BRPI0612678A2

BRPI0612678A2 - derivados de 1 - [2' , 3'-dideoxi-3' c-(hidroximentil) - beta-d-eritro-pentofuranozil] citozina como inibidores de hiv

Info

Publication number: BRPI0612678A2
Application number: BRPI0612678-2A
Authority: BR
Inventors: Christer Sahlberg; Xiao-Xiong Zhou
Original assignee: Medivir Ab
Priority date: 2005-07-07
Filing date: 2006-07-05
Publication date: 2010-11-30
Also published as: CN101213198A; EP1899352B1; EP1899352A1; US8143396B2; ATE527267T1; HK1122798A1; ZA200710662B; MX2008000221A; WO2007006707A1; DK1899352T3; HRP20110830T1; AU2006268743C1; CA2610210A1; US20080221140A1; PT1899352E; JP2008545002A; US20110112294A1; JP5174660B2; GB0513835D0; AU2006268743A1

Abstract

DERIVADOS DE 1 - [2', 3'-DIDEOXI-3' C (HIDROXIMETIL) - BETA-D-ERITRO-PENTOFURANOZIL] CITOZINA COMO INIBIDORES DE HIV Compostos da fórmula (1) onde: R¹ é independentemente Hl-0R3, -NHR4; alquila C~1~-C~4~; ou, quando n é 2, R¹ adjacente em conjunto define uma ligação olefinica; R2 é H; ou quando o gem R¹ é alquila C1-C4, aquele R2 poderá também ser alquila C1-C4; ou quando o gem R¹ é -0R³, aquele R² poderá também ser -C(=0)OH ou um éster farmaceuticamente aceitável do mesmo; R3 é independentemente H, ou um éster farmaceuticamente aceitável do mesmo; R^4^ é independentemente H ou uma amida farmaceuticamente aceitável do mesmo; R^5^ e R^6^ são H ou um radical de prodróga de amina; n é 1, 2 ou 3; e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos; têm utilidade no tratamento ou profilaxia de HIV, especialmente mutantes de transcríptase reversa que permite que um nucleosídeo de terminação de cadeia forçada- oufosfato de nucleotídeo seja extirpado do filamento de DNA nascente por ATP- ou por extirpação mediada por pirofosfato.

Description

"DERIVADOS DE 1 - [2', 3'-DIDEOXI-3' C-(HIDROXIMETIL)- BETA-D-ERITRO-PENTOFURANOZIL] CITOZINA COMOINIBIDORES DE HIV"

Campo Técnico

Esta invenção refere-se a derivados novos detetra-hidrofuran biciclico e seu uso no tratamento deretroviroses tais como HIV, especialmente mutações de fugade fármacos.

Antecedentes da Arte

Diferentemente de outros antiviróticos de HIV,tais como inibidores de proteases ou inibidores detranscriptase reversa de não nucleosideos, os inibidores detranscriptase reversa de nucleosideos (NRTI) sãofarmacologicamente inativos na sua forma de administração erequerem fosforilação através das quinases celulareshospedeiras para produzirem os metabolitos de trifosfatoativos. Esta forma de trifosfato parece com os substratos detrifosfato de deoxinucleotideo de ocorrência natural datranscriptase reversa viral e compete pela ligação HIV-IRT epela incorporação no DNA viral.

Todos os NRTI s aprovados para o tratamento deHIV, e a vasta maioria de todos os outros NRTIs propostos napatente ou na literatura acadêmica, não dispõem de umafunção 3'- hidroxila sobre o radical ribose do nucleosideo.Exemplos incluem zidovudina (AZT), stavudina (d4T),lamivudina (3TC), zaicitabina (ddC), abacavir (ABC),didanosina (ddl) e tenofovir (TNF) (o último sendotipicamente administrado como uma prodróga de fumarato dediisoproxila). Após a fosforilação, tal nucleosídeo ouanálogo de nucleosídeo é ligado covalentemente pela enzimade transcriptase reversa no filamento de DNA nascente, mas afalta da função 3'- hidroxila no nucleosídeo ou nonucleotídeo evita a anexação de nucleotídeos adicionais.Estes NRTIs, portanto terminam a prolongamento do filamentoviral de DNA, dessa forma levando à inibição da replicaçãode HIV (Mitsuya et al 1990, Jacob Molina et al 1993, Reardon1993).

A base de todas as terapias antiviróticas (ARTs) éo uso de NRTIs. Os NRTIs, no entanto, são capazes somente deretardarem a propagação de HIV na corrente sangüínea e até omomento tem sido incapazes de erradicarem o HIV empacientes. 0 HIV opera através da inserção do seu DNA nascélulas hospedeiras latentes envolvidas na memóriaimunológica.

Este modo de infecção significa que os pacientessão forçados a tomarem antibióticos de HIV durante toda avida, para evitarem o retorno de HIV após o final da terapia.

No entanto, na prática, o período de administraçãode um fármaco específico de HIV a um determinado paciente édramaticamente limitado pelo aparecimento de "mutantes defuga". Um mutante de fuga é um vírus que contém umagrupamento distinto de mutações que produzem resistência aofármaco e permitem que ele prolifere na presença do fármaco.Os mutantes de fuga aparecem em um paciente devido à pressãoseletiva dos antiviróticos específicos que o paciente estátomando. Como conseqüência, um período de administraçãoefetivo de um fármaco é dependente de quão rapidamenteaparecem e proliferam os mutantes de fuga.

Nos países em que se prescreve consistentementeantiviróticos de HIV, está se tornando cada vez maisevidente que a infecção principal nos casos novos de HIV,com freqüência, não é com o tipo selvagem de HIV, mas aocontrário, com uma família de HIVs que já é parcialmente oumuitas vezes resistente aos antiviróticos atuais. Em outraspalavras, os mutantes de fuga que são gerados in situ empacientes infectados, também podem ser espalhados parapacientes primários por intermédio de transmissão lateral ouvertical. Isto por seu lado significa que mesmo algunspacientes que de outra forma seriam classificados como detratamento ingênuo, já estão infectados com o vírusresistente às terapias convencionais de primeira linha.

Fatores múltiplos contribuem para a escolha demutantes de fuga de fármacos, incluindo todos os conjuntosde HIVs, capacidade de processamento e infidelidade nareplicação genômica viral, adequação viral e disponibilidademúltipla de células alvo. No final dos anos 90, a evidênciaatravés do uso prolongado de combinações baseadas emzidovudine (AZT) ou stavudine (d4T) sugere que osagrupamentos de mutações específicas no RT eram geradasconsistentemente. Estes aglomerados de mutações são oprotótipo agora conhecido como Thymidine Analogue Mutations(TAMs). A presença de TAMs melhorou a possibilidade deseleção de outras mutações que levam ao desenvolvimento defenotipos de resistência às NRTIs mais avançados que nãoestavam claramente dentro da familia de análogos detimidina. Tais fenotipos são agora conhecidos como"Nucleoside Analogue Mutation (NAM) e Multiple Drugresistance (MDR)" de HIV.

Hipótese para a Resistência à NRTI

O AZT foi o primeiro antiretrovirótico a serlargamente utilizado e sem surpresa, foi o primeiro a gerarmutantes de fuga (Larder et al, 1989). No entanto, em vistado grande número de mutações em todo o genoma de HIV empacientes típicos isolados não é possível produzir-sefenotipos de resistência in vitro utilizando uma enzima RTrecombinante contendo o TAM específico. Como conseqüência,os mecanismos através dos quais os TAMs conferem resistêncianão foram explicados totalmente. Vários modelos hipotéticose previsões teóricas para o mecanismo atrás da resistênciaao TAM foram previstos no envolvimento do ataquenucleofílico através de um doador de pirofosfato (Boyer etal, 2002 e Meyer et al, 2002).

Presumivelmente, a teoria de translocação de RT éuma etapa importante no entendimento do mecanismo deresistência associado ao ΤΑΜ. Isto, no entanto, foi malentendido até o final de 2002, porque os intermediários depré- e pós- translocação de RT são transitórios e de vidacurta e não são facilmente acessados experimentalmente.

O entendimento moderno da teoria da translocaçãode RT afirma que a polimerização de DNA catalisada por RTacontece de uma forma em cascata, detalhada conformeilustrado na figura 3, que é adotada por Sarafianos et al(2003). Estas etapas são

1) A ligação do substrato de DNA pelas posições daenzima E coloca a extremidade principal 3' no

) sítio P (sítio principal).

2) A ligação de um dNTP próximo do sítio N (sítiodNTP) forma um complexo ternário "aberto".

3) Um complexo ternário "fechado" é formado pelasalterações conformacionais da enzima.

4) A formação da ligação fosfodioester entre otérmino primário 31-OH e o alfa fosfato de dNTPé acompanhado pela liberação de pirofosfato(PPi) para formar o complexo de RT pré-translocado no sítio N.

5) A translocação do término primário do sítio Npara o sítio P através da formação de umcomplexo pós-translocado que é um pré-requisitopara a ligação seguinte de dNTP e a continuaçãoda síntese de DNA.

Se é utilizado um trifosfato de nucleosídeo (NRTI)de terminador de cadeia de DNA (tipicamente um análogo denucleosídeo que não contém uma função 3'-hidroxila noradical deoxiribose) , ele copia a sua contraparte natural dedNTP e é ligado no RT. Depois do processamento químicoanálogo, o NRTI incorporado forma um complexo de pré-translocação no sítio N de polimerização. Isto finaliza asíntese adicional de DNA devido à falta da 3'-hidroxilaprimária no radical de deoxiribose de NRTI.Ao contrário, as mutações de RT relacionadas comTAM utilizam um mecanismo de incorporação de nucleotideodiferente, comparado com o tipo selvagem de RT.Especificamente, o mecanismo novo resulta na liberação(extirpação) do NRTI incorporado no término primário,anulando a atividade de terminação de cadeia do NRTI. Estenovo mecanismo é dependente da interação entre e aacumulação de complexos nos estados pré-translocados (nositio N) e a disponibilidade de ATP e de doadores depirofosfato, que com freqüência, são abundantes no local dainfecção, i.e., os linfócitos normais.

ATP ou pirofosfato normalmente não participam nasreações de polimerização de DNA viral, mas a estrutura de umRT expressando um fenótipo resistente relacionado a TAMfacilita a sua entrada em um sitio adjacente a um NRTIincorporado recentemente. 0 equilíbrio entre as espéciescinéticas pré e pós-translocação produz um mecanismo paraassegurar o livre acesso do término primário ao sítio N etambém permite a aglutinação simultânea do doador depirofosfato ATP no sítio P após a incorporação do terminadorde cadeia de NRTI e a liberação de pirofosfato. Quando istoocorre, o ATP (ou pirofosfato) ataca a ligação defosfodiéster que liga o NRTI incorporado na extremidade doDNA, resultando na remoção dos NRTI através depirofosforolise. Quando o doador de pirofosfato é ATP, oNRTI é liberado como um produto de dinucleosídeotetrafosfato. A figura 4 ilustra esta "recuperação primária"em um DNA com terminação AZT (adotado da ClinicCareOptions®)Acredita-se agora que são envolvidos doismecanismos distintos na resistência dos fenótipos ao NRTI(Siuis-Cremer et al, 2000). O primeiro, conhecido comoatividade "de recuperação primária", é descritoimediatamente acima. Aqui, o nucleotideo de terminação decadeia é removido da extremidade 31 do término primárioatravés de um dependente de ATP ou de pirof osf orolisedependente de pirofosfato. Existe, no entanto, outroaglomerado de fenótipos de resistência denominado como"mutantes discriminativos". Estes mutantes têm um RT comhabilidade melhorada para discriminar entre NRTIs e dNTPsnativos. Neste caso, o mecanismo leva ao RT que é capaz deescolher preferencialmente o substrato correto (i.e. dNTPnativo) , dessa forma evitando a terminação de cadeia por umNRTI e assegurando a propagação do genoma viral.

Geração de Mutações em HIV

Retrovirus, tais como HIV, têm o potencial dediversificação genética rápida. Embora este seja um processoenergeticamente ineficiente, ele oferece vantagens claras deadaptação ao organismo. A maquinaria de replicação utilizadapelo HIV é especialmente tendente a erros, gera um grandenúmero de mutações e tem o potencial para levar a acumulaçãode mutações quando o organismo está sob pressão seletiva.

Geralmente, a grande maioria de mutações geradaspela replicação viral resulta em enzimas menos viáveis.Aqui, a acumulação de uma segunda, e especialmente de umaterceira mutação é menos provável, porque o conjunto daspopulação para os mutantes menos viáveis, dentro dos quais asegunda mutação deve ser acumulada, serão diluídos pelamultiplicação mais rápida do organismo do tipo selvagem.

Mutantes virais ainda mais viáveis podem aparecere se expandir através de dois caminhos possíveis. 0 primeiroocorre quando existe um crescimento rápido de uma variantealtamente resistente que já está presente na população viraltotal. Com mais freqüência, isto é uma mutação de um sóponto que confere resistência fenotípica a uma pressãoseletiva. No contexto de mutações de fuga de fármacos,exemplos incluem o K103 rapidamente induzido pelo inibidorde transcriptase reversa de não-nucleosídeo nevirapina.

O segundo caminho ocorre quando existe umareplicação viral continuada na presença de pressão seletiva.Isto permite a acumulação progressiva de mutações que podemser expandidas. Neste caso, a probabilidade de acumulação demutações é relacionada com a quantidade de replicação devírus que está ocorrendo. Isto é, em cargas virais maiores(por exemplo, >200.000 cópias/ml), podem ocorrer acumulaçõesde mutações duplas. A acumulação de mutações triplas, noentanto, são raras e podem resultar somente comoconseqüência de um regime terapêutico complexo, tipicamenteenvolvendo vários fármacos diferentes, o que é um desafiopara a adesão do paciente. É, portanto extremamente difícil,mesmo para um paciente diligente, assegurar que todos osingredientes ativos estão presentes no sangue em níveisacima das concentrações inibitórias necessárias durante operíodo inteiro de 24h de cada dia, "nível durante as 24h".

Aqui, a remoção temporária de qualquer daspressões seletivas do tratamento com fármaco devido a lapsosna administração/nivel durante 24h de um ou mais fármacos,permite a replicação viral desenfreada, dessa formapermitindo a geração e o estabelecimento de vários mutantesnovos. Quando a pressão seletiva é novamente aplicada (i.e.a retomada da terapia do fármaco complexo), os poucosmutantes novos que acumularam outro ponto de mutaçãoconferem uma melhor resistência ao fármaco e podem seexpandir de uma forma semelhante aquela vista para oprimeiro caminho (ver acima).

A discussão acima é enfocada na acumulação demutações de pontos, ao contrário, por exemplo, da exclusãoou adição de mutações. Aqui, no entanto, é aplicável umcenário semelhante aquele descrito para uma mutação tripla.Isto é, a maioria das mutações de extrusão/adiçãoinicialmente envolvem um só nucleotideos. Isto tem o efeitode alterar completamente a seqüência de aminoácido a jusanteda proteína codificada se a alteração ocorre dentro daregião de codificação e leva a uma proteína truncada e/ouinativa. Para conservar a leitura e para alterar a proteínafinal através da eliminação ou adição de um só aminoácido,devem ser eliminados/adicionados três nucleotideos. Como asenzimas inativas reduzem a viabilidade de um organismo deHIV, especialmente se a enzima afetada é RT, asexclusões/adições não se acumularão por si próprias, masdevem ocorrer simultaneamente. Em outras palavras, oequivalente de uma mutação tripla deve ocorrer em um sóevento, o que é altamente incomum (ver Boyer et al (2004)JVirol 78 (18): 9987 - 9997, que é incorporada aqui comoreferência na sua integridade).

Como conseqüência deste processo para aacumulação/introdução de mutante triplo, somente atérelativamente recentemente ficou estabelecido que o virus deHIV que exibia pelo menos três mutações em RT criamresistência especialmente potente a fármacos múltiplos. Porexemplo, nos Estados Unidos, em 1992, somente quando o FDAaprovou o uso de terapia de combinação de fármacos (ddC eAZT). No entanto, somente em setembro de 1995 as tentativasclinicas mostraram que a combinação de AZT com ddC ou ddleram mais efetivas do que com o AZT sozinho. Somente comoresultado do uso das terapias combinadas, onde foramutilizados fármacos múltiplos, mas em regimes de dosagemefetivamente incapazes de garantirem qualquer nivel adequadodurante 24h dos fármacos respectivos, que as famíliasespecialmente problemáticas de vírus de HIV multi-resistentes conhecidos no mundo ocidental hoje em dia foramgerados.

Mutações de Recuperação Primária

O mutante de recuperação primária de TAMoriginalmente descrito era composto de várias permutaçõesdentro de um grupo de 6i fenótipos resistentes a fármacos emposições de aminoácidos M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F eK219Q/E no RT (Larder and Kemp, 1989, Schinazi et al, 2000) .Dados recentes mostraram dois caminhos distintos mutacionaispara o desenvolvimento de mutantes de recuperação primáriamúltipla de ΤΑΜ, ambos ocorrendo por fatores desconhecidos.O primeiro caminho resultou em uma substituição deaminoácido no códon 210 (210W) e de preferência eraassociado com mutações nos códons 41 (41L; mais de 98%) e215 (215Y; mais de 94%) assim como uma substituição no códon67 (67N). 0 segundo caminho gerou uma mutação no códon 219(219K/E), que de preferência, era associado com mutações noscódons 67 (67N) e 70 (70R) (Yahi et al, 1999). Havia,portanto dois padrões de fenótipos: (1) L210W, M41L,T215Y/F, ±D67N, que conferiram níveis elevados deresistência viral ao AZT e ao d4T e (2) K219K/E, D67N, K70R,que conferem níveis moderados de resistência viral ao AZT eao d4T.

