BRPI0611701A2 - materiais e métodos para a geração de transcritos de ácidos nucléicos inteiramente modificados em 2 - Google Patents

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Abstract

MATERIAIS E MéTODOS PARA A GERAçãO DE TRANSCRITOS DE áCIDOS NUCLéICOS INTEIRAMENTE MODIFICADOS EM 2'. Proporcionam-se materiais e métodos para produzir substâncias terapêuticas de aptâmeros tendo trifosfatos de nucleotídeos inteiramente modificados incorporados em sua seqUência.

Description

"MATERIAIS E MÉTODOS PARA A GERAÇÃO DE TRANSCRITOSDE ÁCIDOS NUCLÉICOS INTEIRAMENTE MODIFICADOS EM 2'"
REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido de patente não provisório reivindicaprioridade, sob 35 U.S.C.§ 119 (e) para o seguinte pedidoprovisório: Pedido, de Patente Provisório U.S. Número deSérie 60/696.292, depositado em 30 de junho de 2005, o qualé, nesse documento, incorporado por referência em suatotalidade. A invenção refere-se, em geral, ao campo deácidos nucléicos e, mais particularmente, aos aptâmeros.
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção refere-se aos materiais e métodos paratranscrever ácidos nucléicos, particularmente as enzimasmodificadas, e materiais e métodos para usar as enzimasmodificadas na polimerização direcionada para molde, paraaumentar a incorporação de nucleotideos modificados nosácidos, nucléicos, particularmente os aptâmeros.Adicionalmente, a invenção refere-se aos métodos e materiaispara selecionar seqüências de componentes de moldes detranscrição e ao uso de tais seqüências de componentes noaumento da produção de transcrito, particularmente noaumento da produção de transcrito durante o método SELEX®.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Um aptâmero, por definição, é uma molécula deácido nucléico isolada, a qual se liga com altaespecificidade e afinidade a algum alvo, tal como umaproteína, através de interações diferentes do emparelhamentode bases de Watson-Crick. Embora os aptâmeros sejammoléculas à base de ácidos nucléicos, há uma diferençafundamental entre os aptâmeros e as outras moléculas deácidos nucléicos, tais como os genes e o mRNA. Nessas, aestrutura do ácido nucléico codifica informação através desua seqüência de bases linear e, assim, essa seqüência é deimportância para a função de armazenagem de informação. Emcompleto contraste, a função do aptâmero, que é baseada naligação especifica de uma molécula-alvo, não é dependente deuma seqüência de bases linear conservada, porém, maisexatamente, de uma estrutura secundária/terciária particular.Ou seja, os aptâmeros são seqüências de não codificação.Qualquer potencial de codificação que um aptâmero possapossuir é inteiramente casual e não desempenha nenhumafunção, qualquer que seja, na ligação de um aptâmero ao seualvo cognato. Assim, embora possa ser que aptâmeros que seligam ao mesmo alvo, e mesmo ao mesmo sitio sobre aquelealvo, compartilhem uma seqüência de bases linear similar, amaioria não o faz.
Os aptâmeros devem também ser diferenciados dasseqüências de ácidos nucléicos de ocorrência natural que seligam a certas proteínas. Essas seqüências são seqüênciasde ocorrência natural incorporadas dentro do genoma doorganismo que se ligam a um subgrupo especializado deproteínas que estão envolvidas na transcrição, tradução etransportação de ácidos nucléicos de ocorrência natural,i.e., proteínas de ligação a ácidos nucléicos. Os aptâmeros,por outro lado, são moléculas de ácidos nucléicos deocorrência não natural, isoladas, curtas. Embora possam seridentificados aptâmeros que ligam proteínas de ligação deácidos nucléicos, na maioria dos casos tais aptâmeros têmpouca ou nenhuma identidade de seqüência com as seqüênciasreconhecidas pelas proteínas de ligação a ácidos nucléicosna natureza. Mais importantemente, os aptâmeros podem ligarvirtualmente qualquer proteína (não somente as proteínas deligação a ácidos nucléicos), bem como quase qualquer alvo deinteresse, incluindo as moléculas pequenas, os carboidratos,os peptídeos, etc. Para a maioria dos alvos, mesmo asproteínas, não existe uma seqüência de ácidos nucléicos deocorrência natural à qual ele se liga. Para esses alvos quede fato têm tal seqüência, i.e., as proteínas de ligação aácidos nucléicos, tais seqüências diferirão dos aptâmeroscomo um resultado da afinidade de ligação relativamentebaixa usada na natureza, em comparação com os aptâmerosestreitamente de ligação.
Os aptâmeros, como os peptídeos gerados porexposição em fago ou anticorpos, são capazes de se ligarespecificamente aos alvos selecionados e modular a atividadedo alvo ou as interações de ligação, p.ex., através deligação, os aptâmeros podem bloquear a capacidade de atuardo seu alvo. Como com os anticorpos, essa propriedadefuncional de ligação específica a um alvo é uma propriedadeinerente. Também como com os anticorpos, embora a pessoaversada possa não saber que características estruturaisprecisas um aptâmero para um alvo terá, a pessoa versadasabe como identificar, preparar e usar tal molécula naausência de uma definição estrutural precisa.Os aptâmeros também são análogos a substânciasterapêuticas de moléculas pequenas pelo fato de que umaúnica alteração estrutural, entretanto aparentementesecundária, pode dramaticamente afetar (por diversas ordensde magnitude) a ligação e/ou outra atividade (ou atividades)do aptâmero. Por outro lado, algumas alterações estruturaisterão pouco ou nenhum efeito qualquer que seja. Istoresulta da importância da estrutura secundária/terciária dosaptâmeros. Em outras palavras, um aptâmero é uma estruturatridimensional mantida em uma conformação fixa queproporciona contatos químicos para ligar especificamente oseu dado alvo. Consequentemente: (1) algumas áreas ouseqüências particulares são essenciais como (a) pontosespecíficos de contato com o alvo, e/ou como (b) seqüênciasque posicionam as moléculas em contato com o alvo; (2)algumas áreas ou seqüências particulares têm uma faixa devariabilidade, p.ex., o nucleotídeo X deve ser umapirimidina, ou o nucleotídeo Y deve ser uma purina, ou osnucleotídeos XeY devem ser complementares; e (3) algumasáreas ou seqüências particulares podem ser qualquer coisa,i.e., elas são essencialmente elementos espaçadores, p.ex.,elas poderiam ser qualquer seqüência de nucleotídeos de umdado comprimento ou mesmo um espaçador que não sejanucleotídeo, tal como uma molécula de PEG.
Descobertos por um processo de seleção ín vitro apartir de agrupamentos de oligonucleotídeos de seqüênciasaleatórias, os aptâmeros têm sido gerados por mais de 130proteínas, incluindo os fatores do crescimento, os fatoresde transcrição, as enzimas, as imunoglobulinas, e osreceptores. Um aptâmero típico é 10-15 kDa de tamanho (20-45 nucleotídeos), liga o seu alvo com afinidade nanomolar asubnanomolar, e diferencia contra alvos intimamenterelacionados (p.ex., os aptâmeros tipicamente não ligarãooutras proteínas da mesma família de genes). Uma série deestudos estruturais mostrou que os aptâmeros são capazes deusar os mesmos tipos de interações de ligação (p.ex.,ligação de hidrogênio, complementaridades eletrostáticas,contatos hidrofóbicos, exclusão estérica) que orientam aafinidade e a especificidade em complexos de anticorpo-antígeno.
Os aptâmeros têm diversas característicasdesejáveis para uso como substâncias terapêuticas esubstâncias diagnosticas, incluindo alta especificidade eafinidade, eficácia biológica, e excelentes propriedadesfarmacocinéticas. Além disso, eles oferecem vantagenscompetitivas específicas sobre os anticorpos e outrassubstâncias biológicas protéicas, por exemplo:
1) Velocidade e controle. Os aptâmeros sãoproduzidos por um processo inteiramente in vitro, permitindoa rápida geração de protótipos iniciais, incluindoprotótipos terapêuticos. A. seleção in vitro permite que aespecificidade e a afinidade do aptâmero sejam rigidamentecontroladas e permite a geração de protótipos, incluindoprotótipos contra alvos tanto tóxicos quanto nãoimunogênicos.
2) Toxicidade e Imunogenicidade. Os aptâmeros,como uma classe, têm demonstrado toxicidade terapeuticamenteaceitável ou ausência de imunogenicidade. Enquanto que aeficácia de muitos anticorpos monoclonais pode serseveramente limitada por resposta imune aos anticorpospropriamente ditos, é extremamente difícil produziranticorpos para aptâmeros, mais provavelmente porque osaptâmeros não podem ser apresentados por células T via o MHCe a resposta imune é geralmente direcionada para nãoreconhecer fragmentos de ácidos nucléicos.
3) Administração. Enquanto que a maior parte dassubstâncias terapêuticas de anticorpos atualmente aprovadasé administrada por infusão intravenosa (tipicamente mais de2-4 horas), os aptâmeros podem ser administrados por injeçãosubcutânea (a biodisponibilidade do aptâmero viaadministração subcutânea é >80% em estudos com macacos(Tucker e col., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)).Essa diferença é principalmente devida à solubilidadecomparativamente baixa e, assim, aos volumes grandesnecessários para a maioria dos- mAbs terapêuticos. Com boasolubilidade (>150 mg/mL) e peso molecular comparativamentebaixo (aptâmero: 10-50 kDa; anticorpo: 150 kDa) , uma dosesemanal de aptâmero pode ser distribuída por injeção em umvolume de menos do que 0,5 mL. Além disso, o tamanhopequeno dos aptâmeros permite que eles penetrem em áreas deconstrições conformacionais que não permitem que anticorposou fragmentos de anticorpos penetrem, apresentando ainda umaoutra vantagem de substâncias terapêuticas ou profílaxia àbase de aptâmeros.4) Escalabilidade e Custo. Os aptâmerosterapêuticos são quimicamente sintetizados econsequentemente podem ser prontamente escalonados conformenecessário para atender a demanda de produção. Enquanto queas dificuldades no escalonamento da produção estãoatualmente limitando a disponibilidade de algumassubstâncias biológicas e o custo de capital de uma planta deprodução de proteína em grande escala é enorme, um únicosintetizador de oligonucleotideos de grande escala podeproduzir mais de 100 kg/ano e requer um investimento inicialrelativamente modesto. O custo atual de produtos para asíntese de aptâmeros na escala de quilogramas é estimado em$500/g, comparável àquele para anticorpos altamenteotimizados. Os aperfeiçoamentos sucessivos nodesenvolvimento de processos são esperados diminuir o custode produtos para <$100/g em cinco anos.
5) Estabilidade. Os aptâmeros terapêuticos sãoquimicamente fortes. Eles estão adaptados intrinsecamentepara recuperar a atividade após exposição a fatores taiscomo calor e desnaturantes e podem ser armazenados porperíodos prolongados (>1 ano) na temperatura ambiente comopós Iiofilizados. Em contraste, os anticorpos devem serarmazenados refrigerados.
Além da estabilidade intrínseca dos aptâmeros,nucleotídeos modificados (p.ex., os nucleotídeos modificadosem 2'), os quais são baratos, não tóxicos, e que podemaumentar a resistência à degradação enzimática, química,térmica, e física, podem ser incorporados durante o métodoSELEX®, conforme descrito no pedido de patente U.S. N2 deSérie 10/729.851, depositado em 3 de dezembro de 2002, e nopedido de patente U.S. N2 de Série 10/873.856, depositado em21 de junho de 2004. Embora a incorporação de nucleotideosmodificados durante o processo SELEX® seja freqüentementepreferível à modificação pós-SELEX® devido à perda potencialde afinidade e atividade de ligação que pode ocorrer após aseleção SELEX®, a incorporação de nucleotideos modificados,p.ex., 2'-0-metil nucleotideos ("2-OMe"), durante o processoSELEX® tem sido historicamente difícil por causa dos baixosrendimentos de transcrição. As condições da solução e asmisturas de transcrição são descritas no pedido de patenteU.S. N2 de Série 10/729.851, depositado em 3 de dezembro de2002, e no pedido de patente U.S. N2 de Série 10/873.856,depositado em 21 de junho de 2004, que dão rendimentos detranscrição aperfeiçoados para aptâmeros incorporando 21-OMenucleotideos. Entretanto, os rendimentos de transcriçãopara aptâmeros inteiramente 21-O-metilados permanecemproblemáticos.
Além das vantagens dos aptâmeros como agenteterapêutico, dada a natureza barata, baixa toxicidade, eresistência à nuclease aumentada conferidas pelaincorporação de 2'-OMe nucleotideos nos aptâmeros, seriabenéfico ter materiais e métodos para aumentar as produçõesde transcritos de aptâmeros inteiramente 2'-O-metilados para,p.ex., prolongar ou aumentar a estabilidade das substânciasterapêuticas de aptâmeros in vivo. A presente invençãoproporciona materiais e métodos aperfeiçoados para atenderessas e outras necessidades.
RESUMO DA INVENÇÃO
0 presente refere-se às T7 RNA polimerases, quepodem ser purificadas, isoladas e/ou recombinantes. Comousado nesse documento, o termo isoladas inclui aspolimerases da invenção quando expressas de modorecombinante em uma célula ou tecido. Como usado aqui, otermo isoladas inclui as seqüências de ácidos nucléicos dainvenção quando engenheiradas em uma célula ou tecido. Emuma modalidade, proporciona-se uma T7 RNA polimerasecompreendendo um aminoácido alterado na posição 639 e naposição 784, onde o aminoácido alterado na posição 639 não éuma fenilalanina quando o aminoácido alterado na posição 784for uma alanina. Em uma outra modalidade, proporciona-se aT7 RNA polimerase acima descrita adicionalmentecompreendendo um aminoácido alterado na posição 378. Em umaoutra modalidade, proporciona-se a T7 RNA polimerase acimadescrita adicionalmente compreendendo um aminoácido alteradona posição 266. Em uma modalidade particular, o aminoácidoalterado na posição 639 é uma leucina e o aminoácidoalterado na posição 784 é uma alanina. Em uma modalidadeadicional, o aminoácido alterado na posição 266 é umaleucina. Em uma modalidade adicional, o aminoácido alteradona posição 378 é uma arginina.
Nas modalidades preferidas, os aminoácidosalterados aumentam a produção transcricional de ácidosnucléicos que compreendem modificações com 21-OMe pelapolimerase em uma reação de transcrição compreendendosomente trifosfatos de 2'-OMe nucleotideos. Em umamodalidade particular, o aumento na produção de transcriçãoé relativo a uma T7 RNA polimerase não tendo os aminoácidosalterados quando a transcrição for efetuada tanto para a T7RNA polimerase com aminoácidos alterados quanto para a T7RNA polimerase não tendo os aminoácidos alterados, sobcondições de transcrição idênticas. Em uma outra modalidade,os aminoácidos alterados diminuem a diferenciação contra ostrifosfatos de 21-OMe nucleotideos. Em uma modalidadeparticular, a diferenciação diminuída contra os trifosfatosde 2'-OMe nucleotideos é em relação a uma T7 RNA polimerasenão tendo os aminoácidos alterados quando ambas aspolimerases forem usadas sob condições de transcriçãoidênticas. Nas modalidades particulares desse aspecto, a T7RNA polimerase não tendo os aminoácidos alterados é a T7 RNApolimerase do tipo selvagem compreendendo um aminoácido naposição 639 alterado para uma fenilalanina e um aminoácidona posição 784 alterado para alanina ou uma polimerasemutante tendo a seqüência de aminoácidos do tipo selvagem,exceto que uma fenilalanina substituiu a tirosina na posição639, e uma alanina substituiu a histidina na posição 784 eum resíduo de arginina substituiu o resíduo de lisina naposição 378 (Y639F/H784A/K378R).
Em uma modalidade particular, proporciona-se umpolipeptídeo isolado compreendendo um aminoácido selecionadoa partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 102 e SEQ ID NO 103. Em uma modalidade particular,proporciona-se um kit compreendendo um recipiente contendouma T7 RNA polimerase da invenção.
Em algumas modalidades, proporciona-se um métodode transcrever um ácido nucléico de fita simples,compreendendo a incubação de uma T7 RNA polimerase mutantecom um ácido nucléico de molde, sob condições de reaçãosuficientes para resultar na transcrição.
Em uma outra modalidade, proporciona-se um ácidonucléico isolado que codifica um polipeptideo da invenção.
Em uma modalidade particular, proporciona-se uma seqüênciade ácidos nucléicos, selecionada a partir do grupo queconsiste em: SEQ ID NO 122, SEQ ID NO 123, SEQ ID NO 124 eSEQ ID NO 125. Em algumas modalidades, proporciona-se umvetor compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicosisolada da invenção. em uma modalidade particular,
proporciona-se um vetor de expressão compreendendo um ácidonucléico da invenção operavelmente ligado a um promotor. Emuma outra modalidade da invenção, proporciona-se uma célulacompreendendo o vetor de expressão da invenção. Em umamodalidade particular, proporciona-se uma célula, onde a T7RNA polimerase mutante da invenção é expressa pela célula.
Em algumas modalidades, proporciona-se um kit compreendendoum recipiente contendo um ácido nucléico codificando uma T7RNA polimerase da invenção.
Em uma outra modalidade, proporciona-se um métodode transcrever um ácido nucléico inteiramente com 2'-OMe,compreendendo as etapas de a) incubar um ácido nucléico demolde em uma mistura de reação sob condições compreendendouma RNA polimerase mutante, um molde de transcrição de ácidonucléico e trifosfatos de nucleosideos, onde os trifosfatosde nucleosideos são 2lOMe, e b) transcrever a mistura dereação de transcrição para resultar no ácido nucléico defita simples, onde todos os nucleotideos dos ácidosnucléicos de fitas simples são modificados com 2'-OMe,exceto que o primeiro nucleotideo dos transcritos pode sernão modificado em 2'. Em algumas modalidades, o primeironucleosideo do transcrito pode ser a 21-OH guanosina. Emalgumas modalidades do método, a RNA polimerase mutante éuma T7 RNA polimerase mutante compreendendo um aminoácidoalterado na posição 639 e na posição 784, particularmenteuma T7 RNA polimerase compreendendo um aminoácido alteradona posição 639 e na posição 784, onde o aminoácido alteradona posição 639 não é uma fenilalanina quando o aminoácidoalterado na posição 784 for uma alanina, particularmente umaT7 RNA polimerase adicionalmente compreendendo um aminoácidoalterado na posição 378 e/ou um aminoácido alterado naposição 266. Em uma modalidade particular, o aminoácidoalterado na posição 639 é uma leucina e o aminoácidoalterado na posição 784 é uma alanina, na polimerase parauso nos métodos da invenção. Em uma modalidade adicional, oaminoácido alterado na posição 266 é uma leucina dapolimerase para uso nos métodos da invenção. Em umamodalidade adicional, o aminoácido alterado na posição 378 éuma arginina na polimerase para uso nos métodos da invenção.Em uma modalidade particular, proporciona-se um polipeptideoisolado compreendendo um aminoácido selecionado a partir dogrupo que consiste em: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO102 e SEQ ID NO 103.
Em algumas modalidades do método da invenção, areação de transcrição adicionalmente compreende ionsmagnésio. Em uma outra modalidade, a reação de transcriçãoadicionalmente compreende ions manganês. Em uma outramodalidade, os ions magnésio estão presentes na reação detranscrição em uma concentração que é entre 3,0 a 3,5 vezesmaior do que os ions manganês. Em uma outra modalidade,onde cada trifosfato de nucleotideo está presente na reaçãode transcrição em uma concentração de 1,0 mM, a concentraçãode ions magnésio é 6,5 mM, e a concentração de ions manganêsé 2,0 mM. Em uma outra modalidade, onde cada trifosfato denucleotideo está presente na reação de transcrição em umaconcentração de 1,5 mM, a concentração de ions magnésio é 8mM, e a concentração de ions manganês é 2,5 mM. Em umaoutra modalidade, onde cada trifosfato de nucleotideo estápresente na reação de transcrição em uma concentração de 2,0mM, a concentração de ions magnésio é 9,5 mM e aconcentração de ions manganês é 3,0 mM.
Em uma outra modalidade, a reação de transcriçãoadicionalmente compreende um resíduo que não é de trifosfatoque não é de 21-OMe guanosina, particularmente onde oresíduo que não é de trifosfato que não é de 2'-OMeguanosina é selecionado a partir do grupo que consiste em:monofosfato de guanosina, difosfato de guanosina,monofosfato de 2'-flúor guanosina, difosfato de 2'-flúorguanosina, monofosfato de 2'-amino guanosina, difosfato de2'-amino guanosina, monofosfato de 2'-desóxi guanosina, edifosfato de 21-desóxi guanosina. Em uma outra modalidade,o molde de transcrição compreende um promotor de T7 RNApolimerase. Em uma outra modalidade, a reação detranscrição adicionalmente compreende o polietileno glicol.
Em uma outra modalidade, a reação de transcrição compreendea pirofosfatase inorgânica.
Em um outro aspecto da invenção, proporciona-se ummétodo para identificar aptâmeros. Em uma modalidade,proporciona-se um método para identificar um aptâmero,compreendendo: a) a preparação de uma mistura de reação detranscrição compreendendo uma polimerase mutante da invenção,e um ou mais moldes de transcrição de ácidos nucléicos; b) atranscrição da mistura de reação de transcrição pararesultar em uma mistura candidata de ácidos nucléicos defitas simples, onde todos menos opcionalmente um dosnucleotideos dos ácidos nucléicos de fitas simples sãomodificados em 2', c) o contato da mistura candidata com amolécula-alvo, d) a separação dos ácidos nucléicos que têmuma afinidade aumentada pela molécula-alvo, em relação a umaafinidade da mistura candidata, da mistura candidata, e e) aamplificação dos ácidos nucléicos com afinidade aumentadapara produzir uma mistura enriquecida em aptâmeros, pelo quesão identificados aptâmeros para a molécula-alvocompreendendo nucleotideo todo modificado em 2', exceto queo primeiro nucleotideo dos aptâmeros pode ser não modificadoem 21 . Em algumas modalidades, a etapa de amplificação f)compreende (i) dissociar opcionalmente os ácidos nucléicoscom afinidade aumentada do alvo, ii) transcrever invertidoos ácidos nucléicos com afinidade aumentada, dissociados doscomplexos de ácidos nucléicos-alvo, iii) amplificar osácidos nucléicos com afinidade aumentada transcritosinvertidos; e (ii) preparar uma mistura de reação detranscrição compreendendo os ácidos nucléicos com afinidadeaumentada transcritos invertidos amplificados como o moldede transcrição e transcrever a mistura de transcrição.
Em algumas modalidades do método de identificaçãode aptâmeros da invenção, a RNA polimerase mutante é uma T7RNA polimerase mutante compreendendo um aminoácido alteradona posição 639 e na posição 784, particularmente uma T7 RNApolimerase compreendendo um aminoácido alterado na posição639 e na posição 784, onde o aminoácido alterado na posição639 não é uma fenilalanina quando o aminoácido alterado naposição 784 for uma alanina, particularmente, uma T7 RNApolimerase adicionalmente compreendendo um aminoácidoalterado na posição 378 e/ou um aminoácido alterado naposição 266. Em uma modalidade particular, o aminoácidoalterado na posição 639 é uma leucina e o aminoácidoalterado na posição 784 é uma alanina, na polimerase parauso nos métodos da invenção. Em uma modalidade adicional, oaminoácido alterado na posição 266 é uma leucina dapolimerase para uso nos métodos da invenção. Em umamodalidade adicional, o aminoácido alterado na posição 378 éuma arginina na polimerase para uso nos métodos da invenção.
Em uma modalidade particular, um polipeptideo isoladocompreendendo um aminoácido selecionado a partir do grupoque consiste em: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 102 eSEQ ID NO 103 é usado no método de identificação deaptâmeros da invenção.
Em algumas modalidades, os todos os trifosfatos denucleotideos na reação de transcrição são modificados com2'-OMe. Em uma modalidade, os um ou mais moldes detranscrição de ácidos nucléicos compreendem um promotor deT7 RNA polimerase e uma seqüência lider imediatamente 3' aopromotor de T7 RNA polimerase. Em algumas modalidades desseaspecto, o método compreende repetir as etapas a) até e)iterativamente.
Em algumas modalidades do método de identificaraptâmeros da invenção, a reação de transcriçãoadicionalmente compreende ions magnésio. Em uma outramodalidade, a reação de transcrição adicionalmentecompreende ions manganês. Em uma outra modalidade, os ionsmagnésio estão presentes na reação de transcrição em umaconcentração que é entre 3,0 a 3,5 vezes maior do que osions manganês. Em uma outra modalidade, onde cadatrifosfato de nucleotideo está presente na reação detranscrição em uma concentração de 1,0 mM, a concentração deions magnésio é 6,5 mM, e a concentração de ions manganês é2,0 mM. Em uma outra modalidade, onde cada trifosfato denucleotideo está presente na reação de transcrição em umaconcentração de 1,5 mM, a concentração de ions magnésio é 8mM, e a concentração de ions manganês é 2,5 mM. Em umaoutra modalidade, onde cada trifosfato de nucleotideo estápresente na reação de transcrição em uma concentração de 2,0mM, a concentração de ions magnésio é 9,5 mM e aconcentração de ions manganês é 3,0 mM.
Em uma outra modalidade desse aspecto, a reação detranscrição para uso no método de identificação de aptâmerosda invenção adicionalmente compreende um resíduo que não éde trifosfato que não é de 21-OMe guanosina, particularmenteonde o resíduo que não é de trifosfato que não é de 21-OMeguanosina é selecionado a partir do grupo que consiste em:monofosfato de guanosina, difosfato de guanosina,monofosfato de 2' flúor guanosina, difosfato de 2' flúorguanosina, monofosfato de 2'-amino guanosina, difosfato de21-amino guanosina, monofosfato de 2'-desóxi guanosina, edifosfato de 21-^desóxi guanosina. Em uma outra modalidade,o molde de transcrição compreende um promotor de T7 RNApolimerase. Em uma outra modalidade, a reação detranscrição adicionalmente compreende o polietileno glicol.
Em uma outra modalidade, a reação de transcrição compreendea pirofosfatase inorgânica.
A presente invenção também se refere a um métodode selecionar seqüências de componentes de moldes de ácidosnucléicos para orientar a transcrição. Em uma modalidade, aseqüência de componente aumenta a produção de transcrito datranscrição orientada pelo molde. Em uma modalidadeparticular, a invenção refere-se aos métodos de selecionarseqüências líderes para aumentar a produção de transcrito eàs seqüências líderes, aos moldes de ácidos nucléicoscompreendendo as seqüências líderes e aos métodos de usar asseqüências líderes e os moldes de ácidos nucléicos dainvenção. A presente invenção também se refere às novaspolimerases mutantes e ao seu uso na transcrição,particularmente ao seu uso para aumentar a produção detranscrito onde nucleotideos modificados em 2' estão sendoincorporados, mais particularmente onde todos osnucleotideos que estão sendo incorporados são modificados em2', p.ex., são 2'-OMe. A presente invenção também se refereàs condições de reação de transcrição modificadas, paraaumentar a produção de transcrito. A presente invençãoparticularmente se refere às combinações em pares e triplasdos aspectos acima descritos, particularmente paraaperfeiçoar a produção de transcrito, onde em todos, excetoo nucleotideo de partida, os transcritos, são modificados em2', particularmente modificados com 21-OMe (transcritosinteiramente com 2'-OMe" ou "mRmY" ou "MNA").
Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção,proporciona-se um método de identificar uma seqüência decomponente de molde de ácido nucléico para aumentar atranscrição, compreendendo: a) preparar uma biblioteca decandidatos de moldes de transcrição, onde os moldescompreendem um promotor, uma primeira região fixaimediatamente 3' ao promotor, uma região degeneradaimediatamente 3' à primeira região fixa e uma segunda regiãofixa 3' à região degenerada; b) transcrever a biblioteca decandidatos de moldes de transcrição em uma reação detranscrição para dar uma biblioteca de transcritos; c)transcrever invertida a mistura de transcrição para obteruma mistura candidata de cDNA, onde os moldes de cDNAcompreendem uma extremidade de 5' e 3'; d) ligar umaseqüência de DNA codificando o promotor à extremidade de 3'dos moldes de cDNA em uma reação de ligação; e) amplificaros moldes de cDNA para resultar em uma biblioteca decandidatos de moldes de transcrição; e f) identificar umcomponente de seqüência de ácidos nucléicos para aumentar atranscrição a partir da biblioteca de candidatos de moldesde transcrição, onde o componente de seqüência de ácidosnucléicos compreende uma seqüência derivada de pelo menosuma porção da região degenerada. Em uma modalidade dessemétodo da invenção, a etapa f) compreende i) clonar abiblioteca de candidatos de moldes de transcrição em moldesde transcrição individuais; ii) transcrever os moldes detranscrição individuais em uma reação de transcrição pararesultar em uma produção de transcritos; iii) avaliar aprodução de transcritos dos moldes de transcriçãoindividuais; e iv) identificar o componente de seqüência deácidos nucléicos em um molde de transcrição que resulte emuma produção de transcritos predeterminada. Em umamodalidade particular desse método da invenção, a produçãode transcritos predeterminada é uma produção maior do que aprodução de transcritos obtida na etapa b) por transcriçãoda mistura de candidatos de moldes de transcrição.
Em uma outra modalidade desse método da invenção,a etapa f) compreende analisar a composição de base daregião degenerada da biblioteca de candidatos de moldes detranscrição e identificar o componente da seqüência deácidos nucléicos com base na composição média de base dabiblioteca de candidatos de moldes de transcrição.Em algumas modalidades desse aspecto da invenção,a etapa b) do método adicionalmente compreende tratar amistura de transcrição transcrita com DNase. Nasmodalidades adicionais desse método da invenção, a etapa b)adicionalmente compreende purificar a mistura de transcriçãotranscrita por separação dos moldes de transcriçãotranscritos dos outros componentes da reação de transcrição.Em uma modalidade particular desse método da invenção, aetapa de purificação compreende substituir o tampão dereação de transcrição correndo a reação de transcriçãoatravés de uma coluna de dessalinização.
Em uma outra modalidade desse aspecto da invenção,a etapa d) do método é feita antes da etapa c) . Em umaoutra modalidade desse aspecto da invenção, o métodocompreende repetir as etapas b) até e) mais do que uma vez,antes de efetuar a etapa f).
Em uma modalidade adicional desse aspecto dainvenção, a reação de ligação é uma reação de ligação comesplinte e a reação de ligação compreende uma imobilizaçãode ácido nucléico e um oligonucleotideo 51-monofosforiladocodificando o promotor.
Em uma modalidade particular desse aspecto dainvenção, a reação de transcrição usada no método compreendeum ou mais trifosfatos de nucleotideos modificados e umapolimerase mutada. Em algumas modalidades, o trifosfato denucleotideo modificado é um trifosfato de nucleotideomodificado em 2', particularmente um trifosfato denucleotideo modificado com 2'-OMe. Em algumas modalidades,a polimerase mutada é uma T7 RNA polimerase mutada. Emalgumas modalidades, a reação de transcrição usada no métododa invenção compreende ions magnésio e manganês (Mn2+) e aT7 RNA polimerase mutada é selecionada a partir do grupo queconsiste em: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 100 e SEQID NO 101.
Em algumas modalidades desse aspecto da invenção,os ions magnésio estão presentes na reação de transcrição emuma concentração que é entre 3,0 a 3,5 vezes maior do que osions manganês (Mn2+) . Nas modalidades adicionais desseaspecto da invenção, cada trifosfato de nucleotideo estápresente na reação de transcrição em uma concentração de 1,0mM, a concentração de ions magnésio é 6,5 mM, e aconcentração de ions manganês é 2,0 mM. Nas modalidadesadicionais desse aspecto da invenção, cada trifosfato denucleotideo está presente na reação de transcrição em umaconcentração de 1,5 mM, a concentração de ions magnésio é 8mM, e a concentração de ions manganês é 2,5 mM. Nasmodalidades ainda adicionais desse aspecto da invenção, cadatrifosfato de nucleotideo está presente na reação detranscrição em uma concentração de 2,0 mM, a concentração deions magnésio é 9,5 mM e a concentração de ions manganês é3,0 mM. Em algumas modalidades do método, a reação detranscrição adicionalmente compreende um polialquilenoglicol, particularmente o polietileno glicol. Em algumasmodalidades do métodos, particularmente nas modalidades emque forem desejados transcritos inteiramente com 2'-OMe, areação de transcrição adicionalmente compreende um resíduode guanosina selecionado a partir do grupo que consiste em:monofosfato de guanosina, difosfato de guanosina,monofosfato ou difosfato de 2' flúor guanosina, monofosfatoou difosfato de 21-amino guanosina, monofosfato ou difosfatode 21-desóxi guanosina, ou outros nucleotideos modificados.
Nas modalidades adicionais, a reação de transcrição dométodo da invenção compreende a pirofosfatase inorgânica.
Nas modalidades adicionais, a reação de transcrição dométodo da invenção opcionalmente compreende a combinação apartir do grupo que consiste em: tampão, detergente (p.ex.,Triton X-100), poliamina (p.ex., espermina ou espermidina),e agente redutor (p.ex., DTT ou βΜΕ) . Ainda nas modalidadesadicionais, a reação de transcrição do método da invençãocompreende trifosfatos de nucleotideos, ions magnésio, íonsmanganês (p.ex., Mn2+), polietileno glicol, monofosfato deguanosina, pirofosfatase inorgânica, tampão, detergente,poliamina, e DTT, e um ou mais moldes de transcrição deoligonucleotideos, e uma T7 RNA polimerase, p.ex., uma T7RNA polimerase mutante, p.ex., uma T7 RNA polimerase mutanteselecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO 1,2, 100 e 101.
Em algumas modalidades do método de identificaçãoda invenção, a primeira região fixa da biblioteca decandidatos de moldes de transcrição consiste em 2, 3, 4 ou 5resíduos de guanosina. Em algumas modalidades da invenção,a região degenerada da biblioteca de candidatos de moldes detranscrição compreende pelo menos 4, 10, 20 ou 30nucleotideos.Em algumas modalidades do método, a seqüência decomponente de molde de ácido nucléico a ser identificada éuma seqüência líder. Em algumas modalidades, a seqüêncialíder compreende a primeira região fixa e uma seqüênciaderivada de pelo menos uma parte da região degenerada dabiblioteca de candidatos de moldes de transcrição. Emalgumas modalidades, o método da invenção adicionalmentecompreende incorporar a seqüência líder identificada em ummolde de transcrição de oligonucleotídeo.
A invenção também proporciona a seqüência líderidentificada pelo método de identificação da invenção. Emalgumas modalidades, a seqüência líder da invençãocompreende a seqüência de ácidos nucléicos a partir donucleotídeo 22 até o nucleotídeo 32 em qualquer uma dasseqüências selecionadas a partir do grupo que consiste em:SEQ ID NOs 10 a 99. Em algumas modalidades, a seqüêncialíder da invenção compreende a seqüência de ácidos nucléicosa partir do nucleotídeo 18 até o nucleotídeo 32 em qualqueruma das seqüências selecionadas a partir do grupo queconsiste em: SEQ ID NOs 10 a 99. A invenção tambémproporciona um molde de transcrição de oligonucleotídeocompreendendo uma seqüência líder da invenção. Nasmodalidades particulares, a invenção proporciona um molde detranscrição de oligonucleotídeo selecionado a partir dogrupo que consiste em: SEQ ID NO 3 a 6 e SEQ ID NO 106.
