BRPI0609797A2

BRPI0609797A2 - nanocorpos melhorados para o tratamento de desordens mediadas por agregação

Info

Publication number: BRPI0609797A2
Application number: BRPI0609797-9A
Authority: BR
Inventors: Silence Karen
Original assignee: Ablynx N.V.
Priority date: 2005-05-20
Filing date: 2006-05-19
Publication date: 2010-04-27
Also published as: ES2852423T3; BRPI0609797B1; CA2960105A1; LT2444424T; CN101213214B; FR19C1005I1; NL300966I1; NO2021020I1; NL300966I2; ZA200709570B; KR101414438B1; IL187168A; US8372398B2; SI2444424T1; IL187168A0; PL2444424T3; WO2006122825A3; US20130136736A1; EP2007814A2; DK2444424T3

Abstract

NANOCORPOS MELHORADOS PARA O TRATANENTO DE DESORDENS MEDIADAS POR AGREGAçãO. A presente invenção se relaciona a nanocorpos melhorado contra o Fator de von Willebrand (vWF), bem como à polipeptídios compreendendo ou essencialmente compostos de um ou vários de tais nanocorpos. A invenção também se refere a ácidos nucléicos que codificam tais nanocorpos e polipeptidios; a métodos para preparar tais nanocorpos e polipeptídios; apresentar células que expressam ou são capazes de expressar tais nanocorpos ou polipeptídios, a composições que compreendem tais nanocorpos, polipeptidios, ácidos nucléicos ou células hospedeiras; e a usos de tais nanocorpos, tais polipeptidios, tais ácidos nucléicos, tais células hospedeiras ou tais composições, especialmente para objetivos profiláticos, terapêuticos ou diagnósticos, como objetivos profiláticos, terapêuticos ou diagnósticos.

Description

NANOCORPOS MELHORADOS PARA O TRATAMENTO DE DESORDENSMEDIADAS POR AGREGAÇÃO

A presente invenção relaciona a nanocorpos™ melhoradocontra o Fator de von Willebrand (vWF) , bem como àpolipeptidios compreendendo ou essencialmente compostos deum ou vários de tais nanocorpos. [Observação: Nanocorpo(s)se referem a Nanobody™, Nanobodies™ e Nanoclone ™, que sãomarcas registradas da Ablynx N.V.]

A invenção também se refere aos ácidos nucléicos quecodificam tais nanocorpos e polipeptidios; a métodos parapreparar tais nanocorpos e polipeptidios; apresentar célulasque expressam ou são capazes de expressar tais nanocorpos oupolipeptidios; a composições que compreendem taisnanocorpos, polipeptidios, ácidos nucléicos ou célulashospedeiras; e a usos de tais nanocorpos, taispolipeptidios, tais ácidos nucléicos, tais célulashospedeiras ou tais composições, especialmente paraobj etivos profiláticos, terapêuticos ou diagnósticos, comoobjetivos profiláticos, terapêuticos ou diagnósticosmencionados mais adiante.

Outros aspectos, modalidades de execução, vantagens eaplicações da invenção ficarão claros da nova descrição aseguir.

0 WO 04/062551 do Solicitante relaciona a nanocorposcontra o Fator de von Willebrand (vWF) e à preparação e usodo mesmo, especialmente para a prevenção e/ou o tratamentode doenças e desordens que se relacionam com agregaçãomediada por plaqueta.

O nanocorpos anti-vWF segundo o WO 04/062551 pode serhumanizado e pode ser monovalente ou multivalente, o últimodo qual leva à afinidade aumentada para vWF. O nanocorposanti-vWF segundo o WO 04/062551 também pode sermultiespecifico, e ser especialmente na forma de umconstruto multiespecifico compreendendo dois ou maisnanocorpos contra vWF e um novo nanocorpo dirigido contrauma proteína de soro como albumina de soro humana, que levaa uma meia-vida aumentada in vivo.

Os nanocorpos anti-vWF descritos em WO 04/062551 podemser dirigidos contra qualquer epitope ou a conformação devWF (como o domínio de Al ou dominio A3) , mas sãopreferivelmente dirigidos contra o dominio de Al, eespecialmente contra a conformação ativada do dominio Al.

O WO 04/0 62551 também descreve a preparação donanocorpos anti-vWF, seqüências de nucleotideos quecodificam o nanocorpos anti-vWF, bem como composiçõesfarmacêuticas que compreendem o nanocorpos anti-vWF.

O nanocorpos anti-vWF e composições descritas em WO04/062551 pode ser usado para a prevenção e o tratamento dedoenças e desordens relacionadas à agregação mediada porplaqueta, como a formação de um trombo não-oclusivo, aformação de um trombo oclusivo, formação trombo arterial,oclusão coronária aguda, doença oclusiva arterialperiférica, restenose e desordens que resultam de enxerto dedesvio coronário, substituição de válvula de artériacoronária e intervenções coronárias tais como angioplastia,stenting ou aterectomia, hiperplasia depois angioplastia,aterectomia ou stenting arterial, sindrome oclusiva em umsistema vascular ou a falta de revelação de artérias dedoente, púrpura trombótica trombocitopénica (TTP), ataque deisquemia cerebral transiente, angina pectoris estável ouinstável, enfarte cerebral, sindrome de HELLP,endarterectomia carótida, estenose da artéria carótida,isquemia do limbo critico, cardioembolismo, doença vascularperiférica, restenose e enfarte do miocárdio..

As composições farmacêuticas descritas em WO 04/062551podem ser convenientes para a administração intravenosa,subcutânea, oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal ouretal, ou para administração pela inalação; e também podecompreender um agente tromboutico, como estafiloquinase,ativador plasminogênico de tecido, estreptoquinase,estreptoquinase de cadeia única, uroquinase e complexo deestreptoquinase acil plasminogênico. O nanocorpos anti-vWFdescritos em WO 04/062551 também pode ser usado paraobjetivos de diagnósticos (opcionalmente na forma de um kit-de-partes) ou em revestimentos para dispositivos médicoscomo stents.

Ele é um objeto geral da presente invenção de fornecernanocorpos contra vWF, especialmente contra vWF humano.

Especialmente, é um objeto da presente invençãofornecer nanocorpos contra vWF, especialmente contra vWFhumano, e fornecer proteína ou polipeptídios que compreendamos mesmos, que sejam convenientes para o uso terapêuticoe/ou diagnóstico, e especialmente para a prevenção,tratamento e/ou diagnóstico de uma ou várias doenças edesordens associadas com e/ou mediadas por vWF como as acimamencionados, e/ou que pode ser usado na preparação de umacomposição farmacêutica para a prevenção e/ou o tratamentode uma ou várias doenças associadas com e/ou mediadas porvWF, como os acima mencionados.

Mais especialmente, é um objeto da invenção fornecernanocorpos contra vWF, e fornecer proteína e polipeptídiosque compreendam os mesmos, que são qualquer uma alternativaao nanocorpos e polipeptídios contra vWF descritos em WO04/062551 e/ou que tem uma ou várias propriedades oucaracterísticas melhoradas, em comparação com os nanocorpose polipeptídios contra vWF descrito em WO 04/062551.

Mais especialmente, é um objeto da invenção fornecernanocorpos contra vWF, e fornecer proteína ou polipeptídiosque compreendam os mesmos, que são melhorados em comparaçãocom os nanocorpos e polipeptídios contra vWF descrito em WO04/062551 com respeito a uma ou várias das propriedades oucaracterísticas seguintes:

afinidade aumentada para vWF, seja em um formatomonovalente, em um formato multivalente (por exemplo, em umformato bivaiente) e/ou em um formato multiespecífico (porexemplo, um dos formatos multiespecíficos descritos em WO04/062551 ou a seguir);melhor conveniência para formatação em um formatomultivalente (por exemplo, em um formato bivalente);

melhor conveniência para formatação em um formatomultiespecifico (por exemplo, um dos formatosmultiespecificos descritos em WO 04/062551 ou a seguir);

conveniência melhorada ou suscetibilidade que"humaniza" substituições (como definido neste lugar); e/ou

menos imunogenicidade, sej a em um formatomonovalente, em um formato multivalente (por exemplo, em umformato bivalente) e/ou em um formato multiespecifico (porexemplo, um dos formatos multiespecificos descritos em WO04/062551 ou a seguir) em um formato monovalente;

estabilidade aumentada, seja em um formatomonovalente, em um formato multivalente (por exemplo, em umformato bivalente) e/ou em um formato multiespecifico (porexemplo, um dos formatos multiespecificos descritos em WO04/062551 ou a seguir) em um formato monovalente;

- especificidade aumentada em direção a vWF, seja emum formato monovalente, em um formato multivalente (porexemplo, em um formato bivalente) e/ou em um formatomultiespecifico (por exemplo, um dos formatosmultiespecificos descritos em WO 04/062551 ou a seguir) emum formato monovalente;

reduzido ou onde desejado reatividade cruzadaaumentada com vWF de espécie diferente;e/ou

uma ou várias outras propriedades melhoradasdesejáveis para uso farmacêutico (inclusive uso profiláticoe/ou uso terapêutico) e/ou uso para diagnóstico (inclusive,mas não limitado a, usar para objetivos de visualização) ,seja em um formato monovalente, em um formato multivalente(por exemplo, em um formato bivalente) e/ou em um formatomultiespecifico (por exemplo, um dos formatosmultiespecificos descritos em WO 04/062551 ou a seguir).

Esses objetos são realizados pelo nanocorpos contravWF e pelos polipeptidios descritos na presente. Osnanocorpos contra vWF e polipeptidios descritos na presentesão especialmente dirigidos contra vWF humano, mas estáincluído dentro dos limites da invenção que algunsnanocorpos anti-vWF e os polipeptidios da invenção podemmostrar reatividade cruzada com vWF de outros animaisvertebrados, especialmente de outros animais de sanguequente, mais especialmente de outros mamíferos, eespecialmente de outra espécie de primatas, como os babuinosusados nos Exemplos mais adiante. Contudo, como comnanocorpos anti-vWF descritos em WO 04/062551, a presenteinvenção no seu sentido mais amplo não é em particularlimitada a ou definida por um epitope especifico, dominio ouconfirmação de vWF contra o qual os nanocorpos e ospolipeptidios da invenção são dirigidos. Contudo, égeralmente assumido e preferido que os nanocorpos e ospolipeptidios da invenção sejam dirigidos contra um dominio1 de vWF, na sua confirmação ativada ou não-ativada.

Portanto, em um primeiro aspecto, a invenção refere-sea um nanocorpo (conforme definido na presente), contra vWF,que se compõem de 4 regiões de armação (FR' S I a FR4respectivamente) e 3 regiões que determinamcomplementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), em que:

i) 0 CDR1 compreende ou essencialmente compõe-se deuma seqüência aminoácida escolhida de grupo composto de :

NYGMG [SEQ ID n. 15]

SYTLG [SEQ ID n. 16]

NYNMG [SEQ ID n. 17]

SSAMA [SEQ ID n. 18]

YYNTG [SEQ ID n. 19]

IGAMG [SEQ ID n. 20]

IGTMG [SEQ ID n. 21]

YNPMG [SEQ ID n. 22]

ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das seqüências aminoácidas acimamencionadas; em que

(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmenteuma substituição aminoácida conservadora (conforme definidona presente); e/ou

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência (s)aminoácida(s) acima mencionadas,e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 2 ou só I "diferença(s) aminoácida(s) " (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas;

e em que:

ii) O CDR2 compreende ou essencialmente compoe-se deuma seqüência aminoácida escolhida do grupo composto de:

SISWSGTYTAYSDNVKG [SEQ ID n. 23]

GISWSGVSTDYAEFAKG [SEQ ID n. 24]

TSISWSGSYTAYADNVKG [SEQ ID n. 25]

SISWSGMSTYYTDSVKG [SEQ ID n. 26]

TITSGGRTSYADSVKG [SEQ ID n. 27]

AISWSGGLTYYADSVKG [SEQ ID n. 28]

TITSGGSTNYADPVKG [SEQ ID n. 29]

TITSGGSTNYADSVKG [SEQ ID n. 30]

AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID n. 31]

AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID n. 32]

ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das seqüências aminoácidas acimamencionadas; em que

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida (s) acima mencionadas;

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

e em que:

iii) 0 CDR3 compreende ou essencialmente compõe-

se de uma seqüência aminoácida escolhida do grupo compostode :

QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID n. 33]

LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQ ID n. 34]QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQ ID n. 35]

SNRYRTHTTQAMYNY [SEQ ID n. 36]

VVDGKRAP [SEQ ID n. 37]

NRRQKTVQMGERAYDY [SEQ ID n. 38]

NLKQGSYGYRFNDY [SEQ ID n. 39]

NLKQGDYGYRFNDY [SEQ ID n. 40]

AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID n. 41]

AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID n. 42]

AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID n. 43]

ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm

pelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas; em que

(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmentetuna substituição aminoácida conservadora (conforme definidona presente); e/ou

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoacidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoacidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um nanocorpo(conforme definido na presente), contra

os vWF, que se compõem de 4 regiões de armação (FR1 aFR4 respectivamente) e 3 regiões que determinamcomplementaridade (GDRl a CDR3 respectivamente), em que:

i) O CDR1 é uma seqüência aminoácida escolhida dogrupo composto de :

NYGMG [SEQ ID n. 15]

SYTLG [SEQ ID n. 16]

NYNMG [SEQ ID n. 17]

SSAMA [SEQ ID n. 18]

YYNTG [SEQ ID n. 19]

IGAMG [SEQ ID n. 20]

IGTMG [SEQ ID n. 211

YNPMG [SEQ ID n. 22]

ou do grupo composto de seqüências aminoacidas que têmpelo. menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos

Identidade de seqüência de 99% (conforme definido napresente) com uma das seqüências aminoacidas acimamencionadas; em que

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmenteuma substituição aminoácida conservadora (conforme definidona presente) ; e/ou

e em que :

ii) O CDR2 é uma seqüência aminoácida escolhidado grupo composto de :

SISWSGTYTAYSDNVKG [SEQ ID n. 23]

GISWSGVSTDYAEFAKG [SEQ ID n. 24]

TSISWSGSYTAYADNVKG [SEQ ID n. 25]

SISWSGMSTYYTDSVKG [SEQ ID n. 26]

TITSGGRTSYADSVKG [SEQ ID n. 27]AISWSGGLTYYADSVKG [SEQ ID n. 28]

TITSGGSTNYADPVKG [SEQ ID n. 29]

TITSGGSTNYADPVKG [SEQ ID n. 30]

AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID n. 31]

AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID n. 32]

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoacida(s) acima mencionadas;e em que:

iii) 0 CDR3 é uma seqüência aminoacida escolhidado grupo composto de :

QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID n. 33]

LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQ ID n. 34]

QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQ ID n. 35]

SNRYRTHTTQAMYNY [SEQ ID n. 36]

VVDGKRAP [SEQ ID n. 37]

NRRQKTVQMGERAYDY [SEQ ID n. 38]

NLKQGSYGYRFNDY [SEQ lo n. 39]

NLKQGDYGYRFNDY [SEQ ID n. 40]

AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID n. 41]

AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID n. 42]

AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID n. 43]

(1) qualquer substituição aminoacida é preferivelmenteuma substituição aminoacida conservadora (conforme definidona presente); e/ou

(2) a referida seqüência aminoacida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas;

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só I "diferença (s) aminoácida (s) 11 (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas.

Os nanocorpos contra vWF conforme descritoanteriormente e conforme adicionalmente descrito a seguirtambém são mencionados na presente como nanocorpos dainvenção.

Do nanocorpos da invenção, nanocorpos que compreendemum ou vários do CDR'S explicitamente enumerado anteriormentesão em particular preferidos; os nanocorpos compreensão dedois ou mais do CDR1S explicitamente enumerado anteriormentesão mais em particular preferidos; e os nanocorposcompreensão de três do CDR1S explicitamente enumeradoanteriormente são mais em particular preferidos.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um nanocorpocontra vWF, que se compõem de 4 regiões de armação (FR1 aFR4 respectivamente) e 3 regiões que determinamcomplementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), que éescolhido do grupo composto de nanocorpos com aquela dascombinações seguintes de CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente:CDR1:NYGMG;

CDR2:SISWSGTYTAYSDNVKG; CDR3:QSRYRSNYYDHDDKYAY

CDRI:SYTLG; CDR2:GISWSGVSTDYAEFAKG;CDR3:LGRYRSNWRNIGQYDYCDRI:NYGMG;

CDR2:TSISWSGSYTAYADNVKG; CDR3:QSRYSSNYYDHDDKYAY

CDRI:NYNMG; CDR2:SISWSGMSTYYTDSVKG;

CDR3:SNRYRTHTTQAMYNY

CDRI:SSAMA;CDR2:TlTSGGRTSYADSVKG;CDR3:VVDGKRAP -CDRI:YYNTG; CDR2:AISWSGGLTYYADSVKG; CDR3:NRRQKTVQMGERAYDY

CDRI:IGAMG;CDR2:TITSGGSTNYADPVKG;CDR3:NLKQGSYGYRFNDY

CDRI:IGAMG;CDR2:TITSGGSTNYADSVKG;CDR3:NLKQGSYGYRFNDYCDRI:IGAMG; CDR2:TITSGGSTNYADSVKG;

CDR3:NLKQGDYGYRFNDY

- CDRI:IGTMG;CDR2:TITSGGSTNYADSVKG;CDR3:NLKQGDYGYRFNDYCDRI:YNPMG; CDR2:AISRTGGSTYYARSVEG; CDR3:AGVRAEDGRVRTLPSEYNF

CDRI:YNPMG; CDR2:AISRTGGSTYYPDSVEG;

CDR3:AGVRAE DGRVRTL PS EYT F

CDRI:YNPMG; CDR2 :AISRTGGSTYYPDSVEG;CDR3:AGVRAEDGRVRSLPSEYTF

Nos nanocorpos da invenção que compreendem ascombinações do CDR'S acima mencionadas, cada CDR pode sersubstituído por um CDR escolhido do grupo composto deseqüências aminoácidas que têm pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com oCDR'S mencionado; em que

e/ou escolhido do grupo composto de seqüênciasaminoácidas que têm 3, 2 ou só I (como indicado no parágrafoprecedente) "diferença(s) aminoácida(s) " (conforme definidona presente) com o CDR mencionado (s) um do acima mencionadoseqüências aminoácidas, em que:

(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmenteum aminoácido conservadorsubstituição (conforme definido na presente); e/ou

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência (s)aminoácida(s) acima mencionadas.

Contudo, dos nanocorpos da invenção que compreendem ascombinações do CDR'S acima mencionadas, nanocorpos quecompreendem um ou vários do CDR1S enumerado anteriormentesão em particular preferidos; os nanocorpos compreensão dedois ou mais do CDR'S enumerado anteriormente são mais emparticular preferidos; e os nanocorpos compreensão de trêsdo CDR?S enumerado anteriormente são mais em particularpreferidos.TABELA I: combinações preferenciais de CDR!S, DE CDR'Se seqüências de armação, e do FR' S e humanizado de CDR

<table>table see original document page 20</column></row><table>Tabela I

<table>table see original document page 21</column></row><table><table>table see original document page 22</column></row><table>Portanto, nos nanocorpos da invenção, pelo menos umadas seqüências CDRI, CDR2 e CDR3 presentes é apropriadamenteescolhida do grupo composto das seqüências CDR1, CDR2 eCDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I; ou do grupodas seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos "identidade de seqüência de 99%" (conformedefinido na presente) com pelo menos uma das seqüênciasCDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I;e/ou do grupo composto do CDRI, CDR2 e seqüências CDR3,respectivamente, que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com pelomenos uma das seqüências CDRI, CDR2 e CDR3, respectivamente,enumeradas na Tabela I. Neste contexto, "por apropriadamenteescolhido" quer dizer que, como aplicável, uma seqüênciaCDRI é escolhida de seqüências CDRI convenientes (isto é,conforme definido na presente), uma seqüência CDR2 éescolhida de seqüências CDR2 convenientes (isto é, conformedefinido na presente), e uma seqüência CDR3 é escolhida daseqüência CDR3 conveniente (isto é, conforme definido napresente), respectivamente.

Especialmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menosa seqüência CDR3 presente é apropriadamente escolhida dogrupo composto das seqüências CDR3 enumeradas na Tabela I oudo grupo de seqüências CDR3 que têm pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com pelo menos uma das seqüências CDR3enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto dasseqüências CDR3 que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s)aminoácida(s) com pelo menos uma das seqüências CDR3enumeradas na Tabela I.

Preferivelmente, nos nanocorpos da invenção, pelomenos dois dos CDRI, CDR2 e presente de seqüências CDR3 sãoapropriadamente escolhidas do grupo composto das seqüênciasCDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela Iou do grupo composto das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3,respectivamente, que têm pelo menos 8 0%, preferivelmentepelo menos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmomais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos um dos CDRI, CDR2 e seqüências CDR3,respectivamente, enumeradas na Tabela I; e/ou do grupocomposto das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente,que têm 3, 2 ou só "diferença (s) aminoácida (s) " com pelomenos uma das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente,me inclinei na Tabela I.

Especialmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menosa seqüência CDR3 presente é apropriadamente escolhida dogrupo composto das seqüências CDR3 enumeradas na Tabela I oudo grupo de seqüências CDR3 que têm pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com pelo menos uma das seqüências CDR3enumeradas na Tabela I, respectivamente; e pelo menos umadas seqüências CDRI e CDR2 presentes é apropriadamenteescolhida do grupo composto do CDRI e seqüências CDR2,respectivamente, enumeradas na Tabela I ou do grupo de CDR Ie seqüências CDR2, respectivamente, que têm pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com pelo menos uma das Seqüências CDRI eCDR2, respectivamente, enumeradas na Tabela I; e/ou do grupocomposto das seqüências CDRI e CDR2, respectivamente, quetêm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida (s) com pelo menosuma das Seqüências CDRI e CDR2, respectivamente, enumeradasna Tabela I.

Mais preferivelmente, nos nanocorpos da invenção, ostrês CDRI, CDR2 e o presente de seqüências CDR3 sãoapropriadamente escolhidas do grupo composto do CDRI, CDR2 eseqüências CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I oudo grupo de CDRI, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente,que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos umdos CDRI, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente,enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto dasseqüências CDRI, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm 3, 2ou só 1 diferença (s) aminoácida (s) com pelo menos um dosCDRI, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente, enumeradas naTabela I.Mesmo mais preferivelmente, nos nanocorpos dainvenção, pelo menos uma das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3presentes é apropriadamente escolhida do grupo composto doCDRI, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente, enumeradas naTabela I. Preferivelmente, nesta modalidade de execução,pelo menos uma ou preferivelmente ambas as seqüências CDRpresentes são apropriadamente escolhidas de seqüências CDRque têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos umada correspondência seqüências de CDR, respectivamente,enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto dasseqüências CDR que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácidacom pelo menos uma das seqüências correspondentes,respectivamente, listadas na Tabela I.

Especialmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menosa seqüência CDR3 presente é apropriadamente escolhida dogrupo composto do CDR3 enumeradas na Tabela I.

Preferivelmente, nesta modalidade de execução, pelo menos ume preferivelmente ambos dos CDRI e presente de seqüênciasCDR2 são apropriadamente escolhidas dos grupos de SeqüênciasCDRI e CDR2, respectivamente, que têm pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com o Seqüências CDRI e CDR2,respectivamente, enumerado em enumeradas na Tabela I; e/oudo grupo composto das seqüências CDRI e CDR2,respectivamente, que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s)aminoácida(s) com pelo menos uma das Seqüências CDR1 e CDR2,respectivamente, enumeradas na Tabela I.

Mesmo mais preferivelmente, nos nanocorpos dainvenção, pelo menos dois dos CDRI, CDR2 e presente deseqüências CDR3 são apropriadamente escolhidas do grupocomposto do CDRI, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente,enumeradas na Tabela I. Preferivelmente, nesta modalidade deexecução, o resto da seqüência CDR presente éapropriadamente escolhida do grupo de seqüências CDR que têmpelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos umadas seqüências CDR correspondentes enumeradas na Tabela I;e/ou do grupo composto de seqüências CDR que têm 3, 2 ou só1 diferença(s) aminoácida(s) com pelo menos uma dasseqüências correspondentes enumeradas na Tabela I.

Especialmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menosa seqüência CDR3 é apropriadamente escolhida do grupocomposto das seqüências CDR3 enumeradas na Tabela I, e aseqüência CDRI ou a seqüência CDR2 são apropriadamenteescolhidas do grupo composto do CDRI e seqüências CDR2,respectivamente, enumeradas na Tabela I. Preferivelmente,nesta modalidade de execução, o resto da seqüência CDRpresente é apropriadamente escolhida do grupo de seqüênciasCDR que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%,mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%com pelo menos uma das seqüências CDR correspondentesenumeradas na Tabela 1; e/ou do grupo composto de seqüênciasCDR que têm 3, 2 ou só I diferença (s) aminoácida (s) com acorrespondência que as seqüências de CDR enumeraram naTabela I.

Mesmo mais preferivelmente, nos nanocorpos dainvenção, os três CDRI, CDR2 e o presente de seqüências CDR3são apropriadamente escolhidas do grupo composto do CDRI, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente, enumeradas naTabela I.

Também, geralmente, as combinações do CDRfS enumeradasna Tabela I (isto é, os mencionados na mesma linha na TabelaI) são preferidas. Portanto, é geralmente preferido que,quando um CDR em um nanocorpo da invenção é uma seqüênciaCDR mencionada na Tabela I ou é apropriadamente escolhida dogrupo de seqüências CDR que têm pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com uma seqüência CDR enumerada naTabela I; e/ou do grupo composto de seqüências CDR que têm3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida (s) com uma seqüênciaCDR enumerada na Tabela I, isto pelo menos um epreferivelmente ambos de outro CDR1s são apropriadamenteescolhidas das seqüências CDR que pertencem à mesmacombinação na Tabela I (isto é, mencionado na mesma linha naTabela I) ou são apropriadamente escolhidas do grupo deseqüências CDR que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%com a seqüência(s) CDR que pertence à mesma combinação e/oudo grupo composto de seqüências CDR que têm 3, 2 ou só 1diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência(s) CDR quepertence à mesma combinação. Outras preferências indicadasnos acima mencionados parágrafos também se aplicam àscombinações do CDR'S mencionado na Tabela I.

Portanto, por meio de exemplos não-restritivos, umnanocorpo da invenção, por exemplo, pode compreender umaseqüência CDR1 que tem a identidade de seqüência de mais de80% com uma das seqüências CDR1 mencionadas na Tabela I, umaseqüência CDR2 que tem 3, 2 ou 1 diferença aminoácida comuma das seqüências CDR2 mencionadas na Tabela I (maspertencendo a uma combinação diferente), e uma seqüênciaCDR3.

Alguns nanocorpos preferidos da invenção, por exemplo,podem compreender: (1) uma seqüência CDR1 que tem aidentidade de seqüência de mais de 80% com uma dasseqüências CDR1 mencionadas na Tabela I; uma seqüência CDR2que tem 3, 2 ou 1 diferença aminoácida com uma dasseqüências CDR2 mencionadas na Tabela I (mas pertencendo auma combinação diferente) ; e uma seqüência CDR3 que tem aidentidade de seqüência de mais de 8 0% com uma dasseqüências CDR3 mencionadas na Tabela I (mas pertencendo auma combinação diferente); ou (2) uma seqüência CDR1 que tema identidade de seqüência de mais de 80% com

uma das seqüências CDR1 mencionadas na Tabela I; umaseqüência CDR2, e uma das seqüências CDR3 inclinaram-se naTabela I; ou (3) uma seqüência CDR1; uma seqüência CDR2 quetem a identidade de seqüência de mais de 8 0% com uma daseqüência CDR2 enumerada na Tabela I; e uma seqüência CDR3que tem 3, 2 ou 1 diferenças aminoácidas com a seqüênciaCDR3 mencionada na Tabela I que pertence à mesma combinaçãoque a seqüência CDR2.

Alguns nanocorpos particularmente preferidos dainvenção, por exemplo, podem compreender: (1) uma seqüênciaCDR1 que tem a identidade de seqüência de mais de 80% comuma das seqüências CDR1 mencionadas na Tabela I; umaseqüência CDR2 que tem 3, 2 ou I diferença aminoácida com aseqüência CDR2 mencionada na Tabela I que pertence à mesmacombinação; e uma seqüência CDR3 que tem a identidade deseqüência de mais de 8 0% com a seqüência CDR3 mencionada naTabela I que pertence à mesma combinação; (2) uma seqüênciaCDR1; um CDR 2 enumeradas na Tabela I e uma seqüência CDR3listadas na Tabela I (no qual a seqüência CDR2 e a seqüênciaCDR3 podem pertencer a combinações diferentes).

Alguns nanocorpos até mais preferencial da invenção,por exemplo, podem compreender: (1) uma seqüência CDRl quetem a identidade de seqüência de mais de 8 0% com um dos CDR] seqüências mencionadas na Tabela I; a seqüência CDR2listadas na Tabela I que pertence à mesma combinação; e umaseqüência CDR3 mencionada na Tabela I que pertence a umacombinação diferente; ou (2) uma seqüência CDR1 mencionadana Tabela I; uma seqüência CDR2 que tem 3, 2 ou 1 diferençasaminoácidas com a seqüência CDR2 mencionada na Tabela I quepertence à mesma combinação; e a identidade de seqüência demais de 80% com a seqüência CDR3 listadas na Tabela I quepertence à mesma combinação diferente.

nanocorpos particularmente preferidas da invenção, porexemplo, pode compreender uma seqüência CDR1 mencionada naTabela I, uma seqüência CDR2 que tem mais de 8 0 identidadede seqüência com a seqüência CDR2 mencionada na Tabela I quepertence à mesma combinação; e a seqüência CDR3 mencionadana Tabela I que pertence ao mesmo.

No mais preferencial nos nanocorpos da invenção, asseqüências CDR1, CDR2 e CDR3 presentes são apropriadamenteescolhidas daquela das combinações das seqüências CDR1, CDR2e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I.

Preferivelmente, quando uma seqüência CDR éapropriadamente escolhida do grupo de seqüências CDR que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispref erivelmente pelo menos 95%, mesmo mais pref erivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das seqüências CDR enumeradas na TabelaI; e/ou quando uma seqüência CDR é apropriadamente escolhidado grupo composto de seqüências CDR que têm 3, 2 ou só I adiferença(s) aminoácida(s) com uma das seqüências CDRlistadas na Tabela 1:

i) qualquer substituição aminoácida épreferivelmente uma substituição aminoácida conservadora(conforme definido na presente); e/ou

ii) os referidos que a seqüência aminoácidapreferivelmente só contém substituições aminoácidas, enenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparaçãocom a seqüência CDR enumerada na Tabela I.

Segundo uma modalidade de execução preferida mas nãolimitada da invenção, as seqüências CDR nos nanocorpos dainvenção são como definidos anteriormente e são também taisque o nanocorpo da invenção liga a vWF com uma dissociaçãoconstante (KD) de 10-5 a 1012 mol/litro (M) ou menos, epref erivelmente 10-7 a 10-12 mol/litro (M) ou menos e maispref erivelmente 10-8 a 10-12 mol/litro (M) , e/ou com umaassociação constante (KA) de pelo menos 107 m-1,pref erivelmente pelo menos 108 m-1, mais pref erivelmentepelo menos 109 m-1, como pelo menos 1012 m-1; eespecialmente com um KD menos de 500 nM, pref erivelmentemenos de 200 nM, mais pref erivelmente menos de 10 nM, comomenos de 500 da tarde. O KD e os Valores de KA do nanocorpoda invenção contra vWF podem ser determinados em uma maneiraconhecida por si, por exemplo, usando o ensaio descrito napresente. Mais geralmente, os nanocorpos descritos napresente preferivelmente têm uma dissociação constante comrespeito a vWF que é como descrito neste parágrafo.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um nanocorpocom uma seqüência aminoácida que é escolhida do grupocomposto de lo NO's SEQ: 60 para 73 e SEQ ID NOfs: 86 para97 ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmmais de 80%, pref erivelmente mais de 90%, maispref erivelmente mais de 95%, como 99% ou mais "identidade deseqüência" (conforme definido na presente) com uma ou váriasdas seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's: 60 para 73 e SEQID NO's: 86 para 97, que seqüências aminoácidas o maispref erivelmente têm seqüências de armação que são maisadiante definidas conforme a descrição geral das seqüênciasde armação de nanocorpos.

Segundo uma modalidade de execução especifica, masnão-restritiva, as últimas seqüências aminoácidas foram"humanizadas", conforme adicionalmente descrito maisadiante.

Mais preferivelmente, os nanocorpos da invenção sãoescolhidos do grupo composto de SEQ ID NO1 s: 60 para 73 eSEQ ID NO1 s: 8 6 para 97, de que os nanocorpos "humanizado"de SEQ ID NO's: 86 para 97 pode ser em particular preferido.

Os nanocorpos que são determinados preferidos segundoa invenção são nanocorpo 12B6 (SEQ ID n. 62) e homólogos evariantes disso, e em determinadas variantes humanizadasdisso. Alguns em particular preferidos, mas não-limitandohomólogos e variantes (humanizadas) são, por exemplo,nanocorpos 12A2 (SEQ ID n. 71); 12F2 (SEQ ID n. 72); 14H10(SEQ ID n. 73) e variantes humanizadas disso, como 12B6H1(SEQ ID n. 86); 12B6H2 (SEQ ID n. 87); 12B6H3 (SEQ ID n.88); 12B6H4 (SEQ ID n. 89); 12A2H1 (SEQ ID n. 90); 12A2H3(SEQ ID n. 91); 12A2H4 (SEQ ID n. 92); 12A2H11 (SEQ ID n.93) e 12A2H13 (SEQ ID n. 94).

Particularmente preferidas na invenção é um nanocorpo12 A2 (SEQ ID n. 71) e homólogos e variantes disso, e emdeterminadas variantes humanizadas disso. Alguns emparticular preferidos, mas não-limitando homólogos evariantes (humanizadas) são, por exemplo, nanocorpos 12A2H1(SEQ ID n. 90); 12A2H3 (SEQ ID n. 91); 12A2H4 (SEQ ID n.92); 12A2H11 (SEQ ID n. 93) e 12A2H13 (SEQ ID n. 94), doqual nanocorpo 12A2H1 (SEQ ID n. 90) é especialmentepreferido.

Portanto, um aspecto preferencial mas não-restritivoda invenção relaciona a nanocorpo contra o Fator de vonWillebrand (vWF), o referido nanocorpo composto de 4 regiõesde armação (FR1 a FR4 respectivamente) e 3 regiões quedeterminam complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente) ,em que:

a) O CDR1 compreende ou essencialmente compõe-se de:a seqüência aminoácida YNPMG; ou

umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só Idiferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida YNPMG;e

b) O CDR2 compreende ou essencialmente compõe-se de:a seqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG; ou

uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%,pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelomenos 95%, mesmo mais pref erivelmente pelo menos 99%identidade de seqüência com a seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG; ou

umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só Idiferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG;

e

c) O CDR3 compreende ou essencialmente compõe-se de:

a seqüência aminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; ou

- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%,pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelo

menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com a seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF; ou

umas seqüências aminoácidas que tem só 1diferença aminoácida com o

seqüência de aminoácido AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

Especialmente, a invenção refere-se a tal nanocorpo,em que:

O CDR1 compreende ou essencialmente compõe-se daseqüência aminoácida YNPMG;

ou em que :

O CDR2 compreende ou essencialmente compõe-se daseqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG;

ou em que

O CDR3 compreende ou essencialmente compõe-se daseqüência aminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

Por exemplo, a invenção refere-se a tais nanocorpos,em que:- O CDR1 compreende ou essencialmente compõe-se daseqüência aminoácida YNPMG; e o CDR3 compreende ouessencialmente compõe-se da seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF;

ou em que:

- 0 CDR1 compreende ou essencialmente compõe-se daseqüência aminoácida YNPMG; e o CDR2 compreende ouessencialmente compõe-se da seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG;

ou em que :

O CDR2 compreende ou essencialmente compõe-se daseqüência aminoácida

AISRTGGSTYYPDSVEG; e o CDR3 compreende ouessencialmente compõe-se de o

seqüência de aminoácido AGVRAEDGRVRTLPSEYTF

Em um aspecto, a invenção refere-se a tal nanocorpo,no qual CDRl compreende ou essencialmente se compõe daseqüência aminoácida YNPMG; e o CDR3 compreende ouessencialmente compõe-se da seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

A invenção também se refere a variantes humanizadas detal nanocorpo. Algumas substituições preferidas, mas não-limitadas, que se humanizam serão descritas na presente, ouserão claras para a pessoa experimentada comparando oscorrespondentes nanocorpos não-humanizado e humanizadorevelados na presente. Algumas substituições de humanizaçãoespecialmente úteis são um ou vários daqueles apresentam nasvariantes humanizadas de 12A2 (como estará claro para apessoa experimentada de uma comparação das seqüências de12A2H 1 (SEQ ID n. 90) com as correspondentes seqüênciashumanizadas de 12A2H3 (SEQ ID n. 91); 12A2H4 (SEQ ID n. 92);12A2H11 (SEQ ID n. 93) e 12A2H13 (SEQ ID n. 94).

Outro aspecto preferido mas não-restritivo da invençãorelaciona a nanocorpo contra o Fator de von Willebrand(vWF), o referido nanocorpo composto de 4 regiões de armação(FR1 a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinamcomplementaridade (CDRl a CDR3 respectivamente), em que:

d) O CDRl é:

a seqüência aminoácida YNPMG; ou

umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida YNPMG; e

e) O CDR2 é

a seqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG; ou- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com a seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG; ou

umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG;e

f) O CDR3 é:a seqüência aminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; ou- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%,

preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com a seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF; ou

umas seqüências aminoácidas que tem só Idiferença aminoácida com oseqüência de aminoácido AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

Especialmente, a invenção refere-se a tal nanocorpo, em que:o CDR1 é a seqüência aminoácida YNPMG;ou em que:

O CDR2 é a seqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG; ouem que

O CDR3 é a seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

Por exemplo, a invenção refere-se a tais nanocorpos,em que:

O CDR1 é a seqüência aminoácida YNPMG; e o CDR3 éa seqüência aminoácida

AGVRAEDGRVRTLPSEYTF;ou em que:

O CDR1 é a seqüência aminoácida YNPMG; e o CDR2 éa seqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG;ou em que:

O CDR2 é a seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG; e o CDR3 é a seqüência de aminoácidoAGVRAEDGRVRTLPSEYTF

Em um aspecto, a invenção refere-se a tal nanocorpo,no qual CDRI é a seqüência aminoácida YNPMG; e o CDR3 é aseqüência aminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

A invenção também se refere a variantes humanizadas detal nanocorpo. Algumas substituições preferidas, mas não-1imitadas, que se humanizam serão descritas na presente, ouserão aparentes à pessoa experimentada comparando acorrespondência não-humanizada e nanocorpo humanizadorevelado na presente. Algumas substituições de humanizaçãoespecialmente úteis são um ou vários daqueles apresentam nasvariantes humanizadas de 12A2 (como estará claro para apessoa experimentada de uma comparação das seqüências de12A2111 (SEQ ID n. 90) com as correspondentes seqüênciashumanizadas de 12A2H3 (SEQ ID n. 91); 12A2H4 (SEQ lo n. 92);12A2H11 (SEQ ID n. 93) e 12A2H13 (SEQ ID n. 94).

O nanocorpos descrito na presente pode ser nanocorposde classe GLEW, "103 P, R ou S" - classe nanocorpos ou"KERE-classe nanocorpos" (todos conforme descrito napresente). Especialmente, os nanocorpos descrito na presentepode ser KERE-classe nanocorpos, embora a invenção não sejalimitada a isso.

Em outro aspecto, a invenção refere-se ao nanocorpoque tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos95%, ou identidade de seqüência pelo menos de 99% (conformedefinido na presente) com pelo menos um dos nanocorpos dogrupo composto de SEQ ID NOfs 60-73 e SEQ ID NO!s 86-97.Especialmente, a invenção refere-se ao nanocorpo quetem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ouidentidade de seqüência pelo menos de 99% (conforme definidona presente) com pelo menos um dos nanocorpos 12B6 (SEQ IDn. 62); 12A2 (SEQ ID n. 71); 12F2 (SEQ ID n. 72); 14H10 (SEQID n. 73); 12B6H1 (SEQ ID n. 86); 12136H2 (SEQ ID n. 87);12B6H3 (SEQ ID n. 88); 12B6H4 (SEQ ID n. 89); 12A2H1 (SEQ IDn. 90); 12A2H3 (SEQ ID n. 91); 12A2H4 (SEQ ID n. 92);12A2H11 (SEQ ID n. 93) e/ou 12A2H 13 (SEQ ID n. 94).

Mais especialmente, a invenção refere-se ao nanocorpoque tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos95%, ou identidade de seqüência pelo menos de 99% (conformedefinido na presente) com pelo menos um dos nanocorpos 12A2(SEQ ID n.. 71); 12A2H1 (SEQ ID n. 90); 12A2H3 (SEQ ID n.91) ; 12A2H4 (SEQ ID n. 92) ; 12A2H11 (SEQ ID n. 93) e/ou12A2H 13 (SEQ ID n. 94) .

Mesmo mais especialmente, a invenção refere-se aonanocorpo que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelomenos 95%, ou identidade de seqüência pelo menos de 99%(conforme definido na presente) com nanocorpo 12A2H1 (SEQ IDn. 90) .

A invenção também se refere às variantes humanizadasde tais nanocorpos. Algumas substituições preferidas, masnão-limitadas, que se humanizam serão descritas na presente,ou serão claras para a pessoa experimentada comparando oscorrespondentes nanocorpos não-humanizado e humanizadorevelados na presente. Algumas substituições de humanizaçãoespecialmente úteis são um ou vários daqueles apresentam nasvariantes humanizadas de 12A2 (como estará claro para apessoa experimentada de uma comparação das seqüências de12A2H1 (SEQ ID n. 90) com as correspondentes seqüênciashumanizadas de 12A2H3 (SEQ ID n. 91); 12A2H4 (SEQ ID n. 92);12A2H1I (SEQ ID n. 93) e 12A2H13 (SEQ ID n. 94) .

A invenção também se refere ao nanocorpo que éescolhido do grupo composto dos nanocorpos de SEQ ID NO's60-73 e SEQ ID NO's 86-97.

Especialmente, a invenção refere-se ao nanocorpo que éescolhido do grupo composto dos nanocorpos 12B6 (SEQ ID n.62); 12A2 (SEQ ID n. 71); 12F2 (SEQ ID n. 72); 14H10 (SEQ IDn. 73); 12B6H1 (SEQ ID n. 86); 12B6H2 (SEQ ID n. 87); 12B6H3(SEQ ID n. 88); 12B6H4 (SEQ ID n. 89); 12A2H1 (SEQ ID n.90); 12A2H3 (SEQ ID n. 91); 12A2H4 (SEQ ID n. 92); 12A2H 11(SEQ ID n. 93) e/ou 12A2H13 (SEQ lo n. 94) .

Mais especialmente, a invenção refere-se ao nanocorpoque é escolhido do grupo composto dos nanocorpos 12A2 (SEQID n. 71); 12A2H1 (SEQ ID n. 90); 12A2H3 (SEQ ID n. 91);12A2H4 (SEQ ID n. 92); 12A2H11 (SEQ ID n. 93) e/ou 12A2H13(SEQ ID n. 94). nanocorpo especialmente útil é um nanocorpo12A2H1 (SEQ ID NO:90).

Os nanocorpos descritos na presente preferivelmentetêm seqüências de armação que são como além disso descritasna presente. Algumas seqüências de armação em particularpreferenciais (FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente) sãoaqueles do nanocorpo 12A2 e as suas variantes humanizadas; eas seqüências de armação que têm pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com umade ditas seqüências de armação; e e/ou do grupo composto deseqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma deditas seqüências de armação (no qual qualquer substituiçãoaminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácidaconservadora; e/ou no qual a referida seqüência aminoácidapreferivelmente contém substituições aminoácidas e não maisdo que 3 eliminações aminoácidas ou não mais do que 3inserções aminoácidas). Os nanocorpos contra vWF com taisseqüências de armação formam um novo aspecto da invenção.

Especialmente, a invenção refere-se ao nanocorpocontra vWF, no qual FR1 é lo n. 140 SEQ; o FR2 é SEQ ID n.192; o FR3 é SEQ ID 244; e o FR4 é SEQ ID n. 296; ou asseqüências de armação que têm pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com umade ditas seqüências de armação; e e/ou do grupo composto deseqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só I "diferença (s)aminoácida (s)" (conforme definido na presente) com uma deditas seqüências de armação (no qual qualquer substituiçãoaminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácidaconservadora; e/ou no qual os referidos a seqüênciaaminoácida preferivelmente contém substituições aminoácidase não mais do que 3 eliminações aminoácidas ou não mais doque 3 inserções aminoácidas).

Mais especialmente, a invenção refere-se ao nanocorpocontra vWF, no qual FR1 é SEQ ID n. 140; o FR2 é lo n. 192SEQ; o FR3 é SEQ ID 244; e o FR4 é SEQ ID n. 296.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a umpolipeptidio que compreende ou essencialmente se compõe depelo menos um nanocorpo contra vWF conforme definido napresente. Tais polipeptidios também são mencionados napresente como "os polipeptidios da invenção" e podem serconforme mais adiante descritos na presente e/ou comogeralmente descrito em WO 02/0 62551 para os nanocorposrevelados na presente, e, por exemplo, podem serpolipeptidios muitivalentes ou polipeptidiosmultiespecificos, novamente como mais adiante descrito napresente.

Preferivelmente, um polipeptidio da invenção ébivalente ou trivalente (isto é, compreensão de dois ou trêsnanocorpos da invenção, respectivamente, opcionalmenteligado via um ou dois linkers conforme definido na presente,respectivamente) ou um polipeptidio multiespecifico,compreendendo um ou dois, e preferivelmente dois, nanocorposda invenção e pelo menos um nanocorpo dirigido contra umaproteina de soro, e especialmente contra uma proteina desoro humana, como contra uma albumina de soro humano.

Em modalidades de execução preferenciais, mas não-restritivas, os nanocorpos da invenção presentes nospolipeptidios da invenção são escolhidos do grupo compostode SEQ ID NO!s: 60 para 73 e SEQ ID NO's: 86 para 97, eespecialmente "do humanizado"nanocorpos de lo NO' s SEQ 8 6 para 97 . Os nanocorpos

contra a albumina de soro humano presente nos polipeptidiosda invenção são preferivelmente como definidos na presente,e mais preferivelmente escolhidos do grupo composto de SEQID NO1 s: 107 para 121, e especialmente dos nanocorpos"humanizados" contra albumina de soro humana de SEQ ID NO's114-121.

Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos dospolipeptidios da invenção são os polipeptidios de SEQ IDNO's: 74 para 82 e os polipeptidios de SEQ ID N0!s 98106.

Outros polipeptidios da invenção, por exemplo, podem serescolhidos do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm mais de 80%, pref erivelmente mais de 90%, maispref erivelmente mais de 95%, como 99% ou mais "identidade deseqüência" (conforme definido na presente) com uma ou váriasdas seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's: 74 para 82 e/ouSEQ ID NO's 98 para 106, no qual os nanocorpos compreendidosdentro de ditas seqüências aminoácidas são preferivelmentecomo definidos na presente.

Segundo um aspecto da invenção, o nanocorpos, aproteína e os polipeptidios descritos na presente não têmessencialmente nenhuma influência na rachadura de ULvWF porADAMTS-13. Especialmente, quando o nanocorpos, a proteína eos polipeptidios descritos na presente são usados nas dosesdescritas na presente, a rachadura de ULvWF por ADAMTS-13(qualquer in vivo sobre a administração e/ou como medidoutilização de um ensaio conveniente, como o ensaio descritona presente), essencialmente não reduz ou inibe a rachadurade ULvWF por ADAMTS-13, isto é, em não mais de 50%,preferivelmente não mais de 20%, mesmo mais preferivelmentenão mais de 10%, como menos de 5% ou essencialmente de modonenhum). Portanto, um novo aspecto da invenção refere-se aonanocorpo, proteina ou polipeptidio, e especialmentenanocorpo, proteina ou polipeptidio conforme descrito napresente, isto essencialmente não reduz ou inibe a rachadurade ULvWF por ADAMTS-13.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um ácidonucléico que codifica nanocorpo da invenção e/ou umpolipeptidio da invenção. Um ácido tão nucléico também serãoreferidos abaixo como "um ácido nucléico da invenção" e, porexemplo, pode ser na forma de um construto genético,conforme definido na presente.

Em outro aspecto, a invenção refere-se à célulahospedeira ou hospedeira que expressa ou é capaz deexpressar nanocorpo da invenção e/ou um polipeptidio dainvenção; e/ou que contém um ácido nucléico que codificananocorpo da invenção e/ou apolipeptidio da invenção. Tal hospedeira ou uma célulahospedeira também podem ser análogos aos anfitriões eapresentar células descritas em WO 02/062551, masexpressando ou capazes de expressar nanocorpo da invençãoe/ou um polipeptidio da invenção e/ou conter um ácidonucleico conforme descrito na presente.

A invenção além disso refere-se a um produto oucomposição conter ou compreender do nanocorpo da invenção,um polipeptidio da invenção; e/ou um ácido nucleico dainvenção. Tal produto ou a composição, por exemplo, p.odemser uma composição farmacêutica (conforme descrito maisadiante) ou um produto ou a composição para uso diagnóstico(como também descrito mais adiante) . Tal produto ou acomposição também podem ser análogos aos produtos ecomposições descritas em WO 02/062551, mas conter oucompreender nanocorpo da invenção, um polipeptidio dainvenção ou um ácido nucleico da invenção.