Marcelin et al (2004) resumem a prevalência dasmutações relacionadas com a recuperação primária de TAM empacientes com falhas virológicas. Aqui, 1098 seqüências deRT que foram investigadas produziram dois padrõesgenotípicos conforme indicado na figura 1 e na figura 2.Embora antecedentes genéticos diferentes possam ter sidoapresentados antes da terapia, a seqüência e a composição daterapia antiretrovirótica adotada quando combinada com asdiferenças individuais na farmacologia resultaram em umaresistência viral não somente ao AZT e ao d4T, mas também aoutros NRTIs. Dependendo do padrão de mutação presente, aresistência ao fármaco inclui abacavir (ABC), didanosina(ddl), tenofovira (TNF) , lavibudine (3TC), emtricitabine(FTC) e Zalcitabine (ddC). Assim sendo, a emergência de Tamsrelacionados com a recuperação primária, com freqüência, temum papel importante no desenvolvimento posterior de padrõesgenotipicos de HIV bastante resistentes. Assim sendo, umaetapa na prevenção da resistência de nucleosideos múltiplosé desenvolver um novo NRTI com o objetivo de evitar aacumulação de TAMs relacionados com as recuperação primária,

As mutações de TAM relacionadas com a recuperaçãoprimária podem aparecer concomitantemente com outrasfamílias de mutantes de fuga que tipicamente emergem deterapias de combinação antiretroviral (conhecida de outraforma como terapia de coquetel). Atualmente, o coquetel"combivir" (AZT+3TC) é o regime mais freqüentementeutilizado e recomendado de terapia de primeira linha para otratamento de pacientes primários de HIV. Ele, no entanto,leva a mutantes de fuga que são resistentes a ambos osfármacos. Por exemplo, Miller et al (1998) relatam que ovírus resistente a 3TC com uma mutação M184V foi escolhidosomente 4-12 semanas após a iniciação da terapia combinadade AZT+3TC. Com o tempo, mutações adicionais associadas comAZT aparecerão gradualmente, produzindo um padrão genotipicocaracterístico de M184V, M41L, D67N, K70N, K70R, L210W,T215Y/F e K 219Q/E que é comumente encontrado em tratamentosde pacientes experientes hoje em dia. As mutações adicionaisno RT nas posições H208, R211, e L214 (Stumer et al, 2003) ena posição G333 (Kemp et al 1998) são relatadas como sendoenvolvidas na resistência dupla a AZT-3TC, e especialmente,para conferir um aumento na habilidade para resistir ao AZT.Assim sendo, o contexto do genótipo da recuperação primáriae relacionada com TAMs foi expandido para incluir asmutações dentro de M184V, M41L, DN67, K70R, H208Y, L210W,R211K, L214F, T215Y/F, K219Q/E e G333E.

Outros tipos de mutações geralmente vistos notratamento de pacientes experientes são V1181 e E44D/A.

Estas mutações são fortemente correlacionadas a umaexposição previa ao ddl e ao d5T. Além disso, eles, comfreqüência, são associados com a presença de aglomeradosespecíficos de ΤΑΜ, incluindo o M41L mais T215Y/F ou D67Nmais L210W. 0 resultado é uma resistência a TAM relacionadacom a recuperação primária aumentada à família de análogosde timidina, assim como uma função distinta na resistênciadupla a AZT+3TC (Montes et al, 2002, Girouard et al, 2003).

A prevalência de mutantes de fuga de fármacosaumenta como função do número de NRTIs usados durante ocurso da terapia e formam um padrão de TAMs ou NAMsexpandidos compostos de várias permutações dentro de M41L,E44D/A, D67N, K70R, V118I, M184V, H208Y, L210W, R211K,L214F, T215Y/F, K219Q/E e G333E.

Este aglomerado é também comumente refratário aterapias de combinação contendo AZT e d4T e resistentecruzado a classe inteira de NRTIs.

Uma resistência significativa a análogos detimidina, notavelmente AZT, d4T e TNF, é também encontradaem mutantes de fuga tendo uma eliminação de aminoácido naposição 67 (A67) na região do dedo de RT com freqüênciaassociados com uma substituição de aminoácido no T69Gconcomitante com TAM (ver Imamichi et al 2000 e 2001) . Umaatividade de polimerização de RT aumentada, que é associadacom este genótipo específico, é proposta para resultar emuma extirpação primária dependente de pirofosforolise maiseficiente (descrita acima), levando as uma resistênciaaumentada. Boyer et al, (2004) também observaram que o Α6Ίconcomitante com TAM conferiu uma habilidade aumentada parafacilitar a resistência viral a recuperação primária(extirpação) a AZT e a TNF quando comparado somente com oΤΑΜ.

O HIV está evoluindo simultaneamente, enquanto aterapia antiretrovirótica se desenvolve. Novos fenótipos demutação emergiram quando foram empregados coquetéis deanálogos de nucleosideos triplos e duplos no gerenciamentoclinico de HIV, especialmente no tratamento de pacientesprimários. Os regimes terapêuticos complexos, requerendofármacos múltiplos tomados várias vezes durante o dia,alguns dos quais sem alimentos, são um desafio para ospacientes. A falha em atender exatamente estes regimes dedosagem leva a falhas durante as 24h, facilitando aemergência de vírus de HIV múltiplos resistentes a NRTI,predominantemente como resultado de vírus adquiridos NAMs ouMDRs. Por exemplo, uma quantidade de grupos (por exemplo,Mas et al, 2000) observaram a emergência do vírus mutanteT69S-XX associado com o uso de AZT. Este mutante tem umainserção 5-bp na região de codificação do seu RT entre osácidos nucléicos que especificam os aminoácidos 69 e 70. Oscomplexos resultantes da inserção de aminoácidos duplos(tipicamente, inserções de SS, SG ou AG) não levam somente aresistência viral ao AZT, mas também a quase toda a coleçãode NRTIs, incluindo d4T, 3TC, ddl, ddC e ABC, e TNF. Umarecuperação primária dependente de pirofosforolise é vistacom a inserção do aminoácido duplo T69S+, especialmente napresença de TAMs. Este fenômeno é tipicamente associado comos fenótipos resistentes "M41L/T215Y" ou"M41L/L210W/R211K/L214F/T215Y" e têm uma função fenotipicaimportante na resistência a nucleosideos múltiplos- (Meyer etal, 2003).

Outra classe de MDR tem uma substituição deaminoácido no códon Q151M. Esta mutação é observada comfreqüência relativamente baixa na clinica e com freqüência,é apresentada, juntamente com as mutações secundárias deA62V, V75I, F77L e F116 Y. Ela confere, no entanto, umaresistência significativa a quase toda a classe de NRTIs.Além disso, foram observados associados com TAMs,tipicamente os genótipos "M41L, L210W e T215Y/F" ou "D67N,K70R e K219K/E". Eles aparecem em pacientes que têmexperimentado tratamentos pesados com regimes de combinaçãode AZT/ddl e AZT/ddC.

L74V é mais freqüentemente escolhido pelamonoterapia ddl (Martin et al, 1993) e apresenta umaresistência cruzada a ABC e a 3TC. O seu efeito na produçãode fugas virais é dependente da presença de outras mutações.As pesquisas de resistência sugerem que a freqüência de L74Vestá ligada significativamente com ΤΑΜ, tipicamente emantecedentes de M41L, L210W e T215Y/F (Marcelin et al, 2004)mesmo apesar da mutação L74V ser considerada como causandoum efeito de diminuição na replicação viral e naressensibilização de virus resistentes a AZT que contêm umaquantidade de TAMs (St. Clair et al, 1991). Uma combinaçãode mutações de L74V e M184V no HIV-I RT é o padrão maisfreqüente associado com a resistência para ambos o ABC e oddl (Harrigan et al, 2000 e Miller et al, 2000).

Apesar da resistência em nivel elevado a ABCtipicamente requerer mutações múltiplas compostas de K65R,L74V, Y115F e M184V, uma só mutação, M184V, com freqüênciaaparece primeiro. Esta mutação, agora reconhecida como umamutação principal no mecanismo de discriminação daresistência à fuga do fármaco confere uma redução moderadana suscetibilidade ao ABC (Tisdale et al, 1997). Um estudoCNA3005 no qual um total de 562 pacientes receberamaleatoriamente AZT e 3TC com ABC ou ddl mostrou um aumentobaixo, mas constante na proporção de pacientes contendo TAMno AZT e no 3TC mais o braço de ABC. Na semana 48, até 56%dos pacientes tinha pelo menos um TAM relacionado com arecuperação primária (IxTAM) maior e superior à induçãorápida da mutação M184V (Melby et al, 2001), ilustrando aimportância da prevenção da emergência da resistênciarelacionada com a recuperação primária. Da mesma forma, apassagem in vitro de virus resistentes a AZT contendo opadrão genotipico de 67, 70, 215 e 219 sob a pressãoseletiva de 3TC resultou na escolha da mutação M184V econferiu uma resistência cruzada a ABC (Tisdale et al,1997). Isto outra vez enfatiza o conceito de que tratando-seo TAM pré-existente relacionado com a recuperação primária eevitando a acumulação de mutantes relacionados comrecuperação primária em uma etapa pivotal em evitar odesenvolvimento de resistência de nucleosideos múltiplos.

Tem ficado cada vez mais claro que a mutação K65Raparece rapidamente em uma proporção muito elevada depacientes que estão recebendo TNF ou ABC. Valer et al (2004)relataram que o aumento de K65R aumentou em prevalência noseu hospital de Madrid de < 1% entre 1997 e 2000 a 7% em2003 e 12% nos primeiros quatro meses de 2004. 0 efeito domutante K65R é exacerbado na presença de outros mutantesassociados com a suscetibilidade reduzida a ABC, 3TC, ddl eddC (Parikh et al, 2003). No entanto, a aparência simultâneade K65R dos genótipos de TAM relacionados com a recuperaçãoprimária, apesar de ocorrerem claramente, leva a um efeitomais profundo na recuperação primária (extirpação) de TNF doque de AZT (Naeger et al, 2001) . O TNF foi relatado comosendo ativo contra o HIV-I com até 3 χ TAMS, a não ser que oaglomerado de TAM inclua uma mutação M41L ou L210W.

Atualmente, não está claro porque os TAMs podem reverteralguns dos efeitos do K65R, os quais, de outra formaconsidera-se que impede os mutantes da primeira extirpaçãocom relação a suscetibilidade ao TNF e ABC.

Finalmente, a mutação T69D foi inicialmenteidentificada pela sua função em causar a resistência a ddC.

Também foi relatado como sendo associada a uma respostareduzida a ddl quando ocorre em combinação com a mutaçãoT215Y e outros genótipos de TAM relacionados com arecuperação primária.

Durante muitos anos, o WHO e o DHHS (US Departmentof Health and Human Health Service) recomendou a terapiaantiretroviral de primeira linha no tratamento de pacientesprimários, consistindo da administração de d4T ou de AZT emcombinação com 3TC mais nevirapine ou efavirenz (diretrizespara o uso de agentes retrovirais antivirais em adultos eadolescentes infectados por HIV-1, 14 de julho de 2003 e 23de março de 2004). Todavia, um número substancial depacientes infectados por HIV experimentaram falhas notratamento, enquanto estavam nos regimes de terapiaantiretroviral altamente ativa (HAART), sugerindo que estespacientes já estão infectados com o vírus de fuga defármaco. Os mutantes de resistência a TAM relacionados com arecuperação primária continuam a ter uma função pivotal nodesenvolvimento de resistência a fármacos. Assim sendo, odesenvolvimento de fármacos ou de métodos terapêuticos paracontra-atacar o efeito dos mutantes de resistência a TAMrelacionados com a recuperação primária poderiapotencializar ou prolongar o uso dos NRTIs existentes para otratamento dos pacientes primários e poderia também serutilizado para tratar a população infectada por HIV quetransporta mutantes resistentes relacionados com arecuperação primária em uma terapia de recuperação.

Estratégias de Fármacos para Evitar/Inibir osMutantes de Recuperação Primária

As mutações de recuperação primáriadiscriminativas, com freqüência, aparecem juntas no mesmogenótipo mutante, largamente devido a estratégia atualterapêutica. Uma mutação M184V é representativa da famíliade mutantes discriminativos. Se, no entanto, ela ocorre emconjunto com os mutantes relacionados com a recuperaçãoprimária, como M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, e K219Q/E,ela tem uma função na resistência dupla a AZT e 3TC (Milleret al, 1998).

Estes fenótipos de recuperação primária e deresistência discriminativa parecem ser correlacionados comaglomerados de mutações diferentes em RT. Por exemplo, asmutações associadas com AZT, compostas de várias mutaçõesdentro de M41L, E44D/A, D67N, K70R, V118I, M184V, H208Y,L210W, R211K, L214F, T215Y/F, K219Q/E e G333E, e a mutaçãoMDR T69S com 6 -bp inserções e um A67 tipicamente apresentamatividades de mutante de recuperação primária. Por outrolado, as mutações nas posições 65, 74, 89, 151, e 184 levama habilidade de discriminar entre NRTIs e as contrapartesrespectivas de dNTP ou elas poderão estar envolvidas nareposição do complexo padrão primário.

No artigo recente "Designing anti-AIDS drugstargeting the major mechanism of HIV-I RT resistance tonucleoside analog drugs" (IJBCB 36 (2004) 1706 - 1715, que éincorporado aqui como referência na sua integridade),Sarafianos et al concluem que o mecanismo de recuperaçãoprimária (extirpação) poderia ocorrer somente antes datranslocação de RT no sitio N e concluem ainda que tornou-seo mecanismo dominante de resistência a NRTI. No capitulointitulado "Strategies for inhibition of the ExcisionReaction" (ver página 1711), eles propõem três estratégiaspara derrotar tal mecanismo de resistência:

1. o uso de novos antiviróticos que interfiram coma ligação produtiva de ATP (no sitio Ρ),presumivelmente através da ligação no, oupróximo do sitio de ligação ao ATP, dessa formabloqueando a reação de extirpação, sem afetar areação posterior da síntese de DNA.

2. o uso dos compostos que podem bloquear asíntese de DNA mas são de alguma formaresistentes à extirpação, como variantes dealfa fosfato tio ou borano substituídos dosNRTIs atuais. Da mesma forma, os variantes dosNRTIs atuais podem ser engenheirados parareposição do padrão primário ampliado/terminadoem um modo não extirpável, conforme sugeridopela pobre capacidade de extirpação dosmutantes M184I/V induzidos por 3TC.

3. o uso de inibidores baseados em dinucleotídeotetrafosfato para produzir uma ligaçãobidentato em ambos os sítios N e P.

Cada uma destas três estratégias propostas paraevitar os mecanismos de recuperação primária de resistênciaa NRTI é aberta a críticas por diversos atalhos teóricos.Por exemplo, na primeira estratégia, a ligação de ATP não érequerida para funções RT normais. Assim sendo,contramedidas baseadas na inibição de ATP ou ligação depirofosfato através de competição ou bloqueio não evitará odesenvolvimento de resistência, porque a adequação dos vírussobrepostos não será comprometida por tais agentes. Emoutras palavras, as mutações de resistência aparecerão semnenhum custo adicional. A quantidade abundante de ATPpresente nos linfócitos normais também desafia o raciocínioatrás desta estratégia.

Na segunda estratégia proposta, parece que osanálogos de alfa fosfato borano ou tio-substituídosescolheriam os mutantes resistentes discriminativos, comotem sido visto com 3TC e FTC, e produzem mutantesresistentes a HIV.

A terceira estratégia proposta é limitada pelanecessidade da absorção fármaco-cinética na célula alvo dasespécies grandes altamente carregadas de dinucleotídeotetrafosfato. Este será um desafio farmacêutico e deadministração de fármaco severo.

É digno de nota que cada uma das estratégias deSarafaniano, incluindo a estratégia 1, ela própria não sendoanti-viral, mas pressupõe a administração conjunta de umNRTI convencional, é baseada em variantes da apresentaçãoatual de NRTIs. Isto é, os compostos que não possuem umafunção 3-hidroxila e, portanto agem como terminadores decadeia forçada.

Ao contrário dos NRTIs "clássicos" discutidosacima (i.e. aqueles que não têm uma função 31-hidroxila),Ohrul et al (J Med Chem (2000) 43, 4516 - 4525, que éincorporada aqui como referência na sua integridade)descreve inibidores de HIV de 4'-C-etinila:

<formula>formula see original document page 22</formula>

Formula IEstes compostos retém a função 3'-hidroxila mas noentanto apresentam atividade contra HIV-I, incluindo umafamília típica de MDR discriminatiyo que contém as mutaçõesA62V, V75L, F77L, F116Y e Q151M. 0 mecanismo de ação foipostulado como sendo através de afinidade com a quinase defosforilação de nucleosídeo.

