BRPI0609762A2

BRPI0609762A2 - uso de um agente que reduza o nìvel de il-21 e/ou il-21r, e, método para identificar um composto para tratar, melhorar ou prevenir a fibrose ou um distúrbio associado com a fibrose em um indivìduo

Info

Publication number: BRPI0609762A2
Application number: BRPI0609762-6A
Authority: BR
Inventors: Deborah A Young; Thomas A Wynn; Mary Collins; Michael Grusby
Original assignee: Wyeth Corp; Us Gov Health & Human Serv; Harvard College
Priority date: 2005-04-14
Filing date: 2006-04-13
Publication date: 2010-04-27
Also published as: US20110142833A1; TW200716171A; SG161286A1; RU2007138011A; KR20080017009A; CA2604604A1; CR9428A; CN101287759A; EP2436695A1; IL186599A0; US20060257403A1; ZA200708756B; AR057274A1; RU2419450C2; JP2008538553A; AU2006236755A1; EP1871800A1; GT200600148A; PE20070316A1; NO20075193L

Abstract

USO DE UM AGENTE QUE REDUZA O NìVEL DE IL-21 E/OU IL-21R,E, METODO PARA IDENTIFICAR UM COMPOSTO PARA TRATAR, MELHORAR OU PREVENIR A FIBROSE OU UM DISTúRBIO ASSOCIADO COM A FIBROSE EM UM INDIVìDUO. A presente invenção fornece métodos de triar quanto a composições úteis para tratar, melhorar ou prevenir a fibrose e/ou condições associadas com a fibrose pela medição de mudanças no(s) nível(is) de IL-21 e/ou receptor de IL-21 (IL-21 R) (por exemplo, o nível de expressão da proteína e/ou mRNA de IL-21 e/ou IL-21 R, o nível de atividade de IL-21 e/ou IL-21R, o nível de interação de IL-21 com 1L-21R). A invenção fornece ainda antagonistas de IL-21 ou IL-21R para o tratamento de fibrose e/ou condições associadas com a fibrose. Ainda são aqui fornecidos métodos de diagnosticar, prognosticar e monitorar o progresso (por exemplo, o curso de tratamento) da fibrose e/ou condições associadas com a fibrose pela medição do nível de IL-21 e/ou IL-21R (isto é, o nível de atividade de 11-21 e/ou IL-21R, o nível de expressão de IL-21 e/ou IL-21R (por exemplo, o nível de IL-21 e/ou produtos de gene de IL-21R), e/ou o nível de interação de IL-2 1 com IL-21R).

Description

"MÉTODO PARA TRATAR, MELHORAR OU PREVENIR, PARAIDENTIFICAR UM COMPOSTO PARA TRATAR, MELHORAR OUPREVENIR A FIBROSE OU UM DISTÚRBIO ASSOCIADO COM AFIBROSE, PARA MONITORAR O PROGRESSO DA FIBROSE OU DEUMA CONDIÇÃO ASSOCIADA COM A FIBROSE, E PARAPROGNOSTICAR E PARA DIAGNOSTICAR A FIBROSE OU UMACONDIÇÃO ASSOCIADA COM A FIBROSE EM UM INDIVÍDUO"

Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido dePatente Provisório US No 60/671.374, depositado em 14 de abril de 2005, queé por meio deste aqui incorporado por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito aos métodos para tratar eprevenir a fibrose e condições associadas com a fibrose.

Técnica Fundamental Relacionada

Lesão a qualquer órgão tipicamente leva a uma respostafisiológica envolvendo a hemostase induzida por plaqueta, seguida por uminfluxo de células inflamatórias e fibroblastos ativados. As citocinasproduzidas por estes tipos de célula direcionam a formação de nova matrizextracelular e vasos sangüíneos, que coletivamente formam tecido degranulação. A formação de tecido fibroso é parte do processo benéfico normalde cicatrização a seguir do ferimento; a fibrose, entretanto, é uma condiçãocaracterizada por um acúmulo anormal de uma matriz de colágeno a seguir doferimento ou inflamação que altera a estrutura e função de vários tecidos. Afibrose progressiva nos rins, fígado, pulmão, coração, osso, medula óssea epele é uma causa principal de ou contribuinte para a morte.

Muitas das doenças associadas com a proliferação de tecidofibroso são crônicas e freqüentemente debilitantes e incluem, por exemplo,doenças de pele tais como escleroderma. Algumas, incluindo fibrosepulmonar, podem ser fatais, devido em parte ao fato de que os tratamentoscorrentes têm efeitos colaterais significantes e no geral não são eficazes emdiminuir ou deter a progressão da fibrose. Existe, consequentemente, umanecessidade contínua quanto a novos agentes anti-fibróticos.

O receptor de IL-21 (DL-21R) é um membro recém descobertoda família de receptor de citocina da classe I (Parrish-Novak et al. (2000)Nature 408:57-63; Ozaki et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 97: 11439-44). O receptor de IL-21 mostra homologia de seqüência e estruturalsignificantes com a cadeia do receptor alfa de EL-4(IL-4R() e está adjacente à IL-4R(nos genomas humano e decamundongo, enquanto que o seu ligando, IL-21, compartilha homologiasignificante com as citocinas IL-2, IL-4 e IL-15 (Sivakumar et al. (2004)Immunology 112: 177-82; Habib et al. (2003) J. Allergy Clin. Immunol. 112:1033-45). A IL-21 e IL-21R são assim membros recém descritos da rede decitocina dependente da cadeia gama ((c) por causa da sua homologia comcitocinas e receptores que requerem a (c para a sinalização funcional(Vosshenrich e Di Santo (2001) Curt: Biol. 11: RI 75-77). Porque todos osmembros da rede (c exibem papéis importantes e únicos na imunidade dohospedeiro, tem havido interesse crescente na dissecação das novos funçõesda IL-21R durante as respostas imunes deflagradas por antígeno in vivo.

Estudos iniciais que examinam a função de IL-21 mostrou quea expansão da célula NK é antagonizada, ao passo que a imunidade de célulaT específica de antígeno é promovida pela IL-21, incluindo a imunidade anti-tumor (Ma et al. (2003) J. Immunol. 171: 60815; Kishida et al. (2003) Mol.Then 8: 552-58; Di Cario et al. (2004) J. Immunol. 172: 1540-47),descobertas que sugerem que a IL-21 serve como uma ponte entre asrespostas imunes inatas e adaptivas (Collins et al. (2003) Immunol. Res. 28:131-40). A IL-21 também regula a função da célula B e célula T CD8+ invivo (Ozaki et al. (2002) Science 298: 1630-34; Suto et al. (2002) Blood 100:4565-73; Mehta et al. (2003) J. Immunol. 170: 4111-18; Pene et al. (2004) J.Immunol. 172: 5154-57; Jin et al. (2004) J. Immunol. 173: 657-65; Zeng et al.(2005) J. Exp. Med. 201: 139-48). Estudos adicionais sugerem que a EL-21seja uma citocina TH2 que pode inibir a diferenciação de células TH ingênuasem células TH1 que secretam EFN-(( Wurster et al. (2002) J. Exp. Med. 196:969-77). Na verdade, o tratamento exógeno com IL-21 potencialmente inibiua produção de IFN-(sem afetar outras citocinas associadas com TH1/TH2,sugerindo que a repressão de IFN-(pela EL-21 é altamente específica. Assim,em virtude da sua capacidade para suprimir o desenvolvimento de célulasTH1, foi levantada a hipótese de que a EL-21 poderia promover respostas TH2(Wurster et al., supra). Não obstante, o envolvimento do caminho dasinalização de IL-21R no desenvolvimento da resposta TH2 não foipreviamente investigado em nenhum distúrbio dependente de TH2.

Na esquistossomose, as citocinas TH2 desempenham um papelindispensável na patogênese da doença (Wynn (2004) Nat. Rev. Immunol. 4:583-594;. Pearce e MacDonald (2002) Nat. Rev. Immunol. 2: 499-511). Naverdade, camundongos deficientes em IL-4/IL-13, IL-4R(e Stat6 todosmostram a formação de granuloma significantemente prejudicada e fibrosehepática a seguir da infecção com S. mansoni (Chiaramonte et al. (1999) J.Clin. Invest. 104: 777-85; Kaplan et al. (1998) J. Immunol. 160: 185056;Jankovic et al. (1999) J. Immunol. 163: 337-42; Fallon et al. (2000) J.Immunol. 164: 2585-91). Dada a classificação recente de IL-21 como umacitocina TH2 (Wurster et al. (2002), supra; Mehta et al. (2005). Proc. Natl.Acad. Sei. USA. 102: 2016-21), as similaridades impressionantes entre psreceptores de IL-4 e EL-21 (Sivakumar et al., supra; Habib et al., supra) e opapel crítico do caminho da sinalização de IL-4Ra/Stat6 relacionado nestadoença assim como em outros distúrbios inflamatórios direcionados com acitocina TH2 (Wynn (2003) Annu. Rev. Immunol. 21: 425-56), uma questãoimportante que se desenvolve destes estudos foi se a sinalização de IL-21Rdesempenha um papel significante no início e/ou manutenção da imunidadedeTH2.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos de tratar, melhorar ouprevenir a fibrose ou um distúrbio associado com a fibrose, assim comométodos de triar quanto a compostos e composições úteis nestes métodos. Ainvenção também fornece métodos de diagnosticar, prognosticar e monitoraro progresso (por exemplo, o curso de tratamento) da fibrose e/ou condiçõesassociadas com a fibrose. Estes métodos são relacionados com a medição e/oumodulação do nível de IL-21 e/ou IL-21R (isto é, o nível de atividade de IL-21 e/ou IL-21R, o nível de expressão de EL-21 e/ou IL-21R (por exemplo, onível de produtos de gene de IL-21 e/ou IL-21R), e/ou o nível de interação deIL-21 com IL-21R). A invenção fornece ainda antagonistas de IL-21 ou IL-2 IR para o tratamento de fibrose e/ou condições associadas com a fibrose.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um métodopara tratar, melhorar ou prevenir a fibrose ou um distúrbio associado com afibrose em um paciente (por exemplo, um ser humano) que compreendeadministrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agenteque reduza o nível de IL-21 e/ou IL-21R no paciente. Em uma outra forma derealização, o agente é um antagonista de IL-21/IL-21R selecionado do grupoque consiste de um anticorpo anti-IL-21R, um anticorpo anti-IL-21, umfragmento de ligação de antígeno de um anticorpo anti-IL-21R, um fragmentode ligação de antígeno de um anticorpo anti-IL-21 e um fragmento solúvel deuma IL-21R. Ainda em uma outra forma, o agente é um fragmento solúvel deuma IL-21R e o fragmento solúvel da EL-21R compreende uma seqüência deaminoácido que seja pelo menos 90 % idêntica a uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 538 daSEQ ID NO: 2, aminoácidos de 20 a 538 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1a 235 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 20 a 235 da SEQ ID NO: 2,aminoácidos de 1 a 236 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 20 a 236 da SEQID NO: 2, aminoácidos de 1 a 529 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 20 a529 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a 236 da SEQ ID NO: 5 eaminoácido 20-236 da SEQ ID NO: 5. Em uma outra forma de realização, ofragmento solúvel da IL-21R se liga a um polipeptídeo de IL-21.

Em uma outra forma de realização, o agente é um fragmentosolúvel de uma IL-21R e o fragmento solúvel da IL-21R compreende umaseqüência de aminoácido que é substancialmente idêntica à seqüência deaminoácido apresentada na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27. Em uma outra forma de realização, aseqüência de aminoácido do fragmento solúvel da IL-21R compreende umaseqüência de aminoácido que é substancialmente idêntica à seqüência deaminoácido apresentada na SEQ ID NO: 11. ou SEQ ID NO: 13. Em umaoutra forma de realização, o agente é um fragmento solúvel de uma IL-21R eo fragmento solúvel da IL-21R é codificado por uma seqüência denucleotídeo que é substancialmente idêntica à seqüência de nucleotídeoapresentada na SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ IDNO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24ou SEQ ID NO: 26. Em uma outra forma de realização, o fragmento solúvelda IL-21R é codificado por uma seqüência de nucleotídeo que ésubstancialmente idêntica à seqüência de nucleotídeo apresentada na SEQ IDNO: 12 ou SEQ ID NO: 16.

Em uma outra forma de realização, o agente é um fragmentosolúvel de uma IL-21R e o fragmento solúvel da IL-21R compreende umdomínio extracelular de IL-21R e um fragmento Fc da imunoglobulina. Emuma outra forma de realização, a seqüência de aminoácido do domínioextracelular da IL-21R compreende uma seqüência de aminoácido que sejapelo menos 90 % idêntica aos aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 2 ouaminoácidos de 20 a 235 da SEQ ID NO: 2. Em uma outra forma derealização, o fragmento Fc da imunoglobulina tem uma função alterada.Ainda em uma outra forma, o fragmento Fc da imunoglobulina tem aseqüência de aminoácido dos aminoácidos de 244 a 467 da SEQ DD NO: 17.

Em uma outra forma de realização, a fibrose ou distúrbioassociado com a fibrose afeta o fígado, epiderme, endoderme, músculo,tendão, cartilagem, coração, pâncreas, pulmão, útero, sistema nervoso,testículos, ovário, glândula adrenal, artéria, veia, cólon, intestino delgado,trato biliar ou estômago. Em uma outra forma de realização, a fibrose oudistúrbio associado com a fibrose são fibrose pulmonar intersticial. Em umaoutra forma de realização, a fibrose ou distúrbio associado com a fibrose são oresultado de uma infecção com esquistossoma. Em uma outra forma derealização, a fibrose ou distúrbio associado com a fibrose são o resultado dacicatrização de ferimento. Em uma outra forma de realização, a cicatrizaçãode ferimento resulta de uma incisão cirúrgica.

Em uma outra forma de realização, a invenção compreendeainda administrar ao paciente pelo menos um agente terapêutico adicional.Em uma outra forma de realização, o pelo menos um agente terapêuticoadicional é selecionado do grupo que consiste de inibidores de citocina,inibidores do fator de crescimento, imunossupressores, agentes antiinflamatórios, inibidores metabólicos, inibidores de enzima, agentescitotóxicos e agentes citostáticos. Em uma outra forma de realização, o pelomenos um agente terapêutico adicional é selecionado do grupo que consistede antagonistas de TNF, agentes anti-TNF, antagonistas de IL-12,antagonistas de IL-15, antagonistas de IL-17, antagonistas de IL-18,antagonistas de IL-22, agentes esgotadores de célula T, agentes esgotadoresde célula B, ciclosporina, FK506, CCI-779, etanercept, infliximab, rituximab,adalimumab, prednisolona, azatioprina, ouro, sulfasalazina,hidroxicloroquina, minociclina, anaquinra, abatacept, metotrexato,leflunomida, rapamicina, análogos de rapamicina, inibidores de Cox-2,inibidores de cPLA2, NSAIDs, inibidores p38, antagonistas de B7.1, B7.2,ICOSL, ICOS e/ou CD28 e agonistas de CTLA4.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um

método para identificar um composto para tratar, melhorar ou prevenir afibrose ou um distúrbio associado com a fibrose em um paciente, quecompreende: (a) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R em uma célula ouamostra de interesse; (b) contatar a célula ou amostra de interesse com umcomposto; e (c) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R na célula ou amostra deinteresse a seguir do contato com o composto, em que um nível mais baixo deIL-21 e/ou IL-21R na célula ou amostra de interesse contatada, emcomparação com o nível de IL-21 e/ou IL-21R na célula ou amostra deinteresse não contatada, identifica o composto como um composto útil paratratar, melhorar ou prevenir a fibrose ou uma condição associada com afibrose em um paciente.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece ummétodo para identificar um composto para tratar, melhorar ou prevenir afibrose ou um distúrbio associado com a fibrose em um paciente, quecompreende: (a) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R em uma célula ouamostra de interesse; (b) contatar a célula ou amostra de interesse com umcomposto; (c) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R na célula ou amostra deinteresse a seguir do contato com o composto; e (d) comparar o nível de IL-21e/ou IL-21R na célula ou amostra de interesse contatadas com um nível dereferência de IL-21 e/ou IL-21R, em que um nível mais baixo de IL-21 e/ouIL-21R na célula ou amostra de interesse contatadas, em comparação com onível de referência de IL-21 e/ou IL-21R, identifica o composto como umcomposto útil para tratar, melhorar ou prevenir a fibrose ou uma condiçãoassociada com a fibrose em um paciente.Em uma outra forma de realização, a invenção fornece ummétodo para monitorar o progresso da fibrose ou uma condição associadacom a fibrose em um paciente, que compreende: (a) medir o nível de IL-21e/ou IL-21R em uma célula ou amostra de interesse do paciente em umprimeiro ponto de tempo; e (b) medir o nível de EL-21 e/ou EL-21R em umacélula ou amostra de interesse do paciente em um segundo ponto de tempo,em que um nível mais baixo de IL-21 e/ou IL-21R na célula ou amostra deinteresse do paciente no segundo ponto de tempo, em comparação com onível de IL-21 e/ou BL-21R na célula ou amostra de interesse do paciente noprimeiro ponto de tempo, fornece uma indicação de que a fibrose ou condiçãoassociada com a fibrose diminuiu em gravidade.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece ummétodo para prognosticar a fibrose ou uma condição associada com a fibroseem um paciente, que compreende: (a) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R emuma célula ou amostra de interesse do paciente em um primeiro ponto detempo; e (b) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R em uma célula ou amostra deinteresse do paciente em um segundo ponto de tempo, em que um nível maisbaixo de IL-21 e/ou EL-21R na célula ou amostra de interesse do paciente nosegundo ponto de tempo, em comparação com o nível de IL-21 e/ou IL-21Rna célula ou amostra de interesse do paciente no primeiro ponto de tempo,indica uma probabilidade diminuída de que o paciente desenvolverá fibroseou a condição associada com a fibrose ou uma probabilidade diminuída deque a fibrose ou condição associada com a fibrose piorará no paciente.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece ummétodo para prognosticar a fibrose ou uma condição associada com a fibroseem um paciente, que compreende: (a) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R emuma célula ou amostra de interesse do paciente; e (b) comparar o nível de IL-21 e/ou IL-21R na célula ou amostra de interesse do paciente a um nível dereferência de IL-21 e/ou IL-21R, em que um nível mais baixo de IL-21 e/ouIL-21R na célula ou amostra de interesse do paciente, em comparação com onível de referência de EL-21 e/ou EL-21R, indica uma probabilidade diminuídade que o paciente desenvolverá fibrose ou a condição associada com a fibroseou uma probabilidade diminuída de que a fibrose ou condição associada coma fibrose piorará no paciente.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece ummétodo para diagnosticar a fibrose ou uma condição associada com a fibroseem um paciente, que compreende: (a) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R emuma célula ou amostra de interesse do paciente e (b) comparar o nível de IL-21 e/ou IL-2IR na célula ou amostra de interesse do paciente com um nível dereferência de IL-21 e/ou IL-21R, em que um nível mais alto de IL-21 e/ou TL-2IR na célula ou amostra de interesse do paciente, em comparação com onível de referência de IL-21 e/ou IL-21R, indica a presença de fibrose ou acondição associada com a fibrose no paciente.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A FIG. 1 representa a seqüência de cDNA de tamanho naturalde IL-21 R/MU-1 murino. A seqüência de nucleotídeo corresponde aosnucleotídeos 1 a 2628 da SEQ ID NO: 4.

As FIGS. 2A e 2B representam as seqüências de aminoácidode IL-21 R/MU-1 de murino e ser humano. A FIG. 2A representa a seqüênciade aminoácido de IL-21 R/MU-1 de murino (que corresponde aos aminoácidosde 1 a 529 da SEQ ID NO: 5). Existe uma seqüência líder (prognosticada peloSPScan com uma contagem de 10.1) nos aminoácidos de 1 a 19 (tipo emnegrito). Um domínio de transmembrana prognosticado (sublinhado) éencontrado nos aminoácidos de 237 a 253 da SEQ ID NO: 5. Os motivos desinalização prognosticados incluem o motivo "Box 1" nos aminoácidos de265 a 274 e o motivo "Box 2" nos aminoácidos de 311 a 324 (negrito esublinhado). Seis tirosinas estão localizadas nas posições de aminoácido 281,319, 361, 368, 397 e 510, da SEQ ID NO: 5. O motivo WSXWS (SEQ IDNO: 3) está localizada nos resíduos de aminoácido de 214 a 218 (emmaiúsculo, tipo em negrito). Os sítios de acoplamento Stat potenciais incluemos aminoácidos de 393 a 398 e os aminoácidos de 510 a 513 da SEQ ID NO:5. A FIG. 2B representa a seqüência de aminoácido de EL-21R/MU-1 humana(que corresponde à SEQ ID NO: 2). A localização da seqüência de sinalprognosticada (a cerca dos aminoácidos de 1 a 19 da SEQ DO NO: 2); omotivo WSXWS (a cerca dos aminoácidos de 213 a 217 da SEQ DD NO: 2); eo domínio de transmembrana (a cerca dos aminoácidos de 236 a 252 (ou 236a 253 ou 236 a 254) da SEQ ID NO: 2 (sublinhados)) são indicados. Os sítiosde ligação JAK potenciais, os motivos de sinalização Box 1 e 2 e os sítios deacoplamento Stat são indicados pelas setas rotuladas.

A FIG. 3 representa a comparação de GAP de seqüências decDNA de IL-21R/MU-1 de ser humano e de murino (que corresponde aosácidos nucleicos de 1 a 2665 da SEQ ID NO: 1 e os ácidos nucleicos de 1 a2628 da SEQ ID NO: 4, respectivamente). huMU-l=IL-21R/MU-l de serhumano, murMU-l=IL-21R/MU-l de murino. Parâmetros de Intervalo: Pesode Intervalo = 50; Emparelhamento Médio = 10,000; Peso de Comprimento =3; Desemparelhamento Médio = 0,000; Identidade Percentual = 66,116.

A FIG. 4 representa uma comparação de GAP da proteína EL-21R/MU-1 humana (que corresponde aos aminoácidos da SEQ ID NO: 2) eproteína IL-21R/MU-1 de murino (que corresponde aos aminoácidos da SEQID NO: 5). O alinhamento foi gerado pela matriz de substituição deaminoácido BLOSUM62 (Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sei.USA. 89: 10915-19). Parâmetros de Intervalo = Peso de Intervalo: 8;

Emparelhamento Médio = 2,912; Peso de Comprimento = 2;

Desemparelhamento Médio = -2,003; Identidade Percentual = 65,267.

A FIG. 5 representa um alinhamento de seqüência múltipla dosaminoácidos de DL-21R/MU-1 humana (que corresponde à SEQ ID NO: 2),IL-21R/MU-1 de murino (que corresponde à SEQ ID NO: 5) e a cadeia betade JL-2 humana (Acesso no GENBANK No M26062). O líder e os domíniosde transmembrana são sublinhados. Os motivos de módulo de receptor decitocina conservados são indicados pelo tipo em negrito. As regiões desinalização potenciais são indicadas pelo sublinhado e tipo em negrito.

A FIG. 6 representa a sinalização através da EL-21R/MU-1. AIL-21R/MU-1 fosforila Stat 5 nas células que expressam a quimera IL-21 R/MU-1 no Clone E7 EPO estimulado com EPO. O tratamento das célulasBAF-3 de controle ou quiméricas com IL-3 resultou na fosforilação de Stat 3,mas não de Stat 1 ou 5.

As FIGS. 7A-7B representam um alinhamento das seqüênciasde nucleotídeo e aminoácido de IL-21R humano maduro fundido ao terminalamino a uma seqüência líder de abelha e os rótulos His6 e Flag. Asseqüências de nucleotídeo e aminoácido da proteína de fusão representada nasFIGS. 7A-7B são apresentadas na SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11,respectivamente. As seqüências de aminoácido do fragmento de IL-21Rhumano maduro e o fragmento dos rótulos líder/His de abelha da proteína defusão correspondem aos aminoácidos de 20 a 235 da SEQ ID NO: 2 eaminoácidos de 1 a 44 da SEQ ID NO: 11, respectivamente.

As FIGS. 8A-8C representam um alinhamento das seqüênciade nucleotídeo e aminoácido do domínio extracelular de IL-21R humanafundidas no terminal C por intermédio de um ligador à seqüência Fc daimunoglobulina Gl (IgGl) humana. As seqüências de nucleotídeo eaminoácido da proteína de fusão representada nas FIGS. 8A-8C sãoapresentadas na SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente. Asseqüências de aminoácido do domínio extracelular da IL-21R humana, oligador e a seqüência Fc da imunoglobulina Gl (IgGl) humana correspondeaos aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 236 a 243 daSEQ ID NO: 13 e aminoácidos de 244 a 467 da SEQ ID NO: 13,respectivamente.As FIGS. 9A-9C representam um alinhamento das seqüênciasde nucleotídeo e aminoácido do domínio extracelular da IL-21R humanafundidas no terminal C por intermédio de um ligador para a seqüência Fc daimunoglobulina Gl (IgGl) humana e rótulo de seqüência His6. As seqüênciasde nucleotídeo e aminoácido da proteína de fusão representada nas FIGS. 9A-9C são apresentadas na SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, respectivamente.As seqüências de aminoácido do domínio extracelular da IL-21R humana, oligador, a seqüência Fc da imunoglobulina Gl (IgGl) humana e o rótulo deseqüência His6 correspondem aos aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 2,aminoácidos de 236 a 243 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos de 244 a 467 daSEQ ID NO: 15 e aminoácidos de 468 a 492 da SEQ ID NO: 15,respectivamente.

As FIGS. 10A-10C representam um alinhamento dasseqüências de nucleotídeo e aminoácido do domínio extracelular da IL-21Rhumana fundidas ao terminal C por intermédio de um ligador para a seqüênciamutada em Fc da imunoglobulina Gl (IgGl) humana. A seqüência de Fchumana foi mutada nos resíduos 254 e 257 da seqüência do tipo selvagempara reduzir a ligação do receptor de Fc. As seqüências de nucleotídeo eaminoácido da proteína de fusão representadas nas FIGS. 10A-10C sãoapresentadas na SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17, respectivamente, asseqüências de aminoácido do domínio extracelular da IL-21R humana, oligador e a seqüência mutada em Fc da imunoglobulina Gl (IgGl) humanacorresponde aos aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de236 a 243 da SEQ ID NO: 17 e aminoácidos de 244 a 467 da SEQ ID NO: 17,respectivamente.

As FIGS. 11A-11B representam um alinhamento dasseqüências de nucleotídeo e aminoácido do domínio extracelular da IL-21Rhumana fundida ao terminal C a um rótulo de seqüência da rodopsina. Asseqüências de nucleotídeo e aminoácido da proteína de fusão são apresentadasna SEQ ED NO: 18 e SEQ ID NO: 19, respectivamente. A seqüência deaminoácido do domínio extracelular da IL-21R humana corresponde aosaminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 2.

As FIGS. 12A-12C representam um alinhamento dasseqüências de nucleotídeo e aminoácido de domínio extracelular da EL-21Rhumana fundidas no terminal C a um sítio de clivagem EK e a região Fc deIgGl mutada. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da proteína defusão representadas nas FIGS. 12A-12C são apresentadas na SEQ ED NO: 20e SEQ ID NO: 21, respectivamente. As seqüências de aminoácido do domínioextracelular da IL-21R humana e o sítio de clivagem EK / região Fc de IgGlmutada correspondem aos aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ED NO: 2 eaminoácidos 236 a 470 da SEQ ID NO: 21, respectivamente.

As FIGS. 13A-13B representam um alinhamento dasseqüências de nucleotídeo e aminoácido do domínio extracelular de IL-21Rde murino fundidas no terminal C à imunoglobulina G2a (IgG2a) decamundongo. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido são apresentadas naSEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, respectivamente.

As FIGS. 14A-14B representam um alinhamento dasseqüências de nucleotídeo e aminoácido do domínio extracelular IL-21R demurino fundidas no terminal C aos rótulos de seqüência Flag e His6. Asseqüências de nucleotídeo e aminoácido são apresentadas na SEQ ID NO: 24e SEQ ID NO: 25, respectivamente.

As FIGS. 15A-15B representam um alinhamento dasseqüências de nucleotídeo e aminoácido do domínio extracelular de IL-21Rde murino (líder de abelha) fundidas no terminal N os rótulos de seqüência deFlag e His6. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido são apresentadas naSEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, respectivamente. [0035] A FIG. 16mostra perfis de expressão de IL-21 e IL-21R durante as respostas imunestipo-1 e tipo-2 altamente polarizadas. Grupos de cinco camundongossilenciados em IL-10/1L-4 (TH1, () e silenciados em EL-10/IL-12 (TH2, •)foram sensibilizados i.p. com ovos de S. mansoni e inoculados i.v. 14 diasmais tarde. Os espécimens de RNA pulmonar foram preparadosindividualmente pela análise de RT-PCR em tempo real de IL-13 e IFN-((FIG. 16A) e IL-21R e IL-21 (FIG. 16B). As médias + SEM na expressão degene foram expressadas como vezes de aumento em controles WT nãoinoculados depois da normalização ao HPRT. Os asteriscos denotamdiferenças significantes entre os grupos no ponto de tempo dado, * p < 0,05.