A invenção além disso refere-se a métodos parapreparar ou gerar nanocorpos, polipeptidios, ácidosnucléicos, células hospedeiras, produtos e composições tãodescritas na presente, que métodos são conforme mais adiantedescritos mais adiante. Também, geralmente, o nanocorpos, ospolipeptidios, os ácidos nucléicos, as células hospedeiras,os produtos e as composições descritas na presente tambémpodem estar preparados e usados em uma maneira análoga àmaneira descrita em WO 02/062551.

A invenção além disso relaciona a aplicações e usos doacima mencionado nanocorpos, polipeptidios, ácidosnucléicos, células hospedeiras, produtos e composiçõesdescritas na presente, que as aplicações e os usos incluem,mas não são limitados a, as aplicações e os usos descreverama seguir e/ou os novos usos e aplicações para nanocorposcontra vWF e/ou para polipeptidios que contêm o mesmo em WO02/062551.

Descrição detalhada da invenção

Os aspectos acima mencionados e outros e modalidadesde execução da invenção ficarão claros da nova descrição aseguir, em que:

a) A menos que não indicado ou definido de outramaneira, todos os termos usados têm a sua significaçãohabitual na técnica, que será clara à pessoa experimentada.A referência, por exemplo, é feita aos manuais padrão, comoSambrook e al, "Molecular Cloning: um Laboratório

Manual" (2a Ed.), Vols. 1-3, a Cold Spring HarborLaboratory press (1989); F. Ausubel e al, editores.,"protocolos Atuais em biologia molecular", Green Publication& InterScience Wiley, Nova York (1987); Roitt et al.,"Immunology" (6o. Editor), Mosby/Elsevier, Edimburgo (2001);e Janeway et al., "Immunobiology" (6o ed.), Ciência deGrinalda Publishing/Churchill Livingstone, Nova York (2005),bem como a fundamentos técnicos gerais citada acima;

b) A menos queindicado de outra maneira, o termo "seqüência deimunoglobulina" - se ele usou na presente parareferir-se a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpode 4 cadeias convencional - é usado como um termo geral paraincluir tanto anticorpo de tamanho natural, o indivíduoencadeia disso, como todas as partes, dominios ou fragmentosdisso (inclusive, mas não limitado a, dominios de ligação deantigeno ou fragmentos como dominios VHH ou dominios VHNL,respectivamente). Além do mais, o termo "seqüência" comousado na presente (por exemplo, em termos como "seqüência deimunoglobulina", "a seqüência de anticorpo", "seqüência dedominio variável", "seqüência de VHH" ou "seqüência deproteína"), deve ser geralmente entendido para incluir tantoseqüência aminoácida relevante como seqüências ácidasnucléicas ou seqüências de nucleotideos que codificam omesmo, a menos que o contexto requeira uma interpretaçãomais limitada;

c) A menos que indicado de outra maneira, todos osmétodos, os passos, as técnicas e as manipulações que nãosão especificamente descritas detalhadamente podem serexecutados e foram executados em uma maneira conhecida porsi, como estará claro para a pessoa experimentada. Areferência, por exemplo, é novamente feita aos manuaispadrão, à fundamentos técnicos gerais mencionadaanteriormente e às novas referências citadas na presente;

d) Os resíduos de aminoácido serão indicados segundo o código aminoácido de três letras padrão ou de uma letra,como mencionado na Tabela 1;

Tabela 1: uma Código Aminoácido de 1 letra e trêsletras

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e) Para os objetivos de comparar duas ou maisseqüências de nucleotideos, a porcentagem "da identidade deseqüência" entre uma primeira seqüência de nucleotideos euma segunda seqüência de nucleotideos podem ser calculadosdividindo-se [o número de nucleotideos na primeira seqüênciade nucleotideos que são idênticos ao nucleotideos nasposições correspondentes na segunda seqüência denucleotideos] [pelo número total de nucleotideos na primeiraseqüência de nucleotideos] e multiplicando por [100%], nosquais cada eliminação, inserção, substituição ou adição deum nucleotideos na segunda seqüência de nucleotideos - emcomparação com a primeira seqüência de nucleotideos - sãoconsideradas como uma diferença em um nucleotideo único(posição). Alternativamente, o grau da identidade deseqüência entre duas ou mais seqüências de nucleotideos podeser calculado usando um algoritmo de computador conhecidopara alinhamento de seqüência como NCBI Blast v2 .0, usandoconfigurações padrão.

Algumas outras técnicas, algoritmos de computador econfigurações para determinar o grau da identidade deseqüência, por exemplo, são descritos em WO 04/037999, EP 0967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 ea GB 2357 768-A.

Normalmente, para o objetivo de determinar aporcentagem "da identidade de seqüência" entre duasseqüências de nucleotideos conforme o método de cálculodelineado mais acima, a seqüência de nucleotideos com onúmero maior de nucleotideos será tomada como "a primeira"seqüência de nucleotideos, e outra seqüência de nucleotideosserá tomada como "a segunda" seqüência de nucleotideos;

f) Para os objetivos de comparar duas ou maisseqüências aminoácidas, a porcentagem "da identidade deseqüência" entre uma primeira seqüência aminoácida e umasegunda seqüência aminoácida podem ser calculados dividindo-se [o número de resíduos aminoácidos na primeira seqüênciaaminoácida que são idênticos aos residuos aminoácidos nasposições correspondentes na segunda seqüência aminoácida][pelo número total de nucleotideos na primeira seqüênciaaminoácida] e multiplicando por [100%] , nos quais cadaeliminação, inserção, substituição ou adição de um resíduoaminoácido na segunda seqüência aminoácida - em comparaçãocom a primeira seqüência aminoácida - são consideradas comouma diferença em um residuo aminoácido único (posição), istoé, como uma "diferença aminoácida" conforme definido napresente. Alternativamente, o grau da identidade deseqüência entre duas seqüências aminoácidas pode sercalculado usando um algoritmo de computador conhecido, comoos acima mencionados para determinação do grau da identidadede seqüência para seqüências de nucleotideos, novamenteusando configurações padrão.

Normalmente, para o obj etivo de determinar aporcentagem "da identidade de seqüência" entre duasseqüências aminoácidas conforme o método de cálculodelineado mais acima, a seqüência aminoácida com o númeromaior de residuos aminoácidos será tomada como "a primeira"seqüência aminoácida, e outra seqüência aminoácida serátomada como "a segunda" seqüência aminoácida.

Também, na determinação do grau da identidade deseqüência entre duas seqüências aminoácidas, a pessoaexperimentada pode considerar assim chamadas substituiçõesaminoácidas "conservadoras", que podem ser geralmentedescritas como substituições aminoácidas nas quais umresiduo aminoácido é substituído com outro residuoaminoácido da estrutura quimica semelhante e que não tempouco ou essencialmente nenhuma influência na função,atividade ou outras propriedades biológicas do polipeptidio.Tais substituições aminoácidas conservadoras são bemconhecidas na técnica, por exemplo, de WO 04/037999, a GBuns 2357768, WO 98/49185, WO 00/46383 e WO 01/09300; e ostipos (preferidos) e/ou as combinações de tais substituiçõespodem ser selecionados com base nos ensinos pertinentes deWO 04/037999 bem como WO 98/49185 e das novas referênciascitadas na presente.

Tais substituições conservadoras preferivelmente sãosubstituições nas quais aminoácido dentro dos gruposseguintes (a) - (e) é substituído por outro resíduoaminoácido dentro do mesmo grupo: (a) pequeno alifático,resíduos não-polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr,Pro e Gly; (b) polar, resíduos negativamente carregados eHis (não carregado) amidas: Asp, Asn, Glu e Gln; (c) polar,resíduos positivamente carregados: His, Arg e Lys; (d)grande alifático, resíduos não-polares: Met, Leu, lie, Vai eCys; e resíduos aromáticos (e) : Phe, Tyr e Trp.

As substituições conservadoras em particularpreferenciais são como se segue: Ala em Gly ou em Ser; Argem Lys; Asn em Gln ou no Seu; Asp em Glu; Cys em Ser; Gln emAsn; Glu em Asp; Gly em Ala ou em Pro; His em Asn ou em Gln;lie em Leu ou em Vai; Leu em lie ou em Vai; Lys em Arg, emGln ou em Glu; Met em Leu, em Tyr ou em lie; Phe em Met, emLeu ou em Tyr; Ser em Thr; Thr em Ser; Trp em Tyr; Tyr emTrp; e/ou Phe em Vai, em lie ou em Leu.

Qualquer substituição aminoácida aplicada aospolipeptidios descritos na presente também pode ser baseadana análise das freqüências de variações aminoácidas entre aproteína homóloga da espécie diferente desenvolvida porSchulz et al., Princípios de Estrutura de Proteína,Springer-Verlag, 1978, nas análises de estrutura que formapotenciais desenvolvidos por Chou e Fasman, Bioquímica 13:211, 1974 e Adv. Enzymol., 47: 45149, 1978, e na análise demodelos hidrofobicidade em proteína desenvolvida porEisenberg et al., Proc. Louco. Acad Sei. Os EUA 81: 140-144,1984; Kyte e Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1,e Goldman et al., Ann. Chapman Biophys. Chem. 15: 321353,1986, todos incorporado na presente no seu conjunto porreferência. Informação na estrutura primária, secundária eterciária de nanocorpos dado na descrição mais adiante e natécnica de fundo geral citada anteriormente. Também, comesta finalidade, a estrutura cristalina de um domínio VHH deuma lhama, por exemplo, é dada por Desmyter et al., NaturezaBiologia Estrutural, volume 3, 9, 803 (1996); Spinelli etal. , Biologia Estrutural Natural (1996); 3, 7527 57; e

Decanniere et al., Estrutura, volume 7, 4, 361 (1999);

g) diz-se que seqüências de aminoácido e seqüênciasácidas nucléicas sejam "exatamente o mesmo" se eles tiverema identidade de seqüência de 100% (conforme definido napresente) por cima do seu comprimento inteiro;

h) comparando duas seqüências aminoacidas, o termo"diferença aminoácida" refere-se a uma inserção, eliminaçãoou substituição de um resíduo aminoácido único em umaposição da primeira seqüência, em comparação com a segundaseqüência; sendo entendido que duas seqüências aminoacidaspodem conter um, duas ou mais tais diferenças aminoacidas;i) considera-se que uma seqüência ácida nucléica ou aseqüência aminoácida é "em essencialmente isolado (forma)" -por exemplo, em comparação com a sua fonte biológica nativae/ou o meio de reação ou meio de cultivo do qual foi obtido- quando foi separado de pelo menos um outro componente como qual ele se associa normalmente em dita fonte ou meio,como outro ácido nucléico, outra proteina/polipeptidio,outro componente biológico ou macromolécula ou pelo menos umcontaminante, impureza ou componente menor. Especialmente,uma seqüência ácida nucléica ou a seqüência aminoácida sãoconsideradas "essencialmente isoladas" quando foi purificadopelo menos de 2 vezes, especialmente pelo menos lOfold, maisespecialmente pelo menos de 100 vezes, e até a 1000 vezes oumais. Uma seqüência ácida nucléica ou a seqüência aminoácidaque é "na forma essencialmente isolada" são preferivelmenteessencialmente homogêneas, como determinado utilização deuma técnica conveniente, como uma técnica cromatográficaconveniente, como poliacrilamida-geleletroforese;

j) O termo "domínio" como usado na presente geralmenterefere-se a uma região globular de uma cadeia de anticorpos,e especialmente a uma região globular de um anticorpo decadeia pesada, ou a um polipeptidio que essencialmente secompõe de tal região globular. Normalmente, tal domíniocompreenderá laços de peptideos (por exemplo, 3 ou 4 laçosde peptideos) estabilizado, por exemplo, como uma folha oupor ligações bissulfeto.

k) O termo "antigênico" determinante1 refere-se aoepitope no antigeno reconhecido pela molécula de ligação deantigeno (como um Nanobody ou um polipeptidio da invenção) emais especialmente pelo sitio de ligação de antigeno dareferida molécula. Os termos "antigênico determinante" e"epitope1 também podem ser usados de modo trocável napresente.

1) Uma seqüência aminoácida (como um Nanobody, umanticorpo, um polipeptidio da invenção, ou geralmente umproteina de ligação de antigeno ou polipeptidio ou umfragmento disso) que pode ligar a, que tem a afinidade parae/ou que tem a especificidade para diz-se que umdeterminante antigênico especifico, epitope, o antigeno ou aproteina (ou para pelo menos uma parte, fragmento ou epitopedisso) esteja "contra" ou "dirigido contra" ditodeterminante antigênico, epitope, antigeno ou proteina.

m) O termo "especificidade" refere-se ao número detipos diferentes de antigenos ou determinantes antigênicosaos quais uma determinada molécula de ligação de antigeno ouproteina de ligação de antigeno (como um Nanobody ou umpolipeptidio da invenção) a molécula pode ligar. Aespecificidade de uma proteina de ligação de antigeno podeser determinada baseada em afinidade e/ou avidez. Aafinidade, representada pelo equilíbrio constante para adissociação de um antigeno com uma proteina de ligação de antigeno (KD) , é uma medida para a força de ligação entre umdeterminante antigênico e um sitio de ligação de antigeno naproteina de ligação de antigeno: o menor o valor do KD, omais forte a força de ligação entre um determinanteantigênico e a molécula de ligação de antigeno(alternativamente, a afinidade também pode ser expressa comoa afinidade constante (KA), que é 1/KD). Como estará claropara a pessoa experimentada (por exemplo, com base na novarevelação na presente), a afinidade pode ser determinada emuma maneira conhecida por si, dependendo do antigenoespecifico do interesse, A avidez é a medida da força daligação entre uma molécula de ligação de antigeno (como umNanobody ou o polipeptidio da invenção) e o antigenopertinente. A avidez está relacionada tanto à afinidadeentre um determinante antigênico e sitio de ligação deantigeno na molécula de ligação de antigeno como ao númerode sitios de ligação presentes pertinente na molécula deligação de antigeno. Tipicamente, a proteína de ligação deantigeno (como os nanocorpos e/ou os polipeptidios dainvenção) ligará com uma dissociação constante (KD) de 10-5a 10-12 mol/litro (M) ou menos, e preferivelmente 10-7 a 10-12 mol/litro (M) ou menos e mais pref erivelmente 10-8 a 10-12 mol/litro, e/ou com uma associação constante (KA) de pelomenos 107 M_l, pref erivelmente pelo menos 108 M", maispreferivelmente pelo menos 109 M-l, como pelo menos 1012 m-1. Considera-se geralmente que qualquer valor de KD maior doque 10-4 M indica a ligação não-especifica. Preferivelmente,um Nanobody ou o polipeptidio da invenção ligarão aoantigeno desejado com um KD menos de 500 nM, preferivelmentemenos de 2 00 nM, mais pref erivelmente menos de 10 nM, comomenos de 500 da tarde. A ligação especifica de uma proteinaantigeno-ligante a um antigeno ou determinante antigênicopode ser determinada em qualquer maneira convenienteconhecida por si, inclusive, por exemplo, análise deScatchard e/ou ensaios de ligação competitivos, como rádio-inumoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA) e ensaiosde competição de sandwitch, e as variantes diferentes delesconhecidas per se na técnica, o n) conforme adicionalmentedescrito a seguir, a seqüência aminoácida e a estrutura deum Nanobody pode ser considerado - sem ser limitado contudoa isso - para ser compreendido de quatro regiões de armaçãoou "FR'S", que são referidos na técnica e a seguir como"região de Armação 1" ou " FR1"; como "região de Armação 2"ou " FR2"; como " região de Armação 3" ou " FRITO1 ; e como"região de Armação 4" ou "FR4", respectivamente; que regiõesde armação são interrompidas por três regiões dedeterminação complementares ou "CDR1s", que são referidos natécnica como "Região que Determina Complementaridade] "ou"CDRI"; como "Região que Determina Complementaridade 2" ou"CDR2"; e como "Região que Determina Complementaridade 3" ou"CDR3", respectivamente;

o) como também adicionalmente descrito a seguir, onúmero total de residuos aminoácidos em um Nanobody podeestar na região de 110-120, é preferivelmente 112-115, e émais preferivelmente 113. Deve contudo ser observado que aspartes, os fragmentos ou os análogos (conformeadicionalmente descrito a seguir) de um Nanobody não são emparticular limitados quanto ao seu comprimento e/ou tamanho,enquanto tais partes, os fragmentos ou os análogossatisfazem condições delineadas a seguir e são tambémpreferivelmente convenientes para os objetivos descritos napresente;

p) os residuos aminoácidos de um Nanobody sãonumerados segundo a numeração geral para dominios de VHdados por Kabat et al. ("A seqüência da proteína dointeresse imunológico", os Serviços de Saúde Pública dosEstados Unidos, NIH Bethesda, MD, Publicação n. 91) ,aplicado a dominios VHH de Camelideos no artigo de Riechmannè Muyldermans, mencionado anteriormente (ver, por exemplo, aFigura 2 da referida referência). Segundo esta numeração,FR1 de um Nanobody compreende os residuos aminoácidos nasposições 130, CDR1 de um Nanobody compreende os residuosaminoácidos nas posições 31-36, FR2 de um Nanobodycompreende os aminoácidos nas posições 36-49, CDR2 de umNanobody compreende os residuos aminoácidos nas posições 50-65, FR3 de um Nanobody compreende os residuos aminoácidosnas posições 66-94, CDR3 de um Nanobody compreende osresiduos aminoácidos nas posições 95-102, e FR4 de umNanobody compreende os residuos aminoácidos nas posições103-113. [Neste aspecto, deve ser observado que - como é bemconhecido na técnica para dominios de VH e para dominios deVHH - o número total de residuos aminoácidos em cada um doCDR1S pode variar e corresponder não ao número total deresiduos aminoácidos indicados pela numeração de Kabat (istoé, uma ou várias posições segundo a numeração de Kabat nãopodem ser ocupadas na seqüência real, ou a seqüência realpode conter mais residuos aminoácidos do que o número levadoem conta pela numeração de Kabat) . Isto significa que,geralmente, a numeração segundo Kabat podem ou nãocorresponder à numeração real dos resíduos aminoácidos naseqüência real. Geralmente, contudo, se pode dizer que,segundo a numeração de Kabat e independente do número deresíduos aminoácidos no CDR!S, a posição 1 segundo anumeração de Kabat corresponde ao início de FR1 e vistoversa, a posição 36 segundo a numeração de Kabat correspondeao início de FR2 e visto versa, a posição 66 segundo anumeração de Kabat corresponde ao início de FR3 e vistoversa, e a posição 103 segundo a numeração de Kabatcorresponde ao início de FR4 e visto versa.].

Os métodos alternativos para numeração dos resíduosaminoácidos de domínios VH, cujos métodos também podem seraplicados em uma maneira análoga a domínios VHH deCamelídeos e a nanocorpos, são o método descrito por Chothiaet al. (Nature 342, 877-883 (1989)), a assim chamada"definição de AbM" e a assim chamada "definição de contato".Contudo, na descrição presente, as reivindicações e asfiguras, a numeração segundo Kabat aplicada a domínios VHHpor Riechmann e Muyldermans serão seguidas, a menos queindicado de outra maneira; e

q) as Figuras, a Listagem de Seqüência e aParte/Exemplos Experimental só são dadas para ilustrar alémdisso a invenção e não devem ser interpretadas ou entendidascomo limitação do alcance da invenção e/ou dasreivindicações anexas de qualquer modo, a menos queexplicitamente indicado de outra maneira na presente.

Para uma descrição geral de anticorpos de cadeiaspesadas e domínios variáveis dos mesmos, a referência éentre outras coisas feita às referências seguintes, que sãomencionadas como fundamentos técnicos gerais: WO 94/04 678,WO 95/04079 e WO 96/34103 da Vrije Universiteit Brussel; WO94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 e WO 02/48193de Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO03/054016 e WO 03/055527 do Vlaams Instituut voorBiotechnologie (VIB); WO 03/050531 de Algonomics N.V. esolicitante; WO 01/90190 pelo National Research Council ofCanada; WO 03/025020 (= EP 1 433 793) pelo Institute ofAntibodies; bem como WO 04/041867, WO 04/041862, WO04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 pelo solicitante e osoutros pedidos de patentes pelo solicitante; Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8;Davies and Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21; 339(3): 285-90; Muyldermans et al., Protein Eng. 1994 Sep; 7(9): 1129-3;Davies and Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May; 13(5):475-9; Gharoudi et al., 9th Fórum of Applied Biotechnology,Med. Fac. Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a part I: 2097-2100; Davies and Riechmann, Protein Eng. 1996 Jun; 9(6):531-7; Desmyter et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9):803-11; Sheriff et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9):733-6; Spinelli et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9):752-7; Arbabi Ghahroudi et al., FEBS Lett. 1997 Sep 15;414(3): 521-6; Vu et al., Mol Immunol. 1997 Nov-Dec; 34(16-17): 1121-31; Atarhouch et al., Journal of Camel Practiceand Research 1997; 4: 177-182; Nguyen et al., J. Mol. Biol.

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Conforme acima mencionado, a invenção geralmenterefere-se aos nanocorpos dirigidos contra vWF, bem como apolipeptidios compreendendo ou essencialmente compostos deum ou vários de tais nanocorpos, que podem ser usados parafins profiláticos, terapêuticos e/ou diagnósticos descritosmais adiante e em WO 04/062551.

Conforme também acima mencionado e além disso descritomais adiante, a invenção além disso se refere aos ácidosnucleicos que codificam tais nanocorpos e polipeptidios, amétodos para preparar tais nanocorpos e polipeptidios,apresentar células que expressam ou são capazes de expressartais nanocorpos ou polipeptidios, a usos de tais nanocorpos,polipeptidios, ácidos nucleicos ou células hospedeiras, e acomposições que compreendem tais nanocorpos, polipeptidios,ácidos nucleicos ou células hospedeiras.

Geralmente, deve ser observado que o termo Nanobodycomo usado na presente no seu sentido mais amplo não élimitado a uma fonte biológica especifica ou a um métodoespecifico da preparação. Por exemplo, como será discutidomais detalhadamente mais adiante, os nanocorpos da invençãopodem ser obtidos (1) isolando o domínio VHH de um anticorpode cadeia pesada que ocorre naturalmente; (2) por expressãode uma seqüência de nucleotideos que codifica um dominio VHHde ocorrência natural; (3) "por humanização" (conformedescrito mais adiante) de um dominio VHH de ocorrêncianatural ou por expressão de um ácido nucleico que codificatal dominio VHH humanizado; (4) por "camelização" (conformedescrito mais adiante) de um dominio VH de ocorrêncianatural de qualquer espécie dos animais, especialmente umaespécie de mamifero, como de um ser humano, ou por expressãode um ácido nucleico que codifica tal dominio VHcamelizado; (5) por "camelização" "de um anticorpo dedominio" ou "Dab" como descrito por Ward e al (supra), oupela expressão de um ácido nucleico que codifica tal dominioVH camelizado; (6) técnicas sintéticas ou semi-sintéticasusam que para preparam proteina, polipeptidios ou outrasseqüências aminoácidas; (7) preparando um ácido nucleico quecodifica um Nanobody utilizando técnicas sintese ácida paranucléica, seguida por expressão do ácido nucleicoconseqüentemente obtido; e/ou (8) por qualquer combinação doprecedente. Os métodos convenientes e as técnicas paraexecutar o precedente serão claras para a pessoaexperimentada baseada na revelação na presente e, porexemplo, incluirão os métodos e técnicas descritas maisdetalhadamente a seguir.

Contudo, segundo uma modalidade de execuçãoespecifica, os nanocorpos da invenção não têm uma seqüênciaaminoácida que é exatamente o mesmo como (isto é, como umgrau de identidade de seqüência de 100% com) a seqüênciaaminoácida de um dominio VH de ocorrência natural, como aseqüência aminoácida de um dominio VH de ocorrência naturalde um mamifero, e especialmente de um ser humano.

Uma classe em particular preferencial de nanocorpos dainvenção compreende nanocorpos com uma seqüência aminoácidaque corresponde à seqüência aminoácida de um dominio VHH deocorrência natural, mas que foi "humanizado", isto é,substituindo um ou vários resíduos aminoácidos na seqüênciaaminoácida da referida seqüência VHH de ocorrência naturalpor um ou vários dos resíduos aminoácidos que ocorrem naposição(ões) correspondente em um dominio VH de um anticorpode 4 cadeias convencional de um ser humano (p. ex. indicadoanteriormente). Isto pode ser executado em uma maneiraconhecida por si, o que ficará claro para a pessoaexperimentada, por exemplo, com base na nova descrição maisadiante e a arte prévia na humanização mencionada napresente. Novamente, deve ser observado que tais nanocorposhumanizados da invenção podem ser obtidos em qualquermaneira conveniente conhecida por si (isto é, como indicadoconforme os pontos (1) - (8) acima) e, portanto não sãoestritamente limitados a polipeptidios que foram obtidosusando um polipeptidio que compreende um dominio VHH deocorrência natural como um material inicial.

Outra classe em particular preferencial de nanocorposda invenção compreende nanocorpos com uma seqüênciaaminoácida que corresponde à seqüência aminoácida de umdomínio VH de ocorrência natural que foi "camelizado", istoé, substituindo um ou vários resíduos aminoácidos naseqüência aminoácida de um domínio VH de ocorrência naturalde um anticorpo de 4 cadeias convencional por um ou váriosdos resíduos aminoácidos que ocorrem na posição(ões)correspondente em um domínio VHH de um anticorpo de cadeiapesada. Isto pode ser executado em uma maneira conhecida porsi, o que ficará claro para a pessoa experimentada, porexemplo, com base na nova descrição mais adiante. Areferência também é feita a WO 94/04678. Tal camelizaçãopode ocorrer preferencialmente nas posições aminoácidas queestão presentes na interface VH-VL e nos assim chamadosresíduos de Hallmark Carnelidae (ver, por exemplo, também WO94/04678), como também mencionado mais adiante.Preferivelmente, o domínio VH ou a seqüência que é usadacomo um material inicial ou ponto de partida que para geraou e projeta o Nanobody camelizado é preferivelmente umaseqüência VH de um mamífero, mais preferivelmente aseqüência VH de um ser humano. Contudo, deve ser observadoque tais nanocorpos carnelizados da invenção podem serobtidos em qualquer maneira conveniente conhecida por si(isto é, como indicado conforme os pontos (1) - (8) acima) eportanto não são estritamente limitados a polipeptidios queforam obtidos usando um polipeptidio que compreende umdomínio VH de ocorrência natural como um material inicial.

Por exemplo, novamente conforme adicionalmentedescrito mais adiante, tanto "humanização" como"camelização" pode ser executado fornecendo uma seqüência denucleotideos que codifica uma tal dominio VHH ou domínio VHque ocorrem naturalmente, respectivamente, e logomodificação, em uma maneira conhecida por si, um ou várioscodons na seqüência de nucleotideos tal que a nova seqüênciade nucleotideos codifica um Nanobody humanizado oucamelizado da invenção, respectivamente, e logo expressandoa seqüência de nucleotideos portanto obtida em uma maneiraconhecida por si para fornecer o Nanobody desej ado dainvenção. Alternativamente, baseado na seqüência aminoácidade um dominio VHH de ocorrência natural ou o dominio VH,respectivamente, a seqüência aminoácida do desejado Nanobodyhumanizado ou camelizado da invenção, respectivamente, podemser projetados e logo sintetizados de novo utilizandotécnicas para sintese de peptideo conhecida por si. Também,baseado na seqüência aminoácida ou a seqüência denucleotideos de um dominio VHH de ocorrência natural ou odominio VH, respectivamente, uma seqüência de nucleotideosque codifica o desejado Nanobody humanizado ou camelizado dainvenção, respectivamente, podem ser projetados e logosintetizados de novo utilizando técnicas sintese ácida paranucléica conhecida por si, depois o qual a seqüência denucleotideos portanto obtida pode ser expressa em umamaneira conhecida por si para fornecer o Nanobody desejadoda invenção.

Outros caminhos convenientes e técnicas para obternanocorpos da invenção e/ou seqüências de nucleotideos e/ouácidos nucléicos que codificam o mesmo, que começa (daseqüência aminoácida de) dominios VH que ocorremnaturalmente ou preferivelmente os domínios de VHH e/ou deseqüências de nucleotideos e/ou seqüências ácidas nucléicasque codificam o mesmo serão claros para a pessoaexperimentada, e pode, por exemplo, compreendendo combinaruma ou várias seqüências aminoácidas e/ou seqüências denucleotideos de domínios VH que ocorrem naturalmente (comoum ou vários FR' S e/ou CDR1 s) com uma ou várias uma ouvárias seqüências aminoácidas e/ou seqüências denucleotideos de domínios VHH que ocorrem naturalmente (umou vários FR' S ou CDR1 s) , em uma maneira conveniente parafornecer (uma seqüência de nucleotideos ou codificação deácido nucléica) um Nanobody da invenção.

Segundo um aspecto preferencial, mas não-restritivo doaspecto da invenção, um Nanobody no seu sentido mais amplopode ser geralmente definido como um polipeptidiocompreendendo:

a) uma seqüência aminoácida que é compreendida dequatro regiões/seqüências de armação interrompidas por trêsregiões/seqüências que determinam complementaridade, nasquais o residuo aminoácido na posição 108 segundo anumeração de Kabat é Q; e/ou:

b) uma seqüência aminoácida que é compreendida dequatro regiões/seqüências de armação interrompidas por trêsregiões/seqüências que determinam complementaridade, nasquais o residuo aminoácido na posição 44 segundo a numeraçãode Kabat é E e no qual o residuo aminoácido na posição 45segundo a numeração de Kabat é um R;e/ou:

c) uma seqüência aminoácida que é compreendida dequatro regiões/seqüências de armação interrompidas por trêsregiões/seqüências que determinam complementaridade, nasquais o resíduo aminoácido na posição 103 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de P, ReS, e é especialmente escolhido do grupo composto de R e S.

Portanto, em um primeiro aspecto preferido, mas não-restritivo, um Nanobody da invenção pode ter a estrutura

FR1-CDRI - FR2 - CDR2 - FR3-CDR3-FR4

no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a4, respectivamente, e em que CDR a CDR3 me refiro à regiõesque determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, eem que

i) o resíduo aminoácido na posição 108 segundo anumeração de Kabat é Q; e/ou em que:

ii) o residuo aminoácido na posição 44 segundo anumeração de Kabat é E e no qual o residuo aminoácido naposição 45 segundo a numeração de Kabat é um R;

e/ou em que:

iii) o residuo aminoácido na posição 103 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de P, ReS, e especialmente escolhido do grupo composto de Re S;e em que:

iv) O CDR 1 é uma seqüência aminoácida que éescolhida do grupo composto das seqüências aminoácidasseguintes:

NYGMG [SEQ ID NO: 15] SYTLG [SEQ ID NO: 16] NYNMG [SEQID NO: 17] SSAMA [SEQ ID NO: 18] YYNTG [SEQ ID NO: 19] IGAMG[SEQ ID NO: 20] IGTMG [SEQ ID NO: 21]YNPMG [SEQ ID NO: 22]

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 2 ou só I "diferença (s) aminoácida (s)" (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoacidas, em comparação com as seqüência(s)aminoacida(s) acima mencionadas;e em que:

v) 0 CDR 2 é uma seqüência aminoacida que éescolhida do grupo composto das seqüências aminoácidasseguintes:

SISWSGTYTAYSDNVKG [SEQ ID n. 23] GISWSGVST DYAE FAKG[SEQ ID n. 24] TSISWSGSYTAYADNVKG [SEQ ID n. 25]SISWSGMSTYYTDSVKG [SEQ ID n. 26] TITSGGRTSYADSVKG [SEQ ID n.27] AISWSGGLTYYADSVKG [SEQ lo n. 28] TITSGGSTNYADPVKG [SEQID n. 29] TITSGGSTNYADSVKG [SEQ ID n. 30] AISRTGGSTYYARSVEG[SEQ ID n. 31] AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ lo n. 32]ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das seqüências aminoácidas acimamencionadas; em que

(1) qualquer substituição aminoacida é preferivelmenteuma substituição aminoacida conservadora (conforme definido

na presente); e/ou

(2) a referida seqüência aminoacida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoacida(s) acima mencionadas;

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só I "diferença(s) aminoacida(s)" (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

e em que :

vi) O CDR 3 é uma seqüência aminoácida que éescolhida do grupo composto das seqüências aminoácidasseguintes:

QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID n. 33] LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQID n. 34] QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQ ID n. 35] SNRYRTHTTQAMYNY[SEQ ID n. 36] VVDGKRAP [SEQ ID n. 37] NRRQKTVQMGERAYDY [SEQID n. 38] NLKQGSYGYRFNDY [SEQ ID n. 39] NLKQGDYGYRFNDY [SEQID n. 40] AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ lo n. 41]AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID n. 42] AGVRAEDGRVRSLPSEYTF[SEQ ID n. 43]

(2) a referida seqüência aminoácida pref erivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas.

Preferivelmente, nos nanocorpos da invenção:quando CDR1 é escolhido do grupo composto (de 1)NYGMG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 2 ou só I "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida;então o CDR2 é escolhido do grupo composto (de 1)SISWSGTYTAYSDNVKG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelomenos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida (s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e o CDR3 é escolhido do grupocomposto (de 1) QSRYRSNYYDHDDKYAY; (2) as seqüências deaminoácido que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só1 "diferença (s) aminoácida(s)" (conforme definido napresente) com a referida seqüência aminoácida; quando CDR1 éescolhido do grupo composto (de 1) SYTLG; (2) seqüênciasaminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 2 ou só 1"diferença (s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente)com a referida seqüência aminoácida; então o CDR2 éescolhido do grupo composto (de 1) GISWSGVSTDYAEFAKG; (2) asseqüências de aminoácido que têm pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida; eo CDR3 é escolhido do grupo composto (de 1)LGRYRSNWRNIGQYDY; (2) seqüências aminoácidas que têm pelomenos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida (s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; quando CDR1 é escolhido dogrupo composto (de 1) NYGMG; (2) as seqüências de aminoácidoque têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; então o CDR2 é escolhido dogrupo composto (de 1) TSISWSGSYTAYADNVKG; (2) seqüênciasaminoácidas que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou sóI "diferença (s) aminoácida(s) " (conforme definido napresente) com a referida seqüência aminoácida; e o CDR3 éescolhido do grupo composto (de 1) QSRYSSNYYDHDDKYAY; (2) asseqüências de aminoácido que têm pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida;quando CDR1 é escolhido do grupo composto (de 1) NYNMG; (2)seqüências aminoácidas que têm pelo menos 8 0%,pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida;então o CDR2 é escolhido do grupo composto (de 1)SISWSGMSTYYTDSVKG; (2) as seqüências de aminoácido que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida (s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e o CDR3 é escolhido do grupocomposto (de 1) SNRYRTHTTQAMYNY; (2) seqüências aminoácidasque têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só I "diferença (s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; quando CDR1 é escolhido dogrupo composto (de 1) SSAMA; (2) as seqüências de aminoácidoque têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; então o CDR2 é escolhido dogrupo composto (de 1) TITSGGRTSYADSVKG; (2) seqüênciasaminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelomenos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só1 "diferença (s) aminoácida(s)" (conforme definido napresente) com a referida seqüência aminoácida; e o CDR3 éescolhido do grupo composto (de 1)

VVDGKRAP; (2) seqüências aminoácidas que têm pelomenos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 2 ou só 1 "diferença(s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida;

quando CDR1 é escolhido do grupo composto (de 1)YYNTG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelo menos 8 0%,pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida;então o CDR2 é escolhido do grupo composto (de 1)AISWSGGLTYYADSVKG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelomenos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e o CDR3 é escolhido do grupocomposto (de 1) eNRRQKTVQMGERAYDY; (2) as seqüências deaminoácido que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido napresente) com a referida seqüência aminoácida;

- quando CDR1 é escolhido do grupo composto (de 1)IGAMG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida;então o CDR2 é escolhido do grupo composto (de 1)TITSGGSTNYADPVKG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelomenos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só I "diferença (s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e o CDR3 é escolhido do grupocomposto (de 1) NLKQGSYGYRFNDY; (2) as seqüências deaminoácido que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 2 ou só 1"diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente)com a referida seqüência aminoácida;

- quando CDRl é escolhido do grupo composto (de 1)IGAMG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%,pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s)" (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida;então o CDR2 é escolhido do grupo composto (de 1)TITSGGSTNYADSVKG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelomenos 8 0%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispref erivelmente pelo menos 95%, mesmo mais pref erivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida(s) " (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e o CDR3 é escolhido do grupocomposto (de 1) NLKQGSYGYRFNDY; (2) as seqüências deaminoácido que têm pelo menos 8 0%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só1 "diferença (s) aminoácida(s)" (conforme definido napresente) com a referida seqüência aminoácida;

- quando CDR1 é escolhido do grupo composto (de 1)IGAMG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 2 ou só I "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida;então o CDR2 é escolhido do grupo composto (de 1)TITSGGSTNYADSVKG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelomenos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e o CDR3 é escolhido do grupocomposto (de 1) NLKQGDYGYRFNDY; (2) as seqüências deaminoácido que têm pelo menos 8 0%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só1 "diferença (s) aminoácida(s)" (conforme definido napresente) com a referida seqüência aminoácida; quando CDR1 éescolhido do grupo composto (de 1) IGTMG; (2) seqüênciasaminoácidas que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 2 ou só 1"diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente)com a referida seqüência aminoácida; então o CDR2 éescolhido do grupo composto (de 1) TITSGGSTNYADSVKG; (2) asseqüências de aminoácido que têm pelo menos 8 0%,pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s) " (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida; eo CDR3 é escolhido do grupo composto (de 1) NLKQGDYGYRFNDY;(2) seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida;

quando CDR1 é escolhido do grupo composto (de 1)YNPMG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelo menos 8 0%,pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s)" (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida;então o CDR2 é escolhido do grupo composto (de 1)AISRTGGSTYYARSVEG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelomenos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e o CDR3 é escolhido do grupocomposto (de 1) AGVRAEDGRVRTLPSEYNF; (2 ) as seqüências deaminoácido que têm pelo menos 8 0%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispref erivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido napresente) com a referida seqüência aminoácida; quando CDR1 éescolhido do grupo composto (de 1) YNPMG; (2) seqüênciasaminoácidas que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispref erivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 2 ou só I"diferença (s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente)com a referida seqüência aminoácida; então o CDR2 éescolhido do grupo composto (de 1) AISRTGGSTYYPDSVEG; (2) asseqüências de aminoácido que têm pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida; eo CDR3 é escolhido do grupo composto (de 1)AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; (2) seqüências aminoácidas que têm pelomenos 8 0%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só I "diferença (s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida;

- quando CDR1 é escolhido do grupo composto (de 1)YNPMG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelo menos 8 0%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e (3) seqüências aminoácidasque têm 2 ou só I "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com a referida seqüência aminoácida;então o CDR2 é escolhido do grupo composto (de 1)AISRTGGSTYYPDSVEG; (2) seqüências aminoácidas que têm pelomenos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a referida seqüência aminoácida; e (3)seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s)aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com areferida seqüência aminoácida; e o CDR3 é escolhido do grupocomposto (de 1) AGVRAEDGRVRSLPSEYTF; (2) as seqüências deaminoácido que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com a referida seqüênciaaminoácida; e (3) seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só1 "diferença(s) aminoácida(s) " (conforme definido napresente) com a referida seqüência aminoácida; no qual (1)qualquer substituição aminoácida é preferivelmente umasubstituição aminoácida conservadora (conforme definido napresente); e/ou

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida (s) acima mencionadas.

Especialmente, um Nanobody contra vWF segundo ainvenção pode ter a estrutura:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação I a4, respectivamente, e no qual CDR1 a CDR3 se referem àregiões que determinam complementaridade 1 a 3,respectivamente, e em que

i) o residuo aminoácido na posição 108 segundo anumeração de Kabat é Q; e/ou em que:

ii) o residuo aminoácido na posição 44 segundo anumeração de Kabat é E e no qual o residuo aminoácido naposição 45 segundo a numeração de Kabat é um R;e/ou em que:

iii) o residuo aminoácido na posição 103 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de P, R eS, e especialmente escolhido do grupo composto de R e S;e em que:

NYGMG [SEQ ID n. 15] SYTLG [SEQ lo n. 16] NYNMG [SEQID n. 17] SSAMA [SEQ ID n. 18] YYNTG [SEQ ID n. 19] IGAMG[SEQ ID n. 20] IGTMG [SEQ ID n. 21] YNPMG [SEQ ID n. 22]

e em que:

v) O CDR 2 é uma seqüência aminoácida que éescolhida do grupo composto das seqüências aminoácidasseguintes:

SISWSGTYTAYSDNVKG [SEQ ID n. 23] GISWSGVSTDYAEFAKG[SEQ ID n. 24] TSISWSGSYTAYADNVKG [SEQ ID n. 25]SISWSGMSTYYTDSVKG [SEQ ID n. 2 6] TITSGGRTSYADSVKG [SEQ ID n.27] AISWSGGLTYYADSVKG [SEQ ID n. 28] TITSGGSTNYADPVKG [SEQID n. 29] TITSGGSTNYADSVKG [SEQ ID n. 30] AISRTGGSTYYARSVEG[SEQ ID n. 31] AISRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID n. 32]

e em que:

QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID n. 33]LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQ ID n. 34] QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQID n. 35] SNRYRTHTTQAMYNY [SEQ ID n. 36] VVDGKRAP [SEQ ID n.37] NRRQKTVQMGERAYDY [SEQ ID n. 38] NLKQGSYGYRFNDY [SEQ IDn. 39] NLKQGDYGYRFNDY [SEQ ID n. 40] AGVRAEDGRVRTLPSEYNF[SEQ ID n. 41] AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID n. 42] AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID n. 43] Pref erivelmente, nosnanocorpos da invenção segundo o último aspecto:

Quando CDR1 is:NYGMG; então CDR2is:SISWSGTYTAYSDNVKG; e CDR3 is:QSRYRSNYYDHDDKYAY

Quando CDR1 is:SYTLG; então CDR2 is:GISWSGVSTDYAEFAKG;e CDR3 is:LGRYRSNWRNIGQYDY

Quando CDR1 is:NYGMG; então CDR2is:TSISWSGSYTAYADNVKG; e CDR3 is:QSRYSSNYYDHDDKYAY

Quando CDR1 is:NYNMG; então CDR2is:SISWSGMSTYYTDSVKG; e CDR3 is:SNRYRTHTTQAMYNY

Quando CDR1 is:SSAMA; então CDR2 is:TITSGGRTSYADSVKG;e CDR3 is:VVDGKRAP

Quando CDRI is:YYNTG; então CDR2 is:AISWSGGLTYYADSVKG;e CDR3 is:NRRQKTVQMGERAYDY

Quando CDRI is:IGAMG; então CDR2 is:TITSGGSTNYADPVKG;e CDR3 is:NLKQGSYGYRFNDY

Quando CDRI is:IGAMG; então CDR2 is:TITSGGSTNYADSVKG;e CDR3 is:NLKQGSYGYRFNDY

Quando CDRI is:IGAMG; então CDR2 is :TITSGGSTNYADSVKG;e CDR3 is:NLKQGDYGYRFNDY

Quando CDRI is:IGTMG; então CDR2 é: TITSGGSTNYADSVKG;è CDR3 is:NLKQGDYGYRFNDY

Quando CDRI isrYNPMG; então CDR2 is:AISRTGGSTYYARSVEG;e CDR3 is:AGVRAEDGRVRTLPSEYNF

Quando CDRI is:YNPMG; CDR2:AISRTGGSTYYPDSVEG; eCDR3 is:AGVRAEDGRVRTLPSEYTF

Quando CDRI is:YNPMG; então CDR2 is:AISRTGGSTYYPDSVEG;e CDR3 is:AGVRAEDGRVRSLPSEYTF

Especialmente, segundo um aspecto preferencial, masnão-restritivo do aspecto da invenção, um Nanobody pode sergeralmente definido como um polipeptidio que compreende umaseqüência aminoácida que é compreendida de quatroregiões/seqüências de armação interrompidas por trêsregiões/seqüências que determinam complementaridade, em que;

o a-1) o residuo aminoácido na posição 44 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de G, E, D,G, Q, R, S, L; e é pref erivelmente escolhido do grupocomposto de G, E ou Q; e

o a-2) o residuo aminoácido na posição 45 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de L, R ouC; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de L ouR; e

o a-3) o resíduo aminoácido na posição 103 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de W, R ouS; e é pref erivelmente W ou R, e é mais pref erivelmente W;

o a-4) o residuo aminoácido na posição 108 segundo anumeração de Kabat é Q; ou em que:

o b-1) o residuo aminoácido na posição 44 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de E e Q; e

o b-2) o residuo aminoácido na posição 45 segundo anumeração de Kabat é R; e

o b-3) o residuo aminoácido na posição 103 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de W, ReS; e é preferivelmente W;

o b-4) o residuo aminoácido na posição 108 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de Q e L; eé preferivelmente Q; ou em que:

o c-1) o residuo aminoácido na posição 44 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de G, E, D,Q, R, S e L; e é pref erivelmente escolhido do grupo compostode G, E e Q; e

o c-2) o residuo aminoácido na posição 45 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de L, ReC; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de L e R; e

o c-3) o residuo aminoácido na posição 103 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de P, ReS; e é especialmente escolhido do grupo composto de R e S; e

o c-4) o residuo aminoácido na posição 108 segundo anumeração de Kabat é

escolhido do grupo composto de Q e L; épreferivelmente Q.

Portanto, num outro aspecto preferido, mas não-restritivo, um Nanobody da invenção pode ter a estrutura

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3-CDR3-FR4

no qual FRI a FR4 se referem a regiões de armação 1 a4,respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem àregiões que determinam complementaridade 1 a 3,respectivamente, e em que:

i) o residuo aminoácido na posição 44 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de G, E, D,G, Q, R, S, L; e é pref erivelmente escolhido do grupocomposto de G, E ou Q;e em que:

o ii) o residuo aminoácido na posição 45 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de L, R ouC; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de L ouR;

e em que:

o iii) o residuo aminoácido na posição 103 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de W, R ouS; e é preferivelmente W ou R, e é mais preferivelmente W;e em queiv) o resíduo aminoacido na posição 108 segundoa numeração de Kabat é Q; e em que:

v) O CDRI, CDR2 e CDR3 são tão definidos napresente, e preferivelmente conforme definidos segundo umadas definições preferenciais acima, e mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima, num outro aspecto preferido, mas não-restritivo, um Nanobody da invenção podetenha a estrutura

FR1 - CDRI - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação I a4, respectivamente, e no qual CDRI a CDR3 se referem àregiões que determinam complementaridade I a 3,respectivamente, e em que:

i) o resíduo aminoacido na posição 44 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de E e Q;

e em que:

ii) o resíduo aminoacido na posição 45 segundo anumeração de Kabat é R; e em que:

iii) o resíduo aminoacido na posição 103 segundoa numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de W, ReS; e é preferivelmente W;

e em que:

iv) o resíduo aminoacido na posição 108 segundoa numeração de Kabat é Q;e em que:vi) O CDRI, CDR2 e CDR3 são tão definidos napresente, e preferivelmente conforme definidos segundo umadas definições preferenciais acima, e mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima.

No outro aspecto preferido, mas não-restritivo, umNanobody da invenção pode ter a estrutura

FR1 - CDRI - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a4, respectivamente, e no qual CDRI a CDR3 se referem àregiões que determinam complementaridade 1 a 3,respectivamente, e em que:

i) o residuo aminoácido na posição 44 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de G, E, D,Q, R, S e L; e é preferivelmente escolhido do grupo compostode G, E e Q;

e em que:

o ii) o residuo aminoácido na posição 45 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de L, ReC; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de L e R;e em que:

o iii) o residuo aminoácido na posição 103 segundo anumeração de Kabat é escolhido do grupo composto de P, ReS; e é especialmente escolhido do grupo composto de Re S;e em que:

iv) o residuo aminoácido na posição 108 segundoa numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de Q e L;é preferivelmente Q; e em que:

v) 0 CDR1, CDR2 e CDR3 são tão definidos na presente,e preferivelmente conforme definidos segundo uma dasdefinições preferenciais acima, e mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima.

Dois grupos em particular preferidos, mas não-restritivos dos nanocorpos da invenção são aqueles segundo oa) acima; segundo o a-1) a a-4) acima; -segundo o b)

em cima; segundo o b-1) a b-4) acima; segundo o c)acima; e/ou segundo o c-1) a

c-4) acima, em que;

a) os resíduos aminoácidos nas posições 44-47 segundoa numeração de Kabat formam a seqüência GLEW (ou umaseqüência semelhante a GLEW conforme definido na presente) eo residuo aminoácido na posição 108 é Q;ou em que:

b) os resíduos aminoácidos nas posições 43-46 segundoa numeração de Kabat formam a seqüência KERE ou KQRE (ou umaseqüência semelhante a KERE) e o residuo aminoácido naposição 108 é Q ou L, e é preferivelmente Q.

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a4, respectivamente, e no qual CDR1 a CDR3 se referem àregiões que determinam complementaridade I a 3,respectivamente, e em que:

i) os residuos aminoácidos nas posições 44-47 segundoa numeração de Kabat formam a seqüência GLEW (ou umaseqüência semelhante a GLEW conforme definido na presente) eo resíduo aminoácido na posição 108 é Q;e em que:

ii) CDRI, CDR2 e CDR3 são tão definidos na presente, epreferivelmente conforme definidos segundo uma dasdefinições preferenciais acima, e mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima.