No entanto, foi tambémobservado que estes compostos poderão funcionar comoterminadores de cadeia de DNA, devido ao seu caráter deneopentil álcool e da obstrução estérica severa dosubstituínte eis 4' vicinal, que resultou em uma reatividadegrandemente diminuída da 31-hidroxila.

Kodama et al (Antimicrob Agents Chemother (2001)1539 - 1546, que é incorporada aqui como referência na suaintegridade) descreve um conjunto muito semelhante decompostos contendo um grupo 4'-C-etinila adjacente e afunção 3'-hidroxila retida que foram ensaiados em cultura decélulas com famílias adicionais resistentes a HIV. ComoKodama et al não preparou os trifosfatos dos seus compostos,eles foram incapazes de esclarecer o mecanismo de ação masdeduziram, através de várias observações circunstanciais,que os compostos estão na realidade atuando como NRTIs.Kodama et al mais tarde relataram (abstract 388-T, 9thConference on Retroviruses and Opportunistic Infections, queé incorporado aqui como referência na sua integridade) quesob a pressão seletiva do seu nucleosídeo 4-C-etinila invitro, o HIV resistente a ruptura contendo mutações T1651 eM184V localizado no sítio catalítico RT foi descoberto. Estefenótipo mutante é manifestamente um tipo discriminativo demutação e é muito resistente cruzado a 3TC. A incorporaçãodo nucleosideo de 4-C-etinila de bloqueio de conflitoestérico estava portanto envolvida. Isto foi estabelecidocom o mecanismo inibidor de 3TC e, portanto quase certamenterepresenta o mecanismo resistente discriminativo. Pareceportanto improvável que os compostos de Kodama forneçamorientação em relação à questão dos mutantes facilitarem aprimeira recuperação (extirpação mediada por ATP ou pirofosfato).

Chen et al (Biochemistry (1993) 32:6000 - 6002 queé incorporada aqui como referência na sua integridade)conduziu investigações mecânicas extensas em uma sérieestruturalmente relacionada de compostos contendo um grupoazido em 41 :

<formula>formula see original document page 24</formula>

Fórmula II

Chen demonstrou que o RT incorpora eficientementedois nucleotideos de 41-azidotimidina monofosfato, quefinalizam o alongamento de cadeia. Alem disso, RT também foicapaz de incorporar um primeiro 41-azidotimidinamonofosfato, seguido por um dNTP nativo e então um segundonucleotideo 4'-azidotimidina, que também levou à terminaçãode cadeia. Notar que ambos estes mecanismos resultaram em um4'-azidotimidina monofosfato residindo no término primáriodo DNA terminado, que é um mecanismo inibidor muitoreminescente dos NRTIs atuais. Também era aparente que aspolimerases alfa e beta celulares (i.e. não virais) cada umadelas é capaz de incorporar um só 4'-azido nucleotideo, masnão um segundo, na cadeia nascente do DNA hospedeiro. Estaspolimerases celulares então permitem que a cadeia de DNAhospedeira se alongue com outros dNTPs nativos e assimsendo, incorpore permanentemente os nucleotideos NRTI nosgenes de DNA hospedeiro. Estes compostos não forampesquisados em seres humanos por causa da mis-incorporaçãode nucleotideos não nativos pelas enzimas celulares terclara aplicação em carcinogênese. Da mesma forma, odesenvolvimento farmacêutico dos compostos correspondentesde 4'-C-etinila de Kodama foi interrompido, alegadamentedevido à severa toxidez em organismos maiores.

A EP 341 911 descreve uma extensa família de 3'-C-hidroximetil nucleosídeos da fórmula

<formula>formula see original document page 25</formula>

Fórmula III

e propõe o seu uso predominantemente contra osvírus de herpes, tais como CMV, mas também contra osretrovirus. A WO 92/06201 também apresenta um conjuntosemelhante de compostos e indicações.

A US 5.612.319 (que é incorporada aqui comoreferência na sua integridade) apresenta a atividaderetroviral de 2'-3' dideoxi-31-C-hidroximetilcitosina contraHIV-Iiiib do tipo selvagem e o equivalente de símio, SIV-1,em um modelo de infecção aguda por HIV de modelo de macacocynomolgus. Esta publicação propõe o uso do composto como umagente de profilaxia pós-exposição, especialmente contraferimentos por agulha-bastão. A profilaxia de pós-exposiçãosignifica que o ingrediente ativo é administradoimediatamente em pessoas, como pessoas na área médica, asquais não intencionalmente se auto-espetaram com uma seringainfectada por HIV. Para assegurar o rápido tratamento de umprofissional da saúde traumatizado com razão, uma seringaacionada por mola auto-administrada, tais como aquelasutilizadas para antídotos em guerra química e biológica, éuma rota preferida de administração.

A intenção da profilaxia pós-exposição é evitarque a infecção se estabeleça por si própria, ao invés detratar uma infecção existente. Como tal, pretendia-se que otratamento o fosse executado durante um período de tempocurto, como de 24 - 48h, utilizando doses extremamenteelevadas do composto. Esta publicação menciona que por causado período de tempo distinto de administração, a toxideztransitória é aceitável, porque está sendo feita umatentativa para se evitar uma doença incurável. O métodoprofilático pós-exposição descrito na US 5.612.319 nunca foitentado em seres humanos - na realidade, segundo o queconhecemos, 21-3'-dideoxi-31-C-hidroximetilcitozina nuncafoi administrada em seres humanos.

Em 1994 quando a solicitação da US 5.612.319 foidepositada, o HIV multi-resistente conforme é conhecido hojeainda não tinha aparecido em nenhuma forma convincente. Hojeem dia, o HIV multi-resistente tem mutações de recuperaçãoprimária induzidas por acumulação durante muitos anos depressão seletiva da terapia NRTI. Em outras palavras, o HIVe especialmente o RT existente, no momento em que aquelaspatentes foram concedidas, era estruturalmente emecanicamente muito diferente dos virus de hoje.

A solicitação internacional de patente PCT/EP2005/057196, que não foi publicada na data de prioridade dasolicitação atual, apresenta o uso de 2',3'-dideoxi-3'-hidroximetil- citozina e de prodrógas do mesmo no tratamentode mutantes de fuga de HIV.

Acredita-se que o 2', 31-dideoxi-31-C-hidroximetilcitozina é fosforilado no correspondente 5'-trifosfato por intermédio de enzimas celulares. O RTpesadamente mutado do HIV multi- resistente, especialmente,o RT mutante relacionado com a recuperação primária,incorpora este trifosfato como o 5'-(2', 31-dideoxi-31-C-hidroximetilcitozina) monofosfato na cadeia de DNA nascente.

Os NRTIs convencionais atuam como terminadores decadeia forçada, terminando a síntese de DNA no sítio N, esão portanto suscetíveis ao mecanismo único de recuperaçãoprimária (extirpação) mediada por ATP ou pirofosfato paraHIV multi-resistentes. Ao contrário, o 5'-(2', 3'-dideoxi-3'-C- hidroximetilcitozina) monofosfato não atua como umterminador de cadeia forçada, mais ao contrário, permite queum resíduo adicional seja ligado covalentemente na função3'-hidroximetila do 5'-(2', 3'-dideoxi-31-C-hidroximetilcitozina) monofosfato. Este então promove o RT para sofreras alteração de transformação necessárias para transferirele próprio para o sitio P para o round seguinte depolimerização. Evidência preliminar sugere que este resíduoterminal ligado é um nucleotídeo nativo ao invés de um 5'-(2', 3'-dideoxi-3'-C-hidroximetilcitozina) monofosfato.

Muito importante, os dados sugerem que o últimoincorporado não-2',3'-dideoxi-31-C-hidroximetilcitozinanucleotídeo não é responsável pela adição posterior denucleotídeos pela transcriptase reversa mutada. Isto é, aterminação de cadeia parece ocorrer em uma base além do NRTIda invenção, em vez de no NRTI. Além disso, após aincorporação de 2', 3'-dideoxi-31-hidroximetilcitozina, o RTparece transferir-se com sucesso para o sítio P para aceitaro nucleotídeo seguinte que entra. Esta evidência sugere queo 2', 3'-dideoxi-3'-hidroximetilcitozina, em conjunto com oRT mutado relacionado com recuperação primária, alcança umaforma de terminação de cadeia que não é responsável pelaextirpação induzida por ATP ou pirofosfato. Comoconseqüência, o 2', 31-dideoxi-31-hidroximetilcitozinapermite o tratamento efetivo de infecções por HIV que nãosão responsivas aos regimes atuais de fármacos.

O mecanismo inibitório discutido imediatamenteacima é, portanto fundamentalmente diferente do mecanismo determinação de cadeia dos nucleosídeos 4'-substituídos deChen et al (ver acima), que permitem que vários nucleotídeossejam incorporados depois do composto 4- substituídoincorporado. Primeiramente, o mecanismo de Chen melhoradramaticamente o risco de "transcrição". Isto é, apolimerase de DNA continua a seguir o filamento do código econtinua a adicionar os resíduos codificados para o códon deparada normal, dessa forma mis-incorporando o nucleosídeoanormal dentro do filamento de DNA. A eficácia antiviralpode ser perdida, no entanto, quando um filamento de DNAviral é construído pela polimerase viral (i.e. RT) porque oconstructo da transcrição poderá ainda ser viável, nãoobstante o nucleosídeo 4'-substituído mis- incorporado. Maisimportante, se o nucleosídeo 4'- substituído é transcritoatravés de uma polimerases celular (i.e. hospedeira), comoChen descreve, o constructo resultante posteriormenterepresenta um teratogene e aumenta dramaticamente o risco dedanos celulares e câncer.

Os compostos de Chen, adicionalmente, requerem aadição de um segundo nucleotide 4'-substituído,imediatamente adjacente ao primeiro nucleotídeo 4'-substituído mis- incorporado (i.e. X-X) ou inter-dispersadopor um nucleotídeo nativo (i.e. X-N-X). Na prática, istosignifica que o nucleotídeo na última posição do términoprimário é o nucleotídeo não nativo (i.e. o fármaco). Isto éuma situação análoga ao caso da terminação de cadeia dosNRTIs clássicos (i.e. aqueles que não possuem um grupo 3 -hidroxila). Aqui, o nucleotídeo NRTI também reside na últimaposição do término primário onde, conforme discutido acima,ele é suscetível a extirpação mediada por ATP oupirofosfato.

São necessárias unidades múltiplas do nucleotídeos4'- substituídos de Chen para que ele trabalhe como uminibidor eficiente de RT. Como conseqüência, a efetividadedo fármaco depende da seqüência do filamento de leitura. Porexemplo, se o composto de Chen é um análogo de timidina, eleterá a melhor afinidade se o filamento de leitura tem umaseqüência AA ou A-N-A. Aqui, o fármaco seria eficiente eefetivo em terminar a síntese de DNA. Mas se a seqüência dofilamento de leitura não contém uma exposição abundante daseqüência de AA ou A-N-A, o fármaco de Chen será menos capazde terminar a síntese de DNA, em uma determinadaconcentração. Como um AA duplo ou um A-N-A triplo é muitomenos comum no genoma do que um A simples, o fármaco de Chenserá muito menos eficiente do que outros NRTIs que não têmum requisito de unidades múltiplas.

Mauldin et al Bioorganic and Medicinal Chemistry1998 6:577 - 585 apresenta uma quantidade de prodrógas de2',31-dideoxi-3'-hidroximetilcitozina. De importânciaespecial é o fato de que os autores descobriram que asprodrógas envolvendo substituintes nas posições de álcoolresultaram em uma redução na atividade antiviralvirtualmente em todos os seus ensaios.

Um objetivo da invenção atual é apresentarprodrógas novas de 2', 3'-dideoxi-31-hidroximetilcitozina,de uso no tratamento de HIV, e especialmente, no tratamentode mutantes de fuga de HIV.

Breve Descrição da Invenção

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, sãoapresentados compostos novos da fórmula I:<formula>formula see original document page 31</formula>

onde:

R1 é independentemente H, -OR3, -NHR4; alquila C1-C4;

ou, quando η é 2, o R1 adjacente em conjuntoj define uma ligação olefínica;

R2 é H;

ou quando o gem R1 é alquila C1-C4, aquele R2poderá também ser alquila C1-C4;

ou quando o gem R1 é -OR3, aquele R2 poderá tambémser -C(=0) OH ou um éster farmaceuticamente aceitável do mesmo;

R3 é independentemente H, ou um ésterfarmaceuticamente aceitável do mesmo;

R4 é independentemente H ou uma amidafarmaceuticamente aceitável do mesmo; e

R5 é H, -C(=0)R7, ou um resíduo de L-aminoácidoligado a amida; e

R6 é H;

ou R5 e R6 juntamente definem uma imina = CR8R8';

R7 é alquila Ci-C6 , alquilciclila C0-C3; eR8 e R8' são independentemente H, alquila C1-C6,alquil- ciclila C0-C3;

ou R8 é H e R8' é -NR9R9' ; e

R9 e R9' são independentemente H, e alquila Ci-C6,alquil- ciclila C0-C3;

ou R9 e R9' em conjunto com o átomo de N no qualeles são ligados define um anel saturado com 5 ou 6 membros;e

η é 1, 2 ou 3;

e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

De acordo com uma realização da invenção, η é 1 eos compostos têm a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 31</formula>

As variantes favorecidas para Rl:R2 nestarealização incluem

H:H, H:OH ou um éster farmaceuticamente aceitáveldos mesmos, e Me:Me. As variantes especialmente favorecidasdesta realização têm H como R5 e R6.

Uma realização alternativa da invenção tem η = 2,dessa forma produzindo compostos da fórmula geral:

<formula>formula see original document page 31</formula>

nesta realização, as variantes favorecidas paraR1a:R1b:R2a :R2b incluem H:H:H:HH:H:H:OH ou um éster farmaceuticamente aceitáveldos mesmos

H:H:H:NH2 ou uma amida farmaceuticamente aceitáveldos mesmos

H:OH ou um éster farmaceuticamente aceitável dosmesmos:H:H

H:NH2 ou uma amida farmaceuticamente aceitável dosmesmos:H:H

Me:Me:H:H

H:H:Me:Me

H:OH:H:OH

H:C=C:H

Variantes especialmente favorecidas destarealização têm H como R5 e R6.

Uma outra realização da invenção tem η igual a 3,com a fórmula geral:

As variantes favorecidas de

R1a:R2a:R2a:R2b:R1c:R2c incluem

H: H: H: H: H: H

H:H:Me:Me:H:H

H: H: OH: H: H: HH:H:OH:COOH:H:H

Η:Η:Η:Η:HrNH2

ou um éster ou amida farmaceuticamente aceitáveldos mesmos.

Variantes especialmente favorecidas destarealização têm H como R5 e R6.

Certas realizações da invenção têm uma basemodificada, i.e. R5 e/ou R6 são diferentes de hidrogênio.

Tal realização são iminas, onde R5 e R6 em conjunto definema imina =CR8R8'. Tipicamente R8 e R8' cada um deles será omesmo grupo alquila, mas as variantes assimétricas R8/R8'também estão dentro do escopo da invenção. Iminasrepresentativas dentro desta realização incluem

=CHN(CH3)2

=CHN(ipr)2

=CHN(pr)2

Alternativamente R8 e R8' em conjunto podem definirum grupo cíclico como pirrolidina, piperidina, piperazina,N- metil piperazina ou morfolina. Iminas representativasportanto incluem:

=CHN (CH2) 4=CHN (CH2) 5=CHN (CH2) 6=CHN (CH2CH2) 20

Atualmente é preferível que R5 e R6 sejam H.

Outras realizações da invenção onde R5 e R6 sãodiferentes de H incluem amidas, como amidas de L-aminoácido,como amidas lie, Vai, Leu ou Phe.Amidas alternativas incluem alquil amidas como asalquil amidas Ci-Cê, por exemplo, aquelas onde R5 é C(=0)CH3,C (=0) CH2CH3 ou C (=0) C (CH3) 3. Outras amidas incluem alquilarilamidas C (=0) C0-C3, tais como C(=0)Ph ou C(=0)Bz.

As realizações atualmente preferidas incluem oscompostos da fórmula I denominados de 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il)-octaidro-1, 5,10-trioxaciclopentaciclodeceno-6,9-diona; ou

2 -(4-amino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il)-octaidro-1,5,ll-trioxaciclopentacicloundeceno-6,10-diona:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.Estes compostos liberam subprodutos inócuos após hidrolisein vivo, como o ácido succinico ou glutárico.

Apesar de não desejarmos ser limitados por teoria,acredita-se que os compostos da invenção, ou metabólicosativos dos mesmos, são ativos contra a transcriptase reversaou retrovirus, tais como HIV-1, HIV-2, HTL e SIV.

De acordo com um outro aspecto a invençãoapresenta métodos para a profilaxia ou tratamento deinfecções de retrovirus em seres humanos ou animais,compreendendo a administração de um composto da fórmula I,ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Tipicamente a administração é oral.