A FIG. 17 mostra que a produção de citocina tipo-2 é reduzida nos pulmões de camundongos IL-21 R~A inoculados com ovos deesquistossoma. Os grupos de camundongos do tipo selvagem ingênuos (barrasabertas) e IL-21R"7" (barras cheias) foram inoculadas i.v. com ovos de S.mansoni vivos e sacrificados nos dias 4, 7 e 14 após a inoculação. (a) o RNAfoi preparado a partir de tecidos de pulmão e analisados individualmente (N =5 por grupo/ponto de tempo) pela RT-PCR em tempo real. Os resultados sãomostrados como plotagens de box-and-whisker com barras de resumo decinco números mostrando a média, os quartis e os percentis menores emaiores na distribuição; as barras (do fundo ao topo) indicam o 10°, 25°, 50°,75° e 90° percentis, respectivamente, das amostras testadas. Os asteriscosdenotam diferenças significantes dos valores do tipo selvagem no ponto detempo dado, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. (B) Baços (Spl) elinfonodos associados a pulmão (LN) foram cada um reunidos (2 gruposseparados, 3 a 4 camundongos por grupo) e as suspensões de célula únicaforam ensaiadas quanto à IL-5, IL-10, IL-13 e IFN-(depois de uma incubaçãode 72 h na presença de Con A (CON, 1 ug/ml) ou antígeno de ovo solúvel(SEA, 20 ug/ml). As citocinas foram abaixo do nível de detecção em culturasnão estimuladas. (C) tamanho do granuloma (volume, mm3 X 10-3) e aporcentagem de eosinófilos em granulomas foram microscopicamentequantificadas. (D) Análise de PCR em tempo real de genes inflamatóriosregulados por TH2 em tecido de pulmão granulomatoso. Todos os dados sãorepresentativos de pelo menos 2 experimentos separados.

A FIG. 18 mostra que a resposta do tipo-2 é prejudicada emcamundongos TL-2Y1' infectados com N. brasiliensis. Os pulmões (a) e oslinfonodos associados com o pulmão (LALN) (B) foram removidos no dia 7de camundongos C57BL/6 ou IL-211"7" infectados e não tratados com N.brasiliensis individuais (5/grupo de tratamento). O RNA foi isolado e o cDNAfoi gerado como descrito na legenda para a FIG. 17. O mRNA foi analisadoindividualmente quanto a IL-13, IL-4, AMCase, Yml e FIZZ1 pela PCRquantitativa em tempo real. As vezes de mudança são fundamentadas nascomparações de camundongos infectados com animais ingênuos.

A FIG. 19 mostra que a inflamação direcionada com a citocinatipo-2 é reduzida em camundongos IL-21"A. Os camundongos do tiposelvagem (barras abertas) e IL-21R"/_ (barras cheias) foram sensibilizados i.p.com ovos, inoculados i.v. duas semanas mais tarde com ovos de S. mansonivivos e depois sacrificados nos dias 4 e 7 após a inoculação. (A) O RNA foipreparado a partir de tecidos pulmonares e analisados individualmente (N = 5por grupo/ponto de tempo) pela RT-PCR em tempo real como descrito acimana legenda para a FIG. 17. (B) Os baços (Spl) e linfonodos associados compulmão (LN) foram ensaiados quanto à IL-5, IL-10, IL-13 e IFN-y a seguir daestimulação com antígeno (SEA) ou mitógeno (CON). (C) O tamanho dogranuloma (mm3 X 10-3) e a porcentagem de eosinófilos em granulomasforam quantificados microscopicamente em camundongos do tipo selvagem(camundongos por grupo: N = 10, dia 4; N = 15, dia 7) e IL-21R7" (N = 11,dia 4; N = 16, dia 7). (D) A análise de PCR em tempo real de genesinflamatórios TH2 em tecido pulmonar granulomatoso (N = 5 por grupo/ponto de tempo). Os asteriscos denotam diferenças significantes dos valoresdo tipo selvagem no ponto de tempo dado, * p < 0,05, **p<0,01,***p<0,001. Os dados mostrados são os resultados combinados de 3 experimentosseparados.

A FIG. 20 mostra que a doença hepáticas crônica a seguir dainfecção percutânea por S. mansoni é reduzida na ausência de IL-21R.Camundongos do tipo selvagem (barras abertas) e TL-2V'~ (barras cheias)foram infectadas com 25 a 30 cercadas de S. mansoni. Todos os animaisforam sacrificados na semana 9 (agudos) ou semana 12 (crônicos) após ainfecção. (A) O RNA foi isolado dos tecidos hepáticos e analisadosindividualmente (N = 8 a 10 por grupo/ponto de tempo) pela RT-PCR emtempo real como descrito acima na legenda da FIG. 17. (B) Os baços (Spl) elinfonodos mesentéricos (LN) foram reunidos nos grupos de 2 a 4camundongos e suspensões de célula única foram ensaiados quanto à IL-5,IL-10 e IFN-7. Os dados mostrados são as médias de três grupos reunidosseparados. (C) O tamanho de granuloma (mm3 X 10-3) e a percentagem deeosinófilos em granulomas foram avaliados microscopicamente emcamundongos do tipo selvagem (camundongos por grupo: N = 30 para asemana 9, N = 17 para a semana 12) e camundongos IL-21"7" (camundongospor grupo: N = 27 para a semana 9, N = 19 para a semana 12). (D) análise dePCR em tempo real de genes inflamatórios TH2 em tecido hepáticogranulomatoso (N = 8 a 10 por grupo/ponto de tempo). Os dados mostradossão os resultados combinados de 3 experimentos separados conduzidos nasemana 9 e dois realizados na semana 12. Os asteriscos denotam diferençassignificantes dos valores do tipo selvagem no ponto de tempo dado, * p <0,05, **p< 0,01,*** p< 0,001.

A FIG. 21 mostra que a composição celular de granulomas éimutável pela deficiência de IL-21R. (a) A composição celular de granulomasfoi avaliada nos fígados de camundongos de 9 semanas infectados do tiposelvagem (N = 10) e IL-21"/" (N = 9). A média + SEM de linfócitos pequenos(Sm Lym), linfócitos grandes (Lg Lym), macrófagos (Mac), Fibroblastos(Fibro), Eosinófilos (Eos) e Mastóides (Mc) são mostrados. (B) Os linfócitosforam isolados dos pulmões perfundidos de camundongos ingênuos do tiposelvagem e IL-21"'" (painéis de topo) e no dia 7 seguinte à inoculação i.v. com5000 ovos de S. mansoni (painéis de fundo). Os números nos histogramasindicam as porcentagens de células T de CD4- e CD4+ entre linfócitospulmonares totais.

A FIG. 22 mostra que a deficiência de IL-21Rsignificantemente diminui a progressão da fibrose dependente da citocina deTH2. Os camundongos do tipo selvagem (barras abertas) e IL-21R"/" (barrascheias) foram infectados com cercárias de S. mansoni. Os animais foramsacrificados em 9 (agudos), 12 (crônicos) (painéis A-D) ou 29 semanas(crônicos tardios) (painel E) após a infecção. (A) Os pares de verme médios,vermes totais e pares de ovos/verme em milhares ± SE são mostrados paracada grupo. Nenhuma diferença na intensidade de infecção foi observada emnenhum experimento (n = número de camundongos). (B) Os camundongosforam sangrados no momento do sacrifício e os títulos Ab específicos doisotipo SEA foram determinados pelo ELISA. (C) Os valores IgE séricostotais em (g/ml. (D-F) A fibrose foi avaliada pela quantidade dehidroxiprolina em micromoles detectados no fígado por 10.000 ovos (painelD) ou no fígado total (painéis E e F). No painel F, camundongos C57BL/6 dotipo selvagem infectados foram tratados com um anticorpo de controle deIgG2a (clg - barra aberta) ou com sIL-21R-Fc (barra cheia) por 6 semanas.Os asteriscos denotam diferenças significantes dos valores do tipo selvagemno ponto de tempo dado, * p < 0,05, **p<0,01,***p< 0,001.

A FIG. 23 mostra que a sinalização de IL-21 promove aativação de macrófago alternativa pela modulação da expressão do receptorde IL-13. Os macrófagos derivados da medula óssea foram tratados comvárias combinações de IL-4 (20 ng/ml), IL-13 (20 ng/ml) e IL-21 (20 ng/ml)durante a noite. Os macrófagos tratados com IL-4, IL-13 e IL-21 foram prétratados com IL-21 por 6 horas antes da administração de IL-4 e IL-13. Ascélulas foram Usadas 20 horas mais tarde e o RNA foi analisadoindividualmente pela RT-PCR em tempo real. (A) A capacidade de IL-21 parapromover a ativação de macrófago alternativa foi avaliado pela medição daexpressão de gene Arg-1 e FIZZ1. (B) A atividade de arginase foiquantificada em Usados de célula pela medição da conversão de L-argininapara uréia (mg/dL + SEM, medições em triplicata) (C) A expressão de mRNAde IL-4Ra e IL-13Ral foi avaliada pela PCR em tempo real. O mRNA de IL-13Rcc2 foi quase indetectável em todas as condições (não mostrados). Osdados mostrados nos painéis A, B e C são representativos de 3 experimentosseparados. (D) Os camundongos C57BL/6 ingênuos foram inoculadosintravenosamente com 5000 ovos de S. mansoni vivos e tratados com PBS ourIL-21 (2 j-ig/dose) a cada segundo dia do dia 1 até o dia 6. Os animais (5 porgrupo) foram sacrificados no dia 7 e os níveis de mRNA de IL-13Ra2pulmonar foram ensaiados pela PCR em tempo real e expressados como vezesde aumento em relação aos controles não tratados (barra aberta). Oscamundongos também foram sangrados no momento do sacrifício e aquantidade de sIL-13Ra2 em amostras séricas individuais foi ensaiada peloELISA. Os asteriscos denotam as diferenças significantes, * p < 0,05, ** p <0,01, ***p< 0,001.

A FIG. 24 mostra que os macrófagos alternativamente ativadosnão produzem quantidades significantes de TGF-(1 ativo. O painel direitomostra a ativação de macrófago a seguir de TGF-(1 ativo, enquanto que opainel esquerdo mostra os níveis de TGF-(1 totais a seguir da ativação demacrófago. Os macrófagos derivados da medula óssea foram tratados comvárias combinações de IL-4 (20 ng/ml), IL-13 (20 ng/ml) e IL-21 (20 ng/ml)durante a noite. Os macrófagos tratados com IL-4, IL-13 e IL-21 foram prétratados com IL-21 por 6 horas antes da administração de IL-4 e IL-13. 20horas após a ativação, os sobrenadantes foram ensaiados quanto o TGF-(1total e ativo pelo ELISA. Os altos níveis de TGF-(1 total foram detectados emtodos os grupos (por exemplo, comparar o painel esquerdo "IL-4" com o "nãotratado") exceto para as células tratadas com IL-21 sozinho (comparar opainel esquerdo "EL-21" com o "Não tratado"). Embora a expressão de TGF-(1 total fosse alta, o TGF-(1 ativo foi mínimo em todos os grupos (paineldireito). Os dados mostrados são representativos de 3 experimentos emseparado que produzem resultados similares.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para examinar o papel do caminho de sinalização de IL-21/IL-2IR na patogênese da fibrose, as respostas imunes foram comparadas emcamundongos que carecem de uma IL-21R funcional (IL-21R"A) e noscamundongos do tipo selvagem usando vários modelos de inflamaçãopulmonar e hepática. Em um modelo, os ovos de esquistossoma vivos foraminjetados intravenosamente em animais ingênuos ou sensibilizados comantígeno para estudar a inflamação granulomatosa primária e secundária nopulmão. Em um outro modelo, os camundongos foram infectadospercutaneamente com cercárias de S. mansoni e o desenvolvimento dainflamação induzida pelo ovo e a fibrose foi observada no fígado. Em umoutro modelo, os camundongos foram infectados com N. brasiliensis. Usandoestes modelos, a influência da IL-21R sobre a patologia direcionada pelacitocina tipo 2 em cenários de doença aguda e crônica foi estudada. Osresultados demonstram um papel importante para a IL-21R na geração derespostas do tipo 2 polarizadas in vivo, particularmente na inflamaçãomediada pela citocina tipo 2 e fibrose.

A presente invenção portanto fornece métodos para tratar,melhorar ou prevenir a fibrose ou distúrbios associados com a fibrose em umpaciente (por exemplo, um ser humano, por exemplo, um paciente humano)usando um agente(s) que reduza(m) o nível de IL-21 e/ou IL-21R (porexemplo, o nível de expressão de IL-21 e/ou IL-21R (por exemplo, o nível deprodutos de gene de IL-21 e/ou IL-21R (isto é, proteína e/ou mRNA)), o nívelde atividade de IL-21 e/ou IL-21R, o nível de interação de IL-21 com IL-21R,etc.) em relação a um controle não tratado (por exemplo, um paciente decontrole afligido com fibrose ou uma condição associada com a fibrose, umpaciente de controle não afligido com fibrose ou uma condição associada coma fibrose) ou em relação a um nível de referência apropriado. Em relação àidentificação de um agente(s) que reduza(m) o nível de IL-21 e/ou EL-21R,medir "o nível de IL-21 e/ou IL-21R" inclui, mas não é limitado a, (1) mediro nível de expressão de IL-21 e/ou IL-21R (por exemplo, medir o nível deprodutos de gene de IL-21 e/ou IL-21R (por exemplo, proteína e/ou seumRNA correspondente)); (2) medir o nível de atividade de IL-21 e/ou IL-2IR; e (3) medir o nível de interação de EL-21 com IL-21R (por exemplo, emuma célula ou amostra de interesse, por exemplo, de um paciente (porexemplo, um paciente humano, um paciente de controle)). Como descrito aquiem mais detalhes, os agentes exemplares úteis para tratar, melhorar e/ouprevenir a fibrose ou condições ou distúrbios associados com a fibroseincluem anticorpos anti-IL-21R, fragmentos de ligação de antígeno deanticorpos anti-IL-21R, anticorpos anti-IL-21, fragmentos de ligação deantígeno de anticorpos anti-IL-21 e fragmentos solúveis de polipeptídeos deIL-21R. A invenção fornece ainda métodos para monitorar o curso detratamento da fibrose ou de um distúrbio associado com a fibrose,diagnosticar e prognosticar o mesmo e triar quanto a compostos úteis paratratar a fibrose ou um distúrbio associado com a fibrose.

Como aqui usado, "IL-21" ou "IL-21R" significa qualquerpolipeptídeo que seja substancialmente idêntico à proteína de IL-21 oureceptor de IL-21 que ocorra naturalmente, respectivamente. As seqüências denucleotídeo e aminoácido que codificam a interleucina 21 humana (IL-21) eseu receptor (IL-21R) são descritos, por exemplo, na WO 00/53761, WO01/85792, Parrish-Novak et al. (2000) Nature 408: 57-63 e Ozaki et al. (2000)Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 97: 11439-44. Desejavelmente, o polipeptídeo deIL-21 se liga à IL-21R ou o polipeptídeo de EL-21R se liga à EL-21 e nainteração existe um aumento na atividade de sinalização do caminho de EL-21/IL-21R em pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %,80 %, 90 % ou mais do que 100 % acima dos níveis de controle, comomedido por qualquer método padrão. A IL-21R também é conhecida como"MU-1," "NILR," e "zalphall."

Um agente que diminua o nível de IL-21 e/ou IL-21R abrangequalquer agente que diminua a atividade de sinalização do caminho de IL-21 /IL-21 R, o nível de atividade de IL-21 e/ou IL-21R, o nível de expressão deIL-21 e/ou EL-21R e/ou o nível de interação de IL-21 e IL-21R em pelomenos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100%. Opcionalmente, a diminuição nos níveis de IL-21 e/ou IL-21R é avaliadapela medição do nível de redução na fibrose. Um agente que diminua o nívelde interação de IL-21 com IL-21R abrange qualquer agente que diminua ainteração de IL-21 com IL-21R em pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %,50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 %. Estes agentes anteriormentemencionados que diminuem o nível de atividade ou expressão de IL-21 e/ouIL-21R e/ou diminuem o nível de interação de IL-21 com IL-21R (isto é,agentes que diminuem o nível de IL-21 e/ou IL-21R) podem ser aqui aludidoscomo "antagonistas" de IL-21 e/ou IL-21R.

Um "gene IL-21" ou "gene IL-21R" são definidos como umácido nucleico que codifica um polipeptídeo de IL-21 ou IL-21R,respectivamente.

"Fibrose" é definida como qualquer condição patológica queresulte de uma super produção ou produção aberrante de tecido fibroso. Afibrose pode ocorrer em qualquer órgão incluindo, por exemplo, rim, pulmão,fígado, pele, sistema nervoso central, osso, medula óssea, sistemacardiovascular, um órgão endócrino ou o sistema gastrointestinal. Por"condição associada com a fibrose" é intencionada qualquer condição queesteja relacionada com a fibrose. Assim, condições associadas com a fibrosepodem ser causadas pela, ser concomitante com a ou causa a fibrose.

Diminuir o nível de atividade de IL-21 e/ou IL-21R podereferir-se a uma redução no nível ou atividade biológica de EL-21 em relaçãoao nível ou atividade biológica de IL-21 e/ou IL-21R em um controle nãotratado ou amostra de referência (por exemplo, um nível de referência). Talnível ou atividade podem ser diminuídos em pelo menos 10 %, 20 %, 30 %,40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 %. Uma diminuição na atividadede IL-21 e/ou IL-21R também pode estar associada com uma redução naexpressão e/ou função da citocina tipo 2 ("TH2"), que pode incluir umamodulação, por exemplo, nos níveis e atividade IL-4, EL-13, AMCase, Yml eFizzl/RELM(.

Diminuir o nível de interação de IL-21 com EL-21R podereferir-se a uma diminuição na interação em uma célula ou amostra tratadasem relação ao nível de interação de IL-21 com IL-21R em um controle nãotratado ou amostra de referência. Tal nível de interação pode ser diminuídoem pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou100 %. O nível de interação podem ser avaliado por diversas técnicas dabiologia molecular bem conhecidas, por exemplo, ELISA e Western blotting.

Diminuir o nível de produtos de gene de IL-21 e/ou IL-21Rrefere-se a uma diminuição no mRNA e/ou nível de expressão da proteína emuma célula ou amostra tratadas em relação ao nível de expressão do gene ouproteína de IL-21 e/ou IL-21R em um controle não tratado ou amostra dereferência. Tal expressão pode ser diminuída em pelo menos 10 %, 20 %, 30%, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 %. O nível de expressãopode ser avaliado por várias técnicas de biologia molecular bem conhecidos,por exemplo, Northern blotting ou Western blotting.

Por "tratar ou melhorar a fibrose" é intencionado a diminuir onível de fibrose em relação a um controle não tratado, como medido porqualquer método padrão. Uma redução na fibrose também pode ser medidapor uma redução em qualquer sintoma associado com a fibrose ou umacondição associada com a fibrose. Os exemplos aqui divulgados fornecemmétodos exemplares de determinar se o nível de fibrose é diminuído emrelação a um controle.

Por "tratar ou melhorar uma condição (ou distúrbio) associadacom a fibrose" é intencionado diminuir tal condição antes ou depois que elatenha ocorrido. Quando comparado com um controle não tratado equivalente,tal redução ou grau de prevenção é de pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 40 %, 50%, 60 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 100 % como medido por qualquer técnicapadrão. Um paciente que está sendo tratado quanto a uma condição associadacom a fibrose é um que um médico diagnosticou como tendo uma talcondição. O diagnóstico pode ser por qualquer meio adequado. Um pacienteem quem o desenvolvimento de uma condição associada com a fibrose estásendo prevenida pode ter recebido ou não um tal diagnóstico. Uma pessoa natécnica entenderá que estes pacientes (por exemplo, pacientes) pode ter sidosubmetido aos testes padrão para diagnosticar condições associadas com afibrose ou pode ter sido identificado, sem examinação, como um em alto riscodevido à presença de um ou mais fatores de risco. Os exemplos aquidivulgados fornecem métodos exemplares de determinar se o nível de umdistúrbio associado com a fibrose é diminuído em relação a um controle.

"Prevenir" refere-se a retardar o início, de uma fibrose ou umacondição associada com a fibrose ou proibir o início da fibrose ou umacondição associada com a fibrose em um paciente provável de desenvolveruma tal condição.

Por "uma quantidade eficaz" é intencionado uma quantidadede um composto, sozinho ou em uma combinação, requerida para tratar,melhorar, reduzir ou prevenir a fibrose ou uma condição associada com afibrose em um mamífero. A quantidade eficaz de composto(s) ativo(s) variadependendo da via de administração, idade, peso corporal e saúde geral dopaciente. Por fim, o médico atendente ou veterinário decidirá a quantidade eregime de dosagem apropriados.

Por "substancialmente id~idêntico," quando da referência auma proteína ou polipeptídeo, é intencionado uma proteína ou polipeptídeoque exibe pelo menos 75 %, mais preferivelmente 85 %, mais preferivelmente90 %, o mais preferivelmente 95 % ou ainda 99 % de identidade com umaseqüência de aminoácido de referência, por exemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO: 5 e proteínas de fusão tais como aquelas apresentadas nas SEQ ID NOs:11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 e 27. Para as proteínas ou polipeptídeos, ocomprimento de seqüências de comparação no geral será de pelo menos 20aminoácidos, preferivelmente pelo menos 30 aminoácidos, maispreferivelmente pelo menos 40 aminoácidos e o mais preferivelmente 50aminoácidos ou a proteína ou polipeptídeo de tamanho natural. Os ácidosnucleicos que codificam tais proteínas ou polipeptídeos "substancialmenteidênticas" constituem exemplos de ácidos nucleicos "substancialmenteidênticos". É reconhecido que, devido à redundância do código genético,diversos ácidos nucleicos podem codificar uma dada proteína ou polipeptídeo;tais ácidos nucleicos estão dentro do escopo da invenção se eles codificam umpolipeptídeo que é "substancialmente idêntico" a um polipeptídeo dereferência.

Os ácidos nucleicos relacionados com a presente invençãopodem compreender DNA ou RNA e podem ser total ou parcialmentesintéticos. Referência a uma seqüência de nucleotídeo como aqui apresentadaabrange uma molécula de DNA com a seqüência especificada (ou umcomplemento desta) e abrange uma molécula de RNA com a seqüênciaespecificada em que U é substituído no lugar de T, a menos que o contextorequeira de outro modo.

Os polinucleotídeos isolados relacionados com a presenteinvenção podem ser usados como sondas e iniciadores de hibridização paraidentificar e isolar ácidos nucleicos tendo seqüências idênticas a ou similaresàquelas que codificam os polinucleotídeos divulgados. Os métodos dehibridização para identificar e isolar ácidos nucleicos incluem a reação decadeia da polimerase (PCR), hibridização de Southern, hibridização in situ ehibridização de Northern e são bem conhecidas por aqueles habilitados natécnica.

As reações de hibridização podem ser realizadas sob condiçõesde severidade diferente. A severidade de uma reação de hibridização inclui adificuldade com que qualquer duas moléculas de ácido nucleico hibridizarãoentre si. Preferivelmente, cada polinucleotídeo hibridizador hibridiza ao seupolinucleotídeo correspondente sob condições de severidade reduzida, maispreferivelmente condições severas e o mais preferivelmente condiçõesaltamente severas. Os exemplos de condições de severidade são mostrados naTabela 1 abaixo: as condições altamente severas são aquelas que são pelomenos tão severas como, por exemplo, as condições de A a F; condiçõesseveras são pelo menos tão severas como, por exemplo, as condições de G aL; e as condições de severidade reduzida são pelo menos tão severas como,por exemplo, as condições de M a R.

Tabela I: Condições de Severidade

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1 O comprimento do híbrido é aquele antecipado para a(s) região(ões) hibridizada(s) dospolinucleotídeos hibridizadores. Quando da hibridização de um polinucleotídeo a umpolinucleotídeo alvo de seqüência desconhecida, o comprimento do híbrido é assumido seraquele do polinucleotídeo hibridizador. Quando os polinucleotídeos de seqüênciaconhecida são hibridizados, o comprimento do híbrido pode ser determinado peloalinhamento das seqüências dos polinucleotídeos e identificando a região ou regiões decomplementaridade de seqüência ótima.

2 SSPE (lx SSPE é 0,15 M de NaCl, 10 mM de NaH2P04 e 1,25 mM de EDTA, pH 7,4)pode ser substituído no lugar de SSC (lx SSC é 0,15 M NaCl e 15 mM citrato de sódio)nos tampões de hibridização e lavagem; as lavagens são realizadas por 15 minutos depoisque a hibridização estiver completa.

TB* a TR*: A temperatura de hibridização para híbridos antecipados terem menos do que50 pares de base no comprimento deve ser de 5 a 10° C menor do que a temperatura defusão (Tm) dp híbrido, onde Tm é determinada de acordo com as seguintes equações. Paraos híbridos menores do que 18 pares de base no comprimento, Tm (°C) = 2 (# de bases A +T) + 4(# de bases G + C). Para os híbridos entre 18 e 49 pares de base no comprimento,Tm (°C) = 81,5 + 16,6 (logl0Na+) + 0,41 (% de G+C) - (600/N), onde N é o número debases no híbrido e Na+ é a concentração de íons sódio no tampão de hibridização (Na+para lx SSC = 0,165 M).

Os exemplos adicionais de condições de severidade para a hibridização de polinucleotídeosão fornecidos em Sambrook, J., E. F. Fritsch e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,capítulos 9 e 11 e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds.,John Wiley & Sons, Inc., seções 2.10 e 6.3 a 6.4, incorporado aqui por referência.

Os polinucleotídeos isolados relacionados com a presenteinvenção podem ser usados como sondas e iniciadores de hibridização paraidentificar e isolar DNA tendo seqüências que codificam variantes alélicasdos polinucleotídeos divulgados. Variantes alélicas são formas alternativasque ocorrem naturalmente dos polinucleotídeos divulgados que codificampolipeptídeos que são idênticos aos ou têm similaridade significante aospolipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos divulgados. Preferivelmente,as variantes alélicas têm pelo menos 90 % de identidade de seqüência (maispreferivelmente, pelo menos 95 % de identidade; o mais preferivelmente, pelomenos 99 % de identidade) com os polinucleotídeos divulgados.Alternativamente, similaridade significante existe quando os segmentos deácido nucleico hibridizarão sob condições de hibridização seletiva (porexemplo, condições de hibridização altamente severas) com ospolinucleotídeos divulgados.

Os polinucleotídeos isolados relacionados com a presenteinvenção também podem ser usados como sondas e iniciadores dehibridização para identificar e isolar DNAs tendo seqüências que codificampolipeptídeos homólogos aos polinucleotídeos divulgados. Estes homólogossão polinucleotídeos e polipeptídeos isolados de uma espécie diferente do queaquela dos polipeptídeos e polinucleotídeos divulgados ou dentro da mesmaespécie, mas com similaridade de seqüência significante aos polinucleotídeose polipeptídeos divulgados. Preferivelmente, polinucleotídeos homólogos têmpelo menos 50 % de identidade de seqüência (mais preferivelmente, pelomenos 75 % de identidade; o mais preferivelmente, pelo menos 90 % deidentidade) com os polinucleotídeos divulgados, ao passo que ospolipeptídeos homólogos têm pelo menos 30 % de identidade de seqüência(mais preferivelmente, pelo menos 45 % de identidade; o maispreferivelmente, pelo menos 60 % de identidade) com os polipeptídeosdivulgados. Preferivelmente, homólogos dos polinucleotídeos e polipeptídeosdivulgados são aqueles isolados de espécies de mamífero.

Os cálculos de "homologia" ou "identidade de seqüência"entre duas seqüências são realizados por meios bem conhecidos por aquelesde habilidade na técnica. Por exemplo, um meio geral para calcular aidentidade de seqüência está descrito como segue. As seqüências sãoalinhadas com propósitos de comparação ótimos (por exemplo, os intervalospodem ser introduzidos em um ou ambos de uma primeira e uma segundaseqüência de aminoácido ou nucleotídeo quanto ao alinhamento ótimo e asseqüências não homólogas podem ser desconsideradas para os propósitos decomparação). Em uma forma de realização preferida, o comprimento de umaseqüência de referência alinhada com propósitos de comparação é pelo menos30 %, preferivelmente pelo menos 40 %, mais preferivelmente pelo menos 50%, ainda mais preferivelmente pelo menos 60 % e ainda mais preferivelmentepelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 100 % do comprimento da seqüência dereferência. Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos nas posições deaminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são depoiscomparados. Quando uma posição na primeira seqüência está ocupada pelomesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondentena segunda seqüência, então as moléculas são idênticas naquela posição. AIdentidade Percentual entre as duas seqüências é uma função do número deposições idênticas compartilhadas pelas seqüências, levando-se em conta onúmero de intervalos e o comprimento de cada intervalo, que necessita serintroduzido para alinhamento ótimo das duas seqüências.

A comparação de seqüências e a determinação da identidadede seqüência percentual entre duas seqüências podem ser realizadas usandoum algoritmo matemático. Em uma forma de realização preferida, aIdentidade Percentual entre duas seqüências de aminoácido é determinadausando o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 444-53), que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG(disponível em www.gcg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou umamatriz PAM250 e um Peso de Intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um Pesode Comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Ainda em uma outra forma derealização preferida, a Identidade Percentual entre duas seqüências denucleotídeo é determinada usando o programa GAP no pacote de softwareGCG (diponível em www.gcg.com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP eum Peso de Intervalo de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um Peso de Comprimento de1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Um conjunto preferido de parâmetros é uma matriz decontagem Blossum 62 com uma penalidade de intervalo de 12, umapenalidade de extensão de intervalo de 4 e uma penalidade de intervalo demudança de matriz de 5. A Identidade Percentual entre duas seqüências deaminoácido ou nucleotídeo também pode ser determinada usando o algoritmode Meyers e Miller ((1989) CABIOS 4: 11-17), que foi incorporado noprograma ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de pesoPAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e umapenalidade de intervalo de 4.

"Substancialmente puro" é definido como um ácido nucleico,polipeptídeo ou outra molécula que foi separada dos componentes quenaturalmente a acompanham, por exemplo, material genético, proteínasassociadas, membranas e fragmentos celulares. Tipicamente, um polipeptídeoé substancialmente puro se o mesmo é pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %,95 % ou ainda 99 %, em peso, livre das proteínas e moléculas orgânicas queocorrem naturalmente com o qual o mesmo naturalmente se associa. Porexemplo, um polipeptídeo substancialmente puro pode ser obtido pelaextração de uma fonte natural, pela expressão de um ácido nucleicorecombinante em uma célula que normalmente não expressa esta proteína oupela síntese química.

O termo "DNA isolado" é definido como o DNA que é relativaou substancialmente livre dos genes e outras seqüências de DNA queflanqueiam o DNA no genoma que ocorre naturalmente do organismo do qualo DNA dado é derivado. Assim, o termo "DNA isolado" abrange, porexemplo, cDNA, DNA genômico clonado e DNA sintético.

