ES2653249T3 - Composiciones y métodos para ensayos de toxigenicidad - Google Patents

Composiciones y métodos para ensayos de toxigenicidad Download PDF

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Abstract

Un método de ensayo de una neurotoxina de Clostridium botulinum (BoNT) para actividad, que comprende: a) poner en contacto una célula neuronal derivada de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPS) con una composición que comprende una BoNT; y b) ensayar dicha BoNT para actividad biológica.

Description

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entornos nativos y algunas preparaciones farmacéuticas). Los ensayos descritos en la presente memoria son adecuados para la detección de cualquier número de serotipos de BoNT (por ejemplo, BoNT/A, B, C, D, E, F y G) o variantes o quimeras de los mismos. En algunas realizaciones, las BoNT se expresan recombinantemente. En otras realizaciones, se purifican de células bacterianas.
En algunas realizaciones, se llevan a cabo ensayos de protección de anticuerpos para probar anticuerpos neutralizantes. Aunque las BoNT se usan efectivamente en el tratamiento de un gran número de pacientes para varias afecciones (revisado en Dhaked et al., Indian J Med Res 132:489-503), algunos desarrollarán anticuerpos neutralizantes, los cuales evitarán el éxito de tratamientos adicionales. Por ejemplo, se estima en el tratamiento de distonías cervicales que ~5% de los pacientes tratados desarrollarán anticuerpos BoNT neutralizantes que impedirán el tratamiento adicional (Kessler et al., (1999) J Neurol 246: 265-274). Actualmente, los pacientes no son monitorizados durante el curso de sus tratamientos para el desarrollo de anticuerpos neutralizantes debido a que no está disponible comercialmente un ensayo altamente sensible y cuantitativo (Sesardic et al., (2004) Mov Disord 19 Supl 8: S85-91). La plataforma de ensayo presentada aquí que usa neuronas iPS proporciona una detección sensible y cuantitativa de anticuerpos neutralizantes de BoNT en los sueros de pacientes que han recibido inyecciones terapéuticas o cosméticas repetidas de BoNT. Los anticuerpos neutralizantes pueden detectarse en cualquier número de tipos de muestras (por ejemplo, anticuerpos purificados, suero, antitoxinas, etc.).
En algunas realizaciones, se ensayon inhibidores de molécula pequeña de BoNT (por ejemplo, para investigación o cribado de fármacos). Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células se exponen ya sea a la BoNT primero, luego al inhibidor, se co-exponen a ambos, o las células se exponen al inhibidor primero, luego a BoNT.
Cualquier número de mediciones de punto final adecuadas pueden utilizarse para ensayar la actividad de BoNT. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, transferencia Western, liberación de neurotransmisores, ELISA (Nuss JE, et al (2010) J Biomol Screen 15:42-51) o informadores expresados intracelularmente tales como, por ejemplo, sensores FRET (Dong et al, (2004) Proc Natl Acad Sci USA. 101: 14701-14706).
En algunas realizaciones, los ensayos descritos en la presente memoria encuentran uso en el ensayo de controles de calidad durante la producción de BoNT o derivados como fármacos o para uso en investigación, en la evaluación de diagnóstico, en la optimización y dosificación de tratamiento clínico y en la selección de modalidad terapéutica.
Las aplicaciones adicionales de los ensayos descritos en la presente memoria incluyen, pero no están limitadas a, detección de inhibidores y usos de diagnóstico, clínicos, crinado e investigación.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para ensayar una neurotoxina de Clostridium botulinum (BoNT) para actividad, que comprende: a) poner en contacto una célula neuronal derivada de hiPS con una composición que comprenda una BoNT; y b) ensayar la BoNT para actividad biológica.
