BRPI0610462A2 - evento de elite a5547-127 e métodos e kits para identificar tal evento em amostras biológicas - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a ferramentas as quais permitem a identificação rápida e inequívoca do evento de elite A5547-127 em amostras biológicas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EVENTO DEELITE A5547-127 E MÉTODOS E KITS PARA IDENTIFICAR TAL EVENTOEM AMOSTRAS BIOLÓGICAS".
Campo da invenção
A presente invenção refere-se a métodos e kits para identifica-ção em amostras biológicas da presença de material vegetal, compreenden-do especificamente o evento de transformação A5547-127, assim comoplantas de soja transgênicas, material vegetal e sementes contendo tal even-to. As plantas de soja da invenção combinam o fenótipo tolerante herbicidacom um desempenho agronômico, estabilidade genética e adaptabilidade adiferentes cenários genéticos equivalentes à linhagem de soja não-transformada na ausência de pressão de ervas daninhas.
Antecedentes da invenção
A expressão fenotípica de um transgene em uma planta é de-terminada tanto pela própria estrutura do gene quanto pela sua localizaçãono genoma da planta. Ao mesmo tempo a presença do transgene (em umDNA estrangeiro) em diferentes locais no genoma irá influenciar o fenótipoglobal da planta de diferentes formas. A introdução agronomicamente ouindustrialmente bem-sucedida de uma característica comercialmente inte-ressante em uma planta por manipulação genética pode ser um procedimen-to demorado dependente de diferentes fatores. A verdadeira transformaçãoe regeneração das plantas geneticamente transformadas são somente oprimeiro em uma série de etapas de seleção, os quais incluem a extensivacaracterização genética, criação e avaliação em testes de campo, eventual-mente levando à seleção de um evento de elite.
A identificação inequívoca de um evento de elite está se tornan-do crescentemente importante em vista das discussões de novos alimen-tos/ração, segregação de produtos GMO e não-GMO e da identificação dematerial proprietário. Idealmente, tal método de identificação é tanto rápidoquanto simples, sem a necessidade de um estabelecimento laboratorial ex-tensivo. Além disso, o método deve proporcionar resultados que permitam adeterminação inequívoca do evento de elite sem a interpretação perita, maso qual mostre sob um exame minucioso perito, caso necessário.
A5547-127 foi selecionado como um evento de elite no desen-volvimento da soja (Glycine max L.) resistente ao herbicida Liberty®, pelatransformação da soja com um plasmídeo compreendendo o gene pat sinté-tico codificando tolerância à fosfinotricina e pode ser comercialmente vendi-da como soja Liberty Link®. As ferramentas para uso em métodos simples einequívocos para a identificação do evento de elite A5547-127 em amostrasbiológicas são aqui descritas.
Sumário da invenção
A presente invenção refere-se a métodos para identificar o even-to de elite A5547-127 em amostras biológicas, cujos métodos são baseadosem iniciadores ou sondas as quais reconhecem especificamente a seqüên-cia flanqueadora 5' e/ou 3' do A5547-127.
Mais especificamente, a invenção refere-se a um método compreendendo aamplificação da seqüência de um ácido nucléico presente em amostras bio-lógicas, usando uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos doisiniciadores, um dos quais reconhece a região flanqueadora 5' ou 3' doA5547-127, a outra a qual reconhece uma seqüência no DNA estrangeiro,preferivelmente para obter um fragmento de DNA de entre 100 e 500 bp. Osiniciadores podem reconhecer uma seqüência na região flanqueadora 5' doA5547-127 (SEQ ID NO: 1, da posição 1 até a posição 311) ou na regiãoflanqueadora 3" do A5547-127 (complemento da SEQ ID NO: 2 da posição510 até a posição 1880) e uma seqüência no DNA estrangeiro (complemen-to da SEQ ID NO: 1 da posição 312 até a 810 ou a SEQ ID NO: 2 da posição1 até a posição 510), respectivamente. O iniciador reconhecendo a regiãoflanqueadora 5' pode compreender a seqüência de nucleotídeos da SEQ IDNO: 15 e o iniciador reconhecendo uma seqüência no DNA estrangeiro podecompreender a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 aqui descrita.
A presente invenção, mais especificamente, de refere a um mé-todo para identificar o evento de elite A5547-127 em amostras biológicas,cujo método compreende a amplificação de uma seqüência de um ácido nu-cléico presente em uma amostra biológica, usando uma reação em cadeiada polimerase com dois iniciadores com a seqüência de nucleotídeos daSEQ ID NO: 15 e a SEQ ID NO: 13 respectivamente, para obter um frag-mento de DNA de cerca de 151 bp.
A presente invenção ainda refere-se às seqüências flanqueado-ras específicas do A5547-127, aqui descrita, a qual pode ser usada para de-senvolver métodos de identificação específicos para A5547-127 em amos-tras biológicas. Mais particularmente, a invenção refere-se às regiões flan-queadoras 5' e 3' do A5547-127, as quais podem ser usadas para o desen-volvimento de iniciadores específicos e sondas, conforme adicionalmenteaqui descrito. A invenção ainda refere-se a métodos de identificação para apresença do A5547-127 em amostras biológicas baseando-se no uso detais iniciadores ou sondas específicas. As sondas podem consistir em umaseqüência de nucleotídeos de 17 até cerca de 200 nucleotídeos consecuti-vos selecionados da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 do nucleo-tídeo 1 até o nucleotídeo 311, ou o complemento da seqüência de nucleotí-deos da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880) combi-nada com os iniciadores consistindo em uma seqüência de nucleotídeos de17 até cerca de 200 nucleotídeos consecutivos selecionados do complemen-to de uma seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 312até o nucleotídeo 810 ou a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 donucleotídeo 1 até o nucleotídeo 510. Os iniciadores também podem compre-ender essas seqüências de nucleotídeos localizadas nas suas extremidades3' extremas, e ainda compreender seqüências não-relacionadas ou seqüên-cias derivadas das seqüências de nucleotídeos mencionadas, mas compre-endendo maus emparelhamentos.
A invenção refere-se ainda a kits para identificar o evento deelite A5547-127 em amostras biológicas, os referidos kits compreendendopelo menos um iniciador ou sonda, a qual reconhece especificamente aregião flanqueadora 5'ou 3'do A5547-127.
O kit da invenção pode compreender, além de um iniciador oqual reconhece especificamente a região flanqueadora 5' ou 3' do A5547-127, um segundo iniciador o qual reconhece especificamente uma seqüênciano DNA estrangeiro de A5547-127, para uso em um protocolo de identifica-ção de PCR. Preferivelmente, o kit da invenção compreende dois iniciadoresespecíficos, um dos quais reconhece uma seqüência na região flanqueadora5' do A5547-127, e a outra a qual reconhece uma seqüência no DNA estran-geiro. Especialmente o iniciador reconhecendo a região flanqueadora 5' po-de compreender a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 14 e o inicia-dor reconhecendo o transgene pode compreender a seqüência de nucleotí-deos da SEQ ID NO: 13 ou qualquer outro iniciador, conforme aqui descrito.
A invenção refere-se ainda a um kit para identificar o evento deelite A5547-127 em amostras biológicas, o referido kit compreendendo osiniciadores de PCR com a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 eSEQ ID NO: 15 para uso no protocolo de identificação de PCR aqui descrito.
A invenção também se refere a um kit para identificar o eventode elite A5547-127 em amostras biológicas, cujo kit compreende uma sondaespecífica com uma seqüência a qual corresponde (ou é complementar a)uma seqüência com entre 80% e 100% de identidade de seqüência comuma região específica do A5547-127. Preferivelmente a seqüência da sondacorresponde a uma região específica compreendendo parte da região flan-queadora 5' ou 3' do A5547-127. Mais preferivelmente a sonda específicatem (ou é complementar a) uma seqüência com entre 80% e 100% de iden-tidade de seqüência com a seqüência entre o nucleotídeo 360 e 460 da SEQID NO: 1 ou a seqüência entre o nucleotídeo 460 e 560 da SEQ ID NO: 2.
Os métodos e kits englobados pela presente invenção podemser usados para diferentes propósitos tais como, porém não limitados, aosseguintes: para identificar a presença ou ausência de A5547-127 em plan-tas, material vegetal ou em produtos tais como, mas não limitados, a produ-tos alimentícios ou de ração (frescos ou processados) compreendendo ouderivados de material vegetal; adicionalmente ou alternativamente, os méto-dos e kits da presente invenção podem ser usados para identificar materialde planta transgênica para propósitos de segregação entre material transgê-nico e não-transgênico; adicionalmente ou alternativamente, os métodos ekits da presente invenção podem ser usados para determinar a qualidade(isto é, a porcentagem de material puro) de material vegetal compreendendoA5547-127.
A invenção ainda refere-se às regiões flanqueadoras 5' e/ou 3'de A5547-127, assim como aos iniciadores e sondas específicos desenvol-vidos das seqüências flanqueadoras 5'e/ou 3'do A5547-127.
A invenção também se refere a plantas de soja, suas partes,células, sementes e plantas da progênie, compreendendo o evento de eliteA5547-127. Tais plantas, suas partes, células, sementes e plantas da progê-nie podem ser identificados usando os métodos conforme aqui descritos.
Descrição Detalhada
A incorporação de uma molécula de DNA recombinante no ge-noma da planta resulta tipicamente da transformação de uma célula ou teci-do (ou de outra manipulação genética). O sítio particular de incorporação éou devido à integração "aleatória" ou está em um local predeterminado (seum processo de integração alvejada for usado).
O DNA introduzido no genoma da planta como um resultado datransformação de uma célula ou tecido vegetal com um DNA recombinanteou "DNA transformante", e originado de tal DNA transformante, é de agoraem diante referido como "DNA estrangeiro" compreendendo um ou mais"transgenes". "DNA vegetal" no contexto da presente invenção, irá se referirao DNA originado da planta a qual é transformada. DNA vegetal será usual-mente encontrado no mesmo local genético na correspondente planta detipo selvagem. O DNA estrangeiro pode ser caracterizado pelo local e pelaconfiguração no sítio de incorporação da molécula de DNA recombinante nogenoma vegetal. O sítio no genoma vegetal onde um DNA recombinante foiinserido é também referido como o "sítio de inserção" ou "sítio alvo". A inser-ção do DNA recombinante no genoma da planta pode ser associada a umaanulação do DNA vegetal, referida como a "anulação do sítio alvo". Uma "re-gião flanqueadora" ou "seqüência flanqueadora", conforme aqui utilizada,refere-se a uma seqüência de pelo menos 20 bp, preferivelmente pelo me-nos 50 bp, e até 5000 bp do genoma da planta, o qual está localizado ouimediatamente à montante de um contíguo com ou imediatamente à jusantede um contíguo com o DNA estrangeiro. Os procedimentos de transforma-ção levando à integração aleatória do DNA estrangeiro irão resultar emtransformantes com diferentes regiões flanqueadoras, as quais são caracte-rísticas e únicas para cada transformante. Quando o DNA recombinante éintroduzido em uma planta através de cruzamento tradicional, seu sítio deinserção no genoma da planta, ou suas regiões flanqueadoras, não serãogeralmente alteradas. Uma "região de inserção", conforme aqui utilizada,refere-se à região correspondente à região de pelo menos 40 bp, preferivel-mente pelo menos 100 bp, e até 10000 bp, englobadas pela seqüência aqual compreende a região flanqueadora à montante e/ou à jusante de umDNA estrangeiro no genoma da planta. Levando em consideração diferençasmínimas devido às mutações em uma espécie, uma região de inserção iráreter, no cruzamento em uma planta da mesma espécie, pelo menos 85%,preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95% e mais preferivelmente100% da identidade de seqüência com a seqüência compreendendo as regi-ões flanqueadoras à montante e à jusante do DNA estrangeiro em uma plan-ta originalmente obtida da transformação.