Polipeptídeo ou proteína de "fusão de IL-21" ou polipeptídeoou proteína de "fusão de IL-21R" são definidos como todo ou parte de umaseqüência de aminoácido de IL-21 ou IL-21R, por exemplo, o fragmentoextracelular de IL-21R dos aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 2, ligadosa uma segunda, seqüência de aminoácido heteróloga. Em uma forma derealização, a segunda seqüência de aminoácido heteróloga é uma seqüência derótulo. As seqüências de rótulo comuns incluem os rótulos myc, rótulos his,rótulos flag, etc. Em uma outra forma de realização da invenção, a segundaseqüência de aminoácido heteróloga é uma seqüência de imunoglobulina, porexemplo, um fragmento Fc. Tais proteínas e polipeptídeos de fusão, que sãodescritos aqui em maiores detalhes, são codificados pelas seqüências denucleotídeo aludidas como "genes de fusão de IL-21" ou "genes de fusão deIL-21R."

Nos métodos de triagem um "composto" refere-se a umproduto químico, seja de ocorrência natural ou artificialmente derivado. Taiscompostos podem incluir, por exemplo, peptídeos, polipeptídeos, moléculasorgânicas sintéticas, moléculas orgânicas que ocorrem naturalmente,moléculas de ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico peptídicas ecomponentes e derivados destes. Por exemplo, um composto útil de acordocom a presente invenção reduz a ligação de IL-21 ao IL-21R.

Os antagonistas de IL-21 e IL-21R para o uso no tratamento,melhora ou prevenção da fibrose ou de uma condição associada com a fibrosetambém podem consistir de moléculas pequenas. O termo "moléculapequena" refere-se a compostos que não são macromoléculas (ver, porexemplo, Karp (2000) Bioinformatics Ontology 16: 269-85; Verkman (2004)AJP-Cell Physiol. 286: 465-74). Assim, as moléculas pequenas sãofreqüentemente consideradas aqueles compostos que são, por exemplo,menores do que mil daltons (por exemplo, Voet e Voet, Biochemistry, 2a ed.,ed. N. Rose, Wiley e Sons, Nova Iorque, 14 (1995)). Por exemplo, Davis et al.(2005) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102: 5981-86, usam a frase moléculapequena para indicar foliatos, metotrexato e neuropeptídeos, enquanto Halpine Harbury (2004) PLos Biology 2: 1022-30, usam a frase para indicarprodutos de gene de molécula pequena, por exemplo, DNAs, RNAs epeptídeos. Os exemplos de moléculas pequenas naturais e sintetizadasincluem, mas não são limitados a, colesteróis, neurotransmissores, siRNAs evários produtos químicos listados em numerosas bases de dados de moléculapequena comercialmente disponíveis, por exemplo, FCD (Fine ChemicalsDatabase), SMID (Small Molecule Interaction Database), ChEBI (ChemicalEntities of Biological Interest) e CSD (Cambridge Structural Database) (ver,por exemplo, Alfarano et al. (2005) Nucl. Acids Res. Database Issue 33:D416-24).

O termo "composição farmacêutica" significa qualquercomposição que contenha pelo menos um agente terapêutica oubiologicamente ativo e é adequado para a administração a um paciente.Qualquer uma destas formulações podem ser preparadas por métodos bemconhecidos e aceitos da técnica. Ver, por exemplo, Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy, 21a Ed., (ed. A. R. Gennaro), Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, MD (2005).

A presente invenção fornece vantagens significantes emrelação às terapias padrão para o tratamento e prevenção de condiçõesassociadas com a fibrose. Como aqui descrito, a administração de um agenteterapêutico que reduza o nível de atividade ou expressão de IL-21 e/ou IL-2IR ou diminua as interações entre IL-21 e IL-21R (isto é, reduz o nível deatividade de IL-21 e/ou IL-21R) resulta na melhora, redução ou prevenção defibrose e condições associadas com a fibrose. Além disso, os métodos de triarcomposto, fornecidos por esta invenção, possibilita que se identifique novosprodutos terapêuticos que modifiquem o processo de ferimento, ao invés demeramente mitigar os sintomas.

Distúrbios Fibróticos

A geração de tecido de granulação é um processocuidadosamente orquestrado em que a expressão de inibidores da protease eproteínas de matriz extracelular é super regulada e a expressão de proteases éreduzida, levando ao acúmulo de matriz extracelular. O acúmulo anormal demateriais fibrosos, entretanto, pode por fim levar à insuficiência de órgão (porexemplo, Border et al. (1994) New Engl. J. Med. 331: 1286-92). Odesenvolvimento de condições fibróticas, seja induzida ou espontânea, écausada pelo menos em parte pela estimulação da atividade de fibroblasto. Oinfluxo de células inflamatória e fibroblastos ativados no órgão feridodepende da capacidade destes tipos de célula para interagirem com a matrizintersticial, que contêm primariamente colágenos. Os tecidos exemplares quepodem ser afetados pela fibrose incluem o rim, pulmão, fígado, pele, sistemanervoso central, osso, medula óssea, tecidos do sistema cardiovascular, órgãosendócrinos e tecidos do sistema gastrointestinal.

Os métodos e composições da presente invenção são úteis paraqualquer fibrose ou condição associada com a fibrose que afete qualquertecido incluindo, por exemplo, a fibrose de um órgão interno, um distúrbiofibrosante cutâneo ou dérmico e condições fibróticas do olho. A fibrose deórgãos internos (por exemplo, fígado, pulmão, rim, coração, vasossangüíneos, trato gastrointestinal) ocorre em distúrbios tais como fibrosepulmonar, fibrose idiopática, fibrose autoimune, mielofibrose, cirrosehepática, doença veno-oclusiva, glomerulonefrite mesangial proliferativa,glomerulonefrite crescente, nefropatia diabética, fibrose intersticial renal,fibrose renal em pacientes que recebem ciclosporina, rejeição a enxerto,nefropatia associada com o HIV. Outros distúrbios associados com a fibroseincluem esclerose sistêmica, síndrome de eosinofilia-mialgia e distúrbios doCNS associado com fibrose tais como fibrose intraocular. Os distúrbiosfibrosantes dérmicos incluem, por exemplo, escleroderma, morféia, quelóides,cicatrizes hipertróficas, colagenoma cutâneo familiar e verruga de tecidoconectivo do tipo colágeno. As condições fibróticas dos olhos, incluemcondições tais como a retinopatia diabética, após a cicatrização cirúrgica (porexemplo, depois da cirurgia de filtração de glaucoma e depois da cirurgia dosolhos cruzados (estrabismo)) e vitreoretinopatia. As condições fibróticasadicionais que podem ser tratadas pelos métodos da presente invenção podemresultar, por exemplo, da artrite reumatóide, doenças associada: com dor napolimiosite, dermatomiosite, fasciíte eosinofílica, morféia, síndrome deRaynaud e polipose nasal. Como aqui descrito, um antagonista do caminho daIL-21/IL-21R pode ser administrado para tratar ou prevenir a fibrose edistúrbios associados com a fibrose ou para melhorar um ou mais dossintomas associados com estes distúrbios.

Antagonistas de IL-21 ou IL-21R (Antagonistas de IL-21/IL-21R)

Os antagonistas de IL-21 ou antagonistas de IL-21R dainvenção interagem com IL-21 ou IL-21R (por exemplo, IL-21 ou IL-21R demamífero tal como o ser humano, bovinas, de rato, camundongo, cavalo oucão), respectivamente e reduzem o nível de IL-21 e/ou IL-21R, por exemplo,reduzem uma ou mais atividades biológicas associadas com a IL-21 e/ou IL-21 R. Quando esta interação envolve a ligação direta, os antagonistas se ligama IL-21 ou IL-21R com alta afinidade (por exemplo, com uma afinidadeconstante de pelo menos cerca de 107 M-l, preferivelmente de cerca de 108M-l. e mais preferivelmente, de cerca de 109 M-l a 1010 M-l ou mais forte).

O nível de IL-21 e/ou IL-21R é desejavelmente reduzido em10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou ainda 100 %. Umantagonista, por exemplo, pode reduzir a atividade de IL-21R pelaneutralização de IL-21. Um antagonista pode ser uma proteína de fusão queinclua um fragmento de uma IL-21R fundida a um fragmento que não IL-21Rtal como uma região Fc de imunoglobulina, por exemplo, as proteínas defusão apresentadas nas SEQ ID NOs: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 e 27.Outros antagonistas exemplares são os anticorpos anti-IL-21R ou anti-IL-21ou fragmento de ligação de antígenos destes, formas solúveis de IL-21R,peptídeos, polinucleotídeos inibidores (por exemplo, siRNAs, SNPs eaptâmeros) e moléculas pequenas.

Em uma forma de realização, o antagonista de EL-21/IL-21R éum anticorpo anti-EL-21R ou anti-IL-21 ou um fragmento de ligação deantígeno deste. Em uma outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpode neutralização. Se desejado, o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonalou de especificidade única que se liga a IL-21 ou IL-21R ou um fragmento deligação de antígeno deste (por exemplo, um Fab, F(ab')2, Fv ou umfragmento.de Fv de cadeia única). O anticorpo pode ser humano, humanizado,quimérico ou anticorpo gerado in vitro para o polipeptídeo de IL-21 ou IL-21R.

Alternativamente, o antagonista de IL-21 ou antagonista de IL-2IR podem ser um de tamanho natural (por exemplo, uma seqüência mutada)ou um fragmento de um polipeptídeo de IL-21 ou um polipeptídeo de IL-21R(por exemplo, humano). Os antagonistas exemplares incluem, por exemplo,um domínio de ligação de receptor de IL-21 inibidor de um polipeptídeo deIL-21 (por exemplo, humano) ou o domínio extracelular de murino ou IL-21Rhumana. O antagonista de IL-21 pode ter uma seqüência de aminoácido queseja substancialmente idêntica (por exemplo, tendo pelo menos 85 %, 90 %,95 %, 98 %, 99 % de identidade de seqüência com) à IL-21R que ocorrenaturalmente (por exemplo, SEQ ID NO: 2 (humana) ou SEQ ID NO: 5(murino)) ou um fragmento destas (ver a Tabela 2). Alternativamente, oantagonista pode ter uma seqüência de aminoácido codificada por umaseqüência de nucleotídeo que seja substancialmente idêntica à IL-21R demamífero que ocorre naturalmente ou um fragmento desta (por exemplo, SEQID NO: 1 (humana) ou SEQ ID NO: 4 (murino)) ou por uma seqüência denucleotídeo que hibridize a uma das seqüências de nucleotídeo precedentessob condições severas, por exemplo, condições altamente severas (ver aTabela 1).Tabela 2: Sumário de Seqüências

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Opcionalmente, o polipeptídeo de IL-21R pode ser umpolipeptídeo solúvel incapaz de ancorar membrana. Tais polipeptídeossolúveis incluem, por exemplo, polipeptídeos de IL-21R que carecem de umaporção suficiente de seus domínios que transpõem membrana ou sãomodificados tal que o domínio que transpõem membrana não é funcional. Porexemplo, o polipeptídeo de IL-21R pode ser um fragmento solúvel de umaIL-21R (por exemplo, um fragmento de uma IL-21R contendo o domínioextracelular de murino ou IL-21R humana, incluindo uma seqüência deaminoácido de cerca dos aminoácidos de 1 a 235, 1 a 236, 20 a 235 ou 20 a236 da SEQ ID NO: 2 (humana) ou de cerca dos aminoácidos de 1 a 236 ou20 a 236 da SEQ ID NO: 5 (murino)). Os antagonistas de IL-21 exemplarespodem ter uma seqüência de aminoácido que é substancialmente idêntica aosaminoácidos de 20 a 538 da SEQ ID NO: 2 (IL-21R humana madura),aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 2 (domínio extracelular de IL-21Rhumana), aminoácidos de 1 a 236 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 20 a 235da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 20 a 236 da SEQ ID NO: 2, aminoácidosde 1 a 236 da SEQ ID NO: 5 ou aminoácidos de 20 a 236 da SEQ ID NO: 5.

Um antagonista de IL-21 da invenção também pode sercodificado pelos ácidos nucleicos que hibridizam com a seqüência denucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ IDNO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 26, sob condiçõesaltamente severas, por exemplo, como apresentada na Tabela 1. Ospolinucleotídeos isolados que codificam proteínas de EL-21R ou proteínas defusão, mas que diferem da seqüência de nucleotídeo apresentada nas SEQ IDNOs: 1, 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26, em virtude da degenerescênciado código genético, também são abrangidas pela presente invenção. Variaçõesna seqüência de nucleotídeo como apresentada nas SEQ ID NOs: 1,4, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26, que são causadas pelas mutações pontuais oupelas modificações induzidas, também são incluídas na invenção.

Se desejado, um polipeptídeo de IL-21R solúvel pode incluirou ser fundida a, uma segunda porção tal como um polipeptídeo (porexemplo, uma cadeia de imunoglobulina, uma seqüência de polipeptídeoGST, Lex-A ou MBP). Por exemplo, uma proteína de fusão pode incluir umfragmento de um polipeptídeo de IL-21R, que é capaz de ligar IL-21, talcomo um fragmento solúvel de uma IL-21R (por exemplo, um fragmentocontendo o domínio extracelular de murino ou IL-21R humana tal como osaminoácidos de 1 a 235, 1236, 20 a 235 ou 20 a 236 da SEQ ID NO: 2(humana) ou aminoácidos de 1 a 236 ou 20 a 236 da SEQ ID NO: 5 (murino))fundido a uma segunda porção (por exemplo, uma cadeia de imunoglobulina,um fragmento Fc, uma região constante de cadeia pesada de vários isotipos deimunoglobulina, incluindo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD eIgE).

Desejavelmente, o antagonista de IL-21 da invenção reduzpelo menos uma atividade biológica associada com a IL-21R que ocorrenaturalmente, incluindo, por exemplo, a capacidade para interagir com ouligar-se a um polipeptídeo de IL-21, a capacidade para associar com asmoléculas de transdução de sinal tal como Tc ou JAK1, a capacidade paraestimular a fosforilação e/ou a ativação de proteínas stat (por exemplo, Stat 5e/ou Stat 3) e a capacidade para modular (por exemplo, estimular ou diminuir)a proliferação, diferenciação, função de célula efetora, atividade citolítica,secreção de citocina e/ou sobrevivência de células imunes tais como células T(células T CD8+ e CD4+, incluindo células TH1 e TH2), células NK, célulasB, macrófagos e megacariócitos.

De acordo com a presente invenção, um polipeptídeo de IL-21é uma citocina que mostra a homologia de seqüência para IL-2, EL-4 e EL-15(Parrish-Novak et al. (2000) Nature 408: 57-63). A despeito da homologia deseqüência baixa entre citocinas de interleucina, as citocinas compartilham ummotivo secundário comum, isto é, uma estrutura de "feixe de quatro hélices"que é representativo da família. A IL-21 é expressada primariamente emcélulas T CD4+ ativadas e foi relatada ter efeitos sobre as células NK, B e T(Parrish-Novak et al. (2000) supra; Kasaian et al. (2002) Immunity 16: 559-69). A IL-21 se liga à IL-2 IR (também aludida como "MU-1," "N1LR," e"zalphall"). Na ligação à IL-21, a ativação de IL-21R leva à sinalização deStat5 e/ou Stat3 (Ozaki et al. (2000) supra).

As seqüências de aminoácido de polipeptídeos IL-21 sãopublicamente conhecidas. Por exemplo, a seqüência de nucleotídeo eseqüência de aminoácido de uma IL-21 humana está disponível no GenBankAcc. No NM_021803. A seqüência de nucleotídeo da EL-21 humanadivulgada é apresentada abaixo:

1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tetaetgttg gtaettatga gafcceagtce61 tggcaacatg gagaggattg tcatccgtct gatggtcatc. bbctfcgggga cactggtcca121 caaatcaagc tcecaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgteaac ttatagatat181 tgbbgabeag cbgaaaaabb atgfcgaatga ctbggtccefc gaatttcbgc cagctccaga241 agatgtagag acaaactgtg agbggbcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa301 gbcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgfca tcaafctaaaa agctgaagag.361 gaaaccácct tccacaaatg cagggagãag acagaaacac agactaãcat gcccttcatg421 tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca481 aaagatgatt catcágcatc egtcctctag aacacacgga agtgaagafct cctgaggatcS41 taactfcgcag ttggacacíbá tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg601 tattccaagb ggaggag (SEQIDNÒí7)

A seqüência de aminoácido do polipeptídeo da IL-21 humanadivulgada é apresentada abaixo:

MRSSPGHKERIVIC£^IFLGTI,VHKSSSQGQ^I*WEB2íPM»EI^mC^S^SCFQK&QLra

ífAGRRQKHRLTC PSCDSYBKKPPKEFIiERFKSLLQKM IHQHLSSRTHGS EDS(SEQH>NO:8)Assim, um polipeptídeo de IL-21 refere-se a uma proteína queé capaz de interagir com ou ligar-se à IL-21R e tendo uma das seguintescaracterísticas: (i) uma seqüência de aminoácido substancialmente idêntica auma IL-21 de mamífero que ocorre naturalmente ou um fragmento desta (porexemplo, a SEQ ID NO: 8 (humana)); (ii) uma seqüência de aminoácido que écodificada por uma seqüência de nucleotídeo que é substancialmente idênticaa uma seqüência de nucleotídeo de IL-21 de mamífero que ocorrenaturalmente ou um fragmento desta (por exemplo, a SEQ ID NO: 7(humana) ou um fragmento desta); (iii) uma seqüência de aminoácidocodificada por uma seqüência de nucleotídeo degenerada a uma seqüência denucleotídeo de IL-21 que ocorre naturalmente ou um fragmento desta, porexemplo, a SEQ ID NO: 7 (humana) ou um fragmento desta; ou (iv) umaseqüência de nucleotídeo que hibridize com uma das seqüências denucleotídeo precedentes sob condições severas.

Em todos os aspectos precedentes da invenção, ospolipeptídeos de IL-21 ou IL-21R podem ser fornecidos como umpolipeptídeo variante tendo uma mutação na seqüência de IL-21 ou IL-21Rque ocorre naturalmente (tipo selvagem) que resulta em afinidade mais alta(em relação à seqüência não mutada) que se liga à IL-21R ou IL-21,respectivamente. Tais mutações podem ser úteis, por exemplo, para aumentara resistência às proteólise (em relação à seqüência não mutada). Algumasseqüências de aminoácido nas seqüências divulgadas podem ser variadas semque modifique significantemente as estruturas ou função de IL-21 ou IL-21R.No geral, é possível substituir os resíduos que formam a estrutura terciária dasproteínas IL-21 ou IL-21R, contanto que os resíduos que realizam uma funçãosimilar são usados. Em outros casos, o tipo de resíduo pode sercompletamente irrelevante se uma alteração ocorre em uma área não crítica.Assim, a invenção inclui ainda variantes de IL-21 e IL-21R que mostramatividade biológica do tipo IL-21 substancial. Tais variantes incluemdeleções, inserções, inversões, repetições e substituições (por exemplo,substituição de um resíduo hidrofílico para um outro, mas não um resíduofortemente hidrofílico para um resíduo fortemente hidrofóbico). Mudançaspequenas ou substituições de aminoácido "neutras" freqüentemente terãopouco impacto sobre a função de proteína. (Taylor (1986) J. Theor. Biol. 119:205-18). As substituições conservativas podem incluir, mas não são limitadasàs substituições entre os aminoácidos alifáticos, substituições entre resíduosde amida, mudanças de resíduos básicos e substituições entre os resíduosaromáticos. Orientação adicional com respeito à mudança de aminoácido queé provável ser fenotipicamente silencioso (isto é, é improvável afetarsignificantemente a função) pode ser encontrada em Bowie et al. (1990)Science 247: 1306-10 e Zvelebil et al. (1987) J. Mol. Biol. 195: 957-61.

Opcionalmente, o antagonista de IL-21 ou EL-21R é umaproteína de fusão contendo os polipeptídeos de IL-21 ou IL-21R oufragmentos destes aqui descritos fundidos a uma segunda porção tal comouma cadeia de imunoglobulina, por exemplo, um fragmento Fc, umaseqüência de epítopo (rótulo), por exemplo, GST ou myc e seqüências bemconhecidas adicionais tais como a seqüência de polipeptídeo Lex-A ou MBP.Se desejado, a proteína de fusão pode incluir um fragmento de umpolipeptídeo de IL-21R que é capaz de ligar IL-21, tal como um fragmentosolúvel de uma IL-21R (por exemplo, um fragmento de uma IL-21R contendoo domínio extracelular de murino ou IL-21R humana em torno dosaminoácidos de 1 a 235, 1 a 236, 20 a 235 ou 20 a 236 da SEQ ID NO: 2(humana) ou em torno dos aminoácidos de 1 a 236 ou 20 a 236 da SEQ IDNO: 5 (murino) ou um fragmento idêntico à ou substancialmente idêntico aum polipeptídeo codificado pelas SEQ ID NOs: 1 ou 4) fundido a umasegunda porção (por exemplo, uma cadeia de imunoglobulina, um fragmentoFc, uma região(ões) constante(s) de cadeia pesada dos vários isotipos,incluindo: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl , IgA2, IgD e IgE).Alternativamente, a seqüência de Fc humana foi mutada em um ou maisaminoácidos (por exemplo, mutados nos resíduos 254 e 257 da SEQ ID NO:16) na seqüência que ocorre naturalmente para reduzir a ligação receptor Fc.Em uma outra forma de realização, a proteína de fusão pode incluir o domínioextracelular de IL-21R de murino (em torno dos aminoácidos de 1 a 236 ou20 a 235 da SEQ ID NO: 5 (murino)) fundida a uma cadeia Fc deimunoglobulina de murino (incluindo, mas não limitado a, IgG de murino, porexemplo, IgG2a de murino ou uma forma mutada de IgG2a de murino).

Os exemplos de proteínas de fusão antagonísticas que podemser usados nos métodos da invenção são mostrados nas FIGS. 7 a 15. Aproteína de fusão pode incluir uma seqüência de aminoácido substancialmenteidêntica à SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 ouSEQ ID NO: 27 ou uma seqüência de aminoácido codificada por umaseqüência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica às SEQ ID NOs: 10,12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26. Uma proteína de fusão exemplar contém odomínio extracelular da IL-21R humana (por exemplo, os aminoácidos de 1 a235 da SEQ ID NO: 2) fundida no terminal C por intermédio de um ligador(que corresponde aos aminoácidos 236 a 243 da SEQ ID NO: 17) à seqüênciaFc mutada da imunoglobulina Gl humana (IgGl) (que corresponde aosaminoácidos de 244 a 467 da SEQ ID NO: 17). A seqüência Fc humana foimutadas nos resíduos 254 e 257 da seqüência do tipo selvagem para reduzir aligação do receptor Fc. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido sãomostradas como SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17, respectivamente.

O segundo polipeptídeo é preferivelmente solúvel.Opcionalmente, o segundo polipeptídeo realça a meia vida, (por exemplo, ameia vida sérica) do polipeptídeo ligado. Se desejado, o segundo polipeptídeoinclui uma seqüência que facilita a associação do polipeptídeo de fusão comum segundo polipeptídeo de IL-21R ou IL-21. O segundo polipeptídeo podeincluir pelo menos uma região de um polipeptídeo de imunoglobulina. Ospolipeptídeos de fusão de imunoglobulina são conhecidos na técnica e sãodescritos, por exemplo, nas Patentes US No 5.225.538, 5.428.130, 5.514.582,5.714.147, e 5.455.165.

Opcionalmente, o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo deimunoglobulina de tamanho natural ou um fragmento deste (por exemplo,uma cadeia pesada, cadeia leve, Fab, Fab2, Fv ou Fc).

Em um exemplo, o segundo polipeptídeo tem função menosefetora do que a função efetora de uma região Fc de uma cadeia pesada deimunoglobulina do tipo selvagem. A função efetora de Fc inclui por exemplo,a fixação do complemento de ligação do receptor de Fc, e atividade queesgota a célula T (ver, por exemplo, a Patente US 6.136,310).

Os métodos para ensaiar a atividade que esgota a célula T, afunção efetora de Fc e a estabilidade de anticorpo são conhecidos na técnica.Em uma forma de realização, o segundo polipeptídeo tem afinidade baixa ounenhuma quanto ao receptor de Fc. Em uma forma de realização alternativa, osegundo polipeptídeo tem afinidade baixa ou nenhuma para a proteína decomplemento Clq.

Uma segunda seqüência de polipeptídeo preferida inclui aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 6. Esta seqüência inclui uma regiãoFc. Os aminoácidos sublinhados são aqueles que diferem dos aminoácidosencontrados nas posições correspondentes da seqüência de imunoglobulina dotipo selvagem:

Hl*CPPCmPEALGAPS WLPPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQGNvwscsvm£^amnsH:QKBhsLswQK (SEQ ID NQ:6)

As proteínas de fusão podem adicionalmente incluir umaseqüência(s) ligadora(s) que unem a primeira porção à segunda porção. Porexemplo, a proteína de fusão pode incluir um peptídeo ligador de cerca de 4 aaminoácidos, mais preferivelmente de 5 a 10 aminoácidos no comprimentoe o mais preferivelmente de cerca de 8 aminoácidos no comprimento. Osaminoácidos no peptídeo ligador podem incluir, por exemplo, Gly, Ser, Asn,Thr e Ala. Assim, um peptídeo ligador pode consistir de um elemento Gly-Ser. Em uma outra forma de realização, a proteína de fusão inclui umpeptídeo ligador tendo a fórmula (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y, em que "y" é 1, 2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

Em uma outra forma de realização, as seqüências deaminoácido adicionais podem ser adicionadas ao terminal N ou C da proteínade fusão para facilitar a expressão, detecção e/ou isolação ou purificação. Porexemplo, uma proteína de fusão de IL-21/IL-21R podem ser ligados a uma oumais porções adicionais, por exemplo, rótulos GST (isto é, glutationa 5-transferase), His, FLAG ou myc. Por exemplo, a proteína de fusão podeadicionalmente incluir um peptídeo GST em que as seqüências de proteína defusão são fundidas ao terminal C das seqüências de GST. Tais proteínas defusão facilitam a purificação ou identificação da proteína de fusão de IL-21R/MU-1. Em uma outra forma de realização, as seqüências de aminoácidosadicionais podem ser adicionadas ao terminal N ou C da proteína de fusãopara facilitar a expressão, flexibilidade estérica, detecção e/ou isolação oupurificação.

A proteína de fusão também pode incluir uma seqüência desinal heteróloga no seu terminal N. Por exemplo, a seqüência de sinal de IL-2IR nativa pode ser removida e substituída com uma seqüência de sinal deuma outra proteína. Em certas células hospedeiras (por exemplo, célulashospedeiras de mamífero), a expressão e/ou secreção de IL-21R podem seraumentadas usando uma seqüência de sinal heteróloga. Um peptídeo de sinalque pode ser incluída na proteína de fusão é MPLLLLLLLLPSPLHP (SEQID NO: 9). Se desejado, um ou mais aminoácidos podem ser adicionalmenteinseridos entre a primeira porção de polipeptídeo que compreende a porçãoIL-21R/MU-1 e a segunda porção de polipeptídeo.Os antagonistas de EL-21/IL-21R aqui descritos podem serderivatizados ou ligados a uma outra molécula funcional, por exemplo, umoutro peptídeo ou proteína (por exemplo, um fragmento Fab'). Por exemplo, aproteína de fusão ou um anticorpo ou porção de ligação de antígeno, podemser funcionalmente ligados (por exemplo, pela ligação química, fusãogenética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outrasentidades moleculares, tais como um anticorpo (por exemplo, um anticorpobiespecífico ou um multispecífico), toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicosou citostáticos, entre outros.

Uma proteína quimérica ou de fusão da invenção pode serproduzida pelas técnicas de DNA recombinantes padrão. Por exemplo,fragmentos de DNA que codificam as seqüências de polipeptídeo diferentessão ligadas entre si na matriz de acordo com técnicas convencionais, porexemplo, pela utilização de terminais de extremidade abrupta ou deextremidade pegajosa para a ligação, digestão de enzima de restrição paracriar terminais apropriados, preenchimento de extremidades pegajosas comoapropriado, tratamento com a fosfatase alcalina para evitar a ligaçãoindesejável e a ligação enzimática. Em uma outra forma de realização, o genede fusão pode ser sintetizados pelas técnicas convencionais incluindosintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, a amplificação pelaPCR de fragmentos de gene pode ser realizada usando iniciadores âncora quedão origem a projeções complementares entre os dois fragmentos de geneconsecutivos que podem ser subseqüentemente recozidos e reamplificadospara gerar uma seqüência de gene quimérica (ver, por exemplo, Ausubel etal., supra). Além disso, muitos vetores de expressão que codificam umaporção de fusão (por exemplo, uma região Fc de uma cadeia pesada deimunoglobulina) são comercialmente disponíveis. Um ácido nucleico quecodifica IL-21R/MU-1 ou IL-21 pode ser clonado em um tal vetor deexpressão tal que a porção de fusão é ligado na matriz à proteína deimunoglobulina. Em algumas formas de realização, os polipeptídeos de fusãode IL-21R/MU-1 ou EL-21 existe em como oligômeros, tais como dímeros outrímeros. Um monômero e/ou ácidos nucleicos de IL-21R/MU-1 ou IL-21 quecodificam uma IL-21 R/MU-1 ou EL-21, podem ser construídos usandométodos conhecidos na técnica.

Produção de Ácidos Nucleicos

Os polinucleotídeos isolados da invenção podem seroperavelmente ligados a uma seqüência de controle de expressão, tal como osvetores de expressão pMT2 ou pED divulgados em Kaufman et al. (1991)Nucl. Acids Res. 19: 4485-90, de modo a produzir os polipeptídeos IL-21Rou IL-21 (incluindo fragmentos e fusões destes) recombinantemente. Muitasseqüências de controle de expressão adequados são conhecidos na técnica. Osmétodos gerais de expressar proteínas recombinantes também são conhecidase são exemplificadas em Kaufman (1990) Meth. Enzym. 185: 537-66. Comoaqui definido "operavelmente ligado" significa enzimática ou quimicamenteligados para formar uma ligação covalente entre os polinucleotídeo isoladosda invenção e a seqüência de controle de expressão em um tal meio que opolipeptídeo IL-21R ou IL-21 é expressado por uma célula hospedeira que foitransformada (transfectada) com a seqüência de controle depolinucleotídeo/expressão ligada.

