BRPI0611782A2

BRPI0611782A2 - uso de um polipeptìdio, vetor proteìnico, uso do mesmo, ácido nucléico modificado, vetor de expressão, célula hospedeira de expressão, método para produzir um vetor proteìnico, uso de um ácido nucléico modificado e de um polipeptìdio e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0611782A2
Application number: BRPI0611782-1A
Authority: BR
Inventors: Claude Leclerc; Marta Gorraiz Ayala; Prieto Valtuena Jesus; Sagastibelza Juan Jose Lasarte
Original assignee: Proyecto Biomedicina Cima Sl
Priority date: 2005-06-13
Filing date: 2006-06-13
Publication date: 2010-09-28
Also published as: JP2008543301A; WO2006134190A2; US20090220532A1; EP1913954A4; EP1913954B1; WO2006134190A8; MX2007015935A; CN101287487B; DK1913954T3; US9155783B2; CN101287487A; PT1913954E; WO2006134190A3; AU2006259041B2; RU2430738C2; CA2612151A1; ES2291071A1; US20160215039A1; JP4970435B2; CA2612151C

Abstract

USO DE UM POLIPEPTìDIO, VETOR PROTEìNICO, USO DO MESMO, áCIDO NUCLéICO MODIFICADO, VETOR DE EXPRESSãO, CéLULA HOSPEDEIRA DE EXPRESSãO, MéTODO PARA PRODUZIR UM VETOR PROTEìNICO, USO DE UM áCIDO NUCLéICO MODIFICADO E DE UM POLIPEPTìDIO E COMPOSIçãO FARMACêUTICA. Refere-se a presente invenção ao uso de um polipeptídio na produção de um agente imunoestimulador, o dito polipeptídio compreendendo uma seqüência correspondente ao domínio de fibronectina de EDA, um fragmento do domínio de EDA que pode ligar-se a TLR4 ou uma variante do dito domínio de EDA ou um fragmento que pode ligar-se ao TLR4 e que tem uma homologia de mais de 70% com qualquer forma ou fragmento natural do domínio de EDA. A invenção também se refere aos métodos de produção e aplicações do dito agente.

Description

USO DE UM POLIPEPTíDIO, VETOR PROTEÍNICO, USO DOMESMO, ÁCIDO NUCLÉICO MODIFICADO, VETOR DE EXPRESSÃO,CÉLULA HOSPEDEIRA DE EXPRESSÃO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMVETOR PROTEÍNICO, USO DE TJM ÁCIDO NUCLÉICO MODIFICADO EDE UM POLIPEPTÍDIO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

Campo Técnico da Invenção

Refere-se a presente invenção a um vetorproteínico para transporte molecular para células queexpressam o receptor TLR4 (receptor 4 semelhante aToll), à preparação do dito vetor proteínico e suas a-plicações, com uma incidência particular na preparaçãoe uso de composições farmacêuticas, com particularidadecomposições imuno-terapêuticas, para o tratamento eprevenção de enfermidades infecciosas e tumorais.

Descrição da Técnica Anterior

Agentes patogênicos e câncer permanecemcomo as causas principais de óbitos no mundo inteiro.O desenvolvimento de vacinas para impedir enfermidadespara as quais não existem atualmente vacinas, tais comoAIDS ou malária, ou para tratar infecções crônicas oucânceres, bem como o melhoramento da eficácia e segu-rança das vacinas existentes, permanece uma alta prio-ridade. Na maior parte dos casos, o desenvolvimentodessas vacinas requer estratégias capazes de estimula-rem especificamente os lifócitos T citotóxicos CD8+ (C-TLs).

Os CTL são estimulados pela apresentaçãoaos receptores de células T (TCRs) de peptidios curtosassociados com moléculas I da classe MHC. Estes com-plexos I de classe peptídio-MHC estão presentes na su-perfície de células de apresentação de antígenos(APCs), que também são capazes de proporcionar sinaisco-estimuladores requeridos para ativação dos CTL.

As células dendríticas (DC) são as APCmais potentes, que são dotadas de uma capacidade únicapara interagir com os linfócitos T naturais e que ini-ciam respostas de imunização primárias, estimulando oslinfócitos T auxiliar CD4+ e citotóxico CD8+. A apre-sentação de antígenos e estímulo de células T por DC éexaminada detidamente por Guermonprez et al. ("Antígenopresentation e T cell stimulation by DC". Annu. Rev.Immunol. 2002, 20:621-627), que fica incluído nestecontexto por referência.

Na ausência de respostas inflamatórias ede imunização em execução, as células dendríticas vigi-am o sangue, tecidos periféricos, linfa e órgãos Iin-fóides secundários. Nos tecidos periféricos, as célu-las dendríticas consomem antígenos próprios e não-próprios. Os antígenos interiorizados são então pro-cessados em peptídeos proteolíticos, e estes peptídeossão carregados em moléculas da classe I e II (para ati-vação de linfócito T CD8+ ou CD4+ T, respectivamente).

Este processo de consumo, degradação e carga de antíge-nos é chamado de apresentação de antígeno. Entretanto,na ausência de estímulo, as células dendríticas perifé-ricas apresentam antigenos de forma inteiramente inefi-ciente. Sinal(s) exógeno(s) proveniente(s) de agentespatogênicos ou sinal(s) endógeno(s) induz(em) célulasdendriticas a inserir um programa de desenvolvimento,chamado maturação, que transforma as células dendriti-cas em ativadores de linfócitos T e APCs. Produtosbacterianos e virais, bem como citoquinas inflamatóriase outras auto-moléculas, induzem a maturação de célulasdendriticas através de interação direta com receptoresde superfície de células dendriticas inatas. Linfóci-tos T, através de vias independentes e dependentes deCD40, e células endoteliais contribuem para a maturaçãofinal das células dendriticas através de contacto dire-to de célula com célula e a secreção de citoquinas.Logo depois de encontrar um sinal de perigo, a eficiên-cia do consumo, transporte intracelular e degradação deantígeno, e o tráfego intracelular de moléculas MHC sãomodificados. A carga de peptídeos bem como o semi-período e distribuição para a superfície de célula dasmoléculas MHC é aumentada. A expressão de superfíciedas moléculas co-estimulantes de célula T também sobe.Desta forma, as células dendriticas tornam-se os APCmais potentes, e os únicos capazes de ativarem lifóci-tos T simples e de iniciarem respostas de imunizaçãoadaptativa. Concomitante com as modificações de suashabilidades de preservação de antígeno, a maturaçãotambém induz migração maciça das células dendriticaspara fora dos tecidos periféricos. Modificações na ex-pressão de receptores de quimioquina e moléculas de a-derência, bem como mudanças profundas da organização decitosqueleto, contribuem para a migração de célulasdendriticas, através da linfa, no sentido de órgãoslinfóides secundários.

Indução de maturação de célula dendritica.

As células dendriticas reagem a dois tiposde sinais: reconhecimento direto de agentes patogênicos(através de receptores de reconhecimento padrão especí-ficos) e detecção indireta de infecção (através de ci-toquinas inflamatórias, compostos celulares internos, erespostas de imunização especificas em execução). Emresposta a estes sinais, células dendriticas são ativa-das e entram no programa de maturação, que transformacélulas dendriticas em estimuladores de células T efi-cientes. Pelo menos cinco tipos de receptores de su-perfície foram reportados como disparando a maturaçãode células dendriticas: (i) receptores semelhantes aToll (TLR), (ii) receptores de citoquinas, (iii) molé-cuias da família de receptor de TNF (TNF-R), (iv) FcR,e (v) sensores para morte das células. Alguns dos es-tímulos de maturação mais eficientes são mediados porinteração de TLR (TLR1-9) com os seus respectivos Ii-gantes. Kaisho e Akira estudaram o conhecimento àcercados receptors semelhantes a Toll ("Toll-like receptorsas adjuvant receptors". Biochimica et Biophysica Actar2002, 1589: 1-13). Os TLR são expressos em macrófagose células dendriticas bem como em outras células, taiscomo linfócitos B. Ligantes para vários dos TLR tambémforam identificados. A maior parte destes ligantes sãoderivados de agentes patogênicos, mas não encontradosno hospedeiro, sugerindo que os TLR são da maior impor-tância para detecção de microorganismos invasores. 0reconhecimento de ligantes por TLR provoca rápida ati-vação da imunidade inata por indução de produção de ci-toquinas pró-inflamatórias e melhoramento das moléculasco-estimuladoras. A imunidade inata ativada subseqüen-temente conduz a imunidade adaptadora efetiva. Com re-lação a TLR4, padrões moleculares especificamente reco-nhecidos são LPS (Gram-bacterias), ácidos lipoteicóicos(Gram+bacterias), taxol, proteína F (Respiratory Syncy-tial Vírus), proteína de choque térmico 60, e domíniode Fibronectina EDA.

Conseqüentemente, uma vacina candidata ca-paz de induzir respostas de células T ótimas deve pre-encher várias condições. Primeira, tem de visar APCpara distribuir os epítopes de células T derivadas deantígeno para moléculas de MHC da classe I e/ou II.Desta forma, visar-se DC poderá representar o objetivoprincipal na concepção de novos sistemas de distribui-ção para desenvolvimento de vacinas. Além disso, o ve-tor tem de distribuir sinais apropriados para DC parainduzir a sua ativação. A distribuição de antígeno pa-ra DC sem um sinal de maturação poderá induzir a tole-rância em vez de ativação do auxiliar T e células citó-xicas. Além disso, a sua eficiência não deverá ser a-fetada por imunidade pré-existente contra o próprio vetor.

Uma primeira abordagem para distribuirpeptideos antigênicos a moléculas de MHC da classe Ie/ou II é baseada em vacinas de peptideos sintéticos,que contém epitopes selecionados capazes de aglutinaçãodiretamente a estas moléculas na superfície de APC. Emalguns casos estes peptideos conduziram à proteção con-tra tumores ou liberação de vírus em modelos de murí-deos, enquanto que em outros eles conduziram à induçãode tolerância. Experiências em seres humanos conduzi-dos com diferentes tipos de peptideos deram origem amodestas respostas clínicas ao câncer.

Um grande número de diferentes estratégiasencontra-se atualmente em desenvolvimento. Basicamen-te, elas são divididas em duas categorias. O primeirotipo é baseado na síntese de antígeno pelo APC ou suadistribuição ativa no citoplasma destas células e ex-piora o caminho de processamento de antígeno MHC I"clássico". 0 segundo tipo tira vantagem da capacidadede apresentação cruzada de APC e é baseado em antígenosexógenos livres ou associados a células. A distribui-ção de antígeno no citoplasma de APC tem sido realizadapor meio de toxinas bacterianas (Morón et al. "Newtools for antígeno delivery to the MHC class I path-way". TRENDS in Immunologyr 2004; 25: 92-97). Como umexemplo, a EP1188446A1 refere-se a um vetor proteínicobaseado em toxina de ciclase de adenilato pertussisBordetellaf para distribuição de moléculas para célulasexpressoras de CDllb.

A presente invenção refere-se ao DomínioExtra A de fibronectina (EDA), um possível ligante na-tural para TLR4, como um meio teórico para distribuiçãode antígeno para células expressoras de TLR4 que pode-riam induzir seleção e maturação apropriadas de APC, efinalmente conduzir a uma resposta de CTL específicaefetiva. As moléculas de fibronectina são os produtosde um único gene, e a proteína resultante pode existirem múltiplas formas que decorrem da junção alternativade um único pré-mRNA (Pankov R e Kenneth MY, "Fibronec-tina at a glance". Journal de Cell Science, 2002;115:3861-3863). Um tipo de junção principal ocorredentro do conjunto central de repetições do tipo III.A utilização ou salto de Exon conduz à inclusão ou ex-clusão de cada uma de duas repetições do tipo III: do-mínio extra B (também chamado de EDB, EIIIB ou EDII), edomínio extra A (também chamado de EDA, EIIIA ou EDI).As fibronectinas celulares, que contém alternativamenteEDA e EDB unidos, são produzidas em resposta à lesão detecido. Entre outras funções, EDA tem mostrado induzirliberação de proteoglican, e expressão de metaloprotei-nases (MMP 1, 3, e 9) e de citoquinas pró-inflamatórias(para recapitulação vide Saito S et al. "The Fibronect-ina Extradomain A activates matrix metalloproteinasegene expression by an interleukin-l-dependent mecha-nism", J. Biol. Chem. 1999; 161:3071-3076). Foi igual-mente descrito que o EDA é capaz de ativar TLR4, indu-zindo desta forma respostas semelhantes a LPS (OkamuraY et al., "The domínio extra A de fibronectina activa-tes Toll-Iike receptor 4", J. Biol. Chem. 2001;276:10229-10233).

Tal como indicado anteriormente, o desen-volvimento de estratégias para o fortalecimento da res-posta de imunização para um antígeno, abre a porta aodesenvolvimento de vacinas para o tratamento de câncerou doenças infecciosas. Especificamente, na infecçãopor vírus C da hepatite, descreveu-se que a resposta deimunização desempenha um papel essencial na desobstru-ção da infecção, portanto o uso de estratégias de re-forço de imunização constitui uma alternativa para otratamento e prevenção desta infecção.

O vírus da hepatite C (HCV) é um vírus RNAde cordão único que pretence à família Flaviviridae(Miller RH. e Purcell RH. 1990. PNAS. 87:2057). Estevírus foi reconhecido como um dos agentes causais prin-cipais da hepatite crônica e enfermidades do fígado e éestimado que ele afeta 170 milhões de pessoas no mundotodo (World-Health-Organisation. Hepatitis C. Wkly Epi-demiol Rec 1997; 72:65). Uma das características prin-cipais da infecção pelo HCV é sua alta tendência nosentido da condição crônica (70% de infecções) e do de-senvolvimento de cirrose do fígado (20%) com um altorisco de desenvolvimento de hepatocarcinomas (Dienstaget al. Gastroenterology 1983; 85:439). 0 tratamentocom IFN-α é a terapia mais comum nas infecções de HCV,sendo que é efetivo somente em 20-30% dos pacientestratados (Camps et al. J Hepatol 1993; 17:390). A com-binação de IFN-a e de ribavirin melhorou estes resulta-dos (30-40% dos pacientes desembaraçaram-se do virus deuma maneira sustentada), mas ainda permanence uma altapercentagem de pacientes que são resistentes à terapia(Poynard et al. Lancet 1998; 352:1426). Desta maneira,o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas pa-ra o tratamento de hepatite C crônica é de vital importância.

0 genoma de HCV é de 9,6 quilobases, elecontém regiões de não-codificação altamente conservadasnas extremidades 5' e 3' flanqueando um quadro de lei-tura ampla que codifica 3 proteínas estruturais (nú-cleo, El e E2) e pelo menos 6 proteínas não-estruturais(NS2, NS3, NS4a, NS5a e NS5b) (Major, ME e FeinstoneSM. (1997) Hepatology 25, 1527).

A liberação viral depois de uma infecçãoaguda por HCV ou depois de tratamento com IFN-α estáassociada à presença de uma forte resposta de imuniza-ção de CD4 e CD8 celular às proteínas virais. Com par-ticularidade, a resposta de CD4 à proteína NS3 não-estrutural de HCV tem estado associada à liberação vi-ral depois de infecção aguda, enquanto a ausência destaresposta de célula T envolve persistência viral e o es-tabelecimento de uma infecção crônica (Diepolder et al.Lancet 1995/ 346:1006, Pape et al J Viral Hepat 1999; 6Suppl 1:26-40). Também, vários estudos identificaramvários epitopes citotóxicos dentro da proteína NS3 empacientes infectados por HCV. Estes dados sugerem quea proteína NS3 poderá ser um bom objetivo para a indu-ção de resposta celular anti-HCV.