Um evento é definido como um local genético "artificial" que,como resultado de uma engenharia genética, carrega um transgene com-preendendo pelo menos uma cópia de um gene de interesse. Os estadosalélicos típicos de um evento são a presença ou ausência do DNA estrangei-ro. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do transgene.No nível genético, um evento é parte da composição genética de uma plan-ta. A nível molecular, um evento pode ser caracterizado pelo mapa de restri-ção (por exemplo, conforme determinado por "Southern blotting"), pelas se-qüências flanqueadoras à montante e/ou à jusante do transgene, pelo localde marcadores moleculares e/ou pela configuração molecular do transgene.Geralmente a transformação de uma planta com um DNA transformantecompreendendo pelo menos um gene de interesse leva a uma multidão déeventos, cada um dos quais é único.
Um evento de elite, conforme aqui usado, é um evento o qual éselecionado de um grupo de eventos, obtidos pela transformação com omesmo DNA transformante ou pelo cruzamento reverso com plantas obtidaspor tal transformação, baseando-se na expressão e estabilidade do(s) trans-gene(s) e na sua compatibilidade com características agronômicas ótimas daplanta que o compreende. Conseqüentemente, os critérios para a seleção doevento de elite são um ou mais, preferivelmente dois ou mais, vantajosa-mente todos os seguintes:
a) que a presença do DNA estrangeiro não compromete outrascaracterísticas desejadas da planta, tais como aquelas relacionadas com odesempenho agronômico ou com o valor comercial;
b) que o evento é caracterizado por uma configuração molecularbem definida a qual é estavelmente herdada e para a qual ferramentas a-propriadas para controle de identidade podem ser desenvolvidas;
c) que o(s) gene(s) de interesse mostra(m) uma expressão feno-típica correta, apropriada e espacialmente e temporalmente estável, tanto nacondição heterozigótica (ou hemizigótica) quanto homozigótica do evento,em um nível comercialmente aceitável em uma faixa de condições ambien-tais na qual as plantas carregando o evento são propensas a serem expos-tas em uso agronômico normal.
É preferido que o DNA estrangeiro esteja associado a uma posi-ção no genoma da planta que permita a fácil introgressão nos motivos gené-ticos comerciais desejados.
O status de um evento como um evento de elite é confirmadopela introgressão do evento de elite em diferentes fundos genéticos relevan-tes e observando a complacência com um, dois ou todos os critérios, porexemplo, a), b) e c) acima.
Um "evento de elite", conseqüentemente, refere-se a um localgenético compreendendo um DNA estrangeiro, o qual responde aos critériosacima descritos. Uma planta, material vegetal ou progênie, tal como semen-tes, pode compreender um ou mais eventos de elite em seu genoma.
As ferramentas desenvolvidas identificam um evento de elite daplanta, o material vegetal compreendendo um evento de elite, ou produtosos quais compreendem material vegetal compreendendo o evento de elitesão baseados nas características genomicas específicas do evento de elite,tal como um mapa de restrição específico da região genômica compreen-dendo o DNA estrangeiro, marcadores moleculares ou a seqüência da(s)região(ões) flanquedora(s) do DNA estrangeiro.
Uma vez que uma ou ambas as regiões flanqueadoras do DNAestrangeiro tenham sido seqüenciadas, iniciadores e sondas podem ser de-senvolvidos, os quais reconhecem especificamente essa (essas) seqüen-ciais) no ácido nucléico (DNA ou RNA) de uma amostra através de uma téc-nica biológica molecular. Por exemplo, um método de PCR pode ser desen-volvido para identificar o evento de elite em amostras biológicas (tais comoamostras de plantas, material vegetal ou produtos compreendendo materialvegetal). Tal PCR é baseado em pelo menos dois "iniciadores" específicos,um reconhecendo uma seqüência na região flanqueadora 5' ou 3' do eventode elite e o outro reconhecendo uma seqüência no DNA estrangeiro. Os ini-ciadores preferivelmente têm uma seqüência de entre 15 e 35 nucleotídeos,os quais sob condições otimizadas de PCR, "reconhecem especificamente"uma seqüência na região flanqueadora 5' ou 3' do evento de elite e o DNAestrangeiro do evento de elite respectivamente, de forma que um fragmentoespecífico ("fragmento de integração ou amplicon discriminante) seja ampli-ficado a partir de uma amostra de ácido nucléico compreendendo o eventode elite. Isso significa que somente o fragmento de integração alvejado, enenhuma outra seqüência no genoma vegetal ou DNA estrangeiro, é amplifi-cado sob condições de PCR otimizadas.
Iniciadores de PCR adequados para a invenção podem ser osseguintes:
- oligonucleotídeos variando em comprimento de 17 nt até cercade 300 nt, compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos17 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente 20 nucleotídeos consecutivosselecionados da seqüência flanqueadora 5' (SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 1até o nucleotídeo 311) na sua extremidade 3' (iniciadores reconhecendo se-qüências flanqueadoras 5'); ou
- oligonucleotídeos variando em comprimento de 17 nt até cercade 300 nt, compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos17 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente 20 nucleotídeos consecutivosselecionados da seqüência flanqueadora 3' (complemento da SEQ ID NO: 2do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880) na sua extremidade 3' (iniciado-res reconhecendo seqüências flanqueadoras 3'); ou
- oligonucleotídeos variando em comprimento de 17 nt até cercade 510 nt, compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos17 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente 20 nucleotídeos selecionadosdas seqüências de DNA inseridas (complemento da SEQ ID NO: 1 do nucle-otídeo 312 até o nucleotídeo 810) na sua extremidade 3' (iniciadores reco-nhecendo DNA estrangeiro) ou
- oligonucleotídeos variando em comprimento de 17 nt até cercade 300 nt, compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos17 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente 20 nucleotídeos selecionadosdas seqüências de DNA inseridas (SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 1 ao nucle-otídeo 509).
Os iniciadores podem, é claro, ser mais longos do que os 17 nu-cleotídeos consecutivos, e podem ser, por exemplo, de 20, 21, 30, 35, 50,75, 100, 150, 200 nt de comprimento ou ainda mais longos. Os iniciadorespodem consistir completamente na seqüência de nucleotídeos selecionadadas seqüências de nucleotídeo mencionadas ou das seqüências flanqueado-ras e das seqüências de DNA estrangeiro. Entretanto, a seqüência de nucle-otídeos dos iniciadores nas suas extremidades 5' (isto é, foram dos 17 nu-cleotídeos consecutivos localizados em 3') é menos crítica. Conseqüente-mente, a seqüência 5' dos iniciadores pode consistir em uma seqüência denucleotídeos selecionada das seqüências flanqueadoras ou de DNA estran-geiro, conforme apropriado, mas pode conter várias (por exemplo, 1, 2, 5, 10maus emparelhamentos). A seqüência 5' dos iniciadores pode mesmo com-pletamente consistir em uma seqüência de nucleotídeos não-relacionadacom as seqüências flanqueadoras ou com o DNA estrangeiro, tais como, porexemplo, uma seqüência de nucleotídeos representando sítios de reconhe-cimento de enzimas de restrição. Tais seqüências não-relacionadas ou se-qüências de DNA flanqueadoras com maus emparelhamentos não deve pre-ferencialmente ser mais longas do que 100, mais preferivelmente não sermais longas do que 50 ou mesmo 25 nucleotídeos.
Além disso, iniciadores adequados podem compreender ou con-sistir em uma seqüência de nucleotídeos nas suas extremidades 3', se es-tendendo na região de junção entre as seqüências derivadas de DNA vege-tal e as seqüências de DNA estrangeiro (localizados nos nucleotídeos 311 -312 na SEQ ID NO: 1 e nos nucleotídeos 509 - 510 na SEQ ID NO: 2), coma condição de que os 17 nucleotídeos consecutivos localizados em 3' men-cionados não são derivados exclusivamente ou do DNA estrangeiro ou dasseqüências derivadas de plantas na SEQ ID NO: 1 ou 2.
Conseqüentemente, iniciadores de PCR para a invenção tam-bém podem ser os seguintes:
- oligonucleotídeos variando em comprimento de 17 nt até cercade 300 nt, compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos17 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente 20 nucleotídeos consecutivosselecionados da SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 325) nassuas extremidades 3'; ou
- oligonucleotídeos variando em comprimento de 17 nt até cercade 300 nt, compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos17 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente 20 nucleotídeos consecutivosselecionados da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 495 até o nucleotídeo 1880)na sua extremidade 3'; ou
- oligonucleotídeos variando em comprimento de 17 nt até cercade 300 nt, compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos17 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente 20 nucleotídeos selecionadosdo complemento da SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 295 até o nucleotídeo810) na sua extremidade 3' ou
- oligonucleotídeos variando em comprimento de 17 nt até cercade 300 nt, compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos17 nucleotídeos consecutivos, preferivelmente 20 nucleotídeos selecionadosda SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 525).Também é imediatamente claro para o artífice habilitado quepares de iniciadores de PCR propriamente selecionados não devem tambémcompreender seqüências as quais sejam complementares umas às outras.
Para o propósito da invenção, o "complemento de uma seqüên-cia de nucleotídeos representada na SEQ ID NO: X" é a seqüência de nu-cleotídeos a qual pode ser derivada da seqüência de nucleotídeo represen-tada pela substituição dos nucleotídeos através de seus nucleotídeos com-plementares de acordo com as regras de Chargaff (A <=> T; G <=> C) e lendo aseqüência na direção 5' até 3', isto é, em direção oposta da seqüência denucleotídeos representada.
Exemplos dos iniciadores adequados são as seqüências de oli-gonucleotídeos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 (seqüênciaflanqueadora 5' que reconhece iniciadores) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 (DNA estrangeiro reconhe-cendo iniciadores para uso com a seqüência flanqueadora 5' que reconheceiniciadores) SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:14 (DNA estrangeiro reconhecendo iniciadores para uso com a seqüênciaflanqueadora 3' que reconhece iniciadores) SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16ou SEQ ID NO: 17 (seqüência flanqueadora 3' que reconhece iniciadores).
