ES2347241T3 - Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones. - Google Patents

Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones. Download PDF

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Camellia W. Adams
Andrew C. Chan
Craig W. Crowley
Henry B. Lowman
Gerald R. Nakamura
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Abstract

Anticuerpo CD20 anti-humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo comprende la secuencia VH de SEC ID No. 8 mostrada en la figura 1B (2H7.v16) y la secuencia VL de SEC ID No. 2 mostrada en la figura 1A (2H7.v16).

Description

Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CD-20 y su utilización en el tratamiento de enfermedades relacionadas con las células B.
Antecedentes de la invención
Los linfocitos son una de las diversas poblaciones de glóbulos blancos; reconocen específicamente y responden a antígenos extraños. Las tres clases principales de linfocitos son los linfocitos B (células B), linfocitos T (células T) y células "asesinas" naturales (NK). Los linfocitos B son las células responsables para la producción de anticuerpos y proporcionan inmunidad humoral. Las células B maduran en la médula ósea y dejan la médula expresando un anticuerpo de unión a antígeno en su superficie celular. Cuando una célula B intacta se encuentra primero con el antígeno por el que su anticuerpo unido a membrana es específico, la célula empieza a dividirse rápidamente y su progenie a diferenciarse en células B de memoria y células efectoras denominadas "células plasmáticas". Las células B de memoria presentan un tiempo de vida más largo y continua para expresar el anticuerpo unido a membrana con la misma especificidad que la célula parental original. Las células plasmática no producen anticuerpo unido a membrana, sino que en cambio producen la forma secretada del anticuerpo. Los anticuerpos secretados son las moléculas efectoras principales de la inmunidad humoral.
El antígeno CD20 (también denominado antígeno de diferenciación limitado a linfocitos B humanos, Bp35) es una proteína transmembrana hidrofóbica con un peso molecular de aproximadamente 35 kD situada en pre-linfocitos B y linfocitos B maduros (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989); y Einfeld et al. EMBO J. 7(3):711-717 (1988)). El antígeno también se expresa en más del 90% de los linfomas no de Hodgkin (NHL) de células B (Anderson et al. Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), pero no se encuentra en células madre hematopoyéticas, pro-células B, células plasmáticas normales u otros tejidos normales. (Tedder et al. J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). Se cree que D20 regula una etapa o etapas tempranas en el proceso de activación para el inicio del ciclo celular y la diferenciación (Tedder et al., supra) y posiblemente funciona como canal de iones de calcio (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)).
Dada la expresión de Cd20 en linfomas de células B, este antígeno ha sido una diana terapéutica útil para tratar dichos linfomas. Hay más de 300.000 personas en los Estados Unidos con NHL de células B y se diagnostican cada año más de 56.000 nuevos casos. Por ejemplo, el anticuerpo rituximab (RITUXAN®) que es un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico diseñado genéticamente dirigido contra el antígeno CD20 humano (disponible comercialmente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, U.S.) se utiliza para el tratamiento de pacientes con un linfoma no de Hodgkin de células B, positivas de CD20, de grado bajo o folicular recidivante o refractario. Rituximab es el anticuerpo referido como "C2B8" en la Patente de Estados Unidos No. 5,736,137 concedida el 7 de abril de 1998 (Anderson et al.) y en la Patente de Estados Unidos No. 5,776,456. El mecanismo in vitro de estudios de acción han demostrado que el RITUXAN® se une al complemento humano y lisa líneas de células B linfoides a través de la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). Adicionalmente, tiene una actividad significativa en pruebas para la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Los estudios preclínicos in vivo han mostrado que el RITUXAN® reduce las células B de la sangre periférica, nódulos linfáticos y médula ósea de monos cynomolgus, presumiblemente a través de complemento y procesos mediados por células (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). Otros anticuerpos anti-CD20 indicados para el tratamiento de NHL incluyen el anticuerpo murino Zovalin^{TM} que está unida al radioisótopo, Ytrio-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), Bexxar^{TM} que es otro anticuerpo totalmente murino conjugado a I-131 (Corixa, WA).
Una limitación principal en la utilización de anticuerpos murinos en terapia humana es la respuesta del anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) (véase, por ejemplo, Miller, R.A. et al. "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma" Blood, 62:988-995, 1983; and Schroff, R.W., et al. "Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy" Cancer Res. 45:879-885, 1985). El documento US 5 576 195 describe un anticuerpo anti-CD20 quimérico con CDRs representadas como SEC ID Nos. 4, 5, 6 y 10, 11 y 12 tal como se describen aquí. Incluso las moléculas quiméricas, donde los dominios variables (V) de anticuerpos de roedores se fusionan a regiones constantes (C) humanas son capaces de producir una respuesta inmune significativa (HACA, anticuerpos humano anti-quimérico) (Neuberger et aL Nature (Lond.), 314:268-270, 1985). Una estrategia potente para superar estas limitaciones en el uso clínico de anticuerpos monoclonales es la "humanización" del anticuerpo murino o anticuerpo de una especie no humana (Jones et al. Nature (Lond), 321:522-525,1986; Riechman et al., Nature (Lond), 332:323-327, 1988).
De este modo, es ventajoso producir anticuerpos terapéuticos para el antígeno CD20 que crean una antigenicidad mínima o nula cuando se administran a los pacientes, especialmente para el tratamiento crónico. La presente invención satisface ésta y otras necesidades. La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD20 que superan las limitaciones de las composiciones terapéuticas actuales y ofrece ventajas adicionales que serán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente.
Descripción resumida de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos de unión a CD20 anti-humanos o fragmentos funcionales de los mismos tal como se establece en la reivindicación 1, y se refiere a su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con células B. Estos anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos anti-CD20 descritos aquí pueden comprender además cambios en los residuos de aminoácidos en la región Fc que conducen a una función efectora mejorada incluyendo una función CDC y/o ADCC mejoradas y la eliminación de las células B (también se refiere aquí como reducción de células B). Los anticuerpos anti-CD20 de la invención incluyen aquellos que tienen cambios específicos que mejoran la estabilidad. Las variantes 2H7 humanizadas con mayor estabilidad se describen en el ejemplo 6 siguiente. En la presente invención se describen variantes deficientes en fucosa con una función ADCC mejorada in vivo están descritos aquí.
En una realización preferida de todas de las composiciones de anticuerpos y los métodos de uso de la presente invención, el anticuerpo de unión CD20 humanizado es 2H7.v16 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de SEC ID NO. 21 y 22 respectivamente, tal como se muestra en la Figura 6 y la Figura 7. Cuando se hace referencia a las secuencias de polipéptido en las Figuras 6, 7 y 8, debe entenderse que los primeros 19 o aproximadamente 19 aminoácidos que forman la secuencia señal secretora no están presentes en el polipéptido maduro. La región V de otras variantes basada en la versión 16 tendrá las secuencias de aminoácidos de v16 excepto de las posiciones de las sustituciones de aminoácidos que se indican en la descripción. A menos que se indique lo contrario, las variantes 2H7 tendrán la misma cadena L que la de v16.
La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado que se une a CD20 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se establece en las reivindicaciones, donde el anticuerpo es efectivo para reducir la células B de primate in vivo. En una realización, las células B de primate son de mono Cynomolgus y de humano.
El anticuerpo de la presente invención comprende la secuencia V_{H} de SEC ID NO.8 de v16, tal como se muestra en la Figura 1B y la secuencia V_{L} de SEC ID NO.2 de v16, tal como se muestra en la Figura 1A.
En otras realizaciones, el anticuerpo humanizado es 2H7 v.31 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de SEC ID NO. 21 y 23, respectivamente, tal como se muestra en la Figura 6 y la Figura 8; 2H7 v.31 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEC ID NO.23 tal como se muestra en la Figura 8.
En realizaciones separadas, el anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriores comprende además por lo menos una sustitución de aminoácido en la región Fc que mejora la actividad CDC y/o ADCC del anticuerpo parental u original, del que derivaba, siendo v.16 el anticuerpo parental con el que se compara en la mayoría de los casos, y Rituxan en otros casos. Uno de dichos anticuerpos con la actividad mejorada comprende la sustitución triple de Alanina de S298A/E333A/K334A en la región Fc. Un anticuerpo que tiene la sustitución S298A/E333A/K334A es 2H7.v31 que tiene la secuencia de aminoácido de la cadena pesada de SEC ID NO.23.
En otra realización, el anticuerpo comprende además por lo menos una sustitución de aminoácido en la región Fc que disminuye la actividad CDC en comparación con el anticuerpo parental del cual derivó que es v16 en la mayoría de los casos. Uno de dichos anticuerpos con menor actividad CDC en comparación con v16 comprende por lo menos la sustitución K322A en la cadena H. La comparación de la actividad ADCC y CDC se puede se puede analizar tal como se describe en los ejemplos.
En una realización preferida, los anticuerpos de la invención son anticuerpos de longitud completa, donde la región V_{H} está unida a la región constante de la cadena pesada de IgG humana. En realizaciones preferidas, la IgG es IgG1 o IgG3 humana.
En una realización, el anticuerpo de unión a CD20 se conjuga con un agente citotóxico. En realizaciones preferidas, el agente citotóxico es una toxina o un isótopo radioactivo.
En una realización, los anticuerpos de la invención para el uso en fines de diagnóstico o terapéutico se producen en células CHO.
También se proporciona una composición que comprende un anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriores y un portador. En una realización, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Se pueden proporcionar estas composiciones en un artículo de fabricación o un kit.
La invención también proporciona una formulación líquida que comprende un anticuerpo 2H7 humanizado a 20 mg/ml de anticuerpo, 10 mM de sulfato de histidina a pH 5,8, 60 mg/ml de sacarosa (6%), 0,2 mg/ml de polisorbato 20 (0,02%).
La invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos aquí, incluyendo un vector de expresión para expresar el anticuerpo.
Otro aspecto de la invención son células huésped que comprenden los ácidos nucleicos anteriores, y las células huésped que producen los anticuerpos. En una realización preferida de éstas últimas, la célula huésped es una célula CHO. Se proporciona un método de producción de estos anticuerpos, comprendiendo el método cultivar la célula huésped que produce el anticuerpo y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.
Todavía otro aspecto de la invención es un artículo de la fabricación que comprende un envase y una composición contenida dentro, donde la composición comprende un anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriores. Para el uso en el tratamiento de NHL, el artículo de fabricación comprende además un prospecto que indica que la composición se usa para tratar un linfoma no de Hodgkin.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método de inducción de apoptosis en células B in vivo, que comprende poner en contacto células B con el anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriores, matando así las células B.
La invención también se refiere a los métodos de tratamiento de las enfermedades descritas aquí mediante la administración de un anticuerpo de unión a CD20 o un fragmento funcional del mismo a un mamífero, tal como un paciente humano que padece la enfermedad. En un método para tratar una enfermedad autoinmune o un cáncer positivo de CD20 el anticuerpo puede ser 2H7v.16 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de SEC ID NO.21 y 22, respectivamente, tal como se muestra en la Figura 6 y la Figura 7. De este modo un método de tratamiento de un cáncer positivo de CD20 puede comprender la administración a un paciente que padece de cáncer de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de unión a CD20 de la invención. El cáncer positivo de CD20 puede ser un linfoma o leucemia de células B, incluyendo linfoma no de Hodgkin (NHL) o enfermedad de Hodgkin predominante de linfocito (LPHD), leucemia linfocítica crónica (CLL) o SLL. En un método de tratamiento de linfoma o leucemia de célula B, se puede administrar el anticuerpo en una dosis en el intervalo de aproximadamente 275-375 mg/m^{2}. El método de tratamiento puede comprender además la administración al paciente de, por lo menos, un agente quimioterapéutico, donde para el linfoma no de Hodgkin (NHL), el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina y prednisolona.
Un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune puede comprender la administración a un paciente que padece la enfermedad autoinmune de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo humanizado que se une a CD20 de cualquiera de las reivindicaciones anteriores. La enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistemático (SLE), la enfermedad de Wegener, enfermedad intestinal inflamatoria, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatía de IgA, polineuropatía de IgM, miastenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis. Cuando la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, se puede administrar el anticuerpo conjuntamente con un segundo agente terapéutico que es preferiblemente metotrexato.
En estos métodos de tratamiento se puede administrar los anticuerpos de unión a CD20 solos o conjuntamente con un segundo agente terapéutico, tal como un segundo anticuerpo, o un agente quimioterapéutico o un agente inmunosupresor. El segundo anticuerpo puede ser uno que se une a CD20 o un antígeno de célula B diferente, o un antígeno de célula T o NK. En una realización, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20 radiomarcado. En otras realizaciones, el anticuerpo de unión a CD20 se conjuga con un agente citotóxico, incluyendo una toxina o un isótopo radioactivo.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune seleccionada del grupo que consiste en dermatomiositis, granulomatosis de Wegener, ANCA, anemia aplásica, anemia hemolítica autoinmune (AIHA), deficiencia del factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, rechazo del trasplante de órgano sólido, enfermedad de huésped contra injerto (GVHD), mediada por IgM, púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), tiroiditis de Hashimoto, hepatitis autoinmune, neumonía intersticial linfática (HIV), bronquiolitis obliterante (no trasplante) vs. NSIP, síndrome de Guillain-Barre, vasculitis de vasos grandes, artritis de células gigantes (de Takayasu), vasculitis de vasos medianos, enfermedad de Kawasaki, poliarteritis nodosa, que comprende la administración a un paciente que padece la enfermedad de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de unión a CD20. En una realización de este método, el anticuerpo de unión a Cd20 es Rituxan®.
En la presente invención se describe un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO.:24 del CD20 del mono Cinomolgus (tal como se muestra en la Figura 19).
Un ácido nucleico aislado puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido con sustituciones de aminoácidos conservativos mostradas en la Figura 20. Un vector puede comprender el ácido nucleico anterior, incluyendo un vector de expresión para expresarse en una célula huésped. Una célula huésped puede comprender el vector. También se describe un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos [SEC ID NO.25; Fig. 20] del CD20 de mono Cinomolgus.
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Breve descripción de las figuras
La Figura 1A es una alineación de secuencias que compara las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (V_{L}) de cada uno de 2H7 murino (SEC ID No. 1), variante 2H7.v.16 humanizado (SEC ID NO.2), y subgrupo I de la cadena ligera de kappa humano(SEC ID NO.3). Las CDRs de V_{L} de 2H7 y hu2H7.v16 son las siguientes: CDR1 (SEC ID NO.4), CDR2 (SEC ID NO.5) y CDR3 (SEC ID NO.6).
La Figura 1B es la alineación de secuencias que compara las secuencias V_{H} de 2H7 murino (SEC ID No. 7), variante 2H7.v.16 humanizado (SEC ID NO.8), y la secuencia consenso humana de subgrupo III de la cadena pesada (SEC ID NO.9). Las CDRs de V_{H} de 2H7 y hu2H7.v16 son las siguientes: CDR1 (SEC ID NO.10), CDR2 (SEC ID NO.11) y CDR3 (SEC ID NO.12).
En la Figura 1A y la Figura 1B, las CDR1, CDR2 y CDR3 en cada cadena se incluyen entre paréntesis, flanqueadas por las regiones armazón ("framework"), FR1-FR4, tal como se indica. 2H7 se refiere al anticuerpo 2H7 murino. Los asteriscos entre dos filas de secuencias indican las posiciones que son diferentes entre las dos secuencias. La numeración de residuos es según Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) con inserciones mostradas como a, b, c, d y e.
La Figura 2 muestra la secuencia de fagémido pVX4 (SEC ID NO.13) que se usa para la construcción de los plásmidos Fab 2H7 (véase el Ejemplo 1), así como las secuencias de aminoácidos de la cadena L (SEC ID NO.14) y de la cadena H (SEC ID NO.15) del Fab para el anticuerpo humanizado anti-IFN-a injertado con CDR.
La Figura 3 muestra la secuencia del plásmido de expresión que codifica el Fab 2H7.v6.8 quimérico (SEC ID NO.16). Se muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena L (SEC ID NO.17) y de la cadena H (SEC ID NO.18).
La Figura 4 muestra la secuencia del plásmido pDR1 (SEC ID NO.19; 5391 pb) para la expresión de las cadenas ligeras de inmunoglobulina tal como se describe en el Ejemplo 1. pDR1 contiene secuencias que codifican un anticuerpo irrelevante, la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 humanizado (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)), los codones de inicio y parada que se indican en negrita y subrayados.
La Figura 5 muestra la secuencia de plásmido pDR2 (SEC ID NO.20; 6135 pb) para la expresión de las cadenas pesadas de inmunoglobulina tal como se describe en el Ejemplo 1. pDR2 contiene secuencias que codifican un anticuerpo irrelevante, la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3 humanizado (Shalaby et al., supra), los codones de inicio y parada que se indican en negrita y subrayados.
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena L completa de 2H7.v16 (SEC ID NO.21). Los primeros 19 aminoácidos antes de DIQ son la secuencia señal secretora no presente en la cadena de polipéptido maduro.
La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena H completa de 2H7.v16 (SEC ID NO.22). Los primeros 19 aminoácidos antes de EVQ son la secuencia de señal secretora no presente en la cadena de polipéptido maduro. Alineando la secuencia V_{H} en la Figura 1B (SEC ID NO.8) con la secuencia de la cadena H completa, la región constante \gamma1 humana es de la posición de aminoácido 114-471 en SEC ID NO.22.
La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena H completa de 2H7.v31 (SEC ID NO.23). Los primeros 19 aminoácidos antes de EVQ son la secuencia señal secretora no presente en la cadena de polipéptido maduro. La cadena L es la misma que para 2H7.v16 (véase la Figura 6).
La Figura 9 muestra la estabilidad relativa de las variantes de IgG 2H7.v16 y 2H7.v73. Los resultados de los ensayos se normalizaron hasta los valores anteriores de la incubación y se indicaron como porcentaje restante después de la incubación.
La Figura 10 es un diagrama de flujo que resume los cambios de aminoácidos del 2H7 murino para un subconjunto de versiones humanizadas hasta v75.
La Figura 11 es un resumen del recuento absoluto promedio de células B [CD3-/CD40+] en todos grupos (el estudio de 2H7 y el estudio de Rituxan combinados), tal como se describe en el Ejemplo 10.
La Figura 12 muestra los resultados de un ensayo de ADCC representativo de las variantes 2H7 deficientes en fucosa tal como se describe en el Ejemplo 11.
La Figura 13 muestra los resultados de la tinción de Anexina V representada en función de la concentración de anticuerpo. Las células Ramos se trataron con un anticuerpo de control IgG irrelevante (Herceptin®; círculos), Rituximab (cuadrados), o rhuMAb 2H7.v16 (triángulos) en presencia de un anticuerpo secundario reticulante y se analizaron mediante FACS. Las Figuras 13-15 se describen en el Ejemplo 13.
La Figura 14 muestra los resultados de la doble tinción de Anexina V y yoduro de propidio representada en función de la concentración de anticuerpo. Las células Ramos se trataron con un anticuerpo de control IgG1 irrelevante (Herceptia®; círculos), Rituximab (cuadrados), o rhuMAb 2H7.v16 (triángulos) en presencia de un anticuerpo secundario reticulado y se analizaron mediante FACS.
La Figura 15 muestra los recuentos (por 10 s) de las células no reticuladas vivas que están determinadas como una función de la concentración de anticuerpo. Las células Ramos se trataron con un anticuerpo de control IgG1 irrelevante (Herceptia®; círculos), Rituximab (cuadrados), o rhuMAb 2H7.v16 (triángulos) en la presencia de un anticuerpo secundario reticulante y se analizaron mediante FACS.
Las Figuras 16, 17, 18 muestran la inhibición del crecimiento de las células tumorales Raji en un ratón desnudo, tal como se describe en el Ejemplo 14. Los animales se trataron cada semana (tal como se indica mediante las flechas verticales; n=8 ratones por grupo) durante 6 semanas con PBS (control) o con Rituxan® o rhuMAb 2H7.v16 a 5 mg/kg (Figura 16), 0,5 mg/kg (Figura 17) ó 0,05 mg/kg (Figura 18).
La Figura 19 muestra las secuencias de aminoácidos (SEC ID NO.25) y de nucleótidos (SEC ID NO.24) del CD20 del mono Cynomolgus, tal como se describe en el Ejemplo 15.
La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos para CD20 del mono cynomolgus. Los residuos que difieren de CD20 humano están subrayados y los residuos humanos están indicados directamente debajo de los residuos de mono. El supuesto dominio extracelular de CD20 de mono está en negrita.
La Figura 21 muestra los resultados de las células de mono Cynomolgus que expresan CD20 que se une a hu2H7.v16, .v31 y Rituxan, tal como se describe en el Ejemplo 15. Los anticuerpos se ensayaron por la capacidad de unirse y desplazar 2H7 murino conjugado con FITC que se une a CD20 de cinomolgus.
La Figura 22 muestra un esquema del escalado de la dosis para un ensayo clínico de la fase I/II de artritis reumatoide.
La Figura 23 muestra el vector para expresar 2H7.v16 en células CHO.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
El antígeno "CD20" en una fosfoproteína trans-membrana no glicosilada con un peso molecular de aproximadamente 35 kD que se encuentra en la superficie de más del 90% de las células B de la sangre periférica u órganos linfoides. CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de pre-células B y permanece hasta la diferenciación de células plasmáticas; no se encuentra en células madre humanas, ni en células progenitoras linfoides ni en células plasmáticas normales. CD20 está presente tanto en células B normales como en células B tumorales. Otros nombres para CD20 en la literatura incluyen "antígeno de diferenciación limitado a linfocitos B" y "Bp35". El antígeno CD20 se describe, por ejemplo, en Clark and Ledbetter, Adv, Can. Res. 52:81-149 (1989) y Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989).