O termo "vetor," como aqui usado, é intencionado a se referira uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácidonucleico ao qual o mesmo foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo," quese refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual segmentosde DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetorviral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genomaviral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célulahospedeira na qual os mesmos são introduzidos (por exemplo, vetoresbacterianos tendo uma origem, bacteriana de replicação e vetores demamífero epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos nãoepissômicos) podem ser integrados no genoma de um célula hospedeira naintrodução na célula hospedeira e aí são replicados junto com o genomahospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressãode genes aos quais eles estão operativamente ligados. Tais vetores são aquialudidos como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente,"vetores de expressão"). No geral, os vetores de expressão de utilidade emtécnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos.No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usadosintercambiavelmente visto que o plasmídeo é a forma mais habitualmenteusada de vetor. Entretanto, a invenção é intencionada a incluir outras taisformas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo,retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados defeituosos de replicação),que servem para funções equivalentes.

As construções de expressão recombinante da invenção podemcarregar seqüências adicionais, tais como seqüências regulatórias (isto é, asseqüências que regulam a replicação do vetor, por exemplo, as origens dereplicação, transcrição da seqüência de nucleotídeo que codificam opolipeptídeo (ou peptídeo) de interesse ou expressão do polipeptídeocodificado), as seqüências de rótulo tais como histidina e os genes marcadoresselecionáveis. O termo "seqüência reguladora" é intencionada a incluirpromotores, realçadores e quaisquer outros elementos de controle deexpressão (por exemplo, sinais de poliadenilação, sítios de junção detranscrição) que controlam a transcrição, replicação ou tradução. Taisseqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel, GeneExpression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, SanDiego, CA (1990). Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que oplanejamento do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüênciasreguladoras, dependerá de vários fatores, incluindo a escolha da célulahospedeira e do nível de expressão de proteína desejado. As seqüênciasreguladoras preferidas para a expressão de proteínas em células hospedeirasde mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis deexpressão de proteína, tais como promotores e/ou realçadores derivados dopromotor FF-la e BGH poli A, citomegalovírus (CMV) (por exemplo, opromotor/realçador de CMV), vírus Símio 40 (SV40) (por exemplo, opromotor/realçador de SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardioprincipal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Os elementos reguladoresvirais e seqüências destes, são descritos, por exemplo, nas Patentes US Nos5.168.062, 4.510.245 e 4.968.615.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podemcarregar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicaçãodo vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação eseqüências terminadoras) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcadorselecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foiintroduzido (ver, por exemplo, as Patentes US Nos 4.399.216, 4.634.665 e5.179.017, todos por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene marcadorselecionável confere resistência da célula hospedeira transfectada outransformada com o marcador selecionável aos compostos tais como G418(geneticina), higromicina ou metotrexato. Os marcadores de geneselecionáveis preferidos incluem o gene da diidrofoliato redutase (DHFR)(para o uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação emmetotrexato), o gene neo (para seleção em G418) e genes que conferemresistência à tetraciclina e/ou ampicilina à bactéria.

Os vetores adequados, contendo as seqüências reguladorasapropriadas, incluindo as seqüências promotoras, seqüências terminadoras,seqüências de poliadenilação, seqüências realçadoras, genes marcadores eoutras seqüências como apropriado, podem ser escolhidas ou construídas. Aexpressão de proteínas indutíveis, obtidas usando-se vetores com seqüênciaspromotoras indutíveis, tais como vetores indutíveis com tetraciclina, porexemplo, pTet-On(e pTet-Off((Clontech, Paio Alto, CA), também podem serusados no método divulgado. Para mais detalhes com repeito aos vetores deexpressão, ver, por exemplo, Sambrook et al., supra. Muitas técnicas eprotocolos conhecidos para a manipulação de ácidos nucleicos, por exemplo,na preparação de construções de ácido nucleico, mutagênese,seqüenciamento, introdução de DNA em células, expressão de gene e análisede proteínas, também estão descritos em detalhes em Sambrook et al., supra.

Vários tipos de células podem atuar como células hospedeirasadequadas para a expressão da IL-21 R/MU-1 ou IL-21 ou proteína de fusãodestas. Qualquer tipo de célula capaz de expressar proteína de IL-21 R/MU-1ou IL-21 funcionais ou fusão destas pode ser usado. As células hospedeiras demamífero adequadas incluem, por exemplo, as células COS de macaco, ascélulas do Ovário do Hamster Chinês (CHO), as células 293 de rim humano,as células A431 da epiderme humana, as células Colo205 humanas, as células3T3, as células CV-1, outras linhagens de célula de primata transformadas,células diplóides normais, cepas de célula derivadas de cultura in vitro detecido primário, explantes primários, células HeLa, células L de camundongo,células BHX, HL-60, U937, HaK, C3H10T1/2, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1,PC12,MlxouC2C12.

O polipeptídeo de IL-21R ou IL-21 ou proteína de fusão destetambém podem ser produzidos ligando-se operavelmente o polinucleotídeoisolado da invenção às seqüências de controle adequado em um ou maisvetores de expressão de inseto e utilizando um sistema de expressão de inseto.Materiais e métodos para sistemas de expressão de baculovírus/Sf9 sãocomercialmente disponíveis na forma de kit (por exemplo, o kit MAXBAC®,Invitrogen, Carlsbad, CA). As formas solúveis dos polipeptídeos aquidescritos também podem ser produzidos em células de inseto usandopolinucleotídeos isolados apropriados como descrito acima.Alternativamente, o polipeptídeo de EL-21R ou LL-21 ouproteína de fusão destes podem ser produzidos em eucariotas inferiores taiscomo levedura ou em procariotas tais como bactérias. As cepas de leveduraadequadas incluem as cepas de Saccharomyces cerevisiae,Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, Cândida ou qualquer cepa delevedura capaz de expressar proteínas heterólogas. As cepas bacterianasadequadas incluem Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonellatyphimurium ou qualquer cepa bacteriana capaz de expressar proteínasheterólogas. A expressão em bactérias pode resultar na formação de corpos deinclusion que incorporam a - proteína recombinante. Assim, a redobra daproteína recombinante pode ser requerida de modo a produzir material ativoou mais ativo. Diversos métodos para a obtenção de proteínas heterólogascorretamente dobrada a partir de corpos de inclusão bacteriana são conhecidosna técnica. Estes métodos no geral envolvem solubilizar a proteína dos corposde inclusão, depois de desnaturar a proteína completamente usando um agentecaotrópico. Quando resíduos de cisteína estão presentes na seqüência deaminoácido primária da proteína, é freqüentemente necessário realizar aredobra em um ambiente que segue a formação correta de ligações dedissulfeto (um sistema redox). Os métodos gerais de redobra são divulgadosem Kohno (1990) Meth. Enzym. 185: 187-95, EP 0433225 e Patente US5.399.677.

Uma proteína da invenção (ou um fragmento ou fusão desta)também pode ser expressada como um produto de animais transgênicos, porexemplo, como um componente do leite de vacas, cabras porcos ou ovelhastransgênicos que são caracterizados pelas células somáticas ou germinativascontendo uma seqüência de polinucleotídeo, por exemplo, que codifique a IL-2 IR ou IL-21 ou proteína de fusão destas. Consequentemente, a proteína podeser preparada pelo crescimento de uma cultura de células hospedeirastransformadas sob condições de cultura necessárias para expressar a proteínadesejada. A proteína expressada resultante pode ser depois purificada a partirdo meio de cultura ou extratos de célula. As formas solúveis da proteínapodem ser purificadas a partir de meios condicionados. As formas ligadas àmembrana da proteína EL-21R da invenção pode ser purificada preparando-seuma fração de membrana total da célula expressante e extraindo asmembranas com um detergente não iônico tal como TRITON® X-100 (EMDBiosciences, San Diego, CA).

Os polipeptídeos aqui descritos podem ser purificados usandométodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, aproteína da invenção pode ser concentrada usando um filtro de concentraçãode proteína comercialmente disponível, por exemplo, usando-se uma unidadede ultrafiltração AMICONÒ ou PELLICONÒ (Millipore, Billerica, MA). Aseguir da etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado a umamatriz de purificação tal como um meio de filtração em gel.Alternativamente, uma resina trocadora de íon pode ser utilizada, porexemplo, uma matriz ou substrato tendo grupos dietilaminoetila (DEAE) oupolietilenoimina (PEI) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose,dextrano, celulose ou outros tipos habitualmente utilizados na purificação deproteína. Alternativamente, uma etapa de troca de cátion pode ser utilizada.

Os trocadores de cátion adequados incluem várias matrizes insoluveis quecompreende grupos sulfopropila ou carboximetila. Os grupos sulfopropila sãopreferidos (por exemplo, colunas S-SEPHAROSEÒ, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO). A purificação da proteína IL-21R/MU-1 ou proteína dosobrenadante de cultura também pode incluir uma ou mais etapas de colunaem tais resinas de afinidade tais como concanavalina A-agarose, AF-HEPARIN650, heparina-TOYOPEARLÒ ou Azul de Cibacron 3GASEPHAROSEÒ (Tosoh. Biosciences, San Francisco, CA); ou pelacromatografia de interação hidrofóbica usando resinas tais como éter fenílico,éter butílico ou éter propílico; ou pela cromatografia de imunoafinidade.Finalmente, uma ou mais etapas de cromatografia de alto desempenho de fasereversa (RP-HPLC) utilizando meios de RP-HPLC hidrofóbicos, porexemplo, gel de sílica tendo metila pendente ou outros grupos alifáticos, podeser utilizado para purificar ainda mais a proteína IL-21R/MU-1 ou IL-21. Ascolunas de afinidade incluindo anticorpos para a proteína da invenção tambémpodem ser usadas na purificação de acordo com métodos conhecidos.Algumas ou todas das etapas de purificação precedentes, em váriascombinações ou com outros métodos conhecidos, também podem serutilizadas para fornecer uma proteína recombinante isolada substancialmentepurificada. Preferivelmente, a proteína isolada é purificada de modo que amesma seja substancialmente livre de outras proteínas de mamífero.

Produção de Anticorpos

Os polipeptídeos IL-21 ou IL-21R da invenção podem serusados para imunizar animais para obter anticorpos policlonais e monoclonaisque especificamente reagem com a IL-21 ou IL-21R e regulam a expressão ouatividade de IL-21 e/ou IL-21R ou regulam o nível de interação de IL-21 comIL-21R. Tais anticorpos podem ser obtidos, por exemplo, usando a IL-21Rinteira ou fragmentos destas como imunógenos. Os imunógenos de peptídeopodem adicionalmente conter um resíduo de cisteína no terminal carboxila eser conjugados a um hapteno tal como a hemocianina do lapa buraco defechadura (KLH). Os imunógenos peptídicos adicionais podem ser geradospela substituição de resíduos de tirosina com resíduos de tirosina sulfatados.Os métodos para sintetizar tais peptídeos são conhecidos na técnica, porexemplo, como em Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soe. 85: 2149-54 eKrstenansky e Mao (1987) FEBS Lett. 211:10-16.

Os anticorpos monoclonais humanos (mAbs) direcionadoscontra IL-21 ou IL-21R podem ser gerados usando camundongos transgênicosque carregam os genes da imunoglobulina humana ao invés do sistema decamundongo. Os esplenócitos destes camundongos transgênicos imunizadoscom o antígeno de interesse são usados para produzir hibridomas quesecretam mAbs humanas com afinidades específicas para epitopos de umaproteína humana (ver, por exemplo, a WO 91/00906, WO 91/10741, WO92/03918, WO 92/03917, Lonberg et al. (1994) Narure 368: 856-59, Green etal. (1994) Nat. Genet. 7: 13-21, Morrison et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei.USA. 81: 6851-55 e Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90:3720-24).

Os anticorpos monoclonais também podem ser gerados poroutros métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica da tecnologiade DNA recombinante. Um método exemplar, aludido como o método de"demonstração de anticorpo combinatório", foi desenvolvido para identificare isolar fragmentos de anticorpo tendo uma especificidade de antígenoparticular e pode ser utilizado para produzir anticorpos monoclonais (para asdescrições de demonstração de anticorpo combinatório ver, por exemplo,Sastry et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 86: 5728-32; Huse et al.(1989) Science 246: 1275-81; e Orlandi et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei.USA. 86: 3833-37). Depois de imunizar um animal com um imunógeno comodescrito acima, o repertório de anticorpo da reunião de célula B resultante éclonado. A seqüência de DNA das regiões variáveis de uma populaçãodiversa de moléculas de imunoglobulina pode ser obtida usando uma misturade iniciadores oligoméricos e PCR. Por exemplo, os iniciadores deoligonucleotídeo mistos que correspondem às seqüências líder 5' (peptídeo desinal) e/ou seqüências de esqueleto 1 (FR1), assim como iniciador para uminiciador constante da região 3' conservada podem ser usados para aamplificação pela PCR das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de váriosanticorpos de murino (Larrick et al. (1991) BioTechniques 11: 152-56). Umaestratégia similar também pode ser usada para amplificar as regiões variáveisde cadeia pesada e leve humanas a partir de anticorpos humanos (Larrick etal. (1991) Methods: Companion to Methods in Enzymology 2: 106-10).Os anticorpos quiméricos, incluindo as cadeias deimunoglobulina quiméricas, também pode ser produzidas pelas técnicas deDNA recombinante conhecidas no ramo. Por exemplo, um gene que codificaa região constante Fc de uma molécula de anticorpo monoclonal de murino(ou outra espécie) é digerido com enzimas de restrição para remover a regiãoque codifica a Fc de murino e a porção equivalente de um gene que codificauma região constante de Fc humana é substituída (ver a PCT/US86/02269; EP184.187; EP 171.496; EP 173.494; WO 86/01533; Patente US 4.816.567; EP125.023; Better et al. (1988) Science 240: 1041-43; Liu et al. (1987) Proc.Natl. Acad. ScL USA. 84: 3439-43; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-26; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 84: 214-18; Nishimura et al.(1987) Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-49; eShaw et al. (1988) J. Natl. Câncer Inst. 80: 1553-59).

Se desejado, um anticorpo ou uma cadeia de imunoglobulinapodem ser humanizados pelos métodos conhecida na técnica. Os anticorposhumanizados, incluindo cadeias de imunoglobulina humanizadas, podem sergerados pela substituição de seqüências da região variável Fv que não estãodiretamente envolvidos na ligação de antígeno com seqüências equivalentesdas regiões variáveis de Fv humana. Os métodos gerais para gerar anticorposhumanizados são fornecidos por Morrison (1985) Science 229: 1202-07; Oi etal. (1986) BioTechniques 4: 214-21; e Patente USs 5.585.089, 5.693.761 e5.693.762, todas as quais são por meio deste incorporadas por referência emsuas totalidades. Estes métodos incluem isolar, manipular e expressar asseqüências de nucleotídeo que codifica toda ou parte das regiões variáveis daFv de imunoglobulina de pelo menos uma de uma cadeia pesada ou leve. Asfontes de tal ácido nucleico são bem conhecidas por aqueles habilitados natécnica e, por exemplo, podem ser obtidas a partir de um hibridoma queproduz um anticorpo contra um alvo pré determinado. O DNA recombinanteque codifica o anticorpo humanizado ou fragmento deste, pode ser depoisclonado em um vetor de expressão apropriado.

As moléculas de anticorpo humanizadas ou enxertadas emCDR ou imunoglobulinas podem ser produzidas pelo enxerto com CDR ousubstituição de CDR, em que uma, duas ou todas as CDRs de uma cadeia deimunoglobulina podem ser substituídas. Ver por exemplo, a Patente US5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-25; Verhoeyan et al. (1988)Science 239: 1534-36; e Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-60, todasas quais são por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades.A Patente US 5.225.539 descreve um método de enxertar CDR que pode serusado para preparar anticorpos humanizados da presente invenção (vertambém, GB 2188638A). Todas as CDRs de um anticorpo humano particularpodem ser substituídas com pelo menos uma porção de uma CDR nãohumana ou apenas algumas das CDRs podem ser substituídas com CDRs nãohumanas. É apenas necessário substituir o número de CDRs requeridas para aligação do anticorpo humanizado a um antígeno pré determinado.

Os anticorpos monoclonais, quiméricos e humanizados, queforam modificados, por exemplo, pela deleção, adição ou substituição deoutras porções do anticorpo, por exemplo, a região constante, também estãodentro do escopo da invenção. Por exemplo, um anticorpo pode sermodificado como segue: (i) pela deleção da região constante; (ii) pelasubstituição da região constante com uma outra região constante, porexemplo, um região constante intencionada a aumentar a meia vida,estabilidade ou afinidade do anticorpo ou uma região constante de uma outraespécie ou classe de anticorpo; ou (iii) pela modificação de um ou maisaminoácidos na região constante para alterar, por exemplo, o número de sítiosde glicosilação, função de célula efetora, ligação de receptor Fc (FcR),fixação de complemento, entre outros.

Os métodos para alterar uma região constante de anticorpo sãoconhecidos na técnica. Os anticorpos com função alterada (por exemplo,afinidade alterada para um ligando efetor, tal como FcR em uma célula ou ocomponente Cl de complemento) podem ser produzidos pela substituição depelo menos um resíduo de aminoácido na porção constante do anticorpo comum resíduo diferente (ver, por exemplo, EP 388.151 Al, Patentes US Nos5.624.821 e 5.648.260, todas as quais são por meio deste incorporadas porreferência em suas totalidades). Os tipos similares de alterações tambémpodem ser aplicados às imunoglobulinas de murino e às imunoglobulinas deoutras espécies. Por exemplo, é possível alterar a afinidade de uma região deFc de um anticorpo (por exemplo, uma IgG, tal como uma IgG humana) porum FcR (por exemplo, Fc gama RI) ou para a ligação de Clq pelasubstituição do(s) resíduo(s) especificados com um resíduo(s) tendo umafuncionalidade apropriada na sua cadeia lateral ou pela introdução de umgrupo funcional carregado, tal como glutamato ou aspartato ou talvez umresíduo não polar aromático tal como fenilalanina, tirosina, triptofano oualanina (ver, por exemplo, a Patente US 5.624.821).

Os anticorpos humanos para IL-21 e/ou IL-21R podem seradicionalmente produzidos usando amimais não humanos transgênicos quesão modificados de modo a produzir anticorpos totalmente humanos ao invésdos anticorpos endógenos do animal em resposta à inoculação por umantígeno. Ver, por exemplo, a publicação PCT WO 94/02602. Os genesendógenos que codificam as cadeias de imunoglobulina leves e pesadas nohospedeiro não humano foram incapacitados e os locais ativos que codificamas imunoglobulinas de cadeia pesada e leve humanas são inseridos no genomado hospedeiro. Os genes humanos são incorporados, por exemplo, usandocromossomas artificiais de levedura contendo os segmentos de DNA humanosnecessários. Um animal que fornece todas as modificações desejadas é depoisobtido como progênie cruzando-se animais transgênicos intermediárioscontendo menos do que o complemento completo das modificações. Umaforma de realização de um tal animal não humano é um camundongo e échamado de XENOMOUSE como divulgado nas publicações PCT WO96/33735 e WO 96/34096. Este animal produz células B que secretamimunoglobulinas completamente humana. Os anticorpos podem ser obtidosdiretamente do animal depois da imunização com um imunógeno de interesse,como, por exemplo, uma preparação de um anticorpo policlonal oualternativamente de células B imortalizadas derivadas do animal, tais comohibridomas que produzem anticorpos monoclonais. Adicionalmente, os genesque codificam as imunoglobulinas com regiões variáveis humanas podem serrecuperados e expressados para se obter os anticorpos diretamente ou podemser ainda modificados para se obter análogos de anticorpos tais como, porexemplo, moléculas Fv de cadeia única.

Outras moléculas que ligam proteína também podem serutilizadas para modular a atividade de IL-21 e/ou IL-21R. Tais moléculas deligação de proteína incluem medicamentos imunofarmacêuticos modularespequenos (SMIPTm) (Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA). Os SMIPs sãopolipeptídeos de cadeia única compostos de um domínio de ligação para umaestrutura cognata tal como um antígeno, um contra-receptor ou coisa parecida,um polipeptídeo da região de dobradiça tendo um ou nenhum resíduo decisteína e os domínios de imunoglobulina CH2 e CH3 (ver tambémwww.trubion.com). Os SMIPs e seus usos e aplicações são divulgados, porexemplo, nos Pedidos de Patente Publicados US Nos 2003/0118592,2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/ 0175614,2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028,2005/0202534 e 2005/0238646 e seus membros de família de patentesrelacionados, todas as quais são por meio deste aqui incorporadas porreferência em suas totalidades.

Como aqui debatido, os anticorpos neutralizadores ou nãoneutralizadores (preferivelmente anticorpos monoclonais) que se ligam à IL-2IR ou IL-21 ou uma proteína de fusão desta podem ser úteis no tratamentode condições imunes tais como fibrose e condições associadas com a fibrose.

Consequentemente, a presente invenção fornece aindacomposições que compreendem um anticorpo que especificamente reage comuma IL-21 ou EL-21R ou uma proteína de fusão desta.

Ensaios de Triagem

Os polipeptídeos ou proteínas de fusão de IL-21R ou IL-21 dainvenção também podem estar usados para triar quanto aos agentes que sãocapazes de ligar-se à IL-21 ou EL-21R e regular o nível de IL-21 e/ou IL-21R,por exemplo, o nível de atividade de IL-21 e/ou IL-21R, o nível de expressãode IL-21 e/ou IL-21R (por exemplo, o nível de produtos de gene de IL-21e/ou IL-21R) e/ou o nível de interação entre IL-21 e IL-21R. Os ensaios deligação usando uma proteína da invenção ou um parceiro de ligação desta,que podem ser livres ou imobilizados a um suporte, são bem conhecidos natécnica. Os ensaios de triagem com base em célula ou com base em proteína(isento de célula) purificados podem ser usados para identificar parceiros deligação e/ou ligandos (naturais ou sintéticos, por exemplo, compostos deteste) para polipeptídeos ou proteínas de fusão de IL-21R ou IL-21 dainvenção. Por exemplo, a IL-21R pode ser imobilizada na forma purificadaem um carreador e a ligação de ligandos potenciais para IL-21R podem sermedidos.

Métodos para Diagnosticar, Prognosticar e Monitorar oprogresso da Fibrose e Distúrbios associados com a fibrose, Relacionadoscom a IL-21

A presente invenção fornece métodos para diagnosticar,prognosticar e monitorar o progresso (por exemplo, monitorar o curso detratamento) de distúrbios, isto é, fibrose ou condições ou distúrbios associadoscom a fibrose, relacionados com a IL-21 e/ou IL-21R, por exemplo,detectando-se e/ou medindo-se o nível de IL-21 e/ou IL-21R, em que a frase"nível de IL-21 e/ou IL-21R" e equivalentes desta incluem, mas não sãolimitados a, (1) o nível de expressão de produtos de gene de IL-21 e/ou IL-2IR (por exemplo, o nível de proteína e/ou mRNA de IL-21 e/ou IL-21R emuma célula ou amostra de interesse); (2) o nível de atividade de proteína deIL-21 e/ou proteína de IL-21R (por exemplo, expressão e/ou função decitocina TH2 em uma célula ou amostra de interesse); e (3) o nível deinteração de EL-21 com IL-21R (por exemplo, em uma célula ou amostra deinteresse). Por exemplo, a invenção fornece métodos de diagnosticar,prognosticar e monitorar, por exemplo, pela detecção da super regulagem ouinfra regulagem de produtos de gene de IL-21 e/ou IL-21R e/ou atividade e/oupela medição da interação de IL-21 com IL-21R, etc. (incluindo mas nãolimitado ao uso de tais métodos em pacientes humanos). Os níveis de IL-21e/ou IL-21R também podem ser medido em uma célula de referência ouamostra de interesse para produzir ou obter um nível de referência de IL-21e/ou IL-21R ou tal nível de referência pode ser obtido através de outrosmétodos ou podem ser no geral conhecidos, por uma pessoa de habilidade natécnica. Estes métodos podem ser realizados, por exemplo, utilizando-se kitsde diagnósticos pré embalados que compreendem pelo menos um do grupoque compreende um polinucleotídeo de IL-21 ou IL-21R (ou fragmentosdeste); um polipeptídeo de IL-21 ou IL-21R (ou fragmentos e/ou proteínas defusão deste); um anticorpo para um polipeptídeo de IL-21 ou IL-21R (ouderivados deste ou fragmento de ligação de antígenos deste); ou moduladoresde polinucleotídeos e/ou polipeptídeos IL-21 ou IL-21R como aqui descrito,que podem ser convenientemente usados, por exemplo, em um cenárioclínico.

"Diagnóstico" ou "diagnosticar" significam identificar apresença ou ausência de uma condição patológica. Os métodos de diagnósticoincluem, mas não são limitados a, detectar a super regulagem do nível de IL-21 e/ou IL-21R pela determinação de uma quantidade de teste dos produtos degene (por exemplo, RNA, cDNA ou polipeptídeo, incluindo fragmentosdestes) de EL-21 e/ou EL-21R, pela medição da atividade de IL-21 e/ou IL-2IR e/ou pela medição do nível de interação de IL-21 com IL-21R, em umaamostra biológica de um paciente (mamífero humano ou não humano) ecomparando a quantidade de teste com, por exemplo, uma quantidade oufaixa normais (por exemplo, uma quantidade ou faixa de um indivíduo(s)conhecido(s) não sofrer de distúrbios relacionados com a IL-21 ou de umindivíduo conhecido não sofrer de fibrose ou uma condição associada com afibrose). Embora um método de diagnóstico particular possa não fornecer umdiagnóstico definitivo de distúrbios relacionados com a IL-21, é suficienteque o método forneça uma indicação positiva que ajude no diagnóstico.

A presente invenção também fornece métodos paraprognosticar tais distúrbios pela detecção, por exemplo, pela super regulagemdos níveis de IL-21 e/ou IL-21R, por exemplo, pela detecção da superregulagem de produtos de gene de IL-21 e/ou IL-21R e/ou atividade e/ou pelamedição do nível de interação de IL-21 com IL-21R, etc. "Prognóstico" ou"prognosticar" significam predizer o desenvolvimento provável e/ougravidade de uma condição patológica. Os métodos de prognóstico incluemdeterminar a quantidade de teste de um produto de gene de IL-21 e/ou IL-21Rem uma amostra biológica de um paciente e comparando a quantidade testecom uma quantidade ou faixa de prognóstico (isto é, uma quantidade ou faixade indivíduos com gravidades variáveis de distúrbios, isto é, fibrose e/ou umacondição associada com a fibrose, por exemplo, relacionadas com a IL-21)quanto ao nível de IL-21 e/ou IL-21R. Várias quantidades relacionadas com onível de IL-21 e/ou IL-21R em uma amostra de teste são compatíveis comcertos prognósticos quanto aos distúrbios, por exemplo, fibrose ou condiçõesou distúrbios associados com a fibrose, relacionados com a IL-21 e/ou IL-2IR. A detecção de uma quantidade do nível de IL-21 e/ou IL-21R em umnível de prognóstico particular fornece um prognóstico para o paciente.

A presente invenção também fornece métodos para monitoraro progresso ou o curso de tais distúrbios relacionados com a IL-21 peladetecção, por exemplo, da super regulagem do níveis de EL-21 e/ou EL-21R,por exemplo, pela detecção da super regulagem de produtos de gene de EL-21e/ou EL-21R, atividade e/ou a interação de IL-21 com EL-21R. Os métodos demonitoramento incluem determinar as quantidades de teste de um produto degene de IL-21 em amostras biológicas tiradas de um paciente em umaprimeira e segunda vez e comparando as quantidades. Uma mudança naquantidade de um produto de gene de DL-21 e/ou IL-21R entre a primeira esegunda vezes indica uma mudança no curso de um Distúrbio relacionadocom a IL-21, com uma diminuição na quantidade indicando a remissão de taisdistúrbios e um aumento na quantidade indicando a progressão de taisdistúrbios. Tais ensaios de monitoramento também são úteis para avaliar aeficácia de uma intervenção terapêutica particular em pacientes que sãotratados quanto a fibrose ou um distúrbio associado com a fibrose.

Medição do nível de IL-21 e/ou IL-21R

O nível de IL-21 e/ou IL-2 IR (por exemplo, o nível deprodutos de gene, atividade e/ou interação de IL-21 e/ou IL-21) nos métodosda invenção (por exemplo, métodos para triar quanto a e/ou identificar umcomposto para tratar, melhorar ou prevenir a fibrose ou uma condiçãoassociada com a fibrose, métodos de diagnosticar, apresentar e/ou monitorar oprogresso da fibrose ou de uma condição associada com a fibrose e métodosde tratar, melhorar ou prevenir a fibrose ou uma condição associada com afibrose) aqui esboçados podem ser medidos em uma variedade de amostrabiológicas, incluindo fluidos corporais (por exemplo, sangue integral, plasmae urina), células (por exemplo, células integrais, frações de célula e extratosde célula) e outros tecidos. As amostras biológicas também incluem seções detecido, tais como biópsias e seções congeladas coletadas com propósitoshistológicos. As amostras biológicas preferidas incluem sangue, plasma,linfônodo, biópisas de tecido, urina, CSF (fluido cerebroespinal), fluidosinovial e BAL (lavagem bronquioalveolar). Será avaliado que a análise deuma amostra biológica não precisa necessariamente requerer a remoção decélulas ou tecido do paciente. Por exemplo, agentes apropriadamenterotulados que se ligam a produtos de gene de IL-21 e/ou EL-21R (porexemplo, anticorpos, ácidos nucleicos) podem ser administrados a umpaciente e visualizados (quando ligados ao alvo) usando a tecxnologia deformação de imagem padrão (por exemplo, CAT, RMN (MRI) e PET).