En un aspecto de dicho método, el ensayo puede comprender determinar la presencia o ausencia de actividad biológica de BoNT. Este ensayo algunas veces puede ser referido en la presente memoria como ensayo cualitativo. Se entenderá que con base en la presencia o ausencia de actividad biológica de BoNT, puede concluirse sobre la presencia o ausencia de BoNT biológicamente activa en una composición que comprenda o se sospecha que comprende dicha BoNT biológicamente activa. Además, en otro aspecto más, el ensayo puede abarcar determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa en una composición que comprenda BoNT biológicamente activa. Se entenderá que la cantidad de BoNT biológicamente activa puede derivarse de la cantidad de actividad biológica ensayada para dicha BoNT en la composición. Este ensayo algunas veces puede referirse también como un ensayo cuantitativo en la presente memoria.
En un aspecto del método de la presente invención, la BoNT es una neurotoxina seleccionada de los diferentes grupos de serotipos para neurotoxinas clostridiales, por ejemplo, se selecciona de, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F o BoNT/G.
Las bacterias Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen naturalmente estas neurotoxinas altamente potentes, por ejemplo, toxinas botulínicas (BoNT) y toxina de tétanos (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas se unen específicamente a células neuronales e interrumpen la liberación de neurotransmisores. Cada toxina es sintetizada como una proteína de cadena única inactiva de aproximadamente 150 kDa. El procesamiento posterior a la traducción implica la formación de puentes disulfuro y proteólisis limitada (mellado) por proteasa o proteasas bacterianas. La neurotoxina de cadena doble activa consiste en dos cadenas, una cadena ligera N-terminal de aprox. 50 kDa y una cadena pesada de aprox. 100 kDa unidas por un enlace disulfuro. Las neurotoxinas consisten estructuralmente en tres dominios, por ejemplo, la cadena ligera catalítica, la cadena pesada que abarca el dominio de translocación (mitad N-terminal) y el dominio de unión a receptor (mitad C-terminal), véase, por ejemplo, Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49. Las estructuras de los polipéptidos BoNT y polipéptido TeNT han sido descritas en las referencias mencionadas anteriormente.
Los siete serotipos antigénicamente distintos de las BoNT y TeNT son endoproteasas Zn2+ que bloquean la exocitosis sináptica al escindir proteínas SNARE. Las neurotoxinas causan la parálisis muscular flácida vista en los trastornos de botulismo y tétanos, véase Fischer 2007, Proc Natl. Acad. Sci. USA 104, 10447.
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Un sitio de escisión de neurotoxina reconocido y escindido por la proteasa BoNT/E, en un aspecto de la invención, se derivan de una proteína que es sensible a escisión por BoNT/E. En un aspecto, dicha proteína es, SNAP-25A o B humana o un homólogo, parálogo u ortólogo de la misma de rata, ratón, bovino, Danio, Carassius, Xenopus, Torpedo, Strongylocentrotus, Loligo, Lymnaea o Aplisia. Los sitios de escisión adecuados derivados de las proteínas se describen, por ejemplo, en EP 1 926 744 B1.
Un sitio de escisión de neurotoxina reconocido y escindido por la proteasa BoNT/F, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a escisión por BoNT/F. En un aspecto, dicha proteína es, VAMP-1, VAMP2 y VAMP-3/celubrevina humana o de ratón, VAMP-2 de bovino, VAMP-2 o VAMP-3 de rata, VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus, VAMP-1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplisia o tipo SNB1 de Caenorhabditis o cualquier ortólogo, parálogo u homólogo de las mismas. Los sitios de escisión adecuados derivados de las proteínas se describen, por ejemplo, en EP 1 926 744 B1.
Un sitio de escisión de neurotoxina reconocido y escindido por la proteasa BoNT/G, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a escisión por BoNT/G. En un aspecto, dicha proteína es, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humana o de ratón, VAMP-2 de bovino, VAMP-2 o VAMP-3 de rata, VAMP-1, VAMP2 o VAMP-3 de pollo, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus, VAMP-1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplisia o tipo SNB1 de Caenorhabditis o cualquier ortólogo, parálogo u homólogo de las mismas. Los sitios de escisión adecuados derivados de las proteínas se describen, por ejemplo, en EP 1 926 744 B1.
