BRPI0610463A2

BRPI0610463A2 - usos de um antagonista de ngf e kits e composições farmacêuticas contendo o mesmo

Info

Publication number: BRPI0610463A2
Application number: BRPI0610463-0A
Authority: BR
Inventors: Arnon Rosenthal; Patricia Ann Walicke; David L Shelton
Original assignee: Rinat Neuroscience Corp
Priority date: 2005-04-11
Filing date: 2006-04-11
Publication date: 2010-06-22
Also published as: US20110033447A1; KR20100135336A; DK2305711T3; WO2006110883A3; PT2305711T; IL239170A0; SI2305711T1; ES2389960T3; RU2007137102A; KR101383440B1; WO2006110883A8; TW201242979A; PL1871416T3; EP1871416A2; ES2641787T3; US20080182978A1; AU2006235559A1; TW200716672A; DK1871416T3; AU2006235559B2

Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos anti-NGF (tais como anticorpos anti-NGF antagonistas), e polinucleotídeos codificando os mesmos. A invenção adicionalmente refere-se ao uso de semelhantes anticorpos e/ou polinucleotídeos no tratamento e/ou prevenção de dor, inclusive dor pós-cirúrgica, dor da artrite reumatóide, e dor de osteoartrite.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA TRATAR DOR DE OSTEOARTRITE ADMINISTRANDO UM ANTA-GONISTA DE FATOR DE CRESCIMENTO NERVOSO E COMPOSIÇÕESCONTENDO O MESMO".

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício de prioridade do pedido depatente dos Estados Unidos Serial No. 11/104.248, arquivado em 11 de abri-la de 2005, o qual é incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio dereferência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presnete invenção refere-se a anticorpos anti-NGF (tais comoanticorpos antagonistas anti-NGF). A invenção adicionalmente refere-se aouso de antagonistas tais como anticorpos no tratamento e/ou prevenção dedor, inclusive dor pós-cirúrgica, dor da artrite reumatóide, e dor de osteoartrite.

ANTECENTES DA INVENÇÃO

O fator de crescimento nervoso (NGF) foi a primeira neurotrofinaa ser identificada, e sua função no desenvolvimento e sobrevida tanto dosneurônios periféricos quanto centrais foi bem caracterizado. Foi demonstra-do que o NGF:é um fator crucial de sobrevida e manutenção no desenvolvi-mento de neurônios periféricos simpáticos e embrionários sensoriais e deneurônios colinérgicos do prosencéfalo basal. Smeyne et al., Nature368:246-249 (1994) e Crowley et al., Ce//76:1001-1011 (1994). O fator decrescimento nervoso regula para cima a expressão de neuropeptídeos emneurônios sensoriais (Lindsay and Harmer, Nature 337:362-364 (1989)) esua atividade é mediada através de dois receptores ligados a membranadiferentes, o receptor de tirosina quinase TrkA e o receptor de neurotrofinacomum p75 (algumas denominados receptores de NGF "de alta afinidade" e"de baixa afinidade", respectivamente). Chão et al., Science 232:518-521(1986). O receptor p75 é estruturalmente relacionado o outros membros dafamília de receptores do fator de necrose tumoral (Chão, et al., Science232:518-521 (1986)). Para revisão sobre NGF, veja Huang et al., Annu. Rev.Neurosci. 24:677-736 (2001); Bibel et al., Genes Dev. 14:2919-2937 (2000).Foi determinada a estrutura cristalina de NGF e NGF em complexo com oreceptor trkA. Veja Nature 254:411 (1991); Nature 401:184-188 (1996).

Além de seus efeitos no sistema nervoso, o NGF tem sido cres-centemente implicado em processos fora do sistema nervoso. Por exemplo,foi mostrado que NGF reforça a permeabilidade vascular (Otten, et al., EurJPharmacol. 106:199-201 (1984)), reforça as reações imunes de células T e B(Otten, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10059-10063 (1989)), induz dife-renciação de linfócitos e proliferação de mastócitos e causa a liberção desinais biológicos solúveis de mastócitos (Matsuda, et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA 85:6508-6512 (1988); Pearce, et al., J. Physiol. 372:379-393(1986); Bischoff, et al., Blood 79:2662-2669 (1992); Horigome, et al., J. Biol.Chem. 268:14881-14887 (1993)). Embora tenha sido mostrado que NGFadicionado exogenamente tem a capacidade de ter todos estes efeitos, éimportante notar que somente raramente foi mostrado que NGF endógeno éimportante em quaisquer destes processos in vivo (Torcia, et al., Cell.-85(3):345-56 (1996)). Portanto, não está claro qual este efeito pode ser, sehouver, para inibir a bioatividade do NGF endógeno.

NGF é produzido por uma série de tipos celulares inclusive mas-tócitos (Leon, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91.3739-3743 (1994)), linfóci-tos B (Torcia, et al., Cell 85:345-356 (1996), queratinócitos (Di Marco, et al.,J. Biol. Chem. 268:22838-22846)), células musculares lisas (Ueyama, et al.,J. Hypertens. 11:1061-1065 (1993)), fibroblastos (Lindholm, et al., Eur. J.Neurosci. 2:795-801 (1990)), células epiteliais bronquiais (Kassel, et al., Clin,Exp. Allergy 31:1432-40 (2001)), células mesangiais renais (Steiner, et al.,Am. J. Physiol. 261:F792-798 (1991)) e miotubos dos músculos esqueléticos(Schwartz, et al., J Photochem. Photobiol. B66:195-200 (2002)). Foram en-contrados receptores de NGF em uma variedade de tipos celulares fora dosistema nervoso. Por exemplo, TrkA foi encontrado em monócitos humanos,linfócitos T e B e em mastócitos.

Foi observada uma associação entre aumento dos níveis deNGF e uma variedade de condições inflamatórias em pacientes humanosbem como em vários modelos animais. Estes incluem lúpus eritematoso sis-têmico (Bracci-Laudiero, et al., Neuroreport 4:563-565 (1993)), esclerosemúltipla (Bracci-Laudiero, et al., Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), psoríase(Raychaudhuri, et al., Acta Derm. 1'enereol. 78:84-86 (1998)), artrite (Falcim,et al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), cistite intersticial (Okragly, etal., J. Urology 161:438-441 (1999)) e asma (Braun, et al., Eur. J Immunol.28:3240-3251 (1998)).

Consistentemente, um nível elevado de NGF nos tecidos perifé-ricos está associado a hiperalgesia e inflamação e foi observado em umasérie de formas de artrite. A sinóvia dos pacientes afetados por artrite reu-matóide expressa altos níveis de NGF ao passo que foi reportado que é in-detectável NGF em sinóvia não inflamada (Aloe, et al., Arch. Rheum. 35:351-355 (1992)). Foram vistos resultados semelhantes em ratos com artrite reu-matóide induzida experimentalmente (Aloe, et al., Clin. Exp. Rheumatol.10:203-204 (1992)). Foram reportados níveis elevados de NGF em camun-dongos artríticos transgênicos junto com um aumento no número de mastó-citos (Aloe, el al., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143(1993)). Publicação de Patente Internacional No. WO 02/096458 descreve ouso de anticorpos anti-NGF de algumas propriedades no tratamento de vá-rios distúrbios relacionados com o NGF tais como condição inflamatória (porexemplo, artrite reumatóide). Foi reportado que um anticorpo anti-NGF puri-ficado injetado em camundongos artríticos transgênicos carregando o genedo fator-a de necrose tumoral humana (TNF-a) causou redução no númerode mastócitos, bem como uma redução nos níveis de histamina e substânciaP dentro da sinóvia de camundongos com artrite (Aloe et al., Rheumatol. Int.14: 249-252 (1995)). Foi mostrado que a administração exógena de um anti-corpo contra NGF reduziuo aumento do nível de TNF-a ocorrendo em ca-mundongos artríticos (Manni et al., Rheumatol. Int. 18: 97-102 (1998)).

Além disso, foi observado o aumento da expressão de NGF ereceptor de NGF de alta afinidade (TrkA) em condrócitos na osteoartrite hu-mana (lannone et al., Rheumatology 41:1413-1418 (2002)).

Foram reportados anticorpos antagonistas anti-NGF de roedo-res. Veja, por exemplo, Hongo et al, Hybridoma (2000) 19(3):215-227; Ru-berti et Al. (1993) Cell. Molec. Neurobiol. 13(5): 559-568. No entanto, quandoanticorpos de roedores são usados terapeuticamente em seres humanos,desenvolve-se uma reação de anticorpo antimurino humano em númerossignificativos de indivíduos tratados. Além disso, funções efetoras de anti-corpos de camundongo se comprovaram menos eficientes no contexto hu-mano. Portanto, existe uma séria necessidade de anticorpos antagonistasanti-NGF, inclusive anticorpos antagonistas anti-NGF humanizados.

Todas as referências, publicações, e pedidos de patente descri-tos aqui, são por este incorporado por meio de referência em sua totalidade.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção descreve aqui, diz respeito a anticorpos contra fatorde crescimento nervoso.

Em outro aspecto, a invenção é um anticorpo maturado de afini-dade e humanizado, E3, o qual especificamente liga fator de crescimentonervoso humano e de roedor ("NGF"). A seqüências de aminoácidos da ca-deia pesada e regiões variáveis de cadeia leve de E3 são mostradas nasFiguras 1A (SEQ ID NO: 1) e 1B (SEQ ID NO: 2), respectivamente. As por-ções de CDR de anticorpo E3 (inclusive CDRs de Chothia e Kabat) são re-presentadas diagrammaticamente nas Figuras 1A e 1B. As seqüências deaminoácidos de cadeias pesada e leve E3, e das CDRs individuais estendi-das também são mostradas abaixo (Veja, "seqüências de anticorpos", abai-xo).

Em outro aspecto, a invenção é um anticorpo compreendendoum fragmento ou uma região do anticorpo E3 (denominado de modo inter-cambiável "E3" aqui). Em uma modalidade, o fragmento é uma cadeia levedo anticorpo E3 conforme mostrado na Figura 1B. Em outra modalidade, ofragmento é uma cadeia pesada do anticorpo E3 conforme mostrado na Fi-gura 1A. Em ainda outra modalidade, o fragmento contém uma ou mais regi-ões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo E3.

Em ainda outra modalidade, o fragmento contém uma ou mais regiões de-terminantes de complementaridade (CDRs) de uma cadeia leve e/ou umacadeia pesada do anticorpo E3 conforme mostrado na Figura 1A e 1B.

Em outro aspecto, a invenção é um anticorpo compreendendouma cadeia leve que é codificada por um polinucleotídeo que é produzidopor uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4893 ou ATCC No. PTA-4894. Em outro aspecto, a invenção é um anticorpocompreendendo uma cadeia pesada que é codificada por um polinucleotídeoque é produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito deATCC No. PTA-4895. Em outro aspecto, a invenção é um anticorpo compre-endendo (a) uma cadeia leve que é codificada por um polinucleotídeo que éproduzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCCNo. PTA-4894 o ATCC No. PTA-4893; e (b) uma cadeia pesada que é codi-ficada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeiracom um número de depósito de ATCC No. PTA-4895 (por conveniência a-qui, o um ou mais polinucleotídeos produzidos por uma célula hospedeiradepositada são referidos como tendo um número de depósito de ATCC NOsPTA-4894, PTA-4893 e PTA-4895). Em outro aspecto, a invenção é um anti-corpo compreendendo uma região variável de cadeia leve de uma cadeialeve que é codificada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célulahospedeira com um número de depósito de ATCC No. PTA-4894 ou ATCCNo. PTA-4893.; Em outro aspecto, a invenção é um anticorpo compreenden-do uma região variável de cadeia pesada de uma cadeia pesada que é codi-ficada por um polinucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeiracom um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em outro aspecto, ainvenção é um anticorpo compreendendo (a) uma região variável de cadeialeve de uma cadeia leve que é codificada por um polinucleotídeo que é pro-duzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCC No.PTA-4894 ou ATCC No. PTA-4893, e (b) uma região variável de cadeia pe-sada de uma cadeia pesada que é codificada por um polinucleotídeo que éproduzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCCNo. PTA-4895. Em ainda outro aspecto, a invenção é um anticorpo compre-endendo uma ou mais CDRs codificadas por (a) um polinucleotídeo que éproduzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCCNo. PTA-4894; e/ou (b) uma cadeia pesada que é codificada por um polinu-cleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número dedepósito de ATCC No. PTA-4895.

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a regiãoconstante de lgG2a de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades oanticorpo compreende a região constante capa de cadeia leve humana. Emalgumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante modi-ficada, tal como uma região constante que é imunologicamente inerte, porexemplo, não dispara lise mediada por complemento, ou não estimula citoto-xicidade mediada por células anticorpo-dependentea (ADCC). Em outrasmodalidades, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J.Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pedido de Patente No. PCT/GB99/01441;e/ou Pedido de Patente do Reino Unido No. 9809951.8. Em ainda outrasmodalidades, o anticorpo compreende uma região constante de lgG2a decadeia pesada humana compreendendo as seguintes mutações: A330P331a S330S331 (numeração de aminoácidos com referência à seqüência delgG2a selvagem). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (osquais podem ser ou não um anticorpo) compreendendo qualquer um ou maisdos seguintes: a) uma ou mais CDRs de anticorpo E3 mostrada nas Figuras1A e 1B; b) CDR H3 da cadeia pesada de anticorpo E3 mostrada na figura1A; c) CDR L3 da cadeia leve de anticorpo E3 mostrada na Figura 1B; d)três CDRs da cadeia leve de anticorpo E3 mostrada na Figura 1B; e) trêsCDRs da cadeia pesada de anticorpo E3 mostrada na Figura 1A; e f) trêsCDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada, de anticorpo E3 mos-trada nas Figuras 1A e 1B. A invenção proporciona adicionalmente polipep-tídeos (os quais podem ser ou não um anticorpo) compreendendo qualquerum ou mais dos seguintes: a) uma ou mais (uma, duas, três, quatro, cindo,ou seis) CDRs derivadas do anticorpo E3 mostrada nas Figuras 1A e 1B; b)uma CDR derivada de CDR H3 da cadeia pesada de anticorpo E3 mostradana Figura 1A; e/ou c) uma CDR derivada de CDR L3 da cadeia leve de anti-corpo E3 mostrada na Figura 1B. Em algumas modalidades, as CDRs po-dem ser CDRs Kabat, CDRs Chothia, ou uma combinação de CDRs Kabat eChothia (denominadas CDRs "estendidas" ou "combinadas" aqui). Em algu-mas modalidades, polipeptídeos (tais como um anticorpo) ligam NGF (talcomo NGF humano). Em algumas modalidades, os polipeptídeos compreen-dem quaisquer das configurações de CDF (inclusive combinações, variantes,e etc.) descritas aqui.

Em um aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (tais co-mo um anticorpo), os quais compreendem uma região variável de cadeiapesada compreendendo SEQ ID NO: 9, em que 134 é S, L, V A, ou I; e N35 ésubstituído com N, T ou S. Por conveniência aqui, "substituído" ou "é" nestecontexto ou referência a um aminoácido se refere a escolhas de um ou maisaminoácidos para uma dada posição. Conforme é claro, a substituição, ouescolha, pode ser o aminoácido representado em uma SEQ ID ou Figura.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma região variável de cadeiapesada compreendendo SEQ ID NO: 10, em que M50 é M, I, G, Q, S, ou L;A62 é A, ou S; e L63 é L ou V.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma região variável de cadeiapesada compreendendo SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L, ou R; em queY101 é Y ou W; em que G103 é G, A, õu S; em que T104 é T ou S; em queS105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; emque F108 é F ou W; em que D109 é D, N, ou G; e em que Y110 é Y, K, S, Rou T.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma região variável de cadeiapesada compreendendo SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L, ou R; em queY101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; em queS105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; emque F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T, ou G; e em queY110 é qualquer aminoácido.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma região variável de cadeiapesada compreendendo SEQ ID NO: 11, em que G98 é G, S, A, C, V, N, D,ou T; em que G99 é G, S, A, C, V, N, D, ou T; em que Y100 é Y, L, ou R; emque Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; emque S105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F;em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T, ou G; e em queY110 é qualquer aminoácido.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma região variável de cadeialeve compreendendo SEQ ID NO: 12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A,ou Y; e H32 é H, N, ou Q.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma região variável de cadeialeve compreendendo SEQ ID NO: 13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é SouT.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma região variável de cadeialeve compreendendo SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou Ê; K92 é K, H, R,ou S; e em que Y96 é Y ou R.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma região variável de cadeialeve compreendendo SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é qualqueraminoácido; T93 é qualquer aminoácido; e em que Y96 é Y ou R.

Em um aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (tais co-mo um anticorpo), os quais compreendem uma seqüência de aminoacidosmostrada na SEQ ID NO: 9, em que I34 é S, L, VA, ou I; e N35 é N, T ou S.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma seqüência de aminoacidosmostrada na SEQ ID NO: 10, em que M50 é M, I, G, Q, S, ou L; A62 é A, ouS; e L63 é L ou V.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma seqüência de aminoacidosmostrada na SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L, ou R; em que Y101 é You W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S,A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108é F ou W; em que D109 é D, N, ou G; e em que Y110 é Y, K, S, R ou T.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma seqüência de aminoácidosmostrada na SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L, ou R; em que Y101 é You W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S,A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T, ou G; e em que Y110 é qual-quer aminoácido.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma seqüência de aminoácidosmostrada na SEQ ID NO: 11, em que G98 é G, S, A, C, V, N, D, ou T; emque G99 é G, S, A, C, V, N, D, ou T; em que Y100 é Y, L, ou R; em queY101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; em queS105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; emque F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T, ou G; e em queY110 é qualquer aminoácido.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma seqüência de aminoácidosmostrada na SEQ ID NO: 12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A, ou Y; eH32 é H, N, ou Q.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma seqüência de aminoácidosmostrada na SEQ ID NO: 13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma seqüência de aminoácidosmostrada na SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R, ou S; eem que Y96 é Y ou R.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma seqüência de aminoácidosmostrada na SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoa-cido; T93 é qualquer aminoacido; e em que Y96 é Y ou R.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo anticorpos, inclusive anticorpos humanizados) os quais compreendemuma região variável de cadeia pesada compreendendo a região CDR1 deSEQ ID NO: 9, em que I34 é S, L, V A, ou I; e N35 é N, T ou S; a regiãoCDR2 de SEQ ID NO: 10, em que M50 é M, I, G, Q, S, ou L; A62 é A, ou S;e L63 é L ou V; e a região CDR3 de SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L, ouR; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ouS; em que S105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 éY ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N, ou G; em que Y110 éY, K, S, R ou T. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesa-da compreende a região CDR3 de SEQ ID NO: 11, em que Y100 e Y, L, ouR; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ouS; em que S105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 éY ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T, ou G;em que Y110 é qualquer aminoacido. Em outras modalidades, a região vari-ável de cadeia pesada compreende a região CDR3 de SEQ ID NO: 11, emque G98 é G, S, A, C, V, N, D, ou T; em que G99 é G, S, A, C, V, N, D, ou T;em que Y100 é Y, L, ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ouS; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T,ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A,C, G, D, N, T, ou G; e em que Y110 é qualquer aminoacido. Em algumasmodalidades, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) adicionalmente com-preende uma região variável de cadeia leve de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma região variável de cadeialeve compreendendo a região CDR1 de SEQ ID NO: 12, em que S26 é S ouF; D28 é D, S, A, ou Y; e H32 é H, N, ou Q; a região CDR2 de SEQ ID NO:13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e a região CDR3 de SEQ IDNO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R, ou S; e em que Y96 é Y ou R.Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende aregião CDR3 de SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é qualquer ami-noácido; T93 é qualquer aminoácido; e em que Y96 é Y ou R. Em algumasmodalidades, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) adicionalmente com-preende uma cadeia pesada de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais (a) uma região variável de cadeia pesada com-preendendo a região CDR1 de SEQ ID NO: 9, em que I34 é S, L, V A, ou I; eN35 é N, T ou S; a região CDR2 de SEQ ID NO: 10, em que M50 é M, I, G,Q, S, ou L; A62 é A, ou S; e L63 é L ou V; e a região CDR3 de SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L, ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A,ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y,R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 éD, N, ou G; em que Y110 é Y, K, S, R ou T; e (b) uma região variável de ca-deia leve compreendendo a região CDR1 de SEQ ID NO: 12, em que S26 éS ou F; D28 é D, S, A, ou Y; e H32 é H, N, ou Q; a região CDR2 de SEQ IDNO: 13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e a região CDR3 de SEQID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R, ou S; e em que Y96 é Y ouR. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende aregião CDR3 de SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é qualquer ami-noácido; T93 é qualquer aminoácido; e em que Y96 é Y ou R. Em algumasmodalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a região C-DR3 de SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L, ou R; em que Y101 é Y ou W;em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A, ouT; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ouW; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T, ou G; em que Y110 é qualquer ami-noácido. Em outras modalidades, a região variável de cadeia pesada com-preende a região CDR3 de SEQ ID NO: 11, em que G98 é G, S, A, C, V, N,D, ou T; em que G99 é G, S, A, C, V, N, D, ou T; em que Y100 é Y, L, ou R;em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S;em que S105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é You F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T, ou G; e emque Y110 é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeoadicionalmente compreende uma cadeia leve de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (comoum anticorpo, inclusive um anticorpo humanizado) os quais compreendemuma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 9, em que I34 é S,L, V A, ou I; e N35 é N, T ou S; uma seqüência de aminoácidos mostrada naSEQ ID NO: 10, em que M50 é M, I, G, Q, S, ou L; A62 é A, ou S; e L63 é Lou V; e uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 11, emque Y100 é Y, L, ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S;em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T,ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N,ou G; em que Y110 é Y, K, S, R ou T. Em algumas modalidades, o polipeptí-deo compreende uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:11, em que Y100 é Y, L, ou R; e em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G,A, ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A, ou T; em que Y106 éY, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109é S, A, C, G, D, N, T, ou G; e em que Y110 é qualquer aminoácido. Em ou-tras modalidades, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoáci-dos mostrada na SEQ ID NO: 11, em que G98 é G, S, A, C, V, N, D, ou T;em que G99 é G, S, A, C, V, N, D, ou T; em que Y100 é Y, L, ou R; em queY101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; em queS105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; emque F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T, ou G; e em queY110 é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo (talcomo um anticorpo) adicionalmente compreende uma região variável de ca-deia leve de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais compreendem uma seqüência de aminoácidosmostrada na SEQ ID NO: 12, em que S26 é S ou F; D28 é D, S, A, ou Y; eH32 é H, N, ou Q; uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:1.3, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e uma seqüência de aminoá-cidos mostrada na SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R, ouS; e em que Y96 é Y ou R. Em algumas modalidades, o polipeptídeo com-preende uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, emque S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoácido; T93 é qualquer aminoácido;e em que Y96 é Y ou R. Em algumas modalidades, o polipeptídeo (tal comoum anticorpo) adicionalmente compreende uma região variável de cadeiapesada de anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo) os quais (a) uma seqüência de aminoácidos mostradana SEQ ID NO: 9, em que I34 é S, L, V A, ou I; e N35 é N, T ou S; uma se-qüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10, em que M50 é M, I, G,Q, S, ou L; A62 é A, ou S; e L63 é L ou V; e uma seqüência de aminoácidosmostrada na SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L, ou R; em que Y101 é You W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S,A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108é F ou W; em que D109 é D, N, ou G; e em que Y110 é Y, K, S, R ou T; e (b)uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, em que S26 éS ou F; D28 é D, S, A, ou Y; e H32 é H, N, ou Q; uma seqüência de aminoá-cidos mostrada na SEQ ID NO: 13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ouT; e uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, em queS91 é S ou E; K92 é K, H, R, ou S; e em que Y96 é Y ou R. Em algumasmodalidades, p polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidosmostrada na SEQ ID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é qualquer aminoá-cido; T93 é qualquer aminoácido; e em que Y96 é Y ou R. Em algumas mo-dalidades, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos mos-trada na SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L, ou R; em que Y101 é Y ou W;em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; em que S105 é S, A, ouT; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; em que F108 é F ouW; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T, ou G; em que Y110 é qualquer ami-noácido. Em outras modalidades, o polipeptídeo compreende uma seqüên-cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 11, em que G98 é G, S, A, C,V, N, D, ou T; em que G99 é G, S, A, C, V, N, D, ou T; em que Y100 é Y, L,ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é Tou S; em que S105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é S, A, C, G, D, N, T, ou G;e em que Y110 é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, o polipep-tídeo adicionalmente compreende uma região variável de cadeia leve de an-ticorpo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeo (tais co-mo anticorpos) compreendendo uma região variável de cadeia pesada com-preendendo: (a) uma região CDR1 de SEQ ID NO: 9, em que I34 é S, L, V A,ou I; e N35 é substituído com N, T ou S; (b) uma região CDR2 de SEQ IDNO: 10, em que M50 é I, G, Q, S, ou L; A62 é A, ou S; e L63 é L ou V; e (c)uma região CDR3 de SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y, L, ou R; em queY101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 é T ou S; em queS105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em que Y107 é Y ou F; emque F108 é F ou W; em que D109 é D, N, ou G; e em que Y110 é Y, K, S, Rou T; em que o anticorpo liga NGF.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo anticorpos) compreendendo uma região variável de cadeia leve com-preendendo: (a) uma região CDR1 de SEQ ID NO: 12, em que S26 é S ou F;D28 é D, S, A, ou Y; e H32 é H, N, ou Q; (b) uma região CDR2 de SEQ IDNO: 13, em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e (c) uma CDR3 regionde SEQ ID NO: 14, em que K92 é K, H, R, ou S; e em que Y96 é Y ou R; emque o anticorpo liga NGF.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo anticorpos) compreendendo (a) uma região variável de cadeia pesadacompreendendo: (i) uma região CDR1 de SEQ ID NO: 9, em que I34 é subs-tituído com S, L, V A, ou I; e N35 é substituído com N, T ou S; (ii) uma regiãoCDR2 de SEQ ID NO: 10, em que M50 e I, G, Q, S, ou L; A62 é A, ou S; eL63 é L ou V; e (iii) uma região CDR3 de SEQ ID NO: 11, em que Y100 é Y,L, ou R; em que Y101 é Y ou W; em que G103 é G, A, ou S; em que T104 éT ou S; em que S105 é S, A, ou T; em que Y106 é Y, R, T, ou M; em queY107 é Y ou F; em que F108 é F ou W; em que D109 é D, N, ou G; em queY110 é Y, K, S, R ou T; e (b) uma região variável de cadeia leve compreen-dendo: (i) uma região CDR1 de SEQ ID NO: 12, em que S26 é S ou F; D28 éD, S, A, ou Y; e H32 é H, N, ou Q; (ii) uma região CDR2 de SEQ ID NO: 13,em que 151 é I, T, V ou A; e S56 é S ou T; e (iii) uma região CDR3 de SEQID NO: 14, em que S91 é S ou E; K92 é K, H, R, ou S; e em que Y96 é Y ouR; em que o anticorpo liga NGF.

A menos que mencionado de outro modo, a escolha (por exem-plo, substituição) de um aminoácido em uma localização é selecionada inde-pendentemente da seleção de um aminoácido em qualquer outra localiza-ção.

Em algumas modalidades, polinucleotídeos (tais como um anti-corpo) ligam NGF (tal como NGF humano). Em algumas modalidades, ospolipeptídeos compreendem quaisquer das configurações de CDR (inclusivecombinações, variações, e etc.) descritas aqui.

Conforme é evidente a partir da descrição aqui, a numeração deregiões variáveis usada aqui, é numeração seqüencial. Uma pessoa versadana técnica entende prontamente que existe uma série de sistemas de nume-ração de anticorpos (tais como numeração Kabat e Chothia), e como conver-ter numeração seqüencial em outro sistema de numeração, tal como nume-ração Kabat ou numeração Chothia.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo (taiscomo um anticorpo) compreendendo uma seqüência de aminoacidos (talcomo uma seqüência CDR3) selecionada entre SEQ ID NO: 46 ou 50. Emainda outras modalidades, o polipeptídeo adicionalmente compreende umaou mais das seqüências de aminoacidos mostradas nas SEQ ID NOS: 3, 4,5, 6, 7, e 8. Em ainda outras modalidades, o polipeptídeo adicionalmentecompreende uma ou mais das seqüências de aminoacidos mostradas nasSEQ ID NOS: 9, 10, 11, 12, 13, 14, e 15.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo (talcomo um anticorpo) compreendendo uma seqüência de aminoacidos (talcomo uma região CDR, tal como uma região CDR H1 e/ou CDR H2) sele-cionada entre (a) SEQ ID NOS: 28 e/ou 29; (b) SEQ ID NOS: 30 e/ou 31; (c)SEQ ID NOS: 32 e/ou 33; (d) SEQ ID NOS: 34 e/ou 35; (e) SEQ ID NOS: 36e/ou 37; (f) SEQ ID NOS: 38 e/ou 39; e (g) SEQ ID NOS: 40 e 41. Em algu-mas modalidades, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoaci-dos (tal como uma região CDR H1) selecionada entre SEQ ID NOS: 28, 30,32, 34, 36, 38, e 40. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendeuma seqüência de aminoacidos (tal como uma região CDR H2) selecionadaentre SEQ ID NOS: 29, 31, 33, 35, 37, 39 e 41. Em ainda outras modalida-des, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma ou mais das seqüên-cias de aminoacidos mostradas nas SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 6, 7, e 8. Em ain-da outras modalidades, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma oumais das seqüências de aminoacidos mostradas nas SEQ ID NOS: 9, 10,11, 12, 13, 14, e 15.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo (talcomo um anticorpo) compreendendo uma seqüência de aminoacidos (talcomo uma região CDR, tal como uma região CDRL1 e/ou CDR L2) selecio-nada entre (a) SEQ ID NOS: 18 e/ou 19; (b) SEQ ID NOS: 20 e/ou 21; e (c)SEQ ID NOS: 22 e/ou 23. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compre-ende uma seqüência de aminoacidos (tal como uma região CDR L1) sele-cionada entre SEQ ID NOS: 18, 20, e 22. Em algumas modalidades, o poli-peptídeo compreende uma seqüência de aminoacidos (tal como uma regiãoCDR L2) selecionada entre SEQ ID NOS: 19, 21, e 23. Em ainda outras mo-dalidades, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma ou mais das se-qüências de aminoacidos mostradas nas SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Emainda outras modalidades, o polipeptídeo adicionalmente compreende umaou mais das seqüências de aminoacidos mostradas nas SEQ ID NOS: 9, 10,11, 12, 13, 14, e 15.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo (talcomo um anticorpo) compreendendo uma seqüência de aminoacidos (talcomo uma região CDR, tal como uma região CDRL3 e/ou CDR H3) selecio-nada entre (a) SEQ ID NOS: 51 e/ou 52; (b) SEQ ID NOS: 55 e/ou 56; (c)SEQ ID NOS: 57 e/ou 58; (c) SEQ ID NOS: 59 e/ou 60; (d) SEQ ID NOS: 61e/ou 62; (e) SEQ ID NOS: 63 e/ou 64. Em algumas modalidades, o polipep-tídeo compreende uma seqüência de aminoacidos (tal como uma regiãoCDR L3) selecionada entre SEQ ID NOS: 51, 55, 57, 59, 61, e 63. Em algu-mas modalidades, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoaci-dos (tal como uma região CDR H3) selecionada entre SEQ ID NOS: 52, 56,58, 60, 62, e 64. Em ainda outras modalidades, o polipeptídeo adicionalmen-te compreende uma seqüência de aminoacidos mostrada em uma ou maisdas SEQ ID NOS: 18, 19, 30 e 31. Em ainda outras modalidades, o polipep-tídeo adicionalmente compreende uma ou mais das seqüências de aminoa-cidos mostradas nas SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 6, 7, e 8. Em ainda outras moda-lidades, o polipeptídeo adicionalmente compreende uma ou mais das se-qüências de aminoacidos mostradas nas SEQ ID NOS: 9, 10, 11, 12, 13, 14,e15.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polipeptídeo (talcomo um anticorpo) compreendendo uma ou mais de uma seqüência de a-minoácidos (tal como uma região CDR) mostrada nas SEQ ID NOS: 61, 63,18, 19, 30 e 31.

Em um aspecto, a invenção proporciona um anticorpo anti-NGF(tal como um anticorpo antagonista) que liga NGF (tal como NGF humano)com uma alta afinidade. Em algumas modalidades, alta afinidade é (a) liga-ção de NGF com uma Kd de menos de cerca de 2 nM (tais como any de cer-ca de 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70pM, 60 pM, 50 :pM, or less), e/ou uma "koff" de mais lento do que cerca de6x10"5 s"1); e/ou (b) inibição (redução, e/ou bloqueio) da sobrevida depen-dente do fator de crescimento nervoso humano de neurônios trigeminaisE13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 15 pM deNGF) de cerca de qualquer de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40pM, 20 pM, 10 pM, ou menos; e/ou (c) inibição (redução, e/ou bloqueio) dasobrevida dependente do fator de crescimento nervoso humano de neurô-nios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na presença de cer-ca de 1.5 pM de NGF) de cerca de qualquer de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM, ou menos; e/ou (d) inibição (redução,e/ou bloqueio) da sobrevida dependente do fator de crescimento nervoso derato de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (na pre-sença de cerca de 15 pM de NGF) de cerca de qualquer de 150 pM, 125 pM,100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, ou menos; e/ou(e) inibição (redução, e/ou bloqueio) da sobrevida dependente do fator decrescimento nervoso de rato de neurônios trigeminais E13.5 de camundongocom uma IC50 (na presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de cerca de qual-quer de 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM,ou menos; e/ou (f) e/ou ligação de NGF com maior afinidade do que o recep-tor trkA.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (taiscomo um anticorpo), em que os polipeptídeos (a) ligam NGF (tal como NGFhumano) com uma Kd de menos de cerca de 2 nM (tais como qualquer decerca de 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100pM, 90 pM, 80 pM, 70pM, 60 pM, 50 pM, ou menos), e/ou uma "koff" de mais lento do que cercade 6x10"5 s"1); e/ou (b) inibem a sobrevida dependente do fator de cresci-mento nervoso humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo comuma IC50 (na presença de cerca de 15 pM de NGF) de cerca de qualquer de200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM, ou menos;e/ou (c) inibem a sobrevida dependente do fator de crescimento nervosohumano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 (napresença de cerca de 1,5 pM de NGF) de cerca de qualquer de 50 pM, 40pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM, ou menos; e/ou ligamNGF com maior afinidade do que o receptor trkA. Em algumas modalidades,os polipeptídeos (a) ligam NGF com uma Kd de menos de cerca de 2 nM;e/ou (b) inibem a sobrevida dependente do fator de crescimento nervosohumano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 decerca de 100 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cercade 15 pM de NGF; e/ou (c) inibem a sobrevida dependente do fator de cres-cimento nervoso humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongocom uma IC50 de cerca de 10 pM ou menos, em que a IC50 é medida napresença de cerca de 1.5 pM de NGF, em que a IC50 é medida na presençade cerca de 15 pM de NGF. Em algumas modalidades, os polipeptídeos (a)ligam NGF com uma KD de menos de cerca de 100 pM; e/ou (b) inibem asobrevida dependente do fator de crescimento nervoso humano de neurô-nios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cerca de 20 pM oumenos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de 15 pM de NGF;e/ou (c) inibem a sobrevida dependente do fator de crescimento nervosohumano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 decerca de 2 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cerca de1,5 pM de NGF.

Conforme é evidente a partir da descrição aqui, especificamenteexcluídos da invenção estão modalidades de polipeptídeos consistindo naseqüência de aminoacidos idêntica a uma seqüência de aminoacidos de an-ticorpo monoclonal de camundongo, 911. As seqüências de CDR estendidasde Mab 911 são mostradas nas Figuras 1A e 1B, e nas SEQ ID NOS: 9-14.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona quaisquerdos polipeptídeos ou anticorpos acima, adicionalmente em que o polipeptí-deo (tal como um anticorpo) é isolado. Em algumas modalidades, o polipep-tídeo (tal como um anticorpo) é essencialmente purificado. Em ainda outrasmodalidades, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) é maturado por afinida-de. Em outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo antagonista. Em al-gumas modalidades, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreendeseqüências de estrutura humana. Em ainda outras modalidades, o polipeptí-deo (tal comcvum anticorpo) compreende um ou mais resíduos de estruturanão humana. Em algumas modalidades, o polipeptídeo (tal como um anti-corpo) liga NGF (tal como NGF humano) com uma KD de 2 nM ou menos.Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma ou mais (taiscomo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais) substituições de aminoacidos humanos emrelação a uma seqüência de aminoacidos não humana (tal como uma se-qüência de região variável, tais como uma seqüência de CDR, tal como umaseqüência de estrutura). Em algumas modalidades, o polipeptídeo compre-ende no mínimo 1, no mínimo 2, ou mais tal como no mínimo 3, 4, 5, 6, oumais substituições de aminoacidos em relação a uma seqüência de aminoá-cidos do polipeptídeo de origem (tal como uma seqüência de aminoacidosdo anticorpo 911, tal como qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs 9-14).Em algumas modalidades, a afinidade de ligação do anticorpo foi alterada(em algumas modalidades, aumentada) em relação a um anticorpo de ori-gem (tal como Mab 911) afinidade. Em ainda outras modalidades, a afinida-de de ligação do anticorpo é menor do que a afinidade de ligação do recep-tor trkA para NGF (tal como NGF humano). Em algumas modalidades, ospolipeptídeos podem ser anticorpos. Em algumas modalidades, os anticor-pos são anticorpos humanos. Em outras modalidades, os anticorpos sãoanticorpos humanizados. Em ainda outras modalidades, os anticorpos sãoanticorpos monoclonais. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anti-corpo maturado por afinidade.

A invenção proporciona polinucleotídeos (inclusive polinucleotí-deo isolado) compreendendo polinucleotídeos codificando quaisquer dasmodalidades acima.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polinucleotídeoisolado compreendendo um polinucleotídeo codificando um fragmento ouuma região do anticorpo E3 (interchangeably termed "E3" herein). Em umamodalidade, o fragmento é uma cadeia leve do anticorpo E3 conforme mos-trado na Figura 1B. Em outra modalidade, o fragmento é uma cadeia pesadado anticorpo E3 conforme mostrado na Figura 1A. Em ainda outra modalida-de, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia levee/ou uma cacjeia pesada do anticorpo E3. Em ainda outra modalidade, ofragmento contém uma ou mais regiões de determinação da complementari-dade (CDRs) de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo E3conforme mostrado nas Figuras 1A e 1B.

Em outro aspecto, a invenção é um polinucleotídeo isolado com-preendendo um polinucleotídeo que codifica para o anticorpo E3. Em algu-mas modalidades, o polinucleotídeo compreende qualquer um ou ambos dopolinucleotídeo mostrado nas Figuras 2 e 3.

Em outro aspecto, a invenção é um polinucleotídeo isolado quecodifica para uma cadeia leve E3 com um número de depósito de ATCC No.PTA-4893 ou ATCC No. PTA-4894. Em outro aspecto, a invenção é um poli-nucleotídeo isolado que codifica para uma cadeia pesada E3 com um núme-ro de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em ainda outro aspecto, a invençãoé um polinucleotídeo isolado compreendendo (a) uma região variável codifi-cada no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4893 ou PTA-4894 e (b) uma região variável codificada no polinucleotídeocom um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em outro aspecto, ainvenção é um polinucleotídeo isolado compreendendo (a) uma ou maisCDRs codificadas no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCCNo. PTA-4893 ou PTA-4894; e/ou (b) uma ou mais CDRs codificadas no po-linucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polinucleotídeos codi-ficando quaisquer dos anticorpos (inclusive fragmentos de anticorpos) oupolipeptídeos descritos aqui.

Em outro aspecto, a invenção proporciona vetores (inclusive ve-tores de expressão e clonagem) e células hospedeiras compreendendoquaisquer dos polinucleotídeos descritos aqui.

Conforme é evidente a partir da descrição aqui, especificamenteincluídas da invenção estão modalidades de polinucleotídeos consistindo naseqüência de polinucleotídeos idênticas a uma seqüência de polinucleotí-deos de anticorpo monoclonal de camundongo, 911. As seqüências de CDRestendidas de Mab 911 são mostrada nas Figuras 1A e 1B, e na SEQ IDNOS: 9-14.

Em outro aspecto, a invenção é uma célula hospedeira compre-endendo um polinucleotídeo codificando cadeia leve E3 e um polinucleotídeocodificando cadeia pesada E3, em que o um ou mais polinucleotídeos codifi-cando cadeia leve E3 tem um número de depósito de ATCC No. PTA-4893e/ou ATCC No. PTA-4894, e o polinucleotídeo codificando cadeia pesada E3tem um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em algumas modali-dades, a célula hospedeira compreende polinucleotídeo compreendendo (a)uma região variável codificada no polinucleotídeo com um número de depó-sito de ATCC No. PTA-4893 ou PTA-4894 e/ou (b) uma região variável codi-ficada no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um poli-nucleotídeo codificando (a) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotí-deo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4893 ou PTA-4894;e/ou (b) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com um númerode depósito de ATCC No. PTA-4895. Em algumas modalidades, a célulahospedeira é uma célula de mamífero.

Em outro aspecto, a invenção é um complexo de NGF ligado poranticorpo E3. Em outro aspecto, o complexo é isolado. Em outro aspecto, ocomplexo é substancialmente purificado.

Em outro aspecto, a invenção é um complexo de NGF ligado porquaisquer dos anticorpos ou polipeptídeos descritos aqui. Em outro aspecto,o complexo é isolado. Em outro aspecto, o complexo é substancialmentepurificado.

Em outro aspecto, a invenção é uma composição farmacêuticacompreendendo quaisquer dos polipeptídeos (inclusive anticorpos tais comoanticorpo E3) ou polinucleotídeos descritos aqui, tais como composiçõesfarmacêuticas compreendendo o anticorpo E3 ou um anticorpo compreen-dendo um fragmento do anticorpo E3, e um excipiente farmaceuticamenteaceitável.

Em outro aspecto, a invenção é um método para gerar anticorpoE3 compreendendo preparar uma célula hospedeira compreendendo umvetor de exprejssão que codifica para o anticorpo E3; cultivar a célula hospe-deira ou progênie da mesma sob condições que permitem a produção doanticorpo E3; e purificar o anticorpo E3. Em algumas modalidades, o vetorde expressão compreende uma ou ambas as seqüências de polinucleotí-deos mostrada nas Figuras 2 e 3.

Em outro aspecto, a invenção é um método para gerar o anticor-po E3 compreendendo expressar um polinucleotídeo codificando cadeia leveE3 e um polinucleotídeo codificando cadeia pesada E3 em uma célula ade-quada, em que o polinucleotídeo codificando cadeia leve E3 tem um númerode depósito de ATCC No. PTA-4893 e/ou ATCC No. PTA-4894, e o polinu-cleotídeo codificando cadeia pesada E3 tem um número de depósito deATCC No. PTA-4895; geralmente seguida por recuperação e/ou isolamentodo anticorpo.Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para gerarquaisquer dos polipeptídeos (tais como anticorpos) descritos aqui, por ex-pressão de um ou mais polinucleotídeos codificando o anticorpo (o qual po-de ser separadamente expressado como uma única cadeia leve ou pesada,ou tanto uma cadeia leve quanto uma cadeia pesada podem ser expressadapor um vetor) em uma célula adequada, geralmente seguido por recupera-ção e/ou isolamento do anticorpo ou polipeptídeos de interesse.

Em outro aspecto, a invenção é um método para antagonizar aatividade biológica de NGF (tal como NGF humano) usando quaisquer dospolipeptídeos (inclusive anticorpos tais como anticorpo E3) descritos aqui.Em uma modalidade, o método compreende contactar fator de crescimentonervoso humano com quaisquer dos polipeptídeos (inclusive anticorpo E3)descritos aqui, por meio do quê a atividade de NGF (tal como a atividade dofator de crescimento nervoso humano) é antagonizada, reduzida, bloqueada,ou suprimida.

Em outro aspecto, a invenção é um método para detectar NGFusando quaisquer dos polipeptídeos (inclusive anticorpos, tais como o anti-corpo E3) descritos aqui. A presença de NGF é detectada detectando umcomplexo entre NGF e quaisquer dos polipeptídeos descritos aqui, (tais co-mo anticorpo E3). O termo "detecção" conforme usado aqui, inclui detecçãoqualitativa e/ou quantitativa (medição dos níveis) com ou sem referência aum controle.

Em outro aspecto, a invenção é um método para tratar dor poradministração de uma quantidade eficaz de uma composição compreenden-do o anticorpo E3 ou quaisquer das modalidades de polipeptídeos (inclusiveanticorpo) ou polinucleotídeos descritas aqui. Em algumas modalidades, ador é dor pós-cirúrgica.

Em outro aspecto, a invenção é um método para prevenir ou tra-tar a dor da artrite reumatóide em um indivíduo administrando uma quanti-dade eficaz de anticorpo antagonista anti-NGF ao indivíduo. Foi mostrado deacordo com a invenção que um anticorpo antagonista anti-NGF é capaz deinibir ou bloquear a dor associada a artrite reumatóide. Em algumas modali-dades, a dor é aliviada dentro de cerca de 24 horas depois de administrar oanticorpo antagonista anti-NGF. Em algumas modalidades, a dor é aliviadadentro de cerca de 4 dias depois de administrar o anticorpo antagonista anti-NGF. Em algumas modalidades, a dor é aliviada antes de observar ou naausência de uma indicação de melhora da condição inflamatória no indiví-duo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para reduzira incidência de dor da artrite reumatóide, melhorar a dor da artrite reumatói-de, suprimir a dor da artrite reumatóide, aliviar a dor da artrite reumatóide,e/ou retardar o início, o desenvolvimento, ou a progressão da dor da artritereumatóide em um indivíduo, o método referido compreendendo administraruma quantidade eficaz de anticorpo antagonista anti-NGF ao indivíduo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para tratarcaquexia inflamatória (perda de peso) associada a artrite reumatóide em umindivíduo compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anticor-po antagonista anti-NGF.

Em outro aspecto, a invenção é um método para prevenir ou tra-tar dor de osteoartrite em um indivíduo administrando uma quantidade eficazde um antagonista do fator de crescimento nervoso (tal como um anticorpoantagonista anti-NGF) ao indivíduo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para reduzira incidência da dor de osteoartrite, melhorar a dor de osteoartrite, suppres-são da dor de osteoartrite, aliviar a dor de osteoartrite, e/ou retardar o início,o desenvolvimento, ou a progressão da dor de osteoartrite em um indivíduo,o método referido compreendendo administrar uma quantidade eficaz de umantagonista de NGF (tal como anticorpo antagonista anti-NGF) ao indivíduo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para melho-rar a função física em um indivíduo tendo osteoartrite, o método referidocompreendendo administrar uma quantidade eficaz de um antagonista deNGF (tal como anticorpo antagonista anti-NGF) ao indivíduo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para melho-rar a rigidez em um indivíduo tendo osteoartrite, o método referido compre-endendo administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de NGF (talcomo anticorpo antagonista anti-NGF) ao indivíduo.

Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Emalgumas modalidades, para tratar dor de osteoartrite, freqüência de dosa-gem de anticorpo antagonista anti-NGF é entre uma vez a cada semana euma vez a cada 10 semanas, ou menos freqüente.

Em outro aspecto, a invenção proporciona kits e composiçõescompreendendo qualquer uma ou mais das composições descritas aqui. Es-tes kits, geralmente dentro de embalagem adequada e providos com instru-ções apropriadas, são úteis para quaisquer dos métodos descritos aqui. Ainvenção também proporciona composições farmacêuticas para uso emquaisquer dos métodos descritos aqui, cujas composições compreendemuma quantidade eficaz de um antagonista de NGF (tal como um anticorpoanti-NGF) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

A invenção também proporciona quaisquer das composições ekits descritos para qualquer uso descrito aqui, quer no contexto de uso comomedicamento e/ou uso para fabricação de um medicamento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A FIGURA 1A: mostra a seqüência de aminoácidos da regiãovariável de cadeia pesada do anticorpo E3 (rotulada "6" e "5" + maturaçãode afinidade H3). As CDRs Chothia e CDRs Kabat são representadas portexto sublinhado e por texto em negrito e em itálico, respectivamente. A Fi-gura 1A também mostra o alinhamento das seguintes seqüências de amino-ácidos de região variável de cadeia pesada; (2) seqüência aceitadora de li-nhagem germinativa humana VH4-59 (rotulada "VH4-59" ou "2") (SEQ IDNO: 69); (3) as seqüências aceitadoras enxertadas com as CDRs estendidasdo anticorpo de camundongo 911 (rotuladas "entertada com CDR" ou "3")(SEQ ID NO: 70); (4) as seqüências aceitadoras enxertadas com CDR inclu-sive a substituição V71K (rotuladas "3+mutação de uma estrutura" ou "4")(SEQ ID NO: 71); (5) o clone contendo CDRs de afinidade maturadas H1 eH2 (rotuladas "5" ou "4+ maturação de afinidade H1, H2") (SEQ ID NO: 72);e anticorpo E3 (conforme descrito acima).A FIGURA 1B: mostra a seqüência de aminoácidos da regiãovariável de cadeia leve do anticorpo E3 (rotulada "5" ou "4 + maturação deafinidade L3). As CDRs Chothia e CDRs Kabat são representadas por textosublinhado e texto em negrito e em itálico, respectivamente. A FIGURA 1Btambém mostra o alinhamento das seguintes seqüências de aminoácidos deregião variável de cadeia leve: (2) seqüência aceitadora de linhagem germi-nativa humana 08 (rotulada "08" ou "2") (SEQ ID NO: 73); (3) as seqüênciasaceitadoras enxertadas com as CDRs estendidas do anticorpo camundongo911 (rotuladas "enxertada com CDR" ou "3") (SEQ ID NO: 74); (4) as se-qüências aceitadoras enxertadas com CDR (rotuladas "3+ maturação de afi-nidade L1, L2" ou "4") (SEQ ID NO: 75); (5) o clone contendo CDRs de afini-dade maturada L1 e L2 (rotuladas "5" ou "4+ maturação de afinidade L3"); eanticorpo E3 (conforme descrito acima).

A FIGURA 2: mostra um polinucleotídeo compreendendo umpolinucleotídeo seqüência codificando a região variável de cadeia pesada doanticorpo E3 (SEQ ID NO: 76).

A FIGURA 3: mostra um polinucleotídeo compreendendo umpolinucleotídeo seqüência codificando a região variável de cadeia leve doanticorpo E3 (SEQ ID NO: 77).

A FIGURA 4: é um gráfico representando a sobrevida dependen-te do fator de crescimento nervoso de neurônios E13.5 na presença de con-centração variável de NGF humano e de rato. O eixo X corresponde à con-centração de NGF (ng/ml) e o eixo Y corresponde aos neurônios contados.