Descrição Detalhada da Invenção

De acordo com um aspecto, a presente in-venção refere-se ao uso de um polipeptídio que compre-ende a seqüência de aminoácidos correspondente a:domínio da fibronectina EDA (EDA), ouum fragmento do dito domínio de EDA que é capaz devincular TLR4, ou

uma variante do dito domínio ou fragmento de EDAque é capaz de vincular TLR4 e tem mais do que 70%de homologia com quaisquer formas ou fragmentosnaturais de domínio de EDA,na manufatura de uma resposta de célula de imunizaçãoao agente estimulador de antígeno.

Na presente invenção, este agente inclui odomínio de EDA de fibronectina, e o antígeno para oqual se deseja gerar a resposta de imunização, sendoque estes componentes estão presentes como entidadesseparadas ou vinculadas de forma covalente.

Em uma concretização concreta da invenção,a dita variante do domínio ou fragmento de EDA capaz devincular TLR4 citado no elemento c) , é caracterizadapelo fato de que a sua seqüência de aminoácidos resultada substituição, da adição ou da supressão de um oumais aminoácidos em um polipeptidio definido nos ele-mentos a) e b).

De acordo com uma concretização preferívelda invenção, o referido fragmento capaz de vincular oelemento c) , é caracterizado pelo fato de que ele temmais de 85% em grau de homologia com qualquer forma na-tural de domínio de EDA ou de seu fragmento correspon-dente, e em uma concretização de maior preferência, temmais de 95% em grau de homologia com a dita forma natu-ral de domínio de EDA de fibronectina ou seu fragmentocorrespondente.

De acordo com a invenção, em uma concreti-zação particular a seqüência de aminoácidos de domíniode EDA de fibronectina é aquele de qualquer forma dedomínio de EDA natural que é capaz de vincular TLR4.

Este domínio de EDA pode ser selecionado entre as for-mas naturais do domínio em qualquer espécie de animal,particularmente mamíferos, ou seja, roedores (camundon-gos, ratos e outros), ou primatas (com particularidadeseres humanos).

Em outra concretização específica, os a-gentes imuno-estimuladores compreendem uma seqüência deaminoácidos parcial de um domínio de EDA que é caracte-rizado pelo fato de que ele é capaz de vinculação aTLR4.

Ainda em uma outra concretização particu-lar da invenção, o domínio de EDA é uma variante modi-ficada de qualquer uma das ditas formas naturais oufragmentos de domínio de EDA, e é também caracterizadopelo fato de que ele retém a propriedade de vinculaçãoa TLR4. Em uma concretização particular, esse domíniode EDA variante tem mais de 7 0% de homologia com qual-quer uma das formas naturais de domínio de EDA. Umavariante modificada apropriada pode ser selecionadacomparando-se primeiro a seqüência de uma forma naturalde domínio de EDA de fibronectina, ou fragmento da mes-ma, com outras seqüências polipeptídicas candidatas.Qualquer algoritmo de alinhamento (por exemplo, FASTA,Lipman DJ, Pearson WR. Rapid e sensitive protein simi-larity searches, Science. 1985 Mar 22;227(4693):1435-41), ou software de computador (isto é, Jellifish pro-veniente da Labvelocity Inc., ou software Blast a par-tir da NCBI) pode ser usado para análise de homologia.Subseqüentemente, as seqüências polipeptídicas cândida-tas dotadas de mais de 70% de homologia são testadasquanto à sua capacidade de vinculação a TLR4. As pro-priedades de vinculação a TLR4 podem ser avaliadas pormeio de qualquer ensaio de vinculação convencional, porexemplo, mediante utilização de citometria de fluxo talcomo descrita em vvThe Current Protocols in Immunologyand in The current protocols in Protein Science" publi-cado por John Wiley & Sons (Edited by: John E. Coligan,Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach,Warren Strober) (atualizado periodicamente. Atualizadoaté 1 de maio de 2005).

De acordo com uma concretização da inven-ção o domínio de EDA compreende uma seqüência selecio-nada a partir de:

a) a seqüência de aminoácidos completa de do-mínio de EDA de camundongo (Entrez Protein: NM_010233,aminoácidos 1721 a 1810; SEQ. ID. NO: 2, aminoácidos 291) ;

b) a seqüência de aminoácidos completa de do-mínio de EDA humano (Entrez Protein NM_002026, aminoá-cidos 1631 a 1716; SEQ. ID. NO: 4); e

c) um fragmento de seqüências a) e b) capazde vinculação a células expressoras de TLR4.

Em outra concretização particular, o ditodomínio de EDA compreende uma seqüência selecionada apartir de:

a) aminoácidos 2-57 de SEQ. ID. NO: 6, quecorrespondem a uma forma unida alternativamente de do-mínio de EDA de fibronectina de camundongo;

b) SEQ. ID. NO: 8, que é uma forma unida al-ternativamente de domínio de EDA humano; e

c) um fragmento das seqüências a) e b) capa-baz de vinculação às células expressoras de TLR4.

De acordo com algumas concretizações, oagente imunoestimulador poderá incluir ainda uma oumais moléculas de interesse. Quando se encontra pre-sente no agente imunoestimulador, a molécula de inte-resse pode ser administrada em uma quantidade tal que,em combinação com os outros componentes do agente, éefetiva no sentido de gerar uma resposta de imunizaçãocontra a molécula.

Em uma concretização preferida, o domíniode EDA (ou fragmento ou variante do mesmo) e a moléculade interesse são vinculados entre si na mesma moléculahíbrida ou vetor proteináceo.

Em um outro aspecto, a presente invençãorefere-se a um vetor proteináceo tal como descrito an-teruiormente, em que a dita molécula de interesse é se-lecionada a partir do grupo que consiste de polipeptí-dios, lipopeptidios, oligossacarides, polissacarides,ácidos nucléicos, lípides e agentes químicos.

Em uma concretização particular do vetorproteináceo, a dita molécula de interesse é um antígenoou um epítope. Em uma concretização da invenção, o an-tígeno acoplado ao vetor é um antígeno viral, um antí-geno bacteriano, um antígeno fungico, ou um antígenoparasítico. Em uma concretização concreta, o dito an-tígeno viral é um antígeno viral proveniente do vírusde hepatite C, e em uma concretização preferida o ditoantígeno de vírus de hepatite C é a proteína NS3 ou umfragmento antigênico da mesma. A proteína NS3 refere-se à proteína NS3 não-estruturak do vírus de hepatiteC, uma proteína 67kDa que inclui dois domínios, uma se-rina-protease que compreende os 189 aminoácidos prove-nientes da extremidade N-terminal, e uma triofosfatasehelicase-nucleoside que compreende os 442 aminoácidos apartir da extremidade C-terminal. A seqüência de pro-teínas NS3 incluídas no vetor proteináceo da invençãopode corresponder a qualquer variedade ou isolado dovírus de hepatite C humano.

Em uma outra concretização o dito antígenoé um antígeno tumoral ou uma determinante antigênicatumoral. Da maneira que é utilizado neste contexto,"epítope" refere-se a uma seqüência de peptídeos que sevincula às moléculas da classe I ou class II de MHC epode ser reconhecida pela molécula receptora de célulaT das células T CD8+ ou CD4+ respectivamente, e induziruma resposta de imunização.

Em uma concretização específica a dita mo-lécula de interesse é a determinante T citotóxica anti-gênica proveniente de ovalbumina (OVA 257-264) ou SIIN-FEKL (SEQ. ID. NO: 2, aminoácidos 95-102, que foi flan-queada com 3 aminoácidos adicionais no término-C- e notérmino-N da eítope, QLE-SIINFEKL-TEW).

O antígeno pode ser qualquer material ca-paz de produzir uma resposta immune de Th, uma respostade linfócito T CD8+, uma resposta de célula NK, umaresposta de linfócito T γ/δ, ou uma resposta de anti-corpo. Sem com isso se ficar limitado aos mesmos, osantígenos apropriados incluem peptídeos, polipeptídios,lipidios, glicolipídios, polissacárides, carboidratos,polinucleotídeos, prions, bactérias, vírus ou fungosvivos ou inativados; e antígenos derivados de bactéri-as, vírus, fungos, protozoários, tumores ou microorga-nismos, toxinas ou toxóides.

Em uma outra concretização particular dovetor proteinico a dita molécula de interesse é um a-lérgeno.

Desta maneira, o domínio de EDA atua tam-bém como um vetor para a distribuição de antígeno àscélulas expressoras de TLR4.

Em uma outra concretização particularmenteinteressante da invenção, a dita molécula de interesseé um produto químico ou uma droga acoplada quimicamenteou geneticamente ao vetor proteinico. Desta forma odito vetor proteinico é de utilidade para visar drogasespecíficas para células expressoras de TLR4.

Em uma concretização particular o vetorproteinico é também caracterizado pelo fato de ele tam-bém compreende uma seqüência Tag, por exemplo, uma pon-ta de histidina N-terminal. Isto simplificará o pro-cesso de purificação quando o vetor proteinico é manu-faturado por meio de métodos de engenharia genética.

Como um exempleo, as seqüências SEQ. ID. NO: 2 e SEQ.ID. NO: 6 representam concretizações específicas do ve-tor proteinico da invenção. Em uma concretização nãolimitativa concreta da presente invenção, o vetor pro-teinico compreende a seqüência SEQ ID NO: 10, que com-preende um fragmento de proteína NS3.

O domínio de EDA incorporado no vetor pro-teinico é caracterizado pelo fato de que ele vincula-sea TLR4 e, além disso, facilita a translocação da molé-cuia de interesse para o citossol de células expresso-ras de TLR4.

A invenção também se refere ao uso do ve-tor proteinico para mirar e transestabelecer uma molé-cuia de interesse para células expressoras de TLR4. Emuma concretização particular, as células expressoras deTLR4 são quaisquer espécies de células apresentadorasde antigeno (APC). Em uma concretização preferida es-sas APC são células dendriticas.

Em uma concretização particular da inven-ção, o vetor proteinico é caracterizado pelo fato deque ele facilita a translocação do antigeno ou epitopede interesse, favorecendo ainda o processamento e cargade moléculas de MHC para a apresentação de antigeno aoslinfócitos T.

Em uma outra concretização, o vetor prote-inico é caracterizado pelo fato de ser capaz de estimu-lar a maturação do APC visado, aumentando desta forma aexpressão de moléculas de MHC e de sinais co-estimuladores. Em uma concretização vantajosa particu-lar, o vetor proteinico é caracterizado pelo fato deque é capaz de induzir simultaneamente apresentação deantigeno e de promover maturação de APC, induzindo dês-ta forma uma resposta de imunização especifica de anti-geno efetiva. De acordo com uma concretização de maiorpreferência esta resposta de imunização especifica deantigeno é uma resposta de CTL.

O vetor proteinico da invenção pode serobtido por tecnologia de DNA recombinante. Desta ma-neira, em um outro aspecto, a invenção refere-se a umácido nucléico modificado que codifica um vetor protei-nico da invenção. Este ácido nucléico pode ser facil-mente deduzido da seqüência de aminoácidos do vetorproteinico.

Este ácido nucléico modificado pode estarcontido dentro de uma construção de DNA. Desta forma,a invenção proporciona uma construção de DNA que com-preende um ácido nucléico que codifica o vetor protei-nico da invenção. Esta construção de DNA pode incorpo-rar uma seqüência de controle vinculada operacionalmen-te ao ácido nucléico que codifica o vetor proteinico dainvenção. "Vinculado operacionalmente" quando referen-te aos ácidos nucléicos significa que os ácidos nucléi-cos são colocados em uma relação funcional com outraseqüência de ácido nucléico. As "seqüências de contro-le" são sinais de expressão reconhecidos por uma célulareceptora especifica, que regula funções tais comotranscrição e translação de seqüências de codificaçãoparticulares (exemplos de seqüências de controle sãopromotores, intensificadores, terminadores de transcri-ção, locais de ligação de ribosome, peptideos de sinalpara secreção de proteínas ou para outras localizaçõessub-celulares). A aglutinação das seqüências desejadasé realizada por ligação em locais de restrição conveni-entes. Se esses locais não existirem, utilizam-se a-daptadores ou vinculadores de oligonucleotídeos sinté-ticos de acordo com métodos convencionais. Uma vanta-gem neste sentido é representada pelo fato de que estaconstrução de DNA também compreende um marcador ou geneque codifica um motivo ou fenótipo que permite a sele-ção da célula receptora por meio da construção de DNA.O ácido nucléico modificado e construção de DNA propor-cionados por esta invenção podem ser obtidos por meiode métodos convencionais amplamente conhecidos os quaissão sumariados em muitos manuais de laboratórios (porexemplo, "Molecular Cloning: a Laboratory manual". Jo-seph Sambrook, David W. Russel Eds. 2001, 3rd ed. ColdSpring Harbor, New York) .

Em uma concretização particular o ácidonucléico ou construção de DNA modificados proporciona-dos pela invenção compreendem a SEQ. ID. NO: 1, SEQ ID.NO: 5, SEQ ID NO: 9 (EDA-NS3) ou SEQ ID NO: 11 (EDA-OVA) .

O ácido nucléico modificado ou construçãode DNA proporcionado por esta invenção pode ser inseri-do em um vetor apropriado. Desta forma, em um outroaspecto, a invenção refere-se a um vetor, tal como umvetor de expressão, que compreende o mencionado ácidonucléico ou construção de DNA modificado. A escolha dovetor dependerá da célula hospedeira na qual ele sedestina a ser inserido. Como um exemplo, o vetor den-tro do qual o ácido nucléico é inserido pode ser umplasmidio ou virus que, quando da inserção na célula,poderá ou não integrar o genoma da célula. 0 vetor po-de ser obtido por meio de métodos convencionais (Sam-brook et al., 2001, citado supra).

De acordo com outro aspecto, a invençãorefere-se a uma célula receptora, tal como célula re-ceptora transformada, que compreende um ácido nucléicoou construção de DNA modificado proporcionado por estainvenção. De acordo com a invenção, a expressão de cé-lula receptora é uma hospedeira procariótica, isto é,Escherichia coli, ou uma hospedeira eucariótica, istoé, fermento (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pi-chia Pastoris), células de insetos, ou células de mamí-feros.

Em uma outra particular concretização dainvenção, o vetor de expressão que compreende o ácidonucléico ou construção de DNA modificado que codifica ovetor proteínico da invenção, destina-se à transferên-cia de gene in vivo ou terapia. Em uma concretizaçãomais particular, o dito vetor de expressão é um vetorviral. Vetores virais apropriados para este efeito in-cluem: adenovírus, adenoassociados, retrovírus, lenti-vírus, alfavírus, herpesvírus, coronavírus derivados devetores, e assemelhados.

Em um outro aspecto, a invenção refere-sea um método para produzir um vetor proteínico da inven-ção, que compreende cultivar uma célula receptora quecontém u ácido nucléico ou construção de DNA modifica-do da invenção, sob condições que permitem a expressãodo vetor proteínico. As condições para otimizarem acultura da célula receptora dependerão do tipo de célu-la receptora empregado. Se desejado, o procedimentopara produzir o vetor proteinico da invenção inclui i-solamento e purificação do mesmo.

Alternativamente, o vetor proteinico dainvenção poderá ser obtido por outros métodos conven-cionais. Esses métodos incluem, por exemplo, síntesequímica de fase sólida; purificação com cromatografiade líquido de alto desempenho (HPLC); e, se preferido,análise por técnicas convencionais, tais como técnicasde seqüenciação ou espectrometria de massa, análise deaminoácidos, ressonância magnética e outras.