FR1 - CDR I - FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

i) os residuos aminoácidos nas posições 43-4 6 segundoa numeração de Kabat formam a seqüência KERE ou KQRE (ou umaseqüência semelhante a KERE) e o residuo aminoácido naposição 108 é Q ou L, e é preferivelmente Q;

e em que:

ii) O CDRI, CDR2 e CDR3 são tão definidos napresente, e preferivelmente conforme definidos segundo umadas definições preferenciais acima, e mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima.

Nos nanocorpos da invenção na qual os resíduosaminoácidos nas posições 43-46 segundo a numeração de Kabatformam a seqüência KERE ou KQRE, o residuo aminoácido naposição 37 é o mais pref erivelmente F. nos nanocorpos dainvenção na qual os resíduos aminoácidos nas posições 44-47segundo a numeração de Kabat formam a seqüência GLEW, oresiduo aminoácido na posição 37 é escolhido do grupocomposto de Y, H, I, V ou F, e é mais pref erivelmente F.

Portanto, sem ser limitado a isto de qualquer modo,com base nos resíduos aminoácidos presentes nas posiçõesacima mencionadas, os nanocorpos da invenção podem sergeralmente classificados com base nos três grupos seguintes:

a) "O GLEW-grupo": nanocorpos com a seqüênciaaminoácida GLEW nas posições 44-47 segundo a numeração deKabat e Q na posição 108 segundo a numeração de Kabat.

Conforme mais adiante descrito na presente, nanocorposdentro deste grupo normalmente têm um V na posição 37, epodem ter um W, P, R ou S na posição 103, e pref erivelmenteter um W na posição 103. 0 grupo GLEW também compreendealgumas seqüências semelhantes a GLEW como as mencionadas naTabela 2 mais adiante;

b) "O Grupo KERE": nanocorpos com a seqüênciaaminoácida KERE ou KQRE ou nas posições 43-46 segundo anumeração de Kabat e Q ou L na posição 108 segundo anumeração de Kabat- Conforme mais adiante descrito napresente, nanocorpos dentro deste grupo normalmente têm um Fna posição 37, um L ou F na posição 47; e podem ter um W, P,R ou S na posição 103, e preferivelmente ter um W na posição 103;

c) "Os 103 P, R, S-grupo": nanocorpos com um P R ou Sna posição 103. Esses nanocorpos podem ter seqüênciaaminoácida GLEW nas posições 4 4-47 da numeração de Kabat oua seqüência aminoácida KERE ou KQRE nas posições 43-46segundo a numeração de Kabat, o último mais preferivelmenteem combinação com um F na posição 37 e umL ou umFnaposição 47 (conforme definido para o Grupo KERE); e podemter Q ou L na posição 108 segundo a numeração de Kabat, epreferivelmente ter Q.

Portanto, num outro aspecto preferido, mas não-restritivo, um Nanobody da invenção pode ser um Nanobody quepertence ao GLEW-grupo (conforme definido na presente), e noqual CDR 1, CDR2 e CDR3 são tão definidos na presente, epreferivelmente conforme definidos segundo uma dasdefinições preferenciais acima, e mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima.

No outro aspecto preferido, mas não-restritivo, umNanobody da invenção pode ser um Nanobody que pertence áoGrupo KERE (conforme definido na presente), e no qual CDR1,CDR2 e CDR3 são tão definidos na presente, e preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições preferenciaisacima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo umadas definições mais preferenciais acima.

Portanto, num outro aspecto preferido, mas não-restritivo, um Nanobody da invenção pode ser um Nanobody quepertence aos 103 P, R, S-grupo (conforme definido napresente), e no qual CDR1, CDR2 e CDR3 são tão definidos napresente, e preferivelmente conforme definidos segundo umadas definições preferenciais acima, e mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima.

Também, mais geralmente e além dos resíduos 108Q,43E/44R e 103P, R, S acima mencionados, os nanocorpos dainvenção pode conter, em uma ou várias posições que, em umdomínio VH convencional, formariam (parte de) a interfaceVH/VL, conteriam um ou vários resíduos aminoácidos que sãomais altamente carregados do que os resíduos aminoácidos queocorrem naturalmente na mesma posição(ões) no domínio VH ouVHH que ocorre naturalmente, e especialmente um ou váriosresíduos aminoácidos carregados (como mencionado na Tabela D.

Tais substituições incluem, mas não são limitadas àsseqüências Semelhantes a GLEW mencionadas na Tabela 2 maisadiante; bem como as substituições que são descritas naSolicitação Internacional WO 00/29004 para assim chamados"microcorpos", p. ex. um Q na posição 108 e KLEW nasposições 44-47.Nos nanocorpos da invenção, o residuo aminoácido naposição 83 é escolhido do grupo composto de L, M, S, V e W;e é preferivelmente L.

Também, nos nanocorpos da invenção, o residuoaminoácido na posição 83 é escolhido do grupo composto de R,K, N, E, I e Q; e é mais pref erivelmente K ou E (parananocorpos correspondentes a dominios VHH que ocorremnaturalmente) ou R (para nanocorpos "humanizados", conformedescrito mais adiante). 0 residuo aminoácido na posição 84 éescolhido do grupo composto de P, A, R, S, D e V, e é maispreferivelmente P (para nanocorpos correspondentes adominios VHH que ocorrem naturalmente) ou R (para nanocorpos"humanizados", conforme descrito mais adiante).

Além disso, nos nanocorpos da invenção, o residuoaminoácido na posição 104 é escolhido do grupo composto de Ge D; e é mais preferivelmente G.

Coletivamente, os residuos aminoácidos nas posições11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 e 108, cujos nanocorpossão acima mencionados, também serão mencionados na presentecomo "os Residuos de Hallmark'1. Os Residuos de Hallmark e osresiduos aminoácidos nas posições correspondentes do dominioVH humano o mais estreitamente relacionado, VH3, sãoresumidos na Tabela 2.

Algumas combinações especialmente preferenciais dessesResiduos de Hallmark como ocorrem em dominios VHH queocorrem naturalmente são mencionados na Tabela 3. Para acomparação, os correspondentes residuos aminoácidos do VH3humano chamado DP-47 foi indicada no itálico.

Tabela 2: Resíduos de Hallmark em nanocorpos

<table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 102</column></row><table>

Notas:

(1): Especialmente, mas não exclusivamente, emcombinação com KERE ou KQRE nas posições 4346.

(2): Normalmente como GLEW nas posições 44-47.

(3) : Normalmente como KERE ou KQRE nas posições 43-46,p. ex. como KEREL, KEREF, KQREL, KQREF ou KEREG nas posições43-47. Alternativamente, também as seqüências como TERE (porexemplo, TEREL), KECE (por exemplo, KECEL ou KECER), RE RE(por exemplo, REREG) , QERE (por exemplo, QEREG) , KGRE (porexemplo, KGREG), KDRE (por exemplo, KDREV) são possíveis.Alguns outras seqüências possíveis, mas menos preferenciaisincluem, por exemplo, DECKL e NVCEL.

(4) : Tanto com GLEW nas posições 44-47 como comKERE ou KQRE nas posições 43-46.

(5) : Freqüentemente como KP ou EP nas posições83-84 de dominios VHH que ocorrem naturalmente.

(6) : Especialmente, mas não exclusivamente, emcombinação com GLEW nas posições 44-47.

(7) : Com a prescrição que quando as posições 44-47 são GLEW, a posição 108 seja sempre Q.(8) : O grupo GLEW também contém GLEW-como

seqüências nas posições 44-47, como para

exemplo GVEW, EPEW, GLER, DQEW, DLEW, GIEW, ELEW,GPEW, EWLP,

GPER, GLER e ELEW.

Tabela 3: Algumas combinações preferenciais deResíduos de Hallmark em nanocorpos que ocorrem naturalmente.

Para a humanização dessas combinações, é feitareferência à especificação.

<table>table see original document page 104</column></row><table>Nos nanocorpos, cada resíduo aminoácido em qualqueroutra posição do que os Resíduos de Hallmark pode serqualquer resíduo aminoácido que naturalmente ocorre naposição correspondente (segundo numeração de Kabat) de umdomínio VHH de ocorrência natural.

Tais resíduos aminoácidos serão claros para a pessoaexperimentada. As tabelas 4-7 mencionam alguns resíduosnão-restritivos que podem estar presentes em cada posição(segundo numeração de Kabat) do FR1, FR2, FR3 e FR4 dedomínios VHH que ocorrem naturalmente. Para cada posição, oresíduo aminoácido que mais freqüentemente ocorre em cadaposição de um domínio VHH de ocorrência natural (e que é ore siduo aminoácido mais preferencial para a referida posiçãoem um Nanobody) é indicada em negrito; e outros resíduosaminoácidos preferenciais para cada posição foramsublinhados (nota: o número de resíduos aminoácidos que sãoencontrados nas posições 2 630 de domínios VHH que ocorremnaturalmente apoia a hipótese que é a base da numeraçãoChothia (supra) que os resíduos nessas posições já fazemparte de CDR1.)

Nas Tabelas 4-7, alguns resíduos não-restritivos quepodem estar presentes em cada posição de um domínio VH3humano também foram mencionados. Novamente, para cadaposição, o resíduo aminoácido que mais freqüentemente ocorreem cada posição de um domínio VH3 humano que ocorrenaturalmente é indicada em negrito; e outros resíduosaminoácidos preferenciais foram sublinhados.Tabela 4: os exemplos não-restritivos dos resíduosaminoácidos em FR1 (para as notas, ver as notas à Tabela 2)

<table>table see original document page 106</column></row><table><table>table see original document page 107</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table><table>table see original document page 109</column></row><table>

Tabela 6: os exemplos não-restritivos dos resíduos aminoácidos em FR3 (para as notas, ver as notas à Tabela 2)os.

<table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table><table>table see original document page 113</column></row><table>no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a4, respectivamente, e no qual CDR1 a CDR3 se referem àregiões que determinam complementaridade 1 a 3,respectivamente, e em que: i) os resíduos de Hallmark

são como definidos na presente;

e em que:

ii) 0 CDR1, CDR2 e CDR3 são tão definidos napresente, e preferivelmente conforme definidos segundo umadas definições preferenciais acima, e mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima. Num outro aspecto preferido, mas nãorestritivo, um Nanobody da invenção pode ter oestrutura

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2-FR3-CDR3-FR4

no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a4, respectivamente, e no qual CDR1 a CDR3 se referem à20 regiões que determinam complementaridade 1 a 3,respectivamente, e em que: e em que

i) O FR1 é escolhido do grupo composto da seqüênciaaminoácida:

[1] QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG [2 6] [SEQ ID n. 1]ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a seqüência aminoácida acima; em que

(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida conforme definido na Tabela 4; e/ou

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) 11 (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência (s)aminoácida (s) acima mencionadas;e em que:ii) O FR2 é escolhido do grupo composto daseqüência aminoacida:

[36] WXRQAPGKXXEXVA [49] [SEQ ID n. 2]

ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a seqüência aminoacida acima; em que

(1) qualquer substituição aminoacida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoacidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoacida conforme definido na Tabela 5; e/ou

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoacida (s) " (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(1) qualquer substituição aminoacida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoacidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou

e em que:

iii) 0 FR3 é escolhido do grupo composto daseqüência aminoácida:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID n. 3]

ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm* pelo menos 8 0%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispref erivelmente pelo menos 95%, mesmo mais pref erivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a seqüência aminoácida acima; em que

(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas;e em que:

iv) 0 FR4 é escolhido do grupo composto daseqüência aminoácida:

[103] XXQGTXVTVSS [113] [SEQ ID n. 4]

ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a seqüência aminoácida acima; em que

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas,

v) O CDR1, CDR2 e CDR3 são tão definidos napresente, e preferivelmente conforme definidos segundo umadas definições preferenciais acima, e mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima;

no qual os Resíduos de Hallmark são indicados "por X"e como definidos mais acima e no qual os números entrecolchetes se referem às posições aminoácidas segundo anumeração de Kabat.

Num outro aspecto preferido, mas não restritivo, umNanobody da invenção pode ter a estrutura

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3-CDR3-FR4

no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a4, respectivamente, e no qual CDR1 a CDR3 se referem àregiões que determinam complementaridade 1 a 3,respectivamente, e em que: e em que

i) O FR1 é escolhido do grupo composto da seqüênciaaminoacida:

[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID n. 5]ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 8 0%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com a seqüência aminoacida acima; em que

(1) qualquer substituição aminoacida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoacidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoacida conforme definido na Tabela 4; e/ou

(2) a referida seqüência aminoacida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoacida(s) acima mencionadas; e

(3) o resíduo de Hallmark na posição é como indicadona seqüência acima;

(1) qualquer substituição aminoacida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épref erivelmente qualquer uma substituição aminoacidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoacida conforme definido na Tabela 4; e/ou

(3) o residuo de Hallmark na posição é como indicadona seqüência acima; e em que:

ii) 0 FR2 é escolhido do grupo composto dasseqüências aminoácidas:

[36] WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID n. 6] [36]WFRQAPGKEREFVA [49] [ SEQ ID n. 7 ] [36] WFRQAPGKE RE G A [49][SEQ ID n. 8] [36] WFRQAPGKQRELVA [49] [SEQ ID n. 9] [36]WFRQAPGKC ~REFVA [49] [SEQ ID n. 10] [36] WYRQAPGKGLEWA [49][SEQ ID n. 11](2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas; e

(3) os resíduos de Hallmark nas posições 37, 44, 45 e47 são como indicados em cada uma das seqüências acima;e em que:

iii) O FR3 é escolhido do grupo composto daseqüência aminoácida:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID n. 12]

(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas; e(3) os resíduos de Hallmark nas posições 83 e 84 sãocomo indicados em cada uma das seqüências acima;

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas; e

(3) os resíduos de Hallmark nas posições 83 e 84 sãocomo indicados em cada uma das seqüências acima;

e em que:

iv) 0 FR4 é escolhido do grupo composto dasseqüências aminoácidas:

[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID n. 13]

[103] WGQGTLVTVSS [113] [SEQ ID n. 14]

ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das seqüências aminoácidas acima; emque

(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark é

preferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida (s) acima mencionadas; e

(3) os resíduos de Hallmark nas posições 103, 104 e108 são como indicados em cada uma das seqüências acima;

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida(s)" (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência (s)aminoácida (s) acima mencionadas; e(3) os resíduos de Hallmark nas posições 103, 104 e108 são como indicados em cada uma das seqüências acima;e em que:

v) O CDR1, CDR2 e CDR3 são tão definidos na presente,e estão preferivelmente como definido segundo uma dasdefinições preferenciais acima, e estão mais preferivelmentecomo definido segundo uma das definições mais preferenciaisacima.

FRI - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3-CDR3-FR4

no qual FRI a FR4 se referem a regiões de armação 1 a4, respectivamente, e no qual CDR1 a CDR3 se referem àregiões que determinam complementaridade 1 a 3,respectivamente, e em que: e em que

i) O FRI é escolhido do grupo composto da seqüênciaaminoácida:

[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID n. 5]

o ii) FR2 é escolhido do grupo composto das seqüênciasaminoácidas:

[36] WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID n. 6] [36]WFRQAPGKEREFVA [49] [ SEQ ID n. 7 ] [36] WFRQAPGKEREGA [49][SEQ ID n. 8] [36] WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID n. 9] [36]WFRQAPGKQREFVA [49] [SEQ ID n. 10]

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou(2) a referida seqüência aminoacida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência (s)aminoacida(s) acima mencionadas; e

o iii) FR3 é escolhido do grupo composto da seqüênciaaminoacida:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID n. 12]

(1) qualquer substituição aminoacida em qualquer outraposição que não se j a uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoacidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoacida conforme definido na Tabela 6; e/ou

(2) a referida seqüência aminoacida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoacida (s) acima mencionadas; e

(3) os residuos de Hallmark nas posições 83 e 84 sãocomo indicados em cada uma das seqüências acima;e em que:

o iv) FR4 é escolhido do grupo composto das seqüênciasaminoácidas:

[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID n. 13]

[103] WGQGTLVTVSS [113] [SEQ ID n. 14]

(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida conforme definido na Tabela 7; e/ou

e em que:

v) O CDR1, CDR2 e CDR3 são conforme definido napresente, e são preferivelmente conforme definidos segundouma das definições preferenciais acima, e estão maispreferivelmente como definido segundo uma das definiçõesmais preferenciais acima.

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem àregiões que determinam complementaridade 1 a 3,respectivamente, e em que: e em que

i) O FR1 é escolhido do grupo composto da seqüênciaaminoacida:

[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [2 6] [SEQ ID n. 5]

(2) a referida seqüência aminoacida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida (s) acima mencionadas; e

(3) o resíduo de Hallmark na posição é como indicadona seqüência acima; e em que:

ii) 0 FR2 é escolhido do grupo composto daseqüência aminoácida:

[36] WYRQAPGKGLEWA [49] [SEQ ID n. 11]

(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou

(3) os resíduos de Hallmark nas posições 37, 44, 45 e47 são como indicados em cada uma das seqüências acima;

e em que:

iii) 0 FR3 é escolhido do grupo composto daseqüência aminoácida:[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID n. 12]

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoacida (s) 11 (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(1) qualquer substituição aminoacida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoacidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoacida conforme definido na Tabela 6; e/ou

(3) os residuos de Hallmark nas posições 83 e 8 4 sãocomo indicados em cada uma das seqüências acima;

e em que:

iv) 0 FR4 é escolhido do grupo composto daseqüência aminoacida:

[103] WGQGT (QVTVSS [113] [SEQ ID n. 13]

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só I "diferença (s) aminoacida (s) " (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(3) os residuos de Hallmark nas posições 103, 104 e108 são como indicados em cada uma das seqüências acima;

e em que:

v) O CDR1, CDR2 e CDR3 são tão definidos na presente,e estão preferivelmente como definido segundo uma dasdefinições preferenciais acima, e são mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima.

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3-CDR3-FR4

no qual FRI a FR4 se referem a regiões de armação I a4, respectivamente, e no qual CDR1 a CDR3 se referem àregiões que determinam complementaridade 1 a 3,respectivamente, e em que: e em quei) O FR1 é escolhido do grupo composto de seqüênciasFR1 presentes nos nanocorpos de SEQ ID NO!s 60 para 73 e SEQID NO r s 86 para 97, e especialmente nos nanocorposhumanizados de SEQ ID NO1s 8 6 para 97, ou do grupo compostode seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com umade ditas seqüências FRI; no qual (1) qualquer substituiçãoaminoácida em qualquer outra posição que não seja umaposição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente)

e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 4; e/ou

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com a referidaseqüência FRI; e

(3) o residuo de Hallmark na posição é como indicadona referida seqüência FRI;

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida(s)" (conformedefinido na presente) com uma das referidas seqüências FRI,

em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com a referidaseqüência FR1; e (3) o resíduo de Hallmark na posição é comoindicado na referida seqüência FR1 ;e em que:

ii) O FR2 é escolhido do grupo composto dasseqüências FR2 presentes nos nanocorpos de SEQ ID NO1 s 60para 73 e SEQ ID NO's 86 para 97, e especialmente nosnanocorpos humanizados de lo NO1 s SEQ 8 6 para 97, ou dogrupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos80%, pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmentepelo menos 95%, mesmo mais pref erivelmente pelo menosidentidade de seqüência de 99% (conforme definido napresente) com uma das referidas seqüências FR2; no qual (1)qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posiçãoque não seja uma posição de Hallmark é

preferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente)

e/ou uma substituição aminoácida conforme definido naTabela 5; e/ou

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com a referidaseqüência FR2; e

(3) os residuos de Hallmark nas posições 37, 44, 45 e47 são como indicados na referida seqüência FR2;

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conformedefinido na presente) com uma das referidas seqüências FR2,em que:

(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outraposição que não se j a uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou

e em que:

o iii) FR3 é escolhido do grupo composto dasseqüências FR3 presentes nos nanocorpos de SEQ ID NO1 s 60para 73 e SEQ ID NOfs 86 para 97, e especialmente nosnanocorpos humanizados de SEQ ID NO!s 8 6-97,

ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispref erivelmente pelo menos 95%, mesmo mais pref erivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das referidas seqüências FR3; no qual(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com a referidaseqüência FR3; e

(3) os residuos de Hallmark nas posições 83 e 84 sãocomo indicados na referida seqüência FR3;

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só I "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com uma das referidas seqüências FR3,

em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com a referida seqüência FR3; e

(3) os residuos de Hallmark nas posições 83 e 8 4 sãocomo indicados na referida seqüência FR3;e em que:

iv) O FR4 é escolhido. do grupo composto dasseqüências FR4 presentes nos nanocorpos de SEQ ID NO!s 60para 73 e SEQ ID NO's 86 para 97, e especialmente nosnanocorpos humanizados de SEQ ID NO's 8 6 para 97, ou dogrupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmentepelo menos 95%, mesmo mais pref erivelmente pelo menosidentidade de seqüência de 99% (conforme definido napresente) com uma das referidas seqüências FR4; no qual (1)qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posiçãoque não seja uma posição de Hallmark é

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com a referidaseqüência FR4; e

(3) os resíduos de Hallmark nas posições 103, 104 e108 são como indicados na referida seqüência FR3;

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conformedefinido na presente) com uma das referidas seqüências FR4,em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou

inserções aminoácidas, em comparação com a referidaseqüência FR4; e

(3) os resíduos de Hallmark nas posições 103, 104 e108 são como indicados na referida seqüência FR4;

e em que:

v)" O CDR1, CDR2 e CDR3 são tão definidos napresente, e preferivelmente conforme definidos segundo umadas definições preferenciais acima, e mais preferivelmenteconforme definidos segundo uma das definições maispreferenciais acima.

Alguns nanocorpos particularmente preferidos dainvenção podem ser escolhidos do grupo composto dasseqüências aminoácidas de SEQ ID NO1 s 60 para 73 e SEQ IDNO1 s 8 6 para 97, e especialmente nos nanocorpos humanizadosde SEQ ID NO's 8 6 para 97 ou do grupo composto de seqüênciasaminoácidas que têm pelo menos 8 0%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com uma das seqüênciasaminoácidas de SEQ ID NO's 60 para 73 e SEQ ID NOfs 86 para97 (e pref erivelmente de SEQ ID N0's 86 para 97); em que

(1) os resíduos de Hallmark podem ser como indicadosna Tabela 2 acima;

(2) qualquer substituição aminoacida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoacidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoacida como definido em Tabelas 4-7; e/ou

(3) a referida seqüência aminoacida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoacida (s) acima mencionadas.

Alguns nanocorpos até mais particularmente preferidosda invenção podem ser escolhidos do grupo composto dasseqüências aminoácidas de SEQ ID NO1 s 60 para 73 e SEQ IDNO1 s 8 6 para 97, e especialmente nos nanocorpos humanizadosde SEQ ID NO!s 8 6 para 97 ou do grupo composto de seqüênciasaminoácidas que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelomenos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo maispreferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99%(conforme definido na presente) com uma das seqüênciasaminoácidas de SEQ ID NO!s 60 para 73 e SEQ ID NOfs 86 para97 (e preferivelmente de SEQ ID NO's 86 para 97); em que

(1) os resíduos de Hallmark são como indicados naseqüência pertinente escolhida de SEQ ID NO? s 60 para 73 eSEQ ID NO's 86 para 97 (e pref erivelmente de SEQ ID NO's 86para 97) ;

(2) qualquer substituição aminoacida em qualquer outraposição que não seja uma posição de Hallmark épreferivelmente qualquer uma substituição aminoácidaconservadora (conforme definido na presente) e/ou umasubstituição aminoácida como definido em Tabelas 4-7; e/ou

(3) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com a seqüênciapertinente escolhida de lo NO's SEQ 60 para 73 e SEQ ID NO's86 para 97 (e preferivelmente de SEQ ID NO's 86 para 97).

Alguns nanocorpos mais preferenciais da invenção podemser escolhidos do grupo composto das seqüências aminoácidasde SEQ ID NOfs 60 para 73 e SEQ ID NO's 86 para 97, eespecialmente dos nanocorpos humanizados de SEQ ID NO1s 8 6para 97.

Como ficará claro do acima mencionado, o termonanocorpos da invenção como usado na presente no seu sentidomais amplo também compreende mutantes naturais ousintéticos, variantes, alelos, análogos e ortólogos (aseguir tratados coletivamente como "análogos") dosnanocorpos mencionado no SEQ ID NO's 60 para 73 e SEQ IDNO's 86 para 97.

Geralmente, tais análogos, por exemplo, podemcompreender seqüências homólogas, porções funcionais, ou umaporção funcional de uma seqüência homóloga (conformeposteriormente definido mais adiante) de um Nanobody.Geralmente, em tais análogos, cada resíduo aminoácido (outroque não o Residuo de Hallmark) em cada uma das regiões dearmação pode ser substituído por qualquer outro residuoaminoácido, contanto que o grau total da identidade deseqüência das regiões de armação permaneça conforme definidona presente. Preferivelmente, contudo, em tais análogos:

um ou resíduos aminoácidos nas acima mencionadasseqüências de armação são substituídos por um ou váriosresíduos aminoácidos que ocorrem naturalmente na mesmaposição em um domínio VHH que ocorre naturalmente. Algunsexemplos de tais substituições são mencionados em Tabelas 4-7 acima;

e/ou:

um ou resíduos aminoácidos nas acima mencionadasseqüências de armação são substituídos por um ou váriosresíduos aminoácidos que podem ser considerados umasubstituição aminoácida "conservadora", conforme descritomais acima;

e/ou:

um ou resíduos aminoácidos nas acima mencionadasseqüências de armação são substituídos por um ou váriosresíduos aminoácidos que ocorrem naturalmente na mesmaposição em uma naturalmente ocorrência o domínio de Vii deum ser humano. Isto é, "a humanização" geralmente tratadacomo da naturalmente ocorrência VHH/Nanobody em geral e dareferida posição especialmente, e será discutido maisdetalhadamente a seguir;

e:

as posições para que só um resíduo aminoácido émencionado para ambos o domínio VHe o domínio VHH em Tabelas 4-7 anteriormente não épreferivelmente substituído.

Também, embora geralmente menos preferencial, em taisanálogos, um ou vários resíduos aminoácidos possam sereliminados das regiões de armação e/ou inseridos nas regiõesde armação (opcionalmente além de uma ou váriassubstituições aminoácidas conforme acima mencionado),contanto que o grau total da identidade de seqüência dasregiões de armação permaneça conforme definido na presente.

Os resíduos de Hallmark não devem ser eliminados. Também, omais preferivelmente, resíduos aminoácidos para os quais sóum resíduo aminoácido é mencionado tanto para o domínio VHcomo para o domínio VHH nas Tabelas 4-7 acima não sãopreferivelmente eliminados.

Preferivelmente, tais análogos devem ser tais que elesainda podem ligar a, ter afinidade para e/ou terespecificidade para vWF, isto é, com uma afinidade e/ou umaespecificidade que é pelo menos 10%, pref erivelmente pelomenos 50%, mais pref erivelmente pelo menos 7 0%, mesmo maispref erivelmente pelo menos 80%, como pelo menos 90%, pelomenos 95%, pelo menos 99% ou mais, da afinidade e/ou aespecificidade de pelo menos um dos nanocorpos de SEQ IDNo's 60 para 73 e SEQ ID NO's 86 para 97, conformedeterminado utilizando um ensaio conveniente, por exemplo,um ensaio para determinar a ligação do análogo a vWF, e emparticular um dos ensaios conforme usados nos Exemplosapresentados posteriormente.Geralmente, tais análogos, por exemplo, podem serobtidos fornecendo um ácido nucléico que codifica um dominioVHH de ocorrência natural, modificando os codons para um ouvários residuos aminoácidos que devem ser humanizados noscodons para o(s) residuo(s) aminoácido(s) humano(s)correspondente (s), expressando a seqüência ácida/nucleotideanucléica portanto obtida em um hospedeiro ou sistema deexpressão conveniente; e opcionalmente isolação e/oupurificação do análogo portanto obtido para prover oreferido análogo na forma essencialmente isolada (conformedefinido acima). Isto pode ser geralmente executado usandométodos e técnicas conhecidas por si, o que ficará claropara a pessoa experimentada, por exemplo, dos manuais ereferências citadas na presente e/ou da nova descrição aseguir. Alternativamente, e por exemplo, um ácido nucléicoque codifica um análogo pode ser sintetizado em uma maneiraconhecida por si (por exemplo, usando um aparelhoautomatizado que sintetiza seqüências ácidas nucléicas comuma seqüência aminoácida predestinada) e pode ser expressoem um hospedeiro ou sistema de expressão conveniente, sobreo qual o análogo portanto obtido pode ser opcionalmenteisolado e/ou purificado para prover os referidos análogos naforma essencialmente isolada (conforme definido acima).Outro modo de fornecer os análogos implica a sintese quimicada seqüência aminoácida pertinente que usa técnicas parasintese de peptideo conhecida por si, como as mencionadas a seguir.Será também geralmente ser claro para a pessoaexperimentada que nanocorpos (inclusive análogos dos mesmos)também podem ser preparados começando de seqüências VHhumanas (isto é, seqüências aminoácidas ou as seqüências denucleotideos correspondentes), como seqüências VH3, porexemplo, humanas como DP-47, DP-51 ou DP-29, modificando umou vários resíduos aminoácidos na seqüência aminoácida doreferido domínio VH humano, para fornecer uma seqüênciaaminoácida que tem a um Q na posição 108; e/ou (b) E naposição 44 e/ou R na posição 45, e preferi velmente E naposição 44 e R na posição 45; e/ou (c) P, R ou S na posição103, conforme descrito acima. Novamente, isto pode sergeralmente executado usando vários métodos e técnicasmencionadas no parágrafo prévio, usando uma seqüênciaaminoácida e/ou seqüência de nucleotideos para um domínio VHhumano como um ponto de partida.

0 termo nanocorpos conforme usado na presente no seusentido mais amplo também compreende partes ou fragmentosdos nanocorpos (inclusive análogos) da invenção tão definidana presente, que pode ser novamente conforme adicionalmentedescrito mais adiante.

Geralmente, as partes ou os fragmentos dos nanocorpose/ou análogos têm seqüências aminoácidas nas quais, emcomparação com a seqüência aminoácida do Nanobody ou análogode comprimento completo correspondente, um ou vários dosresíduos aminoácidos no fim do N-terminal, um ou váriosresíduos aminoácidos no fim do C-terminal, um ou váriosresíduos aminoácidos internos contíguos, ou qualquercombinação dos mesmos, foram eliminados e/ou retirados. Étambém possível combinar uma ou várias de tais partes oufragmentos para fornecer um Nanobody da invenção.

Preferivelmente, a seqüência aminoácida de um Nanobodyque compreende uma ou várias partes ou fragmentos de umNanobody e/ou análogo de comprimento completo deve ter umgrau de identidade de seqüência de pelo menos 50%,preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelomenos 70%, como pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos95%, com a seqüência aminoácida do correspondente Nanobodyde comprimento completo.

Também, a seqüência aminoácida de um Nanobody quecompreende uma ou várias partes ou fragmentos de um Nanobodye/ou análogo de comprimento completo é preferivelmente talque compreende pelo menos 10 resíduos aminoácidos contíguos,preferivelmente pelo menos 2 0 resíduos aminoácidoscontíguos, mais preferivelmente pelo menos 30 resíduosaminoácidos contíguos, como pelo menos 40 resíduosaminoácidos contíguos, da seqüência aminoácida docorrespondente Nanobody de comprimento completo.

Geralmente, tais partes ou fragmentos dos nanocorposda invenção terão seqüências aminoácidas nas quais, emcomparação com a seqüência aminoácida do correspondenteNanobody de comprimento completo da invenção, um ou váriosdos resíduos aminoácidos no fim do N-terminal, um ou váriosresíduos aminoácidos no fim do C-terminal, um ou váriosresíduos aminoácidos internos contíguos, ou qualquercombinação dos mesmos, foram eliminados e/ou retirados. Étambém

possível combinar uma ou várias de tais partes oufragmentos para fornecer um Nanobody da invenção.

Segundo uma modalidade de execução preferencial, umfragmento conforme usado na presente compreende pelo menosum dos CDR's presentes em um Nanobody de tamanho natural dainvenção, preferivelmente pelo menos dois dos CDR' spresentes em um Nanobody de tamanho natural da invenção,mais preferivelmente pelo menos CDR2 e CDR3 presentes em umNanobody de tamanho natural da invenção, tais como, porexemplo, o três CDR's presentes em um Nanobody de tamanhonatural da invenção.

Segundo outra modalidade de execução em particularpreferida, mas não-restritiva, tal parte ou fragmentocompreendem pelo menos FR3, CDR3 e FR4 do correspondenteNanobody de comprimento completo da invenção, isto é, como,por exemplo, descrito na solicitação internacional WO03/050531 (Lasters et al.).

Preferivelmente, tais partes ou fragmentos devem sertais que eles ainda podem ligar a, ter afinidade para e/outer especificidade para vWF, isto é, com uma afinidade e/ouuma especificidade que é pelo menos 10%, preferivelmentepelo menos 50%, mais pref erivelmente pelo menos 70%, mesmomais pref erivelmente pelo menos 80%, como pelo menos 90%,pelo menos 95%, pelo menos 99% ou mais, da afinidade e/ou aespecificidade do Nanobody de tamanho natural correspondenteda invenção, por exemplo, um ensaio para determinar aligação do análogo a vWF, e em particular um dos ensaiosconforme usados nos Exemplos apresentados posteriormente.

Da descrição mais acima, ficará claro que asseqüências aminoácidas dos nanocorpos usados na presente sediferenciam em pelo menos uma posição aminoácida em pelomenos uma das regiões de armação das seqüências aminoácidasde domínios VH que ocorrem naturalmente, como as seqüênciasaminoácidas de domínios VH que ocorrem naturalmente deanticorpos de seres humanos. Especialmente, ficará claro queas seqüências aminoácidas dos nanocorpos usados na presentese diferenciam em pelo menos um dos Resíduos de Hallmark deseqüências aminoácidas de domínios VH que ocorremnaturalmente, como as seqüências aminoácidas de domínios VHque ocorrem naturalmente de anticorpos de Camelideos e/ouseres humanos.

Portanto, segundo uma modalidade de execuçãoespecífica, um Nanobody da invenção tem uma seqüênciaaminoácida que se diferencia em pelo menos uma posiçãoaminoácida em uma das regiões de armação da seqüênciaaminoácida de um domínio VH que ocorre naturalmente. Segundouma modalidade de execução mais específica, mas não-restritiva da invenção, um Nanobody da invenção tem umaseqüência aminoácida que se diferencia em pelo menos um dosresíduos de Hallmark da seqüência aminoácida de um domínioVH que ocorre naturalmente.Da descrição mais acima, também ficará claro que asseqüências aminoácidas de alguns nanocorpos da invenção,como os nanocorpos humanizados da invenção, se diferenciarãoem pelo menos uma posição aminoácida em pelo menos uma dasregiões de armação (isto é, na posição de um residuo deHallmark ou em outra posição) das seqüências aminoácidas dedominios VHH que ocorrem naturalmente. Portanto, segundo umamodalidade de execução especifica, mas não-restritiva, umNanobody da invenção tem uma seqüência aminoácida que sediferencia em pelo menos uma posição aminoácida em uma dasregiões de armação da seqüência aminoácida de um dominio VHHde ocorrência natural. Segundo uma modalidade de execuçãomais especifica, mas não-restritiva da invenção, um Nanobodyda invenção tem uma seqüência aminoácida que se diferenciaem pelo menos um dos residuos de Hallmark da seqüênciaaminoácida de um dominio VHH de ocorrência natural.

Conforme acima mencionado, a invenção também se referea proteina ou polipeptidios que compreendem pelo menos umdominio VHH (isto é, como identificado utilização dosmétodos da invenção) ou pelo menos um Nanobody baseadonisso.

Segundo uma modalidade de execução não-restritiva dainvenção, tal polipeptidio da invenção essencialmentecompõe-se de um Nanobody. "Por essencialmente compõem-se de1 quer dizer que a seqüência aminoácida do polipeptidio dainvenção qualquer é exatamente o mesmo como a seqüênciaaminoácida de um Nanobody (como acima mencionado) oucorresponde à seqüência aminoácida de um Nanobody no qual umnúmero limitado de resíduos aminoácidos, como 1-10 resíduosaminoácidos e preferivelmente 1-6 resíduos aminoácidos, como1, 2, 3, 4, 5 ou 6 resíduos aminoácidos, foram acrescentadosao fim terminal amino, ao fim terminal carboxi, ou tanto aofim terminal amino como ao fim terminal carboxi da seqüênciaaminoácida do Nanobody.

Ditos resíduos aminoácidos podem ou não modificar-se,alterar-se ou de outra maneira influir nas propriedades(biológicas) do Nanobody e podem ou não acrescentar a novafuncionalidade ao Nanobody. Por exemplo, ditos resíduosaminoácidos pode:

a) formar "uma etiqueta", isto é, uma seqüênciaaminoácida ou o resíduo que permite ou facilita apurificação do Nanobody, por exemplo, usando técnicas deafinidade dirigidas contra dita seqüência ou resíduo. Depoisdisso, a dita seqüência ou o resíduo podem ser retirados (p.ex. por produto químico ou rachadura enzimáticas) parafornecer a seqüência de nucleotídeos da invenção (com estafinalidade, a seqüência ou o resíduo podem ser opcionalmenteligados à seqüência aminoácida da invenção via uma seqüênciade linker separável). Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos de tais resíduos são múltiplos resíduoshistidina e resíduos glutatione,

b) pode ser um Resíduo N-terminal Met, por exemplo,como o resultado da expressão em uma célula hospedeiraheteróloga ou organismo hospedeiro.c) pode ser um ou vários resíduos aminoácidos quepodem ser munidos de grupos funcionais e/ou foifuncionalizados, em uma maneira conhecida por si. Porexemplo, como é conhecido na técnica, resíduos aminoácidoscomo lisina e em determinado cisteina levam em conta o anexode grupos de PEG, que podem mascarar o sitio superficial emuma proteína e portanto, por exemplo, reduzirimunogenicidade, melhorar a me ia-vida no plasma eestabilizar-se contra a rachadura proteolitica;

d) aumentar a me ia-vida no soro de um Nanobody ou opolipeptidio da invenção. As seqüências de aminoácido quepodem ser ligadas a e/ou fundidas com a proteína terapêuticapara aumentar a sua meia-vida in vivo são bem sabem à pessoaexperimentada e incluem proteína de soro humana oufragmentos disso (como albumina de soro humana ou uma parteou fragmento disso), ou até as porções de Fe dos anticorpos(especialmente de anticorpos humanos). Também, como jádescrito na presente, uma tal seqüência aminoácida que paraaumenta a meia-vida pode ser uma seqüência aminoácidadirigida contra uma proteína de soro, como um Nanobodydirigido contra uma proteína de soro, por exemplo, contrauma albumina de soro humano.

Quanto a pegilação, deve ser observado que geralmente,a invenção também abrange qualquer Nanobody da invenção e/ouo polipeptidio da invenção que foi pegilado em uma ou váriasposições aminoácidas, preferivelmente de tal modo quequalquer pegilação preferida (1) aumenta a meia-vida invivo; (2) reduz imunogenicidade; (3) fornece uma ou váriasnovas propriedades benéficas conhecidas por si parapegilação; (4) não afeta essencialmente a afinidade doNanobody e/ou polipeptidio para vWF (p. ex. não reduz areferida afinidade em mais de 90%, preferivelmente não emmais de 50%, e mais pref erivelmente não em mais de 10%, comodeterminado por um ensaio conveniente, como os descritos nosExemplos mais adiante) ; e/ou (4) não afeta nenhuma dasoutras propriedades desejadas dos nanocorpos e/oupolipeptidios da invenção. Os GRUPOS PEG convenientes e osmétodos que para os ligam, especificamente ou não-especificamente, serão claros para a pessoa experimentada.Os conjuntos convenientes e os reagentes para tal pegilação,por exemplo, podem ser obtidos de Nektar (CA, os EUA) .

Segundo uma modalidade de execução não-restritiva, umou vários resíduos aminoácidos podem ser acrescentados a,inseridos em e/ou substituídos na seqüência aminoácida de umNanobody ou o polipeptidio da invenção, para fornecer um ouvários resíduos aminoácidos específicos para ligação de umgrupo PEG.

A invenção também abrange qualquer Nanobody dainvenção e/ou o polipeptidio da invenção que foi glicosiladoem uma ou várias posições aminoácidas, normalmentedependendo do hospedeira usado para expressar o Nanobody ouo polipeptidio da invenção (conforme adicionalmente descritomais adiante).

Segundo uma modalidade de execução não-restritiva, umou vários resíduos aminoácidos podem ser acrescentados a,inseridos em e/ou substituídos na seqüência aminoácida de umNanobody ou o polipeptidio da invenção, para fornecer um ouvários resíduos aminoácidos específicos e/ou um sitio quepode ser glicosilado pelo organismo hospedeiro usado. Pormeio de um exemplo preferencial, mas não-restritivo, o N-residuo na posição 50 dentro de CDR2 de um Nanobody dainvenção, por exemplo, pode ser substituído por um ResíduoQ, D ou S para fornecer um sitio de glicosilação, p. ex.para glicosilação por Pichia.

Segundo outra modalidade de execução, um polipeptidioda invenção pode compreender a seqüência aminoácida de umNanobody, que é fundido na sua extremidade terminal amino,na sua extremidade terminal carboxi, ou tanto na suaextremidade terminal amino como na sua extremidade terminalcarboxi com pelo menos uma nova seqüência aminoácida.

Novamente, ditas seqüências aminoácidas adicionaispodem ou não modificar-se, alterar-se ou de outra maneirainfluir nas propriedades (biológicas) do Nanobody e podem ounão acrescentar a nova funcionalidade ao Nanobody.

Por exemplo, segundo uma modalidade de execuçãopreferencial, mas não-restritiva, as referidas seqüênciasaminoácidas adicionais compreendem pelo menos um novoNanobody, para fornecer um polipeptidio da invenção quecompreende pelo menos dois, como três, quatro ou cinco,nanocorpos, nos quais os referidos nanocorpos podem seropcionalmente ligados via uma ou várias seqüências delinkers (conforme definido na presente)-

Os polipeptidios da invenção que compreendem dois oumais nanocorpos fazem também mencionado na presente como"multivalente" polipeptidios., por exemplo, um polipeptidio"bivalente" da Invenção compreende dois nanocorpos,opcionalmente ligado via uma seqüência de linker, ao passoque um polipeptidio "trivalente" da invenção compreende trêsnanocorpos, opcionalmente ligados via duas seqüências delinkers; etc.

Em um polipeptidio multivalente da invenção, dois oumais nanocorpos podem ser os mesmos ou diferentes. Porexemplo, dois ou mais nanocorpos em um polipeptidiomultivalente da invenção:

pode ser dirigido contra o mesmo antigeno, isto é,contra as mesmas partes ou epitopes do referido antigeno oucontra duas ou mais partes diferentes ou epitopes doreferido antigeno; e/ou: pode ser dirigido contra osantígenos diferentes;

ou uma combinação disso.

Portanto, um polipeptidio bivalente da invenção porexemplo:

pode compreender dois nanocorpos idênticos;

pode compreender um primeiro Nanobody dirigido contrauma primeira parte ou epitope de um antigeno e um segundoNanobody dirigido contra a mesma parte ou epitope doreferido antigeno ou contra outra parte ou epitope doreferido antigeno;ou pode compreender um primeiro Nanobody dirigidocontra um primeiro antigeno e um segundo Nanobody dirigidocontra um segundo antigeno diferente do primeiro referidoantigeno; ao passo que um Polipeptidio trivalente da

Invenção por exemplo:

pode compreender três nanocorpos idênticos oudiferentes dirigidos contra as mesmas partes ou diferentesou epitopes do mesmo antigeno;

pode compreender dois nanocorpos idênticos oudiferentes dirigidos contra as mesmas partes ou diferentesou epitopes em um primeiro antigeno e um terceiro Nanobodydirigido contra um segundo antigeno diferente do primeiroreferido antigeno; ou

pode compreender um primeiro Nanobody dirigidocontra um primeiro antigeno, um segundo Nanobodydirigido contra um segundo antigeno diferente doprimeiro referido antigeno, e um terceiro Nanobody dirigiucontra um terceiro antigeno diferente do primeiro e segundoreferido antigeno, os Polipeptidios da invenção que contêmpelo menos dois nanocorpos, nos quais pelo menos um Nanobodyé dirigido contra um primeiro antigeno e pelo menos umNanobody é dirigido contra um segundo Nanobody diferente doprimeiro antigeno, também se mencionará como nanocorpos"multiespecifico". Portanto, um "biespecifico" Nanobody é umNanobody que compreende pelo menos um Nanobody dirigidocontra um primeiro antigeno e pelo menos um novo Nanobodydirigido contra um segundo antigeno, ao passo que um"triespecífico" Nanobody é um Nanobody que compreende pelomenos um Nanobody dirigido contra um primeiro antigeno, pelomenos um novo Nanobody dirigido contra um segundo antigeno,e pelo menos um novo Nanobody dirigido contra um terceiroantigeno; etc.

Conseqüentemente, na sua forma mais simples, umpolipeptidio biespecifico da invenção é um polipeptidiobivalente da invenção (conforme definido na presente),compreendendo um primeiro Nanobody dirigido contra umprimeiro antigeno e um segundo Nanobody dirigido contra umsegundo antigeno, no qual os referidos primeiro e segundoNanobody podem ser opcionalmente ligados via uma seqüênciade linker (conforme definido na presente); ao passo que umpolipeptidio triespecifico da invenção na sua forma maissimples é um polipeptidio trivalente da invenção (conformedefinido na presente), compreendendo um primeiro Nanobodydirigido contra um primeiro antigeno, um segundo Nanobodydirigido contra um segundo antigeno e um terceiro Nanobodydirigido contra um terceiro antigeno, no qual os referidosprimeiro, segundo e terceiro Nanobody pode ser opcionalmenteligado via uma ou mais, e em particular uma, e mais emparticular, duas seqüências de linkers.

Contudo, como ficará claro da descrição mais acima, ainvenção não é limitada a isso, no sentido de que umpolipeptidio multiespecifico da invenção pode compreenderqualquer número de nanocorpos dirigidos contra dois ou maisantigenos diferentes.Para polipeptidios multivalentes e multiespecíficosque contêm um ou vários dominios VHH e a sua preparação, areferência também é feita a Conrath et al., J. Biol. Chem.,volume 276, 10. 7346-7350, bem como a EP 0 822985.

Os Linkers para uso em polipeptidios multivalentes emultiespecificos serão claros para a pessoa experimentada,e, por exemplo, incluirão gly-ser linkers, por exemplo, dotipo (glyxsery) Z, como (por exemplo, (gly4ser) 3 ou(gly3ser2) 3i como descrito em WO 99/42077, regiões pregadascomo as regiões pregadas de anticorpos de cadeias pesadasque ocorrem naturalmente ou seqüências semelhantes. Paraoutros linkers convenientes, a referência também é feita àfundamentos técnicos gerais citada anteriormente. Alguns emparticular preferiram que linkers sejam dados em SEQ ID NO's83 para 85, no qual os linkers de SEQ ID NOfs 84 e 85 são emparticular preferidos.

Linkers também podem fornecer um pouco defuncionalidade para o polipeptidio multivalente oumultiespecifico. Por exemplo, linkers contendo um ou váriosresiduos aminoácidos carregados (ver a Tabela 1anteriormente) pode prover propriedades hidrofilicasmelhoradas, ao passo que linkers que formam ou contêmpequenos epitopes ou etiquetas podem ser usados para osobjetivos de detecção, identificação e/ou purificação.

Como também além disso descrito na presente, umpolipeptidio multiespecifico da invenção dirigida contra umantigeno desejado e contra pelo menos uma proteina de soro,como a proteína de soro mencionada a seguir, e especialmentecontra uma albumina de soro humano, pode mostrar a meia-vidaaumentada no soro, em comparação com o correspondenteNanobody monovalente.

Como mencionado mais acima, os métodos descritos napresente são em particular ajustados para gerando taispolipeptidios multiespecificos multivalentes da invenção.

Em um polipeptidio da invenção, pelo menos um Nanobodytambém pode ser ligado a um dominio VH convencional ou a umanálogo natural ou sintético de um dominio VH, opcionalmentevia uma seqüência de linker.

Em um polipeptidio da invenção, pelo menos um Nanobodytambém pode ser ligado a um dominio VL ou a um análogonatural ou sintético de um VL dominio, opcionalmente via umaseqüência de linker, para fornecer um polipeptidio dainvenção que está na forma análoga a um fragmento scFvconvencional, mas conter um Nanobody em vez de um dominioVH.

Em um polipeptidio da invenção, pelo menos um Nanobodytambém pode ser ligado a um ou vários de um CHI, CH2 e/oudominio CH3, opcionalmente via uma seqüência de linker. Porexemplo, um Nanobody ligado a um dominio CHI conveniente,por exemplo, pode ser usado - em conjunto com convenienteas cadeias leves - para gerar fragmentos/estruturas deanticorpo análogos a fragmentos Fab convencionais ou F (ab1)2 fragmentos, mas no qual ou (em caso de um F (ab1) 2fragmento) um ou ambos dos dominios VH convencionais foisubstituído por um Nanobody. Tais fragmentos também podemser heteroespecificos ou biespecifico, isto é, dirigidocontra dois ou mais antigenos. Um Nanobody ligado a CH2conveniente e domínios CH3, por exemplo, derivou deCamelideos, pode ser usado para formar um anticorpo decadeia pesada monoespecifico ou biespecifico. Finalmente, umNanobody ligado a CHI conveniente, CH2 e domínios CH3, porexemplo, derivada de um ser humano, pode ser usado - emconjunto com cadeias leves convenientes - para formar umanticorpo que é análogo a um anticorpo de 4 cadeiasconvencional, mas no qual ou ambos dos domínios VHconvencionais foram substituídos por um Nanobody.