Outros exemplos de iniciadores de oligonucleotídeos adequadoscompreendem nas suas extremidades 3' as seguintes seqüências ou consis-tem em tais seqüências:
a. seqüência flanqueadora 5' que reconhece iniciadores:
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 45até o nucleotídeo 64
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91 do nucleotídeo 22até o nucleotídeo 41
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 47até o nucleotídeo 64
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1 do nucleotídeo183 até o nucleotídeo 202
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo184 até o nucleotídeo 203
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo301 até o nucleotídeo 320
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo303 até o nucleotídeo 322
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo306 até o nucleotídeo 325
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91 do nucleotídeo 36até o nucleotídeo 55
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo182 até o nucleotídeo 202
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo183 até o nucleotídeo 203
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo184 até o nucleotídeo 202
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1 do nucleotídeo185 até o nucleotídeo 203
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ng 1 do nucleotídeo185 até o nucleotídeo 204
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo
292 até o nucleotídeo 311
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo295 até o nucleotídeo 314
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 1 do nucleotídeo307 até o nucleotídeo 325
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91 do nucleotídeo 8até o nucleotídeo 27
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 10até o nucleotídeo 29
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91 do nucleotídeo 11até o nucleotídeo 30
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 13até o nucleotídeo 32
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 20até o nucleotídeo 41
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 35até o nucleotídeo 54
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N-1 do nucleotídeo 37até o nucleotídeo 55
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 66até o nucleotídeo 85
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 67até o nucleotídeo 86
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1 do nucleotídeo 68até o nucleotídeo 87
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo181 até o nucleotídeo 202
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo182 até o nucleotídeo 203
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo184 até o nucleotídeo 204
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo185 até o nucleotídeo 202
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 1 do nucleotídeo186 até o nucleotídeo 204
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ns 1 do nucleotídeo186 até o nucleotídeo 203
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Nõ 1 do nucleotídeo248 até o nucleotídeo 267
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo249 até o nucleotídeo 268
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1 do nucleotídeo290 até o nucleotídeo 309
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo291 até o nucleotídeo 311 nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo- a seqüência de
293 até o nucleotídeo 311 nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo- a seqüência de
294 até o nucleotídeo 314 nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo- a seqüência de
301 até o nucleotídeo 322 nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo- a seqüência de
303 até o nucleotídeo 320 nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo- a seqüência de
305 até o nucleotídeo 322 nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo- a seqüência de
308 até o nucleotídeo 325 nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 11até o nucleotídeo 29
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 36até o nucleotídeo 54
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 41até o nucleotídeo 61
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 43até o nucleotídeo 64
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 66até o nucleotídeo 86
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 67até o nucleotídeo 85
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 67até o nucleotídeo 87
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 68até o nucleotídeo 86
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 69até o nucleotídeo 87
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo180 até o nucleotídeo 197
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo183 até o nucleotídeo 204
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo187 até o nucleotídeo 204
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo200 até o nucleotídeo 219
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo246 até o nucleotídeo 263
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo247 até o nucleotídeo 267
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo
248 até o nucleotídeo 268
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo249 até o nucleotídeo 267
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo250 até o nucleotídeo 268
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo290 até o nucleotídeo 311
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo291 até o nucleotídeo 308
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo291 até o nucleotídeo 309
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo293 até o nucleotídeo 214
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 8até o nucleotídeo 29
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 11até o nucleotídeo 32
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 37até o nucleotídeo 54
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91 do nucleotídeo 40até o nucleotídeo 61
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91 do nucleotídeo 64até o nucleotídeo 85
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 65até o nucleotídeo 86
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 66até o nucleotídeo 87
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ns 1 do nucleotídeo 68até o nucleotídeo 85
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo 69até o nucleotídeo 86
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo
197 até o nucleotídeo 218
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo201 até o nucleotídeo 219
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo201 até o nucleotídeo 218
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo234 até o nucleotídeo 253
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo244 até o nucleotídeo 263
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo246 até o nucleotídeo 267
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1 do nucleotídeo247 até o nucleotídeo 268
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1 do nucleotídeo250 até o nucleotídeo 267
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo292 até o nucleotídeo 309
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo198 até o nucleotídeo 219
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo202 até o nucleotídeo 219
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo
233 até o nucleotídeo 253
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo235 até o nucleotídeo 254
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo235 até o nucleotídeo 253
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo243 até o nucleotídeo 263
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo232 até o nucleotídeo 253
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 1 do nucleotídeo
234 até o nucleotídeo 254
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo242 até o nucleotídeo 263
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo233 até o nucleotídeo 254
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo
234 até o nucleotídeo 255
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo294 até o nucleotídeo 215
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo247 até o nucleotídeo 266
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo248 até o nucleotídeo 266
- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1 do nucleotídeo249 até o nucleotídeo 266
b. Seqüência de DNA estrangeiro reconhecendo iniciadores para uso com aseqüência flanqueadora 5' reconhecendo iniciadores:
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 1do nucleotídeo 781 até o nucleotídeo 800
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 301 até o nucleotídeo 320
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 303 até o nucleotídeo 322
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 442 até o nucleotídeo 461
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 444 até o nucleotídeo 463
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 778 até o nucleotídeo 797
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 781 até o nucleotídeo 799
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 788 até o nucleotídeo 807
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 318 até o nucleotídeo 337
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 322 até o nucleotídeo 341
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 325 até o nucleotídeo 344
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 329 até o nucleotídeo 348
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 353 até o nucleotídeo 372
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 376 até o nucleotídeo 395
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 378 até o nucleotídeo 397
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 384 até o nucleotídeo 403
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 440 até o nucleotídeo 459
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 442 até o nucleotídeo 460
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 444 até o nucleotídeo 462
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 442 até o nucleotídeo 462
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 444 até o nucleotídeo 464
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 449 até o nucleotídeo 468
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 470 até o nucleotídeo 489
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 484 até o nucleotídeo 503
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 492 até o nucleotídeo 511
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 781 até o nucleotídeo 798
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 778 até o nucleotídeo 798
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 781 até o nucleotídeo 802
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 788 até o nucleotídeo 806
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 301 até o nucleotídeo 318
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 303 até o nucleotídeo 320
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 301 até o nucleotídeo 322
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 318 até o nucleotídeo 336
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 318 até o nucleotídeo 338
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ns 1do nucleotídeo 320 até o nucleotídeo 339
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 322 até o nucleotídeo 340
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 322 até o nucleotídeo 342
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 325 até o nucleotídeo 343
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 329 até o nucleotídeo 347
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 346 até o nucleotídeo 365
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 348 até o nucleotídeo 367
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 353 até o nucleotídeo 371
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 378 até o nucleotídeo 396
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 376 até o nucleotídeo 396
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 382 até o nucleotídeo 400
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Nõ 1do nucleotídeo 382 até o nucleotídeo 401
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 384 até o nucleotídeo 404
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 442 até o nucleotídeo 459
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 440 até o nucleotídeo 460
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 444 até o nucleotídeo 461
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 442 até o nucleotídeo 463
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 444 até o nucleotídeo 465
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 469 até o nucleotídeo 488
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 470 até o nucleotídeo 488
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 484 até o nucleotídeo 504
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 490 até o nucleotídeo 509
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 491 até o nucleotídeo 510
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 492 até o nucleotídeo 512
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 561 até o nucleotídeo 580
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 563 até o nucleotídeo 582
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 565 até o nucleotídeo 584
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ns 1do nucleotídeo 568 até o nucleotídeo 587
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 572 até o nucleotídeo 591
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 590 até o nucleotídeo 609
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 640 até o nucleotídeo 659
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 1do nucleotídeo 695 até o nucleotídeo 713
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 782 até o nucleotídeo 799
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 778 até o nucleotídeo 799
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 788 até o nucleotídeo 805
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 788 até o nucleotídeo 808
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 318 até o nucleotídeo 335
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 315 até o nucleotídeo 336
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 320 até o nucleotídeo 338
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 318 até o nucleotídeo 339
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 322 até o nucleotídeo 339
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 320 até o nucleotídeo 340
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 325 até o nucleotídeo 342
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 322 até o nucleotídeo 343
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 329 até o nucleotídeo 346
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 325 até o nucleotídeo 346
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 329 até o nucleotídeo 349
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 346 até o nucleotídeo 364
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 348 até o nucleotídeo 366
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 346 até o nucleotídeo 366
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 348 até o nucleotídeo 368
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 353 até o nucleotídeo 370
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 378 até o nucleotídeo 395
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 376 até o nucleotídeo 397
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 376 até o nucleotídeo 399
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 384 até o nucleotídeo 401
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 384 até o nucleotídeo 405
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N2 1do nucleotídeo 440 até o nucleotídeo 461
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 466 até o nucleotídeo 487
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 484 até o nucleotídeo 505
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 490 até o nucleotídeo 508
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 492 até o nucleotídeo 509
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 491 até o nucleotídeo 509
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 490 até o nucleotídeo 510
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 491 até o nucleotídeo 511
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 492 até o nucleotídeo 513
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 561 até o nucleotídeo 579
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ng 1do nucleotídeo 561 até o nucleotídeo 581
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 563 até o nucleotídeo 581
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 568 até o nucleotídeo 586
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 572 até o nucleotídeo 590
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 572 até o nucleotídeo 592
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 590 até o nucleotídeo 610
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 596 até o nucleotídeo 613
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 596 até o nucleotídeo 614
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 640 até o nucleotídeo 657
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 640 até o nucleotídeo 658
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 640 até o nucleotídeo 660
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 695 até o nucleotídeo 712
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 696 até o nucleotídeo 713
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 320 até o nucleotídeo 337
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 320 até o nucleotídeo 341
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 329 até o nucleotídeo 350
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 346 até o nucleotídeo 363
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 348 até o nucleotídeo 365
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 346 até o nucleotídeo 367
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 348 até o nucleotídeo 369
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 354 até o nucleotídeo 371
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 382 até o nucleotídeo 403
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 482 até o nucleotídeo 503
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 491 até o nucleotídeo 518
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 490 até o nucleotídeo 511
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ns 1do nucleotídeo 491 até o nucleotídeo 512
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 563 até o nucleotídeo 580
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 563 até o nucleotídeo 582
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 565 até o nucleotídeo 582
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 563 até o nucleotídeo 584
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 568 até o nucleotídeo 585
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 562 até o nucleotídeo 589
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 572 até o nucleotídeo 593
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 584 até o nucleotídeo 605
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 590 até o nucleotídeo 607
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 590 até o nucleotídeo 611
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 596 até o nucleotídeo 615
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 599 até o nucleotídeo 618
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 1do nucleotídeo 540 até o nucleotídeo 661
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 779 até o nucleotídeo 798
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 788 até o nucleotídeo 809
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 568 até o nucleotídeo 589
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 596 até o nucleotídeo 616
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 599 até o nucleotídeo 619
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 745 até o nucleotídeo 762
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ng 1do nucleotídeo 779 até o nucleotídeo 797
