BRPI0612321A2 - métodos de tratamento de doença inflamatória do intestino (ibd), método para redução de uma pontuação do ìndice de atividade da doença (dai), artigo de fabricação e usos de um anticorpo cd20 - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE TRATAMENTO DE DOENçA INFLAMATóRIA DO INTESTINO (IBD), MéTODO PARA REDUçãO DE UMA PONTUAçãO DO ìNDICE DE ATIVIDADE DA DOENçA (DAI), ARTIGO DE FABRICAçãO E USOS DE UM ANTICORPO CD20. A presente invenção refere-se ao tratamento de IBD, especialmente colite ulcerativa (UC) com um anticorpo que se liga a CD20.

Description

"MÉTODOS DE TRATAMENTO DE DOENÇA INFLAMATÓRIA DOINTESTINO (IBD), MÉTODO PARA REDUÇÃO DE UMA PONTUAÇÃO DOÍNDICE DE ATIVIDADE DA DOENÇA (DAI)i ARTIGO DE FABRICAÇÃO EUSOS DE UM ANTICORPO CD20"

Este é um pedido não provisório reivindicando prioridade com baseem 35 USC §119 para o pedido provisório US 60/671,902 depositado em 15 deabril de 2005, cujo relatório descritivo é integralmente incorporado ao presentepedido como referência.

Campo da Invenção

A presente invenção relaciona-se ao tratamento de IBD,especialmente colite ulcerativa (UC) com um anticorpo que se liga a CD20.

Antecedentes da Invenção

Doença Inflamatória do Intestino fIBD)

Doença inflamatória do intestino (IBD) é o nome de um grupo dedisfunções que causam inflamação no intestino. Os sintomas de IBD incluemespasmos e dores abdominais, diarréia, perda de peso e sangramentointestinal. A opinião de consenso atual com respeito à patogênese de IBDconcentra-se no papel da desregulação geneticamente determinada naresposta imune do hospedeiro contra a flora bacteriana residente (Pallone etai, The immune system in inflammatory bowel disease. Em: Satsangi J,Sutherland LR, editores. Inflammatory Bowel Disease. Espanha: ChurchillLivingstone, 85-93 (2003)).

Doença de Crohn e colite ulcerativa (UC) são as formas maiscomuns de IBD.

Doença de Crohn usualmente causa úlceras ao longo do comprimentodos intestinos delgado e grosso. Doença de Crohn geralmente tanto se distribui noreto como causa inflamação ou infecção com drenagem ao redor do reto.

Quase sem exceção, UC envolve o reto e se espalha na proximidadedas porções contínuas ou por todo o cólon. A atividadeda doença é usualmenteintermitente, com recidiva e descanso. A imagem sigmoidoscópica oucolonoscópica é característica. Na doença branda, a mucosa colônica aparecehiperêmica e granular. Na doença mais severa, pequenos pontos de úlcera estãopresentes e a mucosa está caracteristicamente friável e pode sangrarespontaneamente. Histologicamente, o infiltrado celular inflamatório na doençaativa usualmente inclui neutrófilos, que freqüentemente invadem as criptas, comotambém estão associados com lesão epitelial e distorção da cripta. Um aumentodo número de linfócitos na lâmina própria e plasmocitose basal estão usualmentepresentes.

Entre 500.000 e 700.000 pacientes sofrem de UC nos EstadosUnidos (Loftus, Gastroenterology 126:1504-1517(2004)). Manifestações extracolônicas de UC incluem artrite, uveíte, estomatite aftosa, pioderma gangrenoso eeritema nodoso. Aterapia inicial para pacientes com a doença branda a moderadaé usualmente um aminosalicilato. Em testes controlados, a melhora da doença porvários critérios ocorreu em até 30% dos sujeitos no grupo placebo, dessa forma, otratamento específico pode ser uma opção para pacientes com doença muitobranda. UC do lado esquerdo distai que envolve o reto e cólon sigmóide pode sertratada de maneira eficaz com formulações enema 5-aminosalicilato (5-ASA). Empacientes com UC ativa que não respondem ao tratamento 5-ASA padrão enaqueles com a doença mais severa, corticoesteróides orais foram a base daterapia sintomática aguda. No entanto, corticoesteróides não são efetivos namanutenção de remissão a longo prazo em pacientes com UC dado que seu usoestá associado com toxicidade significante ao longo do tempo (Lennard-Jones eta/., Lancet 1:188-189 (1965)).

Pacientes que não respondem a drogas 5-ASA e corticoesteróidespara exacerbações da doença tiveram opções terapêuticas limitadas disponíveis.Muitos destes pacientes são tratados com agentes imunossupressivos, maiscomumente 6-mercaptopurina (6-MP) ou azatioprina, que pode ter um atrasosignificante no princípio do efeito terapêutico na doença ativa. Em pacientes coma doença severa que não responderam às altas doses de IV corticoesteróides eque estão a espera de colectomia, a eficácia significante a curto prazo com IVciclosporina foi observada em um pequeno estudo controlado por placebo(Lichtiger et ai, N Engl J Med 330:1841-1845 (1994)). Em última análise, acolectomia é necessária em 25%-40% dos pacientes. Existe uma claranecessidade não apropriada para um agente terapêutico seguro e efetivo quepossa fornecer rápido controle da doença ativa e indução prolongada de remissãoda doença.

Embora a patogênese de UC não seja completamente entendida,existe um aumento de evidência de que UC possa ser uma disfunção auto-imune,com células B desempenhando um papel na patofisiologia da doença. Células B,assim como células T, estão presentes nos agregados linfóides basais, umacaracterística histopatológica considerada indicative de UC e vista em corteshistológicos de pacientes com UC ativa (Yeung etal., Gut47:212-227(2000)). Nasavaliações clínicas e parâmetros histológicos que podem prognosticar recidiva empacientes com UC em descanso, a presença de números elevados de células doplasma na porção basal da mucosa foi descoberto como sendo um indicadorindependente de recidiva (Bitton et al.,Gastroenterology 120:1320 (2001)).Enquanto acha-se que a inflamação na mucosa em UC é dirigida por células Tativadas, estes pacientes possuem um perfil de padrão de expressão de citocinaT-auxiliar-2 (Th2) (Monteleone etal., Gut50(Suppl lll)64 (2002)). Como citocinasTh2 classicamente dirigem respostas imunes de célula B e produção deanticorpos, um papel central para célula B pode ser postulado em UC.

Quantidades elevadas de IgG, IgM e IGA e células do plasma, comotambém produção elevada de anticorpos contra antígenos do lúmen intestinal eauto-antígenos foram encontradas na lâmina própria da mucos colônica inflamadaem pacientes com UC (MacDermott ef al., Gastroenterology 81:844-852 (1981)).Além disso, os dados aumentam na presença de auto-anticorpos em pacientescom UC1 embora um papel definitivo destes anticorpos na patogênese de UC nãoseja certo. Aproximadamente dois terços dos pacientes com UC possuem umanticorpo circulante conhecido como anticorpo citoplasmático antineutrófiloperinuclear (p-ANCA), que é dirigido contra componentes de leucócitos neutrófilos(Quinton et al., Gut 42:788-791 (1998)). Foi recentemente mostrado que o p-ANCA que ocorre em algumas formas de vasculite, e que é dirigido contra umcomponente do neutrófilo diferente (mieloperoxidase), é a própria causa davasculite e lesão no tecido em modelos animais experimentais de vasculite (Xiaoet ai, J Clin Invest 110:955-963 (2002)).

Outro marcador de autoimunidade é a resposta de célula B damucoda colônica contra isoforma 5 topomiosina humana (hTM5), um supostoautoantígeno em UC. A mucosa colônica de pacientes com UC teve um aumentoaltamente significativo no número de células B da lâmina própria que produz IgGcontra hTM5 comparado com pacientes com colite de Crohn e pacientes não IBD1sugerindo um papel distinto importante para anticorpos anti-hTM5 em UC (Onumaet al., Clin Exp Immunol 121:466-471 (2000)). De maneira similar, o número deimunócitos anti-hTM5 IgG foi significantemente maior em pacientes com UCcomparado com controles não-IBD, com 21 de 23 pacientes (91%) tendoimunócitos que produzem IgG, independente da atividade clínica (Onuma et al.,Clin Exp Immunol 121:466-471 (2000)). Além disso, o anticorpo anti-hTM5 foidetectado no soro de pacientes com UC e colangite esclerosante primária(Sakimaki et al., Gut 47:236-241 (2000)). Foi demonstrado que anticorpos anti-cólon no soro de pacientes com UC podem reagir com antígenos de superfícienas células epiteliais colônicas ou mucina colônica em células do cálice (Inoue etal., Gastroenterology 121:1523 (2001)). Estes anticorpos podem contribuir para adestruição da mucosa colônica por meio de mecanismos de citotoxidade mediadapor célula dependente de anticorpo contra células epiteliais colônicas.

Em um estudo, a colite crônica espontânea que ocorre emcamundongos deficientes no receptor de célula T (TCR)a foi observada ser maissevera na ausência de células B maduras. Camundongos deficientes em TCRacom colite crônica que cruzam com camundongos knockout αμ possuemdescendentes que desenvolvem uma forma mais severa de colite do quecamundongos deficientes em TCRa. Neste estudo, a severidade elevada de colitenão foi devido à flora patogênica, mas à completa ausência de células B. Noscamundongos αμ knockout, a colite crônica foi atenuada acentuadamente após aadoção de transferência de células B periféricas dos camundongos deficientes emTCRa para camundongos de 3 a 4 semanas de idade deficientes em αμ antes doprincípio de colite. Isso sugere um papel supressivo para células B nodesenvolvimento de colite nestes modelos murino (Mizoguchi et ai, Int Immunol12:597-605 (2000)).

Anticorpos CD20 E Terapia Com Estes

Linfócitos são um dos muitos tipos de glóbulos brancos do sangueproduzidos na medula óssea durante o processo de hematopoiese. Existem duaspopulações principais de linfócitos: Linfócitos B (células B) e linfócitos T (célulasT). Os linfócitos de interesse particular da presente invenção são as células B.

As células B amadurecem na medula óssea e deixam a medulaexpressando um anticorpo que se liga a um antígeno na superfície de suascélulas. Quando uma célula B virgem encontra pela primeira vez o antígeno parao qual o anticorpo de sua membrana é específico, a célula começa a se dividirrapidamente e sua progênie diferencia-se em células B de memória e célulasefetoras denominadas "plasmócitos". As células B de memória têm um períodode vida mais longo e continuam a expressar o anticorpo na membrana com amesma especificidade que a célula parental original. Os plasmócitos nãoproduzem anticorpo na membrana, mas ao invés disto, produzem o anticorpo deuma forma que possa ser secretado. Os anticorpos secretados são as principaismoléculas efetoras da imunidade humoral.

O antígeno CD20 (também denominado antígeno de diferenciaçãorestrito por linfócitos B humanos, Bp35) é uma proteína hidrofóbica detransmembrana com um peso molecular de aproximadamente 35kD localizada emlinfócitos pré-B e B maduros. Valentine et ai, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989) e Einfeld et ai, EMBO J. 7(3):711-717 (1988). O antígeno étambém expressado em mais de 90% dos Iinfomas não-Hodgkin de célula B(NHL) (Anderson et al. Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), mas não é encontrado emcélulas tronco hematopoiéticas, células pró-B, plamócitos normais ou em outrostecidos normais (Tedder et ai J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). CD-20 regulaa(s) etapa(s) inicial(is) no processo de ativação para a iniciação do ciclo ediferenciação celular (Tedder et al., supra), e possivelmente funciona como umcanal de íon cálcio. Tedder et ai, J. CeH Biochem. 14D:195 (1990).

Dado a expressão de CD20 em Iinfomas de células B, este antígenopode servir como um possível "alvo" de tais linfomas. Essencialmente, tais alvospodem ser generalizados como segue: anticorpos específicos ao antígeno CD20de superfície de células B são administrados a um paciente. Estes anticorposanti-CD20 ligam-se especificamente ao antígeno CD20 (ostensivamente) emambas as células normais e malignas; o anticorpo ligado à superfície do antígenoCD20 pode levar à destruição e à depleção das células B neoplásicas.Adicionalmente, os agentes químicos ou as marcas radioativas que têm opotencial de destruir o tumor podem ser conjugados ao anticorpo anti-CD20 de talforma que o agente é especificamente "entregue" às células B neoplásicas.Independentemente da abordagem, o objetivo primário é destruir o tumor, aabordagem específica pode ser determinada pelo anticorpo anti-CD20 específicoque é utilizado, e assim, as abordagens disponíveis para atingir o antígeno CD20podem variar consideravelmente.O anticorpo rituximab (RITUXAN ) é um anticorpo monoclonalquimérico elaborado geneticamente direcionado contra o antígeno CD20.Rituximab é o anticorpo denominado "C2B8" na patente US 5.736.137 emitida em7 de abril de 1998 (Anderson et al.). Rituximab é indicado para o tratamento depacientes com Iinfoma não-Hodgkin de células B1 CD20-positivo, folicular ou debaixo grau refratário ou recidivado. In vitro, rituximab também demonstrou mediarcitotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxicidade celulardependente de anticorpo (ADCC) e induzir apoptose (Reff et ai, Blood 83(2):435-445 (1994); Maloney et al., Blood 88:637a (1996); Manches et al., Blood 101:949-954 (2003)). A sinergia entre rituximab e quimioterapia foi observada tambémexperimentalmente. Em particular, rituximab sensibiliza linhagens celulares delinfoma de células B humanas resistentes aos efeitos citotóxicos da doxorubicina,CDDP1 toxina de difteria e ricina (Demidem et al., Câncer Chemotherapy &Radiopharmaceuticals 12(3): 177-186 (1997)). Estudos pré-clínicos in vivodemonstraram que rituximab depleta as células B do sangue periférico, nóduloslinfáticos e da medula óssea de macacos cynomolgus. Reff et al., Blood 83:435-445 (1994).

Rituximab foi também estudado em uma variedade de disfunçõesauto-imunes não malignas, nas quais células B e auto-anticorpos parecemdesempenhar um papel na patofisiologia da doença. Edwards et al., BiochemSoe. Trans. 30:824-828 (2002). Rituximab foi relatado aliviar potencialmentesinais e sintomas de, por exemplo, artrite reumatóide (RA) (Leandro et al., Ann.Rheum. Dis. 61:883-888 (2002); Edwards et ai, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S46 (2002); Stahl et ai, Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003); Emery etal., Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)), lúpus (Eisenberg, Arthritis. Res. Ther.5:157-159 (2003); Lenadro etal. Arthritis Rheum. 46:2673-2677 (2002); Gormanet ai, Lupus, 13: 312-316 (2004)), púrpura trombocitopênica imune (D'Arena etai, Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003); Stasi et ai, Blood, 98: 952-957 (2001);Saleh et ai, Semin. Oncol., 27 (Supp 12):99-103 (2000); Zaja et ai,Haematologica, 87: 189-195 (2002); Ratanatharathorn et ai, Ann. Int. Med., 133:275-279 (2000)), aplasia pura de células vermelhas (Auner et ai, Br. J. Haematol.,116:725-728 (2002)); anemia auto-imune (Zaja et ai, Haematologica 87:189-195(2002) (errata aparece em Haematologica 87:336 (2002); doença por aglutininafria (Layios at al., Leukemia115:187-8 (2001); Berentsen et ai, Blood, 103:2925-2928 (2004); Berentsen et ai, Br. J. Haematol., 115: 79-83 (2001); Bauduer, Br. J.Haematol., 112:1083-1090 (2001); Damiani et ai, Br. J. Haematol., 114: 229-234(2001)), síndrome tipo B de resistência à insulina severa (Coll et ai, N. Engi J.Med., 350: 310-311 (2004), crioglobulinemia mista (DeVita et al., Arthritis Rheum.46 Suppl 9: S206/S469 (2002)), miastenia grave (Zaja et ai, Neurology, 55:1062-63 (2000); Wylam et ai, J. Pediatr., 143: 674-677 (2003)), granulomatose deWegener (Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001)), pênfigovulgar refratário (Dupuy et al., Arch Dermatol., 140:91-96 (2004)), dermatose(Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppi. 9):S1299 (2002)), síndrome de Sjogren(Somer et al., Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003)), crioglobulinemia mistatipo Il ativa (Zaja et ai, Blood, 101: 3827-3834 (2003)), pênfigo vulgar (Dupay etai, Arch. Dermatoi, 140: 91-95 (2004)), neuropatia auto-imune (Pestronk et ai, J.Neuroi Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003); síndrome opsoclono-mioclono(Pranzatelli et al. Neurology 60(Suppl. 1) P05.128:A395 (2003)) e esclerosemúltipla remitente-recorrente (RRMS). Cross et ai (resumo) "Preliminary Resultsfrom a Phase Il Trial of Rituximab in MS" Oitavo Encontro Anual dos Comitês dasAméricas para Pesquisa e Tratamento de Esclerose Múltipla, 20-21 (2003).

Um estudo Fase Il (WA16291) foi conduzido em pacientes comartrite reumatóide (RA), fornecendo 48 semanas de acompanhamento dos dadosde segurança e eficácia de rituximab. Emery et al. Arthritis Rheum 48(9):S439(2003); Szczepanski et al. Arthritis Rheum 48(9):S121 (2003); Edwards et ai, NEngi J. Med. 350:2572-82 (2004). Um total de 161 pacientes foram igualmenterandomizados para quatro braços de tratamento: metotrexato, rituximab sozinho,rituximab mais metotrexato e rituximab mais ciclofosfamida (CTX). O regime detratamento de rituximab foi uma grama administrada intravenosamente nos dias 1e 15. Infusões de rituximab na maioria dos pacientes com RA foram bemtoleradas pela maioria dos pacientes, com 36% de pacientes experimentando pelomenos um evento adverso durante sua primeira introdução (comparado com 30%de pacientes recebendo placebo). Geralmente, a maioria dos eventos adversosfoi considerada branda a moderada na severidade e foi bem equilibrada por todosos grupos de tratamento. Houve um total de 19 eventos adversos sérios pelosquatro braços ao longo das 48 semanas, que foram levemente mais freqüente nogrupo rituximab/CTX. A incidência de infecções foi bem equilibrada por todos osgrupos. A média da taxa de infecções sérias nesta população de pacientes RA foi4,66 por cento de pacientes por ano, que é mais baixa que a taxa de infecçõesque exigem entrada hospitalar nos pacientes RA (9,57 por 100 pacientes por ano)relatado em um estudo epidemiológico baseado em uma comunidade. Doran etai, Arthritis Rheum. 46:2287-2293 (2002).

O perfil de segurança relatado de rituximab em um pequeno númerode pacientes com disfunção neurológica, incluindo neuropatia auto-imune(Pestronk et a!., supra), síndrome opsoclono-mioclono (Pranzatelli et ai, supra), eRRMS (Cross et ai, supra), foi similar àquele relatado em onclogia ou RA. Em umestudo patrocinado de investigação avançada (IST) de rituximab em combinaçãocom interferon-beta (IFN-3) ou acetato de glatiramer em pacientes com RRMS(Cross et ai, supra), 1 de 10 pacientes tratados foi admitido para o hospital poruma noite em observação após ter sentido febre moderada e seguindo primeiraintrodução de rituximab, enquanto os outros 9 pacientes completaram os quatroregimes de introdução sem qualquer evento adverso relatado.

Patentes e publicações de patentes que relacionam anticorposCD20 e moléculas de ligação CD20 incluem patentes US. 5.776.456, 5.736.137,5.843.439, 6.399.061 e 6.682.734, assim como patente US 2002/0197255,patente US 2003/0021781, patente US 2003/0082172, patente US 2003/0095963,patente US 2003/0147885 (Anderson et al.); Patente US 6.455.043, patente US2003/0026804 e documento WO 2000/09160 (Grillo-Lopez, A.); documento WO2000/27428 (Grillo-Lopez e White); documento WO 2000/27433 e patente US2004/0213784 (Grillo-Lopez e Leonard); documento WO 2000/44788 (Braslawskyet al.); documento WO 2001/10462 (Rastetter, W.); documento WO 2001/10461(Rastetter e White); documento WO 2001/10460 (White e Grillo-Lopez); patenteUS 2001/0018041, patente US 2003/0180292, documento WO 2001/34194(Hanna e Hariharan); patente US 2002/0006404 e documento WO 2002/04021(Hanna e Hariharan); patente US 2002/0012665 e documento WO 2001/74388(Hanna, N.); patente US 2002/0058029 (Hanna, N.); patente US 2003/0103971(Hariharan e Hanna); patente US 2002/0009444 e documento WO 2001/80884(Grillo-Lopez, A.); documento WO 2001/97858 White, C.); patente US2002/0128488 e documento WO 2002/34790 (Reff, M.); documento WO2002/060955 (Braslawsky et al.); documento WO 2002/096948 (Braslawsky et al.);documento WO 2002/079255 (Reff and Davies); patente US 6,171,586 edocumento WO 1998/56418 (Lam et al.); documento WO 1998/58964 (Raju, S.);documento WO 1999/22764 (Raju, S.); documento WO 1999/51642, patente US6,194,551, patente US 6,242,195, patente US 6,528,624 e patente US 6,538,124(Idusogie et al.); documento WO 2000/42072 (Presta, L.); documento WO2000/67796 (Curd et al.); documento WO 2001/03734 (Grillo-Lopez et al.); patenteUS 2002/0004587 e documento WO 2001/77342 (Miller e Presta); patente US2002/0197256 (Grewal, I.); patente US 2003/0157108 (Presta, L.); documento WO04/056312 (Lowman et al.); patente US 2004/0202658 e documento WO2004/091657 (Benyunes, K.); documento WO 2005/000351 (Chan, A.); patenteUS 2005/0032130A1 (Beresini efa/.); patente US 2005/0053602A1 (Brunetta, P.);patentes US 6.565.827, 6.090.365, 6.287.537, 6.015.542, 5.843.398 e 5.595.721(Kaminski et a/.); patente US 5.500.362, 5.677.180, 5.721.108, 6.120.767 e6.652.852 (Robinson et al.); patente US 6.410.391 (Raubitschek et ai.); patenteUS 6.224.866 e documento WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); documento WO2001/13945 (Barbera-Guillem, E.); documento WO 2000/67795 (Goldenberg);patente US 2003/0133930 e documento WO 2000/74718 (Goldenberg e Hansen);patente US 2003/0219433 e documento WO 2003/68821 (Hansen et al.);documento WO 2004/058298 (Goldenberg e Hansen); documento WO2000/76542 (Golay et al.); documento WO 2001/72333 (Wolin e Rosenblatt);patente US 6.368.596 (Ghetie et al.); patente US 6.306.393 e patente US2002/0041847 (Goldenberg, D.); patente US 2003/0026801 (Weiner e Hartmann);documento WO 2002/102312 (Engleman, E.); patente US 2003/0068664 (Albitaret al.); documento WO 2003/002607 (Leung, S.); documento WO 2003/049694,patente US 2002/0009427, e patente US 2003/0185796 (Wolin et al.); documentoWO 2003/061694 (Sing and Siegall); documento US 2003/0219818 (Bohen etal.);patente US 2003/0219433 e documento WO 2003/068821 (Hansen et al.);patente US 2003/0219818 (Bohen et al.); patente US 2002/0136719 (Shenoy etal.); documento WO 2004/032828 (Wahl et al.); e documento WO 2002/56910(Hayden-Ledbetter); patente US 2003/0219433 A1 (Hansen etal.)·, documentoWO 2004/035607 (Teeling et a/.); patente US 2004/0093621 (Shitara et al.)]documento WO 2004/103404 (Watkins et al.)] documento WO 2005/000901(Tedder et al.)] patente US 2005/0025764 (Watkins et al.)] documento WO2005/016969 e patente US 2005/0069545 A1 (Carr et al.)] e documento WO2005/014618 (Chang et al.). Ver também patente US 5.849.898 e patente EP(Seed et al.)] patente EP 332.865 A2 (Meyer e Weiss); patente US 4,861,579(Meyer et al.)] patente US 2001/0056066 (Bugelski et al.)] e documento WO1995/03770 (Bhat et al.)]

