BRPI0610657A2

BRPI0610657A2 - forma cristalina de um composto de quinolinona-carboxamida

Info

Publication number: BRPI0610657A2
Application number: BRPI0610657-9A
Authority: BR
Inventors: Paul Ross Fatheree; S Derek Turner; Robert S Chao; Adam A Goldblum; Daniel Genov
Original assignee: Theravance Inc
Priority date: 2005-04-06
Filing date: 2006-04-05
Publication date: 2010-07-13
Also published as: KR101322873B1; EA200702161A1; CN101151264A; US7728004B2; EP1874766A2; DE602006016586D1; WO2006108127A2; HK1110866A1; TW200643020A; MY151075A; US9126994B2; US20160095849A1; PT1874766E; ATE479682T1; EA012115B1; KR20070116988A; US20060229332A1; DK1874766T3; EP1874766B1; TWI377206B

Abstract

FORMA CRISTALINA DE UM COMPOSTO DE QUINOLINONA CARBOXAMIDA. A invençào fornece um sal cristalino de cloridrato de ácido { (lS,3R,5R) -8- [(R) -2-hidroxi-3- (metanossulfonil- metil-amino)propil] -8-azabicicloli3.2.íloct-3-ií}amida 1- isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroqu:Lnolina-3-carboxílico ou um soivato desse. A invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem tais formas cristalinas de sal, métodos de uso de tais formas cristalinas de sal para tratar doenças associadas à atividade de receptor 5-HT4 e processos úteis para a preparação de tais formas cristalinas de sal.

Description

FORMA CRISTALINA DE UM COMPOSTO DE QUINOLINONA-CARBOXAMIDA

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Campo da invenção

A invenção é direcionada a formas de sal cristalino de umcomposto de quinolinona-carboxamida que são úteis comoagonistas de receptor 5-HT4. A invenção é também direcionada acomposições farmacêuticas que compreendem tais compostoscristalinos, métodos de uso de tais compostos para otratamento de condições médicas mediadas por atividade dereceptor 5-HT4 e processos úteis para a preparação de taiscompostos.

Estado da técnica

Pedido Provisório U.S. de domínio público No. 60/560.076,depositado em 7 de abril de 2004, e Pedido de Patente U.S. No.11/100.113, depositado em 6 de abril de 2005, revelam novoscompostos de quinolinona-carboxamida que são úteis para otratamento de distúrbios de motilidade reduzida do tratogastrointestinal. Em particular, o composto ácido 1-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[ (R) -2-hidroxi-3- (metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida é especificamente reveladonesses pedidos como demonstraando atividade agonista de 5-HT4.

A estrutura química do ácido 1-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-azabiciclo[3.2.1] oct-3-il}amida é representada pela fórmula I:<formula>formula see original document page 3</formula>

Para usar, de forma eficaz, esse composto como um agenteterapêutico, é desejável ter uma forma de sal de estado sólidoque possa ser prontamente readily manufaturado e que tenhaestabilidade química e física aceitável. Por exemplo, éaltamente desejável ter uma forma de sal que sejatermicamente estável, por exemplo, em temperaturas que excedemcerca de 200°C e não seja higroscópico nem solúvel, dessaforma facilitando o processamento e estocagem do material.Sólidos cristalinos são geralmente preferidos sobre formasamorfas, para melhorar a pureza e estabilidade do produtomanufaturado.

Nenhuma forma de sal cristalino do composto de fórmula Ifoi previamente relatada. Portanto, existe uma necessidade poruma forma de sal cristalino, estável do composto de fórmula Ique não seja higroscópica nem solúvel e que exibaestabilidade térmica favorável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um sal de cloridratocristalino de ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil]-8-azabiciclo[3.2.1] oct-3-il}amida ou um solvato desse. Em um aspecto, a formacristalina do sal da invenção é um sal de cloridratocristalino do composto de fórmula I. Em um outro aspecto, aforma cristalina do sal da invenção é um hidrato cristalino dosal de cloridrato do composto de fórmula I.De modo surpreendente, o sal de cloridrato cristalino dainvenção é termicamente estável em temperaturas maiores quecerca de 200°C e exibem uma mudança de peso de menos quecerca de 0,2% quando exposto a uma escala de umidade relativaentre cerca de 2% e cerca de 90% em temperatura ambiente. Alémdisso, nem o sal de cloridrato cristalino da invenção nem ohidrato desse é solúvel quando exposto a até 90% de umidaderelativa em temperatura ambiente.

Entre outros usos, as formas cristalinas do sal dainvenção são úteis para a preparação de composiçõesfarmacêuticas para o tratamento de distúrbios de motilidadereduzida do trato gastrointestinal. Portanto, em um outroaspecto de sua composição, a invenção fornece uma composiçãofarmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamenteaceitável e um sal de cloridrato cristalino de ácido 1-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico de{(1S, 3R, 5R) -8- [ (R) -2-hidroxi-3- (metanossulfonilmetil-amino)propil]-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida ou um solvatodesse.

A invenção também fornece um método de tratamento de umadoença ou condição associada à atividade de receptor 5-HT4, porexemplo, um distúrbio de motilidade reduzida do tratogastrointestinal, o método compreendendo a administração aomamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de umsal de cloridrato cristalino de ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3- carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3- (metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-azabiciclo[3.2.1] oct-3-il}amida ou um solvato desse.

Em um outro aspecto do método, a invenção fornece umprocesso para a preparação de um sal de cloridrato cristalinoda invenção, o processo compreendendo o contato de ácidol-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico de{(1$,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi3-(metanossulfonil-metil-amino)propil]-8-azabiciclo [3.2.1]oct-3-il}amida com ácidoclorídrico para formar uma mistura de reação e isolação dosal de cloridrato cristalino da mistura de reação.

A invenção também fornece um sal de cloridratocristalino da invenção como aqui descrito para uso em terapiaou como um medicamento, bem como o uso de um sal de cloridratocristalino da invenção na manufatura de um medicamento,especialmente para a manufatura de um medicamento para otratamento de um distúrbio de motilidade reduzida do tratogastrointestinal em um mamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Vários aspectos da presente invenção são ilustrados porreferência aos desenhos que a aconpanham.

A Figura 1 mostra um padrão de difração de pó raios X(PXRD) de um sal de cloridrato cristalino de ácido 1-isopropi 1 - 2 - oxo -1,2- dihidroquinol ina - 3 - carboxí 1 ico de{(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil]-8- azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida da invenção.

A Figura 2 mostra um traço de calorimetria derastreamento diferencial (DSC) (traço inferior, eixo verticallado direito) e um traço de análise gravimétrica térmica(TGA) (traço superior, eixo vertical lado esquerdo) para umsal de cloridrato cristalino de ácido l-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil]-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida da invenção.

A Figura 3 mostra um traço de absorção de umidade dinâmica(DMS) para um sal de cloridrato cristalino de ácido 1-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico de{(1S, 3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil]-8-azabiciclo [3.2.1]oct-3-il}amida da invenção.

A Figura 4 mostra um padrão de difração de pó raios X(PXRD) de um hidrato cristalino de um sal de cloridrato deácido l-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílicode{ (1S, 3R, 5R) -8- [ (R) -2-hidroxi-3- (metanossulfonil-metil-amino)propil]-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida da invenção.

A Figura 5 mostra um traço de calorimetria derastreamento diferencial (DSC) (traço superior, eixo verticallado esquerdo) e um traço de análise gravimétrica térmica(TGA) (traço inferior, eixo vertical lado direito) para umhidrato cristalino de um sal de cloridrato de ácido 1-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxilico de{(1S, 3R, 5R) - 8- [ (R) -2-hidroxi-3- (metanossulfonil-metil-amino)propil]-8-azabiciclo [3.2.1]oct-3-il}amida da invenção.

A Figura 6 mostra um traço de absorção de umidade dinâmica(DMS) para um hidrato cristalino de um sal de cloridrato deácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de{(1S, 3R, 5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil]-8-azabiciclo [3.2.1]oct-3-il}amida da invenção

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção fornece um sal de cloridrato cristalino deácido l-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxilico de{(1S, 3R, 5R) -8- [ (R) -2-hidroxi-3- (metanossulfonilmetil-amino)propil]-8-azabiciclo [3.2.1]oct-3-il}amida e solvatosdesse.

DEFINIÇÕES

Quando se descrevem os compostos, composições emétodos da invenção, os seguintes termos têm os seguintessignificados, a menos que indicado de outra forma.

O termo "terapeuticamente eficaz quantidade"significa uma quantidade suficiente para efetuar otratamento quando administrada a um paciente emnecessidade de tratamento.

O termo "tratamento" como aqui usado significa otratamento de uma doença, distúrbio, ou condição médica emum paciente, como um mamífero (particularmente um humano)que inclui:

(a) prevenir que ocorra a doença, distúrbio oucondição médica, ou seja, tratamento profilático de umpaciente;

(b) melhoria da doença, distúrbio, ou condiçãomédica, ou seja, eliminação ou regressão da doença,distúrbio, ou condição médica em um paciente;

(c) supressão da doença, distúrbio, ou condiçãomédica, ou seja, retardo no desenvolvimento da doença,distúrbio, ou condição médica em um paciente; ou

(d) alívio dos sintomas da doença, distúrbio oucondição médica em um paciente.

O termo "solvato" significa um complexo ou agregadoformado por uma ou mais moléculas de um soluto, ou seja,um composto da invenção ou um sal farmaceuticamenteaceitável desse e uma ou mais moléculas de um solvente.

Tais solvatos são tipicamente sólidos cristalinos que têmuma proporção molar substancialmente fixa de soluto esolvente. Solventes representativos incluem, por via deexemplo, água, metanol, etanol, isopropanol, ácido acéticoe outros. Quando o solvente é água, o solvato formado éespecificamente denominado um hidrato.

O termo "sal de cloridrato cristalino" como aquiusado significa um sólido cristalino que não inclui umafração molar substancialmente fixa de moléculas de solventena estrutura molecular do cristal, ou seja, um que não sejaum solvato. Solvatos, ou especificamente hidratos, dainvenção são explicitamente identificados.

Deve-se observar, como usado na especificação ereivindicações em apêndice, que as formas singulares "um","uma", "o" e "a" podem incluir referências no plural, amenos que o conteúdo claramente dite em contrário.

O termo "grupo de proteção de amino" significa umgrupo de proteção adequado para evitar reações indesejadasem um nitrogênio de amino. Grupos de proteção de aminorepresentativos incluem, sem limitação, formil; grupos acil,por exemplo, grupos alcanoil, como acetil; gruposalcoxicarbonil, como terc-butoxicarbonil (Boc); gruposarilmetoxicarbonil, como benziloxicarbonil (Cbz) e 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc); grupos arilmetil, como benzil(Bn), tritil (Tr) e 1,1-di-(4'-metoxifenil)metil; grupossilil, como trimetilsilil (TMS) e terc-butildimetilsilil(TBDMS); e outros.

Agente ativo

O agente ativo nas presentes formas de sal, ou seja ocomposto de fórmula I, é designado ácido l-isopropil-2-oxo-1,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3- (metanossulfonil-metil-amino) propil] -8-azabiciclo[3 .2.1] oct-3-il}amida usando o programa comercialmentedisponível AutoNom (MDL Information Systems, GmbH, Frankfurt,Germany). A designação (1S,3R,5R) descreve a orientaçãorelativa das ligações associadas com o sistema de anelbicíclico. O composto é alternativamente designado como N-[(3-endo)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino) propil]-8- azabiciclo[3.2.1]oct-3-il]-1-(1-metiletil) -2-oxo-l,2-dihidro-3-quinolinecarboxamida.

Formas de sal da invenção

Em um aspecto, a invenção fornece cloridrato de ácido 1-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico de{(1S, 3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonilmetil-amino)propil]-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida cristalino.

Um sal de cloridrato cristalino da invenção tipicamentecontém entre cerca de 0,8 e cerca de 1,2 equivalente molar deácido clorídrico por equivalente molar do composto de fórmulaI, incluindo entre cerca de 0,9 e cerca de 1,1 equivalentemolar de ácido clorídrico por equivalente molar do compostode fórmula I.

A proporção molar do ácido clorídrico para o agente ativopode ser facilmente determinada por métodos disponíveis paraaqueles habilitados na técnica. Por exemplo, tais proporçõesmolares podem ser facilmente determinadas por titulação comuma solução padrão de nitrato de prata. Alternativamente,análise de elementos, NMR e métodos de cromatografia iônicapodem ser usados para determinar a proporção molar.

