BRPI0610252A2 - carreador dirigido a células nervosas - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma proteína de transporte obtenível por modificação da cadeia pesada da neurotoxina formada por Clostridium botulinum, sendo que (i) a proteína se liga em células nervosas com maior ou menor afinidade comparado com a neurotoxina nativa; (ii) a proteína apresenta uma neurotoxicidade aumentada ou reduzida comparado à neurotoxina nativa; de preferência a neurotoxicidade é determinada no ensaio por hemidiafragma; e/ou (iii) a proteína apresenta uma menor afinidade perante anticorpos neutralizadores se comparado com a neurotoxina nativa. Além disso, é indicado o processo para sua preparação e seu emprego em composições cosméticas e farmacêuticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CARREADORDIRIGIDO A CÉLULAS NERVOSAS".

A presente invenção refere-se a uma proteína de transporte, quese liga a neurônios com maior ou menor afinidade do que a neurotoxina for-mada por Clostridium botulinum. A proteína de transporte de preferência éabsorvida por endocitose mediada por receptores. Esta proteína tem empre-go como transportadora que transloca outras substâncias químicas (por e-xemplo proteases) do compartimento ácido endossomal para o citosol deneurônios que não podem penetrar fisiologicamente, através da membranado plasma, no citosol das células nervosas. A presente invenção refere-separticularmente ao emprego de uma proteína de transporte para infiltraçãode inibidores de liberação de neurotransmissores.

Células nervosas liberam materiais transmissores por exocitose.

Denomina-se exocitose a fusão das membranas intracelulares da vesículacom a membrana plasmatica. Nesta etapa o teor vesicular é despejado con-comitantemente na fenda sináptica. A fusão de ambas as membranas é re-gulada por cálcio que reage com a proteína sinaptotagmina. Sinaptotagminacontrolada juntamente com outros co-fatores controla o estado de três de-nominadas proteínas de fusão, as SNAP-25, Sinaptobrevina 2 e Sintaxina1A. Enquanto sintaxina 1A e sinabrevina 2 estiverem integradas na mem-brana do plasma ou na membrana da vesícula, as SNAP - 25 estarão ape-nas fracamente ligadas à membrana plasmatica. Mediante um aumento daconcentração intracelular de cálcio, as três proteínas se unem umas às ou-tras, ambas as membranas se aproximam, e em seguida se fundem umas àsoutras. Em neurônios colinérgicos acetilcolina é liberada, o que causa con-trações musculares, eliminação de suor, e outras reações colinergicamentetransmitidas.

As proteínas de fusão acima mencionadas são moléculas alvo(substratos) da cadeia leve (LC) das neurotoxinas clostridiais que são for-madas pelas bactérias C. botulinum, C. butyricum, C. baratiie C. tetani.

A bactéria grão-positiva anaeróbia C. botulinum produz sete dife-rentes sorotipos da neurotoxina clostridial. Esses são denominados neuroto-xinas Botulinus (BoNT/A até BoNT/G). Por meio destas, particularmente pormeio das BoNT/A e BoNT/B é causado, nos homens e animais, uma doençaneuroparalítica que é denominada botulismo. Os esporos de C. botulinumencontram-se no solo, entretanto, eles podem se desenvolver em conservasde alimentos de preparação caseira, fechadas e esterilizadas de uma manei-ra não apropriada, podendo-se atribuir a este fato muitas das ocorrências debotulismo.

BoNT/A é a substância biológica mais ativa de todas as conhe-cidas. Apenas cerca de 5-6 pg de BoNT/A purificada representa uma MLD(Dose Letal Média). Uma unidade (ingl.: unit, U) de BoNT/A é definida comoMLD, que após injeção intraperitoneal matou metade das ratazanas fêmeassuíças Webster, respectivamente, com o peso de 18-20 g. Sete BoNT imu-nologicamente diferentes foram caracterizadas. Elas portam as denomina-ções BoNT/A, B, C1, D, E, Fe G e podem ser diferenciadas por neutraliza-ção com sorotipos de anticorpos específicos. Os diversos sorotipos de BoNTdiferenciam-se em tipos de animais aqui encontrados tendo em vista a gra-vidade e duração do dano causado. Assim por exemplo nas ratazanas, ten-do em vista o dano, BoNT/A é 500 vezes mais fortemente eficaz do queBoNT/B. Além disso tem-se que BoNT/B em primatas, em uma dosagem de480 U/kg de peso corporal, mostrou não tóxico. A mesma quantidade deBoNT/A corresponde a 12 vezes a dose letal desse material em primatas.Por outro lado, em ratazanas, a duração da paralisia após injeção deBoNT/A é 10 vezes mais longa do que após injeção de BoNT/E.

As BoNTs são empregadas para o tratamento de distúrbios neu-romusculares que são caracterizados por hiperatividade em músculos doesqueleto causada por nervos periféricos patologicamente superativos. ABoNT/A é permitida pela U.S. Food and Drug Administration para o trata-mento de blefaroespasmos, estrabismos, hiperhidrose, rugas e espasmoshemifaciais. Comparado com a BoNT/A, os serotipos da BoNT usuais apa-rentemente possuem uma eficácia reduzida e uma menor duração da eficá-cia. Os efeitos clínicos da BoNT/A aplicada intramuscularmente, periferica-mente, se fazem sentir normalmente no espaço de tempo de uma semana. Aduração dessa supressão dos sintomas, através de uma única injeção intra-muscular de BoNT/A, totaliza em regra cerca de três até seis meses.

As neurotoxinas clostridiais hidrolisam especificamente diversasproteínas do aparelho de fusão. BoNT/A, C1 e E dissociam SNAP-25, en-quanto BoNT/B, D, F, G, assim como a neurotoxina do tétano (TeNT), ata-cam a membrana de proteína associada à vesícula (VAMP) 2 - também de-nominada snaptobrevina 2. BoNT/C1 dissocia além disso a sintaxina 1A.

As bactérias clostridiais liberam as neurotoxinas como polipeptí-deos de cadeia única respectivamente com 1251 até 1315 aminoácidos. Aseguir proteases endógenas dissociam cada uma dessas proteínas em umdeterminado local em respectivamente 2 cadeias ("corte"), sendo que ambasas cadeias, entretanto, permanecem ligadas uma à outra por uma ponte dedissulfeto. Essas duas proteínas de duas cadeias são denominadas holoto-xinas (vide Shone et al. (1985), Eur. J. Biochem. 151, 75-82). Ambas as ca-deias têm diferentes funções. Enquanto o menor pedaço representa a cadeialeve (light chain = LC), uma endoprotease dependente de Zn2+, a maior uni-dade (heavy chain = HC) é a transportadora da cadeia leve. Através do tra-tamento da HC com endopeptidases produziu-se dois fragmentos de 50 kDa(vide Gimenez et al. (1993), J. Protein Chem. 12, 351 - 363). As metadesamino-terminais (fragmento HN), mediante valores de pH baixos, integram-sea membranas e translocam os LC no citosol das células nervosas. As meta-des carboxila terminais (fragmento Hc) ligam-se aos polissilogangliosídeoscomplexos que existem apenas em membranas das células nervosas, e emreceptores de proteína até agora apenas parcialmente identificados (Halpernera/. (1993), Cur. Top Microbiol. Immunol. 195, 221-241). Isto explica a ele-vada neurosseletividade das neurotoxinas clostridiais. Estruturas de cristalconfirmaram que a BoNT/A dispõe de três domínios que podem estar emharmonia com as três etapas do mecanismo de atuação (vide Lacy et al.(1998), Nat. Struct. Biol. 5, 898-902). Além disso, esses dados concluem quedentro do fragmento de Hc existem duas sub-unidades autônomas (sub-domínios) de respectivamente 25 kDa. A primeira evidenciação da existênciade ambos os sub-domínios funcionais foi feita com a metade amino-terminal(Hcn) e a metade carboxila-terminal (Hcc) do fragmento Hc do TeNT, queforam expressas de modo recombinante e se deixaram reconhecer, pois a-pesar do domínio de Hcc se ligar a neurônios, o domínio de Hcn não se liga(vide Herreros et ai (2000), Biochem. J. 347, 199-204). Em um momentoposterior localizou-se e caracterizou-se um único lugar de ligação de gangli-osídeos dentro do domínio HCc da BoNT/A e B (vide Rummel et a/.(2004),Mol. Microbiol. 51, 631-643). O local para a ligação da sinaptotagmina I e II,identificada como receptor de proteína para BoNT/B e G, pode igualmenteser limitado ao âmbito dos domínios de Hcc da BoNT/B e G (vide Rummel eta/.(2004), J. Biol. Chem. 279, 30865-70). O documento não divulga, entre-tanto, os aminoácidos relevantes para o bolsão de ligação de BoNT/B e G.