Também, além de um ou vários nanocorpos, osPolipeptidios da Invenção também podem conter gruposfuncionais, metades ou resíduos, por exemplo, substânciasterapeuticamente ativas, como os mencionados mais adiante,e/ou marcadores ou etiquetas, como marcadores fluorescentes,isótopos, etc., conforme adicionalmente descrito a seguir.

nanocorpos da invenção, os polipeptidios da invenção,e ácidos nucléicos que codificam o mesmo, pode estarpreparado em uma maneira conhecida por si, ou estará claropara a pessoa experimentada da nova descrição na presente.Alguns os métodos preferidos, mas não-restritivos que parapreparam nanocorpos, polipeptidios e ácidos nucléicosincluem os métodos e técnicas acima mencionadas e/ou novasdescreveram a seguir.

Como estará claro para a pessoa experimentada, ummétodo especialmente útil para preparar um Nanobody e/ou umpolipeptidio da invenção geralmente compreende os passos de

- a expressão, em uma célula hospedeira conveniente ouorganismo hospedeiro (também mencionada na presente como "umhospedeiro da invenção") ou em outro sistema de expressãoconveniente de um ácido nucléico que codifica os referidosNanobody ou o polipeptidio da invenção (também mencionada napresente como "um ácido nucléico da invenção"),opcionalmente seguido por :

isolação e/ou purificação do Nanobody oupolipeptidio da invenção portanto obtido.

Especialmente, tal método pode compreender os passosde

- a cultivação e/ou a manutenção de um hospedeiro dainvenção em condições que são tais que a referida hospedeirada invenção expressa e/ou produz pelo menos um Nanobody e/ouo polipeptidio da invenção; opcionalmente seguido por :

Um ácido nucléico da invenção pode ser na forma de ADNou ARN de trançado simples ou duplo, e é preferivelmente naforma do ADN de trançado duplo. Por exemplo, as seqüênciasde nucleotideos da invenção podem ser ADN genômico, cDNA ouo ADN sintético (como ADN com um uso de codon que foiespecificamente adaptado para expressão na célula hospedeiradesejada ou organismo hospedeiro).Segundo uma modalidade de execução da invenção, oácido nucléico da invenção está em essencialmente isoladode, conforme definido acima.

O ácido nucléico da invenção também pode ser na formade, estar presente em e/ou ser parte de um vetor, como, porexemplo, um plasmideo, cosmideo ou YAC, que novamente podeestar na forma essencialmente isolada.

Os ácidos nucleicos da invenção podem estar preparadosou obtidos em uma maneira conhecida por si, baseado nainformação nas seqüências aminoácidas para os polipeptidiosda invenção dada na presente, e/ou ser isolados de uma fontenatural conveniente. Para fornecer análogos, seqüências denucleotideos que codificam domínios de VHH que ocorremnaturalmente, por exemplo, podem ser submetidos a mutagenesedirecionada a local, de modo a fornecer um ácido nucléico dainvenção que codifica os referidos análogos. Também, comoestará claro para a pessoa experimentada, preparar um ácidonucléico da invenção, também várias seqüências denucleotideos, como pelo menos uma seqüência de nucleotideosque codifica Nanobody e ácidos, por exemplo, nucleicos quecodificam um ou vários linkers podem ser ligadas em conjuntoem uma maneira conveniente.

As técnicas para gerar os ácidos nucleicos da invençãoserão claras à pessoa experimentada e podem incluir porexemplo, mas não são limitadas a, síntese de ADNautomatizada; mutagenese direcionada a local; a combinaçãode duas ou mais seqüências que ocorrem naturalmente e/ousintéticas (ou dois ou mais partes das mesmas), a introduçãode mutações que levam à expressão de um produto de expressãotruncado; a introdução de um ou vários sitios de restrição(p. ex. para criar cassetes e/ou regiões que podem serfacilmente digeridas e/ou ligadas utilizando enzimas derestrição convenientes), e/ou a introdução de mutações pormeio de uma reação PCR que usa um ou vários escorvadores"mal combinados", usando, por exemplo, uma seqüência de umaGPCR de ocorrência natural como um padrão. Estas e outrastécnicas serão claras à pessoa experimentada, e a referênciaé novamente feita aos manuais padrão, como Sambrook. eAusubel et al., acima mencionado, bem como os Exemplos maisadiante.

O ácido nucleico da invenção também pode ser na formade, estar presente em e/ou ser parte de um construtogenético, como estará claro para a pessoa experimentada natécnica. Tais construtos genéticos geralmente compreendempelo menos um ácido nucleico da invenção que é opcionalmenteligada a um ou vários elementos de construto genéticoconhecido por si, como, por exemplo, um ou vários elementosreguladores convenientes (como um promotor(es) conveniente,realçador (es), exterminador(es) , etc.) e os novos elementosdos construtos genéticos mencionados a seguir. Taisconstrutos genéticos compreendendo pelo menos um ácidonucleico da invenção também serão referidos na presente como"construto genético da invenção".

O construto genético da invenção pode ser ADN ou oARN, e são o ADN pref erivelmente de trançado duplo. Oconstruto genético da invenção também pode estar em umaforma conveniente para a transformação da célula hospedeiradesejada ou organismo hospedeiro, em uma forma convenientepara integração no ADN genômico da célula hospedeiradesejada ou em uma forma de réplica independenteconveniente, manutenção e/ou herança' no organismo hospedeirodesejado. Por exemplo, o construto genético da invenção podeser na forma de um vetor, como, por exemplo, um plasmideo,cosmideo, YAC, um vetor viral ou transposon. Especialmente.,o vetor pode ser um vetor de expressão, isto é, um vetor quepode prover a expressão in vitro e/ou in vivo (p. ex. em umacélula hospedeira conveniente, organismo hospedeiro e/ousistema de expressão).

Em uma modalidade de execução preferencial mas não-restritiva, um construto genético da invenção compreende

a) pelo menos um ácido nucléico da invenção;operavelmente conectado a

b) um ou vários elementos reguladores, como umpromotor e opcionalmente um exterminadores conveniente;

c) e opcionalmente também

d) um ou vários novos elementos dos construtosgenéticos conhecido por si;

no qual os termos "elemento regulador", "o promotor","exterminadores" e "operavelmente conectado" tem a suasignificação habitual na técnica (conforme adicionalmentedescrito mais adiante); e no qual os referidos "novoselementos" o presente no construto genético, por exemplo,pode ser 3f-ou 5 seqüências !-UTR, seqüências de líder,marcadores de seleção, genes de marcadores/repórter deexpressão, e/ou elementos que podem facilitar ou aumentar (aeficiência de) a transformação ou a integração. Estes eoutros elementos convenientes para tal construto genéticoficará claro para a pessoa experimentada, e pode depender,por exemplo, do tipo de construto usado, a célula hospedeiradesejada ou organismo hospedeiro; a maneira na qual asseqüências de nucleotídeos da invenção do interesse devemser expressas (p. ex. via a expressão constitutiva,transiente ou induzível); e/ou a técnica de transformação aser usada.

Preferivelmente, no construto genético da invenção, osreferidos pelo menos um ácido nucléico da invenção e osreferidos elementos reguladores, e opcionalmente osreferidos um ou vários novos elementos, são "operavelmenteligados" um a outro, pelo qual geralmente quer dizer queeles estão em uma relação funcional um com outro. Porexemplo, um promotor é considerado "operavelmente ligado" auma seqüência de codificação se o referido promotor forcapaz de iniciar ou controlar/regular de outra maneira atranscrição e/ou a expressão de uma seqüência de codificação(no qual os referidos codificação de seqüência

deve ser entendido como sendo "no controle de 1 osreferidos promotor). Geralmente, quando duas seqüências denucleotídeos são operavelmente ligado, eles estarão na mesmaorientação e normalmente também na mesma armação de leitura.Eles também serão normalmente essencialmente contíguos,embora isto também não possa ser requerido.

Preferivelmente, os elementos reguladores e novos dosconstrutos genéticos da invenção são tais que eles sãocapazes de fornecer a sua função biológica desejada nacélula hospedeira desejada ou organismo hospedeiro.

Por exemplo, um promotor, realçador ou exterminadoresdeve ser "operável" na célula hospedeira desejada ouorganismo hospedeiro, pelo qual se quer dizer que (porexemplo) o referido promotor deve ser capaz da iniciação oude outra maneira controlar/regular a transcrição e/ou aexpressão de uma seqüência de nucleotideos - p. ex. umaligado (conforme definido na presente).

Alguns promotores em particular preferenciais incluem,mas não são limitados a, promotores conhecidos por si para aexpressão em células bacterianas, como as mencionadas aseguir e/ou os usados nos Exemplos.

Um marcador de seleção deve ser tal que permita - istoé, em condições de seleção apropriadas - células hospedeirase/ou organismos hospedeiros que foram (com sucesso)transformadas com a seqüência de nucleotideos da invenção aser distinguida de células/organismos hospedeiros que nãoforam (com sucesso) transformados. Alguns exemplospreferidos, mas não-restritivos de tais marcadores são genesque fornecem a resistência contra antibióticos (comocanamicina ou ampicilina), genes que provêem resistência àtemperatura, ou genes que permitem a célula hospedeira ouorganismo hospedeiro a serem mantidos na ausência de certosfatores, compostos e/ou componentes (alimentares) no meioque são essenciais para a sobrevivência das células não-transformadas ou organismos.

Uma seqüência lider deve ser tal que - na célulahospedeira desejada ou organismo hospedeiro - ela leva emconta as modificações pós-translação desejadas e/ou tal queela dirige o mRNA transcrito a uma parte desejada ouorganela de uma célula. Uma seqüência lider também podelevar em conta a secreção do produto de expressão dareferida célula. Como tal, a seqüência lider pode ser algumapro-, pre, ou a prepro-seqüência operável na célulahospedeira ou organismo hospedeiro. As seqüências de lidernão podem ser requeridas para expressão em uma célulabacteriana.

Um marcador de expressão ou o gene de repórter devemser tais que - na célula hospedeira ou organismo hospedeiro- ele leva em conta a detecção da expressão (de um gene ouseqüência de nucleotideos presente em) os construtosgenéticos. Um marcador de expressão também pode levar emconta opcionalmente a localização do produto expresso, p.ex. em uma parte especifica ou organela de uma célula e/ouem célula(s) especifica (a), tecido(s) , órgão (es) ouparte (s) de um organismo multicelular. Tais genes derepórter também podem ser expressos como uma fusão deproteína com a seqüência aminoácida da invenção. Algunsexemplos preferidos, mas não-restritivos incluem a proteínafluorescente como GFP.

Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos dospromotores convenientes, exterminadores e novos elementosincluem os usados nos Exemplos mais adiante. Para alguns(novos) exemplos não-restritivos dos promotores, marcadoresde seleção, seqüências de lider, marcadores de expressão enovos elementos que podem ser apresentados/usados noconstruto genético da invenção - como exterminadores,realçadores transcricionais e/ou de translação e/ou fatoresde integração - é feita referência aos manuais gerais comoSambrook. e Ausubel acima mencionados, bem como aos exemplosque são dados em WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO98/21355, os US-A-6,207,410, US - - 5,693,492 e EP 1085089.Outros exemplos serão claros para a pessoa experimentada. Areferência também é feita à fundamentos técnicos geraiscitados anteriormente e as novas referências citadas aseguir.

O construto genético da invenção pode ser geralmentefornecido por apropriadamente ligando a seqüência (s)nucleotideos da invenção a um ou vários novos elementosdescritos anteriormente, por exemplo, usando as técnicasdescritas nos manuais gerais como Sambrook. e Ausubel etal., acima mencionado.

Freqüentemente, o construto genético da invenção seráobtido inserindo uma seqüência de nucleotideos da invençãoem um vetor conveniente (expressão) conhecido por si. Algunsexemplos preferidos, mas não-restritivos dos vetores deexpressão convenientes são os usados nos Exemplos maisadiante, bem como os mencionados mais adiante.

Os ácidos nucléicos da invenção e/ou o construtogenético da invenção pode

seja usado para transformar uma célula hospedeira ou oorganismo hospedeiro, isto é, para expressão e/ou produçãode o

Nanobody ou polipeptidio da invenção. Os anfitriõesconvenientes ou as células hospedeiras serão claros para apessoa experimentada, e, por exemplo, podem ser convenientesfungoso, procariótica ou a célula eucariótica ou

linha de célula ou algum conveniente fungoso,procariótica ou organismo eucariotico, por exemplo:

- uma classe bacteriana, inclusive, mas não limitadoa, classes negativas de grama como classes de Escherichiacoli; de Proteus, por exemplo, de Proteus mirabilis; dePseudomonas, por exemplo, de Pseudomonas fluorescens; eclasses positivas de grama como classes de Bacillus, porexemplo, de Bacillus subtilis ou de Bacillus brevis; deStreptomyces, por exemplo, de Streptomyces lividans; deEstafilococo, por exemplo, de Estafilococo carnosus; e deLactococcus, por exemplo, de Lactococcus lactis;

- uma célula fungosa, inclusive, mas não limitado a,células de espécie de Trichoderma, por exemplo, deTrichoderma reesei; de Neurospora, por exemplo/ deNeurospora crassa; de Sordaria, por exemplo, de Sordariamacrospora; de Aspergillus, por exemplo, do NigerAspergillus ou de Aspergillus sojae; ou de outros fungosfilamentosos;

uma célula de levedura, inclusive, mas não limitado a,células de espécie de Saccharomyces, por exemplo, deSaccharomyces cerevisiae; de Schizosaccharomyces, porexemplo, de Schizosaccharomyces pombe; de Pichia, porexemplo, de Pichia pastoris ou de Pichia methanolica; deHansenula, por exemplo, de Hansenula polymorpha; deKluyveromyces, por exemplo, de Kluyveromyces lactis; deArxula, por exemplo, de Arxula adeninivorans; de Yarrowia," por exemplo, de Yarrowia lipolytica;

uma linha de célula ou célula anfibia, como Xenopusoocytes;

uma linha de célula ou célula derivada por inseto,como linhas de células/célula derivadas de lepidoptera,inclusive mas não limitado a Spodoptera SF9 e células Sf21ou as linhas de células/célula derivadas de Drosophila, comoSchneider e células Kc;

uma planta ou célula de planta, por exemplo, emplantas de fumo; e/ou

uma linha de célula ou célula de mamífero, porexemplo, derivada de uma linha de célula ou célula derivadade um ser humano, de mamíferos inclusive mas não limitado aCHO-células, BHK-células (por exemplo, células de BHK-21) ecélulas humanas ou linhas de célula como HeLa, COS (porexemplo, COS 7) e PER C6 células;

bem como todos outros anfitriões ou célulashospedeiras conhecidas por si para a expressão e a produçãode anticorpos e fragmentos de anticorpo (inclusive, mas nãolimitado a, anticorpos de domínio (únicos) e fragmentosScFv), o que ficará claro para a pessoa experimentada. Areferência também é feita à fundamentos técnicos geraiscitados mais acima, bem como a, por exemplo, WO 94/29457; WO96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), supra;Riechmann e Muyldermans, (1999), supra; perua der Tilia,(2000), supra; Thomassen et al., (2002), supra; Joosten etal., (2003), supra; Joosten et al., (2005), supra; e asnovas referências citadas na presente.

nanocorpos e os polipeptidios da invenção também podemser apresentados e expressos em uma ou várias células,tecidos ou órgãos de um organismo multicelular, por exemplo,para objetivos profiláticos e/ou terapêuticos (p. ex. comouma terapia genética). Com esta finalidade, as seqüências denucleotideos da invenção podem ser introduzidas nas célulasou tecidos de qualquer modo conveniente, por exemplo, comotal (p. ex. utilização de liposs ornas) ou depois que elesforam inseridos em um vetor de terapia genético conveniente(por exemplo, derivados de retroviruses como adenovirus, ouparvoviruses como virus adeno-associado). Como também ficaráclaro para a pessoa experimentada, tal terapia genética podeser executada in vivo e/ou em situ no corpo de um pacienteadministrando um ácido nucléico da invenção ou um vetor deterapia genético conveniente codificando o mesmo ao pacienteou a células especificas ou um tecido especifico ou órgão dopaciente; ou as células convenientes (freqüentemente tomadodo corpo do paciente a ser tratado, como linfocitosexplantados, aspirados do tutano dos ossos ou biópsias detecido) podem ser tratadas in vitro com uma seqüência denucleotideos da invenção e logo ser apropriadamente (re)introduzidas no corpo do paciente. Tudo isso pode serexecutado usando vetores de terapia genéticos, técnicas esistemas de entrega que são bem conhecidos à pessoaexperimentada, para Culver, K. W., "Terapia Genética", 1994,p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, Nova York,N.Y.).Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper,Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Ciência 256 (1992),808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lanceta 348(1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Sangue 91; (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5(1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Jogo.: 811 (1997),289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51;Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO97/00957, US 5,580,859; os 1 US 5,5895466; ou Schaper,Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 63 5-640. Porexemplo, expressão in situ de fragmentos ScFv (Afanasieva etal., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) e de diabodies(Blanco et al., J. O Immunol, 171, 1070-1077 (2003)) foidescrito na técnica.Para a expressão dos nanocorpos em uma célula, elestambém podem ser expressos como assim chamados ou como osassim chamados "intracorpos", como, por exemplo, descrito emWO 94/02 610, WO 95/22 618 e USA 7004940; WO 03/014 960; emCattaneo, A. e Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies:Development and Applications. Landes e Springer-Verlag; e emKontermann, Methods 34, (2004), 163-170.

Para a produção, os nanocorpos e os polipeptidios dainvenção, por exemplo, também podem ser produzidos no leitede mamíferos transgênicos, por exemplo, no leite de coelhos,vacas, cabras ou ovelhas (ver, por exemplo, os US-A-6,741,957, os US-A-6,304,489 e US-A-6,849,992 para técnicasgerais para introduzir transgenes em mamíferos), em plantasou partes de plantas inclusive mas não limitado às suasfolhas, flores, frutos, semente, raizes ou tubérculos (porexemplo, em fumo, milho, feijão-soja ou alfafa) ou em, porexemplo, pupas do bicho da seda Bombix mori.

Além disso, os nanocorpos e os polipeptidios dainvenção também podem ser expressos e/ou produzidos emsistemas de expressão sem célula, e os exemplos convenientesde tais sistemas serão claros para a pessoa experimentada.Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos incluem aexpressão no sistema de germe de trigo; em reticulocitelysates em coelhos; ou no E, coli Zubay sistema.

Conforme acima mencionado, uma das vantagens do uso denanocorpos é que os polipeptidios baseados neles podem estarpreparados através de expressão em um sistema bacterianoconveniente,

e os sistemas de expressão bacterianos convenientes,os vetores, as células hospedeiras, os elementosreguladores, etc., serão claros para a pessoa experimentada,por exemplo, das referências citadas anteriormente. Devecontudo ser observado que a invenção no seu sentido maisamplo não é limitada à expressão em sistemas bacterianos.

Preferivelmente, na invenção, um (em vivo ou em vitro)sistema de expressão, como um sistema de expressãobacteriano, é usado que fornece os polipeptidios da invençãoem uma forma que é conveniente para uso farmacêutico, e taissistemas de expressão serão novamente claros para a pessoaexperimentada. Como também ficará claro para a pessoaexperimentada, os Polipeptidios da invenção convenientespara uso farmacêutico podem ser preparados usando técnicaspara sintese de peptideo.

Para produção em escala industrial, anfitriõesheterólogos preferidos para a produção (industrial) denanocorpos ou proteína terapêutica que contém Nanobodyinclui classes de E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiaeque são convenientes para expressão/produção/fermentação emgrande escala, e especialmente paraexpressão/produção/fermentação farmacêutica em grandeescala. Os exemplos convenientes de tais classes serãoclaros para a pessoa experimentada. Tais classes e ossistemas de produção/expressão também são postos àdisposição por companhias como Biovitrum (Úpsala, Suécia).Alternativamente, as linhas de célula de mamíferos, emdeterminadas células dos ovários de hamster chinês (CHO),podem ser usadas para expressão/produção/fermentação emgrande escala, e especialmente paraexpressão/produção/fermentação farmacêutica em grandeescala. Novamente, tais sistemas de expressão/produçãotambém são postos à disposição por algumas companhias acimamencionadas.

A escolha do sistema de expressão especificodependeria em parte do requisito para certas modificaçõespós-translação, mais especificamente glicosilação. Aprodução de uma proteína recombinante que contenha Nanobodypara a qual a glicosilação é desejada ou requerida exigiriao uso de anfitriões de expressão mamíferos que têm acapacidade de glicosilar a proteína expressa. Neste aspecto,estará claro para a pessoa experimentada que o modelo deglicosilação obtido (isto é, a espécie, número e posição deresíduos ligados) dependerá da linha de célula ou célula queé usada para a expressão. Preferivelmente, uma linha decélula ou célula humana é usada (isto é, levar a umaproteína que essencialmente tem um modelo da glicosilaçãohumana) ou outra linha de célula de mamífero é usada quepode fornecer um modelo de glicosilação que é essencialmentee/ou funcionalmente o mesmo como glicosilação humana ou pelomenos imita glicosilação humana. Geralmente, anfitriõesprocarióticos como E. coli não têm a capacidade deglicosilar proteína, e o uso de eucariotes inferiores comolevedura que normalmente leva a um modelo de glicosilaçãoque se diferencia da glicosilação humana. Sem embargo, deveser entendido que todas as células hospedeiras precedentes eos sistemas de expressão podem ser usados na invenção,dependendo do Nanobody desejado ou proteina a ser obtida.

Portanto, segundo uma modalidade de execução não-restritiva da invenção, o Nanobody ou o polipeptidio dainvenção é glicosilado. Segundo outra modalidade de execuçãonão-restritiva da invenção, o Nanobody ou o polipeptidio dainvenção é não-glicosilado.

Segundo uma modalidade de execução preferencial, masnão-restritiva da invenção, o Nanobody ou o polipeptidio dainvenção é produzido em uma célula bacteriana, especialmenteuma célula bacteriana conveniente para produção farmacêuticaem grande escala, como as células das classes acimamencionadas.

Segundo outra modalidade de execução preferida, masnão-restritiva da invenção, o Nanobody ou o polipeptidio dainvenção é produzido em uma célula de levedura,especialmente uma célula de levedura conveniente paraprodução farmacêutica em grande escala, como as células daespécie acima mencionada.

Segundo ainda outra modalidade de execução preferida,mas não-restritiva da invenção, o Nanobody ou o polipeptidioda invenção é produzido em uma célula de mamífero,especialmente em uma célula humana ou em uma célula de umalinha de célula humana, e mais especialmente em uma célulahumana ou em uma célula de uma linha de célula humana que éconveniente a para produção farmacêutica em grande escala,como as linhas de célula mencionadas mais acima.

Quando a expressão em uma célula hospedeira é usadapara produzir os nanocorpos e a proteína da invenção, osnanocorpos e a proteina da invenção podem ser produzidosintracelularmente (p. ex. no cytosol, no periplasma ou emcorpos de inclusão) e logo isolados das células hospedeirase opcionalmente além disso purificados; ou podem serproduzidos extracelularmente (p - ex. no meio no qual ascélulas hospedeiras são cultivadas) e logo isolados do meiode cultura e opcionalmente além disso purificados. Quando ascélulas hospedeiras eucarióticas são usadas, a produçãoextracelular é normalmente preferida desde que istoconsideravelmente facilita a nova isolação e processamentoposterior dos nanocorpos e proteina obtida. As célulasbacterianas como as classes de E. coli acima mencionadasnormalmente não segregam a proteina extracelularmente,exceto algumas classes da proteina como toxinas ehemolisina, e produção secretórios em E. o coli refere-se àdeslocamento da proteina através da membrana interior aoespaço periplásmico. A produção de Periplásmico fornecevárias vantagens por cima da produção citosólica. Porexemplo, o Nterminal amino a seqüência ácida do produtosegregado pode ser idêntico ao produto genético naturaldepois da rachadura da seqüência de sinal de secreção por umsinal especifico peptidase. Também, parece haver muito menosatividade de protease no periplasma do que no citoplasma.Além do mais, a purificação de proteína é mais simplesdevido a menos proteína de contaminação no periplasma. Outravantagem é que as ligações bissulfeto corretas podem formar-se porque o periplasma fornece mais ambiente oxidativo doque o citoplasma. A proteína sobreexpressada em E. colifreqüentemente é encontrada em agregados insolúveis, assimchamados corpos de inclusão. Esses corpos de inclusão podemser localizados no cytosol ou no periplasma; a recuperaçãoda proteína biologicamente ativa desses corpos de inclusãorequer um processo de denaturação/repregado. Muita proteínarecombinante, inclusive a proteína terapêutica, é recuperadade corpos de inclusão. Alternativamente, como estará claropara a pessoa experimentada, classes recombinantes debactérias que foram geneticamente modificadas para segregaruma proteína desejada, e especialmente um Nanobody ou umpolipeptidio da invenção, pode ser usado.

Portanto, segundo uma modalidade de execução não-restritiva da invenção, o Nanobody ou o polipeptidio dainvenção é um Nanobody ou o polipeptidio que foi produzidointracelularmente e foi isolado da célula hospedeira, eespecialmente de uma célula bacteriana ou de um corpo deinclusão em uma célula bacteriana. Segundo outra modalidadede execução não-restritiva da invenção, o Nanobody ou opolipeptidio da invenção é um Nanobody ou o polipeptidio quefoi produzido extracelularmente, e foi isolado do meio noqual a célula hospedeira é cultivada.Alguns promotores preferidos, mas não-restritivos parauso com essas células hospedeiras incluem,

para expressão em E. coli: promotor de lac (ederivados disso como o promotor lacUV5); promotor dearabinose; deixado - (PL) e para a direita (PR) promotor delambda fago; promotor do trp operon; hibrido lac/trppromotores (tac e trc); T7-promotor (mais especificamenteque de 10 genéticos T7-fago) e outros promotores T-fago;promotor do Tn 10 gene de resistência tetraciclina; asvariantes projetadas dos promotores acima mencionados queincluem uma ou várias cópias de uma seqüência de operadorreguladora estranha;

- para expressão em S. cerevisiae: constitutivo: ADH1(álcool dehidrogenase 1) , ENO (enolase), CYC1 (citocromo ciso-1), GAPDH (gliceraldeidos-3-fosfato dehidrogenase); PGKl(fosfoglicerato quinase), PYKl (piruvato quinase); regulado:GAL 1,10,7 (galactose enzimas metabólicas) , ADH2 (álcooldehidrogenase 2), PH05 (ácido fosfatase), XÍCARA I (cobremetalotioneina); heterólogo: CaMV (promotor de 35 de virusde mosaico de couve-flor);

para expressão em Pichia pastoris: o promotorAOXI (álcool oxidase I)

para expressão em células de mamíferos:citomegalovirus humano (hCMV) primeiro realçador/promotorimediato; citomegalovirus humano (hCMV) primeira variante depromotor imediata que contém duas seqüências de operadortetraciclina tal que o promotor pode ser regulado pelo Tetrepressor; Herpes Virus de Simplex timidina quinase (TK)promotor; Vírus de Sarcoma de Rous repetição terminal longa(RSV LTR) realçador/promotor; fator de alongamento la (hEF-la) promotor de ser humano, chimpanzé, rato ou camundongo; oSV40 primeiro promotor; HIV-1 promotor de repetição terminallongo; (promotor 3-actin;

Alguns que os vetores preferidos, mas não-restritivospara uso com essas células hospedeiras incluem:

vetores para expressão em células de mamíferos:pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen) , pMClneo(Stratagene), pSG5 (Stratagene), EB0-pSV2-neo (ATCC 37593),pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC37224) , pRSVgpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198) , pSV2-dhfr(ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) e 1ZD35 (ATCC 37565), bemcomo sistemas de expressão virais, como aqueles baseados emadenovirus;

vetores para expressão em células bacteriais:vetores de estimação (Novagen) e vetores pQE (Qiagen);

vetores para expressão em levedura ou outrascélulas fungosas: pYES2 (Invitrogen) e vetores de expressãoPichia (Invitrogen);

vetores para expressão em células de inseto:pBlueBacII (Invitrogen) e outros vetores baculovirus

vetores para expressão em plantas ou células deplanta:, por exemplo, os vetores baseados em vírus demosaico de couve-flor ou vírus de mosaico de fumo, asclasses convenientes do Agrobacterium, ou Vetores baseadosem Ti-plasmideo.

Algumas seqüências secretoras preferidas, mas não-limitadas para uso com essas células hospedeiras incluem:

para uso em células bacterianas como E. coli:PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, St II, PhoA, PhoE, MalE,Lpp, LamB, e assim por diante; BILRE peptideo de sinal,hemolisina C sinal de secreção terminalpara uso em levedura: acasalando prepro-seqüênciade fator, fosfatase (phol), invertase (Sue) , etc. ;

para uso em células de mamíferos: o sinal nativoem caso de que a proteína objetivo seja de origemeucariótica; os murinos Ig de K-cadeia V-J2-C transmitem opeptideo; etc.

As técnicas convenientes que para transformar umacélula hospedeira ou hospedeiro da invenção serão claras àpessoa experimentada e podem depender do organismohospedeiro/ célula hospedeira desejado e os construtosgenéticos a serem usados. A referência é novamente feita aosmanuais e pedidos de patentes acima mencionados.

Depois da transformação, um passo para detectar eselecionar aquelas células hospedeiras ou organismoshospedeiros que foram com sucesso transformados com aseqüência de nucleotideos / construto genético da invençãopode ser executado. Isto pode ser, por exemplo, um passo deseleção baseado em um marcador selecionável presente noconstruto genético da invenção ou um passo que implica adetecção da seqüência aminoácida da invenção, p. ex. usandoanticorpos especificos.

A célula hospedeira transformada (que pode estar naforma ou uma linha de célula estável) ou organismoshospedeiros (que pode ser na forma de uma linha ou classemutante estável) formam novos aspectos da presenteinvenção.

Preferivelmente, essas células hospedeiras ou osorganismos hospedeiros são tais que eles expressam, ou são(pelo menos) capazes de expressar (p. ex. em condiçõesconvenientes), uma seqüência aminoácida da invenção (e emcaso de um organismo hospedeiro: em pelo menos uma célula,parte, tecido ou órgão disso). A invenção também incluinovas gerações, progênie e/ou descendência da célulahospedeira ou o organismo hospedeiro da invenção, que podeser, por exemplo, obtida pela divisão de célula ou pelareprodução sexual ou assexual.

Produzir/obter a expressão das seqüências aminoácidasda invenção, a célula hospedeira transformada ou o organismohospedeiro transformado podem ser geralmente guardados,mantidos e/ou cultivados em condições tais que a seqüênciaaminoácida (desejada) da invenção é expressada/produzida. Ascondições convenientes serão claras à pessoa experimentada edependerão normalmente do organismo hospedeiro/ célulahospedeira usado, bem como dos elementos reguladores quecontrolam a expressão da seqüência de nucleotideos(relevante) da invenção. Novamente, é feita referência aosmanuais e pedidos de patentes acima mencionados nosparágrafos no construto genético da invenção.

Geralmente, as condições convenientes podem incluir ouso de um meio conveniente, a presença de uma fonteconveniente de nutrimentos alimentares e/ou convenientes, ouso de uma temperatura conveniente, e opcionalmente apresença de um fator de indução ou composto conveniente (p.ex. quando as seqüências de nucleotideos da invenção estãosob o controle de um promotor induzivel); todos os quaispodem ser selecionados pela pessoa experimentada. Novamente,em tais condições, as seqüências aminoácidas da invençãopodem ser expressas em uma maneira constitutiva, de umamaneira transiente, ou só quando apropriadamente induzido.

Também estará claro para a pessoa experimentada que aseqüência aminoácida da invenção pode ser (primeiro) geradaem uma forma imatura (como acima mencionado) , que então podeser submetida à modificação pós-translação, dependendo doorganismo hospedeiro/ célula hospedeira usado. Também, aseqüência aminoácida da invenção pode ser glicosilada,novamente dependendo do organismo hospedeiro/ célulahospedeira usado.

A seqüência aminoácida da invenção então pode serisolada do organismo hospedeiro/ célula hospedeira e/ou domeio no qual os referidos célula hospedeira ou organismohospedeiro foram cultivados, usando isolação de proteínae/ou técnicas de purificação conhecidas por si, comocromatografia (preparativo) e/ou técnicas de eletroforese,técnicas de precipitação diferenciais, técnicas de afinidade(p. ex. usando uma seqüência aminoácida especifica,separável fundida com a seqüência aminoácida da invenção)e/ou técnicas imunológicas preparativas (isto é, usandoanticorpos contra a seqüência aminoácida a ser isolada).

Geralmente, para uso farmacêutico, os polipeptidios dainvenção podem ser formulados como uma preparaçãofarmacêutica que compreende pelo menos um polipeptidio dainvenção e pelo menos uma transportadora farmaceuticamenteaceitável, diluente ou excipiente e/ou adjuvante, eopcionalmente um ou vários polipeptidios novosfarmaceuticamente ativos e/ou compostos. Por meio deexemplos não-restritivos, tal formulação pode estar em umaforma conveniente para administração oral, paraadministração parenteral (como por inj eção intravenosa,intramuscular ou subcutânea ou infusão intravenosa) , paraadministração tópica, para administração pela inalação, porum adesivo na pele, por um implante, por um supôsitório,etc.. . Tais formas de administração convenientes - que podeser sólido, semi-sólido ou liquido, dependendo da maneira deadministração - bem como métodos e transportadoras para usona preparação disso, serão claras à pessoa experimentada, esão além disso descritas a seguir.

Portanto, em um novo aspecto, a invenção refere-se auma composição farmacêutica que contém pelo menos umNanobody da invenção ou pelo menos um polipeptidio dainvenção e pelo menos uma transportadora conveniente (istoé, uma transportadora conveniente para uso veterinário) , eopcionalmente uma ou várias novas substâncias ativas.

Uma modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio a compreensão:

pelo menos um Nanobody da invenção, isto é, dirigidocontra algum de vWF, vWF dominio de Al, domínio de Al de vWFativado, vWF A3 dominio.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio conforme descrito acima, em que oNanobody da invenção dirigida contra o dominio de Al de vWFativado especificamente reconhece a conformação vWF ativadano sitio da formação trombo mas não liga à circulação dasformas não ativadas do vWF.

O nanocorpos da invenção também pode ser dirigidocontra um fragmento de vWF, vWF Al dominio, o dominio de Alde vWF ativado, vWF A3 dominio, como um fragmento capaz deeliciar uma resposta imune. Um objetivo é também umfragmento de vWF, vWF dominio de Al, o dominio de Al de vWFativado, vWF A3 dominio, capaz da ligação a um Nanobody dainvenção levantado contra o objetivo de comprimento completo1 de pais 1 .

Um fragmento conforme usado na presente refere-se amenos de 100% da seqüência (p. ex., 99%, 90%, 80%, 70%, 60%,50%, 40%, 30%, 20%, 10% etc), mas compreendendo 5, 6, 7, 8,9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25 ou mais aminoácidos. Um fragmento é do comprimentosuficiente tal que a interação do interesse é mantida com aafinidade de 1 10-6 M x ou melhor.Um fragmento conforme usado na presente também serefere a inserções opcionais, as eliminações e assubstituições de um ou vários aminoácidos que não alteramsubstancialmente a capacidade do objetivo de ligar a umNanobody da invenção levantaram contra o objetivo de tiponatural. 0 número de eliminações de inserções aminoácidas ousubstituições está à altura preferivelmente 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 2 6, 27, 28, 2 9, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,67, 68, 69 ou 70 aminoácidos.

Um Nanobody da invenção dirigida contra um obj etivogeralmente significa Nanobody da invenção que é capaz daligação ao seu objetivo com uma afinidade de melhor do que10-6 M.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptídio conforme descrito acima em quepelo menos um Nanobody da invenção é uma seqüênciahumanizada.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio conforme descrito acima em quepelo menos um Nanobody da invenção é um Carnelidae VHHanticorpo.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio conforme descrito acima, em que oreferido Nanobody da invenção é uma seqüência homóloga, umaporção funcional, ou uma porção funcional de uma seqüênciahomóloga de nanobody de o comprimento completo da invenção.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio conforme descrito acima, em que osreferidos que construtos de polipeptidios é uma seqüênciahomóloga do referido construto polipeptidio, uma porçãofuncional disso, de uma seqüência homóloga de uma porçãofuncional disso.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio conforme descrito acima, alémdisso compreendendo pelo menos um Nanobody da invençãodirigida contra uma ou várias proteina de soro,especialmente uma ou várias proteina de soro humana.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio conforme descrito acima em que osreferidos pelo menos que uma (humana) proteina de soro éalguma de albumina de soro (humana) , imunoglobulinas de soro(humanas), proteina ligada com tiroxina (humana) ,transferrina (humano), ou fibrinogênio (humano) ou umfragmento disso.

Segundo um aspecto especifico, mas não-restritivo dainvenção, os polipeptidios da invenção contêm, além de um ouvários nanocorpos da invenção, pelo menos um Nanobody contrauma albumina de soro humano. Embora esses nanocorpos contrauma albumina de soro humano possam ser como geralmentedescritos em W04/062551 ou nas novas referências citadas

nisso, segundo uma modalidade de execução emparticular preferencial, mas não-restritiva, os referidosque o Nanobody contra uma albumina de soro humano se compõede 4 regiões de armação (FR1 a FR4 respectivamente) e 3regiões que determinam complementaridade (CDR1 a CDR3respectivamente) , em que: i) 0 CDRl é uma seqüênciaaminoacida escolhida do grupo composto de :

SFGMS [SEQ ID n. 44]

LNLMG [SEQ lo n. 4 5]

INLLG [SEQ ID n. 46]

NYWMY; [SEQ ID n. 47]

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 2 ou só 1 "diferença (s) aminoacida (s) " (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(2) a referida seqüência aminoacida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as acimamencionadas seqüências aminoácidas;

e em que:

ii) O CDR2 é uma seqüência aminoacida escolhidado grupo composto de :

SISGSGSDTLYADSVKG [SEQ ID n. 48]

TITVGDSTNYADSVKG [SEQ ID n. 49]

TITVGDSTSYADSVKG [SEQ ID n. 50]SINGRGDDTRYADSVKG [SEQ ID n. 51]

AISADSSTKNYADSVKG [SEQ ID n. 52]

AISADSSDKRYADSVKG [SEQ ID n. 53]

RISTGGGYSYYADSVKG [SEQ ID n. 54]

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as acimamencionadas seqüências aminoácidas;

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas

acima mencionadas, em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as acimamencionadas seqüências aminoácidas;e em que:

iii) 0 CDR3 é uma seqüência aminoácida escolhidado grupo composto de :

DREAQVDTLDFDY [SEQ ID n. 55]

ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 8 0%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das seqüências aminoácidas acimamencionadas; em que

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as acimamencionadas seqüências aminoácidas;ou do grupo composto de :

GGSLSR [SEQ ID n. 56] RRTWHSEL [SEQ ID n. 57] GRSVSRS[SEQ ID n. 58] GRGSP [SEQ ID n. 59]

e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só I "diferença(s) aminoácida(s)" (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as acimamencionadas seqüências aminoácidas.

Em outro aspecto, a invenção refere-se ao Nanobodycontra vWF, que se compõem de 4 regiões de armação (FR1 aFR4 respectivamente) e 3 complementar a determinação deregiões (CDR/a CDR3 respectivamente), que é escolhido dogrupo composto de nanocorpos com aquela das combinaçõesseguintes de CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente: - CDR1:SFGMS; CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG; CDR3: GGSLSR;

CDR1: LNLMG; CDR2: T1TVGDSTNYADSVKG; CDR3:RRTWHSEL;

CDR1: INLLG; CDR2: TITVGDSTSYADSVKG; CDR3:RRTWHSEL;CDR1: SFGMS; CDR2: SINGRGDDTRYADSVKG; CDR3 :GRSVSRS;

CDR1: SFGMS; CDR2: AISADSSDKRYADSVKG; CDR3:GRGSP;

CDR1: NYWMY; CDR2: RISTGGGYSYYADSVKG;

CDR3: DREAQVDTLDFDY.

Nos nanocorpos da invenção que compreendem ascombinações do CDR'S acima mencionadas, cada CDR pode sersubstituído por um CDR escolhido do grupo composto deseqüências aminoacidas que têm pelo menos 8 0%,pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% (conforme definido na presente) com oCDRfS mencionado; em que

(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoacidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoacidas, em comparação com as acimamencionadas seqüências aminoacidas;

e/ou escolhido do grupo composto de seqüênciasaminoacidas que têm 3, 2 ou só I (como indicado no parágrafoprecedente) "diferença (s) aminoácida(s)" (conforme definidona presente) com o CDR mencionado (s) um do acima mencionadoseqüências aminoácidas, em que:

Contudo, dos nanocorpos da invenção que compreendem ascombinações do CDR'S acima mencionadas, nanocorpos quecompreendem um ou vários do CDR1S enumerado anteriormentesão em particular preferidos; os nanocorpos compreensão dedois ou mais do CDR1 S enumerado anteriormente são mais emparticular preferidos; e os nanocorpos compreensão de trêsdo CDR'S enumerado anteriormente são mais em particularpreferidos.

Nesses nanocorpos contra uma albumina de soro humano,as regiões de Armação FR1 a FR4 são pref erivelmente comodefinidos mais acima para os nanocorpos da invenção.

nanocorpos em particular preferidos contra umaalbumina de soro humano são escolhidos do grupo composto deSEQ ID NO1 s: 107-121. Esses correspondem ao nanocorposcontra uma albumina de soro humano de SEQ ID NO's: 61 para67, SEQ ID NO's 87 para 89 e SEQ ID NO's 100-104 daaplicação provisória dos Estados Unidos co-pendente desolicitante "nanocorpos11*1 Melhorado intitulado contra FatorAlfa de Necrose Tumoral" com uma data que entra do dia 18 deMaio de 2005.

Mais geralmente, nanocorpos contra a albumina de soroconveniente para uso na invenção são descritos nasolicitação internacional pelo solicitante intitulado"albumina de soro proteina de ligação" com uma data dearquivamento internacional do dia 17 de Maio de 2006.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umácido nucléico que codifica um construto de polipeptidioconforme descrito acima.

Outra modalidade de execução da presente invenção éuma composição que compreende um construto de polipeptidioconforme descrito acima e pelo menos um agente trombolitico,para administração simultânea, separada ou subseqüente a umsujeito.

Outra modalidade de execução da presente invenção estáuma composição conforme descrito acima em que os referidosque o agente trombolitico é algum de estafiloquinase,ativador plasminogênico de tecido, estreptoquinase,estreptoquinase de cadeia única, uroquinase e complexo deestreptoquinase acil plasminogênico.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio conforme descrito anteriormente,ou um ácido nucléico conforme descrito anteriormente, ou umacomposição como descrito acima de para o uso no tratamento,prevenção e/ou alivio de desordens que se relacionam comagregação mediana de plaqueta ou disfunção disso.Outra modalidade de execução da presente invenção é umuso de um construto de polipeptidio conforme descritoanteriormente, ou um ácido nucléico conforme descritoanteriormente, ou uma composição como descrito acima para apreparação de um medicamento para o tratamento, prevençãoe/ou alivio de desordens que se relacionam com agregaçãomediana de plaqueta ou disfunção disso.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio, ácido nucléico ou a composiçãoconforme descrito acima ou um uso de um construtos depolipeptidios, ácido nucléico ou composição conformedescrito acima em que as referidas desordens são algum queresulta de ataque de isquemia cerebral transiente, anginainstável ou estável, angina pectoris, enfarte cerebral,enfarte do miocárdio, doença oclusiva arterial periférica,restenose, enxerto de desvio coronário, ou substituição deválvula de artéria coronária e intervenções coronárias talangioplastia, stenting, endarterectomia carótida ouaterectomia.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio, ácido nucléico ou a composiçãoconforme descrito acima ou um uso de um construtos depolipeptidios, ácido nucléico ou composição conformedescrito acima em que as referidas desordens são alguma daformação de um trombo não-oclusivo, a formação de um trombooclusivo, formação trombo arterial, oclusão coronária aguda,restenose, restenose depois de PCTA ou stenting, tromboformação em artérias estenosadas, hiperplasia depoisangioplastia, aterectomia ou stenting arterial, sindromeoclusiva em um sistema vascular ou a falta de revelação deartérias de doente.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio, ácido nucléico ou a composiçãoconforme descrito acima ou um uso de um construtos depolipeptidios, ácido nucléico ou composição conformedescrito acima em que os referidos que a desordem é a placaou a formação trombo em altos ambientes absolutos.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconstruto de polipeptidio, ácido nucléico ou a composiçãoconforme descrito anteriormente ou um uso de um construtosde polipeptidios conforme descrito acima em que os referidosque construtos de polipeptidios é administradointravenosamente, subcutaneamente, oralmente,sublingualmente, topicamente, nasalmente, vaginalmente,retalmente ou pela inalação.

Outra modalidade de execução da presente invenção éuma composição que compreende um construto de polipeptidioconforme descrito acima ou um ácido nucléico que codifica osreferidos que o construtos de polipeptidios, ou umacomposição conforme descrito acima e um veiculofarmaceuticamente aceitável.

Outra modalidade de execução da presente invenção é ummétodo de produzir um polipeptidio conforme descrito acima,compreendendo(a) cultivo de células hospedeiras compreendendo ácidonucléico capaz de codificar um polipeptidio conformedescrito acima em condições que permitem a expressão dopolipeptidio, e, (b) recuperação do polipeptidio produzidoda cultura.

Outra modalidade de execução da presente invenção é ummétodo conforme descrito acima, em que as referidas célulashospedeiras são bacterianas ou levedura.

Outra modalidade de execução da presente invenção é ummétodo para tratar dispositivos médicos invasivos paraimpedir agregação mediana de plaqueta em volta do sitio dainvasão que compreende o passo do revestimento de ditodispositivo com um construto de polipeptidio conformedescrito acima.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umdispositivo médico invasivo que para logra agregação medianade plaqueta em volta do sitio da invasão, em que osreferidos que o dispositivo é coberto de um construto depolipeptidio conforme descrito acima.

Outra modalidade de execução da presente invenção é ummétodo de identificar um agente que modula compreender aagregação mediada por plaqueta

(a) contatar com construtos de polipeptidios conformedescrito acima com um polipeptidio correspondente ao seuobjetivo, ou um fragmento disso, na presença e a ausência deum modulador candidato em condições que permitem a ligaçãoentre ditos polipeptidios, e(b) medir a ligação entre os polipeptidios do passo(a) / em que uma redução na ligação na presença do referidomodulador candidato, quanto à ligação na ausência doreferido modulador candidato identificado o referidomodulador candidato como um agente que modula a agregaçãoplatelet-mediatizada.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconjunto para proteger agentes que modulam a agregaçãomediada por plaqueta segundo o método conforme descritoacima.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umagente desconhecido que modula a agregação mediada porplaqueta identificada segundo o método conforme descritoacima.

Outra modalidade de execução da presente invenção é ummétodo de diagnosticar uma doença ou a desordemcaracterizada pela disfunção da agregação mediada porplaqueta que compreende os passos de :

(a) contatar uma amostra com um construtos de polipeptidios conforme descrito acima, e

(b) o descobrimento da ligação do referido construtode polipeptidios à referida amostra, e

(c) a comparação da ligação descobriu no passo (b) comum padrão, em que uma diferença na ligação quanto à referidaamostra é o diagnóstico de uma doença ou desordemcaracterizada pela disfunção da agregação mediada porplaqueta.Outra modalidade de execução da presente invenção é umconjunto que protege para diagnosticar uma doença oudesordem caracterizada pela disfunção da agregação mediadapor plaqueta segundo o método conforme descrito acima.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umconjunto conforme descrito acima da compreensão de umconstruto de polipeptidio conforme descrito acima.

Nos polipeptidios da invenção, um ou vários nanocorposda invenção que são dirigidos contra um objetivo podem serda mesma seqüência. Alternativamente eles podem não tertodos a mesma seqüência. É dentro dos limites da invençãoque um polipeptidio da invenção compreende o anti-nanocorposobjetivo da invenção que não compartilham todos a mesmaseqüência, mas que são dirigidos contra o mesmo objetivo, oufragmento disso, um ou vários antigenos disso.

Ele é outro aspecto da invenção que o polipeptidio dainvenção compreende dois ou mais nanocorpos da invenção, emque quaisquer dois nanocorpos da invenção são dirigidoscontra epitopes/alvos diferentes, isto é, contra algum devWF, vWF domínio de Al, domínio de Al de vWF ativado,dominio vWF A3.

Outro aspecto da invenção é um polipeptidiobiespecifico da invenção que compreende um Nanobody dainvenção dirigida contra o dominio de Al vWF, o dominio deAl de vWF ativado, e outro Nanobody da invenção dirigidacontra vWF A3 dominio. Dito polipeptidio biespecifico dainvenção inibe a interação entre vWF e colágeno, e ainteração entre vWF e plaquetas.

Segundo um aspecto da presente invenção umpolipeptídio da invenção pode compreender dois ou maisnanocorpos da invenção que foram juntados. os nanocorpos dainvenção pode ser idêntico na seqüência e dirigido contra omesmo objetivo ou antigeno.

Dependendo do núme ro de VHHS 1 igado, um VHHmultivalente pode ser bivalente (2 VHHS), trivalente (3VHHs), tetravalente (4 VHHS) ou ter umas mais altasmoléculas de valência.