Em uma outra concretização, o vetor prote-inico da invenção pode ser obtido por ligação covalentedo polipeptídio com a seqüência de aminoácidos corres-pondente ao domínio de fibronectina de EDA (EDA), ou umfragmento do dito domínio de EDA capaz de vinculação aTLR4, ou uma variante do dito domínio de EDA), com amolécula de interesse (por exemplo: polipeptídios, Ii-popeptidios, oligossacárides, polissacárides, ácidosnucléicos, lipídeos, ou outros produtos químicos). Is-to pode ser executado pela utilização de métodos con-vencionais sumariados em manuais de laboratórios, porexemplo, "The current protocols in protein chemistry",published by John Wiley & Sons (periodically updated.Updated up to May 1, 2005), or "Immobilized affinityligand Techniques", GT Hermanson, AK Mallia e PK Smith,Academic Press, Inc. San Diego, CA, 1992.Subseqüentemente, de acordo com a inven-ção, o vetor proteínico, ou ácido nucléico modificado econstrução de DNAs que codificam os mesmos, ou os veto-res de expressão e células receptoras de expressão queincorporam os ditos ácidos nucléicos ou construções deDNA, podem ser usados na preparação de uma composiçãofarmacêutica.

Em uma outra concretização, a presente in-venção refere-se ao uso do polipeptidio com a seqüênciade aminoácidos correspondente ao domínio de EDA de fi-bronectina (EDA), ou um fragmento ou variante do mesmo,tal como descrito anteriormente, na preparação de umagente imunoestimulador, caracterizado pelo fato de queo dito agente é uma composição farmacêutica.

Em algumas concretizações, a composiçãofarmacêutica da invenção pode ser usada para estimulara maturação das células de apresentação de antígeno, oupara induzir uma imuno-resposta efetiva específica paraa molécula de interesse. Em uma concretização particu-lar, a dita composição farmacêutica pode ser usada parainduzir uma imuno-resposta Thl em um paciente ao qual acomposição imunoestimuladora é administrada. Da manei-ra que é utilizado neste contexto, "induzir uma imuno-resposta Thl" pode incluir situações em que a composi-ção imuno-estimuladora induz uma resposta Thl/Th2 mis-ta. Em outros casos, entretanto, a composição imuno-estimuladora pode induzir uma imuno-resposta Thl compouca ou substancialmente nenhuma indução da imuno-resposta Th2. Em uma concretização particular, a ditacomposição farmacêutica pode ser usada para induzir umaresposta de CTL.

Em algumas concretizações, a composiçãoimunoestimuladora pode ser usada como um adjuvante imu-noestimulador, por exemplo, combinado com um ou maisantigenos, seja com ou sem adjuvantes adicionais. Des-ta forma, em alguns casos, a composição imunoestimula-dora pode formar uma vacina. Em outros casos, a compo-sição imunoestimuladora pode servir como um adjuvanteque pode ser usado em conexão com uma vacina.

A composição imunoestimuladora que incluio polipeptidio que compreende domínio de EDA de fibro-nectina (ou fragmento ou variante do mesmo) pode aumen-tar a expansão dos linfócitos T CD8+ ativados, a gera-ção de linfócitos T CD8+ de memória, ou os dois. Destamaneira, a composição imunoestimuladora da invenção pô-de aumentar a imunidade antigeno-especifica mediada porcélula em um paciente que recebe a composição imunoes-timuladora.

Em uma concretização particular, a compo-sição imunoestimuladora que compreende o domínio de EDAde fibronectina (ou fragmento ou variante do mesmo) éde utilidade para o tratamento ou profilaxia de uma en-fermidade infecciosa, uma enfermidade de tumor, ou umaenfermidade alérgica. Em uma concretização concreta dapresente invenção, a dita composição é usada para otratamento e profilaxia de hepatite C.A composição imunoestimuladora que compre-ende o domínio de EDA de fibronectina (ou fragmento ousua variante) pode conter adicionalmente carreadores,excipientes, e outros ingredientes farmaceuticamenteaceitáveis conhecidos.

A composição imunoestimuladora da invençãopode ser administrada a animais, por exemplo, mamíferos(humanos ou não-humanos), aves, e assemelhados, de a-cordo com métodos convencionais amplamente conhecidosdaqueles versados na tpecnica (por exemplo, oralmente,subcutaneamente, nasalmente, topicamente).

A invenção também proporciona um métodoterapêutico e/ou profilático que inclui administrar umacomposição imunoestimuladora que compreende domínio deEDA de fibronectina (ou fragmento ou variante da mesma)a um paciente.

As vias de administração que são adequadasincluem transdérmica ou absorção transmucosa, injeção(por exemplo, subcutânea, intraperitoneal, intramuscu-lar, intravenosa, e assemelhadas.), ingestão, inalação,e assemelhadas.

De acordo com um outro aspecto, a invençãorefere-se a uma composição farmacêutica que inclui pelomenos um carreador farmaceuticamente aceitável e umaquantidade efetiva do vetor proteínico em pelo menosuma de suas formas de expressão ou concretizações:

a) o vetor proteínico na forma polipeptídica;

b) um ácido nucléico modificado que codifica o ditovetor proteínico;

c) um vetor de expressão que compreende o dito ácidonucléico modificado; ou

d) expressão de células receptoras que também compre-endem o dito ácido nucléico modificado.

Em uma outra particular concretização, acomposição farmacêutica é caracterizada pelo fato deque compreende uma quantidade efetiva de células den-driticas, em que as ditas células dendriticas foram in-cubadas in vitro com o vetor proteínico em pelo menosuma de suas formas de expressão ou concretizações. Deacordo com uma concretização mais particular a ditacomposição farmacêutica é uma vacina ou composição imu-noterapêutica.

Além disso, alguns usos adicionais do ve-tor proteínico são proporcionados neste contexto. Emuma concretização da invenção, o vetor proteínico emqualquer uma de suas formas de expressão é usado para apreparação de uma composição farmacêutica efetiva parainduzir maturação de células dendriticas in vitro ou invivo.

Em uma outra concretização, o dito vetorproteínico é usado para a preparação de uma composiçãofarmacêutica para induzir uma imuno-resposta específicacontra a molécula de interesse (antígeno ou epítope)acoplada ao vetor proteínico. Esta imuno-resposta éuma imuno-resposta humoral (produção de anticorpos côn-tra a molécula de interesse), uma resposta de auxiliarT, ou uma resposta de célula T citotóxica. Em uma com-posição a dita imuno-resposta é uma resposta de CTL.

Em uma concretização mais particular, ainvenção refere-se ao uso do vetor proteinico na prepa-ração de uma composição farmacêutica para o tratamentoe profilaxia de uma enfermidade infecciosa. A dita en-fermidade infecciosa poderá ser uma enfermidade bacte-riana, viral, por fungo ou infecciosa parasitica.

Em uma outra particular concretização, ainvenção refere-se ao uso do vetor proteinico da inven-ção na preparação de uma composição farmacêutica de u-tilidade para o tratamento e profilaxia de uma enfermi-dade por tumor.

Ainda em outra concretização particular, ainvenção refere-se ao uso do vetor proteinico na prepa-ração de uma composição farmacêutica de utilidade parao tratamento e profilaxia de uma enfermidade alérgica.Um número de enfermidades alérgicas encontra-se rela-cionada com a ativação da imuno-resposta de Th2. Destaforma, um desvio, ou uma mudança de uma resposta de Th2para Thl pelo uso do vetor proteinico portador de umalérgeno particular, poderá ter um efeito protetor outerapêutico na enfermidade alérgica.

De acordo com uma concretização particularda invenção, a composição farmacêutica proposta é usadapara administração a um receptor animal ou humano.Qualquer via de administração adequada poderá ser usa-da. Em uma concretização particular, a composição far-macêutica é administrada por uma via parenteral (istoé, intravenosa, subcutânea, intramuscular), uma viatransdérmica, ou uma via de mucosa.

Descrição Breve dos Desenhos

Figura 1. Análise SDS-PAGE de proteínasEDA e EDA-SIINFEKL produzidas e purificadas. Uma alí-quota das proteínas EDA e EDA-SIINFEKL foi cararegadaem gel de poliacrilamida a 15% e submetida a eletrofo-rese. Marcadores de peso molecular (MWM) estão indica-dos em KDa. Observa-se uma banda correspondente ao pe-so molecular putativo das proteínas EDA e EDA-SIINFEKL(13-14 KDa).

Figura 2. Vinculação do vetor proteínicoEDA-SIINFEKL a TLR4. 2A. Ensaios de vinculação direta.

Células HEK293-LacZ e células (HEK293-LacZ) e HEK293-TLR4/MD2/CD14 (HEK293-TLR4) foram pulsadas com ΙμΜ EDA-SIINFEKL, fixadas com paraformaldeído, rotuladas comanticorpos anti-His e anti-EDA, reveladas com anti-camundongo IgG-FITC e analisadas por citometria de flu-xo. 2B. EDA capacidade de inibir vinculação dos anti-corpos anti-TLR4 às células expressoras de TLR4. Incu-baram-se células HEK-TLR4 durante 2 horas a 4°C na pre-sença ou ausência de 500 nM de proteína EDA-SIINFEKL.

As células foram lavadas e incubadas com anticorpos an-ti-TLR4 manchados com FITC e analisados por citometriade fluxo. 2C. Percentagem de inibição de vinculaçãode de anticorpo anti-TLR4 a células expressoras de TLR4por meio de utilização de diferentes concentrações deproteína EDA-SIINFEKL. 2D. Ensaios de aderência decélulas. Células HEK-hTLR4 ou HEK-LacZ, manchadas comtimidina tritiada foram distribuídas em cavidades deuma microplaqueta de 96 cavidades previamente revesti-das com proteína de EDA e incubadas durantes 2 horas a37°C. As células não aderentes foram eliminadas en-quanto que as células aderentes foram coletadas e a ra-dioatividade incorporada foi medida em um contador decintilação Topcount. Os números de células aderentespor cavidade foram calculados com o auxílio de curvaspadrão.

Figura 3. EDA-SIINFEKL activa rota de si-nalização de TLR4. Medição colorimétrica de gene defosfatase alcalina embrionária secretada humana nos so-brenadantes de cultura de células expressoras deHEK2 93/TLR4-MD2-CD14 ou HEK293/LacZ transfectadas comeste gene relator cuja expressão é controlada por umpromotor ELAM-I induzível por NF-kB. 24 horas depoisda transfecção, as células foram incubadas na presençaou ausência de diferentes concentrações de LPS, 100 nMde proteína EDA-SIINFEKL (EDA), ou 100 nM de proteínaEDA-SIINFEKL previamente digerida com proteínase K.Barras representam indução dupla de NF-kB (0D obtidocom sobrenadantes a partir de HEK293/TLR4-MD2-CD14 di-vidido por OD obído com sobrenadante proveniente deHEK293/LacZ) .Figura 4. EDA-SIINFEKL induz secreção decitoquinas pró-inflamatórias por DC in vitro. Medulasespinais derivadas de DC foram cultivadas na presençade LPS (1 μς/πιΐ), EDA-SIINFEKL (500 nM) , EDA-SIINFEKL(500 nM) digeridas com proteinase K, ou solução salina.Depois de 24 horas, as presenças de IL-12 (A) e de TNF-a(B) foram medidas em sobrenadante de cultura por meiode ELISA.

Figura 5. EDA-SIINFEKL induzs maturação deCDllc DC in vivo. A maturação de células dendriticas éum requisito para o estimulo ótimo de uma resposta decélula T. Quando ocorre a maturação, as APC aumentam aexpressão de moléculas de superfície tais como as molé-culas classe I (H2Kb no modelo dos inventores) e classeII MHC (IAb no modelo dos inventores), CD40, CD80 eCD8 6. Portanto, os inventores analisaram se EDA-SIINFEKL induziria maturação das células expressoras deCDllc in vivo. Camundongos C57BL/6 wt foram imunizadosi.v. com 25 μg de EDA-SIINFEKL, 25 μg de EDA-SIINFEKLdigerido com proteinase K, 25 μg de LPS ou com PBS so-zinho. De mesma forma, camundongos C57BL/6 TLR4 KO fo-ram imunizados com 25 μg de EDA-SIINFEKL ou com PBS so-zinho. Quinze horas depois os camundongos foram sacri-ficados e as células CDllc purificadas por autoMACS.As células foram rotuladas e analisadas por citometriade fluxo quanto à expressão de moléculas de H-2Kb, I-Ab, CD40, CD80 e CD86.

Figura 6: EDA-SIINFEKL é eficientementeapresentado por células dendriticas a T células especi-ficas para epitope SIINFEKL. Os inventores caracteri-zaram a capacidade de EDA-SIINFEKL serem capturadas porAPC para apresentação de epitope SIINFEKL processadopor CTL às células T provenientes de camundongos trans-gênicos OT-I, especifico para este epitope. (A) Produ-ção de IFN-γ por células não-aderentes a partir de ca-mundongos transgénicos OT-I. Cultivou-se medula ósseaderivada de DC na presença de meio sozinho, diferentesconcentrações de peptideo SIINFEKL sintético, SIINFEKLe EDA, EDA-SIINFEKL (proteína de fusão) ou EDA sozinho.

Vinte e quatro horas depois foram coletadas DC e usadascomo APC na presença de IO5 de células OT-I não-aderentes. Depois de outras 24 horas, o sobrenadantefoi recuperado e mediu-se o IFN-γ secretado. (B) De-pendência de molécula TLR4. Células de hibridoma B3Z(IO5 células/cavidade) foram incubadas na presença decélulas do baço provenientes de camundongos C57BL/6wtou com esplenócitos provenientes de camundongos abati-dos para moléculas TLR4 (IO5 células/cavidade) e prote-ína EDA-SIINFEKL (100 nM). (C) As células provenientesdo baço de camundongos C57BL7 6wt foram cocultivadas comcélulas de hibridoma B3Z e proteína EDA-SIINFEKL napresença ou ausência de um anticorpo anti-TLR4. (B eC) A quantidade de IL-2 segregada para o sobrenadantede cultura foi medida por bioensaio baseado no uso delinha de células CTLL. (D) Efeito de cloroquina, mo-nensina, brefeldina ou cicloeximida na apresentação deantigeno à proteína de fusão EDA-SIINFEKL. Célulasdendríticas derivadas de medula óssea foram incubadasdurante 1 hora com ausência ou presença de 30 mM decloroquina, brefeldina, monensina ou 4 μς/πιΐ cicloexi-mida, antes da adição de EDA-SIINFEKL ou de peptideosintético SIINFEKL (barras brancas). Depois de 10 ho-ras em cultura, as ditas DC foram fixadas em glutaral-deido e usadas como células de apresentação de antigeno(APC) (IO4 células/cavidade) em co-culturas com célulasde camundongo não-aderentes OT-I (IO5 célu-las/cavidade) . 24 horas depois, a quantidade de IFN-γsecretado foi medida por um ELISA comercial.Para estudar se a expressão de TLR4 em APC poderia fa-vorecer o processo de apresentação, os inventores cul-tivaram células de hibridoma B3Z (especificas para epí-tope SIINFEKL) na presença de células de baço proveni-entes de camundongos C57BL/6 wt ou a partir de camun-dongos TLR4 KO, e diferentes concentrações de EDA-SIINFEKL (nM) . A quantidade de IL-2 liberada para osobrenadante de cultura foi medida por um bioensaio ba-seado em CTLL (Figura 6E).

Figura 7. Imunização de camundongos comEDA-SIINFEKL induz uma resposta de célula especificapara epitope SIINFEKL. Os resultados precedentes de-monstraram que a proteína recombinantee EDA-SIINFEKL ébioativa e especificamente promove a ativação das APC.A indução de imuno-respostas de células T específicasin vivo é da maior importância para o desenvolvimentode uma vacina. Desta maneira, os inventores testaramse camundongos imunizados com proteína de fusão EDA-SIINFEKL desenvolveram respostas de células específicascontra este epítope. (A) Induçãon de células produto-ras de IFN-γ. Nos dias 0 e 10, imunizaram-se camundon-gos C57BL/6 com 1,5 nmol de EDA-SIINFEKL ou com 1,5nmol de peptídeo SIINFEKL. No dia 20, células de baçoforam incubadas durante 48 horas na presença ou ausên-cia de SIINFEKL, e a quantidade de IFN-γ secretado foimedida por meio de ELISA. (B) Indução de análise deresposta de CTL especifica de SIINFEKL. Esplenócitosprovenientes de camundongos imunizados com EDA-SIINFEKLou com SIINFEKL foram restimulados durante 5 dias napresença de peptídeo SIINFEKL. Depois desta incubaçãomediu-se a atividade de CTL contra células visadas EL-4, na ausência ou presença de peptídeo SIINFEKL por umensaio de liberação de cromo51 convencional. Os dadosrepresentam as percentagens médias dos valores de Iiseespecífica líquido (%lise de uma célula visada pulsadacom SIINFEKL menos a percentagem de Iise de uma célulavisada não-pulsada) a partir de amostras em triplicata.

