BRPI0613233A2 - composto para tratar um paciente tendo um distúrbio - Google Patents

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BRPI0613233A2
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Richard Stead
Kerstin Leuther
Kathryn Woodburn
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Abstract

COMPOSTO PARA TRATAR UM PACIENTE TENDO UM DISTúRBIO. A presente invenção refere-se aos compostos de peptídeos que são agonistas do receptor de eritropoietina (EPO-R) A invenção também se refere aos métodos terapêuticos usando os referidos compostos de peptídeos para tratar distúrbios associados com insuficiência ou deficiência na produção de células sangúíneas vermelhas. Composições farmacêuticas que compreendem os compostos de peptídeo da invenção e dosagens são também providas.

Description

"COMPOSTO PARA TRATAR UM PACIENTE TENDO UM DISTÚRBIO"
Campo da invenção
A presente invenção refere-se a compostos de peptídeosque são agonistas do receptor de eritropoietina (EPO-R).A invenção também se refere a métodos terapêuticos usandotais compostos de peptídeos para tratar distúrbiosassociados com a produção insuficiente ou deficiente decélulas sangüíneas vermelhas. Composições farmacêuticas,que compreendem os compostos de peptídeos da invençãotambém são providas.
Histórico da invenção
À eritropoietina (EPO) é um hormônio de glicoproteína de165 aminoácidos, com um peso molecular de cerca de 34quilodaltons (kD) e sítios de glicosilação preferidos nasposições de aminoácido 24, 38, 83 e 126. Ela éinicialmente produzida como uma proteína precursora comum peptídeo sinal de 23 aminoácidos.
A EPO pode ocorrer em três formas: a, β, e asialo. Asformas a e β diferem ligeiramente nos seus componentes decarboidrato, mas têm a mesma potência, atividadebiológica e peso molecular. A forma asialo é uma forma aou β com o carboidrato terminal (ácido siálico) removido.
As seqüências de DNA codificando a EPO foram relatadas[patente U.S. n° 4.703.008 de Lin].
A EPO estimula a divisão mitótica e a diferenciação decélulas precursoras de eritrócitos, e assim assegura aprodução de eritrócitos. Ela é produzida no rim quando ascondições hipóxicas prevalecem. Durante a diferenciaçãoinduzida por EPO, de células precursoras de eritrócitos,é induzida a síntese de globinas; é estimulada a síntesede hemo-complexos; e o número de receptores de ferritinaaumenta.
Essas mudanças permitem que as células tomem um ou maisferros e sintetizem a hemoglobina funcional, que emeritrócitos maduros, ligam o oxigênio. Assim, oseritrócitos e sua hemoglobina desempenham um papel chaveem suprir o corpo com oxigênio. Essas mudanças sãoiniciadas pela interação da EPO com um receptorapropriado na superfície celular das células precursorasde eritrócitos [vide, por exemplo, Graber e Krantz (1978)Ann. Rev. Méd. 29.51-66].
A EPO está presente em concentrações muito baixas noplasma quando o corpo está em estado saudável onde ostecidos recebem oxigenação suficiente do número existentede eritrócitos. Esta baixa concentração normal ésuficiente para estimular a substituição de célulassangüíneas vermelhas que são normalmente perdidas atravésdo envelhecimento.
A quantidade de EPO na circulação é aumentada sobcondições de hipoxia quando o transporte de oxigênioatravés das células sangüíneas na circulação é reduzido.
A hipoxia pode ser causada, por exemplo, por substancialperda de sangue através de hemorragia, destruição decélulas sangüíneas vermelhas por super-exposição àradiação, redução na introdução de oxigênio devido aaltitudes elevadas ou inconsciência prolongada, oudiversas formas de anemia. Em resposta a tal tensãohipóxica, níveis elevados da EPO aumentam a produção decélulas sangüíneas vermelhas pelo estímulo daproliferação de células progenitoras de eritróides.
Quando o número de células sangüíneas vermelhas nacirculação é maior que o necessário para os requisitosnormais de oxigênio para os tecidos, os níveis de EPO nacirculação são reduzidos.
Devido a EPO ser essencial no processo de formação dascélulas sangüíneas vermelhas, este hormônio temaplicações potencialmente úteis tanto no diagnósticoquanto no tratamento de distúrbios sangüíneoscaracterizados por produção baixa ou deficiente decélulas sangüíneas vermelhas. Estudos recentes proveramuma base para a projeção da eficácia terapêutica da EPOpara uma variedade de estados doentios, distúrbios eestados de irregularidade hematológica, incluindo: beta-talassemia [vide, Vedovato, et al. (1984) Acta. Haematol.71:211-213]; fibrose cística [vide, Vichinsky et al.(1984) J. Pediatric 105:15-21]; gravidez e distúrbiosmenstruais [vide, Cotes et al., (1983) Brit. Ostet.Gyneacol. 90:304-311]; anemia precoce ou prematuridade[vide, Haga et al., (1983) Acta Pediatr. Scand. 72:827-831] ; lesão do cordão espinhal [vide, Claus-Walker etal., (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65:370-374]; vôosespaciais [vide, Dunn et al. , (1984) Eur. J. Appl.Physiol. 52:178-182]; perda sangüínea aguda [vide, Milleret al., (1982) Brit. J. Haematol. 52:545-590];envelhecimento [vide, Udupa et al., (1984) J. Lab. Clin.Méd. 103:574-580 e 581-588 e Lipschitz et al., (1983)Blood 63:502-509]; diversos estados doentios neoplásticosacompanhados por eritropoiese anormal [vide, Dainiak etal., (1983) Câncer 5:1101-1106 e Schwarz et al. , (1983)Otolaryngol. 109:2 69-272]; e insuficiência renal [vide,Eschbach et al., (1987) N. Eng. J. Med. 316:73-78].EPO purificada, homogênea foi caracterizada [patente U.S.na 4.677.195 para Hewick]. Uma seqüência de DNAcodificando a EPO foi purificada, clonada e expressa paraproduzir polipeptídios recombinantes com as mesmaspropriedades bioquímicas e imunológicas e EPO natural.
Uma molécula de EPO recombinante com oligossacarídeosidênticos àquelas da EPO natural também foi produzida[vide Sasaki et al., (1987) J. Biol. Chem. 262:12059-12076].
O efeito biológico da EPO aparenta ser mediado, em parte,através da interação com um receptor ligado à membranacelular. Estudos iniciais, usando células eritróidesimaturas isoladas do baço de camundongos, sugeriram queproteínas de superfície-celular ligantes de EPOcompreendem dois polipeptídios tendo pesos moleculares deaproximadamente 85.000 Daltons e 100.000 Daltons,respectivamente [Sawyer et al., (1987) Proc. Natl. Acad.Sci USA 84:3690-3694]. O número de sítios ligantes de EPOfoi calculado como sendo a média de 800 a 1000 porsuperfície celular. Um desses sítios ligantes,aproximadamente 3 00 EPO ligada com um K<j deaproximadamente 90 pM (picomolar), enquanto que a EPOpermanecendo ligada com uma afinidade reduzida deaproximadamente 570 pM [Sawyer et al. , (1987) J. Biol.Chem. 262:5554-5562]. Um estudo independente sugeriu queos eritroblastos esplênicos, responsivos a EPO,preparados a partir de camundongos injetados com cepaanêmica (FVA) do vírus da leucemia de Friend, possuem umtotal de aproximadamente 400 sítios ligantes e uma baixaafinidade de sítios de ligação EPO com valores de K4 deaproximadamente 100 pM e 800 pM, respectivamente[Landschulz et al., (1989) Blood 73:1476-1486],
O trabalho subseqüente indicou que as duas formas dereceptor de EPO (EPO-R) foram codificadas por um geneúnico. Este gene foi clonado [vide, por exemplo, Jones etal., (1990) Blood 76, 31-35; Noguchi et al., (1991) Blood78, 2548-2556; Maouche et al. , (1991) Blood 78: 2557-2563] . Por exemplo, as seqüências de DNA e seqüências depeptídeos codificadas para proteínas EPO-R murinas ehumanas são descritas na publicação internacional do PCTn2 WO 90/08822 para DiAndrea et al. Modelos atuaissugerem que a ligação da EPO ao EPO-R resulta nadimerização e na ativação de duas moléculas de EP0-R, oque resulta em etapas subseqüentes de transdução desinais [ver, por exemplo, Warowich et al. , (1992) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89:2140-2144],
A disponibilidade de genes clonados para EPO-R facilita abusca de agonistas e antagonistas deste importantereceptor. A disponibilidade da proteína receptorarecombinante permite o estudo da interação de receptor-ligante em uma variedade de sistemas de geração dediversidade de peptídeos aleatórios e semi-aleatórios.Esses sistemas incluem o sistema de "peptídeo sobreplasmídeo" [descrito na patente U.S. ne 6.270.170]; osistema de "peptídeos sobre fago" [descrito na patenteU.S. na 5.432.018 e Cwirla et al. , (1990) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 87:6378-6382]; o sistema da "bibliotecasintética codificada" (ESL) [descrito no pedido depatente U.S. ns 946.239, depositado em 16 de setembro de1992]; e o sistema de "síntese de polímero imobilizado emuma escala muito ampla" [descrito na patente U.S. na5.143.854. Pub PCT n2 90/15070; Fodor et al. , (1991)Science 251:767-773; Dower e Fodor (1991) Am. Rep. Med.Chem. 26:271-280; e na patente U.S. No.5.424.186].
Peptídeos que interagem pelo menos até um certo grau como EPO-R foram identificados e, são descritos, porexemplo, nas patentes U.S. Nos.: 5.773.569, 5.830.851 e5.986.047 para Wrighton et al. ; Publicação internacionaldo PCT n2 WO 96/40749 para Wrighton et al.; patente U.S.n2 5.767.078 e Publicação PCT η 2 96/40772 para Johnson eZivin; Publicação PCT n2 WO 01/38342 para Balu; e WO01/91780 de Smith-Swintosky et al. Em particular, umgrupo de peptídeos contendo um peptídeo "alvo" foiidentificado, membros do qual ligam-se ao EPO-R eestimulam a proliferação de células dependentes de EPO.
Ainda, peptídeos identificados até a presente data quecontêm o "alvo" estimulam a proliferação de célulasdependentes de EPO in vitro com valores de EC50 de cercade 20 nanomolares (nM) a cerca de 250 nM. Assim,concentrações de peptídeos de 2 0 nM a 250 nM sãorequeridas para estimular 50% da proliferação celularmáxima estimulada por EPO. Ainda outros peptídeos econstructos dos mesmos que podem se ligar ao receptor EPOforam descritos nos pedidos de patente provisórios Nos.:60/470,244, 60/470,245 e 60/469,993, todos depositados em12 de maio de 2003; pedidos de patente provisórios Nos.:60/627,432 e 60/627,433, ambos depositados em 11 denovembro de 2004; pedido de patente não-provisório No.10/844,968, depositado em 12 de maio de 2004; e ospedidos de patente internacionais Nos.: PCT/US2004/14886e PCT/US2004/14889, ambos depositados em 12 de maio de2004, e os pedidos publicados como WO 2004/101611 e WO2004/101606, respectivamente. Cada um destes pedidos éincorporado aqui por referência em sua íntegra.
Dado o imenso potencial de agonistas de EPO-R, tanto paraestudos das importantes atividades biológicas mediadaspor este receptor e para tratamento de doenças, permaneceuma necessidade para a identificação de peptídeosagonistas de EPO-R com potência e atividade melhoradas. Apresente invenção provê tais compostos.
A citação e/ou discussões das referências citadas nestaseção e ao longo do relatório descritivo são providasmeramente para tornar mais clara à descrição da presenteinvenção e não é uma admissão de que qualquer uma dastais referências seja "técnica anterior" a presenteinvenção.
Sumário da invenção
A invenção presente provê novos compostos de peptídeos,os quais são agonistas de EPO-R de potência e atividademelhoradas dramaticamente. Estes compostos de peptídeossão homodímeros de monômeros peptídicos tendo a seqüênciade aminoácidos (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO:1), ou homodímeros de monômeros peptídicos tendo aseqüência de aminoácidos (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(meG)K (SEQ.ID.NO:2), homodímeros de monômerospeptídicos tendo a seqüência de aminoácidos(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ.ID.NO: 3); ondecada aminoácido é indicado por um padrão de abreviação deletras, "(AcG)" é N-acetilglicina, "(1-nal)", é 1-naftilalanina", e "(MeG)" é N-metilglicina, tambémconhecida como sarcosina. Cada monômero peptídico de umdímero de peptídeo contém um bissulfeto intramolecularligado entre os resíduos de cisteína do monômero.
Os monômeros peptídicos podem ser dimerizados por ligaçãocovalente a um ligante de amida terciária ramificada. 0ligante de amida terciária pode ser descrito como:
-C' O-CH2-X-CH2-C2O-
onde: X é NCO-(CH2)2-N1H-; C1 do ligante forma uma amidaligada com o grupo ε-amino do resíduo de lisina C-terminal do primeiro monômero peptídico; C2 do liganteforma uma amida ligada com o grupo ε-amino do resíduo delisina C-terminal do segundo monômero peptídico; e N1 doX é ligado via uma ligação carbamato ou uma ligação amidaem uma porção de polietileno glicol ativado (PEG), onde oPEG tem um peso molecular de cerca de 20,000 a cerca de40,000 Daltons (o termo "cerca de" indicando que empreparações de PEG, algumas moléculas pesarão mais,algumas menos, do que o peso molecular declarado).
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO:1)e N1 do ligante é ligado via uma ligação carbamato em umaporção polietileno glicol ativado (PEG), o novo compostode peptídeo da invenção pode ser representado como aseguir:
<formula>formula see original document page 8</formula>
onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO: 1)e N1 do ligante é ligado via uma ligação amida em umaporção de polietileno glicol ativado (PEG), o novocomposto de peptídeo da invenção pode ser representadocomo a seguir:
<formula>formula see original document page 9</formula>
onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido,(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(meG)K (SEQ.ID.NO: 2) e N1 do ligante é ligado via uma ligação carbamatoem uma porção de polietileno glicol ativado (PEG), o novocomposto de peptídeo da invenção pode ser representadocomo a seguir:
<formula>formula see original document page 9</formula>onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido,(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(meG)K (SEQ.ID.NO: 2) e N1 do ligante é ligado via uma ligação amida emuma porção de polietileno glicol ativado (PEG), o novocomposto de peptídeo da invenção pode ser representadocomo a seguir:
<formula>formula see original document page 10</formula>
Os monômeros peptídicos podem também ser dimerizadosatravés de ligação covalente a um ligante de amidaterciária ramificada. 0 ligante de amida terciária podeser descrito como:
-C1O-CH2-X-CH2-C2O-
onde: X é NCO-(CH2)2-NH-C3O-; C1 do ligante forma umaamida ligada com o grupo ε-amino do resíduo de lisina C-terminal do primeiro monômero peptídico; C2 do liganteforma uma amida ligada com o grupo ε-amino do resíduo delisina C-terminal do segundo monômero peptídico. OSdímeros peptídicos da invenção compreendem ainda umaporção espaçadora com a estrutura a seguir:
-N1H- (CH2) 4-C4H-N2H-
onde: C4 do espaçador é ligado covalentemente ao C3 de X;
N1 do espaçador é unido covalentemente via uma ligaçãocarbamato ou uma ligação amida em uma porção polietilenoglicol ativado (PEG); e N2 do espaçador é ligadocovalentemente via uma ligação carbamato ou uma ligaçãoamida em uma porção PEG ativado, onde PEG tem um pesomolecular de cerca de 10,000 a cerca de 50,000 Daltons (otermo "cerca de" indicando que em preparações de PEG,algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, do que opeso molecular declarado).
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO:1)e ambos N1 e N2 do espaçador são covalentemente ligadosvia uma ligação carbamato em uma porção PEG ativado, onovo composto de peptídeo da invenção pode serrepresentado como a seguir:
Em uma configuração preferida, a lisina C-terminal dosdois monômeros de peptídeos é L-Iisina. Também, ostécnicos no assunto apreciarão que a partir dasestruturas químicas que as duas porções PEG lineares sãounidas por lisina (por exemplo, como mPEG2-Lys-NHS oucomo mPEG2-Lisinol-NPC) , que é também preferivelmente L-lisina e resulta em uma elevação para a estereoquímica aseguir:<formula>formula see original document page 12</formula>
Alternativamente, um ou mais resíduos de lisina podem seruma D-lisina, resultando em uma elevação para aalternativa estereoquímica que será facilmente apreciadapelos técnicos no assunto.
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO: 1)e ambos N1 e N2 do espaçador são covalentemente ligadosvia uma ligação amida em uma porção de PEG ativado, onovo composto de peptídeo da invenção pode serrepresentado como a seguir:
Novamente, as moléculas de lisina neste composto são,preferivelmente todas L-lisina, resultando em umaelevação a para estereoquímica a seguir:
<formula>formula see original document page 12</formula><formula>formula see original document page 13</formula>
Alternativamente, um ou mais dos resíduos de lisina podemser uma D-Iisina, resulta em uma elevação para aestereoquímica alternativa que será facilmente apreciadapelos técnicos no assunto.
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(meG)K (SEQ.ID.NO: 2) e ambos N1 e N2 do espaçador são covalentementeligados via uma ligação carbamato em uma porção de PEGativado, onde Y é um grupo carbamato, o novo composto depeptídeo da invenção pode ser representado como a seguir:
<formula>formula see original document page 13</formula>
Preferivelmente, os resíduos de lisina unidos ao monômeropeptídico e porções PEG lineares nesta molécula são todosL-Iisina, resultando em uma elevação da estereoquímica aseguir:<formula>formula see original document page 14</formula>
Alternativamente, um ou mais dos resíduos de lisina podemser uma D-lisina, resultando em uma elevação para aestereoquímica alternativa que será facilmente apreciadapelos técnicos no assunto.
