ágar contendo 5 mg/l de tetraciclina e 1 % de metanol foram selecionadas. Subseqüentemente, as cepas de M glycogenes ATCC 29475 selecionadas tendo pAYCPtacMappA-tet ou pAYCTER-tet foram cultivadas em meio líquido SEIIA contendo 5 mg/l de tetraciclina e 2 % de metanol a 37°C por 48 horas. Depois da conclusão da cultura, os sobrenadantes de cultura de células bacterianas da cepas de M. glycogenes ATCC 29475 tendo pAYCPtacMappA-tet ou pAYCTER-tet foram submetidos à SDS-PAGE e como um resultado, uma proteína tendo um peso molecular objeto foi detectada apenas no sobrenadante de cultura da cepa tendo pAYCPtacMappA-tet. Subseqüentemente, os sobrenadantes de cultura das cepas foram usados como soluções de enzima bruta para determinar a atividade da fitase. Como um resultado, no caso de M glycogenes ATCC 29475 tendo pAYCTER-tet, a atividade enzimática não foi detectada no sobrenadante de cultura, enquanto que no caso de M glycogenes ATCC 29475 tendo pAYCPtacMappA-tet, a atividade enzimática foi detectada no sobrenadante de cultura, que revelou que a cepa secretou fitase no sobrenadante de cultura. A atividade enzimática foi determinada pelo mesmo método como aquele descrito no Exemplo 2 acima.

Aplicabilidade Industrial

De acordo com a presente invenção, é possível realizar produção secretora de uma proteína eficientemente e em custo baixo. Em particular, é possível realizar a produção secretora de uma proteína industrialmente útil, por exemplo, fitase ou semelhante. LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110> Ajinomoto Co., INC.

<120> C627-C6042

<130> Método para produzir uma proteína

<150> JP2005-139798

<151> 2005-05-12

<160> 39

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 1

aacgggtggc tactacagcc agcacaacag 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 2

ttttcagcca cgatcaggtt gccgttttcg 30

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> DNA sintético

<4 00> 3

aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagctta 57

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> DNA sintético

<400> 4

gatctaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc gagctcg

57 <210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 5

ctatgatcat ttgcctggcg gcagtagcgc

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 6

cttagatctc aaaaagagtt tgtagaaacg

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 7

cagagtgagc cggagctgaa gct

<210> 8 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR <400> 8

acagttcttc gtttgtcatc age

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 9

ctgttcctgc acctgcatgg catggc

<210> 10 <211> 46

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 10

agcttcagct ccggctcact ctgtgccaca gccaggccgg aaatgc

46

<210> 11

<211> 1000

<212> DNA

<213> Methylophilus methylotrophus

<220> <223>

promotor de metanol desidrogenase

<400> 11

ctgttcctgc

aagatcttgc

agcatcatga

cccatccggc

cagcacaaac

cgggcggcag

caccacgttg

taactgcatt

ctggctgaac

ttgggcatat

cgacaaaaca

gcttaatttg

catgatgagg

cagacatgcg

ggccggtctg

tgttagaaat

aacacttaaa

acctgcatgg tctaccaggc atatcttcag cgacggatct tccggccaat atacggtcaa cccgtcaggt tcagtttgtt cacacactca tcataggtca aaagtcagtg cccagctttt tgaccaaata cactatagac taggaatgaa tattaacaat aaacgcattc

catggcgcgc attgctcggt ccgggacgta gcagtttatt gaaaagaaaa aagcacgatt cgccatcaaa tgcggcgctg gtaacacaaa gcagccaggc ccacgcctgc gaatgtcagt cttccaaatt cacattcatt ttcttgaatc tcggttcgtg ttaagagatt

caataccctg catatcgacc aataaagcgg gaaattgatt cagacggctg atgcatgcca aagcgtgata aatttctgcg cacaaacagg ggtgacacgt gatcacgatg aatcacaggg gcttctgcac gccattgccc catcataggg aagtgcggca gggagaaagt

ttttctttca agataaccat gcgccgacat tccttgtgat gcattgcggt atattgcctt tagagttgct tggatctcct gtgagcggga tcggccaagt agcgtgtcac atagaccggt gcgaatatga cgtgaaaaat aatctttcat ttcggggggg

gtgtacgctc gaatctgggc agcaaggcaa gctgcaactg tggtgctgag caacatccag ggctgttgcg gcatgcgtcg tttcatccag caaattgtga gactggagcg tataagaatg gggtcatgta tccctttatt ctattgcctt tgtctgccac

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1000

<210> 12 <211> 151 <212> DNA

<213> Escherichia coli <220>

<223> tac promoter <400> 12

cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa 60

tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa 120 tttcaccctg caggcaaagg agatgagcgt a 151