Sob condições fisiológicas HC liga-se ao fragmento Hc em gan-gliosídeos neuronais, é absorvido por promotores de recepção da endocitoseno interior das células e atinge, via o compartimento endossomal, a circula-ção vesicular natural. O fragmento HN, no meio ácido dos endossomas re-centes, penetra na membrana vesicular e forma um poro. Toda substância(X) que está ligada a HC por uma ponte de dissulfito, é separada da HC poracesso à ponte de dissulfito através de sistemas redox intracelulares, que areduzem. Por fim X surge no citosol.

No caso das neurotoxinas clostridiais a HC é o carreador de umaLC, que na etapa final dissocia seu substrato específico no citosol. O ciclo daformação de complexo e dissociação das proteínas de fusão é interrompidoe assim a liberação de acetilcolina é inibida. Como conseqüência disto, mús-culos estriados são paralisados, e as glândulas sudoríparas cessam sua se-creção. A eficácia de duração dos sorotipos BoNT individuais é diferente edepende da presença de LC intacto no citosol. Já que todos os neurôniospossuem receptores de neurotoxinas clostridiais, estes podem ser afetadosnão apenas pela liberação de acetilcolina, mas potencialmente também peloesvaziamento da substância P, de noradrenalina, GABA, glicina, endorfina eoutros transmissores e hormônios.

Já que de preferência a transmissão colinérgica é bloqueada,pode ser esclarecido assim que a HC na periferia penetra no neurônio. Si-napses centrais são protegidas pela barreira sangue-cérebro, que não podeser ultrapassada por proteínas.

Em um estudo de ligante-receptor foram trocados determinadosradicais aminoácidos, dentro do domínio HCc da BoNT/B e G, para identificare caracterizar o bolsão de ligação do receptor de proteína, para assim modi-ficar a afinidade no receptor de proteína. A afinidade dos fragmentos Hc mu-tantes da BoNT/B e G foi determinada em experimentos de Pulldown de glu-tationa-S-transferase-(GTS) com sinaptotagmina. Então a HC foi ligada comas mesmas mutações na LC-B ou LC-G. A eficácia dessa construção foianalisada com auxílio do preparado de nervo-músculo isolado da ratazana(ensaio de hemidiafragma = HDA). Neste preparado encontra-se o Nervusphrenicus, que consiste em mononeurônios colinérgicos e representa o prin-cipal alvo fisiológico das neurotoxinas clostridiais. Em seguida aminoácidosindividuais foram trocados no domínio Hcc da BoNT/A, em uma profundida-de que se aproxima da encontrada nos bolsões de ligação do receptor deproteína na BoNT/B e G. O comprimento total dos mutantes individuais daBoNT/A foi em seguida igualmente analisado quanto à potência modificadaem HDA, que nos fornece informações sobre as interações de ligante-receptor de proteína modificadas. -

O complexo da BoNT/A, também denominado toxina A progeni-tora, foi no passado recente empregado para tratamento de distonias moto-ras, assim como para atenuação de atividade simpática excessiva (vide Be-necke era/.(1995), Akt. Neurol. 22, 209 em diante) e para diminuição da dore da enxaqueca (vide Sycha et ai (2004), H. Neurol. 251, 19-30). Esse com-plexo consiste em neurotoxina, diversas hemoaglutininas e uma proteínanão tóxica, não hemoaglutinante. Sob pH fisiológico o complexo dissocia-seem poucos minutos. A neurotoxina originada aqui è a única, constituinte docomplexo, que é terapeuticamente relevante e que causa um alívio dos sin-tomas. Já que a doença neurológica não é curada, o complexo deve ser no-vãmente injetado em intervalos de três até quatro meses. Dependendo daquantidade da proteína estranha injetada, alguns pacientes formam anticor-pos específicos contra a BoNT/A. Esses pacientes se tornam resistentes àneurotoxina. Caso pelo menos uma vez a neurotoxina tomou contato comcélulas sensitivas de antigeno e anticorpos foram formados, as células dememória relacionadas a eles se conservam por anos. Por isso pretende-setratar os pacientes com preparados de máxima atividade em dosagens asmenores possíveis. Além disso, os preparados não devem conter nenhumaoutra proteína de origem bacteriana, já que essas podem atuar como imuno-adjuvantes. Tais materiais atraem macrófagos que tanto reconhecem os i-munoadjuvantes como também as neurotoxinas e apresentam os linfócitosque, além disso, respondem com a formação de imunoglobulinas, por issodevem ter emprego na terapia apenas produtos de pureza máxima, que nãocontêm nenhuma proteína estranha. A resistência dos pacientes perante aneurotoxina refere-se, do ponto de vista do campo molecular, principalmenteà presença de anticorpos neutralizantes.

Com a presente invenção é apresentada então uma proteína detransporte (Trapo), que pode resolver os problemas acima mencionados, dosmétodos até agora conhecidos.

Essa tarefa foi solucionada com uma nova proteína de transpor-te, obtenível por modificação da cadeia pesada da neurotoxina formada porClostridium botulinum, na qual

(i) a proteína em células nervosas liga-se à neurotoxina nativacom maior ou menor afinidade;

(ii) a proteína, em comparação com a neurotoxina nativa, apre-senta uma mais elevada ou reduzida neurotoxicidade, de preferência a neu-rotoxicidade é determinada no ensaio de hemidiafragma; e/ou

(iii) a proteína, em comparação com a neurotoxina nativa, apre-senta uma menor afinidade perante anticorpos neutralizantes.

De acordo com uma forma de execução preferida da presenteinvenção, é preparada uma proteína de transporte que se liga a células ner-vosas com maior ou menor afinidade do que a neurotoxina nativa formadapor C. botulinum.

De acordo com uma outra forma de execução preferida da pre-sente invenção, é preparada uma proteína de transporte que é obtida pormodificação da HC da neurotoxina formada por C. botulinum, sendo que aproteína se liga com maior ou menor afinidade do que a neurotoxina nativaespecificamente às células nervosas. De preferência a proteína de transpor-te dessas células é absorvida por endocitose.

De acordo com uma outra forma preferida de execução é prepa-rada também uma proteína de transporte, que é obtida por modificação daHC da neurotoxina formada por C. botulinum, sendo que a proteína não émais obtenível por trocas de aminoácidos tensoativos particularmente nosreceptores dos bolsões de ligação de gangliosídeos e de proteínas do anti-corpo neutralizador da ligação.

A seguir são definidos termos, como eles são compreendidosem correlação com o presente pedido de patente.

"Ligação em células nervosas com maior ou menor afinidade doque a da neurotoxina nativa". A neurotoxina nativa é aqui a neurotoxina nati-va de C. botulinum. De preferência a neurotoxina nativa aqui é a neurotoxinaBotulinus A e/ou a neurotoxina Botulinus B e/ou a neurotoxina Botulinus Gde C. Botulinum. A neurotoxina Botulinus recombinante preparada a partir deE. coli, que entre outros contém uma seqüência de aminoácido idêntica àneurotoxina Botulinus nativa, comporta-se farmacologicamente identicamen-te à neurotoxina Botulinus nativa, e é denominada neurotoxina Botulinus re-combinante do tipo selvagem. As células nervosas mencionadas aqui sãomotoneurônios colinérgicos. De preferência a proteína de transporte liga-seespecificamente às moléculas associadas à membrana plasmática, proteí-nas da transmembrana, proteínas sinápticas da vesícula, uma proteína dafamília das sinaptotagminas ou das glicoproteínas 2 (SV2) da vesícula sináp-tica, de preferência sinaptotagmina I e/ou sinaptotagmina II e/ou SV2A,SV2B ou SV2C, particularmente preferido, sinaptotagmina I humana, e/ousinaptotagmina II humana, e/ou humana SV2A, SV2B ou SV2C. A ligação édeterminada de preferência in vitro. Particularmente preferentemente a de-terminação ocorre por utilização de um teste GST-Pull-down, que é mencio-nado em detalhes nos exemplos.