Em um outro aspecto da invenção, proporciona-se ummétodo para aumentar a produção de transcritos de um ácidonucléico, onde a transcrição é orientada por um molde detranscrição de oligonucleotídeo. Em algumas modalidadesdesse aspecto da invenção, o método de aumentar a produçãode transcritos compreende orientar a transcrição com ummolde de transcrição de oligonucleotídeo que compreende umaseqüência líder, onde a seqüência líder tenha sidoidentificada pelo método de identificação da invenção usandoa composição de nucleotídeos e/ou a polimerase e/ou ascondições iguais como usadas na reação de transcrição para aqual c aumento da produção de transcritos é desejado.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é uma representação esquemática doprocesso de seleção de aptâmeros in vitro (SELEX®) a partirde agrupamentos de oligonucleotídeos de seqüênciasaleatórias.
A Figura 2 mostra um fluxograma de um métodoSELEX® de Região Terminal (TR-SELEX®) .
A Figura 3 mostra uma análise gráfica dacomposição de nucleotídeos média combinada de regiõesselecionadas a partir de vinte posições degeneradas de umabiblioteca de candidatos de moldes de transcrição antes (RO)e após (R3) a seleção por TR-SELEX®.
A Figura 4 mostra a produção relativa detranscritos, quantificada a partir de imageamento com UV daanálise por PAGE-gel para ARC2118, ARC2119, ARC2120, eARC2121 usando as T7 RNA polimerases mutantesY639F/H784A/K378R ("FAR") e Y639L/H784A/K378R ("LAR") comuma adição de 2'-OH GTP na mistura de transcrição indicaque as produções dadas são em relação à ARC2118 transcritacom a polimerase mutante LAR, que deu a mais alta produçãoquantificada por imageamento com UV.
A Figura 5A mostra o ácido nucléico (SEQ ID NO120) e a Figura 5B dá a seqüência de aminoácidos da T7 RNApolimerase do tipo selvagem (SEQ ID NO 121) .
A Figura 6A mostra a seqüência de ácidos nucléicos(SEQ ID NO 122) da T7 RNA polimerase mutante Y639L/H784A. AFigura 6B mostra a seqüência de ácidos nucléicos (SEQ ID NO123) da T7 polimerase mutante Y639L/H784A/K378R. A Figura6C mostra a seqüência de ácidos nucléicos (SEQ ID NO 124) daT7 polimerase mutante P266L/Y639L/H784A. A Figura 6D mostraa seqüência de ácidos nucléicos (SEQ ID NO 125) da T7polimerase mutante P266L/Y639L/H784A/K378R.
A Figura 7 mostra a produção relativa detranscritos, quantificada a partir de imageamento com UV daanálise por PAGE-gel para ARC2118 e ARC2119, usando a T7 RNApolimerase mutante Y639L/H784A/K378R com uma titulação derGTP (2'-OH GTP) na mistura de transcrição. * indica que asproduções dadas são em relação à ARC2118 transcrita com rGTPa 20 uM, que deu a mais alta produção quantificada porimageamento com UV.
A Figura 8 mostra a produção relativa detranscritos, quantificada a partir de imageamento com UV daanálise por PAGE-gel para ARC2119, usando a T7 RNApolimerase mutante Y639L/H784A/K378R com concentraçõesvariadas de 2'-OMe NTPs (A, U, C, e G) , MgCl2 e MnCl2 enenhum rGTP (2'-OH GTP) na mistura de transcrição. Asproduções dadas são em relação à condição de transcrição de1 mM cada de 2'-OMe NTP, MgCl2 a, 6,5 mM, e MnCl2 a 2 mM.
A Figura 9 é uma tabela que mostra uma análise dasinserções, deleções e substituições de nucleotideos datranscrição inteiramente com 2'-OMe (100% de 2'-OMe A, U, C,G) com a T7 RNA polimerase mutante Y639L/H784A/K378R, emcomparação com a fidelidade da transcrição com totalmenteRNA ou 2'-OMe usando a T7 RNA polimerase mutante Y639F/K378R.Na tabela, (1) indica dados do "Direct in Vitro Selection ofa 2'-O-Methyl Aptamer to VEGF", Burmeister e col., (2005)Chemistry and Biology, 12: 25-33, onde as transcrições foramfeitas com a T7 polimerase mutante FAR e (2) indica que atranscrição foi feita com a T7 polimerase mutante LAR.
A Figura 10 é uma tabela que mostra uma análise daporcentagem de composição de nucleotideos dos transcritosinteiramente com 2'-OMe (100% de 2'-OMe A, T, C, G) antes edepois de uma rodada de transcrição inteiramente com 2'-OMeusando a T7 RNA polimerase mutante Y639L/H784A/K378R,seguida por tratamento com DNase, transcrição reversa,ligação com esplinte, e amplificação por PCR.
A Figura 11 é uma representação esquemática de umaptâmero de MNA anti-IgE minimizado, mostrado na direção 5'para 3', tendo um quepi sobre a sua extremidade de 3' (bolade cor preta).
A Figura 12 é uma representação esquemática doaptâmero de MNA anti-IgE minimizado, o aptâmero de MNA anti-IgE minimizado tendo duas substituições de desóxi e oaptâmero de MNA anti-IgE minimizado tendo uma substituiçãode desóxi e substituições de fosforotioato, cada um mostradona direção 5' para 3' e cada um tendo um quepi sobre a suaextremidade de 3' (bola de cor preta).
A Figura 13 é uma ilustração representandodiversas estratégias de PEGuilação representando a mono-PEGuilação padrão, a PEGuilação múltipla, e a dimerizaçãovia PEGuilação.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os detalhes de uma ou mais modalidades da invençãosão apresentados na descrição abaixo que acompanha. Emboraquaisquer métodos e materiais similares ou equivalentesàqueles descritos nesse documento possam ser usados naprática ou no teste da presente invenção, os métodos e osmateriais preferidos são agora descritos. Outrascaracterísticas, objetivos, e vantagens da invenção serãoaparentes a partir da descrição. No relatório descritivo,as formas singulares também incluem o plural, a não ser queo contexto claramente dite de outro modo. A não ser que deoutro modo definido, todos os termos técnicos e científicosusados nesse documento têm o mesmo significado comocomumente entendidos por alguém de habilidade comum natécnica à qual pertence essa invenção. No caso de conflito,o presente Relatório Descritivo dominará.
0 MÉTODO SELEX™
0 método preferido para gerar um aptâmero é com oprocesso intitulado "Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment" ("SELEX®"), representado de um modogeral na Figura 1 e também referido como seleção in vitro.
0 processo SELEX® é um método para o desenvolvimento invitro de moléculas de ácidos nucléicos com ligação altamenteespecifica a moléculas-alvo e é descrito, p.ex., no pedidode patente U.S. N2 de Sér. 07/536.428, depositado em 11 dejun. de 1990, agora abandonado, na Pat. U.S. N2 5.475.096,intitulada "Nucleic Acid Ligands", e na Pat. U.S. N-5.270.163 (ver também o WO 91/19813), intitulada "NucleicAcid Ligands". Por realização de ciclos iterativos deseleção e amplificação, o SELEX® pode ser usado para obteraptâmeros, também referidos nesse documento como "ligantesde ácidos nucléicos", com qualquer nivel desejado deafinidade de ligação ao alvo.
O processo SELEX® é baseado na constatação únicaque os ácidos nucléicos têm capacidade suficiente paraformar uma variedade de estruturas bi e tridimensionais eversatilidade quimica suficiente disponível dentro de seusmonômeros para atuar como ligantes (i.e., formam pares deligação específicos) com virtualmente qualquer compostoquímico, quer seja monomérico, quer seja polimérico. Asmoléculas de qualquer tamanho ou composição podem servircomo alvos.
O processo SELEX® é baseado na capacidade de ligarum alvo. Os aptâmeros obtidos através do procedimento SELEX®assim terão a propriedade de ligação ao alvo. A meraligação ao alvo, entretanto, não proporciona nenhumainformação sobre o efeito funcional, se algum, que pode serexercido sobre o alvo pela ação da ligação do aptâmero.
A alteração de uma propriedade da molécula-alvorequer que o aptâmero se ligue em certa posição sobre o alvo,para efetuar uma alteração em uma propriedade do alvo. Nateoria, o método SELEX® pode resultar na identificação de umgrande número de aptâmeros, onde cada aptâmero liga em umsitio diferente sobre o alvo. Na prática, as interações deligação entre aptâmero-alvo freqüentemente ocorrem em um ouem um número relativamente pequeno de sítios de ligaçãopreferidos sobre o alvo, que proporcionam interfacesestruturais estáveis e acessíveis para a interação. Alémdisso, quando o método SELEX® for efetuado sobre umamolécula-alvo fisiológica, a pessoa versada geralmente não écapaz de controlar a posição do aptâmero ao alvo. Dessemodo, a posição do sítio de ligação do aptâmero sobre o alvopode ou não ser em, ou próxima a, um de potencialmentediversos sítios de ligação que poderiam resultar no efeitodesejado, ou pode não ter nenhum efeito sobre a molécula-alvo.
Mesmo onde um aptâmero, em virtude de suacapacidade de ligar o alvo, for verificado ter um efeito,não há nenhum modo de predizer a existência desse efeito oude saber de antemão qual será o efeito. Na realização de umexperimento SELEX®, a pessoa versada pode somente saber comalguma certeza que aptâmeros, na medida em que seja possívelobter um aptâmero contra um alvo, terão a propriedade deligação ao alvo. Pode-se efetuar um experimento SELEX® naexpectativa que alguns dos aptâmeros identificados tambémterão um efeito sobre o alvo além da ligação a ele, porémisso é incerto.
O processo SELEX® vale-se como um ponto de partidade uma grande biblioteca ou agrupamento de oligonucleotideosde fita simples compreendendo seqüências ao acaso. Osoligonucleotideos podem ser DNA, RNA, ou híbridos de DNA/RNAmodificados ou não modificados. Em alguns exemplos, oagrupamento compreende 100% de oligonucleotideos degeneradosou parcialmente degenerados. Em outros exemplos, oagrupamento compreende oligonucleotideos degenerados ouparcialmente degenerados contendo pelo menos uma seqüênciafixa e/ou seqüência conservada incorporada na seqüência aoacaso. Em outros exemplos, o agrupamento compreendeoligonucleotideos degenerados ou parcialmente degeneradoscontendo pelo menos uma seqüência fixa e/ou seqüênciaconservada em sua extremidade de 5' e/ou 3', que podecompreender uma seqüência compartilhada por todas asmoléculas do agrupamento de oligonucleotideos. Asseqüências fixas são seqüências comuns aos oligonucleotideosno agrupamento que são incorporadas para um propósito pré-selecionado, tal como os motivos de CpG descritosadicionalmente abaixo, os sítios de hibridização para osprimers da PCR, seqüências promotoras para as RNApolimerases (p.ex., T3, T4, T7, e SP6), sítios de restrição,ou seqüências homopoliméricas, tais como os sistemas de poliA ou poli T, os núcleos catalíticos, os sítios para aligação seletiva a colunas de afinidade, as seqüênciaslíderes que promovem a transcrição, e outras seqüências parafacilitar a clonagem e/ou o seqüenciamento de umoligonucleotídeo de interesse. As seqüências conservadassão seqüências, diferentes das seqüências fixasC1 anteriormente descritas, compartilhadas por diversosaptâmeros que se ligam ao mesmo alvo.
Os oligonucleotideos do agrupamentopreferivelmente incluem uma porção de seqüência degenerada,bem como seqüências fixas necessárias para a amplificaçãoeficiente. Tipicamente, os oligonucleotideos do agrupamentode partida contêm seqüências 5' e 3' terminais, fixas, queflanqueiam uma região interna de 30-40 nucleotideosaleatórios. Os nucleotideos degenerados podem serproduzidos em diversos modos, incluindo a síntese química ea seleção de tamanho a partir de ácidos nucléicos celularesaleatoriamente clivados. A variação de seqüência nos ácidosnucléicos de teste pode também ser introduzida ou aumentadapor mutagênese antes ou durante as iterações deseleção/amplificação.
A porção de seqüência degenerada dooligonucleotídeo pode ser de qualquer comprimento e podecompreender ribonucleotídeos e/ou ·desoxirribonucleotídeos epode incluir nucleotideos ou análogos de nucleotideosmodificados ou não naturais. Ver, p.ex., a Patente U.S. N25.958.691; a Patente U.S. N2 5.660.985; a Patente U.S. N25.958.691; a Patente U.S. N2 5.698.687; a Patente U.S. N25.817.635; a Patente U.S. N2 5.672.695, e a Publicação PCTWO 92/07065. Os oligonucleotideos degenerados podem sersintetizados a partir de nucleotideos ligados a umfosfodiéster, usando as práticas de síntese deoligonucleotideos de fase sólida, bastante conhecidas natécnica. Ver, p.ex., Froehler e col, Nucl. Acid Res.14:5399-5467 (1986) e Froehler e col, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986). Os oligonucleotideos aleatórios podem tambémser sintetizados usando métodos em fase de solução, taiscomo os métodos de síntese de triésteres. Ver, p.ex., Soode col, Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) e Hirose e col, Tet.Lett., 28:2449 (1978). As sínteses típicas realizadas emequipamento de síntese de DNA automatizado produzem IO16-IO17moléculas individuais, um número suficiente para a maioriados experimentos SELEX®. As regiões suficientemente grandesda seqüência degenerada no projeto da seqüência aumentam aprobabilidade que cada molécula sintetizada seja provável derepresentar uma única seqüência.
A biblioteca de partida dos oligonucleotídeos podeser gerada por síntese química automatizada em umsintetizador de DNA. Para sintetizar as seqüênciasdegeneradas, misturas de todos os quatro nucleotídeos sãoadicionadas em cada etapa de adição de nucleotídeos, duranteo processo de síntese, permitindo a incorporação estocásticade nucleotídeos. Conforme acima estabelecido, em umamodalidade, os oligonucleotídeos aleatórios compreendemseqüências inteiramente degeneradas; entretanto, em outrasmodalidades, os oligonucleotídeos degenerados podemcompreender extensões de seqüências não aleatórias ouparcialmente aleatórias. As seqüências parcialmentealeatórias podem ser criadas por adição dos quatronucleotídeos em diferentes razões molares, em cada etapa deadição.
Nessas situações onde uma biblioteca de RNA é paraser usada como a biblioteca de partida, ela é tipicamentegerada sintetizando uma biblioteca de DNA, opcionalmenteamplificando por PCR, então transcrevendo a biblioteca deDNA in vitro usando a T7 RNA polimerase ou uma T7 RNApolimerase modificada, e purificando a biblioteca transcrita.A biblioteca de RNA ou DNA é então misturada com o alvo, sobcondições favoráveis para a ligação, e submetida a iteraçõesem etapas de ligação, separação e amplificação, usando omesmo esquema de seleção geral, para obter virtualmentequalquer critério desejado de afinidade de ligação eseletividade. Mais especificamente, começando com umamistura contendo o agrupamento inicial de ácidos nucléicos,o método SELEX® inclui as etapas de: (a) contatar a misturacom o alvo, sob condições favoráveis para a ligação; (b)separar os ácidos nucléicos não ligados daqueles ácidosnucléicos que tenham se ligado especificamente às moléculas-alvo; (c) opcionalmente dissociar os complexos de ácidosnucléicos-alvo; (d) amplificar os ácidos nucléicosdissociados dos complexos de ácidos nucléicos-alvo, paraproduzir uma mistura de ácidos nucléicos enriquecida emligantes; e (e) repetir as etapas de ligar, separar,dissociar e amplificar através de tantos ciclos quantodesejados, para produzir ligantes de ácidos nucléicosaltamente específicos, de alfa afinidade, para a molécula-alvo. Naquelas situações onde os aptâmeros de RNA estiveremsendo selecionados, o método SELEX® adicionalmentecompreende as etapas de: (i) transcrição reversa dos ácidosnucléicos dissociados dos complexos de ácidos nucléicos-alvo,antes da amplificação na etapa (d); e (ii) transcrição dosácidos nucléicos amplificados da etapa (d) antes dereiniciar o processo.
Dentro de uma mistura de ácidos nucléicos contendoum grande número de seqüências e estruturas possíveis, háuma ampla faixa de afinidades de ligação por um dado alvo.Uma mistura de ácidos nucléicos compreendendo, por exemplo,um segmento ao acaso de 20 nucleotídeos, pode ter 420possibilidades de candidatos. Aqueles que tiverem a maiorafinidade (menores constantes de dissociação) pelo alvo sãomais prováveis de ligarem-se ao alvo. Após a separação, adissociação e a amplificação, uma segunda mistura de ácidosnucléicos é gerada, enriquecida pelos candidatos de maiorafinidade de ligação. As rodadas adicionais de seleçãoprogressivamente favorecem os melhores ligantes, até que amistura de ácidos nucléicos resultante sejapredominantemente composta de somente uma ou poucasseqüências. Essas podem então ser clonadas, seqüenciadas eindividualmente testadas como ligantes ou aptâmeros quanto à1) afinidade de ligação pelo alvo; e/ou 2) capacidade deefetuar a função de alvo.
Os ciclos de seleção e amplificação são repetidosaté que um objetivo desejado seja atingido. No caso maisgeral, a seleção/amplificação é continuada até que nenhumaperfeiçoamento significativo na intensidade de ligação sejaatingido na repetição do ciclo. 0 método é tipicamenteusado para amostrar aproximadamente IO14 espécies diferentesde ácidos nucléicos, porém pode ser usado para amostrartanto quanto cerca de IO18 espécies diferentes de ácidosnucléicos. Geralmente, as moléculas de aptâmeros de ácidosnucléicos são selecionadas em um procedimento de 5 a 20ciclos. Em uma modalidade, a heterogeneidade é introduzidasomente nos estágios iniciais de seleção e não ocorre portodo o processo de replicação.
Em uma modalidade do método SELEX®, o processo deseleção é tão eficiente em isolar aqueles ligantes de ácidosnucléicos que se ligam mais fortemente ao alvo selecionado,que somente um ciclo de seleção e amplificação é requerido.Tal seleção eficiente pode ocorrer, por exemplo, em umprocesso do tipo cromatográfico, onde a capacidade dosácidos nucléicos de associarem-se com alvos ligados sobreuma coluna opera em tal maneira que a coluna ésuficientemente capaz dé permitir a separação e o isolamentodos ligantes de ácidos nucléicos de mais altas afinidades.
Em muitos casos, não é necessariamente desejávelefetuar as etapas iterativas do processo SELEX® até um únicoligante de ácido nucléico ser identificado. A solução deligante de ácido nucléico especifico para o alvo podeincluir uma família de estruturas ou motivos de ácidosnucléicos que tem diversas seqüências conservadas e diversasseqüências que podem ser substituídas ou adicionadas semafetar significativamente a afinidade dos ligantes de ácidosnucléicos pelo alvo. Pela terminação do processo SELEX®antes do término, é possível determinar a seqüência dediversos membros da família da solução de ligante de ácidonucléico.Sabe-se que existe uma variedade de estruturasprimárias, secundárias e terciárias de ácidos nucléicos. Asestruturas ou motivos que tenham sido mostrados, de modomais comum, estarem envolvidos nas interações que não sejamdo tipo Watson-Crick são referidos como agrupamentos do tipogrampo de cabelo ("hairpin"), saliências simétricas eassimétricas, pseudo-nós e um grande número de combinaçõesdestes. Quase todos os casos conhecidos de tais motivossugerem que eles podem ser formados em uma seqüência deácidos nucléicos de não mais do que 30 nucleotideos. Poressa razão, é freqüentemente preferido que os procedimentosSELEX® com segmentos ao acaso contíguos sejam iniciados comseqüências de ácidos nucléicos contendo um segmento ao acasode entre cerca de 20 a cerca de 50 nucleotideos e, emalgumas modalidades, cerca de 30 a cerca de 40 nucleotideos.Em um exemplo, a seqüência fixa em 51:aleatória:fixa em 3'compreende uma seqüência aleatória de cerca de 30 a cerca de40 nucleotideos.
O método SELEX® básico tem sido modificado paraatingir diversos objetivos específicos. Por exemplo, aPatente U.S. N2 5.707.796 descreve o uso do processo SELEX®em conjunção com a eletroforese em gel, para selecionarmoléculas de ácidos nucléicos com característicasestruturais específicas, tais como DNA dobrado. A PatenteU.S. N2 5.763.177 descreve métodos baseados no SELEX® paraselecionar ligantes de ácidos nucléicos contendo gruposfotorreativos, capazes de ligar e/ou foto-reticular com e/oufotoinativar uma molécula-alvo. A Patente U.S. N2 5.567.588e a Patente U.S. N2 5.861.254 descrevem métodos baseados noSELEX® que atingem uma separação altamente eficiente entreos oligonucleotideos tendo alta e baixa afinidade por umamolécula-alvo. A Patente U.S. N2 5.496.938 descreve métodospara obter ligantes de ácidos nucléicos aperfeiçoados após oprocesso SELEX® ter sido efetuado. A Patente U.S. N25.705.337 descreve métodos para ligar covalentemente umligante ao seu alvo.
O método SELEX® pode também ser usado para obterligantes de ácidos nucléicos que se ligam a mais do que umsitio sobre a molécula-alvo, e para obter ligantes de ácidosnucléicos que incluam espécies que não sejam ácidosnucléicos que se ligam a sítios específicos sobre o alvo. Ométodo SELEX® proporciona meios para isolar e identificarligantes de ácidos nucléicos que se ligam a qualquer alvoimaginável, incluindo as biomoléculas grandes e pequenas,tais como as proteínas de ligação a ácidos nucléicos e asproteínas não sabidas ligarem ácidos nucléicos como parte desua função biológica, bem como os cofatores e outraspequenas moléculas. Por exemplo, a Patente U.S. N25.580.737 divulga seqüências de ácidos nucléicos,identificadas através do método SELEX®, que são capazes dese ligarem com alta afinidade à cafeína e ao análogointimamente relacionado, teofílina.
O processo Counter-SELEX® é um método paraaperfeiçoar a especificidade dos ligantes de ácidosnucléicos para uma molécula-alvo, por eliminação dasseqüências de ligantes de ácidos nucléicos com reatividadecruzada com uma ou mais moléculas que não sejam alvos. 0processo Counter-SELEX® é compreendido das etapas de: (a)preparar uma mistura candidata de ácidos nucléicos; (b)contatar a mistura candidata com o alvo, onde os ácidosnucléicos tendo uma afinidade aumentada pelo alvo em relaçãoà mistura candidata podem ser separados do restante damistura candidata; (c) separar os ácidos nucléicos deafinidade aumentada do restante da mistura candidata; (d)opcionalmente dissociar os ácidos nucléicos de afinidadeaumentada do alvo; (e) contatar os ácidos nucléicos deafinidade aumentada com uma ou mais moléculas que não sejamalvos, de modo tal que os ligantes de ácidos nucléicos comafinidade especifica pela(s) molécula(s) que não é(são)alvo(s) sejam removidos; e (f) amplificar os ácidosnucléicos com afinidade especifica somente pela molécula-alvo, para produzir uma mistura de ácidos nucléicosenriquecida por seqüências de ácidos nucléicos com afinidaderelativamente maior e especificidade para ligação àmolécula-alvo. Conforme descrito acima para o método SELEX®,os ciclos de seleção e amplificação são repetidos, conformenecessários, até que um objetivo desejado seja atingido.
Um problema potencial encontrado no uso dos ácidosnucléicos como substâncias terapêuticas e vacinas é que osoligonucleotideos em sua forma de fosfodiéster podem serrapidamente degradados nos fluidos corpóreos por enzimasintracelulares e extracelulares, tais como as endonucleasese as exonucleases, antes do efeito desejado ser mostrado. Ométodo SELEX®, assim, inclui a identificação de ligantes deácidos nucléicos de altas afinidades contendo nucleotideosmodificados que conferem características aperfeiçoadas aoligante, tais como estabilidade in vivo aperfeiçoada oucaracterísticas de distribuição aperfeiçoadas. Os exemplosde tais modificações incluem as substituições químicas nasposições de açúcar e/ou fosfato e/ou base. Os ligantes deácidos nucléicos identificados pelo SELEX® contendonucleotideos modificados são descritos, p.ex., na PatenteU.S. N2 5.660.985, que descreve oligonucleotídeos contendoderivados de nucleotideos quimicamente modificados naposição 2' da ribose, posição 5 da pirimidinas, e posição 8das purinas, na Patente U.S. N- 5.756.703, que descreveoligonucleotídeos contendo diversas pirimidinas modificadasem 2', e na Patente U.S. N2 5.580.737, que descreve ligantesde ácidos nucléicos altamente específicos contendo um oumais nucleotideos modificados com substituintes de 2'-amino(2'-NH2), 2'-flúor (2'-F), e/ou 2'-0-metila (2'-OMe).
As modificações dos ligantes de ácidos nucléicoscontemplados nessa invenção incluem, porém não estãolimitadas, aquelas que proporcionam outros grupos químicosque incorporam carga, polarizabilidade, hidrofobicidade,ligação de hidrogênio, interação eletrostática, evariabilidade adicionais às bases do ligante de ácidonucléico ou ao ligante de ácido nucléico como um todo. Asmodificações para gerar populações de oligonucleotídeos quesejam resistentes às nucleases podem também incluir uma oumais ligações entre nucleotideos substitutas, açúcaresalterados, bases alteradas, ou suas combinações. Taismodificações incluem, porém não estão limitadas às,modificações do açúcar na posição 2', modificações dapirimidina na posição 5, modificações da purina na posição 8,modificações em aminas exociclicas, substituição da 4-tiouridina, substituição da 5-bromo ou 5-iodo-uracil;modificações na cadeia principal, modificações defosforotioato ou fosfato de alquila, metilações, ecombinações incomuns de emparelhamento de bases, tais comoas isobases isocitidina e isoguanosina. As modificaçõespodem também incluir as modificações em 3' e 5', tais como oquepi. As modificações podem também incluir as modificaçõesem 3' e 5', tais como o quepi, p.ex., a adição de um quepide 3'-31-dT para aumentar a resistência à exonucelase (ver,p.ex., as Patentes U.S. 5.674.685; 5.668.264; 6.207.816; e6.229.002, cada uma das quais é incorporada por referêncianesse documento em sua totalidade).
Em uma modalidade, proporcionam-seoligonucleotideos nos quais o grupo P(O)O é substituído porP(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), P(O)NR2 ("amidato"),P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal") ou 3'-amina (-NH-CH2-CH2-) , onde cada R ou R' é independentemente H oualquila substituída ou não substituída. Os grupos deligação podem ser unidos a nucleotídeos adjacentes atravésde uma ligação -0-, -N-, ou -S-. Nem todas as ligações nooligonucleotídeo são requeridas serem idênticas.
Nas modalidades adicionais, os oligonucleotideoscompreendem grupos de açúcares modificados, por exemplo, umou mais dos grupos hidroxila são substituídos com halogênio,grupos alifáticos, ou funcionalizados como éteres ou aminas.
Em uma modalidade, a posição 2' do resíduo de furanose ésubstituída por qualquer de um grupo O-metila, O-alquila, 0-alila, S-alquila, S-alila, ou halo. Os métodos de síntesede açúcares modificados em 2' são descritos, p.ex., emSproat, e col., Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991); Cotten, ecol. Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); e Hobbs, e col.,Biochemistry 12:5138-5145 (1973). As outras modificaçõessão conhecidas para alguém de habilidade comum na técnica.
Tais modificações podem ser as modificações pré-processoSELEX® ou as modificações pós-processo SELEX® (modificaçãode ligantes não modificados previamente identificados) oupodem ser feitas por incorporação no processo SELEX®.
As modificações pré-processo SELEX® ou aquelasfeitas por incorporação no processo SELEX® produzem ligantesde ácidos nucléicos tanto com especificidade por seu alvoSELEX®, quanto com estabilidade aperfeiçoada, p.ex.,estabilidade in vivo. As modificações pós-processo SELEX®(p.ex., truncamento, deleção, substituição ou modificaçõesadicionais de nucleotídeos de ligantes previamenteidentificados, tendo nucleotídeos incorporados pormodificação pré-processo SELEX®) aos ligantes de ácidosnucléicos podem resultar em estabilidade aperfeiçoada, p.ex.,estabilidade in vivo, sem afetar adversamente a capacidadede ligação do ligante de ácido nucléico. Opcionalmente, osaptâmeros em que os nucleotídeos modificados tenham sidoincorporados por modificação pré-processo SELEX® podem seradicionalmente modificados por modificação pós-processoSELEX® (i.e., um pós-processo de modificação SELEX® após oSELEX).
O método SELEX® inclui combinar oligonucleotideosselecionados com outros oligonucleotideos selecionados eunidades funcionais que não sejam oligonucleotideos, comodescrito na Patente U.S. N2 5.637.459 e na Patente U.S. N25.68 3.8 67. 0 método SELEX® adicionalmente inclui combinarligantes de ácidos nucléicos selecionados com compostos dealto peso molecular, lipofilicos ou não imunogênicos, em umcomplexo diagnóstico ou terapêutico, como descrito, p.ex.,na Patente U.S. N2 6.011.020, na Patente U.S. N2 6.051.698,e na Publicação PCT N2 WO 98/18480. Essas patentes epedidos ensinam a combinação de um amplo arranjo de formatose outras propriedades, com as propriedades eficientes deamplificação e replicação de oligonucleotideos.,. e com aspropriedades desejáveis de outras moléculas.
A identificação de ligantes de ácidos nucléicospara peptideos flexíveis, pequenos, via o método SELEX®,também tem sido explorada. Os peptideos pequenos têmestruturas flexíveis e normalmente existem em solução em umequilíbrio de confôrmeros múltiplos e, desse modo,acreditava-se inicialmente que as afinidades de ligaçãopoderiam ser limitadas pela entropia conformacional perdidacom a ligação de um peptídeo flexível. Entretanto, aviabilidade de identificar ligantes de ácidos nucléicos parapeptideos pequenos em solução foi demonstrada na Patente U.S.N2 5.648.214. Nessa patente, foram identificados ligantesde ácidos nucléicos de RNA de alta afinidade para asubstância Ρ, um peptideo de 11 aminoácidos.
Como parte do processo SELEX®, as seqüênciasselecionadas para ligarem-se ao alvo são então opcionalmenteminimizadas para determinar a seqüência mínima tendo aafinidade de ligação desejada. As seqüências selecionadase/ou as seqüências minimizadas são opcionalmente modificadasefetuando-se a mutagênese aleatória ou direcionada daseqüência para, p.ex., aumentar a afinidade de ligação oualternativamente determinar quais posições na seqüência sãoessenciais para a atividade de ligação.
O MÉTODO SELEX® MODIFICADO EM 2'
Para que um aptâmero seja adequado para uso comouma substância terapêutica e/ou para tipos particulares desubstâncias diagnosticas, ele é preferivelmente barato desintetizar, seguro e estável in vivo. Os aptâmexos de RNA eDNA do tipo selvagem tipicamente não são estáveis in vivopor causa de sua suscetibilidade à degradação por nucleases.A resistência à degradação por nucleases pode ser bastanteaumentada pela incorporação de grupos modificadores naposição 21.
Os grupos 2'-flúor e 2'-amino têm sidoincorporados com êxito nos agrupamentos de oligonucleotídeosa partir dos quais os aptâmeros têm sido subseqüentementeselecionados. Entretanto, essas modificações aumentam muitoo custo de síntese do aptâmero resultante, e podemintroduzir preocupações de segurança em alguns casos porcausa da possibilidade que os nucleotídeos modificadospoderiam ser reciclados para o DNA hospedeiro por degradaçãodos oligonucleotídeos modificados e uso subseqüente dosnucleotideos como substratos para a síntese de DNA.
Os aptâmeros que contêm 21-0-metil ("2'-OMe")nucleotideos, como proporcionados nesse documento, superammuitas dessas desvantagens. Os oligonucleotideos contendo2'-OMe nucleotideos são resistentes às nucleases e baratosde sintetizar. Embora os 21-OMe nucleotideos sejam ubíquosnos sistemas biológicos, as polimerases naturais não aceitamos 21-OMe NTPs como substratos sob condições fisiológicas,assim não há nenhuma preocupação de segurança sobre oreciclo de 2'-OMe nucleotideos para o DNA hospedeiro. Osmétodos SELEX® usados para gerar aptâmeros modificados em 2'são descritos, p.ex., no Pedido de Patente Provisório U.S.N2 de Série 60/430.761, depositado em 3 de dezembro de 2002,no Pedido de Patente Provisório U.S. N2 de Série ,60/487.474,depositado em 15 de julho de 2003, no Pedido de PatenteProvisório U.S. N2 de Série 60/517.039, depositado em 4 denovembro de 2003, no Pedido de Patente U.S. N2 10/729.581,depositado em 3 de dezembro de 2003, e no Pedido de PatenteU.S. N2 10/873.856, depositado em 21 de junho de 2004,intitulado "Method for in vitro Selection of 21-0-methylSubstituted Nucleic Acids", cada um dos quais é, nessedocumento, incorporado por referência em sua totalidade.
A presente invenção inclui os aptâmeros que seligam ao, e modulam a função do, alvo do aptâmero e quecontêm nucleotideos modificados (p.ex., nucleotideos que têmuma modificação na posição 2') para tornar ooligonucleotídeo mais estável do que o oligonucleotídeo nãomodificado à degradação enzimática e química, bem como àdegradação térmica e física. Embora existam diversosexemplos de aptâmeros contendo 21-OMe na literatura (ver,ρ.ex. , Ruckman e col., J.Biol.Chem, 1998 273, 20556-20567-695) , esses foram gerados pela seleção in vitro debibliotecas de transcritos modificados em que os resíduos Ce U foram substituídos por 2'-flúor (2'-F) e os resíduos A eG foram por 2'-0H. Assim que as seqüências funcionais foramidentificadas, então cada resíduo AeG foi testado quanto àtolerância à substituição com 2'-OMe, e o aptâmero foisintetizado novamente tendo todos os resíduos AeG, osquais toleravam a substituição com 21-OMe como resíduos com2'-OMe. A maior parte dos resíduos A e G de aptâmerosgerados nesse modo de duas etapas tolera a substituição porresíduos com 2'-OMe, embora, em média,. . aproximadamente. 20%não. Consequentemente, os aptâmeros gerados usando essemétodo tendem a conter de dois a quatro resíduos como 2'-0H,e a estabilidade e o custo de síntese estão comprometidoscomo um resultado. Pela incorporação de nucleotídeosmodificados na reação de transcrição, que geramoligonucleotídeos estabilizados, usados nos agrupamentos deoligonucleotídeos a partir dos quais os aptâmeros sãoselecionados e enriquecidos pelo método SELEX® (e/ouquaisquer de suas variações e aperfeiçoamentos, incluindoaqueles descritos nesse documento), os métodos da presenteinvenção eliminam a necessidade por estabilização dosoligonucleotídeos para aptâmeros selecionados por síntesenovamente dos oligonucleotídeos de aptâmeros com osnucleotideos modificados com 2'-OMe.
Em uma modalidade, a presente invenção proporcionaaptâmeros compreendendo combinações de modificações com 2'-0H, 21-F, 2'-desóxi, e 21-OMe dos nucleotideos de ATP, GTP,CTP, TTP, e UTP. Em uma outra modalidade, a presenteinvenção proporciona aptâmeros compreendendo combinações demodificações com 2-OH, 2'-F, 2'-desóxi, 2'-OMef 2'-NH2, e21-metoxietila dos nucleotideos de ATP, GTP, CTP, TTP, e UTPEm uma modalidade preferida, a presente invenção proporcionaaptâmeros compreendendo nucleotideos de ATP, GTP, CTP, TTP,e/ou UTP totalmente ou substancial e totalmente modificadoscom 2'-OMe.