<210> 13

<211> 1722

<212> DNA

<213> Methylophilus methylotrophus <220>

<223> gene metanol desidrogenase <220>

<221> CDS <222> (1) .. (1722) <400> 13

atg gca gat gca gac ctg gac aag cag gtg aat aca gcc ggt gct tgg 48

Met Ala Asp Ala Asp Leu Asp Lys Gln Val Asn Thr Ala Gly Ala Trp

1 5 10 15

cca att gca acg ggt ggc tac tac age cag cac aac agt ccg ctg gca 96

Pro Ile Ala Thr Gly Gly Tyr Tyr Ser Gln His Asn Ser Pro Leu Ala

20 25 30

caa att aac aaa tcc aac gtt aaa aac gtc aaa gca gcc tgg tca ttt 144

Gln Ile Asn Lys Ser Asn Val Lys Asn Val Lys Ala Ala Trp Ser Phe

35 40 45

tca acg ggt gtc ttg aat ggt cac gaa ggt gcg cca ttg gtc ate ggt 192

Ser Thr Gly Val Leu Asn Gly His Glu Gly Ala Pro Leu Val Ile Gly

50 55 60

gac atg atg tat gtg cac tcc gct ttt cca aac aat act tat gcg ctg 240

Asp Met Met Tyr Val His Ser Ala Phe Pro Asn Asn Thr Tyr Ala Leu 65 70 75 80

aat ctg aac gat cca ggc aag att gtc tgg caa cac aag cct aag caa 288

Asn Leu Asn Asp Pro Gly Lys Ile Val Trp Gln His Lys Pro Lys Gln

85 90 95

gat gct tcc acc aaa gcc gtg atg tgc tgt gac gtg gtt gac cgt ggt 336

Asp Ala Ser Thr Lys Ala Val Met Cys Cys Asp Val Val Asp Arg Gly

100 105 110

ctg gct tac ggc gcg ggg caa att gtt aaa aaa caa gcc aac ggt cac 384

Leu Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Ile Val Lys Lys Gln Ala Asn Gly His

115 120 125

ttg ctg gcg ttg gat gcc aaa act ggc aaa ate aac tgg gaa gta gaa 432

Leu Leu Ala Leu Asp Ala Lys Thr Gly Lys Ile Asn Trp Glu Val Glu

130 135 140

gtg tgt gat cca aaa gtg ggt tca aca ctg aca caa gcg cct ttt gtg 480

Val Cys Asp Pro Lys Val Gly Ser Thr Leu Thr Gln Ala Pro Phe Val 145 150 155 160

gct aaa gac acg gta ttg atg ggg tgt tca ggt gct gag ctg ggt gta 528

Ala Lys Asp Thr Val Leu Met Gly Cys Ser Gly Ala Glu Leu Gly Val

165 170 175

cgt ggt gct gtg aac gcc ttt gac ctg aaa aca ggt gaa ttg aaa tgg 576

Arg Gly Ala Val Asn Ala Phe Asp Leu Lys Thr Gly Glu Leu Lys Trp

180 185 190

cgt gca ttt gca acc ggt tet gat gac tet gtt cgc ctg gcc aaa gac 624

Arg Ala Phe Ala Thr Gly Ser Asp Asp Ser Val Arg Leu Ala Lys Asp

195 200 205

ttc aac agt gca aac cca cat tac ggt caa ttc ggc ctg ggg act aaa 672

Phe Asn Ser Ala Asn Pro His Tyr Gly Gln Phe Gly Leu Gly Thr Lys

210 215 220

acc tgg gaa ggc gat gcc tgg aaa att ggt ggc ggt acc aac tgg ggt 720

Thr Trp Glu Gly Asp Ala Trp Lys Ile Gly Gly Gly Thr Asn Trp Gly 225 230 235 240

tgg tat gcc tat gac cct aaa ttg aac ctg ttc tac tac ggt tca ggt 7 68

Trp Tyr Ala Tyr Asp Pro Lys Leu Asn Leu Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly

245 250 255

aac ccg gcc cca tgg aac gaa acc atg cgt cct ggc gac aac aag tgg 816

Asn Pro Ala Pro Trp Asn Glu Thr Met Arg Pro Gly Asp Asn Lys Trp

260 265 270

acg atg acc ate tgg ggt cgt gac etc gac acc ggc atg gcg aaa tgg 864

Thr Met Thr Ile Trp Gly Arg Asp Leu Asp Thr Gly Met Ala Lys Trp

275 280 285

ggc tac caa aaa acg ccg cat gat gag tgg gac ttt gct ggt gtg aat 912

Gly Tyr Gln Lys Thr Pro His Asp Glu Trp Asp Phe Ala Gly Val Asn

290 295 300

cag atg gtg ctg act gat caa cca gtc aac ggc aaa atg acg ccg ctg 960

Gln Met Val Leu Thr Asp Gln Pro Val Asn Gly Lys Met Thr Pro Leu 305 310 315 320 ctg age cac ate gac cgt aac ggt ate ttg tac aca ctg aac cgc gaa 1008