Um outro aspecto da invenção apresenta o uso decompostos da fórmula I, ou de um sal f armaceuticamenteaceitável dos mesmos na fabricação de um medicamento para otratamento ou profilaxia de infecções retrovirais em sereshumanos ou animais. Tipicamente, o medicamento está em umaforma adaptada para a administração oral.

Outra realização da invenção apresenta um métodopara a inibição da emergência ou da propagação de mutantesde recuperação primária de HIV que são capazes de removeremum nucleotideo NRTI de terminação de cadeia incorporado emum complexo primário/modelo de HIV, onde a remoção éefetuada através de um mecanismo de extirpação dependente deATP ou dependente de pirofosfato. 0 mecanismo é composto daadministração simultânea ou em seqüência a um indivíduo infectado por HIV de uma quantidade efetiva do composto dainvenção e pelo menos um terminador de cadeia NRTI que induzmutantes de recuperação primária.

Os NRTIs convencionais atuam como terminadores decadeia obrigatórios terminando a síntese de DNA no sítio N,e são, portanto suscetíveis ao ATP descrito acima - ou aomecanismo único de recuperação primária (extirpação) mediadopor ATP ou pirofosfato em HIV multiresistente. Ao contrário,evidência preliminar sugere que os compostos da invenção nãoatuam como um terminador de cadeia forçado, mas aocontrário, permite que um resíduo adicional seja ligadocovalentemente na função 3' -hidroximetila do 5'-(2', 3'-dideoxi-3'-C-hidroximetilcitozina) monofosfato. Isto entãofaz com que o RT sofra a alteração transformacionalnecessária para se deslocar por si próprio para o sítio Ppara o round seguinte de polimerização. Evidência preliminarbaseada na seqüência do modelo apresentado abaixo sugere queeste resíduo terminal ligado seja um nucleotideo nativo.

0 HIV multiresistente tipicamente capaz de sertratado ou evitado de acordo com a invenção, tipicamenteterá um RT contendo um padrão genético composto pelo menosde um

(a) M41, ±D67, L210 e T215;

(b) D67, K7 0 e K219;

(c) T69S-XX ou

(d) A67

onde XX representa uma adição na seqüência RT dequaisquer dois aminoácidos naturais e o A67 representa aeliminação do aminoácido no códon 67.

Apesar de acreditar-se que os quatro padrõesgenéticos acima representam a base essencial do fenótipo defuga de fármaco de extirpação, ficará aparente que osmutantes tratados ou evitados pelo uso da invençãotipicamente serão compostos de mutações adicionais no geneRT e em qualquer outro local aqui, com freqüência, pelomenos três mutações no gene RT.

Geralmente, mas não exclusivamente, o aglomeradoM41, ±D67, L210 e T215 com freqüência serão compostos deM41L, ±D67N, L210W e T215Y ou T215F.

Opcionalmente, os aglomerados imediatamente acimapoderão ainda ser compostos, pelo menos, de uma outramutação na posição E44, K70, V118, H208, R211K, L214, K219ou G333.

Os aglomerados imediatamente acima poderão aindaser compostos, pelo menos, de uma mutação adicional naposição A67, T69, E203, L210, D218, H221, D223 ou L228.Geralmente, mas não exclusivamente, o aglomeradoD67, K70 e K219 é composto de D67, K70R e K219Q ou K219E.

Opcionalmente, o aglomerado D67, K70 e K219 poderáainda ser composto, pelo menos de uma mutação adicional naposição M41, E44, V118, H208, L210, R211K, L214, T215,ou G333.

Além disso, o aglomerado D67, K70 e K219,opcionalmente será ainda composto pelo menos de uma mutaçãoadicional na posição A67, T69, E203, L210, D218, H221, D223ou L228.

Geralmente, mas não exclusivamente, o aglomeradoT69S-XX poderá ainda ser composto pelo menos de uma mutaçãoadicional na posição M41, E44, D67, K70, V118, H208,L210, R211K, L214, T215, K219 ou G333.

Opcionalmente, o aglomerado T69S-XX poderá aindaser composto pelo menos de uma mutação adicional na posiçãoA67, T69, E203, L210, D218, H221, D223 ou L228.

Geralmente, mas não exclusivamente, o aglomeradoA67 poderá ainda ser composto pelo menos de uma mutaçãoadicional na posição M41, E44, D67, K70, V118, H208,L210, R211K, L214, T215, K219 ou G333.

Opcionalmente, o aglomerado A67 poderá ainda sercomposto, pelo menos de uma mutação adicional na posiçãoT69, T69S+XX, E203, L210, D218, H221, D223 ou L228.

Opcionalmente, a transcriptase reversa poderáainda conter pelo menos uma mutação discriminativa naposição K65, L74, M184 ou Q151, especialmente K65R, L74V ouM184V ou Q151M.Tipicamente, o aglomerado de mutantesdiscriminativos poderá ser ligado com pelo menos uma mutaçãoadicional na posição A62, V75, Fllr Y115 ou F116.

Entre as famílias de HIV capazes de serem tratadaspela invenção, estão as famílias de HIV multiresistentescujo RT tem mutações que encorajam a recuperação primária(extirpação) mediada por ATP ou pirofosfato de nucleotídeosNRTI de terminação de cadeia e que foram gerados dentro dopaciente como resultado de um tratamento prévio de HIV compelo menos um antiviral escolhido de zudovudine (AZT, ZDV),stavudine (d4T), zaicitabine (ddC), didanosina (ddl),abacavir, (ABC), lamivudine (3TC), emtricitabine (FTV),adefovir (ADV), entacavir (BMS 200475), alovudine (FLT),tenofovir disoproxil fumarato (TNF), amdoxavir (DAPD), D-d4FC (DPC-817), -dOTC (SPD754), SPD-756, racivir, D-FDOC ouGS7340.

Alternativamente, as famílias de HIV que sãoaquelas encontradas em pacientes que receberam tal famíliade HIV resistente ou multiresistente diretamente ouindiretamente de outro indivíduo que induziram eles própriosuma família de HIV resistente ou multiresistente através detratamento prolongado com pelo menos um antiviral da listaacima de antivirais NRTI. Com freqüência, as famílias de HIVmulti- resistentes contêm pelo menos três mutações no RTviral em comparação com o tipo selvagem.

Ficará, portanto aparente que os métodos ecomposições da invenção poderão ser utilizados como umaterapia adicional às atuais terapias antiretrovirais, taiscomo HAART, ou em alguns casos, como uma terapia desalvamento ou de recuperação. Isto tipicamente será o casoonde o HIV multi- resistente foi induzido no paciente realpor aquela história de tratamento anterior com fármacoantiretroviral. Alternativamente, os métodos e composiçõesda invenção constituirão uma terapia de primeira linha,tipicamente em pacientes cuja infecção primária de HIVocorreu com uma familia multiresistente já mutada. Osseguintes fármaco,s antivirais com freqüência, induzem taisfamílias de HIV multiresistentes tendo mutações derecuperação primária de RT e encorajam a extirpação mediadapor ATP ou pirofosfato de nucleotídeos NRTI de terminação decadeia:

zudovudine, lamivudine ou as formas combinadas dedosagens Combivir ou Trizivir; lamivudine, abacavir ou aforma de Epzicom;

tenofovir, emtricitabine ou a forma de dosagemcombinada Truvada.

Embora estes fármacos freqüentemente induzam taisfamílias de HIV multiresistentes, esta lista de fármacos nãoé exclusiva.

Fica, portanto aparente que o composto da invençãoé administrado para evitar a emergência de uma ou maisfamílias de HIV multiresistentes tendo mutações derecuperação primária RT e encorajam a extirpação mediada porATP ou pirofosfato de nucleotídeos NRTI de terminação decadeia. Esta prevenção ocorre menos quando os fármacos deNRTI que induzem tais mutações são administradosconcomitantemente.

Um terceiro aspecto da invenção apresenta umacomposição farmacêutica na forma de dosagem unitária,composta do composto da formula I e pelo menos um terminadorde cadeia NRTI onde a dosagem prolongada com NRTI induzmutações de recuperação primária RT HIV que encorajam aextirpação dependente de ATP ou dependente de pirofosfato deNRTI incorporado por monofosfato do término 3' do complexoprimário/modelo e permite a retomada da síntese de DNA.

As realizações preferidas da composiçãofarmacêutica da invenção e do método da invenção incluemaquelas onde o NRTI é escolhido de zudovudine (AZT, ZDV) ,stavudine (d4T), zaicitabine (ddC), didanosina (ddl),abacavir, (ABC), lamivudine (3TC), emtricitabine (FTV),adefovir (ADV), entacavir (BMS 200475), alovudine (FLT),tenofovir disoproxil fumarato (TNF), amdoxavir (DAPD), D-d4FC (DPC-817), -dOTC (SPD754), SPD-756, racivir, D-FDOC ouGS7340 e combinações dos mesmos.

As realizações especialmente preferidas incluemaquelas onde o NRTI é escolhido de zudovudine, stavudine,didanosina, lamivudine, abacavir, tenofovir, emtricitabineou combinações dos mesmos.

A experiência com fármacos para HIV, e inibidoresde transcriptase reversa de HIV especialmente, têmenfatizado ainda que os regimes de dosagens fármaco-cinéticas e complexos sub-ótimos resultaram rapidamente emfalhas não previstas. Isto por seu lado significa que aconcentração intensa durante 24h (concentração mínima deplasma) para os fármacos respectivos em um regime para HIVcom freqüência cai abaixo do limite inferior IC90 ou EDgo emgrande parte do dia. É considerado que um nivel durante 24hde pelo menos um IC50, e mais realisticamente um IC90 ou EDgoé essencial para reduzir o desenvolvimento de mutantes defuga de fármacos.

Os compostos da invenção são tipicamenteadministrados ao paciente em uma dose comensurável com aexpectativa de um tratamento antiretroviral prolongado eproctrado. O regime de tratamento se destina assim aassegurar um nivel definido de fármaco, e, no entanto aevitar a toxidez, apesar do uso de compostos da fórmula I emtratamento de profilaxia pós-exposição em uma dose elevada,aguda, que puder tolerar alguma toxidez transitória, seraceitável. Os compostos da fórmula I, tipicamente sãoadministrados em faixas de 1 - 25 mg/kg/dia, de preferência,menos de 10 mg/kg/dia, de preferência, na faixa de 0,05 -0,5 mg/kg/dia. A dosagem apropriada dependerá das indicaçõese do paciente, e é rapidamente determinada pelo metabolismoe a farmacocinética do fármaco em animal convencional (DMPK)ou em tentativas clinicas e por um programa de computador deprevisão "in silico".

As composições farmacêuticas de dosagens unitáriasda invenção têm quantidades correspondentes do composto dafórmula I, tipicamente em escala para adulto de 60 kg ou 75kg, e opcionalmente são divididos em 1, 2 ou 3 vezes para umregime de dosagem QD, BID ou TID. Se a dosagem terapêuticaestá na faixa de 0,05 - 0,5 mg/kg/dia, então uma dosagem QDclinica por pessoa por dia seria de 3 mg - 30 mg para umadulto de 60 kg ou 3, 75 - 37, 5 mg para um adulto de 75 kg.As restrições de dosagem e regimes do NRTI convencionaladicional no aspecto da composição farmacêutica de dosagemunitária combinada da invenção poderá necessitar de umadosagem QD, BID ou TID.

A invenção atual inclui sais farmaceuticamenteaceitáveis, tais como sais de ácidos orgânicos,especialmente, ácido carboxilico, incluindo, mas nãolimitado a acetato, trifluor- acetato, lactato, gluconato,citrato, tartarato, maleato, malato, pantotenato,isetionato, adipato, alginato, aspartato, benzoato,butirato, digluconato, ciclopentanato, glucoeptanato,glicerofosfato, oxalato, heptanoato, hexanoato, fumarato,nicotinato, palmoato, pectinato, 3-fenil propionato,picrato, pivalato, propionato, tartarato, lactobionato,pivolato, canforato, undecanoato e succinato. Também sãoincluídos os sais de ácidos sulfônicos orgânicos, comometanosulfonato, etanosulfonato, 2-hidroxi- etano sulfonato,canforsulfonato, 2-naftalenosulfonato, benzenosulfonato, p-clorobenzenosulfonato e p-tolueno- sulfonato. Os saisaceitáveis também incluem aqueles de ácidos inorgânicos,tais como ácido clorídrico, bromico, hidroiodeto, sulfato,bisulfato, hemisulfato, tiocianato, per- sulfato, fosfóricoe sulfônico.

A invenção atual se aplica a agentes ativos quesão hidratos, solvatos, complexos e outras formas físicas que liberam o composto da fórmula I.Embora seja possível que o agente ativo sejaadministrado sozinho, é preferível apresentá-lo como partede uma formulação farmacêutica. Tal formulação será compostado agente ativo dos compostos da fórmula I, juntamente comum ou mais veículos/excipientes aceitáveis e opcionalmenteoutros ingredientes terapêuticos. 0 veículo deve seraceitável no sentido de ser compatível com os outrosingredientes da formulação e não ser prejudicial aosreceptores.

As formulações incluem aquelas adequadas para aadministração retal, nasal, tópica (incluindo bucal esublingual), vaginal ou parenteral (incluindo a subcutânea,intramuscular, intravenosa e intradérmica). De preferência,a formulação é uma formulação administrada oralmente. Asformulações poderão convenientemente ser apresentadas naforma de dosagem unitária, como por exemplo, tabletes ecápsulas de liberação prolongada, e poderão ser preparadaspor quaisquer métodos bem conhecidos na arte de farmácia.

Tais métodos bem conhecidos incluem a etapa decolocar o composto do agente ativo da fórmula I emassociação com o veículo. Em geral, as formulações sãopreparadas através de colocar-se o agente ativo intimamentee uniformemente em associação com veículos líquidos ouveículos sólidos finamente divididos ou ambos, e entãoformatando o produto, se necessário. A invenção se aplica amétodos para a preparação de uma composição farmacêuticacomposta da colocação de um composto da fórmula I ou o seusal farmaceuticamente aceitável em conjunto ou em associaçãocom um veículo farmaceuticamente aceitável. Se a produçãodas formulações farmacêuticas envolve a mistura íntima deexcipientes farmacêuticos e do ingrediente ativo em umaforma de sal, e então, com freqüência é preferível utilizar-se excipientes que não são básicos em natureza, i.e., ácidos ou neutros.

As formulações para a administração oral dainvenção atual poderão ser apresentadas como unidadesdistintas, tais como cápsulas ou tabletes, cada um delescontendo uma quantidade predeterminada do agente ativo.Alternativamente eles podem ser apresentados como um pó ougrânulos; como uma solução ou uma suspensão do agente ativoem um líquido aquoso ou em um líquido não-aquoso ou em umaemulsão líquida óleo-em-água ou uma emulsão líquida água-em-óleo, ou como uma pílula grande, etc.

Com relação às composições para administração oral(por exemplo, tabletes e cápsulas), o termo "veículoadequado" inclui veículos tais como excipientes comuns, porexemplo, agentes aglutinantes, tais como xarope, acácia,gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinil pirrolidona(Povidona), metil celulose, etil celulose, carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropil metilcelulose, sacarose eamido; cargas e veículos, por exemplo amido de milho,gelatina, lactose, sacarose, celulose microcristalina,caulim, manitol, fosfato di-cálcico, cloreto de sódio eácido algínico; e lubrificantes como estearato de magnésio,estearato de sódio e outros estearatos metálicos, ácidoglicerol estearato esteárico, fluido de silicone, ceras detalco, óleos de silica coloidal. Agentes de sabor, tais comohortelã pimenta, óleo de gaultéria, sabor de cereja ousemelhante também podem ser utilizados. Poderá ser desejáveladicionar-se um agente de cor para fazer com que a forma dedosagem seja rapidamente identificável. Os tabletes poderãotambém ser revestidos por métodos bem conhecidos na arte.

Um tablete poderá ser feito por compressão oumoldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientesacessórios. Os tabletes comprimidos poderão ser preparadosatravés de compressão do agente ativo em uma máquinaadequada, na forma de escoamento livre como um pó ougrânulos, opcionalmente misturado com um aglutinante,lubrificante, diluente inerte, conservante, agente ativo nasuperfície ou dispersante. Os tabletes moldados poderão serfeitos através de moldagem em uma máquina adequada de umamistura do composto em pó umidificado com um diluentelíquido inerte. Os tabletes poderão também, opcionalmente,ser revestidos ou marcados e poderão ser formulados paraproduzirem uma liberação lenta ou controlada do agente ativo.

Outras formulações adequadas para a administraçãooral incluem pastilhas compostas do agente ativo em uma basecom sabor, usualmente sacarose e acácia ou tragacanto;pastilhas compostas do agente ativo em uma base inerte comogelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e soluções delavagem da boca, compostas do agente ativo em um veículolíquido adequado.

"Alquila Ci-C6" (também abreviado como ale Ci-C6,ou usado em expressões do composto, tais como alquiloxilaC1-C6, etc) conforme é utilizado aqui, significa incluircadeias de carbono alifáticas de cadeia linear e ramificadacomo metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila,isobutila, t- butila, pentila, isopentila, hexila, heptila equaisquer isômeros simples dos mesmos. O grupo alquilapoderá ter uma ligação insaturada. Adicionalmente, qualquerátomo de C em alquila Ci-C6 opcionalmente poderá sersubstituído por 1, 2 ou onde a valência permitir, por 3halogênios e/ou substituído ou a cadeia alquilenointerrompida por um heteroatomo S, 0, NH. Se o heteroatomo élocalizado no término da cadeia, então ele é substituídoapropriadamente por um ou dois átomos de hidrogênio. AlquilaC1-C11 tem o significado correspondente a alquila Ci-C6ajustado conforme o necessário para o número de carbonos.