Polimerases Modificadas
Os aptâmeros modificados em 21 da invenção sãocriados usando polimerases modificadas, p.ex., uma T7polimerase modificada, tendo uma taxa de incorporação denucleotideos modificados que têm substituintes grandes naposição 2' da furanose que é mais elevada do que daspolimerases do tipo selvagem. Por exemplo, uma T7polimerase mutante em que o resíduo de tirosina na posição639 tenha sido alterado para fenilalanina (Y639F)prontamente utiliza trifosfatos de 2'desóxi, 2'amino-, e21flúor-nucleotídeos (NTPs) como substratos e tem sidoamplamente usada para sintetizar RNAs modificados para umavariedade de aplicações. Entretanto, essa T7 polimerasemutante, ao que consta, não pode prontamente utilizar (i.e.,incorporar) os NTPS com substituintes grandes em 2', taiscomo os substituintes de 21-OMe ou 2'-azido (2'-N3). Para aincorporação de substituintes grandes em 21 , uma T7polimerase tendo a histidina na posição 784 alterada para umresíduo de alanina, além da mutação de Y639F, foi descrita(Y639F/H784A) e foi usada em circunstâncias limitadas paraincorporar NTPs com pirimidina modificada. Ver Padilla, R,e Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138. Uma T7RNA polimerase mutante, na qual o resíduo de tirosina naposição 639 tenha sido alterado para fenilalanina, o resíduode histidina na posição 784 foi alterado para uma alanina, eo resíduo de lisina na posição 378 foi alterado paraarginina (Y639F/H784A/K378R), tem sido usada emcircunstâncias limitadas para incorporar os NTPs com purinae piridimina modificadas, p.ex, os 2'-OMe NTPs, porém incluiuma adição de 2'-OH GTP para a transcrição. Ver Burmeistere col, (2005) Chemistry and Biology, 12: 25-33. A inclusãode uma adição de 2'-OH GTP para a transcrição pode resultarem aptâmeros que não sejam inteiramente com 2'-OMe, porémpreferivelmente pode depender da presença de 2-OH GTPs.
Uma T7 polimerase mutante tendo a histidina naposição 784 alterada para um resíduo de alanina (H784A)também foi descrita. Padilla e col., Nucleic Acids Research,2002, 30: 138. Em ambas as T7 polimerases Y639F/H784Amutante e H784A mutante, a alteração para um resíduo deaminoácido menor, tal como a alanina, permite a incorporaçãode substratos de nucleotídeos maiores, p.ex., osnucleotídeos substituídos com 21-OMe. Ver Chelliserry, K. eEllington, A.D., (2004) Nature Biotech, 9:1155-60. T7 RNApolimerases adicionais foram descritas com mutações no sítioativo da T7 RNA polimerase, que incorporam mais prontamentesubstratos modificados em 2' maiores, p.ex., uma T7 RNApolimerase mutante tendo ,o resíduo de tirosina na posição639 alterado para uma leucina (Y639L). Entretanto, aatividade é freqüentemente prejudicada pela especificidadedo substrato aumentada conferida por tais mutações,resultando em baixas produções de transcritos. Ver PadillaR e Sousa, R., (1999) Nucleic Acids Res., 27(6): 1561. Amutante de T7 RNA polimerase P266L foi descrita parafacilitar a depuração do promotor (Guillerez e col. (2005)Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 102 (17) 5958). Apolimerase fazuma transição da conformação inicial, em que está ligada aopromotor, para a conformação de alongamento, em que não estáNenhuma das polimerases mutantes acima mencionadas foidescrita resultar em transcritos inteiramente com 2'-OMe.
A presente invenção proporciona materiais emétodos para aumentar o rendimento de transcrição deoligonucleotideos. Em uma modalidade, a presente invençãoproporciona métodos e condições para utilizar as T7 RNApolimerases modificadas para incorporar enzimaticamentenucleotídeos modificados em oligonucleotideos. Em umamodalidade preferida, a T7 RNA polimerase modificada, usadacom os métodos de transcrição da invenção, não requer apresença de 21-OH GTP. Em uma modalidade preferida, apolimerase modificada é uma T7 RNA polimerase mutante tendoo resíduo de tirosina na posição 639 alterado para umresíduo de leucina e o resíduo de histidina na posição 784alterado para um resíduo de alanina (Y639L/H784A). Em umaoutra modalidade preferida, a polimerase modificada é uma T7RNA polimerase mutante tendo o resíduo de tirosina naposição 639 alterado para um resíduo de leucina, o resíduode histidina na posição 784 alterado para um resíduo dealanina, e o resíduo de lisina na posição 378 alterado paraum resíduo de arginina (Y639L/H784A/K378R). Em uma outramodalidade, a polimerase modificada para uso nos métodos dainvenção é uma T7 RNA polimerase mutante tendo o resíduo detirosina na posição 639 alterado para uma leucina (Y639L),enquanto que em mais uma outra modalidade, a T7 RNApolimerase mutante tem o resíduo de tirosina na posição 639alterado para um resíduo de leucina e o resíduo de lisina naposição 378 alterado para um resíduo de arginina(Y639L/K378R). Embora não desejando estar ligado porqualquer teoria, a mutação de K378R não está próxima aosítio ativo da polimerase e, desse modo, acredita-se ser umamutação silenciosa. Em uma outra modalidade, a polimerasemodificada para uso nos métodos da invenção é uma T7 RNApolimerase mutante tendo o resíduo de prolina na posição 266alterado para uma leucina, o resíduo de tirosina na posição639 alterado para uma leucina e o resíduo de histidina naposição 784 alterado para um resíduo de alanina(P266L/Y639L/H784A), enquanto que em mais uma outramodalidade, a T7 RNA polimerase mutante tem o resíduo deprolina na posição 266 alterado para uma leucina, o resíduode tirosina na posição 639 alterado para um resíduo deleucina, o resíduo de histidina na posição 784 alterado paraum resíduo de alanina e o resíduo de lisina na posição 378alterado para um resíduo de arginina(P2 66L/Y63 9L/H7 84A/K37 8R).
As seqüências de aminoácidos das T7 RNApolimerases mutantes são mostradas abaixo:
Y639L/H784A (SEQ ID NO 1):
MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA
AAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS
AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKH FKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADML S KGLLGGEAWSSWHK
EDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGVVGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCVVPP
KPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITK
WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH
KAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE
RIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQH
FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTK
ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLI
WESVSVTVVAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPiQTRLN
LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTI
PADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA
Y639L/H784A/K378R (SEQ ID NO 2) :
MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA
AAKPLITTLLPKMIARNDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS
AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHK
EDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGVVGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCVVPP
KPWTGITGGGWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITK
WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWRRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH
KAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE
RIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGQH
FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTK
ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLJ
WESVSVTVVAAVEAivÍNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKK3IQTRLN
LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTI
PADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA
Y639L (SEQ ID NO 100) :
MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA
AAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS
AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQVVEADMLSKGLLGGEAWSSWHK
EDSHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGVVGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCVVPP
KPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVTK
WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAAAVYRKDKARKSRRISLFMLEQANKFANH
KAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE
RIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQH
FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEVVTVTDENTGEISEKVKLGTK
ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLI
WESVSVTVVAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLN
LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVHSQDGSHLRKTVVWAKEKYGIESFALIHDSFGTI
PADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA
Y639L/K378R (SEQ ID NO 101):
MNT'INIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA
AAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS
AGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKPCAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHK
EDSIHVGVRCIEMLIESTGMVS LHRQNAGWGQDSETIELAPEYAEAPAT RAGALAGISPMFQPCWPP
KPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVTTK
WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWRRAWVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH
KAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE
RIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGQH
FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTK
ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLI
WESVSVTWAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPiQTRLN
LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVHSQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTI
PADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDLESDFAFA
P266L/Y639L/H784A (SEQ ID NO 102)
MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA
AAKPLITTLLPKMTARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS
AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHK
EDSIHVGVRCIEMUESTGMVSLHRQNAGWGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISLMFQPCVVPP
KPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITK
WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAIAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH
KAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE
RIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQH
FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEVVTVTDENTGEISEKVKLGTK
ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLI
WESVSVTWAAVEAMNWLKSAAKLLAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLN
LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTIPADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA
P2 66L/Y639L/H7 8 4A/ K378R (SEQ ID NO 103)
MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA
AAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS
AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKH FKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHK
EDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGWGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISLMFQPCVVPP
KPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITK
WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWRRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH
KAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE
RIKFIEENHEN1MACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQH
FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTK
ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLI
WESVSVTVVAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLN
LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTIPADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA
Para gerar agrupamentos de transcritos de RNAmodificados em 2' (p.ex., 2'-OMe), sob condições em que umapolimerase aceita os NTPs modificados em 2', podem serusadas as T7 RNA polimerases mutantes Y639F, Y639F/ K378R,Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L/H784A,Y639L/H784A/K378R, Y639L, Y639L/K378R, P266L/Y639L/H784A ouP266L/Y639L/H784A/ K378R. Uma polimerase preferida é a T7RNA polimerase mutante Y639L/H784A. Uma outra polimerasepreferida é a T7 RNA polimerase mutante Y639L/H784A/K378R.
Uma outra polimerase preferida da invenção é a T7 RNApolimerase mutante P266L/Y639L/H784A ou P266L/Y639L/H784A/K378R. Outras T7 RNA polimerases, particularmente aquelasque exibem uma alta tolerância por substituintes grandes em2', podem também ser usadas nos métodos da presente invenção.Quando usada em uma polimerização molde-direcionada, usandoas condições divulgadas nesse documento, a T7 RNA polimerasemutante Y639L/H784A, a Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784Aou P266L/Y639L/H784A/ K378R pode ser usada para aincorporação de NTPs totalmente com 2'-OMe, incluindo o 2'-OMe GTP, com produções de transcritos maiores do queatingidas por utilização das T7 RNA polimerases mutantesY639F, Y639F/K378R, Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L,ou as Y639L/K378R. As T7 RNA polimerases mutantesY639L/H784A, Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784A ouP266L/Y639L/H784A/ K378R podem ser usadas com, porém nãorequerem, o 21-OH GTP para atingir altas produções deoligonucleotideos modificados em 2', p.ex., contendo 2'-OMe.
Em uma modalidade preferida, as T7 RNA polimerasesmutantes Y639L/H784A ou as Y639L/H784A/K378R da invenção sãousadas com uma mistura de transcrição de MNA para promovermaiores produções de transcritos inteiramente com 2'-OMe.Em algumas modalidades, as T7 RNA polimerases mutantesY639L/H784A ou as Y639L/H784A/K378R podem ser usadas com umamistura de transcrição de rRmY, dRmY, rGmH, fGmH, dGmH, cLAmB,rRdY, dRdY ou rN.
Conforme usada aqui, uma mistura de transcriçãocontendo somente trifosfatos de 21-OMe A, G, C, e U éreferida como uma mistura de MNA, e os aptâmerosselecionados a partir dela são referidos como aptâmeros deMNA e contém somente 2'-0-metil nucleotideos. Uma misturade transcrição contendo 21-OMe CeUe 2'-OH A e G éreferida como uma mistura de "rRmY" e os aptâmerosselecionados a partir dela são referidos como aptâmeros de"rRmY". Uma mistura de transcrição contendo desóxi AeGe2'-OMe U e C é referida como uma mistura de "dRmY" e osaptâmeros selecionados a partir dela são referidos comoaptâmeros de "dRmY". Uma mistura de transcrição contendo2'-OMe A, C, e U, e 2'-OH G é referida como uma mistura de"rGmH" e os aptâmeros selecionados a partir dela sãoreferidos como aptâmeros de "rGmH". Uma mistura detranscrição contendo alternativamente 21-OMe A, C, UeGe2'-OMe A, UeCe2'-FGé referida como uma "misturaalternativa" e os aptâmeros selecionados a partir dela sãoreferidos como aptâmeros da "mistura alternativa". Umamistura de transcrição contendo 2'-OMe A, U, e C, e 2'-F G éreferida como uma mistura de "fGmH" e os aptâmerosselecionados a partir dela são referidos como aptâmeros de"fGmH". Uma mistura de transcrição contendo 2'-OMe A, U, eC, e desóxi G é referida como uma mistura de "dGmH" e osaptâmeros selecionados a partir dela são referidos comoaptâmeros de "dGmH". Uma mistura de transcrição contendodesóxi A, e 2'-OMe C, G e U é referida como uma mistura de"dAmB" e os aptâmeros selecionados a partir dela sãoreferidos como aptâmeros de "dAmB". Uma mistura detranscrição contendo 2'-OH A e 2'-OMe C, G e U é referidacomo uma mistura de "rAmB" e os aptâmeros selecionados apartir dela são referidos como aptâmeros de "rAmB". Umamistura de transcrição contendo trifosfato de 2'-OHadenosina e trifosfato de guanosina e trifosfato de desóxicitidina e trifosfato de timidina é referida como umamistura de rRdY e os aptâmeros selecionados a partir delasão referidos como aptâmeros de "rRdY1. Uma mistura detranscrição contendo nucleotideos totalmente com 21-OH éreferida como uma mistura de "rN" e os aptâmerosselecionados a partir dela são referidos como aptâmeros de"rN", "rRrY" ou RNA, e uma mistura de transcrição contendonucleotideos totalmente com desóxi é referida como umamistura de "dN" e os aptâmeros selecionados a partir delasão referidos como aptâmeros de "dN" ou "dRdY" ou DNA.
Os oligonucleotideos modificados em 2' podem sersintetizados inteiramente de nucleotideos modificados, oucom um subgrupo de nucleotideos modificados. Todos osnucleotideos podem ser modificados, e todos podem conter amesma modificação. Todos os nucleotideos podem sermodificados, porém conter diferentes modificações, p.ex.,todos os nucleotideos contendo a mesma base podem ter umtipo de modificação, enquanto os nucleotideos contendooutras bases podem ter diferentes tipos de modificação.Todos os nucleotideos de purina podem ter um tipo demodificação (ou são não modificados), enquanto todos osnucleotideos de pirimidina têm um outro tipo diferente demodificação (ou são não modificados). Nesse modo, ostranscritos, ou os agrupamentos de transcritos, são geradosusando qualquer combinação de modificações, incluindo, porexemplo, os ribonucleotídeos (2*-0H), osdesoxirribonucleotideos (2'-desóxi), os 2'-F, e 2'-OMenucleotideos. Os oligonucleotideos modificadosadicionalmente podem conter nucleotideos contendo mais doque uma modificação simultaneamente, tal como umamodificação na ligação entre nucleotideos (p.ex.,fosforotioato) e no açúcar (p.ex., 2'-0Me) e na base (p.ex.,inosina).
Condições de Transcrição
Diversos fatores têm sido determinados seremimportantes para as condições de transcrição do métodoSELEX® modificado em 2', que podem também se aplicar aosmétodos SELEX de Região Terminal descritos abaixo. Porexemplo, podem ser observados aumentos nas produções detranscrito modificado sob algumas condições quando umacombinação particular de seqüência lider/polimerase mutantefor usada. Uma seqüência lider é uma seqüência que pode serincorporada na extremidade de 3' de uma seqüência fixa naextremidade de 5' do molde de transcrição de DNA. Aseqüência lider é tipicamente 6-15 nucleotideos decomprimento, e pode ser composta de uma composição denucleotideos predeterminada, por exemplo, ela pode sertotalmente de purinas, ou uma mistura particular denucleotideos de purina e pirimidina.
Os exemplos de moldes que podem ser usados com aspolimerases mutantes e as condições de transcrição dainvenção, particularmente em combinação com a Y639L/H784A, aY639L/H784A/K378R, a P266L/Y639L/H784A ou aP266L/Y639L/H784A/ K378R, são a ARC2118 (SEQ ID NO 3), aARC2119 (SEQ ID NO 4), e a ARC3428GGGAGACAAGAATAAAGCGAGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAGAGTCGATGATGCTTAGCTAG (SEQ ID NO 137).
Além disso, a presença de 2 '-OH GTP tem sidohistoricamente um fator importante na obtenção detranscritos incorporando nucleotideos modificados. Atranscrição pode ser dividida em duas fases: a primeira faseé a iniciação, durante a qual um NTP é adicionado àextremidade de 3' do GTP (ou uma outra guanosinasubstituída) para produzir um dinucleotídeo, o qual é entãoestendido por aproximadamente 10-12 nucleotideos; a segundafase é o alongamento, durante a qual a transcrição avançapara além da adição dos primeiros aproximadamente 10-12nucleotideos. Foi anteriormente verificado que pequenasquantidades de 21-OH GTP adicionadas a uma mistura detranscrição contendo a T7 RNA polimerase mutante Y639F/K378R ou a mutante Y639F/H784A/K378R e um excesso de 2'-OMeGTP eram suficientes para capacitar a polimerase de iniciara transcrição usando o 2'-OH GTP (e deu uma produção maiorde transcrito contendo 2'-OMe do que sem o 21-OH GTP), porém,assim que a transcrição entra na fase de alongamento, adiferenciação reduzida entre 2'-OMe e 2'-OH GTP, e o excessode 21-OMe GTP sobre 2'-OH GTP, permite a incorporação deprincipalmente o 21-OMe GTP.
A presente invenção proporciona T7 RNA polimerasesmutantes, p.ex., Y639L/H784A, Y639L/H784A/K378R,P266L/Y639L/H784A ou P266L/Y639L/H784A/ K378R, as quais nãorequerem o 2'-OH GTP na mistura de transcrição para uma altaprodução de transcrição com 2'-OMe. Em uma modalidade, aalta produção significa em média pelo menos um transcritopor molde de transcrição de entrada.
Um outro fator na incorporação de nucleotideossubstituídos com 2'-OMe nos transcritos é o uso de magnésioe manganês (Mn2+) ambos divalentes na mistura de transcrição.As combinações diferentes de concentrações de cloreto demagnésio e cloreto de manganês foram verificadas afetarem asproduções de transcritos 21-O-metilados, a concentraçãoótima do cloreto de magnésio e manganês sendo dependente daconcentração na mistura de reação de transcrição dos NTPsque formam complexos de íons de metais divalentes. Paraobter as maiores produções de transcritos totalmente 2'-0-metilados (i.e., nucleotideos de A, C, UeG totalmente com2'-OMe), as concentrações de cloreto de magnésio deaproximadamente 5 mM e cloreto de manganês a 1,5 mM sãopreferidas, quando cada NTP estiver presente em umaconcentração de 0,5 mM. Quando a concentração de cada NTPfor 1,0 mM, as concentrações de aproximadamente 6,5 mM decloreto de magnésio e 2,0 mM de cloreto de manganês sãopreferidas. Quando cada NTP estiver presente em umaconcentração de 1,5 mM, as concentrações de aproximadamente8 mM de cloreto de magnésio e 2,5 mM de cloreto de manganêssão preferidas. Quando a concentração de cada NTP for 2,0 mM,as concentrações de aproximadamente 9,5 mM de cloreto demagnésio e 3,0 mM de cloreto de manganês são preferidas. Emqualquer caso, os afastamentos dessas concentrações de atéduas vezes ainda dão quantidades significativas detranscritos modificados.
Iniciar a transcrição com 21-OH GMP, guanosina, ououtras 21-OH guanosinas substituídas em uma posiçãodiferente da posição de 2'-OH do açúcar é também importantepara as misturas de transcrição que não contêm o 21-OH GTP.
Esse efeito resulta da especificidade da polimerase pelonucleotídeo de iniciação. Como um resultado, o nucleotídeo5' terminal de qualquer transcrito gerado nesse modo éprovável de ser a 21-OH G. Uma concentração preferida deGMP (ou guanosina) é 0,5 mM e ainda mais preferivelmente 1mM. Foi também verificado que a inclusão do PEG,preferivelmente o PEG-8000, na reação de transcrição é útilpara maximizar a incorporação de nucleotídeos modificados.
Para a incorporação máxima de 2'-OMe ATP (100%),2'-OMe UTP (100%), 2'-OMe CTP (100%) e 2'-OMe GTP (100%)("MNA") nos transcritos, as seguintes condições podem serusadas: tampão HEPES a 200 mM, DTT a 40 mM, espermidina a 2mM, PEG-8000 a 10% (p/v), Triton X-100 a 0,01% (p/v), MgCl2a 8 mM, MnCl2 a 2,5 mM, 2'-OMe NTP (cada) a 1,5 mM, 2'-OHGMP a 1 mM, pH 7,5, T7 RNA Polimerase mutanteY639L/H784A/K378R a 200 nM, 5 unidades/ml de pirofosfataseinorgânica, e um molde de DNA. Em algumas modalidades, omolde de DNA pode estar presente em uma concentração depreferivelmente cerca de 5 a 500 nM. Opcionalmente, o moldede DNA usado com as condições de transcrição acima descritascompreende uma seqüência lider totalmente de purinas, queaumenta a produção de transcrição em relação a um molde quenão compreende tal seqüência lider, quando ambos os moldesforem transcritos sob condições idênticas. Em uma outramodalidade, a seqüência lider é uma mistura de purinas epirimidinas, que aumenta a produção de transcrição emrelação a um molde que não compreende tal seqüência lider,quando ambos forem transcritos sob condições idênticas.
Conforme usada aqui, uma unidade de pirofosfatase inorgânicaé definida como a quantidade de enzima que liberará 1,0 molde ortofosfato inorgânico por minuto, em pH 7,2 e 25 °C. Areação pode ser realizada a partir de 1 até 24 horas.
Em cada caso, os produtos de transcrição podementão ser usados para a entrada no processo SELEX®, paraidentificar os aptâmeros e/ou para determinar uma seqüênciaconservada que tenha especificidade de ligação para um dadoalvo. As seqüências resultantes já estão estabilizadas,eliminando essa etapa do pós-processo de modificação SELEX®e dando um aptâmero mais altamente estabilizado como umresultado.
Conforme descrito abaixo, as produções úteis detranscritos incorporando inteiramente nucleotideossubstituídos em 2' podem ser obtidas sob condiçõesdiferentes das condições descritas acima. Por exemplo, asvariações nas condições de transcrição acima descritasincluem:
A concentração do tampão HEPES pode variar de 0 a1 Μ. A presente invenção também contempla o uso de outrosagentes de tamponamento tendo um pKa entre 5 e 10, incluindo,por exemplo, o Tris-hidroximetil-aminometano.
A concentração de DTT pode variar de 0 a 400 mM.Os métodos da presente invenção também proporcionam o uso deoutros agentes redutores, incluindo, por exemplo, omercaptoetanol.
As concentrações de espermidina e/ou esperminapodem variar de 0 a 20 mM.
A concentração de PEG-8000 pode variar de 0 a 50 %(p/v). Os métodos da presente invenção também proporcionamo uso de outro polímero hidrofílico, incluindo, por exemplo,um PEG de outro peso molecular ou outros polialquilenoglicóis.
A concentração de Triton X-IOO pode variar de 0 a0,1% (p/v). Os métodos da presente invenção tambémproporcionam o uso de outros detergentes não-iônicos,incluindo, por exemplo, outros detergentes, incluindo outrosdetergentes de Triton-X.
A concentração de MgCl2 pode variar de 0,5 mM a 50mM. A concentração de MnCl2 pode variar de 0,15 mM a 15 mM.
Tanto o MgCl2 quanto o MnCl2 devem estar presentes dentrodas faixas descritas e, em uma modalidade preferida, estãopresentes em torno de uma razão de 10 para cerca de 3 deMgCl2:MnCl2, preferivelmente, a razão é cerca de 3-5:1, maispreferivelmente, a razão é cerca de 3-4:1.
A concentração de 2'-OMe NTP (cada NTP) podevariar de 5 μΜ a 5 mM.
A concentração de 2'-OH GTP pode variar de 0 μΜ a300 μΜ. Em uma modalidade preferida, a transcrição ocorrena ausência de 21-OH GTP (0 μΜ).
A concentração de 2-OH GMP, guanosina ou outra 2'-OH G substituída em uma posição diferente da posição 2' doaçúcar pode variar de 0 a 5 mM. Onde o 21-OH GTP nãoestiver incluído na reação, o 21-OH GMP é requerido e podevariar de 5 μΜ a 5 mM.
A concentração de molde de DNA pode variar de 5 nMa 5 μΜ.
A concentração de polimerase mutante pode variarde 2 nM a 20 μΜ.
A pirofosfatase inorgânica pode variar de 0 a 100unidades/ml.
0 pH pode variar de pH 6 a pH 9. Os métodos dapresente invenção podem ser praticados dentro da faixa de pHde atividade da maioria das polimerases que incorporamnucleotídeos modificados.A reação de transcrição pode ser deixada ocorrer apartir de cerca de uma hora até semanas, preferivelmente decerca de 1 a cerca de 24 horas.
Além disso, os métodos da presente invençãoproporcionam o uso ótimo de agentes quelantes na condição dereação de transcrição, incluindo, por exemplo, EDTA, EGTA, eDTT.
MÉTODO SELEX® DE REGIÃO TERMINAL
Um método para a descoberta de seqüências demoldes de transcrição de ácidos nucléicos que, em algumasmodalidades, são usadas para programar uma polimerização detrifosfato de nucleotideo molde-direcionada, aumentará aprodução de transcritos, é uma variante do método SELEX®,conhecido como o método SELEX® de Região Terminal (métodoTR-SELEX®) . A presente invenção proporciona um método paraidentificar seqüências de componentes de moldes detranscrição de ácidos nucléicos, p.ex., seqüências lideres,cujo uso aumenta a produção de transcritos, particularmentea produção de transcritos contendo nucleotideos modificadosem 21 (p.ex., os 21-OMe nucleotideos), quando usadas paraprogramar uma polimerização molde-direcionada, usando ométodo TR-SELEX®.
Para selecionar as seqüências lideres que promovemuma produção aumentada de transcritos contendo nucleotideosmodificados em 2', uma biblioteca candidata de moldes detranscrição de oligonucleotideos é gerada, a qual contém umaseqüência promotora que permite a transcrição em um mododependente do molde, uma primeira região fixa compreendendomais do que um nucleotideo fixo imediatamente 3' ao promotor,para permitir que ocorram ligações com esplinte, desse modopermitindo a amplificação pela extensão de primers ligadosaos sítios de ligação a primers sobre o molde ligado; umaregião degenerada a partir da qual a seqüência líder seráselecionada; e uma seqüência fixa na extremidade de 3' parapermitir a amplificação. Em uma modalidade preferida, aregião de degeneração do molde da biblioteca está próxima àextremidade de 5', desse modo reduzindo o comprimento daseqüência fixa em 5'.
Essa biblioteca de moldes de transcrição éopcionalmente amplificada por PCR, e então usada paraprogramar a transcrição usando uma mistura de reação detranscrição compreendendo uma polimerase (incluindo, semlimitação, uma T7 RNA polimerase mutada), trifosfatos denucleotídeos (NTPs) (incluindo, sem limitação, um ou maisNTPs modificados em 2') , e íons magnésio, sob as condiçõesdivulgadas nesse documento. A mistura de transcritosresultante é transcrita invertida para obter uma misturacandidata de seqüências de cDNA, que são então ligadas a umaseqüência de DNA codificando . o promotor de T7.
Opcionalmente, a mistura de transcritos resultanteprimeiramente sofre ligação, e é então transcrita invertida.
O cDNA que codifica os transcritos é então amplificado porPCR, e os clones são testados quanto à produção detranscrição usando análise por gel. Os moldes detranscrição amplificados nesse modo podem opcionalmente serusados para efetuar rodadas adicionais do processo TR-SELEX®,se necessário, para obter uma maior produção de transcritos(Ver a Figura 2).
As seqüências de clones dos transcritosamplificados podem ser analisadas para identificar oelemento da seqüência lider em 5' que permite a transcrição(incluindo, sem limitação, a transcrição incorporando um oumais nucleotideos modificados em 2')· Esses elementos daseqüência lider em 5' são úteis para projetar bibliotecascandidatas de moldes de transcrição de oligonucleotideos quepodem ser usados no SELEX® para promover uma produçãoaumentada de transcritos de ácidos nucléicos, os quaiscontêm nucleotideos modificados em 2' . Os exemplos debibliotecas preferidas de moldes de transcrição de DNA, queincorporam elementos da seqüência lider em 5' identificadospelo método TR-SELEX® (mostrado sublinhado) e promovemmaiores produções de transcritos contendo nucleotideosmodificados em 2', p.ex., 2'-OMe nucleotideos, usando ascondições divulgadas nesse documento, são descritos abaixo.
Para cada uma das seqüências das bibliotecas demoldes de transcrição de DNA listadas abaixo, o elemento daseqüência lider em 5' é mostrado sublinhado, e todas asseqüências estão na direção 5'-3'.
ARC 2118 (SEQ ID NO 3)TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
ARC2119 (SEQ ID NO 4)TAATACGACTCACTATAGGGGGTGATATTGACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATGARC2120 (SEQ ID NO 5)
TAATACGACTCACTATAGGGGTGCGCGGTTACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
ARC2121 (SEQ ID NO 6)
TAATACGACTCACTATAGGGGGAGGGGGTGCCGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
Para gerar misturas de transcritos de transcritosde RNA modificados em 2' (p.ex., 2'-OMe), sob condições nasquais uma polimerase aceita os NTPs modificados em 2', a T7RNA polimerase mutante Y639F, Y639F/K378R, Y639F/H784A,Y639F/H7 8 4A/K37 8R, Y639L/H784A, Y639L/H784A/K378R,P266L/Y639L/H784A) ou P266L/Y639L/H784A/K378R) pode serusada com as seqüências lideres em 5' identificadas pelosmétodos proporcionados pela presente invenção. Umapolimerase preferida a ser usada com as seqüências lideresem 5' da presente invenção, dando a maior produção detranscritos de ácidos nucléicos contendo nucleotídeosmodificados em 21 , é a RNA polimerase mutante Y639L/H784Aanteriormente descrita. Uma outra polimerase preferida aser usada com as seqüências lideres em 51 da invenção é a T7RNA polimerase mutante Y639L/H784A/K378R. Outras T7 RNApolimerases, particularmente aquelas que exibem uma altatolerância por substituintes grandes em 2', podem também serusadas na presente invenção.
Além de incorporar seqüências lideres embibliotecas candidatas e polimerases mutantes que promovem aprodução aumentada de transcritos de ácidos nucléicoscontendo nucleotideos modificados em 2' (p.ex., as T7 RNApolimerases mutantes Y639L/H784A e Y639L/H784A/K378R) , osdiversos fatores descritos acima, os quais foramdeterminados serem importantes para as condições detranscrição, podem ser usados para aumentar adicionalmente aprodução de transcritos contendo nucleotideos modificados em 2'.
As seqüências lideres identificadas e as T7 RNApolimerases mutantes Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L,Y639L/K378R, Y639L/H874A, Y639L/H874A/K378R,P266L/Y639L/H784A ou P266L/Y639L/H784A/K378R podem serusadas no SELEX®, com as condições descritas nesse documento,para gerar aptâmeros compreendendo qualquer combinação denucleotideos modificados em 2', p.ex., as modificações com2'-OH, 21-F, 2'-desóxi, 2'-OMe, e 21-NH2 dos nucleotideos deATP, GTP, CTP, TTP, e UTP. Os nucleotideos modificados em2' incorporados são preferivelmente 2'-0-metil nucleotideos.Uma composição de aptâmero compreendendo um ou mais 21 -0-metil nucleotideos é preferida. Uma composição de aptâmerocompreendendo 100% de 21-0-metil purinas e pirimidinas,exceto pelo nucleotideo de partida, é mais preferida. Emuma modalidade preferida, uma das seqüências lideresidentificadas e as T7 RNA polimerases mutantes Y639L/H874A,Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784A ouP266L/Y639L/H784A/K378R são usadas no método SELEX®, com ascondições descritas nesse documento, para gerar produções detranscritos maiores de aptâmeros compreendendo nucleotideosinteiramente com 2'-OMe.
Para a incorporação máxima de 2'-OMe ATP (100%),UTP (100%), CTP (100%) e GTP (100%) (MNA") nos transcritos,as seguintes condições são preferidas: tampão de HEPES a 200mM, DTT a 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 a 10% (p/v) ,Triton X-100 a 0,01% (p/v), MgCl2 a 8 mM, MnCl2 a 2,5 mM,2'-OMe NTP (cada) a 1,5 mM, 21-OH GMP a 1 mM, pH 7,5, T7 RNAPolimerase Y639L/H784A/K378R a 200 nM, 5 unidades/ml depirofosfatase inorgânica, e uma seqüência lider que aumentaa produção de transcrição sob as condições de transcriçãoderivadas. Em uma modalidade, a seqüência lider é umaseqüência lider totalmente de purinas. Em uma outramodalidade, a seqüência lider é uma mistura de purinas epirimidinas. Como usada aqui, uma unidade de pirofosfataseinorgânica é definida como a quantidade de enzima queliberará 1,0 mol de ortofosfato inorgânico por minuto, em pH7,2 e 25 °C.
Química Medicinal dos Aptâmeros
Assim que forem identificados os aptâmeros que seligam a um alvo desejado, diversas técnicas podem seropcionalmente efetuadas para aumentar adicionalmente ascaracter!sticas de ligação e/ou funcionais das seqüências deaptâmeros identificadas. Os aptâmeros, p.ex., os aptâmerosde MNA, que se ligam a um alvo desejado, identificadosatravés do processo SELEX® (p.ex., o método SELEX®Modificado em 2'), podem ser opcionalmente truncados paraobter a seqüência de aptâmeros mínima (também referida aquicomo "construção minimizada") tendo as característicasdesejadas de ligação e/ou funcionais. Um método de efetuarisso é por utilização de programas de duplicação e análiseda seqüência (p.ex., alinhamento de seqüências de clonesresultantes a partir de uma seleção para procurar motivosconservados e/ou co-variação), para informar o projeto dasconstruções minimizadas. Os experimentos bioquímicos desondagem podem também ser efetuados para determinar oslimites em 5' e 3' de uma seqüência de aptâmeros, parainformar o projeto das construções minimizadas. Asconstruções minimizadas podem então ser quimicamentesintetizadas e testadas quanto às características de ligaçãoe funcionais, em comparação com a seqüência não minimizada apartir da qual elas foram derivadas. As variantes de umaseqüência de aptâmeros contendo uma série de deleções em 5' ,3' e/ou internas podem também ser direta e quimicamentesintetizadas e testadas quanto às características de ligaçãoe/ou funcionais, em comparação com a seqüência de aptâmerosnão minimizada a partir da qual elas foram derivadas.
Adicionalmente, as re-seleções dopadas ("dopedreselections") podem ser usadas para explorar as exigênciasdas seqüências dentro de uma única seqüência de aptâmerosativa, tal como um aptâmero de MNA (i.e., um aptâmero que seliga a um alvo desejado identificado através do processoSELEX® (incluindo o processo SELEX® Modificado em 2' ) , ouuma única seqüência de aptâmeros minimizada. As re-seleçõesdopadas são realizadas usando um agrupamento degenerado,sintético, que tenha sido projetado com base na seqüênciaúnica de interesse. 0 nível de degradação normalmente variade 70% a 85% da partir do nucleotídeo do tipo selvagem, i.e.,a seqüência única de interesse. Em geral, as seqüências commutações neutras são identificadas através do processo dere-seleção dopada, porém, em alguns casos, as alterações naseqüência podem resultar em aperfeiçoamentos na afinidade.A informação de seqüência compósita a partir de clonesidentificados usando as re-seleções dopadas pode então serusada para identificar o motivo de ligação mínimo e auxiliarnos esforços da Química Medicinal.
