BRPI0609769A2 - dispositivo de detecção, sistema de detecção, e, método - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVO DE DETECçãO, SISTEMA DE DETECçãO, E, MéTODO. São descritas técnicas para a detecção de múltiplas espécies- alvo em PCR em tempo real (reação em cadeia da polimerase). Por exemplo, um sistema é descrito, que inclui um dispositivo de aquisição de dado e um dispositivo de detecção acoplado com o dispositivo de aquisição de dado. Um dispositivo de detecção inclui um disco rotativo tendo uma pluralidade de câmaras de processo tendo uma pluralidade de espécies que emitem luz fluorescente em diferentes comprimentos de onda. O dispositivo também inclui uma pluralidade de módulos ópticos. Cada um dos módulos ópticos é opticamente configurado para excitar as espécies e capturar luz fluorescente emitida pelas espécies em diferentes comprimentos de onda. Um feixe de fibras ópticas acoplado com a pluralidade de módulos ópticos transmite a luz fluorescente dos múltiplos módulos ópticos para um único detector.

Description

"DISPOSITIVO DE DETECÇÃO, SISTEMA DE DETECÇÃO, E, MÉTODO"

CAMPO TÉCNICO

A invenção refere-se a sistemas de ensaio e, mais particularmente, técnicas para a detecção de múltiplas espécies-alvo usando corantes fluorescentes.

ANTECEDENTES

Sistemas de disco óptico são freqüentemente usados para realizar vários ensaios biológicos, químicos ou bioquímicos. Em um sistema típico, um disco rotativo é usado como um meio para armazenar e processar espécimes fluidos, tais como sangue, plasma, soro, urina ou outro fluido.

Um tipo de análise é a reação em cadeia da polimerase (PCR), que é freqüentemente usada para análise da seqüência de ácidos nucleicos. Em particular, a PCR é freqüentemente usada para seqüenciação de ADN , clonagem, mapeamento genético, e outras formas de análise da seqüência de ácidos nucleicos.

Em geral, a PCR conta com a capacidade de enzimas de cópia de ADN permanecerem estáveis a altas temperaturas. Existem três etapas principais na PCR: desnaturação, hibridização, e extensão. Durante a desnaturação, uma amostra líquida é aquecida a aproximadamente 94°C. Durante este processo, "fusões" de ADN bicatenário se abrem em ADN unicatenário. Durante hibridização, o ADN unicatenário é resfriado para aproximadamente 54°C. Nesta temperatura, iniciadores se ligam ou "se hibridizam" às extremidades dos segmentos de ADN que devem ser replicados. Durante a extensão, a amostra é aquecida para 75°C. Nesta temperatura, enzimas e nucleotídeos se adicionam à seqüência-alvo e eventualmente uma cópia complementar da matriz de ADN é formada. O novo ramo de ADN se torna um novo alvo para a próxima seqüência de eventos, ou "ciclo". Existe um número de instrumentos de PCR existentes projetados para determinar níveis das seqüências específicas de ADN e ARN na amostra durante a PCR em tempo real. Muitos dos instrumentos são baseados no uso de corantes fluorescentes. Em particular, instrumentos convencionais de PCR de tempo real detectam um sinal fluorescente produzido proporcionalmente durante amplificação de um produto da PCR.

Instrumentos convencionais de PCR de tempo real usam diferentes métodos para detecção de diferentes corantes fluorescentes, por exemplo, alguns instrumentos convencionais de PCR incorporam fontes de luz branca com rodas de filtro para espectralmente resolucionar cada corante. As fontes de luz branca são bulbos de halogênio de tungstênio, os quais têm uma vida útil máxima de poucos milhares de horas. As rodas de filtro são tipicamente partes eletromecânicas complicadas que são susceptíveis a desgaste.

SUMÁRIO

Em geral, a invenção refere-se a técnicas para a detecção de múltiplas espécies-alvo em PCR em tempo real (reação em cadeia da polimerase), referida aqui como PCR multiplex. Em particular, um dispositivo de detecção de fluorescência multiplex é descrito, que incorpora uma pluralidade de módulos ópticos. Cada um dos módulos ópticos pode ser otimizado para detecção de um respectivo corante fluorescente em uma banda discreta de comprimento de onda. Em outras palavras, os módulos ópticos podem ser usados para interrogar múltiplas, reações paralelas em diferentes comprimentos de onda. A reação pode, por exemplo, ocorrer no interior de uma única câmara de processo (por exemplo, poço) de um disco rotativo.

A pluralidade de módulos ópticos é opticamente acoplada com um único detector por meio de um feixe de fibras ópticas de múltiplas pernas. Desta maneira, a multiplexagem é atingida por meio de uso de uma pluralidade de módulos ópticos e um único detector, por exemplo, um tubo fotomultiplicador. Os componentes ópticos em cada módulo óptico podem ser selecionados para maximizar a sensibilidade e minimizar a quantidade de diafonia espectral, ou seja, sinais a partir de um corante para um outro módulo óptico.

Em uma forma de concretização, um dispositivo compreende um disco rotativo tendo uma pluralidade de câmaras de processo contendo uma respectiva amostra e uma pluralidade de corantes fluorescentes. O dispositivo também inclui uma pluralidade de módulos ópticos, cada um dos módulos ópticos inclui uma fonte de luz selecionada para um diferente corante dos corantes. As fontes de luz de os módulos ópticos excitam diferentes regiões do disco rotativo e capturar luz fluorescente emitida a partir do disco. Um feixe de fibras ópticas é acoplado com a pluralidade de módulos ópticos para transmitir a luz fluorescente dos múltiplos módulos ópticos para um único detector.

Em uma outra forma de concretização, um sistema compreende um dispositivo de aquisição de dado. O sistema também compreende um dispositivo de detecção acoplado com o dispositivo de aquisição de dado, em que um dispositivo de detecção compreende um disco rotativo tendo uma pluralidade de câmaras de processo cada uma tendo uma pluralidade de espécies que emitem luz fluorescente em diferentes comprimentos de onda, uma pluralidade de módulos ópticos, em que cada um dos módulos ópticos é opticamente configurado para excitar as espécies e capturar luz fluorescente emitida pelas espécies em diferentes comprimentos de onda, um detector, e um feixe de fibras ópticas acoplado com a pluralidade de módulos ópticos para transmitir a luz fluorescente dos múltiplos módulos ópticos para um detector .

Em uma forma de concretização adicional, um método compreende girar um disco tendo uma pluralidade de câmaras de processo cada uma tendo uma pluralidade de espécies que emitem luz fluorescente em diferentes comprimentos de onda; excitar o disco com uma pluralidade de feixes de luz para produzir uma pluralidade de feixes emitidos de luz fluorescente; capturar os feixes de luz fluorescente com uma pluralidade de diferentes módulos ópticos, em que os módulos ópticos são opticamente configurados para os diferentes comprimentos de onda; transmitir os feixes de luz fluorescente a partir da pluralidade de módulos ópticos para um único detector com um feixe de fibras ópticas; e fornecer um sinal a partir de um detector representativo dos feixes de luz fluorescente.