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(meG)K (SEQ.ID.NO: 2) e ambos N1 e N2 do espaçador são covalentementeligados via uma ligação amida em uma porção de PEGativado, o novo composto de peptídeo da invenção pode serrepresentado como a seguir:
<formula>formula see original document page 14</formula>
Preferivelmente, os resíduos de lisina unidos ao monômeropeptídicos e a uma porção PEG linear destas moléculas sãotodos L-lisina, resultando na elevação da estereoquímicaa seguir:<formula>formula see original document page 15</formula>
Em outras configurações, um ou mais resíduos de lisinapodem ser uma D-lisina, resultando em uma estereoquímicaalternativa que será facilmente apreciada pelos técnicosno assunto.
Os monômeros peptídicos podem também ser dimerizados porligações a um ligante lisina, segundo o qual um monômeropeptídico é ligado em sua C-terminal a um grupo ε-aminoda lisina e o segundo monômero peptídico é ligado em seuC-terminal o grupo α-amino da lisina.
Os dímeros peptídicos da invenção compreendem ainda umaporção espaçadora com a estrutura a seguir:
-N1H- (CH2) 2-0- (CH2) 2-N2-H-
Em uma extremidade, N1 do espaçador é ligado via umaligação amida em um carbono de carbonila do ligantelisina. Na extremidade oposta, N2 do espaçador é unidovia uma ligação carbamato ou uma ligação amida a umaporção de polietileno glicol ativado (PEG), onde o PEGtem um peso molecular de cerca de 20,000 a cerca de40,000 Daltons (o termo "cerca de" indicando que empreparações de PEG, algumas moléculas pesarão mais,algumas menos, do que o peso molecular declarado).
Onde o espaçador é ligado via uma ligação carbamato emuma porção de polietileno glicol ativado (PEG), o novocomposto de peptídeo da invenção (SEQ.ID.NO:3) pode serrepresentado como a seguir:<formula>formula see original document page 16</formula>
Onde o espaçador é unido via uma ligação de amida em umaporção do polietileno glicol (PEG), o novo composto depeptídeo da invenção (SEQ.ID.NO:3) pode ser representadocomo a seguir:
<formula>formula see original document page 16</formula>
A invenção provê ainda métodos para tratar váriascondições médicas usando tais compostos de peptídeos. Osmétodos incluem o tratamento de um paciente tendo umdistúrbio definido por uma deficiência de eritropoietinaou uma baixa ou deficiente população de célulassangüíneas vermelhas, através da administração aopaciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de umdos compostos acima. Em determinadas configurações, odistúrbio é o estágio final de uma falha renal oudiálise; anemia associada com AIDS, doenças auto-imunesou uma malignidade; beta-talassemia; fibrose cística,anemia precoce da prematuridade; anemia associada comdoença inflamatória crônica; traumatismo de medulaespinhal, perda sangüínea aguda; envelhecimento; ouestados de doenças neoplásticas acompanhadas poreritropoiese anormal. Além disso, em determinadasconfigurações, os distúrbios é falha renal ou diálise, ea quantidade terapeuticamente eficaz é uma dosagem de0,025 a 0,2 miligramas do composto por 1 quilograma dopeso do corpo do paciente. Em outras configurações, odistúrbio é falha renal ou diálise, e a quantidadeterapeuticamente eficaz é uma dosagem de 0,05 a 0,1miligrama do composto por 1 quilograma do peso do corpodo paciente. Em determinadas configurações, o distúrbio éanemia associada com uma malignidade, e a quantidadeterapeuticamente eficaz é uma dosagem de 0,075 a 0,5miligramas do composto por 1 quilograma do peso do corpodo paciente. Em outras configurações, o distúrbio éanemia associada com uma malignidade, e a quantidadeterapeuticamente eficaz é uma dosagem de 0,2 a 0,4miligrama do composto por 1 quilograma do peso do corpodo paciente. A quantidade terapeuticamente eficaz podeser administrada uma vez a cada 3 a 4 semanas.
A invenção prove ainda, composições farmacêuticascompreendendo os referidos compostos de peptídeos. Emdeterminadas configurações, o PEG tem um peso molecularde 20,000 Daltons. Em outras configurações, a composiçãofarmacêutica compreende qualquer um dos compostos acima eum veiculo farmaceuticamente aceitável.
Descrição detalhada da invenção
Os resíduos de aminoácidos abreviam-se da maneira aseguir: Fenilalanina é Phe ou F; Leucina é Leu ou L;Isoleucina é Ile ou I; Metionina é Met ou M; Valina é Valou V; Serina é Ser ou S; Prolina é Pro ou P; Treonina éThr ou T; Alanina é Ala ou A; Tirosina é Tyr ou Y;Histidina é His ou H; Glutamina é Gln ou Q; Asparagina éAsn ou N; Lisina é Lys ou K; Ácido aspártico é Asp ou D;Ácido glutâmico é Glu ou E; Cisteina é Cys ou C;Triptofano é Trp ou W; Arginina é Arg ou R; e Glicina éGly ou G. Os aminoácidos não-convencionais em peptídeossão abreviados da maneira a seguir: 1-naftil-alanina é 1-nal ou Np; N-metilglicina (conhecida também comosarcosina) é MeG ou Sc; e glicina acetilada (N-acetilglicina) é AcG.
Como usado aqui, o termo "polipeptídios" ou "proteína"refere-se a um polímero de monômeros de aminoácidos quesão alfa-aminoácidos ligados, juntos, através de ligaçõesamidas. Polipeptídios são, portanto, pelo menos doisresíduos de aminoácidos em comprimento, e usualmente sãomais longos. Geralmente, o termo "peptídeo" refere-se aum polipeptídio que é apenas uns poucos resíduos deaminoácidos em comprimento. Os novos peptídeos agonistasde EPO-R da presente invenção são, preferivelmente, nãomais que 50 resíduos de aminoácidos em comprimento. Elessão mais pref erivelmente de cerca de 17 a cerca de 40resíduos de aminoácidos em comprimento. Um polipeptídioem contraste com um peptídeo, pode compreender qualquernúmero de resíduos de aminoácidos. Portanto, o termopolipeptídio inclui peptídeos assim como seqüências maislongas de aminoácidos.
Tal como usada aqui, a frase "farmaceuticamenteaceitável" refere-se a composições e entidadesmoleculares que são "geralmente consideradas comoseguras", por exemplo, que são fisiologicamentetoleráveis e, tipicamente, não produzem uma reaçãoalérgica ou inconveniente semelhante, tal como distúrbiogástrico, tontura e similares, quando administradas a umser humano. Preferivelmente, tal como usado aqui, o termo"farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por umaagência reguladora do Governo Federal ou Estadual oulistado na Farmacopéia U.S. ou outra farmacopéiareconhecida geralmente para uso em animais, e maisparticularmente em seres humanos. 0 termo "veículo"refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ouveículo com o qual o composto é administrado. Taisveículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, taiscomo água e óleos, incluindo aqueles originários depetróleo, animal, vegetal ou sintéticos, tais como óleode amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelime similares. Água ou soluções aquosas salinas e soluçõesaquosa de dextrose e de glicerol são preferivelmenteempregadas como veículos, particularmente para soluçõesinjetáveis. Os veículos farmacêuticos apropriados sãodescritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" porE.W. Martin.
Tal como usado aqui o termo "agonista" refere-se a umligante biologicamente ativo que se liga ao seu receptorbiologicamente ativo complementar e ativa este últimotanto para causar uma resposta biológica no receptor,quanto para acentuar atividade biológica pré-existente doreceptor.
Novos peptídeos que são agonistas de EPO-R
A presente invenção prove novos compostos de peptídeosque são agonistas da EPO-R e mostram potência e atividadedramaticamente acentuadas. Estes compostos de peptídeossão homodímeros de monômeros peptídicos tendo a seqüênciade aminoácido (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO:1), ou homodímeros de monômeros peptídicos tendo aseqüência de aminoácido (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(meG)K (SEQ.ID.NO:2); onde cada aminoácido éindicado pelo padrão de uma abreviação de letras, "(AcG)"é N-acetilglicina, "(1-nal)" é 1-naftilalanina, e "(MeG)"é "(MeG)" é N-metilglicina, também conhecida comosarcosina. Cada monômero peptídico de um dímero peptídicocontém um bissulfeto intramolecular ligado entre osresíduos de cisteína do monômero. Os referidos monômerospodem ser representados esquematicamente como a seguir:(AcG)GL YACHMGPIT(l-nal)vÍQPLRIC (AcG) GLYAÇHMGPIT( 1 -nal) VCQPLRK
ou
(SEQ.ID NO.1); e(AcG)GL YACHMGPIT( 1 -nal) vÍQPLR(MeG)IC Qu (AcG)GLYAÇHMGPIT(l-nal)VÇQPLR(MeG)K
(SEQ. ID NO.2)
Estes peptídeos monoméricos são dimerizados para proverdímeros peptídicos com atividade agonista EPO-Rmelhorada. A porção ligante (LK) é uma amida terciáriaramificada, que se ramifica ao C-terminal dos doismonômeros peptídicos, através de ligação simultânea aoresíduo de lisina C-terminal de cada monômero. 0 liganteamida terciária pode ser representado como:
-ClO-CH2-X-CH2-C2O-
onde: X é NCO-(CH2)2-N1H-; C1 do ligante forma uma amidaligada com o grupo ε-amino do resíduo de lisina C-terminal do primeiro monômero peptídico; C2 do liganteforma uma amida ligada com o grupo ε-amino do resíduo delisina C-terminal do segundo monômero peptídico; e N1 doX é ligado via uma ligação carbamato ou uma ligação amidaem uma porção de polietileno glicol ativado (PEG), onde oPEG tem um peso molecular de cerca de 20,000 a cerca de40,000 Daltons (o termo "cerca de" indicando que empreparações de PEG, algumas moléculas pesarão mais,algumas menos, do que o peso molecular declarado).
0 ligante amida terciária pode também ser descrito como:
-C1O-CH2-X-CH2-C2O-
onde: X é NCO-(CH2)2-NH-C3O-; C1 do ligante forma umaamida ligada com o grupo ε-amino do resíduo de lisina C-terminal do primeiro monômero peptídico; C2 do liganteforma uma amida ligada com o grupo ε-amino do resíduo delisina C-terminal do segundo monômero peptídico. Osdímeros peptídicos da invenção compreendem ainda umaporção espaçadora com a estrutura a seguir:
-N1H- (CH2) 4-C4H-N2H-
onde: C4 do espaçador é ligado covalentemente ao C3 de X;N1 do espaçador é unido covalentemente via uma ligaçãocarbamato ou uma ligação amida em uma porção de PEGativado; e N2 do espaçador é ligado covalentemente viauma ligação carbamato ou uma ligação amida em uma porçãoPEG ativado, onde PEG tem um peso molecular de cerca de10,000 a cerca de 60,000 Daltons (o termo "cerca de"indicando que em preparações de PEG, algumas moléculaspesarão mais, algumas menos, do que o peso moleculardeclarado).
Assim, os novos peptídeos da invenção podem também conteruma porção PEG, que é covalentemente ligada via umaligação carbamato ou uma ligação amida para o liganteamida terciário do dímero peptídico. PEG é um polímerosolúvel em água que é farmaceuticamente aceitável. PEGpara uso na presente invenção pode ser linear, PEG não-ramificado tendo um peso molecular de cerca de 20quiloDaltons (20K) a cerca de 60K (o termo "cerca de"indicando que em preparações de PEG, algumas moléculaspesarão mais, algumas menos, do que o peso moleculardeclarado). Mais preferivelmente, o PEG tem um pesomolecular de cerca de 3OK a cerca de 40K. Um técnico noassunto será capaz de selecionar o tamanho do polímerodesejado com base nas referidas considerações como adosagem desejada; tempo de circulação, resistência àproteólise; efeitos, se qualquer um, na atividadebiológica, fácil de manusear; grau ou perda deantigenicidade; e outros efeitos conhecidos de PEG em umpeptídeo terapêutico.
Peptídeos, dímeros peptídicos e outras moléculas baseadasem peptídeos da invenção podem ser ligados aos polímerossolúveis em água (por exemplo, PEG) usando qualquer umade uma variedade de químicos para ligar os polímerossolúveis em água à porção receptor-ligante da molécula(por exemplo, peptídeo + espaçador). Uma configuraçãotípica emprega uma única junção de ligação para ligaçãocovalente dos polímeros solúveis em água à porçãoreceptor-ligante, entretanto, em configuraçõesalternativas múltiplas junções de ligação podem serusadas, incluindo ainda variações nas quais espéciesdiferentes de polímeros solúveis em água são ligadas àporção receptor-ligante em junções de ligação distintas,que podem incluir junções de ligação covalente com oespaçador e/ou com uma ou ambas cadeias peptídicas. Emalgumas configurações, o dímero ou multímero de ordemmaior compreenderá espécies distintas de cadeia peptídica(isto é, um heterodímero ou outro heteromultímero).
Através de exemplo e não limitação, um dímero podecompreender uma primeira cadeia peptidica tendo umajunção de ligação com PEG e a segunda cadeia peptidicapode tanto perder uma junção de ligação com PEG quantoutilizar uma ligação química diferente daquela daprimeira e/ou segunda cadeia peptidica. Em umaconfiguração alternativa emprega um PEG ligado à porçãode espaçador da porção receptor-ligante e um polímerosolúvel em água diferente (por exemplo, carboidrato)conjugado à cadeia lateral de um dos aminoácidos daporção peptidica da molécula.
Uma ampla variedade de espécies de poli(etileno glicol)(PEG) pode ser usada para a PEGicosilação da porçãoreceptor-ligante (peptídeos + espaçador).
Substancialmente qualquer reagente de PEG reativoapropriado pode ser usado. Em configurações preferidas, oreagente de PEG reativo resultará na formação de umaligação de amida ou carbamato em resposta à conjugaçãocom a porção receptor-ligante. Espécies de PEG reativasapropriadas incluem, mas não se limitam àquelasdisponíveis para venda no catálogo de sistemas deliberação de fármacos (2 003) de NOF Corporation (YebsiuGarden Place Tower, 20-3 Ebisu 4-chome, Shibuya-Ku, Tokyo150-6019) e no catálogo de engenharia molecular (2003) deNektar Therapeutics (490 Discovery Drive, Huntsville,Alabama 35806). Por exemplo e não como limitação, osreagentes de PEG a seguir são preferidos freqüentementeem várias incorporações: mPEG2-NHS, mPEG2-ALD, multi-ArmPEG, mPEG(MAL)2, mPEG2(MAL), mPEG-NH2, mPEG-SPA, mPEG-SBA, mPEG-tioésteres, mPEG-ésteres duplos, mPEG-BTC,mPEG-ButirALD, mPEG-ACET, PEGs heterofuncionais (NH2-PEG-COOH, Boc-PEG-NHS, Fmoc-PEG-NHS, NHS-PEG-VS, NHS-PEG-MAL), acrilatos de PEG (ACRL-PEG-NHS) , fosfolipídeos dePEG (por exemplo, mPEG-DSPE), PEGs multi-armados da sérieSUNBRITE incluindo a série GL de PEGS ativados comSUNBRITE ativados por uma química escolhida por aquelestreinados na técnica, qualquer um dos PEGs ativados comSUNBRITE (incluindo, mas não limitando a carboxil-PEGs,p-NP-PEGs, Tresil-PEGS, PEGs de aldeídos, acetal-PEGs,amino-PEGs, tiol-PEGs, maleimido-PEGs, hidroxil-PEGs,amino-PEG-COOH, hidroxil-PEG-aldeído, PEG tipo anidridocarboxílico, fosfolipídio de PEG funcionalizado, e outrosPEGs reativos apropriados e/ou similares selecionados poraqueles treinados na técnica para sua aplicação e usoparticular.
Os novos peptídeos da invenção também podem conter duasporções de PEG que são covalentemente ligadas via umaligação de carbamato ou amida a uma porção espaçadora,onde a porção espaçadora é covalentemente ligada aoligante amida terciária do dímero peptídico. Cada uma dasduas porções PEG utilizadas nas referidas configuraçõesda presente invenção podem ser lineares e podem serligadas juntas em um ponto único de ligação. Cada porçãoPEG preferivelmente tem um peso molecular de cerca de 10quiloDaltons (IOK) a cerca de 60K (o termo "cerca de"indicando que em preparações de PEG, algumas moléculaspesarão mais, algumas menos, que o peso molecularestabelecido). As porções PEG lineares sãoparticularmente preferidas. Mais preferivelmente, cadauma das duas porções de PEG tem um peso molecular decerca de 2 OK a cerca de 40K, e ainda maispreferivelmente, entre cerca de 20K e cerca de 40K. aindamais pref erivelmente, cada uma das duas porções de PEGtem um peso molecular de cerca de 2 OK. Um técnico noassunto será capaz de selecionar o tamanho do polímerodesejado com base nas referidas configurações quanto àdose desejada: tempo de circulação, resistência aproteólise; efeitos; em qualquer uma, das atividadesbiológicas; fácil manuseio; grau ou perda deantigenicidade; e outros efeitos conhecidos de PEG em umpeptídeo terapêutico.
A presente invenção também compreende peptídeos agonistasque são homodímeros dos monômeros peptídicos tendo aseqüência de aminoácidos (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ.ID.NO: 3), onde cada aminoácido éindicado por um padrão de abreviação de letras, "(AcG)" éN-acetilglicina, "(1-nal)" é 1-naftilalanina, e "(MeG)" éN-metilglicina, também conhecida como sarcosina. Cadamonômero peptídico do dímero peptídico contém umbissulfeto intramolecular ligado entre os resíduos decisteína do monômero. Os referidos monômeros podem serrepresentados esquematicamente como a seguir:
<formula>formula see original document page 24</formula>
Estes peptídeos monoméricos são dimerizados para proverdímeros peptídicos com atividade agonista EPO-Rmelhoradas. A porção ligante (Lk) é um resíduo de lisina,que se ligam ao C-terminal dos dois monômeros peptídicos,por ligação simultânea ao aminoácido C-terminal de cadamonômero. Um monômero peptídico é ligado em sua região C-terminal ao grupo ε-amino da lisina e o segundo monômeropeptídico é ligado a sua região C-terminal ao grupo ex-amino da lisina. Por exemplo, o dímero pode ser ilustradoestruturalmente como mostrado na Fórmula I, e resumidocomo mostrado na Fórmula II:
<formula>formula see original document page 24</formula>
Na Fórmula I e na Fórmula II, N2 representa o átomo denitrogênio do grupo ε-amina da lisina e Nl representa oátomo de nitrogênio do grupo α-amina da lisina.