"A proteína apresenta, em comparação com a neurotoxina nati-va, uma neurotoxicidade mais elevada ou mais reduzida". A neurotoxina na-tiva é aqui é a neurotoxina nativa de C. botulinum. De preferência a neuroto-xina nativa aqui é a neurotoxina Botulinus A, e/ou neurotoxina Botulinus B,e/ou neurotoxina Botulinus G de C. botulinum. A neurotoxina Botulinus re-combinantemente preparada a partir de E. coli que, entre outros, mantémuma seqüência de aminoácidos idêntica à da neurotoxina Botulinus nativa,comporta-se de modo farmacologicamente idêntico à neurotoxina Botulinusnativa e é denominada neurotoxina Botulinus recombinante do tipo selva-gem. As células nervosas aqui mencionadas são motoneurônios colinérgi-cos.

A neurotoxicidade é de preferência determinada com o auxíliodos testes de hemidiafragma (HDA) conhecidos no estado da técnica. A neu-rotoxicidade das muteínas pode de preferência ser determinada como des-crito por Habermann et al., Naunyn Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 311(1980), 33-40.

São conhecidos anticorpos neutralizantes dirigidos contra a neu-rotoxina Botulinus "Anticorpos neutralizantes" (Góschel H., Wohlfarth K, Fre-vert J, Dengler R, Bigalke H. Botulinum A Toxin Therapy: Neutralizing andNon-neutralizing Antibodies-Therapeutic Consequences, Exp. Neurol. 1997Sep; 147 (1): 96-102). Verificou-se que anticorpos neutralizadores da neuro-toxina, particularmente com os centros ativos como, por exemplo os bolsõesde ligação dos gangliosídeos e receptores de proteína, interagem dentro dodomínio de Hcc da neurotoxina. Se forem modificadas as superfícies quecircundam os bolsões de ligação na neurotoxina através de trocas de ami-noácidos sem prejudicar negativamente sua funcionalidade, os anticorposneutralisadores perdem seus locais de ligação e a neurotoxina modificadanão é mais neutralizada.

A expressão "modificação da cadeia pesada da neurotoxina for-mada da C. botulinum". Os aminoácidos e/ou seqüência de ácidos nucléicosda cadeia pesada (HC) da neurotoxina formada a partir de C. botulinum sãoem geral obtidos a partir de bancos de dados abertos à inspeção pública,para cada um dos serotipos conhecidos A até G (vide também tabela 1). Amodificação abrange aqui que pelo menos um aminoácido deletado, adicio-nado, é inserido na seqüência de aminoácido, ou pelo menos um aminoáci-do da neurotoxina nativa é substituído por um outro aminoácido natural ounão natural, e/ou um aminoácido na seqüência de aminoácido indicada épós-translacionaimente modificado. Modificações pós-translacionais abran-gem aqui glicosilações, acetilações, acilações, desaminações, fosforilações,isoprenilações, glicosilfosfatidil inositolações, e outras modificações conheci-das pelos especialistas.

A HC da neurotoxina formada a partir de C. botulinum abrangetrês sub-domínios, a saber os domínios de translocação Hn amino-terminaisde 50 kDa de tamanho, o domínio Hcn seguinte de 25 kDa, e o domínio Hccde 25 kDa com terminação carboxila. Resumindo os domínios Hcn e HCc sãodenominados fragmento Hc. Os respectivos cortes de aminoácidos dos res-pectivos sub-domínios são observáveis para os serotipos individuais e suasvariantes da tabela I.

"Receptor de Gangliosídeos"

As HC da neurotoxina Botulinus possuem uma grande afinidadecom as células nervosas periféricas, que é transmitida principalmente pelainteração com polissialogangliosídeos complexos - que são glicolipídeos queconsistem de mais de um ácido sialínico (Halpern et al., (1995), Curr. Top.Microbiol. Immunol. 195, 221-41; WO 2006/02707). Em seguida as LC liga-das a eles atingem apenas esse tipo celular e são eficazes apenas nestascélulas. BoNT/A e B ligam-se apenas a uma molécula de gangliosídeoGT1b.

No caso da BoNT/B e BoNT/G os receptores de proteína sãosinaptotagmina I e sinaptotagmina II. No caso da BoNT/A os receptores deproteína são a vesícula sináptica da glicoproteína 2 (SV2), de preferênciaSV2A, SV2B e SV2C.

Até o momento são conhecidas 13 isoformas da família das si-naptotagminas. Todas distinguem-se por dois domínios C2 ligados à termi-nação carboxila Ca2+, um domínio de transmembrana médio (TMD), que an-cora a sinaptotagmina na membrana sináptica da vesícula, e uma termina-ção amino de comprimento diferente. Após o fluxo de Ca a fusão da vesí-cula sináptica com a membrana plasmática é iniciada, depois do que a ter-minação amino intraluminal da sinaptotagmina extracelular se apresenta efica à disposição como âncora de receptor para BoNT/B e G. Analogamente,o quarto domínio luminal das isoformas SV2 fica a disposição após exocitosepara a interação com BoNT/A extracelular.

Aminoácidos individuais do bolsão de ligação foram modificadosde tal forma quanto ao seu caráter, através da mutagênese voltada para oobjetivo que uma ligação com um receptor de proteína é dificultada ou impe-dida. Aqui os fragmentos de Hc da BoNT/B e BoNT/G foram recombinante-mente expressos nos bolsões de ligação postulados em E. coli e isolados,como tipo selvagem ou com trocas individuais de aminoácidos (mutações/substituições). Para um ensaio GST-Pull - down, para verificação da intera-ção in vitro entre BoNT/B e BoNT/G, assim como na sinaptotagmina I e nasinaptotagmina II, incubou-se respectivamente a proteína de fusão da sinap-totagmina GST com diferentes quantidades dos respectivos fragmentos deHc da BoNT/B ou BoNT/G e realizou-se uma separação de fases. Fragmen-to Hc livre permaneceu no sobrenadante separado, enquanto o fragmento deHc da BoNT ligado na fase sólida juntamente com GST-sinaptotagmina-proteína de fusão foi observado na fase sólida. A substituição dos respecti-vos fragmentos de Hc, através do comprimento total de BoNT/B e G no en-saio Pull-down, produziu esses resultados.

Assim verificou-se que a BoNT/B do tipo selvagem, na presençade gangliosídeos complexos e de sinaptotagmina I, se liga apenas com do-mínio de transmembrana, enquanto a sinaptotagmina II se liga tanto com odomínio de transmembrana como também na presença ou na ausência degangliosídeos complexos. Através de substituições de aminoácidos dirigidasa um alvo dentro do local de ligação do receptor de proteína de BoNT/B ainteração pode ser visivelmente aumentada ou enfraquecida com ambas asmoléculas de sinaptotagmina (Figura 1).

Além disso mostrou-se, para a BoNT/G do tipo selvagem, queestas tanto ocorrem na presença como também na ausência de gangliosí-deos complexos na sinaptotagmina I e sinaptotagmina II, respectivamentecom ou sem o domínio de transmembranas. Através da substituição alvo-dirigida em BoNT/B de aminoácidos homólogos, dentro do local de ligação,do receptor de proteína de BoNT/G, a interação pode aumentar ou enfra-quecer visivelmente com ambas as moléculas de sinaptotagmina (Figura 2).