Nos métodos de tratar, melhorar ou prevenir a fibrose ou umdistúrbio associado com a fibrose, nos métodos para identificar um compostopara tratar, melhorar ou prevenir a fibrose ou um distúrbio associado com afibrose em um paciente e nos ensaios e métodos de diagnóstico, prognóstico emonitoramento da presente invenção, o nível de IL-21 e/ou IL-21R édetectado e medido para produzir uma quantidade de teste. A quantidade deteste é depois comparada com, por exemplo, uma quantidade ou faixanormais. Por exemplo, uma quantidade acima (por exemplo, um nível maisalto) da quantidade ou faixa normais é um sinal positivo no diagnóstico dedistúrbios relacionados com a IL-21.

As quantidades normais ou níveis de referência de IL-21 e/ouIL-21R podem ser determinados para qualquer tipo e população de amostraparticular. No geral, os níveis de referência (normal) de IL-21 e/ou IL-21Rsão determinados pela medição de níveis respectivos de IL-21 e/ou IL-21Rem uma amostra biológica tipo de pacientes normais (isto é, saudáveis).Alternativamente, os níveis normais de IL-21 e/ou IL-21R podem serdeterminados pela medição da quantidade em células ou tecidos saudáveistirados do mesmo paciente do qual as células ou tecidos de teste doentes (oupossivelmente doentes) foram tirados. O nível de IL-21 e/ou IL-21R (aquantidade normal ou a quantidade de teste) pode ser determinado ouexpressado em uma base em célula, em proteína total ou em volume. Paradeterminar a quantidade de célula de um amostra, pode-se medir o nível deum produto de gene constitutivamente expressado ou outro produto de geneexpressados em níveis conhecidos em células do tipo do qual a amostrabiológica foi tirada.

Será avaliado que os métodos de ensaio da presente invençãonão requerem necessariamente a medição de valores absolutos para o nível deIL-21 e/ou EL-21R porque valores relativos são suficientes para muitasaplicações destes métodos. Também será avaliado que além da quantidade ouabundância de níveis de EL-21 e/ou IL-21R, os níveis de IL-21 e/ou EL-21Rvariantes ou anormais ou os seus padrões de expressão (por exemplo,transcritos mutados, polipeptídeos truncados) podem ser identificados pelacomparação aos níveis normais e padrões de expressão.

Se o nível de um gene ou proteína particular em duas amostrasé aumentado (isto é, mais alto) ou reduzido (isto é, mais baixo), por exemplo,significantemente acima ou significantemente abaixo de um dado nível,respectivamente, depende do próprio gene e, inter alia, a sua variabilidade naexpressão, atividade e/ou interação com um ligando entre indivíduosdiferentes ou amostras diferentes. Está dentro da habilidade na técnicadeterminar se os níveis de IL-21 e/ou IL-21R são significantemente similaresou diferentes entre as amostras. Fatores tais como a variação genética entreindivíduos, espécie, órgãos, tecidos ou células podem ser levados emconsideração (quando e onde necessário) para determinar se o nível de IL-21e/ou IL-21R entre duas amostras é aumentado ou reduzido. Como umresultado da heterogeneidade natural nos níveis de IL-21 e/ou IL-21R entreindivíduos, espécie, órgãos, tecidos ou células, frases tais como"significantemente acima" ou "significantemente abaixo" não podem serdefinidas como uma porcentagem ou valor exatos, mas ao invés podem seraveriguados por uma pessoa habilitada na técnica na prática da invenção. Osmétodos particulares de detecção e medição da atividade e interação deprodutos de gene de EL-21 e/ou IL-21R são aqui descritos.Ensaios para Medir Produtos de Gene de IL-21 e/ou IL-21ROs métodos da presente invenção envolvem detectar equantificar o nível de EL-21 e/ou IL-21R, por exemplo, o nível dos produtosde gene de EL-21 e/ou EL-21R, o nível de atividade de EL-21 e/ou EL-21R e/ouo nível de interação de EL-21 com EL-21R, em amostras biológicas. Osprodutos de gene de IL-21 e EL-21R incluem mRNAs e polipeptídeos e ambospodem ser medidos usando métodos bem conhecidos por aqueles habilitadosna técnica.

Por exemplo, o mRNA pode ser diretamente detectado equantificado usando ensaios com base na hibridização, tais como ahibridização de Northern, hibridização in situ, manchas de ponto e fenda eséries de oligonucleotídeo. Os ensaios com base em hibridização referem-seaos ensaios em que uma sonda de ácido nucleico é hibridizada a um ácidonucleico alvo. Em alguns formatos, o alvo, a sonda ou ambos sãoimobilizados. O ácido nucleico imobilizado pode ser DNA, RNA ou um outrooligonucleotídeo ou polinucleotídeo e pode compreender nucleotídeos,análogos de nucleotídeo ou cadeias principais que ocorrem naturalmente quenão ocorrem naturalmente. Os métodos de selecionar seqüências de sonda deácido nucleico para o uso na presente invenção (por exemplo, com base naseqüência de nucleotídeo de IL-21) são bem conhecidos na técnica.

Alternativamente, o mRNA pode ser amplificado antes dadetecção e quantificação. Tais ensaios com base na amplificação são bemconhecidos na técnica e incluem a reação de cadeia da polimerase (PCR),PCR de transcrição reversa (RT-PCR), PCR-ensaio imunossorvente ligado àenzima (PCR-ELISA) e reação da cadeia da ligase (LCR). Os iniciadores esondas para produzir e detectar produtos de gene de IL-21 amplificados (porexemplo, mRNA ou cDNA) podem ser facilmente planejados e produzidossem a experimentação indevida por aqueles de habilidade na técnica com basenas seqüências de nucleotídeo de EL-21 e/ou IL-21R. os produtos de gene deEL-21 e/ou IL-21R amplificados podem ser diretamente analisados, porexemplo, pela eletroforese em gel; pela hibridização a uma sonda de ácidonucleico; pelo seqüenciamento; pela detecção de um sinal fluorescente,fosforescente ou radioativo; ou por qualquer um de uma variedade demétodos bem conhecidos. Além disso, métodos são conhecidos por aqueles dehabilidade na técnica para aumentar o sinal produzido pela amplificação deseqüências de nucleotídeo alvos. Uma pessoa de habilidade na técnicareconhecerá que, qualquer que seja o método de amplificação usado, umavariedade de métodos quantitativos conhecidos na técnica (por exemplo, PCRquantitativa) podem ser usados se a quantificação de produtos de gene édesejada.

Um polipeptídeo de EL-21 e/ou IL-21R (ou fragmentos destes)podem ser detectados usando vários ensaios imunológicos bem conhecidosutilizando os respectivos anticorpos de anti-EL-21 e/ou IL-21R que podem sergerados como aqui descrito. Os ensaios imunológicos referem-se aos ensaiosque utilizam um anticorpo (por exemplo, policlonal, monoclonal, quimérico,humanizado, scFv e/ou fragmentos destes) que especificamente se liga a, porexemplo, um polipeptídeo de IL-21 (ou um fragmento deste). Tais ensaiosimunológicos bem conhecidos adequados para a prática da presente invençãoincluem ELISA, radioimunoensaio (RIA), imunoprecipitação,imunofluorescência, classificação de célula ativada por fluorescência (FACS)e Western blotting. O técnico ordinariamente habilitado também reconheceráque um polipeptídeo de IL-21 também pode ser detectado usando umpolipeptídeo(s) de IL-21R rotulado(s). Uma pessoa de habilidade na técnicaentenderá que os métodos anteriormente mencionados podem ser aplicadosaos distúrbios relacionados com a IL-21, especialmente a fibrose ou umacondição associada com a fibrose.

Ensaios para Medir a Atividade de IL-21 e/ou IL-21R

A atividade de IL-21/IL-21R (por exemplo, em resposta aosantagonistas de EL-21/IL-21R como moduladores da produção de citocina eproliferação/diferenciação de célula) podem ser testados usando qualquer umde vários ensaios de proliferação de célula dependentes de fator de rotina paraas linhagens de célula incluindo, sem limitação, 32D, DA2, DA1G, TIO, B9,B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, RB5, DAI, 123, TI 165, HT2,CTLL2, TF-1, Mo7e e CMK.

Os ensaios para a proliferação de célula T ou timócito sãodescritos, por exemplo, em Current Protocols in Immunology, Coligan et al.(eds.) Greene Pub. Assoc. & Wiley-Interscience, NY, NY (1991) (Capítulo 3,"In Vitro Assays for Mouse Lymphocyte Function" e Capítulo 7,"Immunologic studies in Humans"); Takai et al. (1986) J. Immunol. 137:3494-500; Bertagnolli et al. (1990) J. Immunol. 145: 1706-12; Bertagnolli etal. (1991) Cell. Immunol. 133: 327-41; Bertagnolli et al. (1992) J. Immunol.149: 3778-83; Bowman et al. (1994) J. Immunol. 152: 1756-61. Os ensaiospara a produção de citocina e/ou proliferação de células do baço, células delinfônodo ou timócitos são descritos, por exemplo, em "Polyclonal T cellstimulation" Kruisbeek e Shevach em Current Protocols in Immunology, Vol.1 Coligan et al. (eds.) pp. 3.12.1-14, John Wiley and Sons, Toronto (1994); e"Measurement of mouse and human Interferon gamma" Schreiber, R. D. emCurrent Protocols in Immunology, Vol. 1 Coligan et al. (eds.) pp. 6.8.1-8,John Wiley and Sons, Toronto (1994).

Os ensaios para a proliferação e diferenciação de célulashematopoiéticas e linfopoiética são descritos, por exemplo, em "Measurementof Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4" Bottomly et al. emCurrent Protocols in Immunology, Vol. 1 Coligan et al. (eds.) pp. 6.3.1-12,John Wiley and Sons, Toronto (1991); deVries et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1205-11; Moreau et al. (1988) Nature 336: 690-92; Greenberger et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80: 2931-38; "Measurement of maouse andhuman interleukin 6" Nordan, R. em Current Protocols in Immunology, Vol.1 Coligan et al. (eds.) pp. 6.6.1-5, John Wiley and Sons, Toronto (1991);Smith et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83: 1857-61; "Measurementof human Interleukin 11" Bennett et al. em Current Protocols in Immunology,Vol. 1 Coligan et al. (eds.) p. 6.15.1, John Wiley and Sons, Toronto (1991);"Measurement of mouse and human Interleukin 9" Ciarletta et al. em CurrentProtocols in Immunology, Vol. 1. Coligan et al. (eds.) p. 6.13.1, John Wileyand Sons, Toronto (1991).

Os ensaios para as respostas de clone de célula T aos antígenos(que identificarão, entre outros, proteínas que afetam as interações de APC-célula T assim como afetam a célula T direta pela medição da proliferação eprodução de citocina) incluem, por exemplo, aqueles descritos em: CurrentProtocols in Immunology, Coligan et al. (eds.) Greene Pub. Assoc. andWiley-Interscience, NY, NY (1991) (Capítulo 3, "In Vitro Assays for MouseLymphocyte Function"; Capítulo 6, "Cytokines and their cellular receptors";Capítulo 7, "Immunologic studies in Humans"); Weinberger et al. (1980)Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77: 6091-95; Weinberger et al. (1981) Eur. J.Immunol. 11: 405-11; Takai et al. (1986) J. Immunol. 137: 3494-500; Takai etal. (1988) J. Immunol. 140: 508-12.

Ensaios para Medir a Interação de IL-21 com IL-21R

Os métodos para detectar e/ou medir o nível de interação deIL-21 com IL-21R são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, taisinterações entre uma citocina e seu receptor podem ser detectadas e/oumedidas com, mas não limitado a, tais técnicas como ELISA, Westernblotting, imunoprecipitação, análise Biacore, etc.

Composições Farmacêuticas

Em um aspecto, a invenção retrata um método de tratar,melhorar ou prevenir um distúrbio relacionado com a IL-21, isto é, a fibroseou uma condição associada com a fibrose. O método pode compreedercontatar uma população de células com (por exemplo, pela administração aum paciente que sofre de ou em risco para a fibrose ou um distúrbio associadocom a fibrose) um agente que reduza o nível da atividade de IL 21 e/ou IL2IR no paciente, por exemplo, um antagonista de IL-21/IL-21R (porexemplo, um anticorpo anti-IL-21R, um anticorpo anti-IL-21, um fragmentode ligação de antígeno de um anticorpo anti-IL-21R, um fragmento de ligaçãode antígeno de um anticorpo anti-IL-21 e um fragmento solúvel de uma IL-2IR (por exemplo, uma seqüência de aminoácido que seja pelo menos 90 %idêntica a uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste deaminoácidos de 1 a 538 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 20 a 538 da SEQID NO: 2, aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 20 a235 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 236 da SEQ ID NO: 2,aminoácidos de 20 a 236 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 529 da SEQID NO: 5, aminoácidos de 20 a 529 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 1 a236 da SEQ ID NO: 5 e aminoácido 20 a 236 da SEQ ID NO: 5)) em umaquantidade suficiente para inibir a atividade de IL-21 na célula ou população.

Os antagonistas de IL-21/IL-21R para tratar a fibrose ou umacondição associada com a fibrose podem ser usados como uma composiçãofarmacêutica quando combinados com um carreador farmaceuticamenteaceitável. Uma tal composição pode conter, além dos antagonistas de IL-21/IL-21R e carreador, vários diluentes, enchedores, sais, tampões,estabilizadores, solubilizadores e outros materiais bem conhecidos na técnica.O termo "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico quenão interfira com a eficácia da atividade biológica do(s) ingrediente(s)ativo(s). As características do carreador dependerá da via de administração eno geral são bem conhecidos na técnica.

A composição farmacêutica da invenção pode estar na formade um lipossoma em que um antagonista(s) de IL-21/IL-21R é/sãocombinados com, além dos outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis,agentes anfipáticos tais como lipídeos que existem na forma agregada comomicelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos ou camadas lamelares queexistem em solução aquosa. Os lipídeos adequados para a formulaçãolipossômica incluem, sem limitação, monoglicerídeos, diglicerídeos,sulfatídeos, lisolecitina, fosfolipídeos, saponina, ácidos biliares e outros. Apreparação de tais formulações lipossômicas está dentro do nível dehabilidade na técnica, como divulgado, por exemplo, nas Patentes US Nos4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 e 4.737.323, todas as quais são incorporadasaqui por referência em suas totalidades.

Como aqui usado, o termo "quantidade terapeuticamenteeficaz" significa a quantidade total de cada componente ativo da composiçãofarmacêutica ou método que seja suficiente para mostrar um beneficiosignificativo ao paciente, por exemplo, melhora ou redução de sintomas de,prevenção de, cicatrização de ou aumento na taxa de cicatrização de taiscondições. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual, administradosozinho, o termo refere-se àquele ingrediente sozinho. Quando aplicado a umacombinação, o termo refere-se às quantidades combinadas dos ingredientesativos que resultam no efeito terapêutico, sejam administrados emcombinação, em série ou simultaneamente.

Na prática do método de tratamento ou uso da presenteinvenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de IL-21/IL-21R é administrado a um paciente, por exemplo, um mamífero (porexemplo, um ser humano). Um antagonista(s) de IL-21/IL-21R podem seradministrados de acordo com o método da invenção sozinho ou emcombinação com outras terapias como descrito aqui em mais detalhes.

Quando coadministrados com um ou mais agentes, um antagonista de IL-21e/ou IL-21R pode ser administrado simultânea ou seqüencialmente com osegundo agente. Se administrado seqüencialmente, o médico atendentedecidirá sobre a seqüência apropriada de administrar um antagonista de IL-21/IL-21 R em combinação com outros agentes.A administração de um antagonista de IL-21/IL-21R usado emuma composição farmacêutica da presente invenção ou para praticar ummétodo da presente invenção pode ser realizado em uma variedade de meiosconvencionais, tais como a ingestão oral, inalação ou injeção cutânea,subcutanea ou intravenosa. A administração intravenosa ao paciente éalgumas vezes preferida. Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz deum agonista ou antagonista de IL-21/IL-21R é administrado oralmente, oagente de ligação estará na forma de um tablete, cápsula, pó, solução ouelixir. Quando administrado na forma de tablete, a composição farmacêuticada invenção pode conter adicionalmente um carreador sólido tal como umagelatina ou um adjuvante. O tablete, cápsula e pó contêm de cerca de 5 a 95 %de agente de ligação e preferivelmente de cerca de 25 a 90 % de agente deligação. Quando administrado na forma líquida, um carreador líquido talcomo água, petróleo, óleos de origem animal ou vegetal tais como óleo deamendoim (embora se mantenha em mente a freqüência de alergias deamendoim na população), óleo mineral, óleo de soja ou óleo de gergelim ouóleos sintéticos podem ser adicionados. A forma líquida da composiçãofarmacêutica pode conter ainda solução salina fisiológica, dextrose ou outrosolução sacarídica ou glicóis tais como etileno glicol, propileno glicol oupolietileno glicol. Quando administrados na forma líquida, a composiçãofarmacêutica contém de cerca de 0,5 a 90 % em peso do agente de ligação epreferivelmente de cerca de 1 a 50 % do agente de ligação.

Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de umantagonista de IL-21/IL-21R é administrada pela injeção intravenosa, cutâneaou subcutanea, o agente de ligação estará na forma de uma solução aquosaisenta de pirógeno, parenteralmente aceitável. A preparação de tais soluçõesde proteína parenteralmente aceitáveis, tendo devido respeito ao pH,isotonicidade, estabilidade e outros, está dentro da habilidade na técnica. Umacomposição farmacêutica preferida para a injeção intravenosa, cutânea ousubcutânea deve conter, além de um agente de ligação, um veículo isotônicotal como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de dextrose,dextrose e injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer lactatada ou outrosveículos como conhecidos na técnica. A composição farmacêutica da presenteinvenção também pode conter estabilizadores, conservantes, tampões,antioxidantes ou outros aditivos conhecidos por aqueles de habilidade natécnica.

A quantidade de um antagonista de EL-21/IL-21R nacomposição farmacêutica da presente invenção dependerá da natureza egravidade da condição que é tratada e da natureza de tratamentos anterioresque o paciente tenha passado por. Por fim, o médico atendente decidirá aquantidade de agente de ligação com a qual tratar cada paciente individual.Inicialmente, o médico atendente administrará doses baixas de agente deligação e observará a resposta do paciente. As doses maiores de agente deligação podem ser administradas até que o efeito terapêutico ótimo seja obtidopara o paciente e neste ponto a dosagem no geral não é mais aumentada. Éconsiderado que as várias composições farmacêuticas usadas para praticar ométodo da presente invenção deve conter de cerca de 0,1 mg a cerca de 100mg de antagonista de IL-211IL-21R por kg de peso corporal.

A duração da terapia intravenosa usando a composiçãofarmacêutica da presente invenção variará, dependendo da gravidade dadoença que é tratada e da condição e resposta idiossincrática potencial de cadapaciente individual. É considerado que a duração de cada aplicação de umantagonista de IL-21/IL-21R pode estar na range de 12 a 24 horas deadministração i.v. contínua. Também é considerada a terapia subcutânea (s.c.)usando uma composição farmacêutica da presente invenção. Estas terapiaspodem ser administradas diária, semanal, ou, mais preferivelmente, bisemanalou mensalmente. Também é considerado que onde o antagonista de IL-21/IL-2IR é uma molécula pequena (por exemplo, para a liberação oral), as terapiaspodem ser administradas diariamente, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, etc.Por fim o médico atendente decidirá sobre a duração apropriada da terapia iv.ou s.c. ou terapia com uma molécula pequena e o momento da administraçãoda terapia usando a composição farmacêutica da presente invenção.

Espera-se que o polinucleotídeo e as proteínas da presenteexibam um ou mais dos usos ou atividades biológicas (incluindo aquelasassociadas com os ensaios aqui citados) identificados abaixo. Os usos ouatividades descritas para as proteínas, anticorpos ou polinucleotídeos dapresente invenção podem ser fornecidos pela administração ou uso de taisproteínas ou anticorpos ou pela administração ou uso de polinucleotídeos quecodificam tais proteínas ou anticorpos (tais como, por exemplo, nas terapiasde gene ou vetores adequados para a introdução de DNA).Terapia de Combinação

Em uma forma de realização, uma composição farmacêuticaque compreende pelo menos um antagonista de IL-21R/IL-21, por exemplo,um anticorpo de IL-21R/IL-21 e pelo menos um agente terapêutico éadministrado na terapia de combinação. Tal terapia é útil para tratar condiçõesou distúrbios patológicos, tais como distúrbios imune e/ou inflamatórios. Otermo "em combinação" neste contexto significa que a composiçãoantagonista e o agente terapêutico são dados de modo substancialmentecontemporâneo, simultânea ou seqüencialmente. Se dados seqüencialmente,no início da administração do segundo composto, o primeiro dos doiscompostos pode ser ainda detectável em concentrações eficazes no sítio detratamento.

Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir pelo menosum antagonista de IL-21R/IL-21 co-formulados com e/ou co-administradoscom, pelo menos um agente terapêutico adicional. Os agentes adicionaispodem incluir pelo menos um inibidor de citocina, inibidor do fator decrescimento, imunossupressores, agente anti-inflamatório, inibidormetabólico, inibidor de enzima, agente citotóxico ou agente citostático, comodescrito em mais detalhes abaixo. Tais terapias de combinação podemvantajosamente utilizar dosagens mais baixas dos agentes terapêuticosadministrados, evitando assim toxicidades possíveis ou complicaçõesassociadas com as várias monoterapias. Além disso, os agentes terapêuticosaqui divulgados atuam nos caminhos que diferem dos caminhos de IL-21/IL-2IR e assim são esperados realçar e/ou sinergizar com os efeitos dosantagonistas de IL-21R/IL-21.

Os agentes terapêuticos usados em combinação comantagonistas de IL-21R/IL-21 podem ser aqueles agentes que interferem emdiferentes estágios na resposta autoimune e inflamatória subseqüente. Emuma forma de realização, pelo menos um antagonista de IL-21R/IL-21 aquidescrito podem ser co-formulados com e/ou co-administrados com, pelomenos uma citocina e/ou antagonista do fator de crescimento. A citocina e/ouantagonistas do fator de crescimento podem incluir receptores solúveis,inibidores de peptídeo, moléculas pequenas, fusões de ligando, anticorpos(que ligam citocinas ou fatores de crescimento ou seus receptores ou outrasmoléculas de superfície celular) e "citocinas anti-inflamatórias" e agonistasdestes.

Os exemplos não limitantes dos agentes que podem ser usadosem combinação com os antagonistas de IL-21R/IL-21 aqui descritos, incluem,mas não são limitados a, antagonistas de pelo menos uma interleucina (porexemplo, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 e IL-22); citocina (por exemplo, TNFa, LT, EMAP-II e GM-CSF); ou fatorde crescimento (por exemplo, FGF e PDGF). Os agentes também podemincluir, mas não são limitados aos antagonistas de pelo menos um receptorpara uma interleucina, citocina e fator de crescimento. Os antagonistas de IL-21R/IL-21 também podem ser combinados com inibidores, por exemplo, deanticorpos para, moléculas de superfície celular tais como CD2, CD3, CD4,CD8, CD20 (por exemplo, o inibidor de CD20 rituximab (RITUXANe)),CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90ou seus ligandos, incluindo CD154 (gp39 ou CD40L) ou LFA-l/ICAM-1 eVLA-4/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansar et al. (2002) Med. Res. Rev. 22: 146-67). Outros compostos que podem ser usados em combinação comantagonistas de IL-21R/IL-21 aqui descritos podem incluir antagonistas dosreceptores para IL-1, IL-12, TNFa, IL-15, IL-17, IL-18 e IL-22.

Os exemplos de agentes úteis nas terapias de combinação comum antagonista de IL-21R/IL-21 incluem os antagonistas de IL-12 (tais comoanticorpos que se ligam à IL-12 (ver por exemplo, a WO 00/56772);inibidores do receptor de IL-12 (tais como anticorpos para o receptor de IL-12); e receptor de IL-12 solúvel e fragmentos destes. Os exemplos deantagonistas de IL-15 incluem anticorpos contra IL-15 ou seu receptor,fragmentos solúveis do receptor de IL-15 e proteínas de ligação de 1L-15. Osexemplos de antagonistas de IL-18 incluem anticorpos para IL-18, fragmentossolúveis do receptor de IL-18 e proteínas de ligação de IL-18 (IL-18BP,Mallat et al. (2001) Circ. Res. 89: E41-45). Os exemplos de antagonistas deIL-1 incluem os inibidores da enzima que converte a interleucina 1 (ICE) (taiscomo Vx740), antagonistas de IL-1 (por exemplo, IL-1RA (anaquinra(KINERETÒ), Amgen)), sIL-lRII (Immunex); e anticorpos anti-receptor de IL-1.

Os exemplos de antagonistas de TNF incluem anticorpos paraTNF (por exemplo, TNFa humano), tal como D2E7 (anticorpo anti-TNFahumano, Patente US 6.258.562, ITM, Abbott Labs); CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticorpos anti-TNFa humanizados, Celltech/Pharmacia); cA2 (anticorpo anti-TNFa quimérico, REMICADEÒ, Centocor);e fragmentos de anticorpo anti-TNF (por exemplo, CPD870). Outrosexemplos incluem os fragmentos do receptor de TNF solúvel (por exemplo,p55 ou p75 humanos) e derivados, tais como p55 kdTNFR-IgG (proteína defusão do receptor de TNF de 55 kD-IgG, LENERCEPTÒ) e 75 kdTNFR-IgG(proteína de fusão do receptor de TNF de 75 kD-IgG, ENBRELO (etanercept- Immunex)). Ver, por exemplo, van der Poli et al. (1997) Blood. 89: 3727-34;Mori et al. (1996) J. Immunol. 157: 3178-82. Outros exemplos incluemantagonistas de enzima (por exemplo, inibidores da enzima que converteTNFa (TACE) tal como o derivado do ácido alfa-sulfonil hidroxâmico (WO01/55112) ou inibidores de N-hidroxiformamida (GW 3333, -005 ou -022,GlaxoSmithKline) e TNF-bp/s-TNFR (proteína de ligação de TNF solúvel,ver, por exemplo, Lantz et al. (1991) J Clin Invest. 88: 2026-31; Kapadia etal. (1995) Amer. J. Physiol. Heart Circ. Phys. 268: H517-25). Os antagonistasde TNF podem ser os fragmentos do receptor de TNF solúvel (por exemplo,p55 ou p75 humano) e derivados, tais como TNFR de 75 kd-IgG; e inibidoresda enzima que converte TNFa (TACE).

Em uma outra forma de realização, os antagonistas de IL-21R/IL-21 aqui descritos podem ser administrados em combinação com pelomenos um dos seguintes: antagonistas de EL-13, tais como receptores de IL-13solúveis e/ou anticorpos anti-IL-13; e antagonistas de IL-2, tais comoproteínas de fusão de IL-2 (por exemplo, DAB 486-IL-2 e/ou DAB 389-IL-2fabricados pela Seragen, ver por exemplo, Sewell et al. (1993) ArthritisRheum. 36: 1223-33) e anticorpos anti-IL-2R (por exemplo, anti-Tac(anticorpo humanizado, Proteína Design Labs, ver Junghans et al. (1990)Câncer Res. 50: 1495-502). Uma outra combinação inclui antagonistas de IL-21R/IL-21 em combinação com inibidores anti-CD4 não esgotadores taiscomo IDEC-CE9.1/SB 210396 (anticorpo anti-CD4, GlaxoSmithKline).

Outras combinações ainda incluem antagonistas de IL-21R/IL-21 comantagonistas do caminho co-estimulador CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2) (taiscomo anticorpos, receptores solúveis ou ligandos antagonísticos); ligando daglicoproteína de P-selectina (PSGL) e inibidores de PSGL-1 (tais como osanticorpos para PSGL e/ou PSGL-1 e inibidores de molécula pequena);agentes esgotadores de célula T e célula B (tais como anticorpos anti-CD4 ouanti-CD22) e citocinas anti-inflamatórias e agonistas destes (por exemplo,anticorpos). As citocinas anti-inflamatórias podem incluir EL-4 (por exemplo,Schering-Plough Biopharma); IL-10 (por exemplo, SCH 52000, IL-10recombinante, Schering-Plough Biopharma); EL-11; EL-13; e TGF13 ouagonistas destes (por exemplo, anticorpos agonistas).

Em uma outra forma de realização, pelo menos um antagonistade IL-21R/IL-21 pode ser co-formulado com e/ou co-administrado com, pelomenos um medicamento anti-inflamatório, imunossupressor, inibidormetabólico e inibidor enzimático. Os exemplos não limitantes dosmedicamentos ou inibidores que podem ser usados em combinação com osantagonistas de IL-21R/IL-21 aqui descritos, incluem, mas não são limitadosa, pelo menos um de: medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais(NSAIDS) (incluindo, mas não limitado a, aspirina, salsalato, diflunisal,ibuprofen, cetoprofen, nabumetona, piroxicam, naproxen, diclofenaco,indometacina, sulindac, tolmetin, etodolac, cetorolac, oxaprozin, tenidap,meloxicam, piroxicam, aceclofenaco, tolmetin, ácido tiaprofênico,nimesulida, etc); sulfasalazina; corticosteróides (tais como prednisolona);medicamentos anti-inflamatórios supressivos de citocina (CSAID); inibidoresda biossíntese de nucleotídeo (tais como inibidores da biossíntese de purina(por exemplo, antagonista de foliato tal como metotrexato)); e inibidores dabiossíntese de pirimidina, por exemplo, um inibidor da diidroorotatodesidrogenase (DHODH) tal como leflunomida (ver, por exemplo, Kraan etal. (2004) Ann. Rheum. Dis. 63: 1056-61). Agentes terapêuticos para o usoem combinação com antagonistas de IL-21/IL-21R podem incluir um ou maisinibidores de NSAIDs, CSAIDs, DHODH (tais como leflunomida) eantagonistas de foliato (tais como metotrexato).