As seqüências de aptâmeros identificadas usando oprocesso SELEX®, tal como os aptâmeros de MNA (incluindo oprocesso SELEX Modificado em 2' e as re-seleções dopadas),e/ou as seqüências de aptâmeros minimizadas podem também seropcionalmente modificadas após seleção SELEX® usando aQuímica Medicinal dos Aptâmeros, para efetuar a mutagênesealeatória ou direcionada da seqüência, para aumentar aafinidade de ligação e/ou as características funcionais, oualternativamente para determinar quais posições na seqüênciasão essenciais para a atividade de ligação e/ou ascaracterísticas funcionais.
A Química Medicinal dos Aptâmeros é uma técnica deaperfeiçoamento dos aptâmeros, na qual grupos de aptâmerosvariantes são quimicamente sintetizados. Esses grupos devariantes tipicamente diferem do aptâmero de origem pelaintrodução de um único substituinte, e diferem um do outropela posição desse substituinte. Essas variantes são entãocomparadas uma com a outra e com a origem. Os
aperfeiçoamentos nas características podem ser profundos osuficiente que a inclusão de um único substituinte pode sertudo que é necessário para obter um critério terapêuticoparticular.
Alternativamente, a informação colhida a partir dogrupo de variantes individuais pode ser usada para projetargrupos adicionais de variantes, em que mais do que umsubstituinte é introduzido simultaneamente. Em umaestratégia de projeto, todas as variantes de um únicosubstituinte são classificadas, as 4 primeiras sãoescolhidas e todas as possíveis combinações duplas (6),triplas (4) e quádruplas (1) dessas 4 variantes de um únicosubstituinte são sintetizadas e testadas. Em uma segundaestratégia de projeto, a melhor variante de um únicosubstituinte é considerada ser a nova origem e todas asvariantes com duplos substituintes possíveis que incluemessa variante de um único substituinte de maiorclassificação são sintetizadas e testadas. Podem ser usadasoutras estratégias, e essas estratégias podem ser aplicadasrepetidamente de modo tal que o número de substituintes sejagradualmente aumentado, ao mesmo tempo continuando aidentificar variantes adicionais aperfeiçoadas.
A Química Medicinal dos Aptâmeros pode ser usadaparticularmente como um método para explorar a introduçãolocal, em vez de global, de substituintes. Porque osaptâmeros são descobertos dentro de bibliotecas que sãogeradas por transcrição, quaisquer substituintes que sejamintroduzidos durante o processo SELEX® devem serintroduzidos globalmente. Por exemplo, se for desejadointroduzir ligações de fosforotioato entre os nucleotídeos,então elas podem somente ser introduzidas em cada A (ou cadaG, C, Τ, U etc.) (globalmente substituídos). Os aptâmerosque requeiram fosforotioatos em algumas As (ou algumas G, C,T, U etc.) (localmente substituídos), porém não podemtolerá-los em outras A, não podem ser prontamentedescobertos por esse processo.
Os tipos de substituintes que podem ser utilizadospelo processo de Química Medicinal dos Aptâmeros estãolimitados somente pela capacidade de gerá-los como reagentesde síntese de fase sólida e introduzi-los em um esquema desíntese de oligômeros. 0 processo certamente não estálimitado aos nucleotídeos sozinhos. Os esquemas da Química.Medicinal dos Aptâmeros podem incluir substituintes queintroduzam volume estérico, hidrofobicidade, hidrofilicidade,lipofilicidade, lipofobicidade, carga positiva, carganegativa, carga neutra, zwitteríons, polarizabilidade,resistência a nucleases, rigidez conformacional,flexibilidade conformacional, características de ligação aproteínas, massa etc. Os esquemas da Química Medicinal dosAptâmeros podem incluir modificações das bases, modificaçõesdos açúcares ou modificações da ligação de fosfodiéster.
Quando considerando os tipos de substituintes quesão prováveis de serem benéficos dentro do contexto de umaptâmero terapêutico, pode ser desejável introduzirsubstituições que incidam em uma ou mais das seguintescategorias:
(1) Substituintes já presentes no corpo, p.ex.,2'-desóxi, 2'-ribo, 2'-0-metil purinas ou pirimidinas ou 5-metil citosina.(2) Substituintes já parte de uma substânciaterapêutica aprovada, p.ex., os oligonucleotideos ligados aofosforotioato.
(3) Substituintes que hidrolisam ou degradam-seaté uma das duas categorias acima descritas, p.ex., osoligonucleotideos ligados ao fosfonato de metila.
(4) Os aptâmeros da presente invenção incluem osaptâmeros desenvolvidos através da química medicinal doaptâmero, como descrito nesse documento.
A afinidade de ligação ao alvo dos aptâmeros dapresente invenção pode ser avaliada através de uma série dereações de ligação entre o aptâmero e o alvo (p.ex., umaproteína) , em que o aptâmero marcado com traço de 32P éincubado com uma série de diluições do alvo em um meiotamponado, então analisado por filtração em nitroceluloseusando um tubo coletor de filtração a vácuo. Referido nessedocumento como o ensaio de ligação por "dot blot", essemétodo utiliza um meio de filtração de três camadas,consistindo (do topo até o fundo) em nitrocelulose, filtrode náilon, e papel blot em gel. 0 RNA que é ligado ao alvoé capturado sobre o filtro de nitrocelulose, enquanto que oRNA não ligado ao alvo é capturado sobre o filtro de náilon.0 papel blot em gel é incluído como um meio de suporte paraos outros filtros. Após a filtração, as camadas do filtrosão separadas, secadas e expostas sobre uma telafosforescente e quantificadas usando um sistema defosforimageamento a partir dela. Os resultadosquantificados podem ser usados para gerar curvas de ligaçãodos aptâmeros a partir das quais as constantes dedissociação (K0) pode ser calculadas. Em uma modalidadepreferida, o meio tamponado usado para efetuar as reações deligação é IX PBS da Dulbecco (com Ca++ e Mg++) mais 0,1 mg/mLde BSA.
Geralmente, a capacidade de um aptâmero de modulara atividade funcional de um alvo, i.e., a atividadefuncional do aptâmero, pode ser avaliada usando modelos invitro e in vivo, que variarão dependendo da função biológicado alvo. Em algumas modalidades, os aptâmeros da presenteinvenção podem inibir uma função biológica conhecida do alvo,enquanto que em outras modalidades, os aptâmeros da invençãopodem estimular uma função biológica conhecida do alvo. Aatividade funcional dos aptâmeros da presente invenção podeser avaliada usando modelos in vitro e in vivo, projetadospara medir uma função conhecida do alvo do aptâmero.
Os aptâmeros da presente invenção podem serrotineiramente adaptados para propósitos diagnósticos deacordo com qualquer número de práticas empregadas poraqueles versados na técnica. A utilização diagnostica podeincluir as aplicações diagnosticas tanto in vivo quanto invitro. Os agentes diagnósticos necessitam somente de seremcapazes de permitir que o usuário identifique a presença deum dado alvo em um local ou uma concentração particular.Simplesmente a capacidade de formar pares de ligação com oalvo pode ser suficiente para desencadear um sinal positivopara propósitos diagnósticos. Aqueles versados na técnicatambém seriam capazes de adaptar qualquer aptâmero porprocedimentos conhecidos na técnica, para incorporar ummarcador de marcação para rastrear a presença de tal ligante.Tal marcador poderia ser usado em diversos procedimentosdiagnósticos.
APTÁMEROS TENDO MOTIVOS IMUNOESTIMULADORES
0 reconhecimento do DNA bacteriano pelo sistemaimunológico do vertebrado é baseado no reconhecimento dedinucleotideos de CG não metilados em contextos particularesda seqüência ("motivos de CpG"). Um receptor que reconhecetal motivo é o receptor similar ao Toll 9 ("TLR 9"), ummembro de uma família de receptores similares ao Toll (~10membros) que participam na resposta imune inata porreconhecimento de componentes microbianos distintos. 0 TLR9 liga seqüências de CpG de oligodesoxinucleotídeos ("ODN")não metiladas em um modo específico para a seqüência. 0reconhecimento de motivos de CpG desencadeia mecanismos dedefesa, resultando em respostas imunes inatas e, no final,adquiridas. Por exemplo, a ativação do TLR 9 em camundongosinduz a ativação de células apresentadoras de antígenos, asupra-regulação das moléculas do MHC das classes Ie II e aexpressão de moléculas e citocinas co-estimuladorasimportantes, incluindo a IL-12 e a IL-23. Essa ativaçãoaumenta tanto direta quanto indiretamente as respostas dascélulas BeT, incluindo a supra-regulação forte do IFN-gamade citocina de THl. Coletivamente, a resposta às seqüênciasde CpG resulta em: proteção contra doenças infecciosas,resposta imune melhorada para as vacinas, uma respostaefetiva contra asma, e citotoxicidade melhorada mediada porcélulas dependentes de anticorpos. Assim, os ODNs de CpGpodem proporcionar proteção contra doenças infecciosas,função como imuno-adjuvantes ou substâncias terapêuticaspara cânceres (monoterapia ou em combinação com um mAb ououtras terapias), e podem diminuir a asma e a respostaalérgica.
Os aptâmeros da presente invenção, p.ex., osaptâmeros de MNA, podem compreender um ou mais CpG ou outraseqüência imunoestimuladora. Tais aptâmeros podem seridentificados ou gerados por uma variedade de estratégiasusando, p.ex., o processo SELEX® descrito nesse documento.Em geral, as estratégias podem ser divididas em dois grupos.No grupo um, as estratégias são dirigidas para identificarou gerar aptâmeros compreendendo tanto um motivo de CpGquanto outra seqüência imunoestimuladora, bem como um sitiode ligação para um alvo, onde o alvo (nas partes que seguem,"alvo que não é de CpG") é um alvo diferente de um sabidoreconhecer os motivos de CpG ou outras seqüênciasimunoestimuladoras e sabido estimular uma respostaimunológica na ligação a um motivo de CpG. A primeiraestratégia desse grupo compreende efetuar o SELEX® paraobter um aptâmero para um alvo que não seja de CpG,especifico, usando um agrupamento de oligonucleotideos, ondeum motivo de CpG tenha sido incorporado em cada membro doagrupamento como, ou como parte de, uma região fixa, p.ex.,em algumas modalidades, a região ao acaso dos membros doagrupamento compreende uma região fixa tendo um motivo deCpG incorporado nela, e identificar um aptâmerocompreendendo um motivo de CpG. A segunda estratégia dessegrupo compreende efetuar o SELEX® para obter um aptâmeropara um alvo que não seja de CpG, especifico,preferivelmente um alvo, e após a seleção, fixar um motivode CpG à extremidade de 5' e/ou 3' ou engenheirar um motivode CpG em uma região, preferivelmente uma região nãoessencial, do aptâmero. A terceira estratégia desse grupocompreende efetuar o SELEX® para obter um aptâmero para umalvo que não seja de CpG, especifico, onde durante a síntesedo agrupamento, a razão molar dos diversos nucleotídeos éinfluenciada em uma ou mais etapas de adição de nucleotídeos,de modo que a região ao acaso de cada membro do agrupamentoesteja enriquecida em motivos de CpG, e identificar umaptâmero compreendendo um motivo de CpG. A quartaestratégia desse grupo compreende efetuar o SELEX® paraobter um aptâmero para um alvo que não seja de CpG,específico, e identificar um aptâmero compreendendo ummotivo de CpG. A quinta estratégia desse grupo compreendeefetuar o SELEX® para obter um aptâmero para um alvo que nãoé de CpG, específico, e identificar um aptâmero que, naligação, estimule uma resposta imune, porém que nãocompreenda um motivo de CpG.
No grupo dois, as estratégias são direcionadaspara identificar ou gerar aptâmeros compreendendo um motivode CpG e/ou outras seqüências que são ligadas pelosreceptores para os motivos de CpG (p.ex., o TLR9 ou outrosreceptores semelhantes ao toll) e, com a ligação, estimulamuma resposta imune. A primeira estratégia desse grupocompreende efetuar o SELEX para obter um aptâmero para umalvo, sabido ligar-se aos motivos de CpG ou outrasseqüências imunoestimuladoras e, com a ligação, estimulamuma resposta imune usando um agrupamento deoligonucleotideos, onde um motivo de CpG tenha sidoincorporado em cada membro do agrupamento como, ou comoparte de, uma região fixa, p.ex., em algumas modalidades, aregião ao acaso dos membros do agrupamento compreende umaregião fixa tendo um motivo de CpG incorporado nela, eidentificar um aptâmero compreendendo um motivo de CpG. Asegunda estratégia desse grupo compreende efetuar o SELEX®para obter um aptâmero para um alvo sabido ligar-se aosmotivos de CpG ou outras seqüências imunoestimuladoras e,com a ligação, estimular uma resposta imune, e então fixarum motivo de CpG à extremidade de 5' e/ou 3' ou engenheirarum motivo de CpG em uma região, preferivelmente uma regiãonão essencial, do aptâmero. A terceira estratégia dessegrupo compreende efetuar o SELEX® para obter um aptâmeropara um alvo, sabido ligar-se aos motivos de CpG ou outrasseqüências imunoestimuladoras e, com a ligação, estimularuma resposta imune, onde durante a síntese do agrupamento, arazão molar dos diversos nucleotídeos é influenciada em umaou mais etapas de adição de nucleotídeos, de modo que aregião ao acaso de cada membro do agrupamento estejaenriquecida em motivos de CpG, e identificar um aptâmerocompreendendo um motivo de CpG. A quarta estratégia dessegrupo compreende efetuar o SELEX® para obter um aptâmeropara um alvo, sabido ligar-se aos motivos de CpG ou outrasseqüências imunoestimuladoras e, com a ligação, estimularuma resposta imune, e identificar um aptâmero compreendendoum motivo de CpG. A quinta estratégia desse grupocompreende efetuar o SELEX® para obter um aptâmero para umalvo, sabido ligar-se aos motivos de CpG ou outrasseqüências imunoestimuladoras, e identificar um aptâmero que,com a ligação, estimula uma resposta imune, porém que nãocompreendem um motivo de CpG.
Uma variedade de diferentes classes de motivos deCpG foi identificada, cada uma resultando em reconhecimentoem uma cascata diferente de eventos, liberação de citocinase outras moléculas, e ativação de certos tipos de células.
Ver, p.ex., CpG Motifs in Bacterial DNA and Their ImmuneEffects, Annu. Rev. Immunol. 2002, 20:709-760, incorporadoaqui por referência. Os motives imunoestimuladoresadicionais são divulgados nas seguintes Patentes U.S., cadauma das quais é incorporada nesse documento por referência:Patente U.S. N2 6.207.646; Patente U.S. N- 6.239.116;Patente U.S. N2 6.429.199; Patente U.S. N2 6.214.806;Patente U.S. N2 6.653.292; Patente U.S. N2 6.426.434;Patente U.S. N2 6.514.948 e Patente U.S. N2 6.498.148.
Quaisquer desses motivos de CpG ou outros motivosimunoestimuladores podem ser incorporados em um aptâmero. Aescolha dos aptâmeros é dependente da doença ou do distúrbioa ser tratado. Os motivos imunoestimuladores preferidos sãocomo a seguir (mostrados 5' até 3', da esquerda paradireita), onde "r" designa uma purina, "y" designa umapirimidina, e "X" designa qualquer nucleotideo: AACGTTCGAG(SEQ ID NO: 136); AACGTT; ACGT, rCGy; rrCGyy, XCGX, XXCGXX,e XiX2CGYiY2, onde Xi é G ou A, X2 não é C, Yi não é G e Y2 épreferivelmente T.
Naqueles casos onde um motivo de CpG forincorporado em um aptâmero que se liga a um alvo especifico,diferente de um alvo sabido ligar-se aos motivos de CpG, e,com a ligação, estimula uma resposta imune (um "alvo que nãoseja de CpG"), o CpG é pref erivelmente posicionado em umaregião não essencial do aptâmero. As regiões não essenciaisdos aptâmeros podem ser identificadas por mutagênese sítio-direcionada, análises de deleção e/ou análises desubstituição. Entretanto, pode ser usada qualquer posiçãoque não interfira significativamente com a capacidade doaptâmero de ligar-se ao alvo que não é de CpG. Além de serincorporado na seqüência de aptâmeros, o motivo de CpG podeser fixado a uma ou a outra, ou a ambas as extremidades de5' e 3' ou de outro modo unido ao aptâmero. Qualquerposição ou meio de ligação pode ser usado, desde que acapacidade do aptâmero de ligar-se ao alvo que não seja deCpG não seja significativamente interferida.
Conforme usado aqui, a "estimulação de umaresposta imune" pode significar (1) a indução de umaresposta especifica (p.ex., a indução de uma resposta deThl) ou da produção de certas moléculas ou (2) a inibição oua supressão de uma resposta especifica (p.ex., a inibição oua supressão da resposta de Th2) ou de certas moléculas.
MODULAÇÃO DA FARMACOCINÉTICA E DA BIODISTRIBUIÇÃODAS SUBSTÂNCIAS TERAPÊUTICAS DE APTÂMEROSÉ importante que as propriedades farmacocinéticaspara todas as substâncias terapêuticas à base deoligonucleotideos, incluindo os aptâmeros, sejam reguladaspara serem compatíveis com a aplicação farmacêutica desejada.
Embora os aptâmeros direcionados contra alvos extracelularesnão sofram de dificuldades associadas com a distribuiçãointracelular (conforme é o caso com as substânciasterapêuticas à base de RNA sem sentido e RNAi) , taisaptâmeros devem ainda ser capazes de ser distribuídos paraórgãos e tecidos-alvo, e permanecer no corpo (nãomodificados) por um período de tempo consistente com oregime de dosagem desejado.
Assim, a presente invenção proporciona materiais emétodos para afetar a farmacocinética das composições deaptâmeros, e, em particular, a capacidade de regular afarmacocinética dos aptâmeros. A capacidade de regulação(i.e., a capacidade de modular) da farmacocinética dosaptâmeros é atingida através da conjugação de porçõesmodificadoras (p.ex., polímeros de PEG) ao aptâmero e/ou daincorporação de nucleotídeos modificados (p.ex., 2'-flúor ou2'-0-metil) para alterar a composição química do ácidonucléico. A capacidade de regular a farmacocinética dosaptâmeros é usada no aperfeiçoamento de aplicaçõesterapêuticas existentes, ou alternativamente, nodesenvolvimento de novas aplicações terapêuticas. Porexemplo, em algumas aplicações terapêuticas, p.ex., nasindicações antineoplásticas ou de cuidado agudo, onde arápida depuração ou desativação da droga possa ser desejada,é desejável diminuir os tempos de residência dos aptâmerosna circulação. Alternativamente, em outras aplicaçõesterapêuticas, p.ex., as terapias de manutenção, onde fordesejada a circulação sistêmica de uma substânciaterapêutica, pode ser desejável aumentar os tempos deresidência dos aptâmeros em circulação.
Além disso, a capacidade de regulação dafarmacocinética dos aptâmeros é usada para modificar abiodistribuição de uma substância terapêutica em um paciente.
Por exemplo, em algumas aplicações terapêuticas, pode serdesejável alterar a biodistribuição de uma substânciaterapêutica de aptâmero em um esforço para alvejar um tipoparticular de tecido ou um órgão especifico (ou conjunto deórgãos). Nessas aplicações, a substância terapêutica deaptâmero preferencialmente acumula-se em um tecido ouórgão(s) especifico(s). Em outras aplicações terapêuticas,pode ser desejável alvejar tecidos que mostrem um marcadorcelular ou um sintoma associado com uma dada doença, lesãocelular ou outra patologia anormal, de modo tal que asubstância terapêutica de aptâmero preferencialmenteacumule-se no tecido afetado. Por exemplo, conformedescrito no pedido provisório dos Estados Unidos N- de Série60/550790, depositado em 5 de março de 2004, e intitulado"Controlled Modulation of the Pharmacokinetics andBiodistribution of Aptamer Therapeutics", e no pedido nãoprovisório dos Estados Unidos N2 de Série 10/---.---,depositado em 7 de março de 2005, e intitulado "ControlledModulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution ofAptamer Therapeutics", a PEGuilação de uma substânciaterapêutica de aptâmero (p.ex., a PEGuilação com um polímerode PEG de 20 kDa) é usada para alvejar tecidos inflamados,de modo tal que a substância terapêutica de aptâmeroPEGuilada preferencialmente acumule-se no tecido inflamado.
Para determinar os perfis de farmacocinética ebiodistribuição das substâncias terapêuticas de aptâmeros(p.ex., os conjugados de aptâmeros ou os aptâmeros tendoquímicas alteradas, tais como os nucleotídeos modificados),uma variedade de parâmetros é monitorada. Tais parâmetrosincluem, por exemplo, a meia-vida (ti/2) , a depuraçãoplasmática (Cl), o volume de distribuição (Vss), a área soba curva de concentração-tempo (AUC), a concentração máximaobservada em soro ou plasma (Cmáx) , e o tempo de residênciamédio (TRM) de uma composição de aptâmero. Conforme usadonesse documento, o termo "AUC" refere-se à área sob ográfico da concentração plasmática de uma substânciaterapêutica de aptâmero versus o tempo após a administraçãodo aptâmero. O valor de AUC é usado para estimar abiodisponibilidade (i.e., a porcentagem de substânciaterapêutica de aptâmero administrada na circulação após aadministração do aptâmero) e/ou a depuração total (Cl) (i.e.,a taxa na qual a substância terapêutica de aptâmero éremovida da circulação) de uma dada substância terapêuticade aptâmero. O volume de distribuição relaciona aconcentração plasmática de uma substância terapêutica deaptâmero com a quantidade de aptâmero presente no corpo.Quanto maior o Vss, mais de um aptâmero é encontrado fora doplasma (i.e., maior o extravasamento).
A presente invenção proporciona materiais emétodos para modular, em um modo controlado, afarmacocinética e a biodistribuição de composições deaptâmeros estabilizadas, p.ex., os aptâmeros de MNA, in vivopor conjugação de um aptâmero, p.ex., um aptâmero de MNA, auma porção moduladora, tal como uma molécula pequena,peptideo, ou grupo terminal de polímero, ou por incorporaçãode nucleotídeos modificados em um aptâmero. Conformedescrito nesse documento, a conjugação de uma porçãomodificadora e/ou a modificação da composição química denucleotídeo(s) altera aspectos fundamentais de tempo deresidência do aptâmero em circulação e distribuição para ostecidos.
Além da depuração pelas nucleases, as substânciasterapêuticas de oligonucleotídeos estão sujeitas àeliminação via filtração renal. Como tal, umoligonucleotídeo resistente a nucleases administrado de modointravenoso tipicamente exibe uma meia-vida in vivo de <10min, a não ser que a filtração possa ser bloqueada. Issopode ser efetuado facilitando a rápida distribuição dacorrente sangüínea para os tecidos ou aumentando o pesomolecular aparente do oligonucleotídeo acima do corte detamanho efetivo para o glomérulo. A conjugação desubstâncias terapêuticas pequenas com um polímero de PEG(PEGuilação), descrita abaixo, pode dramaticamente prolongaros tempos de residência dos aptâmeros em circulação, dessemodo diminuindo a freqüência de dosagem e aumentando aeficácia contra os alvos vasculares.
Os aptâmeros podem ser conjugados a uma variedadede porções modif icadoras, tais como os polímeros de altospesos moleculares, p.ex., o PEG; os peptídeos, p.ex., Tat(um fragmento de 13 aminoácidos da proteína Tat de HIV(Vives, e col. (1997), J. Biol. Chem. 272(25): 16010-7)),Ant (uma seqüência de 16 aminoácidos derivada da terceirahélice da proteína homeótica de Drosophila antennapedia(Pietersz, e col. (2001), Vaccine 19(11-12): 1397-405)) eArg7 (peptídeos de permeação de células positivamentecarregados, curtos, compostos de poliarginina (Arg7)(Rothbard, e col. (2000), Nat. Med. 6(11): 1253-7; Rothbard,J e col. (2002), J. Med. Chem. 45(17): 3612-8)); e asmoléculas pequenas, p.ex., os compostos lipofílicos, taiscomo o colesterol. Entre os diversos conjugados descritosnesse documento, as propriedades in vitro dos aptâmeros sãoalteradas mais profundamente por formação de complexo comgrupos de PEG. Por exemplo, a formação de complexo de umasubstância terapêutica de aptâmero modificada por 2'F e 2'-OMe mista com um polímero de PEG de 20 kDa impede afiltração renal e promove a distribuição de aptâmeros paratecidos tanto saudáveis quanto inflamados. Além disso, oconjugado de polímero de PEG de 20 kDa-aptâmero demonstraser quase tão efetivo quanto um polímero de PEG de 40 kDa naprevenção da filtração renal de aptâmeros. Embora um efeitoda PEGuilação seja sobre a depuração de aptâmeros, aexposição sistêmica prolongada proporcionada pela presençada porção de 20 kDa também facilita a distribuição doaptâraero para os tecidos, particularmente aqueles de órgãosaltamente perfundidos e aqueles no local da inflamação. 0conjugado de aptâmero-polimero de PEG de 20 kDa orienta adistribuição do aptâmero para o local da inflamação, de modotal que o aptâmero PEGuilado preferencialmente acumula-se notecido inflamado. Em algumas situações, o conjugado deaptâmero PEGuilado de 20 kDa é capaz de acessar o interiordas células, tais como, por exemplo, as células dos rins.
Os nucleotideos modificados podem também serusados para modular a depuração plasmática de aptâmeros.
Por exemplo, um aptâmero não conjugado, o qual incorporaquímicas de estabilização tanto de 2'-F quanto de 2'-OMe,que é típico dos aptâmeros de geração atuais, visto que eleexibe um alto grau de estabilidade às nucleases in vitro ein vivo, mostra perda rápida do plasma (i.e., rápidadepuração plasmática) e uma rápida distribuição para ostecidos, principalmente para o rim, quando comparado aoaptâmero não modificado.
ÁCIDOS NUCLÉICOS DERIVADOS COM PEG
Conforme descrito acima, a derivação de ácidosnucléicos com polímeros não imunogênicos de altos pesosmoleculares tem o potencial de alterar as propriedadesfarmacocinéticas e farmacodinâmicas dos ácidos nucléicos,tornando-os agentes terapêuticos mais efetivos. Asalterações favoráveis na atividade podem incluir aresistência aumentada à degradação por nucleases, afiltração diminuída através dos rins, a exposição diminuídaao sistema imunológico, e a distribuição alterada dasubstância terapêutica através do corpo.
As composições de aptâmeros da invenção podem serderivadas com porções de polialquileno glicol ("PAG"). Osexemplos de ácidos nucléicos derivados com PAG sãoencontrados no Pedido de Patente dos Estados Unidos N2 deSérie 10/718.833, depositado em 21 de novembro de 2003, queé aqui incorporado por referência em sua totalidade. Ospolímeros típicos usados na invenção incluem o polietilenoglicol ("PEG"), também conhecido como poli(óxido de etileno)("PEO"), e o polipropileno glicol (incluindo o poliisopropileno glicol). Adicionalmente, os copolímerosaleatórios ou em blocos de diferentes óxidos de alquileno(p.ex., o óxido de etileno e o óxido de propileno) podem serusados em muitas aplicações. Na sua forma mais comum, umpolialquileno glicol, tal como o PEG, é um polímero linearterminado em cada extremidade com grupos hidroxila: HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH. Esse polímero, alfa-, ômega-diidroxilpolietileno glicol, pode também ser representadocomo HO-PEG-OH, onde se entende que o símbolo —PEG-representa a seguinte unidade estrutural: -CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-, onde η tipicamente varia de cerca de 4 acerca de 10.000.
Conforme mostrado, a molécula de PEG é di-funcional e é, algumas vezes, referida como "PEG diol". Asporções terminais da molécula de PEG são porções dehidroxila relativamente não reativas, os grupos -0H, quepodem ser ativadas, ou convertidas em porções funcionais,para a ligação do PEG a outros compostos em locais reativossobre o composto. Tais PEG dióis ativados são referidosnesse documento como PEGs bi-ativados. Por exemplo, asporções terminais do PEG diol têm sido funcionalizadas comoéster de carbonato ativo, para a reação seletiva com asporções de amino, por substituição das porções de hidroxilarelativamente não reativas, -0H, com as porções de éster desuccinimidila ativas a partir da N-hidróxi succinimida.
Em muitas aplicações, é desejável recobrir amolécula de PEG sobre uma extremidade com uma porçãoessencialmente não reativa, de modo que a molécula de PEGseja mono-funcional (ou mono-ativada) . No caso dassubstâncias terapêuticas protéicas, as quais geralmentemostram múltiplos locais de reação para os PEGs ativados, osPEGs ativados bi-funcionais resultam em reticulação ampla,produzindo agregados insatisfatoriamente funcionais. Paragerar PEGs mono-ativados, uma porção de hidroxila sobre aextremidade da molécula de PEG diol tipicamente ésubstituída com a porção de metóxi não reativa naextremidade, -OCH3. A outra extremidade não recoberta damolécula de PEG tipicamente é convertida em uma porçãoreativa na extremidade que pode ser ativada para a ligaçãoem um local reativo sobre uma superfície ou uma molécula,tal como uma proteína.
Os PAGs são polímeros que tipicamente têm aspropriedades de solubilidade em água e em muitos solventesorgânicos, ausência de toxicidade, e ausência deimunogenicidade. Um uso dos PAGs é para unir covalentementeo polímero às moléculas insolúveis para tornar solúvel o"conjugado" resultante de PAG-moléculas. Por exemplo, foimostrado que a droga paclitaxel insolúvel em água, quandoacoplada ao PEG, torna-se solúvel em água. Greenwald, ecol., J. Org. Chem., 60:331-336 (1995). Os conjugados dePAG são freqüentemente usados não somente para aumentar asolubilidade e a estabilidade, como também para prolongar ameia-vida de circulação no sangue das moléculas.
Os compostos polialquilados da invenção sãotipicamente entre 5 e 80 kDa de tamanho, entretanto,qualquer tamanho pode ser usado, a escolha dependente doaptâmero e da aplicação. Os outros compostos de PAG dainvenção são entre 10 e 80 kDa de tamanho. Ainda outroscompostos de PAG da invenção são entre 10 e 60 kDa detamanho. Por exemplo, um polímero de PAG pode ser pelomenos 10, 20, 30, 40, 50, 60, ou 80 kDa de tamanho. Taispolímeros podem ser lineares ou ramificados. Em algumasmodalidades, os polímeros são o PEG.
Em contraste com as substâncias terapêuticasprotéicas biologicamente expressas, as substânciasterapêuticas de ácidos nucléicos são típica e quimicamentesintetizadas a partir de nucleotídeos de monômeros ativados.
Os conjugados de PEG-ácido nucléico podem ser preparados porincorporação do PEG usando a mesma síntese de monômeroiterativa. Por exemplo, os PEGs ativados por conversão emuma forma de fosforamidita podem ser incorporados na síntesede oligonucleotídeos em fase sólida. Alternativamente, asíntese de oligonucleotídeos pode ser completada com aincorporação específica para o sítio de um sítio de união aoPEG reativo. Mais comumente, isso tem sido efetuado poradição de uma amina primária livre na extremidade de 5'(incorporada usando uma fosforamidita modificadora na últimaetapa de combinação da síntese em fase sólida). Usando essaabordagem, um PEG reativo (p.ex., um que seja ativado demodo que ele reagirá e formará uma ligação com uma amina) écombinado com o oligonucleotídeo purificado e a reação decombinação é efetuada em solução.
A capacidade da conjugação do PEG de alterar abiodistribuição de uma substância terapêutica estárelacionada com diversos fatores, incluindo o tamanhoaparente (p.ex., conforme medido em termos de raiohidrodinâmico) do conjugado. Os conjugados maiores (>10kDa) são sabidos bloquear mais efetivamente a filtração viao rim e, consequentemente, aumentar a meia-vida em soro daspequenas macromoléculas (p.ex., os peptídeos, osoligonucleotídeos sem sentido). A capacidade dos conjugadosde PEG de bloquear a filtração foi mostrada aumentar com otamanho do PEG até aproximadamente 50 kDa (os aumentosadicionais têm efeito benéfico mínimo, visto que a meia-vidatorna-se definida pelo metabolismo mediado por macrófagos,em vez de por eliminação via os rins).
A produção de PEGs de altos pesos moleculares (>10kDa) pode ser difícil, ineficiente, e cara. Como uma rotapara a síntese de conjugados de PEG de alto peso molecular-ácido nucléico, um trabalho anterior concentrou-se para ageração de PEGs ativados de pesos moleculares mais elevados.Um método para gerar tais moléculas envolve a formação de umPEG ativado ramificado, no qual dois ou mais PEGs estãounidos a um núcleo central que carrega o grupo ativado. Asporções terminais dessas moléculas de PEG de pesosmoleculares mais elevados, i.e., as porções de hidroxila (-OH) relativamente não reativas, podem ser ativadas, ouconvertidas em porções funcionais, para a união de um oumais dos PEGs a outros compostos, em locais reativos sobre ocomposto. Os PEGs ativados ramificados terão mais do queduas extremidades, e nos casos onde duas ou maisextremidades tiverem sido ativadas, tais moléculas de PEG depesos moleculares mais elevados, ativadas, são referidasnesse documento como PEGs multi-ativados. Em alguns casos,nem todas as extremidades em uma molécula de PEG ramificadaestão ativadas. Nos casos onde quaisquer duas extremidadesde uma molécula de PEG ramificada estiverem ativadas, taismoléculas de PEG são referidas como PEGs bi-ativados. Emalguns casos onde somente uma extremidade em uma molécula dePEG ramificada estiver ativada, tais moléculas de PEG sãoreferidas como mono-ativadas. Como um exemplo dessaabordagem, foi descrito um PEG ativado preparado pela uniãode dois monometóxi PEGs a um núcleo de lisina, que ésubseqüentemente ativado para a reação (Harris e col.,Nature, vol. 2: 214-221, 2003).
A presente invenção proporciona uma outra rota decusto efetivo para a síntese de conjugados de PEG de altopeso molecular-ácido nucléico (preferivelmente, o aptâmero),incluindo multiplicar os ácidos nucléicos PEGuilados. Apresente invenção também inclui oligonucleotídeosmultiméricos ligados ao PEG p.ex., os aptâmeros dimerizados.
A presente invenção também diz respeito às composições dealtos pesos moleculares onde uma porção estabilizante de PEGé um ligador que separa diferentes porções de um aptâmero,p.ex., o PEG conjugado dentro de uma única seqüência deaptâmeros, de modo tal que o arranjo linear da composição deaptâmero de alto peso molecular seja, p.ex., ácido nucléico- PEG - ácido nucléico (- PEG - ácido nucléico) n, onde η émaior do que, ou igual a, 1.
As composições de altos pesos moleculares dainvenção incluem aquelas tendo um peso molecular de pelomenos 10 kDa. As composições tipicamente têm um pesomolecular entre 10 e 80 kDa de tamanho. As composições dealtos pesos moleculares da invenção são pelo menos 10, 20,30, 40, 50, 60, ou 80 kDa de tamanho.
Uma porção estabilizante é uma molécula, ou porçãode uma molécula, que aperfeiçoa as propriedadesfarmacocinéticas e farmacodinâmicas das composições deaptâmeros de altos pesos moleculares da invenção. Em algunscasos, uma porção estabilizante é uma molécula ou porção deuma molécula que coloca dois ou mais aptâmeros, ou domíniosde aptâmeros, em proximidade, ou proporciona liberdaderotacional global diminuída das composições de aptâmeros dealtos pesos moleculares da invenção. Uma porçãoestabilizante pode ser um polialquileno glicol, tal como umpolietileno glicol, que pode ser linear ou ramificado, umhomopolímero ou um heteropolímero. As outras porçõesestabilizantes incluem polímeros tais como os ácidosnucléicos de peptídeos (PNA). Os oligonucleotideos podemtambém ser porções estabilizantes; tais oligonucleotideospodem incluir nucleotideos modificados, e/ou ligaçõesmodificadas, tais como os fosforotioatos. Uma porçãoestabilizante pode ser uma parte integral de uma composiçãode aptâmero, i.e., ela está covalentemente ligada aoaptâmero.