El término "anticuerpo" se usa en el más sentido más amplio y cubre especialmente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica o función deseada.
La actividad biológica de los anticuerpos de unión a CD20 y anticuerpos de unión a CD20 humanizados de la presente invención incluirán por lo menos la unión del anticuerpo a CD20 humano, más preferiblemente la unión a CD20 humano y otro CD20 primate (incluyendo mono cynomolgus, mono Rhesus, chimpancés). Los anticuerpos se unirían a CD20 con un valor K_{d} no superior a 1 x 10^{-8}, preferiblemente un valor K_{d} no superior a aproximadamente 1 x 10^{-9}, y serían capaz de eliminar o reducir las células B in vivo, preferiblemente en, por lo menos, un 20% cuando se compara con el control negativo apropiado que no se trata con dicho anticuerpo. La reducción de las células B puede ser el resultado de uno o más de ADCC, CDC, apoptosis, u otro mecanismo. En algunas realizaciones del tratamiento de la enfermedad de la presente invención, se pueden desear mecanismos o funciones efectoras sobre otros y se prefieren ciertas variantes de 2H7 humanizado para conseguir estas funciones biológicas, tales como ADCC.
"Los fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región variable o de unión a antígeno del mismo. Ejemplos de los fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2} y fragmentos Fv; diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento del antígeno. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de una cadena ligera y una pesada en asociación estrecha no covalente. A partir del plegamiento de estos dos dominios aparecen seis bucles hipervariables (3 bucles de cada cadena L y H) que contribuyen los residuos de aminoácidos para la unión a antígeno y confieren al anticuerpo especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de unión completo.
El término "anticuerpo monoclonal", tal como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una populación de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos siendo dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, a diferencia de las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) que habitualmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante único en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo al obtenerse a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invención se pueden producir mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No.4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de las bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Bio. 222:581-597 (1991), por ejemplo.
El "fragmento funcional" de los anticuerpos de unión a CD20 de la invención son aquellos fragmentos que mantienen la unión a CD20 con sustancialmente la misma afinidad que la molécula de longitud completa intacta de la cual se derivan y muestran actividad biológica incluyendo la reducción de las células B medida mediante ensayos in vivo o in vitro, tales como los descritos aquí.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media en la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a lo largo del tramo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes denominadas regiones armazón ("Framework") (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema denominados "regiones hipervariables" que tienen cada una de 9 a 12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan mayoritariamente una configuración en lámina \beta, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles de conexión y en algunos casos forman parte de la estructura en lámina \beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por medio de las regiones FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, vol. I, páginas 647-669 (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo con el antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tal como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC).
El término "región hipervariable", cuando se utiliza aquí, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el V_{L} y alrededor de aproximadamente 31-35B (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el V_{H}; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. [1991]) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el V_{L} y 26-32 (H1), 52A-55 (H2) y 96-101 (H3) en el V_{H}; Clothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 [1987]).
Tal como se hace referencia aquí, la "secuencia consenso" o secuencia consenso del dominio V es una secuencia artificial derivada de una comparación de las secuencias de aminoácidos de secuencias de regiones variables de inmunoglobulina humana conocidas. En base a estas comparaciones, se prepararon las secuencias de ácidos nucleicos recombinantes que codifican los aminoácidos del dominio V que son un consenso de las secuencias derivadas de los dominios V del subgrupo III de la cadena \kappa humana y la cadena H humana. La secuencia consenso V no tiene ninguna especificidad o afinidad de unión al anticuerpo conocida.
Los anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) tienen una parte de la cadena pesada y/o ligera idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de cadena o cadenas es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada (véase, Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). El anticuerpo humanizado tal como se utiliza aquí es un subgrupo de anticuerpos quiméricos.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor o aceptor) en que los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región armazón ("framework") (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente la acción del anticuerpo, tal como la afinidad de unión. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana, aunque las regiones Fr pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la afinidad de unión. La cantidad de estas sustituciones de aminoácidos en la FR es habitualmente no superior a 6 en la cadena H y en la cadena L, no más de 3. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de una variante en la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: la unión a C1q y la citotoxicidad dependiente de complemento; la unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; subregulación de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y la activación de células B.
"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refieren a una forma de citotoxicidad en que la Ig secretada unida a receptores de Fc (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas ("killer") naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta el antígeno y, posteriormente, destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y son absolutamente necesarias para dicha destrucción. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan Fc\gammaRIII solo, mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de Estados Unidos 5.500.362 ó 5.821.337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede determinar in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA), 95:652-656 (1998).
Los términos "receptor Fc" y "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. La FcR preferida es una FcR humana de secuencia nativa. Además, una FcR preferida es aquella que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc\gammaRI, Fc\gammaRII, y Fc\gammaRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas ("spliced") de estos receptores. Los receptores Fc\gammaRII incluyen Fc\gammaRIIA (un "receptor de activación") y Fc\gammaRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor de activación Fc\gammaRIIA contiene un motivo de activación del inmunoreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición Fc\gammaRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunoreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (revisado en Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están comprendidos por el término "FcR" aquí. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).
WO00/42072(Presta) describe variantes de anticuerpos con una mejor o menor unión a FcRs. Véase, también, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan por lo menos Fc\gammaRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; prefiriéndose las células PBMCs y NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refieren a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación del mecanismo de complemento clásico se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antígeno afín. Para determinar la activación del complemento se puede realizar un ensayo CDC, por ejemplo tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
Las variantes de polipéptido con secuencias de aminoácidos de la región Fc alteradas y una capacidad mayor o menor de unión de C1q se describen en la Patente de Estados Unidos No. 6,194,551B1 y WO99/51642. Véase, también, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
El sitio de N-glicosilación en IgG es en Asn297 en el dominio CH2. La presente invención también proporciona composiciones de un anticuerpo humanizado que se une a CD20 que tiene una región Fc, donde aproximadamente el 80-100% (y preferiblemente aproximadamente 90-99%) del anticuerpo en la composición comprende una estructura central de carbohidratos madura que carece de fucosa, unida a la región Fc de la glucoproteína. Dichas composiciones mostraron en la presente invención que muestran una mejora sorprendente en la unión Fc\gammaRIIIA(F158), que no es eficaz como Fc\gammaRIIIA (V158) en la interacción con IgG humana. De este modo, se anticipa que las composiciones de la presente invención son superiores a las composiciones de anticuerpo anti-CD20 descritas previamente, especialmente para la terapia de pacientes humanos que expresan Fc\gammaRMA (F158). Fc\gammaRIIIA (F158) es más común que Fc\gammaRIIIA (V158) en africanos, americanos y caucásicos sanos normales. Véase, Lehrnbecher et al. Blood 94:4220 (1999). La presente solicitud demuestra además que el incremento sinérgico en la unión de Fc\gammaRIII y/o función ADCC que resulta de la combinación de las variaciones de glicosilación de la presente invención con la modificación o modificaciones en la secuencia de aminoácidos en la región Fc de la glicoproteína.
Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con su uso diagnóstico o terapéutico para el anticuerpo y puede incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferentes, el anticuerpo se purificará (1) en más del 95% en peso según se determina por el procedimiento de Lowry y más preferiblemente en más del 99% en peso (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos del N-terminal o de la secuencia interna de aminoácidos mediante el uso de un secuenciador de copa rotatoria o, (3) hasta homogeneidad mediante separación en SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o preferentemente con tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ sin células recombinantes, ya que no estará presente por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está normalmente asociada en el medio natural del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente de la que está en la forma o tal como se establece en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas se diferencian por tanto de la molécula de ácido nucleico tal como existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el anticuerpo cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.
La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante vinculada operativamente a un organismo huésped en particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operativa, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
El ácido nucleico se halla "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o una secuencia líder secretora se halla unido operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador se halla unido operativamente a una secuencia codificante si influye en la transcripción de la secuencia: o un sitio de unión a ribosomas se halla unido operativamente a una secuencia codificante si está posicionado de tal modo que facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción adecuados. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica convencional.
"Vector" incluye vectores lanzadera y de expresión. Habitualmente, la construcción de plásmido también incluirá un origen de replicación (por ejemplo, el origen de replicación ColE1) y un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a ampicilina o tetraciclina) para la replicación y selección, respectivamente, de los plásmidos en bacterias. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene las secuencias de control o elementos reguladores necesarios para la expresión de los anticuerpos, incluyendo fragmento de anticuerpo de la invención en células bacterianas o eucariotas. Los vectores adecuados se describen a continuación.
La célula que produce un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la presente invención incluirá las células huésped bacterianas y eucariotas en las que se ha introducido el ácido nucleico que codifica los anticuerpos. Las células huésped adecuadas se describen a continuación.
La palabra "marcador" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directamente o indirectamente al anticuerpo. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.
Una "enfermedad autoimmune" de la presente invención es una enfermedad o trastorno no maligno que surge de (auto)antígenos y/o tejidos del propio individuo y dirigidos contra los mismos. Tal como se utiliza aquí, "la reducción de células B" se refiere a la reducción en el nivel de células B en un animal o un ser humano después del tratamiento con fármacos o anticuerpos, en comparación con el nivel de células B antes del tratamiento. Los niveles de células B se miden utilizando ensayos conocidos, tales como los descritos en los Ejemplos Experimentales. La reducción de células B puede ser completa o parcial. En una realización, la reducción de células B que expresan CD20 es de por lo menos el 25%. Sin limitarse por ningún mecanismo, entre los posibles mecanismos de reducción de células B se incluyen ADCC, CDC, apoptosis, modulación del flujo de calcio o una combinación de dos o más de los anteriores.
El término "agente citotóxico" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, I^{131}, I^{124}, Y^{90} y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de los mismos.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alcalizantes o alquilantes, tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN^{TM}); sulfonatos de alquilo, tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas, tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicins, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (Adriamicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propnionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; restituidor de ácido fólico tales como, ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio, etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicin; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxana; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2''-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatin; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinblastina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables. También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores, tales como anti-estrógenos, incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazolas que inhiben aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; otros agentes quimioterapéuticos, tales como prednisolona. Se incluyen sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente
aceptables.
"Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren tanto a un tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas, donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) el estado patológico o trastorno objetivo. Un sujeto es "tratado" de manera satisfactoria para un cáncer positivo de CD20 o una enfermedad autoinmune si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo de unión a CD20 según los métodos de la presente invención, el sujeto muestra una reducción observable y/o medible o ausencia de uno o más signos y síntomas de la enfermedad particular. Por ejemplo, para el cáncer, la reducción en el número de células cancerosas o ausencia de las células cancerosas; la reducción en el tamaño del tumor; la inhibición (es decir, ralentizar en cierto grado y preferiblemente parar) la metástasis del tumor, la inhibición en cierto grado del crecimiento tumoral; el incremento en la longitud de la remisión y/o el alivio en cierto grado, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; la morbidad y mortalidad reducida, y la mejora en la calidad de vida. La reducción de los signos o síntomas de una enfermedad también puede ser sentida por el paciente. El tratamiento puede conseguir una respuesta completa, definida como la desaparición de todos los signos del cáncer, o una respuesta parcial, en la que se disminuye el tamaño de tumor, preferiblemente en más de un 50 por ciento, más preferiblemente en más de un 75%. Se considera también que un paciente está tratado si el paciente experimenta estabilidad en la enfermedad. En una realización preferida, los pacientes con cáncer aún se encuentran la libre progresión en el cáncer después de un año, preferiblemente después de 15 meses. Estos parámetros para valorar el tratamiento exitoso y la mejora en la enfermedad son fácilmente medibles mediante procedimientos de rutina familiares para un médico con los conocimientos apropiados.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo o un fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco se refiere a una cantidad de un anticuerpo o un fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferiblemente parar) la infiltración de las células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferiblemente parar) la metástasis tumoral; inhibir, en cierto grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Véase la definición anterior de "tratamiento".
Administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes en un modo continuo en oposición de a un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un periodo de tiempo extendido. Administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino que es cíclico por naturaleza.
Composiciones y métodos de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos humanizados descritos en las reivindicaciones.
En un anticuerpo de longitud completa, el anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención comprenderá un dominio V humanizado unido a un dominio C de una inmunoglobulina humana. En una realización preferida, la región C de cadena H es de la IgG humana, preferiblemente IgG1 o IgG3. El dominio C de la cadena L es preferiblemente de la cadena \kappa humana.
A menos que se indique lo contrario, una versión del anticuerpo 2H7 humanizado de la presente invención tendrá las secuencias de los dominios V y C de la cadena L 2H7.v16 L (Fig. 6, SEC ID NO. 21) y la cadena H (FIG 7., SEC ID NO. 22), excepto en las posiciones de las sustituciones o cambios de aminoácidos indicados en los ejemplos experimentales a continuación.
Los anticuerpos de unión a CD20 humanizados se unirán a por lo menos CD20 humano y preferiblemente se unirán a otro CD20 de primate, tal como el de monos, incluyendo monos cynomolgus y rhesus, y chimpancés. La secuencia del CD20 de mono cynomolgus se describe en el Ejemplo 15 y la figura 19.
La actividad biológica de los anticuerpos de unión a CD20 humanizados de la presente invención incluirá por lo menos la unión de anticuerpo a CD20 humano, más preferiblemente la unión a CD20 humano y de primate (incluyendo mono cynomolgus, mono rhesus, chimpancés) con un valor de Kd no superior a 1 x 10^{-8}, preferiblemente un valor de Kd no superior a aproximadamente 1 x 10^{-9}, incluso más preferiblemente un valor de Kd no superior a aproximadamente 1 x 10^{-10}, y que sea capaz de eliminar o reducir células B in vitro o in vivo, preferiblemente en por lo menos un 20% cuando se compara con el nivel base o el control negativo apropiado que no es tratado con dicho anticuerpo.
El nivel deseado de reducción de células B dependerá de la enfermedad. Para el tratamiento de un cáncer positivo de CD20, puede ser deseable maximizar la reducción de las células B que son la diana de los anticuerpos anti-CD20 de la invención. De este modo, para el tratamiento de un neoplasma de células B positivo de CD20, es deseable que la reducción de células B sea suficiente para por lo menos evitar la progresión de la enfermedad que se puede valorar por el médico entendido, por ejemplo, mediante el seguimiento del crecimiento tumoral (tamaño), la proliferación del tipo de célula cancerosa, metástasis, otros signos y síntomas del cáncer particular. Preferiblemente, la reducción de células B es suficiente para evitar la progresión de la enfermedad durante por lo menos 2 meses, más preferiblemente 3 meses, incluso más preferiblemente 4 meses, más preferiblemente 5 meses, incluso más preferiblemente 6 o más meses. En realizaciones incluso más preferidas, la reducción de células B es suficiente para aumentar el tiempo de remisión en por lo menos 6 meses, más preferiblemente 9 meses, más preferiblemente un año, más preferiblemente 2 años, más preferiblemente 3 años, incluso más preferiblemente 5 o más años. En la realización más preferida, la reducción de células B es suficiente para centrar la enfermedad. En realizaciones preferidas, la reducción de células B en un paciente con cáncer es por lo menos de aproximadamente un 75%, y más preferiblemente 80%, 85%, 90%, 95%, 99% e incluso 100% del nivel base antes del tratamiento.
Para el tratamiento de una enfermedad autoimmune, puede ser deseable modular el grado de reducción de células B dependiendo de la enfermedad y/o la gravedad de la condición en el paciente individual, mediante el ajuste de la dosis de anticuerpo que se une a CD20. De este modo, la reducción de células B puede pero no tiene que ser completa. O, se puede desear la reducción total de células B en un tratamiento inicial, pero en tratamientos posteriores, la dosis se puede ajustar para conseguir sólo una reducción parcial. En una realización, la reducción de células B es por lo menos del 20%, es decir, un 80% o menos de células B positivas en CD20 en comparación con el nivel base antes del tratamiento. En otras realizaciones, la reducción de células B es del 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% o superior. Preferiblemente, la reducción de células B es suficiente para detener la progresión de la enfermedad, más preferiblemente para aliviar los signos y síntomas de la enfermedad particular en tratamiento, incluso más preferiblemente para curar la enfermedad.
Los anticuerpos de unión a CD20 biespecíficos son anticuerpos en los que un brazo del anticuerpo tiene una cadena H y L humanizada del anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención, y el otro brazo tiene una especificidad de unión de la región V por un segundo antígeno. El segundo antígeno se selecciona del grupo que consiste en CD3, CD64, CD32A, CD16, NKG2D u otros ligandos de activación de NK.
En comparación con Rituxan (rituximab), v16 muestra aproximadamente de 2 a 5 veces una mayor potencia ADCC, 3-4 veces menor CDC que Rituxan.
Producción de anticuerpos Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales se pueden producir utilizando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) o se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567).
En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmunizan como se ha descrito anteriormente para conseguir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aíslan y se fusionan a continuación con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academia Press. 1986)).
Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se desarrollan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas (también referidas como compañero de fusión). Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo selectivo para los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes de HGPRT.
Las células de mieloma de compañero de fusión preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficaz, contribuyen a una producción estable a un nivel elevado de anticuerpo por las células seleccionadas productoras de los anticuerpos, y son sensibles a un medio selectivo que se selecciona contra las células parentales no fusionadas. Entre las líneas de células de mieloma preferidas están las líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 y derivadas, por ejemplo células X63-Ag8-653, disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Estados Unidos. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
Se analiza el medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante la inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y se pueden desarrollar mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academia Press, 1986)). Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o medio RPM1-1640. Además, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores ascíticos en un animal, por ejemplo, mediante inyección i.p. de las células en los ratones.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales, tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, utilizando proteína A o proteína G-Sefarosa) o cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de ningún otro modo producen la proteína anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Entre los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo se incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol Revs., 130:151-188 (1992).
En una realización adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos monoclonales se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos generados utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Las posteriores publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de afinidad elevada (rango de nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al., Biol. Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas convencionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
El ADN que codifica el anticuerpo se puede modificar para producir polipéptidos anticuerpo quiméricos o de fusión, por ejemplo, mediante la sustitución de las secuencias de los dominios constantes de cadena pesada y ligera (C_{H} y C_{L}) humanos por las secuencias murinas homólogas (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o mediante la fusión de la secuencia codificante de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es inmunoglobulina (polipéptido heterólogo). Las secuencias de polipéptidos que no son inmunoglobulinas se pueden sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo divalente quimérico que comprende un sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.
Anticuerpos humanizados
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la técnica. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos "importados", que habitualmente se obtienen de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizar en la fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la respuesta HAMA (anticuerpo anti-ratón de humano) cuando el anticuerpo pretende utilizarse para uso terapéutico humano. Según el método denominado "mejor-ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidos. Se identifica el dominio V humano de la secuencia humana que está más próximo a la del roedor y se acepta la región de armazón (FR) humana en el mismo para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro método utiliza una región de armazón particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma región de armazón se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151: 2623 (1993)).
Es también importante que los anticuerpos se humanicen manteniendo una afinidad de unión elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles normalmente y son familiares para los expertos en la materia. Existen programas informáticos que muestran y visualizan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La observación de estas visualizaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de secuencias receptoras e importadas, de manera que se consigue la característica del anticuerpo deseado, tal como una mayor afinidad para el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno.
El anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, que está conjugado opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos con el fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo de longitud completa, tal como un anticuerpo IgG1 de longitud completa.
Anticuerpos humanos y metodología de la expresión en fagos
Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos no humanos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región de unión (J_{H}) de la cadena pesada del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y en la línea germinal da lugar a la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del grupo de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes en la línea germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos tras la estimulación con antígenos. Ver, por ejemplo Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); y las Patentes de Estados Unidos 5.545.806, 5.569.825 y 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.547.807; y WO 97/17852.
Alternativamente, la tecnología de expresión de fagos (McCafferty et al., Nature 348, 552-553 [1990]) se puede utilizar para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Según esta técnica, los genes del dominio V de anticuerpo se clonan en el marco en un gen de proteína de recubrimiento principal o secundario de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. De este modo, el fago mimetiza algunas de las propiedades de la célula B. La expresión en fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión ver, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos de genes V para la expresión en fagos. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) aislaron un conjunto diverso de anticuerpos de anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos para un conjunto diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993). Véase también las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.565.332 y 5.573.905.
Tal como se ha descrito anteriormente, también se pueden generar anticuerpos humanos por células B activadas in vivo (véase las Patentes de Estados Unidos 5.567.610 y 5.229.275).
Fragmentos de anticuerpos
En ciertas circunstancias, existen ventajas al utilizar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos. El menor tamaño de los fragmentos permite una depuración rápida y puede conducir a un mejor acceso a los tumores sólidos.
Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Habitualmente, estos fragmentos se derivaban mediante la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir actualmente directamente mediante células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv se pueden todos expresar en y secretarse de E. coli, permitiendo así la producción simple de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar a partir de las bibliotecas de anticuerpos en fagos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E coli y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otra estrategia, los fragmentos F(Ab')_{2} se pueden aislar directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} con una mayor vida media in vivo que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor salvaje se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el técnico de la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Véase WO 93/16185; Patente de Estados Unidos No. 5.571.894; y Patente de Estados Unidos No. 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos carentes de regiones constantes; de este modo, son adecuadas para una unión no específica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión con sFv se pueden construir para producir la fusión de una proteína efectora en el extremo amino o carboxi de un sFv. Véase, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión con por lo menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo se pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteína CD20. Otros de dichos anticuerpos pueden combinar un sitio de unión a CD20 con un sitio de unión para otra proteína. Alternativamente, un brazo anti-CD20 puede combinarse con un brazo que se une a una molécula inductora en un leucocito, tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD3) o receptores Fc para IgG (FC\gammaR), tales como FC\gammaRI (CD64), FC\gammaRII (CD32) y FC\gammaRIII (CD16) o NKG2D u otro ligando de activación de células NK con el fin de centrar y localizar los mecanismos de defensa celulares en la célula que expresa CD20. Estos anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos en células que expresan CD20. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a CD20 y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-\alpha, alcaloide vinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno con isótopo radioactivo). Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}).
WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc\gammaRIII y la Patente de Estados Unidos
5.837.234 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc\gammaRI. En WO98/02463 se muestra un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fc\alpha. La Patente de Estados Unidos No. 5.821.337 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.
Los procedimientos para realizar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción habitual de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda y los rendimientos de producto son bajos. En WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) se describen procesos similares.
Según una estrategia diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se produce preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de Ig, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra, C_{H}2 y C_{H}3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (C_{H}1) contenga el sitio necesario para la unión a cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en una célula huésped adecuada. Esto proporciona una mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o las tres cadenas de polipéptido en un único vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da lugar a rendimientos elevados o cuando las proporciones no tienen un efecto significativo en el rendimiento de la combinación de cadenas deseadas.
En una realización preferida de esta estrategia, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera sencilla de separación. Esta estrategia se describe en WO 94/04690. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
Según otra estrategia descrita en la Patente de Estados Unidos No. 5.731.168, se puede diseñar la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivos de células recombinantes. La interfase preferida comprende por lo menos una parte del dominio C_{H}3. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales de aminoácidos grandes por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Entre los anticuerpos biespecíficos se incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, y el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de Estados Unidos No. 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la Patente de Estados Unidos No. 4.676.980 junto con un grupo de técnicas de reticulación.
Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos utilizando enlaces químicos. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se descomponen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de enlaces disulfuro intermoleculares. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
El reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli., que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med, 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')_{2} completamente humanizada. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos.
Se han descrito también varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un V_{H} conectado a un V_{L} mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Se consideran los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Anticuerpos multivalentes
Un anticuerpo multivalente se puede internalizar (y/o catabolizar) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes de los de la clase IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir fácilmente mediante expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión a antígeno amino terminales a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido de la presente invención comprende (o consiste en) tres a aproximadamente ocho, pero preferiblemente cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende por lo menos una cadena polipeptídica (y preferiblemente dos cadenas polipeptídicas), donde la cadena o cadenas polipeptídicas comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o un polipéptido, y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender: VH-CH1-enlazador flexible-VH-CH1-cadena de región Fc; o VH-CH1-VH-CH1-cadena de región Fc. El anticuerpo multivalente de la presente invención comprende preferiblemente además por lo menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos del dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente invención puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos del dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos del dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, además, comprenden un dominio CL.
Otras modificaciones en la secuencia de aminoácidos
Se contempla la modificación o modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de unión a CD20 descritos en la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20 se preparan mediante la introducción de cambios apropiados de nucleótidos en el ácido nucleico del anticuerpo anti-CD20 o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se realiza hasta llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos post-traduccionales del anticuerpo anti-CD20, tales como el cambio del número o posición de sitios de glicosilación.
Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo anti-CD20 que son posiciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por rastreo de alanina", tal como se describe por Cunningham y Wells Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para influir en la interacción de los aminoácidos con el antígeno CD20. Aquellas posiciones de aminoácidos que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación mediante la introducción de variantes adicionales u otras en los sitios de sustitución o para los mismos. De este modo, mientras que el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminada, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar la acción de una mutación en un sitio determinado, se realiza la mutagénesis de rastreo de alanina o aleatorio en el codón o región diana y se criban las variantes de anticuerpo anti-CD20 expresadas por la actividad deseada.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxi terminales que varían de longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencias de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen un anticuerpo anti-CD20 con un residuo metionilo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo anti-CD20 incluyen la fusión al N o C terminal del anticuerpo anti-CD20 a una enzima (por ejemplo, ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media del anticuerpo en el suero.
Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-CD20 sustituida por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en la FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla siguiente bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones dan lugar a un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "ejemplos de sustituciones", en la Tabla o tal como se describe posteriormente en referencia a clases de aminoácidos, y cribar los productos.
TABLA
1
Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan mediante la selección de substituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hélice o lámina, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral:
(1)
hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2)
hidrofílico neutro: cys, ser, thr;
(3)
ácido: asp, glu;
(4)
básico: asn, gln, his, lys, arg;
(5)
residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6)
aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
También se puede sustituir, generalmente por serina, cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación correcta del anticuerpo anti-CD20 para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. En cambio, se pueden añadir el enlace o enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).
Un tipo particularmente preferido de variante por sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo parental del cual se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes por sustitución implica la maduración por afinidad utilizando la expresión en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se expresan de manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetados en cada partícula. A continuación, las variantes expresadas en el fago se criban por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se describe en la presente invención. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede aplicar la mutagénesis por rastreo de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura del cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el CD20 humano. Dichos residuos de contacto y residuos próximos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en la presente invención. Una vez se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describe en la presente invención y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para un desarrollo posterior.
Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por alteración se entiende la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.
La glicosilación de anticuerpos es habitualmente por unión a N u O. La unión a N se refiere a la unión del grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un potencial sitio de glicosilación. La glicosilación por unión a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más habitualmente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza de manera conveniente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos, de manera que contenga una o más de las secuencias tripéptido descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición o sustitución por uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O).
Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20 se preparan mediante una serie de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes en las secuencias de aminoácidos naturales) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida de sitio), la mutagénesis de PCR y la mutagénesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-CD20.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, para aumentar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede conseguir mediante la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el residuo o residuos de cisteína se pueden introducir en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor citólisis mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-195 (1992) y Schopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con mayor actividad antitumoral también se pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncionales tal como se describe en Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y puede tener por tanto una mayor capacidad de lisis de complemento y ADCC. Véase Stevenson et al. anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
Para incrementar la vida media del anticuerpo en el suero, se puede incorporar un epítopo de unión a receptor salvaje en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.739.277, por ejemplo. Tal como se utiliza aquí, el término "epítopo de unión a receptor salvaje" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}) que es responsable del incremento en la vida media de la molécula IgG en el suero in vivo.
Otras modificaciones de los anticuerpos
Se contemplan en la presente invención otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir a uno de un conjunto de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo también se puede introducir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización entre fases (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente), en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A. Ed. (1980).
Cribado de anticuerpos con las propiedades deseadas
Los anticuerpos con ciertas características biológicas se pueden seleccionar tal como se describe en los Ejemplos Experimentales
Los efectos inhibidores del crecimiento de un anticuerpo anti-CD20 de la invención se pueden valorar mediante los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando células que expresan CD20 endógenamente o tras la transfección con el gen de CD20. Por ejemplo, las líneas de células tumorales y las células transfectadas con CD20 se pueden tratar con un anticuerpo monoclonal anti-CD20 de la invención a varias concentraciones durante unos días (por ejemplo, 2-7 días) y se pueden teñir con violeta cristal o MTT o analizarse mediante algún otro ensayo colorimétrico. Otro método de medición de la proliferación sería mediante la comparación de la captación de ^{3}H-timidina por las células tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-CD20 de la invención. Después del tratamiento con anticuerpos, las células se recogen y se cuantifica la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN en un contador de centelleo. Los controles positivos apropiados incluyen el tratamiento de una línea celular seleccionada con un anticuerpo inhibidor del crecimiento conocido por inhibir el crecimiento de esa línea celular.
Para seleccionar anticuerpos que inducen la muerte celular, se puede evaluar la pérdida de integridad de la membrana indicada mediante, por ejemplo, la captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano o 7AAD en relación al control. Se puede realizar un ensayo de captación de PI en ausencia de complemento y células efectoras inmunes. Las células tumorales que expresan CD20 se incuban con medio solo o medio que contiene el anticuerpo monoclonal apropiado a, por ejemplo, aproximadamente 10 \mug/ml. Las células se incuban durante un periodo de 3 días. Tras cada tratamiento, las células se lavan y se fraccionan en tubos 12x 75 de tapón colador de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la extracción de grupos de células. A continuación, los tubos reciben PI (10 \mug/ml). Las muestras se pueden analizar utilizando un citómetro de flujo FACSCAN® y el software FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson). Los anticuerpos que inducen estadísticamente niveles significativos de la muerte celular determinada mediante la captación de PI se pueden seleccionar como anticuerpos inductores de la muerte celular.
Para cribar anticuerpos que se unen a un epítopo en CD20 unido por un anticuerpo de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Este ensayo se puede utilizar para determinar si un anticuerpo de análisis se une al mismo sitio o epítopo que un anticuerpo anti-CD20 de la invención. Alternativa o adicionalmente, la localización del epítopo se realiza mediante métodos conocidos en el sector. Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo se puede mutagenizar mediante, por ejemplo, rastreo de alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante se analiza inicialmente por su unión con anticuerpo policlonal para asegurar el pliegue correcto. En un método diferente, se pueden utilizar péptidos correspondientes a diferentes regiones de CD20 en ensayos de competición con los anticuerpos de análisis o con un anticuerpo de análisis y un anticuerpo con un epítopo caracterizado o conocido.
Vectores, células huésped y métodos recombinantes
La presente invención también proporciona ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de unión a CD20 humanizado, vectores y células huésped que comprenden el ácido nucleico, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.
Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para la clonación posterior (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. Entre los componentes del vector se incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.
(i) Componente secuencia señal
El anticuerpo de unión a CD20 de la presente invención se puede producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específica en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduros. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es la que es reconocida y procesada (es decir, dividida por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para células huésped procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal del anticuerpo de unión a CD20 nativo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o secuencias líderes de enterotoxina II estables térmicamente. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal nativa se puede sustituir por, por ejemplo, la secuencia líder de la invertasa de levadura, la secuencia líder de factor \alpha (incluyendo secuencias líderes de factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces) o secuencia líder de fosfatasa ácida, la secuencia líder de glucoamilasa de C albicans o la señal descrita en WO 90/13646. En la expresión de células de mamíferos, se disponen las secuencias señal de mamíferos, así como las secuencias líderes secretoras víricas, por ejemplo, la señal gD de herpes simplex.
El ADN para dicha región de precursor está ligado en el marco de lectura a ADN que codifica el anticuerpo de unión a CD20.
(ii) Origen de replicación
Los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia es la que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Dichas secuencias son bien conocidas para un conjunto de bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es adecuado para las levaduras, y varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, el componente del origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 se puede utilizar habitualmente sólo porque contiene el promotor temprano).
(iii) Componente de gen de selección
Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman de forma satisfactoria con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y sobreviven de esta manera al régimen de selección. Algunos ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo de unión a CD20, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotioneina-I y -II, preferiblemente genes de metalotioneina de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.
Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identificaron por primera vez mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza la DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096).
Alternativamente, se pueden seleccionar células huésped (particularmente huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo de unión a CD20, proteína DHFR de tipo salvaje y otro marcador seleccionable, tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH), mediante el crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Véase la Patente de Estados Unidos No. 4.965.199.
Un gen de selección adecuado para su utilización en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras YRp7 (Stinchcomb et al. Nature, 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión en trp1 en el genoma de células huésped de levadura proporciona entonces un medio eficaz para la detección de la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes de Leu-2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2.
Además, se pueden utilizar los vectores derivados del plásmido circular de 1,6 \mum pKD1 para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, se describió un sistema de expresión para una producción a gran escala de quimosina recombinante de ternera para K. lactis. Van der Berg, Biol. Technology, 8:135 (1990). También se han descrito vectores de expresión multicopia estables para la secreción de albúminas de suero humanos recombinantes maduras mediante cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Biol. Technology, 9:968-975 (1991).
(iv) Componente promotor
Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido nucleico que codifica el anticuerpo de unión a CD20. Entre los promotores adecuados para la utilización con huéspedes procariotas se incluyen el promotor phoA, sistemas de promotores \beta-lactamasa y lactosa, promotor de fosfatasa alcalina, un sistema de promotores de triptófano (trp), y promotores híbridos, tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para la utilización en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el anticuerpo de unión a CD20.
Se conocen secuencias de promotores para eucariotas. Prácticamente, todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases en dirección 5' desde el sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases en dirección 5' desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas es una secuencia AATAAA que pueden ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de manera adecuada en vectores de expresión eucariotas.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para la utilización en huéspedes de levadura se incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones de promotor para la alcohol deshidrogenada 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en EP 73.657. Los potenciadores de la levadura también se utilizan de forma ventajosa con promotores de levadura.
La transcripción de anticuerpos de unión a CD20 de vectores en células huésped de mamíferos se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviario, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferiblemente Virus del Simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.
Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. En la Patente de Estados Unidos No. 4.419.446 se describe un sistema para expresar ADN en huéspedes de mamíferos que utiliza el virus de papiloma bovino como un vector. En la Patente de Estados Unidos No. 4.601.978 se describe una modificación de este sistema. Véase también Reyes et al., Nature, 297: 598-601 (1982) en la expresión de ADNc de \beta-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus de herpes simplex. Alternativamente, se puede utilizar como promotor la repetición terminal larga del virus de sarcoma de Rous.
(v) Componente elemento potenciador
La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo de unión a CD20 de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa frecuentemente mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Actualmente, se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de células eucariotas. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv. Nature 297:17-18 (1982) en elementos de potenciación para la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en la posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante del anticuerpo de unión a CD20, pero se localiza preferiblemente en un sitio 5' con respecto al promotor.
(vi) Componente de la terminación de la transcripción
Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucariotas (levadura, hongo, insecto, planta, animal, humano o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones no traducidas 5', y alguna vez desde 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo de unión a CD20. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Véase WO 94/11026 y el vector de expresión descrito en la misma.
(vii) Selección y transformación de células huésped
Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Entre las procariotas adecuadas para este objetivo se incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli, tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B. E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.
El anticuerpo de longitud completa, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión de anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando no son necesarias la glicosilación y la función efectora de Fc, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra eficacia en la destrucción de la célula tumoral. Los anticuerpos de longitud completa presentan una vida media mayor en la circulación. La producción en E. coli es más rápida y más rentable. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5,648,237 (Carter et. al.), la Patente de Estados Unidos 5,789,199 (Joly et al.), y la Patente de Estados Unidos 5,840,523 (Simmons et al.) que describen la región de iniciación de la traducción (TIR) y las secuencias señal para optimizar la expresión y secreción. Después de la expresión, se aísla el anticuerpo de la pasta celular de E: coli en una fracción soluble y se puede purificar a través de, por ejemplo, una columna de proteína A o G, dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al proceso para purificar el anticuerpo expresado en, por ejemplo, células CHO.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos o levaduras filamentosas, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo de unión a CD20. El Saccharomyces cerevisiae, o la levadura habitual del panadero, es el más habitualmente utilizado entre los microorganismos de huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, un grupo de otros géneros, especies y cepas están disponibles habitualmente y son útiles en la presente invención, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces, tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Candida; Trichoderma reesta (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanmomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y huéspedes de Aspergillus, tales como A. nidulans y A. Níger.
Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo de unión a CD20 glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células vegetales y de insectos. Se han modificado numerosas cepas baculovíricas y variantes y las correspondientes células huéspedes de insecto permisivas de huéspedes, tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Droshophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Una serie de cepas víricas para la transfección están públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden utilizar como el virus del presente documento según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también se pueden utilizar como huéspedes.
Sin embargo, el mayor interés ha estado en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en un cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Entre los ejemplos de líneas celulares de huéspedes mamíferos útiles están la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción del anticuerpo de unión a CD20 y se cultivan en un medio con nutrientes habituales modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
(viii) Cultivo de células huésped
Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo de unión a CD20 de la presente invención se puede cultivar en una serie de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Mínimo Esencial (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes de Estados Unidos Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 ó 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195 o la Patente de Estados Unidos Re. 30.985 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede suplementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), soluciones tampón (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes habitualmente en concentraciones finales a nivel micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario se puede también incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán obvias para un técnico habitual.
(ix) Purificación de anticuerpo
Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o se secreta directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, la debris particulada, ya sea células huésped o fragmentos lisados, se elimina, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Biol Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, se descongela la pasta celular en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. La debris celular se puede eliminar mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran generalmente en primer lugar utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de filtración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasas tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales.
La composición de anticuerpos preparada a partir de células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo ésta última la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isótopo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas humanas \gamma1, \gamma2 o \gamma4 (Lindmark et al., J. Immunol Meth 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isótopos de ratón y para \gamma3 humanas (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es frecuentemente agarosa, pero se disponen de otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tales como el vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permite mayores velocidades de flujo y tiempos de procesado más cortos que los que se pueden conseguir con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX^{TM} (J.T. Baker Philipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina-Sefarosa^{TM}, cromatografía en una resina de intercambio de anión o catión (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato amónico también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.
Tras cualquier etapa o etapas de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes se pueden someter a una cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo utilizando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferiblemente a concentraciones de sales bajas (por ejemplo, sal de aproximadamente 0-0,25 M).
Conjugados de anticuerpos
El anticuerpo se puede conjugar a un agente citotóxico, tal como una toxina o un isótopo radioactivo. En ciertas realizaciones, la toxina es caliqueamicina, son preferibles un maitansinoide, una dolastatina, auristatina E y análogos o derivado de los mismos.
Los fármacos/toxinas preferidos incluyen agentes que dañan el AND, inhibidores de la polimerización o despolimerización de microtúbulos y antimetabolitos. Las clases preferidas de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, los inhibidores de enzimas, tales como inhibidores de dihidrofolato reductasa e inhibidores de timidilato sintasa, intercaladores de ADN, inhibidores de topoisomerasa, la familia de fármacos de antraciclina, los fármacos vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, los nucleósidos citotóxicos, la familia de fármacos de pteridina, diinenas, la podofilotoxinas e inductores de la diferenciación. Los miembros particularmente útiles de estas clases incluyen, por ejemplo, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, citosina arabinósido, melfalan, leurosina, leurosideina, actinomicina, daunorubicina, doxorrubicina, N-(5,5-diacetoxipentil) doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina, 1-(2-cloroetil)-1,2-dimetanosulfonol hidrazida, N^{8}-acetil espermidina, aminopterina, metopterina, esperamicina, mitomicina C, mitomicin A, actinomicina, bleomicina, carminomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina y derivados de podofilotoxina, tales como etopósido o fosfato de etopósido, vinblastina, viacristina, vindesina, taxol, taxótero, ácido retinoico, ácido butírico, N^{8}-acetil espermidina, camptotecina, caliqueamicina, briostatinas, cefalostatinas, ansamitocina, actosina, maitansinoides, tales como DM-1, maitansina, maitansinol, N-desmetil-4,5-desepoximaitansinol, C-19-decloromaitansinol, C-20-hidroximaitansinol, C-20-emetoximaitansinol, C-9-SH maitensinol, C-14-alcoximetilmaitansinol, C-14-hidroxi o acetiloximetilmaitansinol, C-15-hidroxi/acetiloximaitansinol, C-15-metoximaitansinol, C-18-N-demetilmaitansinol y 4,5-desoximaitansinol, auristatinas, tales como auristatina E, M, PHE y PE; dolostatinas, tales como dolostatina A, dolostatina B, dolostatina C, dolostatina D, dolostatina E (20-epi y 11-epi), dolostatina G, dolostatina H, dolostatina I, dolostatina 1, dolostatina 2, dolostatina 3, dolostatina 4, dolostatina 5, dolostatina 6, dolostatina 7, dolostatina 8, dolostatina 9, dolostatina 10, deo-dolostatina 10, dolostatina 11, dolostatina 12, dolostatin 13, dolostatina 14, dolostatina 15, dolostatina 16, dolostatina 17, y dolostatina 18; cefalostatinas, tales como cefalostatina 1, cefalostatina 2, cefalostatina 3, cefalostatina 4, cefalostatina 5, cefalostatina 6, cefalostatina 7, 25'-epi-cefalostatina 7, 20-epi-cefalostatina 7, cefalostatina 8, cefalostatina 9, cefalostatina 10, cefalostatina 11, cefalostatina 12, cefalostatina 13, cefalostatina 14, cefalostatina 15, cefalostatina 16, cefalostatina 17, cefalostatina 18, y cefalostatina 19.
Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto Maytenus serrata del África del este (Patente de Estados Unidos No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de C-3 maitansinol (Patente de Estados Unidos No. (4,151,042). El maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348;
4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533.
Se han conjugado maitansina y maitansinoides a anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de células tumorales. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,208,020, 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado como DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorectal humano. Se observó que el conjugado era altamente citotóxico hacia las células del cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento de tumores in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que se conjugó un maitansinoide a través de un enlace disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu.
Existen muchos grupos enlazadores conocidos en la técnica para fabricar conjugados anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 5,208,020 o Patente EP 0 425 235 B1, y Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992). Los grupos enlazadores incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa o grupos lábiles a esterasa, tal como se describe en las patentes identificadas anteriormente, siendo preferidos los grupos disulfuro y tioéter.
Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden fabricar utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como, dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como, bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 [1978]), y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro. [0160] El enlazador se puede unir a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace éster puede estar formado por la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede tener lugar en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de
maitansinol.