Leu Ser His Ile Asp Arg Asn Gly Ile Leu Tyr Thr Leu Asn Arg Glu

325 330 335

aac ggc aac ctg ate gtg gct gaa aaa gtg gac ccg gct gtc aac gtg 1056

Asn Gly Asn Leu Ile Val Ala Glu Lys Val Asp Pro Ala Val Asn Val

340 345 350

ttc aaa aaa gtg gac ctg aaa act ggg aca cca gtc cgt gac ccg gaa 1104

Phe Lys Lys Val Asp Leu Lys Thr Gly Thr Pro Val Arg Asp Pro Glu

355 360 365

ttc gcg aca cgt atg gac cat aaa ggc acc aac att tgt cca tcc gcg 1152

Phe Ala Thr Arg Met Asp His Lys Gly Thr Asn Ile Cys Pro Ser Ala

370 375 380

atg ggc ttc cac aac cag ggt gtt gac tet tac gat cca gaa age cgc 1200

Met Gly Phe His Asn Gln Gly Val Asp Ser Tyr Asp Pro Glu Ser Arg

385 390 395 400

acc ttg tac gct ggc ctg aac cac att tgt atg gat tgg gag ccg ttc 1248

Thr Leu Tyr Ala Gly Leu Asn His Ile Cys Met Asp Trp Glu Pro Phe

405 410 415

atg ctg cca tac cgt gcc ggt cag ttc ttc gtt ggt gea acg ctg gcg 1296

Met Leu Pro Tyr Arg Ala Gly Gln Phé Phe Val Gly Ala Thr Leu Ala

420 425 430

atg tac cct ggc ccg aac ggc cca acc aag aaa gaa atg ggt cag att 1344

Met Tyr Pro Gly Pro Asn Gly Pro Thr Lys Lys Glu Met Gly Gln Ile

435 440 445

cgt gea ttt gac ctg acc act ggt aaa gct aaa tgg act aag tgg gag 1392

Arg Ala Phe Asp Leu Thr Thr Gly Lys Ala Lys Trp Thr Lys Trp Glu

450 455 460

aaa ttc gcg gct tgg ggc ggt act ttg tac acc aaa ggt ggc ctg gtt 1440

Lys Phe Ala Ala Trp Gly Gly Thr Leu Tyr Thr Lys Gly Gly Leu Val

465 470 475 480

tgg tat gea acg ctg gat ggt tac ctg aaa gcc ttg gat aac aaa gac 1488

Trp Tyr Ala Thr Leu Asp Gly Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Asn Lys Asp

485 490 495

ggt aaa gag ctg tgg aac ttc aag atg cca tet ggt ggt ate gga tcg 1536

Gly Lys Glu Leu Trp Asn Phe Lys Met Pro Ser Gly Gly Ile Gly Ser

500 505 510

cca atg act tac tcc ttt aaa ggc aag caa tac ate ggc age atg tac 1584

Pro Met Thr Tyr Ser Phe Lys Gly Lys Gln Tyr Ile Gly Ser Met Tyr

515 520 525

ggt gtt ggc ggc tgg cct ggc gtg ggt ctg gtg ttt gac ctg aca gac 1632

Gly Val Gly Gly Trp Pro Gly Val Gly Leu Val Phe Asp Leu Thr Asp

530 535 540

ccg agt gct ggt ttg ggt gcg gtg ggt gcg ttc aga gaa ctg caa aac 1680

Pro Ser Ala Gly Leu Gly Ala Val Gly Ala Phe Arg Glu Leu Gln Asn

545 550 555 560

cac aca caa atg ggc ggt ggc ctg atg gtg ttc age ctg taa 1722

His Thr Gln Met Gly Gly Gly Leu Met Val Phe Ser Leu

565 570

<210> 14 <211> 573 <212> PRT <213> Methylophilus methylotrophus <220> <223> proteína de metanol desidrogenase <400> 14

Met Ala Asp Ala Asp Leu Asp Lys Gln Val Asn Thr Ala Gly Ala Trp 1 5 10 15 Pro Ile Ala Thr 20 Gly Gly Tyr Tyr Ser 25 Gln His Asn Ser Pro 30 Leu Ala Gln Ile Asn Lys Ser Asn Val Lys Asn Val Lys Ala Ala Trp Ser Phe 35 40 Ser Thr Gly Val Leu Asn Gly His 50 55 Asp Met Met Tyr Val His Ser Ala 65 70 Asn Leu Asn Asp Pro Gly Lys Ile 85 Asp Ala Ser Thr Lys Ala Val Met 100 Leu Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Ile 115 120 Leu Leu Ala Leu Asp Ala Lys Thr 130 135 Val Cys Asp Pro Lys Val Gly Ser 145 150 Ala Lys Asp Thr Val Leu Met Gly 165 Arg Gly Ala Val Asn Ala Phe Asp 180 Arg Ala Phe Ala Thr Gly Ser Asp 195 200 Phe Asn Ser Ala Asn Pro His Tyr 210 215 Thr Trp Glu Gly Asp Ala Trp Lys 225 230 Trp Tyr Ala Tyr Asp Pro Lys Leu 245 Asn Pro Ala Pro Trp Asn Glu Thr 260 Thr Met Thr Ile Trp Gly Arg Asp 275 280 Gly Tyr Gln Lys Thr Pro His Asp 290 295 Gln Met Val Leu Thr Asp Gln Pro 305 310 Leu Ser His Ile Asp Arg Asn Gly 325 Asn Gly Asn Leu Ile Val Ala Glu 340 Phe Lys Lys Val Asp Leu Lys Thr 355 360 Phe Ala Thr Arg Met Asp His Lys 370 375 Met Gly Phe His Asn Gln Gly Val 385 390 Thr Leu Tyr Ala Gly Leu Asn His 405 Met Leu Pro Tyr Arg Ala Gly Gln 420 Met Tyr Pro Gly Pro Asn Gly Pro 435 440 Arg Ala Phe Asp Leu Thr Thr Gly 450 455 Lys Phe Ala Ala Trp Gly Gly Thr 465 470 Trp Tyr Ala Thr Leu Asp Gly Tyr 485 Gly Lys Glu Leu Trp Asn Phe Lys 500 Pro Met Thr Tyr Ser Phe Lys Gly 515 520 Gly Val Gly Gly Trp Pro Gly Val