"Alquilarila C0-C3 conforme é utilizado aquisignifica incluir qualquer radical arila como fenila,naftila ou fenila fundida em uma cicloalquila C3-C7, porexemplo, indanila, cuja arila é ligada diretamente (i.e.,C0) ou através de um grupo intermediário metila, etila,propila, ou isopropila, conforme definido para o alquilenoC1-C3 acima. A não ser que seja indicado de outra forma,arila e/ou o seu radical cicloalquila fundido éopcionalmente substituído com 1,3- substituintes escolhidosde halogênio, hidroxila, nitro, ciano, carboxila, alquilaC1-C6, alcoxila Ci-C6 , Ci-C6 alcoxiC1-C6 alquila, alcanoilaC1-C6, amino, azido, oxo, mercapto, nitro C0-C3alquilcarbociclila, C0-C3 alquileterociclila. "Arila" tem osignificado correspondente, i.e., onde a ligação alquilaC0-C3 está ausente.

"C0-C3 alquilC3-C7-cicloalquila" conforme utilizadoaqui significa incluir um grupo cicloalquila C3-C7 comociclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila ouciclo- eptila, cujo cicloalquila é ligado diretamente (i.e.alquila Co) ou através de um grupo intermediário metila,etila ou propila, conforme definido para o alquileno Ci-C3acima. O grupo cicloalquila poderá conter uma ligaçãoinsaturada. A não ser que seja indicado de outra forma, oradical cicloalquila opcionalmente é substituído com 1-3substituintes escolhidos de halogênio, hidroxila, nitro,ciano, carboxila, alquila Ci-C6, alcoxila Ci-C6, Ci-C6alcoxiCi-C6 alquila, alcanoila Ci-C6, amino, ácido, oxo,mercapto, nitro C0-C3 alquilcarbociclila, C0-C3alquileterociclila.

"Alquilcarbociclila C0-C3" conforme usado aquisignifica incluir alquilarila C0-C3 e C0-C3 alquil C3-C7cicloalquila. A não ser que seja indicado de outra forma, ogrupo arila ou cicloalquila opcionalmente é substituído com1-3 substituintes escolhidos de halogênio, hidroxila, nitro,ciano, carboxila, alquila Ci-C6, Ci-C6 alcoxiCi-C6 alquila,alcanoila Ci-C6, amino, ácido, oxo, mercapto, nitro, C0-C3alquilcarbo- ciclila e/ou C0-C3 alquileterociclila.

"Carbociclila" tem o significado correspondente, i.e., ondea ligação alquila C0-C3 está ausente.

"Alquileterocicilila C0-C3" conforme utilizado aquisignifica incluir um anel monocíclico, saturado ouinsaturado contendo heteroatomo, como piperidinila,morfolinila, piperazinila, pirazolila, imidazolila,oxazolila, isozazolila, tiazinolila, isotiazinolila,tiazolila, oxadiazolila, 1,2,3-triazolila, 1,2,4-triazolila,tetrazolila, furanila, tienola, piridila, pirimidila,piridazinila, pirazolila, ou qualquer de tais gruposfundidos em um anel fenila como quinolinila,benzimidazolila, benzoxazolila, benzisoxazolila,benzotiazonolila, benzisoiazinolila, benzotiazolila,benzoxadiazolila, benzo-1,2,3-triazolila, benzo-1,2,4-triazolila, benzotetrazolila, benzofuranila, benzotienila,benzopiridila, benzopirimidila, benzopiridazilila,benzopirazolila, etc, cujo anel é ligado diretamente, i.e.(Co) , ou através de um grupo intermediário metila, etila,propila, ou isopropila, conforme definido para o alquilenoCi-C3 acima. Qualquer anel não saturado tendo um caráteraromático poderá ser referido como heteroarila aqui. A nãoser que seja indicado de outra forma, o anel hétero e/ou oseu radical fenila fundido opcionalmente é substituído com1-3 substituintes escolhidos de halogênio, hidroxila, nitro,ciano, carboxila, alquila Ci-C6, alcoxila C1-C6, Ci-CealcoxiCi-C6 alquila, alcanoíla Ci-C6, amino, azido, oxo,mercapto, nitro, alquilcarbociclila C0-C3,alquileterociclila C0-C3. "Heterociclila" e "heteroarila"têm o significado correspondente, i.e., onde a ligaçãoalquila C0-C3 está ausente.

Radicais tipicamente heterociclila e carbocicliladentro do escopo das definições acima são portanto um anelmonociclico com 5 ou especialmente 6 átomos no anel, ou umaestrutura de anel biciclico composto de um anel fundido commembros em um anel com 4, 5 ou 6 membros.

Tais grupos típicos incluem cicloalquila C3-C8,fenila, benzila, tetraidronaftila, indenila, indanila,heterociclila como azepanila, azocanila, pirrolidinila,piperidinila, morfolinila, tiomorfolinila, piperazinila,indolinila, piranila, tetraidropiranila,tetraidrotiopiranila, tiopiranila, furanila,tetraidrofuranila, tienila, pirrolila, oxazolila,isoxazolila, tiazolila, imidazolila, piridinila,pirimidinila, pirazinila, piridazinila, tetrazolila,pirazolila, indolila, benzofuranila, benzotienila,benzimidazolila, benzoxazolila, benzisoxazolila,quinolinila, tetraidroquinolinila, isoquinolinila,tetraidrosoquinolinila, quinazolinila, tetra-idroquinazolinila e quinoxalinila, qualquer dos quaisopcionalmente poderá ser substituído conforme definido aqui.

O radical heterociclo saturado inclui, portantoradicais, tais como pirrolinila, pirrolidinila,pirazolinila, pirazolidinila, piperidinila, morfolinila,tiomorfolinila, piranila, tiopiranila, piperazinila,indolinila, azetidinila, tetraidropiranila, tetra-idrotiopiranila, tetraidrofuranila, hexaidropirimidinila,hexa- idropiridazinila, 1, 4, 5, 6-tetraidropirimidinilamina,diidro-oxazolila, 1,2-tiazinanil-l,1-dióxido, 1,2,6-tiadiazinanil-1,1-dióxido, isotiazolidinil-1,1-dióxido eimidazolidinil-2,4-diona, onde o heterociclo insaturadoinclui radicais com um caratér aromático, como furanila,tienila, pirrolila, oxazolila, tiazolila, imidazolila,pirazolila, isoxazolila isotiazolila, oxadiazolila,triazolila, tetrazolila, tiadiazolila, piridinila,piridazinila, pirimidinila, pirazinila, indolizinila,indolila, isoindolila. Em cada caso, o heterociclo poderáser condensado com um anel fenila para formar um sistema deanel biciclico.

Os compostos da fórmula I incluem certos ésteresou amidas farmaceuticamente aceitáveis. Ésteresrepresentativos incluem, portanto os ésteres de ácidocarboxilico nos quais o radical não carbonila da porção deácido carboxilico do grupo de éster é escolhido de alquilade cadeia linear ou ramificada (por exemplo, metila, n-propila, t-butila, ou n- butila, cicloalquila, alcoxialquila(por exemplo, metoximetila), aralquila (por exemplo,benzila), ariloxi- alquila (por exemplo fenoximetila), arila(por exemplo, fenila, opcionalmente substituído por, porexemplo, halogênio, alquila C1-4, ou alcoxila C1-4) ou amino;sulfonato ésteres, tais como alquil ou aralquilsulfonila(por exemplo, metanosulfonila); ésteres de aminoácidos (porexemplo, L-valil ou L-isoleucila); e mono-, di-, ou tri-fosfato ésteres. Em tais ésteres, a não ser que sejaespecificado de outra forma, qualquer radical alquilapresente, vantajosamente contém 1 a 18 átomos de carbono,especialmente, 1 a 6 átomos de carbono, mais especialmente,1 a 4 átomos de carbono. Qualquer radical cicloalquilapresente em tais ésteres, vantajosamente contém 3 a 6 átomosde carbono. Qualquer radical arila presente em tais ésteresé, vantajosamente composto de um grupo fenila, opcionalmentesubstituído conforme mostrado na definição de carbocicililaacima.

Ésteres farmaceuticamente aceitáveis incluem,portanto ésteres de ácido graxo C1-C22r tais como os ácidosgraxos monoinsaturados omega-6 ou insaturados lineares ouramificados insaturados de cadeia longa ou de acetila ou t-butila, tais como palmoila, estearoila e semelhantes.

Ésteres de arila ou heteroarila alternativosincluem benzoila, piridilmetiloil e semelhantes, qualquerdos quais poderá ser substituído, conforme definido emcarbociclila acima. Os ésteres farmaceuticamente aceitáveispreferidos incluem os ésteres de ácido L-amino alifáticocomo leucila, isoleucila e especialmente valila. Ésteres deaminoácidos preferidos adicionais incluem os ésteres doácido 2-O-AA-C3-C22 graxo descritos na W099 09031, onde AA éum éster de aminoácido alifático, especialmente aquelesderivados de ácido L-lático e L-valila.

Amidas farmaceuticamente aceitáveis incluemaquelas derivadas de aminoalquila de cadeia linear ouramificada C1-C22 opcionalmente incluindo 1 a 3 insaturaçõese/ou opcionalmente substituído com os substituintesdefinidos em carbocicilila acima ou anilinas oubenzilaminas. As amidas preferidas incluem aquelas formadasda reação da amina com um ácido alcanóico de cadeia linearou ramificada C1-C4. Outras amidas farmaceuticamenteaceitáveis com funções de amina correspondem às amidas dosácidos carboxilicos preferidos para os ésteres indicadosacima.

Síntese

Os compostos da invenção tipicamente sãosintetizados de um derivado de bis-4,5-hidroximetiltetrahidrofuran protegido de forma diferente,preparado de forma análoga à Svansson et al em J. Org. Chem(1991) vol 56: 2993 - 2997 conforme mostrado no esquema 1

<formula>formula see original document page 53</formula>

No esquema 1, o epoxi quiral álcool 1 érapidamente preparado utilizando-se a oxidação Sharplessconforme mostrado em J Org Chem 1987, 52, 2596. Rs é umgrupo de proteção de hidroxila convencional, como aquelesdiscutidos abaixo, por exemplo, para-bromobenzila.

0 epoxi álcool 1 é regioseletivamente alquilado emC-3, por exemplo, com brometo de alil magnésio em dimetiléter a -50 °C. A cromatografia, por exemplo, com silica gel,separa o isômero 2 desejado, opcionalmente após uma etapa dediferenciação na qual as hidroxilas vicinilas doregioisômero não desejado são clivadas com um agenteoxidante como periodato de sódio. 0 grupo hidroxilaprincipal em 2 é protegido com um outro grupo de proteçãohidroxila, por exemplo, benzoilação com cloreto de benzoilaem piridina a 0 0C produzindo o 3 diferencialmenteprotegido. A cis-hidroxilação da ligação olefinicautilizando uma quantidade catalitica de tetróxido de ósmio eN- metilmorfolina N-óxido como re-oxidante, conformedescrito em "Tet. Lett. 1976 17 1973 produz o di-álcoolcorrespondente que por seu lado é clivado com um agenteoxidante como periodato de sódio em um solvente orgânicocomo tetra-hidrofuran aquoso. A furanose instável assimproduzida é desbloqueada com um álcool/ácido como metanol a0,5%, peso/peso, em ácido clorídrico para produzir ointermediário 4 de bis-4,5-hidroximetiltetra-hidrofuranprotegido diferencialmente.

Poderá ser desejável manipular-se os grupos deproteção Rs e Rsl (i.e. para remover e re-proteger com umoutro grupo de proteção hidroxila, dessa forma para utilizara facilidade de remoção seletiva de um dos grupos deproteção escolhidos e não o outro, em etapas posteriores. Osgrupos de proteção diferenciais em 4 são portanto escolhidospara permitirem a remoção seletiva de tal grupo de proteçãoe a acilação da função hidroxila assim exposta conformemostrado abaixo nos esquemas 2 e 3. Vários pares de gruposde proteção de hidroxila escolhidos diferencialmente sãoconhecidos, como por exemplo, os grupos de proteção-0apresentados em Greene, "Protective Groups in OrganicSynthesis", (John Wiley & Sons, New York (1981)).

Os grupos de proteção de hidroxila são entãocompostos de éteres, tais como metil éter ou metil éteressubstituídos, por exemplo, metoximetila (MOM),benziloximetila, t-butoximetila, 2-metoxietoximetila (MEM), 2, 2, 2-tricloroetoximetila, bis (2-cloroetoxi)metila, 2-(trimetilsilil)etoximetila,teroidropiranila (THP), 3-bromotetraidropiranila,tetraidrotiopiranila, 4-metoxitetraidropiranila, 4-metoxitetraidrotiopiranila S,S dixido, tetraidrofuranila etetraidrotiofuranila. Etil éteres incluem 1-etoxietila, 1-metil-l-metoxietila, 1-(isopropoxi)- etila, 2,2,2-tricloroetil e 2-(fenilselenil)etila. Outros éteres incluemt-butila, alila, cinamila, p-ciorofenil e benzil éteres,tais como benzil insubstituido, p-metoxibenzil, o-nitro-benzil, p-nitrobenzil, p-halobenzil e p-cianobenzil. Outroséteres incluem 3-metil-2-picolil N-oxido, difenilmetil, 5-dibenzosuberil, trifenilmetil, alfa naftildifenilmetil, p-metoxifenildifenilmetil, P(P1-bromofenaciloxi)fenildifenilmetil, 9-antril, 9-(9-fenil)xantenil, 9-(9-fenil-10-οχο)antril (tritilona)e benzisotiazolol S,S,dioxodo. Silil éteres incluem trimetilsilil (TMS),trietilsilil, isopropil- dimetilsilil, t-butildimetilsilil(TBDMS), (trifenilmetil)- dimetilsilil, t-butildifenilsilil,metildiisopropilsilil, metil di-t-butilsilil,tribenzilsilil, tri-p-xililsilil, triisopropilsilil etripenilsilil. Grupos de proteção de hidroxila alternativosincluem ésteres, como formiato, benzoilformiato, acetato,cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato,trifluoracetato, metoxiacetato, trifenilmetoxi- acetato,fenoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, 2, 6-tricloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6-dicloro-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1-dimetilpropil)fenoxiacetato,cloro- difenilacetato, ρ-(P)-fenilacetato, 3-fenilpropionato, 3-benzoilpropionato, isobutirato,monosuccinato, 4-oxopenatanoato (Ievinulato), pivaloato,adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, (E)-2-metil-2-butenoato (tigloato) e benzoatos, como os (dibromometil )o-(metoxi- carbonil)-, p-fenil-, 2,4,6-trimetil-(mesilato)ou p-(P)- benzoatos, ou alfa-naftoato. Os grupos de proteçãode hidroxil carbonato incluem os metil, etil, 2,2,2-triclorometil, isobutil, vinil, alil, cinamil, p-nitrofenil,benzils, tais como p-metoxi-, 3,4-dimetoxi-, -nitro- ou p-nitrobenzil, ou S- benziltiocarbonato. Grupos de proteçãohidroxila miscelânea incluem N-fenilcarbamato, N-imidazolilcarbamato, borato, nitrato, Ν,Ν.Ν.Ν-tetrametilfosforodiamidato e 2,4-dinitro- fenilsulfenato.

Greene apresenta gráficos extensos de reatividadepara facilitar a seleção dos pares complementares de gruposde proteção diferenciais.

Grupos de proteção hidroxila representativosincluem aqueles nos exemplos, e éteres, tais como t-butil eoutros alquil éteres menores, tais como isopropil, etil eespecialmente metil, benzil e trifenilmetil;tetraidropiranil éteres; e etil éteres substituídos, porexemplo, 2,2,2-tricloro- etil; silil éteres, por exemplo,trimetilsilil, t-butildimetilsilil e t-butildifenilsilil; eésteres preparados pela reação do grupo hidroxila com umácido carboxilico, como por exemplo, acetato, propionato,benzoato e semelhantes.

0 bis-4,5 hidroximetiltetrahidrofuran 4 protegidodiferencialmente é então condensado com uma 4-amino-pirimidona silitada, opcionalmente N-protegida, conformemostrado no esquema 2, seguido pela acilação e ciclização.

Alternativamente, 4 é primeiramente biciclisado e então écondensado conforme mostrado no esquema 3.