Caliqueamicina
Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo de unión a CD20 conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN de doble cadena a concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, véase las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,770,710; 5,773,001; y 5,877,296 (todas de la American Cyanamid Company). Entre los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitación, \gamma_{1}^{1}, \alpha_{2}^{1}, \alpha_{3}^{1}, N-acetil-\gamma_{1}^{1}, PSAG, y \theta_{1}^{1} (Hinman et al, CancerRes 53: 3336-3342 (1993); Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) y las patentes de Estados Unidos mencionadas anteriormente de American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral al que el anticuerpo se puede conjugar es QFA, un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos aumenta ampliamente sus efectos citotóxicos.
Isótopos radioactivos
Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Existe un conjunto de isótopos radioactivos disponibles para la producción de anticuerpos anti-CD20 radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32}, Pb^{212} e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se utiliza el conjugado para el diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo para estudios centellográficos, por ejemplo tc^{99m} o I^{123}, o un marcador de spin para la obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagen por resonancia magnética, mri), tal como yodo-123, de nuevo, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los radiomarcadores u otros marcadores se pueden incorporar en el conjugado de varias maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar mediante la síntesis química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, fluor-19 en lugar de hidrógeno. Los marcadores, tales como, tc^{99m} o I^{123}, Re^{186}, Re^{188} e In^{111} se pueden unir mediante un residuo de cisteína en el péptido. El ytrio-90 se puede unir mediante un residuo de lisina. El método de IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57) se puede utilizar para incorporar yodo-123. "Monoclonal antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden fabricar utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador separable" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador lábil en ácido, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131; Patente de Estados Unidos No. 5,208,020).
Usos terapéuticos de los anticuerpos de unión a CD20
Los anticuerpos de unión a CD20 de la presente invención son útiles para tratar un conjunto de enfermedades malignas y no malignas, incluyendo enfermedades autoinmunes y patologías relacionadas, y los cánceres positivos en CD20 incluyendo linfomas y leucemias de células B. Las células madre (progenitores de células B) en la médula ósea carecen del antígeno CD20, permitiendo que las células B sanas se regeneren después del tratamiento y vuelvan a niveles normales en varios meses.
Las enfermedades autoinmunes o patologías relacionadas con el sistema autoinmune incluyen artritis (artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriática), psoriasis, dermatitis incluyendo dermatitis atópica; urticaria autoinmune crónica, polimiositis/dermatomiositis, necrólisis epidérmica tóxica, escleroderma sistémica y esclerosis, respuestas asociadas con enfermedad inflamatoria de intestino (IBD) (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), síndrome de insuficiencia respiratoria, síndrome de insuficiencia respiratoria adulta (ARDS), meningitis, rinitis alérgica, encefalitis, uveitis, colitis, glomerulonefritis, patologías alérgicas, eczema, asma, patologías que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, aterosclerosis, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesión a leucocitos, lupus eritematoso sistémico (SLE), lupus (incluyendo nefritis, no renal, discoide, alopecia), diabetes de inicio juvenil, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica, respuestas inmunes asociadas con una hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citoquinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis (incluyendo ANCA), anemia aplástica, anemia positive de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica inmune incluyendo anemia hemolítica autoinmune (AIHA), anemia perniciosa, aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA), deficiencia del Factor VIII, hemofilia a, neutropenia autoinmune, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, trastornos inflamatorios del SNC, síndrome de lesión orgánica múltiple, miastenia gravia, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermead de la membrana basal anti-glomerular, síndrome del anticuerpo anti-fosfolípido, neuritis alérgica, enfermedad de Becher, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens-Johnson, rechazo del transplante de órganos sólidos (incluyendo el pretratamiento para títulos elevados de anticuerpo ractivos en panel, depósitos de IgA en tejidos, etc), enfermedad de injerto frente a huésped (GVHD), penfigoide bulloso, penfigus (incluyendo vulgaris, foliatis), poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad de Reiter, síndrome de la persona rígica, arteritis de células gigantes, nefritis compleja inmune, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM o neuropatía mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, enfermedad autoinmune de los testículos y ovario incluyendo orquitis autoinmune y ooforitis, hipotiroidismo primario; enfermedades endocrinos autonimunes incluyend tiroiditis autoinmune, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hsahimoto), tiroiditis subaguda, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Addison, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), diabetes tipo I también referido como diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) y síndrome de Sheehan; hepatitis autoinmune, penumonitis intersticial linfoide (HIV), bronquiolitis obliterans (no transplante) vs. NSIP, síndrome de Guillain-Barre, Vasculitis de Vaso Grande (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de célula gigante (de Takayasu), vasculitis de vaso medio (incluyendo la enfermedad de Kawasaki y la poliarteritis nodosa), espondilitis anquilosante, enfermedad de erger (nefropatía de IgA), Glomerulonefritis Rápidamente Progresiva, Cirrosis Biliar Primaria, esprúe celíaco (enteropatía de gluten), crioglobulinemia, ALS, enfermedad de arterias coronarias.
Los cánceres positivos en CD20 son aquellos que comprenden una proliferación anormal de células que expresan CD20 en la superficie celular. Los neoplasmas de células B positivos en CD20 incluyen la enfermedad de Hodgkin positivo de CD20, incluyendo la enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD); linfoma no de Hodgkin (NHL); linfomas de células foliculares centrales (FCC); leucemia linfocítica aguda (ALL); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia de célula pilosa. El linfoma no de Hodgkin incluye el linfoma no de Hodgkin (NHL) de grado bajo/folicular, linfoma linfocítico pequeño (SLL), NHL de grado intermedio/folicular, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de grado elevado, NHL linfoblástico de grado elevado, NHL de célula no dividida pequeña de grado elevado, NHL de enfermedad voluminosa, linfoma linfocítico plasmacitoide, linfoma de células de manto, linfoma relacionado con el SIDA y macroglobulinemia de Waldenstrom. También se contempla el tratamiento de recaídas de estos cánceres. LPHD es un tipo de enfermedad de Hodgkin que tiende frecuentemente a la recaída a pesar de los tratamientos de radiación o quimioterapia y se caracteriza por células malignas positivas de CD20. CLL es uno de los cuatro tipos principales de leucemia. Un cáncer de células B maduras denominadas linfocitos, CLL es manifiesta por la acumulación progresiva de células en la sangre, médula ósea y tejidos linfáticos.
En realizaciones específicas, los anticuerpos de unión a CD20 humanizados y los fragmentos funcionales de los mismos son para su uso en el tratamiento del linfoma no de Hodgkin (NHL), enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD), linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia linfocítica crónica, artritis reumatoide y artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico (SLE) incluyendo nefritis de lupus, enfermedad de Wegener, enfermedad de intestino inflamado, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombicitopénica trombótica (ITP), trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, miastenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis.
Los anticuerpos de unión a CD20 humanizados o fragmentos funcionales de los mismos son útiles como tratamiento con un único agente en, por ejemplo, NHL de células B positivo de CD20 de grado bajo o folicular recidivante o refractario o se pueden suministrar a pacientes conjuntamente con otros fármacos un régimen con múltiples fármaco.
El linfoma indolente es una enfermedad incurable de crecimiento lento en la que el paciente medio sobrevive entre seis y diez años después de numerosos periodos de remisión y recaída. En una realización, los anticuerpos de unión a CD20 humanizados o fragmentos funcionales de los mismos se utilizan para tratar el NHL indolente.
Los parámetros para evaluar la eficacia o éxito del tratamiento del neoplasma será conocidos por el médico experto en la enfermedad apropiada. En general, el médico experto buscará la reducción en los signos y síntomas de la enfermedad específica. Los parámetros pueden incluir el tiempo para la progresión de la enfermedad, el tiempo de remisión, y la enfermedad estable.
Las siguientes referencias describen linfomas y CLL, sus diagnósticos, tratamiento y procedimientos médicos estándar para la medición de la eficacia del tratamiento.
Las siguientes referencias describen linfomas y CLL, sus diagnósticos, tratamiento y procedimientos médicos estándar para la medición de la eficacia del tratamiento. Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K y Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, pp 1293-1338, en: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; and Rai, K and Patel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, en: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000.
Los parámetros para evaluar la eficacia o el éxito del tratamiento de una enfermedad autoinmune o enfermedad relacionada con el sistema autoinmune son conocidos por el médico experto en la enfermedad apropiada. En general, el médico experto buscará la reducción en los signos y síntomas de la enfermedad específica. Los siguientes se muestran a modo de ejemplo.
En una realización, los anticuerpos de la presente invención son útiles para tratar la artritis reumatoide. La RA se caracteriza por la inflamación de múltiples articulaciones, pérdida de cartílago y la erosión ósea que conduce a la destrucción de la articulación y en último término a una reducción en la función de la articulación. Adicionalmente, dado que RA es una enfermedad sistémica, puede tener efectos en otros tejidos, tales como los pulmones, ojos y médula ósea. Menos de un 50 por ciento de los pacientes que han padecido RA durante más de 10 años pueden continuar trabajando o actuando de formal normal en el día a día.
Los anticuerpos se pueden utilizar como una terapia de primera línea en pacientes con RA precoz (es decir, metotrexato (MTX) original) y como monoterapia o en combinación con, por ejemplo, MTX o ciclofosfamida. O, los anticuerpos se pueden utilizar en el tratamiento como terapia de segunda línea para pacientes que eran refractarios de DMARD y/o MTX, y como monoterapia o en combinación con, por ejemplo, MTX. Los anticuerpos de unión a CD20 humanizados son útiles para prevenir y controlar el daño en las articulaciones, retrasar el daño estructural, disminuir el dolor asociado con la inflamación en RA, y reducir en general los signos y síntomas en RA de moderada a severa. El paciente con RA se puede tratar con el anticuerpo CD20 humanizado antes de, después de o junto con el tratamiento con otros fármacos utilizados en el tratamiento de RA (véase la terapia de combinación a continuación). En una realización, los pacientes en los que no había tenido éxito los fármacos antireumáticos que modifican la enfermedad y/o no tuvieron una respuesta inadecuada al metotrexato solo se tratan con un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la presente invención. En una realización de este tratamiento, los pacientes se encuentran en un régimen de tratamiento de 17 días que reciben el anticuerpo de unión a CD20 humanizado solo (1 g de perfusiones iv en los días 1 y 15); anticuerpo de unión a CD20 más ciclofosfamida (750 mg de infusión iv en los días 3 y 17); o anticuerpo de unión a CD20 más metotexato.
Un método de evaluación de la eficacia del tratamiento en RA se basa en el criterio de la American College of Rheumatology (ACR), que mide el porcentaje de mejora en articulaciones blandas e hinchadas, entre otras cosas. El paciente con RA se puede valorar en, por ejemplo, ACR 20 (mejora de un 20 por ciento) en comparación con el tratamiento sin anticuerpo (por ejemplo, línea base antes del tratamiento) o tratamiento con placebo. Otras maneras de evaluar la eficacia del tratamiento con anticuerpo incluyen la valoración con rayos X, tal como la valoración con rayos X Sharp utilizada para valorar el daño estructural, tal como la erosión ósea y el estrechamiento del espacio de las articulaciones. Los pacientes también se pueden evaluar por la prevención o mejora en la discapacidad en base a la valoración según el Cuestionario de Valoración de la Salud [HAQ], valoración AIMs, SF-36 en periodos de tiempo durante o después del tratamiento. El criterio de ACR20 puede incluir la mejora del 20% tanto en el recuento de articulaciones blandas como en el recuento de articulaciones hinchadas más un 20% de mejora en al menos 3 de 5 de las mediciones adicionales:
1. valoración del dolor del paciente mediante la escala análoga visual (VAS),
2. valoración global del paciente de la actividad de la enfermedad (VAS),
3. valoración global del médico de la actividad de la enfermedad (VAS),
4. discapacidad autovalorada por el paciente medida por el Cuestionario de Valoración de la Salud, y
5. reactivos de fase aguda, CRP o ESR.
La ACR 50 y 70 se definen de manera análoga. Preferiblemente, el paciente se administra una cantidad de un anticuerpo de unión a CD20 de la invención eficaz para conseguir por los menos una valoración de ACR 20, preferiblemente por lo menos ACR 30, más preferiblemente por lo menos ACR 50, incluso más preferiblemente por lo menos ACR 70, lo más preferible por lo menos ACR 75 y superior.
La artritis psoriática tiene características radiográficas únicas y distintas. Para la artritis psoriática, la erosión de las articulaciones y el estrechamiento del espacio de las articulaciones se pueden evaluar mediante la evaluación Sharp también. Los anticuerpos de unión a CD20 humanizados de la invención se pueden utilizar para evitar el daño de unión, así como reducir los signos y síntomas de la enfermedad del trastorno.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de tratamiento del Lupus o SLE mediante la administración al paciente que padece de SLE, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención. Las valoraciones SLEDAI proporcionan una cuantificación numérica de la actividad de la enfermedad. SLEDAI es un índice ponderado de 24 parámetros clínicos y de laboratorio conocidos por correlacionarse con la actividad de la enfermedad, con un intervalo numérico de 0-103. Véase, Bryan Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" en Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521. Se cree que los anticuerpos para ADN de doble cadena provocan exacerbaciones renales y otras manifestaciones del lupus. Los pacientes que se someten a un tratamiento con anticuerpos se pueden monitorizar durante tiempo hasta la exacerbación renal, que se define como un incremento reproducible significativo en creatinina de suero, proteína en orina o sangre en orina. Alternativamente o adicionalmente, se pueden monitorizar los pacientes por los niveles de anticuerpos antinucleares y anticuerpos para ADN de doble cadena. Los tratamientos para SLE incluyen una dosis elevada de corticosteroides y/o ciclofosfamida (HDCC).
Las espondiloartropatías son un grupo de trastornos de las articulaciones, incluyendo la espondilitis anquilosante, artritis psoriática y enfermedad de Crohn. El éxito del tratamiento se puede determinar herramientas que miden la valoración global validad del médico y el paciente.
Se utilizan varios medicamentos para tratar la psoriasis; el tratamiento difiere directamente en relación con la gravedad de la enfermedad. Los pacientes con una forma más suave de psoriasis utilizan habitualmente tratamientos tópicos, tales como esteroides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol y tazaroteno, para tratar la enfermedad, mientras que los pacientes con una psoriasis moderada y severa tiene más posibilidades de utilizar terapias sistémicas (metotrexato, retinoides, cicloporina, PUVA y UVB). También se utilizan alquitranes ("tars"). Estas terapias presentan una combinación de cuestiones de seguridad, regímenes consumidores de tiempo o procesos inconvenientes de tratamiento. Además, algunos requieren un equipamiento caro y un espacio en la oficina. Las medicaciones sistémicas pueden producir efectos secundarios serios, incluyendo hipertensión, hiperlipidemia, supresión de la médula ósea, enfermedad hepática, y trastorno gastrointestinal. Además, el uso de fototerapia puede aumentar la incidencia de los cánceres de piel. Además del inconveniente y la incomodidad asociada con el uso de terapias locales, la fototerapia y los tratamientos sistémicos requieren ciclar los pacientes con y sin terapia y monitorizar el riesgo vital debido a sus efectos secundarios.
La eficacia del tratamiento para la psoriasis se valora monitorizando los cambios en los signos clínicos y los síntomas de la enfermedad incluyendo cambios de en la Valoración Global del Médico (Physician's Global Assessment (PGA)) y las valoraciones del Índice del Área y Gravedad de la Psoriasis (Psoriasis Area and Severity Index (PASI)), Valoración de los Síntomas de la Psoriasis (PSA) (Psoriasis Symptom Assessment (PSA)), en comparación con la condición base. El paciente se puede analizar periódicamente a lo largo del tratamiento en la escala análoga visual para indicar el grado de picor experimentado en puntos de tiempo específicos.
Los pacientes pueden experimentar una reacción de infusión o síntomas relacionados con la infusión con su primera infusión de un anticuerpo terapéutico. Estos síntomas varían en gravedad y en general son reversibles con intervención médica. Estos síntomas incluyen, pero sin limitación, fiebre de tipo gripe, resfriados/temblores, náusea, urticaria, dolor de cabeza, broncoespasmos, angioedema. Sería deseable para los métodos de tratamiento de la enfermedad de la presente invención minimizar las reacciones de infusión. De este modo, otro aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento de las enfermedades descritas mediante la administración de un anticuerpo de unión a CD20 humanizado, en el que el anticuerpo tiene una citotoxicidad dependiente de complemento reducida o nula y da lugar a síntomas relacionados con la infusión reducidos en comparación con el tratamiento con Rituxan®. En una realización, el anticuerpo de unión a CD20 humanizado es 2H7.v116.
Dosificación
Dependiendo de la indicación a tratar y los factores relevantes para la dosificación con los que un técnico en la materia estará familiarizado, los anticuerpos de la invención se administrarán en una dosis que es eficaz para el tratamiento de esa indicación a la vez que se minimizan la toxicidad y los efectos secundarios. Para el tratamiento de un cáncer positivo de CD20 o una enfermedad autoinmune, la dosis terapéuticamente eficaz estará en el intervalo de aproximadamente 250 mg/m^{2} a aproximadamente 400 mg/m^{2} ó 500 mg/m^{2}, preferiblemente aproximadamente 250-375 mg/m^{2}. En una realización, el intervalo de la dosis es de 275-375 mg/m^{2}. En una realización del tratamiento de un neoplasma de células B positivas en CD20, el anticuerpo se administra en un intervalo de 300-575 mg/m^{2}. Para el tratamiento de pacientes que padecen de linfoma de células B, tales como el linfoma no de Hodgkin, los anticuerpos anti-CD20 y los anticuerpos anti-CD20 humanizados de la invención pueden ser para un paciente humano a una dosis de 10 mg/kg ó 375 mg/m^{2}. Para el tratamiento de NHL, un régimen de dosificación sería administrar una dosis de la composición de anticuerpos, una dosis de 10 mg/kg en la primera semana de tratamiento, seguido de un intervalo de dos semanas, entonces se administra una segunda dosis de la misma cantidad de anticuerpo. En general, los pacientes con NHL reciben dicho tratamiento una vez durante un año, pero tras la recurrencia del linfoma, se puede repetir dicho tratamiento. En otro régimen de dosificación, los pacientes tratados con NHL de grado bajo reciben cuatro semanas de una versión de 2H7 humanizado, preferiblemente v16 (375 mg/m^{2} semanalmente) seguido en la semana cinco por tres tratamientos adicionales del anticuerpos más quimioterapia CHOP estándar (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona) o CVP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona), que se administró cada tres semanas durante tres ciclos.
Para el tratamiento de la artritis reumatoide, en una realización, el intervalo de dosis para el anticuerpo humanizado es de 125 mg/m^{2} (equivalente a aproximadamente 200 mg/dosis) a 600 mg/m^{2}, administrado en dos dosis, por ejemplo, la primera dosis de 200 mg se administra en el día uno seguido de una segunda dosis de 200 mg en el día 15. En realizaciones diferentes, la dosis es 250 mg/dosis, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg.
En el tratamiento de la enfermedad, los anticuerpos de unión a CD20 se pueden administrar al paciente de forma crónica o de forma intermitente, según se determine por el médico experto en la enfermedad.
El paciente administrado con un fármaco mediante infusión intravenosa o subcutáneamente puede experimentar efectos adversos, tales como fiebre, resfriados, sensación de quemazón, astenia y dolor de cabeza. Para aliviar o minimizar dichos efectos adversos, el paciente puede recibir una dosis o variad dosis de acondicionamiento inicial del anticuerpo seguido de una dosis terapéutica. La dosis o varias dosis de acondicionamiento serán inferiores que la dosis terapéutica para acondicionar el paciente para tolerar dosis más elevadas.
Ruta de administración
Los anticuerpos de unión a CD20 son para la administración a un paciente humano según métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, mediante rutas subcutáneas, intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, intra-articular, intrasinovial, intratecal, o por inhalación, generalmente mediante administración intravenosa o subcutánea.
Un anticuerpo humanizado puede ser para la administración mediante infusión intravenosa con una solución de cloruro sódico al 0,9% como vehículo de infusión.
Terapia de combinación
En el tratamiento de neoplasmas de células B descritos anteriormente, el paciente se puede tratar con los anticuerpos de unión a CD20 de la presente invención conjuntamente con uno o más agentes terapéuticos, tales como un agente quimioterapéutico en un régimen de multifármacos. El anticuerpo de unión a CD20 se puede administrar de manera conjunta, secuencialmente o de manera alternativa con el agente quimioterapéutico, o después de la falta de respuesta con otra terapia. La quimioterapia estándar para el tratamiento de linfomas puede incluir ciclofosfamida, citarabina, melfalán y mitoxantrona más melfalán. CHOP es uno de los regímenes de quimioterapia más habituales para tratar el linfoma no de Hodgkin. Los siguientes son los fármacos utilizados en el régimen CHOP: ciclofosfamida (nombres comerciales citoxano, neosar); adriamicina (doxorrubicina/hidroxidoxorrubicina); vincristina (Oncovin); y prednisolona (algunas veces denominada Deltasona u Orasona). Un anticuerpo de unión a CD20 puede ser para la administración a un paciente con necesidad de la combinación con uno o más de los siguientes agentes quimioterapéuticos de doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina y prednisolona. Un paciente que padece de un linfoma (tal como un linfoma no de Hodgkin) se puede tratar con anticuerpo anti-CD20 de la presente invención conjuntamente con terapia CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona). Un paciente con cáncer se puede tratar con un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la presente invención en combinación con quimioterapia CVP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona). Un paciente que padece de NHI positivo de CD20 se puede tratar con 2H7.v16 humanizado conjuntamente con CVP. En el tratamiento de CLL, se puede admsnistrar un anticuerpo de unión a CD20 conjuntamente con quimioterapia con uno o ambos de fludarabina y citoxano.