Publicações relacionando terapia com rituximab incluem: Perotta eAbuel, "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab"Resumo # 3360 Blood 10(1 )(parte 1-2): ρ. 88B (1998); Perotta et aí., "Rituxan in thetreatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)", Blood, 94: 49(resumo) (1999); Matthews, R., "Medicai Heretics" New Scientist (7 April, 2001);Leandro et ai, "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence forsafety, efficacy and dose response" Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001);Leandro et ai., "An open study of B lymphocyte depletion in systemic Iupuserythematosus", Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002), em que duranteum período de 2 semanas, cada paciente recebeu duas introduções de 500 mg derituximab, duas introduções de 750 mg de ciclofosfamida, e dose alta oral decorticoesteróides, e em que dois dos pacientes recidivados tratados em 7 e 8meses, respectivamente, e foram retratados, embora com diferentes protocolos;Weide et ai, "Successful long-term treatment of systemic Iupus erythematosus withrituximab maintenance therapy", Lupus, 12:779-782 (2003), em que um paciente foitratado com rituximab (375 mg/m2 χ 4, repetido em intervalos semanais) e, alémdisso, aplicações de rituximab foram distribuídas a cada 5-6 meses e então amanutenção da terapia foi aceita com 375 mg/m2 a cada três meses, e um segundopaciente com SLE refratária foi tratado com sucesso com rituximab e é aceitamanutenção de terapia a cada três meses, com ambos pacientes respondendo bemà terapia de rituximab; Edwards e Cambridge, "Sustained improvement inrheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes"Rheumatoiogy 40:205-211 (2001); Cambridge et ai, "B lymphocyte depletion inpatients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters"Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002); Edwards et ai, "Efficacy and safety ofrituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: Um teste controladoplacebo randomizado em pacientes com artrite reumatóide. Arthritis andRheumatism 46(9): S197 (2002); Pavelka et ai, Ann. Rheum. Dis., 63: (S1):289-90(2004); Emery et ai, Arthritis Rheum. 50 (S9):S659 (2004); Levine e Pestronk, "IgMantibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using rituximab"Neurology 52:1701-1704 (1999); DeVita et ai, "Efficacy ofselective B cell blockadein the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002);Hidashida etal. "Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab."Apresentado no Annual Scientific Meeting of the American College ofRheumatology, 24 a 29 de outubro; Nova Orleans, LA (2002); Tuscano, J."Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab"Apresentado no Annual Scientific Meeting of the American College ofRheumatology, 24 a 29 de outubro; Nova Orleans, LA (2002); "Pathogenic roles of Bcells in human autoimmunity; insights from the clinic" Martin e Chan1 Immunity20:517-527 (2004); Silverman e Weisman, "Rituximab Therapy and AutoimmuneDisorders, Prospects for Anti-B Cell Therapy", Arthritis and Rheumatism, 48:1484-1492 (2003); Kazkaz e lsenberg, "Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment ofautoimmune diseases", Current opinion in pharmacology, 4: 398-402 (2004);Virgolini e Vanda, "Rituximab in autoimmune diseases", Biomedicine &pharmacotherapy, 58: 299-309(2004); Klemmer et ai, Treatment of antibodymediated autoimmune disorders with a AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab",Arthritis And Rheumatism , 48:S624-S624 (2003); Kneitz et ai, "Effective B celldepletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases" Immunobiology206: 519-527 (2002); Arzoo et ai, Treatment of refractory antibody mediatedautoimmune disorders with an anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab)"Annals ofthe Rheumatic Diseases, 61 (10):922-4 (2002) Looney, R., "Treating humanautoimmune disease by depleting B cells" Ann Rheum Dis. 61: 863-866 (2002);Lake e Dionne, "Future Strategies in Immunotherapy" em Burger1S MedicinalChemistry and Drug Discovery (2003 por John Wiley & Sons, Inc.) artigo on-line comdata de postagem: 15 de janeiro de 2003 (Capítulo 2 "Antibody-DirectedImmunotherapy"); Liang e Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine,Seção: CD20 as an Immunotherapy Target, artigo on-line com data de postagem:15 de janeiro de 2002 entitulado "CD20"; Apêndice 4A entitulado "MonoclonalAntibodies to Human Cell SurfaceAntigens" por Stockinger et ai, edições: Coliganet al., em Current Protocols in Immunology (2003 John Wiley & Sons, Inc) on-linecom data de postagem: maio de 2003; data da publicação impressa: fevereiro de2003, Penichet e Morrison, "CD Antibodies/molecules: Definition; AntibodyEngineering" em Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine Seção: Chimeric,Humanized and Human Antibodies; postado on-line em 15 de janeiro de 2002,Speacks et al. "Response of Wegener's granulomatosis to anti-CD20 chimericmonoclonal antibody therapy" Arthritis & Rheumatism 44:2836-2840 (2001), resumoon-line submissão e convite Koegh et al., "Rituximab for Remission Induction inSevere ANCA-Associated Vasculitis: Report of a Prospective Open-Label Pilot Trialin 10 Patients", American College of Rheumatology, Seção número: 28-100, Títuloda Seção: Vasculitis, Tipo da Seção: ACR Seção Concorrente, Categoria Primária:Vasculitis, Seção 18 de outubro de 2004(http://www.abstractsonline.com/viewer/SearchResults.asp): Eriksson, "Short-termoutcome and safety in 5 patients with ANCA-positive vasculitis treated withrituximab", KidneyandBloodPressure Research, 26: 294 (2003); Kneitz et al., "Bcell depletion with rituximab for refractory vasculitis" Kidney and Blood PressureResearch, 26:294 (2003); Jayne, pôster 88 (11th International Vasculitis and ANCAworkshop), 2003 American Society of Nephrology; Stone e Specks, "RituximabTherapy for the Induction of Remission and Tolerance in ANCA-associatedVasculitis", no Clinicai Trial Research Summary de 2002-2003 Immune ToleranceNetwork, http://www.immunetolerance.orq/research/autoimmune/trials/stone.html; eLeandro et al., "B cell repopulation occurs mainly from naíve B cells in patient withrheumatoid arthritis and systemic Iupus erythematosus" Arthritis Rheum., 48 (Suppl9): S1160 (2003).

Descrição Resumida da Invenção

Em um primeiro aspecto, a invenção relaciona-se a um método paratratar doença inflamatória do intestino (IBD) moderada a severa em um sujeitohumano que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de umanticorpo CD20, em que a administração do anticorpo resulta em uma respostaclínica ou remissão da doença no sujeito.

Em outro aspecto, a invenção relaciona-se a um método para tratardoença inflamatória do intestino (IBD) em um sujeito humano com IBD ativa quecompreende administrar somente uma ou duas doses de um anticorpo CD20 aosujeito, em que a remissão da doença ou resposta é alcançada pelaadministração de uma ou duas doses do anticorpo CD20.

A invenção também fornece um método para tratar doençainflamatória do intestino (IBD) em um sujeito humano com IBD ativa quecompreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo CD20e também compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de umsegundo medicamento selecionado do grupo que consiste de um aminosalicilato,um corticoesteróide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) e azatioprina.

Em ainda um aspecto adicional, a invenção relaciona-se a ummétodo para redução de uma pontuação do índice de atividade da doença (DAI)em um sujeito humano com colite ulcerativa ativa (UC) que compreendeadministrar um anticorpo CD20 ao sujeito em uma quantidade eficaz para reduzira pontuação DAI.

Em ainda uma realização adicional, a invenção relaciona-se a umartigo de fabricação, que compreende:

i. um recipiente que compreende um anticorpo CD20; e

ii. uma bula com instruções de uso para tratar doença inflamatória do intestino (IBD)em um sujeito humano, em que as instruções indicam que uma quantidade eficazdo anticorpo CD20 é administrada ao sujeito humano.

Breve Descrição das Figuras

FIG. 1A é um alinhamento de seqüência que compara asseqüências de aminoácidos de domínio variável leve (Vl) de cada um dos2Η7 murino (SEQ ID NO: 1), variante 2H7.v16 humanizada (SEQ ID NO: 2), eo subgrupo I de cadeia leve kappa humano (SEQ ID NO: 3). As CDRs de Vldo 2H7 e hu2H7v.16 são como segue: CDR1 (SEQ ID NO:4), CDR2 (SEQ IDNO:5), e CDR3 (SEQ ID NO:6).

FIG. 1B é um alinhamento de seqüência que compara as seqüênciasde aminoácidos de domínio variável pesado (Vh) de cada um dos 2H7 murino(SEQ ID NO:7), variante 2H7.v16 humanizada (SEQ ID NO:8), e a seqüênciaconsenso humana do subgrupo Ill de cadeia pesada (SEQ ID NO:9). As CDRs deVh do 2H7 e hu2H7v.16 são como segue: CDR1 (SEQ ID N0:10), CDR2 (SEQ IDNO:11), e CDR3 (SEQ ID NO:12).

Nas FIG. 1A e FIG. 1B, a CDR1, CDR2 e CDR3 em cada cadeiaestão fechadas dentro de parênteses, ladeadas pelas regiões de estrutura FR1-FR4, como indicado. 2H7 refere-se ao anticorpo 2H7 murino. Os asteriscos entreduas linhas das seqüências indicam as posições que são diferentes entre as duasseqüências. A numeração de resíduo está de acordo com Kabat et aL Sequencesof Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991), com inserções mostradas como a, b, c, d, e e.

FIG. 2 mostra um alinhamento das cadeias leves 2H7.v16 e 2H7.v511maduras (SEQ ID NOS: 13 e 15, respectivamente), com numeração de resíduo dedomínio variável Kabat e numeração de resíduo de domínio constante Eu.

FIG. 3 mostra um alinhamento das cadeias pesadas 2H7.v16 e2H7.v511 maduras (SEQ ID NOS: 14 e 16, respectivamente), com numeração deresíduo de domínio variável Kabat e numeração de resíduo de domínio constante Eu.

FIG. 4 decreve o esquema de estudo para o protocolo no Example 1.

Descrição Detalhada das Realizações Preferidas

I. Definições

"Doença inflamatória do intestino" ou "IBD" refere-se ao grupo dedisfunções que causam inflamação no intestino, geralmente manifestada comsintomas que incluem espasmos e dores abdominias, diarréia, perda de peso esangramento intestinal. As principais formas de IBD são colite ulcerativa (UC) edoença de Crohn.

"Colite ulcerativa" ou "UC" é uma doença crônica, episódica einflamatória do intestino grosso e reto caracterizada por diarréia sanguinolenta.Colite ulcerativa é caracterizada por inflamação crônica na mucosa colônica epode ser categorizada de acordo com a localização: "proctite" envolve somente oreto, "proctosigmoidite" afeta o reto e o colon sigmóide, "colite do lado esquerdo"engloba o lado esquerdo inteiro do intestino grosso, "pancolite" inflama o cóloninteiro.

"Doença de Crohn" também chamada "enterite regional" é umadoença auto-imune crônica que pode afetar qualquer parte do tratogastrointestinal, mas ocorre mais comumente no íleo (a área onde o intestinodelgado e grosso se encontram). Doença de Crohn, em contraste a coliteulcerativa, é caracterizada pela inflamação crônica e estende-se através de todasas camadas da parede intestinal e envolve o mesentério como também Iinfonodosregionais. Se o intestino delgado ou cólon está ou não envolvido, o processopatológico básico é o mesmo.

Colite Ulcarativa e doença de Crohn podem ser distinguidas entre siclinicamente, endoscopicamente, patologicamente e sorologicamente em mais de90% dos casos; as diferenças são consideradas IBD indeterminadas (Harrison'sPrincipies of Internai medicine, 12a edição, p. 1271 (1991)).

IBD "moderada-severa" é IBD onde os sinais ou sinomas da doença nosujeito são maiores que a branda. Tais sujeitos podem se identificados por umgastroenterologista especialista. O sujeito com IBD moderada-severa pode ter sidotratado com corticoesteróides orais para UC dentro de 2 anos antes da seleção, e/outratamento intensivo pode ter sido igual ou maior do que uma dose equivalente deprednisona de 20 mg/dia por pelo menos 2 semanas de duração. Tais sujeitospodem ser refratários a esteróides e/ou dependentes de esteróides. Um sujeito comUC moderada-severa pode ser selecionado baseado na pontuação DAI, por exemplo,onde uma pontuação DAI de sangramento retal >6, >2, e/ou pontuação desigmoidoscopia flexível >2 indica que o sujeito tem UC moderada-severa.

Alternativamente, ou adicionalmente, o critério para avaliação da doença branda,moderada e severa como em Truelove e Witts Br Med J. 2:1041-1048 (1955) (verTabela 1 abaixo) pode ser usado para identificar tais sujeitos. Sujeitos com colitefulminante ou tóxica usualmente possuem mais que 10 movimentos intestinais pordia, sangramento contínuo, distenção abdominal e sensibilidade, e evidênciaradiológica de edema e possivelmente dilatação do intestino.

Tabela 1

Critério de Trulove e Witts para Avaliação da Atividade da Doença emColite Ulcerativa

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Sujeitos com menos que 6 dos critérios acima para atividade severa possuem atividade moderada da doença.

Um "sujeito" na presente invenção é um sujeito humano.

Um sujeito com IBD "ativa" é o que sente pelo menos um sintoma deIBD no momento da seleção ou tratamento inicial

IBD "refratária a esteróide" é IBD com progresso ou piora, mesmoque o esteróide esteja sendo administrado ao sujeito com IBD.Um sujeito com IBD "dependente de esteróide" é dependente do usode esteróide e pode não diminuir ou retirar a administração de esteróides devidoaos sintomas persistentes.

Um "sintoma" de IBD é um fenômeno mórbido ou afastamento donormal na estrutura, função ou sensação sentida pelo sujeito e indicativa de IBD.

A "mucosa" é o tecido úmido que limita os ógãos específicos e ascavidades do corpo em todo o corpo, incluindo o trato intestinal. Glândulas aolongo da mucosa secretam muco (um fluido espesso).

"Cólon" é a divisão do intestino grosso que se estende desde o cecoaté o reto.

Mucosa "colônica" é a mucosa que limita o cólon.

"Placas de Peyer" são agregados de folículos linfáticos encontradospor todo o corpo, especialmente no revestimento interno da mucosa do tratodigestivo e respiratório.

Por "remissão da doença" entende-se substancialmente a nãoevidência dos sintomas da doença. A remissão pode ser alcançada dentro de umperíodo de tempo, tal como dentro de ou em aproximadamente 8 semanas, do iníciodo tratamento com a dose inicial ou a partir desta, do antagonista ou anticorpo. Aremissão pode também ser mantida por um período de tempo, tal como 4 semanasou 48 semanas. A remissão da doença pode ser definida como uma pontuação desigmoidoscopia de 0 a 1 e/ou pontuação de sangramento retal de 0.

Uma "sigmoidosscopia" é uma inspeção, através de um endoscópio,do interior do cólon sigmóide.

Uma "pontuação de sigmoidoscopia" refere-se a uma pontuaçãodeterminada por um clínico baseada em uma sigmoscopia. O sistema depontuação de sigmoidoscopia preferida é como segue:

0 = normal ou doença inativa

1 = doença branda (eritema, padrão vascular diminuído, fragilidade branda)2 = doença moderada (eritema acentuado, padrão vascular ausente, fragilidade,erosões)

3 = doença severa (sangramento espontâneo, ulceração)

"Sangramento retal" refere-se a qualquer sangramento no reto ou apartir deste.

Uma "pontuação de sangramento retal" é a pontuação determinadapara qualquer extensão de sangramento retal. Uma pontuação de sangramentodiária representa o sangramento mais forte do dia. O sistema de pontuação desangramento retal preferido é:

0 = nenhum sangue visto

1 = linhas de sangue com fezes menos do que a metade do tempo

2 = sangue evidente com fezes na maior parte do tempo

3 = passagem de sangue sozinho.

Por "resposta clínica" entende-se uma melhora nos sintomas dadoença. A resposta clínica pode ser alcançada dentro de um certo período detempo, por exemplo, dentro de ou em aproximadamente 8 semanas do início dotratamento com a dose inicial ou a partir desta, do antagonista ou anticorpo. Aresposta clínica pode também ser mantida por um período de tempo, tal como 24semanas ou 48 semanas. A resposta clínica pode ser avaliada em termos de umaredução na pontuação do índice de atividade da doença (DAI), por exemplo, apontuação DAI pode ser reduzida para mais ou igual a 3 pontos.

Um sistema de pontuação do "índice de atividade da doença (DAI)" éum método para avaliar quantitativamente a atividade de UC. O sistema depontuação DAI preferido está mostrado na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2

Sistema de Pontuação DAI para Avaliação da Atividade de UC

Freqüência de fezes (cada sujeito serve como seu próprio controle paraestabelecer o grau de anormalidade da freqüência de fezes)0 = número normal de fezes para este sujeito

1 = 1-2 fezes mais do que o normal

2 = 3-4 fezes mais do que o normal

3 = 5 ou mais fezes mais do que o normal

Sangramento retal (a pontuação de sangramento diária representa osangramento mais forte do dia)

0 = nenhum sangue visto

1 = linhas de sangue com fezes menos do que a metade do tempo

2 = sangue evidente com fezes na maior parte do tempo

3 = passagem de sangue sozinho.

Constatações de protosigmoidoscopia flexível

0 = normal ou doença inativa

1 = doença branda (eritema, padrão vascular diminuído)

2 = doença moderada (eritema acentuado, padrão vascular ausente, fragilidade,erosões)

3 = doença severa (sangramento espontâneo, ulceração)

Avaliação global do médico (reconhece os 3 outros critérios, registro diário dosujeito de desconforto abdominal e senso geral de bem estar, e outrasobservações, tais como constatações físicas e o estado de desempenho dosujeito)

0 = normal

1 = doença branda

2 = doença moderada

3 = doença severa

Um "auto-anticorpo" é um anticorpo produzido por um sujeito edirigido contra um antígeno do próprio sujeito.

Uma "tropomiosina" é uma proteína fibrosa extraída do músculo.Existem 8 isoformas de tropomiosina humana conhecidas. Em células epiteliaisdo cólon, a isoforma 5 de tropomiosina humana (hTM5) é a isoformapredominante, com menores quantidades da isoforma 4 (hTM4).

Por "anticorpo anti-hTM5" entende-se um anticorpo produzido por umsujeito e dirigido contra esta hTM5 do próprio sujeito.

"Anticorpo citoplasmático antineutrófilo perinuclear (p-ANCA)" refere-se a um auto-anticorpo produzido por um sujeito e dirigido contra componentesleucócitos neutrófilos deste sujeito. "Perinuclear" refere-se ao padrão decoloração de tais auto-anticorpos.

Por nível de auto-anticorpo "atípico" entende-se um nível de tal auto-anticorpo que excede o nível normal. Tal nível de auto-anticorpo normal ou típicopode ser o nível encontrado em tecido colônico ou mucosa de um sujeito normal,ou sujeito que não está sofrendo de IBD.

Uma "célula B" é um linfócito que amadurece na medula óssea, einclui uma célula B virgem, célula B de memória, ou células B efetoras (células doplasma). A célula B na presente invenção pode ser uma célula B normal ou não-maligna.

Um "marcador de superfície de célula B" ou "antígeno de superfíciede célula B" na presente invenção é um antígeno expressado na superfície deuma célula B que pode ser atingido com um antagnista ou anticorpo que se liga aeste. Marcadores de superfície de célula B exemplares incluem os marcadores desuperfície de leucócitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37,CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a,CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86 (para descrições, verThe LeukocyteAntigen Facts Book, 2a Edição. 1997, ed. Barclay et ai AcademicPress, Harcourt Brace & Co., Nova York). Outros marcadores de surpefície decélula B incluem RP105, FcRH2, célula B CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5,FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHI, IRTA2, ATWD578, FcRH3,IRTA1, FcRH6, BCMA, e 239287. O marcador de surpefície de célula B deinteresse particular é preferencialmente expressado nas células B comparado aoutros tecidos de célula não B de um sujeito e pode ser expressado em ambos,precursores de células B e células B maduras.