As composições da invenção incluem as composiçõesde aptâmeros de altos pesos moleculares nas quais duas oumais porções de ácidos nucléicos estão covalentementeconjugadas a pelo menos uma porção de polialquileno glicol.
As porções de polialquileno glicol servem como porçõesestabilizantes. Nas composições onde uma porção de
polialquileno glicol estiver covalentemente ligada, emqualquer extremidade, a um aptâmero, de modo tal que opolialquileno glicol una as porções de ácidos nucléicosconjuntamente em uma molécula, o polialquileno glicol é ditoser uma porção ligadora. Em tais composições, a estruturaprimária da molécula covalente inclui o arranjo linear ácidonucléico-PAG-ácido nucléico. Um exemplo é uma composiçãotendo a estrutura primária ácido nucléico-PEG-ácido nucléico.
Um outro exemplo é um arranjo linear de: ácido nucléico —PEG — ácido nucléico — PEG — ácido nucléico.
Para produzir o conjugado de ácidonucléico—PEG—ácido nucléico, o ácido nucléico éoriginalmente sintetizado de modo tal que ele contenha umúnico local reativo (p.ex., ele é mono-ativado) . Em umamodalidade preferida, esse local reativo é um grupo aminointroduzido na extremidade de 5' por adição de umafosforamidita modificadora como a última etapa na síntese emfase sólida do oligonucleotídeo. Após a desproteção e apurificação do oligonucleotídeo modificado, ele éreconstituído em alta concentração em uma solução queminimiza a hidrólise espontânea do PEG ativado. Em umamodalidade preferida, a concentração de oligonucleotídeo é 1mM e a solução reconstituída contém tampão de NaHCO3 a 200mM, pH 8,3. A síntese do conjugado é iniciada por adição emetapas, lenta, de PEG bi-funcional altamente purificado. Emuma modalidade preferida, o PEG diol é ativado em ambas asextremidades (bi-ativado) por derivação com propionato desuccinimidila. Seguindo a reação, o conjugado de PEG-ácidonucléico é purificado por eletroforese em gel oucromatografia líquida para separar as espécies inteiramenteconjugadas, parcialmente conjugadas, e não conjugadas. Asmúltiplas moléculas de PAG concatenadas (p.ex., comocopolímeros aleatórios ou em blocos) ou as cadeias de PAGmenores podem ser ligadas para obter diversos comprimentos(ou pesos moleculares). Ligadores que não sejam de PAG podemser usados entre as cadeias de PAG de comprimentos variados.
As modificações de nucleotídeos com 2'-0-metil,2'-flúor e outras modificações de nucleotídeos modificadosestabilizam o aptâmero contra as nucleases e aumentam a suameia-vida in vivo. 0 quepi de 3'-3'-dT também aumenta aresistência à exonuclease. Ver, p.ex., as Patentes U.S.5.674.685; 5.668.264; 6.207.816; e 6.229.002, cada uma dasquais é incorporada por referência nesse documento em suatotalidade.
DERIVAÇÃO COM PAG DE UM ÁCIDO NUCLÉICO REATIVO
Os conjugados de PAG de alto peso molecular-ácidonucléico-PAG podem ser preparados por reação de um PEGativado mono-funcional com um ácido nucléico contendo maisdo que um local reativo. Em uma modalidade, o ácidonucléico é bi-reativo, ou bi-ativado, e contém dois locaisreativos: um grupo 5'-amino e um grupo 3'-amino introduzidosno oligonucleotideo através de síntese convencional defosforamidita, por exemplo: a 31-5'-di-PEGuilação comoilustrada na Figura 13. Nas modalidades alternativas, oslocais reativos podem ser introduzidos em posições internas,usando, por exemplo, a posição 5 das pirimidinas, a posição8 das purinas, ou a posição 2' da ribose como locais para aunião de aminas primárias. Ern tais modalidades, o ácidonucléico pode ter diversos locais ativados ou reativos e édito ser multiplamente ativado. Seguindo a síntese e apurificação, o oligonucleotideo modificado é combinado com oPEG mono-ativado, sob condições que promovam a reaçãoseletiva com os locais reativos do oligonucleotideo, aomesmo tempo minimizando a hidrólise espontânea. Namodalidade preferida, o monometóxi-PEG é ativado com opropionato de succinimidila e a reação combinadai é efetuadaem pH 8,3. Para orientar a síntese do PEG bi-substituído,proporciona-se PEG em excesso estequiométrico em relação aooligonucleotideo. Após a reação, o conjugado de PEG-ácidonucléico é purificado por eletroforese em gel oucromatografia líquida para separar as espécies inteiramenteconjugadas, parcialmente conjugadas, e não conjugadas.
Os domínios de ligação podem também ter uma oumais porções de polialquileno glicol unidas a eles. TaisPAGs podem ser de comprimentos variados e podem ser usadosem combinações apropriadas para obter o peso moleculardesejado da composição.
O efeito de um ligador particular pode serinfluenciado tanto por sua composição química quanto pelocomprimento. Um ligador que seja muito longo, muito curto,ou forme interações estéricas e/ou iônicas desfavoráveis como alvo impedirá a formação de complexo entre o aptâmero e oalvo. Um ligador, o qual é mais longo do que o necessáriopara transpor a distância entre os ácidos nucléicos, podereduzir a estabilidade de ligação por diminuição da- concentração efetiva do ligante. Assim, é freqüentementenecessário otimizar as composições e os comprimentos dosligadores para maximizar a afinidade de um aptâmero a umalvo.
Todas as publicações e documentos de patentescitados nesse documento são incorporados aqui por referênciacomo se cada tal publicação ou documento fosse específica eindividualmente indicado para ser incorporado nessedocumento por referência. A citação de publicações edocumentos de patentes não é pretendida como uma aceitaçãoque algum seja anterioridade pertinente, nem constituiqualquer aceitação quanto aos conteúdos ou data deles. Ainvenção tendo agora sido descrita como descrição escrita,aqueles de habilidade na técnica reconhecerão que a invençãopode ser praticada em uma variedade de modalidades e que adescrição precedente e os exemplos abaixo são parapropósitos de ilustração e não limitação das reivindicaçõesque se seguem.
Todas as publicações e documentos de patentescitados nesse documento são incorporados aqui por referênciacomo se cada tal publicação ou documento fosse especifica eindividualmente indicado para ser incorporado nessedocumento por referência. A citação de publicações edocumentos de patentes não é pretendida como uma aceitaçãoque algum seja anterioridade pertinente, nem constituiqualquer aceitação quanto aos conteúdos ou data deles. Ainvenção tendo agora sido descrita como descrição escrita,aqueles de habilidade na técnica reconhecerão que a invençãopode ser praticada em uma variedade de modalidades e que adescrição precedente e os exemplos abaixo são parapropósitos de ilustração e não limitação das reivindicaçõesque se seguem.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DE SEQÜÊNCIAS LÍDERES EM
5' USANDO O MÉTODO TR-SELEX®
Uma biblioteca de DNA degenerado, com o seguinteprojeto (mostrado na direção 5' para 3'):
Promotor de T7 / G4 / 20 nucleotideos degenerados/ Seqüência fixa em 3' foi sintetizada com a seguinteseqüência:
5'TAATACGACTCACTATAGGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT3' (ARC1140, SEQ ID NO 7)).Essa biblioteca foi amplificada usando o primer em3' AGCTAGCTTACTGCATCGAC (SEQ ID NO 104) e o primer em 5'TAATACGACTCACTATAG (SEQ ID NO 105) . A biblioteca de fitadupla foi então transcrita usando IX Tampão de Transcrição(HEPES a 200 mM, DTT a 40 mM, espermidina a 2 mM, Triton X-100 a 0,01%), a 37°C, durante a noite, sob as seguintescondições: 2'-OMe ATP CTP, ÜTP, GTP a 1 mM cada, 2'-OH GTP a30 μΜ, MgCl2 a 6,5 mM, MnCl2 a 2,0 mM, 10% p/v de PEG-8000,GMP a 1 mM, 0,5 unidade de pirofosfatase inorgânica por 100μΙ, de reação, e T7 RNA polimerase Y639F/H784A/K378R a 200 nM.
A mistura resultante foi então precipitada(isopropanol, cloreto de sódio, EDTA), purificada em gel(10% de PAGE), excisada e extraída do gel, tratada com DNase(RQ1, Promega, Madison WI), transcrita invertida a 65°C(Thermoscript, Invitrogen, Carlsbad, CA) usando o primer em3' usado para a PCR, e diluída diretamente para uma reaçãode ligação com esplinte com os seguintes nucleotídeos.
Oligonucleotideo 5' fosforilado codificando umpromotor de T7 (onde ρ significa a fosforilação em 5'):
pTATAGTGAGTCGTATTA 3' (SEQ ID NO 8)Esplinte para a ligação:51TAATACGACTCACTATAGGGG 3' (SEQ ID NO 9)
Essa mistura foi desnaturada por calor, anelada, eentão a T4 DNA ligase (NEB, Beverley MA) foi adicionada,seguida por incubação a 16°C durante a noite. Subseqüente àetapa de ligação, a reação foi diretamente diluída para umaPCR, com os primers já descritos, para amplificar asseqüências transcritas para a entrada na rodada seguinte dométodo SELEX®. Esse esquema é apresentado na Figura 2.
Após três rodadas de seleção por TR-SELEX®, abiblioteca foi clonada usando um kit de clonagem TOPO TAconforme instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA),seqüenciada, e a estatística da ocorrência de nucleotídeo naregião degenerada foi analisada. Os clones individuaisforam avaliados através de análise por PAGE-gel quanto à suacapacidade de moldar a transcrição de grandes concentraçõesde transcrito, e as seqüências daqueles que produziram asmaiores produções de transcrito foram então utilizadas noprojeto de bibliotecas, que foram, por sua vez, testadasatravés de análise por gel quanto à sua capacidade de moldara transcrição de altas produções de transcrito. A Figura 3mostra a porcentagem média da composição de nucleotídeo deregiões das 20 posições degeneradas antes e depois de 3rodadas da seleção por TR-SELEX®. Conforme indicado pelaFigura 3, uma forte preferência por G das posições 5 a 13 notranscrito (1 a 9 na região degenerada) foi transcrita,depois nenhum nucleotídeo é preferencialmente transcrito.
Os clones descobertos por seqüenciamento após 3Rodadas da seleção por TR-SELEX® foram classificados atravésde análise por PAGE-gel quanto à sua capacidade detranscrever os 21-OMe nucleotídeos usando molde a ~200 nM,IX Tampão de Transcrição (HEPES a 200 mM, DTT a 40 mM,espermidina a 2 mM, Triton X-100 a 0,01%), 2'-OMe ATP CTP,UTP, GTP a 1 mM cada, 2'-OH GTP a 30 uM, MgCl2 a 6,5 mM,MnCl2 a 2,0 mM, 10% p/v de PEG-8000, GMP a 1 mM, 0,5 unidadede pirofosfatase inorgânica por 100 μL de reação, e T7 RNApolimerase mutante Y639F/H784A/K378R a 200 nM, a 37°C,durante a noite. Um exemplo de um clone da Rodada 3, o cloneAMX411.D6, deu significativamente mais transcrito de MNA,conforme visualizado por PAGE-gel, quando comparado aosclones da Rodada 0. As seqüências de DNA dos clones geradosa partir da Rodada 3 são listadas abaixo (todas asseqüências listadas estão na direção 5'-3'):
SEQ ID NO 10 >AMX(411)_A1 ARC 1140 Rd 3_4Il-Al
TAATACGACTCACTATAGGGGGTGGGGCCAATGGCGGGATATACGTAACCGGTTATACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 11 >AMX(411)_B1 ARC 1140 Rd 3_411-B1
TAATACGACTCACTATAGGGGATGTACATATGTATTCGTGACGTGACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 12 >AMX(411)_C1 ARC 1140 Rd 3_411-C1TAATACGACTCACTATAGGGGGAGCGGGGAGACGTAGTCATCACGTAGCCGGTTAAACCC
GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 13 >AMX(411)_D1 ARC 1140 Rd 3_411-D1
TAATACNACTCACTATAGGGGGTGGGGGTGGTGGTGATAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 14 >AMX(411)_E1 ARC 1140 Rd 3_411-E1
TAATACGACTCACTATAGGGGGGTGTCACCAGATATGCCTTGAACGTAACCCGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 15 >AMX(411)_F1 ARC 1140 Rd 3_411-F1
TAATACGACTCACTATAGGGGGTAGGGGGCACGCACTAACCAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 16 >AMX(411)_G1 ARC 1140 Rd 3_411-G1
TAATACGACTCACTATAGGGGGAGGGGGTGCTGACCNCAAACA
SEQ ID NO 17 >AMX(411) Hl ARC 1140 Rd 3 411-H1TAATACGACTCACTATAGGGGTGGGGCTCGGATGAGACAATACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 18 >ΑΜΧ(411)_Α2 ARC 1140 Rd 3_411-Α2TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGTGGGTAGGCGAGCACTCCACGTAACCAGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 19 >ΑΜΧ(411)_Β2 ARC 1140 Rd 3_411-Β2TAATACGACTCACTATAGGGGGGAAGGACGAGCAGACGAGCAACGTAACCTGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 20 >AMX(411)_C2 ARC 1140 Rd 3_411-C2TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGCGGTTAGAGTGTAAGTACCGACGTAACCGGTTAAA
CCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 21 >AMX(411)_D2 ARC 1140 Rd 3_411-D2TAATACGACTCACTATAGGGGGGTTGCTGTTAGTAACGCCACGTAACCGGTTAAACTTGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 22 >AMX(411)_E2 ARC 1140 Rd 3_411-E2
TAATACGACTCACTATAGGGGGGCGGGAGAATGTTATATAGTTACGGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 23 >AMX(411)_F2 ARC 1140 Rd 3_411-F2TAATACGACTCACTATAGGGGAAAGGGGCGGTATGGTACACACGTAACAGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 24 >AMX(411)_G2 ARC 1140 Rd 3_411-G2TAATACGACTCACTATAGGGGGGACGTGTTAGCATTCCAGAATTCGTAACCTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 25 >AMX(411)_H2 ARC 1140 Rd 3_411-H2
TAATACGACTCACTATAGGGGGCGTGGGAGATAGGTTCAAGGACGTACCGGTTATACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 26 >AMX(411)_A3 ARC 1140 Rd 3_411-A3
TAATACGACTCACTATAGGGGGGCTCCGTGCTATCGTCGGATAACGTAACCCGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 27 >ΑΜΧ(411)_Β3 ARC 1140 Rd 3_411-Β3TAATACGACTCACTATAGGGGGGGAGAAGGTCTTAAGGTCGCCAACGTAACTGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 28 >AMX(411)_C3 ARC 1140 Rd 3_411-C3TAATACGACTCACTATAGGGGGGGCATACGAGTTTAGGTGGAGACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 29 >AMX(411)_D3 ARC 1140 Rd 3_411-D3TAATACGACTCACTATAGGGGGATGATGACTTCCGCGTTAATACGTTACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 30 >AMX(411)_E3 ARC 1140 Rd 3_411-E3TAATACGACTCACTATAGGGGTGGGACGCCGTCTGAGTATAACGTACCCGGTCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 31 >AMX(411)_G3 ARC 1140 Rd 3_411-G3TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGGACGTAATCGGCTATCGTTCACCGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAAGGGCGA
SEQ ID NO 32 >AMX(411)_H3 ARC 1140 Rd 3_411-H3TAATACGACTCACTATAGGGTGGGACGGGCAGCGTGGATGTAGGACGTAACCGGTTAAACGCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 33 >AMX(411)_A4 ARC 1140 Rd 3_411-A4TAATACGACTCACTATAGGGGGGTTTGTCTGAAGTGAAGCAGAACGTAACCGGTTAATCCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 34 >AMX(411)_B4 ARC 1140 Rd 3_411-B4TAATACGACTCACTATAGGGGGGGAGGGCACATCATCGTATCAAACGTAACCAGTTAATCCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 35 >AMX(411)_C4 ARC 1140 Rd 3_411-C4TAATACGACTCACTATAGGGGAGGCTAGAGGACGCGACAGAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQ ID NO 36 >AMX(411)_D4 ARC 1140 Rd 3_411-D4TAATACGACTCACTATAGGGGGCGATCGCGAAGGGATTTCAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 37 >AMX(411)_E4 ARC 1140 Rd 3_411-E4TAATACGACTCACTATAGGGGGGTAGGGAAAGATTACGGGGCTACGTAACCGGTTATACC
TGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 38 >AMX(411)_F4 ARC 1140 Rd 3_411-F4TAATACGACTCACTATAGGGGTGGCTATGGCTAACACGTAACCGGTTATACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 39 >AMX(411)_G4 ARC 1140 Rd 3_411-G4
TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGCGGTGGCTGTGCAAGCGGAAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 40 >AMX(411)_H4 ARC 1140 Rd 3_411-H4TAATACGACTCACTATAGGGGGGTGGGGGCACGGTACTGAGTTACGTTACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 41 >AMX(411)_A5 ARC 1140 Rd 3_411-A5TAATACGACTCACTATAGGGGGGAGTGGGGACAATTAGAAGATGACGTAACCGTCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 42 >AMX(411)_B5 ARC 1140 Rd 3_411-B5TAATACNACTCACTATAGGGGTGCAGTGAGGAGCGACNAGTACGTTACCGGTTAAATCCG
AGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 43 >AMX(411)_C5 ARC 1140 Rd 3_411-C5
TAATACNACTCACTATAGGGGGACGGGCACTGTGGATGATTTAACGTTACCGGTTAAACCCGAGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 44 >AMX(411)_D5 ARC 1140 Rd 3_411-D5
TAATACNACTCACTATAGGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQ ID NO 45 >AMX(411)_E5 ARC 1140 Rd 3_411-E5
T AATACNACTCACTATAGGGGGTGATATTGACCTCTAACAGCACGTAACCGGTT AAACCCGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 46 >ΑΜΧ(411)_F5 ARC 1140 Rd 3_411-F5TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGTGCAGAGGATGCATCCAAGCTCGTAATCGGTGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 47 >AMX(411)_G5 ARC 1140 Rd 3_411-G5TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGCGGGTGCTUGTGCCTAATCACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 48 >AMX(411)_H5 ARC 1140 Rd 3_411-H5TAATACGACTCACTATAGGGGTTTGGTAATCGAACGTGGAACGCAACCGGTTTAACCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 49 >AMX(411)_A6 ARC 1140 Rd 3_411-A6TAATACGACTCACTATAGGGGGGATGGAAGAGGCTTGATATCACGTAACCGGTTAAACCTGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 50 >AMX(411)_B6 ARC 1140 Rd 3_411-B6TAATACGACTCACTATAGGGGGTTATACTAACTCTGTACACAACGTAACCGGCeGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 51 >AMX(411)_C6 ARC 1140 Rd 3_411-C6TAATACGACTCACTATAGGGGTATAGGGGGGGTATCGGTGTACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 52 >AMX(411)_D6 ARC 1140 Rd 3_411-D6TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAAGGTTCCGAGAACGCGACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 53 >AMX(41 1)_E6 ARC 1140 Rd 3_411-E6TAATACGACTCACTATAGGGGTGCGCGGTTACAAGGCAACATACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 54 >AMX(411)_F6 ARC 1140 Rd 3_411-F6TAATACNACTCACTATAGGGGGGACGGGGTGACAAAGTGTCNAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQ ID NO 55>AMX(411)_G6 ARC 1140 Rd 3_411-G6TAATACGACTCACTATAGGGGAGACGGCGGTACAAGTCCATATGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 56 >AMX(411)_H6 ARC 1140 Rd 3_411-H6TAATACGACTCACTATAGGGGAGTGGGGGCTTCTCGTTGCCACGTAACCGCTTAAACCCG
GGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 57 >AMX(423)_A7 ARC 1140 R3_423-A7TAATACGACTCACTATAGGGGGGCTGAGCGTGTTTGAGGGACCACGTTACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 58 >AMX(423)_B7 ARC 1140 R3_423-B7TAATACGACTCACTATAGGGGGGTGGGCGCAATGAAAAGTTGGGCGTAACCGGTTCAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ LD NO 59 >AMX(423)_C7 ARC 1140 R3_423-C7TAATACGACTCACTATAGGGGGTAGTGAAGTAAGGCAGTGTTACGTAACCGGTGAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 60 >AMX(423)_D7 ARC 1140 R3_423-D7TAATACGACTCACTATAGGGGGGAGGGTGGGCTAGAACACACAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 61 >AMX(423)_E7 ARC 1140 R3_423-E7TAATACGACTCACTATAGGGGGGGAGAGAGGCGGTTACGTAGGGACGTTACCGATTGAAC
TCAGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 62 >AMX(423)_F7 ARC 1140 R3_423-F7
TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGGCGAATAGGTAGGGCGACGAACGTTACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQ ID NO 63 >AMX(423)_G7 ARC 1140 R3_423-G7
TAATACGACTCACTATAGGGGGAGAGGAGGTCCGGCTAGACAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 64 >ΑΜΧ(423) H7 ARC 1140 R3 423-H7TAATACGACTCACTATAGGGGGGAGGACGGGTCGTACTGTTAAACCTGGGTCGATGCAGT
AAGCTAGCT
SEQ ID NO 65 >ΑΜΧ(423)_Β8 ARC 1140 R3_423-B8TAATACGACTCACTATAGGGGGCGCAACAACGGGAAGTATACGTAACCGGTTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 66 >ΑΜΧ(4 23)_C8 ARC 1140 R3_423-C8TAATACGACTCACTATAGGGGGAAGGAACACGCACATGCATAACGTAACTGGTTGACCCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 67 >AMX(423)_D8 ARC 1140 R3_423-D8TAATACGACTCACTATAGGGGAGTGGGGAGTACTGTGGACAACGTGACCGGTTAAACCCG
GGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 68 >AMX(423)_E8 ARC 1140 R3_423-E8
TAATACGACTCACTATAGGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 69 >AMX(423)_F8 ARC 1140 R3_423-F8
TAATACGAÇTCACTATAGGGGGGGGGGCTAGGGCGGTCGGATCGGACGTAACCAGTTAAA-
CCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 70 >AMX(423)_G8 ARC 1140 R3_423-G8TAATACGACTCACTATAGGGGGGGTGGGGGTTGCTACATGCCCTCGTAACCGGTTAAGCCCAGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 71 >AMX(423)_H8 ARC 1140 R3_423-H8
TAATACGACTCACTATAGGGGGGTGGCGACGATGGAGAGAATAACGTAATCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 72 >AMX(423)_A9 ARC 1140 R3_423-A9TAATACGACTCACTATAGGGGGTAGGCGGGCCTCATCAACAACGCAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 73 >AMX(423)_B9 ARC 1140 R3_423-B9
TAATACGACTCACTATAGGGGGTGGCTGGTAAGGACACAAACACGTAACTCGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQ ID NO 74 >AMX(423)_C9 ARC 1140 R3_423-C9TAATACGACTCACTATAGGGGGGCGGGCAGCGCTTATAGATCCACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 75 >AMX(423)_D9 ARC 1140 R3_423-D9TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGTATCTGCGGTTAGGCTATCGACGTACCCAGTTAA
ACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 76 >AMX(423)_F9 ARC 1140 R3_423-F9TAATACGACTCACTATAGGGGGGGTAGGGGACATCATAGGTATACGTAACCGGTTAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 77 >AMX(423)_H9 ARC 1140 R3_423-H9
TAATACGACTCACTATAGGGGCGCGTGCGTGTATCCATTAAACGTGACTGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 78 >AMX(423)_A10 ALRC 1140 R3_423-A10TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGAGCGTGGATCTTGAGTGTATACGTAACCGGTTAAACCCGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 79 >AMX(423)_B10 ARC 1140 R3_423-B10TAATACGACTCACTATAGGGGATGGAGAGGAGTGTACGCATATACAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 80 >AMX(423)_C10 ARC 1140 R3_423-C10TAATACGACTCACTATAGGGGCGGGTGGTCGCGATGGTTAACGTAACTGGTTAAACCCGG
GTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 81 >AMX(423)_D10 ARC 1140 R3_423-D10TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGGGGACGTTAGCTTCTCTGTATTTACGTAACCGGTTAAGCCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 82 >AMX(423)_E10 ARC 1140 R3_423-E10
TAATACGACTCACTATAGGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQ ID NO 83 >AMX(423)_F10 ARC 1140 R3_423-F10
TAATACGACTCACTATAGGGGGGATGGAGTGGGTGCAAATAANACGTAACTGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 84 >ΑΜΧ(423)_G10 ARC 1140 R3_423-G10
TAATACGACTCACTATAGGGGAGNGTGAQGGGTGAATANTAANGTAANCNGTTAAACCTGGGTCGATGNNNTANNCTNGNT
SEQ ID NO 85 >AMX(423)_H10 ARC 1140 R3_423-H10NAAT NNGACT CACAANAGG G GTC GAT G CAG TAAG CTAGCT
SEQ ID NO 86 >AMX(423)_A11 ARC 1140 R3_423-A11
TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGTGACGTACGGATCTAAGTAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 87 >AMX(423)_B11 ARC 1140 R3_423-B11TAATACGACTCACTATAGGGGAGGGACAGACACTTTGTAGACGTAACCAGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 88 >AMX(423)_C11 ARC 1140 R3_423-C11TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGACTTGGCACTACGTAACAACGTAACCGCTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 89 >AMX(423)_D11 ARC 1140 R3_423-D11TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGCCTCTCGACCAAAAGCCCAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 90 >AMX(423)_E11 ARC 1140 R3_423-E11TAATACNACTCACTATAGGGGGGGGGGGATAGTCATGACTGATAAAACGTAACTGTTGAGCCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 91 >AMX(423)_F11 ARC 1140 R3_423-F11TAATACGACTCACTATAGGGGACAGTGCTAGTGGAATAGCAACGTAACCAGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 92 >AMX(423)_G11 ARC 1140 R3_423-G11TAATACGACTCACTATAGGGGACGACCACTATACTCCGAGAACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 93 >AMX(423) Hll ARC 1140 R3 423-H11TAATACGACTCACTATAGGGGGATGGAGGCGTAGTGTAGTCAACGTTACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 94 >ΑΜΧ(423)_Α12 ARC 1140 R3_423-A12TAATACGACTCACTATAGGGGGGAGGTATAGATGGAATGGTTATGTAACCTGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 95 >AMX(42 3)_B12 ARC 1140 R3_423-B12TAATACGACTCACTATAGGGGTGGGGAGGACCACTTAGATAACGTCACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 96 >AMX(423)_C12 ARC 1140 R3_423-C12TAATACGACTCACTATAGGGGGGATAGGGGCGAGAGAGTCACAACGTAACCGGTTAATCCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 97 >AMX(423)_E12 ARC 1140 R3_423-E12TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGATGGCCGAATCATAAAATAACGTAACCGTTAGACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 98 >AMX(423)_F12 ARC 1140 R3_423-F12 -TAATACGACTCACTATAGGGGGCGATTGCTGAGTCAGTtCGTAATCGGTTAAACCCGGGTQGATGCAGTAAGCTAGCT
SEQ ID NO 99 >AMX(423)_G12 ARC 1140 R3_423-G12TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGAGGATCCGAAACACGGGATCCGTAACCGGTTAAAGCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT
EXEMPLO 2: BIBLIOTECAS QUE INCORPORAM SEQÜÊNCIASLÍDERES IDENTIFICADAS PELO MÉTODO TR-SELEX®
Os elementos da seqüência líder em 5'identificados (os primeiros 10 nucleotídeos da regiãodegenerada) a partir de clones maiores produtores detranscritos modificados em 2', identificados usando aseleção por TR-SELEX®, como descrito no Exemplo 1, foramutilizados para projetar bibliotecas que incorporam oselementos da seqüência lider na região fixa em 5', com oobjetivo de promover um aumento na produção de transcritocontendo nucleotideos modificados em 21. Em uma modalidade,a estratégia de projeto incorpora os primeiros 14nucleotideos dos clones identificados (as 4 guanosinascompreendendo a região fixa em 5' mais os primeiros 10nucleotideos da região degenerada) como a seqüência lider em5', imediatamente seguidos por uns 6-8 nucleotideos fixosadicionais para facilitar a amplificação por PCR subseqüente,imediatamente seguidos por 30-40 nucleotideos de comprimentode uma região degenerada, imediatamente seguidos por umaregião fixa em 3' para também facilitar a amplificação porPCR subseqüente.
Os exemplos das seqüências de_.DNA.__das bibliotecasprojetadas, as quais incorporam os elementos da seqüêncialider identificados, são listados abaixo.
Para cada uma das seqüências das bibliotecas demoldes de transcrição de DNA listadas abaixo, o elemento daseqüência lider em 5' é mostrado sublinhado, e todas asseqüências estão na direção 5'-3'.
ARC2118 (SEQ ID NO 3)
TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATGARC2119 (SEQ ID NO 4)
TAATACGACTCACTATAGGGGGTGATATTGACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
ARC2120 (SEQ ID NO 5)TAATACGACTCACTATAGGGGTGCGCGGTTACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
ARC2121 (SEQ ID NO 6)
TAATACGACTCACTATAGGGGGAGGGGGTGCCGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
Um molde de transcrição de DNA de controle, semuma seqüência lider, é listado abaixo, na direção 5'-3'.
TAATACGACTCACTATAGGGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG (ARC2117, SEQID NO 106).
Para testar se as bibliotecas recentementeprojetadas promovem uma produção aumentada de transcritoscontendo 2'-0-metil nucleotideos, as bibliotecas foramtranscritas usando duas T7 RNA polimerases modificadasdiferentes para comparação, a T7 RNA polimerase mutanteY639F/H784A/K378R, e a polimerase mutante Y639L/H784A/K378R(a mistura de reação de transcrição sem polimerase foi usadacomo um controle negativo), em uma mistura de transcriçãocontendo molde a ~200 nM, IX tampão de transcrição (HEPES a200 mM, DTT a 40 mM, espermidina a 2 mM, Triton X-100 a0,01%), 2'-OMe ATP, CTP, UTP, e GTP a 1 mM cada, 2'-OH GTP a30 uM, MgCl2 a 6,5 mM, MnCl2 a 2,0 mM, PEG-8000 a 10% p/v,GMP a 1 mM, T7 RNA polimerase mutante Y639F/H784A/K378R ouT7 RNA polimerase mutante Y639L/H784A/K378R a 200 nM, 5unidades/mL de pirofosfatase inorgânica, a 37°C, durante anoite. A produção de transcrito para cada condição foitestada através de análise por PAGE-gel, usando 200 uL damistura de reação, e a produção de transcrito para cadacondição foi quantificada a partir de imageamento com UV daanálise por PAGE-gel usando o software ImageQuant versão 5.2(Molecular Dynamics).
A Figura 4 resume os resultados quantificados daanálise por PAGE-gel, mostrando aumento multiplicado daprodução com ambas as T7 RNA polimerases mutantesY639F/H784A/K378R ("FAR") e Y639L/H784A/K378R ("LAR") emrelação ao controle negativo sem polimerase. Conforme podeser visto na Figura 4, foi observado um aperfeiçoamentosignificativo na produção de transcritos inteiramentecontendo 21-OMe quando a T7 RNA polimerase mutanteY639L/H784A/K378R foi usada para transcrever as novasbibliotecas que incorporam os novos elementos da seqüêncialider, em comparação com a polimerase mutanteY639F/H784A/K378R. Notavelmente, a ARC2118, a ARC2119 e aARC2120 deram produções significativamente maiores detranscritos contendo 2'-OMe quando combinadas com a T7 RNApolimerase mutante Y639L/H784A/K378R, em comparação com a T7RNA polimerase mutante Y639F/H784A/K378R. Um aumento naprodução de transcrito por utilização da T7 RNA polimerasemutante Y639L/H784A/K378R foi também visto com a ARC2117,uma biblioteca primeiramente projetada que não tem oselementos da seqüência lider recentemente identificados,sabida transcrever sob as condições dadas com a polimerasemutante Y639F/H794A/K378R, que foi usada como um controle.
Esses resultados indicam que as produções de transcritocontendo 2'-OMe podem ser aumentadas por utilização da T7RNA polimerase mutante Y639L/H784A/K378R em comparação com aΤ7 RNA polimerase mutante Y639F/H784A/K378R. Além disso,diversas das bibliotecas (ARC2118 e ARC2119) que incorporamos elementos da seqüência lider identificados através dométodo TR-SELEX® também deram produções maiores detranscritos contendo 2'-OMe do que a biblioteca de controle,ARC2117, quando usando a T7 RNA polimerase mutanteY639L/H784A/K378R, indicando que pode ser obtido umaperfeiçoamento na produção de transcrito contendo 2'-OMepor utilização da mutante Y639L/H784A/K378R em combinaçãocom as seqüências lideres recentemente identificadasparticulares da presente invenção.
Exemplo 3: Expressão e Purificação da Polimerase
A T7 RNA polimerase mutante, para uso nos métodosda invenção, pode ser preparada como a seguir. A T7 RNApolimerase (seqüência de ácidos nucléicos _e de.. ami.n.oáci-dos -mostrada nas Figuras 5A e 5B, respectivamente, e descrita emBuli, J.J e col., J. MoI. Evol., 57 (3), 241-248 (2003))pode ser mutada para resultar na mutante LA (Y639L/H784A),na mutante LAR (Y639L/H784A/K378R), na mutante LLA(P266L/Y639L/H784A) ou na mutante LLAR(P266L/Y639L/H784A/K378R). A T7 RNA polimerase pode estarcompreendida em um vetor de expressão (um exemplo de umvetor de expressão de T7 RNA polimerase é descrito naPatente U.S. N2 de Série 5.869.320, aqui incorporada porreferência em sua totalidade) ou pode ser inserida em umvetor de expressão seguindo a mutagênese. A T7 RNApolimerase mutada pode ser engenheirada para opcionalmentecompreender um marcador de His para a facilidade durante apurificação da proteína.
As seqüências de oligonucleotídeos complementaresque contêm a mutação de Leucina para a posição 639(agtcatgacgctggctCTGgggtccaaagagttcg (SEQ ID NO 107) egaactctttggacccCAGagccagcgtcatgact (SEQ ID NO 108)) podemser sintetizadas. As seqüências de oligonucleotídeoscomplementares (ggctggcatctctcTgatgttccaaccttgc (SEQ ID NO109) e gcaaggttggaacatcAgagagatgccagcc (SEQ ID NO 110)) paraa mutação P266L podem ser sintetizadas. As seqüências deoligonucleotídeos complementares(cgctcctaactttgtaGCcagccaagacggtagc (SEQ ID NO 111) egctaccgtcttggctgGCtacaaagttaggagcg (SEQ ID NO 112)) para amutação H784A podem ser sintetizadas. As seqüências deoligonucleotídeos complementares(gctctcaccgcgtggaGacgtgctgccgctgct (SEQ ID NO 113). eagcagcggcagcacgtCtccacgcggtgagagc (SEQ ID NO 114)) para amutação K378R podem ser sintetizadas. A mutagênese sítio-direcionada pode ser efetuada usando o Kit de MutagêneseSitio-Direcionada QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA) , deacordo com as instruções do fabricante, para resultar emseqüências de ácidos nucléicos (Figura 6) que codificampolimerases mutantes tendo a combinação de mutações acimaindicada. A seqüência de ácidos nucléicos resultantecodificando uma polimerase mutante da invenção pode serinserida no vetor de expressão desejado, usando técnicaspadrões para a expressão e a purificação.