A presente invenção também se relaciona ao achado queum polipeptidio da invenção que, além disso, compreende umou vários nanocorpos da invenção cada um dirigido contra umasignificativamente a meia-vida na circulação do dito sujeitocomparado com a meia-vida do anti-Nanobody objetivo dainvenção (ões) quando não a parte dos referidos construtos.Além disso, acima citado construtos foram encontrados paraexpor as mesmas propriedades favoráveis de VHHs como altaestabilidade que permanece intactos em ratos, resistência depH extrema, alta estabilidade de temperatura e altaafinidade de objetivo. A proteína de soro pode ser qualquerproteína conveniente encontrada no soro de sujeito, oufragmento disso. Em um aspecto da invenção, a proteína desoro é albumina de soro, imunoglobulinas de soro, proteínaligada com tiroxina, transferrina, ou fibrinogênio.Dependendo do uso desej ado como a meia-vida requerida paratratamento eficaz e/ou compartimentalização do antígeno deobjetivo, o VHH-parceiro pode ser dirigido a uma da acimamencionada proteína de soro.

Tais construtos são capazes de fazer circular no sorodo sujeito por vários dias, reduzindo a freqüência dotratamento, a inconveniência ao sujeito e resultando em umcusto reduzido do tratamento. Além disso, é um aspecto dainvenção que a meia-vida do polipeptídio da invençãorevelada na presente pode ser controlada pelo número de nanobodies de proteína anti-soro do construto da presenteinvenção. Uma meia-vida controlável é desejável em váriascircunstâncias, por exemplo, na aplicação de uma dosedeterminada de um polipeptídio terapêutico da invenção.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umpolipeptídio da invenção como mencionado na presente, alémdisso compreendendo um agente trombolítico.

Dito agente trombolítico pode ser não-covalentementeou covalentemente ligado a um Nanobody da invenção via meiosnão-covalentes ou covalentes. Tais meios covalentes sãodescritos mais adiante. Os meios Não-covalentes incluem viauma interação de proteína como biotina/estrepavidina, ou viaum imunoconjugado.

Alternativamente, o agente trombolítico pode seradministrado simultâneo, separado ou subseqüente a respeitode um polipeptídio da invenção.

Outro aspecto da invenção é uma composição quecompreende pelo menos um polipeptídio da invenção e pelomenos um agente trombolitico, para administração simultânea,separada ou subseqüente a um sujeito.

Um aspecto da invenção é um método para trataradministração de compreensão de doença autoimune a umindivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos umpolipeptidio da invenção e pelo menos um agentetrombolitico, simultaneamente, separadamente ou emseqüência.

Outro aspecto da invenção é um conjunto que contémpelo menos um polipeptidio da invenção e pelo menos umagente trombolitico para administração simultânea, separadaou subseqüente a um sujeito. É um aspecto da invenção que oconjunto pode ser usado segundo a invenção. É um aspecto dainvenção que o conjunto pode ser usado para tratar asdoenças como citado na presente.

Por meios de administração simultâneos que opolipeptidio e o agente trombolitico são administrados a umsujeito ao mesmo tempo. Por exemplo, como uma mistura ou umacomposição que compreende disseram componentes. Os exemplosincluem, mas não são limitados a uma solução administradaintravenosamente, uma pastilha, creme liquida, tópica, etc.,em que cada preparação compreende os componentes dointeresse.

Por que polipeptidio de meios de administraçãoseparado e agente trombolitico são administrados a umsujeito ao mesmo tempo ou substancialmente o mesmo tempo. Oscomponentes estão presentes no conjunto como preparaçõesseparadas, não misturadas. Por exemplo, o polipeptidio e

o agente de trombolitico pode estar presente noconjunto como pastilhas individuais. As pastilhas podem seradministradas ao sujeito engolindo ambas as pastilhas aomesmo tempo, ou uma pastilha diretamente depois do outro.

Por meios de administração seqüentes que opolipeptidio e o agente trombolitico são administrados a umsujeito em seqüência. 0 polipeptidio e o agente tromboliticoestão presentes no conjunto como preparações separadas, nãomisturadas. Há um intervalo de tempo entre doses. Porexemplo, um componente poderia ser administrado até 336,312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24,20, 16, 12, 8, 4, 2, 1, ou 0.5 horas depois de outrocomponente.

Na administração subseqüente, um componente pode seradministrado uma vez, ou qualquer número de tempos e emvárias doses antes e/ou depois da administração de outrocomponente. A administração subseqüente pode ser combinadacom a administração simultânea ou subseqüente.

Os usos médicos do polipeptidio da invenção descritamais adiante, também se aplique à composição que compreendeum polipeptidio da invenção e pelo menos um polipeptidioagente trombolitico, para administração simultânea, separadaou subseqüente a um sujeito como revelado aquianteriormente.

Os agentes de Trombolitico segundo a invenção podemincluir, por exemplo, estafiloquinase, ativadorplasminogênico de tecido, estreptoquinase, estreptoquinasede cadeia única, uroquinase e complexo de estreptoquinaseacil plasminogênico.

O nanocorpos da invenção pode ser juntado para formaralgum do polipeptidio da invenção revelada na presentecompreendendo mais de um Nanobody da invenção que usamétodos conhecidos na técnica ou qualquer futuro método. Porexemplo, eles podem ser fundidos pela ligação cruzadaquimica reagindo resíduos aminoácidos com um agentederivatização orgânico como descrito por Blattler e al,Bioquímica 24,1517-152 4; EP2 947 03. Alternativamente, oNanobody da invenção pode ser fundido geneticamente ao nivelde ADN isto é, um construto polinucleotideo formado quecodifica o polipeptidio completo da invenção que compreendeum ou vários anti-nanobodies alvo da invenção e um ou váriosnanobodies de proteina anti-soro da invenção. Um método quepara produz bivalente ou multivalente VF-, o polipeptidio dainvenção é revelado na aplicação de patente PCT WO 96/34103.Um modo de juntar múltiplos nanobodies da invenção é atravésda via genética ligando Nanobody da invenção que codificaseqüências diretamente ou via um linker de peptideo. Porexemplo, o fim de C-terminal do primeiro Nanobody dainvenção pode ser ligado ao fim do N-terminal do seguinteNanobody da invenção. Este modo de vinculação pode serestendido para ligar nanocorpos adicionais da invenção paraa construção e a produção de construtos tri-, tetra-, etc.funcionais.O polipeptidio da invenção revelada na presente podeser feito pelo técnico experimentado segundo os métodosconhecidos na técnica ou qualquer futuro método. Porexemplo, VHHS pode ser obtido usando métodos conhecidos natécnica como imunizando um camelo e obtendo hibridomasdisto, ou clonando uma biblioteca de nanocorpos da invençãoque usa técnicas de biologia moleculares conhecidas naseleção de arte e subseqüente usando fago-exposição.

Os nanocorpos têm uma estrutura única que se compõe deum domínio variável único. As moléculas de VHH derivaram deanticorpos Camelidae estão entre os domínios de ligação deantigeno intatos menores conhecidos (aproximadamente 15 kDa,ou 10 vezes menores do que um IgG convencional) e daqui sãobem ajustados em direção à entrega a tecidos densos e para oacesso do espaço limitado entre macromoléculas queparticipam em ou começam o processo da plaqueta mediadas aagregação.

Apesar do pequeno tamanho de nanobodies, e portantovantagens para penetração, é ainda surpreendente que uma tãopequena molécula possa inibir interações entre o grandepolímero como vWF (até 60 monômeros) e colágeno e com umatão alta eficiência. Foi descrito que só as grandes formasmui time ricas de vWF são hemos taticamente ativas (Furlan, M.1996, Ann. Hematol. 72:341-348). A ligação de multiméricasvWF a colágeno ocorre com - mais alta afinidade de 100 vezesdo que a ligação de monoméricas vWF fragmentos.

Os resultados de experimentos de alto corte indicamque uma dose mais baixa pode ser administrada a pacientes.Por isso, menos efeitos colaterais são esperados (comoimunogenicidade ou problemas de sangramento).

Em outra modalidade de execução da presente invenção,um polipeptidio da invenção compreende um ou váriosnanocorpos da invenção dirigida ao mesmo objetivo, e alémdisso compreende um ou vários nanocorpos da invençãodirigida ao mesmo objetivo mas a um epitope diferente nomesmo domínio.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umpolipeptidio da invenção em que o número de nanocorpos dainvenção dirigida ao mesmo objetivo é dois ou mais.

Em outra modalidade de execução da presente invenção,um polipeptidio da invenção compreende um ou váriosnanocorpos da invenção dirigida a um dominio do mesmoobjetivo, e um ou vários nanocorpos da invenção dirigida aomesmo objetivo mas a outro dominio do mesmo objetivo. Osexemplos de dominios diferentes poderiam ser Al e domíniosA3 de vWF

Ele é aquele o aspecto não-restritivo da invenção quepelo menos um VHH dirigido ao dominio de Al em umpolipeptidio heteroespecificos da invenção reconhece aconformação ativa de vWF. Tal polipeptidio da invenção podeter efeitos anti-trombóticos superiores em comparação com oVHH'S monoméricas. O experimento de perfusão foi executadoem uma câmara de fluxo, estudar agregação de plaqueta sobalto corte para estudar os efeitos dos polipeptidio dainvenção.

A descoberta de naturalmente ocorrer nanocorpos dainvenção em lhama, dromedário e camelo revelou uma novaclasse de moléculas terapêuticas que combinam as vantagensde anticorpos monoclônicos, por exemplo, especificidade,toxicidade baixa com as vantagens de pequenas moléculas, porexemplo, penetração de tecido e estabilidade. Infelizmente,o desenvolvimento de produtos terapêuticos apropriadosbaseados nessa proteina tem o desconto de ser Carnelidaederivado, e portanto não ser humano. A proteina não-humanacontém resíduos aminoácidos que podem ser imunogênicosquando injetados em um paciente humano. Embora os estudostenham mostrado que VHH Carne lidae-derivados não sãoimunogênica quando injetado em ratos, substituindo resíduosde Camelidae por resíduos humanos é preferível. Essespolipeptidios humanizados devem ser substancialmente não-imunogênica em seres humanos, mas reter a afinidade e aatividade do polipeptidio de tipo natural.

O resultado de humanização é preferivelmente queimunogenicidade sobre a administração em pacientes humanos émenor ou não existente. Humanização de um polipeptidio,segundo a invenção presente, compreende um passo desubstituir um ou vários dos Camelidae aminoácidos pelo seuduplo humano como encontrado na seqüência de consensohumana, sem aquele polipeptidio que perde o seu carátertipico, isto é, a humanização não afeta significativamente acapacidade de ligação do antigeno do polipeptidioresultante.

Os WO 04/0 62551 e a nova descrição na presentedescrevem alguns exemplos preferidos, mas não-restritivosdos resíduos aminoácidos do dominio variável de anticorpo(VHH) que pode ser modificado sem diminuir a afinidadenativa do dominio para antigeno e reduzindo o seuimunogenicidade com respeito a uma espécie heteróloga; o usode VHHS tendo modificações nos resíduos identificados quesão úteis para a administração à espécie heteróloga; e aoVHH assim modificado. Mais especificamente, a invençãotambém abrange a preparação de VHHS modificados, que sãomodificados para administração a seres humanos, o próprioVHH resultante, e o uso de tal VHHS "humanizado" notratamento de doenças em seres humanos.

Como mencionado em WO 04/062551 e na nova descrição napresente, a humanização de polipeptidios VHH requer aintrodução e mutagenese de só um número limitado deaminoácidos em uma cadeia de polipeptidio única sem a perdadramática de atividade de inibição e/ou ligação. Isto é, emcontraste com a humanização de scFv, Fab, (Fab) 2 e IgG, querequer a introdução de modificações aminoácidas em duascadeias, a cadeia leve e pesada e a preservação da união deambas as cadeias.

Uma técnica humanização pode ser executada por ummétodo que compreende a substituição de algum dos resíduosseguintes sozinhos ou em combinação: posições de FR1 1, 5,28 e 30, o Hallmark aminoácido na posição 37, 44, 45 e 47 emFR2, resíduos de FR3 74, 75, 76, 83, 84, 93 e 94 e posições103, 104, 108 e 111 em FR4; numeração segundo a numeração deKabat.

Os nanocorpos da invenção têm um alto grau dahomologia a germline humano VH DP-47. A nova humanizaçãotambém pode implicar a introdução e mutagenese de umaquantidade limitada de aminoácidos em uma cadeia depolipeptidio única. Isto é, em contraste com a humanizaçãode scFv, Fab, (Fab) 2 e IgG, que requer a introdução demodificações aminoácidas em duas cadeias, a cadeia leve epesada e a preservação da união de ambas as cadeias.

Os polipeptidios contêm resíduos parecidos a um serhumanos em FR2. A humanização também pode implicarmutagenese de resíduos em FR1 na posição 1 e 5 que foramintroduzidos pelo escorvador usado para clonagem derepertório e não ocorrer naturalmente na seqüência de lhama.A Mutagenese daqueles resíduos não resultou na perda deatividade de inibição e/ou ligação. A humanização de FR1também requereu mutagenese da posição 28 e 30. A Mutagenesedaqueles resíduos também não resultou na perda de atividadede inibição e/ou ligação.

A humanização também pode implicar mutagenese deresíduos em FR3 na posição 74, 75, 76, 83, 84, 93, 94. AMutagenese daqueles resíduos não resultou na perda deatividade de inibição e/ou ligação.

A humanização também pode implicar mutagenese deresíduos em FR4 na posição 104, 108 e 111. A Mutagenese deQ108L resultou no nível de produção mais baixo emEscherichia coli. A posição 108 é exposta a solvente em VHHcamelídeo, enquanto em anticorpos humanos esta posição éenterrada na interface VH-VL (Spinelli, 1996; Nieba, 1997).Na posição VHS isolada 108 é exposta a solvente. Aintrodução de um hidrofóbico não-polar Leu em vez de polarnão mudado que Gln pode ter um efeito drástico nadobrabilidade/estabilidade intrínseca da molécula.

Uma modalidade de execução da presente invenção é ummétodo que para humaniza um VHH compreendendo os passos de:

(a) substituição de algum dos resíduos seguintessozinhos ou em combinação: posições de FRl 1, 5, 28 e 30,o Hallmark aminoácido na posição 37, 44, 45 e 47 emFR2,

Resíduos de FR3 74, 75, 76, 83, 84, 93 e 94,e posições 103, 104, 108 e 111 em FR4;numeração segundo a numeração de Kabat.Os exemplos de tais seqüências humanizadas são dadosmais adiante e na listagem de seqüência em anexo.

0 uso de anticorpos derivados de fontes como rato,ovelhas, cabra, coelho etc, e derivados humanizados dissocomo um tratamento para condições que requerem uma modulaçãoda agregação associada por plaqueta, é problemático paravárias razões. Os anticorpos tradicionais não são estáveisna temperatura ambiente, e têm de ser refrigerados parapreparação e armazenamento, requerendo equipamento delaboratório refrigerado necessário, armazenamento etransporte, que aumentam o tempo e a despesa. A refrigeraçãonão é às vezes f ativei em pai se s em desenvolvimento. Osrendimentos da expressão de ditas moléculas de Fab são muitobaixos e o método da produção é muito de trabalho intensivo.Além disso, a fabricação ou a produção em escala modesta deditos anticorpos são caras porque os sistemas celularesmamíferos necessários para a expressão de anticorpos intatose ativos requer altos niveis do suporte quanto a tempo eequipamento, e os rendimentos são muito baixos. Além disso,os anticorpos tradicionais têm uma atividade de ligação quedepende de pH, e daqui é imprópria para uso em ambientesfora da variedade de pH fisiológica habitual como, porexemplo, no tratamento de hemorragia gástrica, cirurgiagástrica. Além disso, os anticorpos tradicionais sãomovediços em pH baixo ou alto e daqui não convenientes paraadministração oral. Contudo, foi demonstrado que osanticorpos camelideos resistem condições ásperas, como pHextremo, reagentes desnaturantes e altas temperaturas (EwertS e al, Bioquímica 2002 19 de março; 41 (11) : 3628-36) ,fazendo assim eles convenientes para administração poradministração oral. Além disso, os anticorpos tradicionaistêm uma atividade de ligação que depende da temperatura, edaqui é imprópria para uso em ensaios ou conjuntosexecutados em temperaturas fora de variedades biologicamentede temperatura ativas (p. ex. 37 ± 20°C).

Os nanocorpos e os polipeptidios da invenção não sópossuem as características vantajosas de anticorposconvencionais, como toxicidade baixa e alta seletividade,mas eles também expõem propriedades adicionais. Eles sãomais solúveis, significando que eles podem ser fornecidose/ou administrados em mais altas concentrações comparadascom anticorpos convencionais. Eles são estáveis nasignificação de temperatura ambiente eles podem estarpreparados, fornecidos e/ou transportados sem o uso doequipamento de refrigeração, transmitindo um custo, tempo eeconomias ambientais. Outras características vantajosascomparando com anticorpos convencionais incluem a meia-vidacurta na circulação que pode ser modulada segundo a invençãopor, por exemplo, a união de albumina, um biespecificonanobody com uma especificidade contra a albumina e outrocontra o objetivo, união de Fe, VFIH que liga (VHHSbivalente) ou por pegilação. Uma meia-vida curta econtrolável é desejável procedimentos para cirúrgicos, porexemplo, que requerem uma inibição da agregação mediada porplaqueta por um tempo limitado periodo. Também, quando osproblemas sangradores ocorrem ou outras complicações, adosagem pode ser abaixada imediatamente. Os polipeptidios dapresente invenção também retêm a atividade de ligação em umpH e temperatura fora daqueles de variedades fisiológicashabituais, que significa que eles podem ser úteis emsituações de pH extremo e temperatura que requerem umamodulação da agregação mediada por plaqueta, como nacirurgia gástrica, controle da hemorragia gástrica, ensaiosexecutados na temperatura ambiente etc. Os polipeptidios dapresente invenção também expõem uma estabilidade prolongadaem extremes de pH, significando que eles seriam convenientespara a entrega pela via oral. Os polipeptidios da presenteinvenção podem ser rentavelmente produzidos através defermentação em organismos hospedeiros de recombinanteconvenientes como Escherichia coli e levedura;diferentemente de anticorpos convencionais que tambémrequerem facilidades de cultura de célula de mamíferoscaras, os níveis realizáveis da expressão são altos. Osexemplos de rendimentos dos polipeptidios da presenteinvenção são 1 para 10 mg/ml (E. coli) e até 1 g/l(levedura) . Os polipeptidios da presente invenção tambémexpõem a alta afinidade de ligação para uma larga variedadede tipos de antígeno diferentes, e capacidade de ligar aepitopes não reconhecidos por anticorpos convencionais;, porexemplo, eles expõem muito tempo estruturas de laço baseadoem CDR com o potencial para penetrar em cavidades e inibiçãode função de enzima anexa. Além disso, como a ligaçãofreqüentemente ocorre através do laço CDR3 só, é visto queos peptídeos derivados de CDR3 podem ser usadosterapeuticamente (Desmyter et al., J Biol Chem, 2001, 276:26285-90). Os polipeptidios da invenção são também capazesde reter a capacidade de ligação plena como proteína defusão com uma enzima ou toxina. Além disso, poderia seresperado que o trombocitopenia indesejável causado peloreceptor Fc:Fc mediadas a ativação da agregação de plaquetae/ou F (ab1) (2) - mediadas ligação cruzada de plaquetas quefoi observado usando IgG intacto ou F (ab? ) (2)terapeuticamente in vivo (ver Cauwenberghs N. e ai, aArteriosclerose, Trombose e a biologia Vascular, 2 000, 20:1347), será evitado no uso de VHH, desde que VHH não contémnenhum Fc e não é bivalente. Portanto os polipeptidios dainvenção, homólogos ou porções funcionais disso fornecem umcusto considerável e o tempo salvando no tratamento e odiagnóstico de condições relacionadas à agregação mediadapor plaqueta, e o paciente na necessidade dos referidospolipeptidios encontraria menos dos problemas associados comagentes convencionais.

A agregação mediada por plaqueta é o processo em quevWF-ligado o colágeno adere a plaquetas e/ou receptores deplaqueta, enfim resultando em ativação de plaqueta. Aativação de plaqueta leva à ligação de fibrinogênio, efinalmente à agregação de plaqueta. É dentro dos limites dapresente invenção para fornecer polipeptidios que modulam osprocessos que compreendem a agregação mediada por plaquetacomo ligação de vWF-colágeno, adesão de receptor de vWF-plaqueta, adesão de receptor de colágeno-plaqueta, ativaçãode plaqueta, fibrinogênio agregação de plaqueta e/ouligação.

Segundo um aspecto da invenção um polipeptidio dainvenção pode ser uma seqüência homóloga de um polipeptidiode corpo inteiro da invenção. Segundo outro aspecto dainvenção, um polipeptidio da invenção pode ser uma porçãofuncional de um polipeptidio de corpo inteiro da invenção.Segundo outro aspecto da invenção, um polipeptidio dainvenção pode ser uma seqüência homóloga de um polipeptidiode comprimento cheio da invenção. Segundo outro aspecto dainvenção, um polipeptidio da invenção pode ser uma porçãofuncional de uma seqüência homóloga de um polipeptidio decomprimento cheio da invenção. Segundo um aspecto dainvenção um polipeptidio da invenção pode compreender umaseqüência de um polipeptidio da invenção.

Segundo um aspecto da invenção um Nanobody da invençãousada para formar um polipeptidio da invenção pode ser umNanobody completo da invenção (p. ex. um VHH) ou umaseqüência homóloga disso. Segundo outro aspecto da invenção,um Nanobody da invenção usada para formar o polipeptidio dainvenção pode ser uma porção funcional de um Nanobodycompleto da invenção. Segundo outro aspecto da invenção, umNanobody da invenção usada para formar o polipeptidio dainvenção pode ser uma seqüência homóloga de um Nanobodycompleto da invenção. Segundo outro aspecto da invenção, umNanobody da invenção usada para formar o polipeptidio dainvenção pode ser uma porção funcional de uma seqüênciahomóloga de um Nanobody completo da invenção.

Segundo outro aspecto da invenção um polipeptidio dainvenção pode ser uma seqüência homóloga da seqüência depais. Segundo outro aspecto da invenção, um polipeptidio dainvenção pode ser uma seqüência de pai de porção funcional.Segundo outro aspecto da invenção, um polipeptidio dainvenção pode ser uma porção funcional de uma seqüênciahomóloga da seqüência de pais.

Como usado na presente, uma seqüência homóloga podecompreender adições, eliminações ou substituições de um ouvários aminoácidos, que não alteram substancialmente ascaracterísticas funcionais do polipeptidio. 0 número deeliminações aminoácidas ou substituições está à alturapreferivelmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44, 45, 4 6, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70aminoácidos.

Uma seqüência homóloga segundo a presente invençãoinclui polipeptidios extensos pela adição de aminoácidospara formar o anticorpo de cadeia pesada humano ou o domínioúnico humano anticorpo de cadeia pesada, que não alteramsubstancialmente as características funcionais dopolipeptidio não modificado.

Onde a seqüência homóloga indica a identidade deseqüência, ele significa uma seqüência que apresenta umaalta identidade de seqüência (mais de 70%, 75%, 80%, 85%,90%, identidade de seqüência de 95% ou de 98%) com aseqüência de pais, e é preferivelmente caracterizada porpropriedades semelhantes da seqüência de pais, a saberafinidade, a referida identidade calculada usando métodosconhecidos.

Alternativamente, uma seqüência homóloga também podeser qualquer seqüência aminoácida que resulta desubstituições permitidas em qualquer número de posições daseqüência de pais segundo a fórmula mais adiante:

Ser substituído por Ser, Thr, Gly, e Asn;

Arg substituído por um de Arg, His, Gim, Lys, e Glu;

Leu substituído por um de Leu, lie, Phe, Tyr, Met, e

Vai;

Pro substituído por um de Pro, Gly, Ala, e Thr;

Thr substituído por um de Thr, Pro, Ser, Ala, Gly,

His, e Gln; Ala substituído por um de Ala, Gly, Thr, e Pro;

Vai substituído por um de Vai, Met, Tyr, Phe, lie, e Leu;

Gly substituído por um de Gly, Ala, Thr, Pro, e Ser;

lie substituído por um de lie, Met, Tyr, Phe, Vai, e Leu;

Phe substituído por um de Phe, Trp, Met, Tyr, lie,Vai, e Leu; Tyr substituído por um de Tyr, Trp, Met, Phe,lie, Vai, e Leu; His substituído por um do Seu, Glu, Lys,Gln, Thr, e Arg;

Gln substituído por um de Gim, Glu, Lys, Asn, His,Thr, e Arg; Asn substituído por um de Asn, Glu, Asp, Gim, eSer;

Lys substituído por um de Lys, Glu, Gln, His, e Arg;Asp substituída por uma de Asp, Glu, e Asn;

Glu substituído por um de Glu, Asp, Lys, Asn, Gim,His, e Arg; Met substituído por um dos Met, Phe, lie, Vai,Leu, e Tyr.Um homólogo segundo a presente invenção pode referir-se a seqüências de nucleotideos de mais de 50, 100, 200,300, 400, 500, 600, 800 ou 1000 nucleotideos capaz ahibridizar ao complemento inverso da seqüência denucleotideos capaz de codificar um polipeptidio em condiçõeshibridização estritas (como aqueles descritos por SAMBROOKet al., a Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring,Harbor Laboratory press, Nova York).

Como usado na presente, uma porção funcional envia aum Nanobody da invenção do comprimento suficiente tal que ainteração do interesse é mantida com a afinidade de 1 10-6 Mx ou melhor.

Alternativamente uma porção funcional de um Nanobodyda invenção compreende uma eliminação parcial da seqüênciaaminoácida completa e ainda mantém o sitio(s) de ligação e odominio (s) de proteina necessário para a ligação de einteração com o objetivo.

Alternativamente uma porção funcional de algum doNanobody da invenção é um polipeptidio que compreende umaeliminação parcial da seqüência aminoácida completa e queainda mantém o sitio (s) de ligação e o dominio(s) deproteina necessário para a inibição da ligação de vWF acolágeno.

Alternativamente uma porção funcional de qualquerNanobody da invenção é um polipeptidio que compreende umaeliminação parcial da seqüência aminoácida completa e queainda mantém o sitio (s) de ligação e o dominio (s) deproteína necessário para a ligação de e interação com odomínio Al de vWF.

Alternativamente uma porção funcional de qualquerNanobody da invenção é um polipeptidio que compreende umaeliminação parcial da seqüência aminoácida completa e queainda mantém o sitio (s) de ligação e o domínio (s) deproteína necessário para a ligação de e interação comcolágeno.

Alternativamente uma porção funcional compreende umaeliminação parcial da seqüência aminoácida completa de umpolipeptidio e que ainda mantém o sitio(s) de ligação e odomínio(s) de proteína necessário para a ligação de einteração com o antigeno contra o qual foi levantado. Eleinclui, mas não é limitado a domínios VHH.

Tão usado na presente, uma porção funcional como elese refere a uma seqüência de polipeptidio refere-se a menosde 100% da seqüência (p. ex., 99%, 90%, 80%, 70%, 60% 50%etc.), mas compreendendo de 5 ou mais aminoacidos.

Uma porção como ele se refere a uma seqüência denucleotideos que codifica uma seqüência de polipeptidiorefere-se

a menos de 100% da seqüência (p. ex., 99%, 90%, 80%,70%, 60% 50% etc.) , mas - compreensão de 15 ou maisnucleotideos.

Um aspecto da presente invenção é a administração deum polipeptidio da invenção segundo a invenção pode evitar anecessidade para injeção. A terapêutica baseada em anticorpoconvencional tem o potencial significativo como fármacosporque eles têm a especificidade seleta ao seu objetivo euma toxicidade inerente baixa, contudo, eles têm um descontoimportante: eles são relativamente movediços, e sensíveis aoesgotamento por proteases. Isto significa que as fármacos deanticorpo convencionais não podem ser administradasoralmente, sublingualmente, topicamente, nasalmente,vaginalmente, retalmente ou pela inalação porque eles nãosão resistentes ao pH baixo nesses sitios, a ação deproteases nesses sitios e no sangue e/ou por causa do seugrande tamanho. Eles têm de ser administrados pela injeção(intravenosamente, subcutaneamente, etc.) superar algunsdesses problemas. A administração pela injeção requer otreinamento de especialista para usar uma seringahipodérmica ou a agulha corretamente e seguramente. Ele alémdisso requer o equipamento estéril, uma formulação liquidado polipeptidio terapêutico, a embalagem de frasco doreferido polipeptidio em uma forma estéril e estável e, dosujeito, um sitio conveniente para a entrada da agulha. Alémdisso, os sujeitos comumente experimentam estresse fisico epsicológico antes de e para receber uma injeção.

Um aspecto da presente invenção supera esses problemasda arte prévia, fornecendo os polipeptidios construtos dapresente invenção. Ditos construtos são suficientementepequenos, resistentes e estáveis para ser entregueoralmente, sublingualmente, topicamente, nasalmente,vaginalmente, retalmente ou pela inalação substancial sem aperda da atividade. Os polipeptidios construto da presenteinvenção evitam a necessidade para injeções, não são sóeconomias de custo/tempo, mas são também mais convenientes emais cômodos para o sujeito.

Uma modalidade de execução da presente invenção é umpolipeptidio da invenção para uso em tratamento, prevençãoe/ou alivio dos sintomas de desordens suscetíveis àmodulação por uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta que é capaz de passar através doambiente gástrico sem que a substância seja desativada.

Como conhecido por pessoas experimentadas na técnica,uma vez na posse do referido polipeptidio da invenção, atecnologia de formulação pode ser aplicada para lançar umaquantidade máxima do polipeptidio na posição certa (noestômago, no cólon, etc.) . Este método de administração éimportante para tratar, prevenir e/ou aliviar os sintomas dedesordens cujos objetivos são localizados no sistemaintestinal.

Um aspecto da invenção é um método para tratar,impedir e/ou aliviar os sintomas de uma desordem suscetívelà modulação por uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta que é capaz de passar através doambiente gástrico sem ser desativado, por oralmenteadministrando a um sujeito um polipeptidio da invenção.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umuso de um Nanobody ou o polipeptidio da invenção para apreparação de um medicamento para tratar, impedir e/oualiviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação poruma substância que controla a agregação mediada de plaquetaque é capaz de passar através do ambiente gástrico sem serdesativado.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta ao sistema intestinal sem que a referidasubstância seja desativada, por oralmente administrando a umsujeito um Nanobody ou o polipeptidio da invenção.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta à circulação sangüínea de um sujeito semque a substância seja desativada, por oralmenteadministrando a um sujeito um Nanobody ou o polipeptidio dainvenção.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umNanobody ou o polipeptidio da invenção para uso emtratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas ou desordenssuscetível à modulação por uma substância que controla aagregação mediada de plaqueta ministrada ao trato vaginale/ou retal.

Em um exemplo não-restritivo, uma formulação segundo ainvenção compreende um Nanobody ou o polipeptidio dainvenção, na forma de um gel, creme, supôsitório, filme, ouna forma de uma esponja ou como um anel vaginal quelentamente lança o ingrediente ativo dentro de algum tempo(tais formulações são descritas em EP 707473, EP 684814, US5629001) .

Um aspecto da invenção é um método para tratar,impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis àmodulação por uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta ministrada ao trato vaginal e/ou retal,por administração vaginalmente e/ou retalmente a um sujeitoum Nanobody ou o polipeptidio da invenção.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umuso de um Nanobody ou o polipeptidio da invenção para apreparação de um medicamento para tratar, impedir e/oualiviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação poruma substância que controla a agregação mediada de plaquetaministrada ao trato vaginal e/ou retal.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta ao trato vaginal e/ou retal sem ser ditasubstância que é desativada, administrando ao trato vaginale/ou retal de um sujeito um Nanobody ou o polipeptidio dainvenção.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta à circulação sangüínea de um sujeito semque a referida substância seja desativada, administrando aotrato vaginal e/ou retal de um sujeito um Nanobody ou opolipeptidio da invenção.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umNanobody ou o polipeptidio da invenção, para usar emtratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de desordens

suscetível à modulação por uma substância que controlaa plaqueta mediadas a agregação ministrado ao nariz,tratamento respiratório superior e/ou pulmão.

Em um exemplo não-restritivo, uma formulação segundo ainvenção, compreende um Nanobody ou o polipeptidio dainvenção na forma de um borrifo nasal (p. ex. um aerossol)ou inalador. Desde o Nanobody ou o polipeptidio da invençãoé pequeno, ele pode conseguir o seu obj etivo muito maisefetivamente do que moléculas IgG terapêuticas.

Um aspecto da invenção é um método para tratar,impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis àmodulação por uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta ministrado ao trato respiratóriosuperior e pulmão, administrando a um sujeito um Nanobody ouo polipeptidio da invenção, pela inalação através da boca ounariz.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umuso de um Nanobody ou o polipeptidio da invenção para apreparação de um medicamento para tratar, impedir e/oualiviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação poruma substância que controla a agregação mediada de plaquetaministrada ao nariz, trato respiratório superior e/oupulmão, sem que o referido polipeptidio seja desativado.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta ao nariz, trato respiratório superior epulmão sem inativação, administrando ao nariz, tratorespiratório superior e/ou pulmão de um sujeito um Nanobodyou o polipeptidio da invenção.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta à circulação sangüínea de um sujeito seminativação administrando ao nariz, trato respiratóriosuperior e/ou pulmão de um sujeito um Nanobody ou opolipeptidio da invenção.

Uma modalidade de execução da presente invenção é umNanobody ou o polipeptidio da invenção para uso emtratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de desordenssuscetíveis à modulação por uma substância que controla aagregação mediada de plaqueta ministrada à mucosaintestinal, em que os referidos desordens aumentam apermeabilidade da mucosa intestinal. Por causa do seupequeno tamanho, um Nanobody ou o polipeptidio da invençãopodem passar pela mucosa intestinal e atingir a circulaçãosangüínea mais eficientemente em sujeitos que sofrem dedesordens que causam um aumento na permeabilidade da mucosaintestinal.

Um aspecto da invenção é um método para tratar,impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis àmodulação por uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta ministrada à mucosa intestinal, em queos referidos desordens aumentam a permeabilidade da mucosaintestinal, por oralmente administrando a um sujeito umNanobody ou o polipeptídio da invenção.

Este processo pode ser até adicionalmente realçado porum aspecto adicional da presente invenção - o uso detransportadoras de transporte ativas. Neste aspecto dainvenção, VHH é fundido a uma transportadora que realça atransferência através da parede intestinal na circulaçãosangüínea. Em um exemplo não-restritivo, esta"transportadora" é um segundo VHH que é fundido ao VHHterapêutico. Tais construtos de fusão são feitos usandométodos conhecidos na técnica. O VHH "de transportadora"liga especificamente a um receptor na parede intestinal queinduz uma transferência ativa através da parede.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umuso de um Nanobody ou o polipeptidio da invenção para apreparação de um medicamento para tratar, impedir e/oualiviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação poruma substância que controla a agregação mediada de plaquetaministrada à mucosa intestinal, em que os referidosdesordens aumentam a permeabilidade da mucosa intestinal.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta à mucosa intestinal sem ser desativada,administrando oralmente a um sujeito um Nanobody ou opolipeptidio da invenção.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta à circulação sangüínea de um sujeito semser desativada, administrando oralmente a um sujeito umNanobody ou o polipeptidio da invenção.

Este processo pode ser até adicionalmente realçado porum aspecto adicional da presente invenção - o uso detransportadoras de transporte ativas. Neste aspecto dainvenção, um Nanobody ou o polipeptidio da invenção conformedescrito na presente é fundido a uma transportadora querealça a transferência através da parede intestinal nacirculação sangüínea. Em um exemplo não-restritivo, esta"transportadora" é um VHH que é fundido ao referidopolipeptidio. Tais construtos de fusão são feitos utilizandométodos conhecidos na técnica. 0 VHH "de transportadora"liga especificamente a um receptor na parede intestinal quexnduz uma transferência ativa através da parede.

Uma modalidade de execução da presente invenção é umNanobody ou o polipeptidio da invenção para uso emtratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de desordenssuscetíveis à modulação por uma substância que controla aagregação mediada de plaqueta que é capaz de passar atravésdos tecidos abaixo da lingua com efetividade. Uma formulaçãodo referido Nanobody ou o polipeptidio da invenção, porexemplo, uma pastilha, borrifo, uma gota é colocada embaixoda lingua e adsorvida através das membranas de muco na redecapilar embaixo da lingua.

Um aspecto da invenção é um método para tratar,impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis àmodulação por uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta que é capaz de passar através dostecidos abaixo da lingua com efetividade, por administraçãosublingual a um sujeito Nanobody ou o polipeptidio dainvenção.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umuso do Nanobody ou o polipeptidio da invenção para apreparação de um medicamento para tratar, impedir e/oualiviar os sintomas de desordens suscetiveis à modulação poruma substância que controla a agregação mediada de plaquetaque é capaz de passar pelos tecidos abaixo da lingua.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta aos tecidos abaixo da lingua sem serdesativada, administrando sublingualmente a um sujeitoNanobody ou o polipeptidio da invenção.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta à circulação sangüínea de um sujeito semser desativada, administrando oralmente a um sujeitoNanobody ou o polipeptidio da invenção.

Uma modalidade de execução da presente invenção é umNanobody ou o polipeptidio da invenção para uso emtratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de desordenssuscetiveis à modulação por uma substância que controla aagregação mediada de plaqueta que é capaz de passar atravésda pele efetivamente.

Uma formulação do referido Nanobody ou o polipeptidioda invenção, por exemplo, uma creme, filme, borrifo, baixa,remendo, é colocada na pele e passa através dela.

Um aspecto da invenção é um método para tratar,impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis àmodulação por uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta que é capaz de passar através da peleefetivamente, por atualmente administrando a um sujeitoNanobody ou o polipeptidio da invenção.

Outra modalidade de execução da presente invenção é umuso do Nanobody ou o polipeptidio da invenção para apreparação de um medicamento para tratar, impedir e/oualiviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação poruma substância que controla a agregação mediada de plaquetaque é capaz de passar através da pele efetivamente.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta à pele sem ser desativada, administrandotopicamente a um sujeito Nanobody ou o polipeptidio dainvenção.

Um aspecto da invenção é um método que paraadministração uma substância que controla a agregaçãomediada de plaqueta a circulação sangüínea de um sujeito,administrando topicamente a um sujeito Nanobody ou opolipeptidio da invenção.

Em outra modalidade de execução da presente invenção,Nanobody ou o polipeptidio da invenção além disso compreendeum nanobody transportador da invenção (p. ex. O VHH) queatua como uma transportadora de transporte ativa para otransporte do referido Nanobody ou o polipeptidio dainvenção via o lúmen de pulmão ao sangue.

Nanobody ou o polipeptidio da invenção que, alémdisso, compreende uma transportadora que ligaespecificamente a um receptor presente na superfície demucosa (células epiteliais bronquiais) resultar notransporte ativo do polipeptidio do lúmen de pulmão aosangue. A transportadora Nanobody da invenção pode serfundida ao Nanobody ou o polipeptidio da invenção. Taisconstrutos de fusão são feitos utilizando métodos conhecidosna técnica e é descrevem na presente. "A transportadoraNanobody" da invenção liga especificamente a um receptor nasuperfície de mucosa que induz uma transferência ativaatravés da superfície.

Outro aspecto da presente invenção é um método paradeterminar que nanocorpos da invenção (p. ex. O VHHS) sãoativamente transportados na circulação sangüínea sobadministração nasal. Semelhantemente um VHH ingênuo ou imunefago biblioteca pode ser administrado nasalmente, e depoisde pontos de tempo diferentes depois da administração, osangue ou os órgãos podem ser isolados para resgatar fagosque foram ativamente transportados à circulação sangüínea.Um exemplo não-restritivo de um receptor para transporteativo do lúmen de pulmão à circulação sangüínea é o receptorFc N (Feto). Um aspecto da invenção inclui as moléculas VHHidentificadas pelo método. Tal VHH então pode ser usado comouma transportadora VHH para a entrega de um VHH terapêuticoao obj etivo correspondente na circulação sangüinea sobadministração nasal.

Uma modalidade de execução da presente invenção é umNanobody ou o polipeptidio da invenção para uso emtratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de desordensque se relacionam com agregação mediada por plaqueta oudisfunção disso. As referidas desordens incluem púrpuratrombótica trombocitopénica (TTP), o ataque de isquemiacerebral transiente, angina pectoris estável ou instável,enfarte cerebral, enfarte do miocárdio, doença oclusivaarterial periférica, restenose. As referidas desordens alémdisso incluem os que resultam de enxerto de desviocoronário, substituição de válvula de artéria coronária eintervenções coronárias como angioplastia, stenting, ouaterectomia.

Outras desordens são alguma da formação de um trombonão-oclusivo, a formação de trombo oclusivo, formação tromboarterial, oclusão coronária aguda, restenose, restenosedepois de PCTA ou stenting, trombo formação em artériasestenosadas, hiperplasia depois angioplastia, aterectomia oustenting arterial, sindrome oclusiva em um sistema vascularou a falta de revelação de artérias de doente.

Um aspecto da invenção é um Nanobody ou o polipeptidioda invenção para uso no tratamento, prevenção e/ou alivio dedesordens ou condições que se relacionam platelet-mediatizada agregação ou disfunção disso, em que o referidoNanobody ou polipeptidio da invenção são administradosintravenosamente, subcutaneamente, oralmente,sublingualmente, topicamente, nasalmente, vaginalmente,retalmente ou pela inalação.

Outro aspecto da invenção é o uso do Nanobody ou opolipeptidio da invenção para a preparação de um medicamentopara o tratamento, prevenção e/ou alivio de desordens oucondições que se relacionam com agregação mediada porplaqueta ou disfunção disso, em que o referido Nanobody oupolipeptidio da invenção são administrados intravenosamente,subcutaneamente, oralmente, sublingualmente, topicamente,nasalmente, vaginalmente, retalmente ou pela inalação.

Outro aspecto da invenção é um método de tratamento,prevenção e/ou alivio de desordens ou condições agregaçãomediada por plaqueta se relaciona que se relaciona oudisfunção disso, compreendendo administrando a um sujeitoNanobody ou o polipeptidio da invenção, em que o referidoNanobody heteroespecificos ou o polipeptidio da invenção sãoadministrados intravenosamente, subcutaneamente, oralmente,sublingualmente, topicamente, nasalmente, vaginalmente,retalmente ou pela inalação.

Outro aspecto da invenção é um Nanobody ou opolipeptidio da invenção para uso no tratamento, prevençãoe/ou alivio de desordens ou condições que se relacionamplatelet-mediatizada agregação ou disfunção disso.

Outro aspecto da invenção é um uso de um polipeptidioda invenção para a preparação de um medicamento para otratamento, prevenção e/ou alivio de desordens ou condiçõesque se relacionam com agregação mediada por plaqueta oudisfunção disso.

Cada um pode usar Nanobody ou o polipeptidio dainvenção da presente invenção para analisar agentes quemodulam a ligação do polipeptidio a um vWF. Quandoidentificado em um ensaio que mede a ligação ou o referidodeslocamento de polipeptidio sozinho, os agentes terão deser submetidos à prova funcional para determinar se elesatuam como os moduladores da agregação mediada por plaqueta.Alguns exemplos de métodos de proteção convenientes sãodiscutidos em WO 04/0 62551. Naturalmente, esses métodospodem ser facilmente aplicados à proteção para moduladorescandidatos que alteram a ligação entre Nanobody ou opolipeptidio da invenção revelada na presente e vWF.

Uma célula que é útil segundo a invenção épreferivelmente selecionada do grupo composto de célulasbacterianas como, por exemplo, E. coli, células de leveduracomo, por exemplo, S. cerevisiae, P. pastoris, células deinseto ou células de mamíferos, p. ex. conforme acimamencionado.

Uma célula que é útil segundo a invenção pode serqualquer célula na qual uma seqüência ácida nucléica quecodifica Nanobody ou o polipeptidio da invenção pode ser oufoi introduzida de modo tal que o polipeptidio é expresso aniveis naturais ou acima de niveis naturais, conformedefinido na presente. Preferivelmente um polipeptidio dainvenção que é expresso em uma célula expõe farmacologianormal ou perto da normal, conforme definido na presente.

Segundo uma modalidade de execução preferencial dapresente invenção, uma célula é selecionada do grupocomposto de COS7-células, uma célula CHO, um LM (TK-)célula, uma célula NIH-3T3, célula de HEK-293, célula de K-562 ou um 1321N1 célula astrocitoma mas também outras linhasde célula transfectável.

Em geral, "a quantidade terapeuticamente eficaz", "adose terapeuticamente eficaz" e "quantidade eficaz"significa a quantidade necessária para atingir o resultadoou resultados desejados (agregação de plaqueta que trata ouimpede). Uma habilidade ordinária na técnica reconhecerá quea potência e, por isso, "uma quantidade eficaz" pode variarpara vários nanocorpos ou polipeptidios que inibem aagregação mediada por plaqueta usada na invenção. Umexperimentado na técnica pode avaliar prontamente a potênciado Nanobody ou polipeptidio.

"Por farmaceuticamente aceitável" se que dizer ummaterial que não é biologicamente ou de outra maneiraindesej ável, isto é, o material pode ser administrado a umindivíduo junto com Nanobody ou polipeptidio sem causarqualquer efeito biológico indesejável ou interagir em umamaneira deletéria com algum de outros componentes dacomposição farmacêutica na qual é contido.

A invenção revelada na presente é útil para otratamento ou a prevenção de uma condição da agregaçãomediada por plaqueta, e compreende a administração a umsuj eito de uma quantidade farmaceuticamente eficaz doNanobody ou polipeptidio ou composição que inibe BTK e istoinibe a agregação mediada por plaqueta.

A invenção revelada na presente é útil para otratamento ou a prevenção dos primeiros passos da formaçãotrombo, e compreende a administração a um suj ei to de umaquantidade farmaceuticamente eficaz do Nanobody oupolipeptidio ou composição segundo a invenção.

A invenção revelada na presente é útil para otratamento ou a prevenção restenose, e compreende aadministração a um sujeito de uma quantidadefarmaceuticamente eficaz do Nanobody ou polipeptidio oucomposição segundo a invenção.

Um aspecto da presente invenção é o uso de nanocorposou os polipeptidios da invenção para tratar ou e previne umacondição da agregação mediada por plaqueta, em um sujeito ecompreende administração de uma quantidade farmaceuticamenteeficaz do Nanobody ou polipeptidio em combinação com ooutro, como, por exemplo, aspirina.

Um aspecto da presente invenção é o uso de nanocorposou os polipeptidios. da invenção para tratar ou e previne umacondição da agregação mediada por plaqueta, em um sujeito ecompreende administração de uma quantidade farmaceuticamenteeficaz do Nanobody ou polipeptidio em combinação com ooutro, como, por exemplo, um agente trombolitico.

Outro aspecto da presente invenção é um uso doNanobody ou o polipeptídio da invenção para tratar ouprevenir placa ou trombo em um indivíduo. A referida placaou a formação de trombo podem ser em condições de altodesvio. Tanto em trombose como em re-oclusão, a adesãoreversível ou amarração das plaquetas em alto taxa de corteé seguido por uma adesão firme através do receptor colágenoem plaquetas que resultam em ativação de plaqueta; amarraçãode plaquetas por vWF a colágeno exposto na parede de vasodanificada é especialmente importante sob altas condições decorte. Os inventores encontraram que o Nanobody oupolipeptidio da invenção da presente invençãoinesperadamente funcionava bem em altas condições absolutas.

A presente invenção não é limitada à administração deformulações que compreendem Nanobody único ou o polipeptidioda invenção. É dentro dos limites da invenção para fornecertratamentos de combinação em que uma formulação éadministrada a um paciente na necessidade disso quecompreende mais de um Nanobody ou o polipeptidio dainvenção.

As condições da agregação mediada por plaquetaincluem, mas não são limitadas a, angina instável, anginaestável, angina pectoris, formação de embolus, tromboseprofundamente vã, sindrome urêmico hemolitico, anemiahemolitica, a falha renal aguda, complicações tromboliticas,púrpura trombotica trombocitopénica, comgelopatiaintravascular disseminada, trombose, doença cardiacacoronária, complicações tromboembólicas, enfarte domiocárdio, restenose, e formação de trombose atrial emfibrilação atrial, angina instável crônica, ataques ederrames isquêmicos transientes, doença vascular periférica,trombose arterial, pre-eclampsia, embolia, restenose e/outrombose depois de angioplastia, endarterectomia carótida ,anastomose de enxertos vasculares e exposição crônica adispositivos cardiovasculares. Tais condições também podemresultar de tromboembolismo e reoculsão durante e depois daterapia trombolitica, depois de angioplastia, e depois dodesvio de artéria coronária.

É bem conhecido na técnica como determinar a inibiçãoda agregação mediada por plaqueta que usa os testes padrãodescritos na presente, ou usa outros testes semelhantes.Preferivelmente, o método resultaria em pelo menos umaredução de 10% da agregação mediada por plaqueta, inclusive,por exemplo, 15%, 2 0%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 7 0%, 8 0%,90%, 100%, ou qualquer quantidade no meio, maispreferivelmente em 90%.

Semelhantemente o método resultaria em pelo menos umaredução de 10% do cálcio intracelular mobilisationinclusive, por exemplo, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80%, 90%, 100%. Semelhantemente o método resultaria empelo menos uma redução de 10% do nivel de PLCg 2 fosforiladoinclusive, por exemplo, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80%, 90 100%.

A redução pode ser medida, por exemplo, comparando aimpedância ótica em uma agregômetro de plaqueta decronologia. Qualquer outro método de medição conhecidotambém pode ser usado. Por exemplo, (1) sobre a estimulaçãocolágeno, o nivel de aumentos de mobilização de cálciointracelulares colágeno-induzidos dentro de algum tempo eportanto a medição pode incluir o medir do nivel de cálciointracelular colágeno-induzido ou (2) sobre a estimulaçãocolágeno, o nivel de fosforilado PLCg 2 aumentos dentro dealgum tempo e portanto a medição pode incluir o medir donivel de fosforilado PLCg 2.