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 779 até o nucleotídeo 799
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 786 até o nucleotídeo 805
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ng 1do nucleotídeo 596 até o nucleotídeo 617
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 599 até o nucleotídeo 620
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 779 até o nucleotídeo 796
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 779 até o nucleotídeo 800
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 786 até o nucleotídeo 804
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 314 até o nucleotídeo 335
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N91do nucleotídeo 786 até o nucleotídeo 803
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ns 1do nucleotídeo 786 até o nucleotídeo 806
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 1do nucleotídeo 296 até o nucleotídeo 315
c. seqüência de DNA estrangeiro reconhecendo iniciadores para uso com aseqüência flanqueadora 3' reconhecendo iniciadores:
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1413 até o nucleotídeo 1432
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 721 até o nucleotídeo 740
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 767 até o nucleotídeo 786
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1185 até o nucleotídeo 1204
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1332 até o nucleotídeo 1351
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1413 até o nucleotídeo 1431
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1413 até o nucleotídeo 1433
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 503 até o nucleotídeo 522
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 507 até o nucleotídeo 526
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 721 até o nucleotídeo 739
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 722 até o nucleotídeo 741
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 721 até o nucleotídeo 741
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 770 até o nucleotídeo 789
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 775 até o nucleotídeo 794
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1135 até o nucleotídeo 1154
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1185 até o nucleotídeo 1202
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1185 até o nucleotídeo 1205
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1191 até o nucleotídeo 1210
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1332 até o nucleotídeo 1350
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2do nucleotídeo 1332 até o nucleotídeo 1352
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1413 até o nucleotídeo 1430
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N6 2do nucleotídeo 506 até o nucleotídeo 525
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 507 até o nucleotídeo 525
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 507 até o nucleotídeo 527
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 721 até o nucleotídeo 738
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 722 até o nucleotídeo 740
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2do nucleotídeo 721 até o nucleotídeo 742
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2do nucleotídeo 775 até o nucleotídeo 793
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 775 até o nucleotídeo 795
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2do nucleotídeo 1135 até o nucleotídeo 1153
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1135 até o nucleotídeo 1155
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1185 até o nucleotídeo 1206
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1191 até o nucleotídeo 1209
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1316 até o nucleotídeo 1335
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1325 até o nucleotídeo 1344
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1332 até o nucleotídeo 1353
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1413 até o nucleotídeo 1434
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 507 até o nucleotídeo 528
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2do nucleotídeo 722 até o nucleotídeo 739
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 725 até o nucleotídeo 742
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 730 até o nucleotídeo 749
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 770 até o nucleotídeo 787
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2do nucleotídeo 770 até o nucleotídeo 791
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 771 até o nucleotídeo 792
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 775 até o nucleotídeo 792
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2do nucleotídeo 775 até o nucleotídeo 796
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1153 até o nucleotídeo 1134
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1135 até o nucleotídeo 1156
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2do nucleotídeo 1187 até o nucleotídeo 1206
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1191 até o nucleotídeo 1208
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1191 até o nucleotídeo 1212
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ns 2do nucleotídeo 1325 até o nucleotídeo 1343
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ns 2do nucleotídeo 1325 até o nucleotídeo 1345
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1367 até o nucleotídeo 1384
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2do nucleotídeo 1511 até o nucleotídeo 1528
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 506 até o nucleotídeo 527
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 730 até o nucleotídeo 750
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1187 até o nucleotídeo 1204
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1187 até o nucleotídeo 1205
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2do nucleotídeo 1249 até o nucleotídeo 1266
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1325 até o nucleotídeo 1342
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1325 até o nucleotídeo 1346
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 730 até o nucleotídeo 751
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1187 até o nucleotídeo 1208
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1334 até o nucleotídeo 1353
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1334 até o nucleotídeo 1352
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1334 até o nucleotídeo 1354
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 1334 até o nucleotídeo 1351
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 2do nucleotídeo 1334 até o nucleotídeo 1355
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 754 até o nucleotídeo 771
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ng 2do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 863
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N2 2do nucleotídeo 732 até o nucleotídeo 751
- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2do nucleotídeo 732 até o nucleotídeo 750
d. seqüência flanqueadora 3' que reconhece os iniciadores:
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo284 até o nucleotídeo 303
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N2 2 do nucleotídeo285 até o nucleotídeo 305
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N2 2 do nucleotídeo289 até o nucleotídeo 308
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo160 até o nucleotídeo 179
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo162 até o nucleotídeo 181
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N2 2 do nucleotídeo283 até o nucleotídeo 303
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo
284 até o nucleotídeo 304
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N2 2 do nucleotídeo286 até o nucleotídeo 304
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo287 até o nucleotídeo 306- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo288 até o nucleotídeo 308
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo290 até o nucleotídeo 308
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo394 até o nucleotídeo 413
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo398 até o nucleotídeo 417
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo399 até o nucleotídeo 418
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo400 até o nucleotídeo 418
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo119 até o nucleotídeo 138
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo161 até o nucleotídeo 179
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo161 até o nucleotídeo 181
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo184 até o nucleotídeo 203
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo192 até o nucleotídeo 211
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo
193 até o nucleotídeo 212
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo195 até o nucleotídeo 214
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo241 até o nucleotídeo 260
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo283 até o nucleotídeo 304
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo286 até o nucleotídeo 303- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo286 até o nucleotídeo 306
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo287 até o nucleotídeo 304
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo287 até o nucleotídeo 308
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 2 do nucleotídeo288 até o nucleotídeo 306
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo366 até o nucleotídeo 385
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo393 até o nucleotídeo 412
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo395 até o nucleotídeo 413
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo398 até o nucleotídeo 418
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo399 até o nucleotídeo 417
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo400 até o nucleotídeo 417
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo401 até o nucleotídeo 418
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo430 até o nucleotídeo 449
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo81 até o nucleotídeo 100
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo90 até o nucleotídeo 109
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo159 até o nucleotídeo 179
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo160 até o nucleotídeo 181- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo185 até o nucleotídeo 203
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo191 até o nucleotídeo 211
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo192 até o nucleotídeo 212
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo
193 até o nucleotídeo 211
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo194 até o nucleotídeo 212
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo
194 até o nucleotídeo 214
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo196 até o nucleotídeo 215
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo196 até o nucleotídeo 214
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo219 até o nucleotídeo 238
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo240 até o nucleotídeo 260
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Nõ 2 do nucleotídeo242 até o nucleotídeo 261
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 2 do nucleotídeo242 até o nucleotídeo 260
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo275 até o nucleotídeo 294
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo285 até o nucleotídeo 306
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo289 até o nucleotídeo 306
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo315 até o nucleotídeo 334- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo319 até o nucleotídeo 338
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo366 até o nucleotídeo 383
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 2 do nucleotídeo372 até o nucleotídeo 391
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo392 até o nucleotídeo 412
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo392 até o nucleotídeo 413
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo394 até o nucleotídeo 412
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo397 até o nucleotídeo 417
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo397 até o nucleotídeo 418
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo424 até o nucleotídeo 443
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo429 até o nucleotídeo 449
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo431 até o nucleotídeo 450
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ng 2 do nucleotídeo431 até o nucleotídeo 449
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo439 até o nucleotídeo 458
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo447 até o nucleotídeo 466
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo481 até o nucleotídeo 500
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo507 até o nucleotídeo 526- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo
79 até o nucleotídeo 96
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo80 até o nucleotídeo 100
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo82 até o nucleotídeo 100
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo89 até o nucleotídeo 109
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo91 até o nucleotídeo 109
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N-2 do nucleotídeo121 até o nucleotídeo 138
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo184 até o nucleotídeo 202
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo186 até o nucleotídeo 203
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo190 até o nucleotídeo 211
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo191 até o nucleotídeo 212
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo193 até o nucleotídeo 214
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo194 até o nucleotídeo 211
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo195 até o nucleotídeo 215
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo195 até o nucleotídeo 212
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo218 até o nucleotídeo 238
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo220 até o nucleotídeo 238- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo221 até o nucleotídeo 238
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo239 até o nucleotídeo 260
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo241 até o nucleotídeo 261
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo277 até o nucleotídeo 294
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo282 até o nucleotídeo 303
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo314 até o nucleotídeo 334
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo316 até o nucleotídeo 334
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo318 até o nucleotídeo 338
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo320 até o nucleotídeo 338
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo371 até o nucleotídeo 391
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo391 até o nucleotídeo 412
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo395 até o nucleotídeo 412
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo396 até o nucleotídeo 417
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo423 até o nucleotídeo 443
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo430 até o nucleotídeo 450
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo432 até o nucleotídeo 449- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 2 do nucleotídeo438 até o nucleotídeo 458
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo446 até o nucleotídeo 466
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NQ 2 do nucleotídeo448 até o nucleotídeo 466
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo
449 até o nucleotídeo 466
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo481 até o nucleotídeo 498
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N-2 do nucleotídeo481 até o nucleotídeo 499
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N- 2 do nucleotídeo482 até o nucleotídeo 500
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo508 até o nucleotídeo 526
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ns 2 do nucleotídeo79 até o nucleotídeo 100
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo83 até o nucleotídeo 100
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo88 até o nucleotídeo 109
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo92 até o nucleotídeo 109
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo185 até o nucleotídeo 202
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo194 até o nucleotídeo 215
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo217 até o nucleotídeo 238
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo240 até o nucleotídeo 261- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo241 até o nucleotídeo 262
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo313 até o nucleotídeo 334
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo317 até o nucleotídeo 338
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo321 até o nucleotídeo 338
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo370 até o nucleotídeo 391
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo422 até o nucleotídeo 443
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo428 até o nucleotídeo 449
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo429 até o nucleotídeo 450
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo437 até o nucleotídeo 458
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo441 até o nucleotídeo 458
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo445 até o nucleotídeo 466
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo482 até o nucleotídeo 499
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo504 até o nucleotídeo 523
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo266 até o nucleotídeo 287
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo446 até o nucleotídeo 465
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo156 até o nucleotídeo 175- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ne 2 do nucleotídeo448 até o nucleotídeo 465
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N8 2 do nucleotídeo155 até o nucleotídeo 175
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo157 até o nucleotídeo 175
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo154 até o nucleotídeo 175
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID Ns 2 do nucleotídeo312 até o nucleotídeo 329
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo191 até o nucleotídeo 210
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo190 até o nucleotídeo 210
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo192 até o nucleotídeo 210
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo157 até o nucleotídeo 176
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo189 até o nucleotídeo 210
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo193 até o nucleotídeo 210
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo156 até o nucleotídeo 176
- da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N9 2 do nucleotídeo155 até o nucleotídeo 176
Conforme aqui utilizado, "a seqüência de nucleotídeos da SEQID NO: Z da posição X até a posição Y" indica a seqüência de nucleotídeosincluindo ambos os pontos das extremidades dos nucleotídeos.
Preferivelmente, o fragmento de integração tem um comprimentode entre 50 e 500 nucleotídeos, mais preferivelmente de entre 100 e 350nucleotídeos. Os iniciadores específicos podem ter uma seqüência a qualseja entre 80 e 100% idêntica a uma seqüência na região flanqueadora 5' ou3' do evento de elite e o DNA estrangeiro do evento de elite, respectivamen-te, com a condição de que os maus emparelhamentos ainda permitem a i-dentificação específica do evento de elite com esses iniciadores sob condi-ções de PCR otimizadas. A faixa de emparelhamentos ruins permitida, entre-tanto, pode ser facilmente determinada experimentalmente e são conhecidaspor uma pessoa versada na técnica.