Figura 8. EDA-SIINFEKL protege da provoca-ção de tumor com células expressoras de EG7 OVA. Parase estudar a capacidade da proteína de fusão de EDA-SIINFEKL proteger camundongos contra injeção de célulasde tumor EG70VA, camundongos foram imunizados s.c. nosdias 0 e 10 com 3 nmol de EDA-SIINFEKL, SIINFEKL ou comsolução salina. Vinte dias depois da segunda imuniza-ção os camundongos foram provocados s.c. com IO5 célu-las EG70VA. 0 crescimento do tumor foi monitorado uti-lizando-se um calibre e expressou-se em milímetros cú-bicos utilizando-se utilizando-se a fórmula V = (L χw2)/2, onde L, comprimento; w, largura. Os camundongosforam sacrificados quando a dimensão do tumor atingiuum volume maior do que 8 cm3.

Figura 9. EDA atua como um ajuvante na in-dução de respostas citotóxicas depois da imunização comproteína OVA. Existe a possibilidade de que se EDA forcapaz de promover a maturação de células dendríticas invivo, ele possa agir como um agente adjuvante depois daimunização com uma proteína que contém o epítope cito-tóxico, mas seja incapaz de ativação de uma respostacitotóxica por si mesmo. Para testar esta possibilida-de, os inventores imunizaram um grupo de camundongoscom 50 μg de EDA, com 500μg de OVA proteína (A) e outrogrupo de camundongos com 500μg de OVA (B), sem utilizarqualquer outro tipo de adjuvante. Uma semana depois daimunização, os camundongos foram sacrificados e esple-nócitos foram cultivados na presença de peptídeo sinté-tico SIINFEKL synthe. Depois de 5 dias na cultura, aresposta citotóxica às células visadas EL-4 pulsadascom peptídeo SIINFEKL foi medida em um ensaio de líbe-ração de Cr51 convencional.

Figura 10. EDA pode agir como um veiculopara antigenos maiores. Nas experiências anterioresfoi provado que a proteína de EDA pode agir como um ve-ículo para transportar um epítope cititóxico e favore-cer a indução de uma resposta de CTL contra o dito epí-tope. Em uma etapa posterior os inventores quiseramestudar se o EDA foi capaz de transportar um antígenomaior e facilitar a indução de uma resposta celularcontra o dito antígeno. Com este objetivo, os invento-res construíram a proteína de fusão EDA-OVA e realiza-ram as seguintes experiências in vitro e in vivo. (A)Análise SDS-PA6E de proteína EDA-OVA recombinantee.Proteína EDA-OVA recombinantee foi expressada em E. co-li, purificada por cromatografia de afinidade, dessali-nizada, desentoxicada, concentrada e analisada por SDS-PAGE. Observou-se uma banda de aproximadamente 55kDa,correspondente ao peso molecular putativo da dita pro-teína. (B) Esqperiências de apresentação de antígeno.Cultivaram-se DCs derivados de medula óssea na presençaou ausência de OVA, EDA-OVA (proteína de fusão), EDAplus OVA, ou EDA sozinha. 24 horas depois, os DCs fo-ram usados como células de apresentação de antígeno napresença de IO5 células não-aderentes provenientes decamundongos 0T-1. A produção de IFN-γ por células não-aderentes a partir de camundongos 0T-1 na presença deDC foi quantificada por um ELISA comercial ELISA. (C)Proteína EDA-OVA Induz CTLs específicos de OVA in vivo.Camundongos C57BL/6 foram imunizads com 1 nmol de EDA-OVA ou com 1 nmol de OVA. Sete dias depois da imuniza-ção, esplenócitos provenientes de camundongos imuniza-dos foram re-estimulados in vitro durante 5 dias napresença de peptídeo SIINFEKL. Depois disso, mediu-sea atividade especifica de CTL contra células EL-4 incu-badas na ausência ou presença de de SIINFEKL em um en-saio de liberação de Cr51 convencional. Os dados re-presentam as percentagens médias dos valores de Iiseespecifica liquida (% de Iise de uma célula visada,pulsada com SIINFEKL menos % de Iise de uma célula vi-sada não pulsada) a partir de amostras em triplicata.

Figura 11. A proteína EDA-NS3 produz umaresposta de CTL especifica contra proteína de virus dehepatite C, NS3. Depois que se observou que a proteínaEDA poderia atuar como um veículo para antígenos gran-des, a capacidade da EDA para induzir uma resposta an-tivírus à proteína NS3 de vírus de hepatite C (aminoá-cidos 1-196 provenientes da região de protease de pro-teína NS3) foi analisada, como uma estratégia de vaci-nação contra infecção pelo dito vírus. (A) Análise deSDS-PAGE da proteína recombinantee EDA-NS3 (1-196) .Proteína de fusão recombinantee EDA-NS3 foi construídae expressada em E. coli, e analisada por SDS-PAGE. (B)

A proteína EDA-OVA induz CTL específico de OVA ia vivo.Camundongos HHD (transgênicos para proteína HLA-A2.1)foram imunizados, por viai.v. com 100 μg/camundongo deproteína EDA-NS3 dissolvida em solução salina. Uma se-mana depois da imunização, esplenócitos foram re-estimulados in vitro com peptídeo NS3 1073 (que contémuma determinante T citotóxica imunodominante provenien-te de proteína NS3 para restrição de HLA-A2). Depoisde 5 dias em cultura, a atividade citotóxica foi medidacontra células visadas T2 incubadas com peptideo1073 (V) (SEQ ID NO: 20, CVNGVCWTV) , ou com 1073 (L) va-riante do dito peptideo (SEQ ID NO: 21, CLNGVCWTV) ouna ausência de peptideo, utilizando-se um ensaio de li-beração de Cr51 convencional. (C) A proteína EDA-NS3induz uma resposta multiepitópica contra diferentes e-pitopes provenientes da proteína NS3. Esplenócitos ob-tidos a partir de camundongos imunizados com EDA-NS3foram reestimulados in vitro durante 48 horas na pre-sença de peptideos 1038-1046, NS3 1073-1081 ou NS31169-1177 (que contêm três determinantes citotóxicaspara restrição de HLA-A2 dentro do fragmento 1-196 deproteína NS3) ou com proteína NS3 recombinante (Mikro-gen). A quantidade de IFN-γ segregado no sobrenadantefoi medida por meio de uma ELISA comercial. (D) A pro-teína EDA-NS3 induz uma resposta citotóxica prolongada.Camundongos HHD foram imunizados por via i.v. com 100μg/camundongo de proteína EDA-NS3 em solução salina.Sessenta dias depois de imunização, os camundongos fo-ram sacrificados e a presença de CTLs específicas parapeptideo NS3 1073 foi medida em um ensaio de liberaçãode cromo51 convencional, utilizando-se células visadasT2 incubadas na ausência ou presença de peptideo NS31073. (E) Imunização de camundongos C57BL/6 com DC in-cubado com EDA-NS3 protege camundongos contra infecçãopor virus de enfermidade vHCV(1-3011) recombinante queexpressa proteínas de virus de hepatitis C. Camundon-gos foram imunizados com IO6 de DC previamente incubadocom proteína EDA-NS3 e 7 dias depois eles receberam umaprovocação de 5xl06 de vírus de enfermidade vHCV(l-3011) por via i.p. Três dias depois da infecção os ca-mundongos foram sacrificados e a carga viral foi quan-tificada/mg de tecido ovariano, por meio de um ensaiode infecção por células BSC-I.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Dominio Extra A a partir de fibronectina in-terage com TLR 4 β ativa trajeto de sinalização deTLR4.

1.1 Materiais e Métodos

1.1.1 Expressão de proteínas EDA e EDA-SIINFEKLde vetor proteinico recombinante

Preparação do vetor proteínico recombinante

Domínio Extra A de fibronectina (EDA) foiamplificado por RT-PCR utilizando-se preparadores espe-cíficos e RNA a partir de hepatócitos obtidos a partirde camundongos tratados com concanavalin-A para induzirlisão no fígado [Lasarte et al, Hepatology. 2003;37 (2) :461-70 . ] . Seções de tecido do fígado foram homo-geneizadas e lisadas em Ultraspec (Biotecx, Houston,TX, USA) utilizando-se um Ultraturrax Driver T.25 (Jan-ke & Kunkel, Ika-Labortechnik, Germany) . 0 RNA foi i-solado de acordo com a os métodos de Chomczynski e Sac-chi (Chomczynski P e Sacchi N. Single-step method deRNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987; 162: 156-159). O RNA foi transcrito inverso (60 min a 37°C) com200U de M-MuLV de transcriptase inversa (Gibco-BRL) em20 μL volume de 5xRT amortecedor (250 mM Tris-HCl Ph8, 3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) suplementado com 5 mM deditiotreitol (DDT), 0,5 mM de trifosfato de deoxinucle-oside (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), 25U deinibidor de ribonuclease (Promega Corporation, Madison,WI, USA) e 200 ng de hexâmeros aleatórios (BoehringerMannheim) . Depois de aquecimento (95°C, 1 min) e res-friamento brusco em gelo, utilizou-se 0,3 μg dagrupa-mento cDNA para amplificação PCR em 20 μΐ de IOx solu-ção amortecedora (100 mM Tris-HCl pH 9, 3, 500 mM KCl,1% Triton X-I00) que contém 0,08 mM dNTP, preparadoresa montante e a jusante (40 ng cada um), 1,5 mM MgCl2 e2U de Taq DNA polimerase (Promega Corporation). 0 pre-parador de montante foi (SEQ. ID. NO: 13)5' CCRTATGAACATTGATCGCCCTAAAGGACT 3'

(as bases sublinhadas foram adicionadasaos preparadores para introduzir uma seqüência reconhe-cida pela enzima de restrição NdeI enquanto a seqüênciaem itálico corresponde ao inicio de EDA)E preparador de jusante (SEQ. ID. NO: 14)

5' AGCGGCCGCCCATTCAGTCAGTTTTTCAAAGTTGATTATACTCTCAAGCTGTGTGGACTGGATTCCAATCAGGGG 3'

(As bases sublinhadas foram adicionadas aos preparado-res para introduzir a seqüência reconhecida pela enzimade restrição NotI; a seqüência em negrito corresponde àseqüência de codificação para o epitope OVA CTL (SIIN-FEKL) flanqueado por três aminoácidos nas duas extremi-dades QLESIINFEKLTEV, enquanto que a seqüência em itá-lico corresponde ao final de EDA).

O fragmento amplificado PCR foi clonado empCR2.1-T0P0 utilizando-se o kit de clonagem TOPO TA(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Este plasmidio foidigerido com NdeI e NotI e o fragmento de DNA resultan-te foi subclonado no plasmidio digerido Ndel/NotlpET20b (Novagen), que possibilita a expressão das pro-teínas de fusão que carregam seis resíduos de histidina(6xHis etiquetas) no término carboxi.

O plasmidio pET20b2-26 resultante que ex-pressou a proteína de fusão EDA-SIINFEKL-6xHis foitransfectado em células BL21(DE3) para a expressão dovetor proteínico recombinante. As células transfecta-das foram desenvolvidas em 1 1 de LB a 37°C até OD6OOalcançar 0,5-1. IPTG foi adicionado à cultura para umaconcentração final de 0,4 mM e incubado com agitaçãosob temperatura ambiente durante a noite. As célulasforam coletadas por centrifugação, ressuspensas em 0,1de M Tris-HCl, pH=7,2, tratadas com lisozime, rompidasmédiante utilização de uma prensa French (duas passa-gens a 20.000 pst), clarificadas por centrifugação efiltradas. A proteína de fusão presente na fração so-lúvel foi purificada por cromatografia de afinidade(Histrap, Pharmacia) mediante utilização de uma plata-forma FPLC (AKTA, Pharmacia). A proteína eluída foidessalinizada utilizando-se colunas de dessalinizaçãoHitrap (Pharmacia), e concentrada utilizando-se dispo-sitivo de filtro Amicon Ultra 4-5000 MWCO Centrifugai(Millipore Carrighwahill, Ireland). 0 vetor proteinicorecombinante foi purificado a partir de endotoxinas porutilização de colunas Endotrap (Profos Ag, Regensburg,Germany) até os niveis de endotoxina ficarem abaixo de0,2Εϋ/μς de proteína (avaliado pelo ensaio LAL, Cambrex).

Para se obter um plasmídio de expressãopara a proteína EDA, realizou-se uma PCR utilizando-sepreparadores CCATATGAACATTGATCGCCCTAAAGGACT (SEQ ID NO:13) e AGCGGCCGCTGTGGACTGGATTCCAATCAGGGG (SEQ ID NO: 15)e estratégias de clonagem semelhantes àquelas descritaspara o plasmídio EDA-SIINFEKL, resultando no plasmídiopET20bEDAl.2. Adicionaram-se 20 μg de proteína a cadaamostra em um gel de SDS-acrylamide a 15%, seguido porcoloração com azul Coomassie. Observou-se uma bandacorrespondente ao peso molecular putativo (13 kDa).

1.1.2. Vinculação de EDA-SIINFEKL a TLR4. Citometria defluxo e ensaios de aderência.

Para testar se a proteína recombinanteEDA-SIINFEKL foi capaz de vincular-se às células de ex-pressão TLR-4, utilizou-se HEK293 de expressão humanaTLR4-MD2-CD14 293 (proveniente da Invivogen). Tambémse utilizaram células HEK293 transfectadas com LacZ(Invivogen) como um controle negativo. As células fo-ram pulsadas com 1 mM EDA-SIINFEKL durante lha 4°C,lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeido a 4% emPBS durante 10 min. Depois de 3 lavagens, as célulasforam rotuladas com anticorpos 1/100 anti-His (Qiagen)e 1/200 anti-CD16 (FcBlock, provenientes da Becton Dic-kinson) durante 1 hora e 30 min. Depois de três lava-gens, as células foram incubadas durante 30 minutos com1/100 diluição de um IgG anti-camundongo rotulado comfluoresceina e analisado por Citometria de fluxo.

Alternativamente, mediu-se a capacidade daproteína EDA-SIINFEKL inibir vinculação de anticorpoTLR4 anti-humano colorido-FITC às células HEK-hTLR4.Para isto, células HEK TLR4 foram incubadas durante 2 ha 40C na presença ou ausência de doses diferentes deEDA-SIINFEKL. Depois disso, as células foram lavadas eincubadas com anticorpos anti-TLR4 e analisadas por ci-tometria de fluxo. A percentagem de inibição foi cal-culada para diferentes concentrações ensaiadas de EDA-SIINFEKL. Ensaios de aderência de células também foramrealizados. Células HEK LacZ ou HEK hTLR4 foram previ-amente coloridas com timidina tritiada e distribuídasem placas de 96 cavidades previamente revestidas comproteína de EDA. Depois de uma incubação de 2-horas a37°C, as células não-aderentes foram removidas enquantoas células aderentes foram colhidas e radioatividadeincorporada foi medida em um contador por cintilaçãoTopcount. 0 número de células aderentes por cavidadefoi calculado com o auxílio de curvas padrão obtidasutilizando-se diferentes concentrações das células co-loridas.