Os dímeros peptídicos da invenção compreendem, ainda, umaporção espaçadora da estrutura a seguir:
<formula>formula see original document page 24</formula>Em uma extremidade, N1 do espaçador é ligado via umaligação amida em um carbono de carbonila do ligantelisina. Na extremidade oposta, N2 do espaçador é unidovia uma ligação carbamato ou uma ligação amida a umaporção de polietileno glicol ativado (PEG), onde o PEGtem um peso molecular de cerca de 10,000 a cerca de60,000 Daltons (o termo "cerca de" indicando que empreparações de PEG, algumas moléculas pesarão mais,algumas menos, do que o peso molecular declarado). Maispreferivelmente, o PEG tem um peso molecular de cerca de20,000 a 40,000 Daltons.
Assim, os novos peptídeos da invenção também contêm umaporção PEG, a qual é covalentemente ligada ao dímeropeptidico. PEG é um polímero solúvel em água que éfarmaceuticamente aceitável. PEG para uso na presenteinvenção pode ser linear, PEG não-ramifiçado tendo umpeso molecular de cerca de 20 quiloDaltons (20K) a cercade 6OK (o termo "cerca de" indicando que em preparaçõesde PEG, algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, doque o peso molecular declarado). Mais preferivelmente, oPEG tem um peso molecular de cerca de 20K a cerca de 40K,e ainda mais preferivelmente um peso molecular de cercade 3 0 Ka cerca de 40K. Um técnico no assunto será capazde selecionar o polímero de tamanho desejado com base emuma das referidas considerações como à dosagem desejada;tempo de circulação; resistência à proteólise; efeitos,se qualquer uma das atividades biológicas; fácilmanuseio; grau ou perda de antigenicidade; e outrosefeitos conhecidos de PEG em um peptídeo terapêutico.
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO: 1)e N1 do ligante é ligado via uma ligação carbamato a umaporção do polietileno glicol ativado (PEG), os novoscompostos de peptídeos da invenção podem serrepresentados como a seguir:<formula>formula see original document page 26</formula>
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO: 1)e N1 do ligante é ligado via uma ligação amida a umaporção do polietileno glicol ativado (PEG), os novoscompostos de peptídeos da invenção podem serrepresentados como a seguir:
<formula>formula see original document page 26</formula>Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(meG)K (SEQ.ID.NO:2) e N1 do ligante é unido via uma ligação carbamato auma porção do polietileno glicol ativado (PEG), os novoscompostos de peptídeos da invenção podem serrepresentados como a seguir:
<formula>formula see original document page 27</formula>
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(meG)K (SEQ.ID.NO:2) e N1 do ligante é unido via uma ligação amida a umaporção do polietileno glicol ativado (PEG), os novoscompostos de peptídeos da invenção podem serrepresentados como a seguir:
<formula>formula see original document page 27</formula>Os dímeros peptídicos preferidos da presente invençãoincluem, mas não se limitam a:
<formula>formula see original document page 28</formula><formula>formula see original document page 29</formula><formula>formula see original document page 30</formula><formula>formula see original document page 31</formula>
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO: 1)e ambos os N1 e N2 do espaçador são cova Ien tementeligados via uma ligação carbamato a uma porção de PEGativado, os novos compostos de peptídeos da invençãopodem ser representados como a seguir:
<formula>formula see original document page 32</formula>
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácidos, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO:1) , e ambos os N1 e N2 do espaçador são covaIentementeligados via uma ligação amida a uma porção de PEGativado, os novos compostos de peptídeos da invençãopodem ser representados como a seguir:
<formula>formula see original document page 32</formula>
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(meG)K(SEQ.ID.NO:2) e ambos os N1 e N2 do espaçador sãocovalentemente ligados via uma ligação carbamato a umaporção de PEG ativado, os novos compostos de peptídeos dainvenção podem ser representados como a seguir:
<formula>formula see original document page 33</formula>
Onde cada monômero do homodímero tem a seqüência deaminoácido da seqüência, (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal) VCQPLR (meG) K (SEQ. ID .NO: 2) e ambos os N1 e N2 doespaçador são covalentemente ligados via uma ligaçãoamida a uma porção de PEG ativado, os novos compostos depeptídeos da invenção podem ser representados como aseguir:
<formula>formula see original document page 33</formula>
Os dímeros peptídicos preferidos da presente invençãoincluem, mas não se limitam a:<formula>formula see original document page 34</formula><formula>formula see original document page 35</formula><formula>formula see original document page 36</formula><formula>formula see original document page 37</formula><formula>formula see original document page 38</formula><formula>formula see original document page 39</formula><formula>formula see original document page 40</formula>
Onde o espaçador é ligado via uma ligação carbamato a umaporção de polietileno glicol ativado (PEG), o novocomposto de peptídeo da invenção (SEQ.ID.NO:3) pode serrepresentado como a seguir:
<formula>formula see original document page 40</formula>
Onde o espaçador é unido via uma ligação de amida a umaporção de polietileno glicol ativado (PEG), o novocomposto de peptídeo da invenção (SEQ.ID.NO:3) pode serrepresentado como a seguir:<formula>formula see original document page 41</formula>
Esta estrutura dimérica pode ser escrita [Ac-peptídeo,bissulf eto] 2-Lis-espaçador-PEG2o-40K para denotar umpeptídeo acetilado N-terminal que se liga a ambos osgrupos a- e ε-amino da lisina com cada um dos peptídeoscontendo uma alça de bissulfeto intramolecular e umamolécula espaçadora formando uma ligação covalente entreo C-terminal da lisina e uma porção PEG, onde o PEG temum peso molecular de cerca de 20,000 a cerca de 40,000Daltons.
Os dímeros peptídicos preferidos da presente invençãoincluem, mas não se limitam a:
<formula>formula see original document page 41</formula><formula>formula see original document page 48</formula>
Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinteaminoácidos convencionais, aminoácidos não-naturais taiscomo aminoácidos a,a-dissubstituídos, aminoácidos de N-alquila, ácido lático, e outros aminoácidos não-convencionais podem também ser componentes apropriadospara compostos da invenção presente. Exemplos deaminoácidos não-convencionais incluem, mas não se limitama: β-alanina, 3-piridil-alanina, 4-hidroxiprolina, 0-fosfosserina, N-metilglicina, N-acetil-serina, N-formil-metionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina,norleucina, e outros aminoácidos e iminoácidossemelhantes. Outras modificações também são possíveis,incluindo modificação do terminal amino, modificação doterminal carboxi, substituição de um ou mais aminoácidoscodificados geneticamente de ocorrência natural com umaminoácido não-convencional, modificação da cadeialateral de um ou mais resíduos de aminoácidos,fosforilação peptídicas e similares.As seqüências de peptídeos da presente invenção podemestar presentes sozinhas ou em conjunto com as extensõesN-terminal e/ou C-terminal da cadeia do peptídeo. Asreferidas extensões podem ser naturalmente codificadaspelas seqüências de peptídeos opcionalmente com ousubstancialmente sem seqüências de ocorrência não-natural; as extensões podem incluir qualquer adição,deleção, ponto de mutação, ou outras modificações deseqüências ou combinações como desejadas pelos técnicosno assunto. Por exemplo e não limitado a, seqüências deocorrência não natural podem ser extensões completas ouextensões parciais e podem incluir substituições deaminoácidos para prover um sítio para ligação decarboidratos, PEG, outros polímeros, ou do gênero viaconjunção da cadeia lateral. Em uma variação, asubstituição do aminoácido resulta em humanização de umaseqüência para torná-la compatível com o sistema imunehumano. Proteína de fusão de todos os tipos são providas,incluindo seqüências de imunoglobulinas adjacentes a oubem próximas das seqüências ativadoras da EPO-R dapresente invenção com ou sem, uma seqüência espaçadoranão-imunoglobulina. Um tipo de configuração é uma cadeiade imunoglobulina tendo a seqüência ativadora da EPO-R emlugar da região variável (V) da cadeia pesada e/ou leve.
Preparação dos compostos de peptídeo da invenção:
Síntese de peptídeos
Os peptídeos da invenção podem ser preparados por métodosclássicos conhecidos na técnica. Estes métodos-padrãoincluem sínteses em fase sólida exclusiva, métodos desíntese em fase sólida parcial, condensação de fragmento,síntese em solução clássica, e tecnologia de DNArecombinante [vide, por exemplo, Merrifield J. Am. Chem.Soe. (1963) 85:2149].
Em uma configuração, os monômeros peptídicos de um dímeropeptídico são sintetizados individualmente esubseqüentemente dimerizados para síntese.Em uma outra configuração, os monômeros peptídicos de umdímero se ligam via seus C-terminais por uma porçãoligante Lk tendo dois grupos funcionais capazes de servircomo sítios de iniciação para síntese peptídica e umterceiro grupo funcional (por exemplo, grupo carboxila ougrupo amino) que permite a ligação com outra porçãomolecular (por exemplo, pode estar presente na superfíciede um suporte sólido). Neste caso, os dois monômerospeptídicos podem ser diretamente sintetizados sobre doisgrupos reativos de nitrogênio da porção ligante Lk em umavariação da técnica de síntese em fase sólida. A referidasíntese pode ser seqüencial ou simultânea.
Em uma outra configuração, os dois monômeros peptídicospodem ser sintetizados diretamente sobre dois gruposreativos de nitrogênio da porção ligante Lk em umavariação da técnica de síntese em fase sólida. A referidasíntese pode ser seqüencial ou simultânea. Nestaconfiguração, uma porção do ligante lisina (Lk) tendodois grupos amino como sítios de iniciação para síntesepeptídica e um terceiro grupo funcional (por exemplo, ogrupo carboxila de uma lisina; ou o grupo amino de umaamida-lisina, um resíduo de lisina onde o grupo carboxilafoi convertido em uma porção amida -CONH2) que permite aligação com outra porção molecular (por exemplo, podeestar presente na superfície de um suporte sólido) éusado.
Onde a síntese seqüencial das cadeias peptídicas de umdímero sobre um ligante é realizada, dois gruposfuncionais amina na molécula do ligante são protegidoscom dois grupos protetores de amina ortogonalmenteremovíveis diferentes. 0 ligante protegido acopla-se a umsuporte sólido via o grupo funcional do terceiro ligante.
O primeiro grupo protetor de amina é removido, e oprimeiro peptídeo do dímero é sintetizado na primeiraporção da amina desprotegida. Então, o segundo grupoprotetor de amina é removido, e o segundo peptídeo dodímero é sintetizado na segunda porção de aminadesprotegida. Por exemplo, a primeira porção amino doligante pode ser protegida com Alloc, e a segunda comFmoc. Neste caso, o grupo Fmoc (mas não o grupo Alloc)pode ser removido por tratamento com uma base fraca [porexemplo, piperidina em dimetilformamida (DMF) a 20%], e aprimeira cadeia peptídica sintetizada. Depois o grupoAlloc pode ser removido com um reagente apropriado [porexemplo, Pd(PPh3)/4-metil morfolina e clorofórmio], e asegunda cadeia peptídica é sintetizada. Note que onde seusarem grupos protetores tiol diferentes para cisteínadevem ser usados para controlar a formação de ligaçãobissulfeto (tal como discutido abaixo) esta técnica deveser usada mesmo onde seqüências de aminoácidos finais dascadeias peptídicas de um dímero são idênticas.
Onde se executar sínteses simultâneas das cadeiaspeptídicas de um dímero sobre um ligante, dois gruposfuncionais amina da molécula de ligante são protegidoscom o mesmo grupo protetor de amina removível. 0 liganteprotegido é acoplado a um suporte sólido via o terceirogrupo funcional do ligante. Neste caso os dois gruposfuncionais protegidos da molécula de ligante sãodesprotegidos simultaneamente, e as duas cadeiaspeptídicas sintetizadas simultaneamente nas aminasdesprotegidas. Note que usando esta técnica, asseqüências de cadeias peptídicas serão idênticas, e osgrupos protetores tiol para os resíduos de cisteína serãoos mesmos.
Um método preferido para síntese de peptídeos é sínteseem fase sólida. Procedimentos de síntese de peptídeos emfase sólida são bem conhecidos na técnica [vide, porexemplo, Stewart, "Solid Phase Peptide Syntheses"(Freeman & Co.: San Francisco) 1969; 2002/2003 GeneralCatalog de Novabiochem Corp., San Diego, EUA; Goodman,"Synthesis of Peptides & Peptidomimetics" (Houben-Weyl,Stuttgart) 2002]. Em síntese em fase sólida, tipicamentea síntese começa a partir da extremidade C-terminal dopeptideo usando uma resina protegida α-amino. Um materialde partida apropriado podem ser preparado, por exemplo,ligando o α-aminoácido requerido a uma resinaclorometilada, resina hidroximetilada, resina depoliestireno, resina de benzidrilamina, ou similares. Areferida resina clorometilada é vendida sob a denominaçãocomercial BIO-BEADS SX-I por Bio Rad Laboratories(Richmond, CA) . Descreveu-se a preparação da resina dehidroximetila [Bodonszky, et al. (1966) Chem. Ind.Londres 38:1597]. Descreveu-se a resina de benzidrilamina(BHA) [Pietta & Marshall (1970) Chem. Cimmun. 650], e aforma cloridrato é obtenível comercialmente de BeckmanInstruments, Inc. (Paio Alto, CA). Por exemplo, umaaminoácido α-amino protegido pode ser acoplado a umaresina clorometilada com a ajuda de um catalisador debicarbonato de césio, de acordo com o método descrito porGisin (1973) Helv. Chim. Acta 56:1467.
Após acoplamento inicial, remove-se o grupo protetor deα-amino usando soluções de ácido trifluoroacético (TFA)ou soluções de ácido clorídrico (HCl) em solventesorgânicos em temperatura ambiente. Depois os gruposprotetores de α-amino são sucessivamente acoplados a umacadeia peptídica ligada a suporte crescente. Os gruposprotetores de α-amino são aqueles conhecidos por seremúteis na. técnica de síntese em etapas de peptídeos,incluindo grupos protetores tipo acila (por exemplo,formila, trifluoroacetila, acetila), grupos protetorestipo uretano aromático [por exemplo, benziloxicarbonila(Cbz) e Cbz substituído], grupos protetores de uretanoalifático [por exemplo, terciobutiloxicarbonila (Boc),isopropiloxicarbonila, ciclo-hexiloxicarbonila], e gruposprotetores tipo alquila (por exemplo, benzila,trifenilmetila), fluorenilmetil oxicarbonila (Fmoc),aliloxicarbonila (Alloc), e 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclo-hex-l-ilideno)etila (Dde).Os grupos protetores de cadeia lateral (tipicamenteéteres, ésteres, tritila, PMC, e similares) permanecemintactos durante acoplamento e não se fendem durante adesproteção do grupo protetor amino terminal ou duranteacoplamento. 0 grupo protetor de cadeia lateral deve serremovível em resposta ao término da síntese do peptídeofinal e em condições de reação que não alterarão opeptídeo alvo. Os grupos protetores de cadeia lateralpara Tyr incluem tetraidropiranila, terciobutila,tritila, benzila, Cbz, Z-Br-Cbz, e 2,5-diclorobenzila. Osgrupos protetores de cadeia lateral para Asp incluembenzila, 2,6-diclorobenzila, metila, etila, e ciclo-hexila. Os grupos protetores de cadeia lateral para Thr eSer incluem acetila, benzoila, tritila,tetraidropiranila, benzila, 2,6-diclorobenzila, e Cbz. Osgrupos protetores de cadeia lateral para Arg incluemnitro, tosila (Tos), Cbz, adamantiloxicarbonil-mesitoilsulfonila (Mts), 2,2,4,6,7-pentametil-diidrozenzofurano-5-sulfonila (Pbf), 4-metoxi-2,3 , 6-trimetil-benzenossulfonila (Mtr), ou Boc. Os gruposprotetores de cadeia lateral para Lys incluem Cbz, 2-clorobenziloxicarbonila (2-Cl-Cbz), 2-bromobenziloxicarboniIa (2-Br-Cbz), Tos, ou Boc.
Após remoção do grupo protetor de α-amino, os aminoácidosprotegidos restantes são acoplados em etapas na ordemdesejada. Geralmente, cada aminoácido protegido reage numexcesso de cerca de 3 vezes usando um ativador de grupocarbonila apropriado tal como hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HBTU) oudiciclo-hexilcarbodimida (DCC) em solução, por exemplo,em cloreto de metileno (CH2CI2) , N-metil-pirrolidona,dimetilformamida (DMF), ou misturas dos mesmos.
Após a seqüência desejada de aminoácidos ter sidocompletada, o peptídeo desejado é desacoplado do suportede resina por tratamento com um reagente, tal como ácidotrifluoroacético (TFA) ou fluoreto de hidrogênio (HF) ,que não só cliva o peptídeo da resina, mas cliva tambémtodos os grupos protetores de cadeia lateral restante.
Quando se usa uma resina clorometilada, tratamento comfluoreto de hidrogênio resulta na formação dos ácidospeptídicos livres. Quando se usa a resina debenzidrilamina, tratamento com fluoreto de hidrogênioresulta diretamente na amida peptídica livre.