530 535

6

45 Glu Gly Ala Pro Leu Val Ile Gly 60 Phe Pro Asn Asn Thr Tyr Ala Leu 75 80 Val Trp Gln His Lys Pro Lys Gln 90 95 Cys Cys Asp Val Val Asp Arg Gly 105 110 Val Lys Lys Gln Ala Asn Gly His 125 Gly Lys Ile Asn Trp Glu Val Glu 140 Thr Leu Thr Gln Ala Pro Phe Val 155 160 Cys Ser Gly Ala Glu Leu Gly Val 170 175 Leu Lys Thr Gly Glu Leu Lys Trp 185 190 Asp Ser Val Arg Leu Ala Lys Asp 205 Gly Gln Phe Gly Leu Gly Thr Lys 220 Ile Gly Gly Gly Thr Asn Trp Gly 235 240 Asn Leu Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly 250 255 Met Arg Pro Gly Asp Asn Lys Trp 265 270 Leu Asp Thr Gly Met Ala Lys Trp 285 Glu Trp Asp Phe Ala Gly Val Asn 300 Val Asn Gly Lys Met Thr Pro Leu 315 320 Ile Leu Tyr Thr Leu Asn Arg Glu 330 335 Lys Val Asp Pro Ala Val Asn Val 345 350 Gly Thr Pro Val Arg Asp Pro Glu 365 Gly Thr Asn Ile Cys Pro Ser Ala 380 Asp Ser Tyr Asp Pro Glu Ser Arg 395 400 Ile Cys Met Asp Trp Glu Pro Phe 410 415 Phe Phe Val Gly Ala Thr Leu Ala 425 430 Thr Lys Lys Glu Met Gly Gln Ile 445 Lys Ala Lys Trp Thr Lys Trp Glu 460 Leu Tyr Thr Lys Gly Gly Leu Val 475 480 Leu Lys Ala Leu Asp Asn Lys Asp 490 495 Met Pro Ser Gly Gly Ile Gly Ser 505 510 Lys Gln Tyr Ile Gly Ser Met Tyr 525 Gly Leu Val Phe Asp Leu Thr Asp 540 Pro Ser Ala Gly Leu Gly Ala Val Gly Ala Phe Arg Glu Leu Gln Asn

545 550 555 560

His Thr Gln Met Gly Gly Gly Leu Met Val Phe Ser Leu 565 570

<210> 15

<211> 1299

<212> DNA

<213> Escherichia coli <220>

<223> gene fitase <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1299)

<400> 15 atg aaa gcg ate tta ate cca ttt tta Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu 1 5 ccg caa tct gca ttc gct cag agt gag Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu 20 25 gtg gtg att gtc agt cgt cat ggt gtg Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val 35 40 caa ctg atg cag gat gtc acc cca gac Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp 50 55 aaa ctg ggt tgg ctg aca ccg cgc ggt Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly 65 70 gga cat tac caa cgc cag cgt ctg gta Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val 85 aag ggc tgc ccg cag tct ggt cag gtc Lys Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val 100 105 gag cgt acc cgt aaa aca ggc gaa gcc Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala 115 120 gac tgt gca ata acc gta cat acc cag Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln 130 135 ccg tta ttt aat cct cta aaa act ggc Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly 145 150 aac gtg act gac gcg ate ctc age agg Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg 165 ttt acc ggg cat cgg caa acg gcg ttt Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe 180 185 aat ttt ccg caa tca aac ttg tgc ctt Asn Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu 195 200 age tgt tca tta acg cag gca tta cca Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro 210 215 gac aat gtc tca tta acc ggt gcg gta