Embora o dispositivo possa ser capaz de realizar PCR em tempo real, o dispositivo pode ser capaz de analisar qualquer tipo de reação biológica enquanto ela ocorre. O dispositivo pode ser capaz de modular a temperatura de cada reação independentemente ou como um grupo selecionado, e o dispositivo pode ser capaz de suportar múltiplos estágios de reações por meio de inclusão de uma válvula, entre duas câmaras. Esta válvula pode ser aberta durante reações através do uso de um laser que fornece uma rajada de energia para a válvula.

Em algumas formas de concretização, o dispositivo pode ser portável para permitir operação em áreas remotas ou laboratórios temporários. O dispositivo pode incluir um computador de aquisição de dado para analisar as reações em tempo real, ou o dispositivo pode comunicar o dado para um outro dispositivo através de interfaces de comunicação com ligações elétricas ou sem ligações elétricas.

Os detalhes de uma ou mais formas de concretização da invenção são expostos nos desenhos acompanhantes e na descrição abaixo. Outras características, objetivos, e vantagens da invenção ficarão aparentes a partir da descrição e desenhos, a das reivindicações. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um diagrama em blocos ilustrando uma forma de concretização de exemplo de um dispositivo de detecção de fluorescência multiplex.

a figura 2 é um diagrama esquemático ilustrando um módulo óptico de exemplo, o qual pode corresponder a qualquer um de uma pluralidade de módulos ópticos do dispositivo de detecção de fluorescência da figura 1.

a figura 3 é um diagrama em blocos ilustrando uma forma de concretização de exemplo do dispositivo de detecção de fluorescência multiplex em maior detalhe.

a figura 4 é um diagrama em blocos do um único detector acoplado com quatro fibras ópticas do feixe de fibras ópticas.

a figura 5 é um fluxograma ilustrando operação de exemplo do dispositivo de detecção de fluorescência multiplex.

As figuras 6 e 7 mostram os espectros de absorção e emissão dos comumente usados corantes fluorescentes que podem ser utilizados para PCR multiplex.

As figuras 8A e 8B ilustram dados brutos adquiridos a partir de dois módulos ópticos de exemplo com um único detector durante uma análise de PCR.

A figura 9 é um gráfico que mostra os dados uma vez ajustados para um defasagem de tempo.

As figuras IOA e IOB mostram um limite de detecção (LOD) para os dados recebidos a partir de dois módulos ópticos de exemplo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A figura 1 é um diagrama em blocos ilustrando uma forma de concretização de exemplo de um dispositivo de detecção de fluorescência multiplex 10. No dispositivo ilustrado, o dispositivo 10 tem quatro módulos ópticos 16 que provêm quatro "canais" para detecção óptica de quatro diferentes corantes. Em particular, o dispositivo 10 tem quatro módulos ópticos 16 que excitam diferentes regiões do disco rotativo 13 em qualquer dado momento, e coletam energia de luz fluorescente emitida em diferentes comprimentos de onda a partir dos corantes. Como um resultado, os módulos ópticos 16 podem ser usados para interrogar múltiplas reações paralelas que ocorrem no interior da amostra 22.

As múltiplas reações podem, por exemplo, ocorrer simultaneamente no interior de uma única câmara de um disco rotativo 13. Cada um dos módulos ópticos 16 interroga a amostra 22 e coleta energia de luz fluorescente em diferentes comprimentos de onda quando o disco 13 gira. Por exemplo, fontes de excitação no interior dos módulos 16 podem ser seqüencialmente ativadas por períodos suficientes para coletar dados nos correspondentes comprimentos de onda. Isto é, um módulo óptico 16A pode ser ativado por um período de tempo para coletar dados em uma primeira faixa de comprimentos de onda selecionada para um primeiro corante correspondendo a uma primeira reação. A fonte de excitação pode então ser desativada, e uma fonte de excitação no interior do module 16B pode ser ativada para interrogar a amostra 22 em uma segunda faixa de comprimentos de onda selecionada para um segundo corante correspondendo a uma segunda reação. Este processo continua até que dado tenha sido capturado a partir de todos módulos ópticos 16. Em uma forma de concretização, cada uma das fontes de excitação no interior dos módulos ópticos 16 é ativada por um período inicial de aproximadamente dois segundos para atingir estado estável seguido por um período de interrogação que dura por 10-50 rotações do disco 13. Em outras formas de concretização, as fontes de excitação podem ser seqüenciadas para períodos mais curtos (por exemplo, 1 ou 2 milissegundos) ou períodos mais longos. Em algumas formas de concretização, mais do que um módulo óptico pode ser ativado simultaneamente para concorrente interrogação de amostra 22 enquanto o disco 13 gira. Embora uma única amostra 22 seja ilustrada, o disco 13 pode conter uma pluralidade de câmaras portando amostras. Os módulos ópticos 16 podem interrogar algumas ou todas das diferentes câmaras em diferentes comprimentos de onda. Em uma forma de concretização, o disco 13 inclui 96 câmaras espaçadas em torno de uma circunferência do disco 13. Com um disco de 96 câmaras e quatro módulos ópticos 16, o dispositivo 10 pode ser capaz de adquirir dado a partir de 384 diferentes espécies.

Em uma forma de concretização, os módulos ópticos 16 incluem fontes de excitação que são comuns diodos de emissão de luz de alta potência (LEDs), os quais são comercialmente disponíveis em uma variedade de comprimentos de onda e têm longas vidas úteis (por exemplo, conversor de freqüência 100.000 horas ou mais). Em uma outra forma de concretização, convencionais bulbos de halogênio ou lâmpadas de mercúrio podem ser usados como fontes de excitação.

Como ilustrado na figura 1, cada um dos módulos ópticos 16 pode ser acoplado com uma perna de um feixe de fibras ópticas 14. O feixe de fibras ópticas 14 provê um mecanismo flexível para coleção de sinais de fluorescência a partir dos módulos ópticos 16 sem perda de sensibilidade. Em geral, um feixe de fibras ópticas compreende múltiplas fibras ópticas colocadas lado a lado e ligadas conjuntamente nas extremidades e alojadas em uma camisa de proteção flexível. Alternativamente, o feixe de fibras ópticas 14 pode compreender um menor número de fibras multimodais discretas, de grande diâmetro, ou de vidro ou plástico, tendo uma extremidade comum. Por exemplo, para um dispositivo óptico de quatro módulos, o feixe de fibras ópticas 16 pode compreender quatro fibras multimodais discretas, cada uma tendo um diâmetro de núcleo de 1 mm. A extremidade comum do feixe contém as quatro fibras ligadas conjuntamente. Neste exemplo, a abertura do detector 18 pode ser 8 mm, que é mais do que suficiente para o acoplamento com as quatro fibras.

Neste exemplo, o feixe de fibras ópticas 14 acopla módulos ópticos 16 para um único detector 18. As fibras ópticas transmitem a luz fluorescente coletada por meio dos módulos ópticos 16 e efetivamente fornecem a luz capturada para o detector 18. Em uma forma de concretização, o detector 18 é um tubo fotomultiplicador. Em uma outra forma de concretização, um detector pode incluir múltiplos elementos fotomultiplicadores, um para cada fibra óptica, no interior do único detector. Em outras formas de concretização, um ou mais detectores de estado sólido podem ser usados.