O antígeno "CD20", ou "CD20" é uma fosfoproteína não-glicosiladade aproximadamente 35 kDa, encontrada na superfície de mais de 90% dascélulas B do sangue periférico ou órgãos linfóides. CD20 está presente emambas as células B normais assim como células B malignas, mas não éexpressado em células tronco. Outros nomes para CD20 na literatura incluem"antígeno restrito de linfócito B" e "Bp35". O antígeno CD20 está descrito em Clarketal. Proc. Nati Acad. Sei. (USA) 82:1766 (1985), por exemplo.

Um "antagonista de marcador de superfície de célula B" é umamolécula que sob ligação a um marcador de superfície de célula B nas células B,destroem ou depletam células B em um sujeito e/ou interferem em uma ou maisfunções da célula B, por exemplo, pela redução ou prevenção de uma respostahumoral produzida pela célula Β. O antagonista preferivelmente é capaz dedepletar células B (isto é, reduzir níveis de célula B circulante) em um sujeitotratado com este. Tal depleção pode ser alcançada via vários mecanismos talcomo citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/oucitotoxicidade dependente de complemento (CDC), inibição de proliferação decélula B e/ou indução de morte de célula B (por exemplo, via apoptose).Antagonistas incluídos dentro do escopo da presente invenção incluemanticorpos, peptídeos sintéticos ou peptídeos de seqüência nativa,imunoadesinas, e antagonistas de molécula pequena que se ligam a um marcadorde superfície de célula B tal como CD20, opcionalmente conjugado ou fundido aum agente citotóxico. O antagonista preferido compreende um anticorpo.

Um "antagonista do anticorpo CD20" na presente invenção é umanticorpo que sob ligação ao CD20 em células B, destroem ou depletam células Bem um sujeito e/ou interferem em uma ou mais funções da célula B, por exemplo,por redução ou prevenção de uma resposta humoral produzida pela célula Β. Oanticorpo antagonista preferivelmente é capaz de depletar células B (isto é,reduzir níveis de célula B circulante) em um sujeito tratado com este. Taldepleção pode ser alcançada via vários mecanismos tal como citotoxidademediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidadedependente de complemento (CDC), inibição de proliferação de célula B e/ouindução de morte de célula B (por exemplo, via apoptose).

O termo "anticorpo" na presente invenção é usado no senso maisamplo e especificamente abrange anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais,anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados porpelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo, contanto que elesexibam a atividade biológica desejada.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de umanticorpo intacto, preferivelmente que compreende a região de ligação deantígeno deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab,Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos, anticorpos lineares; moléculas deanticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentosde anticorpo.

Um anticorpo intacto na presente invenção é aquele quecompreende duas regiões de ligação de antígeno, e uma região Fc.Preferivelmente, o anticorpo intacto possui uma região Fc funcional.

Exemplos de anticorpos CD20 incluem: "C2B8" que é agora chamado"rituximab" ("RITUXAN®") (patente US 5.736.137); o anticorpo murino 2B8 marcado comítrio-[90] designado Ύ2Β8" ou "Ibritumomab Tiuxetan" ZEVALIN® comercialmentedisponível pela Idec Pharmaceuticals, Inc. (patente US 5.736.137; 2B8 depositada comATCC sob acesso no HB11388 em 22 de junho de 1993); lgG2a "B1" murino, tambémchamado "Tositumomab", opcionalmente marado com 131I para gerar o "131I-BI" ouanticorpo "iodo I131 tositumomab" (BEXXAR™) comercialmente disponível pela Corixa(ver também, patente US 5.595.721); anticorpo monoclonal murino "1F5" (Press etal.Blood 69(2):584-591 (1987) e variantes destes incluindo "estrutura embutida" ou 1F5humanizado (documento WO 2003/002607, Leung, ATCC depósito HB-96450);anticorpo 2H7 murino e 2H7 quimérico (patente US 5.677.180); um 2H7 humanizado(documento WO 2004/056312 (Lowman et ai.)', e como apresentado abaixo), 2F2(HuMAX-CD20), um anticorpo humano completo de alta afinidade (Genmab, Denmark;ver, por exemplo, Glennie e van de Winkel, Drug Discovery Today8:503-510 (2003) eCragg etal., Blood 101:1045-1052 (2003); documento WO 2004/035607; patente US2004/0167319); os anticorpos monoclonais humanos apresentados no documento WO2004/035607 e patente US 2004/0167319 (Teeling etal.)] os anticorpos que possuemcomplexos de cadeias de açúcar ligados a N-glicosídeo ligados à região Fcdescritos napatente US 2004/0093621 (Shitara et al.)] anticorpos monoclonais e fragmentos deligação de antígeno a CD20 (documento WO 2005/000901, Tedder et al.) tais comoHB20-3, HB20-4, HB20-25 e MB20-11; moléculas de ligação CD20 tais como as sériesAME de anticorpos, por exemplo, anticorpos AME 33 como apresentados nodocumento WO 2004/103404 e patente US 2005/0025764 (Watkins et al., EliLilly/Applied Molecular Evolution, AME); moléculas de ligação CD20 tais como aquelasdescritas na patente US 2005/0025764 (Watkins et a/.); anticorpo A20 ou variantesdestes tal como anticorpo A20 quimérico ou humanizado (cA20, hA20,respectivamente) (patente US 2003/0219433, Immunomedics); anticorpos de ligaçãoCD20, incluindo Leu-16 com epitopo depletado, 1H4, ou 2B8, opcionalmente conjugadocom IL-2, como na patente US 2005/0069545A1 e documento WO 2005/16969 (Carr etal.)] anticorpo biespecífico que se liga a CD22 e CD20, por exemplo, hl_L2xhA20(W02005/14618, Chang etal.)] anticorpos monoclonais L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 ouNU-B2 disponíveis por meio da International Leukocyte Typing Workshop (Valentine etal., Em: Leukocyte TypingIll(McMichael, Ed., pág. 440, Oxford University Press (1987));1H4 (Haisma etal. Blood92:184 (1998). Os anticorpos CD20 preferidos na presenteinvenção são anticorpos CD20 quiméricos, humanizados ou humanos, maispreferivelmente rituximab, 2H7 humanizado, 2F2 (Hu-Max-CD20) anticorpo CD20humano (Genmab), e anticorpo A20 humanizado (Immunomedics).

Os termos "rituximab" ou "RITUXAN®" na presente invenção referem-seao anticorpo monoclonal murino/humano quimérico geneticamente engenheiradodirecionado contra o antígeno CD20 e designado "C2B8" na patente US 5.736.137,incluindo fragmentos destes que retêm a capacidade de se ligar a CD20.

Puramente para os propósitos da presente invenção e a menos queindicado de outra forma, um anticorpo "2h7 humanizado" é um variantehumanizado do anticorpo 2H7 murino, em que o anticorpo é efetivo para reduzircélulas B circulantes in vivo.

Em uma realização, o anticorpo humanizado compreende um, dois,três, quatro, cinco ou seis das seguintes seqüências de CDR:

CDR L1 seqüência RASSSVSYXH em que X é M ou L (SEQ ID NO. 21), porexemplo, SEQ ID NO. 4 (Fig. 1A),

CDR L2 seqüência de SEQ ID NO:5 (Fig. 1A),

CDR L3 seqüência QQWXFNPPT em que X é S ou A (SEQ ID NO. 22), porexemplo, SEQ ID NO:6 (Fig. 1A),

CDR H1 seqüência de SEQ ID N0:10 (Fig. 1B),

CDR H2 seqüência de AIYPGNGXTSYNQKFKG em que X é D ou A (SEQ ID NO.23), por exemplo, SEQ ID NO. 11 (Fig. 1B), e

CDR H3 seqüência de WYYSXXYWYFDV em que X na posição 6 é Ν, A, Y, W ou D,e o X na posição 7 é S ou R (SEQ ID NO. 24), por exemplo SEQ ID NO. 12 (Fig. 1B).

As seqüências CDR acima estão geralmente presentes nasseqüências de estrutura variável leve e variável pesada humanas, tais comosubstancialmente os resíduos de FR consenso humano do subgrupo I kappacadeia leve humana (Vl6I), e substancialmente os resíduos de FR consensohumano do subgrupo Ill cadeia pesada humana (VHIII). Ver também documentoWO 2004/056312 (Lowman et al.).A região pesada variável pode estar ligada a uma região constanteda cadeia IgG humana, em que a região pode ser, por exemplo, IgGI ou lgG3,incluindo seqüência nativa e regiões constantes variantes.

Em uma realização preferida, tal anticorpo compreende a seqüênciade domínio variável pesada da SEQ ID NO:8 (v16, como mostrado na Fig. 1B),opcionalmente também compreende a seqüência de domínio variável leve daSEQ ID NO:2 (v16, como mostrado na Fig. 1A), que opcionalmente compreendeuma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 56,100, e/ou 100a, porexemplo, D56A, N100A ou N100Y, e/ou SIOOaR no domínio variável pesado euma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 32 e/ou 92, por exemplo,M32L e/ou S92A, no domínio variável leve. Preferivelmente, o anticorpo é umanticorpo intacto que compreende as seqüências de aminoácidos de cadeia leveda SEQ ID NOs. 13 ou 15, e seqüências de aminoácidos de cadeia pesada daSEQ ID NO. 14, 16, 17 ou 20.

Um anticorpo 2H7 humanizado preferido é ocrelizumab (Genentech).

O anticorpo na presente invenção pode, além disso, compreenderpelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc que melhora atividadede ADCC, tal como aquele em que as substituições de aminoácido estão nasposições 298, 333, e 334, preferivelmente S298A, E333A, e K334A, usando-senumeração Eu de resíduos de cadeia pesada. Ver também patente US6.737.056B1, Presta.

Qualquer um destes anticorpos pode compreender pelo menos umasubstituição na região Fc que melhora ligação de FcRn ou meia vida do soro, porexemplo, uma substituição na posição 434 da cadeia pesada, tal como N434W.Ver também patente US 6.737.056B1, Presta.

Qualquer um destes anticorpos podem, além disso, compreenderpelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc que aumenta atividadede CDC, por exemplo, que compreende pelo menos uma substituição na posição326, preferivelmente K326A ou K326W. Ver também patente US 6.528.624B1(Idusogie et a/.).

Alguns variantes 2H7 humanizados são aqueles que compreendemo domínio variável leve da SEQ ID NO:2 e o domínio variável pesado da SEQ IDNO:8, incluindo aqueles com ou sem substituições em uma região Fc (sepresente), e aqueles que compreendem um domínio variável pesado comalteração N100A; ou D56A e N100A; ou D56A, N10OY1 e S10OaR; na SEQ IDNO:8 e um domínio variável leve com alteração M32L; ou S92A; ou M32L e S92A;na SEQ ID NO:2.

M34 no domínio variável pesado de 2H7v16 foi identificado comouma fonte potencial de estabilidade do anticorpo e é outro candidato potencialpara substituição.

Em um resumo de várias realizações preferidas da invenção, aregião variável de variantes baseada no 2H7.v16 compreende as seqüências deaminoácidos de v16 exceto nas posições de substituições de aminoácidos queestão indicadas na Tabela 3 abaixo. A menos que indicado de outra forma, osvariantes 2H7 terão a mesma cadeia leve como aquela de v16.

Tabela 3

Variantes De Anticorpo 2H7 Humanizado Exemplares

<table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>

Um 2Η7 humanizado preferido compreende seqüência de domíniovariável leve 2H7.v16:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:2);

e seqüência de domínio variável pesada 2H7.v16:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:8).

Onde o anticorpo 2H7v16 humanizado é um anticorpo intacto, elepode compreender a seqüência de aminoácido de cadeia leve:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO:13);e a seqüência de aminoácido de cadeia pesada da SEQ ID NO: 14 ou:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:17).

Outro anticorpo 2H7 humanizado preferido compreende seqüênciade domínio variável leve 2H7.v511:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO: 18)

e seqüência de domínio variável pesada 2H7.v511:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 19).

Onde o anticorpo 2H7.v511 humanizado é um anticorpo intacto, elepode compreender a seqüência de aminoácido de cadeia leve:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 15)e a seqüência de aminoácido de cadeia pesada da SEQ ID NO: 16 ou:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO. 20).

Anticorpos "inibitórios do crescimento" são aqueles que previnem oureduzem proliferação de uma célula que expressa um antígeno ao qual oanticorpo se liga. Por exemplo, o anticorpo pode prevenir ou reduzir proliferaçãode células B in vitro e/ou in vivo.

Anticorpos que "induzem apoptose" são aqueles que induzem mortecelular, por exemplo, de uma célula B, como determinado pelos testes padrão deapoptose, tal como ligação de anexina V, fragmentação do DNA, dilatação doretículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas namembrana (chamados corpos apoptóticos).

"Anticorpos nativos" são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas deaproximadamente 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas (L) eduas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesadapor uma ligação bissulfeto covalente, enquanto o número de ligações bissulfeto variaentre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeiapesada e leve também tem regularmente pontes bissulfeto espaçadas entre cadeias.Cada cadeia pesada tem em uma terminação um domínio variável (Vh) seguida por umnúmero de domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em umaterminação (Vl) e um domínio constante na sua outra terminação, o domínio constanteda cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e odomínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada.Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formem uma interface entre osdomínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada.

O termo "variável" refere-se ao fato que certas porções do domíniovariável diferenciam-se extensivamente na seqüência entre anticorpos e sãousadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para seuantígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformementepor todos os domínios variáveis dos anticorpos. Ela está concentrada em trêssegmentos chamados regiões hipervariáveis ambos nos domínios variáveis decadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dedomínios variáveis são chamadas de regiões de estrutura (FRs). Os domíniosvariáveis das cadeias leves e pesadas nativas, cada um compreende quatro FRsadotando amplamente uma configuração β-folha, conectada por três regiõeshipervariáveis, na qual formam Ioops que se conectam, e em alguns casosformam parte da estrutura β-folha. As regiões hipervariáveis em cada cadeia sãomantidas juntas em íntima proximidade pelas FRs e, com as regiõeshipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação doantígeno dos anticorpos, (ver Kabat et ai, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão diretamenteenvolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funçõesefetoras, tal como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependentede anticorpo (ADCC).

Digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos deligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com umúnico sítio de ligação de antígeno, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome refletesua habilidade para cristalizar de imediato. Tratamento por pepsina rende umfragmento F(ab')2 que possui dois sítios de ligação de antígeno e é ainda capaz deinterligar-se ao antígeno.

"Fv" é um fragmento mínimo de anticorpo que contém umreconhecimento de antígeno completo e sítio de ligação de antígeno. Esta regiãoconsiste de um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeialeve em associação não covalente estreita. É nesta configuração que as trêsregiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio deligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivemente, as seisregiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antígeno aoanticorpo. No entanto, até um único domínio variável (ou metade de uma Fv quecompreende somente três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno)possui a habilidade de reconhecer e ligar-se a um antígeno, embora comafinidade mais baixa que o sítio de ligação inteiro.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab'diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos na terminaçãocarboxila de um domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínasda região de dobradiça do anticorpo. Fab1-SH é a designação na presenteinvenção para Fab' na qual o(s) resíduo(s) cisteína(s) dos domínios constantesproduz pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos do anticorpo F(ab')2originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuemdobradiças cisteína entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos deanticorpo são também conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquerespécie de vertebrado podem ser designadas para um ou dois tipos claramentedistintos, chamados kappa (κ) e Iambda (λ), baseados nas seqüências deaminoácidos de seus domínios constantes.

Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constante desuas "cadeias pesadas", (se presentes) os anticorpos podem ser designados paradiferentes classes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA,IgD, IgE1 IgG1 e IgM, e várias destas podem também ser divididas em subclasses(isotipos), por exemplo, IgGI1 lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e lgA2. Os domíniosconstantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes deanticorpos são chamados de a, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As subunidades deestruturas e configurações tridimensionais de diferentes classes deimunoglobulinas são bem conhecidas.

A menos que indicado de outra forma, na presente invenção anumeração dos resíduos nos domínios constantes de uma cadeia pesada deimunoglobulina é aquela do indicador EU como em Kabat et ai, Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutesof Health, Bethesda, EU. (1991)), expressamente incorporada à presenteinvenção como referência. O "indicador EU como em Kabat" refere-se ànumeração de resíduos do anticorpo IgGI EU humano.

O termo "região Fc" na presente invenção é usado para definir umaregião C-terminal de uma imunoglobulina de cadeia pesada, incluindo seqüêncianativa de regiões Fc e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc deuma imunoglobulina de cadeia pesada possam variar, a região Fc de cadeiapesada IgG humana é usualmente definida por se estender de um resíduo deaminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, até a terminação carboxila deste.A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) daregião Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do anticorpo oupela recombinação do ácido nucléico engenheirado que codifica uma cadeiapesada do anticorpo. Consequentemente, uma composição de anticorposintactos pode compreender populações de anticorpo com todos os resíduos K447removidos, populações de anticorpo sem resíduos K447 removidos, e populaçõesde anticorpo que possuem uma mistura de anticorpos com e sem resíduos K447.

A "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma regiãoFc de seqüência nativa. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação C1q;citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor Fe; citotoxicidademediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; baixa regulaçãode receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc.

Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada comum domínio de ligação (por exemplo, um anticorpo de domínio variável) e podemser avaliadas usando-se várias análises como divulgado na presente invenção,por exemplo.

Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüência deaminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de uma região Fcencontrada na natureza. Regiões Fc humanas de seqüência incluem uma regiãoFc IgGI humana de seqüência nativa (alótipos A e não A); região Fc lgG2humana de seqüência nativa; região Fc lgG3 humana de seqüência nativa; regiãoFc lgG4 humana de seqüência nativa assim como naturalmente variantes dasacima que ocorrem naturalmente.

Uma "região Fc variante" compreende uma seqüência de aminoácidoque difere daquela região Fc de seqüência nativa em virtude de pelo menos umamodificação de aminoácido, preferivelmente uma ou mais substituições deaminoácido. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos umasubstituição de aminoácido comparada a uma região Fc de seqüência nativa ou àregião Fede um polipeptídeo parental, por exemplo, de aproximadamente uma aaproximadamente dez substituições de aminoácidos, e preferivelmente deaproximadamente uma a aproximadamente cinco substituições de aminoácidosem uma região Fc de seqüência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental.

A região Fc variante na presente invenção irá preferivelmente possuir pelo menosaproximadamente 80% de homologia com uma região Fc de seqüência nativae/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, e mais preferivelmente pelomenos aproximadamente 90% de homologia com esta, mais preferivelmente pelomenos aproximadamente 95% de homologia com esta.

"Citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo" e"ADCC" referem-se à reação mediada por célula na qual células citotóxicas nãoespecíficas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células NaturalKiller (NK)1 neutrófilos, e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado na célulaatingida e subseqüentemente causam Iise da célula atingida. As células primáriaspara mediação de ADCC, células NK1 expressam somente FcyRIII, enquanto quemonócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão FcR em célulashematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-492 (1991). Para avaliar atividade de ADCC de umamolécula de interesse, um ensaio in vitro de ADCC, tal como descrito na patenteUS 5.500.362 ou 5.821.337 pode ser apresentado. Células efetoras úteis paratais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ecélulas Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade ADCCda molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modeloanimal tal como divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um oumais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferencialmente, as célulasexpressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplos deleucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares desangue periférico (PBMC), células natural killer(NK), monócitos, células Tcitotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas.

Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são usados para descrever umreceptor que se liga a região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcRhumano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se ligaa um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui subclasses dos receptores FcyRI,FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas ligadasdestes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor deativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm seqüências similares deaminoácidos que diferem primeiramente nos domínios citoplasmáticos destes.Receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação de imuno-receptorbaseado em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. Receptor de ativaçãoFcyRIIA contém um motivo de inibição de imuno-receptor baseado em tirosina(ITIM) em seu domínio citoplasmático. (ver Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs foram revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol9:457-492 (1991); Capei etal., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et ai,J. Lab. Clin. Med. 126:330-341 (1995). Outros FcRs1 incluindo aqueles a seremidentificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" na presente invenção.

O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn1 que é responsável por transferiras IgGs maternas para os fetos e homeostase de imunoglobulina (Guyer et ai, J.Immunol. 117:587 (1976) e Kim etal., J. Immunol. 24:249 (1994)).

"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se àhabilidade de uma molécula Iisar um alvo na presença de complemento. A via deativação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente dosistema complemento (C1q) para uma molécula complexa (por exemplo, umanticorpo) com um antígeno cognato. Para avaliar ativação de complemento, umteste CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et ai, J. Immunol.Methods 202:163 (1996), pode ser realizado.

Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv"compreendem os domínios Vh e Vl do anticorpo, em que estes domínios estãopresentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferivelmente, o polipeptídeoFv, além disso, compreende um Iigante polipeptídeo entre os domínios Vh e Vlque permite o scFv formar a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Parauma revisão de scFv ver Plückthun em The Pharmacology of MonoclonalAntibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag1 Nova York,páginas 269-315(1994).

O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo pequenocom dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem umdomínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável decadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh-Vl). Pelo uso de umligante que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios namesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínioscomplementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno.Diacorpos estão descritos mais inteiramente em, por exemplo, patente EP404.097; documento WO 93/11161; e Hollingerefa/., Proc. Nati Acad. Sei. USA,90:6444-6448 (1993).