tct ctt ctg att ccg tta acc 48

Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr

10 15

ccg gag ctg aag ctg gaa agt 96

Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser 30

cgt gct cca acc aag gcc acg 144

Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr 45

gca tgg cca acc tgg ccg gta 192

Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val 60

ggt gag cta ate gcc tat ctc 240

Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu

75 80

gcc gac gga ttg ctg gcg aaa 288

Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys

90 95

gcg att att gct gat gtc gac 336

Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp 110

ttc gcc gcc ggg ctg gca cct 384

Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro 125

gca gat acg tcc agt ccc gat 432

Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp 140

gtt tgc caa ctg gat aac gcg 480

Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala 155 160

gca gga ggg tca att gct gac 528

Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp 170 175

cgc gaa ctg gaa cgg gtg ctt 576

Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu 190

aaa cgt gag aaa cag gac gaa 624

Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu 205

tcg gaa ctc aag gtg age gcc 672

Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala 220

age ctc gca tca atg ctg acg 720 Asp Asn Val Ser Leu Thr 225 230

gag ata ttt ctc ctg caa Glu Ile Phe Leu Leu Gln 245

gga agg ate acc gat tca Gly Arg Ile Thr Asp Ser 260

aac gcg caa ttt tat ttg Asn Ala Gln Phe Tyr Leu 275

cgc gcc acc ccg tta tta Arg Ala Thr Pro Leu Leu 290

cca ccg caa aaa cag gcg Pro Pro Gln Lys Gln Ala 305 310

ttt ate gcc gga cac gat Phe Ile Ala Gly His Asp 325

gag ctc aac tgg acg ctt Glu Leu Asn Trp Thr Leu 340

ggt gaa ctg gtg ttt gaa Gly Glu Leu Val Phe Glu 355

tgg att cag gtt tcg ctg Trp Ile Gln Val Ser Leu 370

aaa acg ccg ctg tca tta Lys Thr Pro Leu Ser Leu 385 390

ctg gea gga tgt gaa gag Leu Ala Gly Cys Glu Glu 405

ggt ttt acg caa ate gtg Gly Phe Thr Gln Ile Val 420

taa

Gly Ala Val Ser Leu Ala 235

caa gea cag gga atg ccg Gln Ala Gln Gly Met Pro 250

cac cag tgg aac acc ttg His Gln Trp Asn Thr Leu 265

cta caa cgc acg cca gag Leu Gln Arg Thr Pro Glu 280

gat ttg ate aag aca gcg Asp Leu Ile Lys Thr Ala 295 300

tat ggt gtg aca tta ccc Tyr Gly Val Thr Leu Pro 315

act aat ctg gea aat ctc Thr Asn Leu Ala Asn Leu 330

ccc ggt cag ccg gat aac Pro Gly Gln Pro Asp Asn 345

cgc tgg cgt cgg cta age Arg Trp Arg Arg Leu Ser 360

gtc ttc cag act tta cag Val Phe Gln Thr Leu Gln 375 380

aat acg ccg ccc gga gag Asn Thr Pro Pro Gly Glu 395

cga aat gcg cag ggc atg Arg Asn Ala Gln Gly Met 410

aat gaa gea cgc ata ccg Asn Glu Ala Arg Ile Pro 425

Ser Met Leu Thr 240

gag ccg ggg tgg 7 68

Glu Pro Gly Trp 255

cta agt ttg cat 816

Leu Ser Leu His 270

gtt gcc cgc age 864

Val Ala Arg Ser

285

ttg acg ccc cat 912

Leu Thr Pro His

act tca gtg ctg 960

Thr Ser Val Leu 320

ggc ggc gea ctg 1008

Gly Gly Ala Leu 335

acg ccg cca ggt 1056

Thr Pro Pro Gly 350

gat aac age cag 1104

Asp Asn Ser Gln

365

cag atg cgt gat 1152

Gln Met Arg Asp

gtg aaa ctg acc 1200

Val Lys Leu Thr 400

tgt tcg ttg gea 1248

Cys Ser Leu Ala 415

gcg tgc agt ttg 1296

Ala Cys Ser Leu 430

1299

<210> 16 <211> 432 <212> PRT

<213> Escherichia coli <220>

<223> proteína fitase <400> 16

Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr 15 10 15

Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser

20 25 30

Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr

35 40 45

Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val

50 55 60

Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu 65 70 75 80

Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys

85 90 95

Lys Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp 100 105 110

Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro

115 120 125

Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp

130 135 140

Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala 145 150 155 160

Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp

165 170 175

Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu

180 185 190

Asn Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu

195 200 205

Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala

210 215 220

Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr 225 230 235 240

Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp

245 250 255

Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His

260 265 270

Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser

275 280 285

Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His

290 295 300

Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu 305 310 315 320

Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu

325 330 335

Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly

340 345 350

Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln

355 360 365

Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp

370 375 380

Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr 385 390 395 400

Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala

405 410 415

Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu 420 425 430

<210> <211> <212>

17 81 DNA

<213> Methylophilus methylotrophus

<220> <223>

<220> <221> <222>

gene codificando uma seqüência de sinal de metanol desidrogenase

CDS (1)··(81)