O uso de um único detector 18 pode ser vantajoso na medida que ele permite o uso de um detector altamente sensível e possivelmente caro (por exemplo, um fotomultiplicador), enquanto mantém um custo mínimo em que somente um único detector precisa ser usado. Um único detector é discutido aqui; todavia, um ou mais detectores podem ser incluídos para detectar um maior número de corantes. Por exemplo, quatro módulos ópticos adicionais 16 e um segundo detector pode ser adicionado ao sistema para permitir a detecção de oito diferentes comprimentos de onda emitidos a partir de um disco.

Os módulos ópticos 16 são removíveis a partir do dispositivo e facilmente intercambiáveis por outros módulos ópticos que são otimizados para interrogação em diferentes comprimentos de onda. Por exemplo, os módulos ópticos 16 podem ser fisicamente montados no interior de locais de uma carcaça. Cada um dos módulos ópticos 16 pode ser facilmente inserido em um respectivo local da carcaça ao longo de guias (por exemplo, ranhuras rebaixadas) que se conjugam com uma ou mais marcas (por exemplo, pinos de guia) do módulo óptico. Cada módulo óptico inclui porta de saída óptica (mostrada na figura 2) para o acoplamento com uma perna de feixe de fibras ópticas 14. A porta de saída óptica pode ter uma extremidade rosqueada acoplada com um conector rosqueado da perna. Alternativamente, uma forma de "conexão rápida" pode ser usada (por exemplo, uma conexão deslizável tendo um anel-O e um pino de travamento) que permite que o feixe de fibras ópticas 14 seja deslizavelmente engatado e desengatado a partir da porta de saída óptica. Além disto, cada um dos módulos ópticos 16 pode ter um ou mais contatos elétricos para eletronicamente acoplar-se com a unidade de controle 23 quando totalmente inserido. Módulos ópticos removíveis, de exemplo, para uso com disco rotativo 13 são descritos no Pedido de Patente US No. de Série 11 /174.754, intitulado "MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE HAVING REMOVABLE OPTICAL MODULES", depositado em 5 de julho de 2005.

A arquitetura modular do dispositivo 10 permite que o dispositivo seja facilmente adaptado para todos dos corantes fluorescentes usados em um dado ambiente de análise, tal como PCR multiplex. Outros produtos químicos que podem ser usados no dispositivo 10 incluem Invader (Third Wave, Madison, Wisconsin), Ampliflcação mediada por Transmicripted (GenProbe, San Diego, Califórnia), ensaio imunoabsorvente ligado a enzima, rotulado com fluorescência, (ELISA), ou hibridização por florescência no local (FISH). A arquitetura modular do dispositivo 10 pode prover uma outra vantagem na medida que a sensibilidade de cada módulo óptico 16 pode ser otimizada por meio da escolha da correspondente fonte de excitação (não mostrada) e filtros de excitação e detecção para uma pequena específica faixa-alvo de comprimentos de onda a fim de seletivamente excitar e detectar um correspondente corante na reação multiplex.

Para fins de exemplo, o dispositivo 10 é ilustrado em um arranjo multiplex de 4 cores, contudo mais ou menos canais podem ser usados com o apropriado feixe de fibras ópticas 14. Este projeto modular permite que um usuário facilmente atualize o dispositivo 10 no campo por meio de simplesmente adicionar um outro módulo óptico 16 na base 20 e inserção de uma perna de feixe de fibras ópticas 14 no novo módulo óptico. Os módulos ópticos 16 podem ter componentes eletrônicos integrados que identificam os módulos ópticos e descarregam dados de calibração em um módulo óptico de controle interno ou um outro componente eletrônico interno (por exemplo, unidade de controle 23) do dispositivo 10.

No exemplo da figura 1, as amostras 22 são contidas em câmaras do disco 13, que é montado sobre uma plataforma rotativa sob o controle da unidade de controle 23. Um disparador de sensor de fenda 27 provê um sinal de saída utilizados por meio da unidade de controle 23 e aquisição de dado para sincronizar a aquisição de dados com a posição de câmara durante a rotação do disco. O disparador de sensor de fenda 27 pode ser um sensor mecânico ou óptico. Por exemplo, o sensor pode ser um laser que envia um feixe de luz para o disco 13, e a unidade de controle 23 usa um sensor que detecta luz passando através de uma fenda no disco 13 para posicionar as câmaras sobre o disco. Os módulos ópticos 16 podem ser fisicamente montados acima da plataforma rotativa 25. Como um resultado, os módulos ópticos 16 são superpostos com diferentes câmaras em qualquer momento.

O dispositivo de detecção 10 também inclui um elemento de aquecimento (não mostrado) para modular a temperatura da amostra 22 sobre disco 13. O elemento de aquecimento pode compreender um bulbo de halogênio cilíndrico contido em uma caixa reflexiva. A câmara reflexiva é configurada para focalizar radiação a partir do bulbo sobre uma seção radial do disco 13. Geralmente, a área aquecida do disco 13 lembraria um anel quando o disco 13 gira. Nesta forma de concretização, a forma da caixa reflexiva pode ser uma combinação de geometrias elípticas e esféricas que permitem a focagem precisa. Em outras formas de concretização, a caixa reflexiva pode ser de uma diferente forma ou o bulbo pode extensamente irradiar uma maior área. Em outras formas de concretização, a caixa reflexiva pode ser configurada para focalizar a radiação a partir do bulbo sobre uma única área do disco 13, tal como uma única câmara de processo contendo a amostra 22. Em algumas formas de concretização, o elemento de aquecimento pode aquecer ar e forçar o ar quente sobre uma ou mais amostras para modular a temperatura. Adicionalmente, a amostras podem ser aquecidas diretamente por meio do disco. Neste caso, o elemento de aquecimento pode ser posicionado na plataforma 25 e termicamente acoplar-se com o disco 13. A resistência elétrica no interior do elemento de aquecimento pode aquecer uma selecionada região do disco, quando controlada por meio da unidade de controle 23. Por exemplo, uma região pode conter uma ou mais câmaras, possivelmente o disco inteiro. Um elemento de aquecimento de exemplo para uso com o disco rotativo 13 é descrito no Pedido de Patente US No. de Série 11/1 74.691, intitulado "HEATING ELEMENT FOR A ROTATING MULTIPLEX FLOURESCENCE DETECTION DEVICE", depositado em 5 de Julho de 2005.

Alternativamente, ou em adição, o dispositivo 10 pode também incluir um componente de resfriamento (não mostrado). Um ventilador é incluído no dispositivo 10 para suprir ar frio, ou seja, ar com temperatura ambiente, para o disco 13. O resfriamento pode ser necessário para modular a temperatura da amostra apropriadamente e armazenar amostras após um experimento ter sido completado. Em outras formas de concretização, o componente de resfriamento pode incluir acoplamento térmico entre a plataforma 25 e o disco 13, pois a plataforma 25 pode reduzir sua temperatura quando necessário. Por exemplo, algumas amostras biológicas podem ser armazenadas a 4 graus Celsius para reduzir atividade de enzima ou desnaturação de proteína.