Os exemplos de agentes adicionais que podem ser usados emcombinação com o antagonista de IL-21/IL-21R incluem pelo menos um de:corticosteróide (injeção oral, inalada e local); imunossupressor (tal comociclosporina e tacrolimus (FK-506)); um inibidor de mTOR (tal comosirolimus (rapamicina) ou um análogo de rapamicina e/ou derivado, porexemplo, derivado de éster de rapamicina tal como CCI-779 (ver, porexemplo, Elit (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1249-53; Huang et al.(2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 295-304)); um agente que interfira coma sinalização de citocinas pró inflamatórias tais como TNFa e IL-1 (porexemplo, um IRAK, NIK, IKK, p38 ou inibidor da MAP); inibidores de TPL-2, Mk-2 e NThcb; Inibidores de Cox-2 (por exemplo, celecoxib, rofecoxib,etc. e variantes destes); inibidores da fosfodiesterase (tais como Rolipram);inibidores da fosfolipase (por exemplo, um inibidor de fosfolipase 2citossólico (cPLA2) tal como análogos de trifluorometil cetona (Patente US6.350.892)); inibidores do fator de crescimento de célula vascular endotelial(VEGF); inibidores do receptor de VEGF; inibidores da angiogênese; RAGEe RAGE solúvel; agonistas de receptor beta de estrogênio (ERB), antagonistasde ERB-NFkb; interferon-b (por exemplo, IFNb-la e IFNb-lb); copaxona; ecorticosteróides.

Outros agentes terapêuticos úteis que podem ser combinadoscom um antagonista de IL-21R/IL-21 incluem: budenosida; fator decrescimento epidérmico; aminossalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina;metronidazol; inibidores da lipoxigenase; mesalamina; olsalazina; balsalazida;antioxidantes; inibidores de tromboxano; fatores de crescimento; inibidores deelastase; compostos de piridinil-imidazol; pro-medicamentos conjugados aglicuronida ou dextrano de prednisolona; dexametasona ou budesonida;oligodesoxinucleotídeos de fosforotioato de ICAM-1 de anti-sentido (ISIS2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor 1 de complemento solúvel (TP10;T Cell Sciences, Inc.); mesalazina de liberação lenta; antagonistas do fatorativador de plaqueta (PAF); ciprofloxacina; lignocaína; ciclosporina A;hidroxicloroquina (PLAQUENILÒ); minociclina (M1NOCINO); e anaquinra(KINERETÒ).

A escolha de um agente terapêutico particular para aadministração em combinação com um antagonista de EL-21/IL-21R dainvenção largamente dependerá de fatores tais como o paciente particular, oalvo desejado e comprimento escolhido de tratamento. Tais decisões estãobem dentro da habilidade e conhecimento de uma pessoa habilitada natécnica.

Os exemplos adicionais de agentes terapêuticos que podem sercombinados com um antagonista de IL-21R/IL-21 incluem um ou mais de: 6-mercaptopurinas (6-MP); azatioprina; sulfasalazina; mesalazina; olsalazina;cloroquina, hidroxicloroquina (PLAQUENILÒ); pencilamina; aurotiomalato(intramuscular e oral); azatioprina; colchicina; agonistas do adrenoreceptorbeta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeterol); xantinas (teofilina, aminofilina);cromoglicato; nedocromil; cetotifen; ipratrópio e oxitrópio; micofenolatomofetila; agonistas de adenosina; agentes antitrombóticos; inibidores decomplemento; e agentes adrenérgicos.

Em uma forma de realização, um antagonista de IL-21R7IL-21pode ser usado em combinação com um ou mais anticorpos direcionados aoutros alvos envolvidos na regulação de respostas imunes. Os exemplos nãolimitantes de agentes para tratar ou prevenir respostas imunes com que umantagonista de IL-21R/IL-21 da invenção pode ser combinado incluem oseguinte: anticorpos contra outras moléculas de superfície celular, incluindomas não limitado a CD25 (receptor-a de interleucina-2), CDlla (LFA-1),CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28, CTLA4, ICOSL, ICOS, CD80 (B7.1)e/ou CD86 (B7.2). Já em uma outra forma de realização, um antagonista deIL-21R/IL-21 é usado em combinação com um ou mais agentesimunossupressores gerais, tais como ciclosporina A ou FK506. Em uma outraforma de realização, um antagonista de IL-21/IL-21R é usado em combinaçãocom um agonista de CTLA4, por exemplo, (por exemplo, CTLA4 Ig —abatacept (ORENCIA®)).

Os conteúdos inteiros de todas as referências, patentes epedidos de patente publicados citados por todo este pedido são por meio desteaqui incorporados por referência.

EXEMPLOS

Os seguintes Exemplos fornecem formas de realizaçãoilustrativas da invenção e não limitam a invenção de nenhum modo. Umapessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que numerosas outrasformas de realização são abrangidas dentro do escopo da invenção.

Exemplo 1: Materiais e Métodos

Exemplo 1.1: Camundongos, Infecções Parasíticas e

Preparação de Antígeno

Camundongos fêmeas ou machos C57BL/6, C57BL/6/AÍ-IL-10KO/IL-4KO e C57BL/6AÍ-IL-10KO/IL-12KO foram obtidos da TaconicFarms (Germantown, NY) (Hoffmann et al. (1999) J. Immunol. 163: 927-938). Pares de criação de camundongos IL-21R4 em um fundo C57BL/6foram obtidos a partir de uma colônia de criação alojados na Harvard Schoolof Public Health (Boston, MA) (Kasaian et al. (2002) Immunity 16: 559-69).Todos os camundongos foram alojados sob condições isentas de patógenoespecífico no National Institutes of Health em uma instalação aprovada peloAmerican Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care. ONIAID animal care and use committee aprovou todos os procedimentosexperimentais. Os ovos de S. mansoni foram extraídos dos fígados decamundongos infectados (Biomedical Research Institute, Rockville, MD)como anteriormente descrito (Wynn et al. (1995) Nature 376: 594-96). Para aindução de granulomas pulmonares primários simultâneos, os camundongosforam administrados com 5.000 ovos intravenosamente (i.v.). Para a induçãode granulomas secundários, os camundongos foram sensibilizadosintraperitonealmente (i.p.) com 5000 ovos vivos e depois inoculados com5.000 ovos vivos i.v. (Wynn et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 551-61). Nosexperimentos de infecção, os camundongos foram infectadospercutaneamente por intermédio da cauda com 25 a 30 cercárias de uma CepaPorto-Riquenha de S. mansoni (NMRI) que foram obtidos a partir de lesmasinfectadas com Biomphalaria glabrata (Biomedical Research Institute,Rockville, MD). O antígeno de ovo solúvel (SEA) e as preparaçõesantigênicas de verme solúveis (SWAP) foram purificados e homogeneizadosa partir de ovos e parasitas adultos de S. mansoni como anteriormente descrito(Cheever et al. (1994) J. Immunol. 153: 753-59). Todos os animais passarampela perfusão no momento do sacrifício de modo que as cargas de verme eovos em tecido puderam ser determinadas, como descrito em outro lugar (id.).Larvas de Nippostrongilus brasiliensis (L3) foram preparadas comoanteriormente descrito (Katona et al. (1983) J. Immunol. 130: 350-56). Oscamundongos foram inoculados através da injeção s.c. de 500 L3. No dia seteapós a inoculação, o tecido pulmonar e linfonodos mediastinais foramcoletados para a análise de citocina.

Exemplo 1.2: Histopatologia e Fibrose

Os tamanhos de granulomas pulmonares e hepáticos foramdeterminados em seções histológicas que foram tingidas com o coranteGiemsa de Wright (Histopath of America, Clinton, MD). Em torno de 30granulomas por camundongo foram incluídos em todas as análises. Umpatologista habilitado avaliou as porcentagens de eosinófilos, mastóides eoutros tipos de células nas mesmas seções. O número de ovos esquistossomano fígado e no intestino e o teor de colágeno do fígado, como medido pelosníveis de hidroxiprolina, foram determinados como anteriormente descrito(Cheever et al., supra). Especificamente, o colágeno hepático foi medidocomo hidroxiprolina pela técnica de Bergman e Loxley (Bergman e Loxley(1963) Analytical Biochem. 35: 1961-65) depois da hidrólise de uma porçãode 200 mg de fígado em 5 ml de HC1 6N a 110° C por 18 h. O aumento nahidroxiprolina hepática foi positivamente relacionado com o número de ovosem todos os experimentos e o colágeno hepático é reportado como o aumentoacima do colágeno hepático normal em micromoles por 10.000 ovos;(colágeno hepático infectado -colágeno hepático normal)/ovos no fígado X10-4 ou micromoles por par de verme. Em pontos de tempo crônicos recentes,a fibrose é relatada como colágeno hepático total por fígado. O mesmoindivíduo contou todas as características histológicas e não teve conhecimentodo planejamento experimental.

Exemplo 1.3: Análise de FACS

Pulmões inteiros foram colhidos e colocados em RPMI. Os

tecidos foram rompidos tingindo-se através de uma malha de náilon de 70mícrons (BD Falcon, San Diego, CA). As suspensões de célula única foramlavadas e RBCs foram Usadas pela incubação com solução de lise de ACKpor 3 min. Os linfócitos pulmonares foram rotulados com anti-CD4 rotuladocom PE-Cy5 junto com Bloco Fc (ambos os anticorpos da BD Pharmingen,San Diego, CA) em tampão FACS por 15 min a 4o C. Depois de lavar, ascélulas foram analisadas em um FACS Calibur usando o software FLOWJOO(Treestar, Inc., Ashland, OR).

Exemplo 1.4: Experimentos Que Bloqueiam IL-21 com sIL-21R-Fc

Camundongos C57BL/6 (10/grupo) foram infectadospercutaneamente por intermédio da cauda com 30 a 35 cercárias de S.mansoni. Começando na semana 6 após a infecção, os camundongos foramtratados com mIL-21R-Fc (Wyeth Research) ou anticorpo de controle deIgG2a de murino Anti-E. tenella (Wyeth Research). Cada camundongorecebeu uma dose de 200 mg por intermédio de injeção i.p. 3X/semana porum total de 5 semanas. Os camundongos foram sacrificados 12 semanas apósa infecção e a fibrose hepática foi medida pelo ensaio de hidroxiprolina.

Exemplo 1.5: Cultura de Linfócito e Detecção de CitocinaUsando o Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima (ELISA)

O baço e linfonodos mesentéricos (modelo de infecção) oulinfonodos associados com pulmão (modelo pulmonar) foram removidosassepticamente e as suspensões de célula única foram preparadas comoanteriormente descrito (Hesse et al. (2000) Am. J. Pathol. 157: 945-55). Asculturas foram incubadas a 37° C em uma atmosfera umidificada a 5 % deC02. As células foram estimuladas com SEA (20 mg/ml), SWAP (50 mg/ml),concanavalina A (Con A; 1 jig/ml) ou meio sozinho. Os fluidos sobrenadantesforam colhidos em 72 horas e ensaiados quanto a produção de citocina. IFNI,IL-5 e IL-10 foram medidos pelo ELISA intercalado usando anticorposemparelhados (BD Pharmingen, San Diego, CA) como anteriormente descrito(id.). Os níveis de citocina foram calculados com curvas padrão construídasusando citocinas de murino recombinantes (BD Pharmingen, San Diego, CA).Os níveis de IL-13 foram medidos usando os kits de ELISA de IL-13 demurino (R&D Systems, Minneapolis, MN) de acordo com o protocolo dofabricante. Os níveis de TGF-bl foram quantificados usando o sistema dedesenvolvimento de ELISA de TGF-bl de camundongo DUOSETÒ (R&DSystems, Minneapolis, MN) de acordo com o protocolo do fabricante. Paraevitar a contaminação de TGF-bl derivado de bovino, as células foramlavadas 3X em PBS e cultivadas em mio contendo 0,5 % de soro decamundongo.

Exemplo 1.6: Isolação e Purificação de RNA e Reação daCadeia da Polimerase em Tempo Real

O RNA total foi extraído de amostras de tecido de pulmão efígado colocadas individualmente em 1 ml de reagente TRIZOLÒ (Invitrogen,Carlsbad, CA). A amostra foi homogeneizada usando um tecido politron(Omni International. Inc., Marietta, GA) e o RNA total foi extraído de acordocom as recomendações do fabricante e ainda purificado usando Mini KitRNEASYÒ da Qiagen (Qiagen Sciences, Germantown, MD). O RNA daamostra individual (1 mg) foi transcrito reverso usando SUPERSCRIPT IIÒ(Invitrogen, Carlsbad, CA) e uma mistura de oligo (dT) e iniciadoresaleatórios. A reação de cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) foirealizada em um sistema de detecção de seqüência ABI PRISMÒ 7900(Applied Biosystems, Foster City, CA). As quantidades relativas de rnRNApara diversos genes foram determinadas usando SYBRÒ Green PCR MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA) e pelo método de ciclo depatamar comparativo como descrito pela Applied Biosystems para os sistemasde detecção de seqüência ABI PRISMÒ 7700/7900 (Applied Biosystems,Foster City, CA). Neste método, os níveis de mRNA para cada amostra foramnormalizados para os níveis de mRNA da hipoxantina guanina fosforibosiltransferase e depois expressados como um aumento ou diminuição relativoscomparados com os níveis em controles não infectados. Os iniciadores foramplanejados usando o software PRIMER EXPRESSO (Applied Biosystems,Foster City, CA). Os iniciadores para IL-13, IL-4, IL-10, HPRT (Hesse et al.(2001) J. Immunol. 167: 6533-44), IL-13Ra2 (Chiaramonte et al. (2003) J.Exp. Med. 197: 687-701), Yml, FIZZ1 e quitinase ácida (AMCase) (Sandleret al., supra) foram publicados anteriormente e incluem:IL-21

5' GCCAG ATCGC CTCCT GATTA 3' (sentido) (SEQ ID NO: 28);5' CATGC TCACA GTGCC CCITT 3' (anti-sentido) (SEQ ID NO: 29);IL-21R

5' CTCCC CCCTT GAACG TATCT 3' (sentido) (SEQ ID NO: 30);

5' TTGCC CCTCA GCACG TAGTT 3' (anti-sentido) (SEQ ID NO: 31);IFN-g

5' AGAGC CAGAT TATCT CTTTC TACCT CAG 3' (sentido) (SEQ IDNO: 32);

5' CCTTT TTCGC CTTGC TGTTG 3' (anti-sentido) (SEQ ID NO: 33).

Exemplo 1.7: Análise de Isotipo de Anticorpo Sérico eMacrófagos Derivados de Medula Óssea

A IgE total foi medida usando o Conjunto de ELISA de IgE deCamundongo BD OPTEIAÒ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)de acordo com o protocolo do fabricante. Os títulos de anticorpo (Ab)específicos de isotipo de IgGl e IgG2b específicos de SEA foram avaliadospelo ELISA indireto. 4 placas IMMULONÒ (Thermo Labsystems Inc.,Beverly MA) foram revestidas com 10 ug/ml de SEA (100 ml/reservatório)diluídos em PBS e as amostras de soro foram analisadas usando diluições emsérie de duas vezes. Biotina-IgGl Anti-Camundongo de Coelho (Zymed, SanFrancisco, CA) foi usado em uma diluição 1:1000. Este foi seguido pelaenzima de substrato de estreptavidina rotulada com peroxidase (KPL,

à Gaithersburg, MD) a uma diluição 1:1000. A IgG2b anti-camundongo decoelho conjugado com a Ab de peroxidase de rábano da segunda etapa(Zymed, San Francisco, CA) foi usada em uma diluição 1:1000. Aabsorbância nos reservatórios foi lida a 405 nm usando uma Leitora deMicroplaca Cinética VIVIAXÒ (Molecular Devices) depois adicionando 100ml de componente único de Substrato de Peroxidase ABTS (KPL,Gaithersburg, MD).

A medula óssea foi recuperada a partir de camundongosC57BL/6 fêmea e cultivados em placas de Petri (100 X 15 mm) contendomeios DMEM suplementados (meio condicionado L929) por um período de 6dias. Depois de seis dias, as células foram colhidas e semeadas em umaconcentração de 0,5 X 106 células/reservatório em placas de 24 reservatórioscontendo meios DMEM suplementados (10 % de FBS, 2 mM de L-glutamina,100 U/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina). As células foramestimuladas com IL-4, IL-13 e IL-21 (R&D, Minneapolis, MN) por umperíodo de 20 horas. Em alguns ensaios, as células foram pré tratadas com IL-21. As células foram Usadas e o RNA foi purificado usando o procedimentoRNA Cleanup com os kits RNEASYÒ (Qiagen Sciences, Germantown, MD).Exemplo 1.8: Ensaio de Atividade de ArginaseOs macrófagos derivados da medula óssea foram plaqueados a6X105 por reservatório em placas de cultura de tecido de 96 reservatórios eestimulados com combinações de JL-4, DL-13 e IL-21. IL-21 foramadicionados 6 horas antes da estimulação de IL-4 ou IL-13. A seguir daestimulação, as células foram lavadas com PBS e lisadas com 0,1 % deinibidor da protease contendo Triton X-100 (Roche, Nutley, NJ). Os Usadosforam transferidos em uma placa de PCR de 96 reservatórios e incubadas com10 mM de MnC12 e 50 mM de Tris HC1 (pH 7,5) para ativar a enzima por 10min a 55° C. Depois da ativação da enzima, 25 ml de lisado foram removidose adicionados a 25 ml de arginina 1 M (pH 9,7) em uma nova placa de PCR eincubada por 20 horas a 37° C. 5 ml de cada amostra foram adicionados emduplicata a uma placa de ELISA de 96 reservatórios junto com 5 ml de cadapadrão, diluídos nas mesmas condições de ensaio, partindo a 100 mg/dL. Oreagente de determinação de uréia do Kit de Ensaio de UréiaQUANTICHROMÒ (BioAssay Systems, Hayward, CA) foi usado de acordocom o protocolo do fabricante.

Exemplo 1.9: Estatísticas

A fibrose hepática (ajustada quanto ao número de ovo) diminuicom intensidade crescente de infecção (pares de vermes). Portanto, estasvariáveis foram comparadas pela análise de co-variação, usando o logaritmode ovos hepáticos totais como o co-variado e o logaritmo do teor dehidroxiprolina por ovo. As variáveis que não mudam com a intensidade dainfecção foram comparadas pelo teste de ANO VA de uma via ou o teste t deStudent (Cheever et al., supra). As mudanças no mRNA da citocina,expressão e tamanho de granuloma foram avaliados usando ANOVA. Asdiferenças foram consideradas significantes quando p < 0,05*, p < 0,01** oup< 0,001***.

Exemplo 2: Regulagem de IL-21 e IL-21R durante asRespostas Polarizadas do Tipo 1 e Tipo 2

Para investigar a regulagem e função do receptor de IL-21 invivo, diversos sistemas experimentais diferentes de inflamação dependente deTH2 foram examinados, incluindo modelos de inflamação pulmonar ehepática, assim como um modelo experimental de infecção por nematóide(Pearce et al., supra; Wynn et al. (1994), supra). Em cada caso, as respostasimunes de animais do tipo selvagem (WT) foram comparadas comcamundongos deficientes em IL-21R (Hoffinan et al., supra; Kasaian et al.(2002), supra).

Em comparação com EL-21 (Wurster et al. (2002), supra;

Mehta et al. (2004) Immunol. Rev. 202: 84-95), pouco é conhecido a cerca daregulagem e função do receptor de IL-21. Para determinar se a IL-21 e seureceptor são regulados durante uma resposta TH2 patológica in vivo, o modeloS. mansoni de formação de granuloma foi usado. Neste modelo, as citocinasTH2 são conhecidas desempenhar um papel proeminente na formação de lesão(Pearce e MacDonald, supra). Os estudos iniciais foram designados paradeterminar se a expressão de mRNA de IL-21 e IL-21R foi ligada comrespostas de citocina TH2 polarizada in vivo. Isto foi obtido pelo uso decamundongos que desenvolvem respostas de citocina de TH1 (IL-4"/71L-10"/")ou TH2 (IL-^VIL-IO"7") altamente exageradas a seguir da exposição aos ovosde S. mansoni. Em camundongos "TH1" IL-4"/71L-10"/", a expressão demRNA de IFN-g aumentou no pulmão 75 vezes em relação à referência em 4dias após a inoculação e permaneceu aproximadamente 50 vezes acima dofundo durante todo o dia 14 (FIG. 16A). O mRNA de IL-13 não foi detectávelnestes camundongos em nenhum ponto de tempo, confirmando oestabelecimento de uma resposta inflamatória TH1 altamente polarizada. Aocontrário, dos camundongos IL-^^VIL-IO"7", os camundongos "TH2"demonstraram um aumento de 200 a 250 vezes no mRNA de IL-13 em todosos pontos de tempo após a inoculação, com pouca a nenhuma mudança noEFN-g. Ao contrário das citocinas TH1/ TH2, que demonstraram um padrãoaltamente polarizado de expressão, a IL-21 não foi associada com umfenótipo polarizado (FIG. 16B). Em ambos os grupos, os níveis de mRNA deIL-21 aumentaram pelo menos 50 vezes em relação à referência a seguir dainoculação com ovos de esquistossoma, embora o aumento observado noscamundongos polarizados com TH1 fosse em média de 3 a 4 vezes maior doque os animais polarizados TH2 (FIG. 16B; painel inferior). A IL-21Rtambém não foi especificamente associada com uma resposta imune TH1 ouTH2. Entretanto, ao contrário à IL-21, que foi mais pronunciada em animaisdesviados para o lado TH1, a resposta máxima para a IL-21R foi observadanos camundongos polarizados TH2 (FIG. 16B; painel superior).

Exemplo 3: A Produção de Citocina Tipo 2 é Reduzida nosPulmões de Camundongos deficientes em IL-21R Durante uma RespostaPrimária aos Ovos de Esquistossoma

Dada a elevação significante na expressão de IL-21R emcamundongos inoculados com ovos de esquistossoma (FIG. 16), a sérieseguinte de experimentos examinou se a sinalização de IL-21R estavainfluenciando o desenvolvimento da resposta de TH2. Nestes experimentos, oscamundongos ingênuos do tipo selvagem e IL-21 R"A foram injetadosintravenosamente com ovos de esquistossoma vivos e, a produção decitocinas de TH2 e genes regulados por TH2 foram monitorados no pulmão,baço e linfonodos de drenagem nos 14 dias seguintes. Em camundongos dotipo selvagem, a expressão de mRNA do IL-21R aumentou rapidamente aseguir da exposição aos ovos e permaneceram elevadas até o dia 14 (FIG.17A). A IL-21 mostrou um perfil similar com a expressão de pico ocorrendono dia 7 e depois declinando levemente depois disso. Notavelmente, houveuma diminuição compatível e altamente significante na expressão de IL-21nos dias 7 e 14 nos camundongos IL-21"7", sugerindo que a IL-21R foipositivamente influenciada pela expressão de seu próprio ligando. Compatívelcom as observações anteriores (Wynn et al. (1993) J. Immunol. 151: 1430-40;Vella e Pearce (1992) J. Immunol. 148: 2283-88), a expressão das citocinasassociadas com TH2 EL-4 e IL-13 elevaram gradualmente nos tecidosgranulomatosos de camundongos do tipo selvagem, com aumentos de 5 a 15vezes detectáveis no dia 14. Ao contrário, houve uma diminuição acentuada esignificante na expressão de mRNA de IL-4 e IL-13 nos tecidos EL-21R"7".Embora pouca mudança no mRNA de EFN-g e IL-10 fosse detectada noscamundongos do tipo selvagem entre os dias 4 e 14 após a inoculação, aprodução de IFN-7 e IL-10 também diminuíram levemente nos animais IL-21R~/". Assim, a resposta de TH2 reduzida observada nos camundongos IL-21R"A não foi associada com a produção de citocina de TH1 aumentada. Adiminuição nas citocinas TH2 também foi específica para os tecidosgranulomatosos, visto que a produção de citocina TH2 significante foiobservada em culturas de linfonodo e esplenócito a seguir da estimulação invitro com antígeno (SEA) ou mitógeno de ovo solúvel (FIG. 17B). De fato,SEA compativelmente estimulou respostas de IL-5, IL-10 e IL-13 mais fortesnas culturas de linfonodo preparadas a partir de camundongos IL-21R"7". Nãoobstante, compatível com a resposta de TH2 reduzida no pulmão, umaresolução mais rápida de formação de granuloma foi observada nos animaisIL-21R"7" (FIG. 17C). Além disso, houve uma diminuição acentuada emdiversos genes associados com a ativação de Stató ou "macrófagosalternativamente ativados" (AAMcf) (Nair et al. (2005) Infect. Immun. 73:385-94; Zhu et al. (2004) Science 304: 1678-82; Chiaramonte et al. (2003),supra; Gordon, S. (2003) Nat. Rev. Immunol. 3: 23-35), fornecendo maisevidência de uma redução global na resposta efetora TH2 em camundongosIL-21R-1 (FIG. 17D).

Exemplo 4: A Resposta TH2 é Reduzida em Camundongos IL-21R"A a Seguir da Infecção por N. brasiliensis

Para determinar se a resposta efetora TH2 reduzida foiespecífica para a formação de granuloma pulmonar de S. mansoni,camundongos do tipo selvagem e IL-21R"/" foram infectados com o nematóideintestinal N. brasiliensis. A infecção é estabelecida pela inoculação de larvasdo terceiro estágio (L3) sob a pele. Como os parasitas maduros, eles migramdo sítio de inoculação e entram nos pulmões por intermédio do sistemacirculatório. Uma vez dentro dos pulmões, os parasitas deflagram umaresposta TH2 vigorosa e altamente polarizada (Urban et al. (1993) J. Immunol.151: 7086-94), que foi confirmada analisando-se a expressão de diversosgenes associados com TH2 no pulmão (FIG. 18A) e linfonodos associadoscom o pulmão (FIG. 18B). Os pulmões e os linfonodos de camundongos dotipo selvagem demonstraram aumentos acentuados na expressão de mRNA deIL-4, IL-13, AMCase, FIZZl/RELMla e Yml a seguir da infecção por N.brasiliensis (FIG. 18A e 18B). Entretanto, de acordo com o modelo degranuloma pulmonar, níveis significantemente reduzidos de IL-4, IL-13 eAMCase foram observados, assim como níveis levemente reduzidos demRNA de Yml e FIZZ1 nos pulmões dos camundongos IL-21"7" (FIG. 18A).Os linfonodos drenados demonstraram uma redução similar, embora adiminuição em Yml e FIZZ1 fossem mais significantes nos linfonodos (FIG.18B). A única outra diferença maior entre os dois tecidos foi a resposta demRNA de AMCase, que pareceu ser restrito ao pulmão. Juntos, estes dadosconfirmam um papel importante para a IL-21R no desenvolvimento deresposta TH2 in vivo. Notavelmente entretanto, a despeito de desenvolver umaresposta TH2 acentuadamente atenuada, os camundongos IL-21R"/" infectadoscom N. brasiliensis não demonstraram nenhuma demora significante naexpulsão de vermes adultos (não mostrados).

Exemplo 5: A Inflamação direcionada à Citocina Tipo-2 éDiminuída nos Pulmões de Camundongos IL-21"7"

A série seguinte de experimentos foi planejada para determinarse a IL-21R modula o desenvolvimento de respostas TH2 secundárias. Paraestes experimentos, os camundongos do tipo selvagem e IL-21"7" foramsensibilizados com ovos de S. mansoni e inoculados intravenosamente 2semanas mais tarde. Como esperado, os camundongos sensibilizadosdesenvolveram uma resposta granulomatosa robusta que foi 4 a 5 vezes maior(FIG. 19C) do que os animais inoculados primários (FIG. 17C). Comoobservado no modelo primário, houve um aumento significante no mRNA deIL-21 e IL-21R nos pulmões a seguir da exposição ao ovo, embora a respostade IL-21 chegou ao máximo muito mais cedo durante a inoculaçãosecundária. A IL-21R foi apenas modestamente aumentada quandocomparada com a IL-21 embora a mesma permanecesse significantementeelevada em ambos os pontos de tempo, enquanto que os níveis de mRNA deIL-21 declinaram depois de atingir um pico no dia 4 (FIG. 19A). Assim,houve evidência de regulagem mais firme do ligando nos tecidos. Houvetambém uma diminuição acentuável na expressão de IL-21 nos camundongosIL-21"7", confirmando um mecanismo de retroalimentação potente entre oreceptor e seu ligando. Entre as citocinas associadas com TH2, a IL-13 foi aresposta mais robusta, demonstrando um aumento de 50 a 100 vezes emrelação à referência em camundongos do tipo selvagem. Entretanto, a mesmafoi reduzida para 10 a 20 vezes acima do fundo nos camundongos IL-21R"7",demonstrando que a IL-21R é requerida para o desenvolvimento máximo daresposta TH2 secundário. Mais uma vez, a redução na expressão de citocinaTH2 em camundongos IL-21"7" não foi acompanhada por um aumentosignificante na IFN-g. De fato, a expressão de mRNA de IFN-g diminuiu nospulmões de camundongos IL-21R"7". Não obstante, os silenciadosdemonstraram um aumento modesto mais compatível na produção de IFN-gnos linfonodos e baço, sugerindo uma inibição maior das citocinas TH2globais (FIG. 19B). Compatível com o modelo da inoculação de ovo primário,a redução na produção de citocina TH2 e TH1 foi mais pronunciada nostecidos granulomatosos (FIG. 19A), embora a resposta de TH2 induzida porSEA também foi parcialmente reduzida no baço (FIG. 19B). A reduçãosignificante na inflamação granulomatosa secundária foi compatível com odesenvolvimento de uma resposta TH2 mais fraca no pulmão (FIG. 19C).Além disso, houve uma diminuição acentuada na expressão de FIZZ1, Yml eAMCase (FIG. 19D), confirmando ainda uma deterioração significante derespostas efetoras TH2 secundárias nos camundongos IL-21 R"7".