O termo "anticorpo monoclonal" como usado na presente invençãorefere-se a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmentehomogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população sãoidênticos e/ou ligam-se ao(s) mesmo(s) epitopo(s), exceto por possíveis variantesque podem aparecer durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantesgeralmente estando presentes em menores quantidades. Tal anticorpomonoclonal tipicamente inclui um anticorpo que compreende uma seqüência depolipeptídeo que se liga a um alvo, em que a seqüência de polipeptídeo de ligaçãoalvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma seqüência depolipeptídeo de ligação alvo única de uma pluralidade de seqüências depoplipepídeos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de umúnico clone de uma pluralidade de clones, tais como um grupo de clones dehibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinantes. Deve ser entendidoque a seqüência de ligação alvo selecionada pode ser também alterada, porexemplo, para melhorar a afinidade para este alvo, para humanizar a seqüênciade ligação alvo, para melhorar sua produção na cultura celular, para reduzir suaimunogenicidade in vivo, para criar anticorpo multiespecífico, etc., e que umanticorpo que compreende a seqüência de ligação alvo alterada é também umanticorpo monoclonal desta invenção. Em contraste com preparações deanticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contradiferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal de umapreparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante noantígeno. Além disso, para suas especificidades, as preparações de anticorposmonoclonais são vantajosas, pois elas são tipicamente descontaminadas deoutras imunoglobulinas. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpocomo sendo obtido de uma população substancialmente homogênea deanticorpos, e não sendo construído como produção requerida do anticorpo porqualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para seremusados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por umavariedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (porexemplo., Kohler et ai, Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: ALaboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988);Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681,(Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinantes (ver, por exemplo.,patente US 4.816.567), tecnologias de exposição por fago (ver, por exemplo,Clackson et ai, Nature, 352:624-628 (1991); Marks et ai, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et ai, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et ai,J.Mo/.B/o/. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al. J. Immunol. /Wetfjocte284(1-2):119-132(2004), e tecnologias para produção de anticorpos humanos e similares ahumanos em animais que possuem partes ou todos os Iocide imunoglobulina ougenes que codificam seqüências de imunoglobulina humana (ver, por exemplo,documento WO 1998/24893; documento WO 1996/34096; documento WO1996/33735; documento WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei.EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits et ai, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemannet ai, Yearin Immuno., 7:33 (1993); patentes US 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669(todas da GenPharm), 5.545.807, documento WO 1997/17852, patentes US5.545.807, 5.545.806, 5.569.825,5.625.126; 5.633.425 e 5.661.016; Marks et ai,Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et ai, Nature, 368: 856-859 (1994);Lonberg etal., Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et ai, NatureBiotechnoIogy,14: 845-851 (1996); Neuberger1 Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); e Lonberge Huszar, lntern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

Os anticorpos monoclonais da presente invenção especificamenteincluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), nos quais uma porção dacadeia leve e/ou pesada é idêntica a, ou homóloga às seqüênciascorrespondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica oupertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto orestante da(s) cadeia(s) é idêntico a, ou homólogo às seqüências correspondentesem anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencendo a uma outraclasse ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos,contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567;Morrison et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticorposquiméricos de interesse na presente invenção incluem anticorpos "primatizados"que compreendem seqüências de ligação de antígeno de domínio variávelderivadas de um primata não humano (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, talcomo babuíno, rhesus ou macaco cynomolgus) e seqüências de região constantehumana (patente US 5.693.780).

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo,murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada deimunoglobulina não humana. Na maior parte, anticorpos humanizados sãoimunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma regiãohipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma regiãohipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal comocamundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a desejadaespecificidade, afinidade e capacidade. Em alguns exemplos, resíduos da regiãode estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduoscorrespondentes não humanos. Além disto, anticorpos humanizados podemcompreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou noanticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disto, refinar odesempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreendersubstancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domíniosvariáveis, em que todos ou substancialmente todos os Ioops hipervariáveiscorrespondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ousubstancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência de imunoglobulinahumana, exceto para substituições FR como apontado acima. O anticorpohumanizado opcionalmente irá também compreender pelo menos uma porção deuma região constante da imunoglobulina, tipicamente aquela de umaimunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver Jones et ai, Nature321:522-525(1986); Riechmann etai., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr.Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

O termo "região hipervariável" quando usado na presente invençãorefere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis porligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidode uma "região determinada por complementaridade" ou "CDR" (por exemplo,resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada;Kabat etai, Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest, 5a Ed. Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aquelesresíduos de um uIoop hipervariável" (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2)e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101(H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Região de estrutura" ou resíduos "FR" são aqueles resíduos dedomínio variável, exceto os resíduos de região hipervariável como definido napresente invenção.Um "anticorpo nu" é um anticorpo (como definido na presenteinvenção) que não é comjugado à uma molécula heteróloga, tal como umcomponente citotóxico ou marca radioativa.

Um anticorpo intacto na presente invenção é aquele quecompreende duas regiões de ligação de antígeno, e uma região Fc.Preferivelmente, o anticorpo intacto possui uma região Fc funcional.

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ourecuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentescontaminantes de seu meio natural são materiais que poderiam interferir nodiagnóstico ou usos terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas,hormônios e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em realizaçõespreferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais que 95% por peso deanticorpo como determinado pelo método Lowry, e mais preferivelmente mais que99% por peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos deN-terminal ou seqüência de aminoácido interna pelo uso de um sequenciador decopo giratório, ou (3) para homogeneidade por FAGO-SDS sob condições deredução ou não redução utilizando-se Coomassie blue ou, preferivelmente, silverstain. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes,desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo nãoesteja presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparadopor pelo menos uma etapa de purificação.

Um anticorpo de "afinidade madura" é aquele com uma ou maisalterações em uma ou mais regiões hipervariáveis deste que resultam em umaprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno, comparado com umanticorpo parental que não possui aquela(s) alteração(ões). Anticorpos deafinidade madura preferidos terão afinidades nanomolar ou até afinidadespicomolar para o antígeno alvo. Anticorpos de afinidade madura são produzidospor processos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783(1992) descreve a maturação da afinidade por mistura dos domínios VH e VL.Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita por: Barbas etal. Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J.Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins etal, J. Moi Biol. 226:889-896 (1992).

"Tratamento" de um sujeito na presente invenção refere-se a ambos,tratamento terapêutico e profilático ou medidas preventivas. Aqueles comnecessidade de tratamento incluem aqueles já com IBD assim como aqueles emque IBD será prevenida. Portanto, o paciente a ser tratado na presente invençãopode ter sido diagnosticado como tendo IBD ou pode estar predisposto oususcetível a IBD. Os termos "tratar", "tratamento" e "terapia" como usados napresente invenção referem-se à terapia preventiva (tal como, profilática),tratamento paliativo e tratamento curativo.

O termo "agente imunossupressivo" como usado na presente invençãopara terapia adjunta refere-se a substâncias que agem para suprimir ou mascarar osistema imune de do sujeito sendo tratado na presente invenção. Estes agentesincluiriam substâncias que suprimem a produção de citocinas, regulam para baixo ousuprimem a auto-expressão de antígeno, ou mascaram os antígenos MHC.

Exemplos de tais agentes incluem esteróides tais como glucocorticosteróides, porexemplo, prednisona, metilprednisolona, e dexametasona; 2-amino-6-aril-5-pirimidinas substituídas (ver patente US 4.665.077); drogas anti-inflamatórias nãoesteroidais (NSAIDs), ganciclovir, tacrolimus, glucocorticóides tais como cortisol oualdosterona, agentes anti-inflamatórios tais como um inibidor ciclooxigenase, uminibidor 5-lipoxigenase, ou um antagonista do receptor leucotrieno, antagonistas depurina tal como azatioprina ou micofenolato mofetil (MMF), agentes alquilantes taiscomo ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsona, glutaraldeído (que mascara osantígenos MHC, como descritos na patente US 4.120.649); anticorpos anti-idiotípicospara antígenos MHC e fragmentos MHC; ciclosporina; 6 mercaptopurina, esteróidestais como corticoesteróides ou glicocorticoesteróides ou análogos de glicocorticóides,tais como, predsona, metilprednisolona, incluindo succinato de sódio de prednisolonaSOLU-MEDROL®, e dexametasona, inibidores dihidrofolato redutase tal comometotrexato (oral ou subcutâneo), agentes anti-malária tais como cloroquina ehidroxicloroquina, sulfasalazina, leuflunomida, citocina ou anticorpos do receptor decitocina ou antagonistas incluindo anticorpos anti-interferon alfa, beta ou gama,anticorpos TNF-alfa do fator de necrose anti-tumor (infliximab (REMICADE®) ouadalimumab), imunoadesina anti-TNF-alfa (etanercept), anticorpos anti-TNF-beta,anticorpos anti-leucina-2 (IL-2) e anticorpos receptores anti-IL-2, e anticorposreceptors anti-interleucina-6 (IL-6) e antagonistas; anticorpos anti-LFA-1, incluindoanticorpos anti-CD11a e anti-CD18; anticorpos anti-L3T4; globulina heteróloga anti-linfócito; anticorpos pan-T, preferivelmente anticorpos anti-CD3 ou anti-CD4/CD4a;peptideo solúvel contendo um domínio de ligação LFA-3 (documento WO 90/08187publicado em 26 de julho de 1990); estreptoquinase; que transforma o fator decrescimento beta (TGF-beta); estreptodornase; RNA ou DNA do hospedeiro; FK506;RS-61443; clorambucil; desoxiespergualina; rapamicina; receptor de célula T (Cohenet al., patente US 5.114.721); fragmentos de receptor de célula T (Offner et al.,Science, 251:430-432 (1991); documento WO 90/11294; laneway, Nature, 341:482(1989); e documento WO 91/01133); antagonistas de BAFF tal como BAFF ouanticorpos BR3 ou imunoadesinas e antagonistas de zTNF4 (para revisão, verMackay e Mackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002) e ver também definição abaixo);agentes biológicos que interferem nos sinais de células T auxiliares, tal como receptoranti-CD40 ou Iigante anti-CD40 (CD154), incluindo anticorpos que bloqueiam ligaçãoCD40-CD40 (e.g., Durie et al., Science, 261: 1328-30 (1993); Mohan et al., J.Immunol., 154: 1470-80 (1995)) e CTLA4-lg (Finck et al., Science, 265: 1225-7(1994)); e anticorpos receptores de célula T (EP 340,109) tal como T10B9.

O termo "agente citotóxico" como usado na presente invençãorefere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causadestruição de células. O termo tem a intenção de incluir isótopos radioativos (porexemplo, At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, BÍ212, P32 e isótoposradioativos de Lu), agentes quimioterápicos, e toxinas tal como toxinas demolécula pequena ou toxinas enzimáticamente ativas de origem bacteriana,fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destes.

Um "agente quimioterápico" é um componente químico útil notratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentesalquiladores tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonados taiscomo busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa,carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindoaltretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida etrimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colchicinas;ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo a sintética análoga topotecan(HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina,scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindosuas análogas adozelesina, carzelesina e bizelesina sintética); podofilotoxina;ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 ecriptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo as sintéticas análogas, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina;mostardas de nitrogênio tais como clorambucila, clornafazina, clolofosfamida,estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto óxido de mecloretamina,melfalan, novembiquin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda deuracil; nitrosureas tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina,nimustina, e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos enedina (porexemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall ecaliqueamicina ômega 11 (ver, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; assim comocromóforos de neocarzinostatina e cromóforos de antiobióticos enedinacromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina,azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina,cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluindo ADRIAMYCIN® morfolino-doxorubicina,cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, injeção de Iipossoma HC1doxorubicina (DOXIL®) e deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina,marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico,nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina,rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina,zorubicina; anti-metabólitos tais como metotrexato, gencitabina (GEMZAR®),tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), uma epotilona, e 5-fluorouracil (5-FU); ácido fólico análogos tais como denopterina, metotrexato, pteropterina,trimetrexato; análogos purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina,tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina,carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; ácido fólicorestabelecedortais como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida;ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucila; bisantrena; edatraxato;defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucideo;nitrato de gálio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tais comomaitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina;pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina;complexos polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana;rizoxina; sizofirana; spirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietil amina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A eanguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina;manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulação de paclitaxelde nanopartículas de albumina engenherada (ABRAXANE™), e doxetaxel(TAXOTERE®); cloranbucila; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexatO; análogosda platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina;etoposide (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina;leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina;aminopterina; ibandronato; inibidor topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina(DMFO); retinóides tais como ácido retinóico; sais farmaceuticamente aceitáveis,ácidos ou derivados de qualquer dos acima; assim como combinações de dois oumais dos acima tais como CHOP, uma abreviação para uma terapia combinadade ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, umaabreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™)combinado com 5-FU e leucovorina.

Também incluídos nesta definição estão os agentes anti-hormonaisque agem para regular, reduzir, bloquear, ou inibir os efeitos de hormônios quepodem promover o crescimento de câncer, e estão freqüentemente na forma desistêmico, ou tratamento do corpo inteiro. Eles podem ser os próprios hormônios.Exemplos incluem anti-estrógenos e moduladores seletivos do receptor deestrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifenNOLVADEX®), raloxifeno (EVISTA®), droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno,keoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifene (FARESTON®); anti-progesteronas; baixos reguladores de receptores de estrógeno (ERDs);antagonistas de receptores do estrógeno tal como fulvestrante (FASLODEX®);agentes de função de supressão ou fechamento dos ovários, por exemplo,hormônio Iuteinizante que libera hormônios agonistas (LHRH) tais como acetatode Ieuprolida (LUPRON® e ELIGARD®), acetato de goserelina, acetato debuserelina e tripterelina; outros anti-androgênicos tais como flutamida, nilutamidae bicalutamida; e inibidores aromatase que inibem a enzima aromatase, a qualregula a produção de estrógeno na glândula adrenal, tais como, por exemplo,4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®), exemestano(AROMAS IN®), formestano, fadrozola, vorozola (RIVISOR®), Ietrozola(FEMARA®), e anastrozola (ARIMIDEX®). Além disto, tal definição de agentesquimioterápicos inclui bisfosfonatos tais como clodronato (por exemplo,BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácidozoledrônico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato(AREDIA®), tiludronato (SKELID®), ou risedronato (ACTONEL®)1 assim comotroxacitabina (uma 1,3-dioxolana nucleosídeo citosina análoga); oligonucleotídeosanti-sentido, em específico aqueles que inibem expressão de genes nas vias desinalização implicadas na proliferação celular anormal, tais como, por exemplo,PKC-alfa, Raf, H-Ras, e receptor do fator de crescimento epidermal (EGF-R);vacinas tais como vacina THERATOPE® e vacinas de terapia de gene, porexemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; inibidortopoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por exemplo,ABARELIX®); Iapatinib ditosilato (uma ErbB-2 e inibidor de molécula pequena detirosina quinase EGFR duplo também conhecido como GW572016); e saisfarmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.

O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadas poruma população de células que agem em outra célula como mediadorasintercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas; interleucinas(ILs) tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12,IL-15, incluindo PROLEUKIN® rlL-2 e IL-4 humana e mutantes de IL-4 humana,tais como, por exemplo, um mutante que contém uma mutação na região de IL-4que está envolvida na ligação com IL-2R gamma, por exemplo, Arg 21 é trocadapor um resíduo Glu; fator de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β; e outrosfatores polipeptídicos incluindo LIF e kit Iigante (KL). Como usado na presenteinvenção, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celularrecombinante e equivalentes ativos biologicamente de citocinas de seqüêncianativa, incluindo entidades de molécula pequena produzidas sinteticamente e saise derivados destes farmaceuticamente aceitáveis.

O termo "hormônio" refere-se a hormônios polipeptídicos, que sãogeralmente secretados por órgãos glandulares com dutos. Incluídos entre oshormônios estão, por exemplo, hormônios de crescimento tais como hormônios decrescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionil, hormônios decrescimento bovino; hormônio da paratireóide, tiroxina; insulina; pró-insulina;relaxina; estradiol; terapia de reposição hormonal; andrógenos tais comocalusterona, propionate de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, outestolactona; prorelaxina; hormônios glicoproteina tais como hormônio folículoestimulante (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH), e hormônioluteinizante (LH); prolactina, lactogênio placentário, peptídeo associado agonadotrofina de camundongo, hormônio de liberação de gonadotrofina; inibina;activina; substância de inibição mulleriana; e trombopoietina. Como usado napresente invenção, o termo hormônio inclui proteínas de fontes naturais ou decultura celular recombinante e equivalentes ativos biologicamente de hormôniosde seqüência nativa, incluindo entidades de molécula pequena produzidassinteticamente e sais e derivados destes farmaceuticamente aceitáveis.

O termo "fator de crescimento" refere-se a proteínas que promovemcrescimento, e incluem, por exemplo, fator de crescimento hepático; fator decrescimento do fibroblasto, fator de crescimento endotelial vascular; fator decrescimento do nervo tal como NGF-β; fator de crescimento derivado de plaqueta;fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fatorde crescimento Iell similar a insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos;interferons tais como interferon α, β e γ; e fatores que estimulam colônias (CSFs)tais como macrófagos CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); egranulócito-CSF (G-CSF). Como usado na presente invenção, o termo fator decrescimento inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinantee equivalentes ativos biologicamente de fator de crescimento de seqüência nativa,incluindo entidades de molécula pequena produzidas sinteticamente e sais ederivados destes farmaceuticamente aceitáveis.

O termo "integrina" refere-se a uma proteína receptora que permiteàs células tanto se ligarem como responderem à matriz extracelular e estáenvolvida em uma variedade de funções celulares tais como cicatrização,diferenciação celular, correção de rumo de células tumorais e apoptose. Elas sãoparte de um grande família de receptores celulares adesina que estão envolvidosna matriz extracelular e interações célula-célula. Integrinas funcionais consistemde duas sub-unidadaes de glicoproteína de transmembrana, chamadas alfa ebeta, que não são ligadas covalentemente. Todas as sub-unidades alfacompartilham alguma homologia entre si, como também as sub-unidades beta. Osreceptores sempre contêm uma cadeia alfa e uma cadeia beta. Exemplosincluem Alfa6beta1, Alfa3beta1, Alfa7beta1, LFA-1 etc. Como usado na presenteinvenção, o termo "integrina" inclui proteínas de fontes naturais ou de culturacelular recombinante e equivalentes ativos biologicamente de integrinas deseqüência nativa, incluindo entidades de molécula pequena produzidassinteticamente e sais e derivados destes farmaceuticamente aceitáveis.

Para os propósitos da presente invenção, "fator de necrose tumoralalfa (TNF-alfa)" refere-se a uma molécula TNF-alfa que compreende a seqüênciade aminoácido como descrito em Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) ouAggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985). O "inibidor de TNF-alfa" na presenteinvenção é um agente que inibe, de certa forma, uma função biológica de TNF-alfa, geralmente através de ligação a TNF-alfa e neutralizando sua atividade.

Exemplos de inibidores TNF especificamente contemplados na presente invençãosão etanercept (ENBREL®), infliximab (REMICADE®) e adalimumab (HUMIRA™).

Exemplos de "drogas anti-reumáticas modificadoras de doença" ou"DMARDs" incluem hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, Ieflunomida1etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicilamina, sais de ouro (oral), sais de ouro(intramuscular), minociclina, ciclosporina incluindo ciclosporina A e ciclosporinatópica, Proteína A stafilocóccia., (Goodyear e Silverman, J. Exp. Med., 197, (9),p1125-39 (2003)), incluindo sais e derivados destes, etc.

Exemplos de "drogas anti-inflamatórias não esteroidais " ou"NSAIDs" incluem aspirina, ácido acetil salicílico, ibuprofen, naproxen,indometacina, sulindac, tolmetina, inibidores de COX-2 tais como celecoxib(CELEBREX®; 4-(5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 -il)benzenesulfonamida e valdecoxib (BEXTRA®), e meloxicam (MOBIC®), incluindosais e derivados destes, etc.

Exemplos de "anticorpos ou antagonistas de integrina" na presenteinvenção incluem um anticorpo LFA-1, tal como efalizumab (RAPTIVA®)comercialmente disponível por meio da Genentech, ou um anticorpo integrina alfa4 tal como natalizumab (ANTEGREN®) disponível por meio da Biogen, ouderivados de fenilalanina diazacíclica (documento WO 2003/89410), derivados defenilalanina (documento WO 2003/70709, documento WO 2002/28830,documento WO 2002/16329 e documento WO 2003/53926), derivados do ácidofenilpropiônico (documento WO 2003/10135), derivados de enamina (documentoWO 2001/79173), derivados do ácido propanóico(WO 2000/37444), derivados doácido (documento WO 2000/32575), derivados fenil substituídos (patente US6.677.339 e 6.348.463), derivados amina aromáticas (patente US 6.369.229),polipeptídeos do domínio disintegrina ADAM (patente US 2002/0042368),anticorpos para alfavbeta3 integrina (patnte EP 633945), derivados do aminoácidobicíclico com pontes aza (documento WO 2002/02556), etc.

"Corticoesteróides" referem-se a qualquer uma de diversassubstâncias sintéticas ou que ocorrem naturalmente com a estrutura química geralde esteróides que imitam ou aumentam os efeitos dos corticoesteróides queocorrem naturalmente. Exemplos de corticoesteróides sintéticos incluemprednisona, prednisolona (incluindo metilprednisolona, tal como SOLU-MEDROL®succinato de sódio de metilprednisolona), dexametasona ou dexametasonatriancinolona, hidrocortisona, e betametasona. Os corticoesteróides preferidos dapresente invenção são prednisona, metilprednisolona, hidrocortisona oudexametasona.

Como usado na presente invenção, o termo "quantidade eficaz" tema intenção de se referir a uma quantidade de anticorpo ou antagonista que éeficaz para tratar IBD. Quantidades eficazes são tipicamente determinadas peloefeito que elas possuem comparado ao efeito observado quando uma composiçãoque não inclui ingrediente ativo (isto é, um controle) é administrada a um indivíduoem situação similar.

Uma "bula" refe-se a instruções incluídas como de costume emembalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm infomações sobreas indicações, uso, dosagem, administração, contra indicações, outros produtosterapêuticos a serem combinados com o produto embalado, e/ou advertênciasreferentes ao uso de tais produtos terapêuticos, etc.

Um "medicamento" é uma droga ativa para tratar IBD ou seussintomas ou efeitos colaterais.