O dispositivo de detecção 10 pode também ser capaz de controlar espécies de reação contidas na câmara de processo. Por exemplo, pode ser benéfico carregar algumas espécies na câmara de processo para gerar uma reação e posterior adição de uma outra espécie na amostra uma vez quando a primeira reação terminou. Um sistema de válvula de orientação a laser pode ser adicionado para controlar uma válvula que separa uma câmara de contenção interna a partir da câmara de processo, de modo a controlar a adição de espécies à câmara durante a rotação do disco 13. Este sistema de válvula de orientação a laser pode ser posicionado no interior de um dos módulos ópticos 16 ou separado a partir dos módulos ópticos. Diretamente abaixo do laser, sob o disco 13, pode estar um sensor de laser para posicionar o laser em relação ao disco 13.

Em uma forma de concretização, o laser é um laser próximo a infravermelhos (NIR) com pelo menos dois ajustes de potência. Sob um ajuste de baixa potência, o sensor de posicionamento de laser pode indicar que o laser está em posição sobre a válvula de câmara por meio do reconhecimento da luz de NIR através de uma fenda no disco 13. Uma vez quando o laser está em posição, a unidade de controle 23 orienta o laser para emitir um breve rajada de alta energia de potência para aquecer a válvula e abri-la. A válvula aberta pode então permitir que o espécime de fluido interno flua a partir da câmara interior para a câmara de processo exterior e conduzir uma segunda reação. Em algumas formas de concretização, o disco 13 pode conter uma pluralidade de válvulas para gerar uma pluralidade de reações em seqüência. Mais do que um conjunto de laser e sensor de laser podem também ser usados quando da utilização de múltiplas válvulas de câmara. Um sistema de controle de válvula de orientação a laser, de exemplo, para uso com o disco rotativo 13, é descrito no Pedido de Patente US No. de Série 11/1 74.957, intitulado

"VALVE CONTROL SYSTEM FOR A ROTAING MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE", depositado em 5 de julho de 2005.

O sistema de aquisição de dado 21 pode coletar dado a parin- do dispositivo 10 para cada corante ou seqüencialmente ou em paralelo. Em uma forma de concretização, o sistema de aquisição de dado 21 coleta o dado a partir de módulos ópticos 16 em seqüência, e corrige a sobreposição espacial por meio de um retardo de disparador para cada um dos módulos ópticos medidos a partir do disparador de sensor de fenda 27.

Uma aplicação para o dispositivo 10 é a PCR em tempo real, contudo as técnicas descritas aqui podem ser estendidas para outras plataformas que utilizam detecção de fluorescência em múltiplos comprimentos de onda. O dispositivo 10 pode combinar rápida ciclagem térmica, utilizando o elemento de aquecimento, e centrifugamente impulsionando microfluidos para isolamento, amplificação, e detecção de ácidos nucleicos. Por fazer uso da detecção de fluorescência multiplex, múltiplas espécies-alvo podem ser detectadas e analisadas em paralelo.

Para a PCR em tempo real, fluorescência é usada para medir a magnitude de amplificação em uma das três técnicas gerais. A primeira técnica é o uso de um corante, tal como Sybr Green (Molecular Probes, Eugene, Oregon), cuja fluorescência se eleva quando da ligação ao ADN bicatenário. A segunda técnica usa sondas fluorescentemente rotuladas cuja fluorescência se altera quando ligada com uma seqüência-alvo amplificada (sondas de hibridização, sondas de gancho para cabelo, etc.). Esta técnica é similar a usar um corante se ligando com o ADN bicatenário, mas é mais específica porque a sonda se ligará somente a uma certa seção da seqüência- alvo. A terceira técnica é o uso de sondas de hidrólise (Taqman™, Applied BioSystems, Foster City Califórnia), em que a atividade de exonuclease do enzima de polimerase divide uma molécula de imersão a partir da sonda durante a fase de extensão de PCR, tornando-a fluorescentemente ativa.

Em cada uma das propostas, a fluorescência é linearmente proporcional à concentração-alvo amplificada. O sistema de aquisição de dado 21 mede um sinal de saída a partir do detector 18 (ou alternativamente opcionalmente amostrado e comunicado por meio da unidade de controle 23) durante a reação de PCR para observar a amplificação em tempo próximo ao real. No PCR multiplex, os múltiplos alvos são rotulados com diferentes corantes que são medidos independentemente. Falando geralmente, cada corante irá ter diferentes espectros de absorvência e emissão. Por esta razão, os módulos ópticos 16 podem ter fontes de excitação, lentes e filtros correlacionados que são opticamente selecionados para interrogação de amostra 22 em diferentes comprimentos de onda.

Alguns exemplos de técnicas de construção ou materiais, adequados, que podem ser adaptados para uso em conexão com a presente invenção podem ser descritos em, por exemplo, na Patente US, comumente cedida, No. 6.734.401, intitulada "ENHANCED SAMPLE PROCESSING DEVICES SYSTEMS AND METHODS" (Bedingham et al.) e Publicação de Pedido de Patente US No. 2002/0064885 intitulado "SAMPLE PROCESSING DEVICES". Outras construções de dispositivo que podem ser usadas podem ser encontradas em, por exemplo, Pedido de Patente Provisional US No. de Série 60/214.642 depositado em 28 de junho de 2000 e intitulado "SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS"; Pedido de Patente Provisional US No. de Série 60/237.072 depositado em 2 de outubro de 2000 e intitulado "SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS"; Pedido de Patente Provisional US No. de Série 60/260.063 depositado em 6 de janeiro de 2001 e intitulado "SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS"; Pedido de Patente Provisional US No. de Série 60/284.637 depositado em 18 de abril de 2001 e intitulado "ENHANCED SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS"; e Publicação de pedido de Patente US No. US 2002/0048533 intitulada "SAMPLE PROCESSING DEVICES AND CARRIERS". Outras construções de dispositivo potencial podem ser encontradas, por exemplo, na patente US No. 6.627.159 intitulada "CENTRIFUGAL FILLING OF SAMPLE PROCESSING DEVICES" (Bedingham et al.). A figura 2 é um diagrama esquemático ilustrando um módulo óptico de exemplo 16A, o qual pode corresponder a qualquer um de módulos ópticos 16 da figura 1. Neste exemplo, o módulo óptico 16A contém uma fonte de excitação de alta potência, LED 30, uma lente de colimação 32, um filtro de excitação 34, um filtro dicróico 36, uma lente de focagem 38, um filtro de detecção 40, e uma lente 42 para focar a fluorescência na porta de saída óptica 19 acoplada com uma perna do feixe de fibras ópticas 14.

Conseqüentemente, a luz de excitação a partir de LED 30 é colimatada por meio da lente de colimação 32, filtrada por meio do filtro de excitação 34, transmitida através do filtro dicróico 36, e focada no interior da amostra 22 por meio da lente de focagem 38. A resultante fluorescência emitida por meio da amostra é coletada pela mesma lente de focagem 38, refletida para fora do filtro dicróico 36, e filtrada por meio do filtro de detecção 40 antes de ser focada em uma perna do feixe de fibras ópticas 14 acoplado com porta de saída óptica 19. O feixe óptico 14 então transfere a luz para o detector 18.