Exemplo 6: Anticorpos IgG, Formação de Granuloma eCitocinas Tipo 2 São Substancialmente Reduzidos em CamundongosDeficientes em IL-21R Infectados

Em seguida, para determinar se a sinalização de IL-21 érequerida para a manutenção de uma resposta dominada por TH2 crônica; osanimais foram expostos percutaneamente às cercárias de S. mansoni e suasreações patológicas e respostas imunes nos pontos de tempo tanto agudosquanto crônicos após a infecção foram analisadas. Como observado nosestudos de granuloma pulmonar, houve uma super regulagem acentuada naexpressão de mRNA de IL-21R e IL-21 nos fígados de camundongos do tiposelvagem infectados. Ao contrário, o mRNA de IL-21 foi quase indetectávelnos camundongos IL-21"7" mesmo depois da infecção crônica (FIG. 20A). Noestágio agudo após a infecção, os camundongos IL-21 R_/" tambémmanifestaram uma redução acentuada na expressão do mRNA de citocina TH2(FIG. 20A). Entretanto, as mudanças foram mais uma vez restritas aos tecidosgranulomatosos porque o linfonodo e as respostas de esplenócito de ambos osgrupos foram similares a seguir da estimulação in vitro com antígenos deparasita (FIG. 20B). A única diferença compatível observada nos ensaios invitro foi uma diminuição de 2 a 3 vezes na produção de IL-5 e EL-10 nasculturas de esplenócito. Os camundongos IL-21"7" também desenvolveramgranulomas significantemente menores no estágio agudo após a infecção(FIG. 20C), que foi compatível com as respostas de mRNA de IL-4 e IL-13reduzidas no fígado (FIG. 20A). Entretanto, isto não foi acompanhado pornenhuma mudança óbvia na porcentagem de eosinófilos nos granulomas(FIG. 20C). Uma análise microscópica mais detalhada das lesõesconfirmaram que não houve nenhuma mudança detectável na composiçãoglobal dos granulomas (FIG. 2IA). Os experimentos também foramempreendidos para determinar se a deficiência de EL-21R estavaespecificamente afetando o recrutamento de células T CD4+ aos tecidosgranulomatosos. Para tratar deste assunto, o modelo de granuloma pulmonarfoi usado de modo a sincronizar o recrutamento de células inflamatórias.Entretanto, compatível com as avaliações microscópicas de granulomashepáticos (FIG. 2IA), a porcentagem de células T CD4+ nos pulmões foisimilar em camundongos do tipo selvagem e IL-21"7" tanto antes quanto depoisda exposição aos ovos (FIG. 21B). Assim, as mudanças no recrutamento ou aexpansão de célula T CD4+ são improváveis de explicar as respostas dacitocina TH1/TH2 diminuídas observadas nos tecidos. Ao invés, as mesmasparecem resultar de uma mais reduções gerais na resposta inflamatória global.De modo importante, ambos os grupos eficazmente infra modularam as suasrespostas granulomatosas em 12 semanas após a infecção (Pearce eMacDonald, supra). Consequentemente, não houve nenhuma diferençasignificante no tamanho do granuloma no ponto de tempo crônico (FIG. 20C).

A deterioração mínima na resposta de citocina TH2 foi observada noscamundongos silenciados cronicamente infectados (FIG. 20A). A reduçãoacentuada em FIZZ1 e Yml observada no estágio agudo também diminuiunos animais IL-217" cronicamente infectados (FIG. 20D). Não obstante, aexpressão de AMCase permaneceu acentuadamente baixa na semana 12,sugerindo uma diminuição prolongada de pelo menos um subconjunto dasrespostas que direcionam TH2 em camundongos IL-21"7" cronicamenteinfectados.

Os camundongos IL-21R"7" também foram examinados quantoas mudanças nos níveis de anticorpo séricos (FIG. 22). Compatível com assuas respostas de citocina suprimidas (FIG. 20A), os camundongos IL-21"7"demonstraram uma redução acentuada em títulos de IgGl específicos deparasita (anticorpo associado com TH2) e IgG2b (anticorpo associado comTH1), que foi mantida nos pontos de tempo crônicos (FIG. 22B).Interessantemente entretanto, isto não foi acompanhado por nenhumamudança significante na IgE (FIG. 22C), sugerindo uma deterioração seletivaapenas em um subconjunto de isotipos de anticorpo sérico. A IL-21 exógenamostrou inibir a produção de IgE (Suto et al. (2002) Blood 100: 4565-73), quepode explicar a leve elevação de IgE nos camundongos IL-21"/" cronicamenteinfectados. De modo importante, a redução global na responsividade tipo 2nos camundongos IL-217" não foi atribuída às diferenças na carga parasíticavisto que números similares de ovos e parasitas adultos emparelhados foramencontrados nos tecidos de ambos os grupos em todos os pontos de tempo(FIG. 22A).

Exemplo 7: A deficiência em IL-21R diminui a Progressão da

Fibrose Hepática

Porque acredita-se que as citocinas TH2 desempenhem umpapel principal na fibrogênese tecidual (Wynn (2004), supra), odesenvolvimento e progressão de fibrose hepática em camundongos IL-21R"7"infectados com S. mansoni foram em seguida examinados. Os níveis dehidroxiprolina hepática foram ensaiados em vários pontos de tempo após ainfecção como uma medida direta do teor de colágeno de tecido. Comoesperado, a fibrose hepática acentuada foi observada nos camundongos dotipo selvagem infectados (FIG. 22D). Ao contrário, a IL-21"7" demonstrousignificantemente menos fibrose em pontos de tempo tanto agudos quantocrônicos. Notavelmente, em 29 semanas após a infecção os camundongos IL-21 R_/" exibiram uma diminuição de mais do que 50 % no teor de colágenohepático total comparado com os camundongos do tipo selvagem (FIG. 22E),confirmando assim um papel importante e indispensável para a IL-21R naprogressão de fibrose dependente de TH2.

Os experimentos foram empreendidos para examinar se uminibidor de IL-21 diminuiria a progressão de fibrose em camundongos do tiposelvagem infectados. Para estes experimentos, grupos de camundongosC57BL/6 foram tratados com sIL-21R-Fc ou proteína de controle por um totalde 5 semanas, partindo na semana 6 após a infecção, ao redor do tempoquando os ovos são primeiro detectados no fígado. Embora ambos os grupostivessem cargas de verme e ovo tecidual similares (dados não mostrados), oscamundongos que recebem o bloqueador de IL-21 demonstraram umaredução acima de over 50 % na fibrose hepática no término do experimento(FIG. 22F). A expressão de mRNA de IL-4 e IL-13 também diminuiu nofígado e o tamanho do granuloma foi reduzido aproximadamente 15 % (dadosnão mostrados). Assim, estes dados louvam os experimentos realizados comcamundongos IL-21 R.

Exemplo 8: A Sinalização de IL-21 Promove oDesenvolvimento de Macrófagos Alternativamente Ativados

Porque Arg-1, FIZZ1 e TGF-lb foram ligados com odesenvolvimento de fibrose e a expressão de diversos genes regulados porTH2/Stat6 foi reduzida nos tecidos doentes de camundongos IL-21R"7" (FIGS.17 a 20) (ver também, Gordon,. supra; Nair et al., supra), experimentos foramempreendidos para determinar se Arg-1, FIZZ1 e TGF-bl foram diretamentemodulados em macrófagos a seguir da estimulação com IL-21. Arg-1 e FIZZ1são também marcadores bem conhecidos de macrófagos alternativamenteativados (AAM0) (Gordon, supra). Para estes estudos, as culturas demacrófago derivados da medula óssea (BMW) foram gerados e depoisestimulados com várias combinações de IL-4, IL-13 e IL-21. Como esperado,IL-4 e IL-13 ambos aumentaram a expressão de mRNA de Arg-1 e FIZZ1,com um efeito aditivo observado quando os dois estímulos foram usados emcombinação (FIG. 23 A). Notavelmente entretanto, embora a IL-21 não tivessenenhum efeito sobre o gene quando usada sozinha, as culturas que foram prétratadas com IL-21 demonstraram aumentos altamente significantes naexpressão de mRNA de Arg-1 e FIZZ1 quando subseqüentementeestimuladas com DL-4 e EL-13 (FIG. 23A). A mesma combinação tambémsignificantemente aumentou a função de arginase nas células (FIG. 23B). Aocontrário, a IL-21 não teve nenhum efeito sobre os níveis de TGF-bl total ouativo nos sobrenadantes de cultura (FIG. 24). Inesperadamente, o tratamentocom IL-21 sozinha significantemente aumentou a expressão de IL-4Ra e IL-13Ral (FIG. 23C). Ao contrário, a IL-4 e IL-13 não tiveram nenhum efeitoquando usadas sozinhas (FIG. 23 C) e não houve nenhum efeito adicionalquando os três estímulos foram usados em combinação (não mostrados).

Porque a IL-13Ra2 também pode influenciar a sinalizaçãodependente de IL-13 (Chiaramonte et al. (2003), supra; Mentink-Kane et al.Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 101: 586-90; Wood et al. (2003) J. Exp. Med.197: 703-09), experimentos foram empreendidos para examinar se a IL-21estava regulando a produção da IL-13Ra2. Não surpreendentemente, porque aIL-13Ra2 é primariamente produzida pelas células não hematopoiéticas comofibroblastos e músculo liso (Chiaramonte et al. (2003), supra; Jakubzick et al.(2003) Am. J. Pathol. 162: 1475-86; Zheng et al. (2003) J. Allergy Clin.Immunol. 111: 720-28; Morimoto et al. (2006) J. Immunol. 176: 342-48), nãohouve nenhuma evidência de regulagem de receptor isca nas culturas deBMW (dados não mostrados). Entretanto, quando a regulagem do receptorisca in vivo foi examinada, a IL-21 infira-regulou a expressão de mRNA deIL-13Ra2 nos pulmões de camundongos inoculados com ovo i.v. esignificantemente diminuiu os níveis da IL-13Ra2 solúvel no seu soro (FIG.23D). Quando visualizados juntos, estes dados sugerem que a IL-21 contribuipara o desenvolvimento de macrófagos alternativamente ativados pela superregulagem do receptor de IL-4 tipo-2 (receptor de sinalização) em macrófagose diminuindo-se simultaneamente os níveis da IL-13Ra2 solúvel (receptorisca) no soro. Ambos os mecanismos provavelmente contribuíram para aativação aumentada de Arg-1 e FIZZ1 nos macrófagos estimulados com IL-4/IL-13. Como tais, estes fornecem uma explicação mecanística adicionalpara as respostas TH2 prejudicadas e fibrose dependente de TH2 noscamundongos JL-2V1' infectados com helminto.

Exemplo 9: Debate

A IL-21 foi recentemente caracterizada como uma citocinaTH2 que podem inibir a diferenciação de células TH ingênuas em células TH1que produzem IFN-g (Wurster et al. (2002), supra). Porque a resposta imunena esquistossomose evolui de um IFN-g inicial a uma resposta TH2prolongada e dominante (Pearce e MacDonald, supra), a influência dasinalização de IL-21R no desenvolvimento de respostas TH2 induzidas porhelminto foi examinada. A infecção de camundongos do tipo selvagem comS. mansoizi aumentou a expressão de IL-21 e IL-21R no fígado, confirmandouma associação da sinalização de IL-21 com a imunidade do tipo 2 induzidapor helminto. Entretanto, no pulmão, os ovos de esquistossoma induziram aexpressão de IL-21 significante durante as respostas polarizadas tanto de TH1quanto de TH2. De fato, a expressão de IL-21 aumentou principalmentequando os camundongos foram polarizados para uma resposta TH1. Estesdados sugeriram que a IL-21 exibe um padrão menos restrito de expressão doque aquele das outras citocinas associadas com m TH2. O receptor para a IL-21 também falhou em demonstrar um padrão específico de TH1/TH2.Entretanto, o receptor de IL-21 foi induzido quase 4 vezes mais nos pulmõesde camundongos polarizados TH2 versus TH1, que forneceu uma das primeirasindicações de que a sinalização de IL-21R poderia estar envolvida naregulagem da inflamação mediada pela TH2.

Para determinar se as respostas efetoras do tipo 2 foramcomprometidas na ausência da IL-21R, a expressão de diversos genes que sãoinduzidos preferencialmente sob condições de polarização de TH2 foiexaminada. Estes genes incluíram AMCase, Yml e FIZZ1, todos os quais sãoconsiderados desempenhar papéis importantes e não redundantes naregulagem da inflamação mediada pela TH2 (Thu et al., supra; Chiaramonte etal. (2003), supra; Nair et al., supra; Mentink-Kane et al., supra; Guo et al.(2000) Biol. Chem. 275: 8032-37). Embora alguma variação fosse observadadurante uma resposta imune primária, secundária ou crônica, em cada caso oscamundongos EL-21R"/" demonstraram diminuição altamente significantenestes genes associados com TH2. Yml e AMCase são membros de umafamília de proteínas que compartilham homologia com quitinases deorganismos inferiores (Nair et al., supra). Embora a sua função exata emreações imunes do hospedeiro permaneça indeterminada, considera-se queestas desempenhem papéis importantes na quimiotaxia de eosinófilo,remodelagem de tecido e fibrose. De fato, um estudo recente mostrou que aneutralização de AMCase poderia melhorar a inflamação direcionada poralérgeno e a hiperresponsividade das vias aéreas, confirmando assim aparticipação de quitinases de mamífero na imunidade TH2 (Zhu et al, supra).FIZZ1 também está associada com a fibrogênese de tecido (Mentink-Kane etal., supra; Liu et al. (2004) J. Immunol. 173: 342531). Consequentemente,uma função maior da IL-21R pode regular o mecanismos de cicatrização deferimento e fibrose. Portanto, além da sua participação em respostas imunesinduzidas por helminto, a IL-21R pode estar envolvida na regulagem de umavariedade de distúrbios inflamatórios mediados por TH2.

Na esquistossomose, a deficiência de IL-21R teve um efeitoprofundo sobre a progressão da doença. Embora as intensidades da infecçãofossem as mesmas nos camundongos do tipo selvagem e YL-2Y1', a respostainflamatória induzida pelo ovo diminuiu significantemente na ausência da IL-2IR. Houve também uma redução acentuada na formação de granulomasecundário e uma resolução mais rápida de granulomas primários no pulmão.Juntos, estes dados ilustram um papel indispensável para a IL-21R nainflamação granulomatosa. Estudos anteriores mostraram que a IL-4 e IL-13são essenciais para a formação de lesão (Pearce e MacDonald; supra), assimacredita-se que a IL-21R esteja afetando direta ou indiretamente a atividadedestas citocinas. Estes estudos sugeriram que a IL-21 não estava atuandosozinha visto que níveis extremamente altos de IL-21 foram observados emcamundongos duplamente silenciados em IL-4/IL-10, embora a formação degranuloma fosse quase completamente removida nestes animais deficientesem TH2 (Hoffmann et al. (2000) J. Immunol. 164: 6406-16; Sandler et al.(2003) J. Immunol. 171: 3655-67). Assim, a IL-21 parece colaborar com a IL-4 e IL-13 para induzir uma resposta máxima. Os dados aqui divulgadosmostram que não existe nenhuma mudança detectável na composição celulardos granulomas nos camundongos IL-21"7" e nenhuma deterioração específicano recrutamento da célula T CD4+. Juntas, estas descobertas sugeriram que aIL-21R regula o desenvolvimento de patologia induzida por parasita pelamodulação da intensidade global da resposta efetora TH2.

A IL-21 não é considerada regular a diferenciação da célulaTH2 induzida por IL-4 diretamente (Suto et al., supra; Wurster et al. (2002),supra). Ao contrário, foi levantada a hipótese em um documento recente deque a IL-21 poderia amplificar as respostas direcionadas por TH2 pela infra-regulagem da expansão de células ThI que produzem IFN-g (Wurster et al.(2002), supra). Como tal, é teorizado que a resposta de IFN-g emcamundongos infectados com esquistossoma poderia aumentar na ausência doreceptor de IL-21. Embora um aumento pequeno fosse observado emlinfonodos associados com pulmão in vitro, a produção de IFN-g foicompativelmente reduzida nos tecidos granulomatosos. Assim, os estudos nãomostram que a IL-21R endógena desempenhou um papel substancial nainibição da produção de IFN-g durante a infecção por helminto. Entretanto, oscamundongos IL-21"7" simultaneamente geraram respostas de citocina TH1 eTH2 mais fracas nos tecidos. A redução significante nos títulos de anticorpoIgG2b (associada com TH1) e IgGl (associada com TH2) em todos os temposapós a infecção sustenta esta conclusão. As citocinas TH2 também foramdiminuídas ao nível do mRNA em ambos os pulmões e linfonodos a seguir dainfecção por N. brasiliensis. Na verdade, todos os dados ex vivo diretosconfirmaram uma redução acentuada na expressão de citocina TH2 e a funçãodentro dos tecidos afetados. Não obstante, não houve nenhuma reduçãocompatível na produção de citocina TH2 pelos linfócitos isolados a seguir dareestimulação com antígeno, que sugere que os camundongos IL-21"7" sãocapazes de gerar respostas TH2 significantes, pelo menos in vitro. Assim, osdados aqui divulgados sugerem que a IL-21R está seletivamente aumentandoas respostas TH2 nos tecidos. Além de promover a resposta TH2, a IL-21Rtambém aumentou a produção de IL-21. Assim, a IL-21R parece operar emuma maneira autócrina para direcionar a expressão de citocina TH2 e asfunções efetoras tipo 2 in vivo.

Para elucidar ainda mais os mecanismos envolvidos,experimentos foram empreendidos para determinar se a IL-21 estavamodulando diretamente a função de macrófago, porque os dados in vivomostraram uma redução acentuada em diversos genes que foram associadoscom o fenótipo "alternativamente ativado" (Gordon, supra; Mantovani et al.(2005) Immunity 23: 344-46). Os macrófagos e fibroblastos que exibem umfenótipo alternativamente ativado são constituintes celulares principais degranulomas de esquistossoma e estudos funcionais sugeriram que eles estãocriticamente envolvidos na progressão da doença (Hesse et al. (2001), supra).De fato, um estudo importante por Brombacher et al. mostrou que oscamundongos que são completamente deficientes em macrófagosalternativamente ativados desenvolveram patologia induzida pelo ovo letal aseguir da infecção com S. mansoni (Herbert et al. (2004) Immunity 20: 623-35). Além disso, porque o TGF-bl derivado de macrófago foi implicado nomecanismo da fibrose mediada pela IL-13 (Lee et al. (2001) J. Exp. Med.194: 809-21; Fichtner-Feigl et al. (2006) Nat. Med. 12: 99-106), experimentosforam empreendidos para determinar se a EL-21 estava modulando a produçãode TGF-bl em macrófagos. Para investigar estes problemas, o mRNA de Arg-1 e FIZZ1, a atividade de arginase e as respostas de proteína de TGF-blforam medidos em macrófagos derivados da medula óssea a seguir daestimulação com várias combinações de IL-21, EL-4 e IL-13. Arg-1 e FIZZ1são genes dependentes de EL-4Ra/Stat6 (Liu et al., supra; Hesse et al. (2001),supra; Munder et al. (1998) J. Immunol. 160: 5347-54); portanto, estesservem como marcadores funcionais da ativação de macrófago alternativa. Demodo importante, as descobertas sugeriram que quando macrófagos foramexpostos à IL-21, eles se tornaram muito mais sensíveis às atividadesinduzidas por Arg-1 e FIZZ1 de IL-4 e IL-13. A atividade de arginaseavaliada pela produção de uréia também aumentou significantemente,confirmando a IL-21 como um estímulo importante para o desenvolvimentode macrófagos alternativamente ativados altamente funcionais. Ao contrário,a IL-21 não teve nenhum efeito sobre a produção de TGF-bl pelosmacrófagos. Assim, a citocina pró-fibrótica TGF-bl parece estar envolvida,que é compatível com os estudos anteriores que têm investigado o papel deTGF-bl na esquistossomose (Kaviratne et al. (2004) J. Immunol. 173: 4020-29). Ao contrário, a EL-21 aumentou significantemente a expressão de lL-4Rae IL-13Ral em BMMos e diminuiu a produção do receptor isca de IL-13solúvel in vivo, que provavelmente explica a sua sensibilidade elevada à IL-4e IL-13. Como tais, estes dados louvam os estudos in vivo com camundongosIL-21R"/" e sugerem que uma função importante da sinalização de IL-21R érealçar o desenvolvimento de AAM0, que foi implicado no mecanismo dafibrose (Hesse et al. (2001), supra; Hesse et al. (2000), supra). Além disso,porque AAM0 mostrou amplificar a diferenciação de célula TH2 CD4+(Ossocchi et al. (1998) Blood 92: 2668-71), estes dados também podemexplicar a redução global na atividade de TH2 induzida por helminto noscamundongos EL-21R-L.

Na esquitossomíase humana, o desenvolvimento da patologiahepática flbrótica é a causa princípio de morbidez e mortalidade crônicas(Pearce e MacDonald, supra; Wynn et al. (2004) Immunol. Rev. 201: 156-67).Porque a resposta de citocina TH2 é conhecida desempenhar um papelimportante na deposição de colágeno (Wynn et al. (2004), supra), uma sériefinal de experimentos examinaram a influência da LL-21R sobre a progressãoda fibrose hepática. Notavelmente, o desenvolvimento da fibrose diminuiusignificantemente nos camundongos IL-21"7", com os animais silenciadosdemonstrando uma redução de mais de 50 % na fibrose hepática em 29semanas após a infecção. De modo importante, descobertas similares tambémforam geradas quando camundongos do tipo selvagem infectados foramtratados com sIL-21R-Fc. Assim, o receptor de IL-21 foi revelado como umnovo potencial alvo para a terapia anti-fibrótica. Em conclusão, estes estudosilustram um papel essencial para a IL-21R na progressão da doença mediadapela citocina TH2. Como tal, a IL-21R deve ser adicionada à lista dereceptores importantes que regulam a imunidade tipo 2 e a polarização demacrófago.

Exemplo 10: Tratamentos Profiláticos

Um conjunto não limitante de exemplos de tratamentoprofilático seguem.

Um paciente diagnosticado com cirrose hepática éadministrado com uma proteína de fusão de IL-21R para reduzir o acúmulo detecido fibrótico no fígado. A proteína de fusão de IL-21R inclui osaminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 2 fundida ao seu terminal C porintermédio de um ligador (que corresponde aos aminoácidos de 236 a 243 daSEQ ID NO: 17) a uma seqüência de imunoglobulina Gl (IgGl) humanamutada em Fc (que corresponde aos aminoácidos de 244 a 467 da SEQ IDNO: 17).Um paciente diagnosticado com uma infecção comesquistossoma é administrado com um fragmento de IL-21R solúvel parareduzir o acúmulo de tecido fibrótico. O fragmento contém os aminoácidos de20 a 538 da SEQIDNO: 2.

A seguir da cirurgia, um paciente é administrado com umanticorpo IL-21R para reduzir o acúmulo de fibrose devido à incisão cirúrgicadurante o processo de cicatrização de ferimento.

Um paciente diagnosticado com cirrose hepática éadministrado com um anticorpo IL-21 para reduzir o acúmulo de tecidofibrótico no fígado.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> wyeth

The Government of the United States of America asRepresented by the Secretary of the Department of Health andHuman Services

The President and Fellows of Harvard college<120> MÉTODOS PARA TRATAR E PREVINIR FRIBOSE

<130> 01997.043800

<150> 60/671,374<151> 2005-04-14

<160> 33

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 2665

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (236)..(1849)

<400> 1

gtcgactgga ggcccagctg cccgtcatca gagtgacagg tcttatgaca gcctgattgg 60

tgactcgggc tgggtgtgga ttctcacccc aggcctctgc ctgctttctc agaccctcat 120

ctgtcacccc cacgctgaac ccagctgcca cccccagaag cccatcagac tgcccccagc 180

acacggaatg gatttctgag aaagaagccg aaacagaagg cccgtgggag tcagc atg 238

Met1

ccg cgt gqc tgg gcc gcc ccc ttg etc ctg ctg ctg etc cag gqa gqc 286Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly Gly5 10 15

tgg gqc tgc ccc gac etc gtc tgc tac acc gat tac etc cag acg gtc 334Trp Gly cys Pro Asp Leu Vai Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Vai20 25 30

ate tgc ate ctg gaa atg tgg aac etc cac ccc age acg etc acc ctt 382lie Cys lie Leu Glu Met Trp Asn Leu His pro Ser Thr Leu Thr Leu35 40 45

acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac gag gcc acc tec tgc 430Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys50 55 60 65

age etc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat gcc acc tac acc tgc 478Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys70 75 80

cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac att ttc agt gtc aac 526His Met Asp vai Phe His Phe Met Ala Asp Asp lie Phe Ser Vai Asn85 90 95ate aca gac cag tet ggc aac tac tec cag gag tgt ggc age ttt etclie Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu cys Gly Ser Phe Leu100 105 110 574

ctg gct gag age ate aag ceg gct cec cet ttc aac gtg act gtg acc 622Leu Ala Glu Ser lie Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Vai Thr Vai Thr115 120 125

ttc tca gga cag tat aat ate tec tgg cgc tca gat tac gaa gac cet 670Phe Ser Gly Gln Tyr Asn lie Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp pro130 135 140 145

gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat gag ctg cag tac agg 718Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg150 155 160

aac cgg gqa gac cec tgg gct gtq agt ceg agg aga aag ctg ate tca 766Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Vai Ser pro Arg Arg Lys Leu lie Ser165 170 175

gtg gac tca aga agt gtc tec etc etc cec ctg gag ttc cgc aaa gac 814vai Asp ser Arg ser vai Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp180 185 190

tcg age tat gag ctg cag gtg cgg gea ggg cec atg cet ggc tec tecser Ser Tyr Glu Leu Gln VaT Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser ser195 200 205

aaa tgg gtg ggt gea cec ttc act ggc tec age ctg gag ctg gga cecLys Trp Vai Gly Ala Pro Phe Thr Gly ser Ser Leu Glu Leu Gly Pro290 295 300 305 862

tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ceg gtc ate ttt cag acc 910Tyr Gln Gly Thr Trp ser Glu Trp Ser Asp Pro vai lie Phe Gln Thr210 215 220 225

cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac cet cac ctg ctg ctt etc 958Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu Leu230 235 240

etc ctg ctt gtc ata gtc ttc att cet gcc ttc tgg age ctg aag acc 1006Leu Leu Leu Vai lie Vai Phe lie Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys Thr245 250 255

cat cca ttg tgg agg cta tgg aag aag ata tgg gcc gtc cec age cet 1054His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys lie Trp Ala VaT Pro Ser Pro260 265 270

gag cgg ttc ttc atg cec ctg tac aag ggc tgc age gga gac ttc aag 1102Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly cys Ser Gly Asp Phe Lys275 280 285 1150

tgg age cca gag gtg cec tec acc ctg gag gtg tac age tgc cac cca 1198

Trp Ser Pro Glu vai Pro Ser Thr Leu Glu VaT Tyr ser cys His Pro

310 315 320

cca cgg age ceg gcc aag agg ctg cag etc acg gag cta caa gaa cca 1246

Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu Pro325 330 335

gea gag ctg gtg gag tet gac ggt gtg cec aag cec age ttc tgg ceg 1294

Ala Glu Leu VaT Glu Ser Asp GTy VaT Pro Lys Pro Ser Phe Trp Pro340 345 350

aca gcc cag aac tcg ggg ggc tca gct tac agt gag gag agg gat cgg 1342Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg355 360 365

cca tac ggc ctg gtg tcc att gac aca gtg act gtg cta gat gca gag 1390Pro Tyr Gly Leu vai Ser lie Asp Thr vai Thr Vai Leu Asp Ala Glu370 375 380 385

ggg cca tgc acc tgg ccc tgc age tgt gag gat gac ggc tac cca gcc 1438Gly Pro cys Thr Trp Pro cys ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala390 395 400

ctg gac ctg gat gct ggc ctg gag ccc age cca ggc cta gag gac cca 1486Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp Pro405 410 415

etc ttg gat gca ggg acc aca gtc ctg tcc tgt ggc tgt gtc tca gct 1534Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Vai Leu Ser cys Gly cys Vai ser Ala420 425 430

ggc age cet ggg cta gga ggg ccc ctg gga age etc ctg gac aga cta 1582Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu435 440 445

aag cca ccc ctt gca gat ggg gag gac tgg gct ggg gga ctg ccc tgg 1630Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro Trp450 455 460 465

ggt ggc cgg tca cet gga ggg gtc tca gag agt gag gcg ggc tca ccc 1678Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly vai Ser Glu ser Glu Ala Gly Ser Pro470 475 480

ctg gcc ggc ctg gat atg gac acg ttt gac agt ggc ttt gtg ggc tet 1726Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Vai Gly Ser485 490 495

gac tgc age age cet gtg gag tgt gac ttc acc age ccc ggg gac gaa 1774Asp Cys Ser ser Pro vai Glu Cys Asp Phe Thr ser Pro Gly Asp Glu500 505 510

gga ccc ccc cgg age tac etc cgc cag tgg gtg gtc att cet ceg cca 1822Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp vai vai lie Pro Pro Pro515 520 525

ctt tcg age cet gga ccc cag gcc age taatgaggct gactggatgt 1869Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser530 535

ccagagctgg ccaggccact gggccctgag ccagagacaa. ggtcacctgg gctgtgatgt 1929

gaagacacct gcagcctttg gtctcctgga tgggcctttg agcctgatgt ttacagtgtc 1989

tgtgtgtgtg tgtgcatatg tgtgtgtgtg catatgcatg tgtgtgtgtg tgtgtgtctt 2049

aggtgcgcag tggcatgtcc acgtgtgtgt gtgattgcac gtgcctgtgg gcctgggata 2109

atgcccatgg tactccatgc attcacctgc cctgtgcatg tctggactca cggagctcac 2169

ccatgtgcac aagtgtgcac agtaaacgtg tttgtggtca acagatgaca acagccgtcc 2229

tccctcctag ggtcttgtgt tgcaagttgg tccacagcat ctccggggct ttgtgggatc 2289agggcattgc ctgtgactga ggcggagccc agccctccag cgtctgcctc caggagctgc 2349

aagaagtcca tattgttcct tatcacctgc caacaggaag cgaaagggga tggagtgagc 2409

ccatggtgac ctcgggaatg gcaatttttt gggcggcccc tggacgaagg tctgaatccc 2469

gactctgata ccttctggct gtgctacctg agccaagtcg cctcccctct ctgggctaga 2529

gtttccttat ccagacagtg gggaaggcat gacacacctg ggggaaattg gcgatgtcac 2589

ccgtgtacgg tacgcagccc agagcagacc ctcaataaac gtcagcttcc ttcaaaaaaa 2649

aaaaaaaaaa tctaga 2665

<210> 2

<211> 538

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly15 10 15

Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Vai Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr20 25 30