A FIGURA 5: é um gráfico comparando o efeito de bloqueio deNGF de vários Fabs na presença de ou 0,04 ng/ml de NGF humano (cercade 1,5 pM; mostrada no painel inferior) ou 0,4 ng/ml de NGF humano (cercade 15 pM; mostrada no painel superior). Foi avaliada a sobrevida de neurô-nios trigeminais de camundongo E13.5 em várias concentrações de Fab E3;911 Fab murino; e Fab H19-L129 e Fab 8L2-6D5. A IC50 (em pM) foi calcu-lada para cada Fab em cada concentração de NGF, e é mostrada na Tabela9. Fab E3 bloqueou fortemente a sobrevida de neurônios trigeminais NGF-dependentes humanos, com uma IC50 de cerca de 21 pM na presença de15 pM de humano NGF, e uma IC50 de cerca de 1,2 pM na presença de 1,5pM de NGF humano. Fabs 3C e H19-L129 também bloquearam fortemente asobrevida de neurônios trigeminais NGF-dependentes humanos. Em ambosos painéis, o eixo X corresponde à concentração de anticorpos (nM) e o eixoY corresponde aos neurônios contados. 1,5 pM de NGF foi em torno daIC50, enquanto 15 pM representou uma concentração saturante de NGF.

A FIGURA 6: é um gráfico comparando o efeito de bloqueio deNGF de vários Fabs na presença de ou 0,04 ng/ml de NGF de rato (cerca de1,5 pM; mostrada no painel inferior) ou 0,4 ng/ml NGF de rato (cerca de 15pM; mostrada no painel superior). A sobrevida de neurônios trigeminais decamundongo E13.5 em várias concentrações de Fab E3; Fab 911 murino; eFab H19-L129 e 8L2-6D5 foi avaliada conforme descrito acima. A IC50 (empM) foi calculada para cada Fab em cada concentração de NGF, e é mos-trada na Tabela 9. Fab E3 bloqueou fortemente a sobrevida de neurôniostrigeminais NGF-dependentes humanos, com uma IC50 de cerca de 31,6 pMna presença de 15 pM de NGF de rato, e uma IC50 de cerca de 1,3 pM napresença de 1,5 pM de NGF de rato. Fabs 3C e H19-L129 também bloquea-ram fortemente a sobrevida de neurônios trigeminais NGF-dependentes derato. 1,5 pM de NGF foi em torno da IC50, enquanto 15 pM representou umaconcentração saturante de NGF. Em ambos os painis, o eixo X correspondeà concentração de anticorpos (nM) e o eixo Y corresponde aos neurônioscontados.

A FIGURA 7: é um gráfico representando dor em repouso avali-ada 24 horas depois da cirurgia e mostrando que tratamento com 0,02mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,6 mg/kg, ou 1 mg/kg de anticorpo anti-NGF E3 reduziu ador. "*" indica uma diferença estatisticamente significante (p<0,5) do controlenegativo.

A FIGURA 8: é um gráfico representando dor em repouso avali-ada 24 horas depois da cirurgia e mostrando que tratamento com 0,5 mg/kgde anticorpo anti-NGF E3 reduziu significativamente (p<0,005) a dor em re-pouso quando injetado duas horas depois da cirurgia.

A FIGURA 9: é um gráfico mostrando os resultados de análiseBlAcore da afinidade de ligação a NGF humano do anticorpo de camundon-go 911 (Fab). Anticorpo de camundongo 911 ligou a NGF com uma KD de3,7 nM, "koff" de 8.4x10-5s-1 e kon de 2.2x104Ms-1.

A FIGURA 10: é um gráfico mostrando os resultados de análiseBlAcore da afinidade de ligação a NGF humano do anticorpo E3 (Fab) (refe-rido como "3E Fab"). E3 ligou NGF humano com uma KD de cerca de 0,07nM (e com uma kon de cerca de 6,0 x 105 M"1s~\ e uma "koff" de cerca de4,2x10"5 s"1).

A FIGURA 11: é um gráfico representando que o anticorpo E3bloqueia a interação de NGF com seus receptores, trkA e p75, conforme a-valiado por percentagem de ligação detectada entre NGF e trkA (mostradoem círculos pretos) e NGF e p75 (mostrados como quadrados vazios). Oeixo X corresponde à concentração do anticorpo 3E (Fab) e o eixo Y corres-ponde à ligação de NGF (percentagem máxima de RU). O aumento dasconcentrações de Fab E3 bloqueou a interação de NGF tanto com p75 quan-to com trkA, conforme mostrado por redução de sinal (medida em RU).Quando a concentração de anticorpos E3 (Fab) eqüivaleu à concentração deNGF, não foi observada ligação de NGF (conforme mostrado por um sinal dezero).

A FIGURA 12: é um gráfico representando a capacidade de blo-queio do NGF humano de anticorpo total E3 e Fab E3. Foi avaliada a sobre-vida de neurônios trigeminais de camundongo E13.5 na presença de NGFhumano e vários concentrações de Fab E3 e anticorpo E3. O eixo X corres-ponde à ligação de sítios de NGF (nM) e o eixo Y corresponde à contagemnormalizada de neurônios trigeminais (TG). O anticorpo total E3 e Fab 3Eapresentaram níveis similares de inibição da sobrevida dependente do fatorde crescimento nervoso de neurônios trigeminais quando a concentração deanticorpo total e Fab foram normalizadas para o número de sítios de ligaçãode NGF (Fab tem um sítio de ligação e o anticorpo total tem dois sítios deligação).

A FIGURA 13: é um gráfico representando a capacidade de vá-rias concentrações (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128, e 0,0 nM) doanticorpo E3 (triângulos sólidos; referido como "3E"), anticorpo 911 (círculossólidos), e uma imunoadesina receptora de trkA (quadrados sombreados;referida como "trkA-Fc) para inibir a sobrevida dependente do fator de cres-cimento nervoso de neurônios trigeminais E13.5 na presença de 0,4 ng/mlde NGF humano (condições de saturação). O eixo X corresponde à concen-tração do anticorpo (nM) e a concentração de Y corresponde aos neurônioscontados. Estes resultados demonstraram que o anticorpo E3 bloqueou NGFsignificativamente melhor do que quer o anticorpo anti-NGF monoclonal decamundongo 911 quer a imunoadesina de trkA.

A FIGURA 14: é um gráfico representando que o anticorpo anta-gonista anti-NGF E3 (denominado "3E na figura") ou Fab 911 não inibiram asobrevida neuronal promovida por NT3, NT4/5 e MSP, mesmo em concen-trações de anticorpos tão elevadas quanto 200 nM. Os dados representarampercentagem de sobrevida média depois de 48 horas em cultura (± erro pa-drão da média, n = 3 para cada ponto de dados) relativa à sobrevida obser-vada no controle positivo para cada experimento (100% de sobrevida deneurônios trigeminais cultivados na presença de concentração de NGF satu-rante). Várias concentrações (20 nM, 2 nM, ou 0,2 nM) de E3 Fab (denomi-nado "3E" na figura) e anticorpo de camundongo 911 Fab foram usadas napresença de neurotrofina não adicionada (denominada "controle"), 400 pMde NGF (denominado "NGF-400pM), 10 nM de NT3 (denominado "NT3-10nM) ou 600 pM de MSP (denominado "MSP-600 pM).

A FIGURA 15: é um gráfico representando que o anticorpo anta-gonista anti-NGF E3 (Fab ou anticorpo total) (denominado "3E na figura") ouanticorpo de camundongo 911 (Fab ou anticorpo total) não inibiu a sobrevidaneuronal promovida por NT3, NT4/5 e MSP, mesmo em concentrações deanticorpos tão elevadas quanto 200 nM. Várias concentrações (200 nM e 80nM) de E3 Fab e anticorpo total e anticorpo de camundongo 911 anticorpototal e Fab foram usadas na presença de neurotrofinas não adicionadas (de-nominadas "sem fatores"), 400 pM de NGF (denominado "NGF-400pM), 10nM de NT3 (denominado "NT3-10nM) ou 600 pM de MSP (denominado"MSP-600 pM).A FIGURA 16: é um gráfico representando que o anticorpo anta-gonista anti-NGF E3 ou Fab E3 não inibiu a sobrevida de neurônios nodososE17 promovida por BDNF, NT4/5 ou LIF. Anticorpo antagonista anti-NGF decamundongo 911 também foi testado, e foram observados resultados simila-res. Várias concentrações (200 nM ou 80 nM) de anticorpo total E3 (denomi-nado "3E na figura"), Fab E3, anticorpo total 911, ou Fab 911 foram testadasna presença de neurotrofinas não adicionadas (denominado "sem fatores"),400 pM de BDNF (denominado "BDNF-400pM), 400 pM de NT4/5 (denomi-nado "NT4/5-400pM), ou 2,5 nM de LIF (denominado "LIF-2.5 nM).

A FIGURA 17: é um gráfico representando que o anticorpo anta-gonista anti-NGF E3 ou Fab E3 não inibiu a sobrevida de neurônios nodososE17 promovida por BDNF, NT4/5 ou LIF. Várias concentrações (200 nM, 20nM, 2 nM) de Fab E3 (denominado "3E na figura"), ou Fab 911 foram testa-das na presença de neurotrofinas não adicionadas (denominadas "controle"),400 pM de BDNF (denominado "BDNF-400pM), 400 pM de NT4/5 (denomi-nado "NT4/5-400pM), ou 2,5 nM de LIF (denominado "LIP-2.5 nM).

A FIGURA 18: é um gráfico demonstrando a reação nociceptivaem ratos artríticos (modelo de artrite reumatóide) depois da administração deanticorpos anti-NGF (E3 e 911) no D14 e D19. E3 (1 mg/kg, i.v. no dia 14 edia 19), 911 (.10 mg/kg, i.v. no dia 14 e dia 19), ou indo (indometacina 3mg/kg, por via oral diariamente durante 10 dias) foram administrados a ca-mundongos artríticos. Os valores da intensidade da vocalização são expres-sados em mV como médias ± s.e.m.

A FIGURA 19: é um gráfico demonstrando os efeitos de anticor-pos anti-NGF sobre o peso corporal na artrite em ratos (modelo de artritereumatóide) depois da administração de anticorpos anti-NGF em D14 e D19.E3 (1 mg/kg, i.v. no dia 14 e dia 19), 911 (10 mg/kg, i.v. no dia 14 e dia 19),ou indo (indometacina 3 mg/kg, por via oral diariamente durante 10 dias) fo-ram administrados a camundongos artríticos. Os valores do peso corporalsão expressados em gramas como média ± s.e.m.

A FIGURA 20: é um gráfico demonstrando a reação nociceptivaem ratos artríticos (modelo de artrite reumatóide) depois da administração dediferentes doses de anticorpo anti-NGF E3 (0,003 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,3mg/kg, and 5 mg/kg) on D14 and D18. Os valores da intensidade da vocali-zação são expressados em mV como médias ± s.e.m.

A FIGURA 21: é um gráfico demonstrando os efeitos de anticor-po anti-NGF E3 sobre a percentagem de peso no Dia 14 (normalizado paraDia 14) em ratos artríticos (modelo de artrite reumatóide) depois da adminis-tração de diferentes doses de anticorpo anti-NGF E3 (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg,e 5 mg/kg) em D14 e D18.

A FIGURA 22: é um gráfico demonstrando os efeitos de anticor-po anti-NGF E3 sobre a perda de peso em ratos artríticos (modelo de artritereumatóide) depois da administração de diferentes doses de anticorpo anti-NGF E3 (0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, e 5 mg/kg) em D14 e D18. Os valores depeso corporal foram normalizados para o Dia 0.

A FIGURA 23: representa a seqüência de aminoacidos da regiãovariável de cadeia pesada E3 (Fig. 23A) e a seqüência de aminoacidos daregião variável de cadeia leve (Fig. 23B), conforme numerado usando nume-ração seqüencial, numeração de Kabat, e numeração de Chothia.

A FIGURA 24 representa as alterações na intensidade da dordiária média depois da administração de anticorpo anti-NGF E3 comparadacom a linha de base no dia 0. O eixo Y corresponde à redução na intensida-de da dor diária média (escore de VAS) comparada com a intensidade dador diária média no dia 0. O eixo X corresponde a dias depois da administra-ção de anticorpo anti-NGF E3.

A FIGURA 25 representa o escore médio de VAS depois da ad-ministração de anticorpo anti-NGF E3. "SE" se refere a erro padrão.

A FIGURA 26 representa percentagem de redução máxima nadiferença da intensidade da dor somada (SPID) do dia 2 ao dia 14 e do dia 2ao dia 28 depois da administração de anticorpo anti-NGF E3.

A FIGURA 27 representa a resposta média quadrada mínima(LSM) para WOMAC, subescala da dor, subescala da função física , e sub-escala da rigidez do dia 1 ao dai 28 depois da administração de diferentesdoses (3 |ig/kg, 10 ng/kg, 30 ng/kg, 100 |ig/kg, e 300 (ag/kg) de anticorpoanti-NGF E3. "SE" se refere a erro padrão. Os eixos X correspondem à dosede anticorpo anti-NGF E3 administrada. "*" indica P < 0,05 comparado com alinha de base segundo o ensaio de Dunnett.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção descrita aqui, proporciona anticorpos antagonistasanti-NGF que ligam o fator de crescimento nervoso (tais como o fator decrescimento nervoso humano) com alta afinidade. A invenção adicionalmen-te proporciona anticorpos e polipeptídeos derivados de E3 que ligam NGF, emétodos para fabricar e usar estes anticorpos. Em algumas modalidades, ainvenção proporciona um anticorpo humanizado, E3, o qual liga ao fator decrescimento nervoso ("NGF"), e métodos para fabricar e usar este anticorpo.A invenção também proporciona E3 polipeptídeos (inclusive anticorpos) queligam NGF, e polinucleotídeos codificando anticorpo E3 e/ou polipeptídeo.

A invenção descrita aqui, também proporciona métodos paraprevenir e/ou tratar dor da artrite reumatóide em um indivíduo por adminis-tração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo antago-nista anti-NGF.

A invenção descrita aqui, também proporciona métodos paraprevenir e/ou tratar dor de osteoartrite em um indivíduo por administração deuma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de NGF (tal co-mo um anticorpo antagonista anti-NGF).

A invenção também proporciona métodos para ajustar a afinida-de de um anticorpo e métodos para caracterizar uma região CDR.

Técnicas Gerais

A prática da presente invenção empregará, a menos que indica-do de modo diverso, técnicas convencionais de biologia molecular (inclusivetécnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imuno-logia, as quais estão dentro do âmbito da arte. As técnicas referidas são ex-plicadas integralmente na literatura, tais como, Molecular Cloning: A Labora-tory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring HarborPress; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecu-lar Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis,ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987);Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998)Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle,J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methodsin Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook oí Experimental Immunol-ogy (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mam-malian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols inMolecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The PolymeraseChain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology(J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wileyand Sons, 1999); Immunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997); Anti-bodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRLPress, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shep-herd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: alaboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood A-cademic Publishers, 1995); e Câncer: Principies and Practice of Oncology(V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

Definições

Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de li-gação específica a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipí-deo, polipeptídeo, e etc, através de no mínimo um sítio de reconhecimentoantigênico, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina.Conforme usado aqui, o termo engloba não somente anticorpos intactos po-liclonais ou monoclonais, mas também fragmentos dos mesmos (tais comoFab, Fab', F(ab')2, Fv), cadeia única (ScFv), mutantes dos mesmos, proteí-nas de fusão compreendendo um porção anticorpo, e qualquer outra confi-guração modificada da molécula de imunoglobulina que compreenda umsítio de reconhecimento antigênico. Um anticorpo inclui um anticorpo dequalquer classe, tal como IgG, IgA, ou IgM (ou sub-classe das mesmas), e oanticorpo não precisa ser de qualquer classe em particular. Dependendo daseqüência de aminoácidos do anticorpo do domínio constante de suas ca-deias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes clas-ses. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, eIgM, e vários destes podem ser adicionalmente divididos em subclasses (iso-tipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 o lgA2. Os domínios cons-tantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imuno-globulinas são denominados alfa, delta, épsilon, gama, e mu, respectivamen-te. As estructuras das subunidades e configurações tridimensionais de dife-rentes classes de imunoglobulinas são de conhecimento geral

"Fv" é um fragmento de anticorpo que contém um sítio de reco-nhecimento e de ligação antigênica completa. Em uma espécie Fv de duascadeias, esta região consiste em um dímero de um domínio variável de ca-deia pesada e um de cadeia leve em firme associação não covalente. Emuma espécie de Fv de cadeia única, um domínio variável de cadeia pesada eum de cadeia leve pode ser ligado de modo covalente por um ligante de pep-tídeo flexível tal que as cadeias leve e pesada podem se associar em umaestrutura dimérica análoga à estrutura em uma espécie de Fv de duas ca-deias. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável inte-ragem definindo uma especificidade de ligação de antígeno sobre a superfí-cie do dímero VH-VL. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou me-tade de um Fv compreendendo somente 3 CDRs específicas para um antí-geno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora geralmenteem uma menor afinidade do que o sítio de ligação inteiro.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. FragmentosFab' diferem de fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos no tér-mino carbóxi do domino CH1 de cadeia pesda inclusive uma ou mais cisteí-nas das regiões de articulação de anticorpo.

Um "anticorpo monoclonal" se refere a uma população de anti-corpos homogêneos em que o anticorpo monoclonal consiste em aminoáci-dos (naturais e não naturais) que estão envolvidos na ligação seletiva de umantígeno. Uma população de anticorpos monoclonais é altamente específica,sendo dirigida contra um único sítio antigênico. O termo "monoclonal anti-corpo" engloba não somente anticorpos monoclonais intatos como anticor-pos monoclonais de extensão total, mas também fragmentos dos mesmos(tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadeia única (ScFv), mutantes dos mes-mos, proteínas de fusão compreendendo uma porção anticorpo, e qualqueroutra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compre-ende um sítio de reconhecimento antigênico da especificidade requerida e acapacidade para ligar a um antígeno. Não se pretende ser limitado com res-peito à fonte do anticorpo ou à maneira na qual este é feito (por exemplo, porhibridoma, seleção de fago, expressão recombinante, animais transgênicos,etc).

Conforme usado aqui, "anticorpo humano" significa um anticorpotendo uma seqüência de aminoácidos correspondente à de um anticorpoproduzido por um ser humano e/ou que tenha sido feito usando quaisquerdas técnicas para preparar anticorpos humanos conhecidos na técnica oudescritos aqui. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorposcompreendendo no mínimo um polipeptídeo de cadeia pesada humano ouno mínimo um polipeptídeo de cadeia leve humano. Um exemplo semelhan-te é um anticorpo compreendendo polipeptídeos de cadeia leve murino e decadeia pesada humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos usandovários técnicas conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o anticorpo hu-mano é selecionado entre uma biblioteca de fagos, onde a biblioteca de fa-gos expressa anticorpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechno-logy, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogen-boom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol.Biol., 222:581). Anticorpos humanos também podem ser produzidos introdu-zindo loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo,camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram par-cialmente ou completmente inativados. Esta abordagem é descrita nas Pa-tentes dos Estados Unidos Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126;5.633.425; e 5.661.016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser pre-parado imortalizando linfócitos B humanos que produzem um anticorpo diri-gido contra um antígeno alvo (os linfócitos B referidos podem ser recupera-dos de um indivíduo ou podem ter sido imunizados in vitro). Veja, por exem-plo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; e a Patente dosEstados Unidos No. 5.750.373.

"Anticorpos quiméricos" se refere aos anticorpos em que umaporção de cada uma das seqüências de aminoácidos de cadeias pesada eleve é homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados deuma espécie em particular ou pertencente a uma classe em particular, aopasso que o segmento remanescente das cadeias é homólogo a seqüênciascorrespondentes em outra. Tipicamente, nestes anticorpos quiméricos, aregião variável de ambas as cadeias leve e pesada simula as regiões variá-veis de anticorpos derivados de uma espécie de memíferos, enquanto asporções constantes são homólogas às seqüências em anticorpos derivadosde outra. Uma clara vantagem de semelhantes formas quiméricas é que, porexemplo, as regiões variáveis podem ser derivadas convenientemente defontes atualmente conhecidas usando hibridomas prontamente disponíveisou células B de organismos hospedeiros não humanos em combinação comregiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de células hu-manas. Enquanto a região variável tem a vantagem de facilidade de prepa-ração, e a especificidade não é afetada por sua fonte, a região constantesendo humana, é menos provável de provocar uma reação imune de umsujeito humano quando os anticorpos são injetados do que provocaria a re-gião constante de uma fonte não humana. No entanto, a definição não estálimitada a este exemplo em particular.

Uma "região Fc funcional" possui no mínimo uma função efetorade uma região Fc de seqüência nativa. "Funções efetoras" típicas incluemligação de C1q; citotoxicidade dependente do complemento (CDC); ligaçãode receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células anticorpo-dependentes(ADCC); fagocitose; regulação para baixo de receptores superficiais celula-res (por exemplo, receptor de células B; BCR), etc. As funções efetoras refe-ridas geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domíniode ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem seravaliadas usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliar as fun-ções efetoras de anticorpos referidas.

Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüên-cia de aminoácidos idêntica à seqüência de aminoácidos de uma região Fcencontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compreende uma se-qüência de aminoácidos a qual difere daquela de uma região Fc de seqüên-cia nativa em virtude de no mínimo uma modificação de aminoácido, masretém no mínimo uma função efetora da região Fc de seqüência nativa. Pre-ferencialmente, a região Fc variante tem no mínimo uma substituição de a-minoácido comparada com uma região Fc de seqüência nativa ou com aregião Fc de um polipeptídeo de origem, por exemplo, a partir de cerca deuma até cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente apartir de cerca de uma até cerca de cinco substituições de aminoácidos emuma região Fc de seqüência nativa ou na região Fc do polipeptídeo de ori-gem. A região Fc variante aqui, preferencialmente possuirá no mínimo cercade 80% de identidade de seqüência com uma região Fc de seqüência nativae/ou com uma região Fc de um polipeptídeo de origem, e ainda mais prefe-rencialmente no mínimo cerca de 90% de identidade de seqüência com amesma, mais preferencialmente no mínimo cerca de 95% de identidade deseqüência com a mesma.

Conforme usado aqui "citotoxicidade mediada por células anti-corpo-dependentes" e "ADCC" se referem a uma reação mediada por célu-las na qual células citotóxicas não-específicas que expressam receptores deFc (FcRs) (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos, e ma-crófagos) reconhecem anticorpo ligado sobre uma célula alvo e em seguidacausam lise da célula alvo. A atividade de ADCC de uma molécula de inte-resse pode ser avaliada usando um ensaio de ADCC in vitro, tal como asdescritas na Patente dos Estados Unidos No. 5.500.362 ou 5.821.337. Célu-las efetoras úteis para os ensaios referidas incluen células mononuclearesdo sangue periférico (PBMC) e células NK. Alternativamente, ou adicional-mente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada invivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o descrito em Clynes etai-, 1998, PNAS(USA), 95:652-656.

Conforme usado aqui, "receptor de Fc" e "FcR" descrevem umreceptor que liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferencial é um FcRhumano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferencial é um o qualliga um anticorpo de IgG (um receptor gama) e inclui receptores das sub-classes FcvRI, FcyRII, e FcyRIII, inclusive variantes alélicas e alternativa-mente formas unidas destes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA(um "receptor de ativação") e FcvRNB (um "receptor de inibição"), os quaistêm seqüências de aminoácidos similares que diferem essencialmente nosdomínios citoplasmáticos dos mesmos. FcRs são revisados em Ravetch andKinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capei et al., 1994, Immunome-thods, 4:25-34; e de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR"também inclui o receptor neonatal, FcRn, o qual é responsável pela transfe-rência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., 1976, J. Immunol.,117:587; e Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

"Citotoxicidade dependente do complemento" e "CDC" se refe-rem à lise de um alvo na presença de complemento. O caminho de ativaçãodo complemento é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistemado complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) emcomplexo com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemen-to, pode ser realizada, por exemplo, um ensaio de CDC, conforme descritoem Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Conforme usado aqui, os termos "E3", "3E", e "anticorpo E3" sãousados de modo intercambiável para se referir a um anticorpo compreen-dendo a seqüência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesadae de cadeia leve mostrada nas Figuras 1A (SEQ ID NO: 1) e 1B (SEQ IDNO: 2), respectivamente. As porções CDR do anticorpo E3 (inclusive CDRsde Chothia e Kabat) são representadas diagramaticamente nas Figuras 1A e1B. As Figuras 2 e 3 mostram polinucleotídeos codificando cadeias pesadase leves, respectivamente, compreendendo as regiões variáveis de cadeiapesada e de cadeia leve mostradas nas Figuras 1A e 1B, respectivamente. Aprodução e caracterização de E3 é descrita nos Exemplos. Funções biológi-cas diferentes são associadas com E3, inclusive, mas não limitadas a, capa-cidade para ligar a NGF e inibir atividade biológica de NGF e/ou um ou maiscaminhos a jusante mediados por sinalização de NGF; e capacidade parainibir a sobrevida dependente do fator de crescimento nervoso de neurôniostrigeminais E13.5 de camundongo. Conforme discutido aqui, os anticorposda invenção podem ter qualquer uma ou mais destas características. Emalgumas modalidades, o termo "E3" se refere a imunoglobulina codificadapor (a) um polinucleotídeo codificando cadeia leve de E3 que tem um núme-ro de depósito de ATCC No. PTA-4893 ou ATCC No. PTA-4894, e (b) umpolinucleotídeo codificando cadeia pesada de E3 que tem um número dedepósito de ATCC No. PTA-4895.

Conforme usado aqui, ligação "imunoespecífica" de anticorposse refere à interação de ligação antígeno específica que ocorre entre o sítiode combinação de antígeno de um anticorpo e o antígeno específico reco-nhecido por aquele anticorpo (isto é, o anticorpo reage com a proteína emum imunoensaio ELISA ou diverso, e não reage de modo detectável comproteínas não relacionadas).

Um epitopo que "liga especificamente", ou "liga preferencialmen-te" (usados de modo intercambiável aqui) a um anticorpo ou um polipeptídeoé um termo de conhecimento geral na técnica, os e métodos para determinara ligação específica ou preferencial referida também são de conhecimentogeral na técnica. Diz-se que uma molécula apresenta "ligação específica" ou"ligação preferencial" se reagir ou associar mais freqüentemente, mais rapi-damente, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma célula ousubstância em particular do que o faz com células ou substâncias alternati-vas. Um anticorpo "liga especificamente" ou "liga preferencialmente" a umalvo se ligar com maior afinidade, avidez, mais prontamente, e/ou com maiorduração do que liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo queliga especificamente ou preferencialmente a um epitopo de NGF é um anti-corpo que liga este epitopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente,e/ou com maior duração do que liga a outros epitopos de NGF ou não epito-pos de NGF. Também se entende pela leitura desta definição que, por e-xemplo, um anticorpo (ou porção ou epitopo) que liga especificamente oupreferencialmente a um primeiro alvo pode ou não ligar especificamente oupreferencialmente a um segundo alvo. Deste modo, "ligação específica" ou"ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa incluir)ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, referência a liga-ção significa ligação preferencial.

Os termos "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "proteí-na" são usados de modo intercambiável aqui, para referir a polímeros deaminoácidos de qualquer extensão. O polímero pode ser linear ou ramifica-do, pode compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompidopor não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de amino-ácidos que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por e-xemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação,fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conju-gação com um componente de marcação. Também incluídos dentra da defi-nição estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos deum aminoácido (inclusive, por exemplo, aminoácidos não naturais, e etc),bem como outras modificações conhecidas na técnica. Entende-se que, co-mo os polipeptídeos desta invenção se baseiam em um anticorpo, os poli-peptídeos podem ocorrer como cadeias únicas ou cadeias associadas.

"Polinucleotídeo," ou "ácido nucléico," conforme usado de modointercambiável aqui, se referem a polímeros de nucleotídeos de qualquerextensão, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonu-cleotídeos, ribonucleotídeos, bases ou nucleotídeos modificados, e/ou seusanálogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em um polímeropor DNA ou RNA polimerase. Um polinucleotídeo pode compreender nucleo-tídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Casopresente, a modificação da estrutura do nucleotídeo pode ser conferida an-tes ou depois de montagem do polímero. A seqüência de nucleotídeos podeser interrompida por componentes não-nucleotídeo. Um polinucleotídeo po-de ser adicionalmente modificado depois de polimerização, tal como por con-jugação com um componente de marcação. Outros tipos de modificaçõesincluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeosque ocorrem naturalmente com um análogo, modificações de internucleotí-deos tais como, por exemplo, as com ligações não carregadas (por exemplo,fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, cabamatos, e etc.) ecom ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, eetc), as ligações contendo porções pendentes, tais como, por exemplo, pro-teínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinaliza-ção, ply-L-lisina, e etc), as ligações com intercaladores (por exemplo, acridi-na, psoralen, e etc), as ligações contendo quelantes (por exemplo, metais,metais radioativos, boro, metais oxidativos, e etc), as ligações contendo al-quiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleí-cos alfa anoméricos, e etc), bem como formas não modificadas do um oumais polinucleotídeos. Além disso, quaisquer dos grupos oxidrila ordinaria-mente presentes nos açúcares podem ser substituídos, por exemplo, porgrupos fosfonatos, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores de roti-na, ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais,ou podem ser conjugadas a suportes sólidos. A OH 5' e 3' terminal pode serfosforilada ou substituída com aminas ou porções de grupos de capeamentoorgânico de a partir de 1 a 20 átomos de carbono. Outas oxidrilas tambémpodem ser derivadas para grupos protetores de rotina. Polinucleotídeostambém podem conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirriboseque são conhecidos de modo geral na técnica, inclusive, por exemplo, 2'-0-metila-, 2'-0-alila, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcares carbo-cíclicos, açúcares □-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose,xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses,análogos acíclicos e análogos de nucleosídeos abásicos tais como metilaribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas porgrupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem,mas não estão limitados a, modalidades em que fosfato é substituído porP(0)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR\ COou CH2 ("formacetal"), no qual cada R ou R' é de modo independente H oualquila (1-20 C) substituído ou não substituído opcionalmente contendo umaligação éter (-0-) , arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila.Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. Adescrição precedente se aplica a todos os polinucleotídeos referidos aqui,inclusive RNA e DNA.

Uma "região variável" de um anticorpo se refere à região variávelda cadeia leve de anticorpo ou à região variável da cadeia pesada de anti-corpo, ou sozinha ou em combinação. As regiões variáveis da cadeia pesa-da e leve consistem, cada uma, em quatro regiões de estrutura (FR) conec-tadas por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) tambémconhecidas como regiões hipervariáveis. As CDRs em cada cadeia são man-tidas juntas em íntima proximidade pelos FRs e, com as CDRs da outra ca-deia, contribuem para a formação do sítio de ligação antigênica de anticor-pos. Há no mínimo duas técnicas para determinar CDRs: (1) uma aborda-gem à base de variabilidade de seqüência de espécies cruzadas (isto é, Ka-bat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991,National Institutes of Health, Bethesda MD)); e (2) uma abordagem à basede estudos cristalográficos de complexos antígeno-anticorpo (Chothia et al.(1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)).Conforme usado aqui, uma CDR pode ser referir a CDRs definidas por qual-quer abordagem ou por uma combinação de ambas as abordagens.

Uma "região constante" de um anticorpo se refere à região cons-tante da cadeia leve de anticorpo ou à região constante da cadeia pesada deanticorpo, ou sozinha ou em combinação.

Conforme usado aqui, o termo "fator de crescimento nervoso" e"NGF" se refere a fator de crescimento nervoso e variantes do mesmo queconservam no mínimo parte da atividade biológica do NGF. Conforme usadoaqui, NGF inclui todas as espécies mamíferas de NGF de seqüência nativa,inclusive humana, canina, felina, eqüina, ou bovina.

"Receptor de NGF" se refere a um polipeptídeo que é ligado porou ativado por NGF. Receptores de NGF incluem o receptor TrkA e o recep-tor p75 de quaisquer espécies mamíferas, inclusive, mas não limitadas a,humana, canina, felina, eqüina, primata, ou bovina.Conforme usado aqui, um "anticorpo antagonista anti-NGF" (demodo intercambiável denominado "anticorpo anti-NGF") se refere a um anti-corpo o qual é capaz de ligar a NGF e inibir a atividade biológica do NGFe/ou um ou mais caminhos a jusante mediados por sinalização de NGF. Umanticorpo antagonista anti-NGF engloba anticorpos que bloqueiam, antago-nizam, suprimem ou reduzem (inclusive significativamente) a atividade bioló-gica do NGF, inclusive caminhos a jusante mediados por sinalização deNGF, tais como ligação de receptor e/ou provocação de uma reação celulara NGF. Para os fins da presente invenção, será explicitamente entendidoque o termo "anticorpo antagonista anti-NGF" engloba todos os termos, títu-los, e estados funcionais e características previamente identificados pormeio dos quais o próprio NGF, uma biológica atividade de NGF (inclusivemas não limitada a sua capacidade para capacidade para mediaar qualqueraspecto de dor pós-cirúrgica), ou as conseqüências da atividade biológica,são substancialmente anulados, reduzidos, ou neutralizados em qualquergrau significativo. Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista anti-NGF liga NGF e evita a dimerização de NGF e/ou ligação a um receptor deNGF (tal como p75 e/ou trkA). Em outras modalidades, um anticorpo anti-NGF liga NGF e evita a dimerização de receptor trkA e/ou autofosforilaçãode trkA. Exemplos de anticorpos antagonistas anti-NGF são proporcionadosaqui.

"Atividade biológica" do NGF geralmente se refere à capacidadepara ligar receptores de NGF e/ou ativar caminhos de sinalização de recep-tores de NGF. Sem limitação, uma atividade biológica inclui qualquer uma oumais das seguintes: a capacidade para ligar um receptor de NGF (tal comop75 e/ou trkA); a capacidade para promover dimerização de receptores trkAe/ou autofosforilação; a capacidade para ativar um caminho de sinalizaçãode receptores de NGF; a capacidade para promover diferenciação celular,proliferação, sobrevida, crescimento e outras alterações na fisiologia celular,inclusive alteração (no caso de neurônios, inclusive neurônio periférico ecentral) na morfologia neuronal, sinaptogênese, função sináptica, liberaçãode neurotransmissores e/ou neuropeptídeos e regeneração depois de lesão;a capacidade para promover sobrevida de neurônios trigeminais E13.5 decamundongo; e a capacidade para mediar dor, inclusive dor pós-cirúrgica.

Conforme usado aqui, "substancialmente puro" se refere a mate-rial o qual é no mínimo 50% puro (isto é, livre e contaminantes), mais prefe-rencialmente no mínimo 90 % puro, mais preferencialmente no mínimo 95%puro, mais preferencialmente no mínimo 98% puro, mais preferencialmenteno mínimo 99% puro.

Uma "célula hospedeira" inclui um célula individual ou culturacelular que pode ser ou tenha sido um receptor para um ou mais vetorespara incorporação de insertos de polinucleotídeos. Células hospedeiras in-cluem progenie de uma única célula hospedeira, e a progenie pode não sernecessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemen-to de DNA genômico) à célula original matriz devido a mutação natural, aci-dental, ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas invivo com um ou mais polinucleotídeos desta invenção.

Conforme usado aqui, "tratamento" é uma abordagem para obterresultados clínicos benéficos ou desejados. Para os fins desta invenção, re-sultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitadosa, um ou mais dos seguintes : melhora ou alívio de qualquer aspecto de dor,inclusive dor aguda, crônica, inflamatória, neuropática, dor pós-cirúrgica, dorda artrite reumatóide, ou dor de osteoartrite. Para os fins desta invenção,resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitadosa, um ou mais dos seguintes : inclusive redução da gravidade, alívio de umou mais sintomas associados com dor inclusive qualquer aspecto de dor (talcomo encurtamento da duração da dor, redução da sensibilidade ou sensa-ção de dor).

Uma "quantidade eficaz" de fármaco, composto, ou composiçãofarmacêutica é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficosou desejados inclusive resultados clínicos tais como alívio ou redução nasensação da dor. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma oumais administrações. Para os fins desta invenção, uma quantidade eficaz defármaco, composto, ou composição farmacêutica é uma quantidade suficien-te para tratar, melhorar, reduzir a intensidade de e/ou prevenir dor, inclusivedor pós-cirúrgica, dor da artrite reumatóide, e/ou dor de osteoartrite. Em al-gumas modalidades, a "quantidade eficaz" pode reduzir dor em repouso (dorestacionaria) ou dor induzida mecanicamente (inclusive dor depois de movi-mento), ou ambos, e pode ser administrada antes, durante ou depois de umaincisão, corte, rasgo ou lesão e/ou antes, durante ou depois de estímulo do-loroso. Conforme é entendido no contexto clínico, uma quantidade eficaz deum fármaco, composto, ou composição farmacêutica pode ou não ser obtidaem combinação com outro fármaco, composto, ou composição farmacêutica.

Portanto, uma "quantidade eficaz" pode ser considerada no contexto de ad-ministrar um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser con-siderado para ser administrado em uma quantidade eficaz caso, em combik-nação com um ou mais agentes diversos, possa ser obtido ou seja obtido umresultado desejável.

"Reduzir a incidência" de dor significa qualquer um entre reduzira gravidade (que pode incluir reduzir a necessidade de e/ou quantidade de(por exemplo, exposição a) outros fármacos e/ou terapias usados de modogeral para estas condições, inclusive, por exemplo, opiáceos), duração, e/oufreqüência (inclusive, por exemplo, retardar ou aumentar o tempo para dorpós-cirúrgica em um indivíduo). Conforme é entendido por aqueles versadosna técnica, os indivíduos podem variar em termos de sua reação ao trata-mento, e, deste modo, por exemplo, um "método para reduzir a incidência dedor da artrite reumatóide ou dor de osteoartrite em um indivíduo" reflete ad-ministrar o anticorpo antagonista anti-NGF com base em uma expectativarazoável de que a administração referida pode causar provavelmente umaredução semelhante na incidência naquele indivíduo em particular.

"Melhorar" uma dor ou um ou mais sintomas de uma dor (tal co-mo dor da artrite reumatóide ou dor de osteoartrite) significa uma redução oumelhora de um ou mais sintomas de uma dor comparada com não adminis-tração de um anticorpo antagonista anti-NGF. "Melhorar" também inclui en-curtamento ou redução na duração de um sintoma.

"Aliviar" uma dor ou um ou mais sintomas de uma dor (tal comodor da artrite reumatoide ou dor de osteoartrite) significa reduzir a extensãode uma ou mais manifestações clínicas indesejáveis de dor pós-cirúrgica emum indivíduo ou população de indivíduos tratados com um anticorpo antago-nista anti-NGF de acordo com a invenção.

Conforme usado na mesma, "retardar" o desenvolvimento de dorsignifica adiar, impedir, tornar mais lenta, retardar, estabilizar, e/ou postergara progressão da dor, tal como dor pós-cirúrgica, dor da artrite reumatoide, oudor de osteoartrite. Este atraso pode ser de extensões de tempo variáveis,dependendo do histórico da doença e/ou indivíduos sendo tratados. Confor-me é evidente para uma pessoa versada na técnica, um atraso suficiente ousignificativo pode, em efeito, englobar prevenção, em que o indivíduo nãodesenvolve dor. Um método que "atrasa" o desenvolvimento do sintoma éum método que reduz a probabilidade de desenvolver o sintoma em umadada janela de tempo e/ou reduz a extensão dos sintomas em uma dadajanela de tempo, quando comparado a não usar o método. As comparaçõesreferidas tipicamente se baseiam em estudos clínicos, usando um númeroestatisticamente significante de sujeitos.

"Dor" conforme usado aqui, se refere a dor de qualquer etiologia,inclusive dor aguda e crônica, e qualquer dor com um componente inflamató-rio. Exemplos de dor incluem dor pós-cirúrgica, dor do pós-operatório (inclu-sive dor dental), enxaqueca, cefaléia e nevralgia trigeminal, dor associada aqueimadura, ferimento ou pedra renal, dor associada a trauma (inclusive le-são traumática da cabeça), dor neuropática, dor associada a distúrbios mús-culo-esqueléticos tais como artrite reumatoide, osteoartrite, espondilite an-quilosante, artropatias soro-negativas (não-reumatóides), reumatismo nãoarticular e distúrbios peri-articulares, e dor associada a câncer (inclusive "dorde ruptura" e dor associada a câncer terminal), neuropatia periférica e ne-vralgia pós-herpética. Exemplos de dor com um componente inflamatório(além de algumas das descritas acima) incluem dor reumática, dor associa-da a mucosite, e dismenorréia.

"Dor pós-cirúrgica" (denominada de modo intercambiável "dorpós-incisional" ou "dor pós-traumática") se refere a dor originária ou resultan-te de um trauma externo tal como um corte, punção, incisão, dilaceramento,ou ferimento em tecido de um indivíduo (inclusive a que surge de todos osprocedimentos cirúrgicos, quer invasiva ou não invasiva). Conforme usadoaqui, dor pós-cirúrgica não inclui dor que ocorre (surge ou se origina) semum trauma físico externo. Em algumas modalidades, dor pós-cirúrgica é dorinterna ou externa (inclusive periférica), e o ferimento, corte, trauma, dilace-ramento ou incisão pode ocorrer acidentalmente (como com um ferimentotraumático) ou deliberadamente (como com uma incisão cirúrgica). Confor-me usado aqui, "dor" inclui nocicepção e a sensação de dor, e a dor podeser avaliada objetivamente e subjetivamente, usando escores de dor e ou-tros métodos de conhecimento geral na técnica. Dor pós-cirúrgica, conformeusado aqui, inclui alodinia (isto é, aumento da reação a um estímulo nor-malmente não nocivo) e hiperalgesia (isto é, aumento da reação a um estí-mulo normalmente nocivo ou desagradável), que por sua vez, pode ser denatureza térmica ou mecânica (táctila). Em algumas modalidades, a dor secaracteriza por sensibilidade térmica, sensibilidade mecânica e/ou dor emrepouso. Em algumas modalidades, a dor pós-cirúrgica compreende dor in-duzida mecanicamente ou dor em repouso. Em outras modalidades, a dorpós-cirúrgica compreende dor em repouso. A dor pode ser dor primária ousecundária, conforme é de conhecimento geral na técnica.

Uma "amostra biológica" engloba uma variedade de tipos deamostras obtidas de um indivíduo e pode ser usada em um ensaio de diag-nóstico ou de monitoramento. A definição engloba amostras de sangue eoutros líquidos de origem biológica, amostras de tecidos sólidos tais comouma amostra de biópsia ou culturas de tecidos ou células derivadas dosmesmos, e a progênie dos mesmos. A definição também inclui amostras queforam manipuladas em qualquer modo depois de sua aquisição, tal como portratamento com reagentes, solubilização, ou enriquecimento para algunscomponentes, tais como proteínas ou polinucleotídeos, ou embutindo emuma matriz sólida ou semi-sólida para fins de seccionamento. O termo "a-mostra biológica" engloba uma amostra clínica, também inclui células emcultura, sobrenadantes celulares, lisados celulares, soro, plasma, fluido bio-lógico, e amostras de tecido.

Um "indivíduo" é um vertebrado, preferencialmente um mamífe-ro, mais preferencialmente um ser humano. Memíferos incluem, mas nãoestão limitados a, animais de criação (tais como vacas), animais de competi-ção, animais de estimação (tais como gatos, cães e cavalos), primatas, ca-mundongos e ratos.

Conforme usado aqui, "vetor" significa um construto, o qual écapaz de liberar, e preferencialmente expressar, um ou mais genes ou umaou mais seqüências de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos devetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vetores de ex-pressão de RNA ou DNA nu, plasmídeo, vetores de cosmídeo ou fago, veto-res de expressão de DNA ou RNA associados a agentes de condensaçãocatiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipos-somas, e algumas células eucarióticas, tais como células produtoras.

Conforme usado aqui, "seqüência controle de expressão" signifi-ca uma seqüência de ácido nucléico que orienta a transcrição de um ácidonucléico. Uma seqüência controle de expressão pode ser um promotor, talcomo um promotor constitutivo ou um indutível, ou um intensificador. A se-qüência controle de expressão é encadeada operavelmente à seqüência deácido nucléicoia ser transcrita.

Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável"inclui qualquer material o qual, quando combinado com um ingrediente ativo,permite que o ingrediente conserve a atividade biológica e seja não-reativocom o sistema imune do sujeito. Exemplos incluem, mas não estão limitadosa, quaisquer dos veículos farmacêuticos de padrão tais como uma soluçãosalina tamponada com fosfato, água, emulsões tais como emulsão de óleo /água, e vários tipos de agentes umectantes. Diluentes preferenciais paraadministração aerosol ou parenteral são solução salina tamponada com fos-fato ou solução salina normal (0,9%). Composições compreendendo os veí-culos referidos são formulados por métodos convencionais de conhecimentogeral (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th editi-on, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000).

O termo "koff", conforme usado aqui, pretende se referir à cons-tante de off rate para dissociação de um anticorpo do complexo antíge-no/anticorpo.

O termo "Kd", conforme usado aqui, pretende se referir à cons-tante de dissociação de uma interação antígeno/anticorpo.

ANTICORPO E3, DERIVADOS DE ANTICORPOS E3. COMPOSIÇÕES,E MÉTODOS DE USO

Composições de E3, Composições Derivadas de E3, e Métodos para Prepa-rar as Composições

Esta invenção engloba composições, inclusive composiçõesfarmacêuticas, compreendendo um anticorpo ou polipeptídeo de E3; e poli-nucleotídeos compreendendo seqüências codificando um anticorpo ou poli-peptídeo de E3. Conforme usado aqui, as composições compreendem umou mais anticorpos ou polipeptídeos (os quais podem ser ou não um anticor-po) que ligam a NGF, e/ou um ou mais polinucleotídeos compreendendoseqüências codificando um ou mais anticorpos ou polipeptídeos que ligam aNGF. Estas composições podem compreender adicionalmente excipientesadequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis inclusivetampões, os quais são de conhecimento geral na técnica.

A invenção também engloba modalidades de anticorpo, polipep-tídeo e polinucleotídeo isolados. A invenção também engloba modalidadesde anticorpo, polipeptídeo e polinucleotídeo substancialmente puros.

Os anticorpos e polipeptídeos da invenção são caracterizadospor qualquer uma (uma ou mais) das seguintes características: (a) capaci-dade para ligar a NGF; (b) capacidade para reduzir e/ou inibir a atividadebiológica de NGF e/ou um ou mais caminhos a jusante mediados por sinali-zação de NGF; (c) capacidade para reduzir e/ou inibir a sobrevida depen-dente do fator de crescimento nervoso de neurônios trigeminais E13.5 decamundongo; (d) ausência de qualquer reatividade cruzada significativa aNT3, NT4/5, e/ou BDNF; (e) capacidade para tratar e/ou prevenir dor (inclu-sive dor pós-cirúrgica); (f) capacidade para aumentar o clearance de NGF;(g) capacidade para reduzir ou inibir a ativação de receptor de trkA, confor-me detectado, por exemplo, usando ensaio de ativação de receptor de qui-nase (KIRA) (veja a Patente dos Estados Unidos No. 6.027.927).

As propriedades de ligação do anticorpo E3, o qual liga NGFhumano com alta afinidade e cinética de dissociação lenta, comparado comanticorpo anti-NGF monoclonal murino de origem 911, são resumidas abai-xo. E3 liga NGF humano com uma afinidade de ligação cerca de 50 vezesmajor do que o anticorpo de camundongo de origem 911.

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O anticorpo E3 e anticorpos relacionados também apresentamuma forte capacidade para antagonizar NGF humano, conforme avaliado porensaios in vitro (veja os Exemplos 2 e 3). Por exemplo, o anticorpo E3 anta-goniza a sobrevida dependente do fator de crescimento nervoso de neurô-nios trigeminais E13 de camundongo em uma IC50 de cerca de 21 pM napresença de 15 pM de NGF humano, e cerca de 1,2 pM na presença de 1,5pM de NGF humano.

Por conseguinte, em outro aspecto, os anticorpos e polipeptí-deos da invenção são adicionalmente identificados e caracterizados por: (h)alta afinidade de ligação a NGF humano com baixa cinética de dissociação(em algumas modalidades, com uma Kd de menos de cerca de 2 nM, e/ouuma "koff" de mais lento do que cerca de 6x10-5 s-1) e/ou (i) capacidadepara inibir (bloquear) a sobrevida dependente do fator de crescimento nervo-so de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50 de cercade 100 pM ou menos a cerca de 15 pM de NGF (em algumas modalidades,NGF humano) e/ou uma IC50 de cerca de 20 pM ou menos a cerca de 1,5pM de NGF.

Em algumas modalidades, o anticorpo liga NGF humano, e nãoliga significativamente um NGF de outra espécie de vertebrado (em algumamodalidade, mamífero). Em algumas modalidades, o anticorpo liga NGFhumano bem como um ou mais NGF de outra espécie de vertebrado (emalgumas modalidades, mamífero). Em ainda outras modalidades, o anticorpoliga NGF e não tem reação cruzada significativamente com outras neurotro-finas (tais como as neurotrofinas relacionadas, NT3, NT4/5, e/ou BDNF). Emalgumas modalidades, o anticorpo liga NGF bem como no mínimo uma outraneurotrofina. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a uma espécie ma-mífera de NGF, tal como cavalo ou cachorro, mas não liga significativamentea NGF de outra espécie mamífera.

Em algumas modalidades, a invenção é um anticorpo compre-endendo uma cadeia leve que é codificada por um polinucleotídeo que éproduzido por uma célula hospedeira com um número de depósito de ATCCNo. PTA-4893 ou ATCC No. PTA-4894. Em outro aspecto, a invenção é umanticorpo compreendendo uma cadeia pesada que é codificada por um poli-nucleotídeo que é produzido por uma célula hospedeira com um número dedepósito de ATCC No. PTA-4895. A presente invenção também engloba vá-rias formulações de E3 e fragmentos de anticorpos equivalentes (por exem-plo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc), cadeia única (ScFv), mutantes dosmesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção anticorpo, e qual-quer outra configuração modificada de E3 qaue compreende um sítio de re-conhecimento antigênico (NGF) da especificidade requirida. Os anticorposequivalentes de E3, inclusive fragmentos de anticorpos e de polipeptídeos(os quais podem ser ou não anticorpos) de E3, e polipeptídeos compreen-dendo fragmentos de polipeptídeos de E3 são identificados e caracterizadorpor quaisquer (um ou mais) dos critérios descritos acima.

Por conseguinte, a invenção proporciona quaisquer dos seguin-tes, ou composições (inclusive composições farmacêuticas) compreendendoquaisquer dos seguintes: (a) anticorpo E3; (b) um fragmento ou uma regiãodo anticorpo E3; (c) uma cadeia leve do anticorpo E3 conforme mostradonas Figuras 1B; (c) uma cadeia pesada do anticorpo E3 conforme mostradonas Figuras 1A; (d) uma ou mais regiões variázveis de uma cadeia leve e/ouuma cadeia pesada do anticorpo E3; (e) uma ou mais CDRs (uma, duas,três, quatro, cinco ou seis CDRs) do anticorpo E3 mostradas nas Figuras 1Ae 1B; (f) CDR H3 da cadeia pesada do anticorpo E3 mostrada na figura 1A;(g) CDR L3 da cadeia leve do anticorpo E3 mostrada na Figura 1B; (h) trêsCDRs da cadeia leve do anticorpo E3 mostrada na Figura 1B; (i) três CDRsda cadeia pesada do anticorpo E3 mostrada na Figura 1A; (j) três CDRs dacadeia leve e três CDRs da cadeia pesada, do anticorpo E3 mostrada nasFiguras 1A e 1B; e (k) um anticorpo compreendendo qualquer um de (b) a(j). Conforme é evidente a partir da descrição aqui, especificamente excluí-das da invenção estão modalidades de polipeptídeos consistindo na se-qüência de aminoácidos idêntica a uma seqüência de aminoácidos de anti-corpo monoclonal de camundongo, 911. As seqüências de CDR estendidasde Mab 911 são mostradas nas Figuras 1A e 1B, e na SEQ ID NOS: 9-14.