Alternativamente, quando se emprega a resinaclorometilada, o peptídeo protegido por cadeia lateralpode ser desacoplado por tratamento da resina peptídicacom amônia dando a amida protegida de cadeia lateraldesejada ou com alquilamina dando a alquilamina oudialquilamida protegida de cadeia lateral. Depois seremove a proteção de cadeia lateral por tratamento comfluoreto de hidrogênio dando as amidas, alquilamidas oudialquilamidas livres.
Na preparação de ésteres da invenção, empregam-se asresinas usadas para preparar ácidos peptídicos, e opeptídeo protegido de cadeia lateral é clivado com base eo álcool apropriado (por exemplo, metanol). Gruposprotetores de cadeia lateral são então removidos demaneira usual por tratamento com fluoreto de hidrogênioobtendo-se o éster desejado.
Estes procedimentos podem também ser utilizados parasintetizar peptídeos nos quais aminoácidos outros que nãoos 20 aminoácidos codificados geneticamente ocorrendonaturalmente são substituídos em uma duas, ou maisposições de qualquer um dos compostos da invenção.
Aminoácidos sintéticos que podem ser substituídos nospeptídeos da invenção presente incluem, mas não selimitam a, N-metil, L-hidroxipropil, L-3,4-di-hidroxifenilalanil, δ aminoácidos tais como L-õ-hidroxi-lisil e D-õ-metilalanil, L-a-metilalanil, β aminoácidos,e isoquinolila. D-aminoácidos e aminoácidos sintéticosnão ocorrendo naturalmente podem ser também incorporadosnos peptídeos da invenção presente.Modificações de peptídeos
Também é possível modificar os terminais amino e/oucarboxi dos compostos peptídicos da invenção paraproduzir outros compostos da invenção. Por exemplo, oterminal amino pode ser acetilado com ácido acético ou umderivado halogenado do mesmo tal como ácido a-cloroacético, ácido α-bromoacético, ou ácido oc-iodoacético.
Uma pode repor as cadeias laterais de ocorrência naturaldos 2 0 aminoácidos codificados geneticamente (ou os D-aminoácidos estereoisômeros) com outras cadeias laterais,por exemplo, com grupos tais como alquila, alquilainferior, 4-, 5-, 6- cíclico, a alquila com 7-membros,amida, alquil amida inferior, amida di(alquila inferior),alcoxi inferior, hidroxi, carboxi e derivados ésterinferior dos mesmos, e com heterocíclico com 4-, 5-, 6-,a 7-membros. Em particular, os análogos de prolina nosquais o tamanho do anel do resíduo prolina é alterado de5 membros para 4, 6, ou 7 membros podem ser empregados.
Os grupos cíclicos podem ser saturados ou insaturados, ese insaturados, podem ser aromáticos ou não-aromáticos.
Os grupos heterocíclicos contêm, preferivelmente, um oumais nitrogênios, oxigênios, e/ou heteroátomos deenxofre. Exemplos dos referidos grupos incluem,furazanila, furila, imidazolidinila, imidazolila,imidazolinila, isotiazolila, isoxazolila, morfolinila(por exemplo, morfolino), oxazolila, piperazinila (porexemplo, 1-piperazinila), piperidila (por exemplo, 1-piperidila, piperidino), piranila, pirazinila,pirazolidinila, pirazolinila, pirazolila, piridazinila,piridila, pirimidinila, pirrolidinila (por exemplo, 1-pirrolidinila), pirrolinila, pirrolila, tiadiazolila,tiazolila, tienila, tiomorfolinila (por exemplo,tiomorfolino) e tiazolila. Estes grupos heterocíclicospodem ser substituídos ou não substituídos. Onde um grupoé substituído, o substituinte pode ser alquila, alcoxi,halogênio, oxigênio, ou fenila substituído ou nãosubstituído.
É possível também modificar rapidamente peptídeos porfosforilação, e outros métodos [por exemplo, tal comodescrito em Hruby, et al. (1990) Biochem J. 268:249-262].
Os compostos peptídicos da invenção servem também comomodelos estruturais para compostos não peptídicos comatividade biológica semelhante. Aqueles treinados natécnica reconhecem que uma variedade de técnicas estádisponível para construir compostos com atividadebiológica desejada igual ou semelhante ao compostopeptídico principal, mas com atividade mais favorável queo principal com respeito à solubilidade, estabilidade esusceptibilidade à hidrólise e proteólise [vide, Morgan &Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252]. Estastécnicas incluem substituir a cadeia principal peptídicacom uma cadeia principal composta de fosfonatos,amidatos, carbamatos, sulfonamidas, aminas secundárias, eácidos N-metilamino.
Formação de ligações bissulfeto
Os compostos da presente invenção podem conter uma oumais ligações bissulfeto intramoleculares. As referidasligações bissulfeto podem ser formadas por oxidação doresíduo de cisteína de cada monômero peptídico.
Em uma configuração, o controle da formação da ligação dacisteína é exercido escolhendo um agente oxidante do tipoe concentração eficaz para otimizar a formação do isômerodesejado. Por exemplo, a oxidação de um dímero peptídicopara formar duas ligações bissulfeto intramoleculares(uma em cada cadeia peptídica) é conseguida,preferencialmente (sobre formação de ligações bissulfetointermolecuares) quando o agente oxidante é DMSO ouiodina (I2).
Em uma outra configuração, a formação de ligaçõescisteína é controlada pelo uso seletivo de gruposprotetores tiol durante síntese peptídica. Por exemplo,onde se deseja um dímero com duas ligações bissulfetointramoleculares, a primeira cadeia peptídica monoméricaé sintetizada com os dois resíduos de cisteína daseqüência nuclear protegida com um primeiro grupoprotetor tiol [por exemplo, tritila (Trt),aliloxicarbonila (Alloc), e 1-(4,4-dimetil-2 , 6-dioxociclo-hex-l-ilideno) etila (Dde) ou similar], depoiso segundo monômero peptídico sintetiza os dois resíduosde cisteína da seqüência nuclear protegida com um segundogrupo protetor tiol diferente do primeiro grupo protetortiol [por exemplo, acetamidometila (Acm), terciobutila(tBu), ou similar]. Posteriormente, removem-se osprimeiros grupos protetores tiol efetuando a ciclizaçãobissulfeto do primeiro monômero, e então se remove ossegundos grupos protetores tiol efetuando ciclizaçãobissulfeto do segundo monômero.
Outras incorporações desta invenção provêm análogosdestes derivados de bissulfeto nos quais um dos átomos deenxofre foi substituído por um grupo CH2 ou outro isóterode enxofre. Estes análogos podem ser preparados a partirde compostos da invenção presente, nos quais cadaseqüência nuclear contém pelo menos um C ou resíduo dehomocisteína e um ácido α-amino-Y-butírico em lugar dosegundo resíduo de C, via um deslocamento intramolecularou intermolecular, usando métodos conhecidos na técnica[vide, por exemplo, Barker, et al. (1992) J. Med. Chem.35:2040-2048 e Or, et al. (1991) J. Org. Chem. 56:3146-3149]. Aquele treinado na técnica estimará rapidamenteque este deslocamento pode também ocorrer usando outroshomólogos de ácido α-amino-Y-butírico e homocisteína.
Além das estratégias de ciclização anteriores, outrasestratégias de ciclização peptídicas que não debissulfeto podem ser empregadas. Tais estratégias deciclização alternativas incluem, por exemplo, estratégiasde ciclização por amida assim como àquelas envolvendoformação de ligações tio-éter. Assim, os compostos dapresente invenção podem existir numa forma ciclizada comou uma ligação amida intramolecular ou uma ligação tio-éter intramolecular. Por exemplo, um peptídeo pode sersintetizado no qual uma cisteína da seqüência nuclear ésubstituída com lisina e a segunda cisteína é substituídacom ácido glutâmico. Em seguida, um monômero cíclico podeser formado através de uma ligação amida entre as cadeiaslaterais destes dois resíduos. Alternativamente, umpeptídeo pode ser sintetizado no qual uma cisteína daseqüência nuclear é substituída com lisina (ou serina).
Um monômero cíclico pode então ser formado através de umaligação tio-éter entre as cadeias laterais do resíduo delisina (ou serina) e o segundo resíduo de cisteína daseqüência nuclear. Como tal, além das estratégias deciclização por bissulfeto, estratégias de ciclização poramida e estratégias de ciclização tio-éter, podem ambasser usadas rapidamente para ciclizar os compostos dainvenção presente. Alternativamente, os terminais aminodo peptídeo podem ser capeados com um ácido acético a-substituído, no qual o α-substituinte é um grupo desaída, tal como um ácido α-haloacético, por exemplo,ácido α-cloroacético, ácido α-bromoacético ou ácido a-iodoacético.
Adição de ligantes de amida terciária ramificada
Os monômeros peptídicos podem ser dimerizados por umaporção de amida terciária ramificada. Em umaconfiguração, o ligante é incorporado no peptídeo durantea síntese do peptídeo. Por exemplo, onde uma porção de umligante Lk contém dois grupos funcionais capazes deservir como sítios de iniciação para síntese peptídica eum ou mais de outros grupos funcionais (por exemplo, umgrupo carboxila ou um grupo amino) que permita ligar umaou mais de outras porções moleculares, o ligante pode serconjugado a um suporte sólido. Além disso, dois monômerospeptídicos podem ser sintetizados diretamente sobre osdois grupos de nitrogênio reativo, da porção de liganteLK, em uma variação na técnica de síntese em fase sólida.Em configurações alternativas, o ligante pode serconjugado a dois monômeros peptídicos de um dímeropeptídico após a síntese do peptídeo. A referidaconjugação pode ser conseguida através de métodos bemestabelecidos na técnica. Em uma configuração, o ligantecontém dois grupos funcionais adequados para a ligaçãoaos grupos funcionais alvos dos monômeros peptídicossintetizados. Por exemplo, um ligante contendo doisgrupos carboxila, tanto pré-ativados quanto em presençade um reagente de acoplamento apropriado, pode serreagido com os grupos amina de cadeia lateral de lisinaalvo de cada um dos dois monômeros peptídicos.
Por exemplo, os monômeros peptídicos podem serquimicamente acoplados ao ligante de amida terciário:
A*-C1-CH2-X-CH2-C2O-B*
onde: X é NCO-(CH2)2-NH-Y e Y é um grupo protetoradequado, tal como um grupo protetor t-butiloxicarbonila(Boc) ; A* é um grupo funcional adequado, tal como N-oxisuccinimida, usado para conjugar o C1 do ligante ao grupoε-amino do resíduo de lisina C-terminal do primeiromonômero peptídico; e B* é um grupo funcional adequado,tal como N-oxi succinimida, utilizado para conjugar C2 doligante ao grupo ε-amino do resíduo de lisina C-terminaldo segundo monômero peptídico.
Adicionalmente, por exemplo, os monômeros peptídicospodem ser quimicamente acoplados ao ligante amidaterciário;
A*-C1-CH2-X-CH2-C2O-B*
onde: X é NCO-(CH2)2-NH-C3O; A* é um grupo funcionaladequado, tal como N-oxi succinimida, usado para conjugaro C1 do ligante ao grupo ε-amino do resíduo de lisina C-terminal do primeiro monômero peptídico; e B* é um grupofuncional adequado, tal como N-oxi succinimida, utilizadopara conjugar C2 do ligante ao grupo ε-amino do resíduo delisina C-terminal do segundo monômero peptídico; e oligante amida terciário é quimicamente ligando a porçãoespaçadora:
Y-NH- (CH2)4-C4H-NH-Y
onde: C3 de X é covalentemente ligado ao C4 do espaçador;e Y é um grupo protetor adequado, tal como um grupoprotetor t-butiloxicarbonila (Boc).
Adição do ligante lisina:
Os monômeros peptídicos podem ser dimerizados por umaporção do ligante de lisina Lk. Em uma configuração, oligante de lisina é incorporado no peptídeo durante asíntese do peptídeo. Por exemplo, onde uma porção doligante de lisina Lk contém dois grupos funcionaiscapazes de servir de sítio de iniciação para a síntese depeptídeos e um terceiro grupo funcional (por exemplo, umgrupo carboxila ou um grupo amino) que permite se ligar auma outra porção molecular, o ligante pode ser conjugadoem um suporte sólido. Além disso, dois monômerospeptídicos podem ser sintetizados diretamente sobre osgrupos reativos de nitrogênio da porção do ligante delisina LK em uma variação das técnicas de síntese em fasesólida.
Em configurações alternativas onde um dímero peptídico édimerizado por uma porção ligante de lisina LK, oreferido ligante pode ser conjugado aos dois monômerospeptídicos de um dímero peptídico após a síntese dopeptídeo. A referida conjugação pode ser conseguidaatravés de métodos bem estabelecidos na técnica. Em umaconfiguração, o ligante contém pelo menos dois gruposfuncionais adequados para ligação aos grupos funcionaisalvos dos monômeros peptídicos sintetizados. Por exemplo,dois grupos amina livres da lisina podem ser reagidos comos grupos carboxila C-terminal de cada um dos dois gruposmonômeros peptídicos.
Adição de espaçadores
Os compostos de peptídeos da invenção compreendem ainda,uma porção espaçadora. Em uma configuração, o espaçadorpode ser incorporado nos peptídeos durante a síntese dospeptídeos. Por exemplo, onde um espaçador contém um grupoamino livre e um segundo grupo funcional (por exemplo, umgrupo carboxila ou um grupo amino) que permite ligar aoutra porção molecular, o espaçador pode ser conjugado nosuporte sólido.
Em uma configuração, o espaçador contendo os dois gruposfuncionais é primeiramente acoplado ao suporte sólido,através de um primeiro grupo funcional. Em seguida, umaporção de ligante de lisina Lk possuindo dois gruposfuncionais capazes de servir como sítios de iniciaçãopara a síntese peptídica e um terceiro grupo funcional(por exemplo, um grupo carboxila ou um grupo amino) quepermite ligar a outra porção molecular é conjugado aoespaçador via o segundo grupo funcional do espaçador e oterceiro grupo funcional do ligante. Posteriormente, doismonômeros peptídicos podem ser sintetizados diretamentesobre os dois grupos de nitrogênio reativo da porçãoligante Lk em uma variação da técnica de síntese em fasesólida. Por exemplo, um espaçador acoplado em suportesólido com um grupo amina livre pode ser reagido com umligante de lisina através do grupo carboxila livre doligante.
Em configurações alternativas, o espaçador pode serconjugado ao dímero peptídico após a síntese do peptídeo.
A referida conjugação pode ser conseguida através demétodos bem estabelecidos na técnica. Em umaconfiguração, o ligante contém pelo menos um grupofuncional adequado para se ligar ao grupo funcional alvodo peptídeo sintetizado. Por exemplo, o espaçador com umgrupo amina livre pode ser reagido com um grupo carboxilaC-terminal do peptídeo. Em um outro exemplo, o ligantecom um grupo carboxila livre pode ser reagido com o grupoamina livre de uma amida lisina.
Ligação de polietileno glicol (PEG):
Nos últimos anos, os polímeros solúveis em água, tal comoo poli(etileno glicol) (PEG), têm sido usados paramodificação covalente de peptídeos de importânciaterapêutica e diagnostica. A ligação de tais polímeros éconcebida para acentuar atividade biológica, prolongar otempo de circulação do sangue, reduzir a imunogenicidade,aumentar a solubilidade em água, e acentuar resistência àdigestão de protease. Por exemplo, foi relatada a ligaçãocovalente de PEG com polipeptídios terapêuticos tais comointerleucinas [Kanuf, et al. (1988) J. Biol. Chem.263:15064; Tsutsumi, et al. (1995) J. Controlled Release33:447], interferon [Kita, et al. (1990) Drug Des.Delivery 6:157], catalase [Abuchowski, et al. (1977) J.Biol. Chem. 252:582], dismutase de superóxido [Beauchamp,et al. (1983) Anal. Biochem. 131:25], e desaminase deadenosina [Chen. Et al. (1981) Biochim. Bioph. Acta660:293], para ampliar sua meia vida in vivo, e/oureduzir sua imunogenicidade e antigenicidade.
Os compostos peptídicos da invenção podem compreender umaporção de poli(etileno glicol) (PEG), que écovalentemente ligada ao ligante de amida terciáriaramificada ou ao espaçador do dímero peptídico através deuma ligação por carbamato ou via uma ligação pro amida.
Um exemplo de PEG utilizado na presente invenção élinear, PEG não-ramifiçado tendo um peso molecular decerca de 20 quiloDaltons (20K) a cerca de 40K (o termo"cerca de" indicando que em preparações de PEG, algumasmoléculas pesarão mais, algumas menos, do que o pesomolecular declarado) . Preferivelmente, o PEG tem um pesomolecular de cerca de 30K a cerca de 40K.
Um outro exemplo de PEG utilizado na presente invenção éo PEG linear tendo um peso molecular de cerca de IOK acerca de 60K (o termo "cerca de" indicando que empreparações de PEG, algumas moléculas pesarão mais,algumas menos, do que o peso molecular declarado).
Preferivelmente, o PEG tem um peso molecular de cerca de2OK a cerca de 4OK. Mais preferivelmente, o PEG tem umpeso molecular de cerca de 2OK.
Exemplos de métodos para ligação covalente de PEG(PEGglicosilação) são descritos abaixo. Estas descriçõesilustrativas não pretendem ser limitativas. Um técnico noassunto entenderá que uma variedade de métodos paraligação covalente, de uma ampla faixa de PEG, é bemconhecida da técnica. Como exemplo, compostos peptídicosaos quais o PEG foi ligado por qualquer um dos váriosmétodos de ligação conhecidos da técnica são abrangidospela presente invenção.
Por exemplo, PEG pode ser covalente ligado ao liganteatravés de um grupo reativo ao qual uma molécula de PEGativado pode ser ligada (por exemplo, um grupo aminalivre ou um grupo carboxila) . As moléculas de PEG podemser ligadas aos grupos amino usando PEG metoxilado("mPEG") tendo diferente porções reativas. Os referidospolímeros incluem succinato de mPEG-succinimidila,carbonato de mPEG-succinimidila, mPEG-imidato, carbonatode mPEG-4-nitrofenila, e cloreto de mPEG-cianúrico.