<formula>formula see original document page 57</formula>

O esquema 2 mostra uma condensação Vorbrüggen(Chem Ber. 1981, 114, 1234) do intermediário 4 protegidodiferencialmente com 4-amino-pirimidin-2-ona silitada, ondea função 4-amino é opcionalmente protegida com um grupo deproteção amino convencional conforme mostrado em Greene,"Protective Groups in Organic Synthesis," (John Wiley &Sons, New York (1981)). Exemplos de tais grupos incluem: 1)grupos acila, tais como formila, trifluoracetila, ftalila, ep-toluenosulfonila; 2) grupos carbamato aromáticos comobenziloxicarbonila (CBZ ou Z) e benziloxicarbonilainsubstituidas, e 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc); 3)grupos carbamato alifáticos, tais como terc-butiloxicarbonila (Boc), etoxicarbonila,diisopropilmetoxicarbonila, e aliloxi- carbonila; 4) gruposalquil carbamato ciclicos, tais como ciclopentiloxicarbonilae adamantiloxicarbonila; 5) grupos alquila comotrifenilmetila e benzila; 6) trialquilsilila comotrimetilsilila; 7) grupos contendo tiol comofeniltiocarbonil e ditiasuccinoil. O grupo de proteçãoamino, é claro, é escolhido de tal forma que as suascondições de desproteção são harmonizadas com a seqüência deremoção dos grupos de proteção de hidroxila.Alternativamente, Rs2 é um "synthon" para as amidas e iminasdefinidas para R5 e R6. Em vários casos, não é requeridonenhum grupo de proteção para a função amino e portanto Rs2 é H.

Conforme é convencional na condensação Vorbrüggen,a mistura da reação contém TBDMSOTf e CH2Cl2 e o isômerodesejado 5 é separado com cromatografia, por exemplo, HPLC.Um dos grupos de proteção hidroxila em 5 é então removidoseletivamente para descobrir a função hidroxila. No esquema,composto 6, o Rs é o que é removido primeiramente, e o pardiferencial de grupos de proteção hidroxila pode portanto,por exemplo, ser TBDP (terc-butil-silanil) removidoseletivamente com TBAF em tetra-hidrofuran para Rs, e o MMTR(4-metoxi-fenildifenilmetil) posteriormente removido comácido acético para Rs1. No entanto, fica rapidamenteaparente que outras permutações de grupos de proteçãoalcançarão o mesmo objetivo. Greene apresenta extensosgráficos de reatividade sobre diversos grupos de proteçãopara facilitar tal seleção. Adicionalmente, trocando-se asposições de Rs através de manipulação apropriada de 4 istoproduzirá um intermediário no qual a função hidroximetila édesmascarada e acilada primeiramente.

A função hidroxila desmascarada em 6 é acilada comum ácido dicarboxilico H00C-A-C00H ativado, onde Acorresponde a -(CR1R2)n- conforme definido acima, paraproduzir 7. No caso de R1 ou R2 conter um grupopotencialmente reativo como OH, NH2 ou COOH, estes sãoconvencionalmente protegidos conforme descrito no trabalhode Greene.

O ácido ativado utilizado na acilação poderá sercomposto, por exemplo, de halogeneto ácido, anidrido ácido,éster ácidó ativado ou o ácido na presença de agente deacoplamento, como por exemplo, dicicloexilcarbodiimida.Derivados ácidos ativados representativos incluem o cloretoácido, anidridos derivados de halogenetos de alcoxi-carbonila, tais como cloreto de isobutiloxicarbonila esemelhantes, ésteres derivados de N-hidroxisuccinamida,ésteres derivados de N-hidroxiftalimida, ésteres e derivadosde N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxamida, ésteres ederivados de 2,4,5-triclorofenol e semelhantes. Outrosácidos ativados incluem aqueles da fórmula HCOOHACOOX ondeX, por exemplo, é COCH3, COCH2CH3 ou que COF3 oubenzotriazola.

0 grupo de proteção RS1 no composto 7 é entãoremovido para liberar até 4 grupos hidroximetila de 8 napreparação para a ciclização do segundo anel do sistema deanel biciclico de tetraidrofuran. Isto prossegue através daacilação, conforme descrito no principio acima.

0 grupo Rs2 do composto 8, é então manipulado paraproduzir os compostos da fórmula 1, conforme sejanecessário. Por exemplo, um grupo de proteção amino como RS2pode ser removido para produzir a amina livre em R5 & R6e/ou a função amina convertida em uma amida ou iminaconforme descrito abaixo.

Um esquema alternativo de síntese para oscompostos da fórmula 1 é conforme mostrado na figura 3:

<formula>formula see original document page 60</formula>No esquema 3, o tetra-hidrofuran 4 protegidodiferencial- mente descrito acima é primeiramentebiciclizado e então é condensado conforme Vorbrüggen. Abiciclização prossegue através da desproteção de um primeiropar Rs/Rs1 de grupos de proteção complementares. Neste casoa função 4- hidroximetila do tetra-hidrofuran é que éliberada primeiramente pronta para a acilação, mas estametodologia geral, com a escolha apropriada de grupos deproteção Rs/RS1 também pode prosseguir através da remoção eacilação da função hidroximetila 5 como a primeira etapapara a ciclização.

A escolha da desproteção 4 ou 5 primeiramente ésignificante naqueles casos onde A é o ácido ωω-dicarboxilico HOOC-A-COOH é assimétrico, i.e., nos compostosda fórmula 1 onde m é 2 ou 3 e onde R1ZR2 dos váriosmeridianos de metileno não é idêntico. Por exemplo, onde A é-CH(OH)CH2- (isto é, na fórmula 1, η é 2, R1 no primeirogrupo metileno é OH enquanto R2 é H, ambos o R1 e o R2 nosegundo grupo metileno são Η) , então a localização do grupohidroxila R1 adjacente a ligação éster da funçãohidroximetila 4 do intermediário de tetra-hidrofuran podeser assegurado pela desproteção do Rs primeiro utilizando oPG-OC-CH2-CH (OH)-COOH ácido ativado, onde PG é um grupo deproteção carboxila convencional, que, é claro, é escolhidode tal forma que as suas condições de remoção sãoharmonizadas com a remoção pretendida de RS1. Greeneapresenta gráficos extensos de reatividade para facilitartal seleção.Grupos de proteção de carboxila são extensamenterevistos neste trabalho de Greene e tipicamente sãocompostos de ésteres tais como metil ou ésteres metilsubstituídos, por exemplo, metoximetil, metiltiometil,tetraidropiranil, tetraidrofuranil, metoxietoxietil,benziloximetil, fenacil, incluindo p-bromo, alfa metil ou p-metoxifenacil, diacil- metil, ou N-ftalimidometil. Etilésteres incluem etil insubstituido e 2,2,2-tricloroetil, 2-haloetil, ω-cloralquil, 2-( trimetilsilil)etil, 2-metiltietil, 2-(p-nitrofenilsulfenil)etil, 2-(p-toluenosulfonil)etil e 1-metil-l-fenetil. Outros ésteresincluem t-butil, ciclopentil, cicloexil, alil, cinamil efenil, incluindo m-metiltiofenil. Benzil ésteres incluembenzil insubstituido, trifenilmetil, difenilmetil incluindobis(o- nitrofenil)metil, 9-antrilmetil, 2-(9,10-dioxo)antrilmetil, dibenzosuberil, 2,4,6-trimetilbenzil, p-bromobenzil, o-nitro- benzil, p-nitrobenzil, p-metoxibenzil,piperonil, 4-picolil e ρ-(P)-benzil. Silil ésteres incluemtrimetilsilil, trietilsilil, t-butildimetilsilil, i-propildimetilsilil e fenildimetilsilil. Ésteres ativadosincluem S-t-butil, S-fenil, S-2-piridil, N-hidroxipiperidinil, N-hidroxisuccinimidoil, N-hidroxi-ftalimidoil, e N-hidroxibenzotriazolil. Grupos de proteçãode carboxi éster miscelâneos incluem 0-acil oximas, 2,4-dinitrofenilsulfenil, 2-alquil-l,3-oxazolinas, 4-alquil-5-oxox-1,3-oxazolidinas e 5-alquil-4-oxo-l,3-dioxolanos.

Estanil ésteres incluem dietilestanil e tri-n-butilestanil.Grupos de proteção de carboxila não ésteres incluem amidas,tais como N-N-dimetil, pirrolidinil, piperidinil, o-nitrofenil, 7-nitroindolil, 8-nitrotetraidroquinolil ep(P)benzeno- sulfonamida. Grupos de proteção de carboxilanão éster alos incluem hidrazidas, tais como N-fenilidrazidaou N-N'-di- isopropilidrazida.

Um esquema alternativo em relação a derivados detetra-hidrofuran protegido diferencialmente é mostrado noesquema 4:

<formula>formula see original document page 63</formula>

O esquema 4 é extensamente relatado na literaturaacadêmica. A preparação de precursores de análogo de uridinaé mostrada em Sanghvi et al Synthesis 1994, 1163, Sanghvi etal Tett Lett vol 35 ρ 4697 (1994) e Haly & SanghviNucleosides & Nucleotides Vol 15 1383 (1996). A conversão deuridina em análogos de citozina é mostrada em Koziov,Nucleosides & Nucleotides vol 17 2249 (1998) .

Uma rota alternativa para tetra-hidrofuransprotegidos diferencialmente não requerendo a conversão dabase i é mostrado no esquema 5:

<formula>formula see original document page 64</formula>

a: TrCl, piridina, b: i) MsCl, Pyr ii) IN NaOH,THF, c) i) EtAlCN, 65C, ii ) tolueno/THF, d) i) MsCl, Et3N,ii) EtOAc, f) i) NaBH4 ii) EtOH, α/β 1:3-4, g) i) DIBAL, ii)siliea gel EtOAe, epimerize α/β 93:7, g)i) NaBH4, ii)EtOH/CH2Cl2.

Apesar do esquema 5 ter sido ilustrado com umgrupo de proteção TrO e R5R6=H, ficará aparente que outrasvariantes para os grupos de proteção de amina e hidroxilaserão responsáveis por esta rota.

Com referência agora a todos os esquemas, asiminas onde R5 e R6 juntamente definem um =CR8R8', sãotipicamente preparadas pela condensação do composto dafórmula 1 onde R5 e R6 são o intermediário correspondente 5(opcionalmente desprotegido com um composto da fórmula(CH3O)2CHNR8R8', tipicamente em DMF na temperatura ambiente,de forma análoga ao procedimento em Mauldon et al, BioorgMed Chem 6 (1998) 577 - 585. Os acetais de formamidaapropriados geralmente são preparados a partir dedialquilformamidas intermediárias e dimetil sulfato natemperatura ambiente. A reação do sal intermediário commetóxido de sódio produz semi-acetais, que então sãocondensados conforme descrito acima.

Os compostos da fórmula I onde R5 é uma amida sãotipicamente preparados pela acilação de Akiyama (Chem PharmBull 1978, 26, 981) do composto não protegido N-4 da fórmulaI, ou do intermediário 5 correspondente, com o ROORapropriado em H2O/1,4-dioxano. Os compostos onde R5 é umresíduo de aminoácido são ligados com o resíduo deaminoácido N-protegido utilizando condições de acoplamentode peptídeo convencionais.

Descrição Detalhada das Realizações

Várias realizações dos métodos dos compostos dainvenção serão agora descritos, somente para fins deexemplo, com referência ao seguintes exemplos e figuras; nosquais

A figura 1 é um gráfico das concentrações deplasma ao longo do tempo de metabólicos in vivo após aadministração oral de um composto da invenção a um rato;

A figura 2 detalha a inibição de famílias típicasde TAM tendo um fenótipo de recuperação primária pelocomponente principal dos compostos da invenção em relação ainibição de NRTIs convencionais, conforme adicionalmentediscutido no exemplo biológico 2a;

A figura 3 detalha a inibição de M184V + TAMstendo um fenótipo de recuperação primária pelo componenteprincipal dos compostos da invenção, em relação a inibiçãode NRTIs convencionais, conforme adicionalmente discutido noexemplo biológico 2b;

A figura 4 detalha a inibição de T69S + XX + TAMspelo componente principal dos compostos da invenção, emrelação a inibição de NRTIs convencionais conformeadicionalmente discutido no exemplo biológico 2c;

A figura 5 detalha a inibição das famílias de TAMpelo componente principal dos compostos da invenção, emrelação a inibição por intermédio de zidovudine e delamivudine, conforme adicionalmente discutido no exemplobiológico 3;

EXEMPLO 1

2 -(4-amino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il)-octaidro-1,5,10-trioxaciclopenta-ciclodeceno-6,9-dionaa) N- (1-(5-(terc-butil-difenil-silaniloximetil)-4-[ (4-metoxi-fenil) -difenil-metoximetil] -tetraidrofuran-2-il) -2-oxo-l, 2-diidro-pirimidin-4-il) -2, 2-dimetil-propionamida

<formula>formula see original document page 67</formula>

Em uma solução de 0,75 g (1 mmol) de 4-amino-l-{5-(terc-butil-silaniloximetil) - 4 - [(4-metoxifenil)-difenil-metoximetil]-tetraidrofuran-2-il} -IH- pirimidin - 2 -ona,preparada conforme o esquema 4 acima, em dioxano (25 ml) esob nitrogênio, foi adicionada uma solução de di-terc-butildicarbonato (0,44 g, 2 mrrtols) em dioxano (2 ml). A misturada reação foi agitada na temperatura ambiente durante 4 8h. Amistura da reação foi evaporada sobre silica gel e o resíduofoi purificado em coluna de silica gel utilizando-se acetatode etila/hexanos 2:1 como eluente para produzir 0,42 g (49%)do produto detalhado acima.

Próton RMN (CDCl3): 8,33 (d, 1H) , 7, 64-7, 59 (m,4H) , 7,45-7,18 (m, 18H) , 6,91 (d, 1H) , 6, 79-6, 77 (m, 2H) ,6,10-6,08 (m, 1H) , 4, 08-4, 06 (m, 1H) , 3, 98-3, 96 (m, 1H) ,3,77 (s, 3H) , 3,59 (dd, 1H) , 3,19-3,16 (m, 1H) , 3,02-2,98(m, 1H) , 2, 57-2, 53 (m, 2H), 2, 72-2,25 (m, 1H), 1,50 (s, 9H),1, 08 (s, 9Η).

b) Terc-butil éster do ácido (1-{5-hidroximetil-4- [ (4-metoxifenil-difenil-metoximetil]-tetraidrofuran-2-il} -2-oxo-1,2-diidro-pirimidin-4-il]-carbamico.

<formula>formula see original document page 68</formula>

Em uma solução do composto acima (0,33 g, 0,4em tetra-hidrofuran (10 ml) foi adicionada umade TBAF (0,19 g, 0,6 mmols) em tetra-hidrofuran (1

A mistura da reação foi agitada na temperaturaambiente durante 3h. A mistura da reação foi evaporada sobresilica gel e o resíduo foi purificado em coluna de silicagel utilizando-se acetato de etila/hexanos 2:1 como oeluente. A evaporação das frações apropriadas produziu 0,20g (80% de terc-butil éster do ácido (1-{5-hidroximetil-4-[ (4-metoxifenil-difenil-metoximetil]-tetra-hidrofuran-2-il]-2-oxo-l,2-diidro-pirimidin-4-il]-carbamico.

Próton RMN (CDCl3): 8,22 (d, 1H) , 7, 40-7, 38 (m,4H) , 7, 38-7,23 (m, 10H), 6, 85-6, 82 (m, 1H), 6, 03-6, 00 (m,1H) , 4, 04-3, 94 (m, 2H) , 3,85-3,81 (m, 1H) , 3,80 (s, 3H) ,3,29 (dd, 1H) , 3,11 (dd, 1H) , 2, 35-2,22 (m, 3H) , 1,52 (s,9Η).

c) Éster do ácido mono-{5-(4-terc-butoxicarbonilamino - 2-oxo-2H-pirimidin-l-il)-3-[(4-metoxi-fenil)-difenil-metoximetil]-tetra-hidrofuran-2 - il - metil}succinico

<formula>formula see original document page 69</formula>

Em uma solução do composto acima (2mm mg, 0,33mmols) e 4-dimetilaminopiridina (98 mg, 0,8 mmols) emdiclorometano (20 ml) foi adicionado anidrido succinico (80mg, 0,8 mmols). A mistura da reação foi agitada natemperatura ambiente durante a noite, onde após a reação amistura foi adicionada em uma mistura de diclorometano ecloreto de amônio saturado. A fase orgânica foi lavada comágua e secada. A evaporação do solvente produziu 222 mg(94%) do composto detalhado acima.

Próton RMN (CDCl3): 8,02 (d, 1H) , 7, 38-7, 36 (m,4H) , 7,30-7,15 (m, 9H) , 6,84-6,81 (m, 2H) , 5, 89-5, 87 (m,1H) , 4,58 (dd, 1H) , 4,26 (dd, 1H), 4,13-4,08 (m, 1H) , 3,79(s, 3H) , 3,24 (dd, 1H) , 3,05 (t, 1H) , 2, 80-2, 60 (m, 4H) ,2,31-2,26 (m, 1H), 2,17-2,12 (m, 2H), 1,51 (s, 9H).

d) Éster do ácido mono-{5-(4-terc-butoxicarbonilamino-2-oxo-2Η-pirimidin-1-il)-3-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il- metil] succinico

<formula>formula see original document page 70</formula>

Uma solução do composto acima (222 mg, 0,31 mmols)em ácido acético (10 ml) e água (5 ml) foi agitada natemperatura ambiente durante 3h. LC/MS indicou uma conversãocompleta do material inicial no composto desprotegidodesejado como um ion M+l de 442. Δ mistura da reação foievaporada até a secura e o resíduo foi purificado sobrecoluna em fase reversa de C-8 eluida com acetonitrila/água1:1,5 como eluente para produzir 100 mg (73%) do compostodesejado detalhado acima.