A potência da forma de comprimento total dos tipos selvagensde BoNT/A, B e G foi determinada por HDA por meio de uma curva de dose-eficácia (Figura 3 e 6). Em seguida verificou-se a potência das diferentesformas de comprimento total de mutantes individuais da BoNT/A, B e G porHDA (Figura 6) e ajustou-se, por meio de uma função de potências às po-tências do tipo selvagem da BoNT/B ou G (Figura 4 e 5). Por exemplo, a tro-ca dos aminoácidos Valina 1118 por aspartato, ou lisina 1192 por glutamatoem BoNT/B, leva a uma drástica redução da potência a < 2%. Ao contrário, amutação da tirosina 1183 em leucina ou arginina leva a um reforço visível dapotência da BoNT/B (Figura 4). A modificação de tirosina 1256 em fenilala-mina em BoNT/G resulta, igualmente, em um acréscimo de potência, en-quanto que a mutação de glutamina 1200 em glutamato, lisina ou tirosinaprovoca uma forma redução da potência da BoNT/G (Figura 5). No caso daBoNT/A, a modificação de serina 1207 em arginina ou tirosina provoca umaforte elevação da potência, enquanto que a mutação de lisina 1260 em glu-tamato produz uma drástica redução da potência da BoNT/A (Figura 6).

De acordo com uma forma de execução preferida, a proteína detransporte apresenta pelo menos 15% de maior afinidade, ou uma afinidadepelo menos 15% menor do que a neurotoxina nativa. De preferência, a pro-teína de transporte apresenta uma afinidade pelo menos 50% maior ou me-nor, particularmente preferido pelo menos 80% maior ou menor, e particu-larmente pelo menos 90% maior ou menor do que a neurotoxina.

De acordo com uma forma de execução preferida, a modificaçãoda HC ocorre na faixa do fragmento de Hc da neurotoxina indicada. Desdeque a modificação abranja uma substituição, deleção, inserção ou adição,essas podem ser realizadas, por exemplo, por mutagênese dirigida ao alvo.Processos para tal são conhecidos pelos especialistas. Os aminoácidos pre-sentes na neurotoxina nativa são aqui modificados, ou por aminoacidos queocorrem naturalmente, ou que ocorrem não naturalmente. Basicamente ami-noacidos são divididos em diferentes grupos fisicoquímicos. Dentre os ami-noacidos negativamente carregados estão o aspartato e o glutamato. Dentreos aminoacidos positivamente carregados estão histidina, arginina e lisina.Dentre os aminoacidos polares estão a asparagina, glutamina, serina, treo-nina, cisteína e tirosina. Dentre os aminoacidos não polares estão glicina,alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina prolina, fenilalanina, e triptofa-no. Grupos laterais aromaticos são encontrados nos aminoacidos histidina,fenilalanina, tirosina e triptofano. Em geral, é preferido que um aminoácidoseja trocado por outro aminoácido que pertence a um outro grupo fisicoquí-mico.

De acordo com uma forma de execução preferida da invenção aproteína de transporte é uma neurotoxina Botulinus sorotipo A até G. Aquiestão obteníveis as neurotoxinas nativas como se segue de bancos de da-dos abertos à inspeção pública:

Tabela 1: Números do Banco de Dados das Seqüências de Aminoacidos eDistribuição dos Subdomínios das Sete Neurotoxinas Botulinus.

<table>table see original document page 13</column></row><table>Tabela 1: -continuação-

<table>table see original document page 14</column></row><table>Tabela 1: -continuação-

<table>table see original document page 15</column></row><table>843 até 1251 ou 1252 do sorotipo E da neurotoxina C.botulinum ou C. butiri-cum 861 até 1274, 862 até 1280 ou 1278 e 854 até 1268 do sorotipo F daneurotoxina C. botulinum ou C. barata,861 até 1297 do sorotipo G da neurotoxina C. botulinum.

É portanto preferido que pelo menos um aminoácido seja modifi-cado nas posições pós-translacionais previamente mencionadas, e/ou adi-cionados, e/ou deletados, e/ou inseridos, e/ou substituídos por um aminoáci-do que ocorre naturalmente ou que não tenha origem natural.

De acordo com uma forma de execução preferida, a neurotoxinaé um sorotipo A da neurotoxina Botulinus. De preferência, aqui pelo menosum aminoácido nas seqüências de proteína pós-translacionais é modificadoe/ou adicionado, e/ou deletado, e/ou inserido, e/ou substituído por um ami-noácido, que ou ocorre naturalmente ou não tem origem natural, nas posi-ções treonina 1195, asparagina 1196, glutamina 1199, lisina 1204, isoleucina1205, leucina 1206, serina 1207, leucina 1209, aspartato 1213, leucina 1217,fenilalanina 1255, asparagina 1256, isoleucina 1258, e/ou lisina 1260 do so-rotipo A da neurotoxina Botulinus, particularmente preferidas são as posi-ções asparagina 1196, glutamina 1199, serina 1207, fenilalanina 1255, iso-leucina 1258, e/ou lisina 1260 das seqüências de proteína do sorotipo A daneurotoxina Botulinus. São particularmente preferidas as posições serina1207, que é substituída por arginina ou tirosina, e lisina 1260, que é trocadapor glutamato.

De acordo com uma forma de execução preferida, a neurotoxinaé sorotipo B da neurotoxina Botulinus. De preferência, aqui pelo menos umaminoácido é modificado pós-translacionalmente nas posições lisina 1113,aspartato 1114, serina 111, prolina 1117, valina 1118, treonina 1182, tirosina1183, fenilalanina 1186, lisina 1188, glutamato 1191, lisina 1192, leucina1193, fenilalanina 1194, fenilalanina 1204, fenilalanina 1243, glutamato1245, lisina 1254, aspartato 1255, e tirosina 1256, nas seqüências de proteí-na do sorotipo B da neurotoxina Botulinus, e/ou adicionado, e/ou deletado,e/ou inserido, e/ou substituído por um aminoácido que, ou ocorre natural-mente, ou não tem origem natural.Particularmente preferidas são as posições valina 1118, tirosina1183, glutamato 1191, lisina 1192, glutamato 1245, e tirosina 1256 do soroti-po B das seqüências de proteína da neurotoxina Botulinus. São particular-mente preferidas as posições tisorina 1183, e glutamato 1191, que são subs-tituídas por leucina.

De acordo com uma outra forma de execução preferida, a neuro-toxina é o sorotipo G da neurotoxina Botulinus. De preferência, aqui pelomenos um aminoácido é pós transacionalmente modificado, e/ou adiciona-do, e/ou deletado, e/ou inserido, e/ou substituído por um aminoácido, que ouocorre naturalmente ou é de origem não natural, nas posições fenilalanina1121, lisina 1123, alanina 1124, serina 1125, metionina 1126, valina 1190,leucina 1191, serina 1194, glutamato 1196, treonina 1199, glutamina 1200,leucina 1201, fenilalanina 1202, fenilalanina 1212, fenilalanina 1248, lisina1250, aspartato 1251, e tirosina 1262 das seqüências de proteína do soroti-po G da neurotoxina Botulinus. Particularmente preferidas são as posiçõesmetionina 1126, leucina 1191, treonina 1199, glutamina 1200, lisina 1250, etirosina 1262, das seqüências de proteínas do sorotipo G da neurotoxinaBotulinus. É particularmente preferida a posição tirosina 1262, que é substi-tuída por fenilalanina.

A proteína de transporte preparada na presente invenção apre-senta uma maior ou menor afinidade específica a seus domínios que se li-gam a proteínas, particularmente a moléculas da família das sinaptotagmi-nas ou das vesículas sinápticas das glicoproteínas 2.

Uma outra forma de execução da presente invenção refere-se auma composição, que contém uma proteína de transporte de acordo com ainvenção e pelo menos uma molécula interveniente (X). A molécula interve-niente pode ser uma molécula orgânica pequena, um peptídeo ou uma pro-teína; de preferência ligada covalentemente à proteína de transporte poruma ligação de peptídeo, ligação de éster, ligação de éter, ligação de sulfe-to, ligação de dissulfeto, ou ligação de carbono-carbono.