O LED 30, lente de colimação 32, filtro de excitação 34, filtro dicróico 36, lente de focagem 38, filtro de detecção 40, e lente 42 são selecionados com base nas específicas bandas de absorção e emissão de corante multiplex, com as quais o módulo óptico 16A deve ser usado. Desta maneira, módulos ópticos múltiplos 16 podem ser configurados e carregados no interior do dispositivo 10 para diferentes corantes-alvo.

A Tabela 1 lista componentes de exemplo que podem ser usados em um dispositivo de detecção de fluorescência multiplex de 4 canais 10 para uma variedade de corantes fluorescentes. FAM, HEX, JOE, VIC, ΤΕΤ, ROX são marcas de Applera, Norwalk, Califórnia, Tamra é uma marca de AnaSpec, San José, Califórnia. Texas vermelho é a marca de Molecular Probes. Cy 5 é uma marca de Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido. Tabela 1

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Uma vantagem da arquitetura de detecção multiplex modular é a flexibilidade em otimizar a detecção para uma extensa variedade de corantes. Conceitualmente, um usuário pode ter um banco de vários diferentes módulos ópticos que pode ser conectados no dispositivo 10, quando necessário, do qual N pode ser usado a qualquer momento, onde N é o número máximo de canais suportados pelo dispositivo. Por conseguinte, o dispositivo 10 e módulos ópticos 16 podem ser usados com qualquer corante fluorescente e método de detecção de PCR. Um maior feixe de fibras ópticas pode ser usado para suportar um maior número de canais de detecção. Além disto, múltiplos feixes de fibras ópticas podem ser usados com múltiplos detectores. Por exemplo, dois feixes de fibras ópticas, de 4 pernas, podem ser usados com oito módulos ópticos 16 e dois detectores 18.

A figura 3 é um diagrama funcional em blocos do dispositivo de detecção de fluorescência multiplex 10. Em particular, a figura 3 indica as conexões elétricas entre componentes de dispositivo e os percursos gerais através dos componentes. No exemplo da figura 3, o dispositivo 10 inclui pelo menos um processador 44 ou outra lógica de controle, memória 46, motor de disco 48, fonte de luz 30, filtro de excitação 34, lente 38, filtro de detecção 40, lente de coleta 42, detector 18, disparador de sensor de fenda 27, interface de comunicação 50, elemento de aquecimento 54, laser 55 e fonte de energia 52. Como mostrado na figura 3, a lente 38 e a lente de coleta 42 não precisam ser conectadas com um outro componente. Também, a fonte de luz 30, filtros 34 e 40, lente 38 e lente de coleta 42 são representativos de um módulo óptico 16. Embora não ilustrado na figura 3, o dispositivo 10 pode conter módulos ópticos adicionais 16, como descrito previamente. Neste caso, cada módulo óptico adicional pode incluir componentes dispostos substancialmente similarmente àqueles mostrados na figura 3.

Luz segue um certo percurso através de vários componentes na figura 3. Quando luz é uma vez emitida por meio da fonte de luz 30, ela entra no filtro de excitação 34 e sai como luz de um comprimento de onda discreto. Ela então passa através da lente 38 onde ela sai do dispositivo de detecção 10 e excita a amostra 22 no interior da câmara de processo (não mostrada). A amostra 22 responde por meio de fluorescência em um diferente comprimento de onda, em cujo instante esta luz entra na lente 38 e é filtrada por meio do filtro de detecção 40. O filtro 40 remove luz de fundo de comprimentos de onda fora da fluorescência desejada a partir da amostra 22. A luz remanescente é enviada através da lente de coleta 42 e entra em uma perna de feixe de fibras ópticas 14 antes de ser detectada pelo detector 18. O detector 18 subseqüentemente amplifica o sinal de luz recebido.

O processador 44, memória 46 e interface de comunicação 50 podem ser parte da unidade de controle 23. O processador 44 controla o motor de disco 48 para girar ou girar o disco 13, quando necessário, para coletar informação de fluorescência ou mover fluido através do disco 13. O processador 44 pode usar informação de posição do disco, recebida a partir do disparador de sensor de fenda 27, para identificar o local das câmaras sobre o disco 13 durante a rotação e sincronizar a obtenção de dados de fluorescência recebidos a partir do disco.

O processador 44 pode também controlar quando a fonte de luz 30 no interior do módulo óptico 16 é ligada e desligada. Em algumas formas de concretização, o processador 44 controla o filtro de excitação 34 e filtro de detecção 40. Dependendo da amostra sendo iluminada, o processador 44 pode alterar o filtro para permitir que um diferente comprimento de onda de luz de excitação atinja a amostra ou um diferente comprimento de onda de fluorescência cheque à lente de coleta 42. Em algumas formas de concretização, um ou ambos filtros podem ser otimizados para a fonte de luz 30 do particular módulo óptico 16 e não substituídos pelo processador 44.

A lente de coleta 42 é acoplada com uma perna do feixe de fibras 14 que provê um percurso óptico para a luz a partir da lente de coleta para o detector 18. O processador 44 pode controlar a operação do detector 18. Quando o detector 18 pode constantemente estar detectando toda a luz, algumas formas de concretização podem utilizar outros modos de aquisição. O processador 44 pode determinar quando o detector 18 coleta dado e pode programaticamente ajustar outros parâmetros de configuração do detector 18. Em uma forma de concretização, o detector 18 é um tubo fotomultiplicador que captura fluorescência a partir de luz provida por meio da lente de coleta 42. Em resposta, o detector 18 produz um sinal de saída 43 (por exemplo, um sinal de saída analógico) representativo da luz recebida. Embora não mostrado na figura 3, o detector 18 pode simultaneamente receber luz a partir de módulos ópticos 16 do dispositivo 10. Neste caso, o sinal de saída 19 eletricamente representa a combinação da entrada óptica recebida pelo detector 18 a partir dos vários módulos ópticos 16.

O processador 44 pode também controlar fluxo de dados a partir do dispositivo 10. Dado, tal como fluorescência amostrada a partir do detector 18, temperatura ou as amostras do elemento de aquecimento 54 e sensores correlacionados, e uma informação de rotação de disco, podem ser armazenados na memória 46 para a análise. O processador 44 pode compreender qualquer um ou mais de um microprocessador, processador de sinal digital (DSP), circuito integrado de aplicação específica (ASIC), arranjo de porta programável por campo (FPGA), ou outros circuitos lógicos digitais. Além disto, o processador 44 provê um ambiente de operação para firmware, software, ou combinações dos mesmos, armazenados em um meio legível por computador, tal como memória 46.

A memória 46 pode incluir uma ou mais memórias para armazenar uma variedade de informações. Por exemplo, uma memória pode conter específicos parâmetros de configuração, instruções executáveis, e uma pode conter dados coletados. Por conseguinte, o processador 44 pode usar dados armazenados na memória 46 para controlar a operação e calibração do dispositivo. A memória 46 pode incluir qualquer uma ou mais de uma memória de acesso randômico (RAM), memória exclusivamente de leitura (ROM), ROM programável apagável eletronicamente (EEPROM), memória- flash, ou similar.