Próton RMN (CDCl3): 8,18 (d, 1H) , 7,23 (d, 1H) ,5,93 (cada s, 1H) , 4, 66-4, 63 (m, 1H) , 4,33 (d, 1H) , 4,15(cada s, 1H) , 3,66 (cada s, 2H) , 2, 80-2, 59 (m, 4H) , 2,37(cada s, 2H), 2,28-2,44 (m, 1H), 1,51 (s, 9H).

e) Terc-butil éster do ácido [1-(6,9-dioxo-decaidro-1,5,10-trioxa-ciclopentaciclodecen-2-il)-2-oxo-l,2-diidro-pirimidin-4-il]-carbamico

<formula>formula see original document page 70</formula>Em uma solução do composto acima (74 mg, 0,168mmols) , HOBR (27 mg, 0,2 mmols) e trietilamina (0,14 ml, 1mmol) em diclorometano (65 ml) e DMF (2 ml) foi adicionadoEDAC (39 mg, 0,2 mmols). A mistura da reação foi agitada natemperatura ambiente durante 48h, onde após a reação amistura foi derramada em diclorometano (100 ml) e ácidocitrico aquoso (100 ml) . A fase orgânica foi lavada comsolução de bicarbonato de sódio e salmoura. A fase orgânicafoi secada sobre sulfato de sódio e foi evaporada até umresíduo que foi purificado em coluna de silica gelutilizando-se acetato de etila como o eluente, para produzir22 mg (31%) do composto mostrado acima.

Próton RMN (CDCl3): 7,75 (d, 1H) , 7,36 (cada s,1H) , 7,25 (d, 1H) , 6, 02-5, 99 (m, 1H) , 4,58 (dd, 1H) , 4,36-4,28 (m, 2H), 4,14 (t, 2H) , 2,64 (s, 4H) , 2, 58-2, 55 (m, 1H) ,2,29-2,25 (m, 2H), 1,52 (s, 9H).

f) 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il)-octaidro-1,5,10-trioxa-ciclopentaciclodeceno-6,9-diona.

Em uma solução do composto acima (22 mg, 0,052mmols) em diclorometano (2 ml) foi adicionado ácidotrifluoracético (2 ml) . A mistura da reação foi agitada emna temperatura ambiente durante 1 hora e foi evaporada atésecura. A evaporação conjunta duas vezes com toluenoproduziu, após cuidadosa a secagem, 12,7 mg do compostocapturado como o sal de bis-trifluoracetato. LC/MS confirmoua estrutura com íons característicos de 324 (M+l) e 647(2M+1) e a pureza através de HPLC estava acima de 90% a 254 nm.EXEMPLO 2

7 - amino - 2 -(4-amino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il)-octaidro-1,5,10-trioxaciclopentaciclodeceno-6,9-diona

<formula>formula see original document page 72</formula>

a) O éster 4-(5-(4-terc-butoxicarbonilamino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il]-3-[(4-metoxi-fenil)-difenil-metoximetil]-tetraidrofuran-2-il-metil) do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino succinico

<formula>formula see original document page 72</formula>

Em uma solução de terc-butil éster do ácido(1 - {5-hidroximetil-4-[(4-metoxifenil-difenil-metoximetil]-tetraidrofuran-2-il} - 2 - oxo - 1,2-diidro-pirimidin-4-il]-carbamico [ 98 mg, 0,4 mmols, descrito no exemplo 1] e 4-metilaminopiridina (a 98 mg, 0,8 mmols) em diclorometano (aml) foi adicionado N-Boc-(S)-asp anidrido [172 mg, 0,8mmoles (preparado conforme descrito em J. Med. Chem. 1971,pp 24 - 30)]. A mistura da reação foi agitada natemperatura ambiente durante a noite onde após a reação amistura foi adicionada em acetato de etila (150 ml e cloretode amônio saturado (100 ml) . A fase orgânica foi lavada comágua, secada com sulfato de sódio e evaporada para produzir371 mg de um produto bruto detalhado acima que foi usado semqualquer purificação na etapa seguinte.

Próton RMN (CDCl3): 7,76 (d, 1H), 7,38-7,20 (m, 12H), 7,08 (d, 1H), 6,83 (d, 2H), 6,13 (d, 1H), 5,80 (d, 1H) ,4, 83 (t, 1H), 4,61-4,58 (m, 1H), 4,14-4,06 (m, 2H) , 3,79 (s,3H) , 3,25-3, 23 (m, 1H) , 3,17-3,12 (m, 1H) , 3,00 (t, 1H) ,2, 80-2, 76 (m, 1H), 2,26-2,15 (m, 3H) , 1,56 (s, 9H), 1,4 (s,9H).

b) 4- [5- (4-terc-butoxicarbonilamino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il) - 3 - hidroximetil-tetraidrofuran-2-il-metiléster do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-succínico

<formula>formula see original document page 73</formula>

Uma solução do composto acima (330 mg, 0,40 mmols)em ácido acético (10 ml) e água (5 ml) foi agitada natemperatura ambiente durante a noite. A mistura da reaçãofoi evaporada até a secura e o resíduo foi purificado em umacoluna em fase reversa C-8 eluido com acetonitrila/água 1:1,5 como eluente para produzir 72 mg (32% do produtodesejado. LC/MS confirmou a estrutura correta com um ionmolecular de 557 (M+l).

c) Terc-butil éster do ácido [l-(7-terc-butoxicarbonilamino - 6,9 - dioxo - decaidro - 1,5,10 -trioxaciclopentaciclodecen-2-il)-2-oxo-l,2-diidro-pirimidin-4-il)-carbamico

<formula>formula see original document page 74</formula>

Em uma solução do composto acima (72 mg, 0,13mmols) , HOBR (20 mg, 0,16 mmols) e trietilamina (0,07 ml,0,5 mmols) em diclorometano (50 ml) e DMF (1 ml) foiadicionado EDAC (31 mg, 0,16 mmols). A mistura da reação foiagitada até a temperatura ambiente durante 24h onde após areação, a mistura foi adicionada em diclorometano (100 ml) ea fase orgânica foi lavada com solução de ácido citrico,solução de bicarbonato de sódio e salmoura. A fase orgânicafoi secada sobre sulfato de sódio e foi evaporada até umresíduo que foi purificado em uma coluna de silica gelutilizando acetato de etila como o eluente para produzir 26mg (37%) do composto mostrado acima. LC/MS produziu o ionM+l correto de 539 e o ion M-I de 537.

Próton RMN (CDCl3): 7,73 (d, 1H) , 7,40 (cada s,1H) , 7,24 (d, 1H) , 6, 02-6, 00 (m, 1H) , 5, 26-5, 24 (m, 1H) ,4, 87-4, 85 (m, 1H) , 4, 64-4, 55 (m, 2H) , 4,20-4,18 (m, 1H) ,4,06 (t, 1Η), 3,84 (t, 1Η) , 3, 00-2, 90 (m, 1Η), 2, 76-2, 66 (m,1Η) , 2,57-2,52 (m, 1Η) , 2,31-2,17 (m, 2Η) , 1,52 (s, 9Η) ,1,45 (s, 9Η).

d) 7-amino-2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il)octaidro-1,5,10-trioxaciclopentaciclodeceno-6,9-diona

<formula>formula see original document page 75</formula>

Em uma solução do composto acima (26 mg, 0,05mmols) em diclorometano (2 ml) foi adicionado ácidotrifluoracético (2 ml) . A mistura da reação foi agitada atétemperatura ambiente durante 2h e foi evaporada até asecura. A evaporação conjunta duas vezes com toluenoproduziu, após cuidadosa secagem, 24 mg do composto titulocomo o sal de bis trifluoracetato. LC/MS confirmou aestrutura com ions característicos de 339 (M+l), 677 (2M+1)e 337 (M-I).

EXEMPLO 3

2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il)-octaidro-1,5,ll-trioxaciclopentacicloundeceno-6,10-diona

<formula>formula see original document page 75</formula>a) Mono-{5-[4-terc-butoxicarbonilamino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il] - 3-[(4-metoxi-fenil)-difenil-metoximetil]-tetraidrofuran-2-il-metil} éster do ácido hexanodioico

<formula>formula see original document page 76</formula>

Em uma solução do terc-butil éster do ácido (1—{5 —hidroximetil - 4-[4-metoxifenil-difenil-metoximetil]-tetra-idrofuran-3-il} - 2-oxo-l,2-diidro-pirimidin-4-il]-carbônico[730 mg, 1,19 mmols, descrito no exemplo 1] e 4-metilaminopiridina (350 mg, 2,86 mmols) em diclorometano (80 ml)foi adicionado anidrido glutárico (327 mg, 2,86 mmols). Amistura da reação foi agitada na temperatura ambientedurante a noite onde após a reação, a mistura foi adicionadaem diclorometano. A fase orgânica foi lavada com solução decloreto de amônio diluído, solução de ácido cítrico diluído,água e salmoura e secada com sulfato de sódio e evaporadapara produzir 819 mg (95%) de um produto bruto detalhadoacima que foi utilizado sem' qualquer purificação na etapaseguinte.

b) Mono-[5-[4-terc-butoxicarbonilamino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il] - 3 -hidroximetil-tetraidrofuran-2-il-metil]éster do ácido hexanodioico<formula>formula see original document page 77</formula>

Uma solução do composto acima (1,09 g, 1,5 mmols)em ácido acético (50 ml) e água (25 ml) foi agitada natemperatura ambiente durante 2,5h. A mistura da reação foievaporada até a secura e o resíduo foi purificado em umacoluna de silica gel eluída com EtOAc/MeOH 9:1 como oeluente para produzir 5 mg (64%) do composto desejado.

c) Terc-butil éster do ácido[1-(6,10-dioxo-decaidro - 1,5,ll-trioxa-ciclopentacicloundeceno-2-il)-2oxo-1,2-diidro-pirimidin-4-il)-carbamico

<formula>formula see original document page 77</formula>

Em uma solução do composto acima (395 mg, 0,87mmols), HOBT (235 mg, 1,74 mmols) e DMAP (213 mg, 1,74mmols) em DMF (120 ml), foi adicionado EDAC (334 mg, 1,74mmols). A mistura da reação foi agitada na temperaturaambiente durante 48h após o que o solvente foi evaporado.

Foi adicionado diclorometano ao resíduo da reação e ele foidiluído com solução de cloreto de amônio, solução de ácidocítrico diluído, água e salmoura, secado sobre, sulfato desódio e evaporado para produzir 350 mg de um produto bruto.LC/MS mostrou que o produto desejado tinha ions a 438 (M+l),496 (M+ acetato), 875 (2M+1) e 436 (M-I). Duas purificaçõesem uma coluna em fase reversa C-8 eluida comacetonitrila/água 1:1 e acetonitrila/água 1:1,25 produziram,após a evaporação e Iiofilização, 31 mg do composto titulocom uma pureza em torno de 50%, conforme determinado porHPLC a 220 nM.

d) 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il)-octaidro-1,5,ll-trioxa-ciclopentacicloundeceno-6,10-diona

<formula>formula see original document page 78</formula>

Em uma solução a ± 0 0C do composto acima (31 mg)em diclorometano (2 ml) foi adicionado ácido trifluoracético(2 ml) . A mistura da reação foi agitada a ± 0 0C durante 2he então na temperatura ambiente por outras 2h.

Posteriormente a mistura da reação foi evaporada até asecura e finalmente a evaporação conjunta com toluenoproduziu um produto bruto que foi purificado em uma colunaem fase reversa diluída com acetonitrila/água 1:2. Asfrações apropriadas foram evaporadas após a adição de TFA eforam obtidas 31 mg do composto título como o sal detrifluoracetato. LC/MS confirmou a estrutura com ionscaracterísticos de 338 (M+l), 396 (M+ acetato) e 675 (2M+1)e a pureza a 220 nM foi em torno de 70%.Exemplo Biológico IA:

Farmacocinética de Rato

0 composto do exemplo 1 foi dissolvido em águagrau MQ, 3 mg/ml e foi administrado oralmente em duplas deratos. As doses eram de 15 mg/kg e as amostras de plasmaforam tomadas em t 0, 15 & 30 minutos, 1, 2, 4 e 6h. Arecuperação (como o metabolito 21,3'-dideoxi-3'-C-hidroximetil-p-D-eritropentofuranosilcitosina) no plasma foimedida com espectrometria de massa, detectadacomo derivadode sódio m/z 264 (M+Na)+.

Conforme pode ser visto na figura 1, o composto dainvenção produziu uma concentração substancial de plasma dometabolito 2 ' , 3 1 -dideoxi, 3 1 -C-hidroximetil-D-eritropentofuranoscitosina com uma concentração de piconesta dose em torno de 4 uM. Como os ratos não podem serinfectados com HIV, a atividade antiretroviral destaformulação não pode ser medida diretamente neste exemplo,mas é notado que o ED5O para o metabolito 2' , 3' -dideoxi,3'-C-hidroximetil-p-D-eritropentofuranoscitosina estátipicamente ao redor de 0,01 uM em células H9 de sereshumanos. Isto por seu lado significa que a concentração deplasma de pico é várias centenas de vezes superiores aoED50. Outros parâmetros farmacêuticos, tais como AUC edepuração são consistentes com a obtenção de um niveldurante as 24h bem superior ao ED50 com dosagem QD ou BID.

Exemplo Biológico IB

Permeabilidade

Este exemplo mede o transporte de inibidoresatravés das células do canal gastro-entérico humano. 0ensaio utiliza a células Caco-2 bem conhecidas com um númerode passagens entre 40 e 60.

Apical em Transporte Basolateral

Geralmente cada composto será testado em 2-4poços. Os poços basolateral e apical conterão 1,5 ml e 0,4ml de solução tampão de transporte (TB), respectivamente, ea concentração standard das substâncias testadas é de 10 μΜ.

Além disso, todas as soluções de teste e soluções tampãoconterão 1% de DMSO. Antes da experiência, as placas detransporte são previamente revestidas com meio de culturacontendo 10% de soro durante 30 minutos para evitar aligação não especifica ao material plástico. Após 21 a 28dias na cultura sobre suportes de filtros, as células estãoprontas para as experiências de permeabilidade.

A placa de transporte número 1 é composta de 3fileiras com 4 poços cada um. A fileira 1 é chamada delavagem, a fileira 2 "30 minutos" e a fileira 3 "60minutos". A placa de transporte n° 2 é composta de 3fileiras de 4 poços, uma fileira 4 é chamada de "90minutos", uma fileira 5, "120 minutos" e as fileirasrestantes sem numeração.

0 meio de cultura dos poços apicais é removido eas inserções são transferidas para uma fileira de lavagem(n° 1) em uma placa de transporte (placa n° 1) para fora deduas placas sem inserções, que já tinham sido preparadas com1,5 ml de solução tampão de transportes (HBSS, 25 mM HEPES,pH 7,4)nas fileiras de 1 a 5. Na seleção A B o TB no poçobasolateral também contém 1% de albumina de soro bovino.

0,5 ml de solução tampão de transporte (HBSS, 25mM MES, pH 6,5) são adicionados nas inserções e asmonocamadas das células são equilibradas no sistema desolução tampão de transporte durante 30 minutos a 37 ° C emum agitador "poli-mistura". Depois de ser equilibrado parao sistema de solução tampão, o valor da resistência elétricatransepitelial (TEER) é medido em cada poço por uminstrumento de bastão "EVOM chop stick". Os valores TEERusualmente estão entre 400 a 1.000 Ώ por poço (depende donúmero de passagens utilizado).

A solução tampão de transporte (TB, pH 6,5) éremovida do lado apical e a inserção é transferida para afileira de 30 minutos (n° 2) e são adicionados 425 pL de TB(pH 6,5), incluindo a substância de teste, no poço(doador) . As placas são incubadas em um agitador poli-mistura a 37 ° C com uma baixa velocidade de agitação deaproximadamente 150 a 300.

Após 30 minutos de incubação na fileira 2, asinserções serão movidas para novos poços basolateraispreviamente aquecidos (receptor) a cada 30 minutos; afileira 3 (60 minutos), 4 (90 minutos) e 5 (120 minutos).

Amostras de 25 pL serão tomadas da solução apicalapós aproximadamente 2 minutos e no final da experiência.

Estas amostras representam amostras do doador do inicio e dofinal da experiência.

300 pL serão tomados dos poços basolaterais(receptor) a cada ponto de tempo programado e o valorposterior de TEER é medido no final da experiência. Seráadicionada acetonitrila em todas as amostras recolhidas atéuma concentração final de 50% nas amostras. As amostrasrecolhidas serão estocadas a -20 ° C até a análise atravésde HPLC ou de LC-MS.

Transporte Basolateral a Apical

Geralmente cada composto será testado em 2-4poços. Os poços basolateral e apical conterão 1,55 ml e 0,4ml., respectivamente, e a concentração standard dassubstâncias testadas é 10 μΜ. Além disso, todas as soluçõesde teste e soluções tampão conterão 1% de DMSO. Antes daexperiência, as placas de transporte são revestidaspreviamente com meio de cultura contendo 10% de soro durante30 minutos para evitar a ligação não especifica ao materialplástico.