Similarmente, as moléculas de PEG podem ser ligadas aosgrupos carboxilas usando PEG metoxilado com um grupoamina livre (mPEG-NH2).
Em algumas configurações, o ligante ou o espaçador contémum grupo amino terminal (ou seja, posicionado na posiçãoterminal do espaçador). Este grupo amino terminal podeser reagido com uma molécula PEG ativada adequada, talcomo um mPEG-para-nitrofenilcarbonato (mPEG-NPC), parafazer uma ligação de carbamato covalente estável.
Alternativamente, este grupo amino terminal pode serreagido com uma molécula PEG ativada adequada, tal comoum butirato de mPEG-succinimidila (mPEG-SBA) ou umpropionato de mPEG-succinimidila (mPEG-SPA), contendo umgrupo N-hidroxil-succinimida (NHS) reativo, para fazeruma ligação de carbamato covalente estável. Em outrasconfigurações, o grupo ligante reativo contém um grupocarboxila capaz de ser ativado para formar uma ligaçãocovalente com uma molécula PEG contendo amina sobcondições de reação adequadas. As moléculas PEGapropriadas incluem mPEG-NH2 e condições de reaçãoadequadas incluem formação de amida mediada porcarbodiimida ou similar.
Ensaios de atividade agonista de EPO-R
Ensaios funcionais in vitro
Os ensaio de ligação competitiva in vitro quantificam acapacidade de um peptídeo de teste competir com EPO paraligar a EPO-R. Por exemplo, (vide, por exemplo, tal comodescrito na patente U.S. n2 5.773.569), o domínioextracelular da EPO-R humana (proteína ligando EP0, EBP)podem ser produzido de modo recombinante em E.coli e aproteína recombinante acoplada num suporte sólido, talcomo um disco de microtitulação ou uma conta sintética[por exemplo, contas de sulfoligação de Pierce ChemicalCo. (Rockford, IL)]. A EBP imobilizada é então incubadacom EPO recombinante marcada, ou com EPO recombinantemarcada e um peptídeo de teste. Em tais experimentosempregam-se diluições seriais de peptídeo de teste.
Pontos de ensaio com nenhum peptídeo de teste adicionadodefinem ligação total de EPO a EBP. Para reações contendopeptídeo de teste, a quantidade de EPO ligado quantificae expressa como porcentagem da ligação controle (total =100%). Estes valores são plotados versus concentração depeptídeo. 0 valor IC50 é definido como a concentração depeptídeo de teste que reduz a ligação de EPO a EBP em 5 0%(isto é, 50% de inibição de ligação de EP0).
Um ensaio de ligação competitiva in vitro diferente medeo sinal luminoso gerado como uma função da proximidade deduas contas: uma conta conjugada de EPO e uma contaconjugada de EPO-R. A proximidade de conta é gerada pelaligação de EPO com EPO-R. 0 peptídeo de teste que competecom EPO para ligação com EPO-R impedirá esta ligação,causando uma diminuição na emissão luminosa. Aconcentração de peptídeo de teste que resulta numadiminuição de 50% na emissão luminosa é definido como ovalor IC50.
Os peptídeos da invenção presente competem muitoeficientemente com EPO para ligação com EPO-R. Estafunção acentuada é representada por sua capacidade eminibir a ligação de EPO em concentrações substancialmentemenores de peptídeo (isto é, elas têm valores IC50 muitobaixos).
A potência e atividade biológica de agonistas de EPO-Rpeptídicos diméricos ou monoméricos da invenção, que seligam especificamente ao receptor de EP0, podem sermedidas usando ensaios funcionais baseados em células invitro.
Um ensaio baseia-se numa linhagem celular pré-B de murinoexpressando EPO-R humano e transfectada adicionalmentecom uma estrutura de gene repórter de luciferase dirigidapor promotor fos. Após exposição a EPO ou outro agonistade EP0-R, tais células respondem sintetizando aluciferase. A luciferase causa a emissão de luz emresposta à adição de sua luciferina substrato. Assim, onível de ativação de EPO-R em tais células pode serquantificado via medida de atividade de luciferase. Aatividade de um peptídeo de teste é medida adicionandodiluições seriais do peptídeo de teste nas células, quesão então encubadas por 4 horas. Após a incubação, osubstrato de luciferina é adicionado às células, e mede-se a emissão luminosa. A concentração de peptídeo deteste que resulta em uma emissão semi-máxima de luz éregistrada como o valor EC50.
Os peptídeos da presente invenção mostram capacidadedramaticamente acentuada em promover expressão deluciferase dependente de sinalização de EPO-R nesteensaio. Esta função acentuada é representada por suacapacidade de produzir metade da atividade máxima deluciferase em concentrações substancialmente menores depeptídeo (isto é, eles têm valores EC50 muito baixos).Este ensaio é um método preferido para estimar a potênciae a atividade de um peptídeo agonista de EPO-R dainvenção.
Um outro ensaio pode ser executado usando células FDC-Pl/ER [Dexter, et al. (1980) J. Exp. Med. 152:103 6-1047],uma linhagem celular bem caracterizada derivada de medulaóssea de murino não transformada na qual EPO-R tenha sidotransfectada de modo estável. Estas células exibemproliferação dependente de EPO.
Num ensaio tal, as células crescem até a metade dadensidade estacionária em presença dos fatores decrescimento necessários (vide, por exemplo, tal comodescrito na patente U.S. n2 5.773.569). As células sãoentão lavadas em PBS e alimentadas por 16-24 horas emmeio integral sem os fatores de crescimento. Apósdeterminação da viabilidade das células (por exemplo,corante azul de tripano), preparam-se soluções de estoque(em meio integral sem os fatores de crescimento) para darcerca de IO5 células por 50 yL. Diluições seriais doscompostos agonistas de EPO-R peptídicos (peptídeo em fasesolução, tipicamente livre em oposição a um peptídeoimobilizado ou ligado a outro ou ligado por fago) paraserem testadas são produzidas em placas de cultura detecido de 96 poços para um volume final de 50 pL porpoço. Adicionam-se células (50 μ!·) em cada poço e ascélulas são incubadas 24-48 horas, em cujo ponto oscontroles negativos devem morrer ou estar imóveis.
Depois, mede-se a proliferação celular por técnicasconhecidas da técnica, tal como um ensaio MTT que mede aincorporação de H3-timidina como uma indicação deproliferação celular [vide, Mosmann (1983) J. Immunol.Methods 65:55-63]. Os peptídeos são avaliados em ambas aslinhagens celulares expressando EPO-R s não expressandoparental. A concentração de peptídeo de teste necessáriapara produzir metade da proliferação celular máxima éregistrada como EC50.Os peptídeos da invenção presente mostram capacidadedramaticamente acentuada para promover crescimentocelular dependente de EPO neste ensaio. Esta funçãoacentuada é representada por sua capacidade de produzirmetade da atividade de estimulação de proliferaçãocelular máxima em concentrações substancialmente menoresde peptídeo (isto é, eles têm valores EC50 muito baixos).
Este ensaio é um método preferido para estimar a potênciae a atividade de um peptídeo agonista de EPO-R dainvenção.
Em outro ensaio, as células crescem até fase estacionáriaem meio suplementado por EPO, são coletadas e depoiscultivadas por mais 18 horas em meio sem EPO. As célulassão divididas em três grupos de igual densidade celular:um grupo sem nenhum fator adicionado (controle negativo),um grupo com EPO (controle positivo) , e um grupoexperimental com o peptídeo de teste. As célulascultivadas são então coletadas em vários instantes,fixadas, e coradas com um corante fluorescente ligante deDNA (por exemplo, iodeto de propídio ou corante deHoechst, ambos obteníveis de Sigma). Mede-se então afluorescência, por exemplo, usando um citômetro de fluxode varredura FACS. A porcentagem de células em cada fasedo ciclo celular pode então ser determinada, por exemplo,usando o modelo SOBR de software CellFIT (BectonDickinson). Células tratadas com EPO ou peptídeo ativomostrarão proporção maior de células em fase S (comodeterminado por fluorescência aumentada como um indicadorde conteúdo aumentado de DNA) em relação ao grupo decontrole.
Ensaios semelhantes podem ser executados usando linhagenscelulares FDCP-I [vide, por exemplo, Dexter et al. (1980)J. Exp. Med. 152:1036-1047] ou TF-I [Kitamura, et al.(1989) Blood 73:375-380]. FDCP-I é uma linhagem celularde progenitor hematopoético primitivo multipotencial demurino dependente de fator de crescimento que podemproliferar, mas não diferenciar, quando suplementada commeios condicionados WEHI-3 (meio que contém IL-3, númeroTIB-68 de ATCC). Para tais experimentos, a linhagemcelular FDCP-I é transfectada com EPO-R humano ou demurino para produzir linhagens celulares FDCP-l-hEPO-R ouFDCP-l-mEPO-R, respectivamente, que podem proliferar, masnão diferenciar, na presença de EPO. TF-I, uma linhagemcelular dependente de EPO, pode também ser usada paramedir os efeitos de agonistas de EPO-R peptídico emproliferação celular.
Em ainda, um outro ensaio, o procedimento relatado emKrystal (1983) Exp. Hematol. 11:649-660 para um micro-ensaio, baseado na incorporação de timidina-H3, emcélulas de baço, pode ser empregado para verificar acapacidade dos compostos da presente invenção para servircomo agonistas de EPO. Em resumo, injetam-se,diariamente, camundongos B6C3Fi por dois dias com fenil-hidrazina (60 mg/kg). No terceiro dia, removem-se ascélulas de baço e verifica-se sua capacidade deproliferar por um período de 24 horas usando um ensaio MTT.
A ligação de EPO com EPO-R numa linhagem celular sensívela eritropoietina fosforilação de tirosina tanto doreceptor como das numerosas proteínas intracelulares,incluindo Shc, vav e JAK2 quinase. Além disso, outroensaio in vitro mede a capacidade de peptídeos dainvenção de induzir fosforilação de tirosina de EPO-R ede proteínas de transdutor de sinal intracelular ajusante. Peptídeos ativos, identificados por ensaios deproliferação e ligação descritos acima, trazem à tona umpadrão de fosforilação quase idêntico àquele EPO emcélulas sensíveis a eritropoietina. Para este ensaio,células FDC-Pl/ER [Dexter, et al. (1980) J. Exp. Med.152:103 6-47] são mantidas em meio suplementado por EPO ecrescem até fase estacionária. Estas células sãocultivadas em meio sem EPO por 24 horas. Posteriormente,incuba-se um número definido de tais células com umpeptídeo de teste por aproximadamente 10 minutos a 37°C.
Organiza-se com cada ensaio uma amostra de controle decélulas com EPO. As células tratadas são então coletadaspor centrifugação, suspensas em tampão Iise SDS, esubmetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida SDS.
As proteínas que sofreram eletroforese no gel sãotransferidas para nitrocelulose, e as proteínas contendofosfotirosina visualizadas no blot por técnicasimunológicas padronizadas. Por exemplo, o substrato podeser investigado com um anticorpo de anti-fosfotirosina(por exemplo, anti-fosfotirosina IgG de camundongo deUpstate Biotechnology, Inc.), lavado, e então investigadocom um anticorpo secundário [por exemplo, IgG anti-camundongo caprino marcado com peroxidase de Kirkegaard &Perry Laboratories, Inc. (Washington, DC). Depois disso,as proteínas contendo fosfotirosina podem servisualizadas por técnicas padronizadas incluindo ensaioscolorimétricos, quimioluminescentes ou fluorescentes. Porexemplo, um ensaio quimioluminescente pode ser executadousando o sistema de Western blotting ECL de Amersham.
Outro ensaio in vitro baseado em células que pode serusado para avaliar a atividade dos peptídeos da presenteinvenção compreende um ensaio de colônia, usando célulasde sangue periférico humano ou de medula óssea de murino.
Medula óssea de murino pode ser obtida de fêmures decamundongos, enquanto que sangue periférico pode serobtido de um doador sadio. No caso de sangue periférico,células mononucleares, primeiramente são isoladas dosangue, por exemplo, por centrifugação através de umgradiente de Ficoll-Hypaque [Stem Cell Technologies, Inc.(Vancouver, Canadá)]. Para este ensaio executa-se umacontagem de células nucleadas para estabelecer o número ea concentração de células nucleadas na amostra original.
Um número definido de células é plaqueado em metil-celulose conforme instruções do fabricante [Stem CellTechnologies, Inc. (Vancouver, Canadá)]. Um grupoexperimental é tratado com um peptídeo de teste, um grupode controle positivo é tratado com EPO, e um grupo decontrole negativo não recebe tratamento algum. 0 númerode colônias de crescimento é então marcado após períodosdefinidos de incubação, geralmente 10 dias e 18 dias. Umpeptídeo ativo promoverá formação de colônia.
Outros ensaios biológicos in vitro que podem ser usadospara demonstrar a atividade dos compostos da presenteinvenção estão divulgados em Greenberger, et al. (1983)Proc. Natl. Sei. Acad. Sei. USA 80:2931-2935 (linhagemcelular de progenitor hematopoético dependente de EPO) ;Quelle e Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266:609-614(fosforilação de tirosina protéica em células B6SUt.EP);Dusanter-Fourt, et al. (1992) J. Biol. Chem. 287:10670-10678 (f osforilação de tirosina de receptor de EPO emcélulas sensíveis a EPO humano); Quelle, et al. (1992) J.Biol. Chem. 267:17055-17060 (fosforilação de tirosina deuma proteína citossólica, pp 100, em células FDC-ER);Worthington, et al. (1987) Exp. Hematol. 15:85-92 (ensaiocolorimétrico para hemoglobina); Kaiho e Miuno (1985)Anal. Biochem. 149:117-120 (detecção de hemoglobina com2,7-diaminofluoreno); Patel, et al. (1992) J. Biol. Chem.267:21300-21302 (expressão de c-myb); Witthuhn, et al.(1993) Cell 74:227-236 (associação e fosforilação detirosina de JAK2); Leonard, et al. (1993) Blood 82:1071-1079 (expressão dos fatores de transcrição GATA); e Ando,et al., (1993) Proc. Natl. Sei. Acad. Sei. USA 90:9571-9575 (regulação de transição Gi ciclizando D2 e D3) .
Um instrumento projetado por Molecular Devices Corp.,conhecido como um micro-fisiômetro, foi relatado comotendo sido usado com sucesso para medição do efeito deagonistas e antagonistas em vários receptores. A basepara este aparelho é a medição das alterações na taxa deacidificação dos meios extracelulares em resposta àativação de receptor.Ensaios funcionais in vivo:
Um ensaio funcional in vivo que pode ser utilizado paraavaliar a potência de um peptídeo de teste é o bio-ensaiode camundongo ex-hipóxico policitêmico. Para este ensaio,submetem-se camundongos a um ciclo condicionantealternado por vários dias. Neste ciclo, os camundongosalternam entre períodos de condições hipobáricas econdições de pressão ambiente. Depois, os camundongos sãomantidos em pressão ambiente por 2-3 dias antes daadministração de amostras de teste. As amostras depeptídeo de teste, ou padrão EPO no caso de camundongosde controle positivo, são injetadas sub-cutaneamente noscamundongos condicionados. Administra-se radioisótopo deferro (por exemplo, 59Fe) dois dias depois, e amostras desangue recolhidas dois dias após administração deradioisótopo de ferro. Depois, determinam-se medições deradioatividade e de hematócritos para cada amostra desangue por técnicas padronizadas. Amostras de sangue decamundongos injetados com peptídeos de teste ativosmostrarão radioatividade maior (devido à ligação de 59Fepor hemoglobina de eritrócito) que os camundongos que nãoreceberam peptídeos de teste ou EPO.
Outro ensaio funcional in vivo que pode ser usado paraavaliar a potência de um peptídeo de teste é o ensaio dereticulócito. Para este ensaio, camundongos não tratadosnormais são injetados sub-cutaneamente em três diasconsecutivos ou com EPO ou com peptídeo de teste. Noterceiro dia os camundongos também são injetadosintraperitonealmente com dextrana de ferro. No quinto diacoletam-se amostras de sangue dos camundongos. Determina-se a porcentagem de reticulócitos no sangue por coloraçãocom laranja de tiazol e análise citométrica de fluxo(programa de contagem de reticulócitos) . Além disso, oshematócritos são determinados manualmente. Determina-se aporcentagem de reticulócitos usando a fórmula seguinte:
% RETICcorrigido = % RETICconservado χ (HEMAT0CRITindividual/ HEMATOCRITnormal)Os compostos de teste ativos mostrarão um nível aumentadode % RETICcorrigido em ralação aos camundongos que nãoreceberam peptídeos de teste ou EPO.
Uso de peptídeos agonistas de EPO-R da invenção
Os compostos peptídicos da invenção são úteis in vitrocomo ferramentas para entender o papel biológico de EPO,incluindo a avaliação dos muitos fatores considerados porinfluenciar, e serem influenciados pela produção de EPO epela ligação de EPO com EPO-R (por exemplo, o mecanismode transdução de sinal EP0/EP0-R/ativação de receptor).
Os peptídeos presentes também são úteis nodesenvolvimento de outros compostos que ligam ao EP0-R,porque os compostos presentes provêm informações derelação estrutura-atividade que facilitam aqueledesenvolvimento.