O processador 44 pode adicionalmente controlar o elemento de aquecimento 54. Com base nas instruções contidas no interior da memória 46, o elemento de aquecimento 54 pode ser seletivamente impelido a controlar a temperatura de uma ou mais câmaras de acordo com os desejados perfis de aquecimento. Geralmente, o elemento de aquecimento aquece uma seção radial do disco 13 quando o disco gira. O elemento de aquecimento 54 pode compreender um bulbo de halogênio e refletor para focar energia térmica sobre uma área específica do disco 13. Em outras formas de concretização, o elemento de aquecimento 54 pode aquecer uma ou mais câmaras seqüencialmente. Esta forma de concretização requereria que o disco 13 fosse estacionário enquanto que uma câmara é aquecida. Em qualquer forma de concretização, o elemento de aquecimento 54 pode ser capaz de ser ligado e desligado de forma extremamente rápida, quando necessário.

O laser 55 é usado para controlar a abertura de válvula, o que permite que os conteúdos de uma câmara interna fluam para uma outra câmara sobre o disco 13, por exemplo, uma câmara de processo. O processador 44 e hardware de suporte aciona o laser 55 para seletivamente abrir válvulas específicas contidas com o 13. O processador 44 pode interagir com um sensor de laser abaixo do disco 13 para determinar a posição do laser em relação à válvula desejada. Quando em posição, o processador 44 fornece sinais para orientar o laser 55 para produzir uma rajada de energia dirigida para a válvula. Em alguns casos, a rajada pode demorar aproximadamente 0,5 segundos, ao passo que outras formas de concretização podem incluir tempos de abertura de menor ou maior duração. Uma duração de energia de laser e pulso pode ser controlada por meio do processador 44 através da comunicação com o laser 55.

O processador 44 utiliza a interface de comunicação 50 para comunicar-se com sistema de aquisição de dado 21. A interface de comunicação 50 pode incluir um único método ou combinação de métodos para transferir dados. Alguns métodos podem incluir uma porta de barra coletora universal serial (USB) ou porta IEEE 13 94 para conectividade por hardware com altas taxas de transferência de dados. Em algumas formas de concretização, um dispositivo de armazenagem pode ser diretamente fixado a uma destas portas para armazenagem de dados para o posterior processamento. Os dados podem ser pré-processados por meio do processador 44 e prontos para a visualização, ou os dados brutos podem precisar ser complementarmente processados antes de a análise poder começar.

Comunicações com o dispositivo de detecção 10 podem também ser efetuadas por meio de comunicação de freqüência de rádio (RF) ou uma conexão de rede de área local (LAN). Além disto, a conectividade pode ser atingida por meio de conexão direta ou através de m ponto de acesso à rede, tal como um Concentrador ou roteador, o qual pode suportar ligações por fio ou sem fio. Por exemplo, o dispositivo de detecção 10 pode transmitir dados em uma certa freqüência de RF para recepção pelo visado dispositivo de aquisição de dado 21. O dispositivo de aquisição de dado 21 pode ser um computador de finalidades gerais, um computador tipo Notebook, um dispositivo de computação portátil, ou um dispositivo específico de aplicação. Ademais, múltiplos dispositivos de aquisição de dado podem receber os dados simultaneamente. Em outras formas de concretização, o dispositivo de aquisição de dado 21 pode ser incluído com o dispositivo de detecção 10 como um sistema integrado de detecção e aquisição.

Em adição, o dispositivo de detecção 10 pode ser capaz de descarregar software atualizado, dados de calibração a partir de um dispositivo remoto através de uma rede, tal como a Internet. A interface de comunicação 50 pode também permitir que o processador 44 monitore relatório de inventário de quaisquer falhas. Se ocorrerem problemas operacionais, o processador 44 pode ser capaz de fornecer informação de erro para assistir a um usuário na solução dos problemas por meio da provisão de dados operacionais. Por exemplo, o processador 44 pode prover informação para ajudar o usuário a diagnosticar um elemento de aquecimento falho ou um problema de sincronização.

A fonte de energia 52 fornece energia de operação para os componentes do dispositivo 10. A fonte de energia 52 pode utilizar eletricidade a partir de uma saída elétrica padrão de 115 Volt ou incluir uma bateria e um circuito de geração de energia para produzir a energia de operação. Em algumas formas de concretização, a bateria pode ser recarregável para permitir uma operação estendida. Por exemplo, o dispositivo 10 pode ser portátil para detecção de amostras biológicas em uma emergência, tal como uma área de desastre. O recarregamento pode ser efetuado através da saída elétrica de 115 Volt. Em outras formas de concretização, baterias tradicionais podem ser usadas.

A figura 4 é um diagrama funcional em blocos do único detector 18 acoplado com quatro fibras ópticas do feixe de fibras ópticas. Nesta forma de concretização, o detector 18 é um tubo fotomultiplicador. Cada perna do feixe de fibras ópticas 14, fibra óptica 14A, fibra óptica 14B, fibra óptica 14C e fibra óptica 14D, se acopla com uma interface de entrada óptica 55 do detector 18. Desta maneira, luz transmitida por meio de qualquer uma das fibras ópticas 14 é provida para uma única interface de entrada óptica 55 do detector 18. Em algumas formas de concretização, cada perna de feixe de fibras ópticas 14 pode ser de um diferente diâmetro, comprimento, ou ambos. Por exemplo, a fibra óptica 14A pode ser maior em diâmetro para transmitir mais luz para o detector 18 do que as outras fibras ópticas da óptica de fibras 14. A interface de entrada óptica 55 provê a luz agregada para o multiplicador de elétrons 56. O anodo 58 coleta os elétrons e produz um correspondente sinal analógico na qualidade de sinal de saída.

Em outras palavras, como mostrado, as fibras ópticas 14 se ajustam no interior da abertura óptica para o detector 18. Conseqüentemente, o detector 18 pode ser usado para detectar luz a partir de cada perna do feixe óptico 14 simultaneamente. A interface de entrada óptica 55 provê a luz para o multiplicador de elétrons 56. Para um tubo fotomultiplicador, os fótons a partir das fibras ópticas primeiramente se chocam contra um cátodo fotoemissor, o qual, por sua vez, libera fotoelétrons. Os fotoelétrons então caem em cascata por meio do choque de uma série de dínodos, mais fotoelétrons sendo emitidos quando do contato com cada dínodo. O resultante grupo de elétrons tem, essencialmente multiplicados, os pequenos sinais de luz originalmente transmitidos pelas fibras ópticas 14. O elevado número de elétrons finalmente é coletado pelo ânodo 58. Esta corrente a partir do ânodo 58 é transferida por meio de uma corrente para o amplificador de tensão 59 como um como um sinal de saída analógico que é representativo dos sinais de fluorescência óptica a partir da amostra provida por meio da pluralidade de módulos ópticos 16.

Módulo óptico de controle 23 inclui um conversor de analógico para digital (A/D) 60 que converte o sinal analógico para uma corrente de dados digitais amostrados, isto é, um sinal digital. O processador 44 recebe o sinal digital e armazena o dado amostrado na memória 46 para comunicação com o dispositivo de aquisição de dado 21, como descrito acima. Em algumas formas de concretização, conversor de A/D 60 pode ser contido no detector 18, em lugar de no módulo óptico de controle 23.