Expressão e Purificação
O vetor de expressão compreendendo a seqüência deácidos nucléicos da T7 polimerase mutante é transformado nascélulas competentes BL21 (DE3) (Stratagene, CA) e incubadosobre gelo por 20 min. 0 choque térmico é efetuadocolocando-se o tubo em 42°C por 2 min. Após colocar o tubosobre gelo por 1 minuto, 1 ml de caldo L ("LB") é adicionadoe incubado em agitador a 37°C por 45 min. 100 ul de liquidoda cultura são preparados sobre placas de LB+Amp ágar eincubados a 37°C durante a noite.
Uma única colônia da placa cultivada durante anoite é inoculada em 100 ml de LB-Amp+ (150 ug/ml), a 37°C,durante a noite. No segundo dia, dois frascos de 4 litroscontendo 2 litros de LB+Amp pré-aquecido são inoculados com50 ml da cultura noturna e desenvolvidos a 370C até que aD0600 atinja entre 0, 6-0, 8. 200 ul de IPTG a IM sãoadicionados a cada 2 L de cultura de células comconcentração final de 100 uM e desenvolve-se por outras 3 ha 37°C. As células são precipitadas girando a 5000 rpm por10 min. As células são suspensas, novamente em 200 ml detampão de Iise (Tampão de lise: Tris-Cl a 50 mM, pH 8,0,NaCl a 100 mM, 5% de Glicerol, imidazol a 1 mM,betamercaptoetanol ("BME") a 5 mM) e divididas em 6 tuboscônicos de 50 ml. As células são sonicadas em nível depotência 8, 3x30" para cada tubo, e então o fragmentobacteriano é girado a 11.000 rpm por 60 min e o sobrenadantefiltrado através de um filtro de 0,22 uM. 0 imidazol éadicionado ao filtrado até uma concentração final de 10 mM.
O filtrado é carregado para uma coluna de Ni-NTAde 5 ml (GE Healthcare Bio-Sciences, NJ) com uma bomba deamostra. A coluna é lavada com 10 volumes de coluna (VC) detampão A (Tampão A: Tris-Cl a 50 mM, pH 8,0, NaCl a 100 mM,5% de Glicerol, imidazol a 10 mM, BME a 10 mM) contendoimidazol a 20 mM. A coluna é então lavada com 10 VC detampão com um gradiente linear de concentração de imidazol apartir de 40 mM até 70 mM em tampão A. A proteina é eluidacom 6 VC de Tampão B (Tampão B: Tris-Cl a 50 mM, pH 8,0,NaCl a 100 mM, 5% de Glicerol, imidazol a 250 mM, BME a 10mM). Após checar as frações de coleta com 5 μΐ de amostraem 4-12% de SDS-PAGE, todas as frações de interesse sãocombinadas e dialisadas (tubulação de diálise: membranaporosa Spectrum Spectra/por Molecular (VWR) MWCO: 12-14000)em 1 L de tampão de diálise (Tampão de diálise: Tris-Cl a 50mM, pH 7,9, NaCl a 100 mM, 50% de Glicerol, EDTA a 0,1 mM,0,1% de Triton X-100, BME a 20 mM) , durante a noite. Otampão de diálise é trocado após 12 horas e a diálise éefetuada por umas 4 horas adicionais. A concentração de T7RNA polimerase é medida usando o ensaio de Bradford, comodescrito em Bradford, Μ. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248.
Exemplo 4: Transcrição que incorpora 100% de 21-0-metil nucleotideos
Exemplo 4A: Transcrição com 2'-0-metil sem 2'-OH GTP
Um experimento foi efetuado para testar asensibilidade da polimerase mutante Y639L/H784A/K378R àconcentração de 2'-OH GTP, por utilização de uma titulaçãode 2'-OH GTP.
A ARC2118 e a ARC2119, duas bibliotecas queincorporam os novos elementos da seqüência lideridentificados através da seleção por TR-SELEX® (descrita noExemplo 1), que mostraram altas produções de transcritosquando usadas com a T7 RNA polimerase mutanteY639L/H784A/K378R (ver o Exemplo 2), foram usadas paratestar a sensibilidade de transcrição da T7 RNA polimerasemutante Y639L/H784A/K378R à concentração de 2'-OH GTP. Astranscrições foram efetuadas usando uma titulação de 2'-OHGTP (0-160 uM) com IX tampão de transcrição (HEPES a 200 mM,DTT a 40 mM, espermidina a 2 mM, Triton X-100 a 0,01%),molde a -200 nM, 2'-OMe ATP, CTP, UTP, e GTP a 1 mM cada,MgCl2 a 6,5 mM, MnCl2 a 2,0 mM, PEG-8000 p/v a 10%, GMP a 1mM, 5 unidades/mL de pirofosfatase inorgânica, T7 RNApolimerase mutante Y639L/H784A/K378R a 200 nM, a 37° C,durante a noite.
A produção de transcritos sob cada condição foitestada através de análise por PAGE-gel, usando 200 uL demistura de reação, e a produção de transcritos para cadacondição foi quantificada a partir de imageamento com UV daanálise por PAGE-gel, usando o software ImageQuant versão5.2 (Molecular Dynamics). A Figura 7 resume os resultadosquantificados da análise por PAGE-gel, mostrando o aumentomultiplicado da produção de transcritos com cada condição emrelação à base. Conforme pode ser visto na Figura 7, aARC2118 e a ARC2119 foram transcritas com aY639L/H784A/K378R sob todas as condições, incluindo sem 2'-OH GTP, e a produção na ausência de 21-OH GPT era comparávelà produção de transcrição onde a 2'-OH GTP foi incluída namistura de reação. Esses resultados indicam que a T7 RNApolimerase mutante Y639L/H784A/K378R não requer a presençade 21-OH GTP para a produção de transcrito aumentada, emoposição à T7 RNA polimerase mutante Y639F/H784A/K378R, querequer o 21-OH GTP para a transcrição (dados não mostrados).
Um experimento foi subseqüentemente efetuado paradeterminar as condições de transcrição ótimas a serem usadascom a T7 RNA polimerase mutante Y639L/H784A/K378R, quandocombinada com as seqüências lideres identificadas através deseleção por TR-SELEX® (descrita no Exemplo 1). A ARC2119,uma biblioteca que incorpora os novos elementos da seqüêncialider, identificados através da seleção por TR-SELEX®, quemostraram produção de transcritos significativamente maiorquando usados com a T7 RNA polimerase mutanteY639L/H784A/K378R (ver o Exemplo 2), foi usada para testar oefeito da variação das concentrações de 21-OMe NTP, magnésioe manganês sobre a produção de transcritos.
As transcrições foram efetuadas usando IX tampãode transcrição (HEPES a 200 mM, DTT a 40 mM, espermidina a 2mM, Triton X-IOO a 0,01%), molde a -200 nM, 21-OMe ATP, CTP,UTP, e GTP (0,5 mM, 1 mM, 1,5 mM, e 2 mM cada), MgCl2 (5 mM,6,5 mM, 8 mM, e 9,5 mM) , MnCl2 (1,5 mM, 2 mM, 2,5 mM, 3 mM),PEG-8000 p/v a 10%, GMP a 1 mM, 5 unidades/mL depirofosfatase inorgânica, T7 RNA polimerase mutanteY639L/H784A/K378R a 200 nM, a 37° C, durante a noite.
A produção de transcritos sob cada condição foitestada através de análise por PAGE-gel, usando 200 uL demistura de reação, e a produção de transcritos para cadacondição foi quantificada a partir de imageamento com UV daanálise por PAGE-gel, usando o software ImageQuant versão5.2 (Molecular Dynamics). A Figura 8 resume os resultadosquantificados da análise por PAGE-gel, mostrando o aumentomultiplicado da produção de transcritos com cada condição emrelação à base. Com base no custo dos 2'-OMe NTPs, e nosresultados desse experimento, 1,5 mM cada de 21-OMe NTP (e 8mM de MgCl2, 2,5 mM de MnCl2) foi adotado como as condiçõespreferidas para uso com as seqüências lideres e a T7 RNApolimerase mutante Y639L/H784A/K378R da presente invenção.
Exemplo 4B: Fidelidade e Desvio de Previsão daTranscrição de MNA usando a T7 RNA polimerase mutanteY639L/H7 8 4A/K37 8R
Foram efetuados experimentos adicionais paraajvaliar a fidelidade __e o desvio de previsão da transcriçãode MNA usando a T7 RNA polimerase mutante Y639L/H784A/K378Re nenhum 2'-OH GTP. Para testar a fidelidade, uma únicaseqüência .clonada, identificada através de seleção por TR-SELEX® (descrita no Exemplo 1) , foi amplificada por PCR,usada para programar uma transcrição de MNA usando apolimerase Y639L/H784A/K378R e nenhum 21-OH GTP, purificadapor PAGE, o molde de DNA restante foi digerido usando aDNase RQl (a ausência de molde de DNA foi então testada porPCR) e o material transcrito foi transcrito invertido(Thermoscript, Invitrogen, Carlsbad, CA) e então amplificadopor PCR. Esse produto da PCR foi seqüenciado e a estatísticade deleções, inserções e substituições foi então calculada.Das 1300 bases seqüenciadas nesse experimento, não foipurificada por PAGE, o molde de DNA restante foi digeridousando a DNase RQl (a ausência de molde de DNA foi entãotestada por PCR) e o material transcrito foi transcritoinvertido e amplificado usando PCR, antes da clonagem e doseqüenciamento. 48 clones da biblioteca amplificada e 48clones da biblioteca de partida foram seqüenciados. Aestatística da ocorrência de nucleotídeos na regiãodegenerada foi examinada para ver se o desvio de previsãoocorreu. Conforme indicado pela Figura 10, a porcentagem decomposição de nucleotídeos após a transcrição era muitosimilar à porcentagem de composição de nucleotídeos dabiblioteca de partida, na qual a porcentagem de cadanucleotídeo (A, T, CeG) era aproximadamente igual,observada nenhuma deleção e inserção, e três substituiçõesforam observadas (ver a Figura 9) . Esses números sugeremque a informação de seqüência codificada dentro de umaregião degenerada de 30 nucleotídeos teria uma chance de 93%de ser transmitida fielmente para a próxima rodada de SELEX®,esse número é tão alto que excede aquele medido para o RNAdo tipo selvagem.
Para testar o desvio de previsão de nucleotídeos,a biblioteca ARC2118 foi transcrita sob as seguintescondições: HEPES a 200 mM, DTT a 40 mM, espermidina a 2mM,Triton X-100 a 0,01%, molde a 200 nM, 2'-OMe ATP, CTP, UTP,e GTP a 1 mM cada (nenhum 2 '-OH GTP) , MgCl2 (6,5 mM) , MnCl2(2 mM) , PEG-8000 p/v a 10%, GMP a 1 mM, 5 unidades/mL depirofosfatase inorgânica, T7 RNA polimerase mutanteY639L/H784A/K378R a 200 nM,__a__37°_C,__durante a___noite.,___indicando que nenhum desvio de previsão de nucleotideosocorre com a T7 RNA polimerase mutante Y639L/H784A/K378Rusada para a transcrição.
Exemplo 4C: Comparação da Produção Transcricionalcom Diversas Seqüências Lideres
Moldes 1 a 4:
Para comparar as produções transcricionais usandoa T7 RNA polimerase mutante Y639L/H784A/K378R com múltiplasseqüências lideres diferentes, 4 moldes compreendendo razõesvariadas de purinas para pirimidinas na seqüência lider(posições 1 a 14 nas SEQ ID NOs 126 a 129 abaixo) foramsintetizados com diferentes regiões constantes. Os moldesde DNA foram sintetizados usando um sintetizador de DNA ABIEXPEDITE® (Applied Biosystems, Foster City, CA) , edesprotegidos por métodos padrões. As seqüências (mostradasna direção 5' para 3') são como a seguir:
Molde 1
GGAGAATTCCGACCAGAAGCTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATATGTGCGTCTACATGGATCCTCA (SEQ ID NO 12 6)
Molde 2
GGGAGAGCGGAAGCCGTGCTGGGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATAACCCAGAGGTCGATGGATC (SEQ ID NO 127)
Molde 3
GGGAGAGACAAGCTTGGGTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGAAGAGAAAGAGAAGTTAATTAAGGATCCTCAG (SEQ ID NO 128)
Molde 4
GGGAGAATTCCGACCACAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATATGTGCGTCTACATGGATCCTCA (SEQ ID NO 129).Os moldes foram amplificados com os seusrespectivos primers, conforme indicado abaixo:
Molde 1:
Primer em 5'
TAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAGCTT (SEQ ID NO 130)
Primer em 3' TGAGGATCCATGTAGACGCACATATG (SEQ ID NO 131)
Molde 2:
Primer em 5'
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCCGTGCTGGGGCC (SEQ ID NO 14 9)
Primer em 3' GATCCATCGACCTCTGGGTTATG (SEQ ID NO 132)
Molde 3:
Primer em 5' TAATACGACTCACTATAGGGAGAGACAAGCTTGGGTC(SEQ ID NO 133)
Primer em 3' CTGAGGATCCTTAATTAACTTCTCTTTCTCTTCT(SEQ ID NO 134)
Molde 4:
Primer em 5' TAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCACAAG(SEQ ID NO 135)
Primer em 3' TGAGGATCCATGTAGACGCACATATG (SEQ ID NO 148)
Os moldes foram usados em uma reação detranscrição in vitro de 15 mL com a T7 RNA polimerase(Y639L/ H784A/ K378R) . As transcrições foram feitas usandoHepes a 200 mM, DTT a 40 mM, espermidina a 2 mM, 0,01 % deTritonX-100, 10% de PEG-8000, MgCl2 a 8 mM, MnCl2 a 2,5 mM,mCTP a 1,5 mM, mUTP a 1,5 mM, mGTP a 1,5 mM, mATP a 1,5 mM,GMP a 1 mM, 0,01 unidade/μΐι de pirofosfatase inorgânica, e~9 yg/ml de T7 polimerase (Y639L/ H784A/ K378R) e molde deDNA a 0,2 μΜ. O RNA foi precipitado e purificado sobre PAGEde desnaturação a 10%. 0 RNA foi eluído do gel em NaOAc a300 mM, EDTA a 20 mM, durante a noite, precipitado equantificado com um Espec. de UV. As produções nãodiferiram muito entre as quatro seqüências lideres testadase são mostradas na Tabela IA abaixo.
Tabela IA
<table>table see original document page 127</column></row><table>
Como para os Moldes 1 a 4 acima descritos, asproduções transcricionais para múltiplas seqüências lideresforam avaliadas. Quatro moldes foram sintetizados comdiferentes regiões constantes. Os moldes de DNA foramsintetizados usando um sintetizador de DNA ABI EXPEDITE®(Applied Biosystems, Foster City, CA) , e desprotegidos pormétodos padrões. As seqüências (mostradas na direção 5' para3') são como a seguir:
Molde 5:
GGGCCTTGTAGCGTGCATTCTTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTAACATACTCCGAATCTGTCGAA (SEQ ID NO 138)Molde 6:
GGAGCCTTCCTCCGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCCGGTTTCCCGAGCTT (SEQ ID NO 139)
Molde 7:
GGGAGACAAGAATAAACGCTCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCGACAGGAGGCTCACAACAGGC (SEQ ID NO 140)
Molde 8:
GGGGAGTACAATAACCAGACATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG (SEQ ID NO 150)
Os moldes foram amplificados com os seusrespectivos primers:
Molde 5:
Primer em 5'
TAATACGACTCACTATAGGGCCTTGTAGCGTGCATTCTTG (SEQ IDNO 151)
Primer em 3'
TTCGACAGATTCGGAGTATGTTAG (SEQ ID NO 141)
Molde 6:
Primer em 5'
TAATACGACTCACTATAGGAGCCTTCCTCCGGA (SEQ ID NO 142)
Primer em 3'
AAGCTCGGGAAACCGGA (SEQ ID NO 143)
Molde 7:
Primer em 5'
TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA (SEQ ID
NO 144)
Primer em 3'
GCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA (SEQ ID NO 14 5)
Molde 8:
Primer em 5'TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACCAGACAT (SEQ ID NO 146)
Primer em 3'
CATCGATGCTAGTCGTAACGATCC (SEQ ID NO 14 7)
Os moldes foram então usados para uma transcriçãoin vitro de 0,5 mL com a T7 RNA polimerase (Y639L/ H784A/K378R). As transcrições foram feitas usando Hepes a 200 mM,DTT a 40 mM, espermidina a 2 mM, 0,01 % de Triton X-100, 10%de PEG-8000, MgCl2 a 8 mM, MnCl2 a 2,5 mM, mCTP a 1,5 mM,mUTP a 1,5 mM, mGTP a 1,5 mM, mATP a 1,5 mM, GMP a 1 mM,0,01 unidade^L de pirofosfatase inorgânica, e ~9 μg/ml deT7 polimerase (Y639L/ H784A/ K378R) e molde de DNA a 0,2 μΜ.0 RNA foi precipitado e carregado sobre PAGE de desnaturaçãoa 10%. 0 RNA foi visualizado por absorbância de UV sobregel. As produções não diferiram muito entre as quatroseqüências lideres testadas e são mostradas na Tabela IBabaixo (Produções de transcrição relativas dadas):
Tabela IB
<table>table see original document page 129</column></row><table>
Nas modalidades particulares, os moldesidentificados acima descritos podem ser usados nos métodosde transcrição e/ou nos métodos de seleção de aptâmeros dainvenção.Exemplo 4D: Transcrição de MNA usando a T7 RNApolimerase mutante P266L/Y639L/H784A/K378R
O molde de DNA e os primers a seguir foram usadospara programar uma reação em cadeia por polimerase, paragerar um molde de transcrição de fita dupla. N indica umaposição degenerada com uma probabilidade aproximadamenteigual de ser cada uma de ATGC, todas as seqüências sãolistadas na direção 5' para 3':
Molde de PCR (ARC2118)
TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG (SEQ ID NO 3)primer em 5'
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAT AAT AC GAC TCAC T AT AGG GG AGTACAATAACGTTCTCG (SEQ ID NO 115)
primer em 3' CATCGATGCTAGTCGTAACG (SEQ TD NO 116)
O molde de transcrição de fita dupla resultantefoi então usado para programar misturas de transcrição de200 uL para cada amostra, como a seguir: HEPES (200 mM), DTT(40 mM) , Espermidina (2 mM) , Triton X-IOO (0,01%), MgCl2 (8mM), MnCl2 (2,5 mM) , PEG-8000 (10% p/v), 1,5 mM cada de 2'-OMe NTP, GMP a 1 mM, molde de transcrição a 100-200 nM,Pirofosfatase Inorgânica (1 unidade), pH 7,5, a T7polimerase mutante P266L/Y639L/H784A/K378R foi diluídaconforme indicado abaixo. A mistura de transcrição foiincubada a 37°C, durante a noite (16 h).
Após incubação, as misturas foram precipitadas comisopropanol, o precipitado resultante foi dissolvido equantificado usando PAGE de desnaturação (12,5% deacrilamida) por 60 min, a 25 W. As amostras foramvisualizadas e quantificadas através de imagem por UV a 260 nm.
Tabela 2: Produção Transcricional
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EXEMPLO 5: Seleção de Aptâmeros usando a T7 RNApolimerase mutante Y639L/H784A/K378R
—Uma seleção foi efetuada para identificar osaptâmeros para Ang2 humana (daqui por diante, "h-Ang2")usando um agrupamento consistindo em 2'-OMe nucleotideos depurina e pirimidina (daqui por diante, "MNA"). A estratégiade seleção produziu aptâmeros de altas afinidades,específicos para h-Ang2.
A Ang2 humana foi adquirida de R&D Systems, Inc.(Minneapolis, MN) . A T7 RNA polimerase (Y639L/H784A/K378R)foi expressa e purificada conforme descrito no Exemplo 3acima. Os 21-OMe nucleotideos de purina e pirimidina foramadquiridos da TriLink BioTechnologies (San Diego, CA).
Seleção do aptâmero para Ang2
Preparação do Agrupamento
Um molde de DNA com a seqüência 5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG ARC2118 (SEQ ID NO 3) foi sintetizadousando um sintetizador de DNA ABI EXPEDITE® (AppliedBiosystems, Foster City, CA) , e desprotegido por métodospadrões. Os moldes foram amplificados com os primers (51-(GATCGATCGATCGATCGATCTAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCG-31) (SEQ ID NO 118) e (5'-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCC-31) (SEQ ID NO 119) e então usadoscomo um molde para a transcrição in vitro com a T7 RNApolimerase (Y639L/ H784A/ K378R). As transcrições foramfeitas usando Hepes a 200 mM, DTT a 40 mM, espermidina a 2mM, 0,01 % de TritonX-100, 10% de PEG-8000, MgCl2 a 8 mM,MnCl2 a 2,5 mM, mCTP a 1,5 mM, mUTP a 1,5 mM, mGTP a 1,5 mM,mATP a 1,5 mM, GMP a 1 mM, 0,01 unidade/^L de pirofosfataseinorgânica, e ~ 9 yg/mL de T7 polimerase (Y639L/ H784A/K378R) e molde de DNA a 0,5 μΜ, para gerar o agrupamento deARC2118 mRmY.
Seleção
A seleção foi iniciada por incubação de 330 pmols(2xl014 moléculas) do agrupamento de MNA ARC 2118 com 100pmols de proteína, em um volume final de tampão de seleçãode 100 \iL (IX PBS da Dulbecco (DPBS)), por 1 h, natemperatura ambiente. Os complexos de RNA-proteína e asmoléculas de RNA não ligadas foram separados usando umacoluna de rotação de nitrocelulose de 0,45 mícron(Schleicher e Schuell, Keene, NH). A coluna foi pré-tratadacom KOH (Embeber o filtro da coluna em 1 mL de KOH a 0,5 M,TR de 15 min; girar completamente. Embeber o filtro em 1 mLde dH20, TR de 5 min.; girar completamente), lavada 2 χ com1 mL de IX PBS, e então a solução contendo os complexos deagrupamento:Ang2 foi adicionada à coluna e centrifugada a1500 χ g por 2 minutos. 0 filtro foi lavado duas vezes com500 μΐ. de DPBS para remover os ligantes não específicos. ORNA foi eluído por adição de 2 χ 100 μΐ; de tampão de eluição(uréia a 7 M, acetato de sódio a 100 mM, EDTA a 3 mM, pré-aquecido para 95°C) e então precipitado com etanol. O RNAfoi transcrito invertido com o sistema ThermoScript RT-PCR®(Invitrogen, Carlsbad, CA), de acordo com as instruções dofabricante, usando o primer SEQ ID NO 119. 0 cDNA foiamplificado por PCR com Taq polimerase (New England Biolabs,Beverly, MA) , de acordo com as instruções do fabricante,usando a SEQ ID NO 118 e a SEQ ID NO 119. Os moldes foramtranscritos conforme descrito acima para a preparação doagrupamento e purificados sobre um gel de poliacrilamida dedesnaturação.
A rodada 2 foi efetuada com o mesmo método que arodada 1. As rodadas 3-12 foram realizadas com h-Ang2imobilizada sobre placas hidrofóbicas. Cada rodada deseleção foi iniciada por imobilização de 20 pmols de h-Ang2na superfície de uma placa hidrofóbica Maxisorp da Nunc, por1 hora, na temperatura ambiente, em 100 μΐ; de IX DPBS. Aplaca foi lavada 5x com 120 μΐ, de DPBS, então incubada comtampão de bloqueio (IX DPBS, e 0,1 mg/mL de BSA), por 1 hora.
0 sobrenadante foi então removido e os poços foram lavados 5vezes com 120 μΐ; de IX DPBS. 0 RNA do agrupamento foiincubado por 1 hora na temperatura ambiente nos poços vazios,então por 1 hora em um poço que tinha sido previamentebloqueado com 100 μΐ; de tampão de bloqueio. A partir darodada 3 em diante, os poços com o alvo imobilizado forambloqueados por 1 hora na temperatura ambiente, em 100 μΐ, detampão de bloqueio (IX PBS, 0,1 mg/mL de tRNA, 0,1 mg/mL dessDNA e 0,1 mg/mL de BSA) , antes da etapa de seleçãopositiva. Em todos os casos, o RNA do agrupamento ligado àh-Ang2 imobilizada foi transcrito invertido diretamente naplaca de seleção, pela adição da mistura de transcriçãoreversa ("TR") (primer em 3' , SEQ ID NO 119, e ThermoscriptRT, Invitrogen, Carlsbad, CA) , seguida por incubação a 65°Cpor 1 hora. 0 cDNA resultante foi usado como um molde paraa PCR (Taq polimerase, New England Biolabs, Beverly, MA) e atranscrição, conforme descrito para a rodada 1. As condiçõespara cada rodada estão na Tabela 3.
Tabela 3. Resumo das Rodadas
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Análise da Ligação do Aptâmero de MNA
Os ensaios de ligação por dot blot foram efetuadospor todas as seleções, para monitorar a afinidade de ligaçãodos agrupamentos pelas proteínas. 0 RNA do agrupamentomarcado na extremidade com traços de 32P foi combinado com ah-Ang2 e incubado na temperatura ambiente, por 30 minutos,em tampão de DPBS, em um volume final de 30 μΐ;. A misturafoi aplicada a uma aparelhagem de dot blot (Minifold-1 DotBlot, Acrílico, Schleicher e Schuell, Keene, NH) , montada(do topo até o fundo) com nitrocelulose, náilon, e membranasblot em gel. 0 RNA que está ligado à proteína é capturadosobre o filtro de nitrocelulose; enquanto que o RNA nãoligado à proteína é capturado sobre o filtro de náilon. 0enriquecimento para a ligação da Ang2 foi visto começando narodada 9. Os moldes do agrupamento das rodadas 9, 10 e 12foram clonados usando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen,Carlsbad, CA) , de acordo com as instruções do fabricante, e26 clones únicos foram escolhidos para a síntese química, eas constantes de dissociação (K0) foram determinadas.Resumidamente, os RNAs sintéticos foram marcados naextremidade de 5' com γ-32Ρ ATP e os valores de K0 foramdeterminados usando o ensaio por dot blot e as condições detampão de IX DPBS (c/ Ca2+ e Mg2+) (Gibco, Catálogo n- 14040,Invitrogen, Carlsbad, CA). As KDs foram estimadasadaptando-se os dados à equação: fração de RNA ligado =amplitude * (((AptConc+[h-Ang2]+KD) - SQRT((AptConc+[h-Ang2]+ Kd)2 - 4(AptConc*[h-Ang2])))/(2*AptConc)) + base. Osresultados são descritos na Tabela 4 abaixo.
Dentro das 26 seqüências únicas, 8 compartilharamum motivo similar e tinham atividades de ligação einibidores similares. Essas seqüências são identificadascomo Família I. A Família II compreende 2 seqüências com ummotivo compartilhado que tinham atividades de ligação einibidoras similares.
Análise da Função do Aptâmero de MNA
Ensaio Elisa
Alguns dos aptâmeros foram testados em um ensaioELISA que foi configurado para medir a sua capacidade deinterferir com a ligação da Ang2 ao receptor de Tie2. Paracapturar o receptor de Tie2, 150 ng de Tie2-Fc (R&D systems313-TI-100-CF, Minneapolis, MN) em 100 μ]1 de PBS (pH 7,4)foram colocados sobre uma placa Maxisorb de 96 poços (NUNCn£ 446612, Rochester, NY) e incubados durante a noite, a 4°C. Durante a captura, 50 μΐ, de diversas concentrações deRNA sintético foram misturados com 50 μΕ de Ang2 a 3,6 nM(200 ng/mL) (R&D systems, 623-AN-025/CF, Minneapolis, MN)(em PBS com 0,2% de BSA) , com concentração final de Ang2 a1,8 nM (100 ng/mL) em PBS com 0,1% de BSA, e incubados natemperatura ambiente por 1 hora. A solução de captura foiremovida após uma incubação noturna e a placa foi lavada com200 μί de TBST (Tris-HCl a 25 mM, pH 7,5, NaCl a 150 mM e0,01% de Tween 20), três vezes. A placa foi então bloqueadacom 200 μL de TBST contendo 5% de leite seco sem gordura,por 30 minutos, na temperatura ambiente. Após o bloqueio, aplaca foi lavada com 200 μL de TBST novamente três vezes, natemperatura ambiente, e a mistura de RNA sintético:Ang2 foiadicionada à placa e incubada na temperatura ambiente por 1hora. A placa foi então lavada com 200 μL de TBST trêsvezes, e 100 μL de anticorpo anti-Ang2 em cabra biotinilado(1:1000, R&D Systems BAF623, Minneapolis, MN) foramadicionados e incubados por 1 hora, na temperatura ambiente.Após três lavagens com 200 μΐ, de TBST, 100 μΐ, deEstreptavidina ligada à HRP (1:200; R&D systems n- DY998,Minneapolis, MN) foram adicionados e incubados natemperatura ambiente, por 0,5 hora. Então, a placa foilavada novamente com 200 de TBST três vezes, e 100 μί desolução de TMP (Pierce, n2 34028) foram adicionados eincubados no escuro, na temp. ambiente, por 5 minutos. Umasolução de 100 μϋ contendo H2SO4 a 2 N foi adicionada parainterromper a reação e a placa foi lida por SpectroMax a 450nm. Os resultados são dados na coluna final da Tabela 4abaixo.
Ensaio de FACS
A célula endotelial da veia umbilical humana("HUVEC") (ATCC) e a célula K293, uma linhagem celularsuperexpressando o. receptor de Tie2 humano, foram usadaspara determinar a IC50 dos aptâmeros de MNA para Ang2específicos que inibem a ligação da Ang2 ao receptor de Tie2sobre a membrana celular. Em resumo, o vetor de expressãode mamífero recombinante pCDNA3.1-Tie2 foi transfectado em293 células (ATCC, Manassas, VA) e os clones estáveis foramentão obtidos após seleção com G418 (Invitrogen, Carlsbad,CA). A citometria de fluxo demonstrou a expressão daproteína Tie2 sobre ambas as células HUVEC e K293. Umensaio de titulação de Ang2 adicionalmente determinou asquantidades de Ang2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) para oensaio de inibição do aptâmero nas células HUVEC e K293, queeram 1 e 0,1 μς/ιη!·, respectivamente.
No ensaio de ligação por citometria de fluxo, ascélulas HUVEC e K293 (2 χ IO5 células/poço) foramprecipitadas na placa com 96 poços de fundo em V e foramsubseqüentemente suspensas novamente e incubadas em soluçõesde aptâmero de MNA/Ang2 por 2 horas. As soluções deaptâmero/Ang2 foram preparadas por pré-incubação de dosagensdiferentes de aptâmeros (100 nM, 33,3 nM, 11,1 nM, 3,7 nM,1,2 nM, 0,411 nM, 0,137 nM, e 0,0456 nM) com Ang2 em tampão.de FACs (1% de BSA, 0,2% de azida sódica em PBS) , por 30 min,sobre gelo. Após três lavagens com tampão de FACs, ascélulas foram incubadas, 30 minutos, com anticorpo Anti-Ang2humana biotinilado (5 μg/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN),seguidos por uma outra incubação de 30 minutos comEstreptavidina PE (1:10; BD Biosciences, San Jose, CA). Aanálise por FACS foi completada usando o FACScan (BDBiosciences, . San Jose, CA) . Os resultados são descritos naTabela 4 abaixo.
Tabela 4: Resumo dos resultados de ligação efuncionais para os aptâmeros de MNA anti-Ang2
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EXEMPLO 6: Seleção de Aptâmeros usando a T7 RNApolimerase mutante Y639L/H784A/K378R
Uma seleção foi efetuada para identificar osaptâmeros para a IgE humana (daqui por diante, "h-IgE")usando um agrupamento consistindo em 21-OMe nucleotideos depurina e pirimidina (daqui por diante, "mRmY"). Aestratégia de seleção produziu aptâmeros de altas afinidades,específicos para a h-IgE.
A IgE humana foi adquirida de Athens Research &Technology (Cat. n- 16-16-090705 Athens, GA)). A T7 RNApolimerase (Y639L/H784A/K378R) foi expressa e purificadaconforme descrito no Exemplo 3 acima. Os 21-OMe
nucleotideos de purina e pirimidina foram adquiridos daTriLink BioTechnologies (San Diego, CA).
Seleção do aptâmero para IgE
Preparação do Agrupamento
Um molde de DNA com a seqüência 51-TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG ARC2118 (SEQ ID NO 3) foi sintetizadousando um sintetizador de DNA ABI EXPEDITE® (AppliedBiosystems, Foster City, CA) , e desprotegido por métodospadrões. Os moldes foram amplificados com os primers (5'-(GAT C GAT C GAT C GAT C GAT C TAATAC G AC T CAC T AT AGGG G AGT AC AATAACGTTCTCG-31) (SEQ ID NO 118 ) e (5'-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCC-3') (SEQ ID NO 119 ) e então usadoscomo um molde para a transcrição in vitro com a T7 RNApolimerase (Y639L/ H784A/ K378R). As transcrições foramfeitas usando Hepes a 50 mM, DTT a 10 mM, espermidina a 0,5mM, 0, 0025 % de TritonX-100, 10% de PEG-8000, MgCl2 a 8 mM,MnCl2 a 2,5 mM, mCTP a 1,5 mM, mUTP a 1,5 mM, mGTP a 1,5 mM,mATP a 1,5 mM, GMP a 1 mM, 0,01 unidade/yL de pirofosfataseinorgânica, e ~ 9 yg/mL de Tl polimerase mutante (Y639L/H784A/ K378R) e molde de DNA a 0,3 μΜ, para gerar oagrupamento de ARC2118 MNA.
Seleção
A seleção foi iniciada por incubação de 330 pmols(2xl014 moléculas) do agrupamento de MNA ARC 2118 com 24pmols de proteína ligada a uma placa hidrofóbica bloqueadacom BSA (placa Maxisorp, Nunc, Rochester, NY) , em um volumefinal de tampão de seleção de 100 μΐϋ (IX PBS da Dulbecco(DPBS)), por 1 h, na temperatura ambiente. 0 poço foilavado quatro vezes com 120 μΐ^ de DPBS para remover osligantes não específicos. 0 RNA foi eluido e transcritoinvertido com o sistema ThermoScript RT-PCR® (Invitrogen,Carlsbad, CA) , de acordo com as instruções do fabricante,usando o primer SEQ ID NO 119. 0 cDNA foi amplificado porPCR com Taq polimerase (New England Biolabs, Beverly, MA) ,de acordo com as instruções do fabricante, usando a SEQ IDNO 118 e a SEQ ID NO 119. Os moldes foram transcritosconforme descrito acima para a preparação do agrupamento epurificados sobre um gel de poliacrilamida de desnaturação.
Todas as rodadas foram realizadas com h-IgEimobilizada sobre placas hidrofóbicas. Cada rodada deseleção foi iniciada por imobilização de 24 pmols de h-IgEna superfície de uma placa hidrofóbica Maxisorp da Nunc, por1 hora, na temperatura ambiente, em 100 μΕ de IX DPBS. Aincubada com tampão de bloqueio (IX DPBS, e 0,1 mg/mL deBSA) , por 1 hora. 0 sobrenadante foi então removido e ospoços foram lavados, quatro vezes, com 120 de IX DPBS.