<400> 17

atg aaa ctg aaa tca Met Lys Leu Lys Ser 1 5

ttg ttt gca age att Leu Phe Ala Ser Ile 20

tcc cgt gcc gtt gtt ggc gct ttg gtt ggg ggc Ser Arg Ala Val Val Gly Ala Leu Val Gly Gly

10 15

tcc ggc ctg gct gtg gca Ser Gly Leu Ala Val Ala 25

81 <210> 18 <211> 27 <212> PRT

<213> Methylophilus methylotrophus <220>

<223> seqüência de sinal de metanol desidrogenase <400> 18

Met Lys Leu Lys Ser Ser Arg Ala Val Val Gly Ala Leu Val Gly Gly 1 5 10 15

Leu Phe Ala Ser Ile Ser Gly Leu Ala Val Ala 20 25

<210> 19

<211> 66

<212> DNA

<213> Methylophilus methylotrophus <220>

<223> gene codificando uma seqüência de sinal de fitase <220>

<221> CDS

<222> (1)..(66)

<4 00> 19

atg aaa gcg ate tta ate cca ttt tta tet ctt ctg att ccg tta acc 48

Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr 15 10 15

ccg caa tet gea ttc gct 66

Pro Gln Ser Ala Phe Ala 20

<210> 20 <211> 22 <212> PRT

<213> Methylophilus methylotrophus <220>

<223> seqüência de sinal de fitase <400> 20

Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr 1 5 10 15

Pro Gln Ser Ala Phe Ala 20

<210> 21 <211> 864 <212> DNA <213> Methylophilus methylotrophus <220> <223> promoter of sigma E gene <400> 21

gatcaaaaac gatttggcat gcggatggta aaggcaggtg gggtgaaact gcacaaattc 60

caggttggct acccggcaac cggcccgcca tcccatcgca atcccgtcac cggtactgat 120 gtctgggttg gtggtatata agtagacctt gcctgcgccg cctgttgcca tcacggtgta 180

ttgtgcggag agagtaatca ccttgccgga ctggttgttg agcacatagg cgcccaggca 240

acggttgggg ccgtccgttg cggtctgctt gaagagttta tgcgtggtga tcagatcgac 300

tgcaatgtga tgttcaagga tggtgatatt cgggtgctcg cgcacacggt cggtcaaggt 360

tgtctgcacc gcttgtccgg tggcatcagc gacatgcacc acgcggcgat ggctatggcc 420

gccttcacgc gtcaggtgca ggcggtcatc ttcagcctcg cgggtaaaat taaccccttg 480

ctgtaataac cattcaatac tggcacggcc attggtgacc accatgcgcg tgacctcgct 540

gtcacataat ccagcgccgg catccaatgt atctttaata tgggcttcta ctgaatcctc 600

gttgttaaga actgcagcaa tccccccctg cgcccagttg ctggcactca tggttaattc 660

acgtttgctc agtatgcata ccctatgatt atctgccagg cgtaaggcca atgactggcc 720

tgccagacca ctgccaataa tcagcacatc gaacatttta ttcataggat ggtggggtca 780

atggaacttt gaagagatgt tcaggtcata tcaattgcca acattgctat ttgacattgt 840

aggcaaaaaa taagggatga gacg 864

<210> 22

<211> 1276

<212> DNA

<213> Methylophilus methylotrophus

<220> <223>

promotor de gene de proteína de ribossoma

<400> 22

gatctggcac

gataaaatag

atattgaaca

aaaaaactgc

gcctggtggc

ggcctgctgt

attatcatga

agcctggaga

taatcgcctg

aaaaagggtt

aatcgtgttt

ccgcgcacaa

tcaacttgcc

gtgcagccag

acgtcacctg

ggaaaaatcc

agggttgtga

acaccggcag

gccgggatga

aatctgccat

gcaaagagca

atttaaggag

aaacattgaa cgtttgttac aacttccagg caaaatggtg aagacggtga ttaccttctg aagggccagg atccacccag tttttcaacc ggctctgaag attgttcacc atcacaggca tacccaattc gaagtgctgg accatctcga aaaaccatcg atacgctggt gcttaccctt atcgcaaggt tgcaaagcgg cacaggtggt tttcaa

caattaggca gcacagactg tggagtacgc gctggtgggg tttgctgacg gttttttata ctatgtatca agaggaataa ttgccacact gtggctttaa ctgaccagag atggcggcaa aaaaagtaca aagagctgga ctaaaacagc taggtgatgc gattgcggca gttgcgattg gcagtgtcag cgatcaaatc actgcacata

gtctcccttt

agcatttttt

taccccagcc

acagtactgt

catgatattg

ggcgcgatga

gacccttatt

gtgcttgatt

ttgttcgtga

accacaagga

tgaacaagtg

catccaccgt

caaagcgcac

gcatggcttc

cgtcacagca

acctgctgcg

accattcact.