Desta maneira, um único detector 18 pode ser utilizado para coletar toda a luz que vem do feixe óptico 14 e produzir um sinal representativo da mesma. Uma vez quando o sinal é amplificado pelo amplificador 59 e convertido em um sinal digital, ele pode ser digitalmente separado em dados que correspondem à luz coletada por meio de cada um dos módulos ópticos individuais 16. O sinal inteiro (ou seja, agregado) pode ser separado por faixa de freqüência em cada sinal detectado representativo de cada fluorescência. Estas freqüências podem ser separadas por meio de um filtro digital aplicado por meio do dispositivo de aquisição de dado 21 ou dentro do dispositivo 10.

Em outras formas de concretização, o sinal amplificado pode ser separado por freqüência usando filtros analógicos e enviado para canais separados antes do conversor de A/D 60. Cada canal pode então ser separadamente digitalizado e enviado para o dispositivo de aquisição de dado. Em qualquer caso, o único detector é capaz de capturar toda informação de fluorescência a partir de cada módulo óptico 16. O dispositivo de aquisição de dado 21 pode então desenhar e analisar o sinal adquirido a partir de cada câmara de disco 13 em tempo real sem a necessidade de múltiplos detectores.

Em algumas formas de concretização, o detector 18 pode não ser um tubo fotomultiplicador. Em geral, o detector 18 pode ser qualquer tipo de dispositivo de detecção analógico ou digital, capaz de capturar luz a partir de múltiplas pernas de um mecanismo de fornecimento óptico, ou seja, feixe de fibras 14, e produzir uma representação transmissível da luz capturada. Outras formas de concretização pode incluir um detector que é um fotodiodo amplificado ou um fototransmissor.

A figura 5 é um fluxograma ilustrando a operação do dispositivo de detecção de fluorescência multiplex 10. Inicialmente, um usuário especifica parâmetros de programa no dispositivo de aquisição de dado 21 ou através de uma interface com unidade de controle 23 (62). Por exemplo, estes parâmetros podem incluir uma velocidade e período de tempo para girar o disco rotativo 13, definir perfis de temperatura para a reação, e locais de amostra sobre o disco 13.

A seguir, o usuário carrega o disco 13 em um dispositivo de detecção 10 (64). Quando da fixação do dispositivo 10, o usuário inicia o programa (66), causando com que a unidade de controle 23 inicie a girar o disco (68) na taxa especificada. Após o disco ter começado a girar, dois processos simultâneos podem ocorrer.

Primeiramente, um dispositivo de detecção 10 inicia a detectar fluorescência a partir da luz de excitação (70) produzida por meio de uma ou mais reações no interior de uma ou mais amostras. O detector 18 amplifica os sinais de fluorescência a partir de cada amostra, que são sincronizados com cada respectiva amostra e tempo em que a fluorescência foi emitida (72). Durante este processo, o processador 44 salva os dados capturados na memória 46 e pode comunicar os dados para o dispositivo de aquisição de dado 10 em tempo real para monitorar o progresso de operação e para o processamento adicional (73). Alternativamente, o processador 44 pode salvar os dados no dispositivo 10 até que o programa esteja completo. O processador 44 continua a detectar fluorescência das amostras e salvar dados até que o programa esteja completo (74). Estando a operação é completa, a unidade de controle 23 pára o giro do disco (76).

Durante este processo, a unidade de controle 23 monitora a temperatura de disco (78) e modula o disco, ou de cada amostra, para atingir a temperatura visada para este momento (80). A unidade de controle 23 continua a monitorar e controlar a temperaturas até que o programa esteja completo (92). Estando uma vez a operação completa, a unidade de controle 23 mantém a temperatura das amostras em uma temperatura de armazenamento visada, usualmente 4 graus Celsius (84).

A operação de dispositivo 10 pode variar com respeito ao exemplo da figura 5. Por exemplo, as revoluções por minuto do disco podem ser modificada por todo o programa, e o laser 55 pode ser utilizado para abrir as válvulas entre as câmaras no disco para permitir múltiplas reações. As etapas podem ocorrer em qualquer ordem na operação, dependendo do programa definido pelo usuário.

Exemplo

As figuras 6 e 7 mostram os espectros de absorção e emissão dos corantes fluorescentes comumente usados que podem ser utilizados com o dispositivo 10 para PCR multiplex. Nestes exemplos, os máximos de absorção dos corantes variam de 480-620 nm, e os máximos de emissão resultantes variam de 520-670 nm. Os sinais para cada corante na figura 6 são numerados como FAM 88, Sybr 90, JOE 92, TET 94, HEX 96, ROX 98, Tx Red 100, e Cy5 102. Os sinais na figura 7 são FAM 104, Sybr 106, TET 108, JOE 110, HEX 11 2, ROX 11 4, Tx Red 116, e Cy5 118 S. FAM, HEX, JOE, VIC, ΤΕΤ, ROX são marcas de Applera, Norwalk, Califórnia. Tamra é uma marca de AnaSpec, San José, e Califórnia. Texas Red é uma marca de Molecular Probes. Cy 5 é uma marca de Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido.

Em um exemplo, um disco de 96 câmaras foi cheio com diferentes concentrações de corantes FAM e ROX diluídos em neutralizador de reação PCR padrão. Quatro réplicas de cada corante foram adicionadas em uma série de diluição de 2x, partindo de 200 nM FAM e 2000 nM ROX. Cada volume de amostra foi 10 μΙ.. A câmara 82 tinha uma mistura de 5 pL de 200 nM de FAM e 5 μΙ. de 2000 nM de ROX. O dispositivo 10 foi construído como um dispositivo de detecção PCR multiplex, de dois canais, tendo dois módulos ópticos 16 para detecção dos corantes.

O primeiro módulo óptico (o módulo óptico de FAM) continha um LED azul, filtro de excitação de 475 nm e um filtro de detecção de 520 nm. O segundo módulo óptico (o módulo óptico de ROX) continha um LED verde com um filtro de excitação de 560 nm e um filtro de detecção de 610 nm. Uma outra opção seria incorporar um LED laranja e um filtro de excitação em 580 nm para otimizar a detecção de ROX.

Uma análise de PCR foi conduzida, e sinais de fluorescência a partir das amostras foram multiplexados em um feixe de fibras ópticas bifurcado. O feixe de fibras foi interfaceado com um único detector, especificamente um tubo fotomultiplicador (PMT). Dado foi coletado por meio de uma placa de aquisição de dado da National Instruments (DAQ) interfaceada com um programa de aquisição de dado Visual Basic executando em um computador de finalidade geral. Dado foi adquirido enquanto o disco estava girando em 1000 revoluções por minuto (nominalmente). O módulo óptico de FAM e o módulo óptico de ROX foram seqüencialmente usados para interrogar as amostras. Cada exploração consistiu de uma média de 50 rotações. O dado bruto a partir dos dois módulos ópticos é mostrado nas figuras 8A e 8B.

O gráfico na figura 8A foi adquirido por meio do acionamento do LED no módulo óptico de FAM, e o gráfico em 8B foi adquirido por meio do acionamento do LED no módulo óptico de ROX.