En el tratamiento de las enfermedad autoinmunes o patologías relacionadas con el sistema autoinmune descritas anteriormente, el paciente se puede tratar con los anticuerpos de unión a CD20 de la presente invención conjuntamente con un segundo agente terapéutico, tal como un agente inmunosupresor, tal como en un régimen con multi fármacos. El anticuerpo de unión a CD20 se puede administrar conjuntamente, secuencialmente o de manera alternativa con el agente inmunosupresor o tras una falta de respuesta con otra terapia. El agente inmunosupresor se puede administrar en las misma dosis o inferiores que las indicadas en la técnica. El agente inmunosupresor adjunto preferido dependerá de muchos factores, incluyendo el tipo de trastorno en tratamiento, así como el historial del paciente.
"Agente inmunosupresor" tal como se utiliza aquí para la terapia adjunta se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune de un paciente. Dichos agentes incluirían sustancias que suprimen la producción de citoquinas, desfavorecen o suprimen la expresión de autoantígenos, o enmascaran los antígenos MHC. Entre los ejemplos de dichos agentes se incluyen esteroides, tales como glucocorticosteroides, por ejemplo, prednisona, metilprednisolona, y dexametasona; pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (véase la Patente de Estados Unidos No. 4,665,077), azatioprina (o ciclofosfamida, si existe una reacción adversa a azatioprina); bromocriptina; glutaraldehído (que enmascara los antígenos MHC, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 4,120,649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos MHC, ciclosporina A; citoquina o antagonistas receptores de citoquinas, incluyendo anticuerpos anti-interferón-\gamma, -\beta, o -\alpha; anticuerpos anti-factor-\alpha de necrosis tumoral; anticuerpos anti-factor-\beta de necrosis tumoral; anticuerpos anti-interleuquina-2 y anticuerpos anti-receptor IL-2; anticuerpos anti-L3T4; globulinas heterólogas anti-linfocitos; anticuerpos pan-T, preferiblemente anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de unión a LFA-3 (WO 90/08187 publicada 7/26/90); estreptoquinasa; TGF-\beta; estreptodornasa; ARN o ADN del huésped; FK506; RS-61443; desoxiespergualina; rapamicina; receptor de células T (Patente de Estados Unidos No. 5,114,721); fragmentos de receptores de células T (Offner et al., Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; y WO 91/01133); y anticuerpos de receptores de células T (EP 340,109), tal como T10B9.
Para el tratamiento de la artritis reumatoide, el paciente se puede tratar con un anticuerpo CD20 de la invención conjuntamente con alguna o más de los siguientes fármacos: DMARDS (fármacos antireumatoides que modifican la enfermedad (por ejemplo, metotrexato), NSAI o NSAID (fármacos antiinflamatorios no esteroidales), HUMIRA^{TM} (adalimumab; Abbott Laboratories), ARAVA ® (leflunomida), REMICADE® (infliximab; Centocor Inc., of Malvern, Pa), ENBREL (etanercept; Immunex, WA), inhibidores COX-2, DMARDs utilizados habitualmente en RA son hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicilamina, Gold (oral), Gold (intramuscular), minociclina, ciclosporina, inmunoadsorción de proteína A de Estafilococo. Adalimumab es un anticuerpo monoclonal humano que se une a TNF\alpha. Infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico que se une a TNF\alpha. Etanercept es una proteína de fusión a "inmunoadhesina" que consiste en la parte de unión de ligando extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral de 75 kD (p75) humano unida a la parte Fc de una IgG1 humana. Para el tratamiento convencional de RA, véase, por ejemplo, "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (Febrero, 2002). En una realización específica, el paciente de RA se trata con un anticuerpo CD20 de la invención conjuntamente con metotrexato (MTX). Una dosis de ejemplo de MTX es aproximadamente 7,5-25 mg/kg/semana. MTX se puede administrar oralmente y
subcutáneamente.
Para el tratamiento de la espondilitis anquilosante, la arthritis psoriática y la enfermedad de Crohn, el paciente se puede tratar con un anticuerpo de unión a CD20 de la invención conjuntamente con, por ejemplo, Remicade® (infliximab; de Centocor Inc., of Malvern, Pa.), ENBREL (etanercept; Immunex, WA).
Los tratamientos para SLE incluyen corticosteroides de dosis elevada y/o ciclofosfamida (HDCC).
Para el tratamiento de la psoriasis, se puede administrar a los pacientes un anticuerpo de unión a CD20 conjuntamente con tratamientos tópicos, tales como esteroides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol y tazaroteno, o con metotrexato, retinoides, ciclosporina, terapias PUVA y UVB. Una paciente con psoriasis se puede tratar con el anticuerpo de unión a CD20 se manera secuencial o conjunta con ciclosporina.
Formulaciones farmacéuticas
Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos de unión a CD20 según la presente invención se preparan para su almacenamiento mezclando un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butil o bencil alcohol; alquil parabens, tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, argnina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA, azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contrapones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG).
En WO98/56418 se describen formulaciones de anticuerpo anti-CD20 de ejemplo. Otra formulación es una formulación multidosis líquida que comprende el anticuerpo anti-CD20 a 40 mg/mL, acetato 25 mM, trehalosa 150 mM, alcohol bencílico al 0,9%, polisorbato 20 al 0,02% a pH 5,0 que tiene una vida de almacenamiento mínimo de dos años a 2-8ºC. Otra formulación anti-CD20 de interés comprende 10 mg/mL de anticuerpo en cloruro de sodio 9,0 mg/mL, citrato sódico dihidratado 7,35 mg/mL, polisorbato 80 0,7 mg/mL y Agua estéril para la Inyección, pH 6,5. Otra formulación farmacéutica acuosa comprende acetato de sodio 10-30 mM de aproximadamente pH 4,8 a aproximadamente pH 5,5, preferiblemente a pH 5,5, polisorbato como tensoactivo en una cantidad de aproximadamente 0,01-0,1% v/v, trehalosa en una cantidad de aproximadamente 2-105 p/v, y bencil alcohol como conservante (U.S. 6,171,586). Las formulaciones liofilizadas adaptadas para la administración subcutánea se describen en WO97/04801. Dichas formulaciones liofilizadas se pueden reconstituir con un diluyente adecuado hasta una concentración elevada de proteína y la formulación reconstituida se puede administrar subcutáneamente al mamífero para ser tratado en la presente invención.
Una formulación para el anticuerpo humanizado es un anticuerpo a 12-14 mg/mL en histidina 10 mM, sacarosa al 6%, polisorbato 20 al 0,02%, pH 5,8.
Un anticuerpo de la presente invención y en particular 2H7.v16 se puede formular a 20 mg/mL de anticuerpo en sulfato de histidina 10 mM, sacarosa 60 mg/ml, polisorbato 20 0,2 mg/ml y Agua Estéril para Inyección a pH 5,8.
La formulación de la presente invención puede contener también más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no afectan de manera adversa entre si. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente citotóxico, agente quimioterapéutico, citoquina o agente inmunosupresor (por ejemplo, uno que actúe en células T, tales como ciclosporina o un anticuerpo que se une a células T, por ejemplo, uno que se una a LFA-1). La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y otros factores descritos anteriormente. Éstos se utilizan en general en las mismas dosis y con las rutas de administración tal como se describen aquí o aproximadamente de un 1 a un 99% de las dosis utilizadas hasta ahora.
Los principios activos también pueden estar contenidos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización entre fases, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.
Artículos de fabricación y kits
Otra realización de la presente invención es un artículo de fabricación tal como se establece en las reivindicaciones que contiene materiales útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y patologías relacionadas y cánceres positivos de CD20, tales como linfoma no de Hodgkin. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para el tratamiento de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de unión a CD20 de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la patología particular. La etiqueta o prospecto comprenderán también instrucciones para administrar la composición de anticuerpos al paciente. El prospecto se refiere a instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen la información sobre las indicaciones, utilización, dosis, administración, contraindicaciones y/o avisos sobre el uso de dichos productos terapéuticos. En una realización, la etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza para el tratamiento del linfoma de no Hodgkin.
Adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Se pueden incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Los kits son útiles para varios objetivos, por ejemplo, ensayos para eliminar células B, como control positivo para ensayos de apoptosis, para la purificación o inmunoprecipitación de CD20 de las células. Para el aislamiento y purificación de CD20, el kit puede contener un anticuerpo anti-CD20 acoplado a partículas (por ejemplo, partículas de sefarosa). Los kits se pueden disponer para que contengan los anticuerpos para la detección y cuantificación de CD20 in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Como con el artículo de fabricación, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. El recipiente contiene una composición que comprende por lo menos un anticuerpo anti-CD20 de la invención. Se pueden incluir recipientes adicionales que contengan, por ejemplo, diluyentes y tampones, anticuerpos de control. La etiqueta o prospecto puede proporcionar la descripción de la composición, así como las instrucciones para el uso in vitro o de diagnóstico
pretendido.
CD20 de mono Cynomolgus
En la figura 19 se muestra un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID No. 24 del CD20 de mono Cynomolgus. El ácido nucleico puede ser ADNc. Un ácido nucleico que codifica el CD20 de mono puede ser un vector de expresión para la expresión en una célula huésped. La secuencia de nucleótidos de SEC Id No. 24 en el vector de expresión se puede unir operativamente a una secuencia control de expresión, tal como un promotor o promotor y potenciador. La secuencia de control de la expresión puede ser la secuencia nativa asociada normalmente con el gen de CD20 de Cynomolgus, o heterólogo al gen. También se describe un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos [SEC ID NO. 25; Fig. 19 & 20] del CD20 de mono Cynomolgus, así como células huésped que contienen el ácido nucleico de CD20 de Cynomolgus. Las células huésped pueden ser células eucariotas, por ejemplo, células CHO. También se contemplan proteínas de fusión que comprenden la secuencia de aminoácidos de CD20 de Cynomolgus de fragmentos de la secuencia
Ejemplos experimentales
Ejemplo 1
Humanización del anticuerpo monoclonal murino-anti CD20 2H7
La humanización del anticuerpo CD20 anti-humano murino, 2H7 (también referido aquí como m2H7, m por murino), se llevó a cabo en una serie de etapas de mutagénesis dirigida de sitio. Las secuencias de la región variable del anticuerpo 2H7 murino y el 2H7 quimérico con la V de ratón V y H de humano se han descrito en, por ejemplo las patentes de Estados Unidos 5.846.818 y 6.204.023. Los residuos CDR de 2H7 se identificaron mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de 2H7 murino (descritos en U.S. 5.846.818) con las secuencias de anticuerpos conocidos (Kabal et al., Sequences of proteins of immunological interest, Ed.5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Las regiones CDR para las cadenas pesadas y ligeras se definieron basándose en la hipervariabilidad de la secuencia (Kabat et al., supra) y se muestran en la Figura 1A y la Figura 1B, respectivamente. Usando oligonucleótidos sintéticos (Tabla 1), se usó la mutagénesis dirigida del sitio (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985)) para introducir las seis regiones de CDR de 2H7 murino en un armazón Fab humano completo que corresponde a una secuencia consenso V_{K}I, V_{H}III (subgrupo I de kappa V_{L}, subgrupo III de V_{H}) contenida en el plásmido pVX4 (Figura 2).
Se utilizó el fagémido pVX4 (Fig. 2) para la mutagénesis, así como para la expresión de F(ab) en E. coli. En base al fagémido pb0720, un derivado de pB0475 (Cunningham et al., Science 243: 1330-1336 (1989)), pVX4 contiene un fragmento de ADN que codifica un anticuerpo humanizado anti-IFN-\alpha (interferón \alpha) con una cadena ligera I del subgrupo \kappa de consenso humano (V_{L} \kappal-C_{L}) y una cadena pesada de subgrupo III de consenso humano (V_{H}III-C_{H}I). pVX4 también tiene un promotor de fosfatasa alcalina y una secuencia de Shine-Dalgamo ambos derivados de otro plásmido basado en pUC119 descrito previamente, pAK2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 4285 (1992)). Se introdujo un único sitio de restricción Spel entre el ADN que codifica las cadenas pesadas y ligeras de F(ab). Los primeros 23 aminoácidos en ambas cadenas ligera y pesada anti-IFN-\alpha son la secuencia señal de secreción StII (Chang et al., Gene 55: 189-196 (1987)).
Para construir la versión de intercambio de CDR de 2H7 (2H7.v2), se realizó la mutagénesis dirigida de sitio en una plantilla que contenía desoxiuridina de pVX4; las seis CDRs de anti-IFN-\alpha se cambiaron a los CDRs de 2H7 murinos. La molécula resultante se refiere como la versión 2 de 2H7 humanizado (2H7.v2), o la "versión de intercambio de CDR" de 2H7; contiene los residuos de CDR de m2H7 con los residuos FR de consenso humanos mostrados en las Figuras 1A y 1B. Se utilizaron 2H7.v2 humanizados en la humanización posterior.
La Tabla 1 muestra la secuencia de oligonucleótidos utilizada para crear cada uno de las CDRs de 2H7 murino (m2H7) en las cadenas L y H. por ejemplo, se utilizó el oligonucleótido de CDR-H1 para recrear la CDR1 de la cadena H de m2H7. CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 se refieren a las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena H, respectivamente; de forma similar, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 se refieren a cada una de las CDRs de la cadena L. Las sustituciones en CDR-H2 se realizaron en dos etapas con dos oligonucleótidos, CDR-H2A y CDR-H2B.
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TABLA 1 Secuencias de oligonucleótidos usadas para la construcción del intercambio de CDRs de 2H7 murino en el armazón humano en pVX4. Se subrayan los residuos cambiados para cada nucleótido 
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3 
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Para la comparación de las construcciones humanizadas, se construyó un plásmido que expresaba un Fab 2H7 quimérico (que contiene los dominios V_{H} y V_{L} murinos, y los dominios CH_{1} y C_{L} humanos) mediante la mutagénesis dirigida de sitio (Kunkel, supra) usando oligonucleótidos sintéticos para introducir los residuos de armazón murinos en 2H7.v2. La secuencia de la construcción de plásmido resultante para la expresión del Fab quimérico conocido como 2H7.v6.8, se muestra en la Figura 3. Cada cadena codificada del Fab contiene una secuencia señal de secreción StlI de 23 aminoácidos tal como se describe para pVX4 (Figura 2) anteriormente.
En base a la comparación de secuencias de los residuos de armazón de 2H7 murino con el armazón de consenso V_{\kappa}I,V_{H}III humano (Figuras 1A y 1B) y los anticuerpos humanizados previamente (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 4585-4289 (1992)), se introdujeron algunas mutaciones en el armazón en la construcción de Fab de 2H7.v2 mediante mutagénesis dirigida de sitio. Estas mutaciones dan lugar a un cambio de ciertos residuos de armazón consenso humano con respecto a los encontrados en el armazón de 2H7 murino, en los sitios que podrían afectar a las conformaciones de CDR o los contactos con antígeno. La versión 3 contenía V_{H}(R71V, N73K), la versión 4 contenía V_{H}(R71V), la versión 5 contenía V_{H}(R71V, N73K) y V_{L}(L46P) y la versión 6 contenía V_{H}(R71V, N73K) y V_{L}(L46P, L47W).
Las versiones de Fab quimérico y humanizado del anticuerpo m2H7 se expresaron con E. coli y se purificaron de la siguiente manera. Los plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli XL-1 Blue (Stratagene, San Diego, CA) para la preparación de ADN de cadena única y doble. Para cada variante, se secuenciaron completamente tanto las cadenas ligera como pesada usando el método de didesoxinucleótidos (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.). Los plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli 16C9, un derivado de MM294, se emplacaron en placas LB que contenían 5 \mug/ml de carbenicilina, y se seleccionó una única colonia para la expresión de proteína. La única colonia creció en 5 ml de LB-100 \mug/ml de carbenicilina durante 5-8 horas a 37ºC. Se añadió el cultivo de 5 ml a 500 ml de AP5-100 \mug/ml de carbenicilina y se dejó crecer durante 16 horas en un matraz de agitación con deflectores de 4L a 37ºC. El medio de AP5 consiste en: 1,5 g de glucosa, 11,0 de Hycase SF, 0,6 g de extracto de levadura (certificada), 0,19 g de MgSO_{4} anhidro, 1,07 g de NH_{4}Cl, 3,73 g de KCl, 1,2 g de NaCl, 120 ml de trietanolamina 1 M, pH 7,4 hasta 1L de agua y, después, se filtró de forma estéril a través de un filtro Sealkeen de 0,1 \mum.
Las células se cultivaron mediante centrifugación en una botella para centrífuga de 1L (Nalgane) a 3000xg y se extrajo el sobrenadante. Después de congelar durante 1 hora, el pélet se volvió a suspender en 25 ml de MES 10 mM - EDTA 10 Mm frío, pH 5,0 (tampón A). Se añadieron 250 \mul de PMSF 0,1M (Sigma) para inhibir la proteólisis y se añadieron 3,5 ml de lisozima de clara de huevo de gallina de 10 mg/ml (Sigma) de solución madre para ayudar a la lisis de la pared celular de la bacteria. Después de agitar suavemente en hielo durante 1 hora, la muestra se centrifugó a 40.000xg durante 15 minutos. Se llevó el sobrenadante a 50 ml con tampón A y se cargó en una columna de DEAE de 2 ml equilibrada con tampón A. A continuación, se aplicó un flujo continuo a una columna de proteína G-Sepharose CL-4B (Pharmacia) (0,5 ml de volumen de lecho) equilibrada con tampón A. Se lavó la columna con 10 ml de tampón A y se eluyó con 3 ml de glicina 0,3 M, pH 3,0 en 1,25 ml de Tris 1 M, pH 8,0. Se cambió el tampón del F(ab) a PBS utilizando un Centricon-30 (Amicon) y se concentró hasta un volumen final de 0,5 ml. Se desarrollaron los geles SDS-PAGE de todos los F(ab)s para establecer la pureza y se verificó el peso molecular de cada variante usando espectrometría de masas por electrospray.
En los ensayos de unión ELISA basados en células (descritos abajo), la unión de Fabs, incluyendo Fab de 2H7 quimérico, con CD20 era difícil de detectar. Por lo tanto, las versiones de Fab de 2H7 se reformaron como anticuerpos de IgG1 de longitud completa para ensayos y posterior mutagénesis.
Los plásmidos para la expresión de IgGs de longitud completa se construyeron mediante la subclonación de los dominios V_{H} y V_{L} de Fab de 2H7 quimérico (v6.8), así como las versiones 2 a 6 de Fab humanizado en los vectores pRK descritos previamente para la expresión en células de mamífero (Gorman et al.; DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). En resumen, cada construcción Fab se digirió con EcoRV y BlpI para escindir un fragmento V_{L}, que se clonó en los sitios EcoRV/BlpI del plásmido pDR1 (Fig. 4) para la expresión de la cadena ligera completa (dominios V_{L}-C_{L}). Adicionalmente cada construcción de Fab se digirió con PvuII y ApaI para escindir un fragmento V_{H} que se clonó en los sitios PvuII/ApaI del plásmido pDR2 (Fig.5) para la expresión de la cadena pesada completa (dominios VH-CH_{1}-región bisagra-CH_{2}-CH_{3}). Para cada variante de IgG, se realizaron transfecciones transitorias mediante la contrasfección de un plásmido que expresa la cadena ligera y un plásmido que expresa la cadena pesada en una línea de células de riñón embrionario humano transformadas por adenovirus, 293 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977)). En resumen, se separaron las células 293 en el día previo a la transfección, y se emplacaron en un medio que contenía suero. Al día siguiente, se añadió ADN de doble cadena preparado como un precipitado con fosfato cálcico, seguido por ADN pAdVAntage^{TM} (Promega, Madison, WI) y las células se incubaron durante la noche a 37ºC. Las células se cultivaron en el medio sin suero y se recogieron 4 días después. Los anticuerpos se purificaron de los sobrenadantes de cultivo usando la proteína A-Sepharose CL-4B, a continuación se intercambió el tampón por succinato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM, pH 6.0 y se concentró usando un Centricon-10 (Amicon). Las concentraciones de proteína se determinaron mediante análisis cuantitativo de aminoácidos.
Para medir las afinidades de unión relativas con el antígeno CD20, se desarrolló un ensayo ELISA basado en células. Las células WIL2-S de linfoblastoides B humanas (ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Rockville, MD) se crecieron en RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, HEPES 20 mM, pH 7,2 y suero bovino fetal inactivado por calor al 10% en un incubador de CO_{2} al 5% humidificado. Las células se lavaron con PBS que contenía FBS al 1% (tampón de ensayo) y se sembraron a razón de 250-300.000 células/pocillo en placas de base redonda de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Se añadieron a las placas muestras patrón diluidas en serie dos veces (15,6-1000 ng/ml de IgG quimérico de 2H7 v6.8) y muestras diluidas en serie tres veces (2,7-2000 ng/ml) en tampón de ensayo. Las placas se hundieron en hielo y se incubaron durante 45 minutos. Para extraer el anticuerpo no unido, se añadieron 0,1 mL de tampón de ensayo a los pocillos. Las placas se centrifugaron y se extrajeron los sobrenadantes. Las células se lavaron dos veces más con 0,2 mL de tampón de ensayo. Se detectó el anticuerpo unido a las placas mediante la adición de anticuerpo Fc anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a las placas. Después de una incubación de 45 minutos, las células se lavaron tal como se ha descrito anteriormente. El sustrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametil bencidina; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) se añadió a las placas. La reacción se paró añadiendo ácido fosfórico 1M. Las curvas de valoración se ajustaron con un programa de ajuste de curvas por regresión no lineal de cuatro parámetros (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA). Se determinaron la absorbancia en el punto medio de la curva de valoración (medio-OD) y su correspondiente concentración del patrón. A continuación, se determinó la concentración de cada variante en este medio-OD, y se dividió la concentración del patrón por la de cada variante. Por lo tanto, los valores son una proporción de la unión de cada variante en relación con el patrón. Las desviaciones estándar en la afinidad relativa (concentración equivalente) eran generalmente +/- 10% entre experimentos.