A molécula interveniente abrange adicionalmente todos os mate-riais conhecidos terapeuticamente eficazes. São preferidos aqui os zitostáti-cos, antibióticos, virostáticos, mas também imunoglobulina.

Em uma forma de execução preferida a proteína é uma protea-se, que dissocia uma ou mais proteínas do aparelho de liberação de neuro-transmissores, sendo que a protease é escolhida do grupo das neurotoxinas,que consiste dos LC das neurotoxinas C. botulinum, particularmente do soro-tipo A, B, C1, D, E, F e G ou um fragmento ativo proteolítico da LC de umaneurotoxina C. botulinum, particularmente uma neurotoxina do sorotipo A, B,C1, D, E, F e G, sendo que o fragmento apresenta pelo menos 0,01 da ativi-dade proteolítica da protease nativa particulamente preferido 5%, particular-mente preferido pelo menos 50%, particularmente pelo menos 90%. É prefe-rida a proteína de transporte e a protease derivada do sorotipo da neurotoxi-na C. botulinum, particularmente preferido o domínio Hn da proteína detransporte e a protease derivada do sorotipo A da neurotoxina C. botulinum.As seqüências das proteases são em geral obteníveis dos bancos de dados,e os números dos bancos de dados são visíveis na Tabela 1. A atividadeproteolítica das proteases é determinada por meio de uma cinética de disso-ciação de substrato (vide Binz ef a/.(2002), Bioquímica 41 (6), 1717-23).

De acordo com uma outra forma de execução da presente in-venção, é disponibilizado um processo para preparação da proteína detransporte. Em uma primeira etapa aqui é preparado um ácido nucléico codi-ficador da proteína de transporte. O ácido nucléico codificante pode repre-sentar aqui RNA, DNA ou misturas deles. Além disso, o ácido nucléico, ten-do em vista sua resistência a nuclease, pode ser modificado, como por e-xemplo por acréscimo de ligações de tioato de fósforo. O ácido nucléico po-de ser preparado a partir de um ácido nucléico de partida, sendo que o ácidonucléico de partida é obtenível por exemplo por clonagem de bancos genéti-cos ou de cDNA. Além disso, o ácido nucléico pode ser preparado direta-mente por síntese de fase sólida. Processos apropriados são conhecidos doespecialista. Desde que se parta de um ácido nucléico de partida, por exem-pio, pode ser realizada através de mutagênese dirigida a um local uma modi-ficação orientada para o alvo que leva pelo menos a uma adição, inserção,deleção e/ou substituição no campo dos aminoácidos. O ácido nucléico éentão ligado de modo operativo a um promotor apropriado. Promotores a-propriados para a expressão em sistemas de expressão conhecidos são co-nhecidos do especialista. A escolha do promotor depende aqui do sistemade expressão empregado para expressão. Em geral são preferidos os pro-motores constitutivos, entretanto também são empregáveis promotores indu-zíveis. A construção assim preparada abrange pelo menos uma parte de umvetor, particularmente elementos regulatórios, sendo que o vetor é escolhido,por exemplo, de derivados X, adenovírus, baculovírus, vaciniavírus, vírusSV40 e retrovírus. O vetor é de preferência habilitado para expressão dosácidos nucléicos em uma determinada célula hospedeira.

Além disso, a invenção prepara células hospedeiras, que contêmo vetor e são apropriadas para expressão do vetor. No estado da técnica sãoconhecidos diversos sistemas de expressão procariônticos e eucariônticos,sendo que as células hospedeiras são escolhidas de células procariônticascomo E. coli ou B. subtilis, de células eucariônticas como S. cerevisiae e P.pastoris. Apesar disso podem ser empregadas células eucariônticas maiorescomo células de insetos, ou células de mamíferos, entretanto são preferidascélulas hospedeiras, que não dispõem de nenhum aparelho de glicosilação,assim como C. botulinum.

De acordo com uma forma de execução preferida o ácido nucléi-co codifica o fragmento Hc da neurotoxina C. botulinum. Esse ácido nucléicocontém locais de corte de endonuclease, que flanqueiam o ácido nucléicocodificador do fragmento Hc, sendo que os locais da endonuclease sãocompatíveis com aqueles de outros fragmentos Hc das neurotoxinas C. botu-linum, para permitir sua fácil troca modular no gen codificador da proteína detransporte, enquanto conserva a semelhança da seqüência de aminoácidos.

Desde que seja disponibilizada uma composição de acordo coma invenção, que além da proteína de transporte ainda contém pelo menosuma molécula interveniente, e essa molécula interveniente seja funcionaliza-da por um peptídeo ou proteína ou por uma cisteína terminada em carboxilaou um grupo mercapto, então, de maneira análoga ao anteriormente descri-to, o peptídeo ou a proteína podem ser recombinantemente preparados sobemprego de vetores binários ou por células hospedeiras diferentes. Desdeque a mesma célula hospedeira seja empregada para a expressão, tanto daproteína de transporte como também do peptídeo ou proteína de preferên-cia, é formada in situ uma ligação de dissulfito intermolecular. Para uma pro-dução mais eficiente na mesma célula hospedeira, o ácido nucléico codifica-dor do peptídeo ou da proteína também pode ser transladado com a proteínade transporte, de modo que é produzido um polipeptídeo de cadeia única.

Trata-se aqui então, de preferência, de uma ligação de dissulfito intramole-cular in situ. Para hidrólise simples da ligação peptídica igualmente disponí-vel entre a proteína de transporte e o peptídeo ou a proteína acrescenta-se,na terminação amino da proteína de transporte, uma seqüência de aminoá-cidos que, ou é reconhecida especificamente pela protease trombina, ou poruma endoprotease específica das células hospedeiras e é dissociada.

Surpreendentemente verificou-se que a seqüência de inserçãoCXXXZKTKSLVPRGSKBXXC (SEQ ID NO:1), na qual X representa um ami-noácido qualquer e Z e B, independentemente um do outro, é escolhido apartir de alanina, valina, serina, treonina e glicina, é dissociada eficientemen-te por uma protease endógena de um hospedeiro bacteriano in vivo, de pre-ferência E. coli. O acréscimo da seqüência de inserção entre a seqüência deaminoácidos da proteína de transporte e um outro peptídeo ou proteína temportanto a vantagem de não ser exigido um processamento posterior, comopor exemplo por trombina. Particularmente preferida é a cepa de E. coli, E.coli K 12.

A seqüência de inserção é de preferência parte de um loop depreferência com 1820 aminoácidos.

Desde que essa não seja possível, após purificação separada daproteína de transporte e da proteína, pode ser subseqüentemente realizada,através de um processo de oxidação conhecido pelo especialista, uma res-pectiva ligação intermolecular de dissulfito. A proteína também pode ser ob-tida diretamente por síntese ou condensação de fragmento. Os respectivosprocessos são conhecidos pelo especialista.

A proteína de transporte e o peptídeo ou proteína são a seguirpurificados. Aqui são empregados processos conhecidos pelos especialistas,como por exemplo o processo de cromatografia ou eletroforese.

Uma outra forma de execução da presente invenção refere-se àcomposição farmacêutica, que contém a proteína de transporte ou umacomposição, e opcionalmente carreadores farmaceuticamente aceitáveis,um diluente e/ou aditivo.

A composição farmacêutica é apropriada para administraçãooral, endovenosa, subcutânea, intramuscular e tópica. A administração in-tramuscular é preferida aqui. Uma unidade de dosagem da composição far-macêutica contém mais ou menos 0,1 pg até 1 mg de proteína de transportee/ou a composição de acordo com a invenção.

A composição farmacêutica é apropriada para o tratamento dedistúrbios da liberação de neurotransmissores, e de doenças como, por e-xemplo, espasmo hemifacial, torcicolo espasmódico, blefaroespasmo, es-pasticidades, distonias, enxaquecas, doenças da garganta e lombares, es-trabismo, hipersalivação, fechamento de feridas, ronco, e depressões.