Começando na Rodada 2, o RNA do agrupamento foi incubado por1 hora na temperatura ambiente nos poços vazios, então por 1hora em um poço que tinha sido previamente bloqueado com 100μΐ, de tampão de bloqueio. A partir da Rodada 2 em diante,um competidor não específico foi adicionado à etapa deseleção positiva (0,1 mg/mL de tRNA, e 0,1 mg/mL de ssDNA).Em todos os casos, o RNA do agrupamento ligado à h-IgEimobilizada foi transcrito invertido diretamente na placa deseleção, pela adição da mistura de transcrição reversa("TR") (primer em 3', SEQ ID NO 119, e Thermoscript RT,Invitrogen, Carlsbad, CA), seguida por incubação a 65°C por1 hora. O cDNA resultante foi usado como um molde para aPCR (Taq polimerase, New England Biolabs, Beverly, MA) e atranscrição, conforme descrito para a rodada 1. Ascondições para cada rodada estão na Tabela 5.
Tabela 5. Resumo das Rodadas
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Análise da Ligação do Aptâmero de MNA
Os ensaios de ligação por dot blot foram efetuadospor todas as seleções, para monitorar a afinidade de ligaçãodos agrupamentos pelas proteínas. 0 RNA do agrupamentomarcado na extremidade com traços de 32P foi combinado com ah-IgE e incubado na temperatura ambiente, por 30 minutos, emtampão de DPBS, em um volume final de 30 μΐϋ. A mistura foiaplicada a uma aparelhagem de dot blot (Minifold-1 Dot Blot,Acrílico, Schleicher e Schuell, Keene, NH), montada (do topoaté o fundo) com nitrocelulose, náilon, e membranas blot emgel. 0 RNA que está ligado à proteína é capturado sobre ofiltro de nitrocelulose; enquanto que o RNA não ligado àproteína é capturado sobre o filtro de náilon. 0enriquecimento para a ligação da h-IgE foi visto começandona Rodada 8. Os moldes do agrupamento das Rodadas 5, 8 e 12foram clonados usando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen,Carlsbad, CA), de acordo com as instruções do fabricante.
Os dados de seqüenciamento revelaram que o agrupamento daRodada 8 tinha se convergido em um único clone principal quecompreendia 59% das seqüências totais. Esse clone principale três mínimeros possíveis foram escolhidos para a síntesequímica, e as constantes de dissociação (Kd) foramdeterminadas. Resumidamente, os RNAs sintéticos forammarcados na extremidade de 5' com γ-32Ρ ATP e os valores deKD foram determinados usando o ensaio por dot blot e ascondições de tampão de IX DPBS (c/ Ca2+ e Mg2 + ) (Gibco,Catálogo n£ 14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) . As KDs foramestimadas adaptando-se os dados à equação: fração de RNAligado = amplitude * (((AptConc+[h-IgE]+KD) - SQRT((AptConc+[h-IgE]+ KD)2 - 4(AptConc*[h-IgE])))/(2*AptConc)) + base. 0clone principal tinha uma K0 de cerca de 800 pM. 0 melhormínimero de ligação foi também testado quanto à ligação àIgE de macaco (m-IgE), porém não demonstrou ligação reativacruzada com a proteína IgE de macaco. Essa ausência dereatividade cruzada foi também confirmada por ELISA. Osmínimeros com um dT invertido sobre a extremidade de 3'foram usados como a molécula de origem para o processo dequímica medicinal.
Química Medicinal
A composição química de um dos mínimeros de MNAespecíficos para IgE (Figura 11) foi alterada paraaperfeiçoar a afinidade e a potência, ao mesmo tempomantendo a estabilidade plasmática do composto. 0 processoincluiu o projeto, a síntese e a avaliação de uma série dederivados do aptâmero para IgE minimizado, onde cadaderivado da série compreendia uma única modificação em cadaocorrência de um nucleotídeo predeterminado, para determinarquais resíduos toleraram a substituição. 0 primeiro grupode modificações foi a substituição de cada 21-OMenucleotídeo único por um desóxi nucleotídeo. Em uma rodadaseparada de modificação, uma série de derivados foisintetizada, em que cada derivado compreendia uma únicamodificação com fosforotioato em uma posição de ligaçãoentre nucleotídeos diferente. Os dados gerados nessas fasesiniciais de modificação foram usados para estabelecer umarelação de atividade da estrutura (SAR) para o aptâmerominimizado. Em uma fase subseqüente de modificação, osaptâmeros foram sintetizados e testados com gruposcompósitos de substituições que foram projetados com basenos dados iniciais da SAR. A partir do painel desubstituições compósitas, identificou-se um aptâmero de 39nucleotideos de comprimento com duas substituições de 2'-OMepor 2'-desóxi introduzidas em sua composição. Além disso,identificou-se um aptâmero minimizado modificado resultante,39 nucleotideos de comprimento, com uma substituição de 2'-OMe por 2'-desóxi e quatro substituições de fosfato porfosforotioato incorporadas em sua composição. Conformemostrado na Figura 12, esse aptâmero modificado comdesóxi/fosforotioato demonstra afinidade de ligaçãoaumentada, comparado tanto ao aptâmero de origem minimizado,porém não modificado, quanto ao aptâmero de origemminimizado tendo duas substituições de 2'-OMe por desóxi.
Estabilidade em Soro
0 aptâmero de origem não modificado e o modificadocom desóxi/fosfrotioato, minimizados, foram testados paradeterminar a sua estabilidade em soros humanos, de ratos ede macacos. Cada aptâmero foi adicionado a 1 ml de sororeunido, até uma concentração final de 5 μΜ em 90% de soro.
Os aptâmeros foram incubados a 37 °C, com agitação, e ospontos de tempo foram coletados a 0, 0, 5, 1, 4, 24, 48, 72,e 98 horas. Em cada ponto de tempo, 90 μΐ de estoque apartir das amostras incubadas foram adicionados a 10 μΐ deEDTA a 0,5 M e congelados a -20 °C, para análise posteriorda estabilidade, usando um sistema BIACORE 2000.
Todas as medições de ligação com biossensor foramefetuadas a 25°C, usando um BIACORE 2000 equipado com umchip de biossensor CM5 de grau de pesquisa (BIACORE Inc.,Piscataway, NJ). A IgE humana recombinante purificada(Athens Research & Technology, Athens, GA) foi imobilizada àsuperfície do biossensor usando a química de amino-acoplamento. Para obter isso, as superfícies de duascélulas em fluxo foram primeiramente ativadas por 7 min comuma mistura a 1 : 1 de NHS (N-hidroxissuccinimida) a 0,1 M eEDC (3-(Ν,Ν-dimetilamina) propil-N-etilcarbodiimida) a 0,4 M,em uma vazão de 5 μΐ/min. Após a ativação das superfícies,uma célula em fluxo foi injetada com 50 μς/πιΐ de IgE, a 10μΐ/min, por 20 min, para permitir o estabelecimento deligações covalentes à superfície ativada. A seguir, ocloridrato de etanolamina a 1 M, pH 8,5, foi injetado por 7min, a 5 μΐ/min, para inativar os ésteres residuais. Para acélula em fluxo usada como branco, o cloridrato deetanolamina a 1 M, pH 8,5, foi injetado por 7 min, parainativar os ésteres residuais, sem injeção de proteína.
Um grupo de padrões de aptâmeros foi corridoatravés do chip preparado, para gerar uma curva padrão antesde todos os pontos de tempo serem analisados. Paraestabelecer uma curva padrão, os aptâmeros foram diluídos emsérie (a partir de 200 nM até 12,5 nM) em tampão de HBS-P(HEPES a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, 0, 005% de Tensoativo20) suplementado com 4% de soro humano e EDTA a 50 mM.
Todas as amostras diluídas foram injetadas no Biacore 2000para a ligação, a 20 μΐ/min, por 5 min, e espera por 3minutos. Para regenerar o chip, o NaCl a IN foi injetadopor 60 segundos, a 30 μΐ/min. A resposta de pico RU nofinal da fase de ligação foi plotada contra a concentraçãode aptâmero e uma curva padrão foi gerada usando uma funçãologística de Quatro Parâmetros. Para medir a concentraçãode aptâmero ativo nos soros humanos, de ratos, e de maçados,as amostras nos pontos de tempos foram diluídas 22,5 vezesem HBS-P, para tornar a concentração final em soro a 4%,imediatamente antes da injeção no Biacore 2000. Asconcentrações de aptâmeros funcionais, em cada período deincubação em soro, foram calculadas por conversão da unidadede resposta RU em concentração, usando a curva padrão geradaacima. Como uma medição de controle de qualidade adicional,dois padrões de aptâmeros foram independentemente testadosno final do experimento, para certificar-se que asconcentrações medidas no BIACORE estavam menos do que 20%desviadas dos padrões. 0 aptâmero de origem não modificadoe o modificado com desóxi/fosforotioato, minimizados, foramambos determinados serem mais do que 90% ativos, em 98 horas,nos soros humanos, de ratos, e de macacos.
A invenção, tendo agora sido descrita como formade descrição escrita e exemplo, aqueles de habilidade natécnica reconhecerão que a invenção pode ser praticada emuma variedade de modalidades e que a descrição e os exemplosacima são para propósitos de ilustração, e não limitação,das reivindicações a seguir.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Archemix Corp., et col.
<120> "MATERIAIS E MÉTODOS PARA A GERAÇÃO DE TRANSCRITOS DE ÁCIDOSNUCLÉICOS INTEIRAMENTE MODIFICADOS EM 2"'
<130> 23239-587-061
<150> 60/696.292<151> 30-06-2005
<160> 151
<170> PatentIn versão 3.2
<210> 1<211> 883<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> T7 polimerase modificada, quimicamente sintetizada Y639/H784A<4 00> 1
Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu20 25 30Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu
35 40 45
Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val
50 55 60
Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys65 70 75 80
Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg
85 90 95
Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu
100 105 110
Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser
115 120 125
Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala
130 135 140
Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys145 150 155 160
His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His
165 170 175
Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser
180 185 190
Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp
195 200 205
Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr
210 215 220
Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp225 230 235 240
Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr245 250 255Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val
260 265 270
Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala
275 280 285
Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala
290 295 300
Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile305 310 315 320
Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala
325 330 335
Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile
340 345 350
Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp
355 360 365
Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val
370 375 380
Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe385 390 395 400
Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe
405 410 415
Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe
420 425 430
Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys
435 440 445
Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly
450 455 460
Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys465 470 475 480Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro
485 490 495
Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu
500 505 510
Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr
515 520 525
Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln
530 535 540
His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn545 550 555 560
Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys
565 570 575
Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn
580 585 590
Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys
595 600 605
Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly
610 615 620
Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Leu Gly625 630 635 640
Φ
Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln
645 650 655
Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln
660 665 670
Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr
675 680 685
Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys690 695 700Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg705 710 715 720
Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp
725 730 735
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740 745 750
Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu
755 760 765
Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val Ala
770 775 780
Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu785 790 795 800
Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr
805 810 815
Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met
820 825 830
Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln
835 840 845
Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu
850 855 860
Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe865 870 875 880
Ala Phe Ala
<210> 2<211> 883<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Τ7 polimerase modificada, quimicamente sintetizadaY639L/H7 8 4Α/Κ37 8R
<400> 2
Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu
20 25 30
Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu
35 40 45
Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val
50 55 60
Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys65 70 75 80
Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg
85 90 95
Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu
100 105 110
Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser
115 120 125
Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala
130 135 140
Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys145 150 155 160
His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His165 170 175Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser180 185 190
Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp
195 200 205
Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr
210 215 220
Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp225 230 235 240
Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr
245 250 255
Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val
260 265 270
Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala
275 280 285
Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala
290 295 300
Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile305 310 315 320
Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala
325 330 335
Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile
340 345 350
Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp
355 360 365
Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Arg Arg Ala Ala Ala Ala Val
370 375 380
Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe385 390 395 400
Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe
405 410 415
Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe
420 425 430
Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys
435 440 445
Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly
450 455 460
Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys465 470 475 480
Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro
485 490 495
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500 505 510
Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr
515 520 525
Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln
530 535 540
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Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys
565 570 575
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580 585 590
Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys
595 600 605
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Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Leu Gly625 630 635 640
Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln
645 650 655
Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln
660 665 670
Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr
675 680 685
Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys
690 695 700
Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg705 710 715 720
Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp
725 _ 730 735
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740 745 750
Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu
755 760 765
Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val Ala
770 775 780
Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu785 790 795 800
Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr
805 810 815
Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met
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Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu
850 855 860
Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe865 870 875 880
Ala Phe Ala
<210> 3<211> 93<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado, ARC2118<220>
<221> característica diversa<222> (40)..(69)<223> η é a, t, c ou g
<400> 3
taatacgact cactataggg gagtacaata acgttctcgn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnnnnnnng gatcgttacg actagcatcg atg 93
<210> 4<211> 93<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado, ARC2119<220>
<221> característica diversa<222> (40)..(69)<223> η é a, t, c ou g
<400> 4
taatacgact cactataggg ggtgatattg acgttctcgn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnnnnnnng gatcgttacg actagcatcg atg 93
<210> 5
<211> 93
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado, ARC2120<220>
<221> característica diversa
<222> (40)..(69)
<223> η é a, t, c ou g
<400> 5
taatacgact cactataggg gtgcgcggtt acgttctcgn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnnnnnnng gatcgttacg actagcatcg atg 93
<210> 6<211> 93<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado, ARC2121<220>
<221> característica diversa<222> (40)..(69)<223> η é a, t, c ou g
<400> 6
taatacgact cactataggg ggagggggtg ccgttctcgn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnnnnnnng gatcgttacg actagcatcg atg 93
<210> 7<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado, ARC114 0
<220><221> característica diversa
<222> (22)..(41)
<223> η é a, t, c ou g
<400> 7
taatacgact cactataggg gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nacgtaaccg gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 8<211> 17<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> oligonucleotideo de promotor de T7 fosforilado em 5', quimicamentesintetizado
<220>
<221> base modificada<222> (1)..(1)
<223> onde a timidina na posição 1 está fosforilada em 5'<400> 8
tatagtgagt cgtatta 17
<210> 9<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> esplinte de ligação quimicamente sintetizado<400> 9
taatacgact cactataggg g 21
<210> 10<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 10
taatacgact cactataggg ggtggggcca atggcgggat atacgtaacc ggttataccc 60gggtcgatgc agtaagctag ct 82
<210> 11
<211> 80
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 11
taatacgact cactataggg gatgtacata tgtattcgtg acgtgaccgg ttaaacccgg 60gtcgatgcag taagctagct 80
<210> 12<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 12
taatacgact cactataggg ggagcgggga gacgtagtca tcacgtagcc ggttaaaccc 60gggtcgatgc agtaagctag ct 82
<210> 13
<211> 79
<212> DNA
.<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa
<222> (7)..(7)
<223> η é a, c, g, ou t
<4 00> 13taatacnact cactataggg ggtgggggtg gtggtgataa cgtaaccggt taaacccggg 60tcgatgcagt aagctagct 79
<210> 14<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 14
taatacgact cactataggg gggtgtcacc agatatgcct tgaacgtaac ccgttaaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 15<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 15
taatacgact cactataggg ggtagggggc acgcactaac caacgtaacc ggttaaaccc 60gggtcgatgc agtaagctag ct 82
<210> 16<211> 43<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa
<222> (37)..(37)
<223> η é a, c, g, ou t
<4 00> 16
taatacact cactataggg ggagggggtg ctgaccncaa aca 43
<210> 17<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<4 00> 17
taatacgact cactataggg gtggggctcg gatgagacaa tacgtaaccg gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 18<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 18
taatacgact cactataggg gggggtgggt aggcgagcac tccacgtaac cagttaaacccgggtcgatg cagtaagcta gct
<210> 19<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 19
taatacgact cactataggg gggaaggacg agcagacgag caacgtaacc tgttaaacccgggtcgatgc agtaagctag ct
<210> 20<211> 85<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220><223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 20
taatacgact cactataggg gggggcggtt agagtgtaag taccgacgta accggttaaa 60cccgggtcga tgcagtaagc tagct 85
<210> 21<211> 79<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<40C> 21
taatacgact cactataggg gggttgctgt tagtaacgcc acgtaaccgg ttaaacttgg 60tcgatgcagt aagctagct 79
<210> 22
<211> 84
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 22
taatacgact cactataggg gggcgggaga atgttatata gttacggtaa ccggttaaac 60ccgggtcgat gcagtaagct agct
<210> 23<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 23
taatacgact cactataggg gaaaggggcgggtcgatgca gtaagctagc t
gtatggtaca cacgtaacag gttaaacccg 60
81
<21C> 24<211> 80<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 24
taatacgact cactataggg gggacgtgttgtcgacgcag taagctagct
agcattccag aattcgtaac ctaaacccgg 60
80
<210> 25<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 25
taatacgact cactataggg ggcgtgggag ataggttcaa ggacgtaccg gttatacccgggtcgatgca gtaagctagct
<210> 26<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 26
taatacgact cactataggg gggctccgtg ctatcgtcgg ataacgtaac ccgttaaacccgggtcgatg cagtaagcta gct
<210> 27
<211> 83
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220><223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 27
taatacgact cactataggg ggggagaagg tcttaaggtc gccaacgtaa ctgttaaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 28<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 28
taatacgact cactataggg ggggcatacg agtttaggtg gagacgtaac cggttaaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 29<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 29
taatacgact cactataggg ggatgatgac ttccgcgtta atacgttacc ggttaaaccc 60gggtcgatgc agtaagctag ct 82
<210> 30<211> 75<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 30
taatacgact cactataggg gtgggacgcc gtctgãgtat aacgtacccg gtcgggtcga 60tgcagtaagc tagct 75
<210> 31<211> 87<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 31
taatacgact cactataggg ggggggggac gtaatcggct atcgttcacg taaccggtta 60aacccgggtc gatgcagtaa agggcga 87
<210> 32<211> 84<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 32
taatacgact cactataggg tgggacgggc agcgtggatg taggacgtaa ccggttaaac 60gcgggtcgat gcagtaagct agct 84
<210> 33<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 33
taatacgact cactataggg gggtttgtct gaagtgaagc agaacgtaac cggttaatcc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 34<211> 84<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 34
taatacgact cactataggg ggggagggca catcatcgta tcaaacgtaa ccagttaatc 60ccgggtcgat cagtaagct agct 84
<210> 35<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 35
taatacgact cactataggg gaggctagag gacgcgacag aacgtaaccg gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 36<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 36
taatacgact cactataggg ggcgatcgcg aagggatttc aacgtaaccg gttaaacccgggtcgatgca gtaagctagc t
6081<210> 37<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 37
taatacgact cactatagg gggtagggaa agattacggg gctacgtaac cggttatacctgggtcgatg cagtaagcta gct
<210> 38<211> 75<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 38
taatacgact cactataggg gtggctatgg ctaacacgta accggttata cccgggtcga 60tgcagtaagc tagct 75
6083
<210> 39<211> 86<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 39
taatacgact cactataggg ggggggcggt ggctgtgcaa gcggaaacgt aaccggttaa 60acccgggtcg atgcagtaag ctagct 86
<210> 40<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 40
taatacgact cactataggg gggtgggggc acggtactga gttacgttac cggttaaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 41<211> 78<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 41
taatacgact cactataggg gggagtgggg acaattagaa gatgacgtaa ccgtccgggtcgatgcagta agctagct
<210> 42<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa
<222> (7) .. (7)
<223> η é a, c, g, ou t
<220>
<221> característica diversa
<222> (38)..(38)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 42
taatacnact cactataggg gtgcagtgag gagcgacnag tacgttaccg gttaaatccgagtcgatgca gtaagctagc t
<210> 43<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa
<222> (7)..(7)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 43
taatacnact cactataggg ggacggcac tgtggatgat ttaacgttac cggttaaacc 60cgagtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa
<222> (7) . . (7)
<223> η é a, c, g, ou t<400> 44
taatacnact cactataggg gtcgatgcag taagctagct 40
<210> 45<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa
<222> (7)..(7)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 45
taatacnact cactataggg ggtgatattg acctctaaca gcacgtaacc ggttaaaccc 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 46
<211> 79
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 46
taatacgact cactataggg gggggggtgc agaggatgca tccaagctcg taatcggtgg 60tcgatgcagt aagctagct 79
<210> 47<211> 84<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 47
taatacgact cactataggg gggggcgggt gcttgtgcct aatcacgtaa ccggttaaac 60ccgggtcgat gcagtaagct agct 84
<210> 48<211> 79<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 48
taatacgact cactataggg gtttggtaat cgaacgtgga acgcaaccgg tttaaccggg 60tcgatgcagt aagctagct 79<210> 49<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 49
taatacgact cactataggg gggatggaag aggcttgata tcacgtaacc ggttaaacct 60gggtcgatgc agtaagctag ct 82
<210> 50<211> 76<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 50
taatacgact cactataggg ggttatactaatgcagtaag ctagct
actctgtaca caacgtaacc ggccgggtcg 60
76
<210> 51<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 51
taatacgact cactataggg gtataggggg ggtatcggtg tacgtaaccg gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 52<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 52
taatacgact cactataggg gagtacaata aggttccgag aacgcgaccg gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 53<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 53taatacgact cactataggg gtgcgcggtt acaaggcaac atacgtaacc ggttaaaccc 60gggtcgatgc agtaagctag ct 82
<210> 54<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa
<222> (7)..(7)
<223> η é a, c, g, ou t
<220>
<221> característica diversa
<222> (42) .. (42)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 54
taatacnact cactataggg gggacggggtcgggtcgatg cagtaagcta gct
gacaaagtgt cnaacgtaac cggttaaacc 60
83
<210> 55<211> 81<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 55
taatacgact cactataggg gagacggcgg tacaagtcca tatgtaaccg gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 56<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 56
taatacgact cactataggg gagtgggggc ttctcgttgc cacgtaaccg cttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 57<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 57
taatacgact cactataggg gggctgagcg tgtttgaggg accacgttac cggttaaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 58<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 58
taatacgact cactataggg gggtgggcgc aatgaaaagt tgggcgtaac cggttcaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 59<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 59
taatacgact cactataggg ggtagtgaag taaggcagtg ttacgtaacc ggtgaacccgggtcgatgca gtaagctagc t
6081<210> 60<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 60
taatacgact cactataggg gggagggtgg gctagaacac acaacgtaac cggttaaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 61<211> 84<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 61
taatacgact cactataggg ggggagagagtcaggtcgat gcagtaagct agct
gcggttacgt agggacgtta ccgattgaac 60
84
<210> 62<211> 87<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 62
taatacgact cactataggg ggggggggcg aataggtagg gcgacgaacg ttaccggtta 60aacccgggtc gatgcagtaa gctagct 87
<210> 63<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 63
taatacgact cactataggg ggagaggagg tccggctaga caacgtaacc ggttaaaccc 60gggtcgatgc agtaagctag ct 82
<210> 64<211> 69<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 64
taatacgact cactataggg gggaggacgg gtcgtactgt taaacctggg tcgatgcagt 60aagctagct 69
<210> 65<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 65
taatacgact cactataggg ggcgcaacaa cgggaagtat acgtaaccgg tttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 66<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 66
taatacgact cactataggg ggaaggaaca cgcacatgca taacgtaact ggttgaccccgggtcgatgc agtaactag ct
6082<210> 67<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 67
taatacgact cactataggg gagtggggag tactgtggac aacgtgaccg gttaaacccgggtcgatgca gtaagctagc t
<210> 68<211> 40<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 68
taatacgact cactataggg gtcgatgcag taagctagct
<210> 69<211> 85<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicaraente sintetizada<400> 69
taatacgact cactataggg gggggggcta gggcggtcgg atcggacgta accagttaaa 60cccgggtcga tgcagtaagc tagct 85
<210> 70<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 70
taatacgact cactataggg ggggtggggg ttgctacatg ccctcgtaac cggttaagcc 60caggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 71<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 71
taatacgact cactataggg gggtggcgac gatggaaga ataacgtaat cggttaaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<2i0> 72<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 72
taatacgact cactataggg ggtaggcgggggtcgatgca gtaagctagc t
cctcatcaac aacgcaaccg gttaaacccg 60
81
<210> 73<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 73
taatacgact cactataggg ggtggctggtgggtcgatgc agtaagctag ct
aagacacaa acacgtaact cgttaaaccc 60
82
<210> 74<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 74
taatacgact cactataggg gggcgggcag cgcttataga tccacgtaac cggttaaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 75<211> 86<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 75
taatacgact cactataggg ggggggtatc tgcggttagg ctatcgacgt acccagttaa 60acccgggtcg atgcagtaag ctagct 8 6
<210> 76<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 76
taatacgact cactataggg ggggtagggg acatcatagg tatacgtaac cggttaaccc 60gggtcgatgc agtaagctag ct 82
<210> 77<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 77
taatacgact cactataggg gcgcgtgcgt gtatccatta aacgtgactg gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 78<211> 84<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 78
taatacgact cactataggg gggggagcgt ggatcttgag tgtatacgta accggttaaacccggtcgat gcagtaagct agct
6084<210> 79<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 79
taatacgact cactataggg gatggagag agtgtacgca tatacaaccg gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 80<211> 80<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 80
taatacgact cactataggg gcgggtggtc gcgatggtta acgtaactgg ttaaacccgg 60gtcgatgcag taagctagct 80
<210> 81<211> 90<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 81
taatacgact cactataggg gggggggggg acgttagctt ctctgtattt acgtaaccgg 60ttaagcccgg gtcgatgcag taagctagct 90
<210> 82<211> 40<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 82
taatacgact cactataggg gtcgatgcag taagctagct 40
<210> 83<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa<222> (43)..(43)<223> η é a, c, g, ou t<400> 83
taatacgact cactataggg gggatggagt gggtgcaaat aanacgtaac tggttaaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 84
<211> 81
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa
<222> (24) .. (24)
<223> η é a, c, g, ou t
<220>
<221> característica diversa
<222> (39)..(39)
<223> η é a, c, g, ou t
<220>
<221> caracter!stica diversa<222> (43)..(43)
<223> η é a, c, g, ou t
<220>
<221> característica diversa
<222> (48)..(48)
<223> η é a, c, g, ou t
<220>
<221> característica diversa
<222> (50)..(50)
<223> η é a, c, g, ou t
<220>
<221> característica diversa
<222> (69)..(71)
<223> η é a, c, g, ou t
<220>
<221> característica diversa
<222> (74)..(75)<223> η é a, c, g, ou t
<220>
<221> característica diversa
<222> (78)..(78)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica diversa<222> (80)..(80)<223> η é a, c, g, ou t
<400> 84
taatacgact cactataggg gagngtgagg ggtgaatant aangtaancn gttaaacctg 60ggtcgatgnn ntannctngn t 81
<210> 85<211> 40<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa<222> (1)..(1)<223> η é a, c, g, ou t
<220>
<221> característica diversa
<222> (5)..(6)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica diversa<222> (16)..(16)<223> η é a, c, g, ou t
<400> 85
naatnngact cacaanaggg gtcgatgcag taagctagct 40
<210> 86<211> 84<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 86
taatacgact cactataggg gggggtgacg tacggatcta agtaacgtaa ccggttaaac 60ccgggtcgat gcagtaagct agct 84
<210> 87<211> 80<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 87
taatacgact cactataggg gagggacaga cactttgtag acgtaaccag ttaaacccgg 60gtcgatgcag taagctagct 80
<210> 88<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 88
taatacgact cactataggg gggggacttg gcactacgta acaacgtaac cgcttaaacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 89<211> 86<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 89
taatacgact cactataggg gggggggcct ctcgaccaaa agcccaacgt aaccggttaa 60acccgggtcg atgcagtaag ctagct 86<210> 90<211> 85<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa
<222> (7) . . (7)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 90
taatacnact cactataggg ggggggggat agtcatgact gataaaacgt aactgttgag 60cccgggtcga tgcagtaagc tagct 85
<210> 91<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 91
taatacgact cactataggg gacagtgcta gtggaatagc aacgtaacca gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81<210> 92<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 92
taatacgact cactataggg gacgaccact atactccgag aacgtaaccg gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 93<211> 82<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 93
taatacgact cactataggg ggatggaggc gtagtgtagt caacgttacc ggttaaaccc 60gggtcgatgc agtaagctag ct 82
<210> 94<211> 82<212> DNA<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 94
taatacgact cactataggg gggaggtatagggtcgatgc agtaagctag ct
gatggaatgg ttatgtaacc tgttaaaccc 60
82
<210> 95<211> 81<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 95
taatacgact cactataggg gtggggagga ccacttagat aacgtcaccg gttaaacccg 60ggtcgatgca gtaagctagc t 81
<210> 96<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 96
taatacgact cactataggg gggatagggg cgagagagtc acaacgtaac cggttaatcc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 97<211> 83<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 97
taatacgact cactataggg gggggatggc cgaatcataa aataacgtaa ccgttagacc 60cgggtcgatg cagtaagcta gct 83
<210> 98<211> 78<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 98
taatacgact cactataggg ggcgattgct gagtcagttc gtaatcggtt aaacccgggtcgatgcagta agctagct
6078<210> 99<211> 85<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 99
taatacgact cactataggg gggggaggat ccgaaacaca gggatccgta accggttaaagccgggtcga tgcagtaagc tagct
<210> 100<211> 883<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> T7 polimerase modificada, quimicamente sintetizada Y639L<4 00> 100
Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu
15 10 15
Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu
20 25 30
Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu35 40 45Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val
50 55 60
Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys65 70 75 80
Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg
85 90 95
Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu
100 105 110
Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser
115 120 125
Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala
130 135 140
Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys145 150 155 160
His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His
165 170 175
Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser
180 185 190
Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp
195 200 205
Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr
210 215 220
Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp225 230 235 240
Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr
245 250 255
Arg Ala C-Iy Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val260 265 270Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala
275 280 285
Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala
290 295 300
Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile305 310 315 320
Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala
325 330 335
Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile
340 345 350
Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp
355 360 365
Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val
370 375 380
Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe385 390 395 400
Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe
405 410 415
Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe
420 425 430
Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys
435 440 445
Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly
450 455 460
Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys465 470 475 480
Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro485 490 495Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu
500 505 510
Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr
515 520 525
Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Ile Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln
530 535 540
His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn545 550 555 560
Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys
565 570 575
Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn
580 585 590
Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys
595 600 605
Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly
610 615 620
Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Leu Gly625 630 635 640
Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln
645 650 655
Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln
660 665 670
Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr
675 680 685
Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys
690 695 700
Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg705 710 715 720Lys Arg Cys AIa
Gln Glu Tyr Lys740
Gly Gln Phe Arg755
Ile Asp Ala His770
Ser Gln Asp Gly785
Lys Tyr Gly Ile
Ile Pro Ala Asp820
Val Asp Thr Tyr835
Phe Ala Asp Gln850
Pro Ala Lys Gly865
Ala Phe Ala
<210> 101<211> 883<212> PRT<213> Següência
Val His Trp Val725
Lys Pro Ile Gln
Leu Gln Pro Thr760
Lys Gln Glu Ser775
Ser His Leu Arg790
Glu Ser Phe Ala805
Ala Ala Asn Leu
Glu Ser Cys Asp840
Leu His Glu Ser855
Asn Leu Asn Leu870
Artificial
Thr Pro Asp Gly730
Thr Arg Leu Asn745
Ile Asn Thr Asn
Gly Ile Ala Pro780
Lys Thr Val Val795
Leu Ile His Asp810
Phe Lys Ala Val825
Val Leu Ala Asp
Gln Leu Asp Lys860
Arg Asp Ile Leu875
Phe Pro Val Trp735
Leu Met Phe Leu750
Lys Asp Ser Glu765
Asn Phe Val His
Trp Ala His Glu800
Ser Phe Gly Thr815
Arg Glu Thr Met830
Phe Tyr Asp Gln845
Met Pro Ala Leu
Glu Ser Asp Phe880
<220><223> Τ7 polimerase modificada, quimicamente sintetizada, Y639L/K378R<400> 101
Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu
20 25 30
Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu
35 40 45
Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val
50 55 60
Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys65 70 75 80
Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg
85 90 95
Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu
100 105 110
Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser115 120 125
Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala
130 135 140
Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys145 150 155 160
His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His
165 170 175
Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser180 185 190Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp
195 200 205
Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr
210 215 220
Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp225 230 235 240
Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr
245 250 255
Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val
260 265 270
Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala
275 280 285
Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala
290 295 300
Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile305 310 315 320
Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala
325 330 335
Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile
340 345 360
Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp
355 360 365
Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Arg Arg Ala Ala Ala Ala Val
370 375 380
Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe385 390 395 400
Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe405 410 415Pro Tyr Asn Met Asp Trp420
Asn Pro Gln Gly Asn Asp435
Gly Lys Pro Ile Gly Lys450
Ala Asn Cys Ala Gly Val465 470
Phe Ile Glu Glu Asn His485
Leu Glu Asn Thr Trp Trp500
Ala Phe Cys Phe Glu Tyr515
Asn Cys Ser Leu Pro Leu530
His Phe Ser Ala Met Leu545 .550
Leu Leu Pro Ser Glu Thr565
Lys Val Asn Glu Ile Leu580
Glu Val Val Thr Val Thr595
Val Lys Leu Gly Thr Lys610
Val Thr Arg Ser Val Thr625 630
Arg Gly Arg Val Tyr Ala425
Met Thr Lys Gly Leu Leu440
Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu455 460
Asp Lys Val Pro Phe Pro475
Glu Asn Ile Met Ala Cys490
Ala Glu Gln Asp Ser Pro505
Ala Gly Val Gln His His520
Ala Phe Asp Gly Ser Cys535 540
Arg Asp Glu Val Gly Gly555
Val Gln Asp Ile Tyr Gly570
Gln Ala Asp Ala Ile Asn585
Asp Glu Asn Thr Gly Glu600
Ala Leu Ala Gly Gln Trp615 620
Lys Arg Ser Val Met Thr635
Val Ser Met Phe430
Thr Leu Ala Lys445
Lys Ile His Gly
Glu Arg Ile Lys480
Ala Lys Ser Pro495
Phe Cys Phe Leu510
Gly Leu Ser Tyr525
Ser Gly Ile Gln
Arg Ala Val Asn560
Ile Val Ala Lys575
Gly Thr Asp Asn590
Ile Ser Glu Lys605
Leu Ala Tyr Gly
Leu Ala Leu Gly640Ser Lys Glu Phe
Pro Ala Ile Asp660
Ala Ala Gly Tyr675
Val Val Ala Ala690
Leu Leu Ala Ala705
Lys Arg Cys Ala
Gln Glu Tyr Lys740
Gly Gln Phe Arg
755Ile Asp Ala His770
Ser Gln Asp Gly785
Lys Tyr Gly Ile
Ile Pro Ala Asp820
Val Asp Thr Tyr835
Phe Ala Asp Gln850
Gly Phe Arg Gln645
Ser Gly Lys Gly
Met Ala Lys Leu680
Val Glu Ala Met695
Glu Val Lys Asp710
Val His Trp Val725
Lys Pro Ile Gln
Leu Gln Pro Thr760
Lys Gln Glu Ser775
Ser His Leu Arg790
Glu Ser Phe Ala805
Ala Ala Asn Leu
Glu Ser Cys Asp840
Leu His Glu Ser855
Gln Val Leu Glu650
Leu Met Phe Thr665
Ile Trp Glu Ser
Asn Trp Leu Lys700
Lys Lys Thr Gly715
Thr Pro Asp Gly730
Thr Arg Leu Asn745