caattgcaac

ttacccgcag

aaagtaaaag

caagagttac

ccaaattaaa ctgttaggta ataaagaatg tcgcagcccc agcgtacctc tgattggcct acctacccaa gcaacatgaa ccttttaagt aatctcatgc cctgcgatga ctggaagact tatgtgttga aaatttaacg ccaagcccaa accactgagg ctgttgaagc atgattcaga tactgattgg ggtttttggc agcgaataca

tcgtgtattg atcaatgggc gcagttatta tattgtgcat catgtttctg gatagtgatc ggaagacaaa aatcagttta gttttgacac gacactatga ttgagcgtta ggggccgccg tgaacatcga atgctgtatt tgatgaaaga cagctgctta gttgcgttac acagcaagaa tgaaaaagcc acaacgcagt gtattaaaga

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1276

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<4 00> 23

cccggatccg cacggatcac tgtattcggc tgcaacttt

39

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR <400> 24

cccggatccc cgtgttgcta ggatggttgt tcttggatca 40

<210> 25

<211> 750

<212> DNA

<213> Morganella morganii <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (747)

<220>

<223> gene codificando fosfatase ácida

<4 00> . 25 atg aag aag aat att ate Met Lys Lys Asn Ile Ile 1 5 tcc gcg ctg gcc gcg ate Ser Ala Leu Ala Ala Ile 20 gat tta tat tat ctg aaa Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys 35 tta ccg cca ccg ccg gaa Leu Pro Pro Pro Pro Glu 50 gea atg tat gag aaa ggc Ala Met Tyr Glu Lys Gly 65 70 cag gea cag gea gat gct Gln Ala Gln Ala Asp Ala 85 ttt tca ggg gea ttc ggc Phe Ser Gly Ala Phe Gly 100 ctg tat aaa ctg ctg acc Leu Tyr Lys Leu Leu Thr 115 acc cgc tcc gcc aaa gaa Thr Arg Ser Ala Lys Glu 130 tac ggc aca gaa acc tgt Tyr Gly Thr Glu Thr Cys 145 150 aac gga tet tac ccg tca Asn Gly Ser Tyr Pro Ser 165 ctg gtg ctg gcg gaa gtg Leu Val Leu Ala Glu Val 180 cgg ggt tat cag CtC gga Arg Gly Tyr Gln Leu Gly 195 cag agt gat gtg gat gcc Gln Ser Asp Val Asp Ala

gcc ggt tgt ctg ttc tca

Ala Gly Cys Leu Phe Ser 10

ccg gcg ggc aac gat gcc

Pro Ala Gly Asn Asp Ala 25

aat gaa cag gct ate gac

Asn Glu Gln Ala Ile Asp 40

gtc ggc agt att cag ttt

Val Gly Ser Ile Gln Phe

55 60

cgt atg ctg cgc aat acc

Arg Met Leu Arg Asn Thr 75

gac ctg gcc gea ggg ggt

Asp Leu Ala Ala Gly Gly 90

tat ccg ata acc gaa aaa

Tyr Pro Ile Thr Glu Lys 105

aat atg att gag gat gcc

Asn Met Ile Glu Asp Ala 120

cat tac atg cgc ate cgg His Tyr Met Arg Ile Arg 135 140

aat acc aaa gat cag aaa Asn Thr Lys Asp Gln Lys 155

ggt cat acg tet ate ggc Gly His Thr Ser Ile Gly 170

aac ccg gea aat cag gat Asn Pro Ala Asn Gln Asp 185

cag age cgg gtg att tgc Gln Ser Arg Val Ile Cys 200

gcg cgg att gtc ggt tca Ala Arg Ile Val Gly Ser

ctg ttt tcc ctt 48

Leu Phe Ser Leu 15

acc acc aag ccg 96

Thr Thr Lys Pro 30

age ctg aaa ctg 144

Ser Leu Lys Leu 45

tta aat gat cag 192

Leu Asn Asp Gln

gag cgc gga aaa 240

Glu Arg Gly Lys 80

gtg gea acc gea 288

Val Ala Thr Ala 95

gac tet ccg gag 336

Asp Ser Pro Glu 110

ggt gat ctt gcc 384

Gly Asp Leu Ala 125

ccg ttt gcg ttt 432

Pro Phe Ala Phe

aaa etc tcc acc 480

Lys Leu Ser Thr 160

tgg gea acc gea 528

Trp Ala Thr Ala 175

gcg att ctg gaa 576

Ala Ile Leu Glu 190

ggc tat cac tgg 624

Gly Tyr His Trp

205

gcc gct gtc gcg 672

Ala Ala Val Ala 210 215 220 aca tta cat tcc gat ccg gca ttt cag gcg cag tta gcg aaa gcc aaa Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys 225 230 235 240 cag gaa ttt gca caa aaa tca cag aaa taa Gln Glu Phe Ala Gln 245 Lys Ser Gln Lys