Tal como se muestra en la Tabla 2, la unión de la variante de intercambio de CDR (v.2) se redujo mucho en comparación con 2H7 quimérico (v.6.8). Sin embargo, las versiones 3 a 6 mostraron una unión mejorada. Para determinar el número mínimo de mutaciones que podrían necesitarse para restaurar la afinidad de unión con la de 2H7 quimérico, se construyeron mutaciones adicionales y combinaciones de mutaciones mediante la mutagénesis dirigida de sitio para producir las variantes 7 a 17 tal como se indica en la Tabla 2. En particular, éstas incluyen las mutaciones de V_{H} A49G, F67A, I69L, N73K y L78A; y mutaciones de V_{L} M4L, M33I y F71Y. Las versiones 16 y 17 mostraron las mejores afinidades de unión relativas, 2 veces la de la versión quimérica, sin diferencia significativa (s.d. = +/- 10%) entre las dos. Para minimizar el número de mutaciones, se eligió por tanto la versión 16, que tiene sólo 4 mutaciones de los residuos de armazón humano a los residuos de armazón murino (Tabla 2), como la forma humanizada para la caracterización adicional.
TABLA 2 Afinidad de unión relativa de variantes IgG 2H7 humanizado con CD20 en comparación con ELISA basada en células que usan 2H7 quimérico. La unión relativa se expresa como la concentración del 2H7 quimérico sobre la concentración de la variante requerida para la unión equivalente; por tanto, una proporción <1 indica una afinidad más débil por la variante. La desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/-10%. Las sustituciones del armazón en los dominios variables son en relación a la versión de intercambio de CDR de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., supra)
5
TABLA 3 Secuencias de oligonucleótidos usadas para la construcción de mutaciones VH (A49G, R71V, N73K) y VL(L46P) en la versión 16 de 2H7 humanizado (2H7.v16). Los codones subrayados codifican las sustituciones de aminoácidos indicadas. Para V_{H} (R71V, N73K) y V_{L}(L46P), los oligonucleótidos se muestran como la cadena de sentido, ya que éstos se usaron para la mutagénesis en la plantilla de Fab, mientras que para V_{H} (A49G), el oligonucleótido se muestran como la cadena anti-sentido, ya que éste se usó con la plantilla de pRK (IgG de cadena pesada). La secuencia de proteína de la versión 16 se muestra en la Figura 6 y la Figura 7 
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7 
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Ejemplo 2
Determinantes de unión a antígeno (paratopo) de 2H7
Las sustituciones de alanina (Cunningham & Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)) se realizaron en 2H7.v16 o 2H7.v17 para examinar las contribuciones de las cadenas laterales individuales del anticuerpo en la unión con CD20. Los variantes de IgG se expresaron en células 293 a partir de vectores pDR1 y pDR2, se purificaron y se analizaron por la afinidad de unión relativa tal como se ha descrito anteriormente. Algunas sustituciones de alanina dieron lugar a disminuciones significativas en la unión relativa con CD20 en células WIL-2S (Tabla 4).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 4 Efectos de las sustituciones de alanina en las regiones CDR de 2H7.v16 humanizado medidos usando un ELISA basada en células (células WIL2-S). La unión relativa se expresa como la concentración del 2H7.v16 parental sobre la concentración de la variante requerida para la unión equivalente: por tanto, una proporción <1 indica una afinidad más débil por la variante; una proporción >1 indica una afinidad más elevada por la variante. La desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/-10%. Las sustituciones del armazón en los dominios variables son en relación a 2H7.v16 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., supra). NDB significa que la unión no es detectable. Los dos números para la versión 45 son de experimentos separados
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Ejemplo 3
Mutaciones adicionales en las regiones CDR de 2H7
También se analizaron sustituciones de residuos adicionales y las combinaciones de sustituciones en posiciones de CDR que se identificaron como importantes mediante rastreo de Ala. Varias variantes de combinación, en particular v.96, parecieron unirse más fuertemente que v.16.
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TABLA 5 Efectos de combinaciones de mutaciones y de sustituciones no de alanina en los regiones CDR de 2H7.v16 humanizado medidos usando ELISA basado en células (células WIL2-S). La unión relativa con CD20 se expresa como la concentración del 2H7.v16 parental sobre la concentración de la variante requerida para la unión equivalente: por tanto, una proporción <1 indica una afinidad más débil por la variante; una proporción >1 indica una afinidad más elevada por la variante. La desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/-10%. Las sustituciones del armazón en los dominios variables son en relación a 2H7.v16 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., supra) 
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Ejemplo 4
Mutaciones en los sitios de sustituciones para humanización del armazón
Las sustituciones de los residuos adicionales en las posiciones del armazón que se cambiaron durante la humanización también se analizaron en el 2H7.v16 base. En particular, las sustituciones en el armazón alternativas que no se encontraron en el 2H7 parental murino ni en el armazón de consenso humano se fabricaron en V_{L} (P46) y V_{H} (G49, V71 y K73).
Estas sustituciones condujeron en general a pocos cambios en la unión relativa (tabla 6), indicando que existe cierta flexibilidad en los residuos del armazón en estas posiciones.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 6 Unión relativa en un ensayo basado en células (WIL2-S) de las sustituciones en el armazón. Las variaciones de IgG se muestran con mutaciones con respecto al 2H7.v16 base. La unión relativa se expresa como la concentración de la quimera 2H7.v6.8 sobre la concentración de la variante requerida para la unión equivalente: por tanto, una proporción <1 indica una afinidad más débil por la variante; una proporción >1 indica una afinidad más elevada por la variante. La desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/-10%. Las sustituciones del armazón en los dominios variables son en relación a 2H7.v16 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., supra). (*) Las variantes que se analizaron con 2H7.v16 como el comparador patrón; los valores relativos se normalizan con los de la quimera
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Ejemplo 5
Variantes de 2H7 humanizado con funciones efectoras potenciadas
Debido a que 2H7 puede mediar en la lisis de células B a través de tanto la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), se buscó producir variantes de 2H7.v16 humanizado con mejor actividad CDC y ADCC. Se han descrito mutaciones de ciertos residuos en las regiones Fc de otros anticuerpos se han descrito (Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571-2575 (200 1)) para mejorar la CDC a través de una mayor unión con el componente complemento Clq. También se han descrito mutaciones (Shields et aL, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Presta et al., Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002)) para mejorar ADCC a través de una mayor unión de IgG a receptores de Fc\gamma activantes y una menor unión de IgG a receptores Fc\gamma inhibidores. En particular, se han identificado tres mutaciones para mejorar las actividades CDC y ADCC: S298A/E333A/K334A (también referidos aquí como mutante o variante de triple Ala; la numeración en la región Fc es según el sistema de numeración EU; Kabat et al., supra) tal como se ha descrito (Idusogie et al., supra (2001); Shields et al.,
supra).
Con el fin de aumentar la actividad de CDC y ADCC de 2H7, se construyó un mutante de triple Ala de la Fc de 2H7. La variante humanizada del anticuerpo anti-Her2 4d5 se produjo con las mutaciones S298A/E333A/K334A y se conoce como 4D5Fc110 (es decir, IgG anti-p185HER2 (S298A/E333A/K334A); Shields et al., supra). Se digirió un plásmido, p4D5Fc110 que codificaba el anticuerpo 4D5Fc110 (Shields et al., supra) con ApaI y HindIII, y el fragmento de Fc (que contenía las mutaciones S298A/E333A/K334A) se unió en los sitios ApaI/HindIII del vector pDR2-v162 de la cadena pesada de H7, para producir pDR2-v31. La secuencia de aminoácidos de la cadena H completa de la versión 31 se muestra en la figura 8. La cadena L es la misma que la de la v.16.
Aunque los dominios constantes de la región Fc de los anticuerpos IgG1 se conservan relativamente en una especie determinada, existen variaciones alélicas (revisadas por Lefranc y Lefranc, en The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, pp. 43-78, F. Shakib (ed.), Pergammon Press, Oxford (1990)).
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TABLA 7 Efectos de sustituciones en la región fc en la unión a Cd20. La unión relativa a CD20 se midió en un ensayo basado en células (WIL2-S) de las sustituciones en el armazón. Las mutaciones de Fc (*) se indican mediante la numeración EU (Kabat, supra) y son en relación del 2H7.v16 parental. La combinación de los cambios de tres Ala en la región de Fc de v.31 se describe como "Fc110". Las variantes de IgG se muestran con mutaciones con respecto al 2H7.v17 base. La unión relativa se expresa como la concentración de la quimera 2H7.v6.8 sobre la concentración de la variante requerida para la unión equivalente: por tanto, una proporción <1 indica una afinidad más débil por la variante. La desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/-10% 
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Ejemplo 6
Variantes de 2H7 humanizado con mayor estabilidad
Para el desarrollo como proteínas terapéuticas, es deseable elegir variantes que permanecen estables con respecto a la oxidación, desamidación u otros procesos que pueden afectar a la calidad del producto en un tampón de formulación adecuada. En 2H7.v16, se identificaron varios residuos como posibles fuentes de inestabilidad: VL (M32) y VH (M34, N100). Por tanto, se introdujeron mutaciones en estos sitios por la comparación con v16.
TABLA 8 Unión relativa de variantes de 2H7 diseñadas para el aumento de la estabilidad y/o función efectora, con Cd20 en un ensayo basado en células (WIL2-S). Las variantes de IgG se muestran con mutaciones con respecto al 2H7.v16 base. La unión relativa se expresa como la concentración de la quimera 2H7.v6.8 sobre la concentración de la variante requerida para la unión equivalente: por tanto, una proporción <1 indica una afinidad más débil por la variante. La desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/-10%. Las sustituciones del armazón en los dominios variables son en relación a 2H7.v16 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat y las mutaciones de Fc (*) se indican mediante numeración EU (Kabat et al., supra). (**) Las variantes que se midieron con 2H7.v16 como el comparador patrón, los valores relativos se normalizaron con respecto a los de la quimera 
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Para analizar los efectos de las mutaciones de estabilidad en la velocidad de degradación de la proteína, se formularon 2H7.v16 y 2H7.v73 a 12-14 mg/mL en histidina 10 mM, sacarosa al 6%, polisorbato 20 al 0,02%, pH 5,8 y se incubaron a 40ºC durante 16 días. Las muestras incubadas se analizaron a continuación por los cambios en las variantes de carga mediante cromatografía de intercambio iónico, agregación y segmentación mediante cromatografía por exclusión de tamaño, y unión relativa mediante análisis en un ensayo basado en células (WIL2-S).
Los resultados (figura 9) muestran que 2H7 v.73 tiene una mayor estabilidad en comparación con 2H7 v.16 con respecto a pérdidas en la fracción del pico principal mediante cromatografía de intercambio iónico bajo condiciones de estabilidad aceleradas. No se observaron diferencias significativas con respecto a la agregación, fragmentación o afinidad de unión.
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Ejemplo 7
Análisis Scatchard de unión de anticuerpo a CD20 en células WIL2-S
Se determinaron las constantes de disociación de equilibrio (K_{d}) para la unión de las variantes de IgG 2H7 a células WIL2-S utilizando IgG 2H7 radiomarcada. Las variantes de IgG 2H7 se produjeron en células CHO. Se utilizaron Rituxan® (fuente para todos los experimentos es Genentech, S. San Francisco, CA) y 2H7 murino (BD PharMingen, San Diego, CA) para la comparación con variantes humanizadas. También está disponible el anticuerpo 2H7 murino de otras fuentes, por ejemplo, eBioscience, y Calbiochem (ambas de San Diego, CA), Accurate Chemical & Scientific Corp., (Westbury, NY), Ancell (Bayport, MN), y Vinci-Biochem (Vinci, Italia). Se realizaron todas las diluciones en tampón de ensayo de unión (medio DMEM que contenía albúmina de suero bovino al 1%, HEPES 25 mM pH 7,2, y azida sódica al 0,01%). Se dispensaron alícuotas (0,025 mL) de ^{125}I-2H7.v16 (yodado con lactoperoxidasa) a una concentración de 0,8 nM en pocillos de una placa de microensayo de 96 pocillos de fondo en V, y se añadieron diluciones en serie (0,05 mL) de anticuerpo frío y se mezclaron. A continuación, se añadieron células WIL2-S (60.000 células en 0,025 mL). Se selló la placa y se incubó a temperatura ambiente durante 24 h, a continuación se centrifugó durante 15 min a 3.500 RPM. A continuación, se aspiró el sobrenadante y se lavó y se centrifugó el pélet celular. Se aspiró otra vez el sobrenadante, y se disolvieron los pélets en NaOH 1N y se transfirieron a tubos para el recuento gamma. Se utilizaron los datos para el análisis Scatchard (Munson y Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1980)) utilizando el programa Ligand (McPherson, Comput. Programs Biomed. 17: 107-114 (1983)). Los resultados, mostrados en la Tabla 9, indican que las variantes de 2H7 humanizado tenían una afinidad de unión a CD20 similar en comparación con 2H7 murino, y afinidad de unión similar a Rituxan®. Se espera que 2H7.v31 tendrá una K_{d} muy similar a v.16 sobre la base de la unión mostrada en la Tabla 7 anterior.
TABLA 9 Afinidad de unión en equilibrio de variantes de 2H7 a partir de análisis Scatchard
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Ejemplo 8
Ensayos de Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC)
Se analizaron las variantes de IgG 2H7 por su capacidad de mediar lisis dependiente de complemento de células WIL2-S, una línea de células B linfoblastoides que expresa CD20, esencialmente tal y como se ha descrito (Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000); Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)). Se diluyeron 1:3 en serie los anticuerpos a partir de una solución madre 0,1 mg/mL. Se añadió una alícuota de 0,05 mL de cada dilución a una placa de cultivo tisular de 96 pocillos que contenía 0,05 mL de una solución de complemento humano normal (Quidel, San Diego, CA). A esta mezcla, se añadieron 50.000 células WIL2-S en un volumen de 0,05 mL. Después de la incubación durante 2 h a 37ºC, se añadieron 0,05 mL de una solución de azul de Alamar (Accumed International, Westlake, OH), y se continuó con incubación durante unas 18 h adicionales a 37ºC. A continuación, se extrajeron las cubiertas de las placas y se agitaron durante 15 min a temperatura ambiente en un agitador orbital. Se leyeron las unidades fluorescentes relativas (RFU) utilizando un filtro de excitación de 530 nm y un filtro de emisión de 590 nm. Se calculó una EC_{50} mediante el ajuste de RFU como una función de concentración para cada anticuerpo utilizando software de KaleidaGraph.
Los resultados (Tabla 10) muestran una mejora sorprendente en CDC por los anticuerpos 2H7 humanizados, con una potencia relativa similar a Rituxan® para v.73, 3 veces más potente que Rituxan® para v.75, y 3 veces más débil que Rituxan® para v.16.
TABLA 10 Actividad de CDC de anticuerpos 2H7 en comparación con Rituxan. Números >1 indican una actividad CDC menos potente que Rituxan® y números <1 indican una actividad más potente que Rituxan®. Se produjeron anticuerpos a partir de líneas CHO estables, excepto aquellos indicados mediante (*) que se produjeron transitoriamente
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Ejemplo 9
Ensayos de Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo (ADCC)
Se analizaron variantes de IgG 2H7 por su capacidad de mediar la lisis de células Natural-Killer (célula NK) de células WIL2-S, una línea de células B linfoblastoides que expresan CD20, esencialmente tal y como se ha descrito (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)) utilizando una lectura de lactato deshidrogenasa (LDH). Las células NK se prepararon a partir de 100 mL de sangre heparinizada, diluida con 100 mL de PBS (solución salina tamponada con fosfato), obtenida de donantes humanos normales que habían sido isotipadas para Fc\gammaRIII, también conocidos como CD16 (Koene et al., Blood 90:1109-1114 (1997)). En este experimento, las células NK eran de donantes humanos heterozigóticos para CD16 (F158/V158). La sangre diluida se puso en capas sobre 15 mL de medio de separación de linfocitos (ICN Biochemical, Aurora, Ohio) y se centrifugó durante 20 minutos a 2000 RPM. Se dispensaron los glóbulos blancos en la interfase entre capas en 4 tubos limpios de 50 ml, que se llenaron con medio RPMI que contenía suero de ternero fetal al 15%. Se centrifugaron los tubos durante 5 minutos a 1400 RPM y se descartó el sobrenadante. Se resuspendieron los pélets en tampón MACS (BSA al 0,5%, EDTA 2 mM), y se purificaron las células NK utilizando partículas (Kit de Aislamiento de Células NK, 130-046-502) según el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotech,). Se diluyeron las células NK en tampón MACS a 2x10^{6} células/ml.
Se añadieron diluciones en serie de anticuerpo (0,05 mL) en medio de ensayo (F12/DMEM 50:50 sin glicina, tampón HEPES 1 mM pH 7,2, Penicilina/Estreptomicina (100 unidades/mL; Gibco), glutamina, y suero bovino fetal inactivado por calor al 1%) a una placa de cultivo tisular de base redonda de 96 pocillos. Se diluyeron células WIL2-S en tampón de ensayo hasta una concentración de 4 x 10^{5}/mL. Se mezclaron las células WIL2-S (0,05 mL por pocillo) con anticuerpo diluido en la placa de 96 pocillos y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la unión de anticuerpo con CD20 (opsonización).
Se inició la reacción ADCC mediante la adición de 0,1 mL de células NK a cada pocillo. En pocillos de control, se añadió Triton X-100 al 2%. A continuación, se incubó la placa durante 4 h a 37ºC. Se midieron los niveles de LDH liberada utilizando un kit de detección de citotoxicidad (LDH) (Kit#1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana.) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se añadieron 0,1 mL de revelador de LDH a cada pocillo, seguido de mezclado durante 10 s. A continuación, se cubrió la placa con papel de aluminio y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, se leyó la densidad óptica a 490 nm y se utilizó para calcular el % de lisis mediante la división por el total de LDH medido en pocillos de control. Se representó la lisis en función de la concentración de anticuerpos, y se utilizó un ajuste de curva de 4 parámetros (KaleidaGraph) para determinar las concentraciones de EC_{50}.
Los resultados mostraron que los anticuerpos 2H7 humanizados fueron activos en ADCC, con una potencia relativa 20 veces mayor que Rituxan® para v.31 y v.75, 5 veces más potente que Rituxan® para v.16, y casi 4 veces más alta que Rituxan® para v.73.
TABLA 11 Actividad ADCC de anticuerpos 2H7 en células WIL2-S comparada con 2H7.v16, en base a n experimentos. (Valores >1 indican menor potencia que 2H7.v16, y valores <1 indican mayor potencia)
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Se llevaron a cabo ensayos de ADCC adicionales para comparar variantes de combinación de 2H7 con Rituxan®. Los resultados de estos ensayos indicaron que 2H7.v114 y 2H7.v115 tienen una potencia de ADCC >10 veces aumentada en comparación con Rituxan® (Tabla 12).
TABLA 12 Actividad ADCC de anticuerpos 2H7 en células WIL2-S comparada con Rituxan®, en base a n experimentos (Valores >1 indican una potencia menor que Rituxan®, y valores <1 indican mayor potencia)
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Ejemplo 10
Efectos in vivo de variantes de 2H7 en un estudio piloto en monos cynomolgus
Las variantes de 2H7, producidas por la transfección transitoria de células CHO, se evaluaron en monos cynomolgus (Macaca fascicularis) machos normales con el objetivo de evaluar sus actividades in vivo. Otros anticuerpos anti-CD20, tales como C2B8 (Rituxan®) han demostrado la capacidad de reducir las células B en primates normales (Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)).
En un estudio, se compararon variantes de 2H7 humanizado. En un estudio paralelo, también se evaluó el Rituxan® en monos cynomolgus. Se utilizaron cuatro monos en cada uno de los cinco grupos de dosis: (1) vehículo, (2) hu2H7.v16 0,05 mg/kg, (3) hu2H7.v16 10 mg/kg, (4) hu2H7.v31 0,05 mg/kg, y (5) hu2H7.v31 10 mg/kg. Se administraron anticuerpos de manera intravenosa a una concentración de 0, 0,2, ó 20 mg/mL, durante un total de dos dosis, una en el día 1 del estudio, y otra en el día 8. El primer día de la administración de la dosis se designa como el día 1 y el día previo se designa como día -1; el primer día de recuperación (para 2 animales en cada grupo) se designa como día 11. Se recogieron muestras de sangre en los días -19, -12, 1 (antes de la dosificación), y a las 6 h, 24 h y 72 h después de la primera dosis. Se tomaron muestras adicionales en el día 8 (antes de la dosificación), el día 10 (antes del sacrificio de 2 animales/grupo), y en los días 36 y 37 (para animales de recuperación).