As porções CDR do anticorpo E3 (inclusive CDRs de Chothia eKabat) são representadas diagramaticamente nas Figuras 1A e 1B, e consis-tem nas seguintes seqüências de aminoácidos: (a) CDR 1 de cadeia pesada("CDR H1") GFSLIGYDLN (SEQ ID NO: 3); (b) CDR 2 de cadeia pesada("CDR H2") IIWGDGTTDYNSAVKS (SEQ ID NO: 4); (c) CDR 3 de cadeiapesada ("CDR H3") GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO: 5); (d) CDR 1 de ca-deia leve ("CDR L1") RASQSISNNLN (SEQ ID NO: 6); (e) CDR 2 de cadeialeve ("CDR L2") YTSRFHS (SEQ ID NO: 7); e (f) CDR 3 de cadeia leve ("C-DR L3") QQEHTLPYT (SEQ ID NO: 8). A determinação de regiões de CDRestá bem dentro do conhecimento da técnica. É entendido que em algumasmodalidades, as CDRs podem ser uma combinação da CDR de Kabat eChothia (também denominadas "CDRs combinadas" ou "CDRs estendidas").Em algumas modalidades, as CDRs compreendem a CDR de Kabat. Emoutras modalidades, as CDRs são a CDR de Chothia.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona um anticorpoo qual compreende no mínimo uma CDR que é substancialmente homólogaa no mínimo uma CDR, no mínimo duas, no mínimo três, no mínimo quatro,no mínimo 5 CDRs de E3 (ou, em algumas modalidades substancialmentehomóloga a todas as 6 CDRs de E3, ou derivados de E3). Outras modalida-des incluem anticorpos os quais têm no mínimo duas, três, quatro, cinco, ouseis CDR(s) que são substancialmente homólogas a no mínimo duas, três,quatro, cinco ou seis CDRs de E3 ou derivados de E3. Entende-se que, paraos fins desta invenção, especificidade de ligação e/ou atividade global (aqual pode ser em termos de tratar e/ou prevenir dor ou inibir a sobrevida de-pendente do fator de crescimento nervoso de neurônios trigeminais de ca-mundongo E13.5) é geralmente conservada, embora a extensão da ativida-de possa variar comparada com E3 (pode ser maior ou menor).

A invenção também proporciona um polipeptídeo (o qual podeser ou não um anticorpo) o qual compreende uma seqüência de aminoáci-dos de E3 (mostrada nas Figuras 1A e 1B) que tem quaisquer dos seguintes:no mínimo 5 aminoácidos contíguos, no mínimo 8 aminoácidos contíguos, nomínimo cerca de 10 aminoácidos contíguos, no mínimo cerca de 15 aminoá-cidos contíguos, no mínimo cerca de 20 aminoácidos contíguos, no mínimocerca de 25 aminoácidos contíguos, no mínimo cerca de 30 aminoácidoscontíguos de uma seqüência de E3, em que no mínimo 3 dos aminoácidossão de uma região variável de E3, com o entendimento de que modalidadesque consistem na seqüência de aminoácidos idêntica a uma seqüência deaminoácidos de anticorpo monoclonal dee camundongo, 911, são especifi-camente excluídas. As seqüências de CDR estendidas de Mab 911 sãomostradas nas Figuras 1A e 1B, e nas SEQ ID NOS: 9-14. Em uma modali-dade, a região variável é de uma cadeia leve de E3. Em outra modalidade, aregião variável é de uma cadeia pesada de E3. Em outra modalidade, os 5(ou mais) aminoácidos contíguos são de uma região determinante de com-plementaridade (CDR) de E3 mostrada nas Figuras 1A e 1B.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo oqual compreende uma seqüência de aminoácidos de E3 que tem quaisquerdos seguintes: no mínimo 5 aminoácidos contíguos, no mínimo 8 aminoáci-dos contíguos, no mínimo cerca de 10 aminoácidos contíguos, no mínimocerca de 15 aminoácidos contíguos, no mínimo cerca de 20 aminoácidoscontíguos, no mínimo cerca de 25 aminoácidos contíguos, no mínimo cercade 30 aminoácidos contíguos de uma seqüência de E3, em que a seqüênciade E3 compreende qualquer um ou mais de: resíduo aminoácido L29 deCDRH1, I50 de CDRH2, W101 de CDRH3, e/ou A103 de CDRH3; e/ou resí-duo aminoácido S28 de CDRL1, N32 de CDRL1, T51 de CDRL2, 91E deCDRL3 e/ou H92 de CDRL3, com o entendimento de que modalidades queconsistem na seqüência de aminoácidos idêntica a uma seqüência de ami-noácidos de anticorpo monoclonal de camundongo, 911, são especificamen-te excluídas.

Conforme é evidente, do início ao fim desta descoberta, é usadoum esquema de numeração seqüencial de aminoácidos para referir a resí-duos aminoácidos nas regiões variáveis (isto é, os resíduos aminoácidos emcada região variável são numerados em seqüência). Conforme é de conhe-cimento geral na técnica, os sistemas de numeração Kabat e/ou Chothia sãoúteis ao comparar dois anticorpos ou polipeptídeos, tais como um anticorpoE3 e uma variante de E3 (ou polipeptídeo suspeito de ser uma variante deE3). É de entendimento geral na técnica como converter numeração se-qüencial para numeração Chothia e/ou Kabat, caso desejado, por exemplo,para uso para fazer comparações entre E3 e outro polipeptídeo. A Figura 23representa as regiões variáveis E3 numeradas usando numeração seqüen-cial, Chothia e Kabat. Além disso, para facilitar a comparação, geralmente seentende que resíduos de estrutura geralmente, mas não sempre, têm apro-ximadamente o mesmo número de resíduos. No entanto, as CDRs podemvariar de tamanho (isto é, é possível ter inserções e/ou eliminações de umou mais resíduos aminoácidos). Ao comparar um anticorpo de E3 e um can-didato variante de E3 (por exemplo, no caso de uma região CDR de umaseqüência candidata a qual é mais longa na seqüência no anticorpo E3 aoqual está alinhada), pode-se seguir as seguintes etapas (embora outros mé-todos sejam conhecidos na técnica). A seqüência de anticorpos candidata éalinhada com regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de anti-corpo E3. O alinhamento pode ser feito manualmente, ou por computadorusando programas de computador comumente aceitos. O alinhamento podeser facilitado usando alguns resíduos aminoácidos os quais são comuns àsmaiorias das seqüências Fab. Por exemplo, as cadeias leve e pesada tipi-camente têm cada duas cisteínas, as quais são encontradas em uma posi-ção conservada. Entende-se que a seqüência de aminoácidos de um anti-corpo variante candidato pode ser mais longa (isto é, ter resíduos aminoáci-dos inseridos) ou mais curta (ter resíduos aminoacidos eliminados). Sufixospodem ser adicionados ao número do resíduo para indicar a inserção de re-síduos adicionais, por exemplo, resíduo 34 abe. Para seqüências candidatasas quais, por exemplo, alinham com uma seqüência de E3 para, por exem-pio, resíduos 33 e 35, mas não têm nenhum resíduo entre estes para alinharcom o resíduo 35, o resíduo 35 é simplesmente não atribuído a um resíduo.Em outra abordagem, geralmente é de conhecimento geral que pode serfeita comparação entre aminoacidos equivalentes estruturais (por exemplo,mesma posição no complexo antígeno-anticorpo) ao comparar CDRs de di-ferentes extensões. Por exemplo, a numeração Chothia (Al-Lazikani et al,supra) geralmente (mas não em todos os casos), coloca inserções e elimi-nações nas posições estruturalmente corretas. A equivalência estruturaltambém pode ser deduzida ou demonstrada usando cristalografia de raios Xou análise de ciclo mutante duplo (veja Pons et al. (1999) Prot. Sei. 8:958-968).

A afinidade de ligação de um anticorpo anti-NGF a NGF (tal co-mo hNGF) pode ser cerca de 0,10 até cerca de 0,80 nM, cerca de 0,15 atécerca de 0,75 nM e cerca de 0,18 até cerca de 0,72 nM. Em algumas moda-lidades, a afinidade de ligação é cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, cerca de 40 pM, ou mais de cerca de40 pM. Em uma modalidade, a afinidade de ligação é entre about cerca de 2pM e 22 pM. Em outras modalidades, a afinidade de ligação é menos decerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 4 nM, cerca de 3.5 nM, cerca de 3nM, cerca de 2.5 nM, cerca de 2 nM, cerca de 1.5 nM, cerca de 1 nM, cercade 900 pM, cerca de 800 pM, cerca de 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cer-ca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10pM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é cerca de 10 nM. Emoutras modalidades, a afinidade de ligação é menos de cerca de 10 nM. Emoutras modalidades, a afinidade de ligação é cerca de 0,1 nM ou cerca de0,07 nM. Em outras modalidades, a afinidade de ligação é menos de cercade 0,1 nM ou menos de cerca de 0,07 nM. Em outras modalidades, a afini-dade de ligação é qualquer de cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 4nM, cerca de 3.5 nM, cerca de 3 nM, cerca de 2.5 nM, cerca de 2 nM, cercade 1.5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 900 pM, cerca de 800 pM, bout 700 pM,cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cer-ca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM,cerca de 30 pM, cerca de 10 pM to any de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM,cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, ou cerca de 40 pM. Emalgumas modalidades, a afinidade de ligação é qualquer de cerca de 10 nM,cerca de 5 nM, cerca de 4 nM, cerca de 3,5 nM, cerca de 3 nM, cerca de 2,5nM, cerca de 2 nM, cerca de 1,5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 900 pM, cercade 800 pM, cerca de 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cercade 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10 pM. Em ainda ou-tras modalidades, a afinidade de ligação é cerca de 2 pM, cerca de 5 pM,cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, cerca de 40 pM, ou maisde cerca de 40 pM.

A afinidade de ligação do anticorpo a NGF pode ser determinadausando métodos de conhecimento geral na técnica. Um modo para determi-nar a afinidade de ligação dos anticorpos a NGF é medindo a afinidade defragmentos Fab monofuncionais do anticorpo, conforme descrito nos Exem-plos. Para obter fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo (por exem-pio, IgG) pode ser clivado com papaína ou expressado de modo recombi-nante. A afinidade de um fragmento Fab anti-NGF de um anticorpo pode serdeterminada por ressonância de plasmon superficial (sistema de ressonân-cia de plasmon superficial BIAcore3000™ (SPR), BlAcore, INC, PiscatawayNJ), conforme descrito nos Exemplos. Este protocolo é adequado para usona determinação da afinidade de ligação de um anticorpo a NGF de qualquerespécie, inclusive NGF humano, NGF de outro vertebrado (em algumas mo-dalidades, mamífero) (tal como NGF de camundongo, NGF de rato, NGF deprimata), bem como para uso com outras neurotrofinas, tais como as neuro-trofinas relacionadas NT3, NT4/5, e/ou BDNF.

Em algumas modalidades, os anticorpos ou peptídeos da inven-ção podem inibir (reduzir, e/ou bloquear) a sobrevida dependente do fator decrescimento nervoso humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundon-go com uma IC50 (na presença de cerca de 15 pM de NGF) de cerca dequalquer de 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM,ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos ou peptídeos da inven-ção podem inibr (reduzir, e/ou bloquear) a sobrevida dependente do fator decrescimento nervoso humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundon-go com uma IC50 (na presença de cerca de 1.5 pM de NGF) de cerca dequalquer de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM,ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos ou peptídeos da inven-ção podem inibir (reduzir, e/ou bloquear) a sobrevida dependente do fator decrescimento nervoso de rato de neurônios trigeminais E13.5 de camundongocom uma IC50 (na presença de cerca de 15 pM de NGF) de cerca de qual-quer de 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10pM, 5 pM, ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos ou peptídeosda invenção podem inibir (reduzir, e/ou bloquear) a sobrevida dependente dofator de crescimento nervoso de rato de neurônios trigeminais E13.5 de ca-mundongo com uma IC50 (na presença de cerca de 1,5 pM de NGF) de cer-ca de qualquer de 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2pM, 1 pM, ou menos. Métodos para medição da sobrevida dependente dofator de crescimento nervoso de neurônios trigeminais E13 de camundongosão conhecidos na técnica, e descritos, por exemplo, no Exemplo 2.

A invenção também proporciona métodos para preparar quais-quer destes anticorpos ou polipeptídeos. Os anticorpos desta invenção po-dem ser preparados por procedimentos conhecidos na técnica, alguns dosquais são ilustrados nos Exemplos. Os polipeptídeos podem ser produzidospor degradação proteolítica ou diversa dos anticorpos, por métodos recom-binantes (isto é, polipeptídeos únicos ou de fusão) conforme descrito acimaou por síntese química. Polipeptídeos dos anticorpos, especialmente poli-peptídeos mais curtos até cerca de 50 aminoácidos, são preparados conve-nientemente por síntese química. Métodos de síntese química são conheci-dos na técnica e estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, um anti-corpo E3 pode ser produzido por um sintetizador de polipeptídeos automati-zado empregando o método de fase sólida. Veja também, as Patentes dosEstados Unidos Nos. 5.807.715; 4.816.567; e 6.331.415. Anticorpos quiméri-cos ou híbridos também podem ser preparados in vitro usando métodos co-nhecidos de química de proteínas sintéticas, inclusive aqueles envolvendoagentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídasusando uma reação de permuta dissulfeto ou formando uma ligação tioéter.Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e meti-la-4-mercaptobutirimidato.

Em outra alternativa, os anticorpos podem ser preparados demodo recombinante usando procedimentos que são de conhecimento geralna técnica. Em uma modalidade, um polinucleotídeo compreendendo umaseqüência codificando as regiões de cadeia leve e variável do anticorpo E3(mostradas nas Figuras 1A e 1B) é clonado em um vetor para expresão oupropagação em uma célula hospedeira (por exemplo, células CHO). Em ou-tra modalidade, as seqüências de polinucleotídeos mostradas nas Figuras 2e 3 são clonadas em um ou mais vetores para expresão ou propagação. Aseqüência codificando o anticorpo de interesse pode ser mantida em um ve-tor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode ser então expandi-da e congelada para uso futuro. Vetores (inclusive vetores de expressão) ecélulas hospedeiras são adicionalmente descritas aqui. Foram descritos mé-todos para expressar anticorpos de modo recombinantem em plantas ou lei-te. Veja, por exemplo, Peeters et al. (2001) Vaccine 19:2756; Lonberg, N.and D. Huszar (1995) Int.Rev.lmmunol 13:65; e Pollock etal. (1999) J Immu-nol Methods 231:147. São conhecidos na técnica métodos para prepararderivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, de cadeia única, e etc.

A invenção também engloba fragmentos de região variável decadeia única ("scFv") de anticorpos desta invenção, tais como E3. Fragmen-tos de região variável de cadeia única são preparados encadeando regiõesvariáveis de cadeia leve e/ou pesada usando um peptídeo de ligação curto.Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Um exemplo de um peptídeo de liga-ção é (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 15), o qual constrói ponte de cerca de 3,5 nmentre o término carbóxi de uma região variável e o término amino da outraregião variável. Ligantes de outras seqüências foram designados e usados(Bird et al. (1988)). Ligantes podem ser por sua vez modificados para fun-ções adicionais, tais como fixação de fármacos ou fixação a suportes sóli-dos. As variantes de cadeia única podem ser produzidas ou de modo re-combinante ou sinteticamente. Para produção sintética de scFv, pode serusado um sintetizador automático. Para produção recombinante de scFv,pode ser introduzido um plasmídeo adequado contendo polinucleotídeo quecodificam o scFv em uma célula hospedeira adequada, quer eucariótica, talcomo células de levedura, vegetal, de inseto ou de mamífero, quer procarió-tica, tal como E. coli. Polinucleotídeos codificando o scFv de interesse po-dem ser preparados por manipulações de rotina tais como ligação de polinu-cleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando técnicas de purifica-ção de proteína de rotina conhecidas na arte.

Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diabodi-es também são englobadas. Diabodies são anticorpos bivalentes, biespecífi-cos nos quais os domínios VH e VL são expressados sobre uma cadeia úni-ca de polipeptídeo, mas usando um ligante que é curto demais para permitirpareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, deste modo for-çando os domínios a parear com domínios complementares de outra cadeiae criando dois sítios de ligação antigênica (veja, por exemplo, Holliger, P., etal. (1993) Proc. Natl. Acad Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994)Structure 2:1121-1123).

O anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico, um anticorpomonoclonal que tem especificidades de ligação para no mínimo dois antíge-nos diferentes. Um anticorpo biespecífico pode ser preparado usando osanticorpos descritos aqui. São conhecidos na técnica métodos para prepararanticorpos biespecíficos (veja, por exemplo, Suresh et al., 1986, Methods inEnzymology 121:210). Tradicionalmente, a produção recombinante de anti-corpos biespecíficos se baseou na coexpressão de dois pares de cadeiaspesada-leve de imunoglobulina, com as duas cadeias pesadas tendo dife-rentes especificidades (Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

De acordo com uma abordagem para preparar anticorpos bies-pecíficos, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de liga-ção desejadas (sítios de combinação antígeno-anticorpo) são fundidos a se-qüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão preferencialmen-te é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, com-preendendo no mínimo parte da articulação, regiões CH2 e CH3. É prefe-rencial ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1), contendo osítio necessário para ligação de cadeia leve, presente em no mínimo umadas fusões. DNAs codificando as fusões de cadeia pesada de imunoglobuli-na e, caso desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em ve-tores de expressão isolados, e são cotransfectados em um organismo hos-pedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade em ajustar as pro-porções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeos em modalidadesquando proporções desiguais das três cadeias de polipeptídeos usadas naconstrução proporcionam as produções ótimas. No entanto, é possível inse-rir as seqüências codificantes para duas ou todas as três cadeias de polipep-tideos em um,vetor de expressão quando a expressão de no mínimo duascadeias de polipeptídeos em iguais proporções resulta em altas produçõesou quando as proporções não são de importância particular.

Em uma abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostosde uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especi-ficidade de ligação em um braço, e um par de cadeia pesada-cadeia leve deimunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de li-gação) em outro braço. Esta estrutura assimétrica, com uma cadeia leve deimunoglobulina em somente metade da molécula biespecífica, facilita a se-paração do composto biespecífico desejado de combinações de cadeias deimunoglobulina indesejadas. Esta abordagem é descrita na Publicação dePatente Internacional PCT No. WO 94/04690, publicada em 3 de março de1994.Anticorpos heteroconjugados, compreendendo dois anticorposligados de modo covalente, também estão dentro do âmbito da invenção. Osanticorpos referidos têm sido usados para ter por alvo células do sistemaimune para células indesejadas (Patente dos Estados Unidos No.4.676.980), e para tratamento de infecção por HIV (publicação do pedido depatente PCT Nos. WO 91/00360 e WO 92/200373; EP 03089). Anticorposheteroconjugados podem ser preparados usando quaisquer métodos de reti-culação convenientes. Agentes e técnicas de reticulação adequados são deconhecimento geral na técnica, e são descritos na Patente dos Estados Uni-dos No. 4.676.980.

O anticorpo pode ser um anticorpo humanizado, por exemplo,conforme conhecido na técnica, e conforme descrito aqui.

Anticorpos podem ser modificados conforme descrito na Publi-cação de Patente Internacional PCT No. WO 99/58572, publicada em 18 denovembro de 1999. Estes anticorpos compreendem, além de um domínio deligação dirigido na molécula alvo, um domínio efetor tendo uma seqüênciade aminoácidos substancialmente homóloga ao todo ou parte de um domínioconstante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Estes anticor-pos são capazes de ligar a molécula alvo sem iniciar um processo de lisedependente de complemento significante, ou destruição, mediada por célu-las, do alvo. Preferencialmente, o domínio efetor é capaz de ligar especifi-camente FcRn e/ou FcYRMb. Estes são tipicamente à base de domínios qui-méricos derivados de dois ou mais domínios CH2 de cadeia pesada de imu-noglobulina humana. Anticorpos modificados nesta maneira são preferenci-ais para uso em terapia crônica com anticorpos, para evitar reações adver-sas inflamatórias e diversas a terapia com anticorpo convencional.

A invenção engloba modificações para o anticorpo E3, inclusiveanticorpos funcionalmente equivalentes os quais não afetam significativa-mente suas propriedades e variantes as quais têm atividade aumentada oureduzida. A modificação de polipeptídeos é prática de rotina na técnica e éadicionalmente exemplificada nos Exemplos. Exemplos de polipeptídeosmodificados incluem polipeptídeos com substituições (inclusive substituiçõesconservativas) de resíduos aminoácidos, uma ou mais eliminações ou adi-ções de aminoácidos as quais não alteram prejudicialmente de modo signifi-cativo a atividade funcional, ou uso de análogos químicos.

Um polipeptídeo "variante," conforme usado aqui, é um polipep-tídeo que difere de uma proteína nativa em uma ou mais substituições, eli-minações, adições e/ou inserções, de tal modo que a imunorreatividade dopolipeptídeo não seja substancialmente diminuída. Em outras palavras, acapacidade de uma variante para ligar antígeno especificamente pode serreforçada ou inalterada, em relação à proteína nativa, ou pode ser diminuídapor menos de 50%, e preferencialmente menos de 20%, em relação à prote-ína nativa. Polipeptídeo variantes preferencialmente apresentam no mínimocerca de 80%, mais preferencialmente no mínimo cerca de 90% e aindamais preferencialmente no mínimo cerca de 95% de identidade (determinadaconforme descrito aqui) com os polipeptídeos identificados.

Variantes de seqüências de aminoácidos dos anticorpos podemser preparadas introduzindo alterações de nucleotídeos apropriadas no DNAdo anticorpo, ou por síntese de peptídeo. As variantes referidas incluem, porexemplo, eliminações de, e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduosdentro das seqüências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2 descritas aqui.

Qualquer combinação de eliminação, inserção, e substituição é feita parachegar ao constructo final, contanto que o constructo final possua as carac-terísticas desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterarprocessos pós-translacionais do anticorpo, tais como alterar o número ou aposição de sítios de glicosilação.

Um método útila para identificação de alguns resíduos ou regi-ões do anticorpo que são localizações preferenciais para mutagênese oumodificação é denominado "mutagênese de varredura de alanina," e é des-crito por Cunningham and Wells, 1989, Science, 244:1081-1085. Um resíduoou grupo de resíduos alvo é identificado (por exemplo, resíduos carregadostais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituído por um aminoácido neutro ounegativamente carregado (ainda mais preferencialmente alanina ou poliala-nina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno. As localizaçõesde aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional para as substituiçõessão em seguida refinadas introduzindo variantes adicionais ou diversas em,ou para, os sítios de substituição. Portanto, enquanto é predeterminado osítio para introduzir uma variação de seqüência de aminoácidos, a naturezada mutação per se não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para ana-lisar a performance de uma mutação um dado sítio, é conduzida mutagêne-se aleatória ou de varredura ala na região ou códon alvo e as variantes deanticorpos expressadas são tríadas para a atividade desejada. Mutagênesede varredura de biblioteca, conforme descrito aqui, também pode ser usadapara identificar localizações em um anticorpo que são adequadas para mu-tagênese ou modificação.

Inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusões determinal amino e/ou carboxila variando em extensão de um resíduo até poli-peptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-seqüência de resíduos aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inser-ções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila N-terminal ouo anticorpo fundido a uma etiqueta de epitopo. Outras variantes insercionaisda molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-término do anticorpode uma enzima ou um polipeptídeo o qual aumenta a meia-vida sérica doanticorpo. g.

Substituições variantes têm no mínimo um resíduo aminoácidona molécula do anticorpo removido e um resíduo diferente inserido em seulocal. Os sítios de maior interesse para mutagênese substitucional incluemas regiões hipervariáveis, mas alterações de FR também são contempladas.

Substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título de"substituições conservativas". Se as referidas substituições resultam em umaalteração na atividade biológica, então alterações mais substanciais, deno-minadas "substituições típicas" na Tabela 1, ou conforme adicionalmentedescrito abaixo em referência a classes de aminoácidos, podem ser introdu-zidas e os produtos triados.Tabela 1: Substituições de Aminoácidos

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Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anti-corpo são realizadas selecionando substituições que diferem significativa-mente em seu efeito sobre a manutenção de (a) a estrutura da espinha prin-cipal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma con-formação de placa ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da moléculano sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem natu-ralmente são divididos em grupos à base de propriedades de cadeias late-rais comuns:

(1) Hidrofóbicos: Norleucine, Met, Ala, Vai, Leu, He;(2) Hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr;

(3) Acídicos: Asp, Glu;

(4) Básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e

(6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Substituições não-conservativas são feitas permutando ummembro de uma destas classes por outra classe.

Qualquer resíduo cisteína não envolvido em manter a conforma-ção apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente comserina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar reticula-ção aberrante. De modo inverso, uma ou mais ligações cisteína podem seradicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade, particularmenteonde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv.

Modificações de aminoácidos podem variar entre alterar ou mo-dificar um ou mais aminoácidos até completo redesenho de uma região, talcomo a região variável. Alterações na região variável podem alterar a afini-dade de ligação e/ou a especificidade. Em alguma modalidade, são feitasnão mais de um a cinco substituições de aminoácidos conservativas dentrode uma domínio CDR. Em outras modalidades, são feitas não mais de um atrês substituições de aminoácidos conservativas dentro de um domínio C-DR3. Em ainda outras modalidades, o domínio CDR é CDRH3 e/ou CDR L3.

Modificações também incluem polipeptídeos glicosilados e nãoglicosilados, bem como polipeptídeos com outras modificações pós-translacionais, tais como, por exemplo, glicosilação com açúcares diferentes,acetilação, e fosforilação. Anticorpos são glicosilados em posições conser-vadas em suas regiões constantes (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immu-nol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). As cadeiaslaterais de oligossacarídeos das imunoglobulinas afetam a função das prote-ínas (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard,1990, Biochem. 29:4175-4180) e a interação intramolecular entre porções daglicoproteína, as quais podem afetar a conformação e a superfície tridimen-sional apresentada da glicoproteína (Hefferis and Lund, supra; Wyss andWagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Oligossacarídeos tambémpodem servir para ter por alvo uma dada glicoproteína para algumas molécu-las à base de estruturas de reconhecimento específico. Também foi reporta-do que a glicosilação de anticorpos afeta a citotoxicidade celular dependentede anticorpos (ADCC). Em particular, foi reportado que células CHO comexpressão de (3(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIll) regulada portetraciclina, uma glicosiltransferase catalisadora da formação de GlcNAcseccionante, têm atividade de ADCC aprimorada (Umana et al., 1999, Matu-re Biotech. 17:176-180).

A glicosilação de anticorpos é tipicamente ou N-ligada ou Co-ligada. N-ligada se refere à fixação da porção carboidrato à cadeia lateral deum resíduo asparagina. As seqüências tripeptídicas asparagina-X-serina easparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são asseqüências de reconhecimento para fixação enzimática da porção carboidra-to à cadeia lateral de asparagina. Deste modo, a presença de qualquer umadestas seqüências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosi-lação potencial. Glicosilação O-ligada se refere à fixação de um dos açúca-res N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, ain-da mais comumente serina ou treonina, embora também possam ser usadas5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é realizada con-venientemente alterando a seqüência de aminoácidos de tal modo que con-tém uma ou mais das seqüências tripeptídicas descritas acima (para sítiosde glicosilação N-lidados). A alteração também pode ser feita pela adiçãode, ou substituição por, um ou mais resíduos serina ou treonina à seqüênciado anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligados).

O padrão de glicosilação dos anticorpos também pode ser alte-rado sem alterar a seqüência de nucleotídeos subjacente. A glicosilação de-pende em grande parte da célula hospedeira usada para expressar o anti-corpo. Como o tipo de célula usada para expressão de glicoproteínas re-combinantes, por exemplo, anticorpos, como terapêuticos potenciais é rara-mente a célula nativa, podem ser esperadas variações no padrão de glicosi-lação dos anticorpos (veja, por exemplo, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem.272:9062-9070).

Além das escolhas de células hospedeiras, fatores que afetam aglicosilação durante produção recombinante de anticorpos incluem modo decrescimento, formulação de meio, densidade da cultura, oxigenação, pH,esquemas de purificação e semelhantes. Foram propostos vários métodospara alterar o padrão de glicosilação obtido em um organismo hospedeiroparticular inclusive introduzir ou superexpressar algumas enzimas envolvidasna produção de oligossacarídeos (Patentes dos Estados Unidos Nos.5.047.335; 5.510.261 e 5.278.299). Glicosilação, ou alguns tipos de glicosi-lação, podem ser removidos enzimaticamente da glicoproteína, por exemplousando endoglicosidase H (Endo H). Além disso, a célula hospedeira re-combinante pode ser produzida por engenharia geneticamente para ser de-feituosa no processamento de alguns tipos de polissacarídeos. Estas e téc-nicas similares são de conhecimento geral na técnica.

Outros métodos de modificação incluem usar técnicas de ligaçãoconhecidas na técnica, inclusive, mas não limitadas a, meios enzimáticos,substituição oxidativa e quelação. Pode ser usadas modificações, por exem-plo, para fixação de rótulos para imunoensaio. Polipeptídeos E3 modificadossão fabricados usando procedimentos estabelecidos na técnica e podem sertriados usando ensaios de de torina conhecidas na técnica, algumas dasquais são descritos abaixo e nos Exemplos.

Outras modificações de anticorpo incluem anticorpos que forammodificados conforme descrito na Publicação de Patente Internacional No.WO 99/58572, publicada em 18 de novembro de 1999. Estes anticorposcompreendem, além de um domínio de ligação dirigido na molécula alvo, umdomínio efetor tendo uma seqüência de aminoácidos substancialmente ho-móloga a todo ou parte de um domínio constante de uma cadeia pesada deimunoglobulina humana. Estes anticorpos têm a capacidade de ligar a molé-cuia alvo sem iniciar um processo de lise dependente do complemento signi-ficante, ou destruição do alvo mediada por células. Em algumas modalida-des, o domínio efetor tem a capacidade de ligar especificamente FcRn e/ouFcyRllb. Estes são tipicamente à base de domínios quiméricos derivados dedois ou mais domínios CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana.Anticorpos modificados desta maneira são particularmente adequados parauso em terapia crônica com anticorpos, para evitar reações adversas infla-matórias e diversas a terapia convencional com anticorpos.

A invenção também engloba proteínas de fusão compreendendoum ou mais fragmentos ou regiões dos anticorpos (tais como E3) ou polipep-tídeos desta invenção. Em uma modalidade, é proporcionado um polipeptí-deo de fusão que compreende no mínimo 10 aminoácidos contíguos da re-gião de cadeia leve variável mostrada na Figura 1B e/ou no mínimo 10 ami-noácidos da região de cadeia pesada variável mostrada na Figura 1A. Emoutra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende uma região variávelde cadeia leve e/ou uma região variável de cadeia pesada de E3, conformemostrado nas Figuras 1A e 1B. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fu-são compreende uma ou mais CDRs de E3. Em ainda outras modalidades, opolipeptídeo de fusão compreende CDR H3 e/ou CDR L3 do anticorpo E3.Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende qualquer um oumais de: resíduo aminoácido L29 de CDRH1, I50 de CDRH2, W101 de CD-RH3, e/ou A103 de CDRH3; e/ou resíduo aminoácido S28 de CDRL1, N32de CDRL1, T51 de CDRL2, 91E de CDRL3 e/ou H92 de CDRL3. Para osfins desta invenção, uma proteína de fusão E3 contém um ou mais anticor-pos E3 e outra seqüência de aminoácidos à qual não está fixada na molécu-la nativa, por exemplo, uma seqüência heteróloga ou uma seqüência homó-loga de outra região. Seqüências heterólogas típicas incluem, mas não estãolimitadas a uma "etiqueta" tal como uma etiqueta FLAG ou uma etiqueta6His. Etiquetas são de conhecimento geral na técnica.

Um polipeptídeo de fusão E3 pode ser criado por métodos co-nhecidos na técnica, por exemplo, sinteticamente ou recombinantemente.

Tipicamente, as proteínas de fusão E3 desta invenção são feitas preparandoe expressando um polinucleotídeo codificando as mesmas usando métodosrecombinantes descritos aqui, embora estas também possam ser prepara-das por outros meios conhecidos na técnica, inclusive, por exemplo, síntesequímica.

Esta invenção também proporciona composições compreenden-do anticorpos E3 ou polipeptídeos conjugados (por exemplo, ligados) a umagente que facilita ligação a um suporte sólido (tal como biotina ou avidina).Por simplicidade, será feita referência geralmente a E3 ou anticorpos com oentendimento de que estes métodos se aplicam a quaisquer das modalida-des de ligação de NGF descritas aqui. conjugação se refere a ligação destescomponentes conforme descrito aqui. A ligação (a qual é geralmente fixandoestes componentes em próxima associação no mínimo para administração)pode ser realizada em qualquer número de modos. Por exemplo, é possíveluma reação direta entre um agente e um anticorpo quando cada uma possuium substituinte capaz de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleo-fílico, tal como um grupo amina ou sulfidrila, por um lado pode ser capaz dereagir com um grupo contendo carbonila, tal como um anidrido ou um haletoácido, ou com um grupo alquila contendo um bom grupo de partida (por e-xemplo, um haleto) pelo outro.

Um anticorpo ou polipeptídeo desta invenção pode ser ligado aum agente de marcação (alternativamente denominado "rótulo") tal comouma molécula fluorescente, uma molécula radioativa ou quaisquer outrasetiquetas conhecidas na técnica. São conhecidas na técnica etiquetas asquais geralmente proporcionam (quer diretamente ou indiretamente) um si-nal. Por conseguinte, a invenção inclui polipeptídeos e anticorpos rotulados.

A capacidade dos anticorpos e polipeptídeos desta invenção,tais como ligação de NGF; redução ou inibição de uma atividade biológica doNGF; redução e/ou bloqueio de sobrevida de neurônios trigeminais E13.5 decamundongo, induzida por NGF, pode ser testada usando métodos conheci-dos na técnica, alguns dos quais são descritos nos Exemplos.

A invenção também proporciona composições (inclusive compo-sições farmacêuticas) e kits compreendendo o anticorpo E3, e, conformeesta descoberta torna claro, qualquer um ou todos os anticorpos e/ou poli-peptídeos descritos aqui.Polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras

A invenção também proporciona polinucleotídeos isolados codi-ficando os anticorpos e polipeptídeos da invenção (inclusive um anticorpocompreendendo as seqüências de polipeptídeo da cadeia leve e regiões va-riáveis de cadeia pesada mostrada nas Figuras 1A e 1B), e vectores e célu-las hospedeiras compreendendo o polinucleotídeo.

Por conseguinte, a invenção proporciona polinucleotídeos (oucomposições, inclusive composições farmacêuticas), compreendendo poli-nucleotídeos codificando quaisquer dos seguintes: (a) anticorpo E3; (b) umfragmento ou uma região do anticorpo E3; (c) uma cadeia leve do anticorpoE3 conforme mostrado nas Figuras 1B; (d) uma cadeia pesada do anticorpoE3 conforme mostrado nas Figuras 1A; (e) uma ou mais regiões variáveis deuma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo E3; (f) uma ou maisCDRs (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) do anticorpo E3 mos-trada nas Figuras 1A e 1B; (g) CDR H3 da cadeia pesada do anticorpo E3mostrada na figura 1A; (h) CDR L3 da cadeia leve do anticorpo E3 mostradana Figura 1B; (i) três CDRs da cadeia leve do anticorpo E3 mostrada na Fi-gura 1B; (j) três CDRs da cadeia pesada do anticorpo E3 mostrada na Figura1A; (k) três CDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada, do anticor-po E3 mostrado nas Figuras 1A e 1B; ou (I) um anticorpo compreendendoqualquer de (b) a (k). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compre-ende qualquer um ou ambos dos polinucleotídeos mostrados nas Figuras 2 e 3.

Em outro aspecto, a invenção é um polinucleotídeo isolado quecodifica para uma cadeia leve de E3 com um número de depósito de ATCCNo. PTA-4893 ou ATCC No. PTA-4894. Em outro aspecto, a invenção é umpolinucleotídeo isolado que codifica para uma cadeia pesada de E3 com umnúmero de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em ainda outro aspecto, a in-venção é um polinucleotídeo isolado compreendendo (a) uma região variávelcodificada no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No.PTA-4894 e (b) uma região variável codificada no polinucleotídeo com umnúmero de depósito de ATCC No. PTA-4895. Em outro aspecto, a invençãoé um polinucleotídeo isolado compreendendo (a) uma ou mais CDRs codifi-cadas no polinucleotídeo com um número de depósito de ATCC No. PTA-4894; e/ou (b) uma ou mais CDRs codificadas no polinucleotídeo com umnúmero de depósito de ATCC No. PTA-4895.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polinucleotídeos codi-ficando quaisquer dos anticorpos (inclusive fragmentos de anticorpos) e poli-peptídeos descritos aqui. Polinucleotídeos podem ser preparados por proce-dimentos conhecidos na técnica

Em outro aspecto, a invenção proporciona composições (taiscomo algumas composições farmacêuticas) compreendendo quaisquer dospolinucleotídeos da invenção. Em algumas modalidades, a composiçãocompreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo co-dificando o anticorpo E3 conforme descrito aqui. Em outra modalidade, acomposição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinu-cleotídeo codificando quaisquer dos anticorpos ou polipeptídeos descritosaqui. Em ainda outras modalidades, a composição compreende qualquer umou ambos os polinucleotídeos mostrados nas Figuras 2 e 3. Vetores de ex-pressão, e a administração de composições de polinucleotídeos são adicio-nalmente descritas aqui.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para pre-parar quaisquer dos polinucleotídeos descritos aqui.

Polinucleotídeos complementares a qualquer uma de semelhan-tes seqüências também são englobados pela presente invenção. Polinucleo-tídeos pode ser de filamento único (codificante ou anti-sentido) ou de fila-mento duplo, e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético)ou de RNA. Moléculas de RNA incluem moléculas HnRNA, as quais contêmíntrons e correspondem a uma molécula de DNA em uma maneira um-a-um,e moléculas de mRNA, as quais não contêm íntrons. Seqüências adicionaiscodificantes ou não codificantes podem, mas não precisam, estar presentesdentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeopode, mas não precisa, ser ligado a outras moléculas e/ou materiais de su-porte.Polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa (is-to é, uma seqüência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção domesmo) ou podem compreender uma variante de uma seqüência semelhan-te. Variantes de polinucleotídeos contêm uma ou mais substituições, adi-ções, eliminações e/ou inserções de tal modo que a imunorreatividade dopolipeptídeo codificado não é diminuída, em relação a uma molécula imunor-reativa nativa. O efeito sobre a imunorreatividade do polipeptídeo codificadogeralmente pode ser avaliada conforme descrito aqui. Variantes preferenci-almente apresentam no mínimo cerca de 70% de identidade, mais preferen-cialmente no mínimo cerca de 80% de identidade e ainda mais preferencial-mente no mínimo cerca de 90% de identidade com uma seqüência de poli-nucleotídeo que codifica um anticorpo nativo ou uma porção dos mesmos.

Diz-se que duas seqüências de polinucleotídeo ou polipeptídeosão "idênticas" se a seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duasseqüências for a mesma quando alinhadas para máxima correspondênciaconforme descrito abaixo. As comparações entre duas seqüências são reali-zadas tipicamente comparando as seqüências sobre uma janela de compa-ração para identificar e comparar regiões locais de similaridade de seqüên-cia. Uma "janela de comparação" conforme usado aqui, se refere a um seg-mento de no mínimo cerca de 20 posições contíguas, geralmente 30 até cer-ca de 75, 40 até cerca de 50, nas quais uma seqüência pode ser comparadacom uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguasdepois das duas seqüências serem alinhadas otimamente.

O alinhamento ótimo das seqüências para comparação pode serconduzido usando o programa Megalign na suite do software de bioinformá-tica Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), usando parâmetros default.Este programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritos nas se-guintes referências: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change inproteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical ResearchFoundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in En-zymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. andSharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988,CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N.,Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R.,1973, Numerical Taxonomy the Principies and Practice of Numerical Taxon-omy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J.,1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:726-730.

Preferencialmente, a "percentagem de identidade de seqüência"é determinada comparando duas seqüências otimamente alinhadas sobreuma janela de comparação de no mínimo 20 posições, em que a porção daseqüência de polipeptídeo ou polinucleotídeo na janela de comparação podecompreender adições ou eliminações (isto é gaps) de 20 por cento ou me-nos, geralmente 5 a 15 por cento, ou 10 a 12 por cento, comparadas com asseqüências de referência (as quais não compreendem adições ou elimina-ções) para ótimo alinhamento das duas seqüências. A percentagem é calcu-lada determinando o número de posições nas quais as bases de ácido nu-cléico idênticas ou resíduo aminoácido ocorre em ambas as seqüências paraproduzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posiçõescombinadas pelo número total de posições na seqüência de referência (istoé o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para produzir apercentagem de identidade de seqüência.

Variantes também, ou alternativamente, podem ser substancial-mente homólogas a um gene nativo, ou uma porção ou complemento domesmo. As variantes de polinucleotídeos referidas têm a capacidade de hi-bridizar sob condições moderadamente estringentes a uma seqüência deDNA que ocorre naturalmente codificando um anticorpo nativo (ou uma se-qüência complementar).

"Condições moderadamente estringentes" adequadas incluempré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, 0,5% de SDS, 1,0 mM de EDTA(pH 8.0); hibridização a 50°C a 65°C, 5 X SSC, de um dia para o outro; se-guida por lavagem duas vezes a 65°C por 20 minutos com cada de 2X, 0,5Xe 0,2X SSC contendo 0, 1 % de SDS.Conforme usado aqui, "condições altamente estringentes" ou"condições de alta estringência" são aquelas que: (1) empregam baixa forçaiônica e alta temperature para lavagem , por exemplo, 0,015 M de cloreto desódio / 0,0015 M de citrato de sódio / 0,1% de dodecila sulfato de sódio a50°C; (2) empregam durante hibridização um agente desnaturante, tal comoformamida, por exemplo, 50% (em v/v) de formamida com 0,1% de albuminasérica bovina / 0,1% de Ficoll / 0,1% de polivinilpirrolidona / 50 mM de tam-pão de fosfato de sódio a pH 6.5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM decitrato de sódio a 42°C; ou (3) empegam 50% de formamida, 5 x SSC (0,75M de NaCI, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6.8),0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma desalmão sonicado (50 ug/ml), 0,1% de SDS, e 10% de sulfato de dextrano a42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio / citrato de só-dio) e 50% de formamida a 55°C, seguida por uma lavagem de alta estrin-gência consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55°C. O técnico versadoreconhecerá como ajustar a temperatura, força iônica, e etc. conforme ne-cessário para conciliar fatores tais como extensão a sonda e semelhantes.

Será reconhecido por aqueles versados na ténica que, em con-seqüência da degeneração do código genético, existem muitas seqüênciasde nucleotídeos que codificam um polipeptídeo conforme descrito aqui. Al-guns destes polinucleotídeos suportam homologia mínima com a seqüênciade nucleotídeos d qualquer gene nativo. Não obstante, polinucleotídeos quevariam devido a diferenças no uso de códons são especificamente contem-plados pela presente invenção. Além disso, alelos dos genes compreenden-do as seqüências de polinucleotídeos proporcionadas aqui, estão dentro doâmbito da presente invenção. Alelos são genes endógenos que são altera-dos em conseqüência de uma ou mais mutações, tais como eliminações,adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e a proteína resultan-tes podem, mas não precisam, ter uma estrutura ou função alterada. Podemser identificados alelos usando técnicas de rotina (tais como hibridização,amplificação e/ou comparação de seqüência com o banco de dados).

Os polinucleotídeos desta invenção podem ser obtidos usandosíntese química, métodos recombinantes, ou PCR. Métodos para síntesequímica de polinucleotídeo são de conhecimento geral na técnica e não pre-cisam ser descritos em detalhes aqui. Uma pessoa evrsada na técnica podeusar as seqüências proporcionadas aqui, e um sintetizador de DNA comerci-al para producir uma seqüência de DNA desejada.

Para preparar polinucleotídeos usando métodos recombinantes,um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência desejada pode ser inse-rido em um vetor adequdo, e o vetor por sua vez pode ser introduzido emuma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, conformeadicionalmente discutido aqui. Polinucleotídeos podem ser inseridos em cé-lulas hospedeiras por qualquer meio conhecido na técnica. As células sãotransformadas introduzindo um polinucleotídeo exógeno por captação direta,endocitose, transfecção, "F-mating" ou eletroporação. Uma vez introduzido,o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetornão integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado no genoma da célulahospedeira. O polinucleotídeo amplificado deste modo pode ser isolado dacélula hospedeira por métodos de conhecimento geral dentro da técnica.Veja, por exemplo, Sambrook et al. (1989).

Alternativamente, PCR permite a reprodução de seqüências deDNA. A tecnologia de PCR é de conhecimento geral na técnica e é descritanas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al.eds., Birkauswer Press, Boston (1994).

RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apro-priado e inserindo o mesmo em uma célula hospedeira adequada. Quando acélula se duplica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode ser então isola-do usando métodos de conhecimento geral daqueles versados na técnica,conforme determinado em Sambrook et al., (1989), por exemplo.

Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de a-cordo com técnicas de rotina, ou podem ser selecionados entre um grandenúmero de vetores de clonagem disponível na técnica. Enquanto o vetor declonagem selecionado pode variar de acordo com a célula hospedeira quese pretende usar, vetores de clonagem úteis geralmente terão a capacidadepara auto-duplicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease derestrição em particular, e/ou podem carregar genes para um marcador quepode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. Exemplos adequa-dos incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19,Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322,pMB9, ColE1, pCR1, RP4, fagos de DNAs, e vetores de vai-vém tais comopSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveisem vendedores comerciais tais como BioRad, Strategene, e Invitrogen.

Vetores de expressão geralmente são constructos de polinucleo-tídeo replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção.Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas célulashospedeiras ou como epissomas ou como uma parte integral do DNA cro-mossômico. Vetores de expressão adequados incluem mas não estão limi-tados a plasmídeos, vetores virais, inclusive adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus, cosmídeos, e um ou mais vetores de expressão des-critos em na Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 87/04462. Oscomponentes vetoriais geralmente podem incluir, mas não estão limitados a,um ou mais dos seguintes: uma seqüência de sinal; uma origem de replica-ção; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcripcionaladequados (tais como promotores, intensificadores e terminador). Para ex-pressão (isto é, translação), também são geralmente requeridos um ou maiselementos de controle transcripcional, tais como sítios de ligação de ribos-soma, sítios de iniciação de translação, e códons de parada.

Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse podem serintroduzidos na célula hospedeira por qualquer um de uma série de meiosapropriados, inclusive eletroporação, transfecção empregando cloreto decálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras subs-tâncias; bombardeamento de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por e-xemplo, onde o vector é um agente infeccioso tal como o vírus da vaccinia).A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos freqüentemente depen-derá das características da célula hospedeira.A invenção também proporciona células hospedeiras compreen-dendo quaisquer dos polinucleotídeos descritos aqui. Quaisquer célulashospedeiras capazes de superexpressar DNAs heterólogos podem ser usa-das para a finalidade de isolar os genes codificando o anticorpo, polipeptídeoou proteína de interesse, exemplos não-limitantes de células hospedeiras demamíferos incluem, mas não estão limitados a células COS, HeLa, e CHO.Veja também a Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 87/04462.Células hospedeiras não-mamíferas adequadas incluem procariotas (taiscomo E. coli ou B. subtillis) e levedura (tal como S. cerevisae, S. pombe; ouK. lactis). Preferencialmente, as células hospedeiras expressam os cDNAsem um nível de cerca de 5 vezes maior, mais preferencialmente 10 vezesmaior, ainda mais preferencialmente 20 vezes maior do que o do anticorpoendógeno correspondente ou proteína de interesse, caso presente, nas célu-las hospedeiras. A triagem das células hospedeiras para uma ligação espe-cífica a NGF é realizada por um imunoensaio ou FACS. Pode ser identifica-da uma célula superexpressando o anticorpo ou proteína de interesse.

Métodos usando E3 e anticorpos derivados de E3

Anticorpo E3 o qual liga NGF pode ser usado para identificar oudetectar a presença ou ausência de NGF. Por simplicidade, será feita refe-rência de modo geral a E3 ou anticorpos com o entendimento de que estesmétodos se aplicam a quaisquer das modalidades de ligação de NGF (taiscomo polipeptídeos) descritas aqui. Detecção geralmente envolve contactaruma amostra biológica com um anticorpo descrito aqui, que liga a NGF e aformação de um complexo entre NGF e um anticorpo (por exemplo, E3) oqual liga especificamente a NGF. A formação de um complexo semelhantepode ser in vitro ou in vivo. O termo "detecção" conforme usado aqui, incluidetecção qualitativa e/ou quantitativa (níveis de medição) com ou sem refe-rência a um controle.

Pode ser usado para detecção qualquer um de uma variedadede métodos conhecidos, inclusive, mas não limitados a , imunoensaio, usan-do anticorpo que ligam o polipeptídeo, por exemplo, por ensaio imunossor-vente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e semelhantes; eensaio funcional para o polipeptídeo codificado, por exemplo, atividade deligação ou ensaio enzimático. Em algumas modalidades, o anticorpo é rotu-lado de modo detectável.

Usos Diagnósticos do E3 e Derivados

Anticorpos e polipeptídeos da invenção podem ser usados nadetecção, diagnóstico e monitoração de uma doença, condição, ou distúrbioassociado a expressão de NGF alterada ou aberrante (em algumas modali-dades, aumento ou redução da expressão de NGF (em relação a uma amos-tra normal), e/ou expressão inadequada, tal como presença de expressãoem um ou mais tecidos e/ou uma ou mais células que normalmente carecemde expressão de NGF, ou ausência de expressão de NGF em um ou maistecidos ou uma ou mais células que normalmente possuem expressão deNGF). Os anticorpos e polipeptídeos da invenção são adicionalmente úteispara detecção de expressão de NGF, por exemplo, em uma doença associ-ada a sensibilidade ou responsividade ao NGF alterada ou aberrante. Emalgumas modalidades, a expressão de NGF é detectada em uma amostra deum indivíduo suspeito de ter uma doença, distúrbio caracterizando ou asso-ciado a uma sensibilidade ou responsividade a expressão de NGF alteradaou aberrante expression (por exemplo, um câncer no qual NGF estimulacrescimento e/ou metástase).

Portanto, em algumas modalidades, a invenção proporciona mé-todos compreendendo contactar um espécime (amostra) de um indivíduosuspeito de ter expressão de NGF alterada ou aberrante com um anticorpoou polipeptídeo da invenção e determinar se o nível de NGF difere do nívelde um espécime de controle ou de comparação. Em algumas modalidades,o indivíduo tem uma arritmia cardíaca, doença de Alzheimer, e/ou disfunçãoautônoma.