Vai lie Cys lie Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro ser Thr Leu Thr35 40 45

Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser50 55 60

Cys ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr65 70 75 80

Cys His Met Asp Vai Phe His Phe Met Ala Asp Asp lie Phe Ser Vai85 90 95

Asn lie Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe100 105 110

Leu Leu Ala Glu Ser lie Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Vai Thr vai115 120 125

Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn He Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp130 135 140

Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr145 150 155 160Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Vai Ser Pro Arg Arg Lys Leu lie165 170 175

Ser Vai Asp Ser Arg Ser Vai Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys180 185 190

Asp ser Ser Tyr Glu Leu Gln Vai Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser195 200 205

Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Vai lie Phe Gln210 215 220

Thr Gln ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu225 230 235 240

Leu Leu Leu Leu vai lie vai Phe lie Pro Ala Phe Trp ser Leu Lys245 250 255

Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys lie Trp Ala Vai Pro Ser260 265 270

Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe275 280 285

Lys Lys Trp Vai Gly Ala Pro Phe Thr Gly ser Ser Leu Glu Leu Gly290 295 300

Pro Trp ser Pro Glu Vai Pro Ser Thr Leu Glu Vai Tyr Ser Cys His305 310 315 320

Pro Pro Arg Ser pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu325 330 335

Pro Ala Glu Leu vai Glu Ser Asp Gly vai Pro Lys Pro ser Phe Trp340 345 350

Pro Thr Ala Gln Asn ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp355 360 365

Arg Pro Tyr Gly Leu Vai Ser lie Asp Thr vai Thr Vai Leu Asp Ala370 375 380

Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro385 390 395 400

Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp405 410 415Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr vai Leu Ser Cys Gly cys vai Ser420 425 430

Ala Gly ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly ser Leu Leu Asp Arg435 440 445

Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro450 455 460

Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Vai Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser465 470 475 480

pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp ser Gly Phe vai Gly485 490 495

Ser Asp Cys Ser ser Pro Vai Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp500 505 510

Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp vai vai lie Pro Pro515 520 525

Pro Leu Ser Ser pro Gly pro Gln Ala Ser530 535

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<2i3> Desconhecido

<220>

<223> Motivo conservado do receptor de quimiocina

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente

<400> 3

Trp Ser Xaa Trp ser1 5

<210> 4

<211> 2628

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (407)..(1993)<400> 4 gtcgacgcgg cggtaccagc tgtctgccca cttctcctgt ggtgtgcctc acggtcactt 60

gctrtgtctga ccgcaagtct gcccatccct ggggcagcca actggcctca gcccgtgccc 120

caggcgtgcc ctgtctctgt ctggctgccc cagccctact gtcttcctct gtgtaggctc 180

tgcccagatg cccggctggt cctcagcctc aggactatct cagcagtgac tcccctgatt 240

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ctccgagtcc cgctgtgact cccacgccca ggagaccacc caagtgcccc agcctaaaga 360

atggctttct gagaaagacc ctgaaggagt aggtctggga cacagc atg Met ccc cgg Pro Arg 415

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tgc ctg gac etc act tgc tac act gac tac etc tgg acc ate acc tgt 511cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr He Thr Cys20 25 30 35

gtc ctg gag aca cgg age ccc aac ccc age ata etc agt etc acc tgg 559vai Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser ile Leu ser Leu Thr Trp40 45 50

caa gat gaa tat gag gaa ctt cag gac caa gag acc ttc tgc age cta 607Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe cys Ser Leu55 60 65

cac agg tet ggc cac aac acc aca cat ata tgg tac acg tgc cat atg 655His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His lie Trp Tyr Thr Cys His Met70 75 80

cgc ttg tet caa ttc ctg tec gat gaa gtt ttc att gtc aat gtq acg 703Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Vai Phe lie Vai Asn Vai Thr85 90 95

gac cag tet ggc aac aac tec caa gag tgt ggc age ttt gtc ctg gct 751Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Vai Leu Ala100 105 110 115

gag age ate aaa cca gct ccc ccc ttg aac gtg act gtg gcc ttc tca 799Glu Ser lie Lys Pro Ala Pro pro Leu Asn vai Thr vai Ala Phe Ser120 125 130

gga cgc tat gat ate tec tgg gac tca gct tat gac gaa ccc tec aac 847Gly Arg Tyr Asp ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn135 140 145

tac gtg ctg agg ggc aag cta caa tat gag ctg cag tat cgg aac etc 895Tyr vai Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu150 155 160

aga gac ccc tat gct gtg agg ceg gtg acc aag ctg ate tca gtg gac 943Arg Asp Pro Tyr Ala Vai Arg pro vai Thr Lys Leu Ile Ser VaT Asp165 170 175

tca aga aac gtc tet ctt etc cet gaa gag ttc cac aaa gat tet age 991Ser Arg Asn Vai Ser Leu Leu pro Glu Glu Phe His Lys Asp Ser Ser180 185 190 195

tac cag ctg cag gtg cgg gca gcg cct cag cca ggc act tca ttc agg 1039Tyr Gln Leu Gln VaT Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr Ser Phe Arg200 205 210

ggg acc tgg agt gag tgg agt gac ccc gtc ate ttt cag acc cag gct 1087Gly Thr Trp Ser Glu Trp ser Asp Pro Vai lie Phe Gln Thr Gln Ala215 220 225

ggg gag ccc gag gca ggc tgg gac cct cac atg ctg ctg etc ctg gct 1135Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu Leu Leu Ala230 235 240

gtc ttg ate att gtc ctg gtt ttc atg ggt ctg aag ate cac ctg cct 1183vai Leu lie lie Vai Leu vai Phe Met Gly Leu Lys lie His Leu Pro245 250 255

tgg agg cta tgg aaa aag ata tgg gca cca gtg ccc acc cct gag agt 1231Trp Arg Leu Trp Lys Lys lie Trp Ala Pro VaT Pro Thr Pro Glu Ser260 265 270 275

ttc ttc cag ccc ctg tac agg gag cac age ggg aac ttc aag aaa tgg 1279Phe Phe Gln Pro Leu Tyr Arg Glu His ser Gly Asn Phe Lys Lys Trp280 285 290

gtt aat acc cct ttc acg gcc tec age ata gag ttg gtg cca cag agt 1327Vai Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser lie Glu Leu vai Pro Gln Ser295 300 305

tec aca aca aca tca gcc tta cat ctg tca ttg tat cca gcc aag gag 1375Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro Ala Lys Glu310 315 320

aag aag ttc ceg ggg ctg ceg ggt ctg gaa gag caa ctg gag tgt gat 1423Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu Glu Cys Asp325 330 335

gga atg tet gag cct ggt cac tgg tgc ata ate ccc ttg gca gct ggc 1471Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys lie lie Pro Leu Ala Ala Gly340 345 350 355

caa gcg gtc tca gcc tac agt gag gag aga gac cgg cca tat ggt ctg 1519Gln Ala Vai Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu360 365 370

gtg tec att gac aca gtg act gtg gga gat gca gag ggc ctg tgt gtc 1567Vai Ser lie Asp Thr Vai Thr vai Gly Asp Ala Glu Gly Leu Cys vai375 380 385

tgg ccc tgt age tgt gag gat gat ggc tat cca gcc atg aac ctg gat 1615Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met Asn Leu Asp390 395 400

gct ggc cga gag tet ggc cct aat tca gag gat ctg etc ttg gtc aca 1663Ala Gly Arg Glu ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu Leu vai Thr405 410 415

gac cct gct ttt ctg tet tgc ggc tgt gtc tca ggt agt ggt etc agg 1711Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Vai Ser Gly Ser Gly Leu Arg420 425 430 435

ctt gga ggc tec cca ggc age cta ctg gac agg ttg agg ctg tca ttt 1759Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg Leu Ser Phe440 445 450

gca aag gaa ggg gac tgg aca gca gac cca acc tgg aga act ggg tcc 1807Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg Thr Gly Ser455 460 465

cca gga ggg ggc tct gag agt gaa gca ggt tcc ccc cct ggt ctg gac 1855Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro Gly Leu Asp470 475 480

atg gac aca ttt gac agt ggc ttt gca ggt tca gac tgt ggc age ccc 1903Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp cys Gly ser Pro485 490 495

gtg gag act gat gaa gga ccc cct cga age tat etc cgc cag tgg gtg 1951Vai Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp vai500 505 510 515

gtc agg acc cct cca cct gtg gac agt gga gcc cag age age 1993vai Arg Thr Pro Pro Pro Vai Asp Ser Gly Ala Gln ser Ser520 525

tageatataa taaccagcta tagtgagaag aggcctctga gcctggcatt tacagtgtga 2053

acatgtaggg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 2113

gtgtgtgtgt cttgggttgt gtgttagcac atccatgttg ggatttggtc tgttgctatg 2173

tattgtaatg ctaaattctc tacccaaagt tctaggccta cgagtgaatt ctcatgttta 2233

caaacttgct gtgtaaacct tgttccttaa tttaatacca ttggttaaat aaaattggct 2293

gcaaccaatt actggaggga ttagaggtag ggggcttttg agttacctgt ttggagatgg 2353

agaaggagag aggagagacc aagaggagaa ggaggaaggá gaggagagga gaggagagga 2413

gaggagagga gaggagagga gaggagagga gaggagaggc tgccgtgagg ggagagggac 2473

catgagcctg tggccaggag aaacagcaag tatctggggt acactggtga ggaggtggcc 2533

aggccagcag ttagaagagt agattagggg tgacctccag tatttgtcaa agccaattaa 2593

aataacaaaa aaaaaaaaaa agcggccgct ctaga 2628

<210> 5 <211> 529 <212> PRT <213> Mus museu!us

<400> 5

Met Pro Arg Gly Pro Vai Ala Ala Leu Leu Leu Leu lie Leu His Gly15 10 15

Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr20 25 30

lie Thr cys vai Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser lie Leu ser35 40 45Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe50 55 60

Cys Ser Leu His Arg ser Gly His Asn Thr Thr His lie Trp Tyr Thr65 70 75 80

Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Vai Phe lie Vai85 90 95

Asn Vai Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly ser Phe100 105 110

Vai Leu Ala Glu Ser lie Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn vai Thr Vai115 120 125

Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp lie Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu130 135 140

Pro Ser Asn Tyr Vai Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr145 150 155 160

Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala vai Àrg Pro Vai Thr Lys Leu lie165 170 175

Ser vai Asp ser Arg Asn Vai Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys180 185 190

Asp Ser ser Tyr Gln Leu Gln vai Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr195 200 205

Ser Phe Arg Gly Thr Trp ser Glu Trp ser Asp Pro Vai lie Phe Gln210 215 220

Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu225 230 235 240

Leu Leu Ala Vai Leu lie lie Vai Leu Vai Phe Met Gly Leu Lys lie245 250 255

His Leu Pro Trp Arg Leu Trp Lys Lys lie Trp Ala Pro Vai Pro Thr260 265 270

Pro Glu Ser phe Phe Gln Pro Leu Tyr Arg Glu His Ser Gly Asn Phe275 280 285

Lys Lys Trp vai Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser lie Glu Leu Vai290

295

300

Pro Gln Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu ser Leu Tyr Pro305 310 315 320

Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu325 330 335

Glu cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys lie lie Pro Leu340 345 350

Ala Ala Gly Gln Ala vai Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro355 360 365

Tyr Gly Leu Vai Ser lie Asp Thr vai Thr Vai Gly Asp Ala Glu Gly370 375 380

Leu Cys Vai Trp Pro cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met385 390 395 400

Asn Leu Asp Ala Gly Arg Glu ser Gly Pro Asn ser Glu Asp Leu Leu405 410 415

Leu vai Thr Asp pro Ala Phe Leu ser Cys Gly Cys Vai Ser Gly Ser420 425 430

Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg435 440 445

Leu Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg450 455 460

Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro465 470 475 480

Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys485 490 495

Gly Ser Pro Vai Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg500 505 510

Gln Trp Vai Vai Arg Thr Pro Pro Pro vai Asp Ser Gly Ala Gln Ser515 520 525

Ser<210> 6

<211> 224

<212> PRT

<2i3> Desconhecido

<220>

<223> Fragmento Fc de imunoglobulina

<400> 6

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser1 5 10 15

Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg20 25 30

Thr Pro Glu vai Thr cys Vai vai vai Asp Vai ser His Glu Asp Pro35 40 45

Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu vai His Asn Ala50 55 60

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn ser Thr Tyr Arg Vai Vai65 70 75 80

Ser Vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr85 90 95

Lys Cys Lys Vai ser Asn Lys Ala Leu Pro vai Pro lie Glu Lys Thr100 105 110

lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyr Thr Leu115 120 125

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai Ser Leu Thr cys130 135 140

Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser145 150 155 160

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp165 170 175

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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215 220

<210> 7

<211> 617

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> C47)..(532)

<400> 7

gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtactt atg aga tcc 55

Met Arg ser1

agt cct ggc aac atg gag agg att gtc ate tgt ctg atg gtc ate ttc 103Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg lie Vai lie Cys Leu Met Vai lie Phe5 10 15

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cag aaa cac aga cta aca tgc cct tca tgt gat tet tat gag aaa aaa 439Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys120 125 130

cca cec aaa gaa ttc cta gaa aga ttc aaa tca ctt etc caa aag atg 487Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met135 140 145

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<211> 162

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Met Arg ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Vai ile cys Leu Met1 5 10 15

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Asp Arg His Met ile Arg Met Arg Gln Leu ile Asp lie vai Asp Gln35 40 45

Leu Lys Asn Tyr Vai Asn Asp Leu Vai Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro50 55 60

Glu Asp Vai Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe ser Cys Phe Gln65 70 75 80

Lys Ala Gln Leu Lys ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg ile ile85 90 95

Asn Vai Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala100 105 110

Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp ser Tyr115 120 125

Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys ser Leu Leu130 135 140

Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu145 150 155 160

Asp Ser

<210> 9<211> 16<212> PRT

<213> Apis mel!ifera<400> 9

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ser Pro Leu His Pro15 10 15

<210> 10<211> 786<212> DNA<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> CD • ■ (780)

<400> 10

atg aaa ttc tta gtc aac gtt gcc ctt gtt ttt atg gtc gtq tac att 48Met Lys Phe Leu vai Asn vai Ala Leu Vai Phe Met vai vai Tyr lie1 5 10 15

tct tac ate tat gcc ggc age gga cac cac cat cat cac cac ggt age 96Ser Tyr lie Tyr Ala Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser20 25 30

ggc gac tat aaa gac gat gac gat aag ggt tec gga tgc cec gac etc 144Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly cys Pro Asp Leu35 40 45

gtc tgc tac acc gat tac etc cag acg gtc ate tgc ate ctg gaa atg 192vai Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Vai lie Cys lie Leu Glu Met50 55 60

tgg aac etc cac cec age acg etc acc ctt acc tgg caa gac cag tat 240Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr65 70 75 80

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cac aat gcc acg cat gcc acc tac acc tgc cac atg gat gta ttc cac 336His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys His Met Asp vai Phe His100 105 110

ttc atg gcc gac gac att ttc agt gtc aac ate aca gac cag tct ggc 384Phe Met Ala Asp Ásp lie Phe Ser Vai Asn lie Thr Asp Gln Ser Gly115 120 125

aac tac tec cag gag tgt ggc age ttt etc ctg gct gag age ate aag 432Asn Tyr Ser Gln Glu cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala Glu ser lie Lys130 135 140

ceg gct cec cet ttc aac gtg act gtg acc ttc tca gga cag tat aatPro Ala Pro Pro Phe Asn Vai Thr Vai Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn145 150 155 160

480

ate tec tgg cgc tca gat tac gaa gac cet gcc ttc tac atg ctg aag 528

lie Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys165 170 175

ggc aag ctt cag tat gag ctg cag tac agg aac cgg gga gac cec tgg 576

Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp180 185 190

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<210> 11

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<400> 12

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<210> 18<211> 741<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..C735)

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<210> 19

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

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<220>

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<210> 22

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<212> DNA

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<220>

<221> CDS

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<210> 23

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<400> 23

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tca gct tat gac gaa cec tec aac tac gtg ctg agg ggc aag cta caa 483Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn Tyr Vai Leu Arg Gly Lys Leu Gln140 145 150 155tat gag ctg cag tat cgg aac etc aga gac cec tat gct gtq agg ceg 531Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala VaT Arg Pro160 165 170

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<210> 25

<211> 255

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<400> 25

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<213> Mus musculus

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tct tac ate tat gcc gqc age gqa cac cac cat cat cac cac gqt ageSer Tyr lie Tyr Ala Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser20 25 30

gqc gac tat aaa gac gat gac gat aag gqt tec gqa tgc ctg gac etcGly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly Cys Leu Asp Leu35 40 45

act tgc tac act gac tac etc tgg acc ate acc tgt gtc ctg gag acaThr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr lie Thr Cys vai Leu Glu Thr50 55 60cgg age cec aac cec age ata etc agt etc acc tgg caa gat gaa tat 240Arg Ser Pro Asn Pro Ser lie Leu ser Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr65 70 75 80

gag gaa ctt cag gac caa gag acc ttc tgc age cta cac agg tet gqc 288Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe cys Ser Leu His Arg Ser Gly85 90 95

cac aac acc aca cat ata tgg tac acg tgc cat atg cgc ttg tet caa 336His Asn Thr Thr His lie Trp Tyr Thr Cys His Met Arg Leu Ser Gln100 105 110

ttc ctg tec gat gaa gtt ttc att gtc aat gtg acg gac cag tet gqc 384Phe Leu Ser Asp Glu vai Phe lie Vai Asn Vai Thr Asp Gln Ser Gly115 120 125

aac aac tec caa gag tgt gqc age ttt gtc ctg gct gag age ate aaa 432Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly ser Phe Vai Leu Ala Glu Ser lie Lys130 135 140

cca gct cec cec ttg aac gtg act gtg gcc ttc tca gqa cgc tat gat 480Pro Ala Pro Pro Leu Asn Vai Thr Vai Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp145 150 155 160

ate tec tgg gac tca gct tat gac gaa cec tec aac tac gtg ctg agg 528lie Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn Tyr Vai Leu Arg165 170 175

gqc aag cta caa tat gag ctg cag tat cgg aac etc aga gac cec tat 576Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr180 185 190

gct gtg agg ceg gtg acc aag ctg ate tca gtg gac tca aga aac gtcAla Vai Arg Pro Vaí Thr Lys Leu lie Ser vai Asp Ser Arg Asn vai195 200 205 624

tet ctt etc cet gaa gag ttc cac aaa gat tet age tac cag ctg cag 672ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys Asp ser Ser Tyr Gln Leu Gln210 215 220

gtg cgg gea gcg cet cag cca gqc act tca ttc agg gqg acc tgg agt 720vai Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser225 230 235 240

gag tgg agt gac cec gtc ate ttt cag acc cag gct gqg gag cec gag 768Glu Trp ser Asp Pro Vai lie Phe Gln Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu245 250 255

gea gqc tgg gac tag tga gaattc 792Ala Gly Trp Asp260

<210> 27

<211> 260

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 27

Met Lys Phe Leu Vai Asn vai Ala Leu vai Phe Met Vai Vai Tyr lie15 10 15Ser Tyr lie Tyr Ala Gly ser Gly His His His His His His Gly Ser20 25 30

Gly Asp Tyr l_ys Asp Asp Asp Asp Lys Gly ser Gly Cys Leu Asp Leu35 40 45

Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr lie Thr Cys Vai Leu Glu Thr50 55 60

Arg Ser Pro Asn Pro Ser ile Leu ser Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr65 70 75 80

Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe Cys ser Leu His Arg ser Gly85 90 95

His Asn Thr Thr His lie Trp Tyr Thr cys His Met Arg Leu Ser Gln100 105 110

Phe Leu Ser Asp Glu Vai Phe lie vai Asn Vai Thr Asp Gln Ser Gly115 120 125

Asn Asn ser Gln Glu cys Gly ser Phe Vai Leu Ala Glu Ser lie Lys130 135 140

Pro Ala Pro Pro Leu Asn vai Thr vai Ala Phe ser Gly Arg Tyr Asp145 150 155 160

lie ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro ser Asn Tyr Vai Leu Arg165 170 175

Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr180 185 190

Ala Vai Arg Pro Vai Thr Lys Leu lie Ser Vai Asp Ser Arg Asn Vai195 200 205

Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln210 215 220

Vai Arg Ala Ala Pro Gln pro Gly Thr Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser225 230 235 240

Glu Trp Ser Asp Pro Vai lie Phe Gln Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu245 250 255

Ala Gly Trp Asp<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 28

gccagatcgc ctcctgatta

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 29

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<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 30

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<210> 31

<211> 20

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<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 31

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<210> 32

<211> 28

<212> DNA

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<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 32

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<211> 20

<212> DNA

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<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 33

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Claims

1. Método para tratar, melhorar ou prevenir a fibrose ou umdistúrbio associado com a fibrose em um indivíduo, caracterizado pelo fato deque compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um agente que reduza o nível de IL-21 e/ou EL-21R no indivíduo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o agente é um antagonista de IL-21/IL-21R selecionado do grupoque consiste de um anticorpo anti-IL-21R, um anticorpo anti-IL-21, umfragmento de ligação de antígeno de um anticorpo anti-IL-21R, um fragmentode ligação de antígeno de um anticorpo anti-IL-21 e um fragmento solúvel deuma IL-21R.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o agente é um fragmento solúvel de uma IL-21R e em que ofragmento solúvel da IL-21R compreende uma seqüência de aminoácido queseja pelo menos 90 % idêntica à uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo que consiste dos aminoácidos de 1 a 538 da SEQ ID NO: 2,aminoácidos de 20 a 538 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 235 da SEQID NO: 2, aminoácidos de 20 a 235 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 236 da SEQ ID NO:2, aminoácidos de 20 a 236 da SEQ ID NO: 2,aminoácidos de 1 a 529 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 20 a 529 da SEQID NO: 5, aminoácidos de 1 a 236 da SEQ ID NO: 5 e aminoácidos de 20 a 236 da SEQ ID NO: 5.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que o fragmento solúvel da IL-21R se liga a um polipeptídeo de IL-21.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o agente é um fragmento solúvel de uma IL-21R e em que ofragmento solúvel da IL-21R compreende uma seqüência de aminoácido queé substancialmente idêntica à seqüência de aminoácido apresentada na SEQID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ED NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:-19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que a seqüência de aminoácido do fragmento solúvel da IL-21Rcompreende uma seqüência de aminoácido que é substancialmente idêntica àseqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o agente é um fragmento solúvel de uma IL-21R e em que ofragmento solúvel da IL-21R é codificado por uma seqüência de nucleotídeoque é substancialmente idêntica à seqüência de nucleotídeo apresentada naSEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ IDNO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO:-26.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o fragmento solúvel da IL-21R é codificado por uma seqüência denucleotídeo que é substancialmente idêntica à seqüência de nucleotídeoapresentada na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 16.

9. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o agente é um fragmento solúvel de uma IL-21R e em que ofragmento solúvel da IL-21R compreende um domínio extracelular da IL-21Re um fragmento Fc da imunoglobulina.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a seqüência de aminoácido do domínio extracelular da IL--2IR compreende uma seqüência de aminoácido que seja pelo menos 90 %idêntica aos aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos de 20 a 235 da SEQ ID NO: 2.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que o fragmento Fc da imunoglobulina tem uma função alterada.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o fragmento Fc da imunoglobulina tem a seqüência deaminoácido dos aminoácidos de 244 a 467 da SEQ ID NO: 17.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a fibrose ou distúrbio associado com a fibrose afeta o fígado,epiderme, endoderme, músculo, tendão, cartilagem, coração, pâncreas,pulmão, útero, sistema nervoso, testículos, ovário, glândula adrenal, artéria,veia, cólon, intestino delgado, trato biliar ou estômago.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a fibrose ou distúrbio associado com a fibrose afetam ofígado, epiderme, endoderme ou pulmão.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a fibrose ou distúrbio associado com a fibrose são a fibrosepulmonar intersticial.

16. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a fibrose ou distúrbio associado com a fibrose são o resultadode uma infecção com esquistossoma.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a fibrose ou distúrbio associado com a fibrose são o resultadoda cicatrização de ferimento.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a cicatrização de ferimento resulta de uma incisão cirúrgica.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que ainda compreende administrar ao indivíduo pelo menos umagente terapêutico adicional.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionadodo grupo que consiste de inibidores de citocina, inibidores do fator decrescimento, imunossupressores, agentes antiinflamatórios, inibidoresmetabólicos, inibidores de enzima, agentes citotóxicos e agentes citostático.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionadodo grupo que consiste de antagonistas de TNF, agentes anti-TNF,Antagonistas de EL-12, antagonistas de EL-15, Antagonistas de EL-17,antagonistas de EL-18, antagonistas de EL-22, agentes esgotadores de célula T,Agentes esgotadores de célula B, ciclosporina, FK506, CCI-779, etanercept,infliximab, rituximab, adalimumab, prednisolona, azatioprina, ouro,sulfasalazina, hidroxicloroquina, minociclina, anaquinra, abatacept,metotrexato, leflunomida, rapamicina, análogos de rapamicina, Inibidores deCox-2, inibidores de cPLA2, NSAIDs, inibidores de p38, antagonistas deB7.1, B7.2, ICOSL, ICOS e/ou CD28 e agonistas de CTLA4.

22. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

23. Método para identificar um composto para tratar, melhorarou prevenir a fibrose ou um distúrbio associado com a fibrose em umindivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) medir o nível deIL-21 e/ou IL-21R em uma célula ou amostra de interesse; (b) contatar acélula ou amostra de interesse com um composto; e (c) medir o nível de IL-21e/ou IL-21R na célula ou amostra de interesse a seguir do contato com ocomposto, em que um nível mais baixo de IL-21 e/ou IL-21R na célula ouamostra de interesse contatadas, em comparação com o nível de IL-21 e/ouIL-21R na célula ou amostra de interesse não contatadas, identifica ocomposto como um composto útil para tratar, melhorar ou prevenir a fibroseou uma condição associada com a fibrose em um indivíduo.

24. Método para identificar um composto para tratar, melhorarou prevenir a fibrose ou um distúrbio associado com a fibrose em umindivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) medir o nível deIL-21 e/ou IL-21R em uma célula ou amostra de interesse; (b) contatar acélula ou amostra de interesse com um composto; (c) medir o nível de IL-21e/ou IL-21R na célula ou amostra de interesse a seguir do contato com ocomposto; e (d) comparar o nível de IL-21 e/ou IL-21R na célula ou amostrade interesse contatadas com um nível de referência de IL-21 e/ou IL-21R, emque um nível mais baixo de IL-21 e/ou IL-21R na célula ou amostra deinteresse contatadas, em comparação com o nível de referência de IL-21 e/ouIL-21R, identifica o composto como um composto útil para tratar, melhorarou prevenir a fibrose ou uma condição associada com a fibrose em umindivíduo.

25. Método para monitorar o progresso da fibrose ou de umacondição associada com a fibrose em um indivíduo, caracterizado pelo fato deque compreende: (a) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R em uma célula ouamostra de interesse do indivíduo em um primeiro ponto de tempo; e (b)medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R em uma célula ou amostra de interesse doindivíduo em um segundo ponto de tempo, em que um nível mais baixo deIL-21 e/ou IL-21R na célula ou amostra de interesse do indivíduo no segundoponto de tempo, em comparação com o nível de IL-21 e/ou IL-21R na célulaou amostra de interesse do indivíduo no primeiro ponto de tempo, forneceuma indicação de que a fibrose ou condição associada com a fibrose diminuiuem gravidade.

26. Método para prognosticar a fibrose ou uma condiçãoassociada com a fibrose em um indivíduo, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R em uma célula ouamostra de interesse do indivíduo em um primeiro ponto de tempo; e (b)medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R em uma célula ou amostra de interesse doindivíduo em um segundo ponto de tempo, em que um nível mais baixo deIL-21 e/ou IL-21R na célula ou amostra de interesse do indivíduo no segundoponto de tempo, em comparação com o nível de IL-21 e/ou IL-21R na célulaou amostra de interesse do indivíduo no primeiro ponto de tempo, indica umaprobabilidade diminuída de que o indivíduo desenvolverá fibrose ou acondição associada com a fibrose ou uma probabilidade diminuída de que afibrose ou condição associada com a fibrose piorará no indivíduo.

27. Método para prognosticar a fibrose ou uma condiçãoassociada com a fibrose em um indivíduo, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R em uma célula ouamostra de interesse do indivíduo; e (b) comparar o nível de IL-21 e/ou IL--2IR na célula ou amostra de interesse do indivíduo com um nível dereferência de IL-21 e/ou IL-21R, em que um nível mais baixo de IL-21 e/ou-IL-21R na célula ou amostra de interesse do indivíduo, em comparação com onível de referência de IL-21 e/ou IL-21R, indica uma probabilidade diminuídade que o indivíduo desenvolverá fibrose ou a condição associada com afibrose ou uma probabilidade diminuída de que a fibrose ou condiçãoassociada com a fibrose piorará no indivíduo.

28. Método para diagnosticar a fibrose ou uma condiçãoassociada com a fibrose em um indivíduo, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) medir o nível de IL-21 e/ou IL-21R em uma célula ouamostra de interesse do indivíduo e (b) comparar o nível de IL-21 e/ou IL--2IR na célula ou amostra de interesse do indivíduo com um nível dereferência de IL-21 e/ou IL-21R, em que um nível mais alto de IL-21 e/ou IL--2IR na célula ou amostra de interesse do indivíduo, em comparação com onível de referência de IL-21 e/ou IL-21R, indica a presença de fibrose oucondição associada com a fibrose no indivíduo.