A tabela a seguir exemplifica os tamanhos dos amplicons deDNA esperados (ou fragmentos de integração) com pares selecionados deiniciadores de PCR.
<table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table>
A detecção dos fragmentos de integração pode ocorrer de diver-sas formas, por exemplo, através de estimativa de tamanho depois de análi-se de gel. Os fragmentos de integração também podem ser diretamente se-qüenciados. Outros métodos específicos de seqüência para a detecção defragmentos de DNA amplificados também são conhecidos na técnica.
Uma vez que a seqüência dos iniciadores e seus locais relativosno genoma são únicos para o evento de elite, a amplificação do fragmentode integração irá ocorrer somente em amostras biológicas compreendendo(o ácido nucléico do) evento de elite. Preferivelmente ao efetuar um PCRpara identificar a presença do A5547-A12 em amostras desconhecidas, umcontrole é incluído de um grupo de iniciadores com os quais um fragmentoem um "gene governante" da espécie vegetal do evento pode ser amplifica-do. Gentes governantes são genes que são expressos na maioria dos tiposcelulares e os quais estão envolvidos com atividades metabólicas básicascomuns a todas as células. Preferivelmente, o fragmento amplificado do ge-ne governante é um fragmento o qual é maior do que o fragmento de inte-gração amplificado. Dependendo das amostras a serem analisadas, outroscontroles podem ser incluídos.
Protocolos de PCR padronizados são descritos na técnica, talcomo em "manual de aplicações de PCR" (Roche Molecular Biochemicals,2- Edição, 1999). As condições ótimas para o PCR, incluindo a seqüênciados iniciadores específicos, é especificada em um "protocolo de identificaçãode PCR" para cada evento de elite. É, entretanto, entendido que uma varie-dade de parâmetros no protocolo de identificação de PCR pode necessitarser ajustada a condições laboratoriais específicas, e pode ser levementemodificada para obter resultados semelhantes. Por exemplo, o uso de ummétodo diferente de preparação de DNA pode requerer o ajuste, por exem-plo, da quantidade de iniciadores, polimerase e das condições de anelamen-to usadas. Similarmente, a seleção de outros iniciadores pode ditar outrascondições ótimas para o protocolo de identificação de PCR. Esses ajustesirão, entretanto, ser aparentes para uma pessoa versada na técnica, e sãoainda detalhados nos atuais manuais de aplicação de PCR, tais como aque-les citados acima.
Alternativamente, os iniciadores específicos podem ser usadospara amplificar um fragmento de integração que possa ser usado como uma"sonda específica" para identificar A5547-127 em amostras biológicas. Ocontato do ácido nucléico de uma amostra biológica, com a sonda, sob con-dições as quais permitam a hibridização da sonda com o seu fragmento cor-respondente no ácido nucléico, resulta na formação de um híbrido de ácidonucléico/sonda. A formação desse híbrido pode ser detectada (por exemplo,marcação do ácido nucléico ou sonda), por meio do que a formação dessehíbrido indica a presença de A5547-127. Tais métodos de identificação ba-seados na hibridização com uma sonda específica (seja em veículo de fasesólida ou em solução) foram descritos na técnica. A sonda específica é pre-ferivelmente uma seqüência a qual, sob condições otimizadas, hibridiza es-pecificamente a uma região na região flanqueadora 5' ou 3' do evento deelite e, preferivelmente, também compreendendo parte do DNA estrangeirocontíguo com isso (de agora em diante referida como "região específica).
Preferivelmente, a sonda específica compreende uma seqüência de entre 50e 500 bp, preferivelmente de 100 a 350 bp, a qual é pelo menos 80%, prefe-rivelmente entre 80 e 85%, mais preferivelmente entre 85 e 90%, especial-mente preferivelmente entre 90 e 95%, mais preferivelmente entre 95% e100% idêntica (ou complementar) à seqüência de nucleotídeo de uma regiãoespecífica. Preferivelmente, a sonda específica irá compreender uma se-qüência de cerca de 15 até cerca de 100 nucleotídeos contíguos idênticos(ou complementares) a uma região específica do evento de elite.
Um "kit", conforme aqui utilizado, refere-se a um grupo de rea-gentes para o propósito de efetuar o método da invenção, mais particular-mente, a identificação do evento de elite A5547-127 em amostras biológicas.Mais particularmente, uma modalidade preferida do kit da invenção compre-ende pelo menos um ou dois iniciadores específicos, conforme descrito aci-ma. Opcionalmente, o kit pode ainda compreender qualquer outro reagenteaqui descrito no protocolo de identificação do PCR. Alternativamente, de a-cordo com outra modalidade dessa invenção, o kit pode compreender umasonda específica, conforme descrito acima, a qual hibridiza especificamentecom ácido nucléico de amostras biológicas para identificar a presença deA5547-127 ali. Opcionalmente, o kit pode ainda compreender qualquer outroreagente (tal como, porém não limitado ao tampão hibridizante, marcador)para identificação do A5547-127 em amostras biológicas, usando a sondaespecífica.
O kit da invenção pode ser usado, e seus componentes podemser especificamente ajustados, para propósitos de controle de qualidade (porexemplo, pureza de lotes de sementes), detecção do evento de elite em ma-terial vegetal ou em material compreendendo ou derivado do material vege-tal, tal como, porém não limitado, a produtos alimentícios ou de ração.
Conforme aqui utilizado, "identidade de seqüência", em conside-ração às seqüências de nucelotídeos (DNA ou RNA) refere-se à quantidadede posições com nucleotídeos idênticos divididos pela quantidade de nucleo-tídeos na mais curta das duas seqüências. O alinhamento das duas seqüên-cias de nucleotídeos é efetuado pelo algoritmo de Wilbur e Lipmann (Wilbure Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80:726) usando um tamanho dejanela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, euma penalidade de intervalo de 4. A análise auxiliada por computador e ainterpretação dos dados da seqüência, incluindo o alinhamento da seqüênciaconforme descrito acima, pode, por exemplo, ser convenientemente efetua-da usando os programas do pacote de programas IntelligeneticsTM (Intelli-geneties Inc., CA) ou o pacote de programas de computador de análise deseqüência do Geneties Computer Group (GCG, centro de biotecnologia daUniversidade de Wisconsin). As seqüências são indicadas como "essencial-mente similares" quando tais seqüências têm uma identidade de seqüênciade pelo menos cerca de 75%, particularmente pelo menos cerca de 80%,mais particularmente pelo menos cerca de 85%, muito particularmente cercade 90%, especialmente cerca de 95%, mais especialmente cerca de 100%.
É claro que quando as seqüências de RNA são ditas como sendo essenci-almente similares ou têm um certo grau de identidade de seqüência comseqüências de DNA, a timidina (T) na seqüência de DNA é considerada igualao uracil (U) na seqüência de RNA.
O termo "iniciador", conforme aqui utilizado, engloba qualquerácido nucléico que seja capaz de iniciar a síntese de um ácido nucléico nas-cente em um processo dependente de molde, tal como PCR. Tipicamente,iniciadores são oligonucleotídeos de 10 a 30 nucleotídeos, mas seqüênciasmais longas podem ser empregadas. Iniciadores podem ser fornecidos naforma de duplo filamento, embora a forma de filamento único seja preferida.
As sondas podem ser usadas como iniciadores, mas são projetadas para seligado ao DNA ou RNA alvo e não precisam ser usadas em um processo deamplificação.
O termo "reconhecendo", conforme aqui utilizado, quando sereferindo a iniciadores específicos, refere-se ao fato de que os iniciadoresespecíficos hibridizam especialmente com uma seqüência de ácido nucléicono evento de elite sob as condições estabelecidas no método (tais como ascondições do protocolo de identificação por PCR), por meio do qual a espe-cificidade é determinada pela presença de controles positivos e negativos.
O termo "hibridizando", conforme utilizado aqui, quando se refe-rindo a sondas específicas, refere-se ao fato de que a sonda se liga a umaregião específica na seqüência do ácido nucléico do evento de elite sobcondições de estringência padronizadas. Condições de estringência padro-nizadas, conforme aqui utilizadas, se referem às condições para a hibridiza-ção aqui descrita ou às condições de hibridização convencionais conformedescrito por Sambrook e outros, 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Ma-nual, Segunda Edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY), as quais,por exemplo, podem compreender as seguintes etapas: 1) imobilização dosfragmentos de DNA genômico vegetal em um filtro, 2) pré-hibridização dofiltro por 1 a 2 horas a 42°C em 50% de formamida, 5 x SSPE, 2 x reagentede Denhardfs e 0,1 % de SDS, ou por 1 a 2 horas a 68°C em 6 x SSC, 2 x dereagente de Denhardfs e 0,1% de SDS, 3) adição da sonda de hibridizaçãoa qual foi marcada, 4) incubação por 16 a 24 horas, 5) lavagem do filtro por20 min em temperatura ambiente em 1 x SSC, 0,1% de SDS, 6) lavagem dofiltro três vezes por 20 min cada a 68°C em 0,2 x SSC, 0,1% SDS, e 7) ex-posição do filtro por 24 a 48 horas ao filme de raio-X a -70°C com uma telaintensificante.
Conforme aqui utilizado, uma amostra biológica é uma amostrade uma planta, material vegetal ou produtos compreendendo material vege-tal. O termo "planta" é tencionado para englobar tecidos de planta de soja(Glycine max), em qualquer estágio de maturidade, assim como quaisquercélulas, tecidos ou órgãos tomados de ou derivados de qualquer tal planta,incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes,células individuais, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ou pro-toplastos.
"Material vegetal", conforme aqui utilizado, refere-se ao materialo qual é obtido ou derivado de uma planta. Produtos compreendendo mate-rial vegetal se referem a alimentos, rações ou outros produtos os quais sãoproduzidos usando material vegetal ou que podem ser contaminados pormaterial vegetal. É entendido que, no contexto da presente invenção, taisamostras biológicas são testadas para a presença de ácidos nucléicos espe-cíficos para A5547-127, implicando a presença de ácidos nucléicos nas a-mostras. Conseqüentemente, os métodos referidos aqui para identificar oevento de elite A5547-127 em amostras biológicas, relacionadas com a iden-tificação em amostras biológicas de ácidos os quais compreendem o eventode elite.
Conforme aqui utilizado, "compreendendo" é para ser interpreta-do como especificando a presença das características, números inteiros,etapas, reagentes ou componentes conforme referidos a, mas não impedema presença ou adição de uma ou mais características, números inteiros, eta-pas ou componentes, ou seus grupos. Conseqüentemente, por exemplo, umácido nucléico ou proteína compreendendo uma seqüência de nucleotídeosou aminoácidos, pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos doque os verdadeiramente citados, isto é, estar embutido em um ácido nucléi-co ou proteína maior. Um gene quimérico compreendendo uma seqüênciade DNA a qual seja funcionalmente ou estruturalmente definida pode com-preender seqüências de DNA adicionais, etc.
A presente invenção também refere-se ao desenvolvimento deum evento de elite A5547-127 em soja para as plantas compreendendo esseevento, a progênie obtida dessas plantas e para as células vegetais, ou ma-terial vegetal derivado desse evento. Plantas compreendendo evento de eliteA5547-127 foram obtidas conforme descrito através do exemplo 1.