<210> 26

<211> 249

<212> PRT

<213> Morganella morganii <220>

<223> gene codificando fosfatase ácida

<4 00> 26

Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Leu Ala 20 Ala Ile Pro Ala Gly 25 Asn Asp Ala Thr Thr 30 Lys Pro Asp Leu Tyr 35 Tyr Leu Lys Asn Glu 40 Gln Ala Ile Asp Ser 45 Leu Lys Leu Leu Pro 50 Pro Pro Pro Glu Val 55 Gly Ser Ile Gln Phe 60 Leu Asn Asp Gln Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 65 70 75 80 Gln Ala Gln Ala Asp 85 Ala Asp Leu Ala Ala 90 Gly Gly Val Ala Thr 95 Ala Phe Ser Gly Ala 100 Phe Gly Tyr Pro Ile 105 Thr Glu Lys Asp Ser 110 Pro Glu Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120 125 Thr Arg 130 Ser Ala Lys Glu His 135 Tyr Met Arg Ile Arg 140 Pro Phe Ala Phe Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr 145 150 155 160 Asn Gly Ser Tyr Pro 165 Ser Gly His Thr Ser 170 Ile Gly Trp Ala Thr 175 Ala Leu Val Leu Ala 180 Glu Val Asn Pro Ala 185 Asn Gln Asp Ala Ile 190 Leu Glu Arg Gly Tyr 195 Gln Leu Gly Gln Ser 200 Arg Val Ile Cys Gly 205 Tyr His Trp Gln Ser 210 Asp Val Asp Ala Ala 215 Arg Ile Val Gly Ser 220 Ala Ala Val Ala Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys 225 230 235 240 Gln Glu Phe Ala Gln 245 Lys Ser Gln Lys

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência

<220>

<223> Iniciador

artificial PCR

<4 00> 27

gcatttccgg cctggctgtg gcagcgatcc cggcgggcaa cgatgccacc

50 <210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 28

ttatttctgt gatttttgtg caaattcc

28

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 29

tgccacagcc aggccggaaa tgcttgcaaa caagc

35

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 30

ggcaagcttc tgttcctgca cctgcatggc atggcgcgc

39

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 31

actttctccc aatctcttaa gaatgcg

27

<210> 32

<211> 46

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 32

ttcttaagag attgggagaa agtatgaaag cgatcttaat cccatt

46

<210> 33 <211> 32 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR <400> 33

ggcggtacca cagttcttcg tttgtcatca gc 32

<210> 34

<211> 51

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 34

ttcttaagag attgggagaa agtatgaaga agaatattat cgccggttgt c

51

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador PCR

<4 00> 35

agcttcagct ccggctcact ctgggccagc gcggaaaggg aaaac

45

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador PCR

<4 00> 36

ttggaattcc ccgttctgga taatgttttt tgc 33

<210> 37

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<4 00> 37

tacgctcatc tcctttgcct gcaggg

26

<210> 38

<211> 46

<212> DNA

<213> Seqüência

artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 38

tgcaggcaaa ggagatgagc gtaatgaaac tgaaatcatc ccgtgc 46

<210> 39

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador PCR

<400> 39

gccgaattca cagttcttcg tttgtcatca gc

32

Claims (9)

1. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma bactéria que assimila metanol tendo uma construção de DNA que contenha uma seqüência promotora que funcione na Em outras formas de realização, a presente invenção fornece bactéria que assimila metanol e uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo contendo uma seqüência de sinal e uma seqüência da proteína alvo que está operavelmente conectada à seqüência promotora, em um meio líquido contendo metanol como uma fonte principal de carbono para permitir que a bactéria secrete a proteína alvo e recuperar a proteína alvo secretada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seqüência promotora que funciona na bactéria que assimila metanol é selecionada do grupo que consiste de um promotor da metanol desidrogenase, um promotor tac, um promotor σΕ e um promotor de proteína Em outras formas de realização, a presente invenção forneceribossômica.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seqüência promotora é uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 11, 12,21 ou 22.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de -1 a 3, caracterizado pelo fato de que a seqüência de sinal é uma seqüência de sinal de uma proteína selecionada da metanol desidrogenase, fitase e fosfatase ácida.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de -1 a 3, caracterizado pelo fato de que a seqüência de sinal tem uma seqüência de aminoácido selecionada da SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de -1 a 5, caracterizado pelo fato de que a bactéria que assimila metanol é uma bactéria selecionada do grupo que consiste de bactérias pertencentes aos gêneros Metilophilus, Metilobacillus, Metilophaga, Aehromobaeter, Pseudomonas, Protaminobacter, Metanomonas, Microcyclus e Metilobaetéria.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de -1 a 6, caracterizado pelo fato de que a proteína é selecionada do grupo que consiste de fitase, interleucina, transglutaminase, interferon, insulina, fosfatase ácida e peptídeo sintase.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de -1 a 7, caracterizado pelo fato de que a bactéria que assimila metanol é uma bactéria que assimila metanol forçada.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a bactéria que assimila metanol forçada é selecionada do grupo que consiste de bactérias pertencentes aos gêneros Metilophilus, Metilobacillus e Metilophaga.