II. Terapia De IBD

A presente invenção fornece um método para tratar IBD em umsujeito humano que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz deum anticorpo (ou antagonista) que se liga a um marcador de superfície de célulaB, tal como CD20.

Em particular, a invenção fornece um método para tratar doençainflamatória do intestino moderada-severa (IBD) em um sujeito humano quecompreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo CD20(ou antagonista), em que a administração do anticorpo (ou antagonista) resultaem uma resposta clínica ou remissão da doença.

Tal administração pode também reduzir células B na mucosacolônica, placas de Peyer, tecidos linfóides secundários ou órgãos tais comoIinfonodos e baço, e sangue, mas especialmente a mucosa colônica do sujeito.

A IBD pode ser colite ulcerativa (UC)1 ou doença de Crohn1 maspreferivelmente UC. O sujeito tratado na presente invenção pode ter IBD ativa,UC ativa ou doença de Crohn ativa. Geralmente, o sujeito tratado terá IBDmoderada-severa, UC moderada-severa ou doença de Crohn moderada-severa.

Além disso, o sujeito pode ter IBD refratária a esteróide e/oudependente de esteróide, UC refratária a esteróide e/ou dependente de esteróideou doença de Crohn refratária a esteróide e/ou dependente de esteróide.

Sujeitos tratados na presente invenção podem: ter tido diagnose deIBD >6 meses na seleção; ter >20 cm de doença ativa na seleção desigmoidoscopia; ter doença ativa como definido por uma pontuação DAI entre >6e <11, com >2 para sangramento retal e >2 sigmoidoscopiaflexível; ter sidotratado com corticoesteróides oral para UC dentro de 2 anos antes da seleção; tersido tratado com uma intensidade maior que uma dose equivalente de prednisonade 20 mg/dia por pelo menos 2 semanas de duração; ser resistente ou refratário aetanercept, infliximab ou adalimumab; ter sido tratado com uma dose estável deaminosalicilato por >3 semanas; ter sido tratado com doses estáveis decorticoesteróide oral por >2 semanas; ter sido tratado com 6-MP par um períodode 3 meses, e com uma dose estável deste por >4 semanas; ter sido tratado comazatioprina por um período de 3 meses, com um dose estável por >4 semanas.

O padrão de tratamento para sujeitos com UC ativa moderada-severa envolve terapia com doses padrão de: um aminosalicilato, umcorticoesteróide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) e/ou azatioprina. A terapia comum anticorpo CD20 como divulgado na presente invenção irá resulatr em umamelhora na remissão da doença (rápido controle da doença e/ou remissãoprolongada), e/ou resposta clínica, superior àquela alcançada com a padrão detratamento para tais sujeitos.

A administração do anticorpo pode resultar na remissão da doença,por exemplo, onde a remissão da doença é alcançada em aproximadamente 8semanas. Preferivelmente, o tempo de remissão da doença é menor do queaquele alcançado em um sujeito que não é tratado com o anticorpo CD20. Alémdisso, preferivelmente, o tempo de duração de remissão da doença é maior doque aquele alcançado em um sujeito que não é tratado com o anticorpo CD20.Por exemplo, a duração de remissão da doença pode ser por pelo menos 24semanas, e preferivelmente por pelo menos 48 semanas, e mais preferivelmentepor pelo menos aproximadamente 2 anos, do tratamento inicial ou a partir doalcance de remissão. Remissão pode ser definida como uma pontuação desigmoidoscopia de 0 a 1, e/ou pontuação de sangramento retal de 0.

A administração do anticorpo pode resultar em uma resposta clínica,por exemplo, onde a resposta clínica é alcançada em aproximadamente 8semanas. A resposta clínica na presente invenção pode ser definida como umaredução na pontuação do índice de atividade da doença (DAI), por exemplo,redução de tal pontuação maior ou igual a 3 pontos.

Em uma realização, o sujeito nunca foi tratado anteriormente comum anticorpo CD20. Preferivelmente, o sujeito não está sofrendo de umamalignidade de célula Β. O sujeito é também preferivelmente aquele que não estásofrendo de uma doença auto-imune, exceto IBD, UC ou doença de Crohn.

É também fornecido um método para redução de uma pontuação doíndice de atividade da doença (DAI) em um sujeito humano com colite ulcerativaativa (UC) que compreende administrar um anticorpo CD20 ao sujeito em umaquantidade eficaz para reduzir a pontuação DAI. Preferivelmente, o sistema depontuação DAI é como na Tabela 2 na presente invenção, e a administração doanticorpo CD20 reduz tal pontuação DAI para mais ou igual a 3 pontos.Além disso, o método envolve tratamento de doença inflamatória dointestino ativa (IBD) em um sujeito humano com anticorpo citoplasmáticoantineutrófilo perinuclear (p-ANCA) e /ou nível(is) de auto-anticorpo isoforma 5tropomiosina anti-humana (hTM5) A administração de um anticorpo CD20 para osujeito reduz eficazmente p-ANCA e /ou nível(is) do anticorpo anti-hTM5 nosujeito.

A dose exata será determinada pelo médico de acordo com ospadrões aceitos, levando em conta a natureza e severidade da condição a sertratada, o tipo de antagonista ou anticorpo, as características do sujeito, etc. Adeterminação da dose está dentro do nível dos técnicos no assunto.

Preferivelmente o anticorpo é administrado sistemicamente, intravenosamente ousubcutaneamente. Dependendo da rota e método de administração, oantagonista ou anticorpo pode ser administrado em uma dose única, como umainfusão prolongada, ou intermitentemente por um período de tempo. Aadministração intravenosa será geralmente por injeção de bolus ou infusão porum período típico de uma a várias horas. Formulações de liberação contínuapodem ser empregadas.

Em uma realização preferida, o método compreende administraçãode uma ou mais doses na faixa de aproximadamente 200 mg a 2000 mg,preferivelmente aproximadamente 500 mg a 1500 mg, e mais preferivelmenteaproximadamente 750 mg a 1200 mg. Por exemplo, uma a quatro doses, ousomente uma ou duas doses podem ser administradas. De acordo com estarealização, o anticorpo pode ser administrado dentro de um período deaproximadamente um mês, preferivelmente dentro de um período deaproximadamente 2 a 3 semanas, e mais preferivelmente dentro de um períodode aproximadamente duas semanas.

Onde mais do que uma dose é administrada, a última dose (porexemplo, segunda ou terceira dose) é preferivelmente administrada deaproximadamente 1 a 20 dias, mais preferivelmente de aproximadamente 6 a 16dias, e mais preferivelmente de aproximadamente 14 a 16 dias a partir do tempoem que a dose anterior foi administrada. As doses separadas são preferivelmenteadministradas dentro de um período total entre aproximadamente 1 dia a 4semanas, mais preferivelmente entre aproximadamente 1 a 20 dias (por exemplo,dentro de um período de 6-18 dias). Cada dose separada do anticorpo épreferivelmente aproximadamente 200 mg a 2000 mg, preferivelmenteaproximadamente 500 mg a 1500 mg, e mais preferivelmente aproximadamente750 mg a 1200 mg.

Como apontado acima, no entanto, estas quantidades sugeridas deantagonista ou anticorpo estão sujeitas a uma quantidade maior de discriçãoterapêutica. O fator chave na seleção de uma dose apropriada e programação éo resultado obtido, como indicado acima. Por exemplo, doses relativamente maisaltas podem ser necessárias inicialmente para o tratamento de IBD ativa. Umadose subsequente pode ser maior que uma dose anterior. Para se obterresultados mais eficazes, o antagonista ou anticorpo é geralmente administradotão próximo quanto possível do primeiro sinal, diagnóstico, aparência ouocorrência da doença ou disfunção ou durante remissões da doença oudisfunção.

Portanto, a invenção fornece um método para tratar doençainflamatória do intestino (IBD) em um sujeito humano com IBD ativa quecompreende administrar somente uma ou duas doses de um anticorpo CD20 aosujeito, em que a remissão da doença ou resposta é alcançada pelaadministração de uma ou duas doses do anticorpo CD20. Preferivelmente taisuma ou duas doses são administradas intravenosamente (IV), ousubcutaneamente (SQ). Onde as duas doses intravenosas são administradas,preferivelmente cada uma das duas doses está na faixa de aproximadamente 200mg a aproximadamente 2000 mg.O antagonista ou anticorpo da invenção é administrado por qualquermeio adequado, incluindo parenteral, subcutâneo, intraperitonial, inalação,intratecal, intra-articular e intranasal, e se desejado para tratamento localimunosupressivo, administração intralesional. Infusões parenterais incluemintramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitonial ou administraçãosubcutânea. Além disso, o antagonista ou anticorpo pode adequadamente seradministrado por infusão de pulso, por exemplo, com declínio de doses doantagonista ou anticorpo. Preferivelmente1 a dosagem é dada por injeções, maispreferivelmente injeções intravenosas ou sub-cutâneas, dependendo em parte sea administração é breve ou crônica.

O sujeito pode ser tratado novamente com o antagonista ouanticorpo, como sendo dado mais do que uma exposição ou conjunto de doses,tal que pelo menos aproximadamente duas exposições do antagonista ouanticorpo, por exemplo, de aproximadamente 2 a 60 exposições, e maisparticularmente aproximadamente 2 a 40 exposições, mais particularmenteaproximadamente, 2 a 20 exposições.

Em uma realização, qualquer retratamento pode ser dado quandosinais ou sintomas da doença retornam, quando o sujeito não está mais emremissão, e/ou quando p-ANCA ou os níveis do auto-anticorpo anti-hTM5aumentam, etc.

Em outra realização, qualquer retratamento pode ser dado emintervalos definidos. Por exemplo, exposições subsequentes podem seradministradas em vários intervalos, tal como, por exemplo, aproximadamente 24-28 semanas ou 48-56 semanas ou mais. Preferivelmente, tais exposições sãoadministradas em intervalos de aproximadamente 24-26 semanas ouaproximadamente 38-42 semanas, ou aproximadamente 50-54 semanas.

Em uma realização, cada exposição de antagonista ou anticorpo éfornecida como uma dose única do antagonista ou anticorpo. Em uma realizaçãoalternativa, cada exposição de antagonista ou anticorpo é fornecida como umadose separada do anticorpo. No entanto, nem toda exposição de antagonista ouanticorpo precisa ser fornecida como uma dose única ou como doses separadas.

O antagonista preferido é um anticorpo. Nos métodos apresentadosna presente invenção, o anticorpo CD20 pode ser um anticorpo nu ou pode serconjugado com outra molécula tal como um agente citotóxico ou citocina.

Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo intacto nú. O anticorpo CD20preferido na presente invenção é um anticorpo CD20 quimérico, humanizados ouhumano, mais preferivelmente rituximab, 2H7 humanizado, 2F2 (Hu-Max-CD20)anticorpo CD20 humano (Genmab), e anticorpo A20 humanizado(Immunomedics). Ainda mais preferido é rituximab ou 2H7 humanizado.

Em uma realização adicional de todos os métodos da presenteinvenção, o sujeito nunca foi previamente tratado com droga(s), tal como umagente que trata IBD, e/ou nunca foi previamente tratado com um antagonista ouanticorpo para um marcador de superfície de célula B (por exemplo, nunca foipreviamente tratado com um anticorpo CD20).

Em qualquer um dos métodos da presente invenção, pode seradministrado ao sujeito junto com o antagonista ou anticorpo que se liga a ummarcador de superfície de célula B, uma quantidade eficaz de um segundomedicamento (onde o antagonista ou anticorpo que se liga a um marcador desuperfície de célula B (por exemplo, o anticorpo CD20) é um primeiromedicamento). O tipo de tal segundo medicamento depende de vários fatores,incluindo o tipo de IBD, a severidade de IBD, a condição e idade do sujeito, o tipoe dose do primeiro medicamento empregado, etc.

Exemplos de tais medicamentos adicionais ou outras terapiasincluem outros agentes que tratam IBD, como um agente quimioterápico, umadroga da classe interferon tal como interferon-alfa (por exemplo.da AmarilloBiosciences, Inc.), IFN-beta-1a (REBIF® e AVONEX®) ou IFN-beta-1b(BETASERON®), um oligopeptídeo tal como acetato de glatiramer (COPAXONE®),um agente de bloqueio de ligação CD40-CD40, um agente citotóxico (tal comomitoxantrona (NOVANTRONE®), metotrexato, ciclofosfamida, clorambucil,leflunomida1 e azatioprina), um ou mais agentes imunosupressivos (por exemplo,azatioprina, 6-mercaptopurina, ciclosporina), imunoglobulina intravenosa (gamaglobulina), terapia de depleção de linfócito (por exemplo, mitoxantrona,ciclofosfamida, anticorpos CAMPATH™, anti-CD4, cladribina), uma costrução depolipeptídeo com pelo menso dois domínios que compreendem um antígeno de-imunizado auto-reativo ou seu fragmento que é especificamente reconhecidopelos receptores Ig de células B auto-reativas (documento WO 2003/68822),irradiação total do corpo, transplante de medulla óssea, antagonista ou anticorpointegrina (por exemplo, um anticorpo LFA-1 tal como efalizumab (RAPTIVA®)comercialmente disponível pela Genentech, ou um anticorpo alfa 4 integrina talcomo natalizumab (ANTEGREN®) disponível pela Biogen Idec, ou outros comoapontado acima), esteróide tal como corticoesteróide (por exemplo,metilprednisolona tal como SOLU-MEDROL™ succinato de sódio demetilprednisolona para injeção, prednisona tal como baixa dose de prednisona,dexametasona, ou glucocorticóides, incluindo terapia de corticoesteróidesistêmica), terapia imunosupressiva de depleção de não linfócitos (tal como, MMFou ciclosporina), drogas que abaixam o colesterol da classe "estatina" (queincluem cerivastatina (BAYCOL™), fluvastatina (LESCOL™), atorvastatina(LIPITOR™), Iovastatina (MEVACOR™), pravastatina (PRAVACHOL™), esinvastatina (ZOCOR™)), estradiol, testosterona (opcionalmente em doseselevadas; Stuve et al. Neurology 8:290-301 (2002)), andrógeno, terapia dereposição hormonal, um inibidor de TNF tal como etanercept (ENBREL®),infliximab (REMICADE®), e adalimumab (HUMIRA™), droga anti-reumáticamodificadora da doença (DMARD), droga anti-inflamatória não esteroidal (NSAID),plasmaferese ou troca plasmática, trimetoprim-sulfametoxazola (BACTRIM™,SEPTRA™), mcofenolato mofetil, bloqueadores de H2 ou inibidores de boma depróton (durante o uso da terapia imunosupressiva potencialmente ulcerogênica),levotiroxina, ciclosporina A (por exemplo, SANDIMMUNE®), análogo desomatastatina, citocina, citocina ou anticorpo receptor de citocina ou antagonista,anti-metabólito, cirurgia ou colectomia para reabilitação, radio iodo, tireoidectomia,antagonista de BAFF tal como BAFF ou anticorpos BR3 ou imunoadesinas,receptor anti-CD40 ou Iigante anti-CD40 (CD154), antagonista ou anticorporeceptor anti-IL-6, anticorpo anti-IL-2 tal como daclizumab, outro antagonista ouanticorpo de superfície de célula B tal como um 2H7 humanizado ou outroanticorpo CD20 humano ou humanizado com rituximab, corticoesteróide oral (porexemplo, dentro de 2 anos antes do tratamento inicial com o anticorpo ouanatgonista CD20), prednisona (por exemplo, dose equivalente de prednisona de20 mg/dia por pelo menos 2 semanas de duração), etanercept, infliximab,adalimumab, aminosalicilato (por exemplo, doses estáveis para >3 weeks),corticoesteróides orais (por exemplo, doses estáveis para >2 weeks), 6-MP (porexemplo, tratamento para um período de 3 meses, com uma dose estável para >4weeks), azatioprina (por exemplo, tratamento pra um período de 3 meses, comuma dose estável para >4 semanas), inibidor de calcineurin, ciclosporina,tacrolimus, sirolimus, metotrexato, micofenolato mofetil, preparação retal tópica,terapia de depleção de célula não biológica tal como ADACOLUMN®, antibiótico,antidiarréico, Iigante de ácido biliartal como colestiramina, 5-ASA oral e/ou tópico,esteróide oral e/ou tópico, MLN-02, mesalamina, creme de cortisona, enema dehidrocortisona, sulfasalazina, alsalazina, balsalazida metilprednisolona,hidrocortisona, ACTH, corticoesteróides intravenosos, GELTEX™ (Genzyme),anticorpo anti-CD3 tal como visilizumab (NUVION®), OPC-6535, CBP 1011,talidomida, ISIS 2302, BXT-51072, um fator de crescimento tal como fator-2 decrescimento de queratinócito (KGF-2; REPIFERMIN™), RPD-58, antegren, FK-506, etc.Medicamentos secundários preferidos incluem, um, dois, três ouquatro de: um aminosalicilato, um corticoesteróide oral, 6-mercaptopurina (6-MP)e/ou azatioprina.

Em um método preferido de "combinação de terapia" na presenteinvenção, a invenção relaciona-se a um método para tratar doença inflamatória dointestino (IBD) em um sujeito humano com IBD ativa que compreende administrarao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo CD20 e também compreendeadministrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um segundo medicamentoselecionado do grupo que consiste de um aminosalicilato, um corticoesteróideoral, 6-mercaptopurina (6-MP) e azatioprina.

Todos estes medicamentos secundários podem ser usados emcombinação entre si ou com o primeiro medicamento, de modo que a expressão"segundo medicamento" como usado na presente invenção não significa que é oúnico medicamento além do primeiro medicamento, respectivamente. Dessaforma, o segundo medicamento precisa ser um medicamento, mas pode constituirou compreender mais do que tal droga.

Estes medicamentos secundários como apresentados na presenteinvenção são geralmente usados na mesma dose e com rotas de administraçãocomo usado anteriormente ou cerca de 1 a 99% das doses até agoraempregadas. Se tais medicamentos secundários são usados, opcionalmente elessão usados em baixas quantidades como se o primeiro medicamento nãoestivesse presente, especialmente nas doses subsequentes depois da dose inicialcom o primeiro medicamento, de modo que elimine ou reduza os efeitos colateriascausados pela terapia. Por exemplo, a terapia com um anticorpo CD20 napresente invenção permite administração diminuída ou descontinuada doesteróide.

A administração combinada na presente invenção inclui co-administração, usando-se formulações separadas ou uma formulaçãofarmacêutica única, e a administração consecutiva em qualquer ordem, em quepreferivelmente exista um período de tempo enquanto ambos (ou todos) osagentes ativos simultaneamente exerçam suas atividades biológicas.

Para o método de retratamento na presente invenção, onde umsegundo medicamento é administrado em uma quantidade eficaz com umconjunto de dose de anticorpo, pode ser administrado com qualquer conjunto dedose, por exemplo, somente com um conjunto de doses, ou com mais do que umconjunto de doses. Em uma realização, o segundo medicamento é administradocom o conjunto inicial de doses. Em outra realização, o segundo medicamento éadministrado com o conjunto inicial e secundário de doses. Em ainda umarealização adicional, o segundo medicamento é administrado com todos osconjuntos de doses.

A administração combinada de um segundo medicamento inclui co-administração (administração simultânea), usando-se formulações separadas ouuma formulação farmacêutica única, e a administração consecutiva em qualquerordem, em que preferivelmente exista um período de tempo enquanto ambos (outodos) os agentes ativos (medicamentos) simultaneamente exerçam suasatividades biológicas.

O anticorpo ou antagonista na presente invenção é administrado porqualquer meio adequado, incluindo parenteral, tópico, subcutâneo, intraperitonial,intrapulmonar, intranasal e/ou administração intralesional. Infusões parenteraisincluem intramuscular, intravenosa (i.v), intra-arterial, intraperitonial ou administraçãosubcutânea. Administração intratecal é também contemplada (ver, por exemplo,patente US 2002/0009444, Grillo-Lopez, A conceming intrathecal delivery of a CD20antibody). Além disso, o anticorpo ou antagonista pode adequadamente seradministrado por infusão de pulso, por exemplo, com declínio de doses do anticorp ouantagonista. Preferivelmente, a dose é dada intravenosamente ou subcutaneamentee mais preferivelmente por infusão intravenosa.Se múltiplos conjuntos de dose de anticorpo são fornecidos, cadaconjunto de dose pode ser fornecido usando-se o mesmo ou diferente meio deadministração. Em uma realização, cada conjunto de doses é por administraçãointravenosa. Em outra realização, cada conjunto de doses é dado poradministração subcutânea. Em ainda outra realização, os conjuntos de doses sãodados tanto por administração intravenosa como subcutânea, e os anticorpospodem ser o mesmo ou diferentes.

Segue uma discussão de métodos de produção, modificação eformulação de tais antagonistas e anticorpos.

III. Produção De Antagonistas ε Anticorpos

Os métodos e artigos de fabricação da presente invenção invençãousam, ou incorporam um antagonista ou anticorpo que se liga a um marcador desuperfície de célula B. Consequentemente, métodos para gerar tais antagonistasou anticorpos serão descritos aqui.

O marcador de superfície de célula B a ser usado para a produçãoou seleção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do antígenoou uma porção deste, que contém o epitopo desejado. Alternativamente ouadicionalmente, células que expressam o marcador de superfície de célula B emsua superfície celular são usadas para gerar ou selecionar antagonistas ouanticorpos. Outras formas de marcador de superfície de célula B úteis parageração de antagonistas ou anticorpos serão aparente para aqueles técnicos noassunto. Preferivelmente, o marcador de superfície de célula B é o antígenoCD20.

Enquanto o antagonista preferido é um anticorpo, antagonistasexceto anticorpos estão contemplados na presente invenção. Por exemplo, oantagonista pode compreender uma molécula pequena antagonistaopcionalmente ligada ou conjugada a um agente citotóxico (tal como aqueledescrito na presente invenção). Bibliotecas de moléculas pequenas podem serselecionadas contra o marcador de superfície de célula B de interesse napresente invenção, com o objetivo de identificar uma molécula pequena que seliga a esse antígeno. A molécula pequena pode também ser selecionada parasuas propriedades antagonísticas e/ou conjugada com um agente citotóxico.