1.1.3. Ativação de caminho de sinalização de TLR4

Células de expressão HEK293/hTLR4-MD2-CD14ou HEK293/LacZ foram transfectadas com um plasmídiocarregando o gene de fosfatase alcalina embrionária se-cretada humano (SEAP) de acordo com as instruções dofabricante (Invivogen). Expressão SEAP é controladapor um promotor ELAM-Ia induzivel por NF-kB (pNiFty-SEAP (Invivogen)). Vinte e quatro horas depois datransfecção, células foram incubadas na presença ou au-sência de diferentes concentrações de LPS, 100 nM deproteína EDA-SIINFEKL ou 100 nM de proteína EDA-SIINFEKL previamente digerida com proteínase-K. Depoisde 24 horas, a expressão do gene repórter foi medidanos sobrenadantes da cultura por meio de um ensaio co-lorimétrico (Invivogen). Na Figura 3, as barras repre-sentam o fator de indução NF-kB dobrado (0D obtido nossobrenadantes provenientes de HEK293/TLR4-MD2-CD14 di-vidido pelo OD obtido nos sobrenadantes provenientes deHEK293/LacZ). A quantidade de contaminantes de endoto-xina em preparados de EDA neste ensaio foi inferior a0,0003 μg/ml.

1.2 Resultados

1.2.1. Expressão de proteínas de fusão recombinantes deEDA e EDA-SIINFEKLA proteína de EDA-SIINFEKL recombinantefoi expressada em E. coli como uma proteína de fusão6xHis (SEQ. ID. NO: 2), purificada por cromatografia deafinidade, dessalinizada e purificada a partir de endo-toxinas tal como descrito na seção de métodos. As pro-teínas resultantes foram analisadas por SDS-PAGE e wes-tern blot utilizando-se anticorpos anti-his (Figura 1).Uma banda correspondente ao peso molecular putativo (13kDa) foi observada para cada proteína.

1.2.2. Proteína de fusão EDA-SIINFEKL vincula TLR4

Descreveu-se que o Domínio Extra A de fi-bronectina ativa o receptor semelhante a Toll 4 (Okamu-ra et al, JBC, 2001; 27 6:1022 9-10233). Entretanto, nãoexiste evidência direta de vinculação física de EDA toTLR4. Os inventores analisaram primeiro se a proteínaEDA-SIINFEKL tem a capacidade de vincular células queexpressam TLR4. Células TLR4-MD2-CD14 ou HEK293 huma-nas expressoras de HEK293 transfectadas com LacZ (Invi-vogen) foram pulsadas com ΙμΜ de proteína EDA-SIINFEKL,rotulada com anticorpos anti-His e um anti-camundongoIgG rotulado com fluoresceina (vide métodos) e analisa-das por Citometria de fluxo. Constatou-se que as célu-las HEK 293 expressoras de TLR4-MD2-CD14 humano apre-sentaram uma intensidade de fluorescência ligeiramentemais alta do que as células HEK 293 expressoras de LacZ(Figura 2A) . A capacidade da proteína EDA-SIINFEKL i-nibir o anticorpo colorido de fluoresceina vincular-seao TLR4 humano, também foi medida. Os resultados mos-traram que a incubação prévia de células HEK-hTLR4 com500 mM de proteína EDA-SIINFEKL inibiu em aproximada-mente 50% da dita vinculação de anticorpo (Figura 2B).

A Figura 2C mostra o efeito inibidor de diferentes do-ses de EDA-SIINFEKL na dita vinculação de anticorpo.Por outro lado, mediu-se a capacidade das células decontrole HEK hTLR4 e de controle HEK LacZ se vincularemem um ensaio de aderência, às cavidades plásticas pre-viamente revestidas com proteína EDA. Observa-se queas células HEK hTLR4 são capazes de se vincularem espe-cificamente às cavidades que contêm EDA. Todas estasexperiências indicam que as proteínas EDA e EDA-SIINFEKL são capazes de vinculação a TLR4.

1.2.3. A proteína de fusão EDA-SIINFEKL activa o cami-nho de sinalização de TLR4

A sinalização de TLR4 conduz à transloca-ção de NF-kB, um fator de transcrição que vincula oselementos de consenso dentro dos promotores de uma va-riedade de genes. Para se determinar se a proteínaEDA-SIINFEKL recombinante pode ativar TLR4, utilizaram-se células HEK293/hTLR4-MD2-CD14 ou HEK293/LacZ trans-fectadas com um plasmídio portador de gene de fosfatasealcalina embrionária segregada humana (SEAP) sob o con-trole de um promotor de ELAM-I induzível por NF-kB-(pNiFty-SEAP (Invivogen)). Constatou-se que a proteínaEDA-SIINFEKL foi capaz de estimular a expressão de SEAPsomente nas células transfectadas HEK293/hTLR4-MD2-CD14, atingindo um fator de indução de NF-kB duplo de7, semelhante àquele encontrado quando células foramincubadas com 0,01 μς de LPS (Figura 3). Esta capaci-dader de estimular a translocação nuclear NF-kB foicompletamente anulada se a proteína EDA-SIINFEKL foipreviamente digerida com proteínase K (Figura 3), suge-rindo que a ativação EDA de TLR4 não pode ser responsá-vel pela contaminação de LPS podtencial na preparaçãode proteína recombinante.

1.3 Discussão.

Os inventores construíram o plasmídio re-combinante pET20b2-26 que permitiu a expressão de pro-teína de fusão recombinante EDA-SIINFEKL 6xHis em E.coli. A presença de 6 histidinas facilita a detecção epurificação da proteína de fusão. Desta forma, foipossível purificar-se a partir da fração citoplásmicade culturas de E. coli quantidades consideráveis daproteína de fusão. Ensaios de vinculação realizados emcélulas expressoras de TLR4 sugeriram que a proteínaEDA-SIINFEKL é capaz de vincular TLR4 especificamente.Além disso, foi mostrado aqui que a EDA-SIINFEKL é ca-paz de ativar o caminho de sinalização de TLR-4. Estaativação não está relacionada à contaminação de LPS po-tencial da proteína, uma vez que a digestão prévia comproteínase K anula completamente a capacidade de esti-mular translocação nuclear de NF-kB. Além disso, aquantidade de contaminantes de endotoxina na preparaçãode EDA neste ensaio esteve abaixo de 0, 0003 μς/ιηΐ (con-forme avaliado pelo ensaio de LAL) que é incapaz de a-tivar o caminho de sinalização de TLR-4 neste ensaio invitro. Estes resultados sugerem que a proteína EDA po-deria ser usada como um veículo proteináceo para antí-genos visados para células de expressão de TLR4. É sa-bido que as células dendríticas expressam receptoressemelhantes a tributo e particularmente TLR4. é igual-mente conhecido que alguns dos estímulos de maturaçãomais potentes para DC provêm da interação do receptoresde TLR receptors com seus respectivos ligantes. Destaforma, a interação de uma proteína de fusão que contémEDA e um determinado antígeno poderia favorecer a rapi-da ativação de imunidade inata por indução de produçãode citoquinas pró-inflamatórias e aperfeiçoamento demoléculas co-estimuladoras. Além disso, a objetivaçãodesta proteína de fusão para a superfície da DC poderiaaumentar a captura e endocitose do antígeno pela DC econseqüentemente, aumentar a imuno-resposta contra esteantígeno.

Exemplo 2. EDA que contém proteínas de fusão induz amaturação de células dendriticas in vitro e in vivo epermite a indução de linfócitos T citotóxicos

2.1 Materiais e Métodos.

2.1.1. Medula óssea derivada de geração de células den-driticas.

Desenvolveram-se células dendriticas apartir de células de medula óssea. Depois de lisagemdos eritrócitos com amortecedor de Iise de ACK, as cé-lulas foram lavadas e subseqüentemente esgotadas delinfócitos e granulócitos por incubação com uma misturade anticorpos contra CD4 (GKl; ATCC, Manassas, VA), CD8(53.6.72; ATCC), Ly-6G/Grl (BD-Pharmingen; San DiegoCA) e CD45R/B220 (BD-Pharmingen) seguida por complemen-to de coelho. As células remanescentes foram desenvol-vidas em IO6 células/ml em placas de 12-cavidades emmeio completo suplementado com 20 ng/ml de mGM-CSF e 20ng/ml de mIL-4 (ambos provenientes da Peprotech; Lon-don, UK). A cada dois dias, o meio foi substituído commeio fresco que continha citoquinas. As células den-driticas não-aderentes foram colhidas no Io dia e cul-tivadas na presença ou ausência de 1 μg/ml ou 15 ng/mlLPS (Sigma), EDA-SIINFEKL (500 nM) ou SIINFEKL (10 μΜ)a 370C e 5% CO2. Em algumas experiências adicionou-seàs culturas polimixin (10μg/ml) para inibir o efeitodos contaminantes de endotoxina. Depois de 24 h deculture, os sobrenadantes foram colhidos e IL-12 e TNF-α foram medidos por ELISA (BD-Pharmingen) , de acordocom as instruções do fabricante.2.1.2 Medição da maturação in vivo de células CDllc de-pois de imunização com EDA-SIINFEKL. Efeito de digestãocom proteinase-K.

Maturação de DC foi evalada in vitro porcitometria de fluxo que media a expressão de váriosmarcadores de superfície. Camundongos C57BL6 foram in-jetados i.v. com 25 μς de EDA-SIINFEKL, 25 μς de EDA-SIINFEKL digerido com proteínase K, 25 μg LPS ou comPBS sozinho. A digestão de EDA-SIINFEKL com proteínaseK foi realizada pela utilização de agarose-proteínase K(Sigma, St Louis). Sucintamente, 5 mg/ml de glóbulosde agarose proteínase lavadas em amortecedor de lavagem(20 mM Tris-HCl, pH 7,2, ImM EDTA, ImM ClCa2) foramusados para digerir a proteína EDA-SIINFEKL ou LPS du-rante 20 minutos a 30°C. Os glóbulos de agarose-proteínase K foram removidos por centrifugação. Quinzehoras depois de imunização, os camundongos foram sacri-ficados e células CDllc purificadas por autoMACS. Ascélulas foram rotuladas e analisadas por citometria defluxo.

2.1.3. Estudos In vitro para analisar a capacidade deapresentação de antigeno.

Os inventores caracterizaram a capacidadeda EDA-SIINFEKL ser capturada por APC para apresentar oSIINFEKL o epítope CTL processado às células T proveni-entes de camundongos transgênios 0T-1, ou ao T hibrido-ma B3Z, os dois específicos para este epítope. Medulaóssea derivada de DC foi cultivada na presença de dife-rentes concentrações de EDA-SIINFEKL, EDA e SIINFEKL(não vinculados covalentemente) ou SIINFEKL. Depois devinte e quatro horas de culture, sobrenadantes foramcoletados e a produção de IFN-γ foi medida por ELISA.Alternativamente, 12 horas depois da iniciação da cul-tura, DC foram coletados, fixados com glutaraldehyde0,05% e usados como APC na presença de diferentes quan-tidades de células não-aderentes provenientes de OT-Iou na presença de linha de células T de hibridoma B3Z.Em algumas experiências DC foram incubadas na presençaou ausência de cloroquina (3 μΜ) , monensina (1 μΐGolgystop, Pharmingen), brefeldine (1 μΐ Golgyplug,Pharmingen), cicloeximida (4 μg/ml), e então incubadasna presença de peptideo EDA-SIINFEKL ou SIINFEKL. Emalguns casos anticorpo anti-TLR4 foi adicionado às culturas.

A ativação de células B3Z na presença deAPC tratadas foi realizada pela medição da produção deIL-2. Células de hibridoma B3Z (IO5 células/cavidade)foram cultivadas em meio completo (RPMI 1640 suplemen-tado com 10% FCS, 2 mM glutamina, 100 U/ml penicilina,100 μg/ml de estreptomicina e 5xl0"5M 2-mercaptoetanol)for 18 hours na presença de células de baço (IO5 célu-las/cavidade) a partir de camundongos C57BL/6 wt ou apartir de camundongos TLR4 KO, e diferentes concentra-ções de EDA-SIINFEKL. A quantidade de IL-2 liberadapara o sobrenadante de cultura foi medida por um bioen-saio baseado em CTLL tal como descrito anteriormente.

2.1.4. Medição de indução in vivo de células de produ-ção de linfócitos T citotóxicos (CTL) e IFN-γ depois deimunização.

Camundongos C57BL6 foram imunizados i.v.com 50 μς de EDA-SIINFEKL ou com SIINFEKL nos dias 0 e10. No dia 20, os camundongos foram sacrificados paraanálise de resposta CTL contra SIINFEKL. Esplenócitosprovenientes de animais imunizados foram cultivados napresença de 0,1 μg/ml de SIINFEKL a 5 χ IO6 células/ml(10 ml) durante 5 dias em meio completo. No 5o dia, ascélulas foram colhidas para ensaios de liberação decromo. A atividade lítica foi medida por incubação du-rante 4 horas de diferentes números de células de órgãomotor com Ix IO4 de células EL-4 alvo previamente car-regadas com 51Cr e com ou sem SIINFEKL. A percentagemde Iise especifica foi calculada de acordo com a fórmu-la: (cpm experimental - cpm espontâneo)/(cpm máximo -cpm espontâneo) χ 100, onde Iise espontâneo correspondeàs células alvo incubadas na ausência de células de ór-gão motor e Iise máximo é obtido por incubação de célu-las alvo com 5% Triton xlOO.

Para medir a produção de IFN-γ em respostaa SIINFEKL, esplenócitos provenientes de camundongosimunizados foram chapeados em placas de 96 cavidadessob 8xl05 células/cavidade com meio completo sozinho,ou com 30 μΜ de peptideo em um volume final de 0,25 ml.Sobrenadantes (50 μΐ) foram removidos 48 horas depois ea IFN-γ foi medida por ELISA (Pharmingen, San Diego,CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Em um outro grupo de experiências foi con-firmada a capacidade da proteína EDA atuar como um ad-juvante em uma mistura. Neste caso, um group de camun-dongos C57BL/6 foi iminizado por meio i.v. com 50 μg deEDA-SIINFEKL na presença de 500 μg de proteína OVA emPBS enquanto que outro grupo foi imunizado com 500 μg.de proteína OVA sozinha alone em PBS. Uma semana de-pois os camundogos foram sacrificados para se determi-nar a resposta de CTL contra SIINFEKL nos dois grupos,tais como indicados anteriormente.

2.1.5. Proteção contra provocação de células de tumorEG70VA

Camundongos foram imunizados s.c. nos dias0 e 10 com 3 nmol de EDA-SIINFEKL or SIINFEKL. Vintedias depois da segunda imunização os camundongos foramprovocados s.c. com IO5 de células EG70VA. 0 cresci-mento de tumor foi controlado com um calibre e expressoem mm3 utilizando-se a fórmula V = (L χ w2)/2, em que Lé comprimento; w, largura. Os camundongos foram sacri-ficados quando as dimensões de tumor alcançaram um vo-lume maior do que 8 cm3.

2.2. Resultados

2.2.1. Proteína de fusão EDA-SIINFEKL estimula a produ-ção de IL-12 e TNF-α por medula óssea derivada de célu-las dendriticas (BMDC).

Os inventores examinaram se a proteína re-combinante EDA-SIINFEKL foi capaz de estimular BMDC pa-ra produzir citoquinas pró-inflamatórias tais como IL-12 ou TNF-α. Desta forma, BMDC foram cultivados comSIINFEKL (10 μΜ) , LPS (1 μς/ml e 15 ng/ml) ou EDA-SIINFEKL-6xHis (500 nM). Vinte e quatro horas depois,IL-12 ou TNF-α no sobrenadante da cultura foram medidospor ELISA. Foi constatado que EDA-SIINFEKL foi capazde estimular a produção de níveis muito altos de IL-12ou TNF-α por BMDC (Figura 4). Esta capacidade imunoes-timuladora desapareceu quando a proteína foi previamen-te tratada com proteínase K, indicando que esta ativi-dade não foi devida a possíveis resíduos de endotoxinanas amostras de proteína.