Em outras modalidades, a invenção proporciona métodos com-preendendo contactar um espécime (amostra) de um indivíduo e determinaro nível de expressão de NGF. Em algumas modalidades, o indivíduo é sus-peito de ter uma doença, distúrbio caracterizado ou associado a uma sensi-bilidade ou responsividade a expressão de NGF alterada ou aberrante. Emalgumas modalidades, o indivíduo tem câncer pulmonar de células peque-nas, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma deovário, carcinoma hepatocelular, ou melanoma.

Para aplicações de diagnóstico, o anticorpo tipicamente serárotulado com uma porção detectável inclusive mas não limitada a radioisóto-pos, etiquetas fluorescentes, e várias etiquetas de substratos enzimáticos.Métodos para conjugar etiquetas a um anticorpo são conhecidos na técnica.

Em outras modalidades da invenção, anticorpos da invenção não precisamser rotulados, e a presença dos mesmos pode ser detectada usando um an-ticorpo rotulado o qual liga aos anticorpos da invenção.

Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados emqualquer método de ensaio conhecido, os ensaios de ligação competitivareferidos, ensaios de sanduíche direto e indireto, e ensaios de imunoprecipi-tação. Zola, Monoclonal Antibodyes: A Manual of Techniques, pp.147-158(CRC Press, Inc. 1987).

Os anticorpos também podem ser usados para ensaios de diag-nóstico in vivo, tais como estudo por imagens in vivo. De modo geral, o anti-corpo é rotulado com um radionuclideo (tal como 111 In, 99Tc, 14C, 1311,1251, ou 3H) de modo que as células ou tecido de interesse podem ser loca-lizadas usando imunoscintiografia.

O anticorpo também pode ser usado como reagente de tinturaem patologia, seguindo técnicas de conhecimento geral na técnica.

Métodos para usar E3 e derivados para fins terapêuticos

O anticorpo E3 é útila para reduzir e/ou bloquear a biológica ati-vidade do NGF. Acredita-se que esta atividade antagonista seja útila no tra-tamento de condições patológicas associadas com produção endógena deNGF, tais como dor. Geralmente, nestas modalidades uma quantidade eficazé administrada a um indivíduo. Por conseguinte, em um aspecto, a invençãoproporciona um método para antagonizar a atividade biológica de NGF hu-mano usando quaisquer dos polipeptídeos (inclusive anticorpos tais comoanticorpo E3) descritos aqui. Em uma modalidade, o método compreendecontactar o fator de crescimento nervoso humano com quaisquer dos poli-peptídeos (inclusive anticorpo E3) descritos aqui, por meio do quê a ativida-de do fator de crescimento nervoso humano é antagonizada, reduzida, blo-queada, ou suprimida. Em ainda outra modalidade, a um indivíduo com dor(tal como dor pós-cirúrgica, ou dor da artrite reumatóide) é administrado tra-tamento com E3.

Por simplicidade, será feita referência de modo geral a E3 ouanticorpo com o entendimento de que estes métodos se aplicam a quaisquerdos polipeptídeos e anticorpos variantes E3 descritos aqui.

Podem ser usadas para administração várias formulações de E3ou fragmentos de E3 (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, e etc), taiscomo de cadeia única (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusãocompreendendo uma porção anticorpo, e qualquer outra configuração modi-ficada de E3 que compreende um sítio de reconhecimento antigênico deNGF da especificidade requerida. Em algumas modalidades, anticorpos E3ou várias formulações de E3 dos mesmos podem ser administrados puros.Em outras modalidades, E3 ou várias formulações de E3 (inclusive qualquermodalidade de composição descrita aqui) dos mesmos e um excipiente far-maceuticamente aceitável são administrados, e podem estar em várias for-mulações. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na téc-nica, e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administraçãode uma substância farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipientepode dar forma ou consistência, ou agem como um diluente. Excipientesadequados incluem mas não estão limitados a agentes estabilizantes, agen-tes umectantes e emulsificantes, sais para variar a osmolaridade, agentes deencapsulação, tampões, e intensificadores de penetração na pele. Excipien-tes bem como formulações para liberação de fármacos parenterais e nãoparenterais são determinadas em Remington, The Science and Practice ofPharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

Em algumas modalidades, estes agentes são formuladas paraadministração por injeção (por exemplo, por via intraperitoneal, por via intra-venosa, por via subcutânea, por via intramuscular, e etc), embora outrasformas de administração (por exemplo, oral, via mucosa, através de inala-ção, por via sublingual, e etc) também possam ser usadas. Por conseguinte,anticorpo E3 e equivalentes dos mesmos são preferencialmente combinadoscom veículos farmaceuticamente aceitável tais como salina, solução de Rin-ger, solução de dextrose, e semelhantes. O regime de dosagem em particu-lar, isto é, dose, momento e repetição, dependerá do indivíduo em particulare do histórico médico do indivíduo. De modo geral, pode ser usada qualqueruma das doses seguintes: uma dose de no mínimo cerca de 50 mg/kg depeso corporal; no mínimo cerca de 10 mg/kg de peso corporal; no mínimocerca de 3 mg/kg de peso corporal; no mínimo cerca de 1 mg/kg de pesocorporal; no mínimo cerca de 750 ug/kg de peso corporal; no mínimo cercade 500 ug/kg de peso corporal; no mínimo cerca de 250 ug/kg de peso cor-poral; no mínimo cerca de 100 ug /kg de peso corporal; no mínimo cerca de50 ug /kg de peso corporal; no mínimo cerca de 10 ug /kg de peso corporal;no mínimo cerca de 1 ug/kg de peso corporal, ou menos, é administrado.

Para administrações repetidas durante vários dias ou mais tempo, depen-dendo da condição, o tratamento é sustentado até ocorrer uma supressãodesejada dos sintomas da doença. Um regime de dosagem típico compre-ende administrar uma dose inicial de cerca de 2 mg/kg, seguida por umadose de manutenção semanal de cerca de 1 mg/kg do anticorpo anti-NGF,or seguida por uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg a cada duassemanas. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis, depen-dendo do padrão de decomposição farmacocinética que o médico pretendeobter. Considerações empíricas, tais como a meia-vida, geralmente contribu-irão para a determinação da dosagem. O progresso desta terapia é facilmen-te monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

Em alguns indivíduos, pode ser requerida mais de uma dose. Afreqüência de administração pode ser determinada e ajustada durante o cur-so da terapia. Por exemplo, a freqüência de administração pode ser determi-nada e ajustada com base no tipo e gravidade da dor a ser tratada, se o a-gente for administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia prévia,o histórico clínico do paciente e a resposta ao agente, e a critério do médicoassistente. Tipicamente o médico administrará um anticorpo antagonista an-ti-NGF (tal como E3), até ser atingida uma dosagem que obtém o resultadodesejado. Em alguns casos, podem ser apropriadas formulações de liberçãocontínua sustentada de anticorpos E3. Várias formulações e dispositivos pa-ra obter liberção sustentada são conhecidas na técnica.

Em uma modalidade, as dosagens para anticorpos E3 (ou poli-peptídeos) podem ser determinadas empiricamente em indivíduos aos quaisforam administradas uma ou mais administrações. Aos indivíduos são admi-nistradas dosagens incrementais de E3. Para avaliar a eficácia de E3 ou ou-tro anticorpo equivalente, podem ser monitorados marcadores dos sintomasde doença (tais como dor)!

A administração de um anticorpo (tal como E3) ou polipeptídeode acordo com o método na presente invenção pode ser contínua ou intermi-tente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se afinalidade da administração for terapêutica ou profilática, e outros fatores deconhecimento dos clínicos versados. A administração de um anticorpo podeser essencialmente contínua durante um período de tempo pré-selecionadoou pode ser em uma série de dose espaçadas, por exemplo, ou antes, du-rante, ou depois do desenvolvimento de dor, antes, durante, antes e depois,durante e depois, ou antes, durante, e depois do desenvolvimento de dor. Aadministração pode ser antes, durante e/ou depois de ferimento, incisão,trauma, cirurgia, e qualquer outro evento provável de dar origem a dor pós-cirúrgica.

Outras formulações incluem formas de liberação adequada co-nhecidas na técnica inclusive, mas não limitadas a, veículos tais como lipos-somas. Veja, por exemplo, Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859.

Preparações lipossômicas incluem, mas não estão limitadas a, citofectinas,vesículas multilamelares e vesículas unilamelares.

Em algumas modalidades, mais de um anticorpo ou polipeptídeopode estar presente. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais.

As composições referidas podem conter no mínimo um, no mínimo dois, nomínimo três, no mínimo quatro, no mínimo cinco diferentes anticorpos. Umamistura de anticorpos, conforme eles são freqüentemente denotados na téc-nica, pode ser particularmente útila no tratamento de uma gama mais amplade população de indivíduos.

Um polinucleotídeo codificando quaisquer dos anticorpos ou po-lipeptídeos da invenção (tais como anticorpo E3) também pode ser usadopara liberação e expressão de quaisquer dos anticorpos ou polipeptídeos dainvenção (tais como anticorpo E3) em uma célula desejada. É evidente queum vetor de expressão pode ser usado para orientar a expressão de um an-ticorpo ou polipeptídeo E3. O vetor de expressão pode ser administrado porquaisquer meios conhecidos na técnica, tais como por via intraperitoneal, porvia intravenosa, por via intramuscular, por via subcutânea, por via intratecal,por via intraventricular, por via oral, por via enteral, por via parenteral, por viaintranasal, por via dérmica, por via sublingual, ou por inalação. Por exemplo,a administração de vetores de expressão inclui administração local ou sistê-mica, inclusive injeção, administração oral, pistola de partículas ou adminis-tração cateterizada, e administração tópica. Uma pessoa versada na técnicaestá familiarizada com administração de vetores de expressão para obterexpressão de uma proteína exógena in vivo. Veja, por exemplo, as Patentesdos Estados Unidos Nos. 6.436.908; 6.413.942; e 6.376.471.

Também pode ser usada a liberação orientada de composiçõesterapêuticas compreendendo um polinucleotídeo codificando quaisquer dosanticorpos ou polipeptídeos da invenção (tais como anticorpo E3). Técnicasde liberação de DNA mediada por receptores são descritas, por exemplo, emFindeis et al., Trenós Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Thera-peutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.)(1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem.(1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1990) 87:3655;Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Composições terapêuticas conten-do um polinucleotídeo são administradas dentro de um alcance de cerca de100 ng até cerca de 200 mg de DNA para administração local em um proto-colo de terapia genética. Faixas de concentração de cerca de 500 ng atécerca de 50 mg, cerca de 1 ug até cerca de 2 mg, cerca de 5 ug até cerca de500 ug, e cerca de 20 ug até cerca de 100 ug of DNA também podem serusadas durante um protocolo de terapia genética. Os polinucleotídeos tera-pêuticos e polipeptídeos da presente invenção podem ser liberados usandoveículos de liberação genética. O veículo de liberação genética pode ser deorigem viral ou não viral (vejak, de modo geral, Jolly, Câncer Gene Therapy(1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, HumanGene Therapy (1995) 1:185; e Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). A ex-pressão de semelhantes seqüências codificantes pode ser induzida usandopromotores endógenos mamíferos ou heterólogos. A expressão da seqüên-cia codificante pode ser ou constitutiva ou regulada.

Vetores à base de vírus para liberação de um polinucleotídeodesejado e expressão em uma célula desejada são de conhecimento geralna técnica. Veículos à base de virus típicos incluem, mas não estão limitadosa, retrovírus recombinantes (veja, por exemplo, as Publicações de PatentesInternacionais Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; as Patentes dos Es-tados Unidos Nos. 5. 219.740; 4.777.127; a Patente da Reino Unido No.2.200.651; e a Patente Européia EP No. 0 345 242), vetores à base de alfa-vírus (por exemplo, vetores de Sindbis vírus, Semliki forest vírus (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), Ross River vírus (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) evírus da encefalite eqüina venezuelana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250;ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), e vetores de vírus adeno-associados (A-AV) (veja, por exemplo, as Publicações de Patentes Internacionais Nos. WO94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO95/00655). Também pode ser empregada a administração de DNA ligado aadenovírus morto conforme descrito em Curiel, Hum. Gene Ther. (1992)3:147.

Também podem ser empregados veículos e métodos de libera-ção não viral, inclusive, mas não limitados a, DNA condensado policatiônicoligado ou não-ligado a adenovírus mortos sozinhos (veja, por exemplo, Curi-el, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); DNA ligado a ligante (veja, por exemplo,Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); células de veículos de liberação decélulas eucarióticas (veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No.5.814.482; as Publicações de Patente Internacional PCT Nos. WO 95/07994;WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutralização de carga nu-cléica ou fusão com membranas celulares. Também pode ser empregadoDNA nu. Métodos de introdução de DNA nu típicos são descritos na Publica-ção de Patente Internacional PCT No. WO 90/11092 e na Patente dos Esta-dos Unidos No. 5.580.859. Lipossomas que podem agir como veículos deliberação genética são descritos na Patente dos Estados Unidos No.5.422.120; nas Publicações de Patente Internacional PCT Nos. WO95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e na Patente Européia EP NO. 0524 968. Abordagens adicionais são descritas em Philip, Mol. Cell Biol.(1994) 14:2411 e em Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91:1581.

Com respeito a todos os métodos descritos aqui, referência aanticorpos antagonistas anti-NGF também incluem composições compreen-dendo um ou mais destes agentes. Estas composições podem compreenderadicionalmente excipientes adequados, tais como excipientes farmaceutica-mente aceitáveis inclusive tampões, os quais são de conhecimento geral natécnica. A presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinaçãocom outros métodos de tratamento convencionais.

MÉTODOS PARA USAR ANTICORPO ANTAGONISTA ANTI-NGF PARATRATAR OU PREVENIR DOR DA ARTRITE REUMATÓIDE

Em alguns aspectos, a invenção proporciona métodos para tra-tar e/ou prevenir a dor da artrite reumatóide em indivíduos inclusive memífe-ros, tanto humanos quanto não humanos. Por conseguinte, em um aspecto,a invenção proporciona métodos para tratar a dor da artrite reumatóide emum indivíduo compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anti-corpo antagonista anti-NGF. Anticorpos antagonistas anti-NGF são conheci-dos na técnica e descritos aqui.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para reduzira incidência de, melhorar, suprimir, aliviar, e/ou retardar o início, o desenvol-vimento ou a progressão da dor da artrite reumatóide em um indivíduo. Por-tanto, em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF é admi-nistrado antes do desenvolvimento de dor ou um episódio de dor em um in-divíduo tendo artrite reumatóide.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para tratarcaquexia inflamatória (perda de peso) associada a artrite reumatóide em umindivíduo compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anticor-po antagonista anti-NGF (Roubenoff et al., Arthritis Rheum. 40(3): 534-9(1997); Roubenoff etal., J. Clin. Invest. 93(6):2379-86 (1994)).

O diagnóstico ou avaliação da dor da artrite reumatóide estábem estabelecido na técnica. A avaliação pode ser realizada com base emmedidas conhecidos na técnica, tais como caracterização da dor no pacienteusando várias escalas de dor. Veja, por exemplo, Katz et al, Surg Clin NorthAm. (1999) 79 (2):231-52; Caraceni et al. J Pain Symptom Manage (2002)23(3):239-55. Também há escalas comumente usadas para medir o estadode doença tais como a escala do Colégio Americano de Reumatologia (ACR,American College of Rheumatology) (Felson, et al., Arthritis and Rheumatism(1993) 3(6):729-740), o Questionário de Avaliação de Saúde (HAQ, HealthAssessment Questionnaire) (Fries, et al., (1982) J. Rheumatol. 9: 789-793), aEscala de Paulus (Paulus, et al., Arthritis and Rheumatism (1990) 33: 477-484), e a Escala da Medida do Impacto da Artrite (AIMS, Arthritis Impact Me-asure Scale) (Meenam, et al., Arthritis and Rheumatology (1982) 25: 1048-1053). Anticorpo antagonista anti-NGF pode ser administrado a um indivíduoatravés de qualquer via adequada. Exemplos de diferentes vias de adminis-tração são descritas aqui.

O alívio da dor pode ser caracterizado pelo curso de tempo doalívio. Por conseguinte, em algumas modalidades, o alívio da dor é observa-do dentro de cerca de 24 horas depois da administração de anticorpo anta-gonista anti-NGF. Em outras modalidades, o alívio da dor é observado den-tro de cerca de 36, 48, 60, 72 horas ou 4 dias depois da administração deanticorpo antagonista anti-NGF. Em ainda outras modalidades, o alívio dador é observado antes de observar uma indicação de melhora da condiçãoinflamatória associada a artrite reumatóide. Em algumas modalidades, a fre-qüência e/ou a intensidade da dor é diminuída, e/ou a qualidade de vida dosque estão sofrendo da doença é aumentada.Preparo e uso de antagonistas de NGF (inclusive anticorpos an-ti-NGF) para estes métodos são descritos nas seções abaixo ("antagonistasde NGF ", "Anticorpo antagonista anti-NGF"; "Outros antagonistas de NGF";"Identificação de antagonistas de NGF (tais como anticorpos antagonistasanti-NGF)"; "Composições para uso nos métodos da invenção"; "Administra-ção de um antagonista de NGF (tal como um anticorpo antagonista anti-NGF)").

MÉTODOS PARA USAR ANTICORPO ANTAGONISTA ANTI-NGF PARATRATAR OU PREVENIR DOR DE OSTEOARTRITE

Em alguns aspectos, a invenção proporciona métodos para tra-tar e/ou prevenir a dor de osteoartrite em indivíduos inclusive memíferos,tanto humanos quanto não humanos. Por conseguinte, em um aspecto, ainvenção proporciona métodos para tratar a dor de osteoartrite em um indi-víduo compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um antagonistade NGF (tal como um anticorpo antagonista anti-NGF). Antagonistas deNGF, inclusive anticorpos antagonistas anti-NGF, são conhecidos na técnicae descritos aqui.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para reduzira incidência de, melhorar, suprimir, aliviar, e/ou retardar o início, o desenvol-vimento ou a progressão da dor de osteoartrite em um indivíduo compreen-dendo administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de NGF (talcomo um anticorpo antagonista anti-NGF). Portanto, em algumas modalida-des, o antagonista de NGF (tal como anticorpo antagonista anti-NGF) é ad-ministrado antes do desenvolvimento de dor ou um episódio de dor em umindivíduo tendo osteoartrite.

O diagnóstico ou avaliação da dor de osteoartrite está bem esta-belecido na técnica. A avaliação pode ser realizada com base em medidasconhecidas na técnica, tais como caracterização da dor do paciente usandovárias escalas de dor. Veja, por exemplo, Katz et al, Surg Clin North Am.(1999) 79 (2):231-52; Caraceni et al. J Pain Symptom Manage (2002)23(3):239-55. Por exemplo, pode ser empregada a WOMAC Ambulation Pa-in Scale (inclusive for, rigidez, e função física) e 100 mm Visual AnalogueScale (VAS) para avaliar a dor e avaliar a resposta ao tratamento.

Antagonistas de NGF (tais como um anticorpo antagonista anti-NGF) podem ser administrados a um indivíduo através de qualquer via ade-quada. Exemplos de diferentes via de administração são descritos aqui.

Em algumas modalidades, o antagonista de NGF (tal como oanticorpo antagonista anti-NGF) é administrado uma vez a cada semana,uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez acada quatro semanas, uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seissemanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas,uma vez a cada nove semanas, uma vez a cada dez semanas, uma vez acada quinze semanas, uma vez a cada vinte semanas, uma vez a cada vintee cinco semanas, ou uma vez a cada vinte e seis semanas. Em algumasmodalidades, o antagonista de NGF (tal como o anticorpo antagonista anti-NGF) é administrado uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, umavez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cincomeses, ou uma vez a cada seis meses.

O alívio da dor pode ser caracterizado pelo curso de tempo doalívio. Por conseguinte, em algumas modalidades, o alívio da dor é observa-do dentro de cerca de 24 horas depois da administração de uma antagonistade NGF (tal como um anticorpo antagonista anti-NGF). Em outras modalida-des, o alívio da dor é observado dentro de cerca de 36, 48, 60, 72 horas ou 4dias depois da administração do antagonista de NGF (tal como o anticorpoantagonista anti-NGF). Em algumas modalidades, a freqüência e/ou a inten-sidade da dor é diminuída, e/ou a é aumentada qualidade de vida daquelessofrendo da doença. Em algumas modalidades, o alívio da dor para osteoar-trite é proprcionado por duração de no mínimo cerca de 7 dias, no mínimocerca de 14 dias, no mínimo cerca de 21 dias, no mínimo cerca de 28 dias,no mínimo cerca de 35 dias, no mínimo cerca de 42 dias, no mínimo cercade 49 dias, no mínimo cerca de 56 dias, no mínimo cerca de 63 dias, no mí-nimo cerca de 70 dias, no mínimo cerca de 77 dias, no mínimo cerca de 84dias, no mínimo cerca de 180 dias, ou mais depois de uma única dose doantagonista de NGF (tal como o anticorpo antagonista anti-NGF).Preparo e uso de antagonistas de NGF (inclusive anticorpos an-ti-NGF) para estes métodos são descritos nas seções abaixo ("antagonistasde NGF ", "Anticorpo antagonista anti-NGF"; "Outros antagonistas de NGF";"Identificação de antagonistas de NGF (tais como anticorpos antagonistasanti-NGF)"; "Composições para uso nos métodos da invenção"; "Administra-ção de um antagonista de NGF (tal como um anticorpo antagonista anti-NGF)").

Antagonistas de NGF

Os métodos da invenção (relativos a dor da artrite reumatóide edor de osteoartrite) usam um antagonista de NGF, o qual se refere a qual-quer molécula que bloqueia, suprime ou reduz (inclusive significativamente)a atividade biológica do NGF, inclusive caminhos a jusante mediados porsinalização de NGF, tais como ligação de receptores e/ou provocação deuma reação celular a NGF. O termo "antagonista" não implica qualquer me-canismo específico de ação biológica, e considera-se que inclui expressa-mente e engloba todas as interações possíveis farmacológicas, fisiológicas,e bioquímicas com NGF e suas conseqüências as quais podem ser obtidaspor uma variedade de composições diferentes e quimicamente divergentes.Antagonistas de NGF típicos incluem, mas não estão limitados a, um anti-corpo anti-NGF, uma molécula anti-sentido dirigida para NGF (inclusive umamolécula anti-sentido dirigida para um ácido nucléico codificando NGF), umamolécula anti-sentido dirigida para receptor de NGF (tal como TrkA receptore/ou p75 receptor) (inclusive uma molécula anti-sentido dirigida para um áci-do nucléico codificando TrkA e/ou p75), um composto inibidor de NGF, umanálogo estrutural de NGF, uma mutação dominante-negativa de um TrkAreceptor que liga um NGF, uma imunoadesina TrkA, um anticorpo anti-TrkA,uma mutação dominante-negativa de um p75 receptor que liga um NGF, umanticorpo anti-p75, e um inibidor de quinase. Para os fins da presente inven-ção, será explicitamente entendido que o termo "antagonista" engloba todosos termos, títulos, e estados funcionais previamente identificados e caracte-rísticas por meio dos quais o próprio NGF, uma atividade biológica de NGF(inclusive mas não limitada a sua capacidade para mediar qualquer aspectode dor), ou as conseqüências da atividade biológica, são substancialmenteanuladas, reduzidas, ou neutralizadas em qualquer grau significativo. Emalgumas modalidades, um antagonista de NGF (por exemplo, um anticorpo)liga (interage fisicamente com) NGF, liga a um receptor de NGF (tal comoTrkA receptor e/ou p75 receptor), e/ou reduz (impede e/ou bloqueia) a sinali-zação de receptores de NGF a jusante. Por conseguinte, em algumas moda-lidades, um antagonista de NGF liga (interage fisicamente com) NGF. Emalgumas modalidades, o antagonista de NGF é um polipeptídeo o qual liga aNGF. Em algumas modalidades, o antagonista de NGF é um peptídeo ou umpeptídeo modificado (tal como peptídeo de ligação de NGF fundido a umdomínio Fc) descrito na Publicação de Patente Internacional PCT No. WO2004/026329. Em outra modalidade, um antagonista de NGF liga a um re-ceptor de NGF (tal como trkA receptor ou p75). Em outras modalidades, umantagonista de NGF reduz (impede e/ou bloqueia) a sinalização de recepto-res de NGF a jusante (por exemplo, inibidores de sinalização de quinase).Em outras modalidades, um antagonista de NGF inibe (reduz) a síntese e/ouliberação de NGF. Em outra modalidade, o antagonista de NGF é um anta-gonista de NGF que não é uma imunoadesina TrkA (isto é, é diferente deuma imunoadesina TrkA ). Em outra modalidade, o antagonista de NGF édiferente de um anticorpo anti-NGF. Em outra modalidade, o antagonista deNGF é diferente de uma imunoadesina TrkA e diferente de um anticorpo an-ti-NGF. Em algumas modalidades, o antagonista de NGF liga NGF (tal comohNGF) e não liga significativamente a neurotrofinas relacionadas, tais comoNT-3, NT4/5, e/ou BDNF. Em algumas modalidades, o antagonista de NGFnão está associado a uma reação imune adversa. Em outras modalidades, oantagonista de NGF é um anticorpo anti-NGF. Em ainda outras modalidades,o anticorpo anti-NGF é humanizado (tal como anticorpo E3 descrito aqui).Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF é anticorpo E3 (conformedescrito aqui). Em outras modalidades, o anticorpo anti-NGF compreendeuma ou mais CDRs do anticorpo E3 (tais como uma, duas, três, quatro, cin-co, ou, em algumas modalidades, todas as seis CDRs de E3). Em outrasmodalidades, o anticorpo é humano. Em ainda outras modalidades, o anti-corpo anti-NGF compreende a seqüência de aminoácidos da região variávelde cadeia pesada mostrada na Figura 1A (SEQ ID NO: 1) e a seqüência deaminoácidos da região variável de cadeia leve mostrada na Figura 1B (SEQID NO: 2). Em ainda outras modalidades, o anticorpo compreende uma regi-ão constante modificada, tal como uma região constante que é imunologi-camente inerte, por exemplo, não inicia um processo de lise mediada pelocomplemento, ou não estimula citotoxicidade mediada por células anticorpo-dependentes (ADCC). Em outras modalidades, a região constante é modifi-cada conforme descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pedidode Patente Internacional No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente doReino Unido No. 9809951.8.

Anticorpo antagonista anti-NGF

Os métodos da invenção (relativos a dor da artrite reumatóide edor de osteoartrite) usam um anticorpo antagonista anti-NGF, o qual se refe-re a qualquer molécula de anticorpo que bloqueia, suprime ou reduz (inclusi-ve significativamente) a atividade biológica do NGF, inclusive caminhos ajusante mediados por sinalização de NGF, tais como ligação de receptorese/ou provocação de uma reação celular a NGF.

Um anticorpo antagonista anti-NGF deve apresentar qualqueruma ou mais das seguintes características: (a) ligam a NGF e inibem a ativi-dade biológica de NGF ou caminhos a jusante mediados por função de sina-lização de NGF; (b) previnem, melhoram, ou tratam qualquer aspecto de dorda artrite reumatóide ou dor de osteoartrite; (c) bloqueiam ou reduzem ativa-ção de receptores de NGF (inclusive dimerização e/ou autofosforilação deTrkA receptor); (d) aumentam o clearance de NGF; (e) inibem (reduzem) asíntese, produção ou liberação de NGF. Anticorpos antagonistas anti-NGFsão conhecidos na técnica, veja, por exemplo, a Publicação de Patente In-ternacional Nos. WO 01/78698, WO 01/64247, as Patentes dos Estados U-nidos Nos. 5.844.092, 5.877.016, e 6.153.189; Hongo et al., Hybridoma,19:215-227 (2000); Cell. Molec. Biol. 13:559-568 (1993); Acesso no Gen-Bank Nos. U39608, U39609, L17078, ou L17077. Anticorpos antagonistasanti-NGF e polipeptídeos também são descritos na Publicação de PatenteInternacional No. WO 2005/019266.

Para os fins desta invenção, o anticorpo reage com NGF emuma maneira que inibe NGF e/ou caminhos a jusante mediados pela funçãode sinalização de NGF. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonistaanti-NGF reconhece NGF humano. Em ainda outras modalidades, o anticor-po antagonista anti-NGF especificamente liga NGF humano. Em algumamodalidade, o anticorpo antagonista anti-NGF não liga significativamente aneurotrofinas relacionadas, tais como NT-3, NT4/5, e/ou BDNF. Em aindaoutras modalidades, o anticorpo anti-NGF é capaz de ligar NGF e inibir demodo eficaz a ligação de NGF a seu TrkA e/ou p75 receptor in vivo e/ou ini-bir de modo eficaz a ativação por NGF de seu TrkA e/ou p75 receptor. Emainda outras modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF é um anticorpomonoclonal. Em ainda outras modalidades, o anticorpo anti-NGF é humani-zado (tal como anticorpo E3 descritos aqui). Em algumas modalidades, oanticorpo anti-NGF é humano. Veja, por exemplo, a publicação de PatenteInternacional No. WO 2005/019266. Em uma modalidade, o anticorpo é umanticorpo humano o qual reconhece um ou mais epitopos sobre NGF hu-manp. Em outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo de camundongo oude rato o qual reconhece um ou mais epitopos sobre NGF humano. Em outramodalidade, o anticorpo reconhece um ou mais epitopos sobre um NGF se-lecionado entre o grupo consistindo em: primata, canino, felino, eqüino, ebovino. Em ainda modalidades adicionais, o anticorpo antagonista anti-NGFliga essencialmente o mesmo NGF epitopo 6 como um anticorpo seleciona-do entre qualquer um ou mais dos seguintes: MAb 911, MAb 912 e MAb 938(Veja Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). Em outras modalidades,o anticorpo liga o mesmo epitopo como Mab 911. Em outra modalidade, oanticorpo compreende uma região constante que é imunologicamente inerte(por exemplo, não inicia um processo de lise mediada pelo complemento oucitotoxicidade mediada por células anticorpo-dependentes (ADCC)). A ativi-dade de ADCC pode ser avaliada usando métodos descrito na Patente dosEstados Unidos N.. 5. 500. 362. Em algumas modalidades, a região constan-te é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624;Pedido de Patente Internacional No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Pa-tente do Reino Unido No. 9809951.8.

Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF éum anticorpo anti-NGF monoclonal de camundongo humanizado denomina-do anticorpo "E3", quaisquer dos anticorpos relacionados com E3 descritosaqui, ou qualquer fragmentos dos mesmos, os quais são antagonistas de NGF.

Os anticorpos úteis na presente invenção podem englobar anti-corpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (porexemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc), anticorpos quiméricos, anticorposbiespecíficos, anticorpos heteroconjugados, cadeia única (ScFv), mutantesdos mesmos, proteínas de fusão compreendendo um porção anticorpo, anti-corpos humanizados, e qualquer outra configuração modificada da moléculade imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento antigenicoda especificidade requerida, inclusive variantes de glicosilação de anticor-pos, seqüência de aminoácidos variantes de anticorpos, e anticorpos modifi-cados de modo covalente. Os anticorpos podem ser murinos, de rato, huma-no, ou de qualquer outra origem (inclusive quiméricos ou anticorpos humanizados).

A afinidade de ligação de um anticorpo antagonista anti-NGF aNGF (tal como hNGF) pode ser cerca de 0,10 até cerca de 0,80 nM, cercade 0,15 até cerca de 0,75 nM e cerca de 0,18 até cerca de 0,72 nM. Em umamodalidade, a afinidade de ligação é entre cerca de cerca de 2 pM and 22pM. Em uma modalidade, a afinidade de ligação é entre em torno de cercade 23 pM e cerca de 100 pM. Em uma modalidade, a afinidade de ligação écerca de 10 nM. Em outras modalidades, a afinidade de ligação é menos decerca de 10 nM. Em outras modalidades, a afinidade de ligação é cerca de0,1 nM ou cerca de 0,07 nM. Em outras modalidades, a afinidade de ligaçãoé menos de cerca de 0,1 nM ou menos de cerca de 0,07 nM. Em outras mo-dalidades, a afinidade de ligação é qualquer uma de cerca de 100 nM, cercade 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100pM, ou cerca de 50 pM to any de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, ou cerca de 40 pM. Em algumas mo-dalidades, a afinidade de ligação é qualquer uma de cerca de 100 nM, cercade 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100pM, ou cerca de 50 pM, or menos de cerca de 50 pM. Em algumas modali-dades, a afinidade de ligação é menos de qualquer uma de cerca de 100nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cercade 100 pM, ou cerca de 50 pM. Em ainda outras modalidades, a afinidade deligação é cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM,cerca de 20 pM, cerca de 40 pM, ou mais de cerca de 40 pM.

Um modo para determinar a afinidade de ligação de anticorposao NGF é medindo a afinidade de ligação de fragmentos Fab monofuncio-nais do anticorpo. Para obter fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo(por exemplo, IgG) pode ser clivado com papaína ou expressado de modorecombinante. A afinidade de um fragmento Fab anti-NGF de um anticorpopode ser determinada por ressonância de plasmon superficial (sistema deressonância de plasmon superficial BIAcore3000™ (SPR), BlAcore, INC,Piscaway NJ). Chips de CM5 podem ser ativados com cloridreto de N-etila-N'-(3-dimetilaminopropila)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida(NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. NGF humano (ou qual-quer outro NGF) pode ser diluído em acetato de sódio a 10 mM pH 4.0 e in-jetado sobre o chip ativado em uma concentração de 0,005 mg/mL Usandotempo de fluxo variável através dos canais dos chips individuais, podem serobtidas duas faixas de densidade antigênica : 100-200 unidades de resposar(RU) para estudos cinéticos detalhados e 500-600 RU para ensaios de tria-gem. O chip pode ser bloqueado com etanolamina. Estudos de regeneraçãomostraram que uma mistura de tampão de elutriação de Pierce (Product No.21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) e NaCI a 4 M (2:1) remove demodo eficaz o Fab ligado ao mesmo tempo que mantendo a atividade dehNGF sobre o chip por mais de 200 injeções. Tampão HBS-EP (HEPES a0,01 M, pH 7.4, 0,15 NaCI, EDTA a 3 mM, 0,005% de Surfactant P29) é usa-do como tampão de funcionamento para os ensaios BlAcore. Diluições seri-ais (0,1-10x KD estimada) de amostras de Fab purificado são injetadas por 1min a 100 SLVmin e são permitidos tempos de dissociação de até 2h. Asconcentrações das proteínas Fab são determinadas por ELISA e/ou eletrofo-rese SDS-PAGE usando um Fab de concentração conhecida (determinadopor análise de aminoácidos) como um padrão. índices de associação cinéti-ca (kon) e índices de dissociação ("koff") são obtidos simultaneamente ajus-tando os dados para um modelo de ligação de Langmuir a 1:1 (Karlsson, R.Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando o programa BlAevaluation. Os valores das constantes de disso-ciação de equilíbrio (KD) são calculados como "koff"/kon. Este protocolo é a-dequada para uso na determinação da afinidade de ligação de um anticorpoa qualquer NGF, inclusive NGF humano, NGF de outro vertebrado (em al-gumas modalidades, mamífero) (tal como NGF de camundongo, NGF derato, NGF de primata), bem como para uso com outras neurotrofinas, taiscomo as neurotrofinas relacionadas NT3, NT4/5, e/ou BDNF.

Em algumas modalidades, o anticorpo liga NGF humano, e nãoliga significativamente um NGF de outra espécie de vertebrado (em algumasmodalidades, mamífero). Em algumas modalidades, o anticorpo liga NGFhumano bem como um ou mais NGF de outra espécie de vertebrado (emalgumas modalidades, mamífero). Em ainda outras modalidades, o anticorpoliga NGF e não tem reação cruzada significativamente com outras neurotro-finas (tais como as neurotrofinas relacionadas, NT3, NT4/5, e/ou BDNF). Emalgumas modalidades, o anticorpo liga NGF bem como no mínimo uma neu-rotrofina diversa. Em algumas modalidades, o anticorpo liga a uma espéciede NGF de mamífero, tal como cavalo ou cão, mas não liga significativamen-te a NGF de outra espécie de mamífero.

O um ou mais epitopos podem ser contínuos ou descontínuos.Em uma modalidade, o anticorpo liga essencialmente os mesmos epitoposde hNGF que um anticorpo selecionado entre o grupo consistindo em MAb911, MAb 912, e MAb 938 conforme descrito em Hongo et al., Hybridoma,19:215-227 (2000). Em outra modalidade, o anticorpo liga essencialmente omesmo epitopo de hNGF que MAb 911. Em ainda outra modalidade, o anti-corpo liga essencialmente o mesmo epitopo que MAb 909. Hongo et al., su-pra. Por exemplo, o epitopo pode compreender um ou mais de: resíduosK32, K34 e E35 dentro da região variável 1 (aminoácidos 23-35) de hNGF;resíduos F79 e T81 dentro da região variável 4 (aminoácidos 81-88) dehNGF; resíduos H84 e K88 dentro da região variável 4; resíduo R103 entre aregião variável 5 (aminoácidos 94-98) de hNGF e o C-término (aminoácidos111-118) de hNGF; resíduo E11 dentro da região pré-variável 1 (aminoáci-dos 10-23) de hNGF; Y52 entre a região variável 2 (aminoácidos 40-49) dehNGF e a região variável 3 (aminoácidos 59-66) de hNGF; resíduos L112 eS113 dentro do C-término de hNGF; resíduos R59 e R69 dentro da regiãovariável 3 de hNGF; ou resíduos V18, V20, e G23 dentro da região pré-variável 1 de hNGF. Além disso, um epitopo pode compreender uma ou maisentre a região variável 1, a região variável 3, a região variável 4, a regiãovariável 5, a região de N-término, e/ou o C-término de hNGF. Em ainda outramodalidade, o anticorpo reduz significativamente a acessibilidade a solventedo resíduo R103 de hNGF. Entende-se que embora os epitopos descritosacima se refiram a NGF humano, uma pessoa de conhecimento regular po-de alinhar as estruturas de NGF humano com o NGF de outra espécie e i-dentificar complementos prováveis para estes epitopos.

Em um aspecto, anticorpos (por exemplo, humanos, humaniza-dos, de camundongo, quiméricos) que podem inibir NGF podem ser prepa-rados usando imunogênios que expressam seqüência de NGF de extensãototal ou parcial. Em outro aspecto, pode ser usado um imunogênio compre-endendo uma célula que superexpressa NGF. Outro exemplo de um imuno-gênio que pode ser usado é proteína de NGF que contém NGF de extensãototal ou uma porção da proteína de NGF.

Os anticorpos antagonistas anti-NGF podem ser preparados porqualquer método conhecido na técnica. A via e esquema de imunização doanimal hospedeiro são de modo geral acompanhando técnicas estabelecidase convencionais para estimulação e produção de anticorpos, conforme adi-cionalmente descrito aqui. Técnicas gerais para produção de anticorpos hu-manos e de camundongo são conhecidos na técnica e são descritas aqui.

É contemplado que qualquer indivíduo mamífero inclusive sereshumanos ou células dos mesmos produtoras de anticorpos podem ser mani-pulados para servir como a base para a produção de linhagens celulares dehibridoma, mamífero, inclusive humano. Tipicamente, o animal hospedeiro éinoculado por via intraperitoneal, por via intramuscular, por via oral, por viasubcutânea, intraplantar, e/ou por via intradérmica com uma quantidade deimunogênio, inclusive conforme descrito aqui.

Hibridomas podem ser preparados a partir dos linfócitos e decélulas de mieloma imortalizadas usando a técnica de hibridização de célu-las somáticas geral de Kohler, B. e Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497ou conforme modificado por Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982).Linhagens de mieloma disponíveis, inclusive mas não limitadas a X63-Ag8.653 e as do Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif.,EUA, podem ser usadas na hibridização. De modo geral, a técnica envolvefundir células de mieloma e células linfóides usando um fusogenio tal comopolietileno glicol, ou por meios elétricos de conhecimento geral daquelesversados na técnica. Depois da fusão, as células são separadas do meio defusão e cultivadas em um meio de crescimento seletivo, tal como meio dehipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar células parentais nãohibridizadas. Pode ser usado qualquer um dos meios descritos aqui, suple-mentado com ou sem soro, para cultivar hibridomas que secretam anticorposmonoclonais. Como outra alternativa à técnica de fusão celular, células Bimortalizadas EBV podem ser usadas para produzir os anticorpos anti-NGFmonoclonais da presente invenção. Os hibridomas são expandidos e sub-clonados, caso desejado, e os sobrenadantes são testados para atividadeantiimunogênio por procedimentos de imunoensaio convencionais (por e-xemplo, radioimunoensaio, imunoensaio enzimático, ou imunoensaio de fluo-rescência).

Hibridomas que podem ser usados como fonte de anticorposenglobam todos os derivados, células da progênie dos hibridomas parentaisque produzem anticorpos monoclonais específicos para NGF, ou uma por-ção dos mesmos.

Hibridomas que produzem os anticorpos referidos podem sercultivados in vitro ou in vivo usando procedimentos conhecidos. Os anticor-pos monoclonais podem ser isolados do meio de cultura ou de fluidos corpo-rais, por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina taiscomo precipitação de sulfato de amônio, eletroforese de gel, diálise, croma-tografia, e ultrafiltração, caso desejado. Atividade indesejada, caso presente,pode ser removida, por exemplo, passando a preparação sobre adsorventesfeitos do imunogênio fixado a uma fase sólida e elutriando ou liberando osanticorpos desejados do imunogênio. A imunização de um animal hospedei-ro com um NGF humano, ou um fragmento contendo a seqüência de amino-ácidos alvo conjugada a uma proteína que é imunogenica na espécie a serimunizada, por exemplo, hemocianina de lampreia de Fissurella, albuminasérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja usando um agentebifuncional ou de derivação, por exemplo éster de maleimidobenzoila sulfos-succinimida (conjugação através de resíduos cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos lisina), glitaradeído, anidrido succí-nico, SOCI2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquila diferentes, po-de produzir uma população de anticorpos (por exemplo, anticorpos mono-clonais).

Caso desejado, o anticorpo antagonista anti-NGF (monoclonalou policlonal) de interesse pode ser seqüenciado e a seqüência de polinu-cleotídeo pode ser então clonada em um vetor para expressão ou propaga-ção. A seqüência codificando o anticorpo de interesse pode ser mantida novetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode ser então ex-pandida e congelada para uso futuro. Em uma alternativa, a seqüência depolinucleotídeo pode ser usada para manipulação genética para "humanizar"o anticorpo ou para melhorar a afinidade, ou outras características do anti-corpo. Por exemplo, a região constante pode ser produzida por engenhariapara se assemelhar a regiões constantes humanas para evitar reação imunese o anticorpo for usado em ensaios clínicas e tratamentos em seres huma-nos. Pode ser desejável manipular geneticamente a seqüência de anticorpopara obter maior afinidade para NGF e maior eficácia para inibir NGF. Seráevidente para uma pessoa versada na técnica que pode ser feita uma oumais alterações de polinucleotídeos para o anticorpo antagonista anti-NGF eainda manter sua capacidade de ligação a NGF.

Há quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclo-nal. Estas são: (1) determinar o nucleotídeo e seqüência de aminoácidosprevista dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo departida (2) desenhar o anticorpo humanizado, isto é, decidir qual região deestrutura de anticorpo usar durante o processo de humanização (3) as me-todologias / técnicas de humanização atuais e (4) a transfecção e expressãodo anticorpo humanizado. Veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Uni-dos Nos. 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761;5.693.762; 5.585.089; e 6.180.370.

Foram descritas uma série de moléculas de anticorpos "humani-zados" compreendendo um sítio de ligação antigênica derivado de uma imu-noglobulina não humana, inclusive anticorpos quiméricos tendo regiões V deroedores ou de roedores modificados e suas regiões determinantes de com-plementaridade associadas (CDRs) fundidas a domínios constantes huma-nos. Veja, por exemplo, Winter et al. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio etal. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol.138:4534-4538 (1987), e Brown et al. Câncer Res. 47:3577-3583 (1987).

Outras referências descrevem CDRs de roedores enxertadas em uma regiãode estrutura de suporte humano (FR) antes de fusão com um domínio cons-tante de anticorpo humano apropriado. Veja, por exemplo, Riechmann et al.Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988),e Jones et al. Nature 321:522-525 (1986). Outra referência descreve CDRsde roedores suportadas por regiões de estrutura de roedores recobertas demodo recombinante. Veja, por exemplo, a Publicação de Patente EuropéiaNo. 0519596. Estas moléculas "humanizadas" são projetadas para minimizarreação imunológica indesejada contra moléculas de anticorpos anti-humanosde roedores a qual limita a duração e a eficácia de aplicações terapêuticasdestas porções em receptores humanos. Por exemplo, a região constante doanticorpo pode ser produzida de tal modo que seja imunologicamente inerte(por exemplo, não inicia um processo de lise de complemento). Veja, porexemplo, a Publicação de Patente Internacional No. PCT/GB99/01441; oPedido de Patente do Reino Unido No. 9809951.8. Outros métodos de hu-manização de anticorpos que também podem ser utilizados são descritospor Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991) e nas Patentesdos Estados Unidos Nos. 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692;6.210.671; e 6.350.861; e na Publicação de Patente Internacional No. WO01/27160.

Em ainda outra alternativa, anticorpos totalmente humanos po-dem ser obtidos usando camundongos disponíveis comercialmente que fo-ram produzidos para expressar proteínas imunoglobulinas humanas especí-ficas. Animais transgênicos que são desenhados para produzir uma reaçãoimune mais desejável (por exemplo, anticorpos totalmente humanos) oumais robusta também podem ser usados para produção de anticorpos hu-manos ou humanizados. Exemplos de semelhante tecnologis são Xenomou-se ™ da Abgenix, Inc. (Fremont, CA) e HuMAb-Mouse® e TC Mouse™ daMedarex, Inc. (Princeton, NJ).

Em uma alternativa, anticorpos podem ser preprados de modorecombinante e expressados usando qualquer método conhecidos na técni-ca. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser preparados de modo re-combinante por tecnologia de "display" de fago. Veja, por exemplo, as Pa-tentes dos Estados Unidos Nos. 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; e6.265.150; e Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Alterna-tivamente, a tecnologia de "display" de fago (McCafferty et al., Nature348:552-553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos efragmentos de anticorpos in vitro, a partir de repertórios de gene de domíniovariável (V) de imunoglobulina de doadores não-imunizados. De acordo comesta técnica, os genes do domínio V de anticorpos são clonados in-frame ouem um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófa-go filamentoso, tal como M13 ou fd, e apresentados como fragmentos deanticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como as partí-cula filamentosa contém uma cópia de DNA de filamento único do genomado fago, seleções à base das propriedades funcionais do anticorpo tamgbémresultam na seleção do gene codificando o anticorpo apresentando estaspropriedades. Portanto, o fago simula algumas das propriedades da célula B.O "display" de fago pode ser realizado em uma variedade de formatos; pararevisão veja, por exemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., CurrentOpinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Várias fontes de segmentosde V-gene podem ser usados para "display" de fago. Clackson era/., Nature352:624-628 (1991) isolou uma série diversa de anticorpos antioxazolona deuma biblioteca combinatorial aleatória pequena de genes V derivados dosbaços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadoreshumanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para uma sériediversa de antígenos (inclusive auto-antígenos) podem ser isolados essenci-almente seguindo as técnicas descritas por Mark etal., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith ei a/., EMBO J. 12:725-734 (1993). Em uma reaçãoimune natural, genes de anticorpos acumulam mutações em um alto índice(hipermutação somática). Algumas das alterações introduzidas conferirãomaior afinidade, e células B apresentando imunoglobulina superficial de altaafinidade são preferencialmente duplicadas e diferenciadas durante subse-qüente ataque antigênico. Este processo natural pode ser simulado empre-gando a técnica conhecida como "permutação de cadeia (chain shuffling)."Marks, et ai, Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). Neste método, a afinidade deanticorpos humanos "primários" obtidos por "display" de fago pode ser apri-morada substituindo seqüencialmente os genes de região V de cadeia pesa-da e leve com repertórios de variantes que ocorrem naturalmente (repertó-rios) de genes de domínio V obtidos de doadores não imunizados. Esta téc-nica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afini-dades na faixa pM-nM. Uma estratégia para preparar repertórios de anticor-pos de fagos muito grandes (também conhecidos como "the mother-of-alllibraries") foi descrita por Waterhouse etal., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266(1993). Também pode ser usada permutação genética para derivar anticor-pos humanos de anticorpos de roedores, onde o anticorpo humano tem afi-nidades similares e especificidades para o anticorpo de roedor de partida.De acordo com este método, o qual também é referido como "impressão deepitopo", o gene do domínio V de cadeia pesada ou leve de anticorpos deroedores obtidos por técnica de "display" de fago é substituído com um re-pertório de genes de domínio V humano, criando quimeras roedor-humanas.

A seleção sobre antígeno resulta no isolamento de regiões variáveis huma-nas capazes de restaurar um sítio de ligação antigênica funcional, isto é, oepitopo governa (imprime) a escolha do parceiro. Quando o processo é repe-tido de modo a substituir o domínio V de roedor remanescente, um anticorpohumano é obtido (veja a Publicação de Patente Internacional No. WO93/06213, publicada em 1o. de abrila de 1993). Diferentemente de humani-zação tradicional de anticorpos de roedores por enxertagem de CDR, estatécnica proporciona anticorpos completamente humanos, os quais não têmestrutura ou resíduos CDR de origem de roedor.

É evidente que embora a discussão acima diz respeito a anticor-pos humanizados, os princípios gerais discutidos são aplicáveis para custo-mizar anticorpos para uso, por exemplo, em cães, gatos, primata, eqüinos ebovinos. Adicionalmente é evidente que um ou mais aspectos de humaniza-ção de um anticorpo descrito aqui, podem ser combinados, por exemplo,enxertagem de CDR, mutação de estrutura e mutação de CDR.

Anticorpos podem ser preparados de modo recombinante primei-ro isolando os anticorpos e células produtoras de anticorpos de animais hos-pedeiros, obtendo a seqüência genética, e usando a seqüência genética pa-ra expressar o anticorpo de modo recombinante em células hospedeiras (porexemplo, células CHO). Outro método o qual pode ser empregado é expres-sar a seqüência de anticorpos em plantas (por exemplo, tabaco) ou leitetransgênico. Foram descritos métodos para expressar anticorpos de modorecombinante em plantas ou leite. Veja, por exemplo, Peeters, et al. Vaccine19:2756 (2001); Lonberg, N. and D. Huszar Int.Rev.lmmunol 13:65 (1995); ePollock, et al., J Immunol Methods 231:147(1999). Métodos para prepararderivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, de cadeia única, e etc.são conhecidos na técnica.

Técnicas de imunoensaios e de classificação por citometria defluxo tais como classificação celular ativada por fluorescência (FACS) tam-bém podem ser empregadas para isolar anticorpos que são específicos paraNGF.

Os anticorpos podem ser ligados por muitos veículos diferentes.Os veículos podem ser ativos e/ou inertes. Exemplos de veículos de conhe-cimento geral incluem polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrano, nái-lon, amilases, vidro, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, aga-roses e magnetita. A natureza do veículo pode ser ou solúvel ou insolúvelpara os fins da invenção. Os versados na técnica conhecerão outros veícu-los adequados para ligação de anticorpos, ou serão capazes de determinaros mesmos, usando experimentação de rotina. Em algumas modalidades, oveículo compreende uma porção que tem por alvo o miocárdio.