As células podem ser contatadas em vitro, por exemplo,acrescentando Nanobody ou o polipeptidio da invenção ao meiode cultura (pela infusão continua, pela entrega no bolo, oumodificando o meio para um meio que contém Nanobody ou opolipeptidio) ou acrescentando Nanobody ou polipeptidio aofluido extracelular in vivo (por entrega local, entregasistêmica, inalação, injeção intravenosa, bolo entrega, ouinfusão continua). A duração "do contato" com uma célula oua população de células é determinada Nanobody oupolipeptidio está presente a niveis f isiologicamenteeficazes ou a niveis supostos fisiologicamente eficazes nofluido médio ou extracelular que banha a célula ou células.Preferivelmente, a duração do contato é 1-96 horas, e maispreferivelmente, para 24 horas, mas tais tempos variariambaseado meia-vida do Nanobody ou polipeptidio e podem serotimizadas por um experimentado na experimentação de rotinade utilização de arte.

Nanobody ou o polipeptidio útil na presente invençãopodem ser formulados como composições farmacêuticas eadministrados a um hospedeiro mamifero, como um pacientehumano ou um animal doméstico em várias formas adaptadas àvia escolhida da administração, isto é, oralmente ouparenteralmente, por intra-nasalmente por inalação, viasintravenosas, intramusculares, tópicas ou subcutâneas.

Nanobody ou o polipeptidio da presente invenção tambémpodem ser administrados usando métodos de administração deterapia genética. Ver, p. ex.,Patente U.S. n. 5,399,346,que é incorporada por referência em sua totalidade. Usandoum método de administração por terapia genética, célulasprimárias transfetadas com o gene para Nanobody ou opolipeptidio da presente invenção podem ser adicionalmentetransfetadas com promotores específicos de tecido para visarórgãos específicos, tecido, enxertos, tumores, ou células.

Portanto, o presente Nanobody ou polipeptidio pode sersistemicamente administrado, p. ex., oralmente, emcombinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável comoum diluente inerte ou uma transportadora comestívelassimilável. Eles podem ser incluídos em cápsulas degelatina de capas duras ou suaves, podem ser compressos empastilhas, ou incorporados diretamente com a comida da dietado paciente. Para a administração terapêutica oral, Nanobodyou o polipeptidio podem ser combinados com um ou váriosexcipientes e usados na forma de pastilhas ingeriveis,pastilhas bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões,xaropes, bolinhos delgados, e assim por diante. Taiscomposições e as preparações devem conter pelo menos 0.1% doNanobody ou polipeptídio. A porcentagem das composições epreparações pode ser, naturalmente, variada e pode estarconvenientemente entre aproximadamente 2 a aproximadamente60% do peso de uma forma de dosagem de unidade dada. Aquantidade do Nanobody ou polipeptidio em tais composiçõesterapeuticamente úteis é tal que um nível de dosagem eficazserá obtido.

As pastilhas, comprimidos, pílulas, cápsulas, e assimpor diante também podem conter o seguinte: aglutinantes comogoma tragacanth, acácia, amido de grão ou gelatina;excipientes como fosfato bicálcico; um agente que sedesintegra como amido de grão, amido de batatas, alginicoácido e assim por diante; um lubrificante como magnésioestearato; e um agente de adoçamento como sacarose,fructose, lactose ou aspartame ou um agente de sabor comohortelã, o óleo de pi rola, ou sabor de cereja pode seracrescentado. Quando a forma de dosagem de unidade é umacápsula, ela pode conter, além de materiais do tipo acimamencionado, um portador liquido, como um óleo vegetal ou umglicol de polietileno. Vários outros materiais podem estarpresentes como revestimentos ou modificar de outra maneira aforma fisica da forma de dosagem de unidade sólida. Porexemplo, as pastilhas, as pílulas, ou as cápsulas podem sercobertas de gelatina, cera, goma-laca ou açúcar e assim pordiante. Um xarope ou o elixir podem conter Nanobody ou opolipeptidio, a sacarose ou fructose como um agente deadoçamento, metila e propilparabenos como preservantes, umatintura e sabor como sabor de cereja ou cor de laranja.Naturalmente, qualquer material usado na preparação dequalquer forma de dosagem de unidade deve serfarmaceuticamente aceitável e substancialmente não-tóxicanas quantidades empregadas. Além do mais, Nanobody ou opolipeptidio podem ser incorporados em preparações edispositivos de administração prolongada.

Nanobody ou o polipeptidio também podem seradministrados intravenosamente ou intraperitonealmente porinfusão ou injeção. As soluções do Nanobody ou polipeptidiopodem ser preparadas em água, opcionalmente misturada com umsurfactante não-tóxico. As dispersões também podem serpreparadas em glicerol, glicol de polietileno liquido,triacetin, e misturas disso e em óleos. Em condiçõesordinárias de armazenamento e uso, essas preparações contêmum conservante para prevenir o crescimento demicrorganismos.

As formas de dosagem farmacêuticas convenientes para ainjeção ou a infusão podem incluir soluções aquosas estéreisou dispersões ou pó estéril que compreende o ingredienteativo que são adaptados para a preparação extemporânea desoluções injetáveis ou infusiveis estéreis ou dispersões,opcionalmente encapsuladas em lipossomas. Em todos os casos,a forma de dosagem última deve ser estéril, fluida e estávelnas condições de fabricação e armazenamento. Atransportadora liquida ou o veiculo podem ser um meio dedispersão solvente ou liquido, compreendendo, por exemplo,água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, glicol depropileno, glicol de polietileno liquido, e assim pordiante), óleos vegetais, ésteres gliceril não-tóxicos , emisturas convenientes disso. A fluidez apropriada pode sermantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, pelamanutenção do tamanho de partícula requerido em caso dedispersões ou pelo uso de surf actantes. A prevenção da açãode microrganismos pode ser ocasionada por vários agentesantibacterianos e antifungosos, por exemplo, parabenos,clorobutanol, phenol, ácido sórbico, timerosai, e assim pordiante. Em muitos casos, será preferível incluir agentesisotônicos, por exemplo, açúcar, buffers ou cloreto desódio. A absorção prolongada das composições injetáveis podeser ocasionada pelo uso nas composições de agentes queatrasam absorção, por exemplo, alumínio monostearato egelatina.

As soluções inj etáveis estéreis estão preparadasincorporando Nanobody ou polipeptidio na quantidaderequerida no solvente apropriado com vários de outrosingredientes enumerados anteriormente, como requerido,seguido pela esterilização com filtro. Em caso do pó estérilpara a preparação de soluções injetáveis estéreis, osmétodos preferenciais da preparação são a secagem à vácuo ea técnicas de secagem por congelamento, que produzem um pódo ingrediente ativo mais qualquer presente de ingredientedesejado adicional nas soluções anteriormente estéreis-filtradas.

para administração tópica, o presente Nanobody ou opolipeptidio podem ser aplicados na forma pura, isto é,quando eles são líquidos. Contudo, será geralmente desejáveladministrá-los à pele como composições ou formulações, emcombinação com uma transportadora dermatologicamenteaceitável, que pode ser um sólido ou um liquido.

Os portadores sólidos úteis incluem sólidos finamentedivididos como talco, barro, celulose microcristalina,silica, alumina e assim por diante. Os portadores liquidosúteis incluem água, hidroálcalis ou glicol ou misturas deágua-álcool/glicol, nas quais o presente Nanobody ou opolipeptidio podem ser dissolvidos ou dispersados a niveiseficazes, opcionalmente com a ajuda de surfactantes não-tóxicos. Adjuvantes como fragrâncias e agentesantimicrobiais adicionais podem ser acrescentados paraotimizar as propriedades para um uso dado. As composiçõesliquidas resultantes podem ser aplicadas de almofadasabsorventes, usaram para impregnar bandagens e outrocurativos, ou borrifados na área afetada que usapulverizadores de aerossol ou tipo de bomba.

Os espessantes como polimero sintético, ácidosgordurosos, sais e ésteres de ácidos gordurosos, álcooisgordurosos, celuloses modificadas ou materiais mineraismodificados também podem ser empregados com transportadorasliquidas para formar pastas para borrifar, géis, ungüentos,sabões, e assim por diante, para aplicação diretamente àpele do usuário.

Exemplos de composições dermatológicas úteis que podemser usadas para entregar Nanobody ou o polipeptidio à pelesão conhecidos na técnica; por exemplo, ver Jacquet et al.(U.S. Pat. N°. 4,608,392), Geria (U.S. Pat. N°. 4,992,478),Smith et al. (U.S. Pat. N°. 4,559,157) e Wortzman (U.S. Pat.N°. 4,820,508).

Dosagens úteis do Nanobody ou polipeptidio podem serdeterminadas comparando sua atividade in vitro, e naatividade in vivo em modelos animais. Os métodos para aextrapolação de dosagens eficazes em ratos, e outrosanimais, a seres humanos são conhecidos na técnica; porexemplo, ver U.S. Pat. N°. 4,938,949.

Geralmente, a concentração do Nanobody ou polipeptidioem uma composição liquida, como uma loção, será deaproximadamente 0.1-25 wt-%, preferivelmente deaproximadamente 0.5-10 wt-%. A concentração em umacomposição semi-sólida ou sólida como um gel ou um pó seráaproximadamente 0.15% de wt, preferivelmente aproximadamente0.5-2.5 wt-%.

A quantidade do Nanobody ou polipeptidio requereu paraque o uso no tratamento varie com a via de administração, anatureza da condição que é tratada e a idade e a condição dopaciente e será enfim à discrição do médico ou clinicoatendente. Também a dosagem do Nanobody ou polipeptidiovaria dependendo da célula objetivo, tumor, tecido, enxerto,ou órgão.A dose desejada pode ser convenientemente apresentadaem uma dose única ou como doses divididas administradas emintervalos apropriados, por exemplo, como dois, três, quatroou mais sub-doses por dia. A própria sub-dose pode ser alémdisso dividida, p. ex., em um número de administraçõesdiscretas livremente espaçadas; como múltiplas inalações deum insuflador ou pela aplicação de uma pluralidade de gotasno olho.

Um regime de administração pode incluir o tratamentode longo prazo, diário. Por "de longo prazo" se entende pelomenos duas semanas e preferivelmente, várias semanas, meses,ou anos da duração. As modificações necessárias nestavariedade de dosagem podem ser determinadas por umahabilidade ordinária na técnica usando só experimentação derotina dada nos ensinamentos na presente. Ver Remington' sPharmaceuticals Sciences (Martin, E.W., editor 4) , MackPublishing Co, Easton, PA. A dosagem também pode serajustada pelo médico individual no caso de qualquercomplicação.

A invenção prove um agente que é um modulador daagregação mediada por plaqueta.

O agente de candidato pode ser um agente sintético, ouuma mistura de agentes, ou ser um produto natural (p. ex. umextrato de planta ou cultura supernadante). Um agente decandidato segundo a invenção inclui uma pequena molécula quepode ser sintetizada, um extrato natural, peptideos,proteina, carboidratos, lipidios etc.Os Agentes moduladores candidato de grandesbibliotecas de agentes sintéticos ou naturais podem serprotegidos. Os meios numerosos são atualmente usados para asíntese casual e dirigida de sacarida, peptideo, e agentesbaseados em ácido nucléico. As bibliotecas de agentesintéticas são comercialmente disponíveis de um número decompanhias inclusive Maybridge Chemical Co (Trevillet, oCornwall, Reino Unido) , Comgenex (Princeton, NJ) , BrandonAssociates (Merrimack, NH), e Microsource (New Milford, CT)-Uma biblioteca química rara é disponível de Aldrich(Milwaukee, WI) . As bibliotecas combinatórias sãodisponíveis e podem ser preparadas. Alternativamente, asbibliotecas de agentes naturais na forma de extratosbacteriano, fungoso, planta e dos animais são disponíveis dep. ex., Pan Laboratories (Bothell, WA) ou MycoSearch (NC) ,ou são prontamente produziveis por métodos bem conhecidos natécnica. Adicionalmente, as bibliotecas naturais esinteticamente produzidas e os agentes são prontamentemodificados por meios químicos, fisicos, e bioquímicosatravés de convencionais.

Os agentes úteis podem ser encontrados dentro declasses químicas numerosas. Os agentes úteis podem seragentes orgânicos, ou pequenos agentes orgânicos. Ospequenos agentes orgânicos têm um peso molecular de mais de50 ainda menos de aproximadamente 2,500 daltons,pref erivelmente menos de aproximadamente 750, maispref erivelmente menos de aproximadamente 350 daltons. Asclasses exemplares incluem heterociclos, peptideos,sacarideos, esteróides, e assim por diante. Os agentes podemser modificados para realçar a eficácia, a estabilidade, acompatibilidade farmacêutica, e assim por diante. Aidentificação estrutural de um agente pode ser usada paraidentificar, gerar, ou proteger agentes adicionais. Porexemplo, onde os agentes de peptideo são identificados, elespodem ser modificados de vários modos para realçar a suaestabilidade, como utilização de um aminoácido desnatural,como um ácido D-amino, em particular D-alanina, porfuncionalização do amino ou término carboxilico, p. ex. parao grupo amino, acilação ou alquilação, e para o grupocarboxilo, esterificação ou amidificação, ou o parecido.

Para análise primária, uma concentração útil de umagente de candidato segundo a invenção é de aproximadamente10 mm a aproximadamente 100 ]i M ou mais (isto é, 1 mM, 10mM, 100 mM, I M etc.) . A concentração de análise primáriaserá usada como um limite superior, junto com noveconcentrações adicionais, em que as concentrações adicionaissão determinadas reduzindo a concentração de análiseprimária em intervalos de meio-log (p. ex. para mais 9concentrações) para análises secundárias ou para geração decurvas de concentração.

Um conjunto de análise de alto rendimento segundo ainvenção compreende todos os meios necessários e meios decomunicação para executar a detecção de um agente que modulaa agregação mediada por plaqueta interagindo com um objetivoda invenção, como, por exemplo, vWF, ou fragmento disso napresença de um polipeptidio, preferivelmente em umaconcentração na variedade de 1 manual técnico a 1 mm. Oconjunto compreende o seguinte. As células Recombinantes dainvenção, compreendendo e expressando a seqüência denucleotideos que codifica vWF, ou fragmento disso, que écultivado segundo o conjunto em um suporte sólido, como umachapa de microtitragem, mais preferivelmente uma placa demicrotritragem com 96 cavidades, segundo os métodos bemconhecidos à pessoa experimentada na técnica sobretudo comodescrito em WO 00/02045. Alternativamente o vWF, ou ofragmento disso são fornecidos em uma forma purificada a serimobilizada em, por exemplo, uma placa de microtritragem com96 cavidades pela pessoa experimentada na técnica.

Alternativamente o vWF, ou o fragmento disso são fornecidosno conjunto pré-imobilizado em, por exemplo, uma placa demicrotritragem com 96 cavidades. Agentes moduladores segundoa invenção, em concentrações de aproximadamente 1 jj m a 1 mmou mais, são acrescentados a cavidades definidas na presençade uma concentração apropriada do Nanobody ou o polipeptidioda invenção os referidos a concentração do referidopolipeptidio preferivelmente na variedade de 1 p M a 1 mm.Os conjuntos podem conter mais de um polipeptidio

Os ensaios de ligação são executados como segundo osmétodos já revelados na presente e os resultados são emcomparação com o nivel de base de, por exemplo, vWF, oufragmento disso que liga a um polipeptidio da invenção, masa ausência do agente modulador acrescentado. As cavidadesque mostram pelo menos 2 vezes, pref erivelmente 5 vezes,mais pref erivelmente 10 vezes e o mais pref erivelmente uma100 vezes ou mais aumento ou redução no vWF-polipeptidio queliga (por exemplo) comparando com o nivel da atividade aausência do modulador, são selecionados para nova análise.

A invenção prove conjuntos úteis para proteção para osmoduladores da agregação platelet-mediatizada, bem comoconjuntos úteis para o diagnóstico de doenças ou desordenscaracterizado por de-regulação de agregação mediada porplaqueta. Os conjuntos úteis segundo a invenção podemincluir um vWF isolado, ou o fragmento disso.

Alternativamente, ou além do mais, um conjunto podecompreender células transformadas para expressar vWF, ou ofragmento disso. Em uma nova modalidade de execução, umconjunto segundo a invenção pode compreender umpolinucleotideo que codifica vWF, ou o fragmento disso. Emuma ainda nova modalidade de execução, um conjunto segundo ainvenção pode compreender os escorvadores específicos úteispara a amplificação de vWF, ou fragmento disso os conjuntosúteis segundo a invenção podem compreender um Nanobody ou opolipeptidio da invenção. Um conjunto segundo a invençãopode compreender as células transformadas para expressar oreferido polipeptidio.

Os conjuntos podem conter mais de um polipeptidio. Emuma nova modalidade de execução, um conjunto segundo ainvenção pode compreender um polinucleotideo codificação deuma macromolécula, por exemplo, vWF, ou fragmento disso. Emuma ainda nova modalidade de execução, um conjunto segundo ainvenção pode compreender os escorvadores específicos úteispara a amplificação de uma macromolécula como, por exemplo,vWF, ou fragmento disso. Todos os conjuntos segundo ainvenção compreenderão os itens determinados ou combinaçõesde itens e materiais de embalagem, por isso. Os conjuntostambém incluirão instruções para uso.

A invenção também prove dispositivos médicos invasivoscobertos de um Nanobody ou o polipeptidio da invenção ou umagente que resulta de um método de proteção da invenção parausa em dispositivos que requerem o mesmo. Os exemplos não-restritivos de dispositivos incluem tubulação cirúrgico,dispositivos de oclusão, dispositivos protéticos. Aaplicação para os referidos que os dispositivos incluemprocedimentos cirúrgicos que requerem uma modulação daagregação mediada por plaqueta em volta do sitio da invasão.

Uma modalidade de execução do presente é um métodopara tratar dispositivos médicos invasivos para prevenir aagregação mediana de plaqueta em volta do sitio da invasãoque compreende o passo do revestimento de dito dispositivocom um Nanobody ou o polipeptidio da invenção ou agentesegundo a invenção.

Outra modalidade de execução do presente é unsdispositivos médicos invasivos que logra a agregação medianade plaqueta em volta do sitio da invasão, em que osreferidos que o dispositivo é coberto de um Nanobody ou opolipeptidio da invenção ou agente segundo a invenção.

Em outro aspecto, a invenção se refere a um métodopara a prevenção e/ou o tratamento de pelo menos umadesordem mediada por agregação (conforme descrito napresente), o referido método compreendendo a administração,a um suj eito na necessidade disso, de uma quantidadefarmaceuticamente ativa de um Nanobody da invenção, de umpolipeptidio da invenção, e/ou de uma composiçãofarmacêutica que compreende o mesmo.

No contexto da presente invenção, o termo "aprevenção e/ou o tratamento" não só compreende a prevençãoe/ou o tratamento da doença, mas também geralmentecompreendem a prevenção do ataque da doença, redução develocidade ou reversão do progresso de doença, prevenção ouredução de velocidade do ataque de um ou vários sintomasassociados com a doença, redução e/ou alivio de um ou váriossintomas associados com a doença, redução da gravidade e/oua duração da doença e/ou de qualquer sintoma associado comisso e/ou prevenção de um novo aumento na gravidade dadoença e/ou de qualquer sintoma associado com isso,prevenção, redução ou reversão de qualquer dano fisiológicocausado pela doença, e geralmente qualquer açãofarmacológica que é benéfica ao paciente que é tratado.

0 sujeito a ser tratado pode ser qualquer animal desangue quente, mas é especialmente um mamífero, e maisespecialmente um ser humano. Como estará claro para a pessoaexperimentada, o sujeito a ser tratado será especialmenteuma pessoa que sofre de, ou em perigo de, as doenças edesordens mencionadas na presente.

A invenção se refere a um método para a prevenção e/ouo tratamento de pelo menos uma doença ou desordem que podeser prevenida e/ou tratada administrando um Nanobody oupolipeptídio da invenção a um paciente, o referido métodocompreendendo a administração a um sujeito na necessidadedisso, de uma quantidade farmaceuticamente ativa de umNanobody da invenção, de um polipeptidio da invenção, e/oude uma composição farmacêutica que compreende o mesmo.

Mais especialmente, a invenção se refere a um métodopara a prevenção e/ou o tratamento de pelo menos uma doençaou desordem escolhida do grupo composto das doenças edesordens enumerados na presente, o referido métodocompreendendo a administração, a um sujeito na necessidadedisso, de uma quantidade farmaceuticamente ativa de umNanobody da invenção, de um polipeptidio da invenção, e/oude uma composição farmacêutica que compreende o mesmo.

Em outra modalidade de execução, a invenção se referea um método para a imunoterapia, e especialmente paraimunoterapia passiva, cujo método compreende aadministração, a um sujeito que sofre de ou está em perigodas doenças e desordens mencionados na presente, umaquantidade farmaceuticamente ativa de um Nanobody dainvenção, de um polipeptidio da invenção, e/ou de umacomposição farmacêutica que compreende o mesmo.

Nos acima mencionados métodos, os nanocorpos e/ou ospolipeptidios da invenção e/ou as composições quecompreendem o mesmo podem ser administrados em qualquermaneira conveniente, dependendo da formulação farmacêuticaespecifica ou composição a ser usada. Portanto, osnanocorpos e/ou os polipeptidios da invenção e/ou ascomposições que compreendem os mesmos, por exemplo, podemser administrados oralmente, intraperitonealmente (p. ex.intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, ouvia qualquer outra via de administração que acesse o tratogastrintestinal), intranasalmente, transdermicamente,topicamente, por meio de um supôs itório, pela inalação,novamente dependendo da formulação farmacêutica especificaou composição a ser usada. O clinico será capaz deselecionar uma via conveniente de administração e umaformulação farmacêutica conveniente ou composição a serusada em tal administração, dependendo da doença ou desordema ser prevenida ou tratada e outro fatores bem conhecidos aoclinico.

Como mencionado na presente e como estará claro para apessoa experimentada, condições para agudas e complicações(isto é, como pode ocorrer com algumas desordens mediadaspor agregação mencionadas na presente), normalmente aadministração diretamente no torrente sanguineo por infusãoou injeção ou qualquer outro meio conveniente será preferido.

O nanocorpos e/ou os polipeptidios da invenção e/ou ascomposições que compreendem o mesmo são administradossegundo um regime do tratamento que é conveniente para aprevenção e/ou o tratamento da doença ou desordem a serprevenida ou tratada. O clinico será geralmente capaz dedeterminar um regime de tratamento conveniente, dependendode fatores como a doença ou desordem a ser prevenida outratada, a gravidade da doença a ser tratada e/ou agravidade dos sintomas disso, o Nanobody especifico ou opolipeptidio da invenção a ser usado, a via especifica deadministração e formulação farmacêutica ou composição a serusada, a idade, gênero, peso, dieta, a condição geral dopaciente, e fatores semelhantes bem conhecidos ao clinico.

Geralmente, o regime de tratamento compreenderá aadministração de um ou vários nanocorpos e/ou ospolipeptidios da invenção, ou de uma ou várias composiçõesque compreendem os mesmos, em uma ou várias quantidadesfarmaceuticamente eficazes ou doses. A quantidade(s)especifica ou as doses a serem administradas podem serdeterminadas pelo clinico, novamente baseado nos fatorescitados anteriormente.

Geralmente, para a prevenção e/ou o tratamento dasdoenças e desordens mencionadas na presente e dependendo dadoença especifica ou desordem a ser tratada, a potência doNanobody especifico e o polipeptidio da invenção a serusado, a via especifica de administração e a formulaçãofarmacêutica especifica ou composição usada, os nanocorpos epolipeptidios da invenção serão geralmente administrados emuma quantidade entre 1 grama e 0.01 microgramas por peso decorpo de quilograma por dia, pref erivelmente entre 0.1gramas e 0.1 microgramas por peso de corpo de quilograma pordia, como aproximadamente 1, 10, 100 ou 1000 microgramas porpeso de corpo de quilograma por dia, qualquer continuamente(p. ex. pela infusão) , como uma dose diária única ou comomúltiplas doses divididas durante o dia. O clinico serágeralmente capaz de determinar uma dose diária conveniente,dependendo dos fatores mencionados na presente. Tambémficará claro que em casos especificos, o clinico podedecidir desviar-se dessas quantidades, por exemplo, com basenos fatores citados anteriormente e o seu juizo de perito.Geralmente, um pouco de orientação nas quantidades a seradministradas pode ser obtida das quantidades normalmenteadministradas para anticorpos convencionais comparáveis oufragmentos de anticorpo contra o mesmo objetivo administradovia essencialmente a mesma rota, considerando contudodiferenças em afinidade/avidez, eficácia, biodistribuição,meia-vida e fatores semelhantes bem conhecidos à pessoaexperimentada.

Normalmente, no acima mencionado método, um Nanobodyúnico ou o polipeptidio da invenção serão usados. É contudodentro dos limites da invenção para usar dois ou maisnanocorpos e/ou polipeptidios da invenção em combinação.

Os nanocorpos e os polipeptidios da invenção tambémpodem ser usados em combinação com um ou vários compostos ouprincípios novos farmaceuticamente ativos, isto é, como umregime de tratamento combinado, que pode ou pode não levar aum efeito sinergistico. Novamente, o clinico será capaz deselecionar tais novos compostos ou princípios, bem como umregime de tratamento combinado conveniente, baseado nosfatores citados anteriormente e o seu juizo de perito.

Especialmente, os nanocorpos e os polipeptidios dainvenção podem ser usados em combinação com outros compostosfarmaceuticamente ativos ou princípios que são ou podem serusados para a prevenção e/ou o tratamento das doenças edesordens citadas na presente, em conseqüência do qual umefeito sinergistico pode ou não ser obtido. Os exemplos detais compostos e princípios, bem como vias, métodos eformulações farmacêuticas ou composições que para osadministram serão claros ao clinico, e, por exemplo,incluirão, mas não são limitados a heparina, aspirina (p.ex. Aspegic®) , Plavix e/ou Reopro.

Quando duas ou mais substâncias ou princípios devemser usados como parte de um regime de tratamento combinado,eles podem ser administrados via a mesma rota deadministração ou via rotas diferentes da administração, emessencialmente o mesmo tempo ou em tempos diferentes (p. ex.essencialmente simultaneamente, consecutivamente, ou segundoum regime alternante). Quando as substâncias ou osprincípios são administrados para ser simultaneamente via amesma rota de administração, eles podem ser administradoscomo formulações farmacêuticas diferentes ou composições ouparte de uma formulação farmacêutica combinada oucomposição, como estará claro para a pessoa experimentada.Também, quando duas ou mais substâncias ativas ouprincipios devem ser usados como parte de um regime detratamento combinado, cada uma das substâncias ou principiospode ser administrada na mesma quantidade e segundo o mesmoregime que usado quando o composto ou o principio são usadossozinhos, e tal uso combinado pode ou não levar a um efeitosinergistico. Contudo, quando o uso combinado de duas oumais substâncias ativas ou principios leva a um efeitosinergistico, também pode ser possivel reduzir a quantidadede um, mais ou todas das substâncias ou principios a seradministrados, ainda realizando a ação terapêutica desejada.Isto, por exemplo, pode ser útil para a evitação, alimitação ou a redução de quaisquer efeitos colaterais nãodesejados que se associam com o uso de uma ou várias dassubstâncias ou principios quando eles são usados nas suasquantidades habituais, ainda obtendo o efeito farmacêuticoou terapêutico desej ado.

A eficácia do regime de tratamento usado segundo ainvenção pode ser determinada e/ou seguida em qualquermaneira conhecida por si para a doença ou a desordemimplicada, como serão claras ao clinico. 0 clinico tambémserá capaz, onde apropriado e ou um IM

a base de caso-por-caso, de mudar ou modificar umdeterminado regime de tratamento, para realizar o efeitoterapêutico desejado, para evitar, para limitar ou reduzirefeitos colaterais não desejados, e/ou realizar umequilíbrio apropriado entre a realização do efeitoterapêutico desejado de um lado e evitação, limitação ouredução dos efeitos colaterais indesejados de outro lado.

A invenção também relaciona ao uso de um Nanobody ou opolipeptidio da invenção na preparação de uma composiçãofarmacêutica para a prevenção e/ou o tratamento de pelomenos uma doença ou desordem (p. ex. uma desordem deagregação como mencionado na presente) que pode serprevenido e/ou tratado administrando um Nanobody oupolipeptidio da invenção a um paciente.

Geralmente, o regime de tratamento será seguido atéque o efeito terapêutico desejado seja realizado e/oucontanto que o efeito terapêutico desejado seja mantido.Novamente, isto pode ser determinado pelo clinico.

Finalmente, também estará claro para a pessoaexperimentada que pode ser possível "enxertar" um ou váriosdos CDR'S acima mencionados para os nanocorpos da invençãopara outros "andaimes", inclusive, mas não limitado a,andaimes humanos ou andaimes de não-imunoglobulina. Andaimesconvenientes e técnicas para tal enxerto de CDR estará claropara a pessoa experimentada e é bem conhecido na técnica,vide, por exemplo, os US-A-7, 180, 370, WO 01/27160, EP 0605522, EP 0 4 60167, os US-A-7, 054, 2 97, Nicaise et al.,Protein Science (2004), 13:1882-1891; Ewert et al., Métodos,2004 Oct; 34 (2):184-199; Kettleborough et al., ProteínaEng. Out de 1991; 4 (7) : 773-783; 0'Brien e Jones, MétodosMol. Biol. 2003: 207: 81-100; e Skerra, J. Mol. Recognit.2000: 13: 167-187, e Saerens et al., J. Mol. Biol. 2005 Sep23; 352 (3):597-607, e as novas referências citadas napresente; e também inclua, por exemplo, as regiões dearmação de outros (únicos) anticorpos de dominio. Porexemplo, as técnicas conhecidas por si para enxertando ratoou CDRfs de rato para armações humanas e andaimes podem serusadas em uma maneira análoga para fornecer a proteinaquimérica que compreende um ou vários do CDR1 S dosnanocorpos da invenção e um ou regiões ou seqüências dearmação humanas.

Portanto, em outra modalidade de execução, a invençãocompreende um polipeptidio quimérico que compreende pelomenos uma seqüência CDR escolhida do grupo composto deseqüências CDR1, as seqüências de CDR2 e as seqüências CDR3mencionadas na presente para os nanocorpos da invenção.Preferivelmente, tal polipeptidio quimérico compreende pelomenos uma seqüência CDR escolhida do grupo composto dasseqüências CDR3 mencionada na presente para os nanocorpos dainvenção, e opcionalmente também pelo menos uma seqüênciaCDR escolhida do grupo composto das seqüências CDR1 e CDR2mencionada na presente para os nanocorpos da invenção. Porexemplo, tal polipeptidio quimérico pode compreender umaseqüência CDR escolhida do grupo composto das seqüênciasCDR3 mencionada na presente para os nanocorpos da invenção,uma seqüência CDR escolhida do grupo composto das seqüênciasCDR1 mencionada na presente para os nanocorpos da invenção euma seqüência CDR escolhida do grupo composto das seqüênciasCDR1 e CDR2 mencionada na presente para os nanocorpos dainvenção. As combinações do CDR' S que são mencionadas napresente como preferidas para os nanocorpos da invençãotambém serão normalmente preferidas para esses polipeptidiosquiméricos.

nos referidos polipeptidios quiméricos, o CDR1S podeser ligado a novas seqüências de seqüências aminoácidas e/ouligado um a outro via seqüências aminoácidas, nas quais asreferidas seqüências aminoácidas são preferivelmenteseqüências de armação ou são seqüências aminoácidas queatuam como seqüências de armação, ou em conjunto formam umandaime para apresentar o CDR'S. A referência é novamentefeita à arte prévia mencionada no parágrafo último. Segundouma modalidade de execução preferencial, as seqüênciasaminoácidas são seqüências de armação humanas, por exemplo,seqüências de armação de VH3. Contudo, seqüências de armaçãonão-humanas, sintéticas, semi-sintéticas ou de não-imunoglobulina também pode ser usadas. Preferivelmente, asseqüências de armação usadas são tais que (1) o polipeptidioquimérico é capaz de ligar xxxx, isto é, com uma afinidadeque é pelo menos 1%, preferi velmente pelo menos 5%, maispreferivelmente pelo menos 10%, como pelo menos 25% e até50% ou 90% ou mais da afinidade do correspondente Nanobodyda invenção; (2) o polipeptidio quimérico é conveniente parauso farmacêutico; e (3) o polipeptidio quimérico épreferivelmente essencialmente não-imunogênico nas condiçõesdesejadas para uso farmacêutico (isto é, indicação, modo deadministração, dose e regime de tratamento) disso (que podeser essencialmente análogo às condições descritas napresente para o uso dos nanocorpos da invenção).

Segundo uma modalidade de execução não-restritiva, opolipeptidio quimérico compreende pelo menos duas seqüênciasCDR (como acima mencionado) ligado via pelo menos umaseqüência de armação, na qual pref erivelmente pelo menos umade duas seqüências CDR é uma seqüência CDR3, com outraseqüência CDR que é um CDR1 ou seqüência CDR2. Segundo umamodalidade de execução preferencial, mas não-restritiva, opolipeptidio quimérico compreende pelo menos duas seqüênciasCDR (como acima mencionado) ligado pelo menos duasseqüências de armação, nas quais preferivelmente pelo menosuma de três seqüências CDR é uma seqüência CDR3, com outrasduas seqüências CDR que são seqüências CDR1 ou CDR2, epreferivelmente sendo uma seqüência CDRl e uma seqüênciaCDR2. Segundo uma modalidade de execução especificamentepreferencial, mas não-restritiva, os polipeptidiosquiméricos têm a estrutura FRI1 - CDRl - FR21 - CDR2 - FR31- CDR3 - FR41, no qual CDRl, CDR2 e CDR3 são como definidosna presente para o CDR'S dos nanocorpos da invenção, e FRI1,FR21, FR31 e FR41 são seqüências de armação. FRI', FR21,FR31 e FR4' pode ser especialmente Armação 1, Armação 2,Armação 3 e Armação 4 seqüências, respectivamente, de umanticorpo humano (como seqüências VH3) e/ou partes oufragmentos de tais seqüências de Armação. É também possivelusar partes ou fragmentos de um polipeptidio quimérico com aestrutura FRl1 - CDR1 - FR21 - CDR2 - FR31 - CDR3 - FR4.Preferivelmente, tais partes ou fragmentos são tais que elesencontram os critérios estabelecidos no parágrafoprecedente.

A invenção será além disso descrita agora por meio dosexemplos não-restritivos seguintes e figuras, nas quais asFiguras mostram:

Figura 1: Ligação de nanobodies a vWF em ELISA

Figura 2: Alinhamento de 12A5 homólogo nanobodyseqüências

Figura 3: Alinhamento de 12B6 homólogo nanobodyseqüências

Figura 4: Ligação de 12A5 homólogo nanobodies a vWF em BIACORE

Figura 5: Ligação de 12B6 homólogo nanobodies a vWF em BIACORE

Figura 6: adesão de plaqueta em concentraçõesdiferentes de 12B6, 12A2 e 12A5 nanobodies

Figura 7a: Ligação em ELISA a vWF para 12B6 nanobodydepois de aquecer em temperaturas crescentes

Figura 7b: Ligação em ELISA a vWF para 12A2 nanobodydepois de aquecer em temperaturas crescentesFigura 7c: Ligação em ELISA a vWF para 12A5 nanobodydepois de aquecer em temperaturas crescentes

Figura 8a: Ligação de vWF de espécie diferente a 12B6nanobody em ELISA

Figura 8b: Ligação de vWF de espécie diferente a 12A2nanobody em ELISA

Figura 8c: Ligação de vWF de espécie diferente a 12A5nanobody em ELISA

Figura 9: Ligação dos bivalentes 12B6 nanobodies a vWFem BIACORE

Figura 10: Ligação dos bivalentes 12A2 nanobodies avWF em BIACORE

Figura 11: Ligação dos bivalentes 12A5 nanobodies avWF em BIACORE

Figura 12: Ligação em ELISA a vWF dos bivalentes 12B6nanobodies depois de aquecer em temperaturas crescentes

Figura 13: Ligação em ELISA a vWF dos bivalentes 12A2nanobodies depois de aquecer em temperaturas crescentes

Figura 14: Ligação em ELISA a vWF dos bivalentes 12A5nanobodies depois de aquecer em temperaturas crescentes

Figura 15: Alinhamento dos humanizados 12B6 nanobodyseqüências

Figura 16: Ligação em ELISA a vWF de tipo natural ehumanizado 12B6 nanobody

Figura 17: Alinhamento dos humanizados 12A2 nanobodyseqüências

Figura 18: Ligação em ELISA a vWF dos humanizados 12A2nanobodies, depois de aquecer em temperaturas crescentes

Figura 19: Ligação em ELISA a vWF dos humanizados 12A2nanobodies

Figura 20: Alinhamento dos humanizados 12A5 nanobodyseqüências

Figura 21: Ligação em ELISA a vWF de tipo natural ehumanizado 12A5 nanobody

Figura 22: o Alinhamento de nanobodies selecionou aforma para bivalente

Figura 23: a adesão de plaqueta em concentraçõesdiferentes dos bivalentes (humanizou) nanobodies

Figura 24: o modelo de fluxo de sangue para Foltsmodela em babuinos

Figura 25: a organização experimental para Foltsmodela em babuinos

Figura 26: o estudo de Folts do babuino controla ogrupo. O fluxo de sangue em função do tempo é mostrado,indicando o CFRs (o representante de 2 experimentosindependentes)

Figura 27: o estudo de Folts do grupo de babuinotratado com Aspegic. O fluxo de sangue em função do tempo émostrado, indicando o CFRs (o representante de 3experimentos independentes)

Figura 28: o estudo do grupo de babuino tratado comHeparina. O fluxo de sangue em função do tempo é mostrado,indicando o CFRs (o representante de 3 experimentosindependentes)Figura 29: o estudo de Folts do grupo de babuinotratado com Plavix. 0 fluxo de sangue em função do tempo émostrado, indicando o CFRs (o representante de 4experimentos independentes)

Figura 30: o estudo de Folts do grupo de babuinotratado com Reopro. O fluxo de sangue em função do tempo émostrado, indicando o CFRs (o representante de 3experimentos independentes)

Figura 31: o estudo de Folts do grupo de babuinotratado com ALX-0081 (SEQ ID NO:98). 0 fluxo de sangue emfunção do tempo é mostrado, indicando o CFRs (orepresentante de 8 experimentos independentes)

Figura 32: o Fluxo lido fora do babuino ID 6 tratoucom uma combinação de Aspegic, Heparina, Plavix e ALX-0081

Figura 33: Médias de perda de sangue relativa emfunção de doses diferentes de Plavix, Reopro e ALX-0081

Figura 34: o comprimento médio de CFRs e a quantidaderelativa média da perda de sangue para animais tratados comPlavix em função da dose de farmaco crescente.

Figura 35: o comprimento médio de CFRs e a quantidaderelativa média da perda de sangue para animais tratados comReopro em função da dose de farmaco crescente

Figura 36: o comprimento médio de CFRs e a quantidaderelativa média da perda de sangue para animais tratados comALX-0081 em função da dose de farmaco crescente

Figura 37: a agregação ristocetina-induzida (%, ■) ecomprimento de CFRs (s, +) para cada babuino tratado comALX-0081 em função de todas as doses

Figura 38: a Concentração de ALX-0081 no plasma contrao comprimento de CFRs para todos os babuinos tratados comALX-0081

Figura 39: Concentração de ALX-0081 em plasma contraquantidade relativa de perda de sangue da gaze

Figura 40: o estudo de Folts do babuino 1 tratou comALX-0081 e vWF. 0 fluxo de sangue em função do tempo émostrado, indicando o CFRs

Figura 41: cadeias (flechas) de plaquetas aderidas emULvWF segregado de células endotelial estimuladas

Figura 42: a Ausência de cadeias quando as plaquetassão perfused por cima de ULvWF na presença de ALX-0081

Figura 43: experimento de perfusão de controle: ascadeias de ULvWF antes (painel A, indicado com flechasvermelhas) e durante (painel B) a perfusão com o plasmanormal. No painel B, as cadeias de ULvWF que são rachadaspor ADAMTS-13 são indicadas com uma flecha azul e vermelhapara uma parte de uma cadeia de ULvWF se afastar ou parabasicamente cadeias de ULvWF rachadas respectivamente

Figura 44: experimento de perfusão em presença deALX-0081. A imagem microscópica de um campo antes (painel A)e do mesmo campo depois (painel B) a perfusão com o plasmanormal. Uma cadeia de UlvWF é indicada no painel um com umaflecha vermelha que é ausente no painel B devido à rachadurado ULvWF por ADAMTS-13.

Figura 45: a rachadura de A1-A2-A3 por ADAMTS-13apresenta no plasma de consórcio normal (NPP) na ausência ea presença de ALX-0081

e em que as Tabelas, que formam uma parte integranteda descrição presente, são como se segue:

Tabela 8: listagem de seqüência de nanocorpos anti-vWF

Tabela 9: rendimentos de expressão de nanocorpos anti-vWF

Tabela 10: adesão de plaqueta em câmara de perfusao denanocorpos anti-vWF

Tabela 11: listagem de seqüência de 12B6 e 12A5homólogo nanobodies

Tabela 12: K-on Previsto, K-off e KD valores para 12A5homólogo nanobodies

Tabela 13: K-on Previsto, K-off e KD valores para 12B6homólogo nanobodies

Tabela 14: verdadeiro valor de KD de 12B6, 12A2 e 12A5nanobodies

Tabela 15: adesão de plaqueta em câmara de perfusao de12B6, 12A2 e 12A5 nanobodies

Tabela 16: Concentração de 12B6, 12A2 e 12A5nanobodies depois de aquecer em temperaturas crescentes

Tabela 17: listagem de seqüência de nanobodiesbivalente

Tabela 18: listagem de seqüência de seqüências delinkers

Tabela 19: rendimentos de expressão dos bivalentes12B6, 12A2 e 12A5 nanobodiesTabela 20: Concentração de 12136 nanobodies bivalentesdepois de aquecer em temperaturas crescentes

Tabela 21: Concentração de 12A2 nanobodies bivalentedepois de aquecer em temperaturas crescentes

Tabela 22: Concentração de 12A5 nanobodies bivalentedepois de aquecer em temperaturas crescentes

Tabela 23: adesão de plaqueta em câmara de perfusão de12A2 nanobodies bivalente

Tabela 24: listagem de seqüência dos humanizados 12B6nanobodies

Tabela 25: rendimentos de expressão de tipo nanobodies12B6 natural e humanizado

Tabela 26: Concentração de tipo nanobodies 12B6natural e humanizado depois de aquecer em temperaturascrescentes

Tabela 27: Valores de KD do tipo para natural ehumanizado 12136 nanobodies

Tabela 28: listagem de seqüência dos humanizados 12A2nanobodies

Tabela 29: rendimentos de expressão de tipo natural ehumanizado 12A2 nanobodies

Tabela 30: Concentração de nanobodies 12A2 de tiponatural e humanizado depois de aquecer em temperaturascrescentes

Tabela 31: adesão de plaqueta de nanobodies 12A2 detipo natural e humanizado em câmara de perfusão em 0.7 e 1.5ug/mlTabela 32: adesão de plaqueta de nanobodies 12A2 detipo natural e humanizado em câmara de perfusão em 0.5, 1 e2 uglml

Tabela 33: Valores de KD do tipo para natural ehumanizado 12A2 nanobodies

Tabela 34: listagem de seqüência dos humanizados 12A5nanobodies

Tabela 35: rendimentos de expressão de tipo natural ehumanizado 12A5 nanobodies

Tabela 36: Concentração de nanobodies 12A5 de tiponatural e humanizado depois de aquecer em temperaturascrescentes

Tabela 37: Valores de KD do tipo para natural ehumanizado 12A5 nanobodies

Tabela 38: listagem de seqüência de nanobodiesbivalente humanizado

Tabela 39: rendimentos de expressão de nanobodiesbivalente humanizado

Tabela 40: Concentração do Nanobody bivalentehumanizado depois de aquecer em temperaturas crescentes

Tabela 41: adesão de plaqueta de tipo natural enanobodies bivalente humanizado

Tabela 42: os babuinos usados com diferentes compostosde teste no estudo de Folts

Tabela 43: o Comprimento de CFRs(s) para controlaanimais (ND = não feito)

Tabela 44: o Comprimento de CFRs(s) para animaistratados com AspegicTM (ND = não feito)

Tabela 45: o Comprimento de CFRs(s) para animaistratados com HeparinTM (ND = não feito)

Tabela 46: o Comprimento de CFRs(s) para animaistratados com PlavixTM (ND = não feito)

Tabela 47: o Comprimento de CFRs(s) para animaistratados com ReoproTM (ND = não feito)

Tabela 48: o Comprimento de CFRs(s) para animaistratados com ALX-0081 (ND = não feito)

Tabela 49: os babuinos usados com diferentes compostosde teste no estudo de Folts

Tabela 50: a Inibição de CFRs no Folts modela para asfármacos diferentes testadas. O número de experimentos nosquais uma inibição de CFRs foi observada nas condiçõesdiferentes mencionadas é mostrado como uma função do númerototal de repetições independentes daquela condição.

Tabela 51: Comprimento de CFRs (segundos) para cadababuino e cada dose de Aspegic, Heparina, Plavix e ALX-008

1. A dose eficaz é indicada em amarelo

Tabela 52: a perda de sangue quanto à segunda gaze decontrole para animais tratados com PlavixTM em função dadose final (STD = desvio padrão)

Tabela 53: a perda de sangue quanto à segunda gaze decontrole para animais tratados com ReoproTM em função dadose final (STD = desvio padrão)

Tabela 54: a perda de sangue quanto à segunda gaze decontrole para animais tratados com ALX0081 em função da dosefinal (STD = desvio padrão)

Tabela 55: a média da soma total de perda de sangue (=soma de perda de sangue de cinco primeiras doses de compostode teste) como quanto à segunda gaze de controle

Tabela 56: a perda de sangue na gaze quanto à segundagaze de controle para cada babuino tratado com Aspegic,Heparina, Plavix e ALX-0081 em função da dose de fármaco. Adose de fármaco eficaz na qual uma inibição completa de CFRsfoi observada, é indicada em amarelo

Tabela 57: o% agregação de plaqueta ristocetina-induzida para cada babuino tratado com Aspegic, Heparina,Plavix e ALX-0081 em função da dose de fármaco

Tabela 58: concentração de ALX-0081 [ug/ml] emamostras de sangue obtidas em 10 minutos depois deadministração

Tabela 59: o Comprimento do CFRs [segundos] parababuinos tratados com ALX-0081 e com vWF

Tabela 60: Volumes [ul] para preparar as misturasdiferentes para o estudo da rachadura de A1A2A3 por ADAMTS 13.

EXEMPLOS

A. Seleção e proteção dos nanobodies especifico paravWF e inibição de adesão de plaquetaExemplo 1: nanobodies monovalente especifico deAntigeno

0 nanobodies representados na Tabela 8 ID Números SEQ:60 para 66 são obtidos de lhamas imunizadas com vWF humanoou com o dominio de Al recombinante de vWF. Os nanobodiesligam a um 1 dominio de vWF e inibem a interação entre vWF egplb nas plaquetas.

Exemplo 2: Expressão e purificação de nanobodies

O Plasmideo foi preparado (QIAGEN, segundo asinstruções de fabricantes) e foi transformado em WK6 oucélulas eletro-competentes TG1. Uma colônia única foi usadapara começar uma cultura noturna em LB que contém glicose de2% e 100 gg/ml ampicilina. Esta cultura noturna foi diluída100 vezes em 2x300 ml TB meio que contém 100 4g/mlampicilina, e incubou a 37°C até OD600nm = 0.5. IPTG de 1 mmfoi acrescentado e a cultura foi incubada para mais 3 horasa 37°C ou durante a noite em 2 8°C.

As culturas foram centrifugadas para 20 minutos em10000 rotações por minuto em 4°C. A pilula foi congeladadurante a noite ou para 1 hora em-20°c. Depois, a pilula foidescongelada na temperatura ambiente para 40 minutos, re-suspensos em 20 ml peri buffer (NaH2P04 de 50 mm e NaCl de300 MM) e sacudida na temperatura ambiente para 1 hora. Afração de Periplásmico foi isolada por centrifugação para 20minutos em 4°C em 20000 rotações por minuto. Os nanobodiesforam purificados em uma coluna de Nickel (TALON, Clonetech)conforme descrito pelo fabricante e os rendimentos deexpressão foram calculados como representado na Tabela 9.

Exemplo 3: Ligação de nanobodies a vWF em ELISA

Os nanobodies do Exemplo 1 foram testados para atandoa vWF em ELISA. Por isso, uma microplaca de titragem (Nunc,Maxisorb) foi coberta do vWF (Cruz Vermelha) em uma diluiçãode 200 vezes e pré-aqueceu para 15 minutos a 37 °C. A chapafoi coberta durante a noite em 4°C. A chapa então foi lavadacom o PBS-TWEEN e bloqueada para duas horas na temperaturaambiente com o PSB 1% casein_ Depois da lavagem, as amostrasforam aplicadas começando em uma concentração de 10 tg/ml e3 diluições de vezes foram feitas no PSB. Depois de umperíodo de incubação de duas horas, as chapas foram lavadase rato o anticorpo anti-myc monoclônico em uma diluição de1000 vezes foi aplicado para 1 hora na temperatura ambiente.As chapas foram lavadas e anti-rato-HRP policlônico (o DAKO)foi aplicado em uma diluição de 1000 vezes para uma hora natemperatura ambiente. As chapas foram lavadas e ABTS/H202 osubstrato foi aplicado. O OD 4 05 nm foi medido. Osresultados são mostrados na Figura 1.