Un sitio de escisión de neurotoxina reconocido y escindido por las proteasas de BoNT, en otro aspecto de la invención, se deriva de los sitios de escisión auto-catalíticos encontrados en las proteínas BoNT. En aspectos, un sitio de escisión de neurotoxina que se usará de acuerdo con la presente invención y que se deriva del sitio de escisión auto-catalítico de una BoNT o TeNT dada comprende al menos 6, al menos 8, al menos 10 o al menos 15 residuos consecutivos de incluyendo los residuos 250Tyr-251Tyr de BoNT/A, los residuos 256Phe-257Phe de BoNT/B, los residuos 257Phe-258Tyr de BoNT/C1, los residuos 257Phe-258Phe de BoNT/D, los residuos 239Pro240Leu de BoNT/E, los residuos 254Pro-255Leu de BoNT/F, los residuos 256Phe-257Phe de BoNT/G, los residuos 259Ile-260Tyr de TeNT, los residuos Phe266-Gly267 de BoNT/A, los residuos Phe272-Gly273 de BoNT/B, los residuos Phe273-Gly274 de BoNT/C1, los residuos Phe273-Gly274 de BoNT/D, los residuos Phe255-Gly256 de BoNT/E, los residuos Phe270-Gly271 de BoNT/F, los residuos Phe272-Gly273 de BoNT/G o los residuos Phe275-Gly276 de TeNT. Los sitios de escisión adecuados derivados de las proteínas se describen, por ejemplo en EP 1 926 744 B1.
En un aspecto de la presente invención, la escisión de los sitios de escisión de neurotoxina mencionados anteriormente para las BoNT se puede ensayar al determinar uno o más productos de escisión obtenidos por la escisión de las proteínas mencionadas anteriormente. Los productos derivados de las proteínas pueden determinarse por anticuerpos que se unan específicamente a dichos productos escindidos, pero no a las proteínas no escindidas. La unión de dichos anticuerpos de unión específica a los productos puede determinarse por técnicas descritas en la presente o en cualquier lado. Por ejemplo, los anticuerpos de unión específica pueden ser unidos covalente o no covalentemente a un marcador detectable. Dicho marcador detectable puede ser un resto detectable unido covalentemente al anticuerpo de unión específica o puede ser un agente de detección, tal como un anticuerpo de detección o aptámero que se una específicamente al anticuerpo de unión específica y permita la detección, por ejemplo, por medio de un esto detectable unido covalentemente al mismo. Varios tipos de estos inmunoensayos pueden usarse de esta manera para determinar los productos escindidos y, de esta forma, para ensayar la actividad biológica de una BoNT.
En un aspecto, la escisión de proteínas que tienen un sitio de escisión de neurotoxina como las definidas en la presente memoria puede determinarse por Transferencia Western. En otro aspecto, dicha escisión puede determinarse por ELISA, RIA u otros formatos de ensayo inmunológico incluyendo aquellos mencionados en cualquier lado en la presente memoria.
En otro aspecto, puede usarse un substrato artificial que comprenda un sitio de escisión de neurotoxina como el especificado arriba y el cual después de la escisión en dicho sitio se altere en por lo menos una propiedad física y/o química. Por ejemplo, los substratos contemplados en tal aspecto pueden comprender un primer y un segundo resto capaces de interactuar físicamente y/o químicamente entre sí y ser separados por un enlazador que tenga el sitio de escisión de neurotoxina. Como resultado de la escisión del sitio de escisión, la interacción antes mencionada entre
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los dos restos se alterará. Los restos adecuados son, por ejemplo, fluoróforos donadores y aceptores que exhiban transferencia de energía por resonancia en el estado no escindido, siendo interrumpida dicha transferencia de energía por resonancia después de la escisión. Como alternativa, un fluoróforo y un apantallador pueden aplicarse en donde el efecto de apantallamiento del apantallador se invierte después de la escisión. Los substratos de este tipo se describen, por ejemplo, en una cualquiera de EP 1 438 586 B1, EP 2 208 067 A1, EP 1 543 329 A2, EP 1 869 459 B1, EP 2 293 064 B1, EP 1 920 248 B1, EP 2 264 458 A1, EP 2 332 959 A2, WO 2011/47241, EP 1 901 069 B1, EP 2 293 064 B1, EP 1 807 698 B1 o EP 2 107 112 B1.