O antagonista pode também ser um peptídeo gerado pelo projetoracional ou por exposição por fago (ver, por exemplo, documento WO 98/35036publicado em 13 de agosto de 1998). Em uma realização, a molécula de escolhapode ser uma "CDR mímica" ou anticorpo análogo projetado baseado nas CDRsde um anticorpo. Enquanto tais peptídeos podem ser antagonísticos por simesmos, o peptídeo pode opcionalmente ser ligado a um agente citotóxico tal queadicione ou aumente as propriedades antagonísticas do peptídeo.

Segue uma descrição como técnicas exemplares para a produçãodos anticorpos usados de acordo com a presente invenção.

(O Anticorpos Policlonais

Anticorpos policlonais são preferivelmente cultivados em animais pormúltiplas injeções subcutânea (sc) ou intraperitonial (ip) do antígeno relevante eum adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que éimunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina keyholelimpet, soro de albumina, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de sojautilizando-se um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, éstersulfosuccinimida maleimidobenzoil (conjugação através de resíduos cisteína), N-hidroxsuccinimida (através de resíduos lisina), glutaraldeído, anidrido succínico,SOCI2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquil diferentes.

Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugadosimunogênicos, ou derivados por combinação, por exemplo, 100 pg ou 5 pg deproteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução por viaintradérmica em múltiplos locais. Um mês depois os animais são estimuladoscom 1/5 a 1/10 da quantidade original do peptídeo ou conjugado em adjuvantecompleto de Freund por injeção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 diasdepois os animais são sangrados e o soro é analisado por titulação de anticorpo.Animais são estimulados até a titulação platô. Preferivelmente1 o animal éestimulado com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado com umaproteína diferente e/ou através de um reagente de interligação diferente.Conjugados também podem ser feitos na cultura celular recombinante comoproteína de fusão. Também, agentes de agregação tal como alúmen sãoadequadamente usados para aprimorar a resposta imune.

(II) Anticorpos Monoclonais

Anticorpos monoclonais são obtidos de uma população deanticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais quecompreendem a população são idênticos exceto pela possível ocorrência naturalde mutações que podem estar presentes em menores quantidades. Dessa forma,o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo umamistura de anticorpos distintos.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos usando-seo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et ai. Nature, 256:495 (1975),ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (patente US. 4.816.567).

No método de hibridoma, um camundongo ou outro animalhospedeiro apropriado, tal como hamster, é imunizado na forma descrita acimapara gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos queirão ligar-se especificamente à proteína utilizada para imunização.Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitos são entãofundidos com uma linhagem de células de mieloma, utilizando-se um agente defusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma(Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice1 páginas. 59-103(Academic Press, 1986)).As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas ecultivadas em meio de cultura apropriado que contém preferivelmente uma oumais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células demieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mielomaparentais não contêm a enzima hipoxantino guanina fosforibosil transferase(HGPRT ou HPRT), o meio de cultura selecionado para os hibridomas irá incluirtipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias queevitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundemeficientemente, apoiam a produção de anticorpos estáveis em alto nível pelascélulas produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio talcomo meio HAT. Entre estas, linhagens celulares de mieloma preferidas sãolinhagens de mieloma murino, tais como aquelas derivadas de tumores decamundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Salk Institute CellDistribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e SP-2 ou células X63-Ag8-653 disponíveis por meio da Coleção Americana de Tipos de Cultura,Manassas, Virgínia, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humano eheteromieloma humano de camundongos também foram descritas para aprodução de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001(1984); Brodeur et ai Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, páginas. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)).

O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo étestado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra oantígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonaisproduzidos por células de hibridoma é determinada por meio deimunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal comoradioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo,ser determinada por meio da análise Scatchard de Munson et ai, Anal.Biochem.,107:220 (1980).

Após células de hibridoma serem identificadas para produção deanticorpos de especificidade desejada, afinidade e/ou atividade, os clones podemser subclonados por procedimentos de diluição Iimitantes e cultivados pormétodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice,páginas. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meio de cultura adequado para estepropósito inclui, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as célulasde hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones sãoadequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro porprocedimentos de purificação de imonuglobulina convencional, tais como, porexemplo, proteína A sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese emgel, diálises ou cromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais também podem ser produzidos de formarecombinante. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmenteisolado e sequenciado utilizando-se procedimentos convencionais (por exemplo,pelo uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligarespecificamente aos genes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorposmurinos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA.Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que sãotransfectados em seguida em células hospedeiras tais como células de E. coli,células de COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célulasde mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, paraobter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeirasrecombinantes. Os artigos de revisão sobre expressão recombinante embactérias de DNA que codificam o anticorpo incluem Skerra et ai, Curr. Opinion inImmunol., 5:256-262 (1993) e Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).Em uma realização adicional, anticorpos ou fragmentos deanticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos geradas usando-setécnicas descritas em McCafferty et al. Nature 348:552-554 (1990). Clackson etai Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et ai, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente,utilizando bibliotecas de fago. Publicações subsequentes descrevem a produçãode anticorpos humanos de alta afinidade (variação nM) pela mistura de cadeia(Marks et ai. Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), assim como infecçõescombinatórias e recombinação in vivo, como uma estratégia para a construção debibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et ai., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Desta forma, essas técnicas são alternativas viáveis para técnicasde hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento deanticorpos monoclonais.

O DNA pode ser também modificado, por exemplo, pela substituiçãodas seqüências de codificação de domínios constantes de cadeia leve e cadeiapesada humana no lugar das seqüências de murino homólogas (patente US4.816.567; Morrison, et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 81:6851 (1984)) ou porligação covalente para toda ou parte da seqüência codificadora de imunoglobulinaa um polipeptídeo não imunoglobulina.

Tipicamente tais polipeptídeos de não-imunoglobulina sãosubstituídos pelo domínio constante de um anticorpo, ou eles são substituídospelo domínio variável de um sítio de combinação de um anticorpo para criar umanticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação deantígeno que tem especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação deantígeno que tem especificidade para um antígeno diferente.

(in) Anticorpos Humanizados

Métodos para humanização de anticorpos não humanos foramdescritos na técnica. Preferivelmente, um anticorpo humanizado possui um oumais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não éhumana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentementereferidos como resíduos "importados", que são tipicamente retirados de umdomínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmenteapresentada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. Nature,321:522-525 (1986); Riechmann etal. Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen etal. Science 239:1534-1536 (1988)), pela substituição de seqüências de regiãohipervariável para as seqüências correspondentes de um anticorpo humano.Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos(patente US 4.816.567) em que substancialmente menos de um domínio variávelhumano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécienão humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorposhumanos em que alguns resíduos de região hipervariável e possivelmente algunsresíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos deroedores.

A escolha de domínios variáveis humano, tanto leve como pesado,para serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é muito importantepara reduzir antigenicidade. De acordo com o método também conhecido como"melhor ajuste", a seqüência de domínio variável de um anticorpo de roedor éselecionada em relação à completa biblioteca das seqüências de domínio variávelhumana conhecida. A seqüência humana que é a mais próxima daquela deroedor é então aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpohumanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. MoiBiol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma região de estrutura específicaderivada da seqüência consenso de todos os anticorpos humanos de umsubgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode serutilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter etal., Proc. Natl.Acad. Sei. U. S. A, 89:4285 (1992); Presta etal., J. Immunol., 151:2623 (1993)).É, além disto, importante que anticorpos sejam humanizados comretenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicasfavoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido,anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise dasseqüências parentais e vários produtos humanizados conceituais que usammodelos tridimensionais das seqüências parentais e humanizadas. Modelos deimunoglobulina tridimensional estão comumente disponíveis e são familiares paraaqueles técnicos no assunto. Programas de computador estão disponíveis, osquais ilustram e exibem possíveis estruturas de conformação tridimensional dasseqüências de imunoglobulina candidata selecionada. A inspeção destasexibições permite a análise do papel provável no funcionamento da seqüência deimunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam nahabilidade da imunoglobulina candidata ligar-se ao seu antígeno. Desta maneira,resíduos FR podem ser selecionados e combinados das seqüências do receptor eimportada de forma que a característica do anticorpo desejada, tal como aumentode afinidade para o antígeno(s) alvo, é atingida. Em geral, resíduos de regiãohipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência daligação do antígeno.

(iv) Anticorpos Humanos

Como uma alternativa para humanização, podem ser geradosanticorpos humanos. Por exemplo, agora é possível produzir animaistransgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, medianteimunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos naausência da produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descritoque a deleção homozigótica do gene (Jh) da região de ligação da cadeia pesadado anticorpo em camundongos de linhagem de origem mutante e quiméricoresulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferênciada linhagem de origem humana do conjunto de gene de imunoglobulina em talcamundongo de linhagem de origem mutante irá resultar na produção deanticorpos humanos mediante desafio com antígenos. Ver1 por exemplo,Jakobovits et al. Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al.Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann etal. Yearin Immuno., 7:33 (1993); epatentes US 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807. Alternativamente, tecnologia deexibição por fago (McCafferty et al. pode ser utilizada para produzir anticorposhumanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes dedomínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. De acordocom esta técnica, os genes do domínio V do anticorpo são clonados em quadrotanto em um gene de proteína de revestimento maior como menor de umbacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentosde anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partículafilamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma de fago, asseleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam naseleção do gene que codifica o anticorpo que exibe aquelas propriedades. Dessaforma, o fago imita algumas das propriedades da célula Β. A exibição por fagopode ser realizada em uma série de formatos; para sua revisão, ver, por exemplo,Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structurai Bioiogy3:564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadaspara exibição por fago. Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) isolaram umconjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena bibliotecacombinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongosimunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizadospode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso de antígenos (incluindoauto-antígenos) podem ser isolados seguindo-se essencialmente as técnicasdescritas por Marks etal., J. Moi Bioi 222:581-597 (1991), ou Griffith etal. EMBOJ. 12:725-734 (1993). Ver, também, patentes US 5.565.332 e 5.573.905.

Anticorpos humanos podem também ser gerados por células Bativadas in vitro (ver patentes US 5.567.610 e 5.229.275).

(v) Fragmentos De Anticorpos

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentosde anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados via digestãoproteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et aí. Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et aiScience, 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agoraproduzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, osfragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagodiscutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperadosdiretamente de E. colie acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2(Carter et ai Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outraabordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir dacultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produçãode fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Emoutras realizações, o anticorpo da seleção é um fragmento Fv de cadeia única(scFv). Ver documento WO 93/16185; Patente US 5.571.894; e Patente US5.587.458. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", porexemplo, como descrito na patente US 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentosde anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

(vi) Anticorpos Biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuemespecificidades de ligação para pelo menos dois epitopos diferentes. Anticorposbiespecíficos exemplares podem se ligar a dois epitopos diferentes do marcadorde superfície de célula B. Outros tais anticorpos podem se ligar a um primeiromarcador e também se ligar a um segundo marcador de superfície de célula B.

Alternativamente, um braço do marcador de superfície de célula B pode sercombinado com um braço que se liga a uma molécula acionadora em umleucócito como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3),ou receptores Fc para IgG (FcyR)1 tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) eFcyRII 1 (CD16) assim como focalizar o mecanismo de defesa celular para a célulaB. Anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentescitotóxicos para a célula B. Estes anticorpos possuem um braço que se liga aomarcador de célula B e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo,saporina, anti-interferon-α, alcalóide da vinca, ricina de cadeia A, metotrexato ouhapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparadoscomo anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo,anticorpos biespecíficos F(ab')2).

Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidosna técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimentototal é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada deimunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes(Millstein et aí. Nature 305:537-539 (1983). Devido à seleção aleatória de cadeiasleve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem umamistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenasuma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta,que é normalmente realizada por meio de etapas de cromatografia de afinidade, éum tanto problemática, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentossimilares são divulgados no documento WO 93/08829 e em Traunecker et aiEMBO J. 10:3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis deanticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação deanticorpos e antígenos) são fundidos a seqüências de domínio constante deimunoglobulina. Preferencialmente, a fusão é com um domínio constante decadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiõesde dobradiça, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante de cadeiapesada (CH1) contendo o sítio necessário para a ligação de cadeia leve, presenteem pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeiapesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, sãoinseridos em vetores de expressão separados, e são co-transfectados em umorganismo hospedeiro adequado. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste dasproporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo em realizações quandorazões desiguais das três cadeias de polipeptídeo utilizadas na construçãofornecerem os rendimentos ótimos. É, no entanto, possível inserir as seqüênciasde codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um vetorde expressão único quando a expressão de pelo menos duas cadeias depolipeptídeo em razões iguais resultarem em altos rendimentos ou quando asrazões não forem de significância específica.

Em uma realização preferida desta abordagem, os anticorposbiespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida comuma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeias leve ecadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidadede ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estrutura assimétrica facilita aseparação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia deimunoglobulina indesejadas, pois a presença de cadeia leve de imunoglobulina emapenas uma metade da molécula biespecífica fornece uma maneira fácil deseparação. Esta abordagem é descrita no documento WO 94/04690. Para maioresdetalhes de geração de anticorpos biespecíficos, ver, por exemplo, Suresh et ai.

Methods in Enzymology, 121:210(1986).

De acordo com outra abordagem descrita na Patente US 5.731.168,a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser engenheirada paramaximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da culturacelular recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte dodomínio Cr3 de um domínio constante do anticorpo. Neste método, uma ou maiscadeias laterais de aminoácidos pequenos da interface da primeira molécula deanticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina outriptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s)cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segunda moléculade anticorpo, pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos comcadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismode aumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtos finaisindesejados, tais como homodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos interligados ou"heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado podeser acoplado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos, por exemplo, forampropostos para atingir células do sistema imunológico a células indesejadas(Patente US 4.676.980), e para o tratamento de infecções por HIV (documentoWO 91/00360, documento WO 92/200373 e patente EP 03089). Anticorposheteroconjugados podem ser fabricados utilizando-se qualquer método deinterligação conveniente. Os agentes de interligação apropriados são bemconhecidos na técnica e estão descritos na patente US 4.676.980, juntamentecom uma série de técnicas de interligação.

As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir defragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Por exemplo,anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando-se ligações químicas.Brennan et al. Science 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em queanticorpos intactos são proteolicamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2.

Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante ditiolarsenato de sódio para estabilizar ditióis próximos e prevenir formação bissulfetointermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos paraderivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados do Fab1-TNB é entãoreconvertido para o Fab-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturadocom uma quantidade equimolar do outro derivado do Fab1-TNB para formar oanticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usadoscomo agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

Recente progresso facilitou a recuperação direta de fragmentos deFab1-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formaranticorpos biespecíficos. Shalaby et ai, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)descreve a produção de uma molécula completa do anticorpo biespecíficohumanizado F(ab')2. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado de E. colie sujeito a acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpobiespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de ligar-se acélulas que superexpressam o receptor ErbB2 e células T humanas normais,assim como acionar a atividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contraalvos de tumor de mama humano.

Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos deanticorpos biespecíficos diretamente de cultura celular recombinante tambémforam descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidosutilizando-se Zíper de Leucina. Kostelny et ai, J. Immunoi, 148(5):1547-1553(1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligadosàs porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de gene. Oshomodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça paraformarem monômeros e então reoxidados para formarem os heterodímeros deanticorpo. Este método também pode ser utilizado para a produção dehomodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger etai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismoalternativo para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Osfragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectadoa um domínio variável de cadeia leve (Vl) por um Iigante que é muito curto parapermitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia.Consequentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmento são forçados a parear-se com os domínios Vl e Vh complementares de outro fragmento, através disto,formando dois sítios de ligação de antígenos. Outra estratégia de fabricação defragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros Fv de cadeia única(sFv) também foi relatada. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Porexemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt etal., J. Immunol.147: 60(1991).

IV. Conjugados E Outras modificações Do Antagonista Ou Anticorpo

O antagonista ou anticorpo usado nos métodos ou incluídos nosartigos de fabricação da presente invenção é opcionalmente conjugado ao agentecitotóxico, tal como um agente citotóxico ou citocina (por exemplo, IL2, ver porexemplo, documento WO 2005/016969).

A conjugação irá normalmente ser alcançada através de uma ligaçãocovalente, a natureza precisa desta irá ser determinada pela molécula alvo e osítio de ligação no antagonista CD20 ou anticorpo polipeptídico. Tipicamente, umagente não peptídico é modificado pela adição de um Iigante que permiteconjugação ao antagonista ou anticorpo CD20 através de suas cadeias laterais deaminoácidos, cadeias de carboidratos, ou grupos reativos introduzidos noantagonista de CD20 ou anticorpo pela modificação química. Por exemplo, umadroga pode ser anexada através do grupo ε-amino de um resíduo lisina, atravésde um grupo α-amino livre, por troca de bissulfeto para um resíduo cisteína, oupela oxidação de 1,2- diols em uma cadeia de carboidrato com ácido periódicopara permitir junção de drogas que contêm vários nucleófilos através de umaligação Schiff-base. Ver, por exemplo, patente U.S.4.256.833. Agentes quemodificam proteína incluem reagentes amino-reativos (por exemplo, ésteresreativos, isotiociantatos, aldeídos, e sulfonil halidos), reagentes tiol-reativos (porexemplo, derivados de haloacetil e maleimidas), e reagentes ácido carboxílico ealdeído-reativos. Polipeptídeos antagonistas de CD20 ou anticorpos podem serligados covalentemente aos agentes peptídicos através do uso de reagentes deinterligação bifuncionais. Reagentes heterobifuncionais são mais comumenteutilizados e permitem o acoplamanto controlado de duas proteínas diferentesatravés do uso de dois componentes reativos diferentes (por exemplo, amino-reativo mais tiol, iodoacetamida ou meleimida). O uso de tais agentes de ligação ébem conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Brinkley, acima, e patente US4.671.958. Ligantes peptídicos podem também ser empregados. Comoalternativa, um polipeptídeo antagonista de CD20 ou anticorpo pode ser ligado aum componente peptídico através da preparação de um polipeptídeo de fusão.

Exemplos de agentes de acoplamento de proteína de bifuncionaistais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados deimidoésteres bifuncionais (tal como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (talcomo disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), bis-azidocombinados (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (talcomo tolueno 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativo (tal como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno).

Alternativamente, uma proteína de fusão que compreende oantagonista ou anticorpo e agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, portécnicas recombinantes ou síntese de pepitídeo.

Outras modificações do antagonista ou anticorpo estãocontempladas na presente invenção. Por exemplo, o antagonista ou anticorpopode ser ligado a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, porexemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímerosde polietileno glicol e polipropileno glicol.

Os antagonistas ou anticorpos divulgados na presente invençãotambém podem ser formulados como imunolipossomos. Lipossomos que contêmo antagonista ou anticorpo são preparados pelos métodos conhecidos na técnica,tal como descrito em Epstein et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985);Hwang et al., Proc Proc. Nati Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); patentes US.4.485.045 e 4.544.545; e documento WO 97/38731 publicado em 23 de outubrode 1997. Lipossomos com tempo de circulação aumentada estão divulgados napatente US 5.013.556.

Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo método deevaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo que compreendefosfatidicolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE).Lipossomos são retirados através de filtros com tamanho de poro definido paraproduzir Iipossomos com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab1 do anticorpo dapresente invenção podem ser conjugados aos Iipossomos como descrito em Martin etal. J. Bioi Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reação de intecâmbio debissulfeto. Um agente quimioterápico está opcionalmente contido dentro dolipossomo. Ver Gabizon et ai J. National Câncer /r»sf.81 (19)1484 (1989).

Modificações da seqüência de aminoácido de proteínas ou peptídeosantagonistas ou anticorpos descritos na presente invenção são contempladas.Por exemplo, pode ser desejável aprimorar a afinidade de ligação e/ou outraspropriedades biológicas do antagonista ou anticorpo. Seqüências de amino ácidosvariantes do antagonista ou anticorpo são preparadas pela introdução apropriadade trocas de nucleotídeos no ácido nucléico do antagonista ou anticorpo ou porsíntese de pepitídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções dosresíduos, e/ou inserções e/ou substituições nas seqüências de aminoácido doantagonista ou anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção, esubstituição são feitas para se chegar à construção final, provendo que aconstrução final possua as características desejadas. As trocas de aminoácidotambém podem alterar processos pós-tradução do antagonista ou anticorpo, talcomo troca do número ou posição dos sítios de glicolisação.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões doantagonista ou anticorpo que estão em localizações preferidas para mutagênese échamado "mutagênese de varredura de alanina" como descrito por Cunningham eWells Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduosalvos são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his,Iysl e glu) e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ou neutro(mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação deaminoácidos com antígeno. Essas localizações de aminoácidos que demonstramsensibilidade funcional para as substituições então são refinadas pela introdução,além disto, ou outras variantes no, ou para, os sítios de substituições.Consequentemente, enquanto o sítio para a introdução da variação de seqüênciade aminoácido é pré-determinado, a natureza da mutação por si mesma nãoprecisa ser pré-determinada. Por exemplo, para analisar o desempenho de umamutação em um dado sítio, varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzidano códon ou região alvo e os antagonistas ou anticorpos variantes expressadossão selecionados para a atividade desejada.

Inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões amino e/oucarboxi-terminal variando em comprimento de um resíduo para polipeptídeos quecontêm uma centena ou mais de resíduos, assim como inserções intrasequênciade simples ou múltiplos resíduos de aminoácido. Exemplos de inserções terminaisincluem um antagonista ou anticorpo com um resíduo metionil N-terminal ou oantagonista ou anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras inserçõesvariantes da molécula do antagonista ou anticorpo incluem a fusão para o N ou C-terminal do anticorpo de uma enzima, ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do soro do antagonista ou anticorpo.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição do aminoácido.Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula doantagonista ou anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maiorinteresse para mutagênese substitucional dos anticorpos antagonistas incluem asregiões hipervariáveis, mas alterações FR também são contempladas.