Exemplo 4: Inibição de adesão de plaqueta pornanobodies em uma câmara de fluxo

As amostras de proteina foram analisadas em uma câmarade perfusão. As placas de vidro Thermanox (Nunc) foramembebidas durante a noite em etanol de 8 0%, enxaguadocompletamente com água destilada e secados no ar. Colágenohumano de placenta tipo III (Sigma) foi solubilizado em 0.05mol ácido acético e borrifado nas placas de vidro em umadensidade final de 304g/cm 2 com um aerógrafo de retoque.Depois de borrifar as placas de vidro foram bloqueadas com asolução de albumina humana de 1% no PSB por pelo menos 1hora em RT. As aspersões foram executadas com uma câmara deperfusão de passo único em condições de fluxo não-pulsátilque usam uma pequena câmara de perfusão modificada com umaaltura de fenda de 0.1 mm e uma largura de fenda de 2 mm. Osangue foi obtido por punção na veia de voluntários sãos eanti-coagulado com Penta/PPACK. Placas de vidro triplicadasforam inseridas na câmara. Cinco mililitros do sangue forampré-aquecidos a 37 °C por 5 minutos com ou sem adição de 2micrograma/ml nanobody e logo fizeram circular através dacâmara por 5 minutos em uma parede cortada a uma taxa de1600 s-1 utilização de uma bomba de infusão. Depois que umacorrida de perfusão, a placa de vidro foi tomada da câmara,enxaguada em Hepes com buffer salino (Hepes de 10 mm, NaCLde 150 mm, ph 7.4), fixado em 0.5% gutaraldeido no PSB,desidratado no metanol e manchado com MayGrunwald e Giemsa(Riedel de Haen). A deposição de plaqueta foi avaliada comocobertura de superfície de plaqueta que usa microscopia levee análise assistida por computador. Os resultados sãomostrados na Tabela 10. Os nanocorpos 12B6 e 12A5 claramenteinibem a adesão de plaqueta ao tipo de colágeno III nacâmara de perfusão em alta taxa de corte.

Exemplo 5: a Análise em BIACORE que para liga a vWFpara homólogos nanobodies nanocorpos 12B6 e 12A5 inibe aadesão de plaqueta na câmara de perfusão. As seqüências deHomólogo foram obtidas da lhama que compreende as diferençasaminoácidas como mostrado na Tabela 11 SEQ ID Número 67 a73. A figura 2 e 3 representa o alinhamento do 12A5 e 12136homólogo nanobody seqüências.

o vWF foi covalentemente ligado à superfície de chipsensor via a união de amina. A superfície de CM5 do chip foiativada pela injeção de EDC/NHS (1:1 a mistura de 0,4 m 1-etil-3 (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida e N-hidroxisuccinimida de 0,1 m em água) por 7 minutos. Sobre aativação o vWF foi injetado até que um aumento de 6000unidades de resposta fosse descoberto. O excesso de gruposreativos foi desativado com Etanolamina-HCl de 1 m (pH 8,5)para 7 minutos. O fluxo foi guardado constante durante oprocedimento de imobilização em 5 uUmin. O buffer de eluentefoi HEPES de 0,01 m (pH 7,4) com NaCl de 0,15 m, EDTA de 3mm e 0,005% Surfactante P20.

Os nanobodies 12B6 e 12A5 e a sua proteína homólogoforam analisados em BIACORE em vWF em uma concentração donanobody de 5 pg/ml como mostrado na Figura 4 e 5. Previstoo kon, K-off e os valores de KD são representados na Tabela12 e 13. Os nanocorpos 12A5 e 12B5 têm o melhor K-on etarifas K-off. Os nanocorpos 12A2 e 12B6 têm a melhor tarifaK-on, as tarifas K-off são muito comparáveis para todo osnanocorpos testado.

A tabela 14 demonstrações o verdadeiro KD avalia paravWF em BIAÇORE utilização de uma variedade de concentraçõesdo nanobodies. Do jogo de curvas que foram geradas para cadananobody, só aquelas curvas onde o equilíbrio foiconseguido, foram usadas para derivar o valor de KD via aafinidade de estado constante.

Para o tratamento de eventos agudos, a inibição rápidade vWF é muito importante, e portanto uma tarifa K-on rápidaé preferida. A tarifa K-on determina a que velocidade umnanobody liga o seu objetivo (vWF) quando injetado em serhumano ou animais.

Exemplo 6: Compare a inibição nanobodies para potênciana câmara de perfusão

Para comparar a potência para a inibição da adesão deplaqueta, os nanobodies 12A2, 12B6 e 12A5 foram testados nacâmara de perfusão em 0.2, 0.4 e 0.6 pg/ml. O experimentofoi executado usando o mesmo doador para todo o nanobodies.Os resultados são mostrados na Tabela 15 e a Figura 6. Osnanobodies mostram uma capacidade de inibição muitocomparável na câmara de perfusão, com a inibição completa daadesão de plaqueta em uma concentração de 0.6 pg/mlnanobody.

Exemplo 7: Estabilidade de nanobodies em temperaturaselevadasUma solução de estoque de nanobodies em umaconcentração de 200 gg/ml no PSB esteve preparada e dividiu-se em vários tubos. Cada tubo que contém nanobody foiincubado em temperaturas diferentes para 1 hora, logoesfriou na temperatura ambiente para 2 horas e pôs em 4°Cdurante a noite. No dia seguinte, as amostras foramcentrifugadas por 30 minutos em 13000 rotações por minuto, eo supernadante foi testado para OD280 nm. A concentração desupernadantes foi medida espectrometricamente e expressacomo uma porcentagem da concentração na temperaturaambiente. Os resultados são resumidos na Tabela 16.

Os supernadantes também foram testados em ELISA quepara liga a vWF conforme descrito acima no Exemplo 3. Comomostrado na Figura 7a (12B6), 7b (12A2) e 7c (12A5), osnanobodies são muito estáveis em temperaturas elevadas.

Exemplo 8: Reatividade cruzada dos nanocorpos com vWFde outra espécie

Uma microplaca de titragem foi coberto do rato anti-myc em 1/1000 durante a noite em 4°C. A chapa foi lavada como PBS-TWEEN e bloqueada por duas horas na temperaturaambiente com caseina de PBS1%. Depois da lavagem, osnanobodies foram aplicados em uma concentração de 10 ug/mlem PSB. Depois de um periodo de incubação de 1 hora, aschapas foram lavadas e o plasma (cão, porco, ser humano,babuino e macaco cynomologues) foi aplicado começando em umadiluição quintupla e fazendo diluições além disso duplas noPSB. As chapas foram incubadas para 1 hora na temperaturaambiente. As chapas foram lavadas e anti-vWF-HRP policlônico(o DAKO) foi aplicado em uma diluição de 2000 vezes para umahora na temperatura ambiente. As chapas foram lavadas eABTS/H202 o substrato foi aplicado. O OD 405 nm foi medido.

Como mostrado na Figura 8a (12B6), 8b (12A2) e 8c(12A5), nanobodies 12A5, 12A2 e 12B6 são reativos zangadoscom ser humano, babuino e macaco cynomologues vWF. Osnanobodies 12A2 e 12B6 são também reativos zangados com o10 porco vWF. Esses nanobodies, por isso, podem ser testadospara eficácia e segurança em porcos. Nenhum dos nanobodies éreativo zangado com o cão vWF.

B. Construção dos bivalentes nanobodies especificopara vWF e Exemplo de adesão de plaque ta de inibição 9:seqüências de aminoacido dos nanocorpos bivalente

A tabela 17 SEQ ID Número 74 a 82 representananobodies bivalente construído para 12B6, 12A2 e 12A5. Osnanobodies foram ligados com o linkers representado naTabela 18 SEQ ID Número 83 a 85.

Exemplo 10: Expressão e purificação dos nanocorposbivalente

As expressões foram executadas conforme descrito acimano Exemplo 2. Os rendimentos de expressão são resumidos naTabela 19.

Exemplo 11: Análise dos nanocorpos bivalente emBIACORE

Os nanobodies bivalentes do Exemplo 9 foram analisadosem BIACORE em 1,3 nM conforme descrito acima no Exemplo 5para comparar as afinidades para vWF contra o monovalentenanobody. Os nanobodies bivalentes 12B6 (a Figura 9), 12A2(a Figura 10) e 12A5 (a Figura 11) têm uma afinidademelhorada para vWF quando em comparação com o monovalentenanobody.

Exemplo 12: Estabilidade dos nanocorpos bivalente emtemperaturas elevadas

A estabilidade dos nanocorpos bivalente foi medidaconforme descrito acima no Exemplo 7. A concentração (p og/ml) do supernadantes foi medido e expresso como umaporcentagem da concentração na temperatura ambiente. Osresultados são resumidos na Tabela 2 0 (bivalente 12B6),Tabela 21 (bivalente 12A2) e Tabela 22 (bivalente 12A5).

Os supernadantes foram testados em ELISA que para ligaa vWF conforme descrito acima no Exemplo 3. Os supernadantesforam aplicados começando em uma diluição 1/100 e asdiluições 1/5 foram feitas no PSB. Os resultados sãomostrados na Figura 12 (12B6), a Figura 13 (12A2) e a Figura14 (12A5).

Exemplo 13: Análise de monovalente e bivalente 12A2 nacâmara de fluxo

O Nanobody 12A2 (monovalente e as formas bivalentes)foi testado na câmara de perfusão conforme descrito acima noExemplo 4. 0 experimento foi executado usando o mesmo doadorpara todo o nanobodies. Os resultados são resumidos naTabela 23. Os nanobodies bivalentes inibem a adesão deplaqueta mais eficientemente então a forma de monovalente.

C. Humanização dos nanobodies especifico para vWF eExemplo de adesão de plaqueta de inibição 14: Humanização de12B6 nanobody

Tabela 24 SEQ ID Números: 86 para 89 representa quatrohumanizado 12B6 nanobodies. A tabela II listas asmodificações aminoácidas que foram executadas para realizaressas seqüências. A figura 15 representa o alinhamento dasseqüências humanizadas para 12B6.

Tabela II: não-limitação de substituições se humanizam

<table>table see original document page 278</column></row><table>As expressões foram executadas como descrito noExemplo 2. Os rendimentos de expressão são resumidos naTabela 25.

A estabilidade dos nanocorpos humanizado foi medidacomo descrito no Exemplo 7. A tabela 26 resume o OD280 nmconcentrações (ug/ml) do supernadantes expresso como umaporcentagem da concentração em temperatura ambiente.

A figura 16 mostra a ligação de humanizado 12B6nanobodies a vWF em ELISA executado como descrito no Exemplo 3.

A afinidade de 12136 nanobodies humanizados para vWFfoi determinada em BIACORE. Os valores de KD são resumidosna Tabela 27.

Exemplo 15: Humanização de 12A2 nanobody

Tabela 28 SEQ ID Números: 90 para 94 representa cincohumanizado 12A2 nanobodies. As tabelas III e IV enumeram asmodificações aminoácidas seguintes que foram executadas pararealizar essas seqüências. A figura 17 representa oalinhamento das seqüências humanizadas para 12A2.

Tabela III: não-limitação de substituições sehumanizam:

<table>table see original document page 279</column></row><table><table>table see original document page 280</column></row><table>

TABELA V

<table>table see original document page 280</column></row><table>

As expressões foram executadas comoExemplo 2. Os rendimentos de expressão sãoTabela 29.A estabilidade dos nanocorpos humanizado foi medidacomo descrito no Exemplo 7. A tabela 30 resume o OD280 nmconcentrações (ug/ml) do supernadantes expresso como umaporcentagem da concentração em temperatura ambiente. Todoshumanizado 12A2 nanobodies é muito estável para aquecer-seem temperaturas crescentes.

O ELISA da Figura 18 e 19 foi executado como descritono Exemplo 3. 12A2H1 e 12A2H4 ligam muito bem a vWF emELISA.

Os nanobodies foram testados na câmara de fluxo em umaconcentração de 0.7 ug/ml e 1.5 gg/ml. O mesmo doador foiusado para todos os experimentos. O experimento foiexecutado como descrito no Exemplo 4. Os resultados sãoresumidos na Tabela 31 e 32.

A afinidade dos humanizados 12A2 nanobodies para vWFfoi determinada em BIACORE. Os valores de KD são resumidosna Tabela 33.

Exemplo 16: Humanização de 12A5 nanobody

Tabela 34 SEQ ID Números: 95 para 97 representa trêshumanizado 12A5 nanobodies. A Tabela V enumera asmodificações aminoácidas que foram executadas para realizaressas seqüências. A figura 20 representa o alinhamento dasseqüências humanizadas para 12A5.

Tabela V: não-limitação de substituições se humanizam:

<table>table see original document page 281</column></row><table><table>table see original document page 282</column></row><table>

As expressões foram executadas conforme descrito acimano Exemplo 2. Os rendimentos de expressão depois dapurificação de TALON são resumidos na Tabela 35 para cada umhumanizado 12A5 nanobody.

A estabilidade do humanizado 12A5 nanobodies foimedida conforme descrito acima no Exemplo 7. O OD280 dosupernadantes foi medido e expresso como a porcentagem doOD2 80 na temperatura ambiente. Os resultados são resumidosna Tabela 36. Todos humanizado 12A5 nanobodies é de maneiracomparável estável para aquecer-se em temperaturascrescentes ao tipo natural.

O ELISA foi executado como descrito no Exemplo 3. Afigura 21 ilustra a atividade de ligação para vWF em ELISA.

A afinidade dos humanizados 12A5 nanobodies para vWFfoi determinada em BIACORE. Os valores de KD são resumidosna Tabela 37.

Exemplo 17: Bivalente humanizou nanobodies

Três humanizou nanobodies 12A2H1, 12A2H4 e 12B6H2foram selecionados forma para bivalente com o 3a linker. Asseqüências desses 3 nanobodies diferenciam-se só por algunsaminoácidos como mostrado na Figura 22. Tabela 38 SEQ IDNúmero 98 a 100 listas as seqüências dos nanocorposbivalente. Tabela 38 SEQ ID Número 101 - a 106 listas asseqüências de nanobodies bivalente humanizado ligado com oGS9 e GS30 linker, respectivamente.

As expressões foram executadas como descrito noExemplo 2. Os nanobodies conter (A sua) 6 etiqueta forampurificados em uma coluna de Nickel (TALON, Clonetech) comodescrito pelo fabricante. A seqüência de etiqueta éEQKLISEEDLNGAAHHHHHH. Os nanocorpos sem etiquetas forampurificados na proteína A. Os rendimentos de expressão foramcalculados e são resumidos na Tabela 39.

A estabilidade dos nanocorpos bivalente humanizado foimedida como descrito no Exemplo 7. O OD280 do supernadantesfoi medido e expresso como a porcentagem do OD280 natemperatura ambiente. Os resultados são resumidos na Tabela40.

Os nanobodies (tipo humanizado mas também natural)foram testados na câmara de fluxo em uma concentração de0.15 ug/ml, 0.3 tg/ml e 0.6 ug/ml. 0 mesmo doador foi usadopara todos os experimentos. O experimento foi executado comodescrito no Exemplo 4. A figura 23 mostra a adesão deplaqueta em concentrações diferentes de nanobodiesbivalente. Tabela 41 adesão de plaqueta de listas de tiponatural e nanobodies bivalente humanizado.D. O efeito do Nanobody (bivalente) na trombosearterial em um babuino FOLTS modela o Exemplo 18: o BabuinoFOLTS modela com ALX-0081

Neste estudo a eficácia e a segurança de ALX-0081foram avaliadas em um modelo de trombose Folts em babuinos.

Também, a eficácia e a segurança de ALX-0081 em ummodelo de trombose Folts em babuinos foram em comparação comoutras fármacos atualmente usadas na clinica/ como Reopro,Plavix, Aspegic, Heparina e Epinefrina. Todos esses foramdiluídos no cloreto de sódio de 0.9% e administrados comoinjeções bolo intravenosas. Este estudo foi também projetadopara determinar a dose eficaz para cada um desses compostos.

Finalmente, a eficácia em uma trombose Folts modelamem babuinos de uma combinação de fármacos que é atualmenteusada na clinica em uma colocação de (PCI) de intervençãocoronária percutânea foi testado: Aspegic, Heparina, ePlavix. Além disso avaliamos se ALX-0081 pode melhorar aeficácia desta combinação quando topo acrescentado.

Vimos parâmetros de segurança como a indução dehemorragia, vWF e fator VIII niveis, e contagem de plaqueta,PT, e aPTT.

Protocolo de Estudo

O protocolo de estudo que foi aplicado é o modelo deFolts original e algumas modificações descritas mais adiante(Folts JD, e al, Circulation. 1976; 54:365-370).

Babuinos masculinos ou femininos sãos (Papio ursinus)foram usados. Os animais tinham 8-17 kg de peso e foram semdoença por pelo menos 2 semanas antes do uso. Os babuinosforam alimentados com comida seca padrão só. Os babuinosforam usados em pontos de tempo diferentes. O peso dosbabuinos são resumidos na tabela 42 (estudo de eficácia ALX-0081 e comparação com fármacos individuais) e tabela 50(eficácia de uma combinação de fármacos e ALX-0081 alémdesta combinação).

Os animais foram anestesiados e a temperatura de corpoé mantida a 37 °C com uma mesa aquecida. Um segmento de umaartéria femoral foi dissecado livre do tecido circundante.Desvio foi colocado entre a veia femoral e artéria femoralpara obter altas taxas de corte. O fluxo de sangue médio efásico foi registrado continuamente em todas as partes doexperimento. O fluxo de base foi registrado por 20 minutos.

O sitio de dissecação proximal da artéria femoral então foiprejudicado aplicando duas oclusões de sobreposição daartéria por 1 segundo usando um fórceps. Uma braçadeira foicolocada por cima do sitio ferido para criar uma estenoseexterna.

Um declínio gradual no fluxo de sangue devido a adesão

deplaqueta e agregação foi observado. Quando o fluxo foireduzido ao zero, o fluxo de sangue foi restaurado abrindo abraçadeira para desalojar o trombo rico em plaquetas. Estemodelo repetitivo do fluxo de sangue que diminui depois darestauração mecânica menciona-se como reduções de fluxociclicas (CFRs). O dano endotelial adicional foi repetido senecessário para obter finalmente CFRs estável nessesbabuinos- 0 número de vezes que o trombo tinha de serdesalojado determina o número de CFRs. A figura 24 ilustra omodelo de fluxo de sangue durante o modelo de Folts embabuinos.

Depois de um periodo de controle de 30 minutos de CFRsreprodutivel, o veiculo foi administrado como um controleinterno e CFRs foram acompanhados por mais 30 minutos.Depois deste periodo, agentes de teste (salina (n=2) , Reopro(n=3), Aspegic (n=3), Plavix (n=4), Heparina (n=3) ou ALX-0081 Nanobody™ (n=9)) foram fornecidos via uma injeção debolo intravenoso (seguido por uma infusão continua para ALX-0081) e a monitorização foi continuada até 30 minutos depoisda administração de fármaco. Este procedimento foi repetidopara várias vezes com o escalamento de doses da substânciade teste. O efeito de anti-trombótico foi quantificadocomparando o comprimento de CFRs antes e depois daadministração de fármaco. Quando a inibição plena de CFRsfoi observada, um novo dano foi aplicado para confirmar quea inibição foi um efeito do tratamento mas não de umfenômeno de cura natural. No fim dos experimentos,Epinefrina (2.2 .tg/kg/min) foi injetada para distinguir-seentre uma inibição débil e uma forte do CFRs. De fato, foidemonstrado antes que CFRs reaparecem na presença deEpinefrina quando a aspirina (uma fármaco de anti-plaquetadébil) é usada no mesmo modelo.

A organização do experimento é ilustrada na Figura 25.Os comprimentos dos CFRs, depois de cada dose docomposto de teste são resumidos nas tabelas 43-48. As dosesnas quais a inibição plena de CFRs é obtida são sombreadas.

Uma leitura representativa do fluxo de sangue duranteos experimentos de modelo de Folts é mostrada nas figuras26-31.

Os resultados demonstram que CFRs pode ser obtido nosanimais de controle por pelo menos 3 horas, sem anecessidade para um novo dano no meio. 0 comprimento médiodo CFRs é 2-5 minutos e não há nenhum efeito no comprimentodo CFRs pela injeção salina (figura 26, tabela 43).

Aspegic

Três animais foram injetados com Aspegic (Aspirinainjetável) e procurada inibição de CFRs. Na clinica, umainjeção de bolo de 250 mgs (f 3-5 mgs/kg) é administrada aopaciente, justo antes de começar um procedimento deintervenção coronária percutânea (PCI). Em dois animais(babuino 3 e 5) nenhuma inibição de CFRs pode ser obtida emdoses tão altas como 80 e Aspegic de 4 0 mgs/kgrespectivamente (figura 27, tabela 44) . No babuino 4, foimuito dificil estabelecer um modelo repetitivo estável deCFRs na fase de controle. Depois que vários novos danosforam feitos (isto é, no momento que injetamos a salina),CFRs estáveis foram obtidos. A inibição completa de CFRs foiobtida na dose de Aspegic de 5 mgs/kg, mas em mais altasdoses e sobre o novo dano, o CFRs devolvido, embora ocomprimento médio do CFRs fosse 3-4 vezes mais longo do queantes da administração de Aspegic. Depois de infusão deEpinefrina, o CFRs voltou imediata e completamente (tabela44) .

Heparina

Três animais foram injetados com Heparina nãofracionada e procurados por inibição de CFRs. Na clinica,uma injeção de bolo de 60-70 IU/kg é administrada aopaciente, e o aPTT (tempo de tromboplastina parcial ativado)é controlado a cada 30 minutos. Heparina extra éadministrada se o aPTT for <250 segundos. Nos babuinos 7 e8, nenhuma inibição do CFRs pode ser obtida mesmo em dosestão altas como 24 0 IU/kg (a figura 28, tabela 45) . Nobabuino 6, a inibição completa do CFRs foi obtida naprimeira dose de 15 IU/kg e em mais altas doses, mas quandofizemos um novo dano o CFRs voltou cada vez. Na dose maisalta de 240 IU/kg, CFRs foram inibidos até depois de um novodano, mas o fluxo diminuia e na infusão da Epinef rina, oCFRs retornava imediatamente.

Plavix

Quatro babuinos foram tratados com Plavix e usadospara o estudo de Folts. Usamos Plavix como fármaco injetávelre-suspendendo pastilhas no metanol. Por isso, fomos capazesde executar um experimento de escalamento de dose quanto aoutros fármacos. Em pacientes, Plavix de 300-600 mgs éadministrado oralmente, a inibição da agregação de plaquetapode ser vista 2 horas depois de doses orais únicas dePlavix. Já na dose final de 2.5 mgs/kg nos babuinos, umefeito no comprimento do CFRs pode ser demonstrado, mas esteefeito inibitivo começou só 10 minutos depois da injeção(figura 29, tabela 46) . No babuino 12, a inibição completado CFRs foi obtida nesta dose de 2,5 mgs/kg. Em outros trêsbabuinos a inibição completa de CFRs foi obtida na dosefinal de 5 mgs/kg. O CFRs permaneceu inibido quando um novodano foi feito, mas voltou depois da infusão de Epinefrina.Quando a infusão Epinefrina foi parada, o CFRs permaneceupor outros 5 minutos, mas então novamente a inibiçãocompleta foi obtida (a figura 29).

Reopro

O Reopro foi testado para eficácia no modelo de Foltsem três babuinos. Na clinica, os pacientes recebem uma dosede 250 jag/kg seguido por uma infusão continua de 7,5jag/kg/hora. Isto é, também a dose da qual precisamos embabuinos 13, 14 e 15 para obter a inibição completa do CFRs(dose final de 170-420 gg/kg (a figura 30, tabela 47).Administramos aos babuinos uma injeção de bolo só. Quando umnovo dano foi aplicado, a inibição completa do CFRs foiretida e a infusão de Epinefrina não pode inverter estainibição (a figura 30).

ALX-0081Nove babuinos receberam ALX-0081 e foram usados nomodelo de Folts. Em todos os babuinos a inibição completa deCFRs foi obtida na dose de 30 ug/kg + 45 ug/kg/hora (dosefinal de 43 ug/kg) . Em 2 babuinos, a inibição completa jáfoi obtida na 10 jig/quilograma + 15 gg/kg/hora (babuinos 17e 22) . A inibição foi retida sobre um novo dano e depois dainfusão de Epinefrina nos nove babuinos (a figura 31, tabela 48) .

Aspegic-Heparina-Plavix-ALX-0081 (Asp/Hep/Plav/ALX) combinações

Sete babuinos receberam uma injeção de bolo deAspirina de 5 mgs/kg, 60 IU/kg Heparina e doses crescentesde Plavix. Heparina extra foi administrada em pontos detempo diferentes para segurar certo nivel (aPTT deve serpelo menos dobrado contra o controle) . Os CFRs foramcontrolados por 30 minutos depois de cada dose de compostosde teste. Começamos em uma dose de Plavix de 1 mg/quilogramae acrescentamos 1 mg/quilograma depois de 30 minutos. Oefeito anti-trombótico foi quantificado comparando ocomprimento de CFRs antes e depois da administração defármaco. Quando a inibição completa de CFRs foi observada,um novo dano foi aplicado. A Epinefrina foi injetada econtinuada até o fim do experimento.

Se CFRs não voltava, um novo dano era aplicado. Depoisde 2-3 CFRs as doses crescentes de ALX0081 foramacrescentadas: (1), 3, 10 ou 30 pg/kg. Esperamos depois decada dose de ALX-0081 para 2 CFRs e aumentamos a dose atéque a inibição completa de CFRs fosse obtida. Na inibiçãocompleta do CFRs, a infusão continua foi começada de dose de1,5 tempos ALX-0081/kg/hora para a 30 infusão de epinefrinae minutos foi continuada. Um novo dano foi aplicado depoisde 10-15 minutos. As especificações dos babuinos que foramusados neste estudo são representadas na tabela 49.

Os resultados desses estudos para cada composto deteste individualmente são resumidos na tabela 50. Um efeitoanti-trombótico superior claro no modelo de babuino detrombose Folts é observado para ALX-0081 e Reopro quando emcomparação com a Aspirina, Heparina ou Plavix: sobre o novodano e depois da infusão de Epinefrina, os CFRs não voltamno modelo de Folts no ALX0081 e babuinos tratados com Reoproem contraste com o modelo em Aspegic, Heparina ou Plavixtrataram animais. A dose de ALX-0081 requerida para inibiçãocompleta de CFRs é aproximadamente de 10 vezes mais baixa doque a dose necessária para Reopro. Por isso, é concluído queALX-0081 é mais potente do que Reopro.

Depois da administração de uma combinação da Aspirinade 5 mgs/kg, 60 IU/kg Heparina e doses crescentes de Plavix,nos sete babuinos a inibição completa de CFRs foi obtidanesta dose final. A dose de Plavix requereu que a inibiçãoplena seja de 2,5 vezes mais baixa do que a dose necessáriaquando Plavix sozinho é administrado. Para todos os babuinostestados, CFRs não voltou quando um novo dano foi feito (afigura 32) . Contudo, com injeção de Epinefrina, CFRsretornava espontaneamente em babuinos 5, 8, 9 e 10 e sobreum novo dano em babuinos 4, 6 e 7. Heparina extra foiinjetada ao mesmo tempo como epinefrina. Depois de 2 CFRs,as doses crescentes de ALX0081 foram administradascontinuando a infusão de Epinefrina. A dose de ALX-0081 foiaumentada de 1 mais de 3-10 a 30 yig/kg. Quando a inibiçãocompleta de CFRs foi obtida, uma infusão continua de ALX-0081 foi começada em 1,5 vezes a dose/quilograma/horaeficaz. Nos sete babuinos, a inibição completa do CFRs foiobtida na 30 dose de gg/kg. Esta dose eficaz de ALX-0081 é amesma requerida para a inibição completa de CFRs no modelode Folts quando ALX-0081 é administrado sozinho.

Por isso, podemos concluir que a eficácia de ALX-0081não é aumentada pela infusão simultânea de Plavix, Heparinae Aspegic. Esta observação corresponde completamente à nossahipótese: o ALX-0081 inibe muito a primeira interação entreplaquetas e o colágeno exposto na parede arterialdanificada. O Plavix e Aspegic por outro lado inibe o fluxoulterior na cascata que leva ao desenvolvimento de umtrombo. Por isso, Plavix e a Aspirina não contribuem para amelhor eficácia, dado que ALX-0081 interfere já no primeiropasso na formação do trombo. Além disso, quando um novo danofoi aplicado na dose eficaz de ALX-008 1, o CFRs não voltou,demonstrando um efeito antitrombótico potente desteNanobody™. Os resultados são resumidos na tabela 51.

Medições

Os parâmetros seguintes foram medidos: a) análise desangramento, b) concentração de vWF, níveis de Fator VIII, econtagem de plaqueta, PT e aPTT c) agregação de plaquetaristocetina-induzida d) ALX-0081 concentração, e análise e)de seções arteriais para restenose, f) imunogenicidade de ALX-0081

a) Análise de hemorragia

Para analisar a hemorragia, uma incisão foi feita comum escalpelo na virilha. Isto foi feito 15 minutos depois deregistrar fluxo de base, quando o dano foi feito na artéria.A gaze foi inserida na ferida e substituída a cada 30minutos justo antes de cada nova dose do composto de teste.A quantidade da perda de sangue depois de cada dose docomposto de teste foi determinada pesando a gaze. A perda desangue é expressa quanto à quantidade da perda de sangue nasegunda gaze de controle (durante a injeção salina) (tabelas52-54).

Para todos os babuínos tratados com Plavix e Reopro, aperda de sangue é alta (até 9-40 vezes respectivamente nadose mais alta) , começando da dose eficaz. Para os animaistratados com ALX-0081 a hemorragia é mais baixa do que emanimais tratados do Plavix, e muito mais baixa quando emcomparação com animais tratados com Reopro.

Para determinar a segurança contra o nível de eficáciade Plavix, Reopro e ALX-0081 como fármacos antitrombóticos,as médias da perda de sangue quanto à segunda gaze decontrole são mostradas para esses fármacos em função da dosede fármaco como múltiplo da dose eficaz (a figura 33) . Adose eficaz para Plavix é 5 mgs/kg, para Reopro 250 tg/kg epara ALX-0081 30 ug/kg (tabela 46-48). Esses resultadosagradavelmente demonstram a segurança superior de ALX-0081quando em comparação com Reopro e Plavix: a janela na qualALX-0081 pode ser administrado sem um aumento principal nahemorragia é muito mais larga em comparação com Plavix eReopro.

Os resultados das médias da perda de sangue na gaze(se disponível) foram combinados com as médias doscomprimentos do CFRs nas figuras 34-36.

Uma larga janela terapêutica foi observada para ALX-0081 no modelo de Folts: um efeito antitrombótico forte podeser demonstrado sem qualquer maior hemorragia para dosescumulativas nos limites de 43 .tg/kg até 403 ug/kg (a figura36) . Em contraste contudo, a janela terapêutica para Reoproe Plavix no mesmo modelo foi muito mais estreita emcomparação com ALX0081, combinando um efeito deantitrombótico eficaz com uma alta perda de sangue (a figura34-35) .

A média da soma total da perda de sangue (= a soma daperda de sangue da gaze de cinco primeiras doses do compostode teste) como quanto à segunda gaze de controle é resumidana tabela 55. Nesta tabela também indicamos a dose finalcomo múltiplo da dose eficaz (= a soma das cinco dosesdivididas pela dose eficaz). Como mencionado antes, a doseeficaz para Plavix é 5 mgs/kg, para Reopro 250 pg/kg e paraALX-0081 30 pg/kg.

Os resultados mostrados na tabela 55 claramentedemonstram que a perda de sangue total é significativamenteaumentada nos animais tratados com Plavix e a uma extensãomesmo mais alta nos animais tratados com Reopro. A perda desangue em animais que recebem ALX-0081 é de 2 vezes e 4vezes menos do que em Plavix ou em animais tratados comReopro, respectivamente. Isto novamente claramente demonstraque ALX0081 está mais seguro do que Plavix e Reopro quanto arisco de sangramento, embora doses de mais do que 10 vezes adose eficaz fossem usadas.

A combinação eficaz de Aspegic, Heparina e Plavixresulta em um aumento na perda de sangue de até 14 vezesquando em comparação com a gaze de controle (tabela 56) . Aadição de ALX0081 anteriormente da combinação de Aspegic,Heparina e Plavix não resulta em hemorragia aumentada excetonos babuinos 4 e 7. No babuino 7, a hemorragia foi muitoaumentada depois da administração de epinefrina, extraheparina e não doses eficazes de ALX-0081, mas foi maisbaixa novamente depois da administração da dose eficaz deALX-0081. Esses resultados demonstraram que ALX-0081 éseguro quando acrescentado anteriormente à combinação defármacos que é atualmente usada em uma ambiente clinico.

b) Concentração de vWF, Fator VIII nivel, contagem deplaqueta, PT e aPTTvWF

Os níveis de vWF em plasma rico em plaquetas (PRP) deamostras de sangue tomado depois da administração das dosesdiferentes das fármacos no modelo de Folts foramdeterminados usando um ensaio de imunosorbente e expressoscomo uma porcentagem do padrão humano (QUEM 5 'h PadrãoInternacional para fator VIII e VWF)

Os resultados claramente demonstram que os fármacosdiferentes usados no modelo não têm nenhum efeito principalno nivel de vWF.

Fator VIII

O fator que VIII niveis no PRP de amostras de sanguetomado depois da administração das doses diferentes dosfármacos no modelo de Folts foi determinado usando o testede aPTT. Não testamos as amostras de plasma dos babuinostratados com Heparina, como demonstramos que Heparinaprolonga o tempo aPTT. Os niveis de FVIII foram expressoscomo a porcentagem da primeira amostra de controle, tomada10 minutos depois do dano da artéria femoral. Não vemosnenhum efeito dos tratamentos no teste de aPTT.

Contagem de plaqueta, PT e aPTT

As medições de contagem de plaqueta durante osexperimentos de modelo de Folts foram executadas. Os dadosmostraram que o babuino 15 tem uma contagem de plaquetamuito baixa quando em comparação com outros animais. Ascontagens de plaquetas para toda espécie de tratamentos,exceto o tratamento Plavix, são muito comparáveis com o quevemos nos animais de controle e são regularmente constantesdentro de algum tempo.

Os valores de PT não demonstram nenhum efeito doscompostos de teste no tempo de PT, exceto babuinos tratadoscom a dose de 24 0 IU/kg de Heparina onde um aumento menor noPT foi observado.

Os valores de aPTT observados durante os estudos demodelo de Folts são resumidos. Esses resultados indicam queos compostos de teste não têm nenhum efeito nos valores deaPTT, exceto os babuinos tratados com Heparina. Nessesanimais, valores de aPTT são prolongados da dose de 30-60IU/kg em diante, como também é observado em pacientes. AHeparina atua como um anticoagulante formando um complexocom antitrombina e catalisando a inibição de fatores decoagulação de sangue ativados como Xla, IXa, Xa e trombina(fator lia). Esses fatores estão todos implicados na cascatade coagulação intrínseca da qual a sua funcionalidade émedida no teste de aPTT.

c) A medição da agregação de plaqueta ristocetina-induzida no sangue obtido de babuinos tratados com ALX-0081

O sangue obtido de babuinos tratados com ALX-0081 foianalisado para a inibição da agregação de plaqueta. Asagregações de plaqueta foram executadas em um sangue inteiroChronolog e Agregômetro ótico (Modelo 560CA, Chronolog, osEUA). O PRP foi preparado (colhido em citrato 0.38 mol/L) ,por centrifugação do sangue inteiro em 1200 rotações porminuto por 5 minutos. A fração superior que contém o PRP foicuidadosamente retirada. A fração mais baixa foi além dissocentrifugada a 3000 rotações por minuto por 10 minutos parapreparar o plasma pobre em plaquetas (PPP) . As plaquetasforam contadas em PRP e diluíram-se em PPP a umaconcentração final de 200.000 plaquetas por microlitro. 3mg/ml ristocetina (DAKO) foram acrescentados e a agregaçãofoi medida.

A agregação de plaquetas ex-vivo é medida nas amostrasde sangue tomadas durante o experimento de Folts nosbabuinos tratados com ALX-0081. A agregação de plaquetadependente de GPlb-IX-V através de vWF é medida usandoristocetina como um modulador. O % de agregação é medido emcada ponto de tempo e em cada dose. A amostra de controle étomada 10 minutos depois do dano arterial.

Os resultados do teste de RIPA são comparados com ainibição do CFRs para cada babuino tratado com ALX-0081(figura 37). Como mostrado na figura 37, uma relação inversaentre o RIPA e o comprimento do CFRs é observada. Alémdisso, esses resultados manifestam que a inibição completano teste de RIPA é obtida em doses mais baixas do que ainibição completa de CFRs em babuinos 16, 18, 19 e 23. Paraos babuinos 20, 21, 22 e 24 os resultados com RIPA secomparam muito bem com os resultados para a eficácia nomodelo de Folts.

d) Concentração de ALX-0081

As Microplacas de titragem são cobertas do rato anti-myc policlônico durante a noite a 4°C em uma diluição de1000 vezes. As chapas são lavadas com o PBS-TWEEN ebloqueadas por 2 horas em RT com caseina de 1% de PSB. Asamostras são diluídas em uma microplaca de titragem não-coberta no plasma de babuino de referência de 25%. A curvapadrão está preparada diluindo o nanobody na mesma amostrade plasma de babuino de referência. As amostras sãoaplicadas nas chapas cobertas com anti-myc e deixadas seligar por 2 horas em RT. As chapas são lavadas 5 vezes com oPBS-TWEEN. Anti-vWF-HRP de coelho (DAKO) é aplicado em umadiluição de 3000 vezes por uma hora em RT. Para medir OD405nm, as amostras são lavadas 5 vezes com o PBS-TWEEN esubstrato ABTS/H202 é acrescentado.

Determinamos a concentração de ALX-0081 em amostras deplasma tomadas 10 minutos depois de cada injeção de bolo. Ainjeção de bolo foi imediatamente seguida por uma infusãocontinua. As concentrações (pg/ml) são resumidas na tabela58.

Para todos os babuinos um nivel crescente de ALX-0081nas amostras de plasma foram medidos por ELISA depois does ca lamento de dose de ALX-0081. Para o babuino 16, asquantidades constantemente mais altas de ALX-0081 foramdeterminadas na amostra de plasma tomada depois de dose de10 ug/kg em comparação com a amostra tomada depois de 30gg/kg. O nível de ALX-0081 naquela amostra é tambémsubstancialmente mais alto do que o que é observado paratodos outros babuínos dado o mesmo horário de dosagem deALX-0081. Como os níveis de ALX-0081 para o babuíno 16depois das mais altas doses está na linha das expectativas,assumimos que uma anormalidade desconhecida durante aamostragem de sangue acontece para este contas este valormarginal.

A concentração de ALX-0081 para cada dose nos babuínosdiferentes é variável. Para a dose de 3 pg/kg, aconcentração percorre entre 0,03 e 0,14 ug/ml para 10 pg/kgentre 0,18 e 1,23 pg/ml, para 30 pg/kg entre 0,51 e 1,14pg/ml, para 90 pg/kg entre 1,38 e 6,77 ug/ml e para 270pg/kg entre 4,03 e 35,14 pg/ml. Na figura 38, traçamos aconcentração de ALX-0081 no plasma contra o comprimento doCFRs.

A concentração de ALX-0081 requereu que a inibiçãototal de CFRs esteja entre 0,3 e 0,5 Vg/ml, que está empleno acordo com a concentração requerida para inibir aadesão de plaqueta a colágeno na câmara de fluxo em altataxa de corte, quando ALX-0081 é pregado no sangue humano.Em azul (a figura 38, painel B) indicamos a variedade deconcentração de ALX-0081 onde a inibição começa (omitir adose de 10 Vg/kg no babuíno 16).

Quando traçamos a concentração de ALX-0081 contra aquantidade relativa da perda de sangue da gaze, observamosum aumento de mais do que 2 vezes na hemorragia em dosesacima de 1 pg/ml (a figura 39) . Um aumento de 10 vezes naperda de sangue foi observado quando a concentração ALX-0081é 19 pg/ml, que é 40-60 vezes a concentração eficaz.

e) Análise de seções arteriais para restenoseQuatro semanas depois do tratamento da segundaartéria, as artérias são dissecadas livres do tecidocircundante. A artéria é ligada no sitio superior e abaixodo dano endotelial inclusive o sitio onde o desvio foicolocado. Uma seção é retirada de 2 centímetros, cortada emuma parte mais baixa (local do desvio) e a parte superior(local estenosado e prejudicado) e armazenado em formaldeidoa 10%. Os babuinos então são sacrificados por injeção deeutanásia. As artérias são marcadas segundo a origem ecortadas em anéis de 2 mm cada um. Os anéis são colocados emcassetes marcados convenientes para processamento dehistologia. Os cassetes então são colocados durante a noiteem um Processador VIP Tissue Tek automatizado seguindo ohorário de processamento noturno como descrito em Bancroft(Bancroft, John D., Stevens Alan (1990). Teoria e Prática deTécnicas Histológicas. Terceira Edição).

Depois do processamento, as artérias são embutidas emblocos de cera de parafina marcados e esfriadas em uma chapacongelada. Os blocos de cera são cortados em série as seçõesdo 4 micron cada um em um micrótomo rotativo. As seções sãocolhidas em slides de vidro e manchadas para avaliaçãohistológica. O método de Haematoxylin e Eosin, bem como ométodo de Verhoeff para manchas de fibras elásticas sãoexecutados em cada uma das artérias (Bancroft, John D.,Stevens Alan (1990). Theory and Practice of HistologicalTechniques. Terceira Edição). Depois de manchar, os slidessão desidratados, compensados, montados e etiquetados. Aanálise cega das seções é executada,

f) Análise de Imunogenicidade

A presença de imunoglobulinas ALX-0081 no plasma detrês babuinos foi avaliada por dois métodos, respectivamenteum método ELISA e um método baseado em SPR em Biacore. Osbabuinos foram tratados por 8 semanas com o aumento de dosesde ALX-0081 (começando de 10 ug/kg). Durante as referidas 8semanas, nenhuma resposta imunogênica pode ser observadasobre a injeção de ALX-008 1. A meia-vida de ALX-0081percorreu entre 7 e 9 horas. Exemplo 20: Uso de vWF como umantídoto para ALX-0081

Apesar da segurança provada de ALX-0081 em babuinos, eo despejo rápido do Nanobody™, decidimos avaliar o uso devWF como um antídoto para ALX-0081. Isto foi testado em ummodelo de Folts em babuinos onde avaliamos se o efeitoinibitivo de ALX-0081 na formação trombo arterial pode serinvertido pela injeção de vWF.

O procedimento experimental seguiu o modelo de Foltsoriginal com as modificações como descrito no exemplo prévio 18 .Babuínos masculinos sãos (Papio ursinus) foram usadosneste estudo. Os animais tinham 9-12 kg de peso e ficaramsem doença por pelo menos 2 semanas antes do uso. Osbabuinos foram alimentados com a comida padrão seca só.

Três babuinos foram usados neste estudo, o comprimentodo CFRs durante a fase de controle, depois de administraçãosalina, ALX-0081 e vWF é resumido na tabela 59.

0 fluxo de sangue como uma função do tempo para cadababuino e experimento é mostrado na figura 40.

Nos três babuinos, a inibi ção completa de CFRs foiobtida com uma dose de 30 jig/kg + 45 p de g/kg/hora de ALX-0081, mesmo quando um novo dano foi aplicado, o CFRs nãovoltou. Sobre a injeção da primeira dose de vWF (250 IU) , ofluxo gradualmente diminuiu, mas CFRs não voltou até que umadose extra de 250 IU de vWF fosse administrada. Esteresultado demonstrou agradavelmente que a atividade de ALX-0081 pode ser invertida pela administração de vWF, e que,por isso, o vWF seria um bom antídoto para este Nanobody™

Portanto, outro aspecto da invenção refere-se ao usode vWF, de um fragmento conveniente disso, de DDAVP(desmopressinor) ou um fragmento conveniente disso, ou deuma composição farmacêutica que compreende algum doprecedente, como um antidoto para complicações ou efeitoscolaterais indesejados associados com o uso de um Nanobody, proteína ou polipeptidio contra vWF, especialmente umNanobody, proteina ou polipeptidio conforme descrito napresente.Exemplo 21: Efeitos de ALX-0081 em adesão de plaquetaa célula endotelial derivada UIvWF e na atividade de ADAMTS-13

Este estudo serve como prova do conceito para o uso deALX-0081 como um fármaco em pacientes TTP. As aspersões deplaquetas reconstituídas no plasma TTP (nenhum ADAMTS 13)são executadas em células endoteliais que segregam ULvWF, naausência e presença de ALX-0081. Em um experimento separadotestamos se ALX-0081, que liga ao domínio de Al de vWF,interfere na atividade de ADAMTS-13. ADAMTS-13 liga a eracha o dominio A2 de vWF.

As células Endoteliais foram obtidas de veias decordão umbilical humanas pelo método de Maruyama(Z.Zellforsch. Mikrosk. A4nat. 60:69; 1963). As célulasendoteliais foram ativadas com 100 u M de histamina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) por 15 minutos em temperaturaambiente antes dos experimentos de perfusão.

O sangue foi extraído de voluntários sãos que negarama ingestão da aspirina ou outros farmacos anti-inflamatoriosnão esteroidais (NSAIDs) pelos 10 dias precedentes em umdécimo de volume de citrato de sódio 3.4%. O plasma rico emplaquetas (PRP) foi preparado do sangue inteiro porcentrifugação (10 minutos em 200g na temperatura ambiente).

O PRP foi acidificado pela adição de um décimo de volume deACD (2.5% trissódio citrato, ácido citrico de 1.5%, e D-glicose de 2%), e as plaquetas foram giradas (500g, 15minutos). A pilula de plaquetas foi re-suspensa em HEPES (N-2-hidroxyietilpiperazina-N 1-2-etanesulfônico ácido)-Tyrodebuffer (HEPES de 10 mm, NaCl de 137 mm, KCI de 2.68 mm,NaH2P04 de 0.42 mm, MgCl2 de 1.7 mm, D-glicose de 5 mm, pH6.5). Prostaciclina (PGI2, 10 ng/mL) foi acrescentada paraprevenir a ativação de plaquetas durante o passo de lavagemsubseqüente. As plaquetas foram giradas e re-suspensas em umpequeno volume do buffer HEPES-Tyrode. Esta suspensões deplaqueta foi diluída no buffer HEPES em pH 7.4, ou no plasma TTP.

As aspersões foram executadas em uma câmara deperfusão de passo único como descrito anteriormente. Oexperimento foi seguido por video-microscopia em tempo real.

Em um segundo tipo do experimento, as misturas dereação diferentes estiveram preparadas como resumido natabela 60, contudo, sem a adição do construto A1A2A3. Oconstruto A1A2A3 é um fragmento recombinante consistente emdominios Al, A2 e A3 de vWF. As misturas foram pré-incubadaspor 5 minutos a 37 °C depois que o fragmento A1A2A3 éacrescentado e a mistura é incubada em um banho de águadurante a noite a 37 °C. No dia seguinte um SDS-PAGE redutoré dirigido às amostras (12%, e usando como marcador osPrecision PLus Protein Standard de BioRad) e manchada emImmobilon-FL (Millipore). A mancha foi bloqueada por 2 horasna temperatura ambiente com blockbuffer (1:1 Odysseyblockbuffer em lxTBS pH=7,4) e incubado com anti-vWF decoelho policlônico (DAKO). Alexa Fluor 680 anti-coelho decabra foi usado para detecção. A exploração foi feita noODYSSEY para descobrir os produtos de degradação.

Experimento de controle: ligação de plaquetas a ULvWFCélulas endoteliais foram isoladas de cordão umbilicalhumano recentemente obtidas por digestão de colagenase dointerior da veia umbilical- As células foram cultivadas nacultura de tecido como uma população homogênea. As célulasendotelial humanas cultivadas crescem como monocamadas degrandes células poligonais estreitamente opostas, e elascontêm inclusões citoplasmáticas (corpos de WeibelPalade) .Estimuladas por histamina endotelial, células isoladas decordão umbilical humano expressam Fator Von Willebrand(ULvWF) ultra-grande na sua superfície. A perfusão dessascélulas estimuladas com plaquetas de sangue isoladas, quesão suspensas em buffer ou em plasma de um paciente com TTPadquirido, resulta na deposição de plaquetas para o ULvWF(8). Essas plaquetas ULvWF-aderidas aparecem como assimchamadas xcadeias, que são visíveis quando o experimento deperfusão é controlado pela microscopia de video de temporeal (a figura 41).

Inibição por ALX-0081 para a geração de cadeias deplaquetas

As plaquetas foram re-suspensas no buffer ou no plasmaTTP e as concentrações de ALX0081 usado neste experimentoforam 0,2, 2 e 10 pg/ml. Estimuladas por histaminaendotelial células isoladas de cordão umbilical humano sãoperfundidas com essas suspensões de plaqueta conformedescrito acima.

A adição de ALX-0081 a plaquetas re-suspensas nobuffer ou no plasma de um paciente TTP resulta em umainibição completa da formação de cadeia em todas ascondições testadas (a figura 42) . Os experimentos deperfusão foram executados em taxa de corte de 2.5 dyn/cm2por 4 minutos. Durante esta perfusão de 4 minutos pelo menos20 campos microscópicos foram examinados, e na presença doNanobody™, nenhuma cadeia pode ser demonstrada em todas ascondições testadas (a figura 42).