En otro aspecto específico más del método de la invención, el ensayo se lleva a cabo al determinar la cantidad de SNAP-25 escindida presente en la célula neuronal derivada de células hiPS al determinar la cantidad de SNAP-25 escindida usando un primer anticuerpo y, en un aspecto, un anticuerpo monoclonal que se una específicamente a dicha SNAP-25 escindida. Más aún, la SNAP-25 total presente en las células, por ejemplo, SNAP-25 escindida y no escindida, se determina por un segundo anticuerpo, y, en un aspecto, un anticuerpo policlonal que se une a dicha SNAP-25 total. En un aspecto, la cantidad de primer anticuerpo unido y la cantidad de segundo anticuerpo unido puede determinarse por un agente de detección, en un aspecto, por uno o más anticuerpos de detección que permitan distinguir entre la cantidad de primer anticuerpo unido y la cantidad de segundo anticuerpo unido. Por ejemplo, puede usarse un primer anticuerpo de detección acoplado a un primer marcador y la unión al primer anticuerpo y un segundo anticuerpo de detección acoplado a un segundo marcador y la unión al segundo anticuerpo unido. La cantidad de primer anticuerpo unido y segundo anticuerpo unido y, de esta manera, la cantidad de SNAP25 escindida y total se puede derivar subsecuentemente a partir de la cantidad de primero y segundo marcadores determinados. En un aspecto, un primer marcador contemplado en la presente memoria puede ser una enzima tal como peroxidasa de rábano. En otro aspecto, un segundo marcador contemplado en la presente memoria puede ser una enzima tal como una fosfatasa alcalina. Los marcadores pueden usarse para catalizar una conversión detectable de substratos no fluorescentes en productos fluorescentes.
En otro aspecto más del método de la invención, el ensayo se lleva a cabo al determinar liberación de neurotransmisores, por ejemplo, en el medio de cultivo. La cantidad de neurotransmisores liberados o no liberados puede determinarse por técnicas descritas en la presente memoria o en cualquier lado.
Ventajosamente, los métodos contemplados por la presente invención se basan en recursos no animales, por ejemplo, las células neuronales derivadas de células hiPS, y, por lo tanto, se evitan ensayos con animales. Las células neuronales derivadas de células hiPS, no obstante, permiten probar todas las actividades biológicas de las BoNT requeridas, por ejemplo (a) unión a receptor, (b) internalización, (c) translocación a través de la membrana endosómica al citosol, y/o (d) escisión endoproteolítica de proteínas implicadas en fusión de membranas de vesículas sinápticas. En consecuencia, los métodos pueden usarse para medidas de control de seguridad o calidad, así como para el desarrollo de BoNT con propiedades biológicas modificadas que requieran normalmente, por ejemplo, enfoques de cribado a gran escala.
La presente invención se refiere también a un método para determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa en una preparación que comprenda BoNT biológicamente activa, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una célula neuronal derivada de células hiPS con una muestra de dicha preparación; y (b) determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa presente en la preparación al ensayar la muestra para la actividad biológica de BoNT.
La invención también se refiere al uso de la célula neuronal derivada de células hiPS para ensayar actividad de BoNT en una composición como se especifica en otro lugar en la presente memoria.