Plantas de soja ou material vegetal compreendendo A5547-127podem ser identificadas de acordo com o protocolo de identificação por PCRdescrito para A5547-127 no exemplo 2. Resumidamente, o DNA genômicode soja presente na amostra biológica é amplificado por PCR usando uminiciador o qual reconhece especificamente uma seqüência na seqüênciaflanqueadora 5' ou 3' de A5547-127, tal como o iniciador com a seqüência daSEQ ID NO: 15, e um iniciador o qual reconhece uma seqüência no DNAestrangeiro, tal como o iniciador com a seqüência da SEQ ID NO: 13. Inicia-dores de DNA, os quais amplificam parte de uma seqüência de soja endó-gena, são usados como controle positivo para a amplificação por PCR. Sena amplificação por PCR, o material produzir um fragmento do tamanho es-perado, o material contém material vegetal de uma planta de soja abrigandoo evento de elite A5547-127.
Plantas abrigando A5547-127 são caracterizadas pela sua tole-rância ao glufosinato, o qual no contexto da presente invenção, inclui aque-las plantas que são tolerantes ao herbicida Liberty®. Tolerância ao Liberty™pode ser testada de diferentes formas. O método de pintura da folha, con-forme aqui descrito, é mais útil quando a discriminação entre plantas resis-tentes e sensíveis é necessária, sem matar as sensíveis. Alternativamente, atolerância pode ser testada pela aplicação do spray Liberty™. Tratamentoscom spray devem ser feitos entre os estágios da folha V3 e V4 para melho-res resultados. Plantas tolerantes são caracterizadas pelo fato de que a pul-verização das plantas com pelo menos 200 gramas de ingrediente ati-vo/hectare (g.a.i./ha), preferivelmente 400 g.a.i./ha, e possivelmente até1600 g.a.i./ha (4 x a taxa de campo normal), não mata as plantas. Uma apli-cação espalhada deve ser aplicada em uma taxa de 0,79-0,96 pg (28 - 34oz) de Liberty™. Ela é mais bem aplicada em um volume de 75,7 I (20 ga-lões) de água por acre usando um bico do tipo leque plano enquanto sendocuidadoso para não direcionar aplicações do spray diretamente no verticilodas plantas para evitar que o tensoativo queime as plantas. O efeito herbici-da deve aparecer em 48 horas e ser claramente visível dentro de 5 -7 dias.
As plantas abrigando A5547-127 podem ser ainda caracteriza-das pela presença nas suas células de fosfinotricina acetil transferase con-forme determinado por um ensaio PAT (De Block et al, 1987).
Plantas abrigando A5547-127 também são caracterizadas porter características agronômicas que sejam comparáveis com variedades co-mercialmente disponíveis de soja nos EUA, na ausência de pressão de er-vas daninhas, e uso de Liberty™ para o controle de ervas daninhas. Foi ob-servado que a presença de um DNA estrangeiro na região de inserção dogenoma da planta de soja aqui descrito, confere características fenotípicas emoleculares particularmente interessantes às plantas compreendendo esseevento. Mais especificamente, a presença do DNA estrangeiro nessa regiãoparticular no genoma dessas plantas, resulta em plantas as quais apresen-tam uma expressão fenotípica estável do gene de interesse sem comprome-ter significativamente qualquer aspecto do desempenho agronômico deseja-do das plantas.
Os seguintes exemplos descrevem a identificação do desenvol-vimento de ferramentas para a identificação do evento de elite A5547-127em amostras biológicas.
A não ser que seja estabelecido de outra forma, todas as técni-cas de DNA recombinante são executadas de acordo com protocolos padro-nizados conforme descrito em Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Segunda edição, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, NY e nos volumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Protocolsin Molecular Biology, Current Protocols, EUA. Materiais e métodos padroni-zados para o trabalho molecular vegetal estão descritos em Plant MolecularBiology Labfax (1993) por R.D.D. Croy publicado pela BIOS Scientific Publi-cations Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications, UK.
Na descrição e nos exemplos, é feita referência às seguintesseqüências:
seqüência de nucleotídeos compreendendo a regiãoflanqueadora 5' do A5547-127
seqüência de nucleotídeos compreendendo a regiãoflanqueadora 3'do A5547-127niciador HCA150niciador DPA013SEQIDNO:5: iniciador DPA228
niciador KVM173niciador YTP228niciador YTP220niciador DPA024niciador YTP245niciador YTP170niciador YTP227niciador MDB688niciador KVM175SEQIDNO:15: iniciador MDB687
niciador SMO022niciador SMO024
niciador 1 para a amplificação do fragmento de controleniciador 2 para a amplificação do fragmento de controle
Breve Descrição dos Desenhos
Os seguintes exemplos, não tencionados a limitar a invenção àsmodalidades específicas descritas, pode ser entendido juntamente com a
SEQ ID NO: 1:
SEQ ID NO: 2:
SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 4SEQ ID NO: 5SEQ ID NO: 6SEQ ID NO: 7SEQ ID NO: 8SEQ ID NO: 9SEQ ID NO: 10SEQ ID NO: 11SEQ ID NO: 12SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 14SEQ ID NO: 15SEQ ID NO: 16SEQ ID NO: 17SEQ ID NO: 18SEQ ID NO: 19figura associada, incorporada aqui por referência, na qual:Fig. 1: Representação esquemática da relação entre os iniciadores e as se-qüências de nucleotídeos citadas. Barra preta: DNA estrangeiro; barra clara:DNA de origem vegetal; as figuras sob as barras representam posições denucleotídeos; (c) refere-se ao complemento da seqüência de nucleotídeoindicada.
Fig. 2: Protocolo de identificação por PCR desenvolvido para A5547-127. Aseqüência de carregamento do gel: Raia 1: amostra de DNA das plantas desoja compreendendo o evento transgênico A5547-127; raia 2: amostra deDNA de uma planta de soja transgênica não compreendendo evento de eliteA5547-127; raia 3: amostras de DNA de controle das plantas de soja do tiposelvagem; raia 4: controle sem molde; raia 5: marcador de peso molecular.
Exemplos
1. Identificação das Regiões Flanqueadoras do Evento de Elite A5547-127
Soja resistente ao herbicida foi desenvolvida pela transformaçãode soja com um vetor compreendendo a seqüência codificadora de um genepat que codifica a enzima fosfinotricinacetiltransferase, sob o controle dopromotor 35S constitutivo do vírus mosaico da couve-flor.
O evento de elite A5547-127 foi selecionado baseando-se emum vasto procedimento de seleção baseando-se na boa expressão e estabi-lidade do gene de resistência ao herbicida e sua compatibilidade com carac-terísticas agronômicas ótimas.
A seqüência das regiões flanqueando o DNA estrangeiro no e-vento A5547-127 foi determinada usando o método de PCR interlaçado as-simétrico térmico (TAIL-) descrito por Liu e outros (1995, Plant J. 8(3):457-463). Esse método utiliza três iniciadores aninhados em reações sucessivasjuntamente com um iniciador degenerado arbitrário mais curto de forma queas eficiências de amplificação relativas dos produtos específicos e não-específicos possam ser termicamente controladas. Os iniciadores específi-cos foram selecionados para o anelamento para a borda do DNA estrangeiroe baseando-se nas suas condições de anelamento. Uma pequena quantida-de (5 u.L) de produtos de PCR secundários e terciários, não-purificados, foianalisada em um gel de agarose a 1 %. O produto de PCR terciário foi usadopara amplificação preparativa, purificado e seqüenciado ern um seqüencia-dor automatizado usando o kit do ciclo DyeDeoxy Terminator.1.1 Região Flanqueadora (5') da Direita
O fragmento identificado como compreendendo a região flan-queadora 5' obtida pelo método de TAIL-PCR foi completamente seqüencia-do (SEQ ID NO: 1). A seqüência entre o nucleotídeo 1 e 311 corresponde aoDNA da planta, enquanto que a seqüência entre o nucleotídeo 312 e 810corresponde ao DNA estrangeiro.
1.2 Região Flanqueadora (3') da Esquerda
O fragmento identificado como compreendendo a região flan-queadora 3' obtida pelo método de TAIL-PCR foi completamente seqüencia-do (SEQ ID NO: 2). A seqüência entre o nucleotídeo 1 e 509 corresponde aoDNA estrangeiro, enquanto que a seqüência entre o nucleotídeo 510 e 1880corresponde ao DNA vegetal.
2. Desenvolvimento de um Protocolo de Identificação da Reação em Cadeiada Polimerase
2.1 Iniciadores
Iniciadores específicos foram desenvolvidos os quais reconhe-cem seqüências no evento de elite. Mais particularmente, um iniciador foidesenvolvido o qual reconhece uma seqüência na região flanqueadora 5' doA5547-127. Um segundo iniciador foi, a seguir, selecionado na seqüência doDNA estrangeiro de forma que os iniciadores se estendam em uma seqüên-cia de cerca de 150 nucleotídeos. Os seguintes iniciadores foram descober-tos com proporcionando resultados particularmente claros e reproduzíveisem uma reação em PCR no DNA A5547-127:
MDB687: 5'- TgT.ggT.TAT.ggC.ggT.gCC.ATC -3' (SEQ ID No.: 15)(alvo: DNA vegetal)
MDB688: 5'-TgC.TAC.Agg.CAT.CgT.ggT.gTC-3' (SEQ ID No.: 13)(alvo: DNA inserido)
Iniciadores alvejando uma seqüência endógena são preferivel-mente incluídos no coquetel do PCR.Esses iniciadores servem como um controle interno em amos-tras desconhecidas e no controle positivo de DNA. Um resultado positivocom o par de iniciadores endogenos demonstra que há um DNA amplo dequalidade adequada na preparação do DNA genômico para um produto dePCR ser gerado. Os iniciadores endogenos foram selecionados para reco-nhecer um gene governante em Glycine max:
SOY01: 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3' (SEQ ID No.: 20)(localizado no gene actina 1 da Glycine max (Acesso J01298))SOY02: 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3' (SEQ ID No.: 21)(localizado no gene actina 1 da Glycine max (Acesso J01298))
2.2 Fragmentos Amplificados
Os fragmentos amplificados esperados na reação de PCR são:
Para o par de iniciadores SOY01-SOY02: 413 bp (controle en-dógeno)
Para o par de iniciadores MDB688-MDB687: 151 bp (evento de
elite A5547-127)
2.3 DNA Molde
DNA molde foi preparado a partir de uma punção de folha deacordo com Edwards e outros (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Aousar DNA preparado com outros métodos, uma corrida de teste utilizandodiferentes quantidades de molde devem ser feitas. Geralmente 50 ng deDNA molde genômico produzem os melhores resultados.
2.4 Controles Positivo e Negativo Designados
Para evitar falsos positivos ou negativos, foi determinado que osseguintes controles positivo e negativo devem ser incluídos em uma corridade PCR:
- Controle de mistura mestre (controle de DNA negativo). Esse éum PCR no qual nenhum DNA é adicionado à reação. Quando o resultadoesperado, nenhum produto de PCR, é observado, isso indica que o coquetelde PCR não foi contaminado com DNA alvo.