Rachadura de ULvWF por ADAMTS-13

O ADAMTS-13 reduz o tamanho de multimeros grandes eultra-grandes VWF a formas menores especificamente rachandoa ligação de peptideo Y842/M843 no VWF A2 domínio. Doistipos de ensaios foram usados para avaliar o efeito de ALX-0081 na rachadura de ULvWF por ADAMTS-13: isto é, um ensaiode perfusão e um ensaio que observa a rachadura de umfragmento recombinante vWF.

Em um primeiro experimento, as cadeias foram geradaspor uma perfusão de 4 minutos de plaquetas lavadas re-suspensas no buffer por cima de células endoteliaisestimuladas por histamina. Posteriormente, as plaquetas não-aderidas foram tiradas ao lavar por uma perfusão de 4minutos do buffer. Depois disto, o buffer foi perfundido poroutros 4 minutos, seguidos por uma perfusão de 4 minutos deplasma normal juntado que contém ADAMTS-13. A separação dascadeias de plaqueta foi observada depois da perfusão deplasma normal juntado (a figura 43). Mais de 95% das cadeiasforam rachadas depois da perfusão de 4 minutos.

Em um seguinte experimento, as cadeias foram geradaspor uma perfusão de 4 minutos de plaquetas lavadas re-suspensas no buffer por cima de células endoteliaisestimulado por histamina e as plaquetas não-aderidas foramtiradas ao lavar por uma perfusão de 4 minutos do buffercomo anteriormente. Depois disto, ALX-0081 (10 u o g/ml nobuffer) foi perfundido por 4 minutos, seguidos por umaperfusão de 4 minutos de plasma normal juntado que contémALX-0081 (10 4g/ml = excesso de molar de 10 vezes por cimade vWF) e ADAMTS-13. Podemos demonstrar claramente aseparação das cadeias de plaqueta e 95% das cadeias foramrachadas depois da perfusão de 4 minutos (a figura 44)

Esses resultados claramente demonstram que ALX-0081não tem um efeito na rachadura de cadeias de ULvWF porADAMTS-13.

Em um segundo ensaio, um fragmento recombinante quecontém o dominio A1-A2-A3 de vWF foi misturado com o plasmade coletivo normal (NPP) que contém ADAMTS-13, resultando arachadura proteolitica do fragmento que foi observado poruma análise de Western Blot. A atividade de ADAMTS-13 foitestada na ausência e presença de 10 ug/ml ALX-0081. Comoindicado na figura 45 ALX-0081 não tem nenhum efeito narachadura do fragmento vWF (travessas 6-7-8).

Para demonstrar que a rachadura observada é especificapara ADAMTS-13, um experimento de controle na presença deEDTA foi executado, dado que EDTA inibe a atividade deADAMTS-13. Como esperado, a presença de EDTA em NPP resultouna inibição da rachadura do fragmento (a figura 451ane 4).

Este experimento novamente comprova que ALX-0081 nãotem nenhum efeito na atividade ADAMTS-13.

Tabela 8: listagem de seqüência de nanocorpos anti-vWF

<table>table see original document page 309</column></row><table><table>table see original document page 310</column></row><table>

Tabela 10: adesão de plaqueta em câmara de perfusão de nanocorpos anti-vWF

<table>table see original document page 310</column></row><table>

Tabela 11: listagem de seqüência de 12B6 e 12A5 homólogo nanobodies

<table>table see original document page 310</column></row><table>Tabela 12: K-on Previsto, K-off e KD valores para nanobodies 12A5 homólogos

<table>table see original document page 311</column></row><table>

Tabela 13: K-on Previsto, K-off e KD valores para nanobodies 12B6 homólogos

<table>table see original document page 311</column></row><table>

Tabela 14: verdadeiro valor de KD de nanobodies 12B6, 12A2 e 12A5

<table>table see original document page 311</column></row><table>

Tabela 15: adesão de plaqueta em câmara de perfusão de nanobodies 12B6, 12A2 e 12A5

<table>table see original document page 311</column></row><table>Tabela 16: Concentração de 12B6, 12A2 e 12A5 nanobodies depois de aquecer emtemperaturas crescentes

<table>table see original document page 312</column></row><table>Tabela 17: listagem de seqüência de nanobodies bivalentes

<table>table see original document page 313</column></row><table><table>table see original document page 314</column></row><table>Tabela 22: Concentração de nanobodies 12A5 bivalentes depois de aquecer emtemperaturas crescentes

<table>table see original document page 315</column></row><table>

Tabela 23: adesão de plaqueta em câmara de perfusão de nanobodies 12A2 bivalentes

<table>table see original document page 315</column></row><table> Tabela 24: listagem de seqüência dos nanobodies 12B6 humanizados

<table>table see original document page 315</column></row><table><table>table see original document page 316</column></row><table>

Tabela 26: Concentração de tipo nanobodies 12B6 natural e humanizado depois deaquecer em temperaturas crescentes

<table>table see original document page 316</column></row><table>

Tabela 27: Valores de KD do tipo para nanobodies 12B6 natural e humanizado

<table>table see original document page 316</column></row><table>

Tabela 28: listagem de seqüência dos nanobodies 12A2 humanizados

<table>table see original document page 316</column></row><table><table>table see original document page 317</column></row><table>

Tabela 29: rendimentos de expressão de nanobodies 12A2 tipo natural e humanizado

<table>table see original document page 317</column></row><table>

Tabela 30: Concentração de nanobodies 12A2 de tipo natural e humanizado depois deaquecer em temperaturas crescentes

<table>table see original document page 317</column></row><table>

Tabela 31: adesão de plaqueta de nanobodies 12A2 de tipo natural e humanizado emcâmara de perfusão em 0.7 e 1.5 ug/ml

<table>table see original document page 317</column></row><table>Tabela 32: adesão de plaqueta de nanobodies 12A2 de tipo natural e humanizado emcâmara de perfusão em 0.5, 1 e 2 ug/ml

<table>table see original document page 318</column></row><table>

Tabela 33: Valores de KD para nanobodies 12A2 tipo natural e humanizado

<table>table see original document page 318</column></row><table>

Tabela 34: listagem de seqüência dos nanobodies 12A5 humanizados

<table>table see original document page 318</column></row><table>

Tabela 35: rendimentos de expressão de nanobodies 12A5 tipo natural e humanizado

<table>table see original document page 318</column></row><table><table>table see original document page 319</column></row><table>

Tabela 36: Concentração de nanobodies 12A5 de tipo natural e humanizado depois deaquecer em temperaturas crescentes

<table>table see original document page 319</column></row><table>

Tabela 37: Valores de KD do nanobodies 12A5 tipo para natural e humanizado

<table>table see original document page 319</column></row><table>Tabela 38: listagem de seqüência de nanobodies bivalente humanizado

<table>table see original document page 320</column></row><table><table>table see original document page 321</column></row><table>

Tabela 39: rendimentos de expressão de nanobodies bivalente humanizado

<table>table see original document page 321</column></row><table>

Tabela 40: Concentração do Nanobody bivalente humanizado depois de aquecer emtemperaturas crescentes

<table>table see original document page 321</column></row><table>

Tabela 41: adesão de plaqueta de tipo natural e nanobodies bivalente humanizado

<table>table see original document page 321</column></row><table><table>table see original document page 322</column></row><table>Tabela 42: babuínos usados com os diferentes compostos de teste no estudo de Folts

<table>table see original document page 323</column></row><table>

Tabela 43: Comprimento de CFRs(s) para animais de controle (ND = não feito)

<table>table see original document page 323</column></row><table><table>table see original document page 324</column></row><table>Tabela 44: Comprimento de CFRs(s) para animais tratados com Aspegic ™ (ND = nãofeito)

<table>table see original document page 325</column></row><table>

Tabela 45: Comprimento de CFRs(s) para animais tratados com Heparina ™ (ND = nãofeito)

<table>table see original document page 325</column></row><table>Tabela 46: o Comprimento de CFRs(s) para animais tratados com Plavix ™ (ND = não feito)

<table>table see original document page 326</column></row><table>Tabela 48: o Comprimento de CFRs(s) para animais tratados com ALX-0081 (ND = não feito)

<table>table see original document page 327</column></row><table>

Tabela 49: babuínos usados com diferentes compostos de teste no estudo de Folts

<table>table see original document page 327</column></row><table>

Tabela 50: a Inibição de CFRs no Folts modela para as fármacos diferentes testadas. O númerode experimentos nos quais uma inibição de CFRs foi observada nas condições diferentesmencionadas é mostrado como uma função do número total de repetições independentesdaquela condição.

<table>table see original document page 327</column></row><table><table>table see original document page 327</column></row><table>

Tabela 52: Perda de sangue quanto à segunda gaze de controle para animais tratados com Plavix ™ emfunção da dose final (STD = desvio padrão)

<table>table see original document page 327</column></row><table>Tabela 53: Perda de sangue quanto à segunda gaze de controle para animais tratados comReopro ™ em função da dose final (STD = desvio padrão)

<table>table see original document page 329</column></row><table>

Tabela 54: Perda de sangue quanto à segunda gaze de controle para animais tratados coma função de ALX-0081in da dose final (STD = desvio padrão)

<table>table see original document page 329</column></row><table>

Tabela 55: Média da soma total de perda de sangue ( =soma de perda de sangue de cinco primeiras doses de compostode teste) como quanto à segunda gaze de controle

<table>table see original document page 329</column></row><table>Tabela 56: Perda de sangue na gaze quanto à segundagaze de controle para cada babuino tratado com Aspegic,Heparina, Plavix e ALX-0081 em função da dose de fármaco. Adose de fármaco eficaz na qual uma inibição completa de CFRsfoi observada, é indicada em amarelo

<table>table see original document page 330</column></row><table> Tabela 57: % agregação de plaqueta ristocetina-induzida para cada babuino tratado com Aspegic, Heparina,Plavix e ALX-0081 em função da dose de fármaco

<table>table see original document page 330</column></row><table>

Tabela 58: Concentração de ALX-0081 [ug/ml] emamostras de sangue obtidas em 10 minutos depois deadministração<table>table see original document page 331</column></row><table>

Tabela 59: Comprimento do CFRs [segundos] parababuinos tratados com ALX-0081 e com vWF

<table>table see original document page 331</column></row><table>

Tabela 60: Volumes [ul] para preparar as misturasdiferentes para o estudo da rachadura de A1A2A3 por ADAMTS13

<table>table see original document page 331</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Ablynx N.V.

<120> Nanobodies Melhorado para o tratamento de desordens mediadas por agregação

<130> P05-003 PCT

<160> 303

<170> Patentln version 3.1

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature<222> (11) .. (11)

<223> X = Resíduo de Hallmark (vide tabela 2)

<400>

Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Xaa Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly20 25

<210> 2<211> 14<212> PRT<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> X = Residuo de Hallmark

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> X = Residuo de Hallmark

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> X = Residuo de Hallmark

<220>

<221> misc_feature

<222> (12) . . (12)

<223> X = Residuo de Hallmark

<400> 2

Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly Lys Xaa Xaa Glu Xaa Vai Ala15 10

<210> 3<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> X = Resíduo de Hallmark

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> X = Residuo de Hallmark

<400> 3

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr Leu Gln15 10 15

Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ala20 25 30

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (D

<223> X = Residuo de Hallmark<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> X = Resíduo de Hallmark

<220>

<221> misc_feature<222> (6)..(6)

<223> X = Resíduo de Hallmark

<400> 4

Xaa Xaa Gln Gly Thr Xaa Vai Thr Vai Ser Ser1 5 10

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 5

Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT <213> Artificial<400> 6

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Vai Ala15 10

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 7

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai Ala15 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<400>

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ala15 10

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 9

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai Ala15 10<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 10

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Vai Ala 10

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 11

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ala1 5 10

<210> 12

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 12

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr Leu Gln15 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ala50 20 25 30

<210> 13

<211> 11<212> PRT

<213> Artificial

<400> 13

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser 1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 14

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 15

Asn Tyr Gly Met Gly1 5

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 16

Ser Tyr Thr Leu Gly1 5

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 17

Asn Tyr Asn Met Gly1 5

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 18

Ser Ser Ala Met Ala1 5

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 19

Tyr Tyr Asn Thr Gly1 5

<210> 20<211> 5<212> PRT<213> Artificial

<400> 20

Ile Gly Ala Met Gly1 5

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 21

Ile Gly Thr Met Gly1 5

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 22

Tyr Asn Pro Met Gly 1 5

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 23

Ser Ile Ser Trp Ser Gly Thr Tyr Thr Ala Tyr Ser Asp Asn Vai Lys15 10 15Gly

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 24

Gly lie Ser Trp Ser Gly Vai Ser Thr Asp Tyr Ala Glu Phe Ala Lys15 10 15

Gly

<210> 25

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 25

Thr Ser lie Ser Trp Ser Gly Ser Tyr Thr Ala Tyr Ala Asp Asn Vai15 10 15

Lys Gly

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 26Ser lie Ser Trp Ser Gly Met Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 27

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 27

Thr lie Thr Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly15 10 15

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 28

Ala lie Ser Trp Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 29

Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Vai Lys Gly10

15

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 30

Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly15 10 15

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 31

Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Vai Glu15 10 15

Gly

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 32

Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai Glu15 10 15

Gly<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 33

Gln Ser Arg Tyr Arg Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys Tyr Ala15 10 15

Tyr

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 34

Leu Gly Arg Tyr Arg Ser Asn Trp Arg Asn lie Gly Gln Tyr Asp Tyr15 10 15

<210> 35

<211> 17

<212> PRT <213> Artificial

<400> 35

Gln Ser Arg Tyr Ser Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys Tyr Ala15 10 15

Tyr<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 36

Ser Asn Arg Tyr Arg Thr His Thr Thr Gln Ala Met Tyr Asn Tyr 1 5 10 15

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 37

Vai Vai Asp Gly Lys Arg Ala Pro1 5

<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 38

Asn Arg Arg Gln Lys Thr Vai Gln Met Gly Glu Arg Ala Tyr Asp Tyr15 10 15

<210> 39

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial<400> 39

Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr15 10

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 40

Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr15 10

<210> 41

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<212> PRT

<213> Artificial

<400> 41

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu15 10 15

Tyr Asn Phe

<210> 42

<211> 19

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<213> Artificial

<400> 42

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser GluTyr Thr Phe

<210> 43

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 43

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Ser Leu Pro Ser Glu15 10 15

Tyr Thr Phe

<210> 44

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<212> PRT

<213> Artificial

<400> 44

Ser Phe Gly Met Ser1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 45

Leu Asn Leu Met Gly1 5<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 46

lie Asn Leu Leu Gly1 5

<210>

<211><212><213>

475

PRT

Artificial

<400> 47

Asn Tyr Trp Met Tyr1 5

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<212> PRT

40

<213> Artificial

<400> 48

Ser lie Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 49<211> 16<212> PRT <213> Artificial

<400> 49

Thr lie Thr Vai Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly15 10 15

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<212> PRT

<213> Artificial<400> 50

Thr lie Thr Vai Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly15 10 15

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<213> Artificial

<400> 51

Ser lie Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 52<211> 17 <212> PRT<213> Artificial

<400> 52

Ala lie Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

15 <210> 53

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

25 <400> 53

Ala lie Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

35 <210> 54

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

45 <400> 54

Arg lie Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

55

<210> 55<211> 13<212> PRT<213> Artificial

<400> 55

Asp Arg Glu Ala Gln Vai Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr15 10

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<212> PRT

<213> Artificial

<400> 56

Gly Gly Ser Leu Ser Arg1 5

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<213> Artificial

<400> 57

Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu1 5

<210> 58

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<212> PRT

<213> Artificial

<400> 58Gly Arg Ser Vai Ser Arg Ser1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 59

Gly Arg Gly Ser Pro1 5

<210> 60<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 60

Ala Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly35 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly20 25 30

Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai35 40 45

Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Vai Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Vai Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr85 90 95Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120

<210> 61

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 61

Gln Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai30 35 40 45

Thr Ser lie Ser Trp Ser Gly Thr Tyr Thr Ala Tyr Ser Asp Asn Vai50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Ala Gln Ser Arg Tyr Arg Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys100 105 110

Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser50 115 120 125

<210> 62 <211> 128<212> PRT

<213> Artificial

<400> 62

Gln Vai Gln Leu Vai- Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn20 25 30

Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Vai Vai35 40 45

Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Vai50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Vai Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Ala Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro100 105 110

Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120 125

<210> 63

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<212> PRT

<213> Artificial

<400> 63

Ala Vai Gln Leu Vai Asp Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Arg Thr Thr Phe Ser SerTyr Thr Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe35 40 45

Vai Gly Gly lie Ser Trp Ser Gly Vai Ser Thr Asp Tyr Ala Glu Phe50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp His Ala Ala Asn Thr Vai65 70 75 80

Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr85 90 95

Cys Ala Ala Leu Gly Arg Tyr Arg Ser Asn Trp Arg Asn lie Gly Gln100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120 125

<210> 64

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 64

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr20 25 30

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai35 40 45

Thr Ser lie Ser Trp Ser Gly Ser Tyr Thr Ala Tyr Ala Asp Asn Vai50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Ala Gln Ser Arg Tyr Ser Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys100 105 110

Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120 125

<210> 65

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 65

Ala Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Ser20 25 30

Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai35 40 45

Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys50 55 60

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Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Asp Cys Asn85 90 95

Phe Vai Vai Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai100 105 110

Thr Vai Ser Ser115<210> 66

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 66

Ala Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Arg Ala Phe Ser Tyr Tyr20 25 30

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Ala Ala lie Ser Trp Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai50 55 60

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Leu Gln Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Ala Asn Arg Arg Gln Lys Thr Vai Gln Met Gly Glu Arg Ala Tyr100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120 125

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<213> Artificial

<400> 67Gln Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly20 25 30

Ala Met Gly Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai35 40 45

Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Vai Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr85 90 95

Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120

<210> 68

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 68

Ala Vai Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly20 25 30

Ala Met Gly Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai35 40 45

Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai LysGly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Vai Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr85 90 95

Ala Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120

<210> 69

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 69

Gln Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly20 25 30

Thr Met Gly Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai35 40 45

Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Vai Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr85 90 95

Ala Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120

<210> 70

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 70

Ala Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly20 25 30

Thr Met Gly Leu Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai35 40 45

Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Vai Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr85 90 95

Ala Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120

<210><211><212>

71

128

PRT<213> Artificial

<400> 71

Gln Vai Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn20 25 30

Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Vai35 40 45

Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Vai Tyr65 70 75 80

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Ala Ala Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro100 105 110

Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120 125

<210> 72

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<212> PRT

<213> Artificial

<400> 72

Gln Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn20 25 30Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Asp Vai Vai35 40 45

Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Vai Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Ala Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Ser Leu Pro100 105 110

Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120 125

<210> 73

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 73

Gln Vai Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn20 25 30

Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Vai Vai35 40 45

Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Vai Tyr65 70 75 80Leu Glu Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Ala Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro100 105 110

Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120 125

<210> 74

<211> 259

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 74

Gln Vai Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn20 25 30

Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Vai35 40 45

Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Vai Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Ala Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro100 105 110

Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120 125

Ala Ala Ala Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln130 135 140

Ala Gly Gly Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe145 150 155 160

Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg165 170 175

Asp Leu Vai Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro180 185 190

Asp Ser Vai Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg195 200 205

Met Vai Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg225 230 235 240

Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr245 250 255

Vai Ser Ser

<210> 75

<211> 265

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 75

Gln Vai Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn20 25 30

Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Vai35 40 45Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Vai Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Ala Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro100 105 110

Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser130 135 140

Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala145 150 155 160

Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln165 170 175

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Vai Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly180 185 190

Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser195 200 205

Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Vai Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys210 215 220

Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Vai Arg Ala225 230 235 240

Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly245 250 255

Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser260 265<210> 76

<211> 286

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 76

Gln Vai Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly15 10 15

Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn20 25 30

Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Vai35 40 45

Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Vai Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Ala Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro100 105 110

Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Vai145 150 155 160

Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Ala Gly Gly Ala Leu165 170 175Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met180 185 190

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Vai Ala Ala195 200 205

lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai Glu Gly210 215 220

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Vai Tyr Leu Gln225 230 235 240

Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Gly Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ala245 250 255

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu260 265 270 Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser275 280 285

<210> 77

<211> 247

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 77

Ala Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly20 25 30

Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai35 40 45

Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Vai Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Vai Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr5 85 90 95

Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ala Ala Glu Vai Gln115 120 125

Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg130 135 140

Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly Ala Met Gly145 150 155 160

Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai Ala Thr lie165 170 175

Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Vai Lys Gly Arg Phe180 185 190

Thr lie Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Vai Tyr Leu Gln Met Asn195 200 205

Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr Ala Asn Leu210 215 220

Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly225 230 235 240

Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser245

<210> 78<211> 253<212> PRT

<213> Artificial<400> 78

Ala Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly20 25 30

Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai35 40 45

Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Vai Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Vai Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr85 90 95

Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly115 120 125

Gly Gly Ser Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln130 135 140

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg lie Phe145 150 155 160

Ser lie Gly Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg165 170 175

Glu Leu Vai Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp180 185 190

Pro Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr195 200 205

Vai Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr210 215 220Tyr Cys Tyr Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn225 230 235 240

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser245 250

<210> 79

<211> 274

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 79

Ala Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly20 25 30

Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai35 40 45

Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Vai Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Gly Pro Lys Asn Thr Vai Tyr Leu65 70 . 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr85 90 95

Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly130 135 140Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly145 150 155 160

Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala165 170 175

Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala180 185 190

Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Vai Ala Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser195 200 205

Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp210 215 220

Gly Pro Lys Asn Thr Vai Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu225 230 235 240

Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr Ala Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr

245 250 255

Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai260 265 270

Ser Ser

<210> 80

<211> 259

<212> PRT

<213> Artificial

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Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr245 250 255

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<212> PRT

<213> Artificial

<400> 81

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser130 135 140

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<213> Artificial

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Vai145 150 155 160

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly15 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser20 25 30

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<212> PRT

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<213> Artificial

<400> 94

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<212> PRT

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Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly20 25 30

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<400> 96

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<213> Artificial

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Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg lie Phe Ser lie Gly20 25 30 .

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1 5 10 15

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Vai Ser Ser

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Glu Vai Vai Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala180 185 190Arg Ser Vai Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg195 200 205

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<213> Artificial

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Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser130 135 140

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Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly GlySer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn20 25 30

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser130 135 140

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser130 135 140Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala145 150 155 160

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<400> 104

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn20 25 30

Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Vai35 40 45Ala Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai50 55 60

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Vai145 150 155 160

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<213> Artificial

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Vai145 150 155 160

Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly Ser Leu165 170 175Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met180 185 190

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<213> Artificial

<400> 106

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Vai145 150 155 160

Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly Ser Leu165 170 175

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met180 185 190

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Vai Vai Ala Ala195 200 205

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Vai Ala

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<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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Gly

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Gly

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Gly

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<213> Artificial

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Gly

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<212> PRT

<213> Artificial

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Gly

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<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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Gly

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<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

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Gly

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<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

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<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

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<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

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Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Vai Glu1 5 10 15

Gly

<210>

216

<211>

50

<212>

PRT

<213>

Artificial

55

<400>

216Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Vai Glu15 10 15

Gly

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<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 217

Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Vai Glu15 10 15

Gly

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<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 218

Ala lie Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai Glu15 10 15

Gly

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<212> PRT

<213> Artificial<211> 17<212> PRT

<213> Artificial

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Gly

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<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

<400> 224

Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Vai Lys Gly15 10 15

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<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial<400> 225

Thr lie Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Vai Lys Gly15 10 15

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<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 226

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<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 227

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<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial<400> 228

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<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<213> Artificial

<400> 244

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<211> 32

<212> PRT

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<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<213> Artificial

<400> 251

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr Leu Gln15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Tyr Ala20 25 30

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<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 252

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<212> PRT

<213> Artificial

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Tyr<210> 254

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<212> PRT

<213> Artificial

<400> 254

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Tyr Asn Phe

<210> 255

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 255

Leu Gly Arg Tyr Arg Ser Asn Trp Arg Asn lie Gly Gln Tyr Asp Tyr15 10 15

<210> 256

<211>- 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 256

Gln Ser Arg Tyr Ser Ser Asn Tyr Tyr Asp His Asp Asp Lys Tyr Ala1 5 10 15

Tyr<210> 257

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 257

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<210> 258

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 258

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<210> 259

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 259

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<210> 260

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial<400> 260

Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr15 10

<210> 261

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 261

Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr1 5 10

<210> 262

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 262

Asn Leu Lys Gln Gly Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr15 10

<210> 263<211> 19<212> PRT

<213> Artificial

<400> 263

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Tyr Thr Phe<210> 264

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 264

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Ser Leu Pro Ser Glu10 15

Tyr Thr Phe

<210> 265

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 265

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu15 10 15

Tyr Thr Phe

<210> 266

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 266

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu 10 15Tyr Asn Phe

<210> 267<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 267

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Tyr Asn Phe

<210> 268<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 268

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu1 5 10 15

Tyr Asn Phe

<210> 269<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 269Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu15 10 15

Tyr Asn Phe

<210> 270

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 270

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu15 10 15

Tyr Thr Phe

<210> 271

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 271

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu15 10 15

Tyr Thr Phe

<210> 272

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial<400> 272

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu15 10 15

Tyr Thr Phe

<210> 273

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 273

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu15 10 15

Tyr Thr Phe

<210> 274

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 274

Ala Gly Vai Arg Ala Glu Asp Gly Arg Vai Arg Thr Leu Pro Ser Glu15 10 15

Tyr Thr Phe

<210> 275

<211> 14<212> PRT

<213> Artificial

<400> 275

Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr1 5 10

<210> 276<211> 14<212> PRT<213> Artificial

<400> 276

Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr15 10

<210> 277

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 277

Asn Leu Lys Gln Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Asn Asp Tyr15 10

<210> 278

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 278

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser<210> 279

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 279

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 280

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 280

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 281<211> 11<212> PRT

<213> Artificial

<400> 281

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 282<211> 11<212> PRT<213> Artificial

<400> 282

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser10

<210> 283

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 283

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser10

<210> 284

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 284

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser 1 5 10

<210> 285

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 285

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10<210> 286

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 286

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser1 5 10

<210> 287

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 287

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 288

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 288

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 289

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial<400> 289

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 290

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 290

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 291

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 291

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 292<211> 11<212> PRT

<213> Artificial

<400> 292

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10<210> 293

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 293

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 294

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 294

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser1 5 10

<210> 295

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 295

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 296

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial<400> 296

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 297

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 297

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 298

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 298

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 299<211> 11<212> PRT

<213> Artificial

<400> 299

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10<210> 300<211> 11

<212> PRT

<213> Artificia

<400> 300

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 301<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 301

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser1 5 10

<210> 302<211> 11<212> PRT<213> Artificial

<400> 302

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

<210> 303

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial<400> 303

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Vai Thr Vai Ser Ser15 10

Claims

1. Nanocorpo contra Fator de Von Willebrand (vWF) , oreferido nanocorpo composto de 4 regiões de armação (FR1 aFR4 respectivamente) e 3 regiões que determinamcomplementaridade (CDRl a CDR3 respectivamente) , éCARACTERIZADO pelo fato de que:i.) CDRl compreende, essencialmente compõe-se de, oue uma seqüência aminoácida escolhida do grupo composto de :NYGMG [SEQ ID n. 15]SYTLG [SEQ ID n. 16]NYNMG [SEQ ID n. 17]SSAMA [SEQ ID n. 18]YYNTG [SEQ lo n. 19]IGAMG [SEQ ID n. 20]IGTMG [SEQ ID n. 21]YNPMG [SEQ ID n. 22]ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das seqüências aminoácidas acimamencionadas; em que(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmenteuma substituição aminoácida conservadora (conforme definidona presente); e/ou(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas;e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s) " (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmenteuma substituição aminoácida conservadora (conforme definidona presente); e/ou(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência (s)aminoácida (s) acima mencionadas;e em que:ii) O CDR2 compreende, essencialmente compõe-sede ou é uma seqüência aminoácida escolhida do grupo compostode :SISWSGTYTAYSDNVKG [SEQ ID n. 23]GISWSGVSTDYAEFAKG [SEQ ID n. 24]TSISWSGSYTAYADNVKG [SEQ lo n. 25]S1SWSGMSTYYTDSVKG [SEQ ID n. 26]TITSGGRTSYADSVKG [SEQ lo n. 27]AISWSGGLTYYADSVKG [SEQ ID n. 28]TITSGGSTNYADPVKG [SEQ ID n. 29]TITSGGSTNYADSVKG [SEQ lo n. 30]AISRTGGSTYYARSVEG [SEQ ID n. 31]A1SRTGGSTYYPDSVEG [SEQ ID n. 32]ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das seqüências aminoácidas acimamencionadas; em que(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmenteuma substituição aminoácida conservadora (conforme definidona presente); e/ou(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas.e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmenteuma substituição aminoácida conservadora (conforme definidona presente); e/ou(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas;e em que:iii) O CDR3 compreende, essencialmente compõe-sede ou é uma seqüência aminoácida escolhida do grupo compostode :QSRYRSNYYDHDDKYAY [SEQ ID n. 33]LGRYRSNWRNIGQYDY [SEQ lo n. 34]QSRYSSNYYDHDDKYAY [SEQ ID n. 35]SNRYRTHTTQAMYNY [SEQ ID n. 36]VVDGKRAP [SEQ ID n. 37]NRRQKTVQMGERAYDY [SEQ ID n. 38]NLKQGSYGYRFNDY [SEQ ID n. 39]NLKQGDYGYRFNDY [SEQ ID n. 40]AGVRAEDGRVRTLPSEYNF [SEQ ID n. 41]AGVRAEDGRVRTLPSEYTF [SEQ ID n. 42]AGVRAEDGRVRSLPSEYTF [SEQ ID n. 43]ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têmpelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmentepelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definidona presente) com uma das seqüências aminoácidas acimamencionadas; em que(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmenteuma substituição aminoácida conservadora (conforme definidona presente); e/ou(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida(s) acima mencionadas;e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas quetêm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " (conformedefinido na presente) com uma das seqüências aminoácidasacima mencionadas, em que:(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmenteuma substituição aminoácida conservadora (conforme definidona presente); e/ou(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente sócontém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ouinserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)aminoácida (s) acima mencionadas.

2. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO por ter uma variante humanizada.

3. Nanocorpo contra Fator Von Willebrand (vWF), oreferido nanocorpo composto de 4 regiões de armação (FR1 aFR4 respectivamente) e 3 regiões que determinamcomplementaridade (CDR I a CDR3 respectivamente) ,CARACTERIZADO pelo fato de que:g) CDR1 compreende ou essencialmente compõe-se de -a seqüência aminoácida YNPMG; ouumas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida YNPMG;eh) CDR2 compreende ou essencialmente compõe-se dea seqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG; ouuma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com a seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG; ouumas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1diferença(s) aminoácida(s) coma seqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG;ei) CDR3 compreende ou essencialmente compõe-se dea seqüência aminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; ouuma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99%com a seqüência aminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; ouumas seqüências aminoácidas que tem só Idiferença aminoácida com oseqüência de aminoácido AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

4. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que CDRl compreende ouessencialmente se compõe da seqüência aminoácida YNPMG.

5. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que CDR2 compreende ouessencialmente se compõe da seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG

6. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que CDR3 compreende ouessencialmente se compõe da seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

7. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que:- 0 CDR1 compreende ou essencialmente compõe-se daseqüência aminoácida YNPMG; e o CDR3 compreende ouessencialmente compõe-se da seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF; ou- 0 CDR1 compreende ou essencialmente compõe-se daseqüência aminoácida YNPMG; e o CDR2 compreende ouessencialmente compõe-se da seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG; ou- O CDR2 compreende ou essencialmente compõe-se daseqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG; e o CDR3 compreendeou essencialmente compõe-se da seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF

8. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que CDR1 compreende ouessencialmente se compõe da seqüência aminoácida YNPMG; e oCDR3 compreende ou essencialmente compõe-se da seqüênciaaminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

9. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que CDR1 compreende ouessencialmente se compõe da seqüência aminoácida YNPMG; oCDR2 compreende ou essencialmente compõe-se da seqüênciaaminoácida que AISRTGGSTYYPDSVEG e CDR3 compreendem ouessencialmente se compõem da seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

10. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 3 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de quequalquer substituição aminoácida é umasubstituição aminoácida conservadora; e/oua referida seqüência aminoácida só contémsubstituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserçõesaminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s)acima mencionadas.

11. Nanocorpo contra Fator Von Willebrand (vWF), oreferido Nanocorpo composto de 4 regiões de armação (FRI aFR4 respectivamente) e 3 regiões que determinamcomplementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente) ,CARACTERIZADO pelo fato de que:a) O CDR1 é:a seqüência aminoácida YNPMG; ouumas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1diferença aminoácida com a seqüência aminoácida YNPMG;eb) O CDR2 é:a seqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG; ouuma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com a seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG; ou umas seqüências aminoácidas que tem 2ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüênciaaminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG;ec) O CDR3 é:a seqüência aminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; ou- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidadede seqüência de 99% com a seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF; ou - umas seqüências aminoácida s que tem só 1diferença aminoácida com a seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

12. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que CDR1 é a seqüência aminoácidaYNPMG.

13. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que CDR2 é a seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG

14. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que CDR3 é a seqüência aminoácidaAGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

15. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que:O CDR1 é a seqüência aminoácida YNPMG; e o CDR3 éa seqüência aminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; ouO CDR1 é a seqüência aminoácida YNPMG; e o CDR2compreende a seqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG; ouO CDR2 é a seqüência aminoácidaAISRTGGSTYYPDSVEG; e o CDR3 compreende a seqüênciaaminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF

16. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 11, naqual CDRl é a seqüência aminoácida YNPMG; e o CDR3compreende ou essencialmente compõe-se da seqüênciaaminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

17. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que CDRl é a seqüência aminoácidaYNPMG; o CDR2 é a seqüência aminoácida AISRTGGSTYYPDSVEG eCDR3 é a seqüência aminoácida AGVRAEDGRVRTLPSEYTF.

18. Nanocorpo, de acordo qualquer uma dasreivindicações de 11 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de quequalquer substituição aminoácida é umasubstituição aminoácida conservadora; e/oua referida seqüência aminoácida só contémsubstituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserçõesaminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s)acima mencionadas.

19. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 3 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que éum nanocorpo de classe KERE.

20. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 3 a 18, CARACTERIZADO por ter a variantehumanizada.

21. Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que tem pelomenos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ouidentidade de seqüência pelo menos de 99% (conforme definidona presente) com pelo menos um dos nanocorpos do grupocomposto de SEQ ID NO's 60-73 e SEQ ID NO's 86-97.

22 .Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que tem pelomenos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ouidentidade de seqüência pelo menos de 99% com pelo menos umdos nanocorpos 12136 (SEQ ID n. 62); 12A2 (SEQ ID n. 71);-12F2 (SEQ ID n. 72); 14H10 (SEQ ID n. 73); 12B6H1 (SEQ ID n.-86); 12B6H2 (SEQ ID n. 87); 12B6H3 (SEQ ID n. 88); 12B6H4(SEQ ID n. 89); 12A2H1 (SEQ ID n. 90); 12A2H3 (SEQ ID n.-91); 12A2H4 (SEQ ID n. 92); 12A2H11 (SEQ ID n. 93) e/ou-12A2H13 (SEQ ID n. 94).

23. Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que tem pelomenos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ouidentidade de seqüência pelo menos de 99% (conforme definidona presente) com pelo menos um dos nanocorpos 12A2 (SEQ IDn. 71); 12A2H1 (SEQ ID n. 90); 12A2H3 (SEQ ID n. 91); 12A2H4(SEQ ID n. 92); 12A2H11 (SEQ ID n. 93) e/ou 12A2H13 (SEQ IDn. 94).

24. Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que tem pelomenos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ouidentidade de seqüência pelo menos de 99% (conforme definidona presente) com nanocorpo 12A2H1 (SEQ ID n. 90) .

25. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 20 a 24, CARACTERIZADO por ter a variantehumanizada.

26. Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de serescolhido do grupo composto dos nanocorpos da SEQ ID NO's 6073 e SEQ ID NO1s 86-97.

27. Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de serescolhido do grupo composto dos nanocorpos 12B6 (SEQ ID n.-62); 12A2 (SEQ ID n. 71); 12F2 (SEQ ID n. 72); 14H10 (SEQ IDn. 73); 12B6H1 (SEQ ID n. 86); 12B6H2 (SEQ ID n. 87); 12B6H3(SEQ ID n. 88); 12B6H4 (SEQ ID n. 89); 12A2H1 (SEQ ID n.-90); 12A2H3 (SEQ ID n. 91); 12A2H4 (SEQ ID n. 92); 12A2H1I(SEQ lo n. 93) e/ou 12A2H13 (SEQ ID n. 94).

28. Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de serescolhido do grupo composto dos nanocorpos 12A2 (SEQ ID n.-71); 12A2H1 (SEQ ID n. 90); 12A2H3 (SEQ ID n. 91); 12A2H4(SEQ ID n. 92); 12A2H1 I (SEQ ID n. 93) e/ou 12A2H13 (SEQ ID n. 94) .

29. Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de ser 12A2H1(SEQ ID NO:90).

30. Proteina ou polipeptidio, CARACTERIZADOS pelo fatode que compreende ou essencialmente se compõe do nanocorpo,definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 29.

31. Proteina ou polipeptidio, de acordo com areivindicação 30, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreendeou essencialmente se compõe de pelo menos um nanocorpo,definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 29.

32. Proteina ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 30 a 31, CARACTERIZADOS porcompreender pelo menos dois nanocorpos definido em qualqueruma das reivindicações de 1 a 29.

33. - Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 30 a 31, CARACTERIZADOS porcompreender dois nanocorpos conforme definido em qualqueruma das reivindicações de 1 a 29.

34. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 30 a 33, CARACTERIZADOS pelo fatode que os nanocorpos ou nanocorpo presentes na proteína oupolipeptidio é nanocorpos são conforme definido em qualqueruma das reivindicações de 3 a 20.

35. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 30 a 33, CARACTERIZADOS pelo fatode que os nanocorpos ou nanocorpo presentes na proteína oupolipeptidio são nanocorpos conforme definido em qualqueruma das reivindicações de 22 a 2 9.

36. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 30 a 33, CARACTERIZADOS pelo fatode que os nanocorpos ou nanocorpo presentes na proteína oupolipeptidio são nanocorpos conforme definido nareivindicação 24.

37. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 30 a 33, CARACTERIZADOS pelo fatode que os nanocorpos ou nanocorpo presentes na proteína oupolipeptidio são escolhidos do grupo composto dos nanocorpos-12B6 (SEQ ID n. 62); 12A2 (SEQ ID n. 71); 12F2 (SEQ ID n.-72); 14H10 (SEQ ID n. 73); 12B6H1 (SEQ ID n. 86); 12B6H2(SEQ ID n. 87); 12B6H3 (SEQ ID n. 88); 12B6H4 (SEQ ID n.-89); 12A2H1 (SEQ ID n. 90); 12A2H3 (SEQ ID n. 91); 12A2H4(SEQ ID n. 92); 12A2H11 (SEQ ID n. 93) e/ou 12A2H13 (SEQ ID n. 94).

38. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 30 a 33, CARACTERIZADOS pelo fatode que os nanocorpos ou nanocorpo presentes na proteína oupolipeptidio são escolhidos do grupo composto dos nanocorpos-12A2 (SEQ ID n. 71); 12A2H1 (SEQ ID n. 90); 12A2H3 (SEQ IDn. 91); 12A2H4 (SEQ ID n. 92); 12A2H11 (SEQ ID n. 93) e/ou 12A2H13 (SEQ ID n. 94).

39. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 30 a 33, CARACTERIZADOS pelo fatode que os nanocorpos ou nanocorpo presentes na proteína oupolipeptidio é um nanocorpo 12A2H1 (SEQ ID NO:90).

40. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 31 a 39, CARACTERIZADOS pelo fatode que compreende dois nanocorpos ou pelo menos doisnanocorpos, e onde os referidos referidos dois ou pelo menosdois nanocorpos são diretamente ligados um a outro ouligados um a outro via um linker.

41. Proteína ou polipeptidio de acordo com areivindicação 40, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreendedois nanocorpos ou pelo menos dois nanocorpos, e onde osreferidos referidos dois nanocorpos ou pelo menos doisnanocorpos são ligados um a outro via um linker.

42. Proteína ou polipeptidio de acordo com areivindicação 41, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linker éuma seqüência aminoácida.

43. Proteína ou polipeptidio de acordo com areivindicação 42, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linker écompreendem entre 1 e 40 resíduos aminoácidos, como entre 2e 30 resíduos aminoácidos.

44. Proteína ou polipeptidio de acordo com areivindicação 43, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linkercompreende ou essencialmente se compõe de glicina e resíduosde serina.

45. Proteína ou polipeptidio de acordo com areivindicação 44, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linkercompreende o linker GS9 (SEQ ID n. 84) .

46. Proteína ou polipeptidio de acordo com areivindicação 41, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linkercompreende ou essencialmente se compõe de resíduos alanina.

47. Proteína ou polipeptidio de acordo com areivindicação 42, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linkercompreende entre 1 e 10 resíduos aminoácidos, como 1, 2, 3,-4 ou 5 resíduos aminoácidos.

48. Proteína ou polipeptidio, CARACTERIZADOS pelo fatode que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos-95%, ou identidade de seqüência pelo menos de 99% (conformedefinido na presente) com pelo menos um dos polipeptidios dogrupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 74-82 ou SEQ ID NÚMEROS-98-106.

49. Proteína ou polipeptidio, CARACTERIZADOS pelo fatode que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos-95%, ou identidade de seqüência pelo menos de 99% (conformedefinido na presente) com pelo menos um dos polipeptidios dogrupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 74-76, SEQ ID NO's 80-82ou SEQ ID NÚMEROS 98-106.

50. Proteína ou polipeptidio, CARACTERIZADOS pelo fatode que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos-95%, ou identidade de seqüência pelo menos de 99% (conformedefinido na presente) com pelo menos um dos polipeptidios dogrupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 74-76 e NÚMEROS ID SEQ:-98, 99, 101, 102, 104, 105 e 106.

51. Proteina ou polipeptidio, CARACTERIZADOS pelo fatode que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos-95%, ou identidade de seqüência pelo menos de 99% (conformedefinido na presente) com os polipeptidios de SEQ ID n. 90

52. Polipeptidio, CARACTERIZADOS pelo fato de que é daSEQ ID n. 90.

53. Fragmento de nanocorpo, CARACTERIZADO por serdefinido de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 29.

54. Fragmento de nanocorpo, CARACTERIZADO por serdefinido de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 20.

55. Fragmento de nanocorpo, CARACTERIZADO por serdefinido de acordo com qualquer uma das reivindicações de 22 a 29.

56. Fragmento de nanocorpo, CARACTERIZADO por serdefinido de acordo com a reivindicação 24.

57. Fragmento de nanocorpo, CARACTERIZADO por serdefinido de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27a 29.

58. Fragmento, de acordo qualquer uma dasreivindicações de 53 a 57, CARACTERIZADOS pelo fato de quetem um grau de identidade de seqüência de pelo menos 50%,preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelomenos 7 0%, como pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos-95%, com a seqüência aminoácida do correspondente nanocorpode comprimento completo.

59. Proteína ou polipeptidio, CARACTERIZADOS pelo fatode que compreende ou essencialmente se compõe de umfragmento segundo alguma de reivindicações 53-58.

60. Proteina ou polipeptidio de acordo com areivindicação 59, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreendeou essencialmente se compõe de pelo menos um fragmentoconforme definido em qualquer uma das reivindicações de 53 a-58.

61. Proteina ou polipeptidio segundo alguma dasreivindicações 5 9 ou 60, CARACTERIZADOS pelo fato de quecompreende pelo menos dois fragmentos conforme definidos emqualquer uma das reivindicações de 53 a 58.

62. Proteina ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 59-61, CARACTERIZADOS pelo fato deque compreende dois nanocorpos conforme definidos emqualquer uma das reivindicações de 1 a 29.

63. Proteina ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 59-62, CARACTERIZADOS pelo fato deque compreende dois fragmentos ou pelo menos doisfragmentos, e onde os referidos dois fragmentos ou pelomenos dois fragmentos são diretamente ligados um a outro ouligados um a outro via um linker.

64. Proteína ou polipeptidio, CARACTERIZADOS pelo fatode que compreende ou essencialmente se compõe do nanocorpoque essencialmente não inibe a rachadura de ULvWF porADAMTS-13.

65. Proteína ou polipeptidio de acordo com areivindicação 59, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreendeou essencialmente se compõe de pelo menos um nanocorpo queessencialmente não inibe a rachadura de ULvWF por ADAMTS-13.

66. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações 59 ou 60, CARACTERIZADOS pelo fato deque compreende pelo menos dois nanocorpos que essencialmentenão inibem a rachadura de ULvWF por ADAMTS-13.

67. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 59 a 61, CARACTERIZADOS pelo fatode que compreende dois nanocorpos que essencialmente nãoinibem a rachadura de ULvWF por ADAMTS-13.

68. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 64 a 68, CARACTERIZADOS pelo fatode que compreende dois fragmentos ou pelo menos doisfragmentos, e onde os referidos dois fragmentos ou pelomenos dois fragmentos são diretamente ligados um a outro ouligados um a outro via um linker.

69. Seqüência de nucleotideos ou ácido nucléico,CARACTERIZADOS pelo fato de codificar nanocorpo, proteina,polipeptidio ou fragmento segundo qualquer uma dasreivindicações precedentes.

70. Célula hospedeira,- CARACTERIZADA por compreenderuma seqüência de nucleotideos ou ácido nucléico, de acordocom a reivindicação 64, ou que expressa ou é capaz deexpressar nanocorpo, a proteina, o polipeptidio ou ofragmento segundo qualquer uma das reivindicações de 1 a 68.

71. Método para preparar nanocorpo, proteina,polipeptidio ou fragmento de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 68, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende a cultivação ou a manutenção de uma célulahospedeira segundo a reivindicação 65 em condições tais quea referida célula hospedeira produz ou expressa nanocorpo ,a proteina, o polipeptidio ou o fragmento segundo alguma dereivindicações de 1 a 68; e que opcionalmente além dissocompreende a isolação do nanocorpo , proteina, polipeptidioou fragmento segundo alguma de reivindicações 1-68.

72. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fatode compreender pelo menos um nanocorpo, proteina,polipeptidio ou fragmento segundo alguma de reivindicações 1-68, e opcionalmente pelo menos uma transportadorafarmaceuticamente aceitável.

73. Composição farmacêutica, de acordo com areivindicação 72, ou o nanocorpo, proteina, polipeptidio oufragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 73, CARACTERIZADOS pelo fato de servir para a prevençãoou tratamento de uma doença ou desordem relacionada àagregação mediada por plaqueta.

74. Composição farmacêutica, de acordo com areivindicação 7 3, ou nanocorpo, proteina, polipeptidio oufragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 73, CARACTERIZADOS pelo fato de servir para a prevençãoou tratamento da doença ou desordem relacionada a agregaçãomediada por plaqueta, escolhida de trombo não-oclusivo, aformação de um trombo oclusivo, formação trombo arterial,oclusão coronária aguda, doença oclusiva arterialperiférica, restenose e desordens que resultam de enxerto dedesvio coronário, substituição de válvula de artériacoronária e intervenções coronárias tais como angioplastia,stenting ou aterectomia, hiperplasia depois angioplastia,aterectomia ou stenting arterial, sindrome oclusiva em umsistema vascular ou falta de revelação de artérias dedoente, púrpura trombótica trombocitopénica (TTP), ataque deisquemia cerebral transiente, angina pectoris estável ouinstável, enfarte cerebral, sindrome de HELLP,endarterectomia carótida , estenose da artéria carótida,isquemia do limbo critico, cardioembolismo, doença vascularperiférica, restenose e enfarte do miocárdio.

75. Composição farmacêutica, de acordo com areivindicação 73, CARACTERIZADA por adicionalmente conteruma ou várias outras substâncias ativas para a prevenção ouo tratamento de desordens mediadas por agregação, comoasperina (Aspegic), heparina, Plavix® e/ou Reopro®

76. Uso do nanocorpo, proteína, polipeptidio oufragmento, de acordo com as reivindicações de 1 a 68,CARACTERIZADO por ser utilizado -na preparação de ummedicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença oudesordem relacionada à agregação mediada por plaqueta.

77. Uso do nanocorpo, proteína, polipeptidio oufragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 68, CARACTERIZADO por ser utilizado na preparação de ummedicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença oudesordem relacionada à agregação mediada por plaqueta,escolhida de trombo não-oclusivo, a formação de um trombooclusivo, formação trombo arterial, oclusão coronária aguda,doença oclusiva arterial periférica, restenose e desordensque resultam de enxerto de desvio coronário, substituição deválvula de artéria coronária e intervenções coronárias taiscomo angioplastia, stenting ou aterectomia, hiperplasiadepois angioplastia, aterectomia ou stenting arterial,síndrome oclusiva em um sistema vascular ou falta derevelação de artérias de doente, púrpura trombóticatrombocitopénica (TTP), ataque de isquemia cerebraltransiente, angina pectoris estável ou instável, enfartecerebral, síndrome de HELLP, endarterectomia carótida ,estenose da artéria carótida, isquemia do limbo crítico,cardioembolismo, doença vascular periférica, restenose eenfarte do miocárdio.

78. Uso de vWF, CARACTERIZADO pelo fato de serutilizado de um fragmento conveniente disso, de DDAVP(desmopressinor) ou um fragmento conveniente disso, ou deuma composição farmacêutica que compreende algum doprecedente, como na antidoto para complicações ou efeitoscolaterais indesejados associou-se com o uso do nanocorpo,proteina ou polipeptidio contra vWF, especialmente donanocorpo, proteina ou polipeptidio conforme definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 68.