En un aspecto, el ensayo abarca determinar la presencia o ausencia de actividad de BoNT y/o BoNT biológicamente activa. El ensayo cualitativo para BoNT biológicamente activa puede ser usado, por ejemplo, en aplicaciones que tengan como objetivo la evaluación de riesgos para de esta manera prevenir cualquier daño causado por las BoNT, por ejemplo, como medida de control de seguridad durante el proceso de fabricación o durante las aplicaciones farmacéuticas o cosméticas de las BoNT o para prevenir conductas criminales basadas en BoNT, tales como bioterrorismo.
En otro aspecto, el ensayo abarca determinar la cantidad de actividad BoNT y/o BoNT biológicamente activa. El ensayo cuantitativo para BoNT biológicamente activa puede usarse durante el proceso para la fabricación de BoNT
o para ajustar una dosis adecuada de BoNT biológicamente activa para aplicaciones cosméticas o farmacéuticas. En consecuencia, este ensayo también puede ser útil como un medio para el control de calidad o para la formulación de productos farmacéuticos o cosméticos adecuados.
La invención se refiere también al uso de la célula neuronal derivada de células hiPS para determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa en una preparación que comprenda dicha BoNT biológicamente activa como se especifica en otro lugar de la presente memoria.
Sección experimental
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar más ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención y no se deben considerar como limitativos del alcance de la misma.
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VAMP2 (Hs00360269_m1); VAMP3 (Hs00922166_m1); SV2A (Hs00372069_m1); SV2B (Hs00208178_m1); SV2C (Hs00392676_m1); SYT1 (Hs00194572_m1); SYT2 (Hs00980604_m1) y el conjunto de cebadores de control endógenos de GAPDH humana (todos de Life Technologies). El análisis derivativo Quant/2° se llevó a cabo en todas las muestras y los valores Cp se convirtieron en cambio en veces relativo mediante normalización a la Cp para la expresión de GAPDH endógeno. Se calcularon los promedios y desviación estándar para cada gen dentro de las tres réplicas biológicas. Las reacciones de PCR cuadruplicadas técnicas se llevaron a cabo para cada gen.
Ensayos de captación de BoNT/A1 dependiente de actividad: BoNT/A1 se diluyó hasta una concentración de 55 ó 275 U por 50 µl de estimulación celular (medio neurobasal personalizado de Invitrogen que contenía 2,2 mM de CaCl y 56 mM de KCl, suplementado con B27 y glutamax) o medios neuronales y se añadieron a neuronas iPS de CDI maduradas durante 4 días y células RSC. Las células fueron incubadas con toxina durante 1, 5, 10 y 15 minutos respectivamente. Para el control negativo, el medio respectivo sin toxina se añadió a las células. La toxina fue retirada y las células se lavaron inmediatamente dos veces con 200 µl de medio neuronal seguido por incubación en 200 µl de medio neuronal fresco durante 24 h. Las muestras se recogieron en réplicas de 4.
Para determinar la concentración de toxina requerida mínima para captación dependiente de actividad de BoNT/A1 dentro de 5 min, la toxina se diluyó a concentraciones de entre 1,72 a 55 U por 50 µl de medio de estimulación celular. Las neuronas iPS maduradas cuatro días fueron expuestas a las diluciones de toxina durante 5 min, seguido por eliminación de toxina y dos lavados con medio neuronal e incubación en medio neuronal durante 24 h. Todas las diluciones se probaron en réplicas de 4.
Análisis de protección de anticuerpos: se prepararon anticuerpos específicos para BoNT/A1 de acuerdo con Johnson et al., 1993. La inhibición de la actividad de BoNT/A1 en neuronas iPS por anticuerpos neutralizantes se analizó usando dos métodos diferentes. Para el primer ensayo, 55 U de BoNT/A1 se combinaron con anticuerpo diluido en serie en medio de estimulación celular y se incubaron durante 1 h a 37°C para permitir la interacción anticuerpo-toxina. Las neuronas iPS maduradas 4 días fueron expuestas a la mezcla toxina-anticuerpo durante 5 minutos, seguido de retirada de la mezcla toxina-anticuerpo y dos etapas de lavado con medio neuronal e incubación en medio neuronal durante 24 h. Para el segundo ensayo, 1,5 U de BoNT/A se combinaron con diluciones en serie de anticuerpo en medio neuronal y se incubó a 37°C durante 1 h. Las neuronas iPS fueron expuestas a las mezclas toxina-anticuerpo durante 24 h. La comparación con el bioensayo de ratón usó dilución en serie del anticuerpo pre-incubado con 5-10 U de BoNT/A1 durante 1,5 h a temperaturas ambiente en un volumen de 167 µl. El volumen se ajustó a 500 microlitros y se inyectó en cuatro ratones por dilución.