Em um aspecto, o sal de cloridrato cristalino dapresente invenção é caracterizado por um padrão de difraçãode raios X (PXRD) que tem dois ou mais picos de difração emvalores 20 selecionados de 4,41±0,2, 8,82±0,2, 9,08±0,2,II, 21±0,2, 14,40±0,2, 16,42±0,2, 17,35±0,2, 17,61±0,2,18,14±0,2, 19,04±0,2, 19,95±0,2, 20,12±0,2, 21,23±0,2,22,13±0,2, 22,48±0,2, 22,83±0,2, 24,16±0,2, 25,37±0,2,,25,56±0,2, 26,22+0,2, 27,33±0,2, 29,08±0,2 e 29,61±0,2. emparticular, nesse aspecto, a forma cristalina é caracterizadapor um padrão de difração de pó de raios X que tem dois oumais picos de difração em valores selecionados de 14,4 0±0,2,17,35±0,2, 17,61±0,2, 19,04±0,2, 21,23±0,2 e 22,13±0,2.

Como é conhecido no campo de difração de pó de raios X, asposições de pico de espectro de PXRD são relativamente menossensíveis a detalhes experimentais, como detalhes depreparação da amostra e geometria de instrumentos, do que sãoàs alturas relativas dos picos. Portanto, em um aspecto, umsal de cloridrato cristalino do composto de fórmula I écaracterizado por um padrão de difração de pó de raios X emque as posições do pico estão substancialmente de acordo comaquelas mostradas na Figura 1.

O sal de cloridrato cristalino da presente invenção étambém caracterizado por estabilidade termina de altatemperatura como evidenciado por seu traço de calorimetria derastreamento diferencial (DSC) que exibe um pico no fluxo decalor endotérmico na faixa de cerca de 230°C a cerca de260°C, como ilustrado na Figura 2. Além disso, o traço daanálise gravimétrica térmica (TGA) não mostra evento térmicosignificativo abaixo de cerca de 225°C.

Ainda em um outro aspecto, um sal de cloridrato cristalinoé caracterizado por seu espectro de absorção de infravermelhoque mostra bandas de absorção significativas em cerca de 758,783, 795, 802, 949, 981, 1149, 1158, 1217, 1332, 1377, 1453,1467, 1487, 1525, 1566, 1575, 1615, 1672 e 3197 cm"1.

Foi demonstrado que um sal de cloridrato cristalino docomposto de fórmula I tem um perfil de absorção/desabsorçãoreversível com um nível excepcionalmente baixo de higroscopia(ou seja, menos que cerca de 0,2% de ganho de peso na faixade umidade de 2% de umidade relativa a 90% de umidade relativaem temperatura ambiente) como mostrado na Figura 3.

Adicionalmente, o sal de cloridrato cristalino docomposto de fórmula I é estável sob exposição a temperatura eumidade elevadas por um período estendido. Por exemplo,depois de estocagem por 24 semanas a 40°C e 75% de umidaderelativa, análise por HPLC não mostrou degradação química enão houve mudanças detectáveis nos resultados de DSC, TGA ouPXRD.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um hidratocristalino de um sal de cloridrato do composto de fórmula I.

Em um aspecto, um hidrato cristalino de um sal decloridrato da presente invenção é caracterizado por um padrãode difração de pó de raios X (PXRD) que tem dois ou maispicos de difração em valores 20 selecionados de 5,30±0,2,7,43±0,2, 8,72±0,2, 10,52±0,2, 27,34±0,2, 27,51±0,2 e29,67±0,2. Em particular, nesse aspecto, a forma cristalina écaracterizada por um padrão de difração de pó de raios X quetem dois ou mais picos de difração em valores 20 selecionadosde 10,52±0,2, 13,85±0,2, 15,80±0,2, 17,26±0,2 e 21,06±0,2.

Em um outro aspecto, um hidrato cristalino de um sal decloridrato do composto of formula I é caracterizado por umpadrão de difração de pó de raios X em que as posições do picoestão substancialmente de acordo com aquelas mostradas naFigura 4.

O hidrato cristalino de um sal de cloridrato da presenteinvenção é também caracterizado por seu traço de calorimetriade rastreamento diferencial (DSC) que exibe um pico substancialno fluxo de calor endotérmico identificado com fusão docristal na faixa de cerca de 225°C a cerca de 250°C, comendotermos amplos ou fracos em temperaturas mais baixas comoilustrado na Figura 5. Além disso, o traço de análisegravimétrica térmica (TGA) mostra que a temperatura dedegradação está acima de cerca de 250°C.

Constatou-se que um hidrato cristalino de um sal decloridrato do composto de fórmula I tem um perfil deabsorção/desabsorção reversível em temperatura ambiente sobre afaixa inteira de cerca de 2% a cerca de 90% de umidaderelativa, como ilustrado na Figura 6. O hidrato cristalinoexibe menos que cerca de 0,25% de ganho de peso, entre cercade 40% e cerca de 75% de umidade relativa.

Essas propriedades das formas de sal dessa invenção sãotambém ilustradas nos Exemplos abaixo.

Procedimento sintético

O agente ativo, ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de { (1S, 3R, 5R) -8- [ (R) -2-hidroxi-3- (metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida, podem ser preparados apartir de materiais de iniciação prontamente disponíveis como uso dos procedimentos descritos nos Exemplos abaixo ou como uso dos procedimentos descritos nos pedidos US de domíniopúblico listados na seção de fundamento desse pedido.

Para preparar um sal de cloridrato cristalino dainvenção, o ácido l-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulf onil-metil-amino) propil] -8-azabiciclo [3.2.1] oct-3-il}amida faz contato tipicamente com cerca de 1 a cerca de 1,5equivalentes molares, incluindo de cerca de 1 a cerca de 51,2 equivalentes molares, de ácido clorídrico concentrado.Geralmente, essa reação é conduzida em um diluente inerte emuma temperatura que varia de cerca de 20°C a cerca de 80°C.Diluentes inertes adequados para essa reação incluem, mas nãosão limitados a, etanol, metanol, isopropanol, acetato deetila, acetonitrila, tolueno, tetrahidrofurano e combinaçõesdesses.

Após a finalização da reação, um sal cristalino dainvenção é isolado da mistura de reação por qualquer meioconvencional, como precipitação, concentração, centrifugação eoutros.

O hidrato cristalino pode ser preparado por dissoluçãodo sal de cloridrato de ácido l-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-azabiciclo [3 .2.1] oct-3-il}amida em água em uma concentraçãoacima de cerca de 50 mg/mL, que fornece a suspensão da qual ohidrato cristalino resultante pode ser isolado por meioconvencional.

Composições farmacêuticas

As formas de sal de cloridrato cristalino da invençãosão tipicamente administradas a um paciente na forma de umacomposição farmacêutica. Tais composições farmacêuticaspodem ser administradas ao paciente por qualquer via deadministração aceitável incluindo, sem limitação, as viasde administração oral, retal, vaginal, nasal, inalada,tópica (incluindo transdérmica) e parenteral.

Conseqüentemente, em um dos aspectos de suascomposições, a invenção é dirigida a uma composiçãofarmacêutica que compreende um veiculo ou excipientefarmaceuticamente aceitável e uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um sal de cloridrato cristalinoof um composto de fórmula I. Opcionalmente, tais composiçõesfarmacêuticas podem conter outros agentes terapêuticos e/oude formulação, se desejado.

As composições farmacêuticas da invenção tipicamentecontêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de um salcristalino da presente. Tipicamente, tais composiçõesfarmacêuticas conterão de cerca de 0,01 a cerca de 95% empeso do agente ativo; incluindo, de cerca de 1 a cerca de70% em peso; como, por exemplo, de cerca de 5 a cerca de60% em peso do agente ativo.

Pode ser usado qualquer veículo ou excipienteconvencional nas composições farmacêuticas da invenção. Aescolha de um veículo ou excipiente em particular, oucombinações de veículos ou excipientes, dependerá do modode administração a ser usado para tratar um paciente emparticular ou do tipo de condição médica ou estado dedoença. Em relação a isso, a preparação de uma composiçãofarmacêutica adequada para um modo de administração emparticular está dentro do escopo daqueles com habilidadenas técnicas farmacêuticas. Adicionalmente, os ingredientespara tais composições estão disponíveis comercialmente por,por exemplo, Sigma, P. O. Box 14508, St. Louis, MO 63178.Para ilustrar ainda mais, técnicas de formulaçãoconvencionais são descritas em Remington: The Science andPractice of Pharmacy, 20a Edição, Lippincott Williams &White, Baltimore, Mariland (2000); e H. C. Ansel e cols. ,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7aEdição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Mariland(1999).Exemplos representativos de materiais que podem servircomo veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, semlimitação, os seguintes: (1) açúcares, tais como lactose,glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho eamido de batata; (3) celulose, como celulosemicrocristalina e seus derivados, como carboximetilcelulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; (4)tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8)excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras desupositório; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo desemente de algodão, óleo de açafroa, óleo de gergelim,azeite de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10)glicóis, tais como propileno glicol; (11) polióis, taiscomo glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol;(12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila;(13) ágar; (14) agentes de tamponamento, tais comohidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácidoalgínico; (16) água livre de pirogênio; (17) sorofisiológico isotônico; (18) Solução de Ringer; (19) álcooletílico; (20) soluções tampão de fosfato; e (21) outrassubstâncias atóxicas compatíveis empregadas em composiçõesfarmacêuticas.

As composições farmacêuticas da invenção sãopreparadas tipicamente por mistura ou combinação cuidadosae intimamente um composto da invenção com um veículofarmaceuticamente aceitável e um ou mais ingredientesopcionais. Se necessário ou desejado, a misturauniformemente combinada resultante pode ser então moldadaou carregada em comprimidos, cápsulas, pílulas e outrosusando procedimentos e equipamento convencionais.As composições farmacêuticas da invenção sãopreferivelmente embaladas em uma forma de dosagem unitária.O termo "forma de dosagem unitária" refere-se a uma unidadefisicamente distinta adequada para dosagem a um paciente, ouseja, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada deagente ativo calculada para produzir o efeito terapêuticodesejado isoladamente ou em combinação com uma ou maisunidades adicionais. Por exemplo, tais formas de dosagemunitárias podem ser cápsulas, comprimidos, pílulas e outras.

Em uma modalidade preferida, as composiçõesfarmacêuticas da invenção são adequadas para administraçãooral. Composições farmacêuticas adequadas paraadministração oral podem estar na forma de cápsulas,comprimidos, pílulas, tabletes, sinetes, drágeas, pós,grânulos; ou como uma solução ou suspensão em um líquidoaquoso ou não aquoso; ou como uma emulsão líquida óleo emágua ou água em óleo; ou como um elixir ou xarope; esemelhantes; cada um contendo uma quantidade predeterminadade um composto da presente invenção como um ingredienteativo.

Quando destinada à administração oral em uma forma dedosagem sólida (ou seja, como cápsulas, comprimidos,pílulas e semelhantes), as composições farmacêuticas dainvenção compreenderão tipicamente um composto da presenteinvenção como o ingrediente ativo e um ou mais veículosfarmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio oufosfato dicálcico. Opcional ou alternativamente, estasformas de dosagem sólidas também podem compreender: (1)enchimentos ou extensores, tais como amidos, lactose,celulose microcristalina, lactose, sacarose, glicose,manitol, e/ou ácido sílico; (2) ligantes, tais comocarboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e/ou acácia; (3) umectantes, comoglicerol; (4) agentes de desintegração, tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca,ácido algínico, certos silicatos, e/ou carbonato de sódio;(5) agentes de retardo de solução como, por exemplo,parafina; (6) aceleradores de absorção, tais como compostosde amônio quaternário; (7) agentes umidificantes, tais comoálcool cetílico e/ou monoestearato de glicerol; (8)absorventes, tais como caulim e/ou argila de bentonita; (9)lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio,estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, laurilsulfato de sódio e/ou misturas destes; (10) agentescorantes; e (11) agentes de tamponamento.

Agentes de liberação, agentes umidificantes, agentesde revestimento, adoçantes, flavorizantes e agentesperfumantes, conservantes e antioxidantes também podemestar presentes nas composições farmacêuticas da invenção.

Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveisincluem: (1) antioxidantes hidrossolúveis, tais como ácidoascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio,metabissulfato de sódio, sulfito de sódio e outros; (2)antioxidantes solúveis em óleo, tais como ascorbilpalmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitoluenobutilado (BHT), lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferole outros; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácidocítrico, ácido etilenodiamina tetra acético (EDDA),sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e outros.

Agentes de revestimento para comprimidos, cápsulas, pílulase outros, incluem aqueles usados para revestimentosentéricos, tais como ftalato de acetato de celulose (CAP),ftalato de acetato de polivinila (PAP), ftalato dehidroxipropil metilcelulose, copolímeros de ácidometacrilico-éster de ácido metacrílico, trimelitato deacetato de celulose (CAT), carboximetil etil celulose(CMEC), succinato de acetato de hidroxipropila metilacelulose (HPMCAS) e outros.

Se desejado, as composições farmacêuticas da presenteinvenção também podem ser formuladas para fornecerliberação lenta ou controlada do ingrediente ativo usando,como exemplo, hidroxipropil metil celulose em proporçõesvariáveis; ou outras matrizes de polímero, lipossomos e/oumicroesferas.

Além disso, as composições farmacêuticas da presenteinvenção podem opcionalmente conter agentes de opacificaçãoe podem ser formuladas de forma a liberar apenas oingrediente ativo, ou preferencialmente, em certa porção dotrato gastrintestinal, opcionalmente, de modo retardado.

Exemplos de composições combinadas que podem ser usadasincluem substâncias poliméricas e ceras. O ingredienteativo também pode estar na forma micro-encapsulada, sedesejado, com um ou mais dos excipientes descritos acima.

Formas de dosagem líquidas adequadas paraadministração oral incluem, como forma de ilustração,emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes eelixires farmaceuticamente aceitáveis. Tais formas dedosagem líquida tipicamente compreendem o ingrediente ativoe um diluente inerte, como, por exemplo, água ou outrossolventes, agentes de solubilização e emulsificantes, taiscomo álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato deetila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato debenzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, óleos(especialmente, óleos de semente de algodão, amendoim,milho, germe, oliva, rícino e gergelim), glicerol,tetrahidrofuril álcool, polietileno glicóis e ésteres deácido graxo de sorbitano e misturas desses. Suspensões,além do ingrediente ativo, podem conter agentes desuspensão como, por exemplo, isostearil álcoois etoxilados,polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulosemicrocristalina, metahidróxido de alumínio, bentonita,ágar-ágar e tragacanto, e misturas desses.

Alternativamente, as composições farmacêuticas dainvenção são formuladas para administração por inalação.

Composições farmacêuticas adequadas para administração porinalação estarão tipicamente na forma de um aerossol ou umpó. Tais composições são geralmente administradas usandodispositivos de liberação bem conhecidos, tais como uminalador de dose metrificada, um inalador de pó seco, umnebulizador ou um dispositivo de liberação similar.

Quando administrada por inalação com o uso de umrecipiente pressurizado, as composições farmacêuticas dainvenção compreenderão tipicamente o ingrediente ativo e umpropelente adequado, como diclorodifluormetano,triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido decarbono ou outro gás adequado.

Adicionalmente, a composição farmacêutica pode estar naforma de uma cápsula ou cartucho (feito, por exemplo, degelatina) que compreende um composto da invenção e um póadequado para uso em um inalador de pó. Bases adequadas de póincluem, por via de exemplo, lactose ou amido.

Os compostos dessa invenção também podem seradministrados por via transdérmica usando sistemas eexcipientes de liberação transdérmica conhecidos. Porexemplo, um composto dessa invenção pode ser misturado comintensificadores de permeação, tais como propileno glicol,monolaurato de polietileno glicol, azacicloalcan-2-onas esemelhantes, e incorporado em um emplastro ou sistema deliberação similar. Excipientes adicionais, incluindoagentes de gelificação, emulsificantes e tampões, podem serusados nestas composições transdérmicas se desejado.

Os compostos da invenção também podem ser administradospor via transdérmica com o uso de sistemas de liberaçãotransdérmica e excipientes conhecidos. Por exemplo, um compostoda invenção pode ser misturado com intensif icadores depermeabilidade, como propileno glicol, monolaurato depolietileno glicol, azacicloalcan-2-onas e outros eincorporado em um emplastro ou sistema de liberação similar.Excipientes adicionais que incluem agentes de gelação,emulsificantes e tampões podem ser usados em tais composiçõestransdérmicas, se desejado.

As formulações seguintes ilustram composiçõesfarmacêuticas representativas da presente invenção:

Exemplo de Formulação A

Cápsulas de gelatina dura para administração oral sãopreparadas da seguinte forma:

Ingredientes Quantidade

<table>table see original document page 20</column></row><table>Procedimento Representativo: Os ingredientes sãocuidadosamente misturados e então carregados em uma cápsulade gelatina dura (260 mg de composição por cápsula).

Exemplo de Formulação B

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Estearato de magnésio 2 mg

Procedimento Representativo: Os ingredientes sãocuidadosamente misturados e então passados através de umapeneira U.S. de trama No. 45 e carregados em uma cápsula degelatina dura (200 mg de composição por cápsula).

Exemplo de Formulação C

Cápsulas para administração oral são preparadas daseguinte forma:

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Procedimento Representativo: Os ingredientes sãocuidadosamente misturados e então carregados em uma cápsulade gelatina (310 mg de composição por cápsula).

Exemplo de Formulação D

Comprimidos para administração oral são preparados daseguinte forma:

Ingredientes Quantidade<table>table see original document page 22</column></row><table>

Procedimento Representativo: O ingrediente ativo,amido e celulose são passados através de uma peneira U.S.de trama No. 45 e misturados cuidadosamente. A solução depolivinilpirrolidona é misturada com os pós resultantes, eessa mistura é então passada através de uma peneira U.S.trama No. 14. Os grânulos assim produzidos são secos a 50-60°C e passados através de uma peneira U.S. trama No. 18. Osódio carboximetil amido, estearato de magnésio e talco(previamente passados através de uma peneira U.S. de tramaNo. 60) são então adicionados aos grânulos. Após mistura, amistura é compressa em uma máquina de comprimidos paragerar um comprimido pesando 100 mg.

Exemplo de Formulação E

Comprimidos para administração oral são preparados daseguinte forma:

<table>table see original document page 22</column></row><table>

cuidadosamente misturados e então submetidos à compressãopara formarem comprimidos (44 0 mg de composição porcomprimido).

Exemplo de Formulação F

Comprimidos com uma única marca de divisão paraadministração oral são preparados da seguinte forma:

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Procedimento Representativo: Os ingredientes sãocuidadosamente misturados e submetidos à compressão paraformar um comprimido com uma única marca de divisão (215 mgde composições por comprimido).

Exemplo de Formulação 6 Uma suspensão para administração oral é preparada daseguinte forma: <table>table see original document page 23</column></row><table>Procedimento Representativo: Os ingredientes sãomisturados até formarem uma suspensão contendo 10 mg deingrediente ativo por 10 ml de suspensão.

Exemplo de Formulação H

Um pó seco para administração por inalação é preparadoda seguinte forma:

<table>table see original document page 24</column></row><table>

Procedimento Representativo: O composto da invenção émicronizado e então misturado com lactose. Essa misturacombinada é então carregada em um cartucho de inalação degelatina. Os conteúdos do cartucho são administrados usandoum inalador de pó.

Exemplo de Formulação I

Uma formulação de pó seco para uso em um dispositivode inalação de pó seco é preparada da seguinte forma:

Procedimento Representativo: uma suspensão contendo5% em peso de um sal da invenção e 0,1% em peso de lecitinaé preparada por dispersão de 10 g de composto ativo comopartículas micronizadas com tamanho médio de menos que 10um em uma solução formada de 0,2 g de lecitina dissolvidaem 2 00 mL de água desmineralizada. A suspensão é seca porpulverização e o material resultante é micronizado apartículas que têm um diâmetro médio de menos que 1,5 \xm.As partículas são carregadas em cartuchos com 1,1,1,2-tetrafluoretano pressurizado.

Exemplo de Formulação J

Uma formulação injetável é preparada como se segue:<table>table see original document page 25</column></row><table>

Procedimento Representativo: Os ingredientes acimasão misturados e o pH é ajustado até 4 + 0,5 usando 0,5NHC1 ou 0,5 N NaOH.

Exemplo de Formulação K

Cápsulas para administração oral são preparadas como sesegue:

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Procedimento Representativo: Os ingredientes sãocuidadosamente misturados e então carregados em uma cápsulade gelatina (tamanho #1, branca, Opaca) (264 mg de composiçãopor cápsula).

Exemplo de Formulação L

Cápsulas para administração oral são preparadas como sesegue:

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Procedimento Representativo: Os ingredientes sãocuidadosamente misturados e então carregados em uma cápsulade gelatina (tamanho #1, branca, Opaca) (148 mg de composiçãopor cápsula).

Utilidade

O composto de fórmula I, ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(15, 3R,5R)-8-M-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil] - 8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida, é um agonista de receptor 5-HT4 e, portanto, as presentes formas de sal cristalino docomposto de fórmula I são úteis para tratar condições médicasmediadas por receptores 5-HT4 ou associadas à atividade dereceptor 5-HT4, ou seja condições médicas que são melhoradaspelo tratamento com um agonista de receptor 5-HT4. Taiscondições médicas incluem, mas não são limitadas a sindromedo cólon irritável (IBS), constipação crônica, dispepsiafuncional, esvaziamento gástrico retardado, doença derefluxo gastroesofageano (GERD), gastroparesia, gastropatiadiabética e idiopática, íleo pós-operatório, pseudo-obstrução intestinal e transito retardado induzido pormedicamentos. Além disso, foi sugerido que alguns compostosagonistas de receptor 5-HT4 podem ser usados no tratamento dedistúrbios do sistema nervoso central incluindo distúrbioscognitivos, distúrbios do comportamento, distúrbios do humor edistúrbios de controle de funções autônomas.

Em particular, as formas de sal da invenção aumentam amotilidade do trato gastrointestinal (GI) e assim são úteispara o tratamento de distúrbios do trato GI causados pormotilidade reduzida em mamíferos, incluindo humanos. Taisdistúrbios de motilidade do trato GI incluem, por via deilustração, constipação crônica, sindrome do cólon irritável deconstipação predominante (C-IBS) , gastroparesia diabética eidiopática e dispepsia funcional.Em um aspecto, portanto, a invenção fornece um métodode aumento da motilidade do trato gastrointestinal em ummamífero, o método compreendendo a administração ao mamíferode uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composiçãofarmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamenteaceitável e um sal cristalino da invenção.

Quando usado para tratar distúrbios de motilidadereduzida do trato GI ou outras condições mediadas porreceptores 5-HT4/ as formas de sal da invenção serãotipicamente administradas por via oral em uma dose diáriaúnica ou em múltiplas doses por dia, embora outras formas deadministração possam ser usadas. A quantidade de agenteativo administrada por dose ou a quantidade totaladministrada por dia será tipicamente determinada pelomédico do paciente e dependerá de circunstânciasrelevantes, que incluem a condição a ser tratada, a via deadministração escolhida, o composto real administrado esua atividade relativa, a idade, peso e resposta do pacienteindividual, a severidade dos sintomas do paciente e outros.

Doses adequadas para o tratamento de distúrbios demotilidade reduzida do trato GI ou outros distúrbios mediadospor receptores 5-HT4 variam de cerca de 0,0007 a cerca de 20mg/kg/dia de agente ativo, incluindo de cerca de 0,0007 a cercade 1 mg/kg/day. Para um ser humano de peso médio de 70 kg, essaquantidade deve ser de cerca de 0,05 a cerca de 70 mg por diade agente ativo.

Em um aspecto da invenção, as formas de sal da invençãosão usadas para tratar constipação crônica. Quando usados paratratar constipação crônica, os sais da invenção serãotipicamente administrados por via oral em uma dose diáriaúnica ou em múltiplas doses por dia. The dose para otratamento de constipação crônica deve variar de cerca de 0,05a cerca de 70 mg por dia.

Em um outro aspecto da invenção, as formas de sal dainvenção são usadas para tratar síndrome do cólonirritável. Quando usados para tratar síndrome do cólonirritável de constipação predominante, os sais da invençãoserão tipicamente administrados por via oral ou retal emuma dose única diariamente ou em múltiplas doses por dia. Adose para o tratamento de síndrome do cólon irritável deconstipação predominante irá variar de cerca de 0,05 mg/diaa cerca de 70 mg/dia.

Em um outro aspecto da invenção, as formas de sal dainvenção são usadas para tratar gastroparesia diabética eidiopática. Quando usados para tratar gastroparesia diabéticae idiopática, os sais da invenção serão tipicamenteadministrados por via oral em uma dose única diariamente ouem múltiplas doses por dia. A dose para o tratamento degastroparesia diabética deve variar de cerca de 0,05 a cercade 70 mg por dia.

Ainda em um outro aspecto da invenção, as formas de salda invenção são usadas para tratar dispepsia funcional. Quandousados para tratar dispepsia funcional, os compostos dainvenção serão tipicamente administrados por via oral em umadose única diariamente ou em múltiplas doses por dia. Adose para o tratamento de dispepsia funcional deve variar decerca de 0,05 a cerca de 7 0 mg por dia.

A invenção também fornece um método de tratamento de ummamífero que tem uma doença ou condição associada à atividadede receptor 5-HT4, o método compreendendo a administração aomamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de umaforma de sal da invenção ou de uma composição farmacêuticaque compreende uma forma de sal da invenção.

Como acima descrito, formas de sal da invenção sãoagonistas de receptor 5-HT4. A invenção também fornece,portanto, um método de se comportar como agonista de receptor5-HT4 em um mamífero, o método compreendendo a administração deuma forma de sal da invenção ao mamífero.

Essas propriedades, bem como a utilidade das formas desal de cloridrato da invenção, podem ser demonstradas com ouso de vários ensaios in vitro e in vivo bem conhecidos poraqueles habilitados na técnica. Ensaios representativos sãodescritos em maiores detalhes nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos sintéticos e biológicos sãooferecidos para ilustrar a invenção e não devem serconsiderados de forma alguma limitantes do escopo dessainvenção. Nos exemplos abaixo, as seguintes abreviações têmos seguintes significados, a menos que indicado de outraforma. As abreviações não definidas abaixo têm seusignificado geralmente aceito.

BOC = terc-butoxicarbonil

(Boc)20 = dicarbonato de di-terc-butila

D CM = diclorometano

DMF = N, N-dimetilformamida

DMSO = sulfóxido de dimetila

EtOAc = acetato de etila

mCPBA = ácido m-clorobenzóico

MeCN = acetonitrila

MTBE éter terc-butil metílicoPyBop = benzotriazol-l-iloxitripirrolidino-

Fosfônio hexafluorofosfato

Rf = fator de retensão

RT = temperatura ambiente

TFA = ácido trifluoracético

THF = tetrahidrofurano

Reagentes (incluindo aminas secundárias) e solventesforam adquiridos de fornecedores comerciais (Aldrich, Fluka,Sigma etc.) e usados sem purificação adicional.

As reações foram feitas sob atmosfera de nitrogênio, amenos que apontado de outra forma. O progresso das misturasde reação foi monitorado por cromatografia de camada fina(TLC), cromatografia líquida de alta performance analítica(HPLC anal.) e espectrometria de massa, os detalhes dessassão dados abaixo e separadamente nos exemplos específicos dereações. As misturas de reação foram desenvolvidas comodescrito especificamente em cada reação; comumente, elasforam purificadas por extração e outros métodos depurificação como cristalização dependente de temperatura e desolvente e precipitação. Além disso, as misturas de reaçãoforam rotineiramente purificadas por HPLC preparatória. Acaracterização dos produtos da reação foi rotineiramenterealizada por espectrometria de massa e ^-NMR. Para mediçõesde NMR, as amostras foram dissolvidas em solvente deuterado(CD3OD, CDCI3, ou DMSO-ds) , e os espectros de XH-NMR foramadquiridos com um instrumento a Varian Gemini 2000 (300 MHz)sob condições padrão de observação. A identificação porespectrometria de massa de compostos foi realizada por ummétodo de ionização de eletrospray (ESMS) com um instrumentoApplied Biosystems (Foster City, CA) modelo API 150 EX ou uminstrumento Agilent (Paio Alto, CA) modelo 1100 LC/MSD. 0conteúdo de água é determinado por titulação de Karl Fischerusando um Brinkmann (Westbury, NY) Metrohm Karl Fischer Model813 colorímetro.

Preparação 1: terc-butil éster de ácido (1S,3R,5R) -3-amino-8-azabiciclo[3.2.1]octano-8-carboxílico

a. Preparação de 8-benzil-8-azabiciclo[3.2.1]octan-3-onaÁcido clorídrico concentrado (30 mL) foi adicionado auma solução heterogênea de 2,5-dimetoxi tetrahidrofuran (82,2g, 0,622 mol) em água (170 mL) com agitação. Em um frascoseparado resfriado a 0°C (banho de gelo), ácido clorídricoconcentrado (92 mL) foi adicionado lentamente a uma solução debenzil amina (100 g, 0,933 mol) em água (350 mL) a soluçãode 2,5-dimetoxitetrahidrofurano foi agitada poraproximadamente 20 minutos, diluída com água (250 mL) e entãoa solução de benzil amina foi adicionada, seguida pela adiçãode uma solução de ácido 1,3-acetonadicarboxílico (100 g,0,684 mol) em água (400 mL) e então a adição de hidrogêniofosfato de sódio (44 g, 0,31 mol) em água (200 mL). 0 pH foiajustado de pH 1 a pH -4,5 usando 40% NaOH. A solução amarelopálido turva resultante foi agitada de um dia para o outro. Asolução foi então acidifiçada ao pH 3 de pH 7,5 com o uso de50% ácido clorídrico, aquecida a 85°C e agitada por 2 horas.A solução foi resfriada a temperatura ambiente, basifiçada aopH 12 com o uso de 40% NaOH e extraída com diclorometano (3 x500 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram lavadas comsalmoura, secas (MgS04) , filtradas e concentradas sob pressãoreduzida para produzir o intermediário de título bruto como umóleo marrom viscoso.

A uma solução do intermediário bruto em metanol (1.000mL) foi adicionada dicarbonato de di-terc-butila (74,6 g,0,342 mol) a 0°C. A solução foi deixada para aquecer até atemperatura ambiente e agitada de um dia para o outro. 0metanol foi removido sob pressão reduzida e o óleo resultantefoi dissolvido em diclorometano (1.000 mL) . O intermediáriofoi extraído em 1 M H3P04 (1.000 mL) e lavado comdiclorometano (3 x 250 mL) . A camada aquosa foi basificada aopH 12 com o uso de NaOH aquoso, e extraída com diclorometano(3 x 500 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram secas(MgS04), filtradas e concentradas sob pressão reduzida paraproduzir o intermediário de título como um óleo marrom claroviscoso. 1H-NMR (CDC13) ô (ppm) 7,5-7,2 (m, 5H, C6H5) , 3,7 (s, 2H,CH2Ph) , 3,45 (s amplo, 2H, CH-NBn) , 2,7-2,6 (dd, 2H, CH2CO) ,2,2-2,1 (dd, 2H, CH2CO) , 2,1-2,0 (m, 2H, CH2CH2) , 1,6 (m, 2H,CH2CH2). (m/z): [M + H]+ cale. para Ci4Hi7NO 216,14; encontrado,216.0.

b. Preparação de terc-butil éster de ácido 3-oxo-8-azabiciclo[3.2.1]octano-8-carboxílico

A uma solução de 8-benzil-8-azabiciclo[3.2.1]octan-3-ona (75 g, 0,348 mol) em EtOAc (300 mL) foi adicionada umasolução de dicarbonato de di-terc-butila (83,6 g, 0,383 mol,1,1 eq) em EtOAc (300 mL) . A solução resultante e enxágüe(100 mL EtOAc) foram adicionados a 1 L de frasco dehidrogenação de Parr contendo 23 g de hidróxido de paládio(20% em peso Pd, base seca, em carbono, -50% úmido com água;por exemplo, catalisador de Pearlman) sob uma corrente denitrogênio. O frasco de reação foi desgaseificado (vácuoalternado e N2 cinco vezes) e pressurizado a 2,87 KPa de gásH2. A solução da reação foi agitada por dois dias erecarregada com H2 como necessário para manter a pressão e H2em 2,87 KPa até que a reação estivesse completa comomonitorado por cromatografia de camada fina em sílica. Asolução preta foi então filtrada através de um absorvente deCelites e concentrada sob pressão reduzida para gerar ointermediário de título quantitativamente como um óleoviscoso, amarelo a laranja. Ele foi usado na próxima etapasem tratamento adicional. 1H NMR (CDC13) ô (ppm) 4,5 (amplo,2H, CH-NBoc) , 2,7 (amplo, 2H, CH2C0) , 2,4-2,3 (dd, 2H, CH2CH2) ,2,1 (m amplo, 2H, CH2C0) , 1,7-1,6 (dd, 2H, CH2CH2) , 1,5 (s, 9H,(CH3)3COCON) ).

c. Preparação de terc-butil éster de ácido (1S,3R,5R)-3-amino-8-azabiciclo [3.2.1]octano-8-carboxílico

A uma solução do produto da etapa prévia (75,4 g, 0,335mol) em metanol (1 L) foi adicionada formato de amônio (422,5g, 6,7 mol), água (115 mL) e 65 g de paládio em carbonoativado (10% em base seca, ~50% úmido com água; tipo DegussaE101NETW) sob uma corrente de N2 com agitação via agitadormecânico. Depois de 24 e 48 horas, porções adicionais deformato de amônio (132 g, 2,1 mol) foram adicionadas de cadavez. Uma vez que foi interrompido o progresso da reação,como monitorado por HPLC analítica, Celite* (> 500 g) foiadicionado e a suspensão espessa resultante foi filtrada eentão o sólido coletado foi enxaguado com metanol (-500 mL) .Os filtrados foram combinados e concentrados sob pressãoreduzida até que todo o metanol fosse removido. A soluçãobifásica turva resultante foi então diluída com 1M de ácidofosfórico a um volume final de -1,5 a 2,0 L em pH 2 e lavadacom diclorometano (3 x 700 mL) A camada aquosa foibasifiçada ao pH 12 com o uso de 4 0% NaOH aquoso e extraídacom diclorometano (3 x 700 mL) . As camadas orgânicascombinadas foram secas sobre MgS04/ filtradas e concentradaspor evaporação rotatória, então alto vácuo produzindo 52 g(70%) do intermediário de titulo, comumente N-Boc-endo-3-aminotropano, como um sólido branco a amarelo pálido. Aproporção do isômero de endo para exo amina do produto foi>99 baseado em análise de 1H-NMR (>96% de pureza por HPLCanalítica). 1HNMR (CDC13) ô (ppm) 4,2-4,0 (d amplo, 2H,CHNBoc) , 3,25 (t, 1H, CHNH2) , 2,1-2,05 (m, 4H) , 1,9 (m, 2H) ,1,4 (s, 9H, (CH3)3OCON), 1,2-1,1 (amplo, 2H) . (m/z): [M+H]+cale. para Ci2H22N202 227,18; encontrado, 227,2. HPLC analítica(método isocrático; 2:98 (A:B) para 90:10 (A:B) por 5 min):tempo de retenção = 2,14 minutos.

Preparação 2: ácido l-isopropil-2-oxo-l#2-dihidroquinolina-3-carboxílico

Primeiramente, acetona (228,2 mL, 3,11 mol) foiadicionada a uma suspensão agitada de 2-aminofenilmetanol(255,2 g, 2,07 mol) e ácido acético (3,56 mL, 62 mmol) emágua (2 L) em temperatura ambiente. Depois de 4 h, a suspensãofoi resfriada a 0°C e agitada por mais 2,5 horas e entãofiltrada. O sólido foi coletado e lavado com água e o sólidoúmido resfriado e seco por liofilização para gerar 2,2,-dimetil-1,4-dihidro-2H-benzo[1,3]oxazina (332,2 g, 98%) comoum sólido quase branco. XH NMR (CDC13; 300 MHz) : 1,48 (s, 6H,C(CH3)2), 4,00 (bs, 1H, NH) , 4,86 (s, 2H, CH2) , 6,66 (d, 1H,ArH), 6,81 (t, 1H, ArH), 6,96 (d, 1H, ArH), 7,10 (t, 1H, ArH).

Uma solução de 2,2,-dimetil-1,4-dihidro-2H-benzo [1,3] oxazine (125 g, 0,77 mol) em THF (1 L) foi filtradaatravés de um funil de cintilação e então adicionada em gotasvia um funil de adição, por um período de 2,5 h, a uma soluçãoagitada de 1,0 M LÍAIH4 em THF (800 mL) a 0°C. A reação foiextinta por adição lenta em gotas de Na2SO4.10H2O (110 g) , porum período de 1,5 hora, a 0°C. A mistura de reação foi agitadade um dia para o outro, filtrada e os sais do sólido foramlavados completamente com THF. O filtrado foi concentrado sobpressão reduzida para gerar 2-isopropilaminofenilmetanol (120g, 95%) como um óleo amarelo. XH NMR (CDC13; 300MHz) : 1,24 (d,6H, CH(CH3)2), 3,15 (bs, 1H, OH) , 3,61 (sept, 1H, CH(CH3)2),4,57 (s, 2H, CH2) , 6,59 (t, 1H, ArH) , 6,65 (d, 1H, ArH), 6,99(d, 1H, ArH), 7,15 (t, 1H, ArH).

Dióxido de manganês (85 % 182,6 g, 1,79 mol) foiadicionado a uma solução agitada de 2-isopropilaminofenilmetanol (118 g, 0,71 mol) em tolueno (800 mL) e a misturade reação foi aquecida a 117°C por 4 horas. A mistura dereação foi deixada para resfriar até a temperatura ambientede um dia para o outro e então filtrada através de umabsorvente de Celite que foi eluído com tolueno. O filtradofoi concentrado sob pressão reduzida para gerar 2-isopropilaminobenzaldeído (105 g, 90 %) como um óleolaranja. XH NMR (CDC13; 300MHz) : 1,28 (d, 6H, CH(CH3)2), 3,76(sept, 1H, CH(CH3)2), 6,65 (t, 1H, ArH), 6,69 (d, 1H, ArH),7,37 (d, 1H, ArH), 7,44 (t, 1H, ArH), 9,79 (s, 1H, CHO).

2,2-Dimetil-[1,3]dioxano-4,6-diona, comumente ácido deMeldrum, (166,9 g, 1,16 mol) foi adicionada a uma soluçãoagitada de 2-isopropilaminobenzaldeído (105 g, 0,64 mol),ácido acético (73,6 mL, 1,29 mol) e etilenodiamina (43,0 mL,0,64 mol) em metanol (1 L) a 0°C. A mistura de reação foiagitada por 1 h a 0°C e então em temperatura ambiente de umdia para o outro. A suspensão resultante foi filtrada e osólido lavado com metanol e coletado para gerar ointermediário de título, ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico (146 g, 98 %) como um sólidoquase branco. XH NMR (CDC13; 300MHz) : 1,72 (d, 6H, CR{CH.3)2),5,50 (bs, 1H, CH(CH3)2), 7,44 (t, 1H, ArH), 7,75-7,77 (m, 2H,ArH), 7,82 (d,lH, ArH), 8,89 (s, 1H, CH).

Exemplo 1: Síntese de ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[ (R)-2-hidroxi-3- (metanossulfonil-metilamino)propil] -8-aza-biciclo [3.2.1]oct-3-il}amida

a. Preparação de terc-butil éster de ácido (1S,3R,5R)-3-[(l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carbonil)amino]-8-azabiciclo[3.2.1]octano-8-carboxilico

Em um frasco de 3 L, ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico (112,4 g, 0,486 mol, 1,1 eq)foi suspenso em tolueno (1 L) . A mistura foi aquecida a 85 °Ce cloreto de tionila (86,74 g, 0,729 mol) foi adicionado emgotas por 70 minutos. A mistura foi aquecida a 95°C por 1,5hora com agitação e então deixada para resfriar até atemperatura ambiente.

Em um frasco separado de 12 L, terc-butil éster de ácido(1S, 3R, 5R) -3-amino-8-azabiciclo [3.2.1] octano-8-carboxílico(100,0 g, 0,442 mol, 1 eq) foi suspenso em tolueno (1 L) e 3M NaOH (4 eq) foi adicionado. A mistura foi agitada emtemperatura ambiente por 10 minutos e então resfriada a cercade 5°C. A solução de cloreto ácido foi adicionada lentamentecom agitação por 4 0 minutos mantendo a temperatura internaabaixo de 10°C. A mistura foi agitada a 3-5°C por 30 minutose as camadas foram deixadas para separar de um dia para ooutro. A camada de tolueno (-2,5 L) foi coletada, concentradaa cerca da metade (-1,2 L) por evaporação rotatória e usadadiretamente na próxima etapa.b. Preparação de ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxí 1 ico_de_{ (1S, 3R, 5R) -8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida

À solução de tolueno preparada na etapa prévia (~1,2 L)foi adicionado ácido trifluoracético (200 mL) por 20 minutosa 20°C com agitação. A mistura foi agitada a 20°C por 2 h.Água (1,55 L) foi adicionada e a mistura foi agitada por 30minutos a 20°C. Depois de 30 min, a mistura foi separada emtrês camadas. A camada inferior (-350 mL) , um óleo marromviscoso, continha o intermediário bruto.

A um frasco de 12 L carregado com MTBTE (2,8 L), o óleomarrom bruto foi adicionado por 1 hora a 1-2°C com agitação. Asuspensão foi agitada na mesma temperatura por 1 hora e entãofiltrada. O filtrado foi lavado com MTBE (2 x 300 mL) e secosob vácuo em temperatura ambiente por 4 dias para fornecer osal de trifluoracetato do intermediário de título (163,3 g)como um pó amarelo pálido.

c. Preparação de N-metil-N-[ (S)-2-oxiran-2-ilmetil]metanossulfonamida

Um frasco de 12 L foi carregado com água (1 L) seguidopela adição de NaOH (50 % em água, 146,81 g, 1,835 mol) . Aproveta contendo NaOH foi lavada com água (2 x 500 mL) e aslavagens foram adicionadas ao frasco. A mistura foi agitada emtemperatura ambiente por 10 min e resfriada a ~8°C. (N-metil)metanossulfonamida (200,2 g, 1,835 mol) em água (500 mL)foi adicionada por 5 minutos. A mistura foi agitada por 1hora a ~4°C e (S)-2-clorometiloxirano (339,6 g, 3,67 mol) foiadicionado. A mistura foi agitada por 20 horas a 3-4°C.Diclorometano (2 L) foi adicionado e a mistura foi agitadapor 30 minutos a 5-10°C. As duas camadas foram deixadas paraseparar por 10 minutos e coletadas. A camada orgânica (-2,5L) foi adicionada de volta ao frasco de 12 L e lavada com 1 MH3PO4 (800 mL) e salmoura (800 mL) . Diclorometano foi removidopor evaporação rotatória. Ao produto bruto, tolueno (400 mL)foi adicionado e removido por evaporação rotatória. Depois detrês ciclos adicionais do processo de tolueno, foi obtido ointermediário de título (228,2 g) que foi usado sempurificação adicional na próxima etapa.

d. Síntese_de_ácido_l-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico_de_{ (1S, 3R, 5R) -8-[(R) -2-hidroxi-3- (metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il}amida

Em um frasco de 3 L, trif luoracetato de ácido 1-i sopropi 1 - 2 - oxo -1,2- dihidroquinol ina - 3 - carboxí 1 ico de{(1S,3R,5R)-8-azabiciclo [3.2.1]oct-3-il}amida (105,0 g, 0,232mol) foi suspenso em etanol absoluto (400 mL) . A essasuspensão, NaOH (50 % em água, 0,243 mol. 1,05 eq)dissolvido em etanol absoluto (100 mL) foi adicionado emtemperatura ambiente. A proveta contendo o NaOH foi lavadacom etanol (2 x 50 mL) e as lavagens foram adicionadas àmistura de reação. Depois de 30 minutos de agitação, umasolução de N-metil-N-[ (S)-2-oxiran-2-ilmetil]metanossulfonamida (62,0 g, 1,5 eq) em etanol absoluto(100 mL) foi adicionada. A mistura foi refluída por 2 h,resfriada a temperatura ambiente e cristais do composto detítulo foram adicionados. Depois de cerca de 5 minutos deagitação formou-se um sólido branco. A mistura foi resfriada a3-5°C e agitada por 2 h. O sólido branco foi filtrado e obolo úmido foi lavado com etanol absoluto frio (3 x 50 mL) .

O sólido foi seco sob vácuo a 30°C por 60 h para fornecer ocomposto de título (93,8 g, conteúdo de água por método deKarl Fischer 2,03 %) . XH NMR (CDC13) 6 ppm 10,52 (d, 1H) , 8,83(s, 1H) , 7,75 (d, 2H) , 7,64-7,60 (m, 2H) , 7,28-7,26 m, 1H) ,4,33-4,26 (m, 2H) , 3,78-3,75 (m, 1H), 3,27-3,20 (m, 4H), 3,01(s, 3H) , 2,88 (s, 3H), 2,582,53 (m, 1H) , 2,30-1,81 (m, 11H) ,1,68 (d, 6H).

os cristais foram obtidos a partir de uma Preparaçãoprévia do composto de título pelo método desse exemplo emmenor escala, em que a cristalização ocorreuespontaneamente.

Exemplo 2: Síntese de sal de cloridrato cristalino deácido l-isopropil-2-oxol-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílicode { (1S,3R, 5R) -8- [ (R) -2-hidroxi-3- (metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-aza-biciclo [3.2.1] oct-3-il}amida

Em um frasco de a 1 L, ácido l-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propili-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il}amida (34,7 g, 0,069 mol) foisuspenso em etanol absoluto (210 mL) . HC1 concentrado (1,1 eq)foi adicionado em temperatura ambiente com agitação. A misturafoi agitada em refluxo por 30 minutos e resfriada atemperatura ambiente e agitada por 2 h. O sólido foi filtradoe o bolo úmido foi lavado com etanol absoluto frio (3 x 50mL). O sólido foi seco sob vácuo a 30°C por 48 h parafornecer o composto de título (34,5 g, 93,7% de rendimento,conteúdo de água pelo método de Karl Fischer 0,13 %) .

Exemplo 3: Síntese de hidrato cristalino de sal decloridrato de ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de { (1S, 3R, 5R) - 8- [ (R) -2-hidroxi-3-(metanossulf onil-metil-amino) propi] ] - 8-aza-biciclo [3.2.1] oct-3-amida

Cloridrato de ácido l-Isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R) -2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil]-8-aza-biciclo[3.2.1] oct-3-il}amida (139 mg, 0,28 mmol) foidissolvido em água esterilizada para injeção (2 mL) . Emalgumas horas, a solução tornou-se uma suspensão turva. Asuspensão foi agitada e deixada em repouso de um dia para ooutro em temperatura ambiente resultando em um precipitadobranco. O sólido foi coletado por filtração e seco por 2minutos em condições ambientes (aproximadamente 40-50% deumidade relativa) para fornecer o composto de título (130 mg,91% de rendimento).

Exemplos 4 — 9: Propriedades das Formas de sal dainvenção

Amostras do sal de cloridrato cristalino de ácido 1-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de{ (1S, 3R, 5R) -8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonilmetil-amino)propil]-8-aza-biciclo [3.2.1]oct-3-il}amida (composto defórmula I) , preparado como no Exemplo 2 e do hidrato cristalinodo sal de cloridrato do composto de fórmula I, preparado comono Exemplo 3, foram analisadas por difração de pó de raios X(PXRD), calorimetria de rastreamento diferencial (DSC),análise termogravimétrica (TGA), espectroscopia deinfravermelho (IR) e análise de elementos.

Exemplo 4: Difração de põ de raios X

Os padrões de difração de pó de raios X foram obtidoscom um difratômetro Thermo ARL X-Ray Modelo XTRA (ThermoARL SA, Switzerland) com o uso de radiação de Cu Ka a1,542 Â (45 kV, 40 mA) com um detector de estado sólido deSi(Li). A análise foi tipicamente realizada em uma taxa derastreamento de 2°/min com um tamanho de etapa de 0,03° porponto em um faixa de 2 o a 35° em ângulo dois-teta. Asamostras, como foram recebidas ou moídas a um pó fino,foram levemente embaladas em um implante de pequenovolume desenhado para se ajustar na taça de amostragem decarga superior do instrumento para análise. A calibragemdo instrumento a ±0,02° ângulo de dois-teta foi verificadasemanalmente por comparação com um padrão de metal desilício. Padrões de PXRD representativos para amostras dosal de cloridrato cristalino e do hidrato do sal decloridrato da invenção são mostrados nas Figuras 1 e 4,respectivamente.

Exemplo 5: Analise térmica

Calorimetria de rastreamento diferencial (DSC) foirealizada com o uso de um Instrumento TA Modelo Q-100módulo. Os dados foram coletados e analisados com o uso deprograma "TA Instruments Thermal Advantage Q Series™" . Umaamostra de cerca de 1-10 mg foi precisamente pesada em umabandeja de alumínio com tampa. A amostra foi avaliada como uso de uma rampa de aquecimento linear de 10°C/min de5°C a, tipicamente, 265°C. A célula DSC foi purificada comnitrogênio seco durante o uso. Traços representativos deDSC para amostras do sal de cloridrato cristalino e dohidrato cristalino de um sal de cloridrato do composto Isão mostrados nas Figuras 2 e 5, respectivamente.

Análise termogravimétrica (TGA) foi realizada com ouso de um módulo TA Instruments Model Q-500. Os dados foramcoletados e analisados com o uso de programa "TA InstrumentsThermal Advantage for Q Series™". Uma amostra pesando cercade 1-5 mg foi colocada em uma bandeja de alumínio em umabase de platina e rastreada da temperatura ambiente a300°C com uma de aquecimento linear de 10°C/min. Ascâmaras de equilíbrio e fornalha foram purificadas comnitrogênio durante o uso. Traços representativos paraamostras de um sal de cloridrato cristalino e do hidratocristalino de um sal de cloridrato do composto I sãomostrados nas Figuras 2 e 5, respectivamente.

O traço de DSC na Figura 2 demonstra que um sal decloridrato da presente invenção tem excelente estabilidadetérmica com um Máximo de fluxo de calor endotérmico na faixade cerca de 230°C a cerca de 260°C e nenhum evento térmicosignificativo abaixo de cerca de 225°C. A comparação dostraços de DSC e TGA indica que um sal de cloridrato dapresente invenção sofre simultaneamente fusão e decomposiçãoem temperaturas acima de cerca de 230°C.

O traço de DSC na Figura 5 para a presente forma dehidrato exibe um pico substancial no fluxo de calorendotérmico identificado com fusão do cristal na faixa decerca de 225°C a cerca de 250°C e endotermos amplos ou fracosem menores temperaturas.

A comparação dos traços de DSC e TGA indicam que adecomposição da forma de hidrato cristalino não ésignificativa na temperatura da transição de fusão.

Exemplo 6: Avaliação de absorção de umidade dinâmica

A avaliação de absorção de umidade dinâmica (DMS) foirealizada a 25°C com o uso de sistema "VTI atmosphericmicrobalance, SGA-100" (VTI Corp., Hialeah, FL 33016). Umtamanho de amostra de aproximadamente 5-10 mg foi usado e aumidade foi ajustada no valor ambiente no início da análise.Uma análise típica DMS consistiu em três rastreamentos:ambiente a 2% de umidade relativa (UR), 2% de UR a 90% de UR,90% de UR a 5% de UR em uma taxa de rastreamento de 5% deUR/etapa. A massa foi medida a cada dois minutos e a RH foimodificada para o próximo valor (± 5% de UR) quando a massada amostra foi estável a 0,02% por 5 pontos consecutivos.Traços representativos de DMS para amostras de um sal decloridrato cristalino e de um hidrato cristalino de um sal decloridrato do composto I são mostradas nas Figuras 3 e 6,respectivamente.

O sal de cloridrato exibe um perfil de absorção/desabsorção reversível com uma mudança de peso de menos que0,2% sobre a faixa inteira de 2% a 90% de UR. A forma dehidrato exibe um perfil de absorção /desabsorção reversívelcom uma perda de peso de cerca de 2,3% à medida que a amostrafoi seca do ambiente a 2% de UR que foi recuperada à medidaque o espécime seco foi exposto a 2% de URa 40% de UR. Aforma de hidrato tinha menos que cerca de 0,25% de ganho depeso na faixa de 40% de UR a 75% de UR.

Exemplo 7: Análise de infravermelho

O espectro de absorção de infravermelho (IV) foideterminado sobre a faixa de freqüência de 4.000 a 675 cm"1com o uso de um espectrometro Avatar 360 FT-IR equipado comum "Nicolet attenuated total reflection (ATR) sample holder" .Um espectro de absorção de IR representativo para uma amostrade um sal de cloridrato cristalino da invenção tinha bandasde absorção significativas em 758±1, 78311, 795+1, 802±1,949±1, 981±1, 1149±1, 1158±1, 1217±1, 1332±1, 1377±1, 1453±1,1467±1, 1487±1, 1525±1, 1566±1, 1575±1, 1615±1, 1672±1, e 3197±1 cm"1.Exemplo 8: Avaliação da estabilidade de estado sólido

Amostras do sal de cloridrato da invenção foramestocadas em múltiplos frascos de vidro abertos a 40°C e 75%de UR. Em intervalos específicos, o conteúdo de um frascorepresentativo foi removido e analisado por DSC, TGA, PXRD epor HPLC para pureza química. Depois de 24 semanas deestocagem, não houve mudança detectável no DSC. ou termogramasde TGA nem no padrão de PXRD. A pureza química da amostraestocada foi de 99,6 %.

Exemplo 9: Determinação da proporção molar do contra-íon

A proporção molar do contra-íon de ácido clorídrico (HA)para ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulf onilmetil-amino)propil] -8-aza-biciclo [3.2.1] oct-3-il}amida (composto de fórmula foi calculada de acordo com aseguinte fórmula:

Proporção do contra-íon = (Wha/MWha) / (Wr/MWi)

Em que Wha é a percentagem de peso de HC1 na amostra, MWhaé o peso molecular de HCL, MWi é o peso molecular do compostode fórmula I (504,6 amu) , e Vlx é a percentagem de peso docomposto de fórmula I na amostra, calculados de acordo com afórmula:

Wi=100 - Whx - WH20 - WRS

Em que WH2o é a percentagem de peso do conteúdo de água,WRS é a percentagem de peso de solvente residual, sob apresunção de que o composto I não tenha impurezas.

A proporção molar de ácido clorídrico para o composto Ipara uma amostra de um sal de cloridrato cristalino dainvenção foi calculada como 0,94:1 com o uso da percentagemde peso de de HC1 (Wha) de 6,3 % e os valores de WH20 = 0,26 % eWrs = 0,47%. O conteúdo de HC1 foi determinado por titulaçãocom uma solução padrão de nitrato de prata, o conteúdo deágua WH2o foi determinado por titulação coulométrica de KarlFisher e o conteúdo de solvente residual Wrs foi determinado porcromatografia a gás.

Exemplo Comparativo 1: Síntese de sal de ácido cítricode ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-aza-biciclo [3.2.1] oct-3-il}amida

Ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de { (1S, 3R, 5R) - 8- [ (R) -2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-aza-biciclo [3.2.1] oct-3-il}amida (0,1 g, 0,2 mmol) foi suspenso em etanol (1 mL) . Aessa suspensão foi adicionada uma solução 1M de ácido cítricoem etanol (0,072 mL, 0,072 mmol, 0,33 eq) . A mistura foirapidamente sonificada até ficar clara, tampada e entãodeixada em repouso de um dia para o outro. A tapa foi entãoremovida e a mistura foi deixada para evaporar sob condiçõesambientes até que fossem observados sólidos. A mistura foientão novamente tampada e deixada em repouso por 72 h. Osólido resultante foi filtrado e lavado com etanol frio paragerar o composto de título como um sólido (74,3 mg).

Exemplo Comparativo 2: Síntese de sais ácidos de ácido{ (1S,3R, 5R) -8- [ (R) -2-hidroxi-3- (metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-aza-biciclo [3 .2 .1] oct-3-il}amida 1-isopropil-2-oxo-l,2- dihidroquinolina-3-carboxílico

Seguindo o procedimento do Exemplo Comparativo 1, osseguintes sais ácidos de ácido l-isopropil-2-oxo-l, 2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil]-8-aza-biciclo [3.2.1] oct-3-il}amida foram preparados em formasólida com o uso dos equivalentes indicados de ácido (peso doproduto no segundo parêntese): adípico (0,5 eq) (48,5 mg);fosfórico (0,5 eq) (86,6 mg); sulfúrico (0,5 eq) (27,0 mg);tartárico (0,5 eq) (66,3 mg); málico (0,5 eq) (25,3 mg); ehidrobrômico (1 eq) (62,9 mg).

Exemplo Comparativo 3: Síntese de sal de ácidometanossulf ônico de ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(meth anesulfonil-metil-amino)propil]-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il}amida

A uma solução de ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida (0,1 g, 0,2 mmol) em 50%acetonitrila/água (1 mL) foi adicionada uma solução de 1M deácido metanossulf ônico em etanol (0,2 mL, 0,2 mmol, 1 eq) . Amistura foi então congelada e liofilizada até secagem de umdia para o outro. O sólido resultante foi dissolvido emisopropanol (1 mL) com leve aquecimento e deixada pararesfriar. O sólido resultante foi coletado por filtração elavado com isopropanol frio para gerar o composto de títulocomo um sólido (90 mg).

Exemplo Comparativo 4: Síntese de sais ácidos de ácido1-i sopropi1-2 -oxo-1,2 -dihidroquino1ina-3-carboxí1ico de{ (1S,3R,5R) -8- [ (R) -2-hidroxi-3 - (metanossulfonil-metil-amino) propil] -8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il}amida

Seguindo o procedimento do Exemplo Comparativo 3, osseguintes sais ácidos de ácido l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico de {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil]-8-aza-biciclo [3.2.1] oct-3-il}-amida foram preparados em formasólida com o uso dos equivalentes indicados de ácido (peso doproduto no segundo parêntese): fumárico (1 eq) (107,2 mg);benzóico (1 eq) (105,2 mg); e (R)-mandélico (1 eq) (96,1mg).

Exemplo Comparativo 5: Propriedades dos Compostos dosExemplos Comparativos 1-4.

Os sais de ácido cristalinos do composto de fórmula Idos Exemplos Comparativos 1-4 foram analisados por PXRD, DSC,e TGA. Em todos os casos, foi observada uma perda de peso porTGA em temperaturas abaixo de cerca de 100°C, que pode serprovavelmente atribuída à perda de solvente. As temperatura(s)nas quais o fluxo de calor endotermico foi observado por DSC,exclusivo das características de baixa temperaturaatribuída à perda de solvente, junto com confirmação dacristalinidade por PXRD são resumidas na Tabela I em que aestoiquiometria ê indicada pelo número de equivalentes deácido usado para preparar o sal de ácido.

Tabela I: Comparação dos sais

<table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table>

* múltiplos polimorfos, exotermo observado

# surgimento da fusão e decomposição

Ensaio 1: Ensaio de ligação de radioligante emReceptores de 5-HT4(c) Humano

a. Preparação de Membrana 5-HT4(C)

Células HEK-293 (renais embriônicas humanas) estavelmentetransfectadas com cDNA de receptor humano 5-HT4(C) (Bmax = -6,0pmol/mg proteína, como determinado com o uso de ensaio deligação de radioligante de membrana [3H]-GR113808) cresceramem frascos T-225 em meio de Eagle modificado por Dulbecco(DMEM) contendo 4.500 mg/L D-glicose e cloridrato de piridoxina(GIBCO-Invitrogen Corp., Carlsbad CA: Cat #11965)suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) (GIBCO-Invitrogen Corp. : Cat #10437) , 2 mM L-glutamina e (100unidades) penicilina- (100 fig) estreptomicina/ml (GIBCO-Invitrogen Corp. : Cat #15140) em C02 a 5%, incubadorumidifiçado a 37°C. As células cresceram sob pressão deseleção contínua pela adição de 800 ug/mL de geneticina(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat #10131) ao meio.

As células cresceram a 60-80% de confluência (<35passagens de subcultura). Em 20-22 horas antes da coleta, ascélulas foram lavadas duas vezes e alimentadas com DMEM livrede soro. Todas as etapas da preparação da membrana foramrealizadas em gelo. A monocamada de células foi elevada porleve agitação mecânica e trituração com uma pipeta de 25 mL.As células foram coletadas por centrifugação a 1.000 rpm (5min). Para a preparação da membrana, os péletes de célulasforam ressuspensos em 50 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanossulfônico gelado (HEPES), pH 7,4 (tampão depreparação de membrana) (40 mL/rendimento de célula total de30-40 frascos T225) e homogeneizados com o uso de um"disrupter politron" (ajuste 19, 2 x 10 s) em gelo. Oshomogenados resultantes foram centrifugados a 1.200 g por 5minutos a 4°C. O pélete foi descartado e o sobrenadantecentrifugado a 40.000 g (20 min) . O pélete foi lavado uma vezpor ressuspensão com tampão de preparação de membrana ecentrifugação a 40.000 g (20 min). O pélete final foiressuspenso em 50 mM HEPES, pH 7,4 (tampão de ensaio)(equivalente 1 T225 frasco/l mL) . A concentração de proteínada suspensão de membrana foi determinada pelo método deBradford (Bradford, 1976) . As membranas foram estocadascongeladas em alíquotas a -80°C.

b. Ensaios de ligação de radioligante

Ensaios de ligação de radioligante foram realizados emplacas de ensaio de polipropileno de 96 cavidades profundasde 1,1 mL (Axygen) em um volume total de ensaio de 400 |aLcontendo 2 |ag de proteína de membrana em 50 mM HEPES pH 7,4,contendo 0,025% de albumina bovina sérica (BSA). Estudos deligação de saturação para a determinação de valores de Kd doradioligante foram realizados com o uso de [3H]-GR113808(Amersham Inc., Bucks, UK: Cat #TRK944; atividade especifica-82 Ci/mmol) em 8-12 diferentes concentrações que variam de 0,001nM — 5,0 nM. Ensaios de deslocamento para a determinação devalores de pKi de compostos foram realizados com [3H]-GR113808em 0,15 nM e onze diferentes concentrações de composto quevariam de 10 pM - 100 jjM.

Os compostos de teste foram recebidos como soluções deestoque a 10 mM em DMSO e diluídos a 400 |iM em 50 mM HEPES pH7,4 a 25°C, contendo 0,1% BSA e diluições em série (1:5) entãofeitos no mesmo tampão. A ligação não específica foideterminada na presença de 1 uM de GR113808 não rotulado. Osensaios foram incubados por 60 minutos em temperaturaambiente, e então as reações de ligação foram terminadas porrápida filtração em placas de fibra de vidro de 96 cavidadesGF/B (Packard BioScience Co., Meriden, CT) pré-encharcadas em0,3% polietilenoimina. As placas de filtro foram lavadas trêsvezes com tampão de filtração (50mM HEPES gelado, pH 7,4) pararemover radioatividade não ligada. As placas foram secas, 35uL de fluido de cintilação líquida Microscint-20 (PackardBioScience Co., Meriden, CT) foram adicionados a cadacavidade e as placas foram contadas em um contador decintilação líquida Packard Topcount (Packard BioScience Co.,Meriden, CT).

Os dados de ligação foram analisados por análise deregressão não linear com o pacote de programas GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc. , San Diego, CA) com o uso do modelode 3-parâmetros para competição de um sítio. O BOTTOM (mínimode curva) foi fixado ao valor para ligação não específica, comdeterminado na presença de 1 ^tm GR113808. Os valores de Ki paracompostos de teste foram calculados, em Prisma, a partis dosvalores "best-fit" de IC50 e o valor de Ka do radioligante,com o uso da equação de Cheng-Prusoff (Cheng e Prusoff,Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 3099-108): K± = IC50/(1 +[L]/Kd) em que [L] = concentração [3H] -GR113808. Os resultadossão expressos como o logaritmo decádico negativo dos valoresde Ki, pKi.

Os compostos de teste com um valor Ki mais alto nesseensaio têm uma afinidade de ligação maior para o receptor5-HT4. O composto de fórmula I tinha um valor de pKi maior quecerca de 7,5 nesse ensaio.

Ensaio 2: Ensaio de ligação de radioligante em Receptoresde 5-HT3A Humanos:

Determinação de seletividade de subtipo de receptor

a. Preparação de Membrana de 5-HT3A

Células HEK-293 (renais embriônicas humanas) estavelmentetransfectadas com cDNA de receptor humano 5-HT3A foram obtidasde Dr. Michael Bruess (University of Bonn, GDR) (Bmax - ~9,0pmol/mg proteína, como determinado com o uso de ensaio deligação de radioligante de membrana [3H]-GR65630) . As célulascresceram em frascos T-225 ou fábricas de células em 50% demeio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCO-InvitrogenCorp., Carlsbad, CA: Cat #11965) e 50% de Ham F12 (GIBCO-Invitrogen Corp. : Cat #11765) suplementado com 10% de sorobovino fetal inativado por calor (FBS) (Hyclone, Logan, UT:Cat #SH30070.03) e (50 unidades) penicilina-(50 |ag)estreptomicina/ml (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat #15140) em umincubador umidificado de 5% C02 a 37°C.

As células cresceram a 70-80% de confluência (<35passagens de subcultura). Todas as etapas da preparação damembrana foram realizadas em gelo. Para coletar as células, omeio foi aspirado e as células foram enxaguadas com soluçãosalina tamponada por fosfato de Dulbecco livre de Ca2+, Mg2+-(dPBS). A monocamada de células foi elevada por leve agitaçãomecânica. As células foram coletadas por centrifugação a1.000 rpm (5 min). Etapas subseqüentes da preparação demembrana seguiram o protocolo acima descrito para as membranasque expressam receptores 5-HT4(C).

b. Ensaios de ligação de radioligante

Ensaios de ligação de radioligante foram realizados emplacas de ensaio de polipropileno de 96 cavidades em umvolume total de ensaio de 200 |iL contendo 1,5-2 ^g de proteínade membrana em 50 mM HEPES pH 7,4, contendo 0,025% de tampãode ensaio de albumina bovina sérica (BSA) . Estudos de ligaçãode saturação para a determinação de valores de Kd doradioligante foram realizados com o uso de [3H]-GR65630(PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA: Cat #NET1011,atividade específica ~85 Ci/mmol) em 12 diferentes concentraçõesque variam de 0,005 nM a 20 nM. Ensaios de deslocamento para adeterminação de valores de pKi de compostos foram realizadoscom [3H]-GR65630 em 0,50 nM e onze diferentes concentrações decomposto que variam de 10 pM a 100 |JM. Os compostos foramrecebidos como soluções de estoque a 10 mM em DMSO (veja,seção 3.1), e diluídos a 400 \M em 50 mM HEPES pH 7,4 a 25°C,contendo 0,1% BSA e diluições em série (1:5) então feitos nomesmo tampão. A ligação não específica foi determinada napresença de 10 (jM de MDL72222 não rotulado. Os ensaios foramincubados por 60 minutos em temperatura ambiente e então asreações de ligação foram terminadas por rápida filtração emplacas de fibra de vidro de 96 cavidades GF/B (PackardBioScience Co., Meriden, CT) pré-encharcadas era 0,3%polietilenoimina. As placas de filtro foram lavadas três vezescom tampão de filtração (50mM HEPES gelado, pH 7,4) pararemover radioatividade não ligada. As placas foram secas, 35uL de fluido de cintilação líquida Microscint-20 (PackardBioScience Co., Meriden, CT) foram adicionados a cadacavidade e as placas foram contadas em um contador decintilação líquida Packard Topcount (Packard BioScience Co.,Meriden, CT).

Os dados de ligação foram analisados com o uso deprocedimento de regressão não linear acima descrito paradeterminar ps valores de Kj.. O BOTTOM (mínimo de curva) foifixado ao valor para ligação não específica, com determinadona presença de 10 um MDL72222. A quantidade [L] na equação deCheng-Prusoff foi definida como a concentração [3H]-GR65630.

A seletividade para o subtipo 5-HT4 de receptor comrelação ao subtipo de receptor 5-HT3 foi calculada como aproporção Ki (5-HT3A) /Ki (5-HT4(C). O composto de fórmula I tinha umaseletividade de subtipo de receptor 5-HT4/5-HT3 maior que cercade 1.000 nesse ensaio.

Ensaio 3: Ensaio Flashplate de acúmulo de cAMP de célulainteira com células HEK-293 que expressam Receptores humanos 5-HT4(C)

Nesse ensaio, a potência funcional de um composto deteste foi determinada por medição da quantidade de AMP cíclicoproduzido quando células HEK-293 que expressam receptores 5-HT4fizeram contato com diferentes concentrações de composto deteste.

a. Cultura de célulasCélulas HEK-293 (renais embriônicas humanas) estavelmentetransfectadas com cDNA de receptor humano 5-HT4(C) clonado forampreparadas com a expressão do receptor em duas diferentesdensidades: (1) em uma densidade de cerca de 0,5-0,6 pmol/mgde proteína, como determinado com o uso de um ensaio deligação de radioligante de membrana [3H]-GR113808, e (2) emuma densidade de cerca de 6,0 pmol/mg proteína. As célulascresceram em frascos T-225 em meio de Eagle modificado porDulbecco (DMEM) contendo 4.500 mg/L de D-glicose (GIBCO-Invitrogen Corp. : Cat #11965) suplementado com 10% de sorobovino fetal (FBS) (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat #10437) e(100 unidades) penicilina-(100 pg) estreptomicina/ml (GIBCO-Invitrogen Corp. : Cat #15140) em um incubador umidifiçado de5% C02 a 37°C. As células cresceram sob pressão de seleçãocontínua pela adição de 800 ug/mL de geneticina (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat #10131) ao meio.

Preparação de células

As células cresceram a 60-80% de confluência. Vinte avinte e duas horas antes do ensaio, as células foram lavadasduas vezes, e alimentadas com DMEM livre de soro contendo4.500 mg/L de D-glicose (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat #11965).Para coletar as células, o meio foi aspirado e 10 mL deVersene (GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat #15040) foramadicionados a cada frasco T-225. As células foram incubadaspor 5 min em temperatura ambiente e então removidas do frascopor agitação mecânica. A suspensão de células foi transferidapara um tubo de centrífuga contendo um volume igual de dPBSpré-aquecido (37°C) e centrifugada por 5 minutos a 1.000rpm. O sobrenadante foi descartado e o pélete foi ressuspensoem tampão de estímulo pré-aquecido (37°C) (lOmL equivalentespor 2-3 frascos T-225) . Esse tmpo foi observado e marcadocomo tempo zero. As células foram contadas com um contadorCoulter (contagem acima de 8 |J.m, rendimento do frasco foi de1-2 x IO7 células/frasco). As células foram ressuspensas emuma concentração de 5 x IO5 células/ml em tampão de estimulopré-aquecido (37°C) (como fornecido no kit "flashplate") epré-incubadas a 37°C por 10 minutos.

Ensaios de cAMP foram realizados em um formato deradioimunoensaio com o uso do sistema de ensaio de ativação"Flashplate Adenilil Cyclase" com 125I-cAMP (SMP004B, PerkinElmerLife Sciences Inc., Boston, MA), de acordo com as instruçõesdo fabricante.

As células cresceram e foram preparadas como acimadescrito. Concentrações finais de células no ensaio foram de25 x IO3 células/cavidade e o volume final do ensaio foi de100 uL. Os compostos de teste foram recebidos como soluções deestoque a 10 mM em DMSO e diluídos a 400 |JM em 50 mM HEPES pH7,4 a 25°C, contendo 0,1% BSA e diluições em série (1:5) entãofeitos no mesmo tampão. Os ensaios de acúmulo de AMP cíclicoforam realizados com 11 diferentes concentrações de compostoque variam de 10 pM a 100 (jM (concentrações finais do ensaio) .Uma curva concentração-resposta de 5-ht (10 pM a 100 jjM) foiincluída em cada placa. As células foram incubadas, comagitação, a 37°C por 15 minutos e a reação terminada pelaadição de 100 fjl de tampão de detecção gelado (como fornecidono kit "flashplate") a cada cavidade. As placas foramseladas e incubadas a 4°C de um dia para o outro. Aradioatividade ligada foi quantificada por espectroscopia deproximidade de cintilação com o uso de Topcount (PackardBioScience Co., Meriden, CT).A quantidade de cAMP produzida por mL de reação foiextrapolada a partir da curva padrão de cAMP, de acordo com asinstruções fornecidas no manual de usuário do fabricante. Osdados foram analisados por análise de regressão não linear como pacote de programas GraphPad Prism com o uso do modelo dedose-resposta sigmoidal de 3-parâmetros (inclinação constritaa unidade). Os dados de potência são relatados como valores depEC50, o logaritmo decádico negativo do valor de EC50, em queEC50 é a concentração eficaz para uma resposta máxima de 50%.

Compostos de teste que exibem um maior valor de pEC50nesse ensaio têm uma maior potência de agonista do receptor 5-HT4. O composto de fórmula I que foi testado nesse ensaio nalinha de células (1) que tem uma densidade de cerca de 0,5-0,6pmol/mg de proteína, teve um valor de pEC50 maior que cerca de 7,5.

Ensaio 4: Ensaio de grampo de voltagem in vitro deinibição da corrente de íon potássio em células totais queexpressam o canal de potássio cardíaco hERG

Células CHO-K1 estavelmente transfectadas com cDNA de hERGforam obtidas de Gail Robertson na Universidade de Wisconsin.

As células foram mantidas em estocagem criogênica até seremnecessárias. As células foram expandidas e passadas em Meiode Eagles modificado por Dulbecco/F12 suplementado com 10% desoro bovino fetal e 200 mg/mL geneticina. As células foramsemeadas em lâminas de poli-D-lisina (100 ^ig/mL) de vidrocobertas, em placas de 35 mm2 (contendo 2 mL de meio) em umadensidade que permitiu que as células isoladas fossemselecionadas para estudos de voltagem-grampo de célulainteira. As placas foram mantidas em um ambiente umidifiçado,com 5% C02 a 37°C.Solução extracelular foi preparada pelo menos a cada7 dias e estocada a 4°C quando não em uso. A soluçãoextracelular continha (mM) : NaCl (137), KC1 (4), CaCl2 (1,8),MgCl2 (1), Glicose (10), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico (HEPES) (10), pH 7,4 com NaOH. A soluçãoextracelular, na ausência ou presença de composto de teste,foi contida em reservatórios, dos quais ela fluiu na câmarade registro em aproximadamente 0,5 mL/minuto. A soluçãointracelular foi preparada, dividida em alíquotas eestocada a -20°C até o dia do uso. A solução intracelularcontinha (mM) : KC1 (130) , MgCl2 (1) , sal de ácido etilenoglicol-bis(beta-aminoetil éter) N,N,N',N'-tetra acético(EGTA) (5), MgATP (5), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico (HEPES) (10), pH 7,2 com KOH. Todos osexperimentos foram realizados em temperatura ambiente (20-22°C).

As lâminas nas quais as células foram semeadas foramtransferidas para uma câmara de registro e perfundidascontinuamente. Selos de "Gigaohm" foram formados entre acélula e o eletrodo patch. Uma vez que um patch estável fosseatingido, o registro iniciava no modo de grampo de voltagem,com o potencial de retenção inicial a -80 mV. Depois de umacorrente de célula inteira estável ter sido atingida, ascélulas foram expostas ao composto de teste. O protocolopadrão de voltagem era: medido a partir do potencial deretenção de -80 mV a +20 mV por 4,8 segundos, repolarizar a -50 mV por 5 segundos e então retonrar ao potencial deretenção original (-80 mV) . Esse protocolo de voltagem foifeito a cada 15 segundos (0,067 Hz) . As amplitudes decorrente de pico durante a fase de repolarização foramdeterminadas com o uso de programa pClamp. Compostos de testeem uma concentração de 3 jjM foram perfundidos sobre as célulaspor 5 minutos, seguido por uma período de 5 minutos de lavagemna ausência de composto. Finalmente um controle positivo(cisapride, 20 nM) foi adicionado à perfusão para testar afunção da célula. A etapa de -80 mV a +20 mV ativa o canal dehERG, resultando em um corrente exterior (para fora). A etapade volta a -50 mV resulta em uma corrente de cauda exterior,à medida que o canal se recupera da inativação e desativa.