DNA codificando os anticorpos monoclonais é prontamente iso-lado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, u-sando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de ligar especificamen-te a genes codificando as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclo-nais). As células de hibridoma servem como uma fonte preferencial de se-melhante DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser posto em vetores de ex-pressão (tais como vetores de expressão descritos na Publicação de PatenteInternacional No. WO 87/04462), os quais são então transfectados em célu-las hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, célulasde ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produ-zem de outro modo proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticor-pos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Veja, por exemplo,a Publicação de Patente Internacional No. WO 87/04462. O DNA tambémpode ser modificado, por exemplo, substituindo a seqüência codificante paradomínios constantes de cadeia leve e pesada humanas ao invés das se-qüências murinas homólogas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 81:6851(1984), ou ligando de modo covalente à seqüência codificante de imunoglo-bulina toda ou parte da seqüência codificante a um polipeptídeo não imuno-globulina. Nesta maneira, são preparados anticorpos "quiméricos" ou "híbri-dos" que têm a especificidade de ligação de um anticorpo anti-NGF mono-clonal aqui.Anticorpos antagonistas anti-NGF podem ser caracterizados u-sando métodos de conhecimento geral na técnica. Por exemplo, um métodoé identificar o epitopo ao qual ele liga, ou "mapeamento de epitopo." Há mui-tos métodos conhecidos na técnica para mapeamento e caracterização dalocalização de epitopos sobre proteínas, inclusive solvendo a estrutura cris-talina de um complexo antígeno-anticorpo, ensaios de competição, ensaiosde expressão de fragmento genético, e ensaios à base de peptídeos sintéti-cos, conforme descrito, por exemplo, no Chapter 11 de Harlow and Lane,Usando Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Em um exemplo adicional, omapeamento de epitopos pode ser usado para determinar a seqüência àqual liga um anticorpo antagonista anti-NGF. O mapeamento de epitoposestá disponível comercialmente a partir de várias fontes, por exemplo, Peps-can Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Países Baixos). O epitopopode ser um epitopo linear, isto é, contido em um único trecho de aminoáci-dos, ou um epitopo conformacional formado por uma interação tridimensio-nal de aminoácidos que podem não estar necessariamente contidos em umúnico trecho. Peptídeos de extensões variáveies (por exemplo, no mínimo 4a 6 aminoácidos de extensão) podem ser isolados ou sintetizados (por e-xemplo, de modo recombinante) e usados paro ensaios de ligação com umanticorpo antagonista anti-NGF. Em outro exemplo, o epitopo ao qual o anti-corpo antagonista anti-NGF liga pode ser determinado em uma triagem sis-temática usando sobreposição de peptídeos derivados da seqüência de NGFe determinação da ligação pelo anticorpo antagonista anti-NGF. De acordocom os ensaios de expressão de fragmento genético, a estrutura de leituraaberta codificando NGF é fragmentado ou aleatoriamente ou por constru-ções genéticas específicas e a reatividade dos fragmentos de NGF expres-sados com o anticorpo a ser testado é determinada. Os fragmentos de genepodem ser produzidos, por exemplo, por PCR e em seguida transcrito e tra-duzido em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos. A liga-ção do anticorpo aos fragmentos de NGF rotulados radioativamente é entãodeterminada por imunoprecipitação e eletroforese de gel. Alguns epitopostambém podem ser identificados usando grandes bibliotecas de seqüênciasde peptídeos aleatórias apresentadas sobre a superfície de partículas defagos (bibliotecas de fagos). Alternativamente, uma biblioteca definida desobreposição de fragmentos de peptídeos pode ser testara para ligação aoanticorpo de ensaio em ensaios de ligação simples. Em um exemplo adicio-nal, a mutagenese de um domínio de ligação de antígeno, experimentos depermutação de domínio e mutagenese de varredura de alanina podem serrealizados para identificar resíduos requeridos, suficientes, e/ou necessáriospara ligação de epitopo. Por exemplo, experimentos de permutação de do-mínio podem ser realizados usando um NGF mutante no qual vários frag-mentos do polipeptídeo de NGF foram substituídos (permutados) com se-qüências de uma proteína intimamente relacionada, porém antigenicamentedistinta (tal como outro membro da família das proteínas neurotrofinas). Ava-liando a ligação do anticorpo ao NGF mutante, pode ser avaliada a impor-tância do fragmento de NGF em particular para ligação de anticorpos.

Ainda outro método o qual pode ser usado para caracterizar umanticorpo antagonista anti-NGF é usar ensaios de competição com outrosanticorpos que se sabe que ligam ao mesmo antígeno, isto é, vários frag-mentos sobre NGF, para determinar se o anticorpo antagonista anti-NGF ligaoa mesmo epitopo que outros anticorpos. Ensaios de competição são deconhecimento geral daqueles versados na técnica. Exemplo de anticorposque podem ser usados nos ensaios de competição para a presente invençãoincluem MAb 911, 912, 938, conforme descrito em Hongo, et al., Hybridoma19:215-227 (2000).

Um vetor de expressão pode ser usado para expressão direta deum anticorpo antagonista anti-NGF. Uma pessoa versada na técnica estáfamiliarizada com administração de vetores de expressão para obter expres-são de uma proteína exógena in vivo. Veja, por exemplo, as Patentes dosEstados Unidos Nos. 6.436.908; 6.413.942; e 6.376.471. A administração devetores de expressão inclui administração local ou sistêmica, inclusive inje-ção, administração oral, pistola de partículas ou administração cateterizada,e administração tópica. Em outra modalidade, o vetor de expressão é admi-nistrado diretamente ao gânglio ou tronco simpático, ou em uma artéria co-ronária, átrio, ventrículo, ou pericárdo.

Também pode ser usada a liberação orientada de composiçõesterapêuticas contendo um vetor de expressão, ou polinucleotídeos subgê-nomicos. Técnicas de liberação de DNA mediada por receptores são descri-tas, por exemplo, em Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiouet al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Trans-fer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu etal., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA(1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Composições te-rapêuticas contendo um polinucleotídeo são administradas dentro de umalcance de cerca de 100 ng até cerca de 200 mg de DNA para administraçãolocal em um protocolo de terapia genética. Faixas de concentração de cercade 500 ng até cerca de 50 mg, cerca de 1 |j.g até cerca de 2 mg, cerca de 5|ig até cerca de 500 ng, e cerca de 20 |ig até cerca de 100 ng de DNA tam-bém podem ser usadas durante um protocolo de terapia genética. Os polinu-cleotídeos e polipeptídeos terapêuticos podem ser liberados usando veículosde liberação genética. O veículo de liberação genética pode ser de origemviral ou não viral (veja, de modo geral, Jolly, Câncer Gene Therapy (1994)1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human GeneTherapy (1995) 1:185; e Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). A expressãode semelhantes seqüências codificantes pode ser induzida usando promoto-res heterólogos ou de mamíferos endógenos. A expressão da seqüênciacodificante pode ser ou constitutiva ou regulada.

Vetores à base de vírus para liberação de um polinucleotídeodesejado e expressão em uma célula desejada são de conhecimento geralna técnica. Veículos à base de vírus típicos incluem, mas não estão limita-dos a, retrovírus recombinantes (veja, por exemplo, as Publicações de Pa-tentes Internacionais Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; as Patentes dos E-tados Unidos Nos. 5. 219.740 e 4.777.127; a Patente da Grã Bretanha No.2,200,651; e a Patente Européia No. 0 345 242), vetores à base de alfavírus(por exemplo, vetores de Sindbis vírus, Semliki forest vírus (ATCC VR-67;ATCC VR-1247), Ross River vírus (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e vírusda encefalite eqüina da Venezuela (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCCVR 1249; ATCC VR-532)), e vetores de vírus adeno-associados (AAV) (veja,por exemplo, as Publicações de Patentes Internacionais Nos. WO 94/12649,WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655).Também pode ser empregada a administração de DNA ligado a adenovírusmortos conforme descrito em Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147.

Também podem ser empregados veículos e métodos de libera-ção não virais, inclusive, mas não limitados a, DNA condensado policatiônicoligado ou não ligado a adenovírus morto sozinho (veja, por exemplo, Curiel,Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); DNA ligado a ligante (veja, por exemplo,Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); células veículos de liberação de célu-las eucarióticas (veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No.5.814.482; as Publicações de Patentes Internacionais Nos. WO 95/07994;WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutralização de carga nu-cléica ou fusão com membranas celulares. Também pode ser empregadoDNA nu. Métodos de introdução de DNA nu típicos são descritos na Publica-ção de Patente Internacional No. WO 90/11092 e na Patente dos EstadosUnidos No. 5,580,859. Lipossomas que podem agir como veículos de libera-ção genética são descritos na Patente dos Estados Unidos No. 5,422,120;nas Publicações de Patentes Internacionais Nos. WO 95/13796; WO94/23697; WO 91/14445; e na Patente Européia No. EP 0524968. Aborda-gens adicionais são descritas em Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411, e emWoffendin, Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91:1581.

Outros antaqonistas de NGF

Antagonistas de NGF diferentes de anticorpos anti-NGF podemser usados (relativos a dor da artrite reumatóide e a dor de osteoartrite). Emalgumas modalidades da invenção, o antagonista de NGF compreende nomínimo uma molécula anti-sentido capaz de bloquear ou reduzir a expressãode um NGF funcional. Seqüências de nucleotídeos do NGF são conhecidase estão prontamente disponíveis a partir de bancos de dados disponíveispublicamente. Veja, por exemplo, Borsani et al., Nuc. Acids Res. 1990, 18,4020; Accession Number NM 002506; Ullrich et al., Nature 303:821-825(1983). É rotina preparar moléculas de oligonucleotídeos anti-sentidos queespecificamente ligarão mRNA de NGF sem ter reação cruzada com outrospolinucleotídeos. Sítios típicos de alvo incluem, mas não estão limitados a, ocódon de iniciação, as regiões regulatórias 5', a seqüência codificante e aregião não traduzida 3'. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos têmcerca de 10 a 100 nucleotídeos de extensão, cerca de 15 a 50 nucleotídeosde extensão, cerca de 18 a 25 nucleotídeos de extensão, ou mais. Os oligo-nucleotídeos podem compreender modificações da espinha principal taiscomo, por exemplo, ligações fosforotioato, e modificações de 2'-0 açúcar deconhecimento geral na técnica. Moléculas anti-sentido típicas incluem asmoléculas anti-sentido de NGF descritas na Publicação dos Estados UnidosNo. 20010046959; veja também http://www.rna-tec.com/repair.htm.

Em outras modalidades, o antagonista de NGF compreende nomínimo uma molécula anti-sentido capaz de bloquear ou reduzir a expressãode um receptor de NGF funcional (tal como TrkA e/ou p75). Woolf et al., J.Neurosci. (2001) 21 (3): 1047-55; Taglialetela et al, J Neurochem (1996)66(5): 1826-35. Seqüências de nucleotídeos de TrkA e p75 são conhecidase estão prontamente disponíveis em bancos de dados publicamente disponí-ves.

Alternativamente, a expressão e/ou liberação de NGF e/ou a ex-pressão de receptores de NGF pode ser reduzida usando knockdown gené-tico, morfolino oligonucleotídeos, RNAi, ou ribozimas, métodos que são deconhecimento geral na técnica. Vejahttp://www.macalester.edu/~montgomery/RNAi.html;http://pub32.ezboard.com/fmorpholinosfrm19.showMessage?topiclD=6.topic;http://www.highveld.com/ribozyme.html.

Em outras modalidades, o antagonista de NGF compreende nomínimo um composto inibidor de NGF. Conforme usado aqui, o "compostoinibidor de NGF" se refere a um composto diferente de um anticorpo anti-NGF que diretamente ou indiretamente reduz, inibe, neutraliza, ou abole aatividade biológica do NGF. Um composto inibidor de NGF deve apresentarqualquer uma ou mais das seguintes características: (a) ligação a NGF einibição da atividade biológica de NGF e/ou de caminhos a jusante mediadospor função de sinalização de NGF; (b) prevenção, melhora, ou tratamento dequalquer aspecto de dor (tal como dor de osteoartrite); (c) bloqueio ou redu-ção da ativação de receptores de NGF (inclusive dimerização e/ou autofosfo-rilação de TrkA receptor); (d) aumento da depuração de NGF; (e) inibição(redução) da síntese, produção ou liberação de NGF. Compostos inibidoresde NGF típicos incluem os inibidores de NGF de molécula pequena descritosna Publicação dos Estados Unidos No. 20010046959; os compostos queinibem ligação de NGF a p75, conforme descrito na Publicação de PatenteInternacional No. WO 00/69829, e PD90780 [ácido 7-(benzolilamino)-4,9-diidro-4-metila-9-oxo-pirazolo[5,1 -b]quinazolina-2-carboxílico] conforme des-crito por Colquhoun et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 310(2):505-11 (2004); oscompostos que inibem a ligação de NGF a TrkA e/ou p75, conforme descritona Publicação de Patente Internacional No. WO 98/17278. Exemplos adicio-nais de compostos inibidores de NGF incluem os compostos descritos nasPublicações de Patente Internacional Nos. WO 02/17914 e WO 02/20479, enas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.342.942; 6.127.401; e 6.359.130.

Compostos inibidores de NGF típicos adicionais são compostos que são ini-bidores competitivos de NGF. Veja a Patente dos Estados Unidos No.6.291.247. Além disso, uma pessoa versada na técnica pode preparar outroscompostos inibidores de NGF de moléculas pequenas.

Em algumas modalidades, um composto inibidor de NGF ligaNGF. Sítios típicos de alvo (ligação) incluem, mas não estão limitados a, aporção do NGF que liga ao receptor TrkA e/ou receptor p75, e as porções doNGF que são adjacentes à região de ligação de receptor e as quais são res-ponsáveis, em parte, pela forma tridimensional correta da porção de ligaçãode receptor. Em outra modalidade, um composto inibidor de NGF liga umreceptor de NGF (tal como TrkA e/ou p75) e inibe uma atividade biológica doNGF. Sítios típicos de alvo incluem as porções de TrkA e/ou p75 que ligam aNGF.Em modalidades compreendendo moléculas pequenas, uma mo-lécula pequena pode ter um peso molecular de cerca de qualquer um de 100a 20.000 daltons, 500 a 15.000 daltons, ou 1000 a 10.000 daltons. Bibliote-cas de moléculas pequenas estão disponíveis comercialmente. As moléculaspequenas podem ser administradas usando quaisquer meios conhecidos natécnica, inclusive inalação, por via intraperitoneal, por via intravenosa, porvia intramuscular, por via subcutânea, por via intratecal, por via intraventricu-lar, por via oral, por via enteral, por via parenteral, por via intranasal, ou porvia dérmica. Em geral, quando o antagonista de NGF de acordo com a in-venção é uma molécula pequena, será administrado no índice de 0,1 a 300mg/kg do peso do paciente dividido em uma a três ou mais doses. Para umpaciente adulto de peso normal, podem ser administradas doses variando de1 mg a 5 g por dose.

Em outras modalidades, o antagonista de NGF compreende nomínimo um análogo estrutural de NGF. "Análogos estruturais de NGF" napresente invenção se referem a compostos que têm uma estrutura tridimen-sional similar como parte daquela do NGF e os quais ligam a um receptor deNGF sob condições fisiológicas in vitro ou in vivo, em que a ligação no míni-mo parcialmente inibe uma atividade biológica do NGF. Em uma modalida-de, o análogo estrutural de NGF liga a um TrkA e/ou um p75 receptor. Aná-logos estruturais de NGF típicos incluem, mas não estão limitados a, os pep-tídeos bicíclicos descritos na Publicação de Patente Internacional No. WO97/15593; os peptídeos bicíclicos descritos na Patente dos Estados UnidosNo. 6,291,247; os compostos cíclicos descritos na Patente dos Estados Uni-dos No. 6,017,878; e peptídeos derivados de NGF descritos na Publicaçãode Patente Internacional No. WO 89/09225. Análogos estruturais de NGFadequados também podem ser desenhados e sintetizados através de mode-lagem molecular de ligação de receptor de NGF, por exemplo, pelo métododescrito na Publicação de Patente Internacional No. WO 98/06048. Os aná-logos estruturais de NGF podem ser monômeros ou dímeros / oligômerosem qualquer combinação desejada das mesmas estruturas ou de estruturasdiferentes para obter efeitos biológicos e afinidades aprimorados.Em outras modalidades, a invenção proporciona um antagonistade NGF compreendendo no mínimo um mutante dominante-negativo do Tr-kA receptor e/ou p75 receptor. Uma pessoa versada na técnica pode prepa-rar mutantes dominantes-negativos de, por exemplo, o TrkA receptor de talmodo que o receptor ligará o NGF e, deste modo, agirá como um "sorvedou-ro" para capturar NGFs. Os mutantes dominantes-negativos, no entanto, nãoterão a bioatividade normal do TrkA receptor na ligação a NGF. Mutantesdominantes-negativos típicos incluem, mas não estão limitados a, os mutan-tes descritos nas seguintes referências: Li et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA1998, 95, 10884; Eide et al., J. Neurosci. 1996, 16, 3123; Liu et al., J. Neu-rosci 1997, 17, 8749; Klein et al., Cell 1990, 61, 647; Valenzuela et al., Neu-ron 1993, 10, 963; Tsoulfas et al., Neuron 1993, 10, 975; e Lamballe et al.,EMBO J. 1993, 12, 3083, cada uma das quais é incorporada aqui, a estepedido de patente, por meio de referência em sua totalidade. Os mutantesdominantes-negativos podem ser administrados em forma de proteína ousob a forma de um vetor de expressão de tal modo que o mutante dominantenegativo, por exemplo, TrkA receptor mutante, é expressado in vivo. A prote-ína ou vetor de expressão pode ser administrado usando quaisquer meiosconhecidos na técnica, tais como por via intraperitoneal, por via intravenosa,por via intramuscular, por via subeutânea, por via intratecal, por via intraven-tricular, por via oral, por via enteral, por via parenteral, por via intranasal, porvia dérmica, ou por inalação. Por exemplo, a administração de vetores deexpressão inclui administração local ou sistêmica, inclusive injeção, adminis-tração oral, pistola de partículas ou administração cateterizada, e adminis-tração tópica. Uma pessoa versada na técnica está familiarizada com a ad-ministração de vetores de expressão para obter a expressão de uma proteí-na exógena in vivo. Veja, por exemplo, as Patentes dos Estados UnidosNos. 6.436.908; 6.413.942; e 6.376.471.

Também pode ser usada a liberação orientada de composiçõesterapêuticas contendo um polinucleotídeo anti-sentido, vetor de expressão,ou polinucleotídeos subgenômicos. Técnicas de liberação de DNA mediadapor receptores são descritas, por exemplo, em Findeis et al., Trends Biote-chnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applica-tions Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol.Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem.(1991) 266:338. Composições terapêuticas contendo um polinucleotídeo sãoadministradas dentro de um alcance de cerca de 100 ng até cerca de 200mg de DNA para administração local em um protocolo de terapia genética.Em algumas modalidades, também podem ser usadas faixas de concentra-ção de cerca de 500 ng até cerca de 50 mg, cerca de 1 |ig até cerca de 2mg, cerca de 5 fig até cerca de 500 fig, e cerca de 20 \xg até cerca de 100ug de DNA ou mais durante um protocolo de terapia genética. Os polinucleo-tídeos e polipeptídeos terapêuticos da presente invenção podem ser libera-dos usando veículos de liberação genética. O veículo de liberação genéticapode ser de origem viral ou não viral (veja de modo geral, Jolly, Câncer Ge-ne Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Con-nelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; e Kaplitt, Nature Genetics (1994)6:148). A expressão de semelhantes seqüências codificantes pode ser indu-zida usando promotores e/ou intensificadores endógenos mamíferos ou he-terólogos. A expressão da seqüência codificante pode ser ou constitutiva ouregulada.

Vetores à base de vírus para liberação de um polinucleotídeodesejado e expressão em uma célula desejada são de conhecimento geralna técnica. Veículos à base de vírus típicos incluem, mas não estão limita-dos a, retrovírus recombinantes (veja, por exemplo, as Publicações de Pa-tente Internacional Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; as Patentes dos Es-tados Unidos Nos. 5. 219.740 e 4.777.127; a Patente da Grã Bretanha No.2.200.651; e a Patente Européia No. 0 345 242), vetore à base de alfavírus(por exemplo, vetores de Sindbis vírus, Semliki forest vírus (ATCC VR-67;ATCC VR-1247), Ross River vírus (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e vírusda encefalite eqüina da Venezuela (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCCVR 1249; ATCC VR-532)), e vírus adeno-associado (AAV) vectors (veja, porexemplo, as Publicações de Patente Internacional Nos. WO 94/12649, WO93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655).Também pode ser empragada a administração de DNA ligado a adenovírusmortos conforme descrito em Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147.

Também podem ser empragados veículos e métodos de libera-ção não viral, inclusive, mas não limitados a, DNA condensado policatiônicoligado ou não ligado a adenovírus morto somente (veja, por exemplo, Curiel,Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); DNA ligado a ligante (veja, por exemplo,Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); células veículos de liberação de célu-Ias eucarióticas (veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No.5.814.482; as Publicações de Patente Internacional Nos. WO 95/07994;WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338) e neutralização de carga nu-cléica ou fusão com membranas celulares. Também pode ser empragadoDNA nu. Métodos de introdução de DNA nu típicos são descritos na Publica-ção de Patente Internacional No. WO 90/11092 e na Patente dos EstadosUnidos No. 5.580.859. Lipossomas que podem agir como veículos de libera-ção genética são descritos na Patente dos Estados Unidos No. 5.422.120;nas Publicações de Patente Internacional Nos. WO 95/13796; WO 94/23697;WO 91/14445; e na Patente Européia No. 0524968. Abordagens adicionaissão descritas em Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411, e em Woffendin,Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91:1581.

Também é evidente que um vetor de expressão pode ser usadopara orientar a expressão de quaisquer dos antagonistas de NGF à base deproteína descritos aqui, (por exemplo, anticorpo anti-NGF, TrkA imunoadesi-na, e etc). Por exemplo, outros fragmentos de TrkA receptor que são capa-zes de bloquear (desde bloqueio parcial a completo) NGF e/ou uma ativida-de biológica de NGF são conhecidos na técnica.

Em outra modalidade, o antagonista de NGF compreende nomínimo uma TrkA imunoadesina. TrkA imunoadesinas conforme usado aqui,se referem a moléculas quiméricas solúveis compreendendo o domínio ex-tracelular de um TrkA receptor e uma seqüência de imunoglobulina, a qualconserva a especificidade de ligação do TrkA receptor (substancialmenteconserva a especificidade de ligação do trkA receptor) e é capaz de ligar aNGF.

TrkA imunoadesinas são conhecidas na técnica, e foi visto quebloqueiam a ligação de NGF ao TrkA receptor. Veja, por exemplo, a Patentedos Estados Unidos No. 6.153.189. Brennan et al. relatam a administraçãode TrkA imunoadesina em um modelo de dor pós-cirúrgica em rato. VejaSociety for Neuroscience Abstracts 24 (1-2) 880 (1998). Em uma modalida-de, a TrkA imunoadesina compreende uma fusão de uma seqüência de ami-noácidos de TrkA receptor (ou uma porção da mesma) de domínio extracelu-lar de TrkA capaz de ligar NGF (em algumas modalidades, uma seqüênciade aminoácidos que substancialmente conserva a especificidade de ligaçãodo trkA receptor) e uma seqüência de imunoglobulina. Em algumas modali-dades, o TrkA receptor é uma seqüência de TrkA receptor humano, e a fu-são é com uma seqüência de domínio constante de imunoglobulina. Em ou-tras modalidades, a seqüência de domínio constante de imunoglobulina éuma seqüência de domínio constante de imunoglobulina de cadeia pesada.Em outras modalidades, a associação de duas fusões de cadeia pesada deimunoglobulina-TrkA receptor (por exemplo, através de ligação covalente poruma ou mais ligações dissulfeto) resulta em uma estrutura semelhante a i-munoglobulina homodimérica. Uma cadeia leve de imunoglobulina pode seradicionalmente associada a uma ou ambas as quimeras TrkA receptor-imunoglobulina no dímero ligado a dissulfeto para produzir uma estruturahomotrimérica ou homotetramérica. Exemplos de TrkA imunoadesinas ade-quadas incluem as descritas na Patente dos Estados Unidos No. 6.153.189.

Em outra modalidade, o antagonista de NGF compreende nomínimo um anticorpo anti-TrkA capaz de bloquear, suprimir, alterar, e/ou re-duzir a interação física de NGF com o TrkA receptor e/ou sinalização a ju-sante, por meio da qual uma atividade biológica de NGF é reduzida e/oubloqueada. Anticorpos anti-TrkA são conhecidos na técnica. Anticorpos anti-TrkA típicos incluem os descritos nas Publicações de Patente InternacionalNos. WO 97/21732, WO 00/73344, WO 02/15924, e a Publicação de Patentedos Estados Unidos No. 2001/0046959.Em outra modalidade, o antagonista de NGF compreende nomínimo um anticorpo anti-p75 capaz de bloquear, suprimir e/ou reduzir ainteração física de NGF com o p75 receptor e/ou sinalização a jusante, pormeio da qual uma atividade biológica de NGF é reduzida e/ou bloqueada.

Em outra modalidade, o antagonista de NGF compreende nomínimo um inibidor de quinase capaz de inibir sinalização de quinase a ju-sante associada a atividade de TrkA e/ou p75 receptor. Um inibir de quinasetípico é K252a uo K252b, o qual é conhecido na técnica e descrito em Knu-sel et al., J. Neurochem. 59:715-722 (1992); Knusel et al., J. Neurochemistry57:955-962 (1991); Koizumi et al., J. Neuroscience 8:715-721 (1988); Hirataet al., Chemical Abstracts 111:728, XP00204135, veja sumário e 12th Collec-tive Chemical Substance Index, p. 34237, c. 3 (5-7), 55-60, 66-69), p. 34238,d (41-44), c.2 (25-27, 32-33), p. 3423, c.3 (48-50, 52-53); e a Patente dosEstados Unidos No. 6.306.849.

Espera-se que uma série de outras categorias de antagonistasde NGF venham ser identificadas caso buscadas pelo médico.Identificação de antagonistas de NGF (tais como anticorpos antagonistasanti-NGF)

NGF antagonistas, inclusive anticorpos antagonistas anti-NGF,podem ser identificados ou caracterizados usando métodos conhecidos natécnica, por meio dos quais é detectada e/ou medida a redução, melhora, ouneutralização da uma biológica atividade de NGF. Podem ser usados méto-dos descritos na publicação de patente internacional No. PCT WO04/065560. Outro método, por exemplo, um ensaio de ativação de receptorde quinase (KIRA) descrita nas Patentes dos Estados Unidos Nos.5.766.863 e 5.891.650, pode ser usado para identificar agentes anti-NGF.

Este ensaio tipo ELISA é adequado para medição qualitativa ou quantitativada ativação de quinase medindo a autofosforilação do domínio quinase deuma proteína tirosina quinase receptora (nas partes que se seguem "rPTK"),por exemplo, TrkA receptor, bem como para identificação e caracterizaçãode antagonistas potenciais de um rPTK selecionado, por exemplo, TrkA. Oprimeiro estágio do ensaio envolve fosforilação do domino quinase de umreceptor de quinase, por exemplo, um TrkA receptor, em que o receptor estápresente na membrana celular de uma célula eucariótica. O receptor podeser um receptor endógeno ou ácido nucléico codificando o receptor, ou umconstructo receptor, pode ser transformado dentro da célula. Tipicamente,uma primeira fase sólida (por exemplo, uma cavidade de uma primeira lâmi-na de ensaio) é revestida com uma população substancialmente homogêneade semelhantes células (geralmente uma linhagem celular de mamífero) demodo que as células aderem à fase sólida. Freqüentemente, as células sãoaderentes e deste modo aderem naturalmente à primeira fase sólida. Se forusado um "constructo receptor", geralmente compreende uma fusão de umreceptor de quinase e um polipeptídeo de etiqueta. O polipeptídeo de etique-ta é reconhecido pelo agente de captura, freqüentemente um anticorpo decaptura, na parte ELISA do ensaio. Um analisado, tal como um antagonistade NGF candidato (inclusive anticorpo antagonista anti-NGF) é em seguidaadicionado junto com NGF às cavidades tendo as células aderentes, de talmodo que o receptor de tirosina quinase (por exemplo, TrkA receptor) é ex-posto a (ou posto em contato com) NGF e o analito. Este ensaio possibilitaidentificação de antagonistas (inclusive anticorpos) que inibem a ativação deTrkA por seu NGF ligante. Depois de exposição a NGF e o analisado, ascélulas aderentes são solubilizadas usando um tampão de lise (o qual temum detergente solubilizante no mesmo) e suave agitação, deste modo libe-rando lisado celular o qual pode ser submetido à parte ELISA do ensaio dire-tamente, sem a necessidade de concentração ou clarificação do lisado celular.

O lisado celular preparado deste modo em seguida está pronto aser submetido ao estágio ELISA do ensaio. Como uma primeira etapa noestágio ELISA, uma segunda fase sólida (geralmente uma cavidade de umalâmina de microtítulo ELISA) é revestida com um agente de captura (fre-qüentemente um anticorpo de captura) o qual liga especificamente ao recep-tor de tirosina quinase, ou, no caso de um constructo receptor, ao polipeptí-deo finalizador. O revestimento da segunda fase sólida é realizado de modoque o agente de captura adere à segunda fase sólida. O agente de captura éde modo geral um anticorpo monoclonal, mas, conforme é descrito nos e-xemplos aqui, também podem ser usados anticorpos policlonais. O lisadocelular obtido é em seguida exposto a, ou contactado com, o agente de cap-tura aderente de modo que o receptor ou constructo receptor adere a (ou écapturado em) a segunda fase sólida. Em seguida é realizada uma etapa delavagem, de modo a remover o lisado celular não ligado, deixando o receptorou constructo receptor capturado. O receptor ou constructo receptor aderen-te ou capturado é em seguida exposto a, ou contactado com, um anticorpoantifosfotirosina o qual identifica resíduos tirosina fosforilados no receptor detirosina quinase. Em uma modalidade, o anticorpo antifosfotirosina é conju-gado (diretamente ou indiretamente) a uma enzima a qual catalisa uma alte-ração de cor de um reagente colorido não-radioativo. Por conseguinte, a fos-forilação do receptor pode ser medida por uma alteração de cor subseqüentedo reagente. A enzima pode ser ligada ao anticorpo antifosfotirosina direta-mente, ou uma molécula de conjugação (por exemplo, biotina) pode ser con-jugada ao anticorpo antifosfotirosina e a enzima pode ser em seguida ligadaao anticorpo antifosfotirosina através da molécula de conjugação. Finalmen-te, a ligação do anticorpo antifosfotirosina ao receptor ou constructo receptorcapturado é medida, por exemplo, por uma alteração de cor no reagente co-lorido.

Antagonistas de NGF (tais como anticorpo antagonista anti-NGF) também podem ser identificados incubando um agente candidato comNGF e monitorando qualquer uma ou mais das seguintes características: (a)ligação a NGF e inibição da atividade biológica de NGF ou caminhos a ju-sante mediados por função de sinalização de NGF; (b) inibição, bloqueio ouredução da ativação de receptores de NGF (inclusive dimerização e/ou auto-fosforilação de TrkA); (c) aumento da depuração de NGF; (d) tratamento ouprevenção de qualquer aspecto de dor da artrite reumatóide ou dor de oste-oartrite; (e) inibição (redução) da síntese, produção ou liberação de NGF.

Em algumas modalidades, um antagonista de NGF (por exemplo, um anti-corpo antagonista anti-NGF) é identificado incubando um agente candidatocom NGF e monitorando a ligação e/ou resultante redução ou neutralizaçãode uma atividade biológica de NGF. O ensaio de ligação pode ser realizadacom um ou mais polipeptídeos de NGF purificados, ou com células expres-sando naturalmente, ou transfectadas para expressar, um ou mais polipeptí-deos de NGF. Em uma modalidade, o ensaio de ligação é um ensaio de li-gação competitiva, onde a capacidade de um agente candidato (tal como umanticorpo) para competir com um anticorpo antagonista anti-NGF conhecidopara ligação de NGF é avaliada. O ensaio pode ser realizado em vários for-matos, inclusive o formato ELISA. Em outras modalidades, um antagonistade NGF (tais como anticorpo antagonista anti-NGF) é identificado incubandoum agente candidato com NGF e monitorando a ligação e inibição resultantede dimerização e/ou autofosforilação de trkA receptor.

Depois de identificação inicial, a atividade de um antagonistaanti-NGF candidato (tal como um anticorpo antagonista anti-NGF) pode seradicionalmente confirmada e refinada por bioensaios, que se sabe que tes-tam as atividades biológicas orientadas. Alternativamente, podem ser usa-dos bioensaios para triar candidatos diretamente. Por exemplo, NGF promo-ve uma série de alterações morfologicamente reconhecíveis em células res-ponsivas. Estes incluem, mas não estão limitados a, promover a diferencia-ção de células PC12 e reforçar o crescimento de neurites a partir destas cé-lulas (Greene et al., Proc Natl Acad Sei USA. 73(7):2424-8, 1976), promo-ver o crescimento excessivo de neurite a partir de explantes de gângliossimpáticos e sensoriais responsivos (Levi-Montalcini, R. and Angeletti, P.Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48:534-569, 1968) e promover a sobrevi-da de neurônios NGF dependentes tais como gânglio da raiz dorsal embrio-nária, gânglio trigeminal, ou neurônios de gânglios simpáticos (por exemplo,Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711, (1977); Buchman & Davies, Deve-lopment 118:989-1001 (1993). Portanto, o ensaio para inibição da atividadebiológica de NGF acarreta cultivar células responsivas a NGF com NGFmais um analisado, tal como um antagonista de NGF candidato (inclusiveanticorpo antagonista anti-NGF). Depois de um tempo apropriado a reaçãocelular será testada (diferenciação celular, crescimento excessivo de neuriteou sobrevida celular).A capacidade de um antagonista de NGF candidato (inclusiveanticorpo antagonista anti-NGF) para bloquear ou neutralizar uma biológicaatividade de NGF também pode ser avaliada monitorando a capacidade doagente candidato para inibir sobrevida mediated por NGF no bioensaio dasobrevida dos gânglios da raiz dorsal de rato embrionário conforme descritoem Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000).Composições para uso nos métodos da invenção

As composições usadas nos métodos da invenção (relativos ador da artrite reumatóide e dor de osteoartrite) compreendem uma quantida-de eficaz de um antagonista de NGF (tal como um anticorpo anti-NGF), e,em algumas modalidades, adicionalmente compreendem um excipiente far-maceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição é parauso em quaisquer dos métodos descritos aqui. Exemplos de semelhantescomposições, bem como formular, também são descritos em uma seção an-terior e abaixo. Em uma modalidade, a composição compreende um antago-nista de NGF. Em outra modalidade, a composição compreende um ou maisantagonistas de NGF. Em outra modalidade, a composição compreende umou mais antagonistas de NGF selecionados entre qualquer um ou mais dosseguintes : um antagonista (por exemplo, um anticorpo) que liga (interagefisicamente com) NGF, um antagonista que liga a um receptor de NGF (talcomo um TrkA e/ou p75 receptor), e um antagonista que reduz (impede e/oubloqueia) sinalização de receptor de NGF a jusante. Em ainda outras moda-lidades, a composição compreende qualquer antagonista de NGF que não éuma TrkA imunoadesina (isto é, é diferente de uma TrkA imunoadesina). Emoutras modalidades, a composição compreende qualquer antagonista deNGF que é diferente de um anticorpo anti-NGF. Em ainda outras modalida-des, a composição compreende qualquer antagonista de NGF que é diferen-te de uma TrkA imunoadesina e diferente de um anticorpo anti-NGF. Em ou-tras modalidades, um antagonista de NGF inibe (reduz) a síntese, produçãoou liberação de NGF. Em algumas modalidades, o antagonista de NGF ligaNGF e não tem reação cruzada significativamente com neurotrofinas rela-cionadas (tais como NT3, NT4/5, e/ou BDNF). Em algumas modalidades, oantagonista de NGF não está associado a uma reação imune adversa. Emalgumas modalidades, o antagonista de NGF é selecionado entre o grupoconsistindo em um anticorpo anti-NGF, uma molécula anti-sentido dirigidapara um NGF (inclusive uma molécula anti-sentido dirigida para um ácidonucléico codificando NGF), uma molécula anti-sentido dirigida para um re-ceptor de NGF (tal como TrkA e/ou p75), um composto inibidor de NGF, umanálogo estrutural de NGF, uma mutação dominante-negativa de um TrkAreceptor que liga um NGF, uma TrkA imunoadhesina, um anticorpo anti-TrkA, um anticorpo anti-p75 e um inibidor de quinase. Em outra modalidade,o antagonista de NGF é um anticorpo anti-NGF. Em outras modalidades, oanticorpo anti-NGF reconhece NGF humano. Em algumas modalidades, oanticorpo anti-NGF é humano. Em ainda outras modalidades, o anticorpoanti-NGF é humanizado (tal como anticorpo E3 descrito aqui). Em ainda ou-tra modalidade, o anticorpo anti-NGF compreende uma região constante quenão inicia um processo de uma reação imune indesejada ou indesejável, talcomo lise mediada por anticorpo ou ADCC. Em outras modalidades, o anti-corpo anti-NGF compreende uma ou mais CDRs do anticorpo E3 (tais comouma, duas, três, quatro, cinco, ou, em algumas modalidades, todas as seisCDRs de E3).

Entende-se que as composições podem compreender mais deum antagonista de NGF. Por exemplo, uma composição pode compreendermais de um membro de uma classe de antagonista de NGF (por exemplo,uma mistura de anticorpos anti-NGF que reconhecem diferentes epitopos deNGF), bem como membros de diferentes classes de antagonistas de NGF(por exemplo, um anticorpo anti-NGF e um composto inibidor de NGF). Ou-tras composições típicas compreendem mais de um anticorpos anti-NGF quereconhece o mesmo um ou mais epitopos, diferentes espécies de anticorposanti-NGF que ligam a diferentes epitopos de NGF, ou diferentes compostosinibidores de NGF.

A composição usada na presente invenção pode compreenderadicionalmente veículos, excipientes, ou estabilizantes farmaceuticamenteaceitáveis (Remington: The Science and Practice oi Pharmacy 20th Ed.(2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover.), sob a forma deformulações liofilizadas ou soluções aquosas. Excipientes farmaceuticamen-te aceitáveis são adicionalmente descritos aqui.

O antagonista de NGF e composições dos mesmos também po-dem ser usados em combinação com outros agentes que servem para refor-çar e/ou complementar a eficácia dos agentes. Para dor de osteoartrite, an-tagonista de NGF pode ser administrado em combinação com um ou maisanalgésicos diversos, NSAIDS, ou esteróides. Analgésicos incluem, mas nãoestão limitados a, acetaminofen, tramadol, capsaicina (tópica). Exemplos deNSAIDS são salicilatos acetilados inclusive aspirina; salicilatos não acetila-dos inclusive salsalato, diflunisal; ácidos acéticos inclusive etodolac, diclofe-nac, indometacina, cetorolac, nabumetona; ácidos propiônicos inclusive fe-noprofen, flurbiprofen, ibuprofen, cetoprofen, naproxen, sódio naproxen, o-xaprozin; fenamatos inclusive meclofenamato, ácido mefenâmico; fenilbuta-zona, piroxicam; inibidores de COX-2 inclusive celecoxib, etoricoxib, valde-coxib, rofecoxib, lumiracoxib. Um exemplo de esteróides é corticosteróidesintraarticulares (lACs).

Para tratar a dor da artrite reumatóide, antagonista de NGF podeser administrado em combinação com um ou mais analgésicos diversos,NSAIDS, corticosteróides (por exemplo, prednisona), ou outros fármacosanti-reumáticos modificadores da doença. Exemplos de fármacos anti-reumáticos modificadores da doença são metotrexato, hidroxicloroquina, sul-fasalazina, leflunomida, inibidores de TNF, receptor de interleuquina-1 solú-vel, conjugados de ouro, agentes citotóxicos (azatiprina, ciclofosfamida, ci-closporina A).

Administração de um antagonista de NGF (tal como um anticorpo antagonis-ta anti-NGF)

O antagonista de NGF (tal como anticorpo antagonista anti-NGF)pode ser administrado a um indivíduo (para artrite reumatóide e osteoartrite)através de qualquer via adequada. Deve ser evidente para a pessoa versadana técnica que não se pretende que os exemplos descritos aqui, sejam limi-tantes porém ilustrativos das técnicas disponíveis. Por conseguinte, em al-gumas modalidades, o antagonista de NGF (tal como anticorpo antagonistaanti-NGF) é administrado a um indivíduo de acordo com métodos conheci-dos, tais como administração intravenosa, por exemplo, como um bólus oupor infusão contínua durante um período de tempo, por via intramuscular,intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-artieular, por via sublin-gual, intrassinovial, através de insuflação, intratecal, oral, inalação ou viatópica. A administração pode ser sistêmica, por exemplo, administração in-travenosa, ou localizada. Nebulizadores disponíveis comercialmente paraformulações líquidas, inclusive nebulizadores de jato e nebulizadores ultras-sônicos são úteis para administração. As formulações líquidas podem serdiretamente nebulizadas e pó liofilizado pode ser nebulizado depois de re-constituição. Alternativamente, antagonista de NGF (tais como anticorpo an-tagonista anti-NGF) podem ser aerosolizados usando uma formulação defluorocarbono e um inalador de dose dimensionada, ou inalada como um póliofilizado e triturado.

Em uma modalidade, um antagonista de NGF (tal como um anti-corpo antagonista anti-NGF) é administrado através de técnicas de liberaçãolocal orientada ou sítio-específicas. Exemplos de técnicas de liberação localorientada ou sítio-específicas incluem várias fontes de depósitos implantá-veis do antagonista de NGF (tal como anticorpo antagonista anti-NGF) oucatéteres de liberação local, tais como catéteres de infusão, um cateter resi-dente, ou um cateter de agulha, enxertos sintéticos, revestimentos adventí-cios, derivações e fios ou outros dispositivos implantáveis, veículos sítio es-pecíficos, injeção direta, ou aplicação direta. Veja, por exemplo, a Publica-ção de Patente Internacional No. WO 00/53211 e a Patente dos Estados U-nidos No. 5.981.568.

Várias formulações de um antagonista de NGF (tal como um an-ticorpo antagonista anti-NGF) podem ser usadas para administração. Emalgumas modalidades, o antigonista de NGF (por exemplo, anticorpo anta-gonista anti-NGF) pode ser administrado puro. Em algumas modalidades, oantagonista de NGF (por exemplo, anticorpo antagonista anti-NGF) e umexcipiente farmaceuticamente aceitável pode ser em várias formulações.Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica, e sãosubstâncias relativamente inertes que facilitam a administração de umasubstância farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode darforma ou consistência, ou agir como um diluente. Excipientes adequadosincluem mas não estão limitados a agentes estabilizantes, agentes umectan-tes e emulsificantes, sais para variar a osmolaridade, agentes encapsulan-tes, tampões, e intensificadores da penetração na pele. Excipientes bemcomo formulações para liberação de fármacos parenterais e não-parenteraissão determinaddos em Remington, The Science and Practice of Pharmacy20th Ed. Mack Publishing (2000).

Em algumas modalidades, estes agentes são formulados paraadministração por injeção (por exemplo, por via intraperitoneal, por via intra-venosa, por via subcutânea, por via intramuscular, e etc). Por conseguinte,estes agentes podem ser combinados com veículos farmaceuticamente acei-táveis tais como solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, esemelhantes. O regime de dosagem em particular, isto é, dose, momento erepetição, dependerá do indivíduo em particular e do histórico médico da-quele indivíduo.

Um anticorpo anti-NGF pode ser administrado usando qualquermétodo adequado, inclusive por injeção (por exemplo, por via intraperitoneal,por via intravenosa, por via subcutânea, por via intramuscular, e etc). Anti-corpos anti-NGF também podem ser administrados através de inalação, con-forme descrito aqui. De modo geral, para administração de anticorpos anti-NGF, uma dosagem candidata inicial pode ser cerca de 2 mg/kg. Para osfins da presente invenção, uma dosagem diária típica pode variar a partir decerca de qualquer de 0,1 ug/kg a 1 ug/kg a 3 ug/kg a 30 ug/kg a 300 ug/kg a3 mg/kg, a 30 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencio-nados acima. Por exemplo, um anticorpo anti-NGF pode ser administrado acerca de 1 ug/kg, cerca de 10 ug/kg, cerca de 20 ug/kg, cerca de 50 ug/kg,cerca de 100 ug/kg, cerca de 200 ug/kg, cerca de 500 ug/kg, cerca de 1mg/kg, ou cerca de 2 mg/kg. Para administrações repetidas durante váriosdias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento é sustentadoaté ocorrer uma supressão de sintomas desejada ou até serem atingiros ní-veis terapêuticos suficientes para reduzir a dor. Um regime de dosagem típi-co compreende administrar uma dose inicial de cerca de 2 mg/kg, seguidapor uma dose de manutenção semanal de cerca de 1 mg/kg do anticorpoanti-NGF, ou seguida por uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg acada duas semana. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser Ci-teis, dependendo do padrão de decomposição farmacocinética que o médicopretende obter. Por exemplo, em algumas modalidades, é contemplada do-sagem de uma a quatro vezes por semana . Pode ser usada dosagem aindamenos freqüente. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF é admi-nistrado uma vez a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, a cada 4 semanas,a cada 5 semanas, a cada 6 semanas, a cada 7 semanas, a cada 8 sema-nas, a cada 9 semanas, a cada 10 semanas, a cada 15 semanas, a cada 20semanas, a cada 25 semanas, ou mais tempo. Em algumas modalidades, oanticorpo anti-NGF é administrado uma vez a cada 1 mês, a cada 2 meses,a cada 3 meses, a cada 4 meses, a cada 5 meses, a cada 6 meses, ou maistempo. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de téc-nicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem (inclusive o um oumais antagonistas de NGF usados) pode variar com o tempo.

Estudos realizados em pacientes com dor moderada a grave deosteoartrite do joelho (resumidos no Exemplo 9) demonstraram que dosa-gens dentro do alcance de 3 a 300 ug/kg proporcionaram alívio da dor pordurações variáveis. Todas as dosagens testadas (3, 10, 30, 100, e 300ug/kg) produziram uma redução na dor por no mínimo 7 dias; maiores dosa-gens resultaram em alívio prolongado da dor de no mínimo 28 dias (Figura24). Uma dose de 100 ug/kg produziu alívio da dor por no mínimo 80 dias(Figura 25).

Em geral, quando não é um anticorpo, um antagonista de NGF(em algumas modalidades) pode ser administrado no índice de cerca de 0,1a 300 mg/kg do peso do paciente dividido em uma a três doses, ou conformedescrito aqui. Em algumas modalidades, para um paciente adulto de pesonormal, podem ser administradas doses variando a partir de cerca de 0,3 a5.00 mg/kg. O regime de dosagem em particular, isto é, dose, momento erepetição, dependerão do indivíduo em particular e do histórico médico doindivíduo, bem como as propriedades dos agentes individuais (tais como ameia-vida do agente, e outras considerações de conhecimento geral na téc-nica).

Para os fins da presente invenção, a dosagem apropriada de umantagonista de NGF (inclusive um anticorpo antagonista anti-NGF) depende-rá do antagonista de NGF (ou composições do mesmo) empregado, do tipoe da gravidade da dor a ser tratada, ser o agente é administrado para finspreventivos ou terapêuticos, terapia prévia, do histórico clínico do paciente eda reação ao agente, e do critério do médico assistente. Tipicamente o mé-dico administrará um antagonista de NGF (por exemplo, anticorpo antagonis-ta anti-NGF), até ser atingida uma dosagem que obtém o resultado deseja-do. A dose e/ou freqüência podem variar durante o curso do tratamento.

Considerações empíricas, tais como a meia-vida, geralmentecontribuirão para a determinação da dosagem. Por exemplo, anticorpos quesão compatíveis com o sistema imune humano, tais como anticorpos huma-nizados ou anticorpos totalmente humanos, podem ser usados para prolon-gar a meia-vida do anticorpo e para evitar que o anticorpo seja atacado pelosistema imune do hospedeiro. A freqüência da administração pode ser de-terminada e ajustada durante o curso da terapia, e geralmente, mas não ne-cessariamente, se baseia no tratamento e/ou na supressão e/ou melhorae/ou retardo da dor. Alternativamente, podem ser apropriadas formulaçõesde liberação contínua sustentada de antagonistas de NGF (por exemplo,anticorpos antagonistas anti-NGF). Várias formulações e dispositivos paraobter liberação sustentada são conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, as dosagens para um antagonista de NGF(por exemplo, anticorpo antagonista anti-NGF) podem ser determinadas em-piricamente em indivíduos aos quais foram administradas uma ou mais ad-ministrações de um antagonista de NGF. Aos indivíduos são administradasdosagens incrementais de um antagonista de NGF (por exemplo, um anti-corpo antagonista anti-NGF). Para avaliar a eficácia de um antagonista deNGF (por exemplo, anticorpo antagonista anti-NGF), pode ser seguido umindicador de dor.

A administração de um antagonista de NGF (por exemplo, umanticorpo antagonista anti-NGF) de acordo com o método na presente in-venção pode ser contínuo ou intermitente, dependendo, por exemplo, dacondição fisiológica do receptor, se a finalidade da administração é terapêu-tica ou profilática, e de outros fatores conhecidos dos profissionais versados.

A administração de uma antagonista de NGF (por exemplo, um anticorpoantagonista anti-NGF) pode ser essencialmente contínua durante um perío-do de tempo pré-selecionado ou pode ser em uma série dose espaçada, porexemplo, ou antes, durante, ou depois do desenvolvimento da dor; antes;durante; antes e depois; durante e depois; antes e durante; ou antes, duran-te, e depois do desenvolvimento da dor.

Em algumas modalidades, mais de um antagonista de NGF, taiscomo um anticorpo antagonista anti-NGF, podem estar presentes. No míni-mo um, no mínimo dois, no mínimo três, no mínimo quatro, no mínimo cinco,ou mais antagonistas de NGF diferentes (por exemplo, anticorpos antagonis-tas anti-NGF) podem estar presentes. Geralmente, os antagonistas de NGF(tais como anticorpos antagonistas anti-NGF) têm atividades complementa-res que não afetam de modo adverso umas às outras. Antagonistas de NGFtambém podem ser usados em combinação com outros agentes que servempara reforçar e/ou complementar a eficácia dos agentes.

Formulações terapêuticas do antagonista de NGF (por exemplo,anticorpo antagonista anti-NGF) usadas de acordo com a presente invençãosão preparadas para armazenamento misturando um antagonista de NGF(por exemplo, um anticorpo) tendo o grau desejado de pureza com veículos,excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Re-mington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing(2000)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veícu-los, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não-tóxicos para os recepto-res nas dosagens e concentrações empregadas, e podem compreendertampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; sais tais comocloreto de sódio; antioxidantes inclusive ácido ascórbico e metionina; preser-vantes (tais como cloreto de amônio de octadecildimetilbenzila; cloreto dehexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcoolbenzílico ou butílico; alquila parabenos, tais como metila ou propila parabe-no; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeosde baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos) ; proteínas, taiscomo albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicostais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, as-paragina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, eoutros carboidratos inclusive glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelan-tes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sor-bitol; contra-íons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos(por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos taiscomo TWEENTM, PLURONICSTM ou polietileno glicol (PEG).