Além disso, baseados em sua capacidade de ligar a EP0-R,os peptídeos da presente invenção podem ser usados comoreagentes para detectar EPO-R em células vivas, célulasfixas, em fluidos biológicos, homogenatos de tecidos, emmateriais biológicos naturais purificados, etc. Porexemplo, marcando tais peptídeos, é possível identificarcélulas tendo EPO-R em suas superfícies. Além disso,baseados em sua capacidade de ligar EP0-R, os peptídeosda presente invenção podem ser usados em uma coloração nosítio, análise por FACS (separação de células ativada porfluorescência), análise por Western blotting, ELISA(ensaio imunossorvente ligado a uma enzima), etc. Alémdisso, baseados em sua capacidade de ligar EP0-R, ospeptídeos da presente invenção podem ser usados empurificação de receptor ou na purificação de célulasexpressando EPO-R na superfície celular (ou no interiorde células permeabilizadas).
Os peptídeos da invenção podem ser utilizados também comoreagentes comerciais para vários propósitos diagnósticose de pesquisa médica. Tais usos podem incluir, mas não selimitam a: (1) uso como um padrão de calibração paraquantificar as atividades de agonistas de EPO-Rcandidatos numa variedade de ensaios funcionais; (2) usocomo reagentes bloqueadores em triagem peptidicaaleatória, isto é, em procurar novas famílias de ligantespeptídicos de EPO-R, os peptídeos podem ser usados pararecuperação de blocos de peptídeos de EPO da presenteinvenção; (3) uso em co-cristalização com EPO-R, isto é,cristais dos peptídeos da presente invenção, ligados aoEPO-R podem ser formados, permitindo a determinação deestrutura de peptídeo/receptor por cristalografia deraios-X; (4) uso para medir a capacidade de as célulasprecursoras de eritrócito induzirem síntese de globina esíntese de complexo hemo, e aumentar o número dereceptores de ferritina, iniciando diferenciação; (5) usopara manter a proliferação e o crescimento de linhagenscelulares dependente de EPO, tais como as linhagenscelulares FDCP-l-mEP0-R e TF-I; e (6) uso relacionado commarcadores de peptídeos da invenção com um cromófororadioativo; e (7) outras aplicações diagnosticas e depesquisa nas quais o EPO-R é, preferivelmente, ativado outal ativação é calibrada convenientemente contra umaquantidade conhecida de um agonista de EPO-R, esimilares.
Em ainda outro aspecto da presente invenção, provêm-semétodos de tratamento e manufatura de um medicamento. Oscompostos de peptídeos da invenção podem seradministrados em animais de sangue quente, incluindoseres humanos, para simular a ligação de EPO a EPO-R invivo. Conseqüentemente, a presente invenção abrangemétodos para tratamento terapêutico de distúrbiosassociados com uma deficiência de EP0, cujos métodoscompreendem administrar um peptídeo da invenção emquantidades suficientes para estimular o EPO-R e assim,aliviar os sintomas associados com uma deficiência de EPOin vivo. Por exemplo, os peptídeos desta invençãoencontrarão uso no tratamento de insuficiência renal e/ouinsuficiência renal em estágio terminal/diálise; anemiaassociada com AIDS; anemia associada com doençasinflamatórias crônicas (por exemplo, artrite reumatóide einflamação intestinal crônica) e doença auto-imune; epara alçar a contagem de sangue vermelho de um pacienteantes de cirurgia. Outros estados doentios, distúrbios eestados de irregularidade hematológica que podem sertratados por administração dos peptídeos desta invençãoincluem: beta-talassemia, fibrose cística, gravidez edistúrbios menstruais, anemia precoce de prematuridade,traumatismo de medula espinhal, vôo espacial, perdasangüínea aguda, envelhecimento, ataque fulminante,isquemia (ambos CNS e cardíaca); e vários estadosdoentios neoplásticos acompanhados por eritropoieseanormal.
Em outras incorporações, os compostos peptídicos dainvenção podem ser usados para o tratamento de distúrbiosque não se caracterizam por glóbulos vermelhos baixos oudeficientes, por exemplo, como um pré-tratamento antes detransfusões. Além disso, administração dos compostosdesta invenção pode resultar em uma diminuição do tempode sangramento e assim, encontrará uso na administraçãoem pacientes antes de cirurgia ou para indicações nasquais se espera que ocorra sangramento. Além disso, oscompostos desta invenção encontrarão uso na ativação demegacariócitos.
Uma vez que EPO mostrou um efeito mitogênico equimiotáctico em células endoteliais vasculares assimcomo um efeito nos neurônios colinérgicos centrais [vide,por exemplo, Amagnostou, et al. (1990) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 87:5978-5982 e Konishi, et al. (1993) Brain Res.609:29-35], os compostos desta invenção encontrarão usono tratamento de uma variedade de distúrbios vasculares,tais como: promoção de cura de ferimento, promoção decrescimento de vasos sangüíneos coronários colaterais(tais como aqueles que podem ocorrer após infarto demiocárdio), tratamento de trauma, e tratamento de enxertopós-vascular. Os compostos desta invenção tambémencontrarão uso no tratamento de uma variedade dedistúrbios neurológicos, caracterizados, geralmente, porbaixos níveis absolutos de acetilcolina ou níveisrelativamente baixos de acetilcolina quando comparados aoutras substâncias neuro-ativas, por exemplo,neurotransmissores.
Composições farmacêuticas:
Em ainda outro aspecto da invenção presente, são providascomposições farmacêuticas dos compostos peptídicosagonistas de EPO-R. Condições aliviadas ou moduladas pelaadministração de tais compostos incluem aquelas acimaindicadas. Tais composições farmacêuticas podem ser paraadministração por vias administração oral, parenteral(injeção intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV)ou sub-cutânea), transdérmica (ou passivamente ou usandoiontoforese ou eletroporação), transmucosal (nasal,vaginal, retal, ou sublingual) ou usando insertos bio-corrosíveis e podem ser formuladas em formas de dosagensapropriadas para cada via de administração. Em geral, apresente invenção abrange composições farmacêuticascompreendendo quantidades eficazes de um peptídeoagonista de EPO-R, ou produtos derivados, da invençãojuntamente com diluentes, preservativos, solubilizantes,emulsificantes, adjuvantes e/ou veículosfarmaceuticamente aceitáveis. Tais composições incluemdiluentes de vários conteúdos de tampões (por exemplo,Tris-HCl, acetato, fosfato), pH e força iônica; aditivostais como detergentes e agentes solubilizantes (porexemplo, TWEEN 20, TWEEN 80, Polissorbato 80),antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico,metabissulfito de sódio), preservativos (por exemplo,timersol, álcool benzílico) e substâncias avultantes (porexemplo, Iactose, manitol); a incorporação do material empreparações particuladas de compostos poliméricos taiscomo ácido polilático, ácido poliglicólico, etc., ou emlipossomos. O ácido hilaurônico também pode ser usado.
Tais composições podem influenciar o estado físico,estabilidade, taxa de liberação in vivo, e taxa dedepuração in vivo das proteínas e derivados presentes.Vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences,18â Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)páginas 1435-1712 que se incorporam aqui por referência.
As composições podem ser preparadas na forma líquida, oupodem estar na forma de pó seco (por exemplo,liofilizada).
Liberação oral:
Considera-se para uso aqui formas sólidas de dosagemoral, que estão descritas, geralmente, em Remington'sPharmaceutical Sciences, 18â Ed. 1990 (Mack PublishingCo., Easton, PA 18042) no capítulo 89, que se incorporaaqui por referência. Formas sólidas de dosagem incluemcomprimidos, cápsulas, pílulas, trociscos, discos,pelotas, pós ou grânulos. Igualmente, encapsulação lipossomal ou proteinóide pode ser usada para formular ascomposições presentes (como, por exemplo, micro-esferasproteinóides mencionadas na patente U.S. n9 4.925.673).
Encapsulação lipossomal pode ser usada e os lipossomospodem ser derivados de vários polímeros (por exemplo,patente U.S. n2 5.013.556). Uma descrição de formassólidas de dosagem possíveis para uso terapêutico é dadapor Marshall, K. em: "Modern Pharmaceutics" editado porG.S. Banker e C. T. Rhodes, capítulo 10, 1979,incorporado aqui por referência. Em geral, a formulaçãoincluirá os peptídeos agonistas de EPO-R (ou formasquimicamente modificadas dos mesmos) e ingredientesinertes que permitem proteção contra o ambienteestomacal, e liberação do material biologicamente ativono intestino.
Considera-se também para uso aqui as formas líquidas dedosagem para administração oral, incluindo emulsões,soluções, suspensões e xaropes farmaceuticamenteaceitáveis, que podem conter outros componentes incluindodiluentes inertes; adjuvantes tais como agentesumectantes, emulsificantes e agentes de suspensão; eadoçantes, flavorizantes e agentes aromatizantes.
Os peptideos podem ser modificados quimicamente de modoque a liberação oral do derivado seja eficaz. Geralmente,a modificação química compreende a ligação de pelo menosuma porção da própria molécula componente, onde a ditaporção permite (a) inibição de proteólise; e (b) captaçãona corrente sangüínea do estômago ou do intestino.
Deseja-se também aumentar a estabilidade global docomponente ou componentes e o aumento do tempo decirculação no corpo. Tal como discutido acima, aPEGlicosilação é uma modificação química preferida parauso farmacêutico. Outras porções que podem ser usadasincluem: propileno glicol, copolímeros de etileno glicole propileno glicol, carboximetil-celulose, dextrana,poli(álcool vinílico), polivinilpirrolidona, poliprolina,poli-1,3-dioxolano e poli-1,3,6-tioxocano [vide, porexemplo, Abuchowski e Davis (1981) "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", em Enzymes as Drugs, Hocenberg eRoberts, eds. (Wiley-Interscience: Nova Iorque, NY)páginas 367-383; e Newmark, et al. (1982) J. Appl.Biochem. 4:185-189].
Para formulações orais, o local de liberação pode ser oestômago, o intestino delgado (o duodeno, o jejuno, ou oíleo), ou o intestino grosso. Aqueles treinados natécnica têm formulações disponíveis que não dissolverãono estômago, liberarão o material ainda no duodeno ou emoutro lugar do intestino. Preferivelmente, a liberaçãoevitará os efeitos danosos do ambiente estomacal, querpor proteção do peptídeo (ou derivado) quer pelaliberação do peptídeo (ou derivado) além do ambienteestomacal, tal como no intestino.
Para garantir resistência gástrica completa é essencialum revestimento impermeável em pH de pelo menos 5,0.
Exemplos de ingredientes inertes mais comuns que sãousados como revestimentos entéricos estão o trimelitatoacetato de celulose (CAT), ftalato de hidroxipropil-metil-celulose (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato depoliacetato de vinila (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric,ftalato de acetato de celulose (CAP), Eudragit L,Eudragit S e Shellac. Estes revestimentos podem serusados como películas mistas.
Um revestimento ou uma mistura de revestimentos tambémpode ser usado em comprimidos, que não têm intenção deproteção contra o estômago. Isto pode incluirrevestimentos com açúcar, ou revestimentos que tornam ocomprimido mais fácil de deglutir. Cápsulas podemconsistir de um invólucro duro (tal como gelatina) paraliberação de terapêutico seco (isto é, pó) , para asformas líquidas poderá ser usada uma gelatina mole. 0material de invólucro de discos deve ser amido denso ououtro papel comestível. Para pílulas, comprimidos ediscos moldados ou comprimidos triturados, técnicas deaglutinação úmida podem ser usadas.
0 peptídeo (ou derivado) pode ser incluído na formulaçãocomo multi-particulados finos na forma de grânulos oupelotas de tamanho de partícula de cerca de 1 mm. Aformulação do material para administração em casulas podeser também como pó, tarugos levemente comprimidos, oumesmo como comprimidos. Estes terapêuticos devem serpreparados por compressão.
Corantes e/ou agentes flavorizantes também podem serincluídos. Por exemplo, o peptídeo (ou derivado) pode serformulado (tal como por encapsulação de micro-esferas oulipossomos) e depois ainda contido num produtocomestível, tal como uma bebida refrigerante contendocorantes e agentes flavorizantes.
É possível diluir ou aumentar o volume do peptídeo (ouderivado) com um material inerte. Estes diluente podemincluir carboidratos, especialmente manitol, a-lactose,lactose anidro, celulose, sacarose, dextranas modificadase amido. Determinados sais inorgânicos também podem serusados como cargas incluindo trifosfato de cálcio,carbonato de magnésio e cloreto de sódio. Algunsdiluentes obteníveis comercialmente são Fast-Flo, Emdex,STA-Rx 1500, Emcompress e Avicell.
Desintegrantes podem ser incluídos na formulação doterapêutico numa forma sólida de dosagem. Materiaisusados como desintegrantes incluem, mas não se limitam aamido, incluindo o desintegrante comercial baseado emamido, "Explotab". Glicolato de amido de sódio,Amberlite, carboximetil-celulose de sódio,ultramilopectina, alginato de sódio, gelatina, casca delaranja, carboximetil-celulose ácida, esponja natural ebentonita podem ser todos usados. Os desintegrantes podemser também resinas de troca catiônica insolúveis. Gomaspulverizadas podem ser usadas como desintegrantes e comoaglutinantes, e podem incluir gomas pulverizadas taiscomo ágar, Karaia e tragacanto. Ácido algínico e seu salde sódio também são úteis como desintegrantes.
Aglutinantes podem ser usados para manter o agentepeptídico (ou derivado) unido para formar um comprimidoduro e incluem materiais de produtos naturais tais comoacácia, tragacanto, amido e gelatina. Outros incluemmeti1-celulose (MC), etil-celulose (EC) e carboximetil-celulose (CMC). Polivinilpirrolidona (PVP) ehidroxipropil-metil-celulose (HPMC) podem ser ambosusados em soluções alcoólicas para granular o peptídeo(ou derivado).
Um agente anti-atrito pode ser incluído na formulação dopeptídeo (ou derivado) para impedir pegajosidade duranteo processo de formulação. Lubrificantes podem ser usadoscomo uma camada entre o peptídeo (ou derivado) e a paredede molde, e estes podem incluir, mas não se limitam a:ácido esteárico incluindo seus sais de magnésio e cálcio,politetrafluoroetileno (PTFE) , parafina líquida, ceras eóleos vegetais. Lubrificantes solúveis também podem serusados tais como lauril sulfato de sódio, lauril sulfatode magnésio, polietileno glicol de vários pesosmoleculares, Carbowax 4000 e 6000.
Deslizantes que devem melhorar as propriedades de fluxodo fármaco durante formulação e auxiliar no rearranjodurante a compressão devem ser adicionados. Osdeslizantes podem incluir amido, talco, sílica pirogênicae silicoaluminato hidratado.
Para auxiliar a dissolução do peptídeo (ou derivado) emmeio aquoso deve-se adicionar um surfactante como agenteumectante. Os surfactantes podem incluir detergentesaniônicos tais como lauril sulfato de sódio, dioctilsulfossuccinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio.
Detergentes catiônicos devem ser usados e podem incluircloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetômio. A listade detergentes não iônicos potenciais que podem serincluídos na formulação como surfactantes sãoLauromacrogol 400, estearato de polioxila 40, óleo derícino hidrogenado de poli(óxido de etileno) 10, 50 e 60,monoestearato de glicerol, polissorbato 20, 40, 60, 65 e80, éster de ácido graxo de sacarose, metil-celulose ecarboximetil-celulose. Estes surfactantes devem estarpresentes na formulação da proteína ou derivado quersozinhos quer como uma mistura em proporções diferentes.
Os aditivos que acentuam potencialmente captação dopeptídeo (ou derivado) são, por exemplo, ácidos graxoscomo ácido oléico, ácido linoleico e ácido linolênico.
Formulações orais de liberação controlada podem serdesejáveis. 0 peptídeo (ou derivado) deve ser incorporadoem uma matriz inerte que permita liberar ou por difusãoou por mecanismos de lixiviação, por exemplo, gomas.
Matrizes degenerando lentamente também podem serincorporadas na formulação. Alguns revestimentosentéricos possuem também efeito de liberação atrasada.Outra forma de uma liberação controlada é por um métodobaseado no sistema terapêutico OROS (Alza Corp.), isto é,o fármaco é encerrado numa membrana semipermeável quepermite que a água entre e empurre o fármaco para foraatravés de uma única abertura pequena devido aos efeitososmóticos.
Outros revestimentos podem ser usados para a formulação.Estes incluem uma variedade de açúcares que devem seraplicados num tanque de revestimento. 0 peptídeo (ouderivado) pode ser fornecido também em um comprimidorevestido por película e os materiais usados neste casosão divididos em 2 grupos. 0 primeiro grupo têmmateriais não entéricos e incluem metil-celulose, etil-celulose, hidroxi-etil-celulose, metil-hidroxi-etil-celulose, hidroxipropil-celulose, hidroxipropil-metil-celulose, carboximetil-celulose sódica, providona e ospolietileno glicóis. 0 segundo grupo consiste demateriais entéricos que, comumente, são ésteres de ácidoftálico.
Uma mistura de materiais deve ser usada para prover orevestimento pelicular ótimo. 0 revestimento pelicularpode ser executado num tanque de revestimento ou em umleito fluidizado ou por revestimento por compressão.Liberação parenteral:
Preparações de acordo com esta invenção paraadministração parenteral incluem soluções aquosasestéreis ou soluções não-aquosas, suspensões ou emulsões.
Exemplos de veículos ou solventes não aquosos sãopropileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais,tais como óleo de oliva e óleo de milho, gelatina, eésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila.
Tais formas de dosagem contêm também adjuvantes tais comoagentes preservativos, umectantes, emulsificantes edispersantes. Elas podem ser esterilizadas, por exemplo,por filtração através de filtro retentor de bactéria,incorporando agentes esterilizadores nas composições,irradiando as composições, ou aquecendo as composições.Elas podem ser manufaturadas também usando água estéril,ou algum outro meio injetável estéril, imediatamenteantes do uso.
Liberação retal ou vaginal:
Composições para administração retal ou vaginal são,preferivelmente, supositórios que podem conter, além dasubstância ativa, excipientes tais como manteiga de cacauou uma cera para supositório. Composições paraadministração nasal ou sublingual também são preparadascom excipientes padronizados bem conhecidos na técnica.