B. Resultados
Las neuronas iPS expresan receptores importantes para la intoxicación por BoNT: Con el fin de determinar si las neuronas derivadas de iPS humana pueden usarse para detectar la actividad de BoNT, la expresión de los receptores y dianas enzimáticas necesarias para la entrada en las células y la actividad catalítica de BoNT se analizaron por transferencia Western y PCR cuantitativa (qPCR), respectivamente (Figura 1). La transferencia Western dio como resultado señales para SV2A, una banda tenue para SV2B, sinaptotagmina 1, sintaxina, SNAP25, VAMP2 y beta-actina, que no cambió durante un periodo de tiempo de 21 días después del plaqueo de las células (Figura 1A). Aunque VAMP2 se detectó con un anticuerpo específico para VAMP2, un anticuerpo que reconoce las tres isoformas de VAMP no dio como resultado ninguna señal, indicando que VAMP 2 es la isoforma de VAMP predominante en neuronas iPS. El lisado de células de médula espinal de rata primarias fue usado como un control positivo para la detección de anticuerpos, y las diferentes intensidades en bandas de neuronas iPS frente a células RSC puede deberse a reconocimiento diferencial por el anticuerpo o a niveles de expresión diferentes. El análisis de niveles de ARNm de las mismas proteínas por qPCR indicó la expresión de todas las proteínas analizadas (Figura 2B) incluyendo SV2 isoformas B y C, sinaptotagmina 2 y VAMP1 y 3, que no fueron detectadas por transferencia Western. Sin embargo, los niveles de ARNm de esas isoformas fueron al menos 200 veces más bajos que aquellos de las isoformas detectadas por transferencia Western (SV2A, sinaptotagmina 1 y VAMP2). Así, los datos de qPCR corroboran los datos de transferencia Western e indican que las neuronas iPS expresan principalmente las isoformas SV2A, sinaptotagmina 1 y VAMP 2 de estas proteínas, lo cual es consistente con las neuronas que representan neuronas de prosencéfalo (Janz R y Sudhof TC (1999) Neuroscience 94: 1279-1290). Los niveles de expresión de todas las proteínas no cambiaron a lo largo del periodo de estudio, indicando que las células son completamente maduradas a los 4 días después del plaqueo y permanecen estables durante al menos 21 días.
La matriz de superficie no tiene influencia en la calidad de las células para el ensayo de BoNT/A1: Para determinar si la matriz de plaqueo tenía influencia en la sensibilidad a BoNT, las neuronas plaqueadas en siete matrices diferentes fueron probadas para sensibilidad a BoNT/A1. Las neuronas se fijaron y maduraron sobre todas las matrices, formando una red creciente de axones y dendritas. Se observaron diferencias morfológicas significativas entre las células cultivadas en placas con o sin laminina o matrigel. Las células cultivadas en laminina PDL (BD Biosciences) o placas de matrigel o en placas de laminina PLO (Cellular Dynamics) o matrigel crecieron principalmente en una monocapa, pero formaron algunos agregados con axones largos extendiéndose desde ellas, principalmente alrededor del perímetro de las placas. En contraste, las células cultivadas en placas PLO o PDL permanecieron en una sola monocapa de células con axones y dendritas extendiéndose entre las redes de células. Las células cultivadas en laminina PLO (BD Biosciences) se asemejaron a células cultivadas en placas PLO o PDL.
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