Uma outra forma de execução da presente invenção inclui umacomposição cosmética que contém uma proteína de transporte e um carrea-dor cosmético aceitável, diluentes e/ou aditivo. A composição cosmética éapropriada para o tratamento da hiperhidrose e de rugas faciais.

Figura 1: Verificação da formação in vitro de fragmentos Hc daBoNT/B do tipo selvagem e mutante, em proteínas de fusão GST-Syt 1 eGST-Syt II curtas, na presença ou ausência de gangliosídeos complexos pormeio de ensaio GST-Pull-down.

Figura 2: Verificação dos fragmentos Hc de BoNT/G do tipo sel-vagem e mutante em proteínas de fusão GST-Syt I e GST-Syt II na presençaou ausência de gangliosídeos complexos por meio de ensaio GST-Pull-down.

Figura 3: Curva de Eficácia de Dosagem de BoNT/A e tipos sel-vagens G por HDA. As funções potenciais introduzidas possibilitam umacomparação relativa dos tempos de paralisia dos mutantes individuais comaqueles dos tipos selvagens correspondentes.Figura 4: Aumento e diminuição da neurotoxicidade dos mutan-tes individuais da BoNT/B em comparação com o tipo selvagem por HDA.

Figura 5: Aumento e diminuição da neurotoxicidade dos mutan-tes individuais da BoNT/G em comparação ao tipo selvagem por HDA.

Figura 6: Curvas da Eficácia de dosagem da BoNT/A do tipo sel-vagem e dos mutantes individuais da BoNT/A por HDA.

A presente invenção apresenta em detalhes uma proteína detransporte (Trapo), que se origina por modificação da HC da neurotoxinaproduzida por C. botulinum, de preferência ligando-se especificamente emneurônios, e de preferência é admitida intracelularmente por endocitose in-tracelular promovida por receptores e é translocada do compartimento en-dossomal ácido no citosol de neurônios. Essa proteína é utilizada comotransportador para liberar, nas células proteases ligadas a ela, outras subs-tâncias, que não penetram fisiologicamente na membrana plasmática e quepodem alcançar o citosol das células nervosas. Os substratos das proteasessão proteínas e peptídeos localizados intracelularmente, que tomam parte naliberação do transmissor. Depois da dissociação dos substratos as funçõesespecíficas dos neurônios são bloqueadas, sendo que as próprias célulasnão são danificadas. Uma dessas funções é a exocitose, que assegura aliberação dos neurotransmissores. Se a liberação de transmissores é inibida,a transmissão de sinais de célula para célula é bloqueada. Por exemplo,músculos estriados são paralisados, quando a liberação de acetilcolina nolocal de contato neuromuscular é inibida. Essa eficácia pode ser utilizadaterapeuticamente, quando a proteína de transporte é aplicada em termina-ções nervosas de músculos espásticos ou distônicos. Outras substânciasativas são, por exemplo, substâncias ativas com eficácia antiviral. Conjuga-das com a proteína de transporte, elas são de utilidade para o tratamento demuitas infecções virais do sistema nervoso. A presente invenção refere-setambém ao emprego de uma proteína de transporte para inibição da libera-ção de neurotransmissores.

Proteínas de transporte com menor afinidade ligam-se às célulasnervosas não sendo, entretanto, absorvidas por essas. Essas proteínas detransporte são portanto apropriadas como transportadores específicos paraa superfície das células nervosas.

Quando pacientes são tratados com as toxinas progenitoras A eB de C. botulinum, a injeção dessas proteínas não humanas, apesar da pe-quena dose, acarreta a formação de anticorpos, de modo que a terapia per-manece sem efeito e, portanto, tem que ser interrompida para, por fim, evitarum choque anafilático. Quando se aplica uma substância do mesmo meca-nismo de eficácia com uma maior eficácia de transporte da atividade enzimá-tica, a dose pode ser drasticamente reduzida, e não serão formados anticor-pos. Essas propriedades vêm de encontro à proteína de transporte aqui des-crita.

Também quando são indicados exemplos de aplicação, entãoem geral o modo de aplicação apropriado e a dosagem são determinadospelo médico. Tais decisões são tomadas rotineiramente por qualquer médicoversado no campo. Então o modo de aplicação e a dosagem da neurotoxinade acordo com a invenção aqui apresentada são escolhidos à base de crité-rios como a solubilidade da neurotoxina escolhida ou a intensidade das do-res a serem tratadas.

Atualmente o intervalo de tratamento para a toxina progenitoranativa A e B de C. botulinum é, em média, de três até quatro meses. O pro-longamento desse intervalo reduziu o risco de formação de anticorpos epossibilitou uma maior duração do tratamento com BoNT. A retirada da LCno citosol aumentaria sua decomposição temporal e assim também prolon-garia a eficácia de duração. A proteína de transporte aqui descrita possuiuma afinidade maior e taxa de absorção maior do que a HC nativa.

O seguinte exemplo serve apenas para o propósito de esclare-cimento e não deveria ser visto como limitante.

Material e Métodos

Construção de plasmídeo e Preparação de proteínas recombinantes

Plasmídeos para a expressão de E. coli de fragmentos de Hcrecombinantes de BoNT/B e BoNT/G, assim como a forma de comprimentototal de BoNT/A, BeG, com etiqueta (streptag), com terminação carboxilapara purificação de afinidade, foram preparados por processos de PCR comprimers apropriados, BoNT/A (AAA23262), BoNT/B (AAA 23211) e BoNT/G(CAA52275), DNA cromossomal codificador, e o vetor de expressão pQe3(Qiagen AG) como vetor de partida. Variantes encurtadas de sinaptotagminaI de ratazanas (Syt I) (aminoácidos 1-53; aminoácidos 1-82) e sinaptotagmi-na II de ratazanas (Syt II) (aminoácidos 1-61; aminoácidos 1-90) foram clo-nados no vetor pGEX-2T codificador de GST (Amersham Biosciences AB).

As seqüências de ácido nucléico dos demais plasmídeos foram constatadaspor seqüenciação de DNA. Os fragmentos de Hc recombinantes e a formade comprimento total de BoNT foram preparados na cepa E. coli M 15[pRep4] (Qiagen) durante uma indução de dez horas à temperatura ambien-te e em uma matriz Strep Tactin (IBA GmbH) de acordo com as sugestõesde preparação. As proteínas de fusão GST obtidas a partir de E. coli BL21foram isoladas com o auxílio de glutationa imobilizadas em pequenas esfe-ras de sefarose. Frações que continham as proteínas desejadas foram puri-ficadas e dialisadas com solução tampão de tris-NaCI-triton (20 mM tris-HCI,150 mM de NaCI, 0,5% de Triton X -100, pH 7,2).

Teste GST Pull-down

Proteínas de fusão GST (respectivamente 0,12 mmol), que foramimobilizadas em pequenas esferas de Gt-sefarose de 10 pJ, foram incubadascom fragmentos de Hc (0,1 nmol) na ausência ou presença de uma misturade miolo de boi-gangliosídeos (18% GM1< 55% de GD1a, 10% de GT1b, 2%dos demais gangliosídeos; Calbiochem; 20 pg respectivamente) em um vo-lume total de 180 uJ de solução tampão tris-NaCI-triton por 2 horas a 4o C. Aspequenas esferas foram reunidas por centrifugação, o resíduo foi retirado, eas pequenas esferas separadas foram respectivamente lavadas três vezescom 400 [l\ da mesma solução tampão. As frações de pelotes lavadas foramcozidas em uma solução tampão de amostras de SDS e, juntamente com asfrações residuais, observadas por DSD - PAGE e Tintura azul Coomassie.

O tipo selvagem de BoNT/B se liga apenas na presença de gan-gliosídeos complexos e sinaptotagmina I com os domínios das transmem-branas, enquanto sinaptotagmina II se liga tanto com ou sem os domínios datransmembrana, como também está ligado na presença ou ausência degangliosídeos complexos. Através da substituição dirigida aos aminoácidosalvo, dentro dos locais de ligação do receptor de proteína da BoNT/B, a intera-ção com ambas as moléculas de sinaptotagmina pode ser visivelmente au-mentada (E1191L; Y1183L) ou enfraquecida (V1118D; K1192E) (Figura 1).