Liberação pulmonar:
Inclui-se aqui também a liberação pulmonar dos peptídeos(ou derivados) agonistas de EPO-R. 0 peptídeo (ouderivado) é liberado nos pulmões de um mamífero porinalação e atravessa a camada epitelial pulmonar para acorrente sangüínea [vide, Adjei, et al. (1990)Pharmaceutical Research 7:565-569; Adjei, et al. (1990)Int. J. Pharmaceutics 63:135-144 (acetato leuprólido);Braquet, et al. (1989) J. Cardiovascular Pharmacology13(sup. 5) :143-146(endotelina-1); Hubbard, et al. (1989)Annals of Internai Medicine, Vol. III, páginas 206-212 (a1-antitripsina); Smith, et al. (1989) J. Clin. Invest.84:1145-1146 (α-1-proteinase); Oswein, et al. (1990)
"Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium onRespiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado (hormôniode crescimento recombinante); Debs, et al. (1988) J.Immunol. 140:3482-3488 (interferon-γ e fator α de necrosede tumor); e patente U.S. na 5.284.656 para Platz, et al.(fator estimulador de colônia de granulócito)]. Descreve-se um método e uma composição para liberação pulmonar defármacos para efeito sistêmico na patente U.S. n25.451.569 para Wong, et al.
Incluem-se para uso na prática desta invenção uma amplafaixa de dispositivos mecânicos projetados para liberaçãopulmonar de produtos terapêuticos, incluindo mas nãolimitados a nebulizadores, inaladores de dose medida, einaladores de pós, todos os quais são familiares daquelestreinados na técnica. Alguns exemplos específicos dedispositivos obteníveis comercialmente apropriados para aprática desta invenção são o nebulizador ULTRAVENT(Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO); o nebulizador ACORNII (Marquest Medicai Products, Englewood, CO); o inaladorde dose medida VENTOLIN (Glaxo Inc., Research TrianglePark, NC); e o inalador de pós SPINHALER (Fisons Corp.,Bedford, MA).
Todos tais dispositivos requerem o uso de formulaçõesapropriadas para a administração de peptídeo (ouderivado). Tipicamente, cada formulação é específica parao tipo de dispositivo empregado e pode envolver o uso deum material propelente apropriado, além dos diluentes,adjuvantes e/ou transportadores usuais úteis em terapia.Igualmente, inclui-se o uso de lipossomos, micro-cápsulasou micro-esferas, complexos de inclusão, ou outros tiposde transportadores. Peptídeos modificados quimicamentetambém podem ser preparados em formulações diferentesdependendo do tipo de modificação química ou do tipo dedispositivo empregado.
Formulações apropriadas para uso com um nebulizador, quera jato ou ultra-sônico, compreendem tipicamente opeptídeo (ou derivado) dissolvido em água em umaconcentração de cerca de 0,1 a 2 5 mg de proteínabiologicamente ativa por mL de solução. A formulação podeincluir também um tampão e um açúcar simples (porexemplo, para estabilização e regulação de pressãoosmótica de proteína). A formulação para o nebulizadorpode conter também um surfactante, para reduzir ouimpedir agregação superficial induzida do peptídeo (ouderivado) causada por atomização da solução na formaçãodo aerossol.
Formulações para uso em um inalador de dose controladacompreenderão, geralmente, um pó finamente divididocontendo o peptídeo (ou derivado) suspenso num propelentecom a ajuda de um surfactante. 0 propelente pode serqualquer material convencional usado para este propósito,tal como um clorof luorocarboneto, umhidroclorofluorocarboneto, um hidrofluorocarboneto, ou umhidrocarboneto, incluindo triclorofluorometano,diclorofluorometano, diclorotetrafluoretanol, e 1,1,1,2-tetrafluoroetano, ou combinações dos mesmos. Ossurfactantes apropriados incluem lecitina de soja etrioleato de sorbitan. O ácido oléico também pode serútil como um surfactante.
Formulações para administração a partir de um dispositivoinalador para pó compreenderão pó seco finamente divididocontendo o peptídeo (ou derivado) e pode incluir tambémum agente de avultamento, tal como lactose, sorbitol,sacarose, ou manitol em quantidades que facilitem adispersão do pó pelo dispositivo, por exemplo, 50 a 90%em peso da formulação. O peptídeo (ou derivado) deve sermuitíssimo vantajosamente preparado em forma particuladacom um tamanho médio de partícula menor que 10 mm (oumícrons) , mais preferivelmente de 0,5 a 5 mm, paraliberação mais eficaz para o pulmão distai.Liberação nasal:
Inclui-se também liberação nasal dos peptídeos (ouderivados) agonistas de EPO-R. A liberação nasal permitea passagem do peptídeo para a corrente sangüíneadiretamente após administrar o produto terapêutico nonariz, sem a necessidade de deposição do produto nopulmão. Formulações para liberação nasal incluem aquelascom dextrana ou ciclo-dextrana.
Outras formas de penetração melhoradas usadas parafacilitar a liberação nasal também são contempladas parauso com os peptídeos da presente invenção (tais comoàquelas descritas nos pedido de patente internacional No.WO 20040-56314, depositado em 17 de dezembro de 2003,incorporado aqui por referência em sua íntegra).Dosagens:
Para todos os compostos peptídicos, são conduzidosestudos adicionais, informações emergirão com relação aosníveis de dosagem apropriados para tratamento de váriascondições em vários pacientes, e os técnicos treinadoscomumente, considerando o contexto terapêutico, idade, esaúde geral do recipiente, serão capazes de determinar adosagem apropriada. A dosagem selecionada depende doefeito terapêutico desejado, da via de administração, eda duração do tratamento desejado. Geralmente, os níveisde dosagem de 0,001 a 10 mg/kg de peso corporal sãoadministrados diariamente a mamíferos. Geralmente, parainjeção intravenosa ou infusão a dosagem pode ser menor.
Em determinadas configurações, qualquer um dos peptídeosda presente invenção pode ser utilizado para tratarindivíduos com falha renal antes da diálise ou durante adiálise (pacientes em pré-diálise ou em diálise). A faixade dosagem terapêutica desta configuração pode ser de0,025 a 0,2 miligramas (mg) do composto por 1 quilograma(kg) do peso do corpo do indivíduo (0,025-0,02 mg/kg).
Mais particularmente, a faixa da dose de 0,05-0,1 mg/kgseria preferida. Além disso, um médico pode usar,inicialmente, dosagens escalonadas, iniciando em 0,025mg/kg e, então, titulações de dosagem de aproximadamente0,025 mg/kg incrementadas, para cada indivíduo emtratamento, com base em sua resposta da hemoglobinaindividual. Assim, o medido pode titular a dosagem paracada indivíduo até uma resposta da hemoglobina adequadaser conseguida. No caso de indivíduos que estão em pré-diálise ou pacientes em diálise, a resposta dehemoglobina adequada conseguiria, aproximadamente, níveisnormais de hemoglobina (14-15 g/dL) ou um outro nível dehemoglobina como determinado pelo médico. Nestaconfiguração, a dose farmacologicamente ativa (PAD) paracada indivíduo em pré-diálise ou paciente em diálise éesperada como sendo de 0,067-0,075 mg/kg. Uma vantagemdesta configuração é esperada por ter uma freqüência dedosagem inferior uma vez a cada três a quatro semanaspara cada paciente individualmente ao invés desemanalmente como é no caso de outros agentesestimulantes da eritropoiese (ESAs). Muitas vias deadministração podem ser usadas (oral, IV, etc., comodescrito acima). Uma via de administração preferida parapacientes em diálise seria a intravenosa. Uma viapreferida de administração para pacientes em pré-diáliseseria a subcutânea. Em outras configurações, um doscompostos descritos acima pode ser utilizado para tratarindivíduos com anemia associada com malignidades(pacientes oncológicos). As faixas de doses terapêuticasnesta configuração são esperadas como sendo de três acinco vezes na faixa para pacientes em pré-diálise oupacientes em diálise (ou seja, 0,075-0,5 mg/kg). Maisparticularmente, a faixa de dose de 0,2-0,4 mg/kg seriapreferida. Como acima, o médico tratando de pacientes naoncologia pode titular a dosagem, iniciando em 0,075mg/kg, e aumentar em 0,075 mg/kg desenvolvendo até umaresposta adequada da hemoglobina ser conseguida. 0 PAD decada indivíduo paciente da oncologia é esperado comosendo de aproximadamente 0,2 5 mg/kg. Novamente, avantagem de dosagens freqüentes menores a cada três -quatro semanas é esperada para cada um dos pacientesindividualmente. Além disso, outras vantagens para ospacientes da oncologia é que a dosagem pode seradministrada antes da quimioterapia (por exemplo, 3-5dias antes) ou co-administrada com a quimioterapia paraprevenir o declínio da hemoglobina durante a fase de Iagentre o estimulo do reticulócito e o alcance dahemoglobina. Muitas vias de administração podem serutilizadas (oral, IV, etc., como descrito acima). Aadministração subcutânea seria uma via preferida deadministração para os pacientes da oncologia. Oscompostos preferidos para uso no tratamento de pacientesem pré-diálise, em diálise, ou pacientes da oncologiaincluem àqueles mostrados a seguir:
Ligação de carbamato, sem sarcosina, e com a faixa depeso de PEG (aqui mostrando a SEQ.ID.NO:1):
<formula>formula see original document page 81</formula>
Ligação de carbamato, sem sarcosina, e pesos preferidosde PEG (aqui mostrando a SEQ.ID.NO:1):
<formula>formula see original document page 81</formula><formula>formula see original document page 82</formula><formula>formula see original document page 83</formula>
Ligação de carbamato, com sarcosina e com a faixa de pesode PEG (aqui mostrando a SEQ.ID.NO:2):
<formula>formula see original document page 83</formula>
Ligação de carbamato, com sarcosina, e pesos preferidosde PEG (aqui mostrando a SEQ.ID.NO:2):
<formula>formula see original document page 83</formula><formula>formula see original document page 84</formula><formula>formula see original document page 85</formula>
Ligação de amida, sem sarcosina, e os pesos preferidos dePEG (aqui mostrando a SEQ.ID.NO:1):
<formula>formula see original document page 85</formula>
Ligação de amida, sem sarcosina, e os pesos preferidos dePEG (aqui mostrando a SEQ.ID.NO:1):
<formula>formula see original document page 85</formula><formula>formula see original document page 86</formula><formula>formula see original document page 87</formula>
Ligação de amida, com sarcosina, e os pesos de PEG (aquimostrando a SEQ.ID.NO:2):
<formula>formula see original document page 87</formula>
Ligação de amida, sarcosina, e os pesos preferidos de PEG(aqui mostrando a SEQ.ID.NO:2):
<formula>formula see original document page 87</formula><formula>formula see original document page 88</formula><formula>formula see original document page 89</formula>
Os peptídeos da presente invenção (ou seus derivados)podem ser administrados em conjunto com um ou maisingredientes ativos adicionais ou composiçõesfarmacêuticas.
EXEMPLOS
A presente invenção é descrita a seguir por meio dosexemplos que se seguem. Contudo, o uso destes e de outrosexemplos em qualquer lugar do pedido de patente éilustrativo apenas, e de forma alguma limita o escopo e osignificado da invenção ou qualquer forma exemplificada.
Além disso, a invenção não está limitada a qualquerconfiguração particular preferida aqui descrita. Aocontrário, muitas modificações e variações da invençãoserão aparentes aos técnicos no assunto durante a leiturado relatório descritivo, e podem se feitas sem fugir doespírito e do escopo da invenção. A invenção é dessemodo, limitado apenas aos termos das reivindicaçõesanexas, com as quais o escopo completo de equivalentesaos quais as reivindicações são dirigidas.
Exemplo 1: Síntese do dímero peptídico agonista de EPO-Rpor síntese em fase sólida.
Etapa 1- Síntese de Cbz-TAP: Uma solução contendo adiamina obtenível comercialmente ("TAP" de AldrichChemical Co.) (10 g, 67,47 mmol) em DCM anidro (100 mL)foi resfriada a 0°C. Adicionou-se lentamente uma soluçãode cloroformato de benzila (4,82 mL, 33,7 mmol) em DCManidro (50 mL) através de um funil de decantação por umperíodo de 6-7 horas, mantendo do princípio ao fim atemperatura da mistura reagente em 0°C, depois aquecendoaté a temperatura ambiente (-2 5°C). Após mais 16 horas, oDCM foi removido a vácuo e o resíduo dividido entre HCl3N e éter. As camadas aquosas foram coletadas eneutralizadas com NaOH aquoso a 50% até pH 8-9 eextraídas com acetato de etila. A camada de acetato deetila foi seca em Na2SO4 anidro, depois concentrada avácuo para prover o mono-Cbz-TAP bruto (5 g, rendimentode cerca de 50%). Este composto foi usado para a reação
<formula>formula see original document page 90</formula>
seguinte sem qualquer purificação adicional.
Etapa 2- Síntese de Cbz-TAP-Boc: A uma suspensão agitada15 vigorosamente de Cbz-TAP (5 g, 17,7 mmol) em hexano (25mL) adicionou-se Boc2O (3,86 g, 17,7 mmol) e a agitaçãocontinuou em temperatura ambiente de um dia para outro. Amistura reagente foi diluída com DCM (25 mL) e lavada comsolução aquosa de ácido cítrico a 10% (2 vezes), água (2vezes) e salmoura. A camada orgânica foi seca em Na2SO4anidro e concentrada a vácuo. 0 produto bruto (5 g) foiusado diretamente na reação seguinte.
<formula>formula see original document page 90</formula>
Etapa 3- Síntese de Boc-TAP: 0 produto bruto da reaçãoanterior foi dissolvido em metanol (25 mL) e hidrogenadona presença de 5% de Pd em carbono (5% em peso) sobpressão de balão por 16 horas. A mistura foi filtrada,lavada com metanol e o filtrado concentrado a vácuo paraprover o produto bruto H-TAP-Boc (3,7 g) . 0 rendimentototal aproximado de Boc-TAP após as etapas 1-3 foi de 44%(calculado baseado na quantidade usada de Cbz-Cl).<formula>formula see original document page 91</formula>
Etapa 4- Síntese de TentaGel-Ligante: Brometo de TentaGel(2,5 g, 0,48 mmol/g, de Rapp Polymere, Alemanha), ligantefenólico (5 equivalentes), e K2CO3 (5 equivalentes) foramaquecidos em 20 mL de DMF a 70°C por 14 horas. Apósresfriamento até a temperatura ambiente, a resina foilavada (HCl 0,1 N, água, ACN, DMF, MeOH) e seca em umaresina de cor âmbar.
Etapa 5- Síntese de TentaGel-Iigante-TAP(Boc): 2,5 gramasda resina acima e H-TAP-Boc (1,5 g, 5 equivalentes) eAcOH glacial (34 pL, 5 equivalentes) foram juntados numamistura de MeOH-THF 1:1 e mexidos de um dia para outro.
Adicionou-se a esta uma solução 1 M de cianoboro-hidretode sódio (5 equivalentes) em THF e mexeu-se por outras 7horas. A resina foi filtrada, lavada (DMF, THF, HCl 0,1N, água, MeOH) e seca. Uma pequena quantidade da resinafoi benzoilada com Bz-Cl e DIEA em DCM e clivada com 70%de TFA-DCM e verificada por LCMS e HPLC.
Etapa 6- Síntese de TentaGel-Iigante-TAP-Lys: A resinaacima foi tratada com uma solução ativada de Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (preparada a partir de 5 equivalentes deaminoácido e 5 equivalentes de HATU dissolvido em 0,5 Mem DMF, seguido pela adição de 10 equivalentes de DIEA) emexida suavemente por 14 horas. A resina foi lavada (DMF,THF, DCM, MeOH) e seca para produzir a resina protegida.Grupos amina residuais foram capeados tratando a resinacom uma solução de 10% de anidrido acético, 20% depiridina em DMC por 2 0 minutos, seguido por lavagem talcomo acima. Os grupos Fmoc são removidos mexendosuavemente a resina em 30% de piperidina em DMF por 2 0minutos, seguido por lavagem (DMF, THF, DCM, MeOH) esecagem.
<formula>formula see original document page 92</formula>
Etapa 7- Síntese de TentaGel-Iigante-TAP-Lys(peptídeo)2:
A resina acima foi submetida a ciclos repetidos deacoplamentos de aminoácido-Fmoc com ativação de HBTU/HOBte remoção de Fmoc com piperidina para formarsimultaneamente ambas as cadeias peptídicas. Isto foiexecutado convenientemente num sintetizador peptídicoautomatizado ABI 433 obtenível de Applied Biosystems,Inc. Após remoção final de Fmoc, os grupos aminaterminais foram acilados com anidrido acético (10equivalentes) e DIEA (20 equivalentes) em DMF por 2 0minutos, seguido por lavagem tal como acima.
<formula>formula see original document page 92</formula>
Etapa 8- Clivagem de resina: A resina acima foi suspensanuma solução de TFA (82,5%), fenol (5%), etanoditiol(2,5%), água (5%), e tioanisol (5%) por 3 horas emtemperatura ambiente. Coquetéis alternativos de clivagemtal como TFA (95%), água (2,5%), e tri-isopropil-silano(2,5%) também podem ser usados. A solução de TFA éresfriada a 5°C e vertida em Et2O para precipitar opeptídeo. Filtração e secagem sob pressão reduzida deramo peptídeo desejado. Purificação via HPLC preparativa comuma coluna C18 propiciou o peptídeo puro.
<formula>formula see original document page 92</formula>
Etapa 9 - Oxidação de peptídeos para formar ligaçõesdissulfeto intramoleculares:
O dímero peptídico foi dissolvido em 2 0% de DMSO/água (1mg de peptídeo em peso seco/mL) e permitiu-se permanecerem temperatura ambiente por 3 6 horas. O peptídeo foipurificado carregando a mistura de reação sobre umacoluna de HPLC C18 (Waters Delta-Pak C18, tamanho departícula 15 mícrons, tamanho de poro de 3 00 angstroms,40 mm χ 2 00 mm de comprimento) , seguido por um gradientelinear de ACN/água/0,1% de TFA de 5 a 95% de ACN durante40 minutos. A liofilização das frações contendo opeptídeo desejado propicia o produto como um sólidobranco leve.