2.2.2. EDA-SIINFEKL induz maturação in vivo dependentede TLR4 da DC expressora de CDllc.

Células dendriticas (DC) são as células deapresentação de antígeno mais potentes com uma habili-dade única de estimularem células T naturais e respos-tas secundárias a antígenos. As DC têm a capacidade decapturar antígenos, processá-los em peptídeos e apre-sentar os peptídeos em associação com moléculas MHCclasse I ou II a células T citotóxicas (CTL) ou célulasT auxiliares, respectivamente. As DC imaturas podemcapturar antígenos, mas elas devem diferenciá-los ouamadurecer para se tornarem capazes de estimular célu-las T naturais. Desta forma, a maturação de célulasdendriticas é um requisito para o estimulo ótimo de umaresposta a célula-T. Quando a maturação ocorre, as APCaumentam as moléculas de expressão de superfície taiscomo as moléculas MHC classe I e classe II, CD40, CD80e CD86. Portanto, os inventores analisaram se EDA-SIINFEKL poderia induzir a maturação de células de ex-pressão de CDllc in vivo. Camundongos C57BL6 foram i-munizados i.v. com 25 de EDA-SIINFEKL, 25 μς de EDA-SIINFEKL digeridas com proteinase K, 25 μg LPS ou comPBS sozinha. Quinze horas depois os camundongos foramsacrificados e as células CDllc purificadas por auto-MACS, rotuladas por anticorpos e analisadas por citome-tria de fluxo. Os inventores constataram que a imuni-zação com EDA-SIINFEKL foi capaz de induzir a expressãode moléculas MHC da classe I e classe II, CD40 e CD86.

Esta capacidade de EDA-SIINFEKL foi completamente anu-lada quando a proteína foi digerida com proteinase Kantes da imunização (Figura 5) . A digestão de LPS comproteinase K não teve qualquer efeito inibidor na capa-cidade de LPS induzir a expressão destes marcadores dematuração (não ilustrados). Os inventores testaram acapacidade de EDA-SIINFEKL induzir maturação das célu-las CDllc provenientes de camundongos C57BL/6 TLR4 KO econstataram que a EDA-SIINFEKL foi incapaz de induzirsobre-expressão de marcadores de maturação encontradosem camundongos C57BL/6 wt (Figura 5).2.2.3 EDA-SIINFEKL é apresentada eficientemente pelascélulas dendríticas às células T especificas para epi-tope de SIINPEKL.

Os inventores caracterizaram a habilidadede EDA-SIINFEKL ser capturado por APC para apresentar oSIINFEKL epitope CTL processado às células T a partirde camundongos transgênicos OT-1, específicos para esteepitope. Medula óssea derivada de DC (IO5 célu-las/cavidade) foi cultivada na presença de diferentesconcentrações de peptideo EDA-SIINFEKL, EDA+SIINFEKL,EDA ou SIINFEKL. Quarenta e oito horas depois, adicio-naram-se IO5 células OT-I não-aderentes. A produção deIFN-γ por células 0T-1 não-aderentes foi medida (Figura6A). Peptideo SIINFEKL foi eficientemente apresentadoàs células T a partir de camundongos 0T-1 conforme pro-vado por produção de IFN-μ. EDA-SIINFEKL também induzaltos níveis de IFN-γ, muito embora sejam necessáriasaltas doses da proteína para se obterem níveis simila-res ou mesmo mais elevados de IFN-γ, indicando clara-mente que a proteína EDA carrega este epitope SIINFEKLpara as moléculas MHC classe I. A adição da proteínaEDA à DC incubada com peptideo SIINFEKL não aumenta aprodução de IFN-γ pelas células T a partir de camundon-gos OT-I. Como é de se esperar, DC incubada com EDAsozinho não ativa as células T provenientes de camun-dongos 0T-1. Para analisar se a expressão de moléculaTLR4 em DC poderá aumentar a apresentação de EDA-SIINFEKL, células B3Z específicas de SIINFEKL foram in-cubadas com diferentes concentrações de EDA-SIINFEKL napresença de células de baço a partir de camundongosC57BL/6 wt ou TLR4K0. A apresentação de EDA-SIINFEKLàs células B3Z foi mais eficiente na presença de antí-geno que apresenta células que expressaram TLR4 (Figura6B). Também, a apresentação de EDA-SIINFEKL a célulasB3Z foi completamente bloqueada pela adição de anticor-pos anti-TLR4 (Figura 6C) , sugerindo que TLR4 está en-volvida na captura de EDA-SIINFEKL. Depois disso, osinventores estudaram o efeito de diferentes drogas noprocessamento de EDA-SIINFEKL e constataram que estaapresentação foi totalmente inibida por monensina, bre-feldina ou cicloeximida, mas não por cloroquina, um i-nibidor de acidificação conhecido em endosomes e Iiso-somes posteriores (Figura 6D) . Como é de se esperar, aapresentação de peptideo sintético SIINFEKL não foi a-fetada por estas drogas. Estes dados sugerem que a in-ternalização de EDA-SIINFEKL não é mediada por macropi-nocitose e demonstram que EDA-SIINFEKL é processado porintermédio de caminho de processamento citossólico declasse I.

2.2.4. EDA-SIINFEKL induz CTL especifico de SIINFEKL invivo.

Os resultados precedentes demonstram que aproteína recombinante EDA-SIINFEKL é bioativa e especi-ficamente ativa APCs. A indução de imuno-respostas delinfócito T específico in vivo é da maior importânciapara o desenvolvimento de uma vacina. Assim, os inven-tores testaram se camundongos imunizados com proteínade fusão EDA-SIINFEKL desenvolveu respostas de CTL es-pecíficas contra células visadas pulsadas com epítopede SIINFEKL. Camundongos C57BL6 foram imunizados i.v.com 50 μg de EDA-SIINFEKL ou com SIINFEKL em PBS nosdias 0 e 10. No dia 20, os camundongos foram sacrifi-cados para análise de resposta de CTL contra SIINFEKL.Constatou-se que EDA-SIINFEKL foi capaz de induzir CTLcontra células alvo EL-4 pulsadas com SIINFEKL. Poroutro lado, nenhuma atividade de CTL foi encontradaquando camundongos foram imunizados com SIINFEKL sozi-nho (Figura 7). Devido à capacidade de EDA induzir ma-turação de células dendríticas in vivo, a capacidade deEDA atuar como um adjuvante foi também analisada quandoimunizada com proteína OVA. Nesta experiência, os in-ventores observaram que a presença de EDA na mistura deimunização teve um efeito imunoestimulador e é capaz deaumentar a indução de resposta de CTL contra SIINFEKLinduzida pela proteína OVA (compare-se a atividade lí-tica entre os painéis A e B da figura 9).

2.2.5. EDA-SIINFEKL protege camundongos da provocaçãocom células de tumor expressoras de proteína OVA.

Para estudar a capacidade da proteína fu-são EDA-SIINFEKL proteger camundongos contra injeção decélulas de tumor EG70VA, camundongos foram imunizadoss.c. com 3 nmol de EDA-SIINFEKL, SIINFEKL ou com solu-ção salina. Vinte dias depois da segunda imunização oscamundongos foram provocados s.c. com IO5 EG70VA célu-las. Os inventores constataram que a imunização deEDA-SIINFEKL protege os camundongos do crescimento detumores. Todos os camundongos imunizados com SIINFEKLou com solução salina desenvolveram tumores, enquantoque 40% dos camundongos imunizados com EDA-SIINFEKLpermaneceram isentos de tumores e os restantes 60% ex-perimentaram retardamento de crescimento de tumores(Figura 8).

2.3. Discussão.

No presente estudo, utilizando-se proteínaEDA recombinante como um vetor de distribuição epítope,estabeleceu-se uma estratégia para imunização que provêrespostas de CTL in vivo, contornando a necessidade deum adjuvante. Os inventores identificaram os mecanis-mos que contribuem para a eficiência de EDA que contémproteínas de fusão como um vetor para distribuir antí-genos às células expressoras TLR-4 e para induzir imu-no-respostas celulares contra um antígeno.

Primeiro os inventores descobriram que oestímulo in vitro de BMDC com EDA foi capaz de estimu-lar a produção de sitoquinas proinflamatórias, tais co-mo IL-12 e TNF-α. Estas citoquinas são conhecidas comosendo cruciais para a iniciação de uma forte imuno-resposta contra um antígeno. Adicionalmente, foi cons-tatado que a imunização in vivo com EDA foi capaz deinduzir maturação de DC e aumentar a expressão de molé-culas co-estimuladoras na superfície da DC. A expres-são destas moléculas co-estimuladoras é de suma impor-tância para a indução eficiente de imuno-respostas con-tra um antígeno. Constatou-se que este efeito é depen-dente da presença de TLR4, uma vez que células CDllcisoladas in vivo provenientes de camundongos C57BL/6TLR4 KO previamente imunizados com EDA, não mostramqualquer melhoramento no seu estado de maturação emcomparação com aquelas encontrados nos animais não-imunizados.

Os inventores constataram que a presençade molécula TLR4 em APC aperfeiçoa a apresentação deantígeno depois de incubação com proteína de fusão EDA-SIINFEKL e que esta apresentação não foi afetada pelacloroquinona, que inibe proteólise endolisossomal. Es-tes dados sugerem que a internalização de EDA-SIINFEKLnão é mediada por macropinocitose e demonstra que aproteína EDA-SIINFEKL recombinante é processada como umantígeno citosólico, e implica em que a proteína de fu-são tem de ser distribuída para o citosol através damembrana de plasma de APC.

E o mais importante, os inventores consta-taram que a imunização de camundongos com a proteína defusão EDA-SIINFEKL recombinante é capaz de induzir invivo uma resposta de CTL específica contra o epítopeSIINFEKL. Além disso, a imunização com EDA-SIINFEKL écapaz de proteger camundongos contra provocação com cé-lulas de tumor EG70VA. Todos estes dados mostram queeste vetor proteinico que contém EDA é capaz de: (i)visar antígenos para as células expressoras de TLR4 eem particular APC profissional; (ii) distribuir o antí-geno vetorizado para o caminho de processamento de an-tigeno Classe-I clássico; (iii) induzir a maturação decélulas dendriticas in vivo e in vitro; e (iv) prepararo CTL in vivo contra o antigeno vetorizado na ausênciade adjuvante e, assim, pode ser usado em estratégias devacinação contra agentes infecciosos ou contra câncer.

Também, estas proteínas de fusão que contêm EDA podemservir para a distribuição citossólica de moléculasfarmaceuticamente relevantes para células de expressãode TLR4. Adicionalmente, a capacidade da EDA para in-duzir maturação in vivo de células dendriticas permiteo seu uso como um adjuvante em formulações que contêmum antigeno contra o qual se deseja produzir uma res-posta imunogênica, abrindo o espectro de possibilidadespara o uso de EDA no desenvolvimento de vacinas.

Exemplo 3. A proteína EDA pode ser usadacomo um veiculo para transportar antigenos de pelo me-nos 390 aminoácidos.

3.1 Materiais e métodos.

3.1.1 Expressão de proteínas recombinantes EDA-OVA eEDA-NS 3.

Para a construção um plasmídio de Expres-são de EDA-OVA, mRNA foi extraído de células de tumorEG70VA, que expressam proteína OVA. Depois de trans-crição reversa e amplificação por PCR com preparadoresGCGGCCZGCAATGGGCTCCATCGGCGCA (SEQ ID NO: 16) e GCGGCCG-CAGGGGAAACACATCT (SEQ ID NO: 17) (as bases sublinhadasforam adicionadas para introduzir a seqüência reconhe-cida pela enzima NotI de restrição, enquanto que a se-qüência em itálico pertence ao início e final de oval-bumina). 0 produto PCR foi clonado em pCR2.1-T0P0 uti-lizando-se o kit TOPO TA (Invitrogen), digerido com No-tl e subclonados em plasmídio pET20EDA 1.2 (que expres-sa proteína EDA) previamente digerida com NotI. A ori-entação correta da construção foi verificada por se-qüenciação. Depois de indução de E. coli transformadocom as culturas de plasmídio, a proteína de fusão pre-sente na fração solúvel foi purificada por afinidadecromatográfica (Histrap, Pharmacia) utilizando-se umaplataforma FPLC (AKTA, Pharmacia). A proteína foi des-salinizada com colunas de dessalinização Hitrap (Phar-macia) , e foi concentrada com o dispositivo de filtropor centrifugação Amicon Ultra 4-5000 MWCO (MilliporeCarrighwahill, Ireland). 0 vetor de proteína recombi-nante foi purificado utilizando-se colunas de endotoxi-na Endotrap (Profos Ag, Regensburg, Germany), até osníveis de endotoxina se encontrarem abaixo de 0,2 EU/μςde proteína (medidos por ensaio de LAL, Cambrex). Paraa construção de proteína EDA-NS3 seguiu-se uma estraté-gia de construção similar utilizando-se preparadoresAGCGGCCGCAGCCACCATGGCGCCTATCACGGCCTATTC (SEQ ID NO: 18)e AGCGGCCGCTTGCGGTACGGCCGGAGGGGATGAGTT (SEQ ID NO: 19)que permitem a expressão do fragmento amino-terminal daproteína NS3 (aminoácidos 1026-1221). Em contraste àproteína EDA-OVA que foi extraída a partir da fraçãosolúvel das frações de E. coli, no caso da proteínaEDA-NS3, a proteína foi purificada a partir de corposde inclusão previamente dissolvidos em 8M uréia. De-pois de uma cromatografia de afinidade utilizando-secolunas Histrap, realizou-se uma cromatografia de per-muta iônica (DEAE-sefarose) . A fração purificada pro-veniente desta segunda cromatografia foi redobrada se-guindo-se um protocolo de redobramento em uma colunaG25. Uma vez redobrada, a coluna EDA-NS3 foi dessali-nizada e purificada de endotoxinas utilizando-se colu-nas Endotrap (Profos, Germany).

As proteínas assim purificadas foram ana-lisadas por SDS-PAGE.

3.1.2 Estudos In vítro studies para avaliar a capacida-de de apresentação de antígeno.

Avaliou-se a capacidade da EDA-OVA sercapturada por APC e subseqüente apresentação de CTLepítope processed SIINFEKL para linfócitos T provenien-te de camundongos transgênicos OT-I. Medula óssea-derivada de células dendríticas (IO5 células/cavidade)foram cultivadas na presença de diferentes concentra-ções de EDA-OVA, EDA + OVA (vinculação de forma não-covalente), OVA ou EDA. 12 h depois adicionaram-se 105células/cavidade de células não-aderentes provenientesde camundongos transgenicos OT-I. 24 horas a partir doinicio da cultura o sobrenadante foi extraído paraquantificação de IFN-γ segregado por um ensaio ELISAcomercial.

3.1.3 Medição de indução in vivo de células de produ-ção de linfócitos T citotóxicos (CTL) e IFN-γ depois deimunização.

Camundongos C57BL6 ou HHD (transgênicospara molécula HLA-A2.1) foram imunizados i.v. com 50 μgde EDA-OVA ou EDA-NS3, respectivamente, nos dias 0 e10. No dia 20, os camundongos foram sacrificados parase determinar a resposta CTL contra SIINFEKL ou contrapeptídio NS3 1073. Esplenócitos provenientes de ani-mais imunizados foram cultivados na presença de 0,1μς/πιΐ de SIINFEKL ou 1 μς/πιΐ de NS3 1073 a 5 χ IO6 cé-lulas/ml (10 ml) durante 5 dias em meio completo. No5o dia, as células foram colhidas para ensaios de libe-ração de cromo. A atividade litica foi medida por in-cubação durante 4 horas de diferentes quantidades decélulas de órgão motor com Ix IO4 de células EL-4 alvopreviamente carregadas com 51Cr e com ou sem peptídio.