Para a BoNT/G do tipo selvagem verificou-se que, tanto na pre-sença como também na ausência de gangliosídeos complexos, a ligação emsinaptotagmina I e sinaptotagmina II ocorre respectivamente com ou sem odomínio da transmembrana. Através da substituição objetivada ao alvo deaminoácidos homólogos a BoNT/B, dentro dos locais de ligação do receptorde proteína de BoNT/G, a interação com ambas as moléculas de sinapto-tagmina é visivelmente aumentada (Y1262F) ou enfraquecida (Q1200E) (Fi-gura2).

Através da comprovação da ligação dos fragmentos Hc recombi-nantes de BoNT/B e G em gangliosídeos isolados, imobilizados, um dano dafunção dos bolsões de ligação dos gangliosídeos vizinhos pode ser descar-tado e podem ser tiradas conclusões suficientes em uma estrutura terciáriaintacta do fragmento de Hc. Esses resultados são suportados por verifica-ções espectroscópicas CD assim como experimentos de desnaturação tér-mica, que igualmente mostram estruturas terciárias intactas dos fragmentosde Hc mutantes de BoNT/B e G.

Ensaio de Hemidiafraqma de ratazana (HDA)

A neurotoxicidade das BoNT/A, B e G muteíns? foi determinadaconforme descrito em Haberman et al, Naunyn Schimiedeberg's Arch. Pha-macol. 311 (1980), 33-40.

A potência da forma do comprimento total da BoNT/A, B e G dostipos selvagens foi determinada por HDA por meio de uma curva-dose-eficácia (Figura 3 e 6). Em seguida a potência das diversas formas de com-primento - total da BoNT/A, B e G mutantes individuais foi verificada porHDA (Figura 6) e determinada por meio de uma função de potência aplicadana proporção das potências da BoNT/B e G dos tipos selvagens (Figura 4 e5). Assim, a troca dos aminoácidos valina 1118 por aspartato ou lisina 1192por glutamato em BoNT/B leva a uma drástica redução da potência a < 2%.

Ao contrário disto, a mutação da tirosina 1183 em leucina ou arginina produzum visível reforço da potência da BoNT/B (Figura 4). A modificação de tirosi-na 1256 para fenilalanina em BoNT/G resulta igualmente em um acréscimode potência, enquanto a mutação de glutamina 1200 para glutamato, lisinaou tirosina, efetua uma forte redução da potência da BoNT/G (Figura 5). Nocaso da BoNT/A a modificação de serina 1207 para arginina ou tirosina pro-duz um aumento de potência, enquanto a mutação de lisina 1260 em gluta-mato atua uma drástica redução da potência de BoNT/A (Figura 6).

Claims (45)

1. Proteína de transporte, obtenível por modificação da cadeiapesada da neurotoxina Clostridium botulinum, na qual(i) a proteína se liga em células nervosas com maior ou menorafinidade do que a neurotoxina nativa;(ii) a proteína apresenta uma neurotoxicidade aumentada oureduzida comparado com a neurotoxina nativa; de preferência a neurotoxici-dade é determinada através do ensaio de hemidiafragma; e/ou(iii) a proteína apresenta uma menor afinidade perante anti-corpos neutralizadores se comparado com a neurotoxina nativa.

2. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 1, naqual o anticorpo neutralizador impede a ligação da neurotoxina nativa com oreceptor de proteína ou receptor de gangliosídeos e/ou a absorção da neuro-toxina nas células nervosas.

3. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 1 ou 2,na qual a proteína de transporte é extraída por endocitose das células.

4. Proteína de transporte de acordo com as reivindciações 1 a 3,na qual a proteína se liga especificamente nas moléculas associadas àmembrana de plasma, proteínas da transmembrana, proteínas da vesículasinaptica, proteínas da família da sinaptotagmina ou da vesícula sinapticaglicoproteína 2 (SV2) e/ou sinaptotagmina I e/ou sinaptotagmina II (motoneu-rônios colinérgicos) e/ou SV2A, SV2B, ou SV2C, de preferência sinaptotag-mina humana I, e/ou sinaptotagmina humana II, e/ou SV2A, SV2B ou SV2Chumana.

5. Proteína de transporte de acordo com uma das reivindicações-1 a 4, na qual a proteína apresenta mais alta afinidade do que pelo menos-15%, de ou pelo menos 15% de mais baixa afinidade do que a neurotoxinanativa, de preferência pelo menos 50%, particularmente preferido pelo me-nos 80%, particularmente preferido pelo menos 90%.

6. Proteína de transporte de acordo com uma das reivindicações-1 a 5, na qual o fragmento Hc da proteína de transporte apresenta pelo menosuma substituição e/ou deleção e/ou inserção e/ou adição e/ou modificaçõespós-translacionais de aminoácidos, que ou ocorrem naturalmente ou não sãode origem natural e que aumentam ou diminuem a afinidade perante a neu-rotoxina nativa.

7. Proteína de transporte de acordo com uma das reivindicações-1 a 6, na qual a neurotoxina é sorotipo A até G da neurotoxina Botulinus.

8. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 7, naqual pelo menos um aminoácido nas posições-867 até 1296 do sorotipo A da neurotoxina Clostridium botulinum-866 até 1291 do sorotipo B da neurotoxina Clostridium botulinum-864 até 1291 ou 1280 do sorotipo C1 da neurotoxina Clostridium botulinum-860 até 1276 ou 1285 do sorotipo D da neurotoxina Clostridium botulinum-843 até 1251 ou 1252 do sorotipo E da neurotoxina Clostridium botulinum ouClostridium butiricum-861 até 1274, 862 até 1280 ou 1278 e 854 até 1268 do sorotipo F da neuro-toxina Clostridium botulinum ou Clostridium baratii,-861 até 1297 do sorotipo G da neurotoxina Clostridium botulinum é póstransacionalmente modificado, e/ou adicionado, e/ou deletado, e/ou inseridoe/ou substituído por aminoácidos, que ou ocorrem naturalmente ou não sãode origem natural.

9. Proteína de transporte de acordo com uma das reivindicaçõesanteriores, na qual a neurotoxina nativa é o sorotipo A da neurotoxina, e depreferência liga a proteína de transporte à vesícula sináptica glicoproteína 2(SV2), particularmente preferido SV2A, SV2B ou SV2C.

10. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 9, naqual pelo menos um aminoácido nas posições treonina 1195, asparagina-1196, glutamina 1199, lisina 1204, isoleucina 1205, leucina 1206, serina-1207, leucina 1209, aspartato 1213, leucina 1217, fenilalanina 1255, aspara-gina 1256, isoleucina 1258, e/ou lisina 1260 do sorotipo A da neurotoxinaBotulinus das seqüências de proteínas é pós-translacionalmente modificado,e/ou adicionado, e/ou deletado, e/ou inserido, e/ou substituído por um ami-noácido, que ou ocorre naturalmente ou não tem origem natural.

11. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 10, naqual pelo menos um aminoacido nas posições asparagina 1196, glutamina-1199, serina 1207, fenilalanina 1255, isoleucina 1258, e/ou lisina 1260 é pós-translacionalmente modificado, e/ou adicionado, e/ou deletado, e/ou inseri-do, e/ou substituído por um aminoacido, que ou tem origem natural ou nãonatural.

12. Proteína de transporte de acordo com uma das reivindica-ções 10 ou 11, onde o aminoacido serina é substituído na posição 1207 porarginina e tirosina.

13. Proteína de transporte de acordo com uma das reivindica-ções 10 ou 11, sendo que o aminoacido lisina na posição 1260 é substituídopor glutamato.

14. Proteína de transporte de acordo com uma das reivindica-ções 1 até 8, sendo que a neurotoxina é o sorotipo B da neurotoxina Botulinus,e de preferência a proteína de transporte se liga em sinaptotagmina I ou II.

15. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 14, naqual pelo menos um aminoacido nas posições lisina 1113, aspartato 1114,serina 1116, prolina 1117, valina 1118, treonina 1182, tirosina 1183, fenilala-nina 1186, lisina 1188, glutamato 1191, lisina 1192, leucina 1193, fenilalani-na 1194, fenilalanina 1204, fenilalanina 1243, glutamato 1245, lisina 1254,aspartato 1255, e tirosina 1256 de seqüência de proteínas do sorotipo B daneurotoxina Botulinus é pós-translacionalmente modificado, e/ou adicionado,e/ou deletado, e/ou inserido e/ou substituído por um aminoacido, que ou o-corre naturalmente ou tem origem não natural.

16. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 15, naqual pelo menos um aminoacido nas posições valina 1118, tirosina 1183,glutamato 1191, lisina 1192, glutamato 1245, e/ou tirosina 1256 das seqüên-cias de proteína do sorotipo B da neurotoxina Botulinus pós-translacional-mente modificada, e/ou adicionado, e/ou deletado, e/ou inserido e/ou substi-tuído por um aminoacido, que ou ocorre naturalmente ou tem origem nãonatural.

17. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 16, naqual o aminoacido tirosina é substituído por leucina na posição 1183.

18. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 16, naqual o aminoácido glutamato na posição 1191 é substituído por leucina.

19. Proteína de transporte de acordo com uma das reivindica-ções 1 a 8, na qual a neurotoxina é o sorotipo G da neurotoxina Botulinus.

20. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 19, naqual pelo menos um aminoácido, nas posições fenilalalina 1121, lisina 1123,alanina 1124, serina 1125, metionina 1126, valina 1190, leucina 1191, serina1194, glutamato 1196, treonina 1199, glutamina 1200, leucina 1201, fenilala-nina 1202, fenilalanina 1212, fenilalanina 1248, lisina 1250, aspartato 1251 etirosina 1262 da seqüência de proteínas do sorotipo G da neurotoxina Botu-linus, é modificado pós-translacionalmente, e/ou adicionado, e/ou deletado,e/ou inserido e/ou substituído por um aminoácido, que ou é de origem natu-ral ou não natural.

21. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 20, naqual pelo menos um aminoácido nas posições metionina 1126, leucina 1191,treonina 1199, glutamina 1200, lisina 1250, e tirosina 1262, da seqüência deproteína do sorotipo G da neurotoxina Botulinus é pós-translacionalmentemodificado, e/ou adicionado, e/ou deletado, e/ou inserido, e/ou substituídopor um aminoácido, que ou é de origem natural ou não natural.

22. Proteína de transporte de acordo com a reivindicação 21, naqual o aminoácido tirosina na posição 1262 é substituído por fenilalanina.

23. Composição contendo uma proteína de transporte como de-finida em uma das reivindicações 1 a 22, e pelo menos uma molécula inter-veniente.

24. Composição de acordo com a reivindicação 23, na qual amolécula interveniente está ligada, por uma ligação de peptídeo, ligação és-ter, ligação éter, ligação sulfeto, ligação dissulfeto, ou ligação carbono-carbono, covalentemente na proteína de transporte.

25. Composição de acordo com a reivindicação 23 ou 24, naqual a molécula interveniente ou é uma pequena molécula orgânica, um pep-tídeo ou uma proteína.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, na qual apequena molécula orgânica é um vírustático, zitostático, antibiótico ou umaimunoglobulina.

27. Composição de acordo com a reivindicação 25, na qual aproteína é uma protease.

28. Composição de acordo com a reivindicação 27, na qual aprotease abrange uma ou mais cadeias mais leves (LC) dos sorotipos A, B,C1, D, E, F e/ou G da neurotoxina Clostridium botulinum.

29. Composição de acordo com a reivindicação 27, na qual aprotease contém um fragmento proteoliticamente ativo que é derivado dacadeia leve (LC) dos sorotipos A, B, C1, D, E, F e/ou G da neurotoxina Clos-tridium botulinum e é caracterizado pelo fato de apresenta pelo menos 0,01% da atividade proteolítica da protease nativa, de preferência pelo me-nos 50% .

30. Composição de acordo com a reivindicação 28 e 29, na quala protease dissocia determinados substratos dentro do motoneurônio coli-nérgico específico.

31. Composição de acordo com a reivindicação 30, na qual ossubstratos são escolhidos a partir de proteínas, que estão envolvidas na libe-ração de neurotransmissores nas células nervosas, e proteínas, que sãopassíveis de reações catalíticas dentro das células nervosas.

32. Composição de acordo com a reivindicação 28 e 29, na quala protease e a proteína de transporte estão ligadas covalentemente por umaseqüência de aminoácidos que são especificamente reconhecidos por umaendopeptidase e são dissociados.

33. Composição de acordo com a reivindicação 32 na qual, aseqüência de aminoácido abrange a seqüência CXXXZKTKSLVPRGSKBXXC,na qual X é qualquer aminoácido e Z e B independentes um do outro são esco-lhidos de alanina, valina, serina, treonina e glicina.

34. Composição de acordo com a reivindicação 32, na qual apósa dissociação através da endopeptidase, uma ponte de dissulfito liga a pro-tease e a proteína de transporte uma com a outra, o que novamente leva aosurgimento de uma holotoxina ativa.

35. Composição farmacêutica, que contém a proteína de trans-porte como definida em uma das reivindicações de 1 a 22, ou a composiçãode acordo com uma das reivindicações 23 a 34, assim como opcionalmenteum carreador farmaceuticamente aceitável, diluente e/ou aditivo.

36. Emprego da composição farmacêutica como definida na rei-vindicação 35, para tratamento de distúrbios e doenças, para as quais umaterapia com neurotoxina Botulinus é indicada.

37. Emprego de acordo com a reivindicação 36, no qual o distúr-bio ou doença é um dos seguintes: espasmo hemifacial, torcicolo espasmó-dico, blefaroespasmo, espasticidades, distonias, enxaquecas, dores, doen-ças da garganta e lombares, estrabismo, hipersalivação, ronco, fechamentode feridas, e doenças depressivas.

38. Composição cosmética, que contém a proteína de transportecoo definida em uma das reivindicações 1 a 22, ou a composição de acordocom uma das reivindicações 23 a 34, assim como opcionalmente um carrea-dor cosmeticamente aceitável, diluente e/ou aditivo.

39. Emprego de uma composição cosmética como definida nareivindicação 38, para o tratamento das indicações cosméticas hiperhidrosee rugas do rosto.

40. Processo para preparação de uma proteína de transportecomo definida nas reivindicações 1 a 22, ou uma composição como definidanas reivindicações 23 a 34, por recombinação de acordo com processos co-nhecidos.

41. Processo para preparação da proteína de transporte de a-cordo com a reivindicação 40, no qual o gen do fragmento Hc é flanqueadopor interfaces de restrição de corte de endonuclease contendo dois ácidosnucléicos, em que as interfaces de restrição de endonuclease são compatí-veis com aquelas dos outros fragmentos de Hc das neurotoxinas de Clostri-dium botulinum, para permitir sua troca modular facilitada, enquanto obtém-se a semelhança da seqüência de aminoácido.

42. Processo para preparação da composição de acordo com areivindicação 40, no qual o gen da protease é flanqueado por interfaces deendonuclease de restrição contendo dois ácidos nucléicos, sendo que asinterfaces da endonuclease de restrição são compatíveis com aquelas dosoutros domínios de protease das neurotoxinas de Clostridium botulinum, pa-ra permitir sua troca modular fácil, enquanto que a semelhança da seqüênciade aminoácido é mantida.

43. Célula hospedeira, que contém um vetor de expressão re-combinante, sendo que o vetor de expressão codifica uma proteína detransporte como definida nas reivindicações 1 a 22, ou uma composição co-mo definida nas reivindicações 23 a 34.

44. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 43, na quala célula hospedeira pode ser uma célula de Escherichia coli, particularmenteE. CO//K12, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Bacillus megateri-um.

45. Vetor de expressão no qual o vetor abrange um ácido nucléi-co, que codifica uma proteína de transporte, como definida em uma das rei-vindicações 1 a 22, ou uma composição como definida em uma das reivindi-cações 23 a 34.