<formula>formula see original document page 92</formula>
ETAPA 10 - Polietilenoglicosilação de um grupo NH2terminal: PEGlicosilação via ligação de carbamato: 0dímero peptídico foi misturado com 1,5 equivalente (basemolar) de espécie PEG ativado (mPEG-NPC de NOF Corp.Japão) em DMF seco para propiciar uma solução límpida.
Após 5 minutos 4 equivalentes de DIEA foram adicionados àsolução acima. A mistura foi agitada em temperaturaambiente por 14 horas, seguido por purificação com HPLCde fase reversa na C18.
A estrutura de peptídeo PEGlicosado foi confirmada pormassa MALDI. 0 peptídeo purificado foi também submetido àpurificação através de cromatografia de troca iônica decátion tal como descrito abaixo. 0 esquema abaixo mostraPEGlicosilação de mPEG-NPC usando a SEQ.ID.N0:3.
<formula>formula see original document page 94</formula>
PEGlicosilação via ligação de amida: 0 dímero peptídicofoi misturado com 1,5 equivalente (base molar) de 1equivalente de espécie PEG ativado (PEG-SPA-NHS daShearwater Corp., USA) em DMF seco para propiciar umasolução límpida. Após 5 minutos 10 equivalentes de DIEAforam adicionados à solução acima. A mistura foi agitadaem temperatura ambiente por 2 horas, seguido porpurificação com HPLC de fase reversa na C18. A estruturade peptídeo PEGlicosado foi confirmada por massa MALDI. 0peptídeo purificado também foi submetido à purificaçãoatravés de cromatografia de troca iônica de cátion talcomo descrito abaixo. 0 esquema abaixo mostra aPEGlicosilação de PEG-SPA-NHS usando a SEQ.ID.N0:3.<formula>formula see original document page 95</formula>
Etapa 11 - Purificação por troca iônica:
Diversos suportes de troca foram examinados por suacapacidade de separar o conjugado peptídeo-PEG acima apartir de PEG não-reagido (ou hidrolisado) , além de suacapacidade de reter os peptídeos diméricos iniciais. Aresina de troca iônica (2-3 g) foi carregada em umacoluna de 1 cm, seguido por conversão à forma sódio (NaOH0,2 N carregado sobre coluna até que o eluente fosse pH14, ca. 5 volumes de coluna), e depois para a formahidrogênio (eluído ou com HCl 0,1 N ou com HOAc 0,1 M atépH de carga ajustada de eluente, ca. 5 volumes decoluna), seguido por lavagem com 2 5% de ACN/água até pH6. Dissolveu-se ou o peptídeo antes da conjugação ou oconjugado peptídeo-PEG em 25% de ACN/água (10 mg/mL) e opH ajustado para <3, com TFA e depois carregado nacoluna. Após lavagem com 2-3 volumes de coluna de 2 5% deACN/água e coleta de frações de 5 mL, o peptídeo foiliberado da coluna por eluição com NH4OAc 0,1 M em 25% deACN/água, coletando novamente frações de 5 mL. A análisevia HPLC revelou que as frações continham o peptídeodesejado. Análise com o detector de espalhamento de luzevaporativa (ELSD), indicou que quando o peptídeo foiretido na coluna e foi eluído com a solução de NH4OAc(geralmente entre frações 4 e 10), não se observou nenhumPEG não conjugado como um contaminante. Quando o peptídeoeluiu no tampão de lavagem inicial (geralmente asprimeiras 2 frações), não se observou nenhuma separaçãode PEG de conjugado e nenhum excesso de PEG.
As colunas seguintes retiveram com sucesso tanto opeptídeo como o conjugado peptídeo-PEG, e purificou comsucesso o conjugado peptídeo-PEG do peptídeo nãoconjugado:
Tabela 1: Resinas de troca iônica
<table>table see original document page 96</column></row><table>
Exemplo 2: Síntese dos dímeros peptídicos agonistas deEPO-R por condensação de fragmento.
Etapa 1 - Síntese de (Cbz)2-Lis: Lisina é reagida sob15 condições padrões com uma solução de cloroformato debenzila para obter a lisina protegida e seus dois gruposamino com um grupo Cbz.
Etapa 2 - Síntese de Boc-TAP: Boc-TAP é sintetizado comodescrito nas etapas 1 a 3 do Exemplo 1.
20 Etapa 3 - Acoplamento de (Cbz)2-Lis e Boc-TAP: (Cbz)2-Lise Boc-TAP foram acoplados sob condições de acoplamentopadrão para obter (Cbz)2-Lis-TAP-Boc.<formula>formula see original document page 97</formula>
Etapa 4 - Lis-TAP-Boc: O produto bruto da reação prévia édissolvido em metanol (25 ml) e hidrogenado em presençade 5% de Pd em carbono (5% p/p) sob pressão de balão por16 horas. A mistura é filtrada, lavada com metanol e oconcentrado filtrado a vácuo para prover o produto Lis-TAP-Boc bruto.
<formula>formula see original document page 97</formula>
Etapa 5 - Síntese dos monômeros peptídicos porcondensação de fragmento: Quatro fragmentos de peptídeosda seqüência de monômeros peptídicos foram sintetizadospor técnicas padrões. Estes fragmentos parcialmenteprotegidos foram então submetidos a duas corridasindependentes de acoplamento. Na primeira corrida, ametade da N-terminal do monômero foi formada poracoplamento de dois dos fragmentos de peptídeos, enquantoa metade da C-terminal do monômero foi formada poracoplamento de outros dois fragmentos de peptídeos. Nasegunda rodada de acoplamento, as metades N-terminal e C-terminal são acopladas para formar o monômero protegidocompleto. 0 monômero é então OBn-desprotegido portécnicas padrões.<formula>formula see original document page 98</formula>
Etapa 6 - Oxidação dos monômeros peptídicos para formarligações bissulfeto intramoleculares: Os monômerospeptídicos condensados desprotegidos OBn (SEQ.ID.NO:12)são então oxidados com e sob iodeto para formar asligações bissulfeto intramoleculares entre os resíduos decisteína Acm-protegidos dos monômeros.
<formula>formula see original document page 98</formula>
Etapa 7 - Acoplamento de Lis-TAP-boc para os monômerosObn-desprotegidos oxidados para formar um dímeropeptídico: Lis-TAP-Boc é acoplado a 2χ excessos molaresdos monômeros OBn-desprotegidos oxidados sob condiçõespadrões para formar um dimero peptídico. O dimeropeptídico é então desprotegido sob condições padrões.
<formula>formula see original document page 99</formula>
Etapa 8 - PEGlicosilação do dimero desprotegido: 0 dimerode peptideo desprotegido é então PEGlicosilado comodescrito na Etapa 10 do Exemplo 1.
Etapa 9 - Purificação de troca iônica: 0 dimero depeptideo PEGlicolisado é então purificado como descritona Etapa 11 do Exemplo 1.
Exemplo 3: Ensaios de atividade in vitro
Este exemplo descreve vários ensaios in vitro que sãoúteis na avaliação da atividade e da potência dospeptídeos agonistas de EPO-R da invenção. Os resultadospara estes ensaios demonstram que os novos peptídeosdesta invenção se ligam ao EPO-R e ativam o sinal de EPO-R. Além disso, os resultados destes ensaios mostram queas novas composições de peptídeos apresentam um aumentosurpreendente na afinidade de ligação ao EPO-R e naatividade biológica comparado com os peptídeos miméticosde EPO que foram previamente descritos.
Os dímeros peptídicos agonistas EPO-R são preparados deacordo com os métodos providos no Exemplo 1 ou no Exemplo2. A potência destes dímeros peptídicos é avaliada usandouma série de ensaios de atividade in vitro, incluindo:ensaio repórter, um ensaio de proliferação, um ensaio deligação competitiva, e um ensaio C/BFU-e. Estes quatroensaios são descritos a seguir em detalhes.
Os resultados destes ensaios de atividade in vitro sãoresumidos na Tabela 2.
1. Ensaio repórter
Este ensaio baseia-se numa célula repórter derivada delinhagem celular pré-B de murino, Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux. Esta linhagem celular repórter expressa umreceptor quimérico compreendendo a porção extracelular doreceptor de EPO humano até a porção intracelular doreceptor de GCSF humano. Esta linhagem celular é aindatransfectada com um constructo de gene repórter deluciferase dirigida a promotor fos. A ativação destereceptor quimérico através de adição de agenteeritropoiético resulta na expressão do gene repórter deluciferase e, conseqüentemente, na produção de luz devidoà adição da luciferina substrato da luciferase. Assim, onível de ativação de EPO-R em tais células pode serquantificado através da mensuração de atividade deluciferase.
As células Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux são cultivadas em meioDMEM/F12 (Gibco) suplementado com 10% de soro bovinofetal (FBS; Hyclone), 10% de sobrenadante WEHI-3 (osobrenadante de uma cultura de células WEHI-3, ATCC #TIB-68), e penicilina/estreptomicina. Aproximadamente 18horas antes do ensaio, as células foram desnutridastransferindo — as para meio DMEM/F12 suplementado com 10%de FBS e 0,1% de sobrenadante WEHI-3. No dia do ensaio,as células são lavadas uma vez com meio DMEM/F12suplementado com 10% de FBS (nenhum sobrenadante WEHI-3),depois 1 χ IO6 células/mL são cultivadas na presença deuma concentração conhecida de peptídeo de teste, ou comEPO (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) como umcontrole positivo, em meio DMEM/F12 suplementado com 10%de FBS (nenhum sobrenadante WEHI-3). Diluições seriais dopeptídeo de teste são correntemente testadas nesteensaio. Placas de ensaio são incubadas por 4 horas a 370Cnuma atmosfera de 5% de CO2, após o que se adicionaIuciferina (Steady-Glo; Promega, Madison, WI) em cadapoço. Após 5 minutos de incubação, mede-se a emissão deluz num luminômetro Topcount Packard (Packard InstrumentCo., Downers Grove, 111). Contagens de luz são locadas emrelação à concentração de peptídeo de teste e analisadasusando um software Graph Pad. A concentração de peptídeode teste que resulta numa emissão semi-máxima de luz éregistrada como o EC50 [Vide Tabelas 2 e 3: Repórter EC5 0].
2. Ensaio de proliferação
Este ensaio baseia-se numa linhagem celular pré-B demurino, Baf3, transfectada para expressar EPO-R humano. Aproliferação da linhagem celular resultante,Baf3/Gal4/Elk/EPOR, é dependente da ativação de EPO-R. 0grau de proliferação celular é quantificado usando MTT,onde o sinal no ensaio MTT é proporcional ao número decélulas viáveis.
As células Baf3/Gal4/Elk/EPOR são cultivadas em frascoscônicos em meio DMEM/F12 (Gibco) suplementado com 10% deFBS (Hyclone) e 10% de sobrenadante WEHI-3 (ATCC # TIB-68). Células cultivadas foram desnutridas de um dia paraoutro, num frasco cônico em uma densidade celular deIxlO6 células/mL, em meio DMEM/F12 suplementado com 10%de FBS e 0,1% de sobrenadante WEHI-3. As célulasdesnutridas são então lavadas duas vezes com PBS deDulbecco (Gibco), e re-suspensas até uma densidade deIxlO6 células/mL em DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS(nenhum sobrenadante WEHI-3). Alíquotas de 50 μΕ (-50.000células) da suspensão celular são colocadas em placas, emtriplicata, em placas de ensaio de 96 poços. Alíquotas de50 μΐ; de série de diluição de peptídeos miméticos de EPOde teste, ou 50 μΙ, de EPO (R & D Systems Inc.,Minneapolis, MN) ou ARANESP™ (darbepoetina alfa, umagonista de EPO-R obtenível comercialmente de Amgen) emmeios DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS (nenhumsobrenadante WEHI-3) são adicionados em placas de ensaiode 96 poços (volume de poço final de 100 μΐ;) . Porexemplo, 12 diluições diferentes podem ser testadas ondea concentração final de peptídeo de teste (ou peptídeoEPO controle) varia de 810 pM a 0,045 pM. As célulascolocadas nas placas são então incubadas por 48 horas a370C. Em seguida, adiciona-se 10 μ]^ de MTT (RocheDiagnostics) em cada poço de placa de cultura, e depoispermite-se incubar por 4 horas. Depois a reação foiinterrompida adicionando 10% de SDS + HCl 0,01 N. Depois,as placas são incubadas de um dia para outro a 37 °C.
Mede-se por espectrofotometria a absorbância de cada poçoem um comprimento de onda de 595 nm. Gráficos dasleituras de absorbância contra concentração de peptídeode teste são construídos e calcula-se EC50 usando osoftware Graph Pad. A concentração de peptídeo de testeque resulta em uma absorbância semi-máxima é registradacomo o EC50 [Vide Tabela 3; EC50 de proliferação].
3. Ensaio de ligação competitiva
São feitos cálculos de ligação competitiva usando umensaio em que um sinal luminoso é gerado como uma funçãoda proximidade de duas contas: uma conta doadora deestreptavidina transportando um marcador de peptídeoligante de EPO-R biotinilado e uma conta aceptora que seliga a EPO-R. A luz é gerada por transferência de energianão radiativa, durante a qual um oxigênio singleto éliberado de uma primeira conta devido à iluminação, e ocontato com o oxigênio singleto liberado faz com que asegunda conta emita luz. Estes conjuntos de contas sãoobteníveis comercialmente (Packard). A proximidade deconta é gerada pela ligação do marcador de peptideoligante de EPO-R com o EPO-R. 0 peptídeo de teste quecompete com o marcador de peptídeo ligante de EPO-R paraligar com EPO-R impedirá esta ligação, causando umadiminuição na emissão luminosa.
Em mais detalhes, o método é como a seguir: Adicionar 4μΐ; de diluições seriais do peptídeo agonista de EPO-R deteste, ou controles positivos ou negativos, nos poços deuma placa de 384 poços. Depois disso, adicionar 2 μΐ,/ροςοde coquetel de receptor/conta. 0 coquetel dereceptor/conta consiste de: 15 pL de contas doadoras deestreptavidina de 5 mg/mL (Packard) , 15 μΐ, de anticorpomonoclonal abl7 9 de 5 mg/mL (este anticorpo reconhece aporção da proteína fosfatase alcalina placental humanacontida no EPO-R recombinante), contas aceptorasrevestidas com a proteína A (proteína A se ligará aoanticorpo abl79; Packard) , 112,5 μΐ, de uma diluição 1:6,6de EPO-R recombinante (produzido em células de ovário dehamster chinês como uma proteína de fusão a uma porção daproteína fosfatase alcalina placental humana que contém oepítopo alvo abl79) e 607,5 μΐ, de tampão ALPHAQUEST(HEPES 40 mM, pH 7,4; MgCl2 1 mM; 0,1% de BSA, 0,05% deBSA, 0,05% de TWEEN 20). Descobrir para misturar.
Adicionar 2 μΐι/poço do marcador peptídico de ligação EPO-R biotinilado, AF33068 (concentração final 30 nM) .AF33068, um peptídeo de ligação com EPO-R (vide Tabela 3"EC50 repórter (pM)"), é preparado de acordo com osmétodos descritos no Exemplo 1, com a seqüência Biotin-GGLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ.ID.NO:4).
<formula>formula see original document page 104</formula>
Centrifugar 1 minuto para misturar. Selar a placa comvedação de topo Packard e envolver em folha metálica.
Incubar de um dia para outro em temperatura ambiente.
Após 18 horas ler emissão luminosa usando leitorAlphaQuest (Packard). Plotar emissão luminosa versusconcentração de peptídeo e analisar com Graph Pad ouExcel.
A concentração do peptídeo de teste que resulta em umaumento de 50% na emissão luminosa, relativa àquelaobservada sem o peptídeo de teste, é registrada como IC50[vide Tabelas 2 e 3: AQ IC50].
4. Ensaio de C/BFU-e
A sinalização com EPO-R estimula a diferenciação decélulas-tronco da medula óssea em precursores deproliferação de células sangüíneas vermelhas. Este ensaiomede a capacidade de peptídeos de teste estimular aproliferação e a diferenciação de precursores de célulassangüíneas vermelhas de células-tronco pluripotentes demedula óssea humana principal.
Para este ensaio, são feitas diluições seriais depeptídeo de teste em meio IMDM (Gibco) suplementado com10% de FBS (Hyclone). Estas diluições seriais, oupeptídeo EPO de controle positivo são então adicionadosem metil-celulose para obter um volume final de 1,5 mL.Turbilhonar inteiramente a mistura de peptídeo e metil-celulose. Alíquotas (100.000 células/mL) de células CD34+derivadas de medula óssea humana (Poietics/Camcrex) sãodescongeladas. As células descongeladas são adicionadassuavemente a 0,1 mL de DNase de lmg/mL (células-tronco)em um tubo de 50 mL. Em seguida adicionam-se, suavemente,40-50 mL de meio IMDM às células: o meio é adicionadogota a gota ao longo da parede do tubo de 50 mL, nosprimeiros 10 mL, e depois, o volume restante de meio édistribuído lentamente pela parede do tubo. Em seguida,as células são giradas a 900 rpm por 20 minutos, e osmeios removidos cuidadosamente por aspiração suave. Ascélulas são re-suspensas em 1 mL de meio IMDM e faz-se acontagem da densidade celular por mL em lâmina dehemocitômetro (alíquota de 10 μL de suspensão celular nalâmina, e a densidade celular é a contagem média χ 10.000células/mL). Em seguida, as células são diluídas em meioIMDM até uma densidade celular de 15.000 células/mL.
Depