BRPI0711572A2 - organismos recombinantes atenuados de clostridium e vacinas - Google Patents

Abstract

ORGANISMOS RECOMBINANTES ATENUADOS DE CLOSTRIDIUM E VACINAS. A presente invenção refere-se a organismos atenuados de Clostridium perfringens que expressam uma toxina alfa substancialmente não-tóxica. A toxina alfa expressada é uma muteina com deleção que, em relação à toxina alfa da toxina alfa madura da cepa 13 de Clostridium perfringens, não possui, pelo menos, nove resíduos de aminoácidos consecutivos, incluindo HiS~68~. A presente invenção refere-se a também a organismos atenuados que codificam as muteínas, bem como o uso destes organismos atenuados como vacinas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ORGANIS- MOS RECOMBINANTES ATENUADOS DE CLOSTRIDIUM E VACINAS".

Referência Cruzada a Pedidos de Patentes Correlatos

Este é um pedido de patente não provisório que reivindica priori- dade sob 35 U.S.C. § 119(e) do pedido de patente provisório U.S. Nq de série 60/792 553, depositado em 17 de abril de 2006, o conteúdo do qual são aqui incorporados em sua totalidade por referência neste pedido de pa- tente.

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a organismos atenuados do gênero Clostridium, a métodos de produção e de uso dos mesmos, e a muteínas de toxina alfa e ácidos nucléicos que codificam as mesmas. Antecedentes da Técnica

As bactérias anaeróbicas patogênicas são um fardo econômica sério sobre o setor agrícola. As bactérias da família Clostridium representam um fardo especial, uma vez que estas bactérias causam doenças sérias em aves domésticas e outros animais domésticos de valor econômico. Esforços anteriores para controlar estes organismos basearam-se em medidas sanitárias e na administração de antibióticos na alimentação dos animais.

Em particular, Clostridium perfringens ("C. perfringens") é uma bactéria anaeróbica encontrada no solo, matéria orgânica em decomposição e como parte da flora intestinal de seres humanos e animais. Cepas diferentes de C. perfringens são designadas como biotipos AaE, dependendo do espectro de toxinas produzidas [Justin et ai, Biochemistry 41, 6253-6262 (2002); McDoneI (1986) Pharmacology of Bacterial Toxins; F Dorner e J Drews (Eds.) Pergamon Press, Oxford]. As cepas do biotipo A são de importância particular como os agentes etiológicos de vários tipos de gangrena e de doenças entéricas. Uma doença entérica especialmente sé- ria, causada pelo C. perfringens é a enterite necrotizante (também conhecida na técnica como "enterite necrótica"), uma gangrena dos intestinos que resulta em necrose, sepse e hemólise, tanto em seres humanos como em animais domésticos [consultar, Pearson et al., J. Am. Vet. Med. 1309-10 (1986); Al-Sheikhy e Truscott, Avian Dis. 21(2):256-63 (1977)]. Em aves, por exemplo, galinhas (Gallus gallus), enterite necrotizante é um problema significativo. C. perfringens do tipo A ou tipo C pode causar perdas importantes, especialmente na produção de galinhas poedeiras [Ficken e Wages, Necrotic Enteritis, In Diseases of Poultry, 10° Ed. pp 261- 264 (1997)]. Além de perdas associadas a surtos de enterite necrótica, de acordo com o relatado a produtividade é comprometida em plantéis com do- ença associada a C. perfringens [Lovl e Kaldhusdal, Avian Pathology 30:73- 81 (2001)]. Conforme foi observado acima, a introdução de agentes antibac- terianos na ração dos animais é o método mais comum de controle. No en- tanto, agentes antibacterianos, por exemplo, antibióticos são caros e sujeitos à preocupação crescente relacionada à promoção de resistência bacteriana.

Mais recentemente, foram feitas várias tentativas para produção de vacinas contra espécies nocivas de Clostridium. Por exemplo, Lovland et al. [Avian Pathology 33(1):83-92 (2004)] apresentaram vacinas candidatas à base de toxóides de C. perfringens tipo A e tipo C com hidróxido de alumínio como adjuvante. Foi relatado que a vacinação de galinhas reprodutoras for- nece anticorpos específicos que protegem a progênie contra lesões entéri- cas induzidas por desafio subclínico com C. perfringens. São conhecidas outras vacinas à base de toxóides preparadas a partir de toxinas destoxificadas de C. perfringens [consultar, por exemplo, a Patente U.S. N9 4 292 307 que descreve toxóides de C. perfringens tipos A, B e D, de Cl. oedematiens e de Cl. septicum].

Foram propostos também preparados de toxóides recombinan- tes. Por exemplo, Titball et al., [Patentes U.S. Nos 5 851 827, 6 403 094 e 5 817 317] relatam ácidos nucléicos que codificam peptídeos antigênicos do C. perfringens, bem como os próprios peptídeos, e vacinas preparadas a partir dos peptídeos. São descritos peptídeos, por exemplo, que possuem de 261 a 300 resíduos de aminoácidos da toxina alfa natural do C. perfringens, mas que são desprovidos dos domínios da fosfolipase C de hidrolisinas da esfingomielina da toxina natural. Foi relatado ainda que estes peptídeos in- duzem proteção imune contra a toxina natural. Ademais, a Patente U.S. N9 6 610 300 descreve uma vacina à base de um fragmento antigênico de toxina beta de uma muteína de C. perfringens.

Contudo, independentemente se uma vacina de toxóide é derivada do organismo nativo ou se é obtida por recombinação, a produção e a administração de proteínas toxóides para animais que necessitam de imunização são consideradas atividades economicamente pesadas, exceto sob circunstâncias especiais (por exemplo, o tratamento em seres humanos que poderiam ser alérgicos ou sensíveis a outros componentes de uma vacina de organismo inteiro). Além disso, vacinas à base de proteína/toxóide requerem tipicamente vacinas de reforço repetidas para manutenção de efe- tividade plena.

Outra solução proposta foi construir um vírus antigenicamente ativo que produziria uma muteína da toxina alfa, ao invés de toxina do tipo selvagem. Por exemplo, Bennett et ai. [Viral Immunol. 720:97-105 (1999)] demonstraram um vetor de vírus Vaccinia recombinante que expressa um domínio C não-tóxico de toxina alfa C. perfringens. Infelizmente, embora diversas vacinas de Vaccinia recombinante tenham sido propostas durante os últimos 20 anos, permanecem ainda preocupações que existem há muito tempo sobre a segurança de liberar vírus Vaeeinia vivos infecciosos em ambiente onde poderiam ser transmitidos a pessoas que não são resistentes a este vírus.

A toxina alfa (gene pie) de C. perfringens possui reconhecidamente várias atividades biológicas que incluem atividade hemolítica, atividades de fosfolipase C, esfingomielinase, fosfodiesterase, além de letal. Há alguns relatos na técnica referente a mutações efetuadas a esta toxina alfa que reduzem sua toxicidade. Schoepe et al. [Infeet. and Immun. 69(11):7194-7196 (2001)] descrevem uma cepa natural de C. perfringens que produz toxina alfa não-tóxica. No entanto, seria difícil modificar esta cepa para provocar proteção imune contra outras espécies variantes, porém tóxicas de C. perfringens do tipo selvagem.

Williamson e Titball [Vaeeine 7 7(72;: 1253-1258 (1993)] mostraram que a região da toxina, formam somente os resíduos de aminoácidos 247 a 370 foi suficiene para imunizar camundongos contra gangrena gasosa induzida experimentalmente por C. perfringens. Alape- Girón et al. [Eur. J. Biochem. 267:5191-5197 (2000)] relataram que substituições em Asp269, Asp336, Tir275, Tyr307 e Tir331 reduziram a toxicidade da toxina alfa. Nagahama et ai [Infect. and Immun. 65:3489-3492 (1997)] relataram que a substituição de Asp-56, Asp-130 ou de Glu-152 resultou em toxicidade menor da toxina alfa. Nagahama et al. [J. Bacteriology 177:1179-1185 (1995)] relataram que a substituição da histidina na posição 68 por um aminoácido neutro, como glicina, na toxina alfa de C. perfringens resultou em perda completa da atividade hemolígica, de fosfolipase C, esfingomielinase e letal de toxina alfa da muteína. Essa alteração de um único aminoácido, supostamente, inativava um dos três domínios de ligação ao zinco da proteína. Este domínio de ligação ao zinco, inativado por substituição de His68 foi posteriormente marcado como Zn2 [Justin et al., Biochemistry 41:6253-6262 (2002)].

Apesar de o precedente, permanece havendo necessidade na técnica por um método seguro, econômico e efetivo que proteja intensamente animais domésticos criados, incluindo aves, contra infecção por espécies de Clostridium, incluindo C. perfringens.

A menção a referências neste pedido de patente não deve ser interpretada como admissão de que esta referência está disponível como "arte anterior" para a aplicação imediata.

Sumário da Invenção

A fim de abordar as deficiências descritas acima na técnica, a presente invenção provê moléculas de ácido nucléico que codificam uma muteína substancialmente não-tóxica da toxina alfa de Clostridium perfringens. Em uma dessas concretizações, a molécula de ácido nucléico codifica uma toxina alfa de uma muteína que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 18 resíduos de aminoácidos consecutivos, em que um dos resíduos deletados de aminoácido é HiS68- Em outra concretização, a molécula de ácido nucléico codifica uma toxina alfa de uma muteína que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 12 resíduos de aminoácidos consecutivos, em que um dos resíduos deletados de aminoácido é His6S- Em ainda uma outra concretização, a molécula de ácido nucléico codifica uma muteína que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 9 resíduos de aminoácidos consecutivos, em que um dos resíduos deletados de aminoácido é His68- Em mais uma outra concretização, a molécula de ácido nucléico codifica uma muteína que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 6 resíduos de aminoácidos consecutivos, em que um dos resíduos deletados de aminoácido é His6S- Em ainda outra concretização, a molécula de ácido nucléico codifica uma muteína que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 3 resíduos de aminoácidos consecutivos, em que um dos resíduos deletados de aminoácido é His68-

Em uma concretização, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção codifica uma muteína, em que não mais do que 48 resíduos de aminoácidos consecutivos são deletados da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em outra concretização, uma molécula de ácido nucléico codifica uma muteína em que não mais do que 36 resíduos de aminoácidos consecutivos são deletados da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em ainda uma outra concretização, uma molécula de ácido nucléico codifica uma muteína em que não mais do que 24 resíduos de aminoácidos consecutivos são deletados da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em outra ainda concretização, uma molécula de ácido nucléico codifica uma muteína em que não mais do que 18 resíduos de aminoácidos consecutivos são deletados da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Em uma concretização especial, a presente invenção provê uma molécula de ácido nucléico que codifica uma muteína na qual nove resíduos de aminoácidos consecutivos são deletados da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, um dos quais sendo His68- Em uma concretização especial desse tipo, a molécula de ácido nucléico codifica uma muteína em que os nove resíduos consecutivos de aminoácidos deletados estendem-se de Tir62 até Trp70 da SEQ ID NO: 3. Em uma concretização mais especial, a molécula de ácido nucléico codifica uma muteína em que estes nove aminoácidos deletados são substituídos por um único resíduo de leucina.

Em outra concretização, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, em que os nucleotídeos 268-294 são deletados. Em uma concretização específica deste tipo, os nucleotídeos 268-294 de uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2 são substituídos por três nucleotídeos que codificam um único resíduo de leucina.

A invenção provê também muteínas substancialmente não- tóxicas de toxina alfa de Clostridium perfringens. Em uma destas concretizações, a toxina alfa da muteína compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 18 resíduos consecutivos de aminoácidos, em que um dos resíduos deletados de aminoácido é HiS68· Em outra concretização, a muteína compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 12 resíduos consecutivos de aminoácidos, em que um dos resíduos deletados de aminoácido é His6S- Em ainda outra concretização, a muteína compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 9 resíduos consecutivos de aminoácidos, em que um dos resíduos deletados de aminoácido é HiS6s- Em ainda uma outra concretização, a muteína compreende a seqüência de aminoácidos of SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 6 resíduos consecutivos de aminoácidos, em que um dos resíduos deletados de aminoácido é HiS68- Em ainda uma outra concretização, a muteína compreende a seqüência de aminoácidos of SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 3 resíduos consecutivos de aminoácidos, em que um dos resíduos deletados de aminoácido é His68.

Em uma concretização, uma muteína da presente invenção compreende não mais do que 48 resíduos consecutivos de aminoácido que são deletados da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em outra concretização, a muteína compreende não mais do que 36 resíduos consecutivos de aminoácido que são deletados da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em ainda uma outra concretização, a muteína compreende não mais do que 24 resíduos consecutivos de aminoácido que são deletados da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em ainda uma outra concretização, a muteína compreende não mais do que 18 resíduos consecutivos de aminoácido que são deletados da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Em uma concretização especial, a presente invenção provê uma muteína substancialmente não-tóxica, na qual nove resíduos consecutivos de aminoácido são deletados da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, um dos quais sendo HÍS68· Em uma concretização mais especial desse tipo, os noves resíduos deletados consecutivos de aminoácidos estendem- se de Tir62 a Trp7O da SEQ ID NO: 3. Em ainda uma concretização mais especial, estes nove aminoácidos consecutivos deletados são substituídos por um único resíduo de leucina na seqüência de aminoácidos da muteína.

A invenção provê ainda organismos atentuados de Clostridium perfringens que possuem uma molécula de ácido nucléico que codifica uma muteína substancialmente não-tóxica da toxina alfa de Clostridium perfringens integrada em seus cromossomos. Esta molécula integrada de ácido nucléico está localizada, de preferência, em uma posição no cromossomo homóloga à localização de uma molécula de ácido nucléico que codifica a toxina alfa do tipo selvagem no organismo do tipo selvagem de Clostridium perfringens. Dessa forma, um organismo atenuado de Clostridium perfringens da presente invenção pode ser substancialmente não-tóxico pela ausência de um gene funcional pie do tipo selvagem. Conforme exemplificado no presente, o organismo atenuado de Clostridium perfringens pode ser de Clostridium perfringens tipo A.

Em uma concretização especial da presente invenção, o organismo atenuado de Clostridium perfringens é o Clostridium perfringens CPERF/AccToxina 365-054 (Depósito N5 da ATCC PTA7364). Em outra con- cretização especial da presente invenção, o organismo atenuado de Clostridium perfringens é o Clostridium perfringens CPERF/AaToxina 365- 053 (Depósito Nq da ATCC PTA7365).

Um organismo do tipo Clostridium perfringens, atenuado pelos métodos da presente invenção, pode ser isolado de um animal hospedeiro que pode ser um mamífero ou uma ave. Estes mamíferos podem incluir: bovinos, ovinos e suínos. Exemplos de aves apropriadas incluem galinhas, perus, patos, pombos, gansos, cisnes, perdiz e faisão.

A presente invenção provê também vacinas. Estas vacinas podem compreender os organismos atenuados de Clostridium perfringens da presente invenção. As vacinas da presente invenção podem incluir também tampões farmacologicamente aceitáveis, excipientes e/ou adjuvantees.

Ademais, a invenção provê métodos de induzir de imunidade contra Clostridium perfringens em um animal. Uma destas concretizações compreende a administração de uma dose imunologicamente efetiva de uma vacina da presente invenção para o animal. As vacinas da presente invenção podem ser administradas por algumas vias que incluem: oral, in- tramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutânea e intranasal. Uma vacina da presente invenção pode recobrir a ração do animal e/ou ser pulverizada nos animais para permitir administração oral. A presente invenção provê ainda uma ração animal que inclui uma vacina da presente invenção.

A presente invenção provê também um organismo atenuado de Clostridium perfringens da presente invenção que, além do mais, expressa pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo que não pertence ao Clostridium perfringens. Em uma destas concretizações, um ou mais dos polipeptídeos que não pertencem ao Clostridium perfringens são polipeptídeos bacterianos, como proteínas antigênicas provenientes de E. coli, salmonella, lawsonia, ou campylobacter, etc., e/ou combinações destas.

Alternativamente, ou em combinação com o mesmo, um polieptídeo que não pertence ao Clostridium perfringens pode ser um polipeptídeo não- bacteriano. Exemplos destes polipeptídeos não-bacterianos incluem proteínas de mamíferos ou de aves, por exemplo, citocinas, como IL-18 de galinha; vírus como rotavírus ou coronavírus; e parasitas como eimeria, isospora e cryptosporidium.

Em uma outra característica, a presente invenção provê um anticorpo que se liga seletivamente a um epitopo que não está presente na muteína substancialmente não-tóxica da toxina alfa de Clostridium perfringens. Estes anticorpos podem diferenciar a muteína substancialmente não-tóxica de toxina alfa do tipo selvagem de Clostridium perfringens.

São também providos kits de testes que incluem os anticorpos da presente invenção para serem utilizados na identificação se um determinado animal foi vacinado ou se, alternativametne, foi infectado naturalmente por um organismo do tipo Clostridium perfringens.

De acordo com o mesmo, são providos também métodos de identificação e/ou para distinguir se um animal foi naturalmente infectado por um organismo do tipo Clostridium perfringens de um vacinado com um organismo atenuado de Clostridium perfringens. Em uma destas concretizações, o método requer o contrato de uma amostra líquida do animal com um anticorpo que se liga seletivamente a um epitopo encontrato em toxina alfa do tipo selvagem de Clostridium perfringens que foi excluída da muteína substancialmente não-tóxica da toxina alfa de Clostridium perfringens da presente invenção. Por conseguinte, o anticorpo pode distinguir aqueles animais que foram vacinados com uma muteína substancialmente não-tóxica da toxina alfa de Clostridium perfringens da presente invenção, (e/ou um organismo atenuado de Clostridium perfringens que expresse a muteína) daqueles que estão infectados ou que foram infectados por toxina alfa do tipo selvagem de Clostridium perfringens. A próxima etapa é determinar se o anticorpo reage com a amostra líquida, se por exemplo, liga-se a um antígeno contido na amostra líquida. É identificado o animal que está/esteve infectado naturalmente por organismo do tipo Clostridium perfringens quando o anticorpo reage com a amostra líquida.

Breve Descrição das figuras

A figura 1 ilustra um mapa genômico da região codificadora da toxina alfa de C. perfringens. São apresentados os locais dos dois grandes fragmentos (1182 pares de base e 1746 pares de base), respectivamente, que foram utilizados para construir CPERF001. O local da deleção resultante, constituída por 27 pares de base, é indicado também. "Ypld' indica o gene yplc (CPE0035); "pie" indica o gene codificador da toxina alfa (uma fosfolipase C) e "CobW", um gene em sentido descendente.

A figura 2A ilustra a seqüência de uma parte do gene pie da cepa CP6 de C. perfringens [SEQ ID NO: 4; esta seqüência é parte da SEQ ID NO: 22, (ou seja, nucleotídeos 262-300) de um fragmento do gene pie da cepa CP6] e a seqüência peptídica correspondente (SEQ ID NO: 5), em que o sublinhado indicada o sítio de restrição BamHI da endonuclease, utilizado para criar a deleção.

A figura 2B ilustra a seqüência do iniciador (SEQ ID NO: 6) utilizada para criar a deleção na cepa 1240 progenitora de C. perfringens, dando origem ao CPERF001 com a deleção. O sublinhado indica o sítio de restrição BamHI, incluído no iniciador, para facilitar a construção da deleção. O peptídeo correspondente está ilustrado também. (SEQ ID NO: 7).

A figura 2C ilustra a seqüência da deleção resultante no CPERF001 (SEQ ID NO: 8; nucleotídeos 103-117) e a do peptídeo resultante (SEQ ID NO: 9). O sublinhado indica o sítio de restrição BamHi restaurado da endonuclease.

A figura 3A ilustra mais uma vez a seqüência de uma parte do gene pie da cepa CP de C. perfringens [SEQ ID NO: 4, nucleotídeos 262- 300] e a seqüência do peptídeo correspondente (SEQ ID NO: 5), em que o sublinhado indica o sítio de restrição BamHI da endonuclease, utilizado para criar a deleção.

A figura 3B ilustra a seqüência do iniciador (SEQ ID N0:10), utilizada para criar a deleção na cepa 29 progenitora de C. perfringens, dando origem ao CPERF002 com deleção. O peptídeo correspondente está ilustrado também (SEQ ID NO:11).

A figura 3C ilustra a seqüência da deleção resultante no CPERF002 (SEQ ID NO: 12) e a do peptídeo resultante (SEQ ID NO: 13). Descrição Detalhada da Invenção

De acordo com o mesmo, a invenção provê organismos modificados e culturas de Clostridia que expressam uma ou mais toxinas de Clostridia, por exemplo, toxinas alfa, como muteínas que não possuem toxicidade detectável e/ou exibem toxicidade substancialmente baixa em relação às toxinas nativas ou do tipo selvagem de Clostridia. Vantajosamente, os organismos mutantes do tipo C. perfringens da invenção são de administração imediata, sob a forma de vacina viva, para animais. As muteínas de toxina alfa de C. perfringens da invenção, são também providas, juntamente com moléculas de ácido nucléico que codificam as muteínas, vetores para expressão das toxinas alfa e métodos de uso dos mesmos.

A fim de fornecer uma descrição clara da invenção, vários termos são definidos, da forma como segue. Uma vacina é uma composição que inclui um imunogênio e outros ingredientes opcionais farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, em certas concretizações, adjuvantes adequados. Conforme utilizado no presente, o termo "imunogênio" descreve uma composição, uma substância ou um vetor que, quando introduzido em um animal, estimula uma resposta imune. Para fins da presente invenção, é contemplado um imunogênio que inclua qualquer vetor capaz de expressar ou introduzir a muteína da toxina alfa da invenção em um animal a ser imunizado. Um vetor inclui, por exemplo, o C. perfringens da invenção ou outro microorganismo adequado que expresse a muteína de toxina alfa da invenção, quando o vetor é introduzido em um animal. Um vetor inclui também moléculas de ácido nucléico conhecidas na técnica, por exemplo, plasmídeos e similares que expressam a muteína de toxina alfa da invenção, quando introduzidos diretamente em um animal, por exemplo, pela entrada em célula do animal e pela expressão da muteína de toxina alfa no animal. Um imunogênio é também uma proteína, como a toxina alfa da invenção, empregada isoladamente ou como parte de uma composição adequada de vacina.

Conforme utilizados no presente e a não ser que especificados de outra forma, os termos "imunizar" e "vacinar" são sinônimos e utilizados alternadamente para descrever a introdução de um imunogênio em um animal para provocar resposta imune no animal. A resposta imune induzida proporciona imunidade protetora ao animal tratado que limita ou reduz sinais clínicos da doença, por exemplo, gangrena gasosa e/ou mortalidade, em animais vacinados que são desafiados posteriormente com dose virulenta de espécies de C. perfringens contra os quais a vacina da invenção confere proteção.

O termo "adjuvante" é definido como uma ou mais substâncias que causam estimulação do sistema imune. Nesse contexto, um adjuvante é utilizado para intensificar uma resposta imune a um ou mais antígenos/isolados da vacina. É possível administrar um adjuvante antes, associado ou após a administração da vacina. Adjuvantes da presente invenção podem ser obtidos a partir de várias origens, incluindo de origens naturais, origens recombinantes e/ou serem sintetizados quimicamente, etc. Exemplos de compostos químicos utilizados como adjuvantes incluem, entre outros, compostos de alumínio; óleos que podem ou não ser metabolizados; polímeros em bloco; ISCOM (complexos de estimulação imune); vitaminas e minerais (incluindo, entre outros,: vitamina E1 vitamina A, selênio e vitamina B12); Quil A (saponinas); polímeros à base de ácido acrílico reticulado (por exemplo, polímeros de ácido prop-2-enóico) reticulado em níveis diferentes com um polialquenil poliéter, conforme vendido sob a marca registrada de CARBOPOL®; e/ou gotículas de óleo de tamanho microscópico, uniformemente dispersas em emulsão hídrica, por exemplo, conforme vendidas sob a marca registrada de Emulsigen®.

Exemplos adicionais de adjuvantes que às vezes têm sido especificamente referidos como estimulantes imunes, incluem, componentes da parede celular de bactérias e de fungos (por exemplo, lipopolissacarídeos, lipoproteínas, glicoproteínas, muramilpeptídeos, beta- 1,3/1,6-glucanos), vários complexos de carboidratos derivados de plantas (por exemplo, glicanos, acemanano), várias proteínas e peptídeos derivados de animais (por exemplo, hormônios, citocinas, fatores co-estimuladores) e novos ácidos nucléicos derivados de vírus e de outras origens (por exemplo, RNA de fita dupla, CpG). Além disso, combinações em qualquer número das substâncias supramencionadas podem prover efeito adjuvante e, por conse- guinte, podem formar um adjuvante da presente invenção.

O termo "anticorpo", conforme utilizado no presente, destina-se a abranger anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais e/ou fragmentos ou derivados recombinantes destes, incluindo proteínas de ligação construídas que incorporam domínios variáveis de anticorpos.

Conforme utilizado no presente, a numeração de resíduos e posição dos resíduos de aminoácidos das proteínas toxina alfa da invenção são baseadas no sistema numérico descrito para cepa 13 de Clostridium perfringens. A toxina alfa da cepa 13 de C. perfringens é relatada pelo N9 de Acesso do GenBank NC 003366, conforme ilustrada pela SEQ ID NO: 1. A proteína completa possui 398 aminoácidos em extensão. A toxina alfa codifi- cada pelos vetores de muteína, exemplificados abaixo, correspondem à pro- teína da SEQ ID NO: 1 com deleção dos resíduos de aminoácidos 90-98. Há uma seqüência de sinalização contendo 28 aminoácidos que é clivada e retirada durante a maturação da proteína. Por conseguinte, a deleção exemplificada corresponde aos resíduos 62-70 da proteína madura que possui 370 aminoácidos em extensão (SEQ ID NO: 3).

A numeração de códon do DNA codificador das proteínas toxina alfa da invenção baseia-se no gene pie da cepa 13 de Ciostridium perfringens, conforme relatada no N- de Acesso do GenBank NP 560952, e conforme ilustrada pela SEQ ID NO: 2. A seqüência codificadora de toxina alfa estende-se do nucleotídeo 48590 ao 49786 na cepa 13 de C. perfringens. A deleção do códon nas duas construções exemplificadas nesta exposição correspondem aos nucleotídeos 48857 a (e incluindo) 48883 do gene NP 560952. Esta deleção é encontrada no gene da toxina alfa e corresponde aos nucleotídeos 268-294 na seqüência codificadora de SEQ ID NO: 2.

Além disso, o uso de termos no singular, por conveniência na descrição, não pretende de forma alguma assim limitá-la. Portanto, por exemplo, referência a uma composição compreendendo uma célula de C. perfringens inclui referência a uma ou mais destas células. Deverá ser entendido também que esta invenção não está limitada às configurações especiais, etapas de processo e materiais, expostos no presente, uma vez que estas configurações, etapas de processo e materiais podem variar de certa forma. Deverá ser entendido também que a terminologia empregada nesta exposição é utilizada somente para descrever apenas concretizações especiais e não se destina a ser limitante, uma vez que a abrangência da presente invenção será limitada somente pelas reivindicações anexadas e equivalentes das mesmas.

Em uma característica especial da presente invenção, são providos mutantes irreversíveis de C. perfringens que são "substancialmente não-tóxicos", isto é, organismos que expressam uma toxina alfa imunogênica ou sem toxicidade, tornando-os, dessa forma, adequados para serem utilizados como vacinas protetoras. Os organismos do tipo C. perfringens da inveção são conferidos, portanto, de toxicidade suficientemente menor, em relação a organismos do tipo selvagem de C. perfringens, que os tornam toleráveis como vacina ou antígeno, quando empregados sob condições com efeito para produzir uma resposta imune contra toxina alfa ou contra C-perfringens, em um animal assim vacinado. Dessa forma, o organismo do tipo C. perfringens da invenão é "atenuado" em relação a C. perfringens do tipo selvagem.

A frase, "substancialmente não-tóxicos" destina-se também a se aplicar às muteínas imunogênicas de toxina alfa observadas acima que possuem toxicidade suficientemente baixa ou nenhuma, tornando-as, dessa forma, adequadas para uso em vacina de proteção.

A redução em toxicidade é medida, por exemplo, por um dos seguintes testes conhecidos na técnica: atividade hemolítica, atividade de fosfolipase C, atividade de esfingomielinase, atividade de fosfodiesterase e atividade letal em geral em um grupo de animais em teste. Geralmente, toxicidade residual não é detectável por estes testes convencionais. Não obstante, a presença de nível mínimo de uma ou mais destas atividades, por exemplo, de aproximadamente 10"4a aproximadamenteut 10"2, em relação à toxicidade em número equivalente de unidades infecciosas de toxina alfa de C. perfringens do tipo selvagem, da qual a muteína foi derivada, pode provar ser aceitável em ambiente veterinário.

Em uma concretização, a invenção é praticada empregando cepas do biotipo A de C. perfringens, as quais de particular importância como os agentes etiológicos de vários tipos de gangrena e de doenças entéricas. Em particular, a toxina alfa do C. perfringens é o alvo para deleção-atenuação, uma vez que a atenuação desta toxina é o bastante para tornar o C. perfringens suficientemente não-letal, em relação a cepas do tipo selvagem.

Em linhas gerais, o gene pie de C. perfringens da invenção expressa uma muteína de toxina alfa. A muteína de toxina alfa possui uma deleção que inclui a His do "loop" Zn2, juntamente com resíduos flanqueadores, para reduzir bastante a possibilidade de qualquer retorno da mutação à forma tóxica. Atualmente, foi descoberto que deleção do resíduo His do Ioop Zn2, por exemplo, His6S da SEQ ID NO: 3, juntamente com a deleção de resíduos adicionais que flanqueiam o resíduo His do Ioop Zn2, faz com que uma toxina alfa retenha imunogenicidade suficiente para induzir imunidade protetora em animais vacinados com o C. perfringens da invenção, ao mesmo tempo em que sendo improvável que ocorra reversão de mutação para codificação de toxina alfa do tipo selvagem. Os resíduos adicionais que podem ser deletados são deletados no sentido C-terminal e/ou no sentido N-terminal, em relação a HiS68, e podem variar em número de aproximadamente 4 até aproximadamente 60 resíduos em qualquer um destes sentidos. Alternativamente, Hisi4e e resíduos laterais podem ser igualmente deletados.

Uma concretização da muteína de alfa toxina da invenção inclui também, além de a deleção de HiS68, deleção de pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de qualquer lado (no sentido C-terminal ou sentido N-terminal) da posição de His68, em relação a SEQ ID NO: 3. Em outra concretização, a muteína de alfa toxina da invenção inclui, além de a deleção de Ηίβββ, deleção de pelo menos 20 resíduos de aminoácidos de qualquer lado de HÍS68, em relação a SEQ ID NO: 3. Em ainda uma outra concretização alternativa, a muteína de alfa toxina da invenção inclui também, além de a deleção de His6S, deleção de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos de qualquer lado de His68, em relação a SEQ ID NO: 3. Em ainda uma outra concretização, a muteína de alfa toxina da invenção inclui deleção de aproximadamente 62 resíduos a aproximadamente 70 resíduos, em relação a SEQ ID NO: 3. Opcionalmente, os aminoácidos deletados são substituídos por um ou mais outros resíduos, como um único resíduo de leucina.

Em ainda uma outra concretização, a muteína de toxina alfa de C. perfringens é produzida e isolada a partir de C. perfringens, ou de um organismo alternativo recombinante a ser empretado como reagente de pesquisa e/ou em kits diagnósticos ou ensaios, por exemplo, como alvo para anticorpos contra toxina alfa. Uma outra utilidade ainda para proteínas mute- Tna de toxina alfa de C. perfringens é em vacinas especializadas para animais, por exemplo, seres humanos que podem não tolerar vacina com o organismo atenuado de C. perfringens da invenção.

Além disso, a presente invenção provê um anticorpo que se liga especificamente a toxina alfa do tipo selvagem, em relação às muteínas de toxina alfa da presente invenção.

Em ainda uma outra concretização é provido um anticorpo que se liga especificamente à proteína toxina alfa do tipo selvagem de C. perfringens, ao mesmo tempo em que exibe ligação mínima ou nenhuma à muteína de toxina alfa da invenção, por exemplo, evitando ligação a uma muteína de toxina alfa que possui deleção conforme descrita em detalhes acima. O anticorpo provido é, por conseguinte, útil para distinguir muteína de toxina alfa com deleção da toxina alfa do tipo selvagem e, dessa forma, é útil também para distinguir animais vacinados com uma vacina da presente invenção de animais que foram infectados por C. perfringens do tipo selvagem. Métodos para obter e rastrear estes anticorpos seletivos são conhecidos na técnica. Igualmente, anticorpos que reconhecem a muteína de toxina alfa da invenção, porém não a proteína do tipo selvagem, podem ser gerados também. Os anticorpos da presente invenção podem ser policlonais, monoclonais ("mAb") ou fragmentos ou fragmentos construídos ou derivados destes anticorpos que retêm propriedades de ligação seletiva.

Técnias para o preparo e rastreamento de anticorpos monoclonais foram descritas amplamente [consultar, por exemplo, Stites et ai (eds.) Basic and Clinicai Immunology (49 ed.), Lange Medicai Publications, Los Altos, Califórnia (1988); Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2- ed.), Academic Press, New York (1986); e Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975), todos os quais são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente].

Por exemplo, e sem limitação, um resposta imune é produzida em animais adequados, como camundongo ou galinha, por vacinação com proteína alfa purificada do tipo selvagem de C. perfringens, por exemplo, associada a adjuvante adequado. Por exemplo, a fim de evitar a toxicidade de proteína alfa do tipo selvagem, o imunogênio é um peptídeo que corresponde aos resíduos deletados e, se necessário, a imunogenicidade do peptídeo é intensificada por combinação com adjuvante adequado ou por acoplamento a uma proteína transportadora adequada. Acoplamento a uma proteína transportadora é técnica conhecida e pode ser realizada, por exemplo, provendo o peptídeo com cisteína terminal e acoplando-o a hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH) ou albumina bovina sérica (BSA), utilizando a química de acoplamento de ligante maleimida ou sulfossuccinimidil 4-[N maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilate (de Pierce). Um ligante carbodiimida pode ser empregado também sem requerer cisteína terminal.

Para o preparo de anticorpos monoclonais, linfócitos esplênicos podem ser obtidos de um animal imunizado, hibridomas são preparados a partir destes linfócitos e um ou mais hibridomas potencialmente adequados que expressem anti-proteína alfa podem ser obtidos. Os hibridomas são rastreados contra muteína e proteína alfa do tipo selvagem, e um hibridoma que expresse um anticorpo que se ligue somente à toxina alfa do tipo selvagem é identificado, clonado e empregado para produzir anticorpos monoclonais que se ligam somente à proteína alfa do tipo selvagem. Opcionalmente, cDNA da linhagem clonal do hibridoma identificado é obtido, e anticorpos recombinantes ou fragmentos de anticorpos podem ser produzidos em sistemas de expressão conhecidos na técnica.

Conforme foi discutido acima, uma possível desvantagem de vacinações em geral é a de que os animais vacinados resultantes podem gerar falsos positivos quando testados quanto à infecção, utilizando anticorpos criados contra uma cepa que ocorra naturalmente e, dessa forma, comprometendo a identificação de animais infectados. Por conseguinte, a presente invenção provê um kit de teste para distinguir um animal que tenha sido infectado por organismo do tipo C. perfringens que ocorra naturalmente de um vacinado com uma muteína de toxina alfa da presente invenção.

Um destes kits de teste inclui uma quantidade de anticorpo contra toxina alfa do tipo selvagem que exibe nível de ligação mínimo ou nenhum para uma muteína de toxina alfa da presente invenção. O kit pode incluir ainda outros reagentes adequados, suficientes para conduzir pelo menos um teste diagnóstico. Em uma outra concretização, o anticorpo é rotulado ou marcado com um grupamento de marcador de detecção imediata, por exemplo, qualquer marcador enzimático conhecido na técnica, entre eles, peroxidase; identificação fluorescente, por exemplo, fluoresceína; partículas, incluindo partículas magnéticas; e similares. Opcionalmente, o kit pode incluir ainda um anticorpo identificado que se liga seletivamente ao anticorpo contra toxina alfa do tipo selvagem. Imunoensaios são bem conhecidos na técnica e incluem imunoensaio do tipo sanduíche, imunoensaios competitivos, ensaios imunoenzimáticos de absorvência (ELISA), radioimunoensaios (RIA) e outros.

São providos também métodos para identificar e distinguir um animal que foi infectado por um organismo que ocorre naturalmente, isto é, C. perfringens do tipo selvagem, de um animal vacinado com uma vacina compreendendo o organismo atenuado de C. perfringens da inveção, conduzidos, por exemplo, seguindo as etapas abaixo: (a) por em contato amostra líquida do animal com um anticorpo seletivo antitoxina alfa do tipo selvagem descrito acima que exiba ligação mínima ou nenhuma a uma muteína de toxina alfa da presente invenção; e

(b) determinar se o anticorpo reage com a amostra líquida;

em que, quando o anticorpo reage com a amostra líquida, o animal é identificado como tendo sido infectado por organismo do tipo que ocorre naturalmente de C. perfringens.

Produção de Cepas Atenuadas de C. Perfrinaens

Um processo de conversão de isolado de C. perfringens do tipo selvagem em cepa atenuada ou substancialmente não-tóxica, adequada para ser administrada como vacina pode ser conduzido da forma como segue. O gene da toxina alfa (p/c) pode ser substituído no cromossomo da bactéria por um gene que codifica somente muteína de toxina alfa, não deixando qualquer resquício de capacidade para que o organismo do tipo C. perfringens produza toxina alfa do tipo selvagem. Em termos bem gerais, o processo de produção do organismo da vacina inclui, entre outras, as se- guintes etapas, em ordem não necessariamente da apresentada.

(1) Identificação do tipo de animal a ser protegido pela vacina e um ou mais isolados clínicos, obtidos para fins de rastreamento. Esta etapa é tipicamente opcional, no caso da toxina alfa, uma vez que isolados provenientes de uma espécie de animal são mais possivelmente propensos a não conferirem proteção para outras espécies de animais.

(2) Amplificação do gene p/c do isolado ou isolados de C. perfringens, por exemplo, por PCR ou por outra técnica de amplificação de ácido nucléico conhecida na arte, com iniciadores flanqueadores adequados para criar a mutação desejada por deleção. Alternativamene, é possível efetuar varredura com sonda em biblioteca apropriada.

(3) Criação de vetor suicida, compreendendo o gene p/c com a deleção, no qual a origem de replicação de C. perfringens tenha sido removida e/ou no qual simplesmente não haja origem de replicação que possa replicar em C. perfringens; e, em qualquer caso, incluindo marcadores selecionáveis adequados, por exemplo, marcadores antibióticos, adjacentes ao gene pie mutado. Este vetor pode ser inserido em organismos do tipo C. perfringens, por exemplo, por eletroporação ou por outros métodos conhecidos na técnica.

(4) Seleção de organismos do tipo C. perfringens nos quais o gene pie da muteína foi integrado com êxito no cromossomo bacteriano.

Esta seleção é realizada pela cultura de organismos do tipo C. perfringens da etapa (3), na presença do agente selecionável, por exemplo, antibiótico(s) que correspondam aos marcadores selecionáveis. Por exemplo, os únicos organismos do tipo C. perfringens que cresceriam sob a seleção antibiótica seriam aqueles que, através de recombinação em região de homologia, integraram diretamente o vetor suicida, com seu(s) gene(s) de resistência a antibiótico, no cromossoma bacteriano. Estes organismos do tipo C. perfringens cultivados, possuiriam, portanto, dois genes pie adjacentes, sendo do tipo selvagem, enquanto que o outro possuiria a mutação da deleção.

(5) Seleção de organismos do tipo C. perfringens que sofreram um evento posterior de recombinação que remove os marcadores selecionáveis, por exemplo, marcadores antibióticos, juntamente com o gene pie do tipo selvagem. Esta seleção é realizada pela cultura dos organismos da etapa (4), na ausência do agente selecionável, por exemplo, o antibiótico e seleção de clones não hemolígicos no ágar sangue.

Como a inserção do ácido nucléico da muteína é obtida por re- combinação em região de homologia, uma molécula de ácido nucléico que codifica a muteína da toxina alfa é incorporada em posição cromossômica homóloga à localização de uma molécula de ácido nucléico que codifica toxina alfa do tipo selvagem, presente em Clostridium perfringens não- atenuado.

Em mais detalhes, isolados em campo de C. perfringens são obitidos de animais doentes ou de outras origens. Inicialmente, DNA genômico de isolados em campo de interesse são inseridos em vetor duplo adequado de microorganismos do tipo ponte, por exemplo, um plasmídeo do tipo ponte com marcadores selecionáveis, por exemplo, marcadores antibióticos para avaliar a sua capacidade de transformação. Em linhas ge- rais, um vetor do tipo ponte adequado incluirá um, dois, três ou mais dos seguintes atributos, um sítio de clonagem, uma origem de replicação de C. perfringens, uma origem de replicação de E. coli e um gene de resistência a antibiótico e/ou marcador selecionável. Vetores conhecidos na técnica, adequados para essa finalidade ou que podem ser rapidamente adaptados para esta finalidade, incluem, por exemplo, o plasmídeo recombinante do tipo ponte pHR106, descrito por Roberts et al, [Appl Env Mircobiol 54: 268- 270 (1988)]; os plasmídeos pJIR 750 e pJIR 751, descritos por Bannam et al, [Plasmid 29233-235 (1993)]; o vetor de seleção sem promotor pPSV de Matsushita et al, 1994, Plasmid 31, 317-319; os plasmídeos tipo ponte pJIR1456 e pJIR1457, descritos por Lyras et al, 1988, Plasmid 39, 160-164; e o vetor tipo ponte pAK201, descrito por Kim et al, 1989, Appl Environ Microbiol 55, 360-365, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. A remoção da origem de replicação do C. perfringens converte o vetor do tipo ponte em vetor suicida.

Por exemplo, um plamídeo tipo ponte é o pJIR418, descrito por Sloan et al, 1992, Plasmid 27, 207-219, incorporado ao presente por referência neste pedido.

Isolados com rendimento ≥ 104 transformantes por micrograma de DNA do plasmídeo e que são susceptíveis ao marcador antibiótico, por exemplo, cloranfenicol ou eritromicina, são possíveis candidatos para deleção. DNA genômico das cepas canditadas é utilizado, em seguida, como modelo para PCR de extensão longa do gene pie (toxina alfa) e seqüências flanqueadoras das cepas canditadas. Por exemplo, conforme exemplificado abaixo, o cromossomo da cepa 13 de C. perfringens foi utilizado para identificar iniciadores para amplificação do gene codificador da toxina alfa. Estes iniciadores foram utilizados, em seguida, para clonar o gene da toxina alfa de outra cepa, que foi o isolado CP6 de galinha.

Após subclonagem dos produtos obtidos por PCR, o gene da toxina alfa e regiões flanqueadoras são seqüenciados e a restrição, mapeada. Novos iniciadores oligonucleotídeos são sintetizados com sítios de restrição que os flanqueiam e os produtos de duas amplificações separadas são clonados em um plasmídeo suicida adequado (origem de replicação de C. perfringens foi removida), por exemplo, exemplificado abaixo como plasmídeo 1192-23.1 para criar a cepa desejada da vacina com a deleção.

O(s) vetor(es) suicida(s) provido(s), específico(s) para o(s) isola- do(s) é(são) inserido(s) na cepa animal correspondente de C. perfringens, por meio de qualquer método convencional conhecido na técnica. Por exemplo, essa inserção pode ser obtida por eletroporação. Quando o vetor suicida é inserido no C. perfringens (sem a origem de replicação do C. perfringens, ele não é capaz de replicar no citoplasma e não sobrevive a não ser que seja integrado com êxito no cromossomo bacteriano). Organismos que se integram com êxito são somente aqueles que crescerão na presença do antibiótico correspondente ao gene do marcador antibiótico recém- introduzido.

Qualquer gene de marcador selecionável, conhecido na técnica, pode ser empregado, embora marcadores de cloranfenicol e/ou eritromicina são empregados nos vetores exemplificados abaixo.

Esses eventos recombinantes resultam da homologia do gene pie do tipo selvagem com o gene pie com deleção do DNA do plasmídeo. A bactéria recombinante resultante é denominada integrante. O integrante contém uma cópia do vetor de homologa introduzido que é integrado no locus do gene pie. Dessa forma, o integrante resultante inclui duas cópias do gene p/c, a cópia normal original e a versão introduzida deletada. Os genes introduzidos de resistência a antibiótico estão localizados entre as duas cópias do gene pie. Eventos de recombinação aleatórios podem ocorrer raramente entre as duas cópias do gene pie. Este evento de recombinação pode produzir um entre dois desfechos. Em ambos os casos, o DNA interveniente entre as duas cópias do gene pie (incluindo os genes de resistência) foi removido. No primeiro desfecho, o gene pie normal ou do tipo selvagem é restaurado, resultando em recuperação da cepa original progenitora sem marcadores antibióticos. No segundo desfecho, o gene pie do tipo selvagem é substituído pela cópia deletada, produzindo a construção de toxina alfa com deleção, sem os marcadores antibióticos.

A retirada do antibiótico do meio de cultura permite que estas bactérias que passaram por recombinação sobrevivam e repliquem-se. Os clones recombinantes com deleção são identificados, em seguida, por cres- cimento em ágar sangue, sem a hemólise normalmente exibida por C. perfringens que expressa a toxina alfa do tipo selvagem.

Animais a Serem Vacinados

Animais para os quais uma vacina com C. perfringens atenuado pode ser produzida e dos quais uma cepa útil de C. perfringens do tipo selvagem pode ser isolada, incluem, em linhas gerais, quaisquer animais para os quais infecção por C. perfringens seja um problema.

Vertebrados de interesse incluem aves, mamíferos e peixe, e especialmente, animais de importância econômica e/ou agrícola. A lista seguinte de animais inclui aqueles contemplados para se beneficiarem de vacina contra C. perfringens e/ou dos quais isolados de úteis de C. perfringens do tipo selvagem podem ser obtidos. Embora às vezes seja possível que qualquer uma destas vacinas compreenda um componente (vivo ou não) que foi isolado originalmente de animais do mesmo gênero ou espécie a serem vacinados, isso não é uma exigência.

Uma lista incompleta destes animais inclui aqueles das famílias de aves, bovina, ovina, etc., bem como animais aquáticos que podem ser, por exemplo, criados em aquacultura e/ou pescados de ambiente selvagem e mantido vivos em tanques por um tempo antes de serem comercializados.

Eles incluem peixes como truta ou salmão, e outras espécies criadas ou pescadas para benefício econômico. Animais aquáticos não vertebrados in- cluem lagostas, caranguejos, moluscos, por exemplo, lula, polvo, mariscos, ostras, mexilhões, vieiras e similares. Por aves, deve-se entender, por exemplo, galinhas, perus, ganso, pato, etc. Animais bovinos deverão incluir, por exemplo, gado de criação, gado de corte, vitela, etc. Ovinos deverão incluir, por exemplo, ovelha, etc.

Para fins da presente invenção, o termo "peixe" deverá incluir, entre outros, a classificação de peixes Teleosti, ou seja, teleósteos. A ordem Salmoniformes (que inclui a família Salmonidae) e a ordem Perciformes (que inclui a família Centrarchidae) estão contidas na classificação Teleosti.

Exemplos de possíveis peixes repositários incluem a família Salmonidae, a família Serranidae, a família Sparidae, a família Cichlidae, a família Centrarchidae, o peixe-porco de três linhas (Parapristipoma trilineatum) e o Plecostomus de olhos azuis (Plecostomus spp).

Família Salmonidae

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Em ainda uma outra concretização, o animal é um animal de companhia ou um ser humano. Para fins da presente invenção, o termo animal "de companhia" deverá incluir todos os animais - cavalos (eqüinos), gatos (felinos), cachorros (caninos) e roedores, incluindo camundongos, ratos, porquinhos-da-índia, espécies de coelho e aves, como pombos, papagaios e similares.

Aves que receberem esta vacina podem estar associadas à avicultura comercial ou não. Estas incluem, por exemplo, Anatidae, como cisnes, gansos e patos, Columbidae, por exemplo, pombas e rolinhas, como pombas domésticas, Phasianidae, por exemplo, perdiz, faisão e perús, Thesienidae, por exemplo, galinhas domésticas, Psittacines, por exemplo, periquitos, araras e papagaios, por exemplo, criados para o mercado de bichos de estimação ou de colecionador. As galinhas são exemplificadas abaixo.

Fontes de Isolados do Tipo Selvagem

Em geral, os organismos atenuados de C. perfringens da invenção podem ser produzidos a partir de C. perfringens do tipo selvagem que foi isolado originalmente de qualquer animal infectado de interesse, como discutido acima, e/ou de qualquer ambiente. O ambiente inclui qualquer material que contenha organismos viáveis de C. perfringens e/ou esporos viáveis de C. perfringens incluindo, por exemplo, alimento contaminado, solo, água, material utilizado como cama para animais, fezes e similares.

Justin et ai, [Biochemistry 41, 6253-6262 (2002)] caracterizaram toxinas alfa de cepas diferentes de C. perfringens, cujas seqüências e propriedades bioquímicas são quase idênticas. No entanto, Justin et ai. descrevem também uma cepa que foi isolada de origem aviária (cisne) que possuía uma toxina alfa exibindo alto grau de variação de seqüência e especificidade alterada para substrato, em comparação às outras cepas. Por esse motivo, acredita-se que a maioria dos isolados produzirá, quando convertidos para forma atenuada, imunidade protetora contra a toxina alfa de muitas outras cepas que ocorrem naturalmente de C. perfringens. Não obstante, dada a possibilidade de variação de toxina alfa entre isolados, será freqüentemente vantajoso isolar e atenuar organismos C. perfringens de espécies animais para as quais uma vacina contra C. perfringens é desejada. O isolado exemplificado abaixo foi obtido de galinha e testado naquela espécie.

Vacinas

Os organismos atenuados de C. perfringens da invenção são formulados geralmente em composições de vacina farmaceuticamente aceitáveis. As composições da vacina são formuladas de acordo com a via de administração e são compatíveis com o agente antigênico ativo. O agente antigênico ativo é, por exemplo, uma ou mais cepas de organismos atenuados de C. perfringens tipo A de acordo com a invenção. Opcionalmente, a composição da vacina pode incluir também um ou mais tipos de proteína alfa não-tóxica, em combinação com os organismos atenuados de C. perfringens tipo A.

Por exemplo, substancialmente todos os organismos atenuados de C. perfringens tipo A, incluídos na composição da vacina, estão vivos e viáveis, embora para certas situações específicas, por exemplo, imunização de certos seres humanos ou animais imunocomprometidos, a vacina compreenderá exclusivamente organismos mortos atenuados de C. perfringens tipo A.

A composição da vacina inclui tampões e/ou sais fisiologicamente compatíveis, em combinação opcional com adjuvantes e/ou promotores ou estimulantes opcionais imunes (co-administrados ou administrados em série, por exemplo, antes ou após a vacinação).

Estimulantes imunes adequados incluem, entre outros, citocinas, fatores de crescimento, quimiocinas, sobrenadantes de culturas celulares de linfócitos, monócitos, células de órgãos linfóides, preparados de células ou extratos de células (por exemplo, Staphylococcus aureus ou preparados de lipopolissacarídeos), mitogênios ou adjuvantes que incluem substâncias farmacêuticas de baixo peso molecular. Um estimulante imune pode ser ad- ministrado in ovo em qualquer momento durante a incubação. Em uma característica especial, o estimulante imune é administrado no meio contendo os organismos atenuados de C. perfringens tipo A.

Métodos de Administração da Vacina

As vacinas da invenção descritas acima são administradas, por exemplo, por injeção ou inoculação por uma ou por combinação das seguintes vias: oral, intranasal, parenteral, subcutânea, escarificação e/ou administração intramuscular em qualquer formulação adequada conhecida na técnica, por exemplo, tampão compatível e/ou solução salina fisiologicamente aceitável, associado opcionalmente a adjuvantes e/ou promotores ou estimulantes imunes (co-administrados ou administrados em série, por exemplo, antes ou após a vacinação). Para vacinas/métodos de vacinação de administração oral, qualquer um dos tampões fisiologicamente adequados ou agentes de suspensão que são conhecidos da técnica podem ser empregados de imediato. Além disso, a composição pode ser incorpora- da, por exemplo, misturada à água de beber ou pulverizada sobre grãos de ração, na forma de pó ou pulverizada sobre milho ou outros grãos, e similares.

O trato gastrointestinal é um sítio comum de infecção por C. perfringens e, por conseguinte, administração oral é contemplada como um método de inoculação. A presença do trato gastrointestinal dos organismo vivos atenuados de C. perfringens da invenção é contemplada para produzir reações reações imunes protetoras localizadas na camada da mucosa do trato gastrointestinal, e pode atuar competitivamente para impedir colonização subseqüente por C. perfringens do tipo selvagem.

Para aves, como aves domésticas, incluindo galinhas, patos, gansos, etc., o método oral, ou injeção in ovo, está entre as vias que podem ser utilizadas para vacinação. A via in ovo é exemplificada abaixo, e produziu imunização ativa e proteção contra desafio em galinhas em fase de choco.

Expressão de Gene Estranho por C. Perfringens

Empregando as técnicas desenvolvidas nos exemplos preceden- tes, qualquer gene que não ocorra naturalmente, ou seja, estranho ao C. Perfringens, pode ser opcionalmente inserido no DNA cromossômico do C. perfringens. Para expressão de proteínas estranhas, podem ser feitas fusões de genes que preservem as seqüências que flanqueiam o gene da toxina alfa, o promotor da toxina alfa e a sua seqüência de sinalização. Em uma concretização, a maior parte da seqüência codificadora do gene pie é substituída pelo gene estranho. Os demais nucleotídeos do gene pie, a jusante do gene inserido, estão fora da estrutura e, por conseguinte, nenhuma toxina alfa funcional é produzida. Alternativamente, o gene estranho pode ser inserido dentro da estrutura de uma seqüência de nucleotídeos que codifica a muteína de toxina alfa, formando uma proteína de fusão constituída por toxina alfa-proteína estranha.

Iniciadores oligonucleotídeos, para o gene estranho, podem ser sintetizados, por exemplo, com seqüência N-terminal com Etiqueta FLAG e sítios de restrição apropriados. Os produtos obtidos por PCR podem ser clonados no vetor suicida; a Etiqueta FLAG e o gene estranho são inseridos na estrutura da seqüência de sinalização da toxina alfa. A proteína estranha é expressa sob controle do promotor da toxina alfa e rotulada para secreção pela seqüência de sinalização do p/c. A proteína estranha secretada pode ser detectada no meio do sobrenadante por Western blot, utilizando um anticorpo anti-FLAG.

Qualquer gene estranho adequado pode ser inserido no genoma do C. perfringens nesta maneira. Estes genes incluem, por exemplo, DNA codificador de antígenos de patógenos do trato gastrointestinal, incluindo, por exemplo, proteínas antigênicas de bactérias como E. coli, espécies de Salmonella, espécies de Campylobacter, espécies de Lawsonia e similares; proteínas antigênicas de parasitas como espécies de Eimeria, espécies de Isospora, espécies de Cryptosporidium e similares; e proteínas antigênicas de vírus como rotavírus, coronavírus e semelhantes, para imunizar o animal tratado com C. perfringens recombinante. Outras proteínas que podem ser expressas por este C. perfringens recombinante incluem proteínas ou peptídeos terapêuticos. Opcionalmente, estes incluem peptídeos que são endógenos ao trato gastrointestinal, incluindo fator de trifólio ou qualquer tipo de citocina conhecida na técnica, por exemplo, IL-18 de galinha e similares.

Uma destas construções de C. perfringens expressa a proteína IL-18 de galinha. A administração de bactérias vivas, contendo a fusão gênica, possibilitará a liberação de doses terapêuticas de IL-18 no intestino, ainda que sendo relativamente inócuas para o animal hospedeiro em virtude de não haver produção de produção de toxina alfa. Outros agentes terapêuticos podem ser expressos também, utilizando esse sistema.

Inúmeras referências são citadas aqui, os conteúdos das quais são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido. Os exemplos específicos seguintes estão incluídos para fins de ilustração e não se destinam a limitar a abrangência da invenção, a não ser que indicado de outra forma.

Exemplo 1

Vetor de Região Homóloga de Toxina Alfa com Delecão de C. ρerfrinaens

Foi criado um vetor plasmídeo de região de homologia 1162-55- 20 útil na construção de variantes compreendendo deleção de toxina alfa de C. perfringens. O plasmídeo incorpora vários elementos importantes; a região de replicação do plasmídeo pl)C18 de E. coli; os genes de C. perfringens de resistência a cloranfenicol (catF) e eritromicina (ermBP) 10 (ambos também expressados em E.coli), e gene (p/c) de toxina alfa de C. perfringens, inativado por deleção específica de 9 aminoácidos. O plasmídeo 1162-55-20 foi criado em várias etapas, da forma como segue.

Inicialmente, o gene pie foi clonado a partir de um isolado recente de ave de C. perfringens (cepa CP6J. A seqüência da cepa 13 de C. perfringens (Genbank NC 003366; SEQ ID NO: 2) foi utilizada para desenhar os iniciadores oligonucleotídeos a serem utilizados na clonagem do gene pie. Estes e outros iniciadores subseqüentes foram adquiridos comercialmente de Sigma Genosys, Woodlands, TX. O iniciador a montante, localizado no gene yplc (CPE0035), 5' AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC 3' (SEQ ID NO: 14) corresponde aos nucleotídeos 47675-47700 da cepa 13 (SEQ ID NO: 2). O iniciador a jusante, localizado no gene cobW (CPE0037), 5' GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC 3' (SEQ ID NO: 15), é complementar dos nucleotídeos 50597-50629 da cepa 13. Estes iniciadores foram utilizados com o DNA genômico da cepa CP6 de C. perfringens em uma reação em cadeia de polimerase (PCR) de extensão longa. Foi previsto que seria obtido, da seqüência conhecida da cepa 13, um produto composto por 2955 pares de base do gene yplc a montante ao gene cob W a jusante (conforme ilustrado pela figura 1). O promotor da toxina alfa, a seqüência de sinalização e a seqüência codificadora do gene pie (CPE0036) estão contidos neste fragmento, isto é, entre o gene yplc a montante e o gene cob W a jusante. O fragmento com 2955 pares de base, obtido por PCR, foi clonado em seguida no vetor de clonagem pCR-Blunt (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), resultando no plasmídeo 1162-52.1. Foi deter- minada a partir deste fragmento a seqüência de nucleotídeos da região codificadora de pie do fragmento de 2955 pares de bae da cepa CP 6 (SEQ ID NO: 22; o polipeptídeo correspondente é SEQ ID NO: 23), e foi demonstrado que esta era substancialmente homóloga àquela do gene pie da cepa 13 de C. perfringens (SEQ ID NO: 2).

Em seguida, a região de replicação do E. coli e os genes de resistência do C. perfringens foram clonados, a partir do plasmídeo do tipo ponte pJIR418 (Sloan et ai, 1992, Plasmid 27, 207-219; Genebank M77169).

O plasmídeo pJIR418 foi digerido com as enzimas de restrição Bam Hl e Spe I, e as extremidades preenchidas com Klenow polimerase. A ligação do fragmento grande produziu o plasmídeo 1162-45.1 e restaurou o sítio de restrição Bam Hl. Este plasmídeo conserva a região de replicação de E. coli, porém diferentemente do pJIR418, não contém uma origem de replicação de C. perfringens. O plasmídeo é, portanto, capaz de replicação autônoma em E. coli, porém não em C. perfringens.

Na etapa seguinte, a metade C-terminal do gene pie foi subclonada no plasmídeo intermediário 1162-45.1. A digestão do plasmídeo 1162-52.1, pela Bam Hl e Eco RI, liberou um fragmento composto por 1742 pares de base, contendo a porção C-terminal do gene da toxina alfa, a partir do único sítio de Bam Hl, localizado no gene pie a jusante ao gene cob W até um sítio de Eco RI, localizado no sítio de clonagem múltipla do plasmídeo progenitor. O fragmento de 1742 pares de base foi clonado entre os sítios de Bam Hl e Eco RI, localizados no sítio de clonagem múltipla do plasmídeo 1162-45.1. No plasmídeo 1162-53.7 resultante, a metade C- terminal do gene pie gene está na mesma orientação transcricional dos genes catPe ermBP do plasmídeo progenitor.

Na etapa final, a metade N-terminal do gene pie foi clonada no sítio único de Bam Hl do plasmídeo 1162-53.7. Isso foi obtido pela criação de um fragmento por PCR, derivado do gene da toxina alfa subclonado no plasmídeo 1162-52.1. O iniciador a montante, 5' ggatccAGCTGCAT AAGCAAAAGTTCCAACTC 3' (SEQ ID NO: 16), era idêntico ao iniciador do yp/c observado previamente (SEQ ID NO: 4), exceto que foi incluída uma região que flanqueava o sítio Bam Hl(em minúsculas). O iniciador a jusante, localizado no gene da toxina alfa, 5' ggatccaATGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3' (SEQ ID NO: 17) era complementar dos nucleotídeos 48824-48857 da cepa 3 e incluía uma região que flanqueava o sítio de restrição Bam Hl e um nucleotídeo espaçador para manter a estrutura de leitura (em minúsculas). O fragmento Bam Hl, resultante de PCR com estes iniciadores e o DNA de modelo do plasmídeo 1162-52-1, foi clonado no sítio único de Bam Hl do plasmídeo 1162-53.7. Foi isolado um plasmídeo contendo as duas regiões do gene p/c no mesmo sentido transcricional. Este plasmídeo 1162-55.20 contém o gene p/c com a deleção desejada de nove aminoácidos e a adição de um resíduo leu entre os resíduos ala 61 e asp 71 da toxina do tipo selvagem (consultar a figura 2). O seqüenciamento do DNA do plasmídeo confirmou a estrutura de leitura e a deleção final de 24 códons (codificando oito resíduos de aminoácidos).

Exemplo 2

Construção do Clostridium perfringens recombinante CPERF001

A versão deletada do gene p/c gene construída no Exemplo 1 foi introduzida no C. perfringens, empregando a seguinte estratégia. O vetor de região de homologia 1162-55.20 é denominado "plasmídeo suicida" de C. perfringens uma vez que a sua origem de replicação de C. perfringens foi removida.

Quando este plasmídeo transforma-se em C. perfringens, ele não é capaz de replicar e não sobrevive. No entanto, se a bactéria transformada for submetida à seleção por cloranfenicol e/ou eritromicina, o DNA do plasmídeo pode ser forçado a se recombinar no genoma bacteriano por homologia com o gene p/c. A bactéria recombinante resultante é denominada integrante. A integrante continha uma cópia do vetor de região de homologia introduzido que foi integrada no lócus do gene p/c. Dessa forma, a integrante resultante continha duas cópias do gene p/c, a cópia normal original e a versão deletada introduzida. Os genes de resistência introduzidos estão localizados entre as duas cópias do gene p/c. Quando a seleção antibiótica foi removida da integrante, ocorreu recombinação entre as duas cópias do gene p/c. Esse evento de recombinação pode produzir dois desfechos. Em ambos os casos, o DNA que intervinha entre as duas cópias do gene p/c (incluindo os genes de resistência) foi removido. No primeiro desfecho, o gene p/c normal foi restaurado, resultando em recuperação da cepa original progenitora. No segundo desfecho, o gene p/c normal é substituído pela cópia deletada, produzindo a construção desejada de toxina alfa com deleção. Uma vez que a toxina alfa da cepa com deleção está inativada, esta cepa não era hemolítica. Por conseguinte, a integrante desejada com deleção foi identificada por varredura quanto a clones não- hemolíticos em placas de ágar sangue.

Por ser previsto que o evento de recombinação, resultando na integrante desejada, ocorresse em freqüência pequena, foi fundamental em- pregar cepas progenitoras de C. perfringens com alta eficiência de transformação. Por conseguinte, vários isolados recentes de ave de C. perfringens foram analisados quanto à eficiência de transformação. Os isolados foram transformados com o plasmídeo do tipo ponte pJIR418, descrito por Allen e Blaschek (Applied and Environmental Microbiology 54:2322 (1988)) com ligeiras modificações (descritas abaixo). A cepa 1240 exibiu a mais alta eficiência de transformação (consultar a Tabela 1), 9,2 χ 106 transformantes^g de DNA de plasmídeo pJIR418. Esta cepa foi escolhi- da para ser a cepa progenitora utilizada para construção de CPERF001 com deleção. A cepa 29 foi escolhida para ser a cepa progenitora de CPERF002.

Tabela 1

Eficiência de Transformação de Isolados de Aves de C. perfringens

<table>table see original document page 35</column></row><table> CP-2 Nenhum

1230 7,1 χ 10^3

5227 Nenhum

5230 Nenhum

A origem das cepas do tipo selvagem listadas acima foi Dr. J. Glenn Songer, Departamento de Ciências Veterinárias e Microbiologia, Universidade de Arizona, Tucson, Arizona 85721

Células da cepa 1240 de C. perfringens, provenientes de cultura anaeróbica durante a noite em meio TSYC (30 g/l de caldo tríptico de soja, 5 g/l de extrato de leveduras, 0,5 g/l de cisteína), foram diluídas em 1:25 e cultivadas até A6oo=0,5436. Após centrifugação de 100 ml de células em 18.000 χ g por 10 minutos, as células eletrocompetentes foram preparadas, ressuspendendo as células duas vezes em volume igual de tampão fosfato de magnésio com sacarose pré-reduzido ("SMP" foi preparado como sacarose a 270 mM, MgCI2 a 1 mM, NaPO4 a 7 mM, pH 7,3), seguido por ressuspensão final com 0,5 ml de SMP. O volume final resultante foi de -2,0 ml.

Alíquotas de 100 μΙ de células foram submetidas à eletroporação com 4 μg de plasmídeo 1162-55.20 em cubetas de 0,2 cm. Foi utilizado o aparelho Bio-Rad Gene Pulser II em 1,37 kilovolts, resistência de 100 Ohms e capacitância de 50 microfarads. Imediatamente após a eletroporação, as células foram diluídas com 2,0 ml de meio pré-reduzido contendo caldo tríp- tico de soja, levedura e cisteína ("TSYC" foi preparado como 30 g de caldo tríptico de soja, 5g de extrato de leveduras, 0,5 g de cisteína e 950 ml de água) e incubadas por três horas a 37°C em jarra anaeróbica. Após o perío- do de recuperação, células em várias diluições foram colocadas em placas com TSYC + 25 μg/ml de cloranfenicol por placa. Estas placas foram incu- badas durante a noite a 37°C em jarra anaeróbica.

Após o crescimento durante a noite, foi observada, em média, 50 colônias resistentes a cloranfenicol por micrograma de DNA 1162-55.20. Colônias isoladas de sete supostas integrantes foram cultivadas em meio TSYC não-seletivo por quatro ciclos de crescimento sucessivos e colocadas em placas de agar sangue não-seletivo. Um dos estoques não-selecionados, 1192-31.7, exibiu várias colônias não-hemolíticas. Vinte e uma destas colônias não-hemolíticas foram embutidas em placas máster não-seletivas e reproduzidas em placas com TSYC + cloranfenicol. Duas das 21 colônias foram sensíveis a cloranfenicol.

Uma das colônias com deleção, supostamente sensível a cloran- fenicol, 1192-32.14, foi cultivada junto com a 1240 do tipo selvagem e a integrante 1192-31.7, sendo colocadas em placas de ágar sangue. A cepa 1240 do tipo selvagem exibiu áreas claras de beta hemólise, enquanto que a de 1192-32.14 com deleção foi uma cultura pura de colônias não-hemolíticas e foi renomeada CPERF001.

Outras placas contendo sangue foram utilizadas como placas máster e de reprodução para meio não-seletivo e seletivo. A 1240 do tipo selvagem e CPERF001 foram sensíveis a cloranfenicol e eritromicina. A integrante, 1192-31.7, foi resistente a cloranfenicol e eritromicina, conforme esperado.

A fim de descartar a possibilidade de que genes de resistência antibiótica estivessem presentes, porém não expressados no CPERF001, iniciadores para PCR, de genes específicos para cloranfenicol e eritromicina, foram sintetizados para serem utilizados em reações de PCR. DNAs genômicos foram preparados a partir de cepas do tipo selvagem, integrante e CPERF001 e utilizados como modelos para reações de PCR com os iniciadores dos genes antibióticos. Os resultados da análise por PCR revelaram resposta positiva somente do plasmídeo suicida e do integrante, e não do progenitor 1240 ou do CPERF001 com deleção. Esse achado con- firma a perda prevista de seqüências gênicas de resistência.

A fim de confirmar a deleção no gene da toxina alfa, uma região com 1086 pb, em volta da deleção, foi amplificada por PCR, empregando os iniciadores apropriados específicos da toxina alfa. O fragmento amplificado foi clonado e seqüenciado. Os resultados do seqüenciamento confirmaram a deleção dos nove aminoácidos, de tir 62 a trp 70, do gene da toxina alfa e a inserção de uma única leu (consultar as figuras 2A-2C). CPERF001 foi analisado quanto à expressão da proteína toxóide alfa inativada. Após 6 horas de crescimento anaeróbico, alíquotas de 1ml de células foram coletadas e centrifugadas. Quinze microlitros do meio sobrenandante não-concentrado foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida e submetidos à análise por Western Blot com anticorpo policlonal de coelho direcionado contra a proteína toxina alfa recombinante (Vaccine 11(12): 1253-1258 (1993)). Os resultados revelaram reatividade contra anticorpo específico com uma proteína do tamanho previsto para a proteína toxóide alfa.

CPERF001 é uma cepa com delação geneticamente construída de C. perfringens Tipo A. Esta cepa secreta uma forma toxóide inativada da toxina alfa do C. perfringens. Por não expressar mais toxina alfa ativa, porém conservando uma parte significativa da antigenicidade da toxina, esta cepa será útil como vacina para proteger contra doença causada por C. perfringens.

Exemplo

Construção de Clostridium perfrigens flecombinante CPERF002

A fim de compensar a eficiência de transformação mais baixa da cepa 29 de C. perfringens (consultar a Tabela 1, acima), um novo vetor de região de homologia foi construído. O novo vetor incorporou seqüências de C. perfringens clonadas diretamente a partir do genoma da cepa 29. O resul- tado previsto foi uma etapa de recombinação mais eficiente. O novo vetor, 1192-38.3, foi criado da forma como segue.

Na primeira etapa, a região de replicação de E. coii e os genes de resistência do C. perfringens foram clonados do plasmídeo do tipo ponte pJIR418 (Sloan et al, Plasmid 27, 207 (1992); Genebank M77169). O plas- mídeo pJIR418 foi digerido com a enzima de restrição Ndel. A ligação do fragmento maior produziu o plasmídeo 1192-23.1. Este plasmídeo não pos- sui origem de replicação de C. perfringens, porém, diferentemente do plasmídeo 1162-45.1 que foi construído no Exemplo 1, conserva o sítio de clonagem múltipla inteiro do pJIR418.

Na etapa seguinte, a metade C-terminal do gene pie gene foi subclonada no plasmídeo intermediário 1192-23.1. DNA genômico da cepa 29 foi utilizado como modelo para PRC de extensão longa. A região do gene pie (toxina alfa), do sítio Bam Hl até a porção do gene do CPE0038, foi amplificada. O iniciador a montante do p/c, 5' CTGGGATCCTGATAC AGATAATAATTTCTCAAAGGAT 3' (SEQ ID NO: 18), corresponde aos nucleotídeos 48880-48916 da cepa 13 (Genbank NC 003366). O iniciador a jusante no gene do CPE0038, 5' actctgcagTTGTCATATCAAT TAAATTAACTATAATCCC 3' (SEQ ID NO: 19), é complementar dos nucleotídeos 51244-51275 da cepa 13 e contém nucleotídeos flanqueadores, incluindo um sítio de restrição Pst I (em minúsculas). Foi ob- tido um produto composto por 2402 pares de base, sendo digerido com as enzimas de restrição Bam Hl e Pst I. Este fragmento foi ligado ao fragmento maior do 1192-23.1, digerido por Bam Hl e Pst I, para produzir o plasmídeo 1192-36.10.

Na etapa final, a metade N-terminal do gene p/c foi clonada por PCR. O iniciador a montante, 5' actgagctcCTAGACACTTTGCTTCAAT ATTTGGGAA 3' (SEQ ID NO: 20), corresponde aos nucleotídeos 46513- 46540 da cepa 13 e inclui nucleotídeos flanqueadores e um sítio Sac I (em minúsculas). O iniciador a jusante, 5' actggatccGCATTCTTATCATA ATCTGGATAAGTAGAACC 3' (SEQ ID NO: 21), é complementar dos nucleotídeos 48824-48855 da cepa 13 e inclui nucleotídeos flanqueadores e um sítio Bam Hl. Foi obtido um produto composto por 2363 pares de base e este foi digerido com as enzimas de restrição Sac I e Bam Hl. O fragmento digerido foi ligado ao fragmento maior do 1192-36.10, digerido por Sac I e Bam Hl, para produzir o plasmídeo 1192-38.3. O seqüenciamento subse- qüente da região que flanqueava o sítio Bam Hl do pie no 1192-38.3 confirmou a deleção de nove aminoácidos, de tir 62 a trp 70.

O plasmídeo 1192-38.3 foi utilizado para eletroporação de células da cepa 29 de C. perfringens. A cepa 29 havia revelado transformar- se com eficiência de 3,6 x104 transformantes/pg de DNA do plasmídeo pJIR418. Células da cepa 29 foram cultivadas e submetidas à eletroporação conforme no Exemplo 2, com exceção de que uma técnica de seleção líquida foi utilizada após o período de recuperação de três horas. Em vez de serem colocadas em placas, alíquotas de 0,67 ml de células foram diluídas em 12 ml de TSYC + 25 ug/ml de cloranfenicol e cultivadas durante a noite a 37°C em jarra anaeróbica. Essa modificação foi utilizada por causa do nível de eficiência mais baixo de transformação e de crescimento em placa da cepa 29 em relação à 1240. Após o crescimento durante a noite, as células foram novamente diluídas em meio de seleção. As células do segundo ciclo de crescimento foram submetidas, em seguida, a cinco seleções, anteriores à colocação em placas de ágar sangue. Nenhuma das colônias das placas de ágar sangue foi não hemolítica. Duas placas com sangue foram, em seguida, reproduzidas em placas contendo TSYC, TSYC + 25 ug/ml de cloranfenicoil e TSYC + 50 pg de eritromicina. Todas as colônias foram sensíveis à eritromicina, porém somente uma das 130 colônias foi sensível a cloranfenicol. Esta colônia, 1192-45.4B, foi renomeada CPERF002. A análi- se por PCR de DNA genômico do CPERF002 com iniciadores específicos de toxina alfa revelou uma faixa positiva para toxina alfa. Esta faixa foi menor do que a faixa correspondente do DNA da cepa 29 do tipo selvagem. Iniciadores específicos para os genes de resistência a cloranfenicol e eritromicina não conseguiram amplificar o DNA do CPERF002, porém exibiram faixas fortemente positivas do palsmídeo 1192-38.3. O seqüencia- mento da toxina alfa do CPERF002 confirmou a deleção de nove aminoácidos (consultar a figura 3).

CPERF002 foi analisado quanto à expressão da proteína toxóide alfa inativada. Após 6 horas de crescimento anaeróbico, alíquotas de 1ml de células foram coletadas e centrifugadas. Quinze microlitros do meio sobrenandante não-concentrado foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida e submetidos à análise por Western Blot com anticorpo policlonal de coelho direcionado contra proteína toxina alfa recombinante (Vaccine 11: 1253 (1993)). Os resultados revelaram reatividade contra anticorpo específico com uma proteína do tamanho previsto para a proteína toxóide alfa.

CPERF002 é uma cepa geneticamente construída com deleção do C. perfringens Tipo A. Esta cepa secreta uma forma toxóide inativada da toxina alfa do C. perfringens. Por não expressar mais toxina alfa ativa, embo- ra conserve uma parte significativa da antigenicidade da toxina, esta cepa é útil como vacina para proteger contra doença causada por C. perfringens.

Exemplo 4

Vacinas com C. PERFRINGENS com Delecão

As vacinas com cepas exibindo deleção, CPERF001 e CPERF002, descritas nos Exemplos 2 e 3, foram avaliadas quanto a sua capacidade para prover proteção desafiada por C. perfirngens do tipo selvagem. A primeira parte do estudo foi planejada para determinar se a administração de vacinas com cepas vivas exerciam qualquer efeito adverso sobre a capacidade de incubação de ovos embrionados. A designação de grupos experimentais e os resultados de segurança são descritos pela Tabela 2.

Tabela 2

Resultados de segurança

Grupo* Vacina (dose)** Número de ovos incubados (%)

<table>table see original document page 41</column></row><table>

* 20 ovos por grupo

** Dose de 100 μΙ fornecida in ovo em 18 dias de embrionação (IM) xO título por dose é medido em unidades formadoras de colônia (cfu")

Em dose de 103 ou menos (grupos 1,2, 5 e 6), a capacidade de incubação, nestes grupos, não foi significativamente menor do que no grupo inoculado com somente meio (grupo 11) ou no grupo que não foi inoculado (grupo 12). Na dose mais baixa, CPERF001 exibiu a mesma capacidade de incubação do que a do controle de meio e melhor do que a do grupo de controle não-inoculado.

Por poderem as doses mais altas exibir efeito adverso sobre a capacidade de incubação de ovos, somente foram incluídos os grupos de doses mais baixas na parte de eficácia do estudo. Estes grupos, juntamente com as aves de controle de meio (grupo 11), foram desafiados com a cepa CP6 (tipo selvagem) do C. perfringens que foi administrada por via oral, em aproximadamente 108 cf u/m l/ave, quando as aves tinham 20, 21 e 22 dias de vida. Foi efetuada necropsia em todas as aves ao atingirem 25 dias de vida, e foi efetuada a pontuação de lesões no intestino delgado com a escala de classificação de enterite necrótica resumida abaixo.

<table>table see original document page 42</column></row><table> A pontuação com modificações mínimas é efetuada de acordo com Charles Hofacre, D.V.M., M.A.M., Ph.D., Universidade da Geórgia, Centro de Pesquisa e Diagnóstico de Aves Domésticas, 953 College Station Road, Athens, GA 30602.

Cinco (5) aves do grupo de controle não-vacinado (não- desafiado) foram submetidas à necropsia no final do estudo para confirmar que não houve exposição a C. perfringens durante o estudo. Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3

Grupos de tratamento de proteção* Resultados

<table>table see original document page 43</column></row><table>

* necropia em 25 dias de vida

A pontuação dos Grupos 1 e 2 foi, cada uma, significante esta- tisticamente mais baixa comparada a do Grupo 11 (Teste de Soma Exata de Postos de Wilcoxon p ≤ 0,0250). Os escores médios dos Grupos 5 e 6 foram mais baixos do que o do Grupo 11, porém não estatisticamente diferentes (Teste de Soma Exata de Postos de Wilcoxon p ≥ 0,2177). Foi efetuada esti- mativa da eficácia da vacina, de acordo com o procedimento descrito por David Siev [Journal of Modem Applied Statistical Methods Vol. 4, N9 2, 500- 508 (2005)]. A eficácia da vacina em reduzir a gravidade da doença foi esti- mada em 54% para o Grupo 1, 65% para o Grupo 2, 20% para o Grupo 5 e 27% para o Grupo 6, quando comparada a do Grupo 11.

Exemplo 5

Construção de C. Perfrigens com Delecão de Suínos As estratégias utilizadas nos Exemplos 1 e 2, supra, são utilizadas para construir mutantes de toxina alfa com deleção, a partir de cepas suínas de C. perfringens. Inicialmente, isolados em campo de suínos doentes são submetidos à eletroporação com plasmídeo pJIR418 para avaliar a sua capacidade de transformação. Isolados com rendimento ^IO4 transformantes por micrograma de DNA de plasmídeo e susceptíveis a cloranfenicol ou eritromicina são candidatos à deleção.

DNA genômico das cepas candidatas é utilizado como modelo para PCR de extensão longa do gene pie (toxina alfa) e seqüências flanqueadoras. Após a subclonagem dos produtos obtidos por PCR1 o gene da toxina alfa e regiões flanqueadoras são seqüenciados e a restrição, mapeada. Novos iniciadores oligonucleotídeos são sintetizados com sítios de restrição flanqueadores, e os produtos de duas amplificações separadas são clonados no plasmídeo suicida 1192-23.1 para criar a deleção de 27 pares de base, conforme no Exemplo 1.

O vetor suicida suíno é submetido à eletroporação na cepa suína correspondente de C. perfringens, e os mutantes com deleção são isolados, empregando os métodos descritos no Exemplo 2, supra. Mutantes com deleção são confirmados pela ausência de beta hemólise em placas de ágar sangue e por seqüenciamento de DNA do gene da toxina alfa.

Essa construção é uma cepa geneticamente construída com deleção do C. perfringens Tipo A. Esta cepa secreta uma forma toxóide inativada da toxina alfa do C. perfringens. Por não expressar mais toxina alfa ativa, embora conserve uma parte significativa da antigenicidade da toxina, esta cepa é útil como vacina para proteger suínos contra doença causada por C. perfringens.

Depósito biológico

Culturas dos materiais biológicos abaixo foram depositadas junto aos seguintes depositários internacionais:

American Tipo Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., sob condições que atendem às exigências do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Processos de Patentes.

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Claims (35)

1. Molécula de ácido nucléico que codifica uma muteína substancialmente não-tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens; em que a muteína da toxina alfa compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 9 resíduos de aminoácidos consecutivos; e em que um dos resíduos de aminoácidos deletados é His68-

2. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, em que a muteína da toxina alfa compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 12 resíduos de aminoácidos consecutivos; e em que um dos resíduos de aminoácidos deletados é His68-

3. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 2, em que a muteína da toxina alfa compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 18 resíduos de aminoácidos consecutivos; e em que um dos resíduos de aminoácidos deletados é His68.

4. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, em que a muteína da toxina alfa compreende SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 9 resíduos de aminoácidos consecutivos, estendendo de Tir62 a Trp70-

5. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a seqüência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 2; em que os nucleotídeos 268-294 da molécula de ácido nucléico estão deletados.

6. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 5, em que os nucleotídeos deletados são substituídos por uma seqüência de nucleotídeos que codifica um único resíduo de Leu.

7. Muteína substancialmente não-tóxica de toxina alfa de Ciostridium perfringens-, em que a muteína da toxina alfa compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 9 resíduos de aminoácidos consecutivos; e em que um dos resíduos de aminoácidos deletados é His68-

8. Muteína substancialmente não-tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 7, em que a muteína da toxina alfa compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 12 resíduos de aminoácidos consecutivos; e em que um dos resíduos de aminoácidos deletados é HiS68-

9. Muteína substancialmente não-tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 8, em que a referida muteína compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, contando com pelo menos, no mínimo, 18 resíduos de aminoácidos consecutivos; e em que um dos resíduos de aminoácidos deletados é HiS68·

10. Muteína substancialmente não-tóxica de toxina alfa de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 7, em que os nove resíduos de aminoácidos consecutivos, que se estendem de Tir62 a Trp70, são deletados e substituídos por um único resíduo de Leu.

11. Organismo atenuado de Clostridium perfringens, construído por integração da molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1, em um cromossomo de um organismo não-atenuadode Clostridium perfringens:

12. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 11, que é substancialmente não-tóxico.

13. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 11, em que a molécula de ácido nucléico está localizada em uma posição no cromossomo homóloga à localização de uma molécula de ácido nucléico que codifica a toxina alfa do tipo selvagem, presente no Clostridium perfringens não-atenuado.

14. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 11, que é Clostridium perfringens Tipo A.

15. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 11, em que o Clostridium perfringens não-atenuado do qual foi construído foi isolado de um animal hospedeiro que é um mamífero ou uma ave.

16. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 15, em que o referido mamífero é seleiconado do grupo constituído por bovinos, ovinos e suínos.

17. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 15, em que a referida ave é galinha, peru, ganso, pato, cisne, pomba, rolinha, faisão ou perdiz.

18. Vacina compreendendo o organismo atenuado de Clostridium perfringens como definido na reivindicação 11.

19. Vacina de acordo com a reivindicação 18, compreendendo ainda um ou mais dos seguintes: tampão farmacologicamente aceitável, excipiente ou adjuvante.

20. Método de indução de imunidade contra Clostridium perfringens em um animal, compreendendo administração para o animal de uma dose imunologicamente efetiva da vacina como definida na reivindicação 18.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a vacina é administrada por uma ou mais das seguintes vias: oral, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutânea ou intranasal.

22. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a vacina é depositada sobre a ração do animal.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a vacina é pulverizada sobre os animais para permitir administração oral.

24. Ração de animal que compreende a vacina como definida na reivindicação 18.

25. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 11, que compreende, pelo menos, um gene codificador de polipeptídeo que não pertence a Clostridium perfringens.

26. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 25, em que o referido polipetídeo que não pertence ao Clostridium perfringens é um polipeptídeo não-bacteriano.

27. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 26, em que o polipeptídeo não-bacteriano é um polipeptídeo de ave ou de mamífero.

28. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 27, em que o polipeptídeo não-bacteriano é um polipeptídeo de ave.

29. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 27, em que o polipeptídeo não-bacteriano é uma citocina.

30. Organismo atenuado de Clostridium perfringens de acordo com a reivindicação 29, em que a citocina é IL-18 de galinha.

31. Anticorpo que se liga seletivamente a um epitopo encontrado em toxina alfa de Clostridium perfringens, porém sem a muteína substancialmente não-tóxica da toxina alfa de Clostridium perfringens como definida na reivindicação 11, em que o referido anticorpo é capaz de distinguir a referida muteína substancialmente não-tóxica de uma toxina alfa do tipo selvagem de Clostridium perfringens.

32. Kit de teste para identificar se um animal em teste foi infec- tado naturalmente por um organismo do tipo Clostridium perfringens, compreendendo o anticorpo como definido na reivindicação 31.

33. Método de identificação de um animal que tenha sido infectado naturalmente por um organismo do tipo Clostridium perfringens de um vacinado com um organismo atenuado de Clostridium perfringens, o referido método compreendendo: (a) por em contato uma amostra líquida do animal com o anticorpo como definido na reivindicação 31; (b) determinar se o anticorpo reage com a amostra líquida; em que se o anticorpo reagir com a amostra líquia, o animal é identificado como tendo sido naturalmente infectado por organismo do tipo Clostridium perfringens.

34. Organismo do tipo Clostridium perfringens que é CPERF/AocToxina 365-054 com N9 de Depósito na ATCC PTA7364.

35. Organismo do tipo Clostridium perfringens que é CPERFMaToxina 365-053 com N9 de Depósito na ATCC PTA7365.