- Um controle positivo de DNA (amostra de DNA genômico co-nhecido por conter as seqüências transgênicas). A amplificação bem sucedi-da desse controle positivo demonstra que o PCR correu sob condições asquais permitem a amplificação das seqüências alvo.
o DNA molde fornecido é DNA genômico preparado a partir de uma plantanão-transgênica. Quando o resultado esperado, nenhuma amplificação deum produto de PCR transgênico, mas sim a amplificação do produto de PCRendógeno, é observada, isso indica que não há amplificação de fundo detransgene detectável em uma amostra de DNA genômico.2.5 Condições de PCR
Resultados ótimos foram obtidos sob as seguintes condições:
2,5 uL de DNA molde
2,5 uL de tampão de amplificação 10x (fornecido com Taq polimerase)
0,5 |iL de dNTP's 10 mM
0,5 i± de MDB688 (10 pmols/nl_)
0,5uL de MDB687 (10 pmols/u.L)
0,25 nl_ de SOY01 (10 pmols/ul)
0,25 de SOY02 (10 pmols/fiL)
0,1 uL de Taq DNA polimerase (5 unidades/nl_)
Água até 25 ml_
- Um controle de DNA do tipo selvagem. Esse é um PCR no qual
- a mistura de PCR para reações de 25 |iL contém:
- o perfil termociclizador a ser seguido para resultados ótimos é
o seguinte:
4 min a 95°C
Seguido por:
1 min a 95°C
1 min a 57°C
2 min a 72°C
Por 5 ciclos
Seguido por:
30 seg a 92°C30 seg a 57°C
1 min a 72°C
Por 25 ciclos
Seguido por:
5 minutos a 72°C2.6 Análise de Gel de Agarose
Para visualizar otimamente os resultados do PCR foi determina-do que entre 10 e 20 \iL das amostras de PCR devem ser aplicadas em umgel de agarose 1,5% (tampão tris-borato) com um marcador de peso molecu-lar apropriado (por exemplo, série de 100 bp PHARMACIA).
2.7 Validação dos Resultados
Foi determinado que dados das amostras de DNA vegetal trans-gênico em uma única corrida de PCR e um único coquetel de PCR não de-vem ser aceitas, a não ser que 1) o controle positivo de DNA apresente osprodutos de PCR esperados (fragmentos transgênicos e endógenos), 2) ocontrole negativo de DNA seja negativo para a amplificação do PCR (semfragmentos) e 3) o controle de DNA do tipo selvagem mostre o resultado es-perado (amplificação de fragmento endógeno).
Ao seguir o Protocolo de Identificação de PCR para A5547-127,conforme descrito acima, as raias apresentando quantidades visíveis dosprodutos de PCR transgênicos e endógenos dos tamanhos esperados, indi-cam que a planta correspondente a partir da qual o DNA molde genômico foipreparado, herdou o evento de elite A5547-127. As raias que não mostraramquantidades visíveis de qualquer um dos produtos de PCR transgênico eapresentando quantidades visíveis do produto de PCR endógeno, indicamque a planta correspondente a partir da qual o molde de DNA foi preparadonão compreende o evento de elite. As raias não apresentando quantidadesvisíveis dos produtos de PCR endógeno e transgênico indicam que a quali-dade e/ou quantidade do DNA genômico não permitem que um produto dePCR seja gerado. Essas plantas não podem ser pontuadas. A preparação deDNA genômico deve ser repetida e uma nova corrida de PCR, com os con-troles apropriados, tem que ser efetuada.
2.8 Uso de Protocolo de PCR Discriminativo para Identificar A5547-127.
Antes de tentar testar desconhecidos, uma corrida de teste, comtodos os controles apropriados, tem que ser efetuada. O protocolo desenvol-vido deve requerer a otimização para os componentes que podem diferir en-tre laboratórios (preparo do DNA molde, Taq DNA polimerase, qualidade dosiniciadores, dNTP's, termociclizador, etc).
A amplificação da seqüência endógena desempenha um papelchave no protocolo. Uma pessoa tem que conseguir condições de PCR e determociclização que amplifiquem quantidades equimolares tanto da seqüên-cia endógena quanto da seqüência transgênica em um molde de DNA ge-nômico transgênico conhecido. Sempre que o fragmento endógeno alvejadonão for amplificado ou sempre as seqüências alvejadas não forem amplifica-das com as mesmas intensidades de manchamento de brometo de etídio,conforme julgado pela eletroforese em gel de agarose, a otimização dascondições de PCR podem ser requeridas.
Material de folha de Glycine max a partir de uma variedade deplantas, algumas das quais compreendendo A5547-127, foram testadas deacordo com o protocolo acima descrito. Amostras do evento de elite A5547-127 e do tipo selvagem de Glyvine max foram tomadas como controles posi-tivo e negativo, respectivamente.
Figura 2 ilustra o resultado obtido com o protocolo de identifica-ção de PCR do evento de elite para A5547-127 em uma variedade de amos-tras de plantas de soja (raias de 1 a 14). Descobriu-se que as amostras naraia 1 contêm o evento de elite uma vez que a banda de 185 bp é detectada,enquanto que as amostras nas raias 2, 3 e 4 não compreendem A5547-127.A raia 2 compreende outro evento de elite da soja, a raia 3 representa umcontrole de Glycine max não-tansgênico; raia 4 representa a amostra decontrole negativo (água), e a raia 5 representa o Marcador de Peso Molecu-lar (100 bp).
3. Uso de um Fragmento de Integração Específico como uma Sonda para aDetecção de Material compreendendo A5547-127
Um fragmento de integração específico do A5547-127é obtidopor amplificação de PCR usando iniciadores específicos MDB687 (SEQ IDNO: 15) e MDB688 (SEQ ID NO: 13) ou por síntese química e é marcado.
Esse fragmento de integração é usado como uma sonda específica para adetecção de A5547-127em amostras biológicas. Ácido nucléico é extraídodas amostras de acordo com procedimentos padronizados. Esse ácido nu-cléico, então, entra em contato com a sonda específica sob condições hibri-dização as quais são otimizadas para permitir a formação de um híbrido. Aformação do híbrido é, a seguir, detectada para indicar a presença do ácidonucléico A5547-127 na amostra. Opcionalmente, o ácido nucléico nas amos-tras é amplificado usando os iniciadores específicos antes do contato com asonda específica. Alternativamente, o ácido nucléico é marcado antes docontato com a sonda específica ao invés do fragmento de integração. Op-cionalmente, a sonda específica é ligada a um veículo sólido (tal como, po-rém não limitado, a um filtro, tira ou contas) antes do contato com as amos-tras.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Bayer BioScience N.V.
Marc, De Beuckeleer<120> Evento de elite A5547-127 e métodos e ktis para identificar tal evento em amostras biológicas<130> BCS 05-2009<150> EP05075846.5<151> 2005-04-11<150> US60/670,414<151> 2005-04-12<160> 19
<170> Patente Versão 3.3
<210> 1
<211> 810
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de nucleotídeos compreendendo a região flanço 5' de A5547
127
<220>
<221> descrição_mixta
<222> (1)..(311)
<223> 5' seqüência do flanço
<220>
<221> descrição_mixta<222> (312).. (810)<223> seqüência DNA inserida<400> 1
gtcatcgtcg tcgcgctgga gttcttgtgg tgccgctggt cgcactggag tttgggtgtt 60gttgttcatg cttgcgctgc taatcccctt ttgtatgcga aaatcgggtt tgggtcgggt 120cgggtcagcc caacacgacc taatttgtgt tacgaaaatt tcaacaaaaa aaaaaagtta 180tcttccgcca ttatcgccat tccgccacga tcattaaggc tatggcggcc gcaatggcgc 240cgccatatga aacccgcaat gccatcgcta tttggtggca tttttccaaa aacccgcaat 300gtcataccgt catcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 360cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 420agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 480cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 540aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 600áacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catçttttac tttcaccagc gtttctgggt 660gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aacgccaggg ttttcccagt 720cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcccatggag tcaaagattc aaatagagga 780
cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga 810<210> 2<211> 1880<212> DNA<213> Artificial
<220>
<223> nucleotide sequence comprising the 3' flanking region ofA5547-127
<220>
<221> descrição_mixta<222> (1) . . (509)
<223> seqüência DNA inseridas<220>
<221> descrição_mixta<222> (510) .. (1880)<223> 3' flanking DNA sequences<400> 2
cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 60gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 120tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 180ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 240ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 300atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 360cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 420
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 480
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatg gcaccgccat aaccacaatt taacaacttt 540
ataaatgact tagtatatta gcaatttatc ttgtcacatg cacatatttt ataactataa 600
taggagtttg agtttaaatg atgtaatgaa ttttggattg catgttgttt tgtactatat 660
tggtagcttt ttccaatgaa gtgttaaatt tgtatttttc atatteaggg tcacgtttga 720
ccttctctag tcactgccct aattaagccc tttctcttgc actcttgatg cttacttaac 780
ctgggcatca ggcatatgta atgttatcaa tcaaactatc acgtttcatg catttattaa 840
tcttcattga tgcccttgtc tcgctcttgc ccctttttcc aatttatgct tcaaatcttt 900
gacatgttcc atgtccttat tccttttctc tgtaactgtt cattttcgtt atgaaccatg 960
aagataaact actattgtta aagtctcggt tcaaatttaa cttttctgct tttccccata 1020
taattgaata agacttggtc gtggttgttc tcattgcata tacctttatt atatgcatag 1080
aagtgatttt tttgcctaac ttgtacattt ttttatggca gtgatganga tgtagagagg 1140
cttatcgagc ttgtgaaggg aatttcttgc aagattaatc taatctcatt caatccgcac 1200
agtggatcat tcttcaaacc aaccaaatat gaaaggatga ttgaattccg aaatacattg 1260
gctggggcag gattgatagt atttttaaga cttagtagag gtgatgatca attggcttcc 1320
tgtggtcaat tgggtaagcc tggcaccatt caagctccat ttcttcgtgt accagagcaa 1380
ttccaaatgg caattggaag ttcaacttga ttctttgtgg aggttctgtg gcaaattgat 1440
cttacagtta ttaacgaaga attatatagg acacttgtgg tgggggtagc tagggatgac 1500
ttcatactga caatgcaaga ccaagagcta aattaggggg atgtctgtct gttttcatat 1560
tgtacttttc cattttacag ttaattgata tatttttttt tattaatgtg acggatccag 1620
attacttact ggctaagaaa taagaaataa aaatgattta aatatatttt tagtcgaagt 1680
ctgtattttt tagtttccca aattaaaatt tgcatttttt aatctctcat ttataaaatg 1740
cctttttaag ttcttcttag ctgatttttg gcaacttgga tgcacaatgt gcaactatcg 1800
taacaatatt tttcttgaaa tttaaagaga ctaaaatata tgttttacca taacactcat 1860
gttagtaaaa ccattatttg 1880<210> 3<211> 21<212> DNA
<220>
<223> iniciador HCA150<400> 3
tcgtcgcgct ggagttcttgt
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador DPA013<400> 4
tcatgcttgc gctgctaatc c
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador DPA228<400> 5
acccgcaatg tcataccgtc
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador KVM173<400> 6
tgctgccata accatgagtg a
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador YTP228<400> 7
atcttacgga tggcatgaca g<210> 8<211> 27<212> DNA
<213> Artificial<220>
<223> iniciador YTP220<400> 8
aactggatct caacagcggt aagatcc
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> iniciador DPA024
<400> 9
gttttacaac gtcgtgactg g<210> 10 <211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>
<223> PRIMER YTP245 <400> 10
ggcgagttct gttaggtcct c
<210> 11
<211> 21
<212> DNA<213> Artificial
<220>
<223> iniciador YTP170<400> 11
agtgaggcac ctatctcagcg
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador YTP227<400> 12
agcaataaac cagccagccg g
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador MDB688<400> 13
tgctacaggc atcgtggtgt c
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador KVM175<400> 14
gcaaaaaagc ggttagctcc t
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador MDB687<400> 15
tgtggttatg gcggtgccat c<210> 16<211> 20<212> DNA
<213> Artificial<220>
<223> iniciador SMO022
<400> 16aaggtcaaac gtgaccctga
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial<220>
<223> iniciador SMO024
<400> 17
gaagaatgat ccactgtgcg<210> 18<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>