Lipossomas contendo o antagonista de NGF (tal como anticorpoantagonista anti-NGF) são preparados por meio de métodos conhecidos natécnica, tal como descrito em Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 77:4030 (1980); enas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomascom tempo de circulação reforçado são descritos na Patente dos EstadosUnidos No. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser produzi-dos pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição delipídeos compreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolaminaderivada e PEG (PEG-PE). Lipossomas são extrusados através de filtros detamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado.

Os ingredientes ativos também podem ser capturados em micro-cápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por po-limerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de gelatina ou hidroxime-tilcelulose e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, emsistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, mi-croesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ouem macroemulsões. As técnicas referidas são descritas em Remington, TheScience and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas.

Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem ma-trizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antago-nista (tal como o anticorpo), cujas matrizes estão sob a forma de artigos mo-delados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes deliberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietila-metacrilato), ou 'poli(vinila álcool)), polilactidas (Patente dos Es-tados Unidos. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etila-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não degradável, copolímeros de ácidoláctico-ácido glicólico degradáveis tais como o LUPRON DEPOT TM (micro-esferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico eacetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarose, e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a serem usadas para administração in vivo de-vem ser estéreis. Isto é prontamente realizado, por exemplo, por filtraçãoatravés de membranas de filtração estéreis. Composições terapêuticas deantagonista de NGF (por exemplo, anticorpo antagonista anti-NGF) são ge-ralmente colocadas dentro de um recipiente tendo uma porta de acesso es-térila, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa tendo umarolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

As composições de acordo com a presente invenção podem es-tar em formas de unidade de dosagem tais como comprimidos, pílulas, cáp-sulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões, ou supositórios, para admi-nistração oral, parenteral ou retal, ou administração por inalação ou insufla-ção.

Para preparar composições sólidas tais como comprimidos, oingrediente ativo principal é misturado com um veículo farmacêutico, por e-xemplo, ingredientes para fabricação de tabletes convencionais tais comoamido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearatode magnésio, fosfato dicálcico ou gomas, e outros diluentes farmacêuticos,por exemplo, água, para formar uma composição de pré-formulação sólidacontendo uma mistura homogênea de um composto da presente invenção,ou um sal farmaceuticamente aceitável não-tóxico do mesmo. Ao se referir aestas composições de pré-formulações como homogêneas, se indica que oingrediente ativo é dispersado uniformemente por toda a composição demodo que a composição pode ser prontamente subdividida em formas deunidade de dosagem igualmente eficazes tais como comprimidos, pílulas ecápsulas. Esta composição de pré-formulação sólida é em seguida subdivi-dida em formas de unidade de dosagem do tipo descrito acima contendo apartir de 0,1 até cerca de 500 mg do ingrediente ativo da presente invenção.Os comprimidos ou pílulas da nova composição podem ser revestidos oucompostos de outro modo para proporcionar uma forma de dosagem propor-cionando a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido oupílula pode compreender uma dosagem interna e um componente de dosa-gem externa, o último estando sob a forma de um envoltório sobre o prece-dente. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entéri-ca que serve para resistir a desintegração no estômago e permite que ocomponente interno passe intacto para dentro do duodeno ou tenha a libera-ção retardada. Uma variedade de materiais pode ser usada para semelhan-tes camadas ou revestimentos entéricos, semelhantes materiais inclusiveuma série de ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com mate-riais tais como goma-laca, álcool cetílico e acetato celulósico.

Agentes tensoativos adequados incluem, em particular, agentesnão-iônicos, tais como sorbitanos de polioxietileno (por exemplo, TweenTM20, 40, 60, 80 ou 85) e outros sorbitanos (por exemplo, SpanTM 20, 40, 60,80 ou 85). Composições com um agente tensoativo convenientemente com-preenderão entre 0,05 e 5% de agente tensoativo, e podem ser entre 0,1 e2,5%. Será reconhecido que outros ingredientes podem ser adicionados, porexemplo manitol ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, caso ne-cessário.

Emulsões adequadas podem ser preparadas usando emulsõesde gordura disponíveis comercialmente, tais como IntralipidTM, LiposynTM,InfonutrolTM, LipofundinTM e LipiphysanTM. O ingrediente ativo pode ser oudissolvido em uma composição de emulsão pré-misturada ou alternativa-mente pode ser dissolvido em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo deaçafrão, óleo de algodão, óleo de gergelim, óleo de milho ou óleo de amên-doas) e uma emulsão formada na mistura com um fosfolipídeo (por exemplo,fosfolipídeos de ovo, fosfolipídeos de soja ou lecitina de soja) e água. Seráreconhecido que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo,glicerol ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão. Emulsões adequa-das tipicamente conterão até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%. Aemulsão de gordura pode compreender gotículas de gordura entre 0,1 e 1,0.lm, particularmente 0,1 e 0,5 .lm, e têm um pH dentro do alcance de 5,5 a8,0.

As composições de emulsões podem ser aquelas preparadasmisturando um antagonista de NGF (tal como um anticorpo de fator de cres-cimento nervoso) com IntralipidTM ou os componentes do mesmo (óleo desoja, fosfolipídeos de ovo, glicerol e água).

Composições para inalação ou insuflação incluem soluções esuspensões em solventes aquosos ou orgânicos farmaceuticamente aceitá-veis, ou misturas dos mesmos, e pós. As composições líquidas ou sólidaspodem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados confor-me determinado acima. Em algumas modalidades, as composições são ad-ministrados pela via oral ou nasal respiratória para efeito local ou sistêmico.

Composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis preferencialmenteestéreis podem ser nebulizadas por uso de gases. Soluções nebulizadaspodem ser aspiradas diretamente do dispositivo de nebulização ou o disposi-tivo de nebulização pode ser fixado a uma máscara facial, dreno ou máquinade respiração por pressão positiva intermitente. Composições em solução,suspensão ou pó podem ser administradas, preferencialmente por via oralou por via nasal, a partir de dispositivos os quais liberam a formulação emuma maneira apropriada.

A eficácia do tratamento pode ser avaliada por métodos de co-nhecimento geral na técnica.KITS COMPREENDENDO ANTICORPOS E POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO

A invenção também proporciona kits compreendendo anticorposou polipeptídeos para uso na detecção e/ou terapia. Por conseguinte, emalgumas modalidades, os kits compreendem um anticorpo E3. Em algumasmodalidades, o kit compreende qualquer anticorpo ou polipeptídeo descritoaqui.

Em outros aspectos, os kits podem ser usados para quaisquerdos métodos descritos aqui, inclusive, por exemplo, para tratar um indivíduocom dor (inclusive dor pós-cirúrgica, dor da artrite reumatóide, e dor de oste-oartrite). Os kits desta invenção estão dentro de embalagem adequada, eopcionalmente podem proporcionar componentes adicionais tais como, tam-pões e instruções para uso do anticorpo em quaisquer dos métodos descri-tos aqui. Em algumas modalidades, os kits incluem instruções para tratardor. Em algumas modalidades, o kit compreende um anticorpo antagonistaanti-NGF descrito aqui, e instruções para tratar e/ou prevenir a dor da artritereumatóide em um indivíduo. Em outras modalidades, o kit compreende umantagonista de NGF (tal como um anticorpo antagonista anti-NGF) descritoaqui, e instruções para tratar e/ou prevenir a dor de osteoartrite em um indi-víduo. Em algumas das modalidades, o anticorpo antagonista anti-NGF éanticorpo E3.

Em outro aspecto, a invenção proporciona kits compreendendoum polinucleotídeo codificando um polipeptídeo E3 conforme descrito aqui.Em algumas modalidades, os kits adicionalmente compreendem instruçõespara uso do polinucleotídeo em quaisquer dos métodos descritos aqui.

MÉTODOS PARA AJUSTAR A AFINIDADE DE UM ANTICORPO E MÉTO-DOS PARA CARACTERIZAR UM CDR

Foi desenvolvido um novo método para caracterizar uma CDRde um anticorpo e/ou alterar (tal como melhorando) a afinidade de ligação deum polipeptídeo, tal como um anticorpo, denominado "mutagênese de varre-dura de bibliotecas". Geralmente, a mutagênese de varredura de bibliotecasfunciona como se segue. Uma ou mais posições de aminoácidos na CDRsão substituídas com dois ou mais (tais como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, .14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20) aminoácidos usando métodos reconheci-dos na técnica. Isto produz pequenas bibliotecas de clones (em algumasmodalidades, uma para cada posição de aminoácido que é analisado), cadaum com uma complexidade de dois ou mais membros (se dois ou mais ami-noácidos são substituídos em cada posição). De modo geral, a bibliotecatambém inclui um clone compreendendo o aminoácido nativo (não substituí-do). Um pequeno número de clones, por exemplo, cerca de 20 a 80 clones(dependendo da complexidade da biblioteca), de cada biblioteca são triadospara afinidade de ligação ao polipeptídeo alvo, e são identificados candida-tos com aumento da ligação, a mesma ligação, ligação reduzida ou nenhu-ma ligação. Os métodos para determinar a afinidade de ligação são de co-nhecimento geral na técnica. Em algumas modalidades, a afinidade de liga-ção é determinada usando análise de ressonância de plasmon superficialBlAcore, a qual detecta diferenças na afinidade de ligação de cerca de 2 ve-zes ou mais. BlAcore é particularmente útila quando o anticorpo de partida jáliga com uma afinidade relativamente alta, por exemplo uma KD de cerca de10 nM ou menos. Triagem usando ressonância de plasmon superficial BlA-core é descrita nos Exemplos, aqui.

Em outras modalidades, a afinidade de ligação é determinadausando Kinexa Biocensor, ensaios de proximidade de cintilação, ELISA, i-munoensaio ORIGEN (IGEN), extinção de fluorescência, transferência defluorescência, e/ou "display" de levedura. Em outras modalidades, a afinida-de de ligação é tríada usando um bioensaio adequado.

Em algumas modalidades, cada posição de aminoácido em umaCDR é substituída (em algumas modalidades, uma de cada vez) com todosos 20 aminoácidos naturais usando métodos de mutagênese reconhecidosna ténica (alguns dos quais são descritos aqui). Isto gera pequenas bibliote-cas de clones (em algumas modalidades, uma para cada posição de amino-ácido que é analisada), cada uma com uma complexidade de 20 membros(se todos os 20 aminoácidos são substituídos em cada posição).

Em algumas modalidades, a biblioteca a ser triada compreendesubstituições em duas ou mais posições, as quais podem estar na mesmaCDR ou em duas ou mais CDRs. Portanto, em algumas modalidades, a bi-blioteca compreende substituições em duas ou mais posições em uma CDR.

Em outras modalidades, a biblioteca compreende substituição em duas oumais posições em duas ou mais CDRs. Em ainda outras modalidades, a bi-blioteca compreende substituição em 3, 4, 5, ou mais posições, as referidasposições encontradas em duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs. Em algu-mas modalidades, a substituição é preparada usando códons de baixa re-dundância. Veja, por exemplo, a Tabela 2 de Balint et al. , (1993) Gene137(1):109-18).

Em algumas modalidades, a CDR é CDRH3 e/ou CDRL3. Emoutras modalidades, a CDR é uma ou mais de CDRL1, CDRL2, CDRL3,CDRH1, CDRH2, e/ou CDRH3. Em algumas modalidades, a CDR é umaCDR de Kabat, uma CDR de Chothia, ou uma CDR estendida.

Candidatos com aprimorada ligação podem ser seqüenciados,deste modo identificando um mutante de substituição de CDR o qual resultaem aprimorada afinidade (também denominada uma substituição "aprimora-da"). Por exemplo, conforme demonstrado no Exemplo 1, o uso deste méto-do permitiu identificação de uma única substituição a qual melhorou a liga-ção, mesmo quando umas 18 substituições diferentes estimadas na mesmaposição de aminoácidos resultou em nenhuma ligação (isto é, perda da fun-ção do anticorpo). Candidatos que ligam também podem ser seqüenciados,deste modo identificando uma substituição de CDR a qual conserva ligação.

Em algumas modalidades, são conduzidas múltiplas rodadas detriagem. Por exemplo, candidatos (cada um compreendendo uma substitui-ção de aminoácido em uma ou mais posição de uma ou mais CDRs) comaprimorada ligação também são úteis para o desenho de uma segunda bibli-oteca contendo no mínimo o aminoácido original e substituído em cada posi-ção de CDR aprimorada (isto é, posição de aminoácido na CDR na qual ummutante de substituição apresentou ligação aprimorada). A preparação, etriagem ou seleção desta biblioteca são discutidas adicionalmente abaixo.

Mutagênese de triagem de bibliotecas também proporciona ummeio para caracterizar uma CDR, na medida que a freqüência de clonescom ligação aprimorada, a mesma ligação, ligação reduzida ou nenhumaligação também proporciona informação referente à importância de cadaposição de aminoácido para a estabilidade do complexo antígeno-anticorpo.Por exemplo, se uma posição da CDR conserva ligação quando alteradapara todos os 20 aminoácidos, esta posição é identificada como uma posi-ção que é improvável de ser necessária para ligação de antígeno. Ao invés,se uma posição de CDR conserva ligação em somente uma pequena per-centagem de substituições, esta posição é identificada como uma posiçãoque é importante para a função de CDR. Portanto, os métodos de mutagê-nese de triagem de bibliotecas geram informação referente às posições nasCDRs que podem ser alteradas para muitos aminoácido diferentes (inclusivetodos os 20 aminoácidos), e posições nas CDRs as quais não podem seralteradas ou as quais somente podem ser alteradas para uns poucos amino-ácidos. Este aspecto é discutido e exemplificado no Exemplo 1.

Em algumas modalidades, candidatos com aprimorada afinidadesão combinados em uma segunda biblioteca, a qual inclui o aminoácido a-primorado, o aminoácido original nesta posição, e pode incluir adicionalmen-te substituições adicionais nesta posição, dependendo da complexidade dabiblioteca que é desejada, ou permitida usando o método de triagem ou se-leção desejado. Além disso, caso desejado, a posição do aminoácido adja-cente pode ser randomizado para no mínimo dois ou mais aminoácidos. Arandomização de aminoácidos adjacentes pode permitir flexibilidade confor-macional adicional no CDR mutante, o qual pode, por sua vez, permitir oufacilitar a introdução de um grande número de mutações aprimoradas. Emalgumas modalidades, a biblioteca também compreende substituição nasposições que não mostram aprimorada afinidade na primeira rodada de triagem.

A segunda biblioteca é triada ou selecionada para membros dabiblioteca com afinidade de ligação aprimorada e/ou alterada usando qual-quer método conhecido na técnica, inclusive triagem usando análise de res-sonância de plasmon superficial BlAcore, e seleção usando qualquer métodoconhecido na técnica para seleção, inclusive "display" de fago, "display" delevedura, e "display" de ribossoma.

Vantagens dos métodos para ajustar a afinidade de um anticorpo e caracte-rizar um CDR

Os métodos são úteis para pré-triagem de posições de aminoá-cido de CDR de modo a identificar substituições de aminoácidos que melho-ram a ligação ou conservam a ligação. A pré-identificação de importantesresíduos, substituições que melhoram a ligação e/ou substituições que con-servam a função de anticorpos permite eficiente desenho e triagem de umabiblioteca de maturação de afinidade.

O presente método também é útila para caracterizar um CDR, eproporciona informação completa referente à importância de cada posiçãode aminoácido em uma CDR para ligação a antígeno. O presente métodotambém pode ser usado para identificar substituições que melhoram a liga-ção.

O uso de pequenas bibliotecas, nas quais cada posição pode serrandomizada (em algumas modalidades, uma de cada vez), permite triagemde mutantes de substituição usando métodos sensíveis tais como BlAcoreos quais proporcionam informação cinética detalhada. Métodos de triagemgeralmente não são práticos quando são tríadas bibliotecas maiores. Ao in-vés, métodos de seleção, tais como "display" de fago, "display" de levedura,e "display" de ribossoma, são comumente usados para identificar clones queconservam ligação, "display" de fago e ensaios ELISA podem depender for-temente da concentração da amostra de proteínas preparada a partir do clo-ne, e portanto tendem a ser fortemente tendenciosos para clones que têmaumento da expressão, aumento da estabilidade, ou redução da toxicidade,ao invés de identificar clones com aumento da afinidade de ligação. Alémdisso, diferenças no nível de expressão dos clones podem mascarar peque-nas melhoras na afinidade de ligação. Estas desvantagens são particular-mente agudas quando um anticorpo com alta afinidade de ligação é usadocomo a material de partida, porque devem ser usados níveis muito baixos deantígeno de modo à triagem ser suficientemente estringente.Em contraste, os métodos da invenção, tais como randomizaçãoem cada posição (em algumas modalidades, uma posição de cada vez),permite introdução e caracterização do efeito da substituição de, por exem-plo, todos os 20 aminoácidos em uma dada posição. Esta análise proporcio-na informação quanto a como muitas substituições em uma dada posiçãosão toleradas (isto é, conservam ligação de anticorpo), a qual por sua vez,proporciona informações relativas à importância de cada aminoácido para afunção do anticorpo. Além disso, podem ser identificadas substituições queresultam em ligação aprimorada, mesmo sob circunstâncias nas quais mui-tas ou a maior parte das substituições em uma dada posição produzem anti-corpos não funcionais (não ligantes). Em contraste, mutagênese de varredu-ra de alanina, a qual é comumente usada para identificar posições de CDRimportantes, proporciona informação relativa a se a substituição da alaninapermite ou evita ligação. Geralmente, posições nas quais uma substituiçãode alanina evita ligação são removidas da biblioteca de maturação de afini-dade. Em muitos casos, no entanto, a alanina pode ser um substituto insatis-fatório na posição de CDR.

Os presentes métodos também permitem identificação e carac-terização do efeito de mutações de CDR única. Em contraste, métodos taiscomo "display" de fago introduzem e selecionam muitas mutações simulta-neamente, e deste modo aumentam potencialmente o risco de que muta-ções positivas serão mascaradas pela presença de uma mutação prejudicialpresente em um clone em particular.

Os presentes métodos também são úteis para melhorar a afini-dade ao mesmo tempo que conservando a especificidade de ligação do anti-corpo original (de partida), à medida que os presentes métodos permitamidentificação de pequenos números de mutações (por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou5 mutações em uma única CDR) que resultam em aprimorada afinidade deligação. Em contraste, métodos tais como "display" de fago tipicamente me-lhoram a afinidade de ligação usando múltiplas mutações de um a vez, asquais podem resultar em mudança da especificidade do anticorpo e/ou au-mento indesejável da reatividade cruzada.Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar, masnão limitar, a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Humanização e maturação de afinidade de anticorpo antagonistaanti-NGF de camundongo 911

A. Métodos gerais

Foram usados os métodos gerais seguintes neste exemplo.

Produção de biblioteca

Bibliotecas foram geradas por mutagênese de cassete de PCRcom oligonucleotídeos degenerados conforme descrito em Kay et al. (1996),Phage "displav" of peptids and proteins : a laboratory manual. San Diego,Academic Press (veja, páginas pg 277-291). O códon de doping NNK foi u-sado para randomizar uma posição de aminoácido para incluir 20 aminoáci-dos possíveis. Para randomizar uma posição de aminoácido para incluir so-mente um subgrupo de aminoácidos com propriedades específicas, códonsde doping foram usados conforme descrito em Balint et al, (1993) Gene137(1):109-18). Foi realizada mutagênese sítio dirigida usando PCR recom-binante conforme descrito em Innis et al, (1990) PCR protocols: A guide tomethods and applications (veja, pp. 177-183).

Preparação de Fab em peguena escala

A expressão em pequena escala em lâminas de 96 cavidades foiotimizada para triagem de bibliotecas de Fab. Iniciando a partir de E. colitransformada com uma biblioteca de Fab, foram escolhidas colônias parainocular tanto uma lâmina mestre (agar LB+Ampicillin (50 ug/ml) + 2% deGlicose) e uma lâmina de trabalho (2 ml/cavidade, 96 cavidade/lâmina con-tendo 1,5 ml_ de LB+Ampicillin (50 ug/ml) + 2% de Glicose). Ambas as lâmi-nas foram cultivadas a 30°C por 8-12 horas. A lâmina mestre foi armazenadaa 4°C e as células da lâmina de trabalho foram peletizadas a 5000 rpm eressuspendidas com 1 mL de LB+Ampicillin (50 ug/ml)+ 1 mM de IPTG parainduzir a expressão de Fabs. As células foram colhidas por centrifugaçãodepois de tempo de expressão de 5 h a 30°C, em seguida ressuspendidasem 500 uL de tampão HBS-EP (tampão de 100 mM de HEPES pH 7.4, 150mM de NaCI, 0,005% de P20, 3 mM de EDTA). Foi obtida lise de célulasressuspendidas em HBS-EP por um ciclo de congelamento (-80°C) em se-guida degelando a 37°C. Os lisados celulares foram centrifugados a 5000rpm por 30 min para separar fragmentos celulares de sobrenadantes con-tendo Fabs. Os sobrenadantes foram em seguida injetados no equipamentode ressonância de plasmon BlAcore para obter informação de afinidade paracada Fab. Clones expressando Fabs foram resgatados da lâmina mestrepara seqüenciar o DNA e para produção de Fab em grande escala e carac-terização detalhada conforme descrito abaixo.

Preparação de Fab em grande escala

Para obter parâmetros cinéticos detalhados, Fabs foram expres-sados e purificados de grandes culturas. Frascos de Erlenmeyer contendo200 ml_ de LB+Ampicillin (50 ug/ml) + 2% de Glicose foram inoculados com5 ml_ de cultura de um dia para o outro de um clone de E. coli expressandoFab selecionado. Os clones foram incubados a 30°C até uma OD550nm de 1,0ser atingida e em seguida induzidos substituindo o meio por 200 ml, deLB+Ampicillin (50 ug/ml) + 1 mM de IPTG. Depois de tempo de expressão de5 horas a 30°C, as células foram peletizadas por centrifugação, em seguidaressuspendidas em 10 mL de PBS (pH 8). A lise das células foi obtida pordois ciclos de congelamento / decongelamento (a -80°C e 37°C, respectiva-mente). O sobrenadante dos lisados celulares foram carregados sobre colu-nas de Ni-NTA superflow sepharose (Qiagen, Valencia. CA) equilibradascom PBS, pH 8, em seguida lavadas com 5 volumes de coluna de PBS, pH8. Fabs individuais elutriados em diferentes frações com PBS (pH 8) + 300mM de Imidazol. Frações contendo Fabs foram reunidas e dializadas emPBS, em seguida quantificadas por ELISA antes de caracterização de afini-dade.

Preparação de anticorpo total

Para expressão de anticorpos totais, regiões variáveis de cadeiapesada e leve foram clonados em 2 vetores de expressão de mamíferos(Eb.911.E3 ou Eb.pur.911.3E para cadeia leve e Db.911.3E para cadeia pe-sada; descritos aqui) e transfectados usando lipofectemina em células HEK293 para expressão transitória. Os anticorpos foram purificado usando prote-ína A usando métodos de rotina.Ensaio Biacore

As afinidades de Fabs anti-NGF e anticorpos monoclonais foramdeterminadas usando o sistema de ressonância de plasmon superficial BIA-core3000™ (SPR) (BlAcore, INC, Piscaway NJ). Chips CM5 foram ativadoscom cloridreto de N-etila-N'-(3-dimetilaminopropila)-carbodimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. NGFhumano foi diluído em 10 mM de acetato de sódio pH 4.0 e injetado sobre ochip ativado em uma concentração de 0,005 mg/mL. Usando tempo de fluxovariável através dos canais de chips individuais, foram obitdas duas faixasde densidade de antígeno: 100 a 200 unidades de resposta (RU) para estu-dos cinéticos detalhados e 500 a 600 RU para ensaios de triagem. O chip foibloqueado com etanolamina. Estudos de regeneração mostraram que umamistura de tampão de elutriação Pierce (Product No. 21004, Pierce Biotech-nology, Rockford, IL) e 4 M de NaCI (2:1) removeu de modo eficaz o Fabligado ao mesmo tempo mantendo a atividade de hNGF sobre o chip pormais de 200 injeções. Tampão HBS-EP (0,01 M de HEPES, pH 7.4, 0,15NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005% de Tensoativo P29) foi usado como tampãode funcionamento para todos os ensaios BlAcore.

Ensaio de triagem

Um ensaio de triagem BlAcore foi otimizado para determinar aafinidade de clones Fab de bibliotecas. Os sobrenadantes de pequenos usa-dos de cultura foram injetados em 50 ul/min por 2 min. Foram usados tem-pos de dissociação de 10 a 15 minutos para determinação de um único índi-ce de dissociação exponencial ("koff") usando software de BlAevaluation.Amostras que mostraram índices "koff" dentro do mesmo alcance que o mo-delo usado para criar a biblioteca (clone 8L2-6D5, "koff" 1x10"3 s'1) foraminjetados para confirmação e tempos de dissociação de até 45 min forampermitidos para obter melhores valores de "koff". Clones apresentando valo-res aprimorados de (menores) "koff" foram expressados em grande escala eparâmetros cinéticos totais, kon e "koff", foram determinados sobre proteínapurificada. O ensaio foi capaz de detectar diferenças em afinidade que foramde cerca de 2 vezes ou maiores.

Ensaio de determinação de afinidade

Diluições seriais (0,1 -10x KD estimada) de amostras de Fab puri-ficadas foram injetadas por 1 min a 100 uL/min e foram permitidos temposde dissociação de até 2h. As concentrações das proteínas Fab foram deter-minadas por ELISA e/ou eletroforese SDS-PAGE usando como um padrãoum Fab de concentração conhecida (conforme determinado por análise deaminoácidos). Os índices de associação cinética (kon) e índices de dissocia-ção ("koff") foram obtidos simultaneamente ajustando os dados para um mo-delo de ligação de Langmuir a 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Pe-tersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando o programa deBlAevaluation. Os valores da constante de dissociação de equilíbrio (KD) fo-ram calculados como "koffVkon.

B. Humanizacão e maturação de afinidade de anticorpo antagonista anti-NGF de camundonqo 911

O anticorpo antagonista anti-NGF de camundongo, 911 (vejaHongo et al, (2000) Hybridoma 19(3):215-227) foi selecionado por humani-zacão e maturação de afinidade. Mab 911 liga NGF humano e de rato comalta afinidade e não apresenta reatividade cruzada significante com as neu-rotrofinas NT3, NT4/5 ou BDNF. Veja Hongo, id. A afinidade do fragmentoFab clivado com papaína de camundongo Mab 911 foi determinada usandoanálise BlAcore conforme descrito acima. O fragmento Fab clivado com pa-paína de Mab 911 de camundongo ligou NGF humano com uma Kp de cercade10nM.

Humanizacão e maturação de afinidade foram conduzidas emvárias etapas, como se segue:

(1) Preparação de modelo enxertado com CDR. As CDRs esten-didas de cadeia leve do anticorpo 911 (isto é, inclusive tanto as regiões CDRde Kabat e de Chothia) foram enxertados nas seqüências aceitadoras delinhagem germinativa humana 08 com JK2 e as CDRs de cadeia pesadaestendidas do anticorpo 911 foram enxertadas na seqüência aceitadora delinhagem germinativa humana VH4-59 com JH4. As seqüências de aminoá-cidos das seqüências aceitadoras de linhagem germinativa humana sãomostradas nas Figuras 1A e 1B. A numeração de aminoácidos é seqüencial.Usando as estruturas de proteína mencionadas acima, foram desenhadasseqüências de DNA para genes sintéticos codificando estrutura humana comas CDRs murinas. Estes domínios variáveis humanizados de cadeia pesadae leve foram denominados hVH e hVL respectivamente. Os códons foramotimizados para E. coli e uso em hamster. Vários oligonucleotídeos de so-breposição (69 a 90 bases de extensão) se estendendo toda a extensão dohVL e hVH com dois iniciadores flanqueantes curtos para cada cadeia foramusados para sintetizar separadamente os dois genes por PCR recursiva es-sencialmente conforme descrito em Prodromou et al, (1992) Protein Eng5(8): 827-9. Fragmentos de DNA resultantes da extensão correta foram puri-ficados por gel e em seguida clonados em um plasmídeo de expressão bicis-irônico de E. coli (resistente a ampicilina). A expressão dos anticorpos esta-va sob controle de um promotor lacZ indutível por IPTG similar ao descritoem Barbas (2001) Phage "display": a laboratory manual, Cold Spring Harbor,NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press (veja Vector pComb3X, at pg2.10), no entanto, modificações incluíram adição e expressão dos seguintesdomínios adicionais: o domínio constante de cadeia leve Capa humano (vejaGenBank Accession No. CAA09181) e o domínio constante CHI de imuno-globulina humana lgG2a (GenBank Accession No. P01859).

As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis do anticor-po enxertado com CDR (também denominado o "modelo"), denominado 8L2-4D5, também são mostradas nas Figuras 1A e 1B. A afinidade de 8L2-4D5foi determinada usando análise BlAcore conforme descrito acima. 8L2-4D5ligou NGF humano com uma KD de cerca de 38 nM.

(2) Introdução de uma mutação de ponto na seqüência de estru-tura. A substituição V71K foi introduzida na cadeia pesada enxertada comCDR usando mutagênese sítio dirigida por PCR recombinante conformedescrito em Innis et al, (1995) PCR strateqies. San Diego, Academic Press.Esta substituição substituiu o resíduo de estrutura humana com o resíduo deestrutura de camundongo correspondente. O anticorpo resultante foi deno-minado 8L2-6D5, e a seqüência de aminoácidos da região variável de cadeiapesada de 8L2-6D5 é mostrada na Figura 1A. A afinidade de 8L2-6D5 foideterminada usando análise BlAcore conforme descrito acima. O fragmentoFab de 8L2-6D5 ligou NGF humano com uma Kd de cerca de 15 nM. 8L2-6D5 foi escolhido como modelo para maturação de afinidade.

(3) Humanizacão e maturação de afinidade de CDRs L1, L2, H1e H2. As CDRs L1, L2, H1 e H2 foram submetidas a humanizacão e matura-ção de afinidade. Foram identificadas posições de aminoácidos nas CDRsL1, L2, H1, e H2 que não são essenciais para a estrutura das CDRs combase na estrutura canônica de Chothia (veja Al-Lazikani et al (1997) J. Mol.Biol. 273(4):927-48); e submetidas a randomização como se segue. Duasbibliotecas foram preparadas contendo as mutações de cadeia leve ou mu-tações de cadeia pesada mostradas na Tabela 2, e a CDR L3 enxertada (decamundongo) ou CDR H3, respectivamente, usando mutagênese de cassetede PCR com oligonucleotídeos degenerados conforme descrito em Kay et al.(1996), Phaqe "displav" of peptides and proteins : a laboratorv manual. SanDiego, Academic Press, usando códons de doping conforme descrito emBalint et al, (1993) Gene 137(1):109-18). Geralmente, os resíduos aminoáci-dos foram alterados para resíduos que são mais comuns em anticorpos hu-manos, com base em alinhamentos das seqüências de aminoácidos de ca-deia pesada e de cadeia leve do anticorpo 911 com seqüências de anticorpode linhagem germinativa humana. O resíduo aminoacido tipo selvagem (nãosubstituído) também foi representado na biblioteca com a exceção do resí-duo CDR H2 50, uma metionina, na qual a metionina tipo selvagem não es-tava representada na biblioteca. Resíduos metionina são submetidos a oxi-dação; portanto, espera-se que a substituição do resíduo melhore a estabili-dade do anticorpo resultante. As bibliotecas de Fabs foram clonadas no ve-tor pComb3X mais as regiões CH1 e Ck humanas, conforme descrito acima.Tabela 2:

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Para experimentos de triagem de afinidade, cada biblioteca foiadicionalmente pareada com a cadeia leve ou pesada enxertada com CDRcorrespondente (por exemplo, a biblioteca H1/H2 foi pareada com cadeialeve enxertada com CDR), o anticorpo foi expressado, e a afinidade a NGFhumano dos clones individuais foi triada usando o sistema de ressonânciade plasmon superficial (SPR) BIACORE (BlAcore, Inc. Piscataway, NJ) deacordo com as instruções do fabricantge e conforme descrito acima. Foramdeterminados "koff", kon e KD. Clones de anticorpos foram classificados combase nos índices de "koff" , uma vez que geralmente a maior parte das vari-ações na afinidade é vista nos índices de "koff", e adicionalmente porque osíndices de "koff" são independentes da concentração de anticorpos.

A seqüência de clones que ligou foi determinada e a seqüênciade clones que ligou é mostrada na tabela 3.Tabela 3: Seqüências de aminoácidos L1 e L2, seqüências de aminoácidosH1 e H2, e dados cinéticos para clones que ligaram depois de triagem deafinidade de clones das bibliotecas H1/H2 ou L1/L2.

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AA em negrito foram randomizados conforme indicado acima*KD calculada usando kon 4e4 M"V1

**Por conveniência, "e" conforme usado aqui, denota "x10." Portanto, 4e4 demodo intercambiável significa 4x104.

CDRs contendo as seguintes substituições conservaram ligação:CDR-H1

I34: S, L, V, I e A ligaram.N35: N, T e S ligaram.CDR-H2

CDR-L1

M50: M, I, G, Q, S, L ligaram.A62: A e S ligaram.L63: L e V ligaram.

S26: S, e F ligaram.D28: D, S, A, Y ligaram.H32: H, N, Q ligaram.

CDR-L2

Y50:Y ligou.

151: I, T, V, A, ligaram.F54 : F ligouS56: S e T ligaram

CDRs contendo as seguintes substituições foram selecionadasgeralmente com base na afinidade de ligação e combinadas em um únicoclone, denominado H19-L129:CDR-H1: I34L: N35N (sem alteração)CDR-H2: M50I; A62A (sem alteração); L63VCDR-L1: S26S (sem alteração); D28S; H32NCDR-L2: Y50Y (sem alteração); 151T; F54F (sem alteração); S56S (sem alte-ração)

Estas mutações foram combinadas (amplificando as cadeias H eL por PCR, cortando os produtos de PCR e vetor (pRN8) com enzima derestrição e realizando uma ligação de 3 fragmentos) em um único clone, de-nominado H19-L129, o qual também incluiu as CDRs H3 e L3 enxertadas. Aseqüência das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de H19-L129 é mostrada nas Figuras 1A e 1B, e a Tabela 4 mostra a seqüência deaminoácidos das CDRs L1, L2, H1 e H2. H19-L129 ligou NGF com uma KDde cerca de 1 nM, conforme determinado usando análise BlAcore conformedescrito aqui.Tabela 4: Seqüência de aminoácidos de CDRs H1, H2, L1 e L2 e dados ci-néticos para clone combinado H19-L129.

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*KD calculada usando kon 4e4 M"1s"1

(4) Maturação por afinidade de CDRs H3 e L3. A maturação deafinidade das CDRs H3 e L3 foi realizada em duas etapas. Primeiro, em umprocesso denominado "mutagênese de varredura de bibliotecas", cada resí-duo aminoácido em H3 e L3 foi individualmente pré-triado de modo a identi-ficar posições de aminoácido nas quais uma mutação resultou em aumentoda afinidade de ligação para NGF humano. Com base nos resultados da mu-tagênese de varredura de bibliotecas (também denominada "análise porrandomização de biblioteca pequena"), um subgrupo de posições de amino-ácidos em H3 e L3 foram selecionadas para preparação da biblioteca de ma-turação de afinidade, e a biblioteca de maturação de afinidade foi triada paraafinidade a NGF humano usando análise BlAcore conforme descrito aqui.

Reconhece-se que estas técnicas podem ser aplicadas de modo geral.

(a) Mutagênese de varredura de bibliotecas

Cada posição de aminoácido nas CDRs H3 e L3 foi individual-mente pré-triada para substituições as quais resultaram em aumento da afi-nidade de ligação a NGF humano. A freqüência das substituições de amino-ácidos em qualquer dada posição que resultou em ligação aprimorada, namesma ligação, pior ligação ou nenhuma ligação proporcionou informaçãorelativa a posições nas CDRs que podem ser alteradas para muitos aminoá-cidos diferentes (inclusive todos os 20 aminoácidos), e posições nas CDRsas quais não podem ser alteradas ou as quais podem ser somente alteradaspor uns poucos aminoácidos. Também foram identificadas substituições deaminoácidos resultando em aumento da afinidade de ligação. Com base nosresultados desta triagem, um subgrupo de posições de aminoácido nas C-DRs H3 e L3 foram selecionadas para preparação de uma biblioteca de ma-turação de afinidade.

Foram preparadas bibliotecas de Fab individuais nas quais cadaaminoácido das CDRs L3 e H3 foi randomizado para todos os 20 aminoáci-dos, um de cada vez, resultando em várias (5 bibliotecas para a cadeia leve13 bibliotecas para a cadeia pesada) pequenas bibliotecas, cada com umacomplexidade de 20 possibilidades de aminoácidos em cada posição de a-minoácido. Em todos os casos, o aminoácido nativo (isto é, inalterado) foirepresentado na biblioteca. As bibliotecas foram preparadas por mutagênesede cassete de PCR com oligonucleotídeos degenerados conforme descritoem Kay et al. (1996), Phage "display" of Peptides and Proteins: a laboratorymanual, San Diego, Academic Press, usando o códon de doping NNK pararandomizar uma posição de aminoácido para incluir 20 aminoácidos possí-veis. O 8L2-6D5 (o anticorpo enxertado com CDR, tendo a mutação de es-trutura V71K) serviu como o modelo para construção da biblioteca porque amenor afinidade do anticorpo enxertado com CDR permitiu detecção maisfácila de diferenças na afinidade em mutantes H3 e L3 durante a triagem.Portanto, cada membro de uma biblioteca continha uma CDR3 (ou H3 ou L3)com uma substituição de aminoácido, e 5 CDRs enxertadas.

• 20 a 80 clones de cada biblioteca pequena foram triados usandoanálise BlAcore conforme descrito aqui. As amostras foram analisadas si-multaneamente por BlAcore por afinidade de ligação a NGF em um canal dochip BlAcore e para presença de Fab por ligação a um anticorpo penta-histag em outro canal do chip sensor, para detectar a etiqueta his no C tér-mino da cadeia pesada. Clones que expressavam proteína foram classifica-dos como tendo a mesma afinidade, pior afinidade, melhor afinidade ou ne-nhuma ligação, usando "koff" para classificar: Os resultados desta análisesão mostrados na Tabela 5.Tabela 5. Clones que expressaram proteína foram classificados como tendoa mesma afinidade, pior afinidade, melhor afinidade ou nenhuma ligação,com base na "koff".

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A seqüência de todos os clones com aprimorada afinidade foideterminada, revelando a freqüência e a identidade de substituições de ami-noácidos que resultaram em aumento da afinidade. Além disso, uns poucosclones que conservaram uma afinidade similar ao clone 8I2-6D5 foram sele-cionados entre cada biblioteca, de modo a determinar substituições de se-qüências de aminoacidos que foram permitidas em uma dada posição, muitoembora a substituição não tenha necessariamente aumentado a afinidade deligação. Os resultados desta análise são resumidos na Tabela 6.

Tabela 6.

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*KD calculada usando k™ 4e4 M"1s

Várias mutações resultaram em aumento da afinidade de liga-ção. No mínimo as seguintes mutações resultaram em afinidade de ligaçãosignificativamente aumentada comparada com o modelo 8L2-6D5:(H_Y101W (CDR seqüência GGYWYGTSYYFDY (SEQ ID NO: 46));H_S105A (CDR seqüência GGYYYGTAYYFDY (SEQ ID NO: 47)); H_S105T(CDR seqüência GGYYYGTTYYFDY (SEQ ID NO: 48)); H_G103A (CDRseqüência GGYYYATSYYFDY (SEQ ID NO: 49); e L_S91 E (CDR seqüênciaQQEKTLPYT (SEQ ID NO: 50)).

Os resultados deste experimento foram usados para orientar aseleção de posições de aminoácido para produção das bibliotecas de matu-ração de afinidade.

Este experimento também proporcionou informação relativa àfreqüência de substituições de aminoácidos em qualquer dada posição queresultou em ligação aprimorada, na mesma ligação, pior ligação ou nenhumaligação, conforme mostrado na Tabela 5. Esta informação permitiu a identifi-cação de posições de aminoácidos nas CDRs que podem ser alteradas paramuitos aminoácidos diferentes (inclusive todos os 20 aminoácidos), e posi-ções nas CDRs as quais podem ser alteradas para uns poucos aminoácidosou muito poucos aminoácidos (em algumas modalidades, nenhum aminoáci-do). Estes resultados também demonstraram substituições de aminoácidosque aumentaram a afinidade de ligação.

(b) Maturação de afinidade

Em seguida, os resultados da análise por randomização de bibli-otecas pequenas (acima) foram usados para selecionar resíduos para pro-dução das bibliotecas H3 e L3 para maturação de afinidade das CDRs H3 eL3. Os resíduos Y101 e G103 de CDR H3 e os resíduos S91 e K92 de CDRL3 foram selecionados para produção das bibliotecas H3 e L3 para matura-ção de afinidade das CDRs H3 e L3.

Esta biblioteca combinou mutações em H3 e L3 ao mesmo tem-po no clone 8L2-6D5 enxertado em CDR, e separadamente no fundo deH19-L129, e teve uma diversidade de 80 clones diferentes. A Tabela 7 mos-tra os resíduos aminoácidos selecionados para substituição e os aminoáci-dos que foram substituídos em cada posição.

Tabela 7. Resíduos aminoácido em H3 e L3 selecionados para substituiçãoe os aminoácidos que foram substituídos em cada posiçãoCDR-H3:

Y101 foi alterado para Y e W, C. (Notar que C foi incluído porqueo uso do códon TRS em um oligonucleotídeo degenerado também gerou ocódon C).

G103 foi alterado para A ,P, S

CDR-L3:

S91 foi alterado para E.

K92 foi alterado para todos os vinte aminoácidos. A, R, K, e Hligado.

Cada polipeptídeo foi expressado como um Fab, e a afinidadepara NGF humano de 96 clones individuais foi tríada para cada bibliotecausando análise BIACORE de acordo com as instruções do fabricante e des-crita acima. Os resultados desta análise são mostrados na Tabela 8.

Tabela 8.

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*KD calculada usando kon 4e4 M"1s"1

Com base na afinidade de ligação, os melhores clones, E3 (demodo intercambiável denominado "3E") e 3C, foram selecionados para ca-racterização adicional. E3 compreendeu as seguintes substituições de CDR:CDR-H3: Y101W, G103A; e CDR-L3: S91E, K92H, as quais foram combina-das em um único clone o qual também incluiu as seguintes mutações L1, L2,H1 e H2 :CDR-H1: I34L;CDR-H2: M50I; L63V;CDR-L1: D28S; H32N;CDR-L2: I51T.

A seqüência das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeialeve de E3 é mostrada nas Figuras 1A e 1B. 3C compreendeu as seguintessubstituições de CDR : CDR-L3: S91E; K92R; CDRH3: Y101W; G103A, asquais foram combinadas em um único clone o qual também incluiu as se-guintes mutações L1, L2, H1 e H2 descritas para o clone 3E.

As seqüências 3E e 3C foram clonadas em vetores de expres-são de mamífero para produção de Fab e anticorpo total, e expressadas emcélulas HEK293 e purificadas usando Ni-NTA ou cromatografia de proteínaA. Proteína pura foi precisamente quantificada por análise de aminoácidos.

As afinidades de ligação a NGF humano dos Fabs E3 e 3C fo-ram medidas usando análise BlAcore de acordo com as instruções do fabri-cante e conforme descrito acima, exceto que 100 RU NGF foi usado sobre ochip para prevenir um efeito de religação. Em resumo, várias concentraçõesde anticorpos (Fabs) foram injetados por 2 minutos sobre um chip CM5 com100 RU de NGF humano imobilizado sobre o mesmo, e permitiu dissociarpor 1800 segundos. Anticorpo de camundongo 911 (Fab) foi analisado comoum controle. Os dados foram analisados usando o software BlAevaluationseguindo as instruções do fabricante. Os resultados da análise do anticorpoE3 e 911 são mostrados nas Figuras 9 e 10. E3 ligou NGF humano com umaKD de cerca de 0,07 nM (e com uma kon de cerca de 6,0e5 M-1s-1, e um"koff" de cerca de 4,2e-5 s-1). 3C ligou NGF humano com uma KD de cercade 0,35 nM (com um "koff" de cerca de 1.4E-5). Em contraste, anticorpo decamundongo 911 ligou NGF com uma KD de 3,7 nM, "koff" de 8,4x10"5s"1 ede 2,2x104Ms"1.

O anticorpo E3 (denominado de modo intercambiável 3E) foi se-lecionado por análise adicional com base na afinidade de alta ligação. Paratestar a capacidade de E3 para prevenir a interação de NGF com os recepto-res de NGF trkA e p75, 2,5 nM de NGF humano foi pré-misturado e incubadopor uma hora com 0 a 50 nM do anticorpo E3 (Fab). Depois da incubação,foram injetadas amostras a 10 ul/minuto sobre um chip BlAcore CM5 con-tendo 260 RU de p75 (canal 2) e 600 RU de trkA (canal 3), e foi determinadaa percentagem de ligação. Os resultados desta análise são mostrados naFigura 11. Concentrações aumentadas de Fab E3 bloquearam a interaçãode NGF tanto com p75 quanto com trkA, conforme mostrado por sinal redu-zido (medido em RU), indicando que Fab E3 bloqueia a interação de NGFhumano com tanto trkA quanto p75. Quando a concentração de anticorpo E3(Fab) foi igual à concentração de NGF (a cerca de 2,5 nM de concentraçãode NGF), não foi observada nenhuma ligação de NGF (conforme mostradopor um sinal de zero). O fato de ter ocorrido zero por cento de ligação NGF-receptor quando a concentração de NGF foi igual à concentração de anticor-po 3E sugeriu que 2,5 nM de NGF era no mínimo dez vezes maior do que akD de E3 para NGF e em equilíbrio.

Exemplo 2: Avaliação da capacidade de bloqueio de NGF de anticorpos anti-NGF usando ensaio de sobrevida neurônio triqeminal E13.5 de camundongoA capacidade de Fab E3 ou anticorpo total E3 para bloquear aatividade de NGF foi avaliada por medição da capacidade do anticorpo parainibir a sobrevida dependente do fator de crescimento nervoso de neurôniostrigeminais E13.5 de camundongo in vitro. O gânglio trigeminal consiste emneurônios sensoriais cutâneos que inervam a região facial. A sobrevida deneurônios trigeminais E13.5 de camundongo é um ensaio sensível para ava-liar a atividade de bloqueio de NGF de anticorpos antagonistas anti-NGFporque é necessário NGF para suportar a sobrevida destes neurônios. Porexemplo, em concentrações saturantes de NGF, a sobrevida é próxima de100% por 48 horas em cultura. Em contraste, menos de 5% dos neurôniossobrevivem por 48 horas na ausência de NGF.

O ensaio de sobrevida foi conduzido como se segue: camun-dongos fêmeas Swiss Webster prenhas combinadas por tempo foram euta-nizadas por inalação de C02. As trompas uterinas foram removidas e osembriões no estágio embrionário E13.5 foram extraídos e decapitados. Osgânglios trigeminais foram dissecados usando agulhas de tungstênio estimu-ladas eletroliticamente. Os gânglios foram em seguida tripsinizados, dissoci-ados mecanicamente e laminados em uma densidade de 200 a 300 célulaspor cavidade em meio Ivire de soro definido em lâminas de 96 cavidadesrevestidas com poli-L-ornitina e laminina.

A atividade de bloqueio de anticorpos ou Fabs anti-NGF foi ava-liada adicionando aos neurônios trigeminais doses variáveis de anticorposanti-NGF Mab 911 (Fab), 8L2-6D5; H19-L129; E3 e 3C; e NGF humano oude rato nas seguintes concentrações: 0,4 ng/ml (-15 pM; esta concentraçãorepresentou uma concentração saturante de NGF para sobrevida) e 0,04ng/ml (~1,5 pM; esta concentração é em torno de IC50). Depois de 48 horasem cultura, as células foram submetidas a um protocolo de imunocitoquímicaautomatizado realizado em uma estação de trabalho de manipulação de lí-quido Biomek FX (Beckman Coulter) como se segue: fixação usando 4% deformaldeído, 5% de sacarose, e PBS; permeabilização usando 0,3% de Tri-ton X-100 em PBS); bloqueio de sítios de ligação inespecífica usando 5% desoro de cabra normal, 0,11% de BSA em PBS; e incubação seqüencial comalguns anticorpos primáios e secundários para detectar neurônios. O anti-corpo primário foi anticorpo policlonal de coelho contra o produto genéticoprotéico 89.5 (PGP9.5, Chemicon), um marcador fenotípico neuronal estabe-lecido. O anticorpo secundário foi anti-coelho de cabra Alexa Fluor 488 (Mo-lecular Probes), junto com o corante nuclear Hoechst 33342 (Molecular Pro-bes) para marcar os núcleos de todas as células presentes na cultura. A a-quisição de imagem e a análise de imagem foram realizadas em um Disco-very-l/Genll Imager (Universal Imaging Corporation). As imagens foram au-tomaticamente adquiridas em dois comprimentos de onda por Alexa Fluor488 e Hoechst 33342, com a coloração nuclear sendo usada como ponto dereferência para o sistema de auto-foco baseado nas imagens do Imager,uma vez que a coloração nuclear está presente em todas as cavidades. Ob-jetivos apropriados e número de sítios estudados por imagens por cavidadeforam selecionados para cobrir toda a superfície de cada cavidade. Análisede imagens automatizada foi estabelecida para contar o número de neurô-nios presentes em cada cavidade depois de 48 horas em cultura com baseem sua coloração específica com o anticorpo anti-PGP9.5. Cuidadoso limiarda imagem e aplicação de morfologia e filtro de seletividade à base da inten-sidade de fluorescência resultou em uma contagem precisa de neurônios porcavidade.

Os resultados deste experimento demonstraram que Fab E3bloqueou a atividade de NGF com uma alta afinidade. Os resultados sãomostrados nas Figuras 4 a 6, e na Tabela 9.

A Figura 4 é um gráfico mostrando a sobrevida dependente dofator de crescimento nervoso de neurônios E13.5 na presença de concentra-ção variável de NGF humano e de rato.

A Figura 5 é um gráfico comparando o efeito de bloqueio deNGF de vários Fabs na presença ou de 0,04 ng/ml de NGF humano (cercade 1,5 pM; mostrado no painel inferior) ou de 0,4 ng/ml de NGF humano(cerca de 15 pM; mostrado no painel superior). 1,5 pM de NGF foi em tornoda EC50 do NGF estimulando sobrevida, ao passo que 15 pM representouuma concentração saturante de NGF. A sobrevida de neurônios trigeminaisde camundongo E13.5 em várias concentrações de Fab E3; Fab 911 murino;e Fab H19-L129 e Fab 8L2-6D5 foi avaliada conforme descrito acima. AIC50 (em pM) foi calculada para cada Fab em cada concentração de NGF, eé mostrada na Tabela 9. Fab E3 bloqueou fortemente a sobrevida de neurô-nios trigeminais dependente de NGF humano, com uma IC50 de cerca de 21pM na presença de 15 pM de NGF humano, e uma IC50 de cerca de 1,2 pMna presença de 1,5 pM de NGF humano. Fabs 3C e H19-L129 também blo-quearam fortemente a sobrevida de neurônios trigeminais dependente deNGF humano.