Ile Asn Thr Asn
Gly Ile Ala Pro780
Lys Thr Val Val795
Leu Ile His Asp810
Phe Lys Ala Val825
Val Leu Ala Asp
Gln Leu Asp Lys860
Asp Thr Ile Gln655
Gln Pro Asn Gln670
Val Ser Val Thr685
Ser Ala Ala Lys
Glu Ile Leu Arg720
Phe Pro Val Trp735
Leu Met Phe Leu750
Lys Asp Ser Glu765
Asn Phe Val His
Trp Ala His Glu800
Ser Phe Gly Thr815
Arg Glu Thr Met830
Phe Tyr Asp Gln845
Met Pro Ala LeuPro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe865 870 875 880
Ala Phe Ala
<210> 102<211> 883<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> T7 polimerase modificada, quimicamente sintetizada,P266L/Y639L/H784A
<4 00> 102Met Asn1
Ala Ala
Ala Arg
Ala Arg50
Ala Asp65
Met IleGly Lys
Thr Ile
Ile Pro20
Glu Gln
35Phe Arg
Asn Ala
Ala Arg
Arg Pro100
Asn Ile
. 5Phe Asn
Leu Ala
Lys Met
Ala Ala70
Ile Asn
85Thr Ala
Ala Lys
Thr Leu
Leu Glu40
Phe Glu
55Lys Pro
Asp Trp
Phe Gln
Asn Asp10
Ala Asp
25His Glu
Arg Gln
Leu Ile
Phe Glu90
Phe Leu105
Phe Ser
His Tyr
Ser Tyr
Leu Lys60
Thr Thr
75Glu Val
Gln Glu
Asp Ile
Gly Glu30
Glu Met45
Ala Gly
Leu Leu
Lys Ala
Ile Lys110
Glu Leu15
Arg Leu
Gly Glu
Glu Val
Pro Lys80
Lys Arg95
Pro GluAla Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser
115 120 125
Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala
130 135 140
Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys145 150 155 160
His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His
165 170 175
Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser
180 185 190
Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp
195 200 205
Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr
210 215 220
Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp225 230 235 240
Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr
245 250 255
Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Leu Met Phe Gln Pro Cys Val
260 265 270
Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala
275 280 285
Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala
290 295 300
Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile305 310 315 320
Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala325 330 335Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile
340 345 350
Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp
355 360 365
Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val
370 375 380
Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe385 390 395 400
Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe
405 410 415
Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe
420 425 430
Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys
435 440 445
Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly
430 455 460
Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys465 470 475 480
Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro
485 490 495
Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu
500 505 510
Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr
515 520 525
Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln
530 535 540
His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn545 550 555 560Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys
565 570 575
Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn
580 585 590
Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys
595 600 605
Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly
610 615 620
Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Leu Gly625 630 635 640
Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln
645 650 655
Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln
660 665 670
Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr
675 680 685
Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys
690 695 700
Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg705 710 715 720
Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp
725 730 735
Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu
740 745 750
Gly Gln Pne Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu
755 760 765
Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val Ala770 775 780Ser Gln Asp Gly Ser785
Lys Tyr Gly Ile Glu805
Ile Pro Ala Asp Ala820
Val Asp Thr Tyr Glu835
Phe Ala Asp Gln Leu850
Pro Ala Lys Gly Asn865
Ala Phe Ala
<210> 103<211> 883<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> T7 polimerase modificada, quimicamente sintetizada,P2EEL/Y639L/H784A/K378R
<4 00> 103
Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu20 25 30
His Leu Arg Lys Thr790
Ser Phe Ala Leu Ile810
Ala Asn Leu Phe Lys825
Ser Cys Asp Val Leu840
His Glu Ser Gln Leu855
Leu Asn Leu Arg Asp870
Val Val Trp Ala His Glu795 800
His Asp Ser Phe Gly Thr815
Ala Val Arg Glu Thr Met830
Ala Asp Phe Tyr Asp Gln845
Asp Lys Met Pro Ala Leu860
Ile Leu Glu Ser Asp Phe875 880Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu
35 40 45
Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val
50 55 60
Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys65 70 75 80
Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg
85 90 95
Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu
100 105 110
Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser
115 120 125
Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala
130 135 140
Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys145 150 155 160
His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His
165 170 175
Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser
180 185 190
Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp
195 200 205
Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr
210 215 220
Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp225 230 235 240
Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr245 250 255Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Leu Met Phe Gln Pro Cys Val
260 265 270
Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala
275 280 285
Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala
290 295 300
Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu.Val Tyr Lys Ala Ile305 310 315 320
Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala
325 330 335
Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile
340 345 350
Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp
355 360 365
Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Arg Arg Ala Ala Ala Ala Val
370 375 380
Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe385 390 395 400
Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe
405 410 415
Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe
420 425 430
Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys
435 440 445
Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly
450 455 460
Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys465 470 475 480Phe Ile Glu Glu Asn485
Leu Glu Asn Thr Trp500
Ala Phe Cys Phe Glu515
Asn Cys Ser Leu Pro530
His Phe Ser Ala Met545
Leu Leu Pro Ser Glu565
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Glu Val Val Thr Val595
Val Lys Leu Gly Thr610
Val Thr Arg Ser Val625
Ser Lys Glu Phe Gly645
Pro Ala Ile Asp Ser660
Ala Ala Gly Tyr Met675
Val Val Ala Ala Val690
His Glu Asn Ile Met490
Trp Ala Glu Gln Asp505
Tyr Ala Gly Val Gln520
Leu Ala Phe Asp. Gly535
Leu Arg Asp Glu Val550
Thr Val Gln Asp Ile570
Leu Gln Ala Asp Ala585
Thr Asp Glu Asn Thr600
Lys Ala Leu Ala Gly615
Thr Lys Arg Ser Val630
Phe Arg Gln Gln Val650
Gly Lys Gly Leu Met665
Ala Lys Leu Ile Trp680
GIu Ala Met Asn Trp695
Ala Cys Ala Lys Ser Pro495
Ser Pro Phe Cys Phe Leu510
His His Gly Leu Ser Tyr525
Ser Cys Ser Gly Ile Gln540
Gly Gly Arg Ala Val Asn555 560
Tyr Gly Ile Val Ala Lys575
Ile Asn Gly Thr Asp Asn590
Gly Glu Ile Ser Glu Lys605
Gln Trp Leu Ala Tyr Gly620
Met Thr Leu Ala Leu Gly635 640
Leu Glu Asp Thr Ile Gln655
Phe Thr Gln Pro Asn Gln670
Glu Ser Val Ser Val Thr685
Leu Lys Ser Ala Ala Lys700Leu Leu Ala Ala Glu705
Lys Arg Cys Ala Val725
Gln Glu Tyr Lys Lys740
Gly Gln Phe Arg Leu755
Ile Asp Ala His Lys770
Ser Gln Asp Gly Ser785
Lys Tyr Gly Ile Glu805
Ile Pro Ala Asp Ala820
Val Asp Thr Tyr Glu835
Phe Ala Asp Gln Leu850
Pro Ala Lys Gly Asn865
Ala Phe Ala
Val Lys Asp Lys Lys710
His Trp Val Thr Pro730
Pro Ile Gln Thr Arg745
Gln Pro Thr Ile Asn760
Gln Glu Ser Gly Ile775
His Leu Arg Lys Thr790
Ser Phe Ala Leu Ile810
Ala Asn Leu Phe Lys825
Ser Cys Asp Val Leu840
His Glu Ser Gln Leu855
Leu Asn Leu Arg Asp870
Thr Gly Glu Ile Leu Arg715 720
Asp Gly Phe Pro Val Trp735
Leu Asn Leu Met Phe Leu750
Thr Asn Lys Asp Ser Glu7 65
Ala Pro Asn Phe Val Ala780
Val Val Trp Ala His Glu795 800
His Asp Ser Phe Gly Thr815
Ala Val Arg Glu Thr Met830
Ala Asp Phe Tyr Asp Gln845
Asp Lys Met Pro Ala Leu860
Ile Leu Glu Ser Asp Phe875 880
<210> 104<211> 20<212> DNA<213> Seqüência
Artificial<220>
<223> primer em 5', quimicamente sintetizado<400> 104
agctagctta ctgcatcgac 20
<210> 105<211> 18<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> primer em 3', quimicamente sintetizado<400> 105
taatacgact cactatag 18
<210> 106
<211> 94
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA de controle, quimicamente sintetizado,sem seqüência lider, ARC2117
<220><221> característica diversa<222> (41)..(70)<223> η é a, t, c ou g
<400> 106
taatacgact cactataggg gagaggagag aacgttctcg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnnnnnnnn ggatcgttac gactagcatc gatg 94
<210> 107<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 107
agtcatgacg ctggctctgg ggtccaaaga gttcg 35
<210> 108<211> 34<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400>
108gaactctttg gaccccagag ccagcgtcat gact 34
<210> 109<211> 31<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 109
ggctggcatc tctctgatgt tccaaccttgc 31
<210> 110<211> 31<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 110
gcaaggttgg aacatcagag agatgccagcc 31
<210> 111<211> 34<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 111
cgctcctaac tttgtagcca gccaagacgg tagc
<210> 112<211> 34<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 112
gctaccgtct tggctggcta caaagttagg agcg
<210> 113
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada
<400> 113
gctctcaccg cgtggagacg tgctgccgct gct<210> 114<211> 33<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência quimicamente sintetizada<400> 114
agcagcggca gcacgtctcc acgcggtgag age 33
<210> 115<211> 66<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> primer em 5', quimicamente sintetizado<400> 115
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaataa tacgactcac tataggggag tacaataacg 60ttctcg 66
<210> 116<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> primer em 3', quimicamente sintetizada<400> 116
catcgatgct agtcgtaacg 20
<210> 117<211> 24<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizada<220>
<221> característica diversa
<222> (5)..(20)
<223> η é a, t, c ou g
<220>
<221> característica diversa<222> (21)..(24)<223> η é a, c , ou t
<4 00> 117
ggggnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24
<210> 118<211> 59<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> primer quimicamente sintetizado<400> 118
gatcgatcga tcgatcgatc taatacgact cactataggg gagtacaata acgttctcg
<210> 119<211> 24<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> primer quimicamente sintetizado<400> 119
catcgatgct agtcgtaacg atcc
<210> 120<211> 2652<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de T7 RNA polimerase do tipo selvagem, quimicamentesintetizada<400> 120
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt-aggt.caagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020
atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg cgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaâaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1660
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacga 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 24 60
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttçgcgt aa 2652
<210> 121<211> 883<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> 'seqüência de T7 RNA polimerase do tipo selvagem, quimicamentesintetizada<400> 221
Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu
20 25 30
Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu
35 40 45
Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val
50 55 60
Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys65 70 75 80
Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg
85 90 . 95
Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu
100 105 110
Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser
115 120 125
Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala
130 135 140
Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys145 150 155 160
His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His
165 170 175
Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser
180 185 190
Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp195 200 205Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr
210 215 220
Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp225 230 235 240
Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr
245 250 255
Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val
260 265 270
Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala
275 280 285
Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala
290 295 300
Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile305 310 315 320
Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala
325 330 335
Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile
340 345 350
Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp
355 360 365
Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val
370 375 380
Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe385 390 395 400
Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe
405 410 415
Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe420 425 430Asn Pro Gln Gly Asn435
Gly Lys Pro Ile Gly450
Ala Asn Cys Ala Gly465
Phe Ile Glu Glu Asn485
Leu Glu Asn Thr Trp500
Ala Phe Cys Phe Glu515
Asn Cys Ser Leu Pro530
His Phe Ser Ala Met545
Leu Leu Pro Ser Glu565
Lys Val Asn Glu Ile580
Glu Val Val Thr Val595
Val Lys Leu Gly Thr610
Val Thr Arg Ser Val625
Ser Lys Glu Phe Gly645
Asp Met Thr Lys Gly Leu440
Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp455
Val Asp Lys Val Pro Phe470 475
His Glu Asn Ile Met Ala490
Trp Ala Glu Gln Asp Ser505
Tyr Ala Gly Val Gln His520
Leu Ala Phe Asp Gly Ser535
Leu Arg Asp Glu Val Gly550 555
Thr Val Gln Asp Ile Tyr570
Leu Gln Ala Asp Ala Ile585
Thr Asp Glu Asn Thr Gly600
Lys Ala Leu Ala Gly Gln615
Thr Lys Arg Ser Val Met630 635
Phe Arg Gln Gln Val Leu650
Leu Thr Leu Ala Lys445
Leu Lys Ile His Gly460
Pro Glu Arg Ile Lys480
Cys Ala Lys Ser Pro495
Pro Phe Cys Phe Leu510
His Gly Leu Ser Tyr525
Cys Ser Gly Ile Gln540
Gly Arg Ala Val Asn560
Gly Ile Val Ala Lys575
Asn Gly Thr Asp Asn590
Glu Ile Ser Glu Lys605
Trp Leu Ala Tyr Gly620
Thr Leu Ala Tyr Gly640
Glu Asp Thr Ile Gln655Pro Ala Ile Asp660
Ala Ala Gly Tyr675
Val Val Ala Ala690
Leu Leu Ala Ala705
Lys Arg Cys Ala
Gln Glu Tyr Lys740
Gly Gln Phe Arg755
Ile Asp Ala His770
Ser Gln Asp Gly785
Lys Tyr Gly Ile
Ile Pro Ala Asp820
Val Asp Thr Tyr835
Phe Ala Asp Gln850
Pro Ala Lys Gly865
Ser Gly Lys Gly
Met Ala Lys Leu680
Val Glu Ala Met695
Glu Val Lys Asp710
Val His Trp Val725
Lys Pro Ile Gln
Leu Gln Pro Thr760
Lys Gln Glu Ser775
Ser His Leu Arg790
Glu Ser Phe Ala805
Ala Ala Asn Leu
Glu Ser Cys Asp840
Leu His Glu Ser855
Asn Leu Asn Leu870
Leu Met Phe Thr665
Ile Trp Glu Ser
Asn Trp Leu Lys700
Lys Lys Thr Gly715
Thr Pro Asp Gly730
Thr Arg Leu Asn745
Ile Asn Thr Asn
Gly Ile Ala Pro780
Lys Thr Val Val795
Leu Ile His Asp810
Phe Lys Ala Val825
Val Leu Ala Asp
Gln Leu Asp Lys860
Arg Asp Ile Leu875
Gln Pro Asn Gln670
Val Ser Val Thr685
Ser Ala Ala Lys
Glu Ile Leu Arg720
Phe Pro Val Trp735
Leu Met Phe Leu750
Lys Asp Ser Glu765
Asn Phe Val His
Trp Ala His Glu800
Ser Phe Gly Thr815
Arg Glu Thr Met830
Phe Tyr Asp Gln845
Met Pro Ala Leu
Glu Ser Asp Phe880Ala Phe Ala
<210> 122<211> 2652<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de T7 RNA polimerase mutante, quimicamente sintetizada,Y639L/H784A
<400> 122
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat:cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560
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tctggcatCc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggctctgggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agctccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtag ccagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 24 60
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652<210> 123<211> 2652<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de Τ7 RNA polimerase mutante, quimicamente sintetizada,Y639L/1-1784A/K378R
<400> 123
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gagacgtgct 1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg Cgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560
gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggctctgggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtag ccagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2é40
gcgttcgcgt aa 2652<210> 124<211> 2652<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de Τ7 RNA polimerase mutante, quimicamente sintetizada,P266L/Y639L/H784A
<400> 124
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagqtaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctctgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggctctgggg 1920tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340aactttgtag ccagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctcá attggacaaa 2580atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640gcgttcgcgt aa 2652<210> 125<211> 2652<212> DNA<213> Seqüência
Artificial
<220>
<223> seqüência de Τ7 RNA polimerase mutante, quimicamente sintetizada,P266L/Y639L/H7 84A/K378R
<400> 125
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttCaggctgt agcaagcgca 420atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tcçgtgacct tgaagctaag 480cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780ctggctggca tctctctgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840attactggtg gtggctattg ggctaaCggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gagacgtgct 1140
gccgctgcgt tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560
gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaCCgt tcaggaCatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 18 60
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggctctgggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtag ccagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccacjttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aaccttícgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652<210> 126<211> 89<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado<220>
<221> característica diversa<222> (24)..(63)<223> η é a, t, c ou g
<4 00> 126
gggagaattc cgaccagaag cttnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnncatatgt gcgtctacat ggatcctca 8 9
<210> 127 ;
<211> 89<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado<220>
<221> característica diversa<222> (27)..(66)<223> η é a, t, c ou g
<400> 127
gggagagcgg aagccgtgct ggggccnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnnnnnnnncata acccagaggt cgatggatc
<210> 128<211> 94<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado<220>
<221> característica diversa
<222> (21)..(60)
<223> η é a, t, c ou g ;
<400> 128
gggagagaca agcttgggtc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnnagaagagaaa gagaagttaa ttaaggatcc tcag
<210> 129<211> 86<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado<220>
<221> característica diversa<222> (21) . . (60)<223> η é a, t, c ou g
<400> 129
gggagaattc cgaccacaag nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnncatatgtgcg tctacatgga tcctca
<210> 130<211> 40<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220> ;
<223> seqüência de primer em 5', quimicamente sintetizada<400> 130
taatacgact cactataggg agaattccga ccagaagctt
<210> 131<211> 26<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 3', quimicamente sintetizada<400> 131
tgaggatcca tgtagacgca catatg
<210> 132<211> 23<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 3', quimicamente sintetizada<400> 132
gatccatcga cctctgggtt atg
<210> 133<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer 5', quimicamente sintetizada<400> 13'3
taatacgact cactataggg agagacaagc ttgggtc<210> 134
<211> 34
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer 3', quimicamente sintetizada
<400> 134
ctgaggatcc ttaattaact tctctttctc ttct 34
<210> 135<211> 37<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer 5', quimicamente sintetizada<4 00> 135
taatacgact cactataggg agaattccga ccacaag 37
<210> 136<211> 10<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> motivo imunoestimulador quimicamente sintetizado<400> 136
aacgttcgag 10
<210> 137<211> 76<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de DNA, quimicamente sintetizado, ARC3428<220>
<221> característica diversa
<222> (24)..(53)
<223> η é a, t, c, ou g
<400> 137
gggagacaag aataaagcga gttnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnaagagtc 60gatgatgctt agctag 76
<210> 138<211> 77<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado<220>
<221> característica diversa
<222> (24)..(53)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 138
gggccttgta gcgtgcattc ttgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnctaacatactccgaatc tgtcgaa
<210> 139<211> 73<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado<220>
<221> característica diversa<222> (17)..(56)<223> η é a, c, ou t
<400> 139
ggagccttcc tccggannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnntccggtttcccgag ctt<210> 140<211> 87<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, qüimicamente sintetizado<220>
<221> característica diversa
<222> (24)..(63)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 140
gggagacaag aataaacgct caannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnttcgaca ggaggctcac aacaggc 87
<210> 141<211> 24<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 3', qüimicamente sintetizado
<400> 141
ttcgacagat tcggagtatg ttag
24<210> 142
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 5', quimicamente sintetizado
<400> 142
taatacgact cactatagga gccttcctcc gga
<210> 143<211> 17<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 3', quimicamente sintetizado<400> 143
aagctcggga aaccgga
<210> 144<211> 40<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220><223> seqüência de primer em 5',<400> 144
taatacgact cactataggg agacaagaat
<210> 145<211> 24<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 3',<400> 145
gcctgttgtg agcctcctgt cgaa
<210> 146<211> 39<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 5',<400> 146
taatacgact cactataggg gagtacaata
quimicamente sintetizado
aaacgctcaa 40
quimicamente sintetizado
24
quimicamente sintetizado
accagacat 39
<210> 147<211> 24<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 3', quimicamente sintetizado<400> 147
catcgatgct agtcgtaacg atcc
<210> 148<211> 26<212 DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 3', quimicamente sintetizado<400> 148
tgaggatcca tgtagacgca catatg
<210> 149<211> 43<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 5', quimicamente sintetizado<400> 149
taatacgact cactataggg agagcggaag ccgtgctggg gcc 43
<210> 150<211> 76<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> molde de transcrição de DNA, quimicamente sintetizado<220>
<221> característica diversa
<222> (23)..(52)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 150
ggggagtaca ataaccagac atnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnggatcgtt 60acgactagca tcgatg 76
<210> 151<211> 40<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> seqüência de primer em 5', quimicamente sintetizado<400> 151
taatacgact cactataggg ccttgtagcg tgcattcttg

Claims (73)

1. T7 RNA polimerase isolada, CARACTERIZADA porcompreender um aminoácido alterado na posição 639 e na posi-ção 784, onde o aminoácido alterado na posição 639 não é umafenilalanina quando o aminoácido alterado na posição 784 foruma alanina.
2. T7 RNA polimerase isolada, de acordo com a rei-vindicação If CARACTERIZADA por adicionalmente compreenderum aminoácido alterado na posição 378.
3. T7 RNA polimerase isolada, de acordo com quais-quer das reivindicações acima mencionadas, CARACTERIZADA poradicionalmente compreender um aminoácido alterado na posição 266.
4. T7 RNA polimerase isolada, de acordo com quais-quer das reivindicações acima mencionadas, CARACTERIZADA pe-lo fato de que o aminoácido alterado na posição 639 é umaleucina e o aminoácido alterado na posição 784 é uma alanina
5. T7 RNA polimerase isolada, de acordo com quais-quer das reivindicações acima mencionadas, CARACTERIZADA pe-lo fato de que o aminoácido alterado na posição 266 é umaleucina.
6. Tl RNA polimerase isolada, de acordo com quais-quer das reivindicações acima mencionadas, CARACTERIZADA pe-lo fato de que o aminoácido alterado na posição 378 é umaarginina.
7. T7 RNA polimerase isolada, de acordo com quais-quer das reivindicações acima mencionadas, CARACTERIZADA pe-lo fato de que os aminoácidos alterados aumentam a produçãotranscricional de ácidos nucléicos que compreendem modifica-ções de 2'-OMe pela polimerase em uma reação de transcriçãocompreendendo somente trifosfatos de 2'-OMe nucleotideos.
8. T7 RNA polimerase isolada, de acordo com a rei-vindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o aumento naprodução de transcrição é relativo a uma T7 RNA polimerasenão tendo os aminoácidos alterados quando a transcrição forefetuada sob condições de transcrição idênticas.
9. T7 RNA polimerase isolada, de acordo com quais-quer das reivindicações acima mencionadas, CARACTERIZADA pe-lo fato de que os aminoácidos alterados diminuem a diferen-ciação contra os trifosfatos de 2'-OMe nucleotideos.
10. T7 RNA polimerase isolada, de acordo com areivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a diferenci-ação diminuída contra os trifosfatos de 2'-OMe nucleotideosé em relação a uma T7 RNA polimerase não tendo os aminoáci-dos alterados.
11. T7 RNA polimerase isolada, de acordo com areivindicação 8 ou 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a T7RNA polimerase não tendo os aminoácidos alterados é a T7 RNApolimerase do tipo selvagem compreendendo um aminoácido naposição 639 alterado para uma fenilalanina e um aminoácidona posição 784 alterado para alanina.
12. Polipeptideo isolado, CARACTERIZADO por com-preender um aminoácido selecionado a partir do grupo queconsiste em: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 102 e SEQID NO 103.
13. Método de transcrever um ácido nucléico de fi-ta simples, CARACTERIZADO por compreender a incubação de umapolimerase de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes com um ácido nucléico de molde, sob condições dereação suficientes para resultar na transcrição.
14. Ácido nucléico isolado, CARACTERIZADO pelo fa-to de que codifica um polipeptideo de acordo com quaisquerdas reivindicações precedentes.
15. Seqüência de ácidos nucléicos isolada,CARACTERIZADA por ser selecionada a partir do grupo que con-siste em: SEQ ID NO 122, SEQ ID NO 123, SEQ ID NO 124 e SEQID NO 125.
16. Vetor, CARACTERIZADO por compreender uma se-qüência de ácidos nucléicos isolada de acordo com a reivin-dicação 14 ou 15.
17. Vetor de expressão, CARACTERIZADO por compre-ender um ácido nucléico da reivindicação 14 ou 15 operavel-mente ligado a um promotor.
18. Célula, CARACTERIZADA por compreender o vetorde expressão da reivindicação 17.
19. Célula, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADA pelo fato de que a T7 RNA polimerase mutante éexpressa pela célula.
20. Kit, CARACTERIZADO por compreender um recipi-ente contendo uma T7 RNA polimerase de acordo com quaisquerdas reivindicações precedentes.
21. Kit, CARACTERIZADO por compreender um recipi-ente contendo um ácido nucléico codificando uma T7 RNA poli-merase de acordo com quaisquer das reivindicações preceden-tes.
22. Método de transcrever um ácido nucléico intei-ramente com 2'-OMe, CARACTERIZADO por compreender as etapasde a) incubar um ácido nucléico de molde em uma mistura dereação compreendendo uma RNA polimerase mutante, um molde detranscrição de ácido nucléico e trifosfatos de nucleosideos,onde os trifosfatos de nucleosideos são 2'-OMe, eb) transcrever a mistura de reação de transcriçãopor um tempo suficiente para resultar no ácido nucléico defita simples, onde todos os nucleotideos dos ácidos nucléi-cos de fitas simples são modificados com 2'-OMe, exceto queo primeiro nucleotideo dos transcritos podem ser não modifi-cados em 2 1 .
23. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a RNA polimerase mutante éuma T7 RNA polimerase mutante compreendendo um aminoácidoalterado na posição 639 e na posição 784.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADO pelo fato de que a T7 RNA polimerase mutante éuma T7 RNA polimerase mutante de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 12.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 22 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação detranscrição adicionalmente compreende ions magnésio.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 22 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação detranscrição adicionalmente compreende ions manganês.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 22 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação detranscrição adicionalmente compreende um resíduo que não éde trifosfato que não é de 2'-OMe guanosina.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 22 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o molde detranscrição compreende um promotor de T7 RNA polimerase.
29. Método, de acordo com as reivindicações 26 a-28, CARACTERIZADO pelo fato de que os íons magnésio estãopresentes na reação de transcrição em uma concentração que éentre 3,0 a 3,5 vezes maior do que os íons manganês.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 26 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que cada tri-fosfato de nucleotídeo está presente na reação de transcri-ção em uma concentração de 1,0 mM, a concentração de íonsmagnésio é 6,5 mM, e a concentração de íons manganês é 2,0 mM.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 2 6 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que cada tri-fosfato de nucleotídeo está presente na reação de transcri-ção ém uma concentração de 1,5 mM, a concentração de íonsmagnésio é 8 mM, e a concentração de íons manganês é 2,5 mM.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 26 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de que cada tri-fosfato de nucleotídeo está presente na reação de transcri-ção em uma concentração de 2,0 mM, a concentração de íonsmagnésio é 9,5 mM e a concentração de íons manganês é 3,0 mM,
33. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 22 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação detranscrição adicionalmente compreende o polietileno glicol.
34. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 22 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o resíduo quenão é de trifosfato que não é de 2'-OMe guanosina é selecio-nado a partir do grupo que consiste em: monofosfato de gua-nosina, difosfato de guanosina, monofosfato de 2'-flúor gua-nosina, difosfato de 2'-flúor guanosina, monofosfato de 2'-amino guanosina, difosfato de 2'-amino guanosina, monofosfa-to de 2'-desóxi guanosina, e difosfato de 2'-desóxi guanosina.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 22 a 34, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação detranscrição compreende a pirofosfatase inorgânica.
36. Método para identificar aptâmeros,CARACTERIZADO por compreender:a) a preparação de uma mistura de reação de trans-crição compreendendo uma polimerase mutante de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 12, e um ou mais moldesde transcrição de ácidos nucléicos;b) a transcrição da mistura de reação de transcri-ção para resultar em uma mistura candidata de ácidos nucléi-cos de fitas simples, onde todos menos opcionalmente um dosnucleotídeos dos ácidos nucléicos de fitas simples são modi-ficados em 2 1 ,c) o contato da mistura candidata com a molécula-alvo,d) a separação dos ácidos nucléicos que têm umaafinidade aumentada pela molécula-alvo, em relação a uma a-finidade da mistura candidata, da mistura candidata, ee) a amplificação dos ácidos nucléicos com afini-dade aumentada para produzir uma mistura enriquecida em ap-tâmeros, pelo que são identificados aptâmeros para a molécu-la-alvo compreendendo nucleotideo todo modificado em 21, ex-ceto que o primeiro nucleotideo dos aptâmeros pode ser nãomodificado em 2'.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de amplificação com-preende (i) dissociar opcionalmente os ácidos nucléicos comafinidade aumentada do alvo, ii) transcrever invertido osácidos nucléicos com afinidade aumentada, dissociados doscomplexos de ácidos nucléicos-alvo, iii) amplificar os áci-dos nucléicos com afinidade aumentada transcritos inverti-dos; e (ii) preparar uma mistura de reação de transcriçãocompreendendo os ácidos nucléicos com afinidade aumentadatranscritos invertidos amplificados como o molde de trans-crição e transcrever a mistura de transcrição.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 36 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que todos ostrifosfatos de nucleotideos na reação de transcrição são mo-dificados com 2'-OMe.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 36 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que os um oumais moldes de transcrição de ácidos nucléicos compreendemum promotor de T7 RNA polimerase e uma seqüência lider ime-diatamente 3' ao promotor de T7 RNA polimerase.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 37 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que compreenderepetir as etapas a) até e) iterativamente.
41. Método de identificar uma seqüência de compo-nente de molde de ácido nucléico para aumentar a transcrição,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a) preparar uma biblioteca de candidatos de moldesde transcrição, onde os moldes compreendem um promotor, umaprimeira região fixa imediatamente 3' ao promotor, uma regi-ão degenerada imediatamente 3' à primeira região fixa e umasegunda região fixa 3' à região degenerada.b) transcrever a biblioteca de candidatos de mol-des de transcrição em uma reação de transcrição para resul-tar em uma mistura de transcrição tendo uma produção detranscrito,c) transcrever invertida a mistura de transcriçãopara obter uma mistura candidata de moldes de cDNA, onde osmoldes de cDNA compreendem uma extremidade de 5' e 31 ,d) ligar uma seqüência de DNA codificando o promo-tor à extremidade de 3' dos moldes de cDNA em uma reação deligação,e) amplificar os moldes de cDNA para resultar emuma biblioteca de candidatos de moldes de transcrição, ef) identificar um componente de seqüência de áci-dos nucléicos para aumentar a transcrição a partir da bibli-oteca de candidatos de moldes de transcrição, onde o compo-nente de seqüência de ácidos nucléicos compreende uma se-qüência derivada de pelo menos uma porção da região degene-rada.
42. Método, de acordo com a reivindicação 45,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa f) compreende as etapas de:i) clonar a biblioteca de candidatos de moldes detranscrição em moldes de transcrição individuais,ii) transcrever os moldes de transcrição individu-ais em uma reação de transcrição para resultar em uma produ-ção de transcrito,iii) avaliar a produção de transcrito dos moldesde transcrição individuais, eiv) identificar o componente de seqüência de áci-dos nucléicos em um molde de transcrição que resulte em umaprodução de transcrito predeterminada.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que a produção de transcrito pre-determinada é uma produção maior do que a produção de trans-crito obtida na etapa b) por transcrição da mistura de can-didatos de moldes de transcrição.
44. Método, de acordo com a reivindicação 41,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa f) compreende anali-sar a composição de base da região degenerada da bibliotecade candidatos de moldes de transcrição e identificar o com-ponente da seqüência de ácidos nucléicos com base na compo-sição média de base da biblioteca de candidatos de moldes detranscrição.
45. Método, de acordo com qualquer uma das 41 a 44,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa b) adicionalmentecompreende tratar a mistura de transcrição transcrita comDNase.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 41 a 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa a-dicionalmente compreende purificar a mistura de transcriçãotranscrita por separação dos moldes de transcrição transcri-tos dos outros componentes da reação de transcrição.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de purificação com-preende substituir o tampão de reação de transcrição corren-do a reação de transcrição através de uma coluna de dessali-nização.
48. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 41 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa d) éfeita antes da etapa c).
49. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 41 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação deligação é uma reação de ligação imobilizada e a reação deligação compreende uma imobilização de ácido nucléico e umoligonucleotideo 5'-monofosforilado codificando o promotor.
50. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 41 a 49, CARACTERIZADO por adicionalmente compreenderrepetir as etapas b) até e) mais do que uma vez, antes deefetuar a etapa f).
51. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 41 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação detranscrição compreende um ou mais trifosfatos de nucleotí-deos modificados e uma polimerase mutada.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51,CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais trifosfatos denucleotideos modificados são um trifosfato de nucleotideomodificado em 21.
53. Método, de acordo com a reivindicação 51 ou 52,CARACTERIZADO pelo fato de que a polimerase mutada é uma T7RNA polimerase mutada.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 51 a 53, CARACTERIZADO pelo fato de que o trifosfa-to de nucleotideo modificado é um trifosfato de 2'-OMe nu-cleotideo.
55. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 51 a 54, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação detranscrição compreende ions magnésio e ions manganês.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55,CARACTERIZADO pelo fato de que a T7 RNA polimerase mutada éselecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO 1,SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 100, SEQ ID NO 101, SEQ ID NO 102 eSEQ ID NO 103.
57. Método, de_acordo com qualquer uma das reivin-dicações 55 a 56, CARACTERIZADO pelo fato de que os ionsmagnésio estão presentes na reação de transcrição em umaconcentração que é entre 3,0 a 3,5 vezes maior do que a con-centração de ions manganês.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 55 a 56, CARACTERIZADO pelo fato de que cada tri-fosfato de nucleotideo está presente na reação de transcri-ção em uma concentração de 1,0 mM, a concentração de ionsmagnésio é 6,5 mM, e a concentração de ions manganês é 2,0mM.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 55 a 56, CARACTERIZADO pelo fato de que cada tri-fosfato de nucleotideo está presente na reação de transcri-ção em uma concentração de 1,5 mM, a concentração de ionsmagnésio é 8 mM, e a concentração de íons manganês é 2,5 mM.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 55 a 56, CARACTERIZADO pelo fato de que cada tri-fosfato de nucleotideo está presente na reação de transcri-ção em uma concentração de 2,0 mM, a concentração de ionsmagnésio é 9,5 mM e a concentração de ions manganês é 3,0 mM
61. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 41 a 60, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação detranscrição adicionalmente compreende o polialquileno glicol
62. Método, de acordo com a reivindicação 61,CARACTERIZADO pelo fato de que o polialquileno glicol é opolietileno glicol.
63. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 41 a 61, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação detranscrição adicionalmente compreende um residuo de guanosi-na selecionado a partir do grupo que consiste em: monofosfa-to de guanosina, difosfato de guanosina, monofosfato de 2'flúor guanosina, difosfato de 2' flúor guanosina, monofosfa-to de 2'-amino guanosina, difosfato de 21-amino guanosina,monofosfato de 21-desóxi guanosina, e difosfato de 21-desóxiguanosina.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 41 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação detranscrição compreende a pirofosfatase inorgânica.
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 41 a 64, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeiraregião fixa consiste em 2, 3, 4 ou 5 resíduos de guanosina.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 41 a 65, CARACTERIZADO pelo fato de que a regiãodegenerada compreende pelo menos 4, 10, 20 ou 30 nucleotídeos.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 41 a 66, CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüênciade componente de molde de ácido nucléico a ser identificadaé uma seqüência líder.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência líder compreendea primeira região fixa e uma seqüência derivada da regiãodegenerada do molde de transcrição da biblioteca de candidatos.
69. Seqüência líder, CARACTERIZADA por ser identi-ficada por um método de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 41 a 68.
70. Seqüência líder, CARACTERIZADA por compreendera seqüência de ácidos nucléicos a partir do nucleotídeo 22até o nucleotídeo 32 de qualquer uma das seqüências selecio-nadas a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs 10 a 99.
71. Seqüência líder, CARACTERIZADA por compreendera seqüência de ácidos nucléicos a partir do nucleotídeo 18até o nucleotídeo 32 em qualquer uma das seqüências selecio-nadas a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs 10 a 99.
72. Molde de transcrição, CARACTERIZADO por com-preender uma seqüência líder de acordo com qualquer uma dasreivindicações 70 a 71.
73. Molde de transcrição de oligonucleotídeo,CARACTERIZADO por ser selecionado a partir do grupo que con-siste em: SEQ ID NOs 3 a 6 e 106.
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