A percentagem de Iise específica foi calculada de acor-do com a fórmula: (cpm experimental - cpm espontâ-neo) /(cpm máximo - cpm espontâneo) χ 100, onde Iise es-pontâneo corresponde às células alvo incubadas na au-sência de células de órgão motor e Iise máximo é obtidopor incubação de células alvo com 5% Triton xlOO.

Para medir a produção de IFN-γ em respostaaos diferentes peptídios, esplenócitos provenientes decamundongos imunizados foram chapeados em placas de 96cavidades sob 8 χ IO5 células/cavidade, somente commeio completo sozinho, ou com 30 μΜ de peptideos NS31038-1046 (SEQ ID NO: 23), 1073-1081 (SEQ ID NO: 20,CVNGVCWTV) , 1169-1177 (SEQ ID NO: 22), ou com 1 μςΛαΙde recombinante NS3 in a final volume de 0.25 ml. So-brenadantes (50 μΐ) foram removidos 48 horas depois e aIFN-γ foi medida por ELISA (Pharmingen, San Diego, CA)de acordo com as instruções do fabricante.

3.1.4 Proteção contra infecção por vírus de enfermidadevHCV 1-1031 que expressa poliproteina de virus de hepa-tite C.

C57BL/6 foram imunizados nos dias 1 e 10com 1 χ IO6 de medula óssea-derivada de células dendrí-ticas pulsadas com proteína EDA-NS3. Dez dias depoisda segunda imunização, os camundongos foram infectadosvia i.p. com 5 χ IO6 pfu de recombinante vírus de en-fermidade vHCV 1-1031. Três dias depois da infecção,os animais foram sacrificados e a carga viral/mg de te-cido ovariano foi quantificada por um ensaio de quanti-ficação de unidade de formação de placa baseada no usode linha de células CBSC-I.

3.2 Resultados.

3.2.1 Expressão e purificação de proteínas EDA-OVA eEDA-NS3 ρ.

Tal como indicado na seção Materiais e mé-todos, EDA-OVA OU EDA-NS3 foram purificados a partir deextratos de E. coli transformados utilizando-se a fra-ção solúvel no caso de EDA-OVA e forma corpos de inclu-são no caso de EDA-NS3. Nas Figuras IOA e IlA está i-lustrado o resultado de SDS-PAGE para as duas proteí-nas. Obtiveram-se bandas simples correspondentes àsproteínas de dimensões de 55 kDa e 32 kDa corresponden-tes, respectivamente, às dimensões esperadas para cadauma destas proteínas.

3.2.2 Vinculação de EDA à proteína OVA aumenta a apre-sentação de antigeno de IVA aos linfócitos T provenien-tes de caxnundongos transgênicos OT-I.

Os inventores analisaram a capacidade devinculação de EDA à proteína OVA para aumentar a apre-sentação de antigeno de epítope SIINFEKL a células Tespecíficas para este epítope. Os inventores observa-ram que as células dendríticas derivadas de medula ós-sea cultivadas na presença de EDA-OVA estimularam aprodução de IFN-γ mais forte por células não-aderentesde camundongos OT-I do que aquelas induzidas por quan-tidades equimolares de proteína OVA sozinha (Figura9B). Os inventores observaram que a produção de IFN-γtambém foi aumentada em co-culturas que continham pro-teína EDA e proteína OVA, quando comparadas à proteínaOVA sozinha, sugerindo que a maturação de DC induzidapor EDA pôde aumentar a ativação de células T.

3.2.3. Vinculação de EDA à proteína OVA ou à proteínaNS3 aumenta a indução de linfócitos T citotóxicos espe-cíficos in vivo.

Analizou-se a capacidade de EDA-OVA e EDA-NS3 induzirem uma resposta de CTL contra epitope SIIN-FEKL ou contra epitope NS3 1073, respectivamente. Osinventores observaram, para a proteína EDA-OVA, que i-munização com esta proteína dissolvida em solução sali-na foi capaz de induzir uma resposta citotóxica contracélulas alvo incubadas com peptídeo SIINFEKL, que a i-munização com proteína OVA sozinha não é capaz de indu-zir (Figura 9C). Da mesma maneira, imunização de ca-mundongos HHD (transgênicos para HLA-A2.1) com proteínaEDA-NS3 induz uma resposta citotáxica efetiva contracélulas alvo previamente incubadas com peptídeo NS31073 (V) (SEQ ID NO: 20, CVNGNCWTV) , ou com variante1073 (L) deste peptídeo (SEQ ID NO: 21, CLNGVCWTV) Fi-gura IlB. Os inventores também observaram que imuniza-ção de camundongos HHD com proteína EDA-NS3 induz a a-tivação de células produtoras de IFNy específicas parapeptídeos NS3 1038 (SEQ ID NO: 23), 1073 (SEQ ID NO:20, CVNGVCWTV) e 1169 (SEQ ID NO: 22) (Figura 11C).

Além disso, a imunização de camundongos com proteínaEDA-NS3 induz uma resposta celular citotóxica de longapermanência específica contra peptídeo NS3 1073. Comefeito, quando camundongos imunizados com proteína EDA-NS3 foram sacrificados 60 dias depois da imunização, osinventores detectaram a presença de CTL especifico paraeste peptidio (Figura 11D).

3.2.4 Imunização de camundongos C57BL/6 com célulasdendriticas incubadas com proteína EDA-NS3 protege ca-mundongos contra infecção por um vírus de enfermidadeque expressa proteínas de vírus da hepatite C.

Os inventores quiseram estudar se a imuni-zação com células dendriticas incubadas in vitro comproteína EDA-NS3 era capaz de induzir uma resposta decélula capaz de proteger camundongos contra provocaçãocom um vírus recombinante expressor de proteínas de ví-rus da hepatite C. Por esta razão, os inventores imu-nizaram camundongos C57/BL6 com células dendriticas in-cubadas derivadas de medula óssea com proteína EDA-NS3ou com células dendriticas que não tinham sido previa-mente incubadas com qualquer antígeno. Dez dias depoisda segunda imunização, os camundongos foram infectadoscom 5 χ IO6 pfu de vírus recombinante de enfermidadevHCV 1-3011 (um presente gentil do Dr Rice, WashingtonUniversity School of Medicine, St Louis, MO and descri-bed by Grakoui A, et al. J Virol. 1993; 67:1385). Trêsdias depois a carga viral foi medida nos dois grupos decamundongos. Nesta experiência os inventores observa-ram que imunização com DC incubada com proteína EDA-NS3foi capaz de proteger 6% de camundongos contra infec-ções por vírus de enfermidade recombinante.3.3. Discussão.

Tal como se encontra ilustrado nos resul-tados anteriores, a proteína EDA pode servir como umvetor de utilidade para objetivação de epítope de SIIN-FEKL proveniente da proteína OVA proteína para célulasexpressoras de molécula TLR4 e aumenta a sua imunogeni-cidade. Para se avaliar a capacidade de EDA aumentar aimunogenicidade de proteínas maiores, os inventoresconstruíram proteínas recombinantes de fusão de EDA-OVAque continham OVA completa (397 aminoácidos) e proteínaEDA-NS3 que continha o fragmento com atividade de pro-tease de proteína NS3 a partir de vírus de hepatite C.

Estes resultados demonstram que a proteínade EDA pode agir como um vetor muito eficiente para an-tígenos maiores visados. Desta forma, os inventoresacharam que em ensaios de apresentação de antígeno quea vinculação da OVA ao EDA aumenta a captura de antíge-no capture pelas células de apresentação de antígeno,aumentando a ativação de célula T específica. Também,os inventores observaram que imunização com estas pro-teínas de fusão (EDA-OVA e EDA-NS3) permite a induçãode respostas citotóxicas específicas contra estes antí-genos. Estas respostas induzidas foram de longa dura-ção. Finalmente, os inventores observaram que a admi-nistração da proteína EDA-NS3 com células dendríticaspermitem a indução de uma resposta celular protetoracontra a infecção por vírus antivariólico que expressaas proteínas de vírus de hepatite C.Estes dados indicam que a proteína de EDApode ser um vetor de proteína muito adequado para a in-dução de respostas celulares contra um antígeno de in-teresse. A construção das proteínas de fusão baseadaem proteína de EDA constitui uma estratégia apropriadanos protocolos de vacinação contra as enfermidades detumores ou as enfermidades provocadas por agentes in-fecciosos.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA S.L.

<120> AGENTES e MÉTODOS BASEADOS NO USO DE DOMÍNIO DE EDA DE FIBRONECTINA

<130> 1.2006.0176/ZAR

<150> ES200501412

<151> 2005-06-13

<160> 23

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1

<211> 348

<212> DNA

<213> Vetor proteináceo recombinante

<400> 1

atgaacattg atcgccctaa aggactggca ttcactgatg tggatgtcga ttccatcaaa 60attgcttggg aaagcccaca ggggcaagtt tccaggtaca gggtgaccta ctcgagccct 120gaggatggaa tccgggagct tttccctgca cctgatggtg aagacgacac tgcagagctg 180cagggcctca ggccggggtc tgagtacaca gtcagtgtgg ttgccttgca cgatgatatg 240gagagccagc ccctgattgg aatccagtcc acacagcttg agagtataat caactttgaa 300aaactgactg aatgggcggc cgcactcgag caccaccacc accaccac 348

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> Vetor proteináceo recombinante

<220>

<221> CONDIÇÃO_MISC

<222> (1) .. (116)

<223> Vetor proteináceo recombinante mEDA-SIINFEKL-6xHis (EDA-SIINFEKL) ,codificado pela seqüência SEQ. ID. NO.: 1

<220>

<221> CONDIÇÃO_MISC

<222> (2) . . (91)

<223> domínio de fibronectina EDA de camundong (mEDA)<220>

<221> CONDIÇÃO_MISC

<222> (92)..(105)<223> PeptidioQLE-SIINFEKL-TEW

<220><221> CONDIÇAO_MISC<222> (111) . . (116)<223> Final de histidina 6xHis

<400> 2Met Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val1 5 10 15

Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg20 25 30

Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile Arg Glu Leu Phe35 40 45

Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg50 55 60

Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met65 70 75 80

Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser Thr Gln Leu Glu Ser Ile85 90 95

Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Ala Ala Ala Leu Glu His His100 105 110

His His His His115

<210> 3

<211> 255

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 3

aacattgatc gccctaaagg actggcattc actgatgtgg atgtcgattc catcaaaatt 60gcttgggaaa gcccacaggg gcaagtttcc aggtacaggg tgacctactc gagccctgag 120

gatggaatcc atgagctatt ccctgcacct gatggtgaag aagacactgc agagctgcaa 180

ggcctcagac cgggttctga gtacacagtc agtgtggttg ccttgcacga tgatatggag 24 0

agccagcccc tgatt 255

<210> 4

<211> 85

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 4

Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp1 5 10 15

Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr20 25 30

Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro35 40 45

Ala Pro Asp Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro50 55 60

Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu65 70 75 80

Ser Gln Pro Leu Ile85

<210> 5

<211> 246

<212> DNA

<213> Vetor proteinico recombinante

<400> 5

atgaacattg atcgccctaa aggactggca ttcactgatg tggatgtcga ttccatcaaa 60attgcttggg aaagcccaca ggggcaagtt tccaggtaca gggcctcagg ccggggtctg 120agaacacagt cagtgtggtt gccttgcacg atgatatgga gagccagccc ccagcttgag 180agtataatca actttgaaaa actgactgaa tgggcggtcg cactcgagca ccaccaccac 240caccac 246

<210> 6

<211> 82

<212> PRT

<213> Vetor proteinico recombinante

<220>

<221> condição_misc<222> (1) .. (82)

<223> Vetor proteinico recombinante mEDAalt-SIINFEKL-6xHis, codificado porseqüência SEQ. ID. NO.: 5

<220>

<221> condição_misc<222> (2) .. (57)

<223> Domínio de fibronectina EDA alternativo de camundongo (mEDAalt), ge-rado por junção alternativa<220>

<221> condição_misc

<222> (58)..(71)

<223> Peptidio QLE-SIINFEKL-TEW

<220>

<221> condição_misc

<222> (77)..(82)

<223> Final de histidina

<400> 6

Met Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val15 10 15

Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg20 25 30

Tyr Arg Ala Ser Gly Arg Gly Leu Arg Thr Gln Ser Val Trp Leu Pro35 40 45

Cys Thr Met Ile Trp Arg Ala Ser Pro Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn50 55 60

Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Ala Val Ala Leu Glu His His His His65 70 75 80

His His

<210> 7

<211> 168

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

aacattgatc gccctaaagg actggcattc actgatgtgg atgtcgattc catcaaaatt 60

gcttgggaaa gcccacaggg gcaagtttcc aggtacaggg cctcagaccg ggttctgagt 120

acacagtcag tgtggttgcc ttgcacgatg atatggagag ccagcccc 168

<210> 8

<211> 56

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 8

Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp15 10 15Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly

Gln Val Ser Arg Tyr30

20

25

Arg Ala Ser Asp Arg Val Leu Ser Thr Gln Ser

Val Trp Leu Pro Cys45

35

40

Thr Met Ile Trp Arg Ala Ser Pro

50

55

<210> 9<211> 909<212> DNA

<213> Vetor proteinico recombinante<4 00> 9

atgaacattg atcgccctaa aggactggca ttcactgatg tggatgtcga ttccatcaaa 60

attgcttggg aaagcccaca ggggcaagtt tccaggtaca gggtgaccta ctcgagccct 120

gaggatggaa tccgggagct tttccctgca cctgatggtg aagacgacac tgcagagctg 180

cagggcctca ggccggggtc tgagtacaca gtcagtgtgg ttgccttgca cgatgatatg 240

gagagccagc ccctgattgg aatccagtcc acagcggccg cagccaccat ggcgcctatc 300

acggcctatt cccaacaaac gcggggcctg cttggctgta tcatcactag cctcacaggt 360

cgggacaaga accaggtcga tggggaggtt caggtgctct ccaccgcaac gcaatctttc 420

ctggcgacct gcgtcaatgg cgtgtgttgg accgtctacc atggtgccgg ctcgaagacc 480

ctggccggcc cgaagggtcc aatcacccaa atgtacacca atgtagacca ggacctcgtc 54 0

ggctggccgg cgccccccgg ggcgcgctcc atgacaccgt gcacctgcgg cagctcggac 600

ctttacttgg tcacgaggca tgccgatgtc attccggtgc gccggcgagg cgacagcagg 660

gggagtctac tctcccctag gcccgtctcc tacctgaagg gctcctcggg tggaccactg 720

ctttgccctt cggggcacgt tgtaggcatc ttccgggctg ctgtgtgcac ccggggggtt 780

gcgaaggcgg tggacttcat acccgttgag tctatggaaa ctaccatgcg gtctccggtc 840

ttcacagaca actcatcccc tccggccgta ccgcaagcgg ccgcactcga gcaccaccac 900

caccaccac 909

<210> 10

<211> 303

<212> PRT

<213> Vetor proteinico recombinante<220>

<221> CONDIÇÃO_MISC<222> (1)..(303)

<223> Vetor proteinico recombinante mEDA-NS3-6xHis (EDA-NS3), codificadopor seqüência SEQ. ID. NO. : 9

<220>

<221> CONDIÇÃ0_MISC

<222> (2)..(91)

<223> Domínio de fibronectina EDA de camundongo (mEDA)

<220>

<221> C0NDIÇÃ0_MISC

<222> (97)..(292)

<223> NS3 proteína proveniente de vírus de hepatite C

<220>

<221> C0NDIÇÃ0_MISC

<222> (298)..(303)

<223> Final de histidina

<400> 10

Met Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val1 5 10 15

Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg20 25 30

Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile Arg Glu Leu Phe35 40 45

Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg50 55 60

Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met65 70 75 80

Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser Thr Ala Ala Ala Ala Thr85 90 95

Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly100 105 110

Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Asp Gly115 120 125

Glu Val Gln Val Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys130 135 140Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr145 150 155 160

Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp165 170 175

Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr180 185 190

Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala195 200 205

Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu210 215 220

Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu225 230 235 240

Leu Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys245 250 255

Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Met260 265 270

Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro275 280 285

Ala Val Pro Gln Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His290 295 300

<210> 11<211> 1473<212> DNA

<213> Vetor proteinico recombinante<4 00> 11

atgaacattg atcgccctaa aggactggca ttcactgatg tggatgtcga ttccatcaaa 60

attgcttggg aaagcccaca ggggcaagtt tccaggtaca gggtgaccta ctcgagccct 120gaggatggaa tccgggagct tttccctgca cctgatggtg aagacgacac tgcagagctg 180cagggcctca ggccggggtc tgagtacaca gtcagtgtgg ttgccttgca cgatgatatg 240gagagccagc ccctgattgg aatccagtcc acagcggccg caatgggctc catcggcgca 300gcaagcatgg aattttgttt tgatgtattc aaggagctca aagtccacca tgccaatgag 360aacatcttct actgccccat tgccatcatg tcagctctag ccatggtata cctgggtgca 420aaagacagca ccaggacaca gataaataag gttgttcgct ttgataaact tccaggattc 480ggagacagta ttgaagctca gtgtggcaca tctgtaaacg ttcactcttc acttagagac 540atcctcaacc aaatcaccaa accaaatgat gtttattcgt tcagccttgc cagtagactt 600tatgctgaag agagataccc aatcctgcca gaatacttgc agtgtgtgaa ggaactgtat 660agaggaggct tggaacctat caactttcaa acagctgcag atcaagccag agagctcatc 720aattcctggg tagaaagtca gacaaatgga attatcagaa atgtccttca gccaagctcc 780gtggattctc aaactgcaat ggttctggtt aatgccattg tcttcaaagg actgtgggag 840aaaacattta aggatgaaga cacacaagca atgcctttca gagtgactga gcaagaaagc 900aaacctgtgc agatgatgta ccagattggt ttatttagag tggcatcaat ggcttctgag 960aaaatgaaga tcctggagct tccatttgcc agtgggacaa tgagcatgtt ggtgctgttg 1020cctgatgaag tctcaggcct tgagcagctt gagagtataa tcaactttga aaaactgact 1080gaatggacca gttctaatgt tatggaagag aggaagatca aagtgtactt acctcgcatg 1140aagatggagg aaaaatacaa cctcacatct gtcttaatgg ctatgggcat tactgacgtg 1200tttagctctt cagccaatct gtctggcatc tcctcagcag agagcctgaa gatatctcaa 1260gctgtccatg cagcacatgc agaaatcaat gaagcaggca gagaggtggt agggtcagca 1320gaggctggag tggatgctgc aagcgtctct gaagaattta gggctgacca tccattcctc 1380ttctgtatca agcacatcgc aaccaacgcc gttctcttct ttggcagatg tgtttcccct 1440gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cac 1473

<210> 12

<211> 491

<212> PRT

<213> Vetor proteínico recombinante<220>

<221> CONDIÇAO_MISC

<222> (1)..(491)

<223> Vetor proteínico recombinante mEDA-0VA-6xHis (EDA-OVA), codificadopor seqüência SEQ. ID. NO.: 11

<220>

<221> CONDIÇÃO_MISC

<222> (2)..(91)

<223> Domínio de fibronectina EDA de camundongo (mEDA)<220>

<221> CONDIÇÃO_MISC

<222> (95)..(480)

<223> Proteína OVA<220>

<221> CONDIÇÃO_MISC

<222> (486)..(491)

<223> Final de histidina

<400> 12

Met Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val1 5 10 15

Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg20 25 30

Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile Arg Glu Leu Phe35 40 45

Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg50 55 60

Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met65 70 75 80

Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser Thr Ala Ala Ala Met Gly85 90 95

Ser Ile Gly Ala Ala Ser Met Glu Phe Cys Phe Asp Val Phe Lys Glu100 105 110

Leu Lys Val His His Ala Asn Glu Asn Ile Phe Tyr Cys Pro Ile Ala115 120 125

Ile Met Ser Ala Leu Ala Met Val Tyr Leu Gly Ala Lys Asp Ser Thr130 135 140

Arg Thr Gln Ile Asn Lys Val Val Arg Phe Asp Lys Leu Pro Gly Phe145 150 155 160

Gly Asp Ser Ile Glu Ala Gln Cys Gly Thr Ser Val Asn Val His Ser165 170 175

Ser Leu Arg Asp Ile Leu Asn Gln Ile Thr Lys Pro Asn Asp Val Tyr180 185 190

Ser Phe Ser Leu Ala Ser Arg Leu Tyr Ala Glu Glu Arg Tyr Pro Ile195 200 205Leu Pro Glu Tyr Leu Gln Cys Val Lys Glu Leu Tyr Arg Gly Gly Leu210 215 220

Glu Pro Ile Asn Phe Gln Thr Ala Ala Asp Gln Ala Arg Glu Leu Ile225 230 235 240

Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile Arg Asn Val Leu245 250 255

Gln Pro Ser Ser Val Asp Ser Gln Thr Ala Met Val Leu Val Asn Ala260 265 270

Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Thr Phe Lys Asp Glu Asp Thr275 280 285

Gln Ala Met Pro Phe Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Pro Val Gln290 295 300

Met Met Tyr Gln Ile Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser Met Ala Ser Glu305 310 315 320

Lys Met Lys Ile Leu Glu Leu Pro Phe Ala Ser Gly Thr Met Ser Met325 330 335

Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser340 345 350

Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met355 360 365

Glu Glu Arg Lys Ile Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met Lys Met Glu Glu370 375 380

Lys Tyr Asn Leu Thr Ser Val Leu Met Ala Met Gly Ile Thr Asp Val385 390 395 400

Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Glu Ser Leu405 410 415

Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala420 425 430

Gly Arg Glu Val Val Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala Ala Ser435 440 445Val Ser Glu Glu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys Ile Lys450 455 460

His Ile Ala Thr Asn Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val Ser Pro465 470 475 480

Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His485 490

<210> 13<211> 30<212> DNA

<213> Oligonucleotidio sintético<400> 13

ccatatgaac attgatcgcc ctaaaggact 30

<210> 14<211> 75<212> DNA

<213> Oligonucleotidio sintético<400> 14

agcggccgcc cattcagtca gtttttcaaa gttgattata ctctcaagct gtgtggactg 60

gattccaatc agggg 75

<210> 15<211> 33<212> DNA

<213> Oligonucleotidio sintético<400> 15

agcggccgct gtggactgga ttccaatcag ggg 33

<210> 16<211> 27<212> DNA

<213> Oligonucleotidio sintético<400> 16

gcggccgcaa tgggctccat cggcgca 27

<210> 17<211> 23<212> DNA<213> Oligonucleotídio sintético<400> 17

gcggccgcag gggaaacaca tct

<210> 18<211> 39<212> DNA

<213> Oligonucleotídio sintético<400> 18

agcggccgca gccaccatgg cgcctatcac ggcctattc

<210> 19<211> 36<212> DNA

<213> Oligonucleotídio sintético<4 00> 19

agcggccgct tgcggtacgg ccggagggga tgagtt

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Peptidio sintético

<400> 20

Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Peptídio sintético

<4 00> 21

Cys Leu Asn Gly Val Cys Trp Thr Val1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Peptídio sintético

<400> 22

Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val1 5<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Peptidio sintético

<400> 23

Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser1 5

Claims

1. - Uso de um polipeptídio que compreendea seqüência de aminoácidos selecionada entre:a) domínio EDA de fibronectina (EDA), oub) um fragmento do dito domínio de EDA capaz deligação a TLR4, ouc) uma variante do dito domínio ou fragmento deEDA capaz de ligação a TLR4 e com mais de 70% dehomologia com quaisquer formas ou fragmentos na-turais de domínio de EDAcaracterizado pelo fato de ser usado na manufatura deuma composição farmacêutica estimuladora de uma respos-ta imune específica de antígeno.

2. - Uso de um polipeptídio, de acordo coma reivindicação 1, caracterizado pelo fato de se desti-nar à manufatura de uma composição farmacêutica estimu-ladora de uma resposta imune para o tratamento e profi-laxia de uma enfermidade infecciosa, de tumor ou alérgica.

3. - Uso de um polipeptídio, de acordo coma reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a di-ta composição farmacêutica se destina ao tratamento eprofilaxia de uma enfermidade infecciosa.

4. - Uso de um polipeptídio, de acordo coma reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a di-ta composição farmacêutica se destina ao tratamento eprofilaxia de hepatite C.

5. - Uso de um polipeptídio, de acordo coma reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a di-ta composição farmacêutica se destina ao tratamento eprofilaxia de uma enfermidade de tumor.

6. - Uso de um polipeptidio, de acordo coma reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a di-ta composição farmacêutica se destina ao tratamento eprofilaxia de uma enfermidade alérgica.

7. - Uso de um polipeptidio, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadopelo fato de que o fragmento correspondente ao domíniode EDA compreende uma seqüência selecionada a partirde:a) aminoácidos 2-91 da SEQ. ID. NO: 2;b) SEQ. ID. NO: 4; ec) um fragmento das seqüências a) e b) ca-paz de ligar células expressoras deTLR4.

8. - Uso de um polipeptidio, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadopelo fato de que o fragmento correspondente ao domíniode EDA compreende uma seqüência selecionada a partirde:a) aminoácidos 2-57 da SEQ. ID. NO: 6;b) SEQ. ID. NO: 8; ec) um fragmento das seqüências a) e b) ca-paz de ligar células expressoras deTLR4.

9. - Uso de um polipeptidio, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizadopelo fato de que a dita composição farmacêutica compre-ende ainda uma ou mais moléculas de interesse selecio-nadas a partir de: um antígeno, um epitope, e um alérgeno.

10. - Uso de um polipeptídio, de acordo coma reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o di-to polipeptídio é encadeado à dita molécula de interes-se.

11. - Uso de um polipeptídio, de acordo comqualquer uma das reivindicações 9 e 10, caracterizadopelo fato de que o dito antígeno é selecionado a partirde um antígeno viral, um antígeno fúngico, um antígenobacteriano, e um antígeno parasítico.

12. - Uso de um polipeptídio, de acordo comqualquer uma das reivindicações 9 e 10, caracterizadopelo fato de que o dito antígeno é um antígeno viralproveniente de vírus da hepatite C.

13. - Uso de um polipeptídio, de acordo comqualquer uma das reivindicações 9 e 10, caracterizadopelo fato de que o antígeno é selecionado a partir deum antígeno de tumor e uma determinante antigênica detumor.

14. - Uso de um polipeptídio, de acordo comqualquer uma das reivindicações 9 e 10, caracterizadopelo fato de que a molécula de interesse é um alérgeno.

15. - Vetor proteínico, caracterizado pelofato de compreender um polipeptídio cuja seqüência deaminoácidos é selecionada a partir de:a) domínio EDA de fibronectina (EDA),b) um fragmento do dito domínio de EDA ca-paz de ligação a TLR4, ouc) uma variante do dito domínio ou frag-mento de EDA capaz de ligação a TLR4 ecom mais de 70% de homologia com qual-quer forma ou fragmento natural do ditodomínio de EDA:ligado a uma molécula de interesse selecionada a partirde: um antígeno, um epítope, e um alérgeno.

16. - Vetor proteínico, conforme descritona reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que adita molécula de interesse é selecionada a partir de umantígeno viral, um antígeno fúngico, um antígeno bacte-riano, e um antígeno parasítico.

17. - Vetor proteínico, de acordo com areivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a ditamolécula de interesse é um antígeno viral provenientedo vírus de hepatite C.

18. - Vetor proteínico de acordo com a rei-vindicação 17, caracterizado pelo fato de que o antíge-no viral de hepatite C é a proteína NS3 ou um fragmentoantigênico da dita proteína.

19. - Vetor proteínico, de acordo com areivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a ditaseqüência de aminoácidos é SEQ ID NO: 10.

20. - Vetor proteínico, de acordo com areivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a ditamolécula de interesse é selecionada a partir de um an-tigeno tumoral e de uma determinante antigênica tumoral.

21. - Vetor proteinico, de acordo com areivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a ditamolécula de interesse é um alérgeno.

22. - Vetor proteinico, de acordo com qual-quer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelofato de que compreende uma seqüência de aminoácidos se-lecionada a partir dos aminoácidos 2-91 da SEQ ID NO: 2ou aminoácidos 2-57 da SEQ ID NO: 6.

23. - Ácido nucléico modificado, caracteri-zado pelo fato de que ele codifica um vetor proteinicoconforme descrito em qualquer uma das reivindicações 15a 22.

24. - Ácido nucléico modificado, de acordocom a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de quetambém compreende uma seqüência de controle encadeadaoperacionalmente reguladora de expressão do vetor pro-teinico .

25. - Ácido nucléico modificado, de acordocom as reivindicações 23 ou 24, caracterizado pelo fatode que compreende a SEQ. ID. NO: 1, ou SEQ ID. NO: 5.

26. - Ácido nucléico modificado, de acordocom a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fatode ser compreendido pela SEQ ID NO: 9.

27. - Vetor de expressão para a expressãode gene de um vetor proteínico conforme descrito emqualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizadopelo fato de que o dito vetor de expressão compreendeum ácido nucléico modificado definido em qualquer umadas reivindicações 23 a 26.

28. - Vetor de expressão de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o ditovetor é um vetor viral.

29. - Célula hospedeira de expressão, ca-racterizada pelo fato de compreender um ácido nucléicomodificado conforme descrito em qualquer uma das rei-vindicações 23 a 26, ou um vetor de expressão definidonas reivindicações 27 ou 28.

30. - Célula hospedeira de expressão, deacordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fatode que a dita célula de expressão de hospedeira é Es-cherichia coli.

31. - Método para produzir um vetor proteí-nico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15a 22, caracterizado pelo fato de compreender cultivaruma célula de expressão de hospedeira definida nas rei-vindicação 2 9 ou 30 sob condições que permitem a produ-ção do dito vetor proteínico e recuperação do mesmo.

32. - Uso de um ácido nucléico modificado,conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 23a 26, um vetor de expressão definido nas reivindicações-27 a 28, ou uma célula hospedeira definida nas reivin-dicações 29 ou 30, caracterizado por ser usado na pre-paração de uma composição farmacêutica estimuladora deuma imuno resposta especifica de antigeno para o trata-mento e profilaxia de uma enfermidade infecciosa, detumor, ou alérgica.

33. - Composição farmacêutica, caracteriza-da pelo fato de compreender pelo menos um carreadorfarmaceuticamente aceitável, e pelo menos um dos se-guintes componentes:i) um vetor proteinico definido em qualquer umadas reivindicações 15 a 22;ii) um ácido nucléico modificado definido em qual-quer uma das reivindicações 23 a 2 6;iii) um vetor de expressão que compreende o ditoácido nucléico modificado definido nas reivin-dicações 27 a 28; ouiv) uma célula hospedeira de expressão que tambémcompreende o dito ácido nucléico modificadodefinido nas reivindicações 29 ou 30.

34. - Composição farmacêutica, caracteriza-da pelo fato de compreender uma quantidade de célulasdendriticas, em que as ditas células dendriticas foramincubadas in vitro com pelo menos um dos seguintes com-ponentes :i) um vetor proteinico definido em qualquer umadas reivindicações 15 a 22;ii) um ácido nucléico definido em qualquer uma dasreivindicações 23 a 26; ouiii) um vetor de expressão que compreende o ditoácido nucléico definido nas reivindicações 27 a 28.

35. - Composição farmacêutica, de acordocom as reivindicações 33 ou 34, caracterizada pelo fatode que a composição é uma vacina ou uma composição imu-no-terapêutica.