A Figura 6 é um gráfico comparando o efeito de bloqueio deNGF de vários Fabs na presença de ou 0,04 ng/ml de NGF de rato (cerca de1,5 pM; mostrado no painel inferior) de ou 0,4 ng/ml de NGF de rato (cercade 15 pM; mostrado no painel superior). 1,5 pM de NGF foi em torno daEC50, ao passo que 15 pM representou uma concentração saturante deNGF. A sobrevida de neurônios trigeminais de camundongo E13.5 em váriasconcentrações de Fab E3; Fab 911 murino; e Fab H19-L129 e 8L2-6D5 foiavaliado conforme descrito acima. A EC50 (em pM) foi calculada para cadaFab em cada concentração de NGF, e é mostrada na Tabela 9. Fab E3 blo-queou fortemente a sobrevida de neurônios trigeminais dependente de NGFhumano, com uma IC50 de cerca de 31,6 pM na presença de 15 pM de NGFde rato, e uma IC50 de cerca de 1,3 pM na presença de 1,5 pM de NGF derato. Fabs 3C e H19-L129 também bloquearam fortemente a sobrevida deneurônios trigeminais dependente de NGF de rato.

Tabela 9:

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Em um experimento diferente, foi comparado a capacidade doanticorpo total E3 e Fab 3E para inibir a sobrevida dependente do fator decrescimento nervoso de neurônios E13.5 na presença de 0,4 ng/ml (concen-tração saturante) de NGF humano. Os resultados da análise são mostradosna Figura 12. O anticorpo total E3 e Fab 3E apresentou níveis similares deinibição da sobrevida dependente do fator de crescimento nervoso quando aconcentração de anticorpo total e Fab foram normalizadas para o número desítios de ligação de NGF (Fab tem um sítio de ligação e anticorpo total temdois sítios de ligação). Estes resultados demonstraram que não houve efeitode avidez devido à ligação de um anticorpo total ao dímero de NGF.

Em outros experimentos, foi comparada a capacidade de váriasconcentrações (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128, e 0,0 nM) do anti-corpo E3, anticorpo 911, e uma imunoadesina de trkA receptor (consistindono domínio extracelular do receptor de NGF trkA fundido com o domínio deimunoglobulina Fc, CH2-CH3) para inibir a sobrevida dependente do fator decrescimento nervoso de neurônios E13.5 na presença de 0,4 ng/ml (condi-ções saturantes). Estes resultados são mostrados na Figura 13. Estes resul-tados demonstraram que o anticorpo E3 bloqueou NGF melhor do que ou oanticorpo 911 ou a trkA imunoadesina.

Exemplo 3: Avaliação da especificidade do anticorpo anti-NGF E3 usandoensaios de sobrevida de neurônios triqeminais e nodoso de camundongo

A capacidade do anticorpo E3 para bloquear especificamente aatividade de NGF foi avaliada por medição da capacidade do anticorpo parainibir a sobrevida de neurônios trigeminais E17/18 de camundongo in vitro napresença de concentrações saturantes de NGF, a neurotrofina NT3 relacio-nada com NGF, ou o fator neurotrófico não relacionado com NGF, proteínaestimulante de macrófago (MSP). A sobrevida de neurônios trigeminaisE17/18 de camundongo é um ensaio sensível para avaliar a atividade debloqueio de NGF de anticorpos antagonistas anti-NGF porque é necessárioNGF para suportar a sobrevida destes neurônios em concentrações maioresdo que o nível de NGF requerido para suportar a sobrevida de neurôniosE13.5 TG). A sobrevida destes neurônios também é suportada por NT3 ouMSP; portanto, a sobrevida destes neurônios também é um ensaio sensívelpara avaliar se o anticorpo antagonista anti-NGF também bloqueou NT3 ouMSP.

A capacidade do anticorpo E3 para bloquear especificamente aatividade de NGF também foi avaliada por medição da capacidade do anti-corpo para inibir a sobrevida de neurônios E17 nodosos de camundongo napresença de concentrações saturantes de BDNF ou NT4/5. A sobrevida deneurônios nodosos é suportada por BDNF ou NT4/5; portanto, a sobrevidadestes neurônios é um ensaio sensível para avaliar a atividade de bloqueiode BDNF ou NT4/5 do anticorpo antagonista anti-NGF.

O ensaio de sobrevida foi conduzido como se segue: camun-dongos fêmeas Swiss Webster prenhas combinados por tempo foram euta-nizados por inalação de C02. As trompas uterinas foram removidas e osembriões (no dia embrionário 17 ou 18) foram extraídos e decapitados. Osgânglios trigeminais e nodosos foram dissecados e limpados. Em seguida osgânglios foram tripsinizados, dissociados mecanicamente e laminados emuma densidade de 100 a 300 células por cavidade em meio livre de soro de-finido em lâminas de 4 cavidades (Greiner) revestidas com poli-L-ornitina elaminina.

Neurônios trigeminais E17/18 foram cultivados ou sem fatoresneurotróficos adicionados (controle negativo) ou na presença de concentra-ções saturantes de NGF humano (400 pM e 15 pM) (controle positivo); NT3(400 pM); ou MSP (600 pM). Foram estabelecidas culturas em duplicata queincluíram concentrações variáveis de Fabs E3 e 911 e anticorpos totais. Aconcentração de Fab e anticorpos totais foi indicada por sítio de ligação (porexemplo, um anticorpo total contém dois sítios de ligação, ao passo que umFab contém um sítio de ligação).

Neurônios nodosos E17 foram cultivados ou na ausência de fa-tores neurotróficos adicionados (controle negativo), ou com concentraçõessaturantes de BDNF (400 pM) (controle positivo) ou NT4/5 (400 pM) ou fatorde crescimento não relacionado com NGF ILF (fator inibitório de interleuci-na). Altas concentrações de neurotrofinas foram usadas, uma vez que a me-ta deste experimento foi testar a especificidade dos anticorpos. Foram esta-belecidas culturas em duplicata que incluíram variar novamente com e sem aadição de anticorpos E3 e 911. Depois de 48 horas em cultura o número to-tal de neurônios sobreviventes em cada cavidade sob cada condição foi de-terminado por contagem manual usando um microscópio de contraste de fase.

Os resultados destes experimentos demonstraram que anticor-pos E3 e 911 bloquearam completamente os efeitos estimuladores de so-brevida de NGF sobre neurônios trigeminais E18. Em contraste, anticorposE3 e 911 não tiveram efeito sobre a sobrevida de neurônios trigeminais es-timulados por NT3 ou MSP, ou a sobrevida de neurônios nodosos estimula-da por BDNF ou NT4/5 or LIF. Estes resultados demonstraram que o anti-corpo E3 possuiu especificidade seletiva para NGF, uma vez que não foidetectada interação entre estes anticorpos e outras neurotrofinas relaciona-das com NGF (NT3, NT4/5, BDNF) em concentrações 1000 vezes a 10.000vezes maiores do que concentração eficaz para bloqueio de NGF. Além dis-so, estes resultados demonstraram que a morte neuronal vista em neurôniosdependentes de culturas de NGF suplementadas com NGF na adição doanticorpo ou Fab E3 foi devido a uma interação específica entre estes anti-corpos e NGF e não foi devido a um efeito tóxico generalizado. Anticorpoantagonista anti-NGF de camundongo 911 também foi testado, e foram ob-servados resultados similares. Observar que devido às altas concentraçõesde neurotrofinas usadas, ambos os anticorpos E3 e 911 estão muito próxi-mos a suas condições de titulação e se esperou que ligassem NGF em ní-veis similares porque as diferenças na afinidade de ligação destes anticor-pos a NGF seria menos evidente sob estas condições.

Os resultados destes experimentos são mostrados nas figuras14, 15, 16, e 17. Os dados mostraram a percentagem da sobrevida médiadepois de 48 horas em cultura (± erro padrão da média, n = 3 para cadaponto dos dados) relativa à sobrevida vista no controle positivo para cadaexperimento (por exemplo, 100% de sobrevida de neurônios trigeminadoscultivados na presença de concentração de NGF saturante, e 100 % de so-brevida de neurônios nodosos cultivados na presença de concentração deBDNF saturante, respectivamente). As Figuras 14-15 são gráficos mostrandoque anticorpo antagonista anti-NGF E3 ou Fab E3 não inibiram a sobrevidapromovida por NT3, e MSP, mesmo em concentrações de anticorpo tão ele-vadas quanto 200 nM. Em contraste, 20 nM do anticorpo E3 ou Fab 3E eFab 911 bloquearam totalmente a sobrevida provocada por NGF. Anticorpoantagonista anti-NGF de camundongo 911 também foi testado, e foram ob-servados resultados similares. Especificamente, a Figura 14 é um gráficomostrando comparação do efeito de várias concentrações (20 nM, 2 nM, ou0,2 nM) de Fab E3 (denominado "3E" na figura) e anticorpo Fab 911 de ca-mundongo sobre a sobrevida de neurônios trigeminais E18 na presença denenhuma neurotrofina adicionada (denominado "controle"), 400 pM de NGF(denominado "NGF-400pM), 10 nM de NT3 (denominado "NT3-10nM) ou600 pM de MSP (denominado "MSP-600 pM). A Figura 15 é um gráfico re-presentando comparação do efeito de várias concentrações (200 nM e 80nM) de E3 Fab e anticorpo total e anticorpo de camundongo 911 anticorpototal e Fab da sobrevida de neurônios trigeminais E17 na presença de ne-nhuma neurotrofina adicionada (denominado "nenhum fator"), 400 pM deNGF (denominado "NGF-400pM), 10 nM de NT3 (denominado "NT3-10nM)ou 600 pM de MSP (denominado "MSP-600 pM).

A Figura 16-17 são gráficos mostrando que anticorpo antagonis-ta anti-NGF E3 ou Fab E3 não inibiram a sobrevida de neurônios nodososE17 promovida por BDNF, NT4/5 ou LIF. Anticorpo antagonista anti-NGF911 de camundongo também foi testado, e foram observados resultados si-milares. Especificamente, a Figura 16 é um gráfico mostrando comparaçãodo efeito de várias concentrações (200 nM ou 80 nM) de anticorpo total E3(denominado "3E na figura"), Fab E3, anticorpo total 911, ou Fab 911 sobrea sobrevida de neurônios nodosos E17 na presença de nenhuma neurotrofi-na adicionada (denominado "nenhum fator"), 400 pM de BDNF (denominado"BDNF-400pM), 400 pM de NT4/5 (denominado "NT4/5-400pM), ou 2,5 nMde LIF (denominado "LIP-2.5 nM). A Figura 17 é um gráfico mostrando com-paração do efeito de várias concentrações (200 nM, 20 nM, 2nM) de Fab E3(denominado "3E na figura"), ou Fab 911 sobre a sobrevida de neurôniosnodosos E17 na presença de nenhuma neurotrofina adicionada (denomina-do "controle"), 400 pM de BDNF (denominado "BDNF-400pM), 400 pM deNT4/5 (denominado "NT4/5-400pM), or 2.5 nM de LIF (denominado "LIP-2.5nM).

Exemplo 4: Preparação de vetores de expressão de mamífero e expressãodo anticorpo E3 em células de mamíferos

Três vetores de expressão de mamíferos foram projetados econstruídos para uso na expressão do anticorpo E3 em células de mamífero.

O vetor Db.911.3E é um vetor de expressão compreendendo aregião variável de cadeia pesada do anticorpo E3 e a região constantelgG2a humana, e é adequado para expressão transitória ou estável da ca-deia pesada. Db.911.3E consiste em seqüências de nucleotídeos corres-pondentes às seguintes regiões: a região promotora de citomegalovírus mu-rino (nucleotídeos 1-612); um íntron sintético (nucleotídeos 619-1507); a re-gião codificante DHFR (nucleotídeos 707-1267); peptídeo de sinalização dehormônio de crescimento humano (nucleotídeos 1525-1602); região variávelde cadeia pesada de anticorpo 3E (nucleotídeos 1603-1965); região cons-tante de lgG2a de cadeia pesada humana contendo as seguintes mutações:A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácidos com referência à se-qüência lgG2a selvagem; veja Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624); sinalde poliadenilação tardio SV40 (nucleotídeos 2974-3217); região intensifica-dora de SV40 (nucleotídeos 3218-3463); região de fago f1 (nucleotídeos3551-4006) e região codificante de beta lactamase (AmpR) (nucleotídeos4443-5300). Db.911.3E foi depositado na ATCC em 8 de janeiro de 2003, efoi atribuído o No. de Acesso ATCC PTA-4895.

O vetor Eb.911.3E é um vetor de expressão compreendendo aregião variável de cadeia leve do anticorpo E3 e a região constante de ca-deia capa humana, e é adequado para expressão transitória da cadeia leve.Eb.911.3E consiste em seqüências de nucleotídeos correspondentes às se-guintes regiões: a região promotora de citomegalovírus murino (nucleotídeos1-612); íntron EF-1 humano (nucleotídeos 619-1142); peptídeo de sinaliza-ção de hormônio de crescimento humano (nucleotídeos 1173-1150); regiãovariável de cadeia leve do anticorpo E3 (nucleotídeos 1251-1571); regiãoconstante de cadeia capa humana (nucleotídeos 1572-1892); sinal de polia-denilação tardio SV40 (nucleotídeos 1910-2153); região intensificadora deSV40 (nucleotídeos 2154-2399); região de fago f1 (nucleotídeos 2487-2942)e região codificante de beta lactamase (AmpR) (nucleotídeos 3379-4236).Eb.911.3E foi depositado na ATCC em 8 de janeiro de 2003, e foi atribuído oNo. de Acesso ATCC PTA-4893.O vetor Eb.pur.911.3E é um vetor de expressão compreendendoa região variável de cadeia leve do anticorpo E3 e a região constante capahumana, e é adequado para expressão estável da cadeia leve.Eb.pur.911.3E consiste em seqüências de nucleotídeos correspondentes àsseguintes regiões: região promotora de citomegalovírus murino (nucleotí-deos 1-612); íntron EF-1 humano (nucleotídeos 619-1758); região codifican-te do gene pac (puromycinR) (nucleotídeos 739-1235); região hsp70 5'UTRhumana (nucleotídeos 1771-1973); peptídeo de sinalização de hormônio decrescimento humano (nucleotídeos 1985-2062); região variável de cadeialeve do anticorpo E3 (nucleotídeos 2063-2383); região constante de cadeiacapa humana (nucleotídeos 2384-2704); sinal de poliadenilação tardio SV40(nucleotídeos 2722-2965); região intensificadora de SV40 (nucleotídeos2966-3211); região de fago f1 (nucleotídeos 3299-3654) e região codificantede beta lactamase (AmpR) (nucleotídeos 4191-5048). Eb.pur.911.E3 foi de-positado na ATCC em 8 de janeiro de 2003, e foi atribuído o No. de AcessoATCC PTA-4894.

Expressão celular transitória foi realizada como se segue: célu-las CHO e HEK293T em placas de 150 mm foram co-transfectadas transito-riamente com 25 ug de cada plasmídeo (isto é, um plasmídeo contendo acadeia pesada e um plasmídeo contendo a cadeia leve). O DNA foi mistura-do com 100 ul de lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instru-ções do fabricante. Os complexos de DNA-lipídeo foram deixados para en-trar em contato com as células em meio DMEM/F12 sem soro ou antibióticospor 5 horas. Depois desta incubação, o meio foi trocada para expressão paraOpti-MEM (Invitrogen) sem quaisquer aditivos por dois dias. Sobrenadantescelulares contendo anticorpo foram colhidos seqüencialmente até quatro ve-zes com reposição de meio subseqüente. Os sobrenadantes foram purifica-dos por cromatograpia por afinidade usando resina MapSelect Protein A (A-mersham biosciences 17-5199-02). O anticorpo foi ligado à resina de proteí-na A em 0,3 M de glicina, 0,6 M de tampão NaCI em pH 8, em seguida elu-triado com 0,1 M de tampão de citrato em pH 3. Frações contendo anticorpoforam imediatamente neutralizadas com 1 M de tampão de Tris em pH 8.0,Frações de anticorpos foram em seguida dialisadas e concentradas em PBS.Exemplo 5: Anticorpo anti-NGF E3 é eficaz no tratamento de dor pos-cirúrqica

Foi usado um modelo de dor que simula a dor pós cirúrgica paraavaliar a eficácia do tratamento com anticorpo E3. Anticorpo E3 compreen-deu a região constante de lgG2a de cadeia pesada humana contendo asseguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácidoscom referência à seqüência lgG2a selvagem; veja Eur. J. Immunol. (1999)29:2613-2624); a região constante capa de cadeia leve humana; e as regi-ões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve mostradas nas Tabelas 1Ae 1B.

Animais. Ratos machos Sprague Dawley pesando entre 220 e240 gramas foram adquridos da Harlan (Wisconsin) e aclimatados às insta-lações animais por uma semana antes da cirurgia.

Cirurgia. A cirurgia se baseou no procedimento descrito porBrennan, et al. Pain 64:493-501 (1996). Os animais foram anestesiados comum isoflurano a 2% em mistura de ar que foi mantida durante a cirurgia atra-vés de um cone nosal. A superfície plantar da pata traseira direita foi prepa-rada com um chumaço de iodo povidona, e foi feita uma incisão longitudinalcentral de 1 cm através da pele e fascia, iniciando a 0,5 cm da borda do cal-canhar e se estendendo em direção dos dedos dos pés. Foram feitas medi-ções com uma régua com a pata mantida em uma posição flexionada. Omúsculo plantar foi elevado usando forceps curvado e incisado longitudinal-mente. O músculo foi incisado através de toda a sua profundidade, entre aorigem e a inserção. O sangramento foi controlado durante toda a cirurgiapor pressão aplicada através de um chumaço de gaze. O ferimento foi fe-chado com duas suturas de colchão (monofilamento de ethilon black 5-0).Estas suturas foram amarradas 5 a 6 vezes, com o primeiro nó amarradofrouxamente. O sítio do ferimento foi esfregado com mecha com solução debacitracina. Aos aimais foi permitido se recuperarem e repousar dentro degaiolas limpas por duas horas ou mais antes da experimentação comporta-mental se iniciar.Avaliação de dor em repouso. Foi usado um escore de dor cu-mulativa para avaliar dor relacionada com o ato de carregar peso. Os ani-mais foram colocados sobre uma malha plástica (grade: de 8 mm2) dentor degaiolas claras de plástico que foram elevadas sobre uma plataforma (h: 18")permitindo a inspeção do lado inferior de suas patas. Depois de um períodode aclimatação de 20 minutos, o ato de carregar peso foi avaliado em umaescala de 0 a 2. Um escore de 0 foi dado se a pata estivesse descorada oupressionada contra a malha, indicando ato de carregar peso máximo. Umescore de 1 foi dado se a pata estivesse favorecida com a pele somente to-cando a malha, sem descoramento ou indentação da pele. Um escore de 2foi dado se a pata estivesse mantida completamente fora da malha. Retra-ção da pata foi considerado um 2 se o rato ainda estivesse em repouso. Ca-da animal foi observado por 1 minuto a cada 5 minutos por 30 minutos. Asoma de 6 escores (0 a 12) obtidos durante 1/2 hora foi usada para avaliar ador na pata incisada. A freqüência de escores de 2 também foi calculada efoi usada para avaliar a incidência de dor severa ou total proteção da patapelo animal. Cada animal foi testado 24 horas antes da cirurgia (linha de ba-se), e 2 horas, 24 horas, 48 horas, e 72 horas depois da cirurgia. Os resulta-dos deste experimento são mostrados na Figura 1, a qual representa o esco-re da dor cumulativa em repouso observada em animais tratados com 35mg/kg de anticorpo anti-NGF 911 de camundongo. Estes resultados de-monstraram que o tratamento com anticorpo anti-NGF reduziu significativa-mente a dor em repouso pós-cirúrgica. O ato de carregar peso foi um bomcorrelato de o quão disposto o animal estava a usar o membro, e portanto foiuma medida eficaz do alívio da dor.

O anticorpo E3 foi injetado intra peritonealmente (i.p.) em váriasconcentrações do anticorpo (0,004, 0,01, 0,02, 0,1, 0,6, e 1 mg por quilo-grama de peso animal) em 15 horas pré-incisão. O grupo controle negativonão recebeu nenhum anticorpo mas foi injetado i.p. com uma solução solu-ção salina. Fentanila a 0,01 mg/kg foi injetado i.p. como um controle positivo30 minutos antes da experimentação em 24 horas pós-cirurgia. Cada expe-rimento envolveu 8 animais (n = 8 por grupo) para cada condição, e o grupocontrole teve 56 animais. A cirurgia foi realizada e um escore da dor cumula-tiva foi medido conforme descrito acima. A dor em repouso foi avaliada vintee quatro horas depois da cirurgia.

Conforme mostrado na Figura 7, anticorpo anti-NGF humanizadoE3 reduziu significativamente a dor em repouso (p < 0,05) depois de cirurgiaquando administrado a 0,02 mg/kg a 1 mg/kg de dosagem. Um "*" denotauma diferença significativamente importante do controle (p < 0,05). Trata-mento com 0,02 mg/kg aliviou o comportamento da dor de modo no mínimotão eficaz quanto tratamento com 0,01 mg/kg de fentanila. Esta dose de fen-tanila é 10 vezes a dose humana normal deste potente opióide.

Em outro experimento, foi testada a eficácia do anticorpo E3 pa-ra reduzir a dor pós-cirúrgica quando administrado pós-cirurgicamente. Anti-corpo E3 (0,5 mg/kg) foi injetado por via intravenosa (i.v.) duas horas depoisda cirurgia. O grupo controle não recebeu anticorpo mas foi injetado i.v. comuma solução solução salina. Foi realizada cirurgia e a dor em repouso ex-pressada como um escore da dor cumulativa foi avaliada 24 horas depois dacirurgia. Conforme mostrado na Figura 8, tratamento com anticorpo anti-NGFreduziu significativamente (p < 0,05) a dor em repouso em vinte e quatro ho-ras depois de incisão quando o anticorpo foi administrado 2 horas pós-incisão. Estes resultados demonstraram que o anticorpo E3 aliviou de modoeficaz a dor pós-cirúrgica quando administrado depois da cirurgia.Exemplo 6: Avaliação dos efeitos analgésicos do anticorpo antagonista anti-NGF 911 em um modelo de rato de artrite reumatóide

• Os efeitos analgésicos do anticorpo anti-NGF, 911 (veja Hongoet al., Hybridoma 19(3):215-227 (2000)) em artrite crônica induzida por adju-vante completo de Freund (CFA) em ratos foram investigados usando o en-saio de vocalização, em comparação com indometacina usada como subs-tância de referência.

Cinqüenta (50) ratos machos Lewis (LEWIS LEW / Cri Ico)(Charles River Bélgica) pesando 150 g a 220 g no início da fase experimen-tal foram incluídos neste estudo. Todos os animais foram mantidos por nomínimo 5 dias antes do experimento, e foram alojados em um ambiente detemperatura (19,5 a 24,5 °C), umidade relativa (45 a 65 %) e ciclo de 12 ho-ras de luz / escuridão controlados com acesso ad libitum a água correntefiltrada e ração de laboratório em péletes padrão (U.A.R., França) do inícioao fim do estudo. Os animais foram identificados individualmente sobre acauda.

No dia 0 (DO), foi induzida artrite em ratos por injeção intradér-mica na cauda de 0,05 ml de uma suspensão de Mycobacterium butyricum(Difco, USA) em óleo mineral (10 mg/ml). No dia 14 (D14), ratos artríticosforam incluídos no estudo de acordo com sua capacidade para vocalizar nasuave flexão da pata traseira e por seu índice de artrite, avaliado usando umescore de inflamação para cada pata traseira e cada pata dianteira (veja Ku-zuna et al., Chem. Pharm. Buil.ÇTokyo) 23:1184-1191 (1975); Pearson et al.,Arthritis Rheum. 2:440-459 (1959)). Os animais foram classificados com ba-se nos seguintes critérios: Escore 0: aspecto normal; Escore 1: eritema; Es-core 2: eritema com ligeiro edema; Escore 3: forte inflamação sem anquilo-se; Escore 4: anquilose. Somente animais com capacidade para vocalizar nasuave flexão e apresentando um escore de 2 ou 3 foram incluídos no estudo.

Quatro grupos de 10 ratos cada foram incluídos no estudo. Parao grupo 1 (veículo), no dia 14 (D14), depois da seleção, aos ratos foi admi-nistrado por via intravenosa veículo (solução salina). No dia 18 (D18), a in-tensidade nociceptiva foi avaliada por suave flexão da pata traseira e a in-tensidade do nível de experimentação foi registrada para cada animal. Parao grupo 2 (4 dias), no D14, depois da seleção, aos ratos foi administrado porvia intravenosa 911 (10 mg/kg). No dia 18 (D18), a intensidade nociceptivafoi avaliada por suave flexão da pata traseira e a intensidade do nível de ex-perimentação foi registrada para cada animal. Para o grupo 3 (24 horas), nodia 17 depois de injeção de CFA, aos ratos foi administrado por via intrave-nosa 911 (10 mg/kg). A intensidade nociceptiva foi avaliada por suave flexãoda pata traseira 24 horas depois, e a intensidade do nível de experimentaçãofoi registrada para cada animal. Para o grupo 4 (indometacina), no dia 18(D18), a intensidade nociceptiva foi avaliada por suave flexão da pata trasei-ra uma hora depois de administração oral de indometacina (10 mg/kg). Aintensidade do nível de experimentação também foi registrada para cadaanimal. As substâncias de ensaio foram administradas em uma maneira ce-ga e aleatória por via intravenosa sob um volume de 5 ml/kg, ao passo que aindometacina foi administrada por via oral sob um volume de 10 ml/kg.

Os efeitos analgésicos do anticorpo anti-NGF 911 são mostra-dos na Tabela 10. Os resultados foram expressados para cada grupo à me-dida que a intensidade nociceptiva avaliou a intensidade do nível de vocali-zação registrado para cada animal em mV (média ± SEM), e a percentagemde variação da intensidade nociceptiva calculada a partir do valor médio dogrupo tratado com veículo. A importância estatística entre os grupos tratadose o grupo de veículo foi determinada com um ensaio de Dunnett usando avariância residual depois de uma análise one-way da variância (P< 0,05).

Tabela 10. Efeitos analgésicos de 911 em artrite crônica induzida por adiu-vante completo de freund em ratos

<table>table see original document page 170</column></row><table>

Os resultados são expressados como média ± sem

n = 10 ratos por grupo

Dia 0 (DO): Indução de Artrite crônica por administração de CFA

Veículo: solução salina

911 (10 mg/kg) foi administrado por via intravenosa em D14 ou D17 e a me-dição da dor foi realizada em D18.

Indometacina (10 mg/kg) foi administrada por via oral em D18 e a mediçãoda dor foi realizada uma hora depois da dosagem.

ensaio de Dunnett: * indica uma diferença significante em comparação como grupo tratado com veículo para P<0,05Conforme mostrado na Tabela 10, o anticorpo anti-NGF 911 re-duziu significativamente a dor em um modelo de artrite reumatóide em rato24 horas ou 4 dias depois de uma única administração do anticorpo.

Exemplo 7: Efeitos farmacológicos do anticorpo antagonista anti-NGF E3 e911 em um modelo de artrite reumatóide em rato

Os efeitos farmacológicos (efeitos antiinflamatórios e analgési-cos) do anticorpo antagonista anti-NGF E3 e 911 foram investigados em ummodelo de artrite crônica induzida por adjuvante complete de Freund (CFA)em ratos em comparação com indometacina usada como uma substânciainterna de controle positivo. Os efeitos analgésicos de E3 e 911 foram avali-ados pela medição da reação nociceptiva. Os efeitos antiinflamatórios foramavaliados pelo volume da pata, índice de artrite (escore de inflamação), pesocorporal e das patas traseiras. Os níveis de citocinas das patas (IL-6, IL-ip,TNF-f e TGF-(31), TGF-f31 circulante no soro, concentrações plasmáticas deE3 e 911, parâmetros biológicos e radiografias de raios-X foram realizadosao final do experimento.

Protocolo experimental

1. Projeto do estudo

80 ratos machos Lewis (LEWIS Lew / Ico) (Charles River Labo-ratories- Bélgica) de 5 semanas de idade foram incluídos neste estudo. Elesforam alojados em um ambiente de temperatura (19,5-24,5°C) e umidaderelativa (45-65%) controladas com um cilco de 12 horas de luz / escuridão,com acesso ad libitum a água corrente filtrada e ração de laboratório em pé-letes padrão (SAFE, França) do início ao fim do estudo. No recebimento nasinstalações animais, eles foram alojados 5 por gaiola e foram observadospor um período de aclimatação de 10 dias antes de qualquer experimento.Os animais foram identificados individualmente na cauda.

Cinco grupos de 10 animais (ratos machos Lewis de 5 semanasde idade -LEWIS Lew/lco, dos Charles River Laboratories - Bélgica) foramcada um incluídos neste estudo: Grupo 1: ratos não artríticos / solução salina(veículo), bólus i.v., n = 10; Grupo 2: ratos artríticos / solução salina (veícu-lo), bólus i.v., n = 10; Grupo 3: ratos artríticos / Indometacina 3 mg/kg, porvia oral diariamente durante 10 dias, n = 10; Grupo 4 : ratos artríticos / E3, 1mg/kg, bólus i.v, n = 10; Grupo 5 : ratos artríticos / 911, 10 mg/kg, bólus i.v, n= 10. As doses foram expressadas em termos de substância ativa livre(mg/kg). E3 e 911 foram preparados extemporaneamente em saline a partirda solução de matéria-prima para a concentração desejada. E3 1 mg/kg:3,41 mL da solução de matéria-prima (0,88 mg/ml) q.s.p. 15 mL de soluçãosalina. 911 10 mg/kg: 12 mL da solução de matéria-prima (2,5 mg/ml) q.s.p.15 mL de solução salina. Todas as soluções diluídas (antes de injeção i.v)foram esterilizados usando uma unidade de filtro estérila de 0,20 um. Os va-lores do pH e da osmolaridade de soluções diluídas foram medidos antes decada injeção i.v.. Antes da primeira i.v., a osmolaridade (mosm/L) para solu-ção salina, E3, e 911 foram 278, 269, e 308 respectivamente; pH para solu-ção salina, E3, e 911 foram 5,93, 6,76, 6,71 respectivamente. Antes da se-gunda i.v., a osmolaridade (mosm/L) para solução salina, E3, e 911 foram280, 270, e 309 respectivamente; pH para solução salina, E3, e 911 foram5,86, 6,72, e 6,59 respectivamente.

E3 ou 911 ou solução salina foram administrados por injeção debólus i.v. no Dia 14 e no Dia 19 depois de indução de artrite em uma ordemcodificada e aleatória com um volume de 5 mL/kg. Ao grupo não artrítico foiadministrada por bólus i.v. injeção de solução salina no Dia 14 e no Dia 19com um volume de 5 mL/kg. Indometacina foi preparada extemporaneamen-te em 1% de metilcelulose. Indometacina foi administrada por via oral (p.o.)uma vez ao dia durante 10 dias do Dia 14 ao Dia 23 depois de indução deartrite em uma ordem codificada e aleatória com um volume de 10 mL/kg.

2. Indução de artrite

No Dia 0 (D 0), foi induzida artrite em 70 ratos por injeção intra-dérmica na cauda de 0,05 ml de uma suspensão de Mycobacterium butyri-cum. Um grupo de 10 ratos não recebeu qualquer injeção intradérmica (ratosnão artríticos). No Dia 14 (D 14), os ratos artríticos foram incluídos no estudousando os seguintes critérios: todos os ratos incluídos apresentaram umaumento no volume médio da pata (média do volume das patas esquerda edireita) de no mínimo 0,30 ml comparado com o (média do volume das patasesquerda e direita) no grupo não-artrítico (medição do volume da pata con-forme descrito abaixo); todos os ratos incluídos apresentaram uma vocaliza-ção na flexão suave (medição da reação nociceptiva conforme descrito abai-xo); e todos os ratos incluídos apresentaram um escore do índice de artritede 2 a 3 sobre cada pata traseira (medição do índice de artrite conformedescrito abaixo) (os animais com um escore de 0, 1 ou 4 foram descartados).

3. Peso corporal

Os animais foram pesados uma vez ao dia do Dia 0 ao Dia 24(exceto durante os dias do fim de semana antes do tratamento: D 1, D 2, D8, D 9, D10). Todas as medições foram realizadas entre 9:00 e 12:00 damanhã exceto no D 14 (7:30 - 9:00 da manhã) e no D 24 (7:30 - 8:00 da manhã).

3. Medição do volume da pata

O volume da pata traseira direita e esquerda de cada rato (ratosartríticos e não artríticos) foi medido usando um pletismômetro. As mediçõesforam realizadas nos seguintes momentos (depois da indução de artrite): Dia14 (antes de bólus i.v. ou administração por via oral); e Dia 24 (5 dias depoisda última injeção de bólus i.v. ou 24 h depois da última administração por viaoral). Todas as medições foram realizadas entre 9:00 e 12:00 horas da ma-nhã. Todos os dados foram coletados e armazenados pelo software WinDas.

4. índice de artrite

O índice de artrite foi avaliado usando um escore de inflamaçãopara cada pata traseira e pata dianteira (ratos artríticos): Escore 0: aspectonormal; Escore 1: eritema; Escore 2: eritema com ligeiro edema; Escore 3:forte inflamação sem anquilose; Escore 4: anquilose. Esta avaliação foi reali-zada nos seguintes momentos (depois da indução de artrite): Dia 14 (antesde bólus i.v. ou administração por via oral); e Dia 24 (5 dias depois da últimainjeção de bólus i.v. ou 24 h depois da última administração por via oral).

Todas as medições foram realizadas entre 2:00 e 3:00 horas da tarde (D 14),8:00 e 9:00 horas da manhã (D 24). Todos os dados foram coletados e ar-mazenados pelo software WinDas.5. Medição da reação nociceptiva (Ensaio de vocalização)

A reação nociceptiva foi avaliada por suave flexão da pata trasei-ra direita e esquerda repetidamente 2 vezes em intervalos de 4 a 5 segun-dos com um dedo do operador (ratos artríticos). A intensidade do nível devocalização foi registrada para cada animal para cada pata traseira (2 vezes:sobre a pata traseira direita: s1 e s3; 2 vezes: sobre a pata traseira esquer-da: s2 e s4). Esta avaliação foi realizada nos seguintes momentos (depoisda indução de artrite): Dia 14 (antes de bólus i.v. ou administração por viaoral); Dia 18 (antes da segunda injeção de bólus i.v. ou 1 hora depois de10 administração por via oral); e Dia 24 (5 dias depois da última injeção de bó-lus i.v. ou 24 h depois da última administração por via oral). Todas as medi-ções foram realizadas entre 9:00 e 12:00 horas da manhã exceto em D 14(7:30 - 9:00 da manhã) e D 24 (7:30 - 9: 00 da manhã).

6. Coleta de sangue para medição da concentração de E3 ou 911 e TGF-D1circulante e parâmetros hematológicos

No Dia 24 (depois das medições do volume das patas e o índicede artrite e experimentação de ensaio), sob anaestesia geral usando isoflu-rano (em uma mistura de oxigênio e oxido nitroso), as amostras de sangue(cerca de 800 a 1000 ul) foram coletadas por ação capilar com uma micropi-peta a partir do seio retroorbital.

Medição da concentração de E3 ou 911 (grupos 2, 4 e 5): Umaparte da amostra de sangue foi coletada em tubos contendo Li-Heparina(mantida sobre gelo) e centrifugados a 2500-3000 g por 10 min. Amostras deplasma (no mínimo 100 ul_) foram obtidas, congeladas em nitrogênio líquido,armazenadas a -80°C. Uma amostra foi ligeiramente hemolisada (rato artríti-co tratado com veículo no. 36).

Medição de TGF-B1 circulante (grupos 1-2-3-4-5): Uma parte daamostra de sangue foi coletada em micro tubos para preparação de soro emtemperatura ambiente. Depois de coleta da amostra, foi misturado sangue edeixado para coagular por 30 minutos antes da centrifugação. Os tubos fo-ram centrifugados a cerca de 6000 g por 3 minutos. Cada amostra de soro(no mínimo 100 uL, exceto pelo rato no. 52 e no. 53) foi dividida em alíquo-tas e armazenadas a -20°C até análise da ativação da amostra por TGF-B1.Estas alíquotas (50 frascos) foram mantidas por um período de 6 meses ini-ciando a partir do fim do estudo. Algumas amostras foram hemolisadas ligei-ramente (rato não artrítico tratado com veículo: no. 2, no. 5, no. 9, no. 10;rato artrítico tratado com veículo: no. 53, no. 63; rato artrítico tratado com E3no. 31, no. 51; rato artrítico tratado com 911: no. 52, no. 62, no. 64). Os ní-veis de TGF-B1 foram medidos usando kit ELISA de TGF-B1 humano (ref.DB100, Lote 212258 e 213610, R&D Systems - França).

Coleta de sangue para parâmetros hematológicos (grupos 1 -2-3-4-5: 50 frascos): Uma parte da amostra de sangue foi coletada em tuboscontendo K3 - EDTA (no mínimo 100 uL). A determinação dos parâmetrosfoi realizada no dia da coleta e as amostras não foram armazenadas. Osparâmetros hematológicos inclusive hemácias, leucócitos, plaquetas, hemo-globina, hematócrito foram medidos com um contador da hematologia celular(D 24). Alguns parâmetros hematológicos não foram medidos devido às a-mostras coaguladas (rato não artrítico tratado com veículo: no. 10; ratos ar-tríticos tratados com E3: no. 59, no. 67; ratos artríticos tratados com 911: no.16).

7. Níveis de citocinas das patas

No Dia 24 (5 dias depois da última injeção de bólus i.v. ou 24horas depois da última administração por via oral) (depois de radiografias deraios-X), cada pata traseira dos animais (ratos artrítico e não artríticos) foipesada e foi coletada em um frasco de polietileno etiquetado. As amostrasde tecido foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C.

Preparação de homoqenados articulares: Patas traseiras conge-ladas foram pulverizadas usando um Bio-Pulverizador. As patas traseiraspulverizadas foram em seguida colocadas dentro de um tubo de centrífugacônico de 50 ml contendo 3 ml de PBS suplementado com 50 ul de coquetelanti-protease e homogenizadas sobre gelo usando homogenizador Ultra-Turrax (50% da velocidade máxima). Os homogenados foram em seguidacentrifugados a 2000 x g por 15 minutos a 4°C e os sobrenadantes foramfiltrados através de filtros Sartorius de 0,2 um, divididos em alíquotas e ar-mazenados a -80°C até o uso.

Medição dos níveis de citocina: Os níveis de citocina de TNF-a(kit ELISA de TNF-a de rato, ref. RTAOO, Lote 213718, R&D Systems, Fran-ça) , IL-ip de rato (kit ELISA IL-1B, ref. RLBOO, batelada 212435, R&D Sys-tems, França), IL-6 de rato (kit ELISA IL-6 , ref. R6000, Lote 211773, 214008e 214362, R&D Systems, França), e TGF-p1. Humano (kit ELISA TGF-B1,ref. DB100, batelada 212258 e 213610, R&D Systems, França) foram deter-minados em duplicata, de acordo com o procedimento do fabricante. Alíquo-tas de homogenados das patas traseiras foram armazenadas a -80°C.

8. Análise por raios-X

No Dia 24, depois da coleta de sangue os animais foram sacrifi-cados e foram obtidas radiografias de raios X (patas traseira) para avaliaçãode lesões das juntas. A análise de raios-X foi focalizada sobre erosões arti-culares, o espaço articular, anormalidades do periósteo sobre ambas as pa-tas traseira. Todas as radiografias foram analisadas olhando sete itens dife-rentes: a lesão de tecidos moles, deformidade, desmineralização, o espaçoarticular, erosões, osteogênese e reação periostal. Para cada animal, os seisprimeiros itens foram analisados de modo independente olhando a pior patatraseira. A reação periostal foi analisada olhando a cauda. Para cada item, oescore vai de 0 (normal) a 4 (lesão máxima). Portanto o escore total vai de 0a 28. A interpretação radiográfica foi feita pelo mesmo leitor sem saber nadasobre os animais (tratados ou não tratados).

9. Observações

Um animal (no. 65) morreu em D 23 depois da administração deindometacina (antes da administração em D 23) devido a uma causa desco-nhecida.

10. Análise e expressão de resultados

Todos os resultados foram reportados como Média ± S.E.M. de10 ratos em cada grupo em cada ponto de tempo. O volume das patas foiexpressado em ml calculados a partir do valor médio do volume das patasdireita e esquerda. O índice de artrite foi calculado a partir da soma do esco-re obtido para cada uma das 4 patas. A reação nociceptiva foi avaliada pelaintensidade do nível de vocalização registrado para cada animal (meda de 4valores: 2 tempos / pata) em mV. A percentagem de inibição da reação noci-ceptiva foi calculada a partir do valor médio do grupo artrítico tratado comveículo [(valor médio do grupo artrítico tratado com veículo - valor médio dogrupo artrítico tratado / valor médio do grupo artrítico tratado com veícu-lo)*! 00]. O peso corporal foi expressado em gramas. O peso das patas tra-seira (esquerda e direita) foi expressado em gramas. Os níveis de citocina(IL-6, IL-1 □, TNF-D e TGF-D1) de cada pata traseira foram expressados empg/ml. Os níveis circulantes de TGF-D1 foram expressados em pg/ml. O ín-dice radiológico para cada parâmetro (desmineralização, erosões, reaçãoperiostal, lesão de tecidos moles, espaço articular, deformidade por osteo-gênese) e o índice radiológico total (escore total) foram calculados a partir dasoma dos escores obtidos para cada parâmetro. As significâncias inter-grupodos desvios entre os valores do grupo tratado com veículo (ratos artríticos) eo grupo tratado com veículo (ratos não artríticos) foram avaliadas pelo en-saio t de Student ou Mann-Whitney Rank Sum Test quando igual variânciaou ensaio de normalidade falhou, significâncias inter-grupo dos desvios entreos valores do grupo tratado com veículo (ratos artríticos) e grupos tratadoscom E3 e tratados com 911 e tratados com Indometacina foram avaliadaspela análise 1-way de variância ANOVA seguida pelo ensaio t de Dunnettnão pareado. Uma probabilidade de P < 0,05 foi considerada como signifi-cante. Toda a análise estatística foi realizada pelo software Sigmastat™.

Resultados

1. Reação nociceptiva (ensaio de vocalização)

Conforme mostrado na Tabela 11 e na Figura 18, em D 14, areação nociceptiva foi 4147 ± 331, 4386 ± 235, 4644 ± 367 e 4468 ± 143 emgrupos artríticos tratados com veículo, tratados com indometacina, tratadoscom E3 , e tratados com 911, respectivamente. Indometacina reduziu forte-mente e significativamente a reação nociceptiva depois de 3 mg/kg/dia porvia oral (por 10 dias) por cerca de -3768 mV (% de inibição: 71 %) e -4353mV (% de inibição: 74 %) em D 18 e D 24, respectivamente comparadoscom o grupo artrítico tratado com veículo (D 18: 1511 ± 398 vs 5279 ± 326mV; D 24: 1552 ± 508 vs 5905 ± 345 mV). E3 (1 mg/kg i.v. em D 14 e D 19)reduziu fortemente e significativamente a reação nociceptiva por cerca de -4167 mV (% de inibição : 79 %) e -5905 mV (% de inibição: 100 %) em D 18e D 24, respectivamente comparado com o grupo artrítico tratado com veícu-Io (D 18: 1112 ± 401 vs 5279 ± 326 mV; D 24: 0 ± 0 vs 5905 ± 345 mV). 911(10 mg/kg i.v. 2 dias em D 14 e D 19) reduziu fortemente e significativamentea reação nociceptiva por cerca de -3932 (% de inibição: 74 %) e -5358 mV(% de inibição: 91 %) em D 18 e D 24, respectivamente comparado com ogrupo artrítico tratado com veículo (D 18: 1347 ± 492 vs 5279 ± 326 mV; D24: 547 ± 307 vs 5905 ± 345 mV).

Tabela 11. Efeitos de E3 e 911 depois de injeção i.v. (2 dias: D 14- D 19)sobre a reação nociceptiva em artrite reumatóide em ratos

<table>table see original document page 178</column></row><table>

Os valores são expressados em mV como Média ± S.E.M.n = 10 animais por grupo exceto em D 24 para Indometacina (n = 9)

ensaio t de Dunnett : * P < 0,05 vs ratos artríticos tratados comveículo

2. Peso corporal

Conforme mostrado na Tabela 12 e na Figura 19, foi observadauma acentuada redução no ganho de peso corporal em ratos artríticos emcomparação com ratos não artríticos de D 0 a D 14 devido a estabelecimen-to de artrite. Em D 14 (dia da seleção) os ratos artríticos apresentaram umasignificativa redução no peso comparados com os ratos não artríticos (289 ±2 vs 217 ± 4 g) (ensaio rde Student P<0,05). No entanto, não foi detectadadiferença significativa no peso (D 14) em todos os grupos artrítico (ensaio tde Dunnett P> 0,05). O peso corporal aumentou moderadamente e significa-tivamente no grupo tratado com Indometacina (3 mg/kg/dia por 10 dias) de D17 a D 24 com um máximo de cerca de 43 g em D 24 comparado com ogrupo artrítico tratado com veículo (261 ±5 vs 218 ± 3 g). Depois de trata-mento com E3 (1 mg/kg i.v. em D 14 e D 19), o peso corporal aumentou mo-deradamente e significativamente de D 17 a D 24 com um máximo de cercade 46 g em D 24 comparado com o grupo artrítico tratado com veículo (264 ±5 g vs 218 ± 3 g). Depois de tratamento com 911 (10 mg/kg i.v. em D 14 e D19), o peso corporal aumentou moderadamente e significativamente de D 18a D 24 com um máximo de cerca de 47 g em D 24 comparado com o grupoartrítico tratado com veículo (265 ± 7 vs 218 ± 3 g).Tabela 12. Efeitos de E3 e 911 depois de injeção i.v. (2 dias: D 14- D 19) sobre o peso corporal em artrite reumatóide em ratos

<table>table see original document page 180</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 181</column></row><table>

Os valores são expressados em gramas como Média ± S.E.M.

n = 10 animais por grupo exceto em D 23 e D 24 (n = 9) para Indometacinaensaio ide Dunnett: * P £ 0,05 vs ratos artríticos tratados com veículo3. Volume das patas

Em D 14, foi realizada uma randomização de modo a obter gru-pos homogêneos em termos de volume da pata. Conforme mostrado na Ta-bela 13, em D 14, o volume da pata traseira (média do volume da pata direi-ta e esquerda) foi significativamente maior no grupo artrítico do que no gruponão artrítico (2,10 ± 0,05 vs 1,44 ± 0,02 ml_ (ensaio ide Student P<0,05)).Indometacina (3 mg/kg/dia por via oral por 10 dias) reduziu significativamen-te o volume das patas por cerca de -0,75 ml_ (D 24) comparado com o grupoartrítico tratado com veículo (1,59 ± 0,03 ml_ vs 2,34 ± 0,08 ml_). E3 (1 mg/kgi.v. em D 14 e D 19) aumentou ligeiramente e significativamente o volumedas patas por cerca de 0,37 mL comparado com o grupo artrítico tratadocom veículo (2,71 ± 0,09 mL vs 2,34 ± 0,08 mL). 911 (10 mg/kg i.v. em D 14e D 19) aumentou ligeiramente e significativamente o volume das patas porcerca de 0,36 mL comparado com o grupo artrítico tratado com veículo (2,70±0,11 mLvs 2,34 ±0,08 mL).

Tabela 13. Efeitos de E3 e 911 depois de injeção i.v. (2 dias: D 14 - D 19)sobre o volume das patas em artrite reumatóide em ratos

<table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table>

Os valores são expressados em ml_ como Média ± S.E.M.

n = 10 animais por grupo exceto em D 24 para Indometacina (n = 9)

ensaio f de Dunnett : * P < 0,05 vs ratos artríticos tratados comveículo

4. índice de artrite

Conforme mostrado na Tabela 14, no D 14, o índice de artrite foide 10,1 ± 0,8, 8,7 ± 0,6, 10,2 ± 0,4 e 9,4 ± 0,7 e em grupos artríticos tratadoscom veículo, tratados com indometacina, tratados com E3, e tratados com911, respectivamente. Indometacina reduziu fortemente e significativamenteo índice de artrite depois de 3 mg/kg/dia por via oral (por 10 dias) por ummáximo de cerca de -8,0 comparado com o grupo artrítico tratado com veí-culo (2,7 ± 0,7 vs 10,7 ± 0,6). E3 (1 mg/kg i.v. no D 14 e D 19) não afetou oíndice de artrite comparado com o grupo artrítico tratado com veículo (11,4 ±0,4 vs 10,7 ± 0,6). 911 (10 mg/kg i.v. no D 14 e D 19) não afetou o índice deartrite comparado com o grupo artrítico tratado com veículo (10,9 ± 0,7 vs 10,7 ±0,6).

Tabela 14. Efeitos de E3 e 911 depois de injeção i.v. (2 dias: D 14- D 19)sobre o índice de artrite em artrite reumatóide em ratos

<table>table see original document page 183</column></row><table><table>table see original document page 184</column></row><table>

Os valores são expressados como Média ± S.E.M. (escore)n = 10 animais por grupo exceto para Indometacina (n = 9)ensaio f de Dunnett : * P < 0,05 vs ratos artríticos tratados comveículo

5. Níveis de citocina das patas

Conforme mostrado na Tabela 15, em D 24, os níveis de citocinanas patas esquerda e direita estavam aumentados no grupo artrítico tratadocom veículo por um máximo de cerca de 3,5 (IL-1 □), 4 (TNF-D) e 1,8 (TGF-□ 1) vezes comparado com o grupo não artrítico tratado com veículo. Não foiobservada diferença significativa para os níveis de IL-6, na pata direita e es-querda, entre os dois grupos. Os níveis de citocina do grupo artrítico foramsimilares na pata esquerda e direita: 259,7 ± 38,5 vs 219,2 ± 32,4, 4802,8 ±365.5 vs 4007,1 ± 380,4, 17,8 ± 1,6 vs 18,6 ± 1,9 e 9735,0 ± 1219,8 vs9161,4 ± 846,1 pg/ml para IL-6, IL-1p, TNF-oc e TGF-pi respectivamente.