<223> iniciador 1 por amplificação do fragmento de controle endogeno<400> 18
tgtggttatg gcggtgccat c
<210> 19
<211> 21
<212> DNA<213> Artificial
<220>
<223> iniciador 2 por amplificação do fragmento de controle endogeno<400> 19
tgctacaggc atcgtggtgt

Claims (28)

1. Método para identificar o evento de elite A5547-127 em amos-tras biológicas, cujo método compreende a detecção de uma região especí-fica A5547-127 com uma sonda ou iniciador específico, o qual especifica-mente reconhece a região flanqueadora 5' ou 3' do A5547-127.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, o referido métodocompreendendo a amplificação de um fragmento de DNA entre 100 e 500 bpde um ácido nucléico presente nas referidas amostras biológicas usandouma reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, umdos referidos iniciadores reconhecendo a região flanqueadora 5' de A5547--127, a referida região flanqueadora 5' com a seqüência de nucleotídeos daSEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 311, ou a região flanquea-dora 3' do A5547-127, a referida região flanqueadora 3' com a seqüência denucleotídeos do complemento da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até onucleotídeo 1880, o outro iniciador dos referidos iniciadores reconhecendouma seqüência no DNA estrangeiro com a seqüência de nucleotídeos docomplemento da SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 312 até o nucleotídeo 810 oua seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até o nu-cleotídeo 1880.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que o referidoiniciador reconhecendo a região flanqueadora 5' consiste em uma seqüênciade nucleotídeos de 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionados da se-qüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, do nucleotídeo 1 até o nucleotí-deo 311, ou o referido iniciador reconhecendo a região flanqueadora 3' doA5547-127 consiste em uma seqüência de nucleotídeos de 17 a 200 nucleo-tídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos do comple-mento da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880, e o refe-rido iniciador reconhecendo uma seqüência no DNA estrangeiro consiste em-17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotí-deos do complemento da SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 312 até o nucleotí-deo 810 ou a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo-510 até o nucleotídeo 1880.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que o referidoiniciador reconhecendo a região flanqueadora 5' compreende na sua extre-midade 3' extrema uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucle-otídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos da SEQ IDNO: 1 do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 311, ou o referido iniciador reco-nhecendo a região flanqueadora 31 do A5547-127 compreende em sua ex-tremidade 3' extrema uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 17 nu-cleotídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos docomplemento da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880,e o referido iniciador reconhecendo uma seqüência no DNA estrangeirocompreende na sua extremidade 3' pelo menos 17 nucleotídeos consecuti-vos selecionados da seqüência de nucleotídeos do complemento da SEQ IDNO: 1 do nucleotídeo 312 até o nucleotídeo 810 ou a seqüência de nucleotí-deos da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que os referidosiniciadores compreendem a seqüência da SEQ ID NO: 13 e da SEQ ID NO: 15, respectivamente.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, cujo método com-preende a amplificação de um fragmento de cerca de 151 bp usando o pro-tocolo de identificação A5547-127.
7. Kit para identificar o evento de elite A5547-127 em amostrasbiológicas, o referido kit compreendendo um iniciador reconhecendo a regiãoflanqueadora 5' do A5547-127, a referida região flanqueadora 5' com a se-qüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 1 até o nucleotí-deo 311, ou um iniciador reconhecendo a região flanqueadora 3' do A5547- 127, a referida região flanqueadora 3' com a seqüência de nucleotídeos docomplemento da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880,e um iniciador reconhecendo uma seqüência no DNA estrangeiro, o referidoDNA estrangeiro com a seqüência de nucleotídeos do complemento da SEQID NO: 1 do nucleotídeo 312 até o nucleotídeo 810 ou a seqüência de nucle-otídeos da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 ao nucleotídeo 1880.
8. Kit, de acordo com a reivindicação 7, em que o referido inicia-dor reconhecendo a região flanqueadora 5' consiste em uma seqüência denucleotídeos de 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionados da se-qüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 1 até o nucleotí-deo 311 ou o referido iniciador reconhecendo a região flanqueadora 3' doA5547-127 consiste em uma seqüência de nucleotídeos de 17 a 200 nucleo-tídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos do comple-mento da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880, e o refe-rido iniciador reconhecendo uma seqüência no DNA estrangeiro consiste em-17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotí-deos do complemento da SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 312 até o nucleotí-deo 810 ou a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo-510 até o nucleotídeo 1880.
9. Kit, de acordo com a reivindicação 7, em que o referido inicia-dor reconhecendo a região flanqueadora 5' compreende na sua extremidade-3' extrema uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeosconsecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 311, ou o referido iniciador reconhecendoa região flanqueadora 3' de A5547-127 compreende na sua extremidade 3'extrema uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeosconsecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos do complementoda SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880, e o referidoiniciador reconhecendo uma seqüência no DNA estrangeiro compreende nasua extremidade 3' pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionadosda seqüência de nucleotídeos do complemento da SEQ ID NO: 1 do nucleo-tídeo 312 até o nucleotídeo 810 ou a seqüência de nucleotídeos da SEQ IDNO: 2 do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880.
10. Kit, de acordo com a reivindicação 7, compreendendo uminiciador consistindo da seqüência da SEQ ID NO: 13 e um iniciador consis-tindo da seqüência da SEQ ID NO: 15.
11. Iniciador para uso em um protocolo de identificação de PCRdo A5547-127, com uma seqüência a qual, sob condições de PCR otimiza-das, reconhece especificamente uma seqüência na região flanqueadora 5'ou 3' do A5547-127, a referida região flanqueadora 5' com a seqüência denucleotídeos da SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 311, e areferida região flanqueadora 3' com a seqüência de nucleotídeos do com-plemento da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880.
12. Iniciador, de acordo com a reivindicação 11, em que o referi-do iniciador consiste em uma seqüência de nucleotídeos de 17 a 200 nucleo-tídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos da SEQ IDNO: 1 do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 311 ou uma seqüência de nucleo-tídeos de 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüência denucleotídeos do complemento da SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até onucleotídeo 1880.
13. Iniciador, de acordo com a reivindicação 11, em que o referi-do iniciador compreende na sua extremidade 3' extrema uma seqüência denucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionados daseqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 1 até o nucleo-tídeo 311 ou uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeosconsecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeos do complemento daSEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 510 até o nucleotídeo 1880.
14. Iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema aseqüência da SEQ ID NO: 13.
15. Iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema aseqüência da SEQ ID NO: 15.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, cujo método com-preende a hibridização de um ácido nucléico de amostras biológicas comuma sonda específica para o A5547-127.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, em que a se-qüência da referida sonda específica tem pelo menos 80% de identidade deseqüência com uma seqüência compreendendo parte da seqüência flanque-adora 5' ou a seqüência flanqueadora 3' do A5547-127, e a seqüência doDNA estrangeiro contíguo a essa.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que a se-qüência da referida sonda específica tem pelo menos 80% de identidade deseqüência com a SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 260 ao 360 ou com a SEQID NO: 2 do nucleotídeo 460 ao 560, ou o complemento das referidas se-qüências.
19. Kit para identificar o evento de elite A5547-127 em amostrasbiológicas, o referido kit compreendendo uma sonda específica, capaz dehibridizar especificamente a uma região específica da A5547-127.
20. Kit, de acordo com a reivindicação 19, em que a seqüênciada referida sonda específica tem pelo menos 80% de identidade de seqüên-cia com uma seqüência compreendendo parte da seqüência flanqueadora 5'ou a seqüência flanqueadora 3' do A5547-127 e a seqüência do DNA es-trangeiro contíguo a essa.
21. Kit, de acordo com a reivindicação 20, em que a seqüênciada referida sonda específica tem pelo menos 80% de identidade de seqüên-cia com a SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 260 ao 360 ou com a SEQ ID NO: 2do nucleotídeo 460 ao 560, ou o complemento das referidas seqüências.
22. Sonda específica para a identificação do evento de eliteA5547-127 em amostras biológicas.
23. Sonda, de acordo com a reivindicação 22, a qual tem pelomenos 80% de identidade de seqüência com uma seqüência compreenden-do parte da seqüência flanqueadora 5' ou da seqüência flanqueadora 3' doA5547-127 e a seqüência do DNA estrangeiro contíguo a ela, ou o seu com-plemento do mesmo.
24. Sonda, de acordo com a reivindicação 23, a qual tem pelomenos 80% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:1 do nucleotídeo-260 ao 360 ou com a SEQ ID NO: 2 do nucleotídeo 460 ao 560, ou o com-plemento das referidas seqüências.
25. Sonda específica para a identificação do evento de eliteA5547-127 em amostras biológicas, a seqüência sendo essencialmente simi-lar à SEQ ID NO: 1 do nucleotídeo 260 ao 360 ou à SEQ ID NO: 2 do nucle-otídeo 460 ao 560, ou ao complemento das referidas seqüências.
26. Método para confirmar a pureza da semente, cujo métodocompreende a detecção de uma região específica A5547-127 com um inici-ador ou sonda específica a qual reconhece especificamente a região flan-queadora 5' ou 3' do A5547-127, em amostras de sementes.
27. Método para testar sementes para a presença do A5547-127, cujo método compreende a detecção de uma região específica A5547-127 com um inieiador ou sonda específica, a qual reconhece especificamen-te a região flanqueadora 5' ou 3' do A5547-127 em amostras de lotes de sementes.
28. Planta de soja, ou células, partes, sementes ou sua progê-nie, compreendendo o evento de elite A5547-127 em seu genoma.
BRPI0610462-2A 2005-04-11 2006-04-04 Métodos para identificar o evento elite a5547-127 em amostras biológicas, para confirmar a pureza de semente e para triar sementes para a presença do referido evento, kits e sondas para a realização dos referidos métodos, bem como dna referente ao evento elite a5547-127 BRPI0610462B1 (pt)

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