As amplitudes de corrente de pico durante a fase derepolarização foram determinadas com o uso de programa pCLAMP.Os dados de artigo de teste e controle foram exportados paraOrigin® (OriginLab Corp., Northampton MA) em que as amplitudesindividuais da corrente foram normalizadas à individuais dacorrente inicial na ausência de composto. A média de correntenormalizada e erros padrão para cada condição foram calculadose colocados em gráfico versus a duração em tempo doexperimento.

Foram feitas comparações entre as inibições de correntede K+ observadas depois da exposição de cinco minutos aoartigo de teste ou controle de veículo (comumente 0,3% DMSO).Comparações estatísticas entre os grupos experimentais foramrealizadas com o uso de um teste T independente de duaspopulações (Microcal Origin, v. 6.0). As diferenças foramconsideradas significativas em p < 0,05.

Quanto menos a inibição percentual da corrente de íonpotássio nesse ensaio, menor o potencial para compostos deteste de modificar o padrão da repolarização cardíaca quandousados como agentes terapêuticos. O composto de fórmula I foitestado nesse ensaio em uma concentração de 3 jjM e exibiu umainibição da corrente de íon potássio de menos que cerca de15%.

Ensaio 5: Modelo ín vitro de biodisponibilidade oral:ensaio de penetração Caco-2

O ensaio de penetração Caco-2 foi realizado para modelara capacidade dos compostos de teste de passar através dointestino e atingir a corrente sangüínea depois daadministração oral. A taxa na qual os compostos de teste emsolução permeiam uma monocamada de células projetada paraimitar a junção firme das monocamadas do intestino delgadohumano foi determinada.

Células Caco-2 (cólon, adenocarcinoma; humana) foramobtidas de ATCC (American Type Culture Collection; Rockville,MD). Para o estudo de penetração, as células foram semeadas emuma densidade de 63.000 células/cm2 em filtros depolicarbonato pré-umedecidos transwell (Costar,- Cambridge,MA). Uma monocamada de células foi formada depois de 21 diasem cultura. Após a cultura de células na placa transwell, amembrana contendo a monocamada de células foi destacada daplaca transwell e inserida na câmara de difusão (Costar;Cambridge, MA) . A câmara de difusão foi inserida no bloco deaquecimento que foi equipado com água circulante externa,termostaticamente regulada a 37°C para controle datemperatura. O distribuidor de ar liberou 95% 02/5% C02 a cadametade de uma câmara de difusão e criou um padrão de fluxolaminar por toda a monocamada de células, que foi eficaz naredução da camada de limite não agitada.

O estudo de penetração foi realizado com concentrações de ocomposto de teste a 100 uM e com 14C-manitol para monitorar aintegridade da monocamada. Todos os experimentos foramconduzidos a 37°C por 60 minutos. Amostras foram retiradasem 0, 30 e 60 minutos dos lados doador e receptor da câmara.As amostras foram analisadas por HPLC ou contagem decintilação líquida para composto de teste e concentrações demanitol. O coeficiente de penetração (Kp) em cm/seg. foicalculado.

Nesse ensaio, um valor de Kp maior que cerca de 10 x IO"6cm/seg., é considerado indicativo de biodisponibilidadefavorável. O composto de fórmula I foi testado nesse ensaio eexibiu um valor de Kp maior que cerca de 20 x IO"6 cm/seg.Ensaio 6: Estudo farmacocinético no ratoFormulações de solução aquosa do compostos de teste forampreparadas em ácido lático 0,1% em um pH entre cerca de 5 ecerca de 6. Ratos machos Sprague-Dawley (cepa CD, CharlesRiver Laboratories, Wilmington, MA) receberam o compostos deteste via administração intravenosa (IV) em uma dose de 2,5,mg/kg ou por ingesta oral (VO) em uma dose de 5 mg/kg. Ovolume de dosagem foi de 1 mL/kg para administração IV e 2mL/kg para administração oral. Amostras sangüíneas em sérieforam coletadas de animais pré-dose e em 2 (apenas IV) , 5,15, e 30 minutos, e em 1, 2, 4, 8, e 24 horas pós-dose. Asconcentrações dos compostos de teste em plasma sangüíneoforam determinadas por análise de cromatograf ia líquida-espectrometria de massa (LC-MS/MS) (MDS SCIEX, API 4000,Applied Biosystems, Foster City, CA) com um limite inferior dequantificação de 1 ng/mL.

Os parâmetros farmacocinéticos padrão foram avaliados poranálise não compartimental (Modelo 201 para IV e Modelo 200para VO) com o uso de WinNonlin (Versão 4.0.1, Pharsight,Mountain View, CA) . O máximo na curva de concentração docomposto de teste no plasma sangüíneo vs. tempo é denotadoQnax- ^ área sob a curva de concentração vs. tempo do tempo dedosagem à última concentração mensurável (AUC(O-t)) foicalculada pela regra trapezoidal linear. A biodisponibilidadeoral (F(%)), ou seja, a proporção dose-normalizada de AUC(0-t) para administração por via oral para AUC(O-t) paraadministração IV, foi calculada como:

F(%) = AUCvd/AUCiv x Doseiv/Dosevo x 100%

Espera-se que os compostos de teste que exibem maioresvalores dos parâmetros Cnax, AUC(O-t), e F(%) nesse ensaiotenham maior biodisponibilidade quando administrados por viaoral. O composto de fórmula I tinha um valor de C^ax de 0,16ug/mL, um valor de AUC(O-t) de 0,46 (ig/mL e biodisponibilidadeoral (F(%)) no modelo de rato de cerca de 19%.

Embora a presente invenção tenha sido descrita comreferência às modalidades específicas dessa, serácompreendido por aqueles com habilidade na técnica quevárias alterações podem ser feitas e equivalentes podem sersubstituídos sem se afastar do verdadeiro espírito e escopoda invenção. Adicionalmente, várias modificações podem serfeitas para adaptar uma situação, material, composição dematéria, processo, etapa ou etapas de processo, em particularao objetivo, espírito e escopo da presente invenção, todasessas modificações devem estar dentro do escopo dasreivindicações em apêndice. Adicionalmente, todas aspublicações, patentes e documentos de patente aqui citadossão aqui incorporados por referência em sua totalidade namesma extensão como se cada documento tivesse sidoindividualmente aqui incorporado por referência.

Claims

1. Forma cristalina de sal caracterizada por ser o salde cloridrato de ácido { (1S, 3R, 5R) - 8- [ (R) -2-hidroxi-3-(metanossulf onil-metil-amino) propil] -8-azabiciclo [3.2.1] oct- 3-il}amida l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico ou um solvato desse.

2. Forma cristalina de sal, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a formacristalina de sal é um sal de cloridrato cristalino.

3. Forma cristalina dé sal, de acordo com areivindicação 2, carac teri zada pelo fato de que a formacristalina do sal é caracterizada por um padrão de difração depó de raios X que tem dois ou mais picos de difração emvalores 20 selecionados de 4,41 ± 0,2, 8,82 ± 0,2, 9,08 ±- 0,2, 11,21 + 0,2, 14,40 ± 0,2, 16,42 + 0,2, 17,35 ± 0,2,- 17,61 ± 0,2, 18,14 ± 0,2, 19,04 ± 0,2, 19,95 ± 0,2, 20,20 ±- 0,2, 21,23 ± 0,2, 22,13 ± 0,2, 22,48 ± 0,2, 22,83 + 0,2,- 24,16 ± 0,2, 25,37 ± 0,2, 25,56 ± 0,2, 26,22 ± 0,2, 27,33 ±- 0,2, 29,08 ± 0,2 e 29,61 ± 0,2.

4. Forma cristalina de sal, de acordo com areivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o padrão dedifração de pó de raios X compreende dois ou mais picos dedifração em valores 20 selecionados de 14,40 ± 0,2, 17,35 + 0,2, 17,61 ± 0,2, 19,04 ± 0,2, 21,23 ± 0,2 e 22,13 ± 0,2.

5. Forma cristalina de sal, de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a formacristalina do sal é caracterizada por um padrão de difraçãode pó de raios X em que as posições do pico estãosubstancialmente de acordo com as posições de pico do padrãomostrado na Figura 1.

6. Forma cristalina de sal, de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a formacristalina do sal é caracterizada por um traço de calorimetriade rastreamento diferencial que mostra um máximo no fluxo decalor endotermico em uma temperatura maior que cerca de 230 °C.

7. Forma cristalina de sal, de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a formacristalina do sal é caracterizada por um traço decalorimetria de rastreamento diferencial substancialmente deacordo com aquele mostrado na Figura 2.

8. Forma cristalina de sal, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a formacristalina do sal é um hidrato.

9. Forma cristalina de sal, de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a formacristalina do sal é caracterizada por um padrão de difraçãode pó de raios X que tem dois ou mais picos de difração emvalores 26 selecionados de 5,30 ± 0,2, 7,43 ± 0,2, 8,72 ±- 0,2, 10,52 ± 0,2, 13,85 ± 0,2, 14,11 ± 0,2, 15,80 ± 0,2,- 15,99 ± 0,2, 17,26 ± 0,2, 19,53 ± 0,2, 20,08 ± 0,2, 21,06 +- 0,2, 21,48 ± 0,2, 21,92 ± 0,2, 22,85 ± 0,2, 23,91 ± 0,2,- 25,28 ± 0,2, 26,06 ± 0,2, 27,34 ± 0,2, 27,51 ± 0,2 e 29,67 ± 0,2.

10. Forma cristalina de sal, de acordo com areivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o padrão dedifração de pó de raios X compreende dois ou mais picos dedifração em valores 20 selecionados de 10,52 + 0,2, 13,85 ± 0,2, 15,80 ± 0,2, 17,26 ± 0,2 e 21,06 ± 0,2.

11. Forma cristalina de sal, de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a formacristalina do sal é caracterizada por um padrão de difração depó de raios X em que as posições do pico estão substancialmentede acordo com as posições de pico do padrão mostrado na Figura 4.

12. Forma cristalina de sal, de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a formacristalina do sal é caracterizada por um traço decalorimetria de rastreamento diferencial substancialmente deacordo com aquele mostrado na Figura 5.

13. Composição farmacêutica caracterizada porcompreender um veículo farmaceuticamente aceitável e umaforma cristalina de sal de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.

14. Método de tratamento de um mamífero tendo umacondição médica associada à atividade do receptor 5-HT4, ométodo caracterizado por compreender a administração aomamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de umacomposição farmacêutica que compreende um veículofarmaceuticamente aceitável e uma forma cristalina de sal dequalquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.

15. Método de tratamento de um distúrbio de motilidadereduzida do trato gastrointestinal em um mamífero, o métodocaracterizado por compreender a administração ao mamífero deuma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composiçãofarmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamenteaceitável e uma forma cristalina de sal de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que o distúrbio de motilidadereduzida é selecionado de constipação crônica, síndrome docólon irritável de constipação predominante, gastroparesiadiabética e idiopática e dispepsia funcional.

17. Forma cristalina de sal, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizada por ser para uso em terapia.

18. Uso de uma forma cristalina de sal de qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12,caracterizado por ser para a manufatura de um medicamento.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o medicamento é para otratamento de uma condição médica em um mamífero associadaà atividade de receptor 5-HT4.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a condição médica é um distúrbio demotilidade reduzida do trato gastrointestinal.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que a condição médica éselecionada de constipação crônica, síndrome do cólon irritávelde constipação predominante, gastroparesia diabética eidiopática e dispepsia funcional.

22. Processo para a preparação de um sal cristalino decloridrato de ácido {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-azabiciclo [3.2.1] oct-3-il}amida l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico, o processo caracterizado por compreender:(a) o contato de ácido {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulf onil-metil-amino) propil] -8-azabiciclo [3.2.1] oct-3-il}amida 1-isopropi1-2-oxo-1,2-dihidroquinolina-3 -carboxílico com ácido clorídrico para formar uma mistura dereação; e(b) isolação do sal cristalino de cloridrato damistura de reação.

23. Processo para a preparação de um hidrato cristalinodo sal de cloridrato de ácido {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino) propil] -8-azabiciclo [3.2.1] oct-3-il} amida l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico, o processo caracterizado por compreender:(a) dissolução de cloridrato de ácido {(1S,3R,5R)-8-[(R) -2-hidroxi-3-(metanossulfonil-metil-amino)propil] -8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il}amida l-isopropil-2-oxo-l,2-dihidroquinolina-3-carboxílico em água em uma concentraçãomaior que cerca de 50 miligramas por mililitro para formaruma suspensão; e(b) isolação do hidrato cristalino da suspensão.