Indometacina reduziu ligeiramente, mas significativamente, o nível de TGF-p1 na pata direita depois de 3 mg/kg/dia por via oral (por 10 dias) por cercade 1,3 vezes, comparada com o grupo artrítico tratado com veículo (7057,4 ±335.6 vs 9161,4 ± 846,1), ao passo que não modificou os níveis de IL-6,TNF-a ou IL-ip. Foi observado um efeito similar mas não significativo na pata esquerda. E3 (1 mg/kg i.v. no D 14 e D 19) não afetou os níveis de IL-6,IL-1(3, TNF-a ou TGF-pi, em ambas as patas, comparado com o grupo artrí-tico tratado com veículo. 911 (10 mg/kg i.v. em D 14 e D 19) aumentou onível de IL-ip na pata direita comparado com o grupo artrítico tratado comveículo (6215,3 ± 666,7 vs 4007,1 ± 380,4). Não teve nenhum efeito sobreoutros níveis de citocina em ambas as patas.Tabela 15. Efeito de E3 e 911 depois de iniecão i.v. (2 dias em D 14 e D 19)sobre os níveis de citocina das patas em ratos artríticos reumatóides

<table>table see original document page 185</column></row><table>Os valores são expressados em pg/ml, como Média ± S.E.M.n = 10 animais por grupo exceto por Não artrítico/veículo (Patadireita), Artrítico/veículo (Pata esquerda) e Indometacina (n = 9)ensaio t de Dunnett : * P < 0,05 vs ratos artríticos tratados comveículo

6. Medição de TGF-B1 circulante

Conforme mostrado na Tabela 16, em D 24, o nível sérico deTGF-B1 estava aumentado no grupo artrítico tratado com veículo comparadocom o grupo não artrítico tratado com veículo (81715,7 ± 1984,1 vs 60269,9± 2142,8). Indometacina reduziu significativamente o nível sérico de TGF-Didepois de 3 mg/kg/dia por via oral (por 10 dias) por cerca de 1,5 vezes,comparado com o grupo artrítico tratado com veículo (57222,2 ± 3194,1 vs81715,7 ± 1984,1). E3 (1 mg/kg i.v. em D 14 e D 19) e 911 (10 mg/kg i.v. emD 14 e D 19) reduziu significativamente o nível sérico de TGF-01 de modoque o nível de citocina nos grupos tratado com E3 e tratado com 911 foramcomparáveis com os observados no grupo não artrítico tratado com veículo(69408,8 ± 3926,7 e 67214,5 ± 3649,4 respectivamente, vs 60269,9 ±2142,8).

Tabela 16. Efeito de E3 e 911 depois de injeção i.v. (2 dias em D 14 e D 19)sobre os níveis séricos de TGF-[31 em ratos artríticos reumatóides

<table>table see original document page 186</column></row><table>

Os valores são expressados em pg/ml, como Média ± S.E.M.n = 10 animais por grupo exceto por Não-artrítico/veículo (Patadireita), Artrítico/veículo (Pata esquerda) e Indometacina (n = 9)ensaio f de Dunnett : * P < 0,05 vs ratos artríticos tratados comveículo

7. Parâmetros hematolóqicos

Conforme mostrado na Tabela 17, os parâmetros hematológicostais como hemácias e plaquetas foram maiores em ratos artríticos tratadoscom veículo em comparação com ratos não artríticos tratados com veículo(ensaio t de Student P<0,05), ao passo que as hemácias, hemoglobina ehematócrito (ensaio t de Student P>0,05) foram inalterados. Indometacinanão afetou os parâmetros sangüíneos depois de 3 mg/kg/dia por via oral (por10 dias) comparado com o grupo artrítico tratado com veículo. E3 (1 mg/kgi.v. em D 14 e D 19) não afetou os parâmetros sangüíneos comparado como grupo artrítico tratado com veículo. 911 (10 mg/kg i.v. em D 14 e D 19) nãoafetou os parâmetros sangüíneos comparado com o grupo artrítico tratadocom veículo.

Tabela 17. Efeitos de E3 e 911 depois de injeção i.v. (2 dias em D 14 e D 19)sobre parâmetros sangüíneos na artrite reumatóide em ratos (Medição em D

<table>table see original document page 187</column></row><table><table>table see original document page 188</column></row><table>

Os valores são expressados como Média ± S.E.M.

Anova: P> 0,05 vs ratos artríticos tratados com veículo

7. Peso da pata traseira

Conforme mostrado na Tabela 18, o peso da pata traseira es-querda e direita foi maior nos ratos artríticos tratados com veículo do quenos ratos não artríticos tratados com veículo (3,43 ± 0,11 vs 1,98 ± 0,01 e3,32 ± 0,12 vs 1,99 ± 0,02 g, respectivamente) (ensaio t de Student ouMann-Withney P<0,05). Indometacina reduziu significativamente o peso daspatas traseiras depois de 3 mg/kg/dia por via oral (por 10 dias) comparadocom o grupo artrítico tratado com veículo (pata traseira esquerda : 2,23 ±0,04 vs 3,43 ± 0,11 g; pata traseira direita: 2,20 ± 0,05 vs 3,32 ±0,12 g). E3(1 mg/kg i.v. em D 14 e D 19) somente aumentou significativamente o pesoda pata traseira esquerda comparado com o grupo artrítico tratado com veí-culo (pata traseira esquerda : 3,86 ±0,14 vs 3,43 ±0,11 g; pata traseira di-reita: 3,72 ± 0,13 vs3,32 ± 0,12 g). 911 (10 mg/kg i.v. em D 14 e D 19) so-mente aumentou significativamente o peso da pata traseira direita compara-do com o grupo artrítico tratado com veículo (pata traseira esquerda : 3,73 ±0,12 vs 3,43 ±0,11 g; pata traseira direita: 3,83 ±0,15 vs 3,32 ±0,12 g).Tabela 18. Efeitos de E3 e 911 depois de injeção i.v. 12 dias em D 14 e D 19)sobre o peso das patas traseiras na artrite reumatóide em ratos (Medição em D 24)

<table>table see original document page 189</column></row><table> Os valores são expressados em gramas como Média ± S.E.M.

n = 10 animais por grupo exceto para Indometacina (n = 9)

test ide Dunnett: * P < 0,05 vs ratos artríticos tratados com veículo

8. Análise por raios-X

Conforme mostrado na Tabela 19, foi observado um escore totalde 0,0 ± 0,0 nos ratos não-artríticos tratados com veículo. Os ratos artríticostratados com veículo têm um escore total de 15,1 ± 1,3 com altos escorespara desmineralização (2,4 ± 0,3), erosões (2,7 ± 0,3), lesão de tecidos mo-les (3,1 ± 0,2) e espaço articular (3,3 ± 0,2), um escore moderado para rea-ção periostal (1,0 ± 0,3), osteogênese (0,8 ± 0,2) e deformidade (1,8 ± 0,2).Indometacina (3 mg/kg/dia por via oral por 10 dias) reduziu fortemente e sig-nificativamente o escore total por cerca de 10,7 em comparação com ratosartríticos tratados com veículo (4,4 ± 0,9 vs 15,1 ±1,3). E3 (1 mg/kg i.v. no D14 e D 19) não afetou o escore total comparado com o grupo artrítico tratadocom veículo (14,2 ± 1,3 vs 15,1 ± 1,3). 911 (10 mg/kg i.v. em D 14 e D 19)não afetou o escore total comparado com o grupo artrítico tratado com veí-culo (15,4 ± 10vs 15,1 ±1,3).Tabela 19. Efeitos de E3 e 911 depois de iniecão i.v. (2 dias em D 14 e D 19) sobre parâmetros de raios-X em artrite reumatóide

<table>table see original document page 191</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 192</column></row><table>

Os valores são expressados como Média ± S.E.M (escore).

n = 10 animais por grupo exceto para Indometacina (n = 9)

test t de Dunnett: * P < 0,05 vs ratos artríticos tratados com veículoConclusão

Sob as condições experimentais descritas acima, E3 (1 mg/kgi.v. 2 dias: D 14 - D 19) e 911 (10 mg/kg i.v. 2 dias: D 14 - D 19) apresenta-ram fortes efeitos analgésicos, mas não apresentaram efeitos antiinflamató-rios significativos neste modelo de artrite.

Exemplo 8: Efeitos de diferentes doses de anticorpo anti-NGF E3 em ummodelo de artrite reumatóide em rato

A capacidade de E3 para produzir redução na dor em ratos artrí-ticos foi adicionalmente investigada examinando a relação da reação da do-se entre administração de E3 e redução da dor. Os ratos foram tratados comadjuvante para induzir artrite conforme descrito acima. Dez ratos não-injetados com adjuvante foram usados como controles não-artríticos. Qua-torze dias depois da injeção de adjuvante, os animais foram qualificados noestudo com base nos critérios determinados acima, randomizados em oitogrupos de dez ratos e testados para a intensidade de sua reação de vocali-zação. Em seguida eles foram dosados dia 14 com solução salina, ou 0,003mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg ou 5 mg/kgde anticorpo E3 conforme descrito acima. Os animais foram testados parasua reação de vocalização nos dias 16, 18, 20, e 24. Os animais foram redo-sados com solução salina ou a mesma dose de E3 no dia 18 depois do ex-perimento de vocalização. Os animais foram também pesados a cada dia,iniciando no dia 14. Portanto, os animais foram dosados duas vezes comuma dada dose do anticorpo ou solução salina nos dias 14 e 18, e avaliadospara dor cinco vezes, nos dias 14, 16, 18, 20 e 24. Os são mostrados nasTabelas 20 a 22 e nas Figuras 20 a 22.Tabela 20. Efeitos de diferentes doses de E3 sobre reação nociceotiva (in-tensidade da vocalização) em ratos artríticos reumatóides. Os valores daintensidade da vocalização são expressados em mV como média ± s.e.m.

<table>table see original document page 194</column></row><table>

O efeito de tratar animais com várias doses de anticorpo anti-NGF E3 sobre a vocalização induzida por dor (dados mostrados na Tabela20) foi analisado estatisticamente usando "two-way" (ANOVA) para compa-rar os resultados obtidos pareados entre animais artríticos tratados com veí-culo com aqueles tratados com uma dada dose do anticorpo E3. Houve umefeito altamente significativo em todos os níveis de E3 testados (p < 0,0001).Mesmo na menor dose testada (0,003 mg/kg de E3), a diferença na vocali-zação foi significativa (p < 0,0001).

Conforme mostrado na Tabela 20 e na Figura 20, de acordo comos experimentos acima, o tratamento com anticorpo E3 a 1 mg/kg mostrouum alívio rápido e forte da dor. Dentro de dois dias (o ponto de tempo maiscedo testado) a intensidade da vocalização baixou por 90%. Tratamento commenores concentrações de E3 também proporcionou forte alívio da dor, em-bora em menores doses o alívio da dor levou um pouco mais de tempo parase manifestar. É provável que a redução aparente na eficácia no dia 24 detodas exceto as maiores doses testadas seja devida a uma redução no nívelreal do nível plasmático de E3 secundário a uma reação imune pelos ratosobjetos de experiência. É evidente que doses tão baixas quanto 0,003 mg/kgproporcionam no mínimo alívio parcial da dor neste modelo.Tabela 21. Efeitos de diferentes doses de E3 sobre o peso corporal em ratosartríticos reumatóides (normalizado até o dia 14).

<table>table see original document page 195</column></row><table><table>table see original document page 196</column></row><table>

O efeito de tratar animais com várias doses de anticorpo anti-NGF E3 sobre o peso corporal foi analisado estatisticamente usando ANO-VA two-way para comparar os resultados obtidos pareados entre animaisartríticos tratados com veículo com aqueles tratados com uma dada dose doanticorpo E3. Usando dados normalizados para o peso no dia 14 (Tabela21), doses de 0,03 mg/kg de E3 resultaram em uma alteração significativano peso corporal (p<0.005). Em toda a dose maior de E3, a diferença entreanimais artríticos tratados e não tratados foi significativa (p = ou < 0,0001).

Usando dados normalizados para o peso no dia 0 (Tabela 22), dose de 0,03mg/kg de E3 resultou em uma alteração significativa no peso corporal(p<0.002). Em toda a dose maior de E3, a diferença entre animais artríticostratados e não tratados foi significativa (p < 0,0001).

Novamente de acordo com estudos anteriores, ratos tratadoscom E3 apresentaram menos perda de peso aparente do que ratos artríticostratados com solução salina (Tabela 22 e Figura 22). De fato, ratos tratadoscom altas doses do anticorpo E3 foram recuperando a perda de peso anteri-or, e na verdade ganhando peso mais rápido do que suas coortes não artríti-cas (Tabela 21 e Figura 21).

Exemplo 9. Efeitos analgésicos de anticorpo anti-NGF E3 em pacientes comdor moderada a grave de osteoartrite do joelho

Neste estudo de escalonamento da dose, randomizado, contro-lado por placebo, duplo-cego, efeitos analgésicos de doses intravenosasúnicas (3 ug/kg, 10 ug/kg, 30 ug/kg, 100 ug/kg, ou 300 ug/kg) de anticorpoanti-NGF E3 foram comparados com placebo em pacientes com dor mode-rada a grave de osteoartrite do joelho. Adultos do sexo masculino e do sexofeminino (idades entre 35 a 65) que sofreram dor moderada a grave de oste-oartrite do joelho, mas tendo de outro modo boa saúde global foram regis-trados no estudo. Durante o período de triagem, foi exigido dos pacientesque descontinuassem as medicações contra artrite tais como NSAIDs, inibi-dores da ciclooxigenase tipo-2 (COX-2), e opiáceos no mínimo 14 dias antesda administração de anticorpo anti-NGF E3. Os pacientes foram autorizadosa usar medicações de auxílio de acetaminofen ou ibuprofen com algumasrestrições com base em achados laboratoriais ou histórico médico passado.

Alguns pacientes tomaram medicações de auxílio durante o estudo, mas asmedicações de auxílio não foram consumidas por 2 dias antes e depois daadministração de anticorpo anti-NGF E3.

Trinta e quatro pacientes foram admitidos no estudo e avaliadoscomo pacientes internados para os Dias de Estudo -1, 1 e 2. A administra-ção de anticorpos anti-NGF E3 ocorreu na manhã do Dia 1. Foram usadosdiários eletrônicos para registrar o índice de dor do joelho e uso de medica-ção de auxílio na clínica e em casa. Dez pacientes foram tratados com pla-cebo. Vinte e quatro pacientes foram tratados com anticorpo anti-NGF E3:quatro pacientes por nível de dose para 3 ug/kg (coorte 1), 10 ug/kg (coorte2), e 30 M9/k9 (coorte 3); e seis pacientes por nível de dose para 100 ug/kg(coorte 4) e 300 ug/kg (coorte 5). O placebo usado foi Injeção de Cloreto deSódio a 0,9% estérila, USP (solução salina normal). Anticorpo anti-NGF E3foi uma formulação líquida congelada consistindo em 10 mg/ml de anticorpoem uma solução aquosa de 10 mM de histidina, 275 mM de sacarose, 0,01%de polissorbato 20, pH 6.0. Uma hora antes da administração IV, anticorpocongelado foi degelado e diluído em Injeção de Cloreto de Sódio, USP. Ovolume para cada paciente foi calculado com base no peso do paciente Dia -1 e nível de dose atribuída, variando de 3-6 cc para a coorte 1, 10-20 cc paraa coorte 2, 30-60 cc para a coorte 3, e 100 cc para a coorte 4 e a coorte 5.Para as coortes 1 e 2, o anticorpo E3 foi administrado por um bólus IV lentodurante 3 a 5 minutos, seguido por um jato IV de 5 cc de Injeção de Cloretode Sódio, USP. Para as coortes 3-5, anticorpo E3 foi administrado a 100cc/hour através de bomba de infusão, seguido por um jato IV de 5 cc de In-jeção de Cloreto de Sódio, USP e descontinuação do IV. Dentro de cadacoorte, o placebo (Injeção de Cloreto de Sódio, USP) foi administrado porbólus lento ou infusão contínua do mesmo modo que o anticorpo E3.

Depois de dois dias hospitalizados, os pacientes tiveram alta.Dependendo da coorte do nível de dose, eles continuaram a ser avaliadospara níveis de dor por 28 dias depois da administração de anticorpo E3 (Co-ortes 1, 2, e 3) ou até 181 dias depois da administração de anticorpo E3(Coortes 4 e 5). Foi feita avaliações periódicas de segurança por 181 diasem todos os pacientes.

Os efeitos analgésicos foram avaliados antes da dosagem e emmúltiplos tempos depois da administração de anticorpo E3. VAS eletrônicovalidado variando de 0-100 com 101 pontos de resolução foi usado para ín-dice da dor do joelho corrente. Os pacientes foram informados 4 vezes diari-amente e instruídos a indicar o nível de dor de artrite no índice do joelho na-quele momento. VAS eletrônico validado variando de 0-100 com 101 pontosde resolução também foi usado para índice da dor do joelho durante deam-bulação. VAS para índice da dor do joelho durante deambulação foi comple-tado diariamente, concorrente com o quarto índice corrente de VAS da dordo joelho.

Foi emitido diário eletrônico para coleta de dados no dia -8 e foifeita uma avaliação de triagem de 7 dias da aceitação do diário eletrônico dodia -8 ao dia -2 para determinar o sucesso no uso dos diários eletrônicospara um dado sujeito. Os indivíduos foram instruídos a completar 4 diáriospor dia. O VAS médio registrado durante o período de triagem é usado comolinha de base para avaliação da eficácia.

Também foi usada a WOMAC (Western Ontario and McMaster

Universities Arthritis Scale) 3.1 Osteoarthritis Index Version VA.T© para ava-liar a dor de artrite. WOMAC 3.1 TM consiste em 24 questões divididas em 3domínios: dor (5 questões), rigidez (2 questões), e função física (17 ques-toes). Bellamy et al., J. Rheumatol 15:1833-40 (1988); e Bellamy, Semin.Arthritis Rheum. 18:14-7 (1989). O domínio da função física proporciona in-formação da capacidade para realizar as atividades da vida diária. Os paci-entes realizaram o ensaio diretamente no diário eletrônico durante visitasclínicas designadas, usando VAS eletrônico validado variando de 0-100 com101 pontos de resolução. Cada domínio foi classificado determinando asmédias dos escores de VAS das questões componentes. O WOMAC 3.1TMtotal foi classificado determinando as médias dos escores de cada um dos 3domínios. Os pacientes também foram instruídos a relatar medicação deauxílio usada através do diário eletrônico.

O resultado foi avaliado como alteração da linha de base (nívelde dor durante o período de triagem), expressado como diferença da inten-sidade da dor (PID) ou soma da diferença da intensidade da dor (SPID) paradiferentes níveis de dose. As alterações da linha de base nas medições daatividade foram analisadas usando uma análise do modelo de covariância(ANCOVA) com tratamento como o fator principal e dor basal como um co-variado. Para médias e alterações médias, foram feitas comparações do an-ticorpo E3 com placebo usando ensaio de Dunnett. Foi usado ensaio de ten-dência de Tukey-Ciminera-Heyse para avaliar a relação dose-resposta.

Conforme mostrado na Figura 24, a redução da intensidade dador diária média depois da única administração de anticorpo anti-NGF E3 foiobservada em cada dose testada. De modo geral, o efeito na redução daintensidade da dor durou mais tempo no grupo tratado com maior dose (30ug/kg, 100 ug/kg e 300 ug/kg) do que no no grupo tratado com menor dose(3 ug/kg e 10 ug/kg). Conforme mostrado na Figura 25, as reduções na in-tensidade da dor duraram por no mínimo 80 dias depois da administração de100 ug/kg de E3.

A Tabela 23 abaixo mostra a soma das diferenças da intensida-de da dor (SPID) para cada dosagem de E3 para os dias 2-8, dias 2-14, dias2-21, e dias 2-28 comparada com níveis basais. ANCOVA foi usado paraanálise estatística. A Tabela 23 indica que a redução da dor foi estatistica-mente significante (p < 0,05) depois de administração única de anticorpo an-ti-NGF E3.

Tabela 23. Soma das diferenças da intensidade da dor para intervalos de

tempo variáveis comparada com a linha de base.

<table>table see original document page 200</column></row><table>

Foi feita análise etatisticamente sem ajuste e com ajuste paramúltiplas comparações. A primeira linha de valores de p dentro de parênte-ses para cada intervalo de tempo foi sem ajuste; a segunda linha de de valo-res de p dentro de parênteses foi com ajuste de Dunnett..

Conforme mostrado na Figura 26, a percentagem de reduçãomáxima em SPID pela administração única de anticorpo anti-NGF E3 atingiucerca de 45% até cerca de 65% do dia 2 ao dia 14 para cada dose de E3testada, e atingiu cerca de 45% até cerca de 60% do dia 2 ao dia 28 paradose de 10 ug/kg, 30 ug/kg, 100 ug/kg, e 300 ug/kg de E3.

Conforme mostrado na Figura 27, a administração de anticorpoanti-NGF E3 também reduziu o escore WOMAC do dia 1 ao dia 28. O escorede dor, função física e rigidez foi reduzido significativamente em dose de 100ug/kg de E3. Estes dados indicam que a administração única de anticorpoanti-NGF não somente reduz a dor, mas também melhora a função física e arigidez em pacientes tendo osteoartrite.

Depósito de Material Biológico

Os materiais seguintes foram depositados junto à American Ty-pe Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia, EUA (ATCC):

<table>table see original document page 201</column></row><table>

O vetor Eb.911.3E é um polinucleotídeo codificando a regiãovariável de cadeia leve E3; o vetor Eb.pur.911.3E é um polinucleotídeo codi-ficando a região variável de cadeia leve E3, e o vetor Db.911.3E é um poli-nucleotídeo codificando a região variável de cadeia pesada E3.

Este depósito foi feito segundo as estipulações do Tratado deBudapest acerca do Reconhecimento Internacional do Depósito de Microor-ganismos para fins de Procedimento de Patente e de Regulamentações su-bordinadas (International Recognition of the Deposit of Microorganisms forthe Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder (Tratadode Budapest)). Este garante a manutenção de uma cultura viável do depósi-to por 30 anos da data de depósito. O depósito será tornado disponível pelaATCC sob os termos do Tratado de Budapest, e estará sujeito a um acordoentre Rinat Neuroscience Corp. e a ATCC, o qual garante disponibilidadepermanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito para o público napublicação da patente dos Estados Unidos pertinente ou na exposição aopúblico de qualquer pedido de patente dos Estados Unidos ou estrangeira,qualquer que venha primeiro, e assegura disponibilidade da progênie paraalguém determinado pelo Comissário de Patentes de Marcas Registradasdos Estados Unidos {U.S. Commissioner of Patents and Trademarks) a serintitulado para isso de acordo com 35 USC Section 122 e as regras do Co-missário de acordo para isso (inclusive 37 CFR Section 1.14 com particularreferência a 886 OG 638).

O representante do presente pedido concordou que se uma cul-tura dos materiais em depósito morrese ou fosse perdida ou destruída quan-do cultivada sob condições adequadas, os materiais serão prontamentesubstituídos sob notificação com outros dos mesmos. A disponibilidade domaterial depositado não deve ser considerada como uma licença para práti-ca da invenção em contravenção dos direitos concedidos sob a autoridadede qualquer governo de acordo com suas leis de patente.Seqüências de anticorpos

Região variável de cadeia pesada (CDRs Kabat estão sublinha-das; CDRs Chothia estão EM NEGRITO E EM ITÁLICO)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGyPLA/WIRQPPGKGLEWIG//l/yGPG7TPyA/S>A\//CSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGmyATSYYFDWVGQGTLVTVS (SEQ ID NO: 1)

Região variável de cadeia leve (CDRs Kabat estão sublinhadas;CDRs Chothia estão EM NEGRITO E EM ITÁLICO)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCfí^SQS/S/VA/L/WVYQQKPGKAPKLLIY YTSfíFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHrLPyTFGQGTKLEIKRT (SEQ ID NO: 2)

CDRs estendidas de cadeia pesada E3

CDRH1: GFSLIGYDLN (SEQ ID NO: 3)

CDRH2: IIWGDGTTDYNSAVKS (SEQ ID NO: 4)

CDRH3: GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO: 5)

CDRs estendidas de cadeia leve E3

CDRL1: RASQSISNNLN (SEQ ID NO: 6)

CDRL2: YTSRFHS (SEQ ID NO: 7)

CDRL3: QQEHTLPYT (SEQ ID NO: 8)

CDRs estendidas 911 de anticorpo monoclonal de camundongoCDRs estendidas de cadeia pesada 911

CDRH1 : GFSLIGYDIN (SEQ ID NO: 9)

CDRH2 : MIWGDGTTDYNSALKS (SEQ ID NO: 10)

CDRH3: GGYYYGTSYYFDY (SEQ ID NO: 11)

CDRs estendidas de cadeia leve 911

CDRL1: RASQDISNHLN (SEQ ID NO: 12)

CDRL2: YISRFHS (SEQ ID NO: 13)

CDRL3: QQSKTLPYT (SEQ ID NO: 14)

Seqüência de aminoácidos de cadeia pesada E3 (total)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIW

GDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWY

ATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY

FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTC

NVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSV

LTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSRE

EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 16)

Seqüência de aminoácidos de cadeia leve 3E (anticorpo total)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHXVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 17)

Seqüência de nucleotídeos de cadeia pesada 3E (anticorpo total)CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATT

G G G ATTATCTG G G GTG ATGG AACC AC AG ACTATAATTCAGCTGTC AAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCC

TGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTA

AGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCACCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACG

GATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA(SEQ ID NO: 65)

Seqüência de nucleotídeos de domínio variável de cadeia pesada 3E

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAACCACAGACTATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 66)Seqüência de nucleotídeos de cadeia leve 3E (anticorpo total)

GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTTCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCT

GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACMAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA(SEQ ID NO: 67)

Seqüência de nucleotídeos de domínio variável de cadeia leve 3EGATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGC(SEQ ID NO: 68)

Entende-se que os exemplos e modalidades descritos aqui, são para finsilustrativos somente e que serão sugeridas várias modificações ou altera-ções a luz dos mesmos às pessoas versadas na arte e devem ser incluídasdentro do espírito e do campo de ação deste pedido.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> RINAT NEUROSCIENCE CORPORATION

ROSENTHAL, Arnon

SHELTON, David L.

WALICKE, Patricia A.<12 0> MÉTODOS PARA TRATAR DOR DE OSTEOARTRITE ADMINISTRANDO UM ANTAGO

NISTA DE FATOR DE CRESCIMENTO NERVOSO E COMPOSIÇÕES CONTENDO

MESMO

<130> 514712001460<140> PCT/US2006/013921<141> 2005-04-11<150> US 11/104,248

<151> 2006-04-11<160> 77

<170> FastSEQ for Windows Versão 4.0

<210> 1<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 1

Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu

1:5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr

20 25 30

Asp Leu Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly lie lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai Lys

50 55 60

Ser Arg Vai Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser115 120<210> 2<211> 109<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 2

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly

15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Asn Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu His Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr

100 105<210> 3<211> 10<212> prt

<213> Seqüência artificial<223> Construção sintética

<400> 3

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Asn15 10<210> 4<211> 16<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 4

Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai Lys Ser

10 15

<210> 5<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 5 ...

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr15 10

<210> 6

<211> ■: 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 6Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu Asn15 10<210> 7<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 7

Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificiai<220>

<223> Construção sintética

<400> 8

Gln Gln Glu His Thr Leu Pro Tyr Thr

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr Asp lie Asn15 10

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Met lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser15 10<210> 11<211> 13<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 11

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 12<211> 11<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn His Leu Asn

15 10<210> 13<211> 7<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 13Tyr lie Ser Arg Phe His Ser

1 5<210> 14<211> ; 9

<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 14

Gln Gln Ser Lys Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5<210> 15<211> 15<212> PRT<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

15 10 15

<210> 16<211> 447<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 16

Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu

15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr

20 25 30

Asp Leu Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly lie lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai Lys

50 55 60

Ser Arg Vai Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys <3ly Pro Ser

115 120 125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr VaiSer Trp Asn Ser

Vai Leu Gln Ser180

Pro Ser Ser Asn195

Lys Pro Ser Asn210

Vai Glu Cys Pro225

Phe Leu Phe Pro

Pro Glu Vai Thr260

Vai Gln Phe Asn275

Thr Lys Pro Arg290

Vai Leu Thr Vai305

Cys Lys Vai Ser

Ser Lys Thr Lys340

Pro Ser Arg Glu355

Vai Lys Gly Phe370

Gly Gln Pro Glu385

Asp Gly Ser Phe

150

Gly Ala Leu Thr165

Ser Gly Leu Tyr

Phe Gly Thr Gln200

Thr Lys Vai Asp215

Pro Cys Pro Ala230

Pro Lys Pro Lys245

Cys Vai Vai Vai

Trp Tyr Vai Asp280

Glu Glu Gln Phe295

Vai His Gln Asp310

Asn Lys Gly Leu325

Gly Gln Pro Arg

Glu Met Thr Lys360

Tyr Pro Ser Asp375

Asn Asn Tyr Lys390

Phe Leu Tyr Ser

155

Ser Gly Vai His170

Ser Leu Ser Ser185

Thr Tyr Thr Cys

Lys Thr Vai Glu220

Pro Pro Vai Ala235

Asp Thr Leu Met250

Asp Vai Ser His265

Gly Vai Glu Vai

Asn Ser Thr Phe300

Trp Leu Asn Gly315

Pro Ser Ser lie330

Glu Pro Gln Vai345

Asn Gln Vai Ser

lie Ala Vai Glu380

Thr Thr Pro Pro395

Lys Leu Thr Vai

160

Thr Phe Pro Ala175

Vai Vai Thr Vai190

Asn Vai Asp His205

Arg Lys Cys Cys

Gly Pro Ser Vai240

lie Ser Arg Thr255

Glu Asp Pro Glu270

His Asn Ala Lys285

Arg Vai Vai Ser

Lys Glu Tyr Lys320

Glu Lys Thr lie335

Tyr Thr Leu Pro350

Leu Thr Cys Leu365

Trp Glu Ser Asn

Met Leu Asp Ser400

Asp Lys Ser Arg405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 17<211> 214<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<220>

<221> VARIANT<222> 190

<223> Xaa = Any Amino Acid

<400> 17

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly

15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Asn Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu His Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160

Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Xaa Vai Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 18<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 18

Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Asn Asn Leu Asn1 5 10

<210> 19<211> 7<212> : PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 19

Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser

1 5<210> 20<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 20

Arg Ala Ser Gln Tyr lie Ser Asn His Leu Asn

15 10<210> 21<211> 7<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 21

Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser

1 5<210> 22<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 22

Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Asn Gln Leu Asn

15 10<210> 23<211> 7<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 23Tyr Vai Ser Arg Phe His Ser

1 5<210> 24<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 24

Arg Ala Phe Gln Ala lie Ser Asn Gln Leu Asn

15 10<210> 25<211> 7<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 25

Tyr lie Ser Arg Phe His Thr

1 5<210> 26<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 26

Arg Ala Phe Gln Ser lie Ser Asn Gln Leu Asn

15 10<210> 27<211> 7<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 27

Tyr Ala Ser Arg Phe His Ser

1 5

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 28

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Ser Asn

1 5 10

<210> 29

<211> 14

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 29

Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu

15 10

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 30

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Asn15 10<210> 31<211> 14<212> PRT<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 31

lie lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai1 5 10

<210> 32<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 32

Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr Asp Vai Thr15 10<210> 33<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 33

Gly lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai

15 10<210> 34

<2ii> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 34

Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr Asp Vai Thr

15 10<210> 35<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 35

Gly lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Vai

15 10<210> 36<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 36

Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr Asp Ala Thr

15 10<210> 37<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 37

Gly lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 38

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Vai Ser

15 10

<210> 39

<211> 14

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 39

Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Vai

15 10

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> : Construção sintética

<400> 40

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr Asp Ile Ser

1 5 10

<210> 41

<211> 14

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220><223> Construção sintética

<400> 41

Gln lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Vai15 10

<210> 42<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 42

Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr Asp Ala Ser

15 10<210> 43<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência artificiai

<220>

<223> Construção sintética

<400> 43

Gly lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Vai15 10

<210> 44

<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 44Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr Asp Ser Thr15 10<210> 45<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 45

Ser lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu

15 10<210> 46<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 46

Gly Gly Tyr Trp Tyr Gly Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 47<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> : 47

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 48<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética<400> 48

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 49<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 49

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 50<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 50

Gln Gln Glu Lys Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5<210> 51<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 51

Gln Gln Glu Ala Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5<210> 52<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 52

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 53

<211>

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 53

Gln Gln Glu Arg Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5<210> 54<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 54

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 55<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 55Gln Gln Glu His Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5<210> 56<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 56

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 57<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 57

Gln Gln Glu Ser Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5<210> 58<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 58

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ser Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 59<211> 9<212> PRT<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 59

Gln Gln Glu Lys Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5<210> 60<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 60

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 61<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 61

Gln Gln Glu Arg Thr Leu Pro Tyr Thr

1-5<210> 62<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 62

Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr15 10<210> 63<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 63

Gln Gln Glu Arg Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5<210> 64<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 64

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

15 10<210> 65<211> 1344<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 65

caggtgcagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc cttccgagac cctgtccctc 60acctgcactg tctctgggtt ctcacttatc ggctatgatc ttaactggat ccgacagcct 120ccagggaagg gactggagtg gattgggatt atctggggtg atggaaccac agactataat 180tcagctgtca aatcccgcgt caccatctca aaagacacct ccaagaacca gttctccctg 240aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggaggttat 300tggtacgcca ctagctacta ctttgactac tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360tcagcctcca ccaagggccc atctgtcttc ccactggccc catgctcccg cagcacctcc 420gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tcccagaacc tgtgaccgtg 480

tcctggaact ctggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtcc 540

tcaggtctct actccctcag cagcgtggtg accgtgccat ccagcaactt cggcacccag 600acctacacct gcaacgtaga tcacaagcca agcaacacca aggtcgacaa gaccgtggag 660

agaaagtgtt gtgtggagtg tccaccttgt ccagcccctc cagtggccgg accatccgtg 720

ttcctgttcc ctccaaagcc aaaggacacc ctgatgatct ccagaacccc agaggtgacc 780

tgtgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac ccagaggtgc agttcaactg gtatgtggac 840

ggagtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg agcagttcaa ctccaccttc 900

agagtggtga gcgtgctgac cgtggtgcac caggactggc tgaacggaaa ggagtataag 960

tgtaaggtgt ccaacaaggg actgccatcc agcatcgaga agaccatctc caagaccaag 1020

ggacagccaa gagagccaca ggtgtatacc ctgccaccat ccagagagga gatgaccaag 1080

aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggattctatc catccgacat cgccgtggag 1140

tgggagtcca acggacagcc agagaacaac tataagacca cccctccaat gctggactcc 1200

gacggatcct tcttcctgta ttccaagctg accgtggaca agtccagatg gcagcaggga 1260

aacgtgttct cttgttccgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagagc 1320

ctgtccctgt ctccaggaaa gtaa 1344<210> 66<211> 363<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> : 66

caggtgcagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc cttccgagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctgggtt ctcacttatc ggctatgatc ttaactggat ccgacagcct 120

ccagggaagg gactggagtg gattgggatt atctggggtg atggaaccac agactataat 180

tcagctgtca aatcccgcgt caccatctca aaagacacct ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggaggttat 300

tggtacgcca ctagctacta ctttgactac tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360tca 363<210> 67<211> 645<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 67

gatatccaga tgacacagtc cccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggtga ccgcgtcacc 60atcacctgcc gcgcatctca gtccattagc aataatctga actggtatca gcagaagcca 120ggcaaagccc caaaactcct gatctactac acctcacgct tccactcagg tgtcccatca 180cgcttcagtg gcagtggctc tggtacagat ttcaccttca ccattagcag cctgcaacca 240gaagatattg ccacttatta ctgccaacag gagcataccc ttccatatac cttcggtcaa 3 00ggcaccaagc tggagatcaa acgcactgtg gctgcaccat ctgtcttcat ctttcctcca 360tctgatgagc agttgaaatc cggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420ccacgcgagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatccgg taactcccag 480gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacc 540ctgagcaaag cagactacga gaaacacmaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600ctgagttctc cagtcacaaa gagcttcaac cgcggtgagt gctaa 645<210> 68<211> 324<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 68

gatatccaga tgacacagtc cccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggtga ccgcgtcacc 60atcacctgcc gcgcatctca gtccattagc aataatctga actggtatca gcagaagcca 120ggcaaagccc caaaactcct gatctactac acctcacgct tccactcagg tgtcccatca 180cgcttcagtg gcagtggctc tggtacagat ttcaccttca ccattagcag cctgcaacca 240gaagatattg ccacttatta ctgccaacag gagcataccc ttccatatac cttcggtcaa 3 00ggcaccaagc tggagatcaa acgc 324<210> 69<211> 98<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 ' 60

Ser Arg Vai Thr lie Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

Arg Gly<210> 70<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 70

Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu

15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr

20 25 30

Asp lie Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Vai Thr lie Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser115 120<210> 71<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 71

Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr

20 25 30

Asp lie Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Vál Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser115 120<210> 72<211> 120<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 72

Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu

15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr

20 25 30

Asp Leu Asn Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly lie lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Vai Lys

50 55 60

Ser Arg Vai Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser115 120<210> 73<211> 95<212> • PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly

15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr

50 55

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys85

Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly60

Phe Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro

75 80Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro90 95

<210> 74<211> 109<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> 74

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly

1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn His

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie

35 40 45

Tyr Tyr lie Ser Arg Phe His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Sèr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr

100 105<210> 75<211> 109<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Construção sintética

<400> 75

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly

15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Asn Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr

100 105<210> 76<211> 1429<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construção sintética

<400> : 76

atggccaccg actccagaac ctcctggctg ctgacagtgt ccctgctgtg tctgctgtgg 60ccacaggagg ccagcgctca ggtgcagctg caggagtctg gcccaggact ggtgaagcct 120tccgagaccc tgtccctcac ctgcactgtc tctgggttct cacttatcgg ctatgatctt 180aactggatcc gacagcctcc agggaaggga ctggagtgga ttgggattat ctggggtgat 240ggaaccacag actataattc agctgtcaaa tcccgcgtca ccatctcaaa agacacctcc 300aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct gtgaccgccg cggacacggc cgtgtattac 360tgtgcgagag gaggttattg gtacgccact agctactact ttgactactg gggccagggc 420accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat ctgtcttccc actggcccca 480tgctcccgca gcacctccga gagcacagcc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 540ccagaacctg tgaccgtgtc ctggaactct ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc 600ccagctgtcc tgcagtcctc aggtctctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccatcc 660agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc aacgtagatc acaagccaag caacaccaag 720gtcgacaaga ccgtggagag aaagtgttgt gtggagtgtc caccttgtcc agcccctcca 780gtggccggac catccgtgtt cctgttccct ccaaagccaa aggacaccct gatgatctcc 840agaaccccag aggtgacctg tgtggtggtg gacgtgtccc acgaggaccc agaggtgcag 900ttcaactggt atgtggacgg agtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc aagagaggag 960cagttcaact ccaccttcag agtggtgagc gtgctgaccg tggtgcacca ggactggctg 1020

aacggaaagg agtataagtg taaggtgtcc aacaagggac tgccatccag catcgagaag 1080accatctcca agaccaaggg acagccaaga gagccacagg tgtataccct gccaccatcc 1140agagaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgtc tggtgaaggg attctatcca 1200tccgacatcg ccgtggagtg ggagtccaac ggacagccag agaacaacta taagaccacc 1260cctccaatgc tggactccga cggatccttc ttcctgtatt ccaagctgac cgtggacaag 1320tccagatggc agcagggaaa cgtgttctct tgttccgtga tgcacgaggc cctgcacaac 13 80cactataccc agaagagcct gtccctgtct ccaggaaagt aattctaga 1429

<210> 77

<211> 729

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Construção sintética<220>

<221> misc_feature

<222> 646

<223> m = A ou C

<400> 77

atggccaccg actccagaac ctcctggctg ctgacagtgt ccctgctgtg tctgctgtgg 60

ccacaggagg ccagcgctga tatccagatg acacagtccc catcctccct gtctgcctct 120

gtgggtgacc gcgtcaccat cacctgccgc gcatctcagt ccattagcaa taatctgaac 180

tggtatcagc agaagccagg caaagcccca aaactcctga tctactacac ctcacgcttc 240cactcaggtg tcccatcacg cttcagtggcattagcagcc tgcaaccaga agatattgccccatatacct tcggtcaagg caccaagctggtcttcatct ttcctccatc tgatgagcagctgctgaata acttctatcc acgcgaggcccaatccggta actcccagga gagtgtcacactcagcagca ccctgaccct gagcaaagcagaagtcaccc atcagggcct gagttctccataattctag

agtggctctg gtacagattt caccttcacc 300acttattact gccaacagga gcataccctt 360gagatcaaac gcactgtggc tgcaccatct 420ttgaaatccg gaactgcctc tgttgtgtgc 480aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600gactacgaga aacacmaagt ctacgcctgc 660gtcacaaaga gcttcaaccg cggtgagtgc 720

729

Claims

1. Método para tratar dor de osteoartrite em um indivíduo com-preendendo administrar uma quantidade eficaz de um antagonista NGF aoindivíduo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduoé um humano.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o antagonis-ta de NGF é um anticorpo antagonista anti-NGF.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado em uma freqüência de dosagem dentrode um alcance a partir de uma vez a cada semana até uma vez a cada dozesemanas.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado uma vez a cada mês, uma vez a cadadois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses,uma vez a cada cinco meses, ou uma vez a cada seis meses.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado uma vez a cada três meses.

7. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a dor é ali-viada por uma duração de no mínimo cerca de sete dias depois da adminis-tração de uma única dose do anticorpo antagonista anti-NGF.

8. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a dor é ali-viada por uma duração de no mínimo cerca de quatorze dias depois da ad-ministração de uma única dose do anticorpo antagonista anti-NGF.

9. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a dor é ali-viada por uma duração de no mínimo cerca de quatro semanas depois daadministração de uma única dose do anticorpo antagonista anti-NGF.

10. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a dor éaliviada por uma duração de no mínimo cerca de doze semanas depois daadministração de uma única dose do anticorpo antagonista anti-NGF.

11. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado em uma dose dentro de um alcance apartir de cerca de 3 ug/kg até cerca de 1 mg/kg.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado em uma dose de cerca de 100 ug/kg.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado em uma dose de cerca de 300 Mg/kg.

14. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado por via intravenosa.

15. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado por via subcutânea.

16. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é um anticorpo monoclonal.

17. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é um anticorpo humanizado.

18. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF liga NGF humano.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o anticor-po antagonista anti-NGF adicionalmente liga NGF de roedor.

20. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF:(a) liga NGF com uma KD de menos de cerca de 2 nM;(b) inibe a sobrevida dependente do fator de crescimento nervo-so humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50de cerca de 100 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença decerca de 15 pM de NGF humano; e(c) inibe a sobrevida dependente do fator de crescimento nervo-so humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50de cerca de 10 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cer-ca de 1,5 pM de NGF.

21. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF compreende uma região variável de cadeia pesadacompreendendo:(a) uma região CDR1 mostrada na SEQ ID NO: 3;(b) uma região CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e(c) uma região CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5.

22. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpoantagonista anti-NGF compreende uma região variável de cadeia leve com-preendendo:(a) uma região CDR1 mostrada na SEQ ID NO:6;(b) uma região CDR2 mostrada na SEQ ID NO:7; e(c) uma região CDR3 mostrada na SEQ ID NO:8.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o anticor-po antagonista anti-NGF adicionalmente compreende uma região variável decadeia pesada compreendendo:(a) uma região CDR1 mostrada na SEQ ID NO: 3;(b) uma região CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e(c) uma região CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é um anticorpo compreendendo as seqüências deaminoácidos mostradas na SEQ ID NOS: 1 e 2.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é um anticorpo compreendendo as seqüências deaminoácidos mostradas na SEQ ID NOS: 16 e 17.

26. Método para melhorar a função física em um indivíduo tendoosteoartrite compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anta-gonista de NGF ao indivíduo.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o indiví-duo é um ser humano.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o antago-nista de NGF é um anticorpo antagonista anti-NGF.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado em uma freqüência de dosagemdentro de um alcance a partir de uma vez a cada semana até uma vez a ca-da doze semanas.

30. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado uma vez a cada mês, uma vez acada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro me-ses, uma vez a cada cinco meses, ou uma vez a cada seis meses.

31. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado uma vez a cada três meses.

32. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado em uma dose dentro de um alcancea partir de cerca de 3 ug/kg até cerca de 1 mg/kg.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado em uma dose de cerca de 100 ug/kg.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado em uma dose de cerca de 300 ug/kg.

35. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado por via intravenosa.

36. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado por via subcutânea.

37. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é um anticorpo monoclonal.

38. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é um anticorpo humanizado.

39. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF liga NGF humano.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o anticor-po antagonista anti-NGF adicionalmente liga NGF de roedor.

41. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF:(a) liga NGF com uma KD de menos de cerca de 2 nM;(b) inibe a sobrevida dependente do fator de crescimento nervo-so humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50de cerca de 100 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença decerca de 15 pM de NGF humano; e(c) inibe a sobrevida dependente do fator de crescimento nervo-so humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50de cerca de 10 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cer-ca de 1,5 pM de NGF.

42. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF compreende uma região variável de cadeia pesadacompreendendo:(a) uma região CDR1 mostrada na SEQ ID NO: 3;(b) uma região CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e(c) uma região CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5.

43. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor-po antagonista anti-NGF compreende uma região variável de cadeia levecompreendendo:(a) uma região CDR1 mostrada na SEQ ID NO:6;(b) uma região CDR2 mostrada na SEQ ID NO:7; e(c) uma região CDR3 mostrada na SEQ ID NO:8.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o anticor-po antagonista anti-NGF adicionalmente compreende uma região variável decadeia pesada compreendendo:(a) uma região CDR1 mostrada na SEQ ID NO: 3;(b) uma região CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e(c) uma região CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é um anticorpo compreendendo as seqüências deaminoácidos mostradas na SEQ ID NOS: 1 e 2.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é um anticorpo compreendendo as seqüências deaminoácidos mostradas na SEQ ID NOS: 16 e 17.

47. Método para melhorar a rigidez em um indivíduo tendo oste-oartrite compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um antagonis-ta de NGF ao indivíduo.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, em que o indiví-duo é um humano.

49. Método de acordo com a reivindicação 47, em que o antago-nista de NGF é um anticorpo antagonista anti-NGF.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado em uma freqüência de dosagemdentro de um alcance a partir de uma vez a cada semana até uma vez a ca-da doze semanas.

51. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado uma vez a cada mês, uma vez acada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro me-ses, uma vez a cada cinco meses, ou uma vez a cada seis meses.

52. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado uma vez a cada três meses.

53. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado em uma dose dentro de um alcancea partir de cerca de 3 ug/kg até cerca de 1 mg/kg.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado em uma dose de cerca de 100 Mg/kg.

55. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado em uma dose de cerca de 300ug/kg.

56. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado por via intravenosa.

57. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é administrado por via subcutânea.

58. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é um anticorpo monoclonal.

59. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é um anticorpo humanizado.

60. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF liga NGF humano.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, em que o anticor-po antagonista anti-NGF adicionalmente liga NGF de roedor.

62. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF:(a) liga NGF com uma KD de menos de cerca de 2 nM;(b) inibe a sobrevida dependente do fator de crescimento nervo-so humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50de cerca de 100 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença decerca de 15 pM de NGF humano; e(c) inibe a sobrevida dependente do fator de crescimento nervo-so humano de neurônios trigeminais E13.5 de camundongo com uma IC50de cerca de 10 pM ou menos, em que a IC50 é medida na presença de cer-ca de 1,5 pM de NGF.

63. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF compreende uma região variável de cadeia pesadacompreendendo:(a) uma região CDR1 mostrada na SEQ ID NO: 3;(b) uma região CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e(c) uma região CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5.

64. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po antagonista anti-NGF compreende uma região variável de cadeia levecompreendendo:(a) uma região CDR1 mostrada na SEQ ID NO:6;(b) uma região CDR2 mostrada na SEQ ID NO:7; e(c) uma região CDR3 mostrada na SEQ ID NO:8.

65. Método de acordo com a reivindicação 64, em que o anticor-po antagonista anti-NGF adicionalmente compreende uma região variável decadeia pesada compreendendo:(a) uma região CDR1 mostrada na SEQ ID NO: 3;(b) uma região CDR2 mostrada na SEQ ID NO:4; e(c) uma região CDR3 mostrada na SEQ ID NO:5.

66. Método de acordo com a reivindicação 65, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é um anticorpo compreendendo as seqüências deaminoácidos mostradas na SEQ ID NOS: 1 e 2.

67. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o anticor-po antagonista anti-NGF é um anticorpo compreendendo as seqüências deaminoácidos mostradas na SEQ ID NOS: 16 e 17.

68. Kit compreende uma quantidade eficaz de um antagonista deNGF e instruções para administrar uma quantidade eficaz do antagonista deNGF a um indivíduo para tratar dor de osteoartrite no indivíduo.

69. Kit de acordo com a reivindicação 68, em que o indivíduo éum humano.

70. Kit de acordo com a reivindicação 68, em que o NGF-antagonista é um anticorpo antagonista anti-NGF.

71. Kit de acordo com a reivindicação 70, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado em uma freqüência de dosagem dentrode um alcance a partir de uma vez a cada semana até uma vez a cada dozesemanas.

72. Kit de acordo com a reivindicação 70, em que a dor é alivia-da por uma duração de no mínimo cerca de sete dias depois da administra-ção de uma única dose do anticorpo antagonista anti-NGF.

73. Kit compreende uma quantidade eficaz de um antagonista deNGF e instruções para administrar uma quantidade eficaz do antagonista deNGF a um indivíduo tendo osteoartrite para melhorar a função física no indi-víduo.

74. Kit de acordo com a reivindicação 73, em que o indivíduo éum ser humano.

75. Kit de acordo com a reivindicação 73, em que o NGF-antagonista é um anticorpo antagonista anti-NGF.

76. Kit de acordo com a reivindicação 75, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado em uma freqüência de dosagem dentrode um alcance a partir de uma vez a cada semana até uma vez a cada dozesemanas.

77. Kit de acordo com a reivindicação 75, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado em uma dose dentro de um alcance apartir de cerca de 3 ug/kg até cerca de 1 mg/kg.

78. Kit compreende uma quantidade eficaz de um antagonista deNGF e instruções para administrar uma quantidade eficaz do antagonista deNGF a um indivíduo tendo osteoartrite para melhorar a rigidez no indivíduo.

79. Kit de acordo com a reivindicação 78, em que o indivíduo éum ser humano.

80. Kit de acordo com a reivindicação 78, em que o NGF-antagonista é um anticorpo antagonista anti-NGF.

81. Kit de acordo com a reivindicação 80, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado em uma freqüência de dosagem dentrode um alcance a partir de uma vez a cada semana até uma vez a cada dozesemanas.

82. Kit de acordo com a reivindicação 80, em que o anticorpoantagonista anti-NGF é administrado em uma dose dentro de um alcance apartir de cerca de 3 ug/kg até cerca de 1 mg/kg.

83. Composição farmacêutica compreendendo um antagonistade NGF e um veículo farmaceuticamente aceitável para tratar dor de osteo-artrite em um indivíduo.

84. Composição farmacêutica compreendendo um antagonistade NGF e um veículo farmaceuticamente aceitável para melhorar a funçãofísica em um indivíduo tendo osteoartrite.

85. Composição farmacêutica compreendendo um antagonistade NGF e um veículo farmaceuticamente aceitável para melhorar a rigidezem um indivíduo tendo osteoartrite.