Durante a análise, o dado coletado mostrou claramente que existiu um defasagem de tempo associado com módulos ópticos que estão fisicamente posicionados sobre diferentes câmaras em qualquer instante. Um valor de defasagem foi calculado por meio da determinação da defasagem de tempo entre os módulos ópticos 1 e 2 para uma câmara particular, ou seja, câmara 82 neste caso. Em outras palavras, a defasagem de tempo indica a quantidade retardo de tempo entre dado capturado pelo módulo óptico de FAM e dado capturado por meio do módulo óptico de ROX para a mesma câmara. A figura 9 é um gráfico que mostra o dado integrado de defasagem subtraída para cada câmara. FAM é indicado por meio de barras marcadas fechadas, ROX é indicado por meio de barras abertas, e o dado de ROX é posicionado sobre o dado de FAM data. Os dados mostraram que não existiu sinal do corante ROX no módulo óptico 1 e não existiu sinal do corante FAM no módulo óptico 2. Existiu um fundo mais elevado o módulo óptico 1, o qual pode ser retificado por meio do uso de um conjunto otimizado de filtros. O dado foi analisado para determinar o limite de detecção (LOD), descrito como o sinal equivalente ao nível de ruído na linha de base. O nível de ruído na linha de base foi definido como a média de dez explorações de uma câmara de peça em bruto mais 3 vezes o desvio padrão.

O LOD foi determinado por meio de um ajuste linear de mínimos quadrados do sinal integrado registrado contra a concentração dos padrões FAM e ROX. O LOD dos módulos ópticos de FAM e ROX foram calculados para ser 1 e 4 nM, respectivamente, como mostrado nas figuras 10A e 10B.

Claims (29)

1. Dispositivo de detecção, caracterizado pelo fato de que compreende: um motor para girar um disco tendo uma pluralidade de câmaras de processo cada uma portando uma respectiva amostra e uma pluralidade de corantes fluorescentes; uma pluralidade de módulos ópticos, em que cada um dos módulos ópticos inclui uma fonte de luz selecionada para um diferente corante dos corantes e uma lente para capturar luz fluorescente emitida a partir do disco; um detector; e um feixe de fibras ópticas acoplado com a pluralidade de módulos ópticos para transmitir a luz fluorescente dos múltiplos módulos ópticos para um detector.

2. Dispositivo de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um dos módulos ópticos também compreende um filtro de excitação e um filtro de detecção.

3. Dispositivo de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que também compreende um disparador de sensor de fenda que provê um sinal de saída para sincronização de rotação do disco com dado provido por meio de um detector.

4. Dispositivo de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o feixe de fibras ópticas inclui uma pluralidade de pernas de fibra óptica que, cada, terminam na abertura do detector.

5 .Dispositivo de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o detector compreende um fotomultiplicador, um fotodiodo amplificado, um fotodiodo de avalancha ou um fototransistor.

6. Dispositivo de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as fontes de luz dos módulos ópticos compreendem diodos de emissão de luz ou diodos de laser.

7. Dispositivo de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo inclui pelo menos dois módulos ópticos.

8. Dispositivo de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo inclui pelo menos quatro módulos ópticos.

9. Dispositivo de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as fontes de luz são selecionadas para detecção de diferentes espécies de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando detecção de fluorescência em múltiplos comprimentos de onda.

10. Sistema de detecção, caracterizado pelo fato de que compreende: um dispositivo de aquisição de dado; e um dispositivo de detecção acoplado com o dispositivo de aquisição de dado, em que o dispositivo de detecção compreende: um motor para girar um disco tendo uma pluralidade de câmaras de processo cada uma tendo uma pluralidade de espécies que emitem luz fluorescente em diferentes comprimentos de onda; uma pluralidade de módulos ópticos, em que cada um dos módulos ópticos é opticamente configurado para excitar as espécies e capturar luz fluorescente emitida pelas espécies em diferentes comprimentos de onda, um detector; e um feixe de fibras ópticas acoplado com a pluralidade de módulos ópticos para transmitir a luz fluorescente dos múltiplos módulos ópticos para um detector.

11. Sistema de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de aquisição de dado computa um defasagem de tempo entre os módulos ópticos e processa dados a partir de um dispositivo de detecção com base na defasagem de tempo.

12. Sistema de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que cada um dos módulos ópticos também compreende um filtro de excitação e um filtro de detecção selecionados para os diferentes comprimentos de onda.

13. Sistema de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que um dispositivo de detecção também compreende um disparador de sensor de fenda que provê um sinal de saída para sincronização de rotação do disco com dado provido por meio de um detector.

14. Sistema de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que cada módulo óptico pode ser fisicamente montado no interior de respectivos locais do dispositivo, e em que cada módulo óptico pode ser inserido no respectivo local ao longo de guias que se conjugam com uma ou mais marcas do módulo óptico.

15. Sistema de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que cada módulo óptico inclui uma porta de saída óptica para acoplamento com uma perna do feixe óptico de fibras.

16. Sistema de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a porta de saída óptica tem uma extremidade rosqueada para acoplar-se com um conector rosqueado da perna.

17. Sistema de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a porta de saída óptica tem uma conexão deslizável que permite que o feixe de fibras ópticas seja deslizavelmente engatado e desengatado a partir da porta de saída óptica.

18. Sistema de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende um membro de aperto associado com a conexão deslizável para forçar o η para forçar o feixe de fibras ópticas contra a porta de saída óptica.

19. Sistema de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que cada módulo óptico tem um ou mais contatos elétricos para eletronicamente acoplar uma unidade de controle quando totalmente inserido no local.

20. Sistema de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o feixe de fibras ópticas inclui uma pluralidade de pernas ópticas de fibra que terminam, cada, na abertura do detector.

21. Sistema de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o detector é um fotomultiplicador, um fotodiodo amplificado, um fotodiodo de avalancha ou um fototransistor.

22. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: girar um disco tendo uma pluralidade de câmaras de processo cada uma tendo uma pluralidade de espécies que emitem luz fluorescente em diferentes comprimentos de onda; excitar o disco com uma pluralidade de feixes de luz para produzir uma pluralidade de feixes emitidos de luz fluorescente; capturar os feixes de luz fluorescente com uma pluralidade de diferentes módulos ópticos, em que os módulos ópticos são opticamente configurados para os diferentes comprimentos de onda; transmitir os feixes de luz fluorescente a partir da pluralidade de módulos ópticos para um único detector com um feixe óptico de fibras; e fornecer um sinal a partir do detector representativo dos feixes de luz detectados.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que excitar o disco com uma pluralidade de feixes de luz pode ser efetuado por enviar os feixes de luz através de um filtro de excitação e capturar os feixes de luz fluorescente pode ser efetuado por enviar os feixes de luz fluorescente através de um filtro de detecção.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que também compreende prover um sinal de saída a partir de um disparador de sensor de fenda para sincronização de rotação do disco com dado provido por meio de um detector.

25. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o único detector compreende um fotomultiplicador, um fotodiodo amplificado ou a fototermistor.

26. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de feixes de luz são produzidos por meio de diodos de emissão de luz ou diodos de laser.

27. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que feixes de luz são produzidos e capturados a partir de pelo menos dois módulos ópticos.

28. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que feixes de luz são produzidos e capturados a partir de pelo menos quatro módulos ópticos.

29. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende selecionar um comprimento de onda para cada um da pluralidade de feixes de luz para excitar as diferentes espécies da reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando detecção de fluorescência em múltiplos comprimentos de onda.