Se determinaron las concentraciones de células B periféricas mediante un procedimiento FACS que contó las células CD3-/CD40+. Se obtuvo el porcentaje de células B CD3-CD40+ del total de linfocitos en muestras de mono mediante la siguiente estrategia de "gating". Se marcó la población de linfocito en el dispersigrama de dispersión directa/dispersión lateral para definir la Región 1 (R1). Utilizando los casos en R1, se mostraron trazos punteados de intensidad de fluorescencia para marcadores de CD40 y CD3. Se utilizaron controles de isotipo marcados fluorescentemente para determinar los puntos de corte respectivos para la positividad de CD40 y CD3.
Los resultados indicaron que tanto 2H7.v16 como 2H7.v31 fueron capaces de producir el reducción completo de células B periféricas en la dosis de 10 mg/kg y el reducción parcial de células B periféricas en la dosis de 0,05 mg/kg (Fig. 11). La evolución con el tiempo y el grado de reducción de células B medida durante las primeras 72 h de la administración de la dosis fueron similares para los dos anticuerpos. El análisis posterior de los animales de recuperación indicó que los animales tratados con 2H7.v31 1 mostraron un reducción prolongado de células B en comparación con los dosificados con 2H7.v16. En particular, los animales de recuperación tratados con 2H7.v16 10 mg/kg, las células B mostraron una recuperación sustancial de células B en algunos momentos entre la toma de muestras en el Día 10 y en el Día 36. No obstante, para los animales de recuperación tratados con 2H7.v31 10 mg/kg, las células B no mostraron recuperación hasta algún momento entre el Día 36 y el Día 67 (Fig. 11). Esto sugiere una mayor duración del reducción completo durante aproximadamente un mes para 2H7.v31 en comparación con 2H7.v16.
No se observó toxicidad en el estudio con monos a bajas o altas dosis y la patología a simple vista era normal. En otros estudios, se toleró bien v16 hasta la mayor dosis evaluada de (100 mg/kgx2 = 1200 mg/m^{2} x2) siguiendo la administración i.v. de 2 dosis administradas con 2 semanas de diferencia en estos monos.
Los datos en monos Cynomolgus con 2H7.v16 frente a Rituxan® sugiere que una reducción de 5 veces en la actividad de CDC no afecta de manera adversa a la potencia. Un anticuerpo con actividad ADCC potente pero actividad CDC reducida puede tener un perfil de seguridad más favorable con relación a las primeras reacciones de infusión que con mayor actividad CDC.
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Ejemplo 11
Anticuerpos variantes de 2H7 deficiente en fucosa con función efectora aumentada
Las células HEK293 y CHO normales añaden fucosa a oligosacárido de IgG hasta un grado elevado (97-98%). Las IgG de suero también estaban altamente glicosiladas.
Se utilizaron DP 12, una línea celular de CHO de dihidrofolato reductasa negativo (DHFR^{-}) que es competente con la fucosilación, y Lec13, una línea celular que es deficiente en fucosilación de proteínas, para producir anticuerpos para este estudio. Se obtuvo la línea celular de CHO Pro-Lec13.6a (Lec13) de la Catedrática Pamela Stanley del Albert Einstein College of Medicine de Yeshiva University. Las líneas parentales son Pro- (auxótrofo de prolina) y Gat- (auxótrofo de glicina, adenosina y timidina). La línea celular CHODP12 es un derivado de la línea celular CHO-Kl (ATCC #CCL-61), que es deficiente en dihidrofolato reductasa, y tiene una necesidad reducida por insulina. Se transfectaron las líneas celulares con ADNc utilizando el procedimiento Superfect (Qiagen, Valencia, CA). Se realizó la selección de las células Lec13 que expresan anticuerpos transfectados utilizando dihidrocloruro de puromicina (Calbiochem, San Diego, CA) a 10 (\mug/ml en medio de cultivo que contenía: Medio MEM Alpha con L-glutamina, ribonucleósidos y desoxiribonucleósidos (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), complementado con FBS inactivado al 10% (GIBCO), HEPES 10 mM, y 1X de penicilina/estreptomicina (GIBCO). De forma similar, se seleccionaron las células CHO en medio de cultivo que contenía Ham F12 sin GHT: DMEM bajo en glucosa sin glicina con
NaHCO3 complementado con FBS al 5% (GIBCO), HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, IX GHT (glicina, hipoxantina, timidina), y IX penicilina/estreptomicina.
Las colonias se formaron en dos o tres semanas y se agruparon por su expansión y expresión proteica. Se sembraron los grupos de células inicialmente a 3 x 10^{6} células/placa de 10 cm para expresión de proteínas en lotes pequeños. Se convirtieron las células en medios sin suero una vez crecieron hasta una confluencia del 90-95% y después de 3-5 días se recogieron los sobrenadantes celulares y se evaluaron en un ELISA de IgG con Fc y de IgG intacto para estimar los niveles de expresión de proteína. Se sembraron las células Lec13 y CHO a aproximadamente 8 x 10^{6} células/placa de 15 cm un día antes de convertir en medio de producción PS24, complementado con insulina humana recombinante 10 mg/L y elementos traza 1 mg/L.
Las células Lec13 y la células DP12 permanecieron en un medio de producción sin suero durante 3-5 días. Se recogieron los sobrenadantes y se aclararon mediante centrifugación en tubos cónicos de 150 ml para eliminar células y restos celulares. Se añadieron los inhibidores de proteasa PMSF y aprotinina (Sigma, St Louis, MO) y se concentraron los sobrenadantes 5 veces en células removidas utilizando filtros MWC030 (Amicon, Beverly, MA) antes de la purificación inmediata utilizando cromatografía de proteína G (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)). Se cambió el tampón de todas las proteínas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizando concentradores Centripriep-30 (Amicon) y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Se determinaron las concentraciones de proteína utilizando A280 y se verificaron utilizando análisis de composición de aminoácidos.
Se transfectaron las células CHO con vectores que expresan 2H7v16, 2H7v.31 humanizados y se seleccionaron tal y como se ha descrito. El anticuerpo 2H7v.16 retiene la región Fc de tipo salvaje mientras que v.31 (ver Ejemplo 5, Tabla 7 anterior) tiene una región Fc donde se hicieron 3 cambios de aminoácidos (S298A, E333A, K334A) que dan lugar a mayor afinidad para el receptor Fc\gammaRIIIa (Shields et al. J. Biol. Chem. 276 (9):6591-6604 (2001)). Después de la transfección y la selección, se aislaron las colonias individuales de células y se evaluaron por su nivel de expresión de proteínas y las mayores productoras fueron sometidas a selección con metotrexato para seleccionar células que habían amplificado el número de copias de plásmido y que por tanto produjeron mayores niveles de anticuerpo. Se dejaron crecer las células, se transfirieron a medio sin suero durante un periodo de 7 días, a continuación se recogió el medio, se cargó en una columna de proteína A y se eluyó el anticuerpo utilizando técnicas estándar. Se determinó la concentración final del anticuerpo utilizando un Elisa que mide el anticuerpo intacto. Se cambió el tampón de todas las proteínas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizando concentradores Centripriep-30 (Amicon) y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.
Análisis espectral de masas a tiempo-de-vuelo con ionización/desorción Láser asistida por matriz de oligosacáridos unidos a asparagina: Se liberaron oligosacáridos unidos a N de glicoproteínas recombinantes utilizando el procedimiento de Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998). En resumen, se condicionaron los pocillos de una placa de microtitulación recubierta de PVDF de 96 pocillos (Millipore, Bedford, MA) con 100 \mul de metanol que se condujo a través de las membranas de PDVF mediante la aplicación de vacío al colector de vacío Millipore Multiscreen. Se lavaron las membranas de PVDF condicionadas con 3 X 250 \mul de agua. Entre todos los pasos de lavado se drenaron completamente los pocillos mediante la aplicación de vacío moderado al colector. Se lavaron las membranas con tampón de reducción y carboximetilación (RCM) consistente en clorhidrato de guanidina 6 M, Tris 360 mM, EDTA 2 mM, pH 8,6. Se aplicaron muestras de glicoproteína (50 \mug) a pocillos individuales, se condujeron de nuevo a través de las membranas de PVDF mediante vacío moderado y se lavaron los pocillos con 2 x 50 \mul de tampón RCM. Se redujeron las muestras inmovilizadas mediante la adición de 50 \mul de una solución de ditiotreitol (DTT) 0,1 M a cada pocillo y la incubación de la placa de microtitulación a 37ºC durante 1 hora. Se extrajo el DTT mediante vacío y se lavaron los pocillos con 4 x 250 \mul de agua. Se carboximetilaron los residuos de cisteína mediante la adición de 50 \mul de una solución de ácido yodoacético (LAA) 0,1 M que se preparó recientemente en NaOH 1 M y se diluyó hasta 0,1 M con tampón RCM. Se llevó a cabo la carboximetilación mediante la incubación durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Se aplicó vacío a la placa para eliminar la solución de IAA y se lavaron los pocillos con 4 x 250 \mul de agua purificada. Se bloquearon las membranas de PVDF mediante la adición de 100 \mul de solución de PVP360 (polivinilpirrolidina 360,000 MW) al 1% (Sigma) e incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Se extrajo la solución de PVP-360 mediante vacío moderado y se lavaron los pocillos con 4 x 250 \mul de agua. Se añadió a cada pocillo la solución digerida con PNGasa F (New England Biolabs, Beverly, MA), 25 \mul de una solución 25 Unidades/ml en acetato de Tris 10 mM, pH 8,4, y la digestión se siguió durante 3 horas a 37ºC. Después de la digestión, se transfireron las muestras en tubos Eppendorf de 500 \mul y se añadió a cada muestra 2,5 \mul de una solución de ácido acético 1,5 M. Se incubaron las muestras acidificadas durante 3 horas a temperatura ambiente para convertir los oligosacáridos de glicosilaminas a la forma hidroxilo. Antes del análisis espectral de masa MALDI-TOF, se desalaron los oligosacáridos liberados utilizando un lecho de 0,7 ml de resina de intecambio catiónico (resina AG50W-X8 en forma de hidrógeno) (Bio-Rad, Hercules, CA), en empaquetaron en emulsión en tubos de reacción compactos (US Biochemical, Cleveland, OH).
Para el análisis espectral de masa MALDI-TOF de la muestras en el modo positivo, se aplicaron los oligosacáridos desalados (alícuotas de 0,5 \mul) al objetivo sin marca con 0,5 \mul de la matriz de ácido 2,5 dihidroxibenzoico (sDHB) que se preparó mediante la disolución de 2 mg de ácido 2,5-dihidroxibenzoico con 0,1 mg de ácido 5-metoxisilicílico en 1 ml de etanol/cloruro sódico 10 mM 1:1 (v/v). Se secó la mezcla de muestra/matriz mediante vacío. Para el análisis en modo negativo, se aplicaron los oligosacáridos unidos a N desalados (alícuotas de 0,5 \mul) al objetivo sin marca junto con 0,5 \mul de matriz de 2',4',6'-trihidroxiacetofenona (THAP) preparada en tampón de 1:3 (v/v) de acetonitrilo/citrato de amonio 13,3 mM. Se secó en vacío la mezcla muestra/matriz y a continuación se dejó que absorbiera humedad atmosférica antes del análisis. Se analizaron oligosacáridos liberados mediante MALDI-TOF en un espectrómetro de masas PerSeptive BioSystems Voyager-DE. Se operó el espectrómetro de masa a 20 kV en el modo positivo o negativo con la configuración lineal y utilizando extracción retrasada. Se adquirieron datos utilizando una potencia de láser de 1300 y en el modo de suma de datos (240 rastreos) para mejorar la señal ante el ruido. Se calibró el instrumento con una mezcla de oligosacáridos estándar y se "suavizaron" los datos utilizando un algoritmo Savitsky-Golay de 19 puntos antes de que se asignaran las masas. Se llevó a cabo la integración de los datos espectrales de las masas utilizando el paquete de software de análisis de datos Caesar 7.0 (SciBridge Software).
Ensayos de citotoxicidad dependientes de anticuerpo de células "killer" naturales (NK)
Se realizaron los ensayos ADCC tal y como se describe en el ejemplo 9. La proporción de NK con respecto a células diana (WIL2-S) fue de 4 a 1, se realizaron ensayos durante 4 horas, y se midió la toxicidad al igual que antes utilizando el ensayo de lactosa deshidrogenasa. Se opsonizaron células diana con las concentraciones de anticuerpo indicadas durante 30 minutos antes de la adición de células NK. El anticuerpo Rituxan® utilizado era de Genentech (S. San Francisco, CA). La Figura 12 muestra los resultados de un ensayo de ADCC representativo.
Los resultados muestran que los anticuerpos subfucosilados median la muerte de células diana de células NK de manera más eficaz que los anticuerpos con un complemento completo de fucosa. El anticuerpo subfucosilado, 2H7v.31, es el más eficaz en la mediación de la muerte de célula diana. Este anticuerpo es eficaz a concentraciones más bajas y es capaz de mediar la muerte de un mayor porcentaje de células diana a mayores concentraciones que otros anticuerpos. La actividad de los anticuerpos es la siguiente: 2H7 v31 derivado de Lec13> 2H7v16 derivado de Lec13> 2H7v31 derivado de Dp12> 2H7v16 derivado de Dp12> o=a Rituxan. Las alteraciones de proteína y carbohidrato son aditivas. La comparación del carbohidrato encontrado en IgG nativa de la IgG producida por Lec13 y producida por CHO no mostró diferencias apreciables en el grado de galactosilación y por lo tanto los resultados pueden atribuirse únicamente a la presencia/ausencia de fucosa.
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Ejemplo 12
Anticuerpos variantes de 2H7 deficientes en fucosa con ADCC aumentada in vivo
Este ejemplo describe la actividad ADCC in vivo de las variantes de 2H7 humanizados deficientes en fucosa incluyendo v.16 y v.31 producidas en Lecl3 en comparación con homólogos fucosilados normales producidos en DP12, en ratones que expresan CD16 humano [FcR\gammaIII] y CD20 humano.
Generación de ratones huCD20Tg^{+} huCD16Tg^{+} mCD16^{-/-}
Se generaron ratones transgénicos CD20 humanos a partir de ADN de BAC CD20 humano (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se cribaron los ratones en base al análisis FACS de expresión de CD20 humano. A continuación se cruzaron los ratones HuCD20 Tg con ratones huCD16Tg^{+}mCD16^{-/-} para generar ratones huCD20Tg^{+}huCD16Tg^{+}mCD16^{-/-}.
Tratamiento in vivo
Se administran de diez a 100 \mug de cada una de las variantes de 2H7 o Rituxan®) a ratones huCD20Tg^{+}huCD16
Tg^{+}mCD16^{-/-} mediante inyecciones intraperitoneales. Se aplicará una cantidad equivalente de anticuerpos con isotipo emparejado de forma similar al grupo de control negativo de animales.
Preparación de linfocitos de ratón
Se preparan linfocitos de ratón de sangre completa, bazo, nódulos linfáticos y médula ósea según el protocolo estándar descrito en "Current Protocols in Immunology, editado por John Coligan, Ada Kruisbeek, David Margulies, Ethan Shevach y Warren Strober, 1994".
Análisis FACS
Se lavan y se resuspenden medio millón de células en 100 \mul de tampón de FACS, que es solución salina tamponada con fosfato con BSA al 1%, que contiene 5 \mul de anticuerpo de tinción o control. Todos los anticuerpos de tinción, incluyendo los controles de isotipo, se obtienen de PharMingen, San Diego, CA. Se calcula la expresión de CD20 humano mediante la tinción con Rituxan® junto con anticuerpo secundario de IgG1 anti-humano conjugado con FITC. Se realiza el análisis FACS utilizando FACScan y Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Se definen todos los linfocitos en las dispersiones de luz directa y lateral, mientras que todos los linfocitos B se definen con la expresión de B220 en la superficie celular.
Se calculan el reducción y la recuperación de células B mediante el análisis del recuento de células B periféricas y el análisis de células B hCD20+ mediante FACS en el bazo, nódulo linfático y médula ósea en una base diaria durante la primera semana después de la inyección y a partir de entonces en una base semanal. Se monitorizan los niveles séricos del anticuerpo variante de 2H7 inyectado.
Los resultados de este ensayo in vivo confirma los descubrimientos in vitro en la actividad de ADCC incrementada y el mayor reducción de células B de variantes de 2H7 deficientes en fucosa sobre los homólogos de glicosilación de tipo salvaje (en cuanto a la fucosilación).
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Ejemplo 13
Actividad apoptótica
Se ha observado que los anticuerpos anti-CD20 que incluyen Rituxan® inducen la apoptosis in vitro cuando reticulan mediante un anticuerpo secundario o mediante medios químicos (Shan et al., Blood 9:1644-1652 (1998); Byrd et al., Blood 99:1038-43 (2002); Pederson et al., Blood 99:1314-19 (2002)). Cuando se reticularon químicamente, los dímeros de 2H7 murino indujeron la apoptosis de células de Daudi (Ghetie et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:7509-14 (1997)). La reticulación con un anticuerpo secundario también indujo la apoptosis con el anticuerpo 2H7 murino (Shan et al., 1998). Se cree que estas actividades son relevantes fisiológicamente porque varios mecanismos podrían conducir a la reticulación de anticuerpos anti-CD20 unidos a CD20 de superficie celular in vivo.
Se compararon RhuMAb 2H7.v16 [2H7 v16 humanizado; RhuMAb significa anticuerpo monoclonal humano recombinante] y Rituxan® en ensayos de apoptosis in vitro utilizando un anticuerpo secundario de reticulación. Se utilizaron células Ramos (CRL-1596, ATCC, Manassas, VA), una línea celular de linfocitos B humanos que expresan CD20, para medir la capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-CD20 rhuMAb 2H7.v16 y Rituximab frente a un anticuerpo de control negativo, Trastuzumab (Herceptin®, Genentech, South San Francisco, CA), para inducir la apoptosis medida a través de la tinción con Anexina V y la exclusión de colorante de yoduro de propidio (Vybrant® Apoptosis Assay Kit, Molecular Probes, Seattle, WA). Se cultivaron las células Ramos en medio RPMI-1640 (Gibco, Rockville, MD) que contenía suero bovino fetal al 10% (Biosource International, Camarillo, CA) y L-glutamina 2 mM (Grbco). Antes de ensayarse, se lavaron dos veces las células en medios nuevos y a continuación se ajustaron a una concentración celular de 2 X 10^{6} por mL. Se añadieron las células (150 \muL) en placas de ensayo de 96 pocillos (Becton Dickinson, Palo Alto, CA) que contenían 150 \muL de una cantidad predeterminada de IgG1 de control, rhuMAb 2H7.v16, o Rituximab, junto con Fc anti-humano de cabra F(ab)'2 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Las concentraciones finales de IgG fueron 100, 10, 1,0, 0,1, 0,01 y 0,001 nM, y se fijó la concentración de anticuerpo Fc anti-humano de cabra F(ab)'2 a dos veces la concentración de anticuerpo de muestra respectiva. Se preparó cada dilución por triplicado. Después de una incubación de 24 horas a 37ºC, se lavaron las células dos veces con PBS y a continuación se tiñeron con Anexina V y yoduro de propidio según las recomendaciones del fabricante. Se analizaron los patrones de tinción de las células Ramos mediante citometría de flujo utilizando un citrómetro de flujo FACscan (Becton Dickinson, San Jose, CA), y se recogieron los datos en periodos de 10 segundos. Se redujeron los datos utilizando el software Cellquest Pro (Becton Dickinson). Se contaron y representaron utilizando software KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) las células Ramos que fueron positivas para (1) tinción de Anexina V, (2) doble tinción de Anexina V y yoduro de propidio, y (3) el conjunto de células vivas no teñidas, se contaron y se
plotted.
Tanto rhuMAb 2H7.v16 como Rituximab indujeron la apoptosis de las células Ramos cuando se reticularon con Fc anti-humano y en comparación con un anticuerpo de control IgG1 irrelevante (Figuras 13-15). La actividad apoptótica de (rhuMAb 2H7) fue ligeramente más baja que la de Rituximab. A concentraciones de 10 nM de rhuMAb 2H7 reticulado, Rituximab, y anticuerpo IgG1 de control, las fracciones de células teñidas de Anexina V fueron 18,5, 16,5, 2,5%, respectivamente, las fracciones de células doblemente marcadas fueron 29, 38, y 16%, y el conjunto de células vivas contadas por cada 10 segundos fueron 5200, 3100, y 8600.
Estos datos in vitro demuestran que la apoptosis es un mecanismo potencial para el reducción de células B in vivo. La reticulación in vivo de rhuMAb 2H7 o Rituximab unidos a CD20 en la superficie celular puede suceder a través de Fc\gammaR en las superficies de células efectoras inmunes.