Depois de 21 a 28 dias em cultura sobre suportesde filtros as células estão prontas para as experiências depermeabilidade. 0 meio de cultura dos poços apicais éremovido e as inserções são transferidas para uma fileira delavagem (n° 1) em uma nova placa sem inserções (placa detransporte).

A placa de transporte é composta de 3 fileiras de4 poços. A fileira 1 é denominada de "Lavagem" e a fileira 3é a "Fileiras experimental". A placa de transporte foipreparada previamente com 1,5 ml de TB (pH 7,4) e a fileirade lavagem n° 1 com 1,55 ml de TB (pH 7,4) incluindo asubstância de teste, na fileira experimental n° 3 (lado dodoador).0,5 ml de solução de transporte (HBSS, 25 mM, pH6,5) são adicionados nas inserções na fileira n° 1 e asmonocamadas de células são equilibradas no sistema desolução tampão de transporte durante 30 minutos, a 37 ° C emum agitador poli- mistura. Depois de ser equilibrado aosistema de solução tampão, o valor TEER é medido em cadapoço através de um instrumento "EVOM chop stick".

A solução tampão de transporte (TB, pH 6,5) éremovida do lado apical e a inserção é transferida para afileira 3 e são adicionados 400 yL de TB fresco, pH 6,5, nasinserções. Depois de 30 minutos, são retirados 250 yL dopoço apical (receptor) e substituídos por solução tampão detransporte fresco. Posteriormente, serão retiradas amostrasde 250 yL e substituídas por solução tampão de transportefresca a cada 30 minutos até o final da experiência há 120minutos, e finalmente um valor posterior de TEER é medido nofinal da experiência. Serão tiradas amostras de 25 yL docompartimento (doador) após aproximadamente 2 minutos e nofinal da experiência. Estas amostras representam amostras dódoador do início e do final da experiência.

Em todas as amostras recolhidas será adicionadoacetonitrila até uma concentração final de 50% nas amostras.As amostras recolhidas serão estocadas a -20 0 C até aanálise por HPLC ou LC-MS.

Cálculo

Determinação da fração cumulativa absorvida,contra o tempo. A FAcum é calculada de:<formula>formula see original document page 84</formula>

onde a concentração do receptor no final dointervalo I é a concentração do doador no inicio dointervalo. Deverá ser obtida uma relação linear.

A determinação dos coeficientes de permeabilidade(Pappr cm/s) são calculados de:

<formula>formula see original document page 84</formula>

onde k é a taxa de transporte (min-1) definidocomo a curva obtida por uma regressão linear da fraçãoacumulada absorvida (FRcum) como uma função do tempo (min) ,Vr é o volume da câmara do recebedor (ml) , e A é a área dofiltro (cm2).

Compostos de Referência

<table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>

Exemplo Biológico 2

Atividade contra HIV resistente relacionado àrecuperação primária de TAM no ensaio de HIV fenosenso

A suscetibilidade dos compostos da invenção,medida como o metabolito de plasma 21,31-dideoxi, 3'-C-hidroximetil- β-D-eritropentofuranoscitosina sobre isoladosde HIV-I de amostras de plasma de paciente que contémgenótipos existentes mutantes típicos de recuperaçãoprimária de ΤΑΜ, é determinada pelo ensaio de HIV FenoSensodisponível comercialmente (descrito em Petropoulos, CJ etai., (2000) Antimicrob. Agents Chemother. 44:920 - 928 e éexecutado pela Virologics, Inc) . 0 ensaio é executado pelaamplificação do segmento RT-(PR) de protease do gene pol deHIV a partir de plasma de paciente e inserindo os produtosde amplificação em um vetor HIV-I modificado derivado de umclone molecular NL4-3.

Os estoques virais são preparados através datransfecção conjunta de culturas de células 293 com um vetorde DNA viral recombinante e um vetor de expressão que produzas proteínas de envelopes de vírus de leucemia murinaanfotrópica. As partículas de vírus pseudotipifiçadas sãorecolhidas das culturas de células transfectadas e sãoutilizadas para infectar culturas frescas de células 293. 0DNA viral recombinante contém um cassete de gene luciferasedentro da região do gene HIV env e a produção de luciferasenas células alvo é dependente do término de um round dereplicação de virus. A suscetibilidade do fármaco é medidapela adição de concentrações em série do composto dainvenção e dos compostos de referência para as células. Osfármacos que inibem a replicação de vírus reduzem o sinal deluciferase de uma forma dependente da dose, produzindo umamedida quantitativa da suscetibilidade da droga.

Exemplo 2a.

A tabela 1 resume um aglomerado principal dosmutantes de TAM relacionados com a recuperação primária,utilizados na experiência que são resistentes a HIV e contêma característica do genótipo de TAM que tipicamente emergedurante a terapia antiretroviral envolvida em AZT.

TABELA 1. Genótipo característico em isolados depacientes de TAM 20 e 21 relacionados com recuperaçãoprimária

<table>table see original document page 86</column></row><table>

Os resultados são detalhados na figura 2. 0 vírusde HIV do tipo selvagem é utilizado como a referência. Aqui,a inibição do isolado do paciente das famílias 20 e 21 éexpresso como o número de alterações na redução dasuscetibilidade ao tratamento do fármaco, comparado comcorridas paralelas da referência. Os seguintes fármacosantivirais foram testados: AZT, 3TC, TNF, ABC, d4T, FTC e ocomposto da invenção, como o metabolito do plasma 2',3'-dideoxi, 3'-C- hidroximetil-p-D-eritropentofuranoscitosina.

É claramente aparente que o composto da invenção reteve aatividade contra as famílias que contêm ΤΑΜ. Os resultadosmostram somente uma redução de 1,0 *, na suscetibilidadepara a família do isolado 20 e menos de 1,0 vez de reduçãona suscetibilidade para o isolado da família 21. Istosignifica que os compostos da invenção retiveram atividadecontra o RT HIV mutante relacionado com recuperação primáriado paciente em um nível de potência semelhante a suapotência, contra o RT de HIV do tipo selvagem. Ao contrário,outros fármacos, notavelmente o AZT (redução de 451 vezes emsuscetibilidade), mas também em relação ao 3TC,TFN, ABC, d4Te FTC, perderam potência contra o vírus destes pacientes,quando comparados com o tipo selvagem. Em outras palavras, ovírus destes pacientes apresentou resistência, isto égrandes reduções na suscetibilidade, a estes fármacos,conforme mostrado na figura 2.

É importante notar que os dois isolados depacientes abrigam transições de aminoácidos diferentes nocódon 215; TF no isolado 20 e TY no isolado 21. Isto é umaindicação de qualidade representativa dos mutantes deresistência a TAM relacionados com recuperação primária.Exemplo 2b

A tabela 2 apresenta um HIV mutante relacionadocom recuperação primária com os antecedentes genéticos M184V(um mutante discriminativo) , que é tipicamente escolhidopela terapia antiretroviral muito comumente utilizada de AZT+ 3TC (Combivir).

Tabela 2. Alterações genotipicas do isolado 19 depaciente relacionado com recuperação primária de TAM

<table>table see original document page 88</column></row><table>

Conforme mostrado na figura 3, os compostos dainvenção, conforme medido pelo metabólico de plasma 2',3'-dideoxi, 3'-C-hidroximetil^-D-eritropentofuranoscitosinamais uma vez reteve a atividade contra o virus resistente,mostrando somente uma diferença de 1,78 vezes emsuscetibilidade quando comparado com o HIV do tipo selvagem.Ambos o 3TC e o AZT perderam atividade e mostraram potênciareduzida (i.e. uma redução pronunciada na suscetibilidadeviral) ao virus de resistência (figura 3).

Exemplo 2c

O desafio continuo de pacientes com agentesantiretrovirais resultou na emergência do MDR. Uma mutaçãoT69S com uma inserção 6-bp entre os aminoácidos 68 e 70 naregião do dedo de RT, com freqüência, é visto em combinaçãocom várias formas de TAMs e contribui para uma atividadeaumentada da recuperação primária. Foi escolhido umaglomerado de MDR (com formas diferentes de inserção deaminoácido) em combinação com ΤΑΜ, conforme mostrado natabela 3.

Tabela 3. Alterações genotipicas nos isolados dospacientes 31, 32 e 35 relacionados com recuperação primária

<table>table see original document page 89</column></row><table>

Conforme mostrado na figura 4, o composto dainvenção inibiu estes isolados de paciente, produzindoalteração menor na suscetibilidade do fármaco, em comparaçãocom 6 antivirais de referência utilizados atualmente naterapia anti- retroviral convencional.

Notar que uma redução pronunciada (500 a 1000vezes) na suscetibilidade a AZT foi observada para osisolados 32 e 35 de pacientes, enquanto que o composto dainvenção mostrou alterações de 2,79 e 4,29 vezes,respectivamente. Isto é consistente com o composto dainvenção, apresentando um mecanismo diferente de inibiçãocomparado com os terminadores obrigatórios de cadeia de DNArepresentados pelos NRTIs convencionais.

Exemplo 2d

O isolado 4 representa um outro mutantediscriminativo contendo o genótipo K65R + M184V em umantecedente não essencial de TAM consistindo de mutaçõesR211S e K219E. Este isolado provoca uma resistência cruzadaatípica a abacavir, 3TC e ' o nucleosídeo FTC aprovadorecentemente, mas retém a sua suscetibilidade a análogo,tais como AZT e d4T. Este isolado não contém mutaçõestípicas de recuperação primária, e, no entanto o composto dainvenção ainda inibe este fenótipo viral conforme indicadopor ura valor FC de 3,88. Este valor é comparável aosanálogos de timidina, AZT (FC= 1,11) e d4T (FC= 0,71),enquanto que foi encontrada uma resistência significativapara o 3TC (FC > 200), FTC (FC > 40) e até certo ponto aoABC (FC > 9,0). Estes dados experimentais demonstram que ocomposto da invenção não apresenta somente propriedadesúnicas contra os mutantes de "recuperação primária", mas étambém capaz de inibir mutantes de HIV da famíliadiscriminativa. Isto, portanto, contrasta com o mecanismoinibitório utilizado pelo 3TC e FTC, assim como o mecanismo"parecido dos compostos de que 41-C-etinila nos quais M 184Vem conjunto com uma alteração adicional de aminoácido nocódon T165R na região catalítica, contribui para aresistência cruzada ao nucleosídeo 4-C-etinil (Kodama 2002).Exemplo biológico 3

Atividade de 2',31-dideoxi-3-C-hidroximetilcitozina contra HIV resistente relacionado àrecuperação primária em PBMC.

O desempenho anti-viral do composto da invençãocontra os isolados adicionais de HIV resistentesrelacionados com recuperação primária de ΤΑΜ, foi testado emuma cultura de PBMC. Os isolados de HIV-I foram gerados eexpandidos até uma titulação elevada pelo cultivo conjuntode PBMC de paciente infectado com PBMC com doador estimuladopor PHA (Manual de virologia para laboratórios de HIV ACTG).

Os sobrenadantes isentos de células foram recolhidos,colocados em seqüência, e estocados em porções a -70 0C paraensaios de suscetibilidade de fármacos.

Os ensaios de suscetibilidade de fármacos in vitroforam executados utilizando-se um método de consensoACTG/DOD modificado (Manual de virologia para oslaboratórios HIV ACTG). Os PBMCs foram infectadospreviamente com estoques virais durante 4h a 37 0C em umaatmosfera umidifiçada de 5% de CO2 após 4h de incubação. Ascélulas infectadas foram lavadas duas vezes em meio epipetadas para uma placa de micro-titulação com 8 diluiçõesdo fármaco em série. Cada poço continha 100.000 PBMC pré-infectados e todas as diluições de fármacos foram feitas commeio de cultura de célula. As diluições dos fármacos foramescolhidas para cobrir 50% da concentração inibitória (IC50)para cada fármaco sozinho. Os poços de controle continhamcélulas e foram incubados virus conjuntamente em cada placa.Depois de uma incubação de 7 dias a 37 ° C em uma atmosferaumidificada com 5% de CO2, o crescimento viral foideterminado utilizando-se um ensaio antigene p24 sobre ossobrenadantes (Abbott Laboratories, Chicago, USA) . Ainibição percentual do crescimento viral comparado com opoço de controle, que não continha nenhuma droga, foicalculada e expressa como número de alterações (reduções nasuscetibilidade dos compostos) comparado com o poço decontrole. 0 composto de referência AZT foi efetuado emparalelo com o composto da invenção.

Foi escolhido um aglomerado representativo dosvirus mutantes relacionados com recuperação primária queabriga a característica essencial das mutações RTresistentes a TAM relacionadas com a recuperação primária.As famílias com mutações na posição M41L, D67N, K70R, L210W,T215Y/F e K219Q/E em várias' combinações com ou sem o mutantediscriminativo M184V foram utilizadas conforme indicado natabela 4.

Tabela 4. Genótipo relacionado com recuperaçãoprimária de TAM em 9 isolados de paciente

<table>table see original document page 92</column></row><table><table>table see original document page 93</column></row><table>

A maioria destes mutantes de recuperação primáriaescolhidos conferiu uma resistência pronunciada àsuscetibilidade do AZT, reduzindo um par de 100 vezes ovalor FC. A exceção foi o isolado 7086 (FC= 3,0), que contéma mutação de aminoácido T215V. Um relatório completo devalores FC é apresentado na figura 5. Aqui, a 21,3'-dideoxi-3'-C-hidroximetilcitosina inibiu todos os 8 isolados, com ovalor mais alto de FC sendo somente 2,7.

Todas as referências em relação a estasolicitação, incluindo a patente e as solicitações depatente, são incorporadas aqui como referência com aextensão mais completa possível.

Em toda a especificação e reivindicações que seseguem, a não ser que o contexto requeira de outra forma, apalavra "é composto", e variações, tais como "compõe-se" e"composto de", será entendido como incluindo um numerointeiro, etapa, grupo de números inteiros ou grupos deetapas, mencionado de números inteiros ou grupo de etapasmas não a exclusão de qualquer outro número inteiro, etapa,grupo de números inteiros ou grupo de etapas.

Claims

1. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de ter afórmula I<formula>formula see original document page 94</formula>onde:R1 é independentemente H, -OR3, -NHR4; alquila C1-C4;ou, quando η é 2, o R1 adjacente em conjuntodefine uma ligação olefínica;R2 é H;ou quando o R1 gem é alquila C1-C4, aquele R2também poderá ser alquila C1-C4;ou quando R1 gem é -OR3, aquele R2 poderá ser-C(=0)0H ou um éster farmaceuticamente aceitável do mesmo;R3 é independentemente H, ou um ésterfarmaceuticamente aceitável do mesmo;R4 é independentemente H ou uma amidafarmaceuticamente aceitável do mesmo;R5 é H;R6 é H;η é 1, 2 ou 3;e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de η ser 1.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de R1 ser H, OH ou um ésterfarmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de η ser 2.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de um primeiro R1 ser H; e o segundoR1 ser -OH ou -NH2, ou um éster ou amida farmaceuticamenteaceitável do mesmo.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 95</formula>onde R5 e R6 são conforme definidos nareivindicação 1 e RI* é o referido segundo R1.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de ser denominado de 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il)-octaidro-1,5,10-trioxaciclopenta-ciclodeceno-6,9-diona; ou um sal farmaceuticamente aceitáveldo mesmo.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de η ser 3.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 8,CARACTERIZADO pelo fato de ser denominado de 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidin-l-il)-octaidro-1, 5, 11-trioxaciclopenta-cicloundeceno-β,10-diona, ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo.

10. Formulação farmacêutica, CARACTERIZADA pelofato de ser composta de um composto, conforme definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 9, em conjunto com umveiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

11. Composto, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de ser parauso como um medicamento.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de ser para uso no tratamento ouprofilaxia de HIV.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato do HIV ser um HIV multi-resistente.

14. Composto, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADO pelo fato da transcriptase reversa do HIVmulti-resistente conter pelo menos uma mutação que permiteque um nucleosideo ou fosfato de nucleotideo de terminaçãode cadeia obrigatória seja extirpado do filamento de DNAnascente através de extirpação mediada por ATP oupirofosfato.

15. Composto, de acordo com a reivindicação 14,CARACTERIZADO pelo fato da transcriptase reversa conter pelomenos um dos seguintes padrões genéticos:(a) M41, ± D 67, L210 e T215;(b) D67, K70 e K219;(c) T69S-XX; ou(d) A67 (eliminação em 67).

16. Composto, de acordo com a reivindicação 15,CARACTERIZADO pelo fato da transcriptase reversa conter pelomenos 3 mutações.

17. Método para o tratamento ou prevenção deinfecção por HIV, CARACTERIZADO pelo fato de ser composto daadministração de uma quantidade segura e eficaz de umcomposto conforme definido em qualquer das reivindicações 1a 9 a um indivíduo necessitando do mesmo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato do HIV ser um HIV multi-resistente.

19. Uso de um composto, conforme definido emqualquer das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fatode se destinar à fabricação de um medicamento para otratamento ou prevenção de infecção por HIV.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato do HIV ser um HIV multi-resistente.