Substituições conservativas são mostradas na Tabela 4 sob o título de"substituições preferidas". Se tais substituições resultam em uma troca naatividade biológica, então mais trocas substanciais, denominadas "substituiçõesexemplares" na Tabela 4 ou também como descritas abaixo na referência paraclasses de aminoácido, podem ser introduzidas e os produtos selecionados.

Tabela 4

<table>table see original document page 82</column></row><table>Modificações substanciais nas propriedades biológicas doantagonista ou anticorpo são realizadas por seleções de substituições que diferemsignificantemente em seus efeitos na manutenção (a) da estrutura do esqueletodo polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma conformaçãofolha ou helicoidal (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c)da massa da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente podem serdivididos em grupos baseados em propriedades comuns das cadeias laterais:

(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr;

(3) acídica: asp, glu;

(4) básica: asn; gln; his, lys; arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: gly, pro; e

(6) aromática: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas irão conferir troca de um membro deuma destas classes por outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção daconformação apropriada do antagonista ou anticorpo também pode sersubstituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa damolécula e prevenir interligação anormal. De modo oposto, cisteína(s) ligada(s)pode ser adicionada ao antagonista ou anticorpo para melhorar sua estabilidade(particularmente onde o antagonista ou anticorpo é um fragmento de anticorpo talcomo um fragmento Fv).

Um tipo de variante substitucional particularmente preferida envolvesubstituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpoparental. Geralmente, a variante(s) resultante(s) selecionada(s) para posteriordesenvolvimento terá propriedades biológicas melhoradas relativas ao anticorpoparental a partir do qual elas são geradas. Uma maneira conveniente para gerartais variantes substitucionais é maturação de afinidade usando-se exibição porfago. Resumidamente, diversos sítios de região hipervariável (por exemplo, sítios6-7) são mutados para gerar todas as possíveis substituições de aminoácido emcada sítio. Os anticorpos variantes dessa forma gerados são exibidos em umaforma monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões para ogene Ill produto de M13 empacotado no interior de cada partícula. As variantesde fago exibidas são então selecionadas para suas atividades biológicas (porexemplo, afinidade de ligação) como divulgado na presente invenção. Com oobjetivo de identificar candidatos para sítios de região hipervariável paramodificações, pode ser realizada mutagênese de varredura de alanina paraidentificar resíduos de região hipervariável que contribuem significantemente paraligação do antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéficoanalisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificarpontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato eresíduos vizinhos são candidatos para substituições de acordo com as técnicaselaboradas na presente invenção. Uma vez que tais variantes são geradas, asvariantes do painel são sujeitas à seleção como descrito na presente invenção eanticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantespodem ser selecionados para posterior desenvolvimento.

Outro tipo de aminoácido variante do antagonista ou anticorpo alterao padrão de glicosilação original do antagonista ou anticorpo. Pela alteração éintencionado deletar um ou mais componentes carboidratos encontrados noantagonista ou anticorpo, e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que nãoestão presentes no antagonista ou anticorpo.

Glicosilação de polipeptídeos é tipicamente tanto N-Iigado como O-ligado. N-Iigado refere-se à conexão do componente carboidrato à cadeia lateralde um resíduo asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina easparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, sãoseqüências de reconhecimento para conexão enzimática do componentecarboidrato para a cadeia lateral asparagina. Dessa forma, a presença de ambasseqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilaçãopotencial. Glicosilação O-Iigado refere-se à conexão de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxi-aminoácido, maiscomumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina podemtambém ser usadas.

A adição de sítios de glicosilação ao antagonista ou anticorpo éconvenientemente realizada por alteração da seqüência de aminoácido, tal comoaquela que contém um ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima (parasítios de glicosilação N-ligado). A alteração pode também ser feita por adição de, ousubstituição de, um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência doantagonista ou anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligado).

Onde o antagonista ou anticorpo compreende uma região Fc1 ocarboidrato conectado a este pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos comuma estrutura de carboidrato madura que é desprovida de fucose conectada auma região Fc do anticorpo estão descritos no pedido de patente US2003/0157108 A1, Presta, L. Ver também patente US 2004/0093621 A1 (KyowaHakko Kogyo Co., Ltd). Anticorpos com uma N-acetilglucosamina dividida(GIcNAc) no carboidrato conectado a uma região Fc do anticorpo estão referidosno documento WO 03/011878, Jean-Mairet et al. e patente US 6.602.684 Umanaet al. Anticorpos com pelo menos um resíduo galactose no oligossacarídeoconectado a uma região Fc do anticorpo estão relatados no documento WO97/30087, Patel et al. Ver, também, documento WO 98/58964 (Raju, S.) edocumento WO 99/22764 (Raju, S.) que relaciona anticorpos com carboidratoalterado inserido à região Fc deste.

A variante de glicosilação preferida da presente invençãocompreende uma região Fe, em que uma estrutura de carboidrato ligada à regiãoFc desprovida de fucose. Tais variantes possuem função ADCC melhorada.Opcionalmente, a região Fc também compreende uma ou mais substituições deaminoácidos que também melhoram ADCC1 por exemplo, substituições nasposições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos Eu). Exemplosde tais publicações relacionadas a anticorpos "defucosilados" ou "deficientes emfucose" incluem: pedido de patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; documentoWO 00/61739A1; documento W001/29246A1; patente US 2003/0115614A1;patente US 2002/0164328A1; patente US 2004/0093621A1; patente US2004/0132140A1; patente US 2004/0110704A1; patente US 2004/0110282A1;patente US 2004/0109865A1; documento WO 03/085119A1; documento WO03/084570A1; Okazaki et ai J. Moi Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnukiet ai Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares queproduzem anticorpos defucosilados incluem células Lecl 3 CHO deficientes emproteína de defucosilação (Ripka et ai Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545(1986); pedido de patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e docuemtno WO2004/056312 A1, Adams et ai, especialmente no Exemplo 11), e linhagenscelulares knockout, tal como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHOknockout (Yamane-Ohnuki etal. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).

Moléculas de ácido nucléico que codificam seqüências variantes doantagonista ou anticorpo são preparadas por uma variedade de métodosconhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados a,isolamento de uma fonte natural (no caso de ocorrer seqüência variante deaminoácido naturalmente) ou preparação por mutagênese de oligonucleotídeomediada (ou sítio-dirigida), mutagênese de PCR e mutagênese cassete de umavariante preparada anteriormente ou uma versão não-variante do antagonista ouanticorpo.

Pode ser desejável modificar o antagonista ou anticorpo da invençãocom relação à função efetora, por exemplo, para aumentar citotoxicidade mediadapor célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente decomplemento (CDC) do antagonista ou anticorpo. Isto pode ser alcançado pelaintrodução de uma ou mais substituições em uma região Fc de um anticorpoantagonista ou anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) decisteína pode ser introduzido na região Fc1 através disso permitindo formação deponte bissulfeto entre cadeias nesta região. O anticorpo homodimérico dessaforma gerado pode ter melhorado a capacidade de internalização e/ou aumentode morte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp Med. 176:1191 -1195 (1992) e Shopes1B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividadeanti-tumor aumentada podem também ser preparados usando-se interligantesheterobifuncionais como descrito em Wolff etal. CancerResearch 53:2560-2565(1993). Alternativamente, um anticorpo que possui regiões Fc dupla pode serengenheirado e pode através disso ter aumento de capacidades de Iise decomplemento e de ADCC. Ver Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989).

Documento WO 00/42072 (Presta, L.) descreve anticorpos comfunção ADCC melhorada na presença de células efetoras humanas, onde osanticorpos compreendem substituições de aminoácidos na região Fc region deste.Preferivelmente, o anticorpo com ADCC melhorada compreende substituiçõesnas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos Eu).Preferivelmente, a região Fc alterada é uma região Fc IgGI humana quecompreende ou que consiste de substituições em uma, duas ou três destasposições. Tais substituições são opcionalmente combinadas com substituiçõesque aumentam ligação C1q e/ou CDC.

Anticorpos com ligação C1q alterada e/ou citotoxicidade dependentede complemento (CDC) estão descritos no documento WO 99/51642, patente US6.194.551 B1, patente US 6.242.195B1, patente US 6.528.624B1 e patente US6.538.124 (Idusogie et al.). Os anticorpos compreendem uma substituição deaminoácido em uma ou mais das posições do aminoácido 270, 322, 326, 327,329, 313, 333 e/ou 334 da região Fc destes (numeração de resíduos Eu).Substituições de um ou mais resíduos nas posições 326, 327, 333 e/ou 334podem melhorar ligação C1q e/ou função CDC.

Para aumentar a meia vida do soro do anticorpo, alguém podeincorporar um epitopo de ligação do receptor de resgate no anticorpo(especialmente um fragmento de anticorpo) como descrito na Patente US5.739.277, por exemplo. Como usado na presente invenção, o termo "epitopo deligação do receptor de resgate" refere-se a um epitopo da região Fc de umamolécula IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável poraumentar in vivo a meia vida do soro da molécula de IgG.

Anticorpos com ligação melhorada para o receptor Fc neonatal(FcRn), e meia vida do soro aumentada estão também descritos no documentoWO 00/42072 (Presta, L.) e patente US 2005/0014934A1 (Hinton et a/.). Estesanticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nesteque melhoram ligação da região Fc a FcRn. Por exemplo, a região Fc pode tersubstituições em uma ou mais posições 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305,307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424,428 or434 (numeração de resíduos Eu). O anticorpo variante que compreende a regiãoFc preferida com ligação FcRn melhorada compreende substituições deaminoácidos em uma, duas ou três das posições 307, 380 e/ou 434 da região Fc(numeração de resíduos Eu).

Anticorpos engenheirados com três ou mais (preferivelmente quatro)sítios de ligação antígeno funcional estão também contemplados (pedido US2002/0004587 A1, Miller et ai).

V. Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas dos antagonistas ou anticorpos usados deacordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento pelamistura do antagonista ou anticorpo que tem o grau desejado de purificação comveículos opcionais farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes,(Remington1S Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na formade formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos aceitáveis, excipientesou estabilizantes não tóxicos para receptores nas dosagens e concentraçõesempregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidosorgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (talcomo octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto debenzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzil; alcila parabenostais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; em-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que aproximadamente10 resíduos); proteínas, tais como soro de albumina, gelatina, ou imunoglobulinas;polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina,glutamina, asparagina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, eoutros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes talcomo EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formaçãode sais de contra íons tais como sódio; complexos de metal (por exemplo,complexo proteína Zn); e/ou surfactantes não-iônicos tais como TWEEN™,PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

Formulações de anicorpo anti-CD20 exemplares estão descritas nodocumento WO 1998/56418. Esta publicação descreve uma formulação líquidamultidose que compreende 40 mg/ml d rituximab, 25 mM de acetato, 150 mM detrealose, 0,9% de álcool benzil, 0,02% de polisorbato 20 em pH 5,0 que tem umavida mínima de armazenamento em prateleira de dois anos a 2-8°C. Outraformulação de anticorpo anti-CD20 de interesse compreende 10mg/ml de derituximab em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 7,35 mg/ml de diidrato citrato desódio, 0,7 mg/ml de polisorbato 80 e água estéril para injeção, pH 6,5.

Formulações Iiofilizadas adaptadas para administração subcutâneaestão descritos na patente US 6.267.958 (Andya et.al). Tais formulaçõesliofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequado para uma altaconcentração de proteína e a formulação reconstituída pode ser administradasubcutaneamente para o sujeito a ser tratado na presente invenção.

A formulação da presente invenção pode também conter mais queum componente ativo (como segundo medicamento como apontado acima) comonecessário, preferivelmente aqueles com atividades complementares que nãoafetem contrariamente um ao outro. O tipo e quantidades eficazes de taismedicamentos dependem, por exemplo, da quantidade de antagonista ouanticorpo presente na formulação, e parâmetros clínicos dos sujeitos sendotratados. Tais medicamentos preferidos estão apontados abaixo.

Os ingredientes ativos podem também ser colocados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou porpolimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas degelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemasde distribuição coloidal de droga (por exemplo, lipossomos, microesferas dealbumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou emmacroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em Remington's PharmaceuticalSciences 16a edição, Osol1 A. Ed. (1980).

Preparações de liberação contínua podem ser preparadas.

Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizessemipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o antagonista ouanticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo,filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação contínua incluempoliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), oupoli(vinilálcool)), polilactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável,copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRONDEPOTJTM™ (microesferas injetáveis compostas de copolímeros ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)- 3-hidroxibutírico.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devemser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membrana defiltração estéril.

VI. Artigos De Fabricação

Em outra realização da invenção, são fornecidos artigos defabricação que contêm materiais úteis para o tratamento de IBD descrita acima.

Em um aspecto, o artigo de fabricação compreende (a) um recipiente quecompreende um antagonista (por exemplo, um anticorpo) que se liga a ummarcador de superfície de célula B (por exemplo, CD20), opcionalmente em umveículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, e (b) uma bula com instruçõespara tratar IBD em um sujeito humano.

Em todos estes aspectos, a bula está no recipiente ou associada aeste. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas,etc. Os recepientes podem ser formados de uma variedade de materiais taiscomo vidro ou plástico. O recipiente inclui ou contém uma composição que éeficaz para tratar IBD e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, orecipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possuiuma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos umagente ativo na composição é o antagonista ou anticorpo da invenção. O rótuloou bula indicam que a composição é usada para o tratamento de um sujeitoelegível para tratamento, por exemplo, aquele que tem ou está pré-disposto a IBD,incluindo IBD ou UC moderada-severa, com guias específicos com respeito àsquantidades e intervalos de dosagem do anticorpo e qualquer outro medicamentosendo fornecido. O artigo de fabricação pode, além disso, compreender umrecipiente adicional que compreende um tampão diluente farmaceuticamenteaceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), fosfato salinotamponado, solução de Ringer e/ou solução de dextrose. O artigo de fabricaçãopode, além disso, incluir outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vistacomercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas eseringas.

O artigo de fabricação da presente invenção opcionalmente tambémcompreende um recipiente que compreende um segundo medicamento, em que oanticorpo é um primeiro medicamento, e cujo artigo também compreendeinstruções na bula para tratamento do sujeito com um segundo medicamento, emuma quantidade eficaz. O segundo medicamento pode ser qualquer um daquelesestabelecidos acima, com um segundo medicamento exemplar sendo umaminosalicilato, um corticoesteróide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) e/ouazatioprina.

Detalhes adicionais da invenção estão ilustrados pelos seguintesExemplos não limitantes. As divulgações de todas as citações na especificaçãoestão expressamente incorporadas na presente invenção pela referência.

Exemplo 1

Terapia de IBD

Esta é uma avaliação de rituximab em sujeitos humanos com UCativa como definido nos critérios de inclusão. Dados de microarranjo de genedemonstraram que genes de célula B e expressão de CD20 são regulados paracima em UC humana. Este exemplo fornece um protocolo para terapia de sujeitoscom UC.

Esquema de estudo para este protocolo descrito na Fig.4.

A terapia da presente invenção inclui um período de seleção deaproximadamente 2 semanas, um período de estudo de aproximadamente 24semanas, e um período de follow-up de 24 semanas. Avaliações rigorosas desegurança serão realizadas por todo o estudo. O período de seleção do Dia 14 aoDia 0 inclui um histórico médico, exame físico, avaliações laboratoriais, coleção dedados diários, e uma sigmoidoscopia flexível com biópsias para confirmar adoença ativa e determiner a pontuação do índice de Atividade da Doença (DAI). Apontuação DAI é usada para identificar sujeitos potenciais para cadastramento noestudo e para avaliar a atividade clínica de rituximab.

Sujeitos irão receber 1 grama de infusão intravenosa (IV) derituximab (ou placebo) nos Dias 1 e 15. Todos os sujeitos irão continuarem dosesestáveis de uma ou mais das seguintes por pelo menos Semana 8: umaminosalicilato, um corticoesteróide oral, 6 MP e/ou azatioprina. O monitoramentode segurança com exames laboratoriais e avaliações físicas serão realizados emtodas as visitas do estudo. Após as visitas do Dia 1 e 15, os sujeitos terão umprograma de visita cada 4 semanas a 24 semanas e então cada 3 meses a 48semanas. Além disso, os sujeitos irão retornar no Dia 2 e Dia 16 somente paraamostras faramacocinéticas (PK). A repetição de sigmoidoscopia flexível combiópsias pode ser realizada na Semana 8 para histologia, avaliação da doença eavaliação da depleção de célula B da mucosa. Uma sigmoidoscopia adicional combiópsias pode ser realizada na Semana 24 para avaliação do estado da doença erecuperção de depleção de célula B na mucosa colônica. A avaliação histológicade inflamação nas espécimes de biópsia serão pontuadas de acordo com umaescala padrão (Geboes et ai, Gut 47:404-409 (2000)).

Uma pontuação DAI será calculada na Semana 8 para determinar aproporção de sujeitos que alcançaram remissão da doença. A pontuação DAItambém será calculada na visita da Semana 24. Uma avaliação será realizada nasvisitas quando uma sigmoidoscopia flexível não for realizada (isto é, nos Dias 1 e15 e Semanas 4, 12, 16, 20, 36 e 48). Os sujeitos irão ser acompanhados peloinvestigador e pelo patrocinador até a Semana 48 ou até a recuperação de célulaB, qualquer que seja o tempo. A recuperação de célula B é definida como níveisde célula B que retornaram aos parâmetros iniciais (Dia 1) ou ao mais baixo limitedo normal.Este exemplo fornece uma avaliação da segurança e tolerância derituximb em sujeitos adultos com UC ativa. A medida do resultado de segurançaprimária é a freqüência de eventos alcançados de exacerbações de UC definidasno protocolo (agravamento da doença).

A avaliação de célula B irá continuar até a semana 48 ourecuperação de célula B1 qualquer que seja o tempo.

Este exemplo também avalia a atividade clínica terapêutica derituximab em UC usando-se o sistema de pontuação DAI como definido abaixo. Osistema de pontuação DAI para avaliação da atividade UC foi usado empesquisas clínicas centrais (Schroeder et ai, N Engl J Med 317:1625-1629(1987)). A remissão dos sinais e sintomas da doença ativa, como evidenciadopelo cessamento do sangramento retal e cicatrização da mucosa frágil, foiescolhido como um ponto final secundário para a atividade clínica. A duração daremissão também será medida. Os resultados de sigmoidoscopia flexível epontuação DAI da Semana 24 e follow-up clínico até Semana 48 irão permitir aavaliação da duração dos efeitos terapêuticos.

Medidas De Resultados

Medida de Resultado de Segurança Primária

A medida do resultado de segurança primária é a freqüência deeventos alcançados de exacerbações de UC definidas no protocolo que ocorremdurante o período de estudo (Dia 1 até Semana 24).

Uma exacerbação de UC definida no protocolo deve satisfazer umou mais dos seguintes critérios:

• Um aumento £3 na pontuação DAI

Megacólon tóxico suspeito ou iminente

• Necessidade de hospitalização por uma exacerbação de UC

• No julgamento clínico do investigador, agravação significante do ponto devista médico da doençaMedidas de Resultados Secundários

Medidas de resultados secundários são as seguintes:

• Outra medida de resultado de segurança

• Incidência de infecções sérias, definidas como infecções que requeremhospitalização ou antibióticos IV

• Incidência de todos os eventos adversos (sérios e não sérios) graduadosde acordo com o Critério de Toxicidade Comum de Eventos Adversos doIstituto do Câncer (NCI-CTCAE), versão 3.0

• Incidência de anormalidades clínicas Iaboratorias

• Proporção de sujeitos que alcançaram remissão da doença na Semana 8.

• Remissão da doença é definida como uma pontuação de sigmoidoscopiade O a 1 (sem fragilidade) e pontuação de sangramento retal de 0.

• Proporção de sujeitos que alcançaram resposta clínica na Semana 8.

• Resposta clínica é definida como uma redução de £3 pontos na pontuaçãoDAI.

• Tempo de remissão da doença

• Duração da remissão da doença como determinado pelo investigador

• Mudança nos parâmetros durante o período de estudo nos resultados doQuestionário de Doença Inflamatória do Intestino (IBDQ).

Os efeitos de rituximab em diversos marcadores celulares serãoexaminados pela comparação do sangue, soro e amostras de tecidos noparâmetro inicial e durante o tratamento. As avaliações são como segue:

• Painel de linfócitos no sangue com contagem de célula B (CD19+ e outrossubgrupos de célula B).

• Níveis de Ig no soro (IGA, IgG e IgM total)

• Anticorpos específicos para UC (p-ANCA)

• Depleção de célula B em biópsias colônicas, como medido porimunohistoquímica (IHC)Sujeitos

Critério de Inclusão

Os sujeitos devem apresentar os seguintes critérios para seremelegíveis para entrada no estudo

• Consentimento informado por escrito

• Idade entre 18-75 anos e capaz de entender os procedimentos do estudo

• Diagnóstico de UC >6 meses na selação

• >20 cm de doença ativa na seleção de sigmoidoscopia

• Doença ativa, como definido por uma pontuação DAI entre >6 e <11, comsangramento retal >2 e sigmoidoscopia flexível >2 na seleção

• Tratamento com corticoesteróides oral para UC dentro de 2 anos antes daseleção

• A intensidade do tratamento deve ter sido igual ou maior que uma doseequivalente de prednisona de 20 mg/dia por pelo menos 2 semanas deduração

• Colonoscopia dentro dos 2 anos anteriores para extensão da doença epara excluir pólipos

• Colonoscopia com biópsia apropriada para excluir displasia dentro de 1 anoantes da seleção se a doença UC >10 anos

• Para sujeitos com potencial reprodutivo (homens e mulheres), o uso de ummeio confiável de contracepção (por exemplo, hormônio contraceptivo,adesivo, anel vaginal, dispositivo intrauterino, barreira física) durante oestudo do tratamento e por 1 ano seguindo a última dose do estudo.

• Retirada de todas as terapias biológicas investigativas prévias (porexemplo, etanercept, infliximab, adalimumab, rituximab) em pelo menos 15semanas antes da randomização

• Tratamento atual com uma ou mais das seguintes terapias em uma doseestável para o período indicado antes do parâmetro inicial (Dia 1).Aminosalicilato, dose estável por >3 semanas

Corticoesteróides orais, dose estável por >2 semanas

Tratamento com 6-MP para um período de 3 meses, com uma doseestável por >4 semanas

Tratamento com azatioprina por um período de 3 meses, com umadose estável por >4 semanas

• Para as terapias listadas acima que foram usadas anteriormente, mas nãoatualmente no Dia 1, os sujeitos precisam ter descontinuidade deaminosalicilatos por >2 semanas e ter descontinuidade no tratamento comazatioprina, 6-MP ou corticoesteróides orais por >4 semanas antes doparâmetro inicial.

Critério de Exclusão

Os sujeitos que apresentam os seguintes critérios serão excluídos da entrada noestudo:

• Colite severa como evidenciado pelo julgamento do investigador de que éprovável que o sujeito necessite de uma colectomia ou instituição de uminibidor de calcineurina com 12 semanas do parâmetro inicial (Dia 1)

• Suspeita clínica ou evidência por radiografia de perfuração colônica ouMegacólon tóxico

• Histórico de colangite esclerosante primária

• Histórico de displasia colônica e/ou pólipos adenomatosos no cólon

• Tratamento com ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, metotrexato oumicofenolato mofetil dentro de 8 semanas antes da seleção

• Tratamento com uma preparação retal tópica dentro de 2 semanas antesda seleção

• Uso de drogas anti-inflamatórias não esteroidais (NSAIDs) exceto baixasdoses de aspirina dentro de 4 semanas antes do parâmetro inicial

• Fezes positivas para ovos ou parasitas, fezes positivas para cultura depatógenos, ou fezes positivas para toxina de Clostridium difficile na seleçãoReceita/tratamento com qualquer vacina viva dentro de 4 semanas antesda randomização

Tratamento prévio com qualquer terapia não biológica de depleção decélula tal como ADACOLUMN®

Histórico de obstrução ou cirurgia colônica ou do intestino delgadoUso de agentes antidiarréicos durante o período de seleçãoHistórico de hepatite B ou C

Exclusões para Segurança GeralHistórico de reações alérgicas severas ou anafiláticas para anticorposinteiros, quiméricos ou humanizados ou anticorpos monoclonais murinos.Doença cardíaca ou pulmonar significante (incluindo doença pulmonarobstrutiva)

Evidência de doenças concomitantes significantes não controladas, taiscomo doença cardiovascularou do sistema nervoso, disfunção pulmonar,renal, hepática, endócrina ou gatrointestinal

Infecções ativas bacterianas, virais, micobacterianas ou outras (incluindotuberculose ou doença micobacteriana atípica, mas excluindo infecçõesfúngicas de unha) ou qualquer episódio importante que requerhospitalização ou tratamento com antibióticos IV dentro de 4 semanas daselação ou antibióticos orais dentro de 2 semanas da selaçãoHitórico de infecção recorrente significante ou infecções bacterianasrecorrentes

Imunodeficiência primária ou secundária (histórico ou atualmente ativa),incluindo HIV

Histórico de câncer, incluindo tumores sólidos e malignidadeshematológicas (exceto célula basal e carcinomas escamosos da pele queforam retirados e curados)• Mulheres grávidas ou mães amamentando (alimentação do peito)

• Histórico de álcool, droga ou abuso químico dentro de 6 meses antes daseleção

• Falta de acesso venoso periférico

Critério de Exclusão Laboratorial (na Seleção)

• Creatinina do soro >1,4 mg/dl para mulheres ou >1.6 mg/dl para homens

• Aspartato aminotransferase (AST) ou alanina aminotransferase (ALT)>2,5 vezes acima do limite normal

• Contagem de plaqueta <100.ΟΟΟ/μΙ

· Hemoglobina <8,5 g/dl

• Neutrófilos <1500/μΙ

• Contagem de linfócito <100/μΙ

• Hepatite B positiva ou sorologia C

• IgG <5,65 mg/ml

· IgM <0,55 mg/ml

• Contagem de célula B < 1,1 %

• Electrocardiograma (ECG) mostrando uma anormalidade cardíaca que oInvestigador Principal determina que pode comprometer a saúde do sujeitopela participação neste estudo.

Estudo Do Tratamento

Formulação

Rituximab é formulado para administração IV como um produtoestéril em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 0,7 mg/ml de polisorbato 80, 7,35 mg/mlde diidrato citrato de sódio e Água Estéril para Injeção (pH 6,5). O anticorpo éfornecido para uso mercadológico em frascos de 10 ml e 50 ml a umaconcentração de 10,0 mg/ml. Os frascos de 10 ml contêm 100 mg do anticorpo Osfrascos de 50 ml contêm 500 mg do anticorpo Não é usado conservante porque ofrasco é projetado para dose única. Serão fornecidos aos locais de estudo frascosde 50 ml de 500 mg de rituximab e frascos de 50 ml de mistura placebo.

Dosagem, Administração ε Armazenamento

O estudo do tratamento irá consistir de 1g de rituximab ou placeboequivalente administrado IV nos Dias 1 e 15. Os sujeitos irão receber tratamentoprofilático com acetaminofeno (1 g) e difenidramina HCI (50 mg), ou seusequivalentes, por mês 30-60 minutos antes do início de cada infusão. Os sujeitospodem ser hospitalizados para observação, particularmente para sua primeirainfusão, a critério do investigador. Rituximab deve ser administrado sob atentasupervisão, e os aparelhos de ressuscitação total devem estar imediatamentedisponíveis. Se uma exacerbação de UC definida no protocolo ocorre antes dasegunda infusão, a segunda infusão será contida.

Soluções de rituximab para infusão são estáveis a 2°C-8°C (36°F-46°F) por 24 horas e em temperatura ambiente por 24 horas adicionais. Nãoutilizardepois da data de validade impressa na caixa. Nenhuma incompatibilidadeentre rituximab e cloreto de polivinil ou bolsas de polietileno foram observadas.

Terapias Concomitantes ε Excluídas

Antes do parâmetro inicial (Dia 1), todos os sujeitos estarão emdoses estáveis de um aminosalicilato, um corticoesteróide oral, 6-MP, e/ouazatioprina por períodos variáveis antes do parâmetro inicial. Portodo o estudo eperíodos de follow-up, os sujeitos devem manter suas doses constantes deaminosalicilato, 6-MP e/ou azatioprina. Doses de corticoesteróides orais devempermanecer estáveis até após a Semana 8, se aceitável sob o ponto de vistamédico. A diminuição deve ser instituída se indicado sob o ponto de vista médicoapós a semana 8.

Terapias para condições da doença exceto UC podem sercontinuadas, exceto como apontado acima. O uso de vírus vivo ou vacinas debactérias é proibido do Dia-28 até o final do período de estudo. Estas vacinaspodem incluir, mas não estão limitadas para, sarampo, caxumba, rubéola, pólio,bacilo de Calmette-Guerin, febre amarela e TY21a tifóide. Vacinas que nãocontêm organismos vivos (por exemplo, influenza, Pneumovax®, tétano) não sãoproibidas, mas podem não ser eficazes. É recomendável que um registro devacinação no sujeito e possíveis requisitos sejam revisados, e, se necessário,qualquer vacinação/reforço necessário seja dado em pelo menos 28 dias antes doinício do estudo do tratamento da droga.

O tratamento com ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, metotrexato oumicofenolato mofetil é proibido dentro de 8 semanas da seleção e durante oestudo. Ciclosporina em qualquer formulação pode ser usada de acordo com ocritério do investigador como uma medicação de resgate para uma exacerbaçãode UC definida no protocolo. Se a medicação de resgate é necessária antes daSemana 8, o sujeito será considerado um não responsivo, mas deve continuarcom as visitas de estudo programadas.

Outras medicações excluídas durante o período de estudo são comosegue:

• Antibióticos para tratar UC

Antibióticos podem ser usados para tratar infecções como indicadas deacordo com critérios médicos, mas não como uma terapia de UC.

• NSAIDs, com exceção de aspirina em dose baixa para profilaxiacardiovascular.

• Terapias retais tópicas para UC

• Antid iarréicos

• Laxantes

• Ligantes de ácido biliar tal como colestiramina

Drogas ou tratamentos de investigação são proibidos

Métodos Do Teste

Amostras de soro serão obtidas para análise PK e HACA emperíodos de tempo de acordo com o cronograma de avaliação.O teste imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) PK de rituximabserá usado para medir o nível de rituximab em amostras de soro humanas.

O rituximab HACA ELISA é um teste de ligação, que utiliza rituximabcomo o reagente de captura e rituximab biotinilado e estreptavidina-HRP paradeleção. O teste usa um calibrador de curva preparado com anticorpos policlonaisde cabra purificados para afinidade a rituximab, então, os resultados deste testesão relatados relativos a este anticorpo policlonal em termos de unidadesrelativas.

Todas as análises p-ANCA serão realizadas por um laboratóriocentral. Imunfluorescência indireta será usada para detrminar a presença deANCAs. Além disso, testes ELISA podem ser usados para determinar aespecificidade de ANCA para mieloperoxidase ou outros antígenos relevantescomo determinado pelo laboratório central.

Análise da Atividade Clínica

A atividade clínica de rituximab em UC será avaliada. As proporçõesde sujeitos que sentem remissão da doença e as proporções de sujeitos querespondem clinicamente na Semana 8 serão estimadas e intervalos de confiançaque correspondem a 95% serão gerados para cada braço de tratamento. Asdiferenças de tratamento e intervalos de confiança de 95% serão fornecidos.

A duração da remissão da doença será resumida pelo braço detratamento. O tempo médio de resposta para remissão da doença sera resumidopara cada braço de tratamento usando-se o método Kaplan-Meier somente parapropósitos descritivos.

Sujeitos com UC ativa tratados com anticorpo rituximab comodescrito acima, irão sentir uma melhora nos sinais e sintomas de UC, incluindoremissão da doença e/ou resposta clínica (atingida pela semana 8), a obtenção deuma pontuação de sigmoidoscopia de 0 ou 1, e pontuação de sangramento retalde 0, uma redução na pontuação DAI (para mais ou igual a 3 pontos), umaredução na células na mucosa colônica, e/ou uma redução no nível do anticorpop-ANCA.

A partir do aqui descrito, será apreciado que, embora realizaçõesespecíficas da invenção tenham sido descritas na presente invenção parapropósitos de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem se afastar doescopo e espírito da invenção. Consequentemente, a invenção não está limitadaexceto pelas reivindicações anexas.Listagem de Seqüência

<110> Sheila Gujrathi

<120> TRATAMENTO DE DOENÇA INFLAMATÓRIA DO INTESTINO (IBD)

<130> P2211R1

<141> 13-04-2006

<150> US 60/671,902<151> 15-04-2005

<160> 24

<210> 1<211> 107<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 1

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro15 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro35 40 45

Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser65 70 75

Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp80 85 90

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu95 100 105

Lys Arg

<210> 2<211> 107<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

80 85 90

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

95 100 105

Lys Arg

<210> 3<211> 108<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90

Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 4<211> 10<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 4

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

5 10<210> 5<211> 7<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 5

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser

<210> 6<211> 9<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 6

Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

<210> 7<211> 122<212> PRT

<213> Mus musculus

Val Arg Pro Gly

Tyr Thr Phe Thr30

Arg Gln Gly Leu45

Asp Thr Ser Tyr60

Val Asp Lys Ser75

Thr Ser Glu Asp90

Tyr Ser Asn Ser105

Thr Val Thr Val120

Ser Ser

<210> 8<211> 122<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

Gln Ala1

Tyr LeuAla Ser Val Lys

Ser Tyr Asn MetGlu Trp Ile GlyAsn Gln Lys PheSer Ser Thr AlaSer Ala Val TyrTyr Trp Tyr Phe

Gln Gln5

Met Ser20

His Trp35

Ala Ile50

Lys Gly65

Tyr Met80

Phe Cys95

Asp Val

110

Ser Gly AlaCys Lys AlaVal Lys GlnTyr Pro GlyLys Ala ThrGln Leu SerAla Arg ValTrp Gly Thr

Glu Leu10

Ser Gly25

Thr Pro40

Asn Gly55

Leu Thr70

Ser Leu85

Val Tyr

100

Gly Thr

115<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser95 100 105

Tyr T.rp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120

Ser Ser

<210> 9<211> 119<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Leu Thr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu

95 100 105Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115

<210> 10<211> 10<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 10

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His

5 10

<210> 11<211> 17<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 11

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe15 10 15

Lys Gly

<210> 12<211> 13<212> PRT

<213> Mus musculus<4 00> 12

Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

5 10

<210> 13<211> 213<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp80 85 90Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

95 100 105

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

110 115 120

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

125 130 135

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

140 145 150

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

155 160 165

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

170 175 180

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

185 190 195

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

200 205 210

Gly Glu Cys

<210> 14<211> 452<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<4 00> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr

50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser

95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

110 115 120Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

200 205 210

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

215 220 225

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

320 325 330

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

335 340 345

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

350 355 360

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

365 370 375

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

380 385 390

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

395 400 405

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser410 415 420Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe425

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln440

Gly Lys

Ser Cys Ser Val Met His Glu

430 435

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

445 450

<210> 15

<211> 213<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

80 85 90

Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

95 100 105

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

110 115 120

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

125 130 135

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

140 145 150

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

155 160 165

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

170 175 180

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

185 190 195Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg200 205 210

Gly Glu Cys

<210> 16<211> 452<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys200 205 210

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys215 220 225Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

320 325 330

Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys

335 340 345

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

350 355 360

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

365 370 375

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

380 385 390

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

395 400 405

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

410 415 420

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

425 430 435

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

440 445 450

Gly Lys

<210> 17<211> 451<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

_<223> Seqüência é Sintetizada<4 00> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys200 205 210

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys215 220 225

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

320 325 330

J Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

335 340 345

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

350 355 360

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

365 370 375

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

380 385 390

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

395 400 405

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

410 415 420

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

425 430 435

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

440 445 450

Gly

<210> 18<211> 107<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

80 85 90

Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

95 100 105Lys Arg

<210> 19<211> 122<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr

50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg

95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

110 115 120

Ser Ser

<210> 20<211> 451<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr50 55 60Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys200 205 210

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys215 220 225

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln290 295 300

Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn320 325 330

Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys335 340 345

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg350 355 360Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

365 370 375

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

380 385 390

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

395 400 405

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

410 415 420

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

425 430 435

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

440 445 450

Gly

<210> 21<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<220><221> Xaa<222> 9

<223> Xaa is M or L<400> 21

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa His

5 10

<210> 22<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<220><221> Xaa<222> 4

<223> Xaa is S or A<400> 22

Gln Gln Trp Xaa Phe Asn Pro Pro Thr

5

<210> 23<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<220><221> Xaa<222> 8

<223> Xaa is D or A<400> 23

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe1 5 10 15

Lys Gly

<210> 24<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<220><221> Xaa<222> 6

<223> Xaa is Ν, A, Y, W or D

<220><221> Xaa<222> 7

<223> Xaa is S or R

<400> 24

Val Val Tyr Tyr Ser Xaa Xaa Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

5 10

Claims (57)

1. MÉTODO DE TRATAMENTO DE DOENÇA INFLAMATÓRIADO INTESTINO (IBD) moderada a severa em um sujeito humano, caracterizadopelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de umanticorpo CD20, em que a administração do anticorpo resulta em uma respostaclínica ou remissão da doença.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a IBD é colite ulcerativa (UC).

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a IBD é doença de Crohn.

4. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que o sujeito possui IBD ativa.

5. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo resulta em remissãoda doença.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a remissão é alcançada aproximadamente na semana 8.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5 ou 6,caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo resulta em umapontuação de sigmoidoscopia de 0 a 1 e pontuação de sangramento retal de 0.

8. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 7,caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo resulta em umaresposta clínica.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a resposta clínica é alcançada aproximadamente na semana 8.

10. MÉTODO, de acordo com a reivinidicação 8 ou 9,caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo reduz a pontuação doíndice de atividade da doença (DAI).

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a pontuação DAI, pontuada usando-se o sistema de pontuaçãoconforme descrito na Tabela 2, é reduzida para mais ou igual a 3 pontos.

12. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 11,caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo reduz células B namucosa colônica.

13. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humano ouhumanizado.

14. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 13,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende rituximab.

15. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 13,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 2H7 humanizado.

16. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 13,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 2F2 (huMax-CD20).

17. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 16,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo nu.

18. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 16,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado com outra molécula.

19. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 18,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado como uma dose nafaixa de cerca de 200 mg a 2000 mg em uma freqüência de cerca de uma aquatro doses dentro de um período de cerca de um mês.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a dose está na faixa de cerca de 500 mg a 1500 mg.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que a dose está na faixa de cerca de 750 mg a-1.200 mg.

22. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 19 a 21,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado em uma ou duas doses.

23. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 19 a 22,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado dentro de um períodode cerca de 2 a 3 semanas.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que o período é de cerca de duas semanas.

25. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 24,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado intravenosamente.

26. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 25,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado subcutaneamente.

27. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 26,caracterizado pelo fato de que um segundo medicamento é administrado em umaquantidade eficaz, em que o anticorpo CD20 é um primeiro medicamento.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o segundo medicamento é mais do que um medicamento.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27 ou 28,caracterizado pelo fato de que o segundo medicamento é selecionado do grupoque consiste de aminosalicilato, um corticoesteróide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) e azatioprina.

30. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 27 a 29,caracterizado pelo fato de que o segundo medicamento é administrado em umaquantidade mais baixa do que é usada se o anticorpo CD20 não é administrado aum sujeito tratado com o segundo medicamento.

31. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 30,caracterizado pelo fato de que o sujeito nunca foi previamente tratado com umanticorpo CD20.

32. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 31,caracterizado pelo fato de que o sujeito não está sofrendo de uma malignidade decélula B.

33. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 32,caracterizado pelo fato de que o sujeito não está sofrendo de uma doençaautoimune, diferente de IBD.

34. MÉTODO DE TRATAMENTO DE DOENÇA INFLAMATÓRIADO INTESTINO (IBD), em um sujeito humano com IBD ativa, caracterizado pelofato de que compreende administrar somente uma ou duas doses de umanticorpo CD20 ao sujeito, em que a remissão da doença ou resposta clínica éalcançada pela administração de uma ou duas doses do anticorpo CD20.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que uma ou duas doses são administradas intravenosamente (IV).

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que uma ou duas doses são administradas subcutaneamente (SQ).

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que duas doses intravenosas são administradas, em que cada umadas duas doses está na faixa de cerca de 200 mg a cerca de 2000 mg.

38. MÉTODO DE TRATAMENTO DE DOENÇA INFLAMATÓRIADO INTESTINO (IBD), em um sujeito humano com IBD ativa, caracterizado pelofato de compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpoCD20 e também compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de umsegundo medicamento selecionado do grupo que consiste de um aminosalicilato,um corticoesteróide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) e azatioprina.

39. MÉTODO DE REDUÇÃO DE UMA PONTUAÇÃO DO ÍNDICEDE ATIVIDADE DA DOENÇA (DAI), em um sujeito humano com colite ulcerativaativa (UC), caracterizado pelo fato de compreende administrar um anticorpo CD20ao sujeito em uma quantidade eficaz para reduzir a pontuação DAI.

40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a pontuação DAI1 pontuada usando-se o sistema de pontuaçãoconforme descrito na Tabela 2, é reduzida para mais ou igual a 3 pontos.

41. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 40,caracterizado pelo fato de que o sujeito possui um nível atípico de anticorpocitoplasmático anti-neutrófilo perinuclear (p-ANCA) ou auto-anticorpo isoforma 5tropomiosina anti-humana (hTM5).

42. ARTIGO DE FABRICAÇÃO, caracterizado pelo fato de quecompreende:i. um recipiente que compreende um anticorpo CD20; eii. uma bula com instruções de uso para tratar doençainflamatória do intestino (IBD) em um sujeito humano, em queas instruções indicam que uma quantidade eficaz do anticorpoCD20 é administrada ao sujeito humano.

43. USO DE UM ANTICORPO CD20, caracterizado pelo fato deser na fabricação de um medicamento para tratar uma doença inflamatória dointestino (IBD) moderada a severa em um sujeito.

44. USO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelofato de que a IBD é colite ulcerativa (UC).

45. USO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelofato de que a IBD é doença de Crohn.

46. USO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 45,caracterizado pelo fato de que o sujeito possui IBD ativa.

47. USO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 46,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humano ouhumanizado.

48. USO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 47,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende rituximab.

49. USO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 47,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 2H7 humanizado.

50. USO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 47,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 2F2 (huMax-CD20).

51. USO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 50,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo nu.

52. USO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 50,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado com outra molécula.

53. USO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 52,caracterizado pelo fato de que o sujeito nunca foi previamente tratado com umanticorpo CD20.

54. USO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 53,caracterizado pelo fato de que o sujeito não está sofrendo de uma malignidade decélula B.

55. USO DE UM ANTICORPO CD20, caracterizado pelo fato deser na fabricação de um medicamento para reduzir uma pontuação do índice deatividade da doença (DAI) em um sujeito humano com colite ulcerativa ativa (UC).

56. USO, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelofato de que a pontuação DAI, pontuada usando-se o sistema de pontuaçãoconforme descrito na Tabela 2, é reduzida para mais ou igual a 3 pontos.

57. USO, de acordo com uma das reivindicações 43 a 56,caracterizado pelo fato de que o sujeito possui um nível atípico de anticorpocitoplasmático anti-neutrófilo perinuclear (p-ANCA) ou auto-anticorpo isoforma 5tropomiosina anti-humana (hTM5).