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Ejemplo 14
Supresión in vivo del crecimiento tumoral
Se evaluó la capacidad de rhuMAb 2H7.v16 de inhibir el crecimiento de las células B humanas de Raji, una línea celular de linfoma (ATCC CCL 86), en ratones desnudos Balb/c (atímicos). Las células de Raji expresan CD20 y se ha descrito que crecen en ratones desnudos, produciendo enfermedad metastásica; se inhibe el crecimiento de tumor mediante Rituxan® (Clynes et al., Nature Medicine 6, 443-446 (2000)). Se dividieron cincuenta y seis ratones desnudos Balb/c de 8-10 semanas de vida en 7 grupos (A--G) con cada grupo consistente en 8 ratones. En el día 0, cada ratón recibió una inyección subcutánea de 5 x 10^{6} células de linfoma B de Raji en el costado. Empezando en el día 0, cada ratón recibió 100 uL de la solución de control negativo (PBS; solución salina tamponada con fosfato), Rituxan® o 2H7.v16. La dosis dependía del peso y la liberación del fármaco fue intravenosa a través de la vena de la cola. Los ratones del grupo A recibieron PBS. Los ratones de los grupos B-D recibieron Rituxan® a 5,0 mg/kg, 0,5 mg/kg, y 0,05 mg/kg respectivamente. Los ratones de los grupos E-G recibieron 2H7 v.16 a 5,0 mg/kg, 0,5 mg/kg, y 0,05 mg/kg respectivamente. Se repitieron las inyecciones cada semana durante 6 semanas. En intervalos semanales durante el tratamiento, se inspeccionó cada ratón por la presencia de tumores palpables en el lugar de inyección, y se midió y registró el volumen de los tumores cuando estaban presentes. Se realizó una inspección final en la semana 8 (después de un intervalo de dos semanas sin tratamientos).
Los resultados de este estudio mostraron que tanto rhuMAb 2H7.v16 como Rituxan® y fueron efectivos en la inhibición subcutánea del crecimiento tumoral de células Raji en ratones desnudos (Figs. 16-18). Se observó crecimiento tumoral en el grupo de control con PBS empezando a las 4 semanas. No obstante, no se observó crecimiento tumoral en grupos tratados con Rituxan® o 2H7.v16 a 5 mg/kg o 0,5 mg/kg durante las 8 semanas de duración del estudio. En los grupos de tratamiento de dosis baja de 0,05 mg/kg, se observaron tumores en un animal en el grupo de 2H7 y en un animal en el grupo de Rituxan® (Fig. 18).
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Ejemplo 15
Clonación de CD20 de mono cynomolgus y unión de anticuerpo
Se determinó la secuencia de ADN de CD20 para mono cynomolgus (Macaca fascicularis) sobre el aislamiento de ADNc que codifica CD20 de una biblioteca de ADNc de bazo de mono cynomolgus. Se utilizó un sistema de plásmidos SUPERSCRIPT^{TM} para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos (Cat#18248-013, Invitrogen, Carlsbad, CA) con ligeras modificaciones para construir la biblioteca. Se ligó la biblioteca de ADNc en un vector pRK5E utilizando sitios de restricción Xho I y Not I. Se aisló el ARNm del tejido del bazo ((California Regional Research Primate Center, Davis, CA). Se diseñaron cebadores para amplificar el ADNc que codifica CD20 en base a secuencias no codificantes de CD20 humano. Se utilizaron el cebador de la región N-terminal 5'-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3' y el cebador de la región C-terminal 5'-AAGCTATGAACACTAATG-3' para clonar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el ADNc que codifica el CD20 de mono cynomolgus. Se llevó a cabo la reacción PCR utilizando Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity según la recomendación de los fabricantes (Gibco, Rockville, MD). Se subclonó el producto de PCR en pCR ®2.1-TOPO ® Vector (Invitrogen) y se transformó en E. coli azul XL-1 (Stratagene. La Jolla, CA). Se aisló ADN plasmídico que contenía productos de PCR ligados a partir de clones individuales y se secuenció.
En la Figura 19 se muestra la secuencia de aminoácidos para CD20 de mono cynomolgus. La Figura 20 muestra una comparación de CD20 de mono cynomolgus y humano. El CD20 de mono cynomolgus es un 97,3% similar al CD20 humano con 8 diferencias. El dominio extracelular contiene un cambio en V157A, mientras que los 7 residuos restantes pueden encontrarse en las regiones citoplasmática o transmembrana.
Se evaluaron anticuerpos dirigidos contra CD20 humano por su capacidad para unirse y desplazar unión de 2H7 murino conjugado con FITC a células de mono cynomolgus que expresan CD20. Se extrajeron veinte mililitros de sangre de 2 macacos cangrejeros (California Regional Research Primate Center, Davis, CA) en heparina sódica y se enviaron directamente a Genentech Inc.. En el mismo día, se agruparon las muestras de sangre y se diluyeron 1:1 mediante la adición de 40 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se dispusieron en capas 20 ml de sangre diluida en 4 x 20 ml de Ficoll-Paque ^{TM}Plus (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) en tubos cónicos de 50 ml (Cat#352098, Falcon, Franklin Lakes, NJ) y se centrifugó a 1300 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente en una centrífuga Sorval 7. (Dupont, Newtown, CT). Se aisló la capa de PBMC y se lavó en PBS. Se lisaron los glóbulos rojos en una solución de NaCl al 0,2%, se restableció hasta isotonicidad con un volumen equivalente de una solución de NaCl al 1,6%, y se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. Se resuspendió el pélet de PBMC en RPMI 1640 (Gibco, Rockville, MD) que contenía suero bovino fetal (FBS) al 5% y se dispuso en una placa de cultivo de tejido de 10 cm durante 1 hora a 37ºC. Se extrajeron las poblaciones de células B y T no adherentes mediante aspiración, se centrifugaron y se contaron. Se recuperaron un total de 2,4 x 10^{7} células. Se distribuyeron las PBMC resuspendidas en veinte tubos de cultivo de 12 x 75 mm (Cat#352053, Falcon), con cada tubo conteniendo 1 x 10^{6} células en un volumen de 0,25 ml. Se dividieron los tubos en cuatro grupos de cinco tubos. A cada grupo se le añadió medio (RPMI1640, FBS al 5%), cantidades tituladas de anticuerpo IgG_{1} humano de control, Rituxan®, 2H7.v16, o 2H7.v31. La concentración final de cada anticuerpo fue 30, 10, 3,3 y 1,1 nM. Además, cada tubo también recibió 20 \mul de CD20 anti-humano conjugado con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) (Cat#555622, BD Biosciences, San Diego, CA). Se mezclaron suavemente las células, se incubaron durante 1 hora en hielo y se lavaron a continuación dos veces en PBS frío. Se analizó la tinción de la superficie celular en un Epic XL-MCL (Coulter, Miami, FL), la media geométrica derivada se representó (KaleidaGraph^{TM}, "Synergy Software" Reading, PA) frente a concentraciones de anticuerpo.
Los datos mostrados en la Figura 21 mostraron que 2H7 v.16 y 2H7 v.31 desplazaron competitivamente la unión de 2H7 murino con FITC a células de mono cynomolgus. Además, Rituxan® también desplazó la unión de 2H7 murino con FITC demostrando de esta manera que tanto 2H7 como Rituxan® se unen a un epítopo solapante en CD20. Además, los datos muestran que el valor de IC_{50} para v.16, 2H7 v.31 y Rituxan son similares y disminuyen en el intervalo de 4-6 nM.
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Ejemplo 16
Estudio de fase I/II de rhuMAb 2H7 (2H7.v16) en artritis reumatoide de moderada a severa Sinopsis del protocolo
Estudio ciego de la fase I/II multicentro controlado por placebo de tipo aleatorio de la seguridad de las dosis en escala de PRO70769 (rhuMAb 2H7) en sujetos con artritis reumatoide de moderada a severa que reciben las dosis estables de metotrexato concomitante.
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Objetivos
El objetivo principal de este estudio es evaluar la seguridad y tolerabilidad de la dosis intravenosas (IV) en escala de PR070769 (rhuMAb 2H7) en sujetos con artritis reumatoide (R.A.) de moderada a severa.
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Diseño del estudio
Este es un estudio ciego de de la fase I/II multicentro controlado por placebo de tipo aleatorio y el estudio ciego de investigador y sujeto de la seguridad de las dosis en escala de PRO70769 en combinación con MTX en sujetos con RA de moderada a severa. El estudio consiste en una fase de escalado de la dosis y una segunda fase con la inscripción de un mayor número de sujetos. El Sponsor permanecerá sin mezclar para la signación de tratamiento.
Se inscribirán los sujetos con una RA de moderada a severa en los que no habían tenido éxito de uno a cinco fármacos antireumatoides que modifican la enfermedad o agentes biológicos que actualmente presentan respuestas clínicas insatisfactorias al tratamiento con MTX.
Se requerirá que los sujetos reciban MTX en el intervalo de 10-25 mg semanales durante por lo menos 12 semanas antes de la entrada en el estudio y tengan una dosis estable durante por lo menos 4 semanas antes de recibir su dosis inicial del fármaco de estudio (PRO70769 o placebo). Los sujetos también pueden recibir dosis estables de corticosteroides orales (hasta 10 mg diarios o el equivalente de prednisona) y dosis estables de fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDs). Los sujetos recibirán dos perfusiones IV de PRO70769 o placebo equivalente en la dosis indicada en los días 1 y 15 según el siguiente plan de escalado de la dosis (véase la Figura 22).
El escalado de la dosis tendrá lugar según un criterio específico (véase (Reglas de Escalado de Dosis) y después de la revisión de los datos de seguridad por un comité interno de revisión de los datos de seguridad y la valoración de la toxicidad aguda 72 horas después de la segunda infusión en el último sujeto tratado en cada cohorte. Después de la fase de escalado de la dosis, se eligieron al azar 40 sujetos adicionales (32 activos y 8 placebos) para cada uno de los siguientes niveles de dosis: 2x50 mg, 2x200 mg, 2x500 mg, y 2x1000 mg, si los niveles de dosis se demuestran que son tolerables durante la fase del escalado de dosis. Aproximadamente 205 sujetos se inscribieron en el
estudio.
Los recuentos de células B se obtendrán y registrarán (para valoraciones del estudio, véase la sección 4.5 y el Apéndice A-1). Los recuentos de células B se evaluarán utilizando citometría de flujo en un periodo de seguimiento de 48 semanas más allá de la evaluación de la eficacia de 6 meses. El reducción de células B no se considerará una toxicidad limitante de la dosis (DLC), sino más bien el resultado farmacodinámico esperado del tratamiento con PRO70769.
En un subestudio opcional, se obtendrá sangre para análisis de suero y ARN, así como muestras de orina de sujetos en varios puntos de tiempo (véase la Sección 3.3.3). Estas muestras se pueden utilizar para identificar biomarcadores que pueden ser predictivos de la respuesta al tratamiento con PRO70769 en sujetos con una Ra de moderada a severa.
Mediciones del resultado
La medición del resultado primario para este estudio es la seguridad y la tolerabilidad de PRO70769 en sujetos con RA de moderada a severa.
Tratamiento de estudio
Los cohortes de sujetos recibirán dos perfusiones IV de PR070769 o placebo equivalentes a la dosis indicada en los días 1 y 15 según el siguiente plan de escala:
- 10 mg PRO70769 o placebo equivalente: 4 sujetos con fármaco activo, 1 control
- 50 mg PRO70769 o placebo equivalente: 8 sujetos con fármaco activo, 2 control
- 200 mg PRO70769 or o placebo equivalente: 8 sujetos con fármaco activo, 2 control
- 500 mg PRO70769 o placebo equivalente: 8 sujetos con fármaco activo, 2 control
- 1000 mg PRO70769 o placebo equivalente: 8 sujetos con fármaco activo, 2 control
Eficacia
La eficacia de PRO70769 se medirá mediante las respuestas de ACR. El porcentaje de sujetos que consiguen una respuesta ACR20, ACR50, y ACR70 se resumirán mediante el grupo de tratamiento y se generarán intervalos de confianza del 95% para cada grupo. Los componentes de estas respuestas y sus cambios de la línea base se resumirán mediante el tratamiento y la visita.
Conclusión
Los datos anteriores demostraron el éxito en la producción de anticuerpos de unión a CD20 humanizados, en particular variantes de anticuerpos 2H7 humanizados, que mantenían e incluso aumentaban sus propiedades biológicas. Los anticuerpos 2H7 humanizados de la presente invención se unieron a CD20 con afinidades similares a las del donante murino y los anticuerpos 2H7 quiméricos eran eficaces para eliminar células B en un primate, conduciendo al reducción de células B. Ciertas variantes mostraron una mayor ADCC sobre un anticuerpo anti-CD20 quimérico utilizado actualmente para tratar NHL, favoreciendo la utilización de dosis inferiores del anticuerpo terapéutico en pacientes. Adicionalmente, aunque puede ser necesario administrar un anticuerpo quimérico que tiene residuos FR murinos en una dosis eficaz para conseguir el reducción completo de las células B para obviar la respuestas de un anticuerpo con el mismo, los presentes anticuerpos humanizados se pueden administrar en dosis que consiguen el reducción pacial o completo de células B y para diferentes duraciones de tiempo, según se desee para la enfermedad y paciente particulares. Además, estos anticuerpos demostraron una estabilidad en solución. Estas propiedades de los anticuerpos 2H7 humanizados los hace ideales para su uso como agentes inmunoterapéuticos en el tratamiento de cánceres positivos en Cd20 y enfermedades autoinmunes; no se espera que estos anticuerpos sean inmunogénicos o serán al menos menos inmunogénicos que los anticuerpos anti-CD20 totalmente murinos o quiméricos en pacientes humanos.
Referencias
La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular y similares, que se encuentran en la técnica habitual. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds., 1987 actualizado); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al. eds., Bartlett PubL 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu et al. eds., Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotschnology(M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard et al. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney et al. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al. eds., Wiley-Liss 1990); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Wirth M. and Hauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982,1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir&C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al. eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering 2nd edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); y la serie Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunology.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
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Claims (68)

1. Anticuerpo CD20 anti-humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo comprende la secuencia VH de SEC ID No. 8 mostrada en la figura 1B (2H7.v16) y la secuencia VL de SEC ID No. 2 mostrada en la figura 1A (2H7.v16).
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde la región VH está unida a una región constante de cadena de IgG humana.
3. Anticuerpo según la reivindicación 2, donde la IgG humana es IgG1 o IgG3.
4. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera y pesada de la SEC ID No. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y en la figura 7, respectivamente.
5. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera y pesada de la SEC Id No. 21 mostrada en las figuras 6 y 23 y en la figura 8, respectivamente.
6. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es eficaz para reducir las células B de primate in vivo y las células B de primate son de humano y mono Cynomolgus.
7. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones anteriores conjugado a un agente citotóxico.
8. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 7, donde el agente citotóxico es un isótopo radioactivo o una toxina.
9. Anticuerpo CD20 anti-humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, cuyo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se produce mediante un método de expresión de un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en una célula huésped y la recuperación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno producidos a partir del cultivo de células huésped.
10. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 9, donde la célula huésped es una célula
CHO.
11. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, donde el ácido nucleico codifica el anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera o pesada de SEC ID NO. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y en la Figura 7, respectivamente.
12. Composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un portador.
13. Composición de la reivindicación 12, donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera o pesada de SEC ID NO. 21 mostrada en las Figuras 6 y 22 y en la Figura 7, respectivamente, y el portador es un portador farmacéuticamente aceptable.
14. Artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones de 1-11.
15. Artículo de fabricación de la reivindicación 14, que comprende además un prospecto que indica que la composición se puede utilizar para tratar el linfoma no de Hodgkin o artritis reumatoide.
16. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 para su uso en un método de inducción de apoptosis en células B in vivo, un método de tratamiento de un cáncer positivo de CD20 en un paciente, o un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune en un paciente.
17. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 16, donde el cáncer positivo de CD20 es un linfoma o leucemia de células B.
18. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 17, donde el cáncer positivo de CD20 es un linfoma no de Hodgkin (NHL) o enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD).
19. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 16, donde el cáncer es leucemia linfocítica crónica o linfoma linfocítico pequeño.
\newpage
20. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según una de las reivindicaciones 16 a 19, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en un intervalo de dosis de aproximadamente 275-375 mg/m^{2}.
21. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según una de las reivindicaciones 16 a 19, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en un intervalo de dosis entre aproximadamente 250 mg/m^{2} y aproximadamente 500 mg/m^{2}.
22. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según una de las reivindicaciones 16 a 21, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para administrar al paciente para tratar un cáncer positivo de CD20 con por lo menos un agente quimioterapéutico.
23. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 22, donde el cáncer es un linfoma no de Hodgkin (NHL) y el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisolona y CHOP.
24. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 20, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en por lo menos dos dosis de 375 mg/m^{2} por dosis.
25. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 24, donde las dos dosis tienen dos semanas de diferencia.
26. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 16, donde la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico (SLE), nefritis de lupus, colitis ulcerosa, enfermedad de Wegener, enfermedad intestinal inflamatoria, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, miastenia gravis, vasculitis, vasculitis ANCA, rechazo de transplante de órganos sólidos, enfermedad de injerto contra huésped, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis.
27. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 26, donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.
28. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 27, donde el paciente padece de artritis reumatoide de moderada a severa y el tratamiento con por lo menos un fármaco antireumático modificador de la enfermedad no fue satisfactorio.
29. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 27, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración al paciente para tratar la enfermedad autoinmune con un segundo agente terapéutico.
30. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 29, donde el segundo agente terapéutico es un agente inmunosupresor.
31. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 30, donde el agente inmunosupresor es metotrexato.
32. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 27, donde el anticuerpo de unión a CD20 o fragmento de unión a antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada de SEC ID No. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y en la figura 7, respectivamente, y donde el anticuerpo es para la administración para tratar una enfermedad autoinmune en una dosis seleccionada entre 2x50 mg, 2x 200 mg y 2x500 mg.
33. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 32, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración mediante infusión intravenosa.
34. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 32, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración mediante administración subcutánea.
35. Ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
36. Vector de expresión que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
37. Célula huésped que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 35.
38. Célula huésped según la reivindicación 37 que produce un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a CD20 humano.
39. Célula huésped según la reivindicación 38 que es una célula CHO.
40. Método de producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a CD20 humano, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 38 o la reivindicación 39 y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.
41. Formulación líquida que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a 20 mg/mL, sulfato de histidina 10 mM a pH 5,8, sacarosa 60 mg/ml, y polisorbato 20 0,2 mg/ml, donde el anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de cadena ligera y pesada de SEC ID No. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y mostrada en la figura 7, respectivamente.
42. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 26, donde el anticuerpo de unión a CD20 comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y cadena pesada de la SEC ID No. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y en la figura 7, respectivamente.
43. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde la enfermedad autoinmune es el lupus eritematoso sistémico (SLE) o nefritis de lupus.
44. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde la enfermedad autoinmune es colitis ulcerosa.
45. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde la enfermedad autoinmune es vasculitis ANCA.
46. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde la enfermedad autoinmune es el rechazo del transplante de órganos sólidos o la enfermedad de injerto contra huésped.
47. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde el anticuerpo es para la administración mediante infusión intravenosa.
48. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 42, donde el anticuerpo o fragmento de unión a anticuerpo es para la administración mediante administración subcutánea.
49. Utilización del anticuerpo de unión a CD20 o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente.
50. Utilización según la reivindicación 49, donde el cáncer positivo de CD20 es un linfoma o leucemia de células B.
51. Utilización según la reivindicación 49, donde el cáncer positivo de CD20 es el linfoma no de Hodgkin (NHL) o enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD).
52. Utilización según la reivindicación 50, donde el cáncer es leucemia linfocítica crónica o linfoma linfocítico pequeño.
53. Utilización según la reivindicación 49, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en una intervalo de dosis de aproximadamente 275-375 mg/m^{2}.
54. Utilización según la reivindicación 49, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en una intervalo de dosis de aproximadamente 250 mg/m^{2} a aproximadamente 500 mg/m^{2}.
55. Utilización según la reivindicación 53, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración para tratar un cáncer positivo de CD20 en un paciente en por lo menos dos dosis de 375 mg/m^{2} por dosis.
56. Utilización según la reivindicación 55, donde las dos dosis están separadas dos semanas.
57. Utilización según la reivindicación 49, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración al paciente para tratar un cáncer positivo de CD20 con por lo menos un agente quimioterapéutico.
58. Utilización según la reivindicación 57, donde el cáncer es linfoma no de Hodgkin (NHL) y el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisolona, y CHOP.
59. Utilización del anticuerpo de unión a CD20 o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmune en un paciente.
60. Utilización según la reivindicación 59, donde la enfermedad autoimmune se selecciona del grupo que consiste en arthritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico (SLE), nefritis de lupus, colitis ulcerosa, enfermedad de Wegener, enfermedad de intestino inflamado, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopéncia trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, miastenia gravis, vasculitis, vasculitis ANCA, rechazo del transplante de órganos sólidos, enfermedad de injerto contra huésped, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis.
61. Utilización según la reivindicación 60, donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.
62. Utilización según la reivindicación 61, donde el paciente padece de arthritis reumatoide de moderada a severa y el tratamiento con por lo menos un fármaco antireumático modificador de la enfermedad no fue satisfactorio.
63. Utilización según la reivindicación 61, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración al paciente para tratar la enfermedad autoinmune con un segundo agente terapéutico.
64. Utilización según la reivindicación 63, donde el segundo agente terapéutico es un agente inmunosupresor.
65. Utilización según la reivindicación 64, donde el agente inmunosupresor es metotrexato.
66. Utilización según al reivindicación 61, donde el anticuerpo de unión a CD20 o fragmento de unión a antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera y cadena pesada de la SEC ID No. 21 mostrada en las figuras 6 y 22 y mostrada en la figura 7, respectivamente, y donde el anticuerpo es para la administración para tratar una enfermedad autoinmune en una dosis seleccionada entre 2x50 mg, 2x 200 mg y 2x500 mg.
67. Utilización según la reivindicación 66, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración mediante infusión intravenosa.
68. Utilización según la reivindicación 66, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es para la administración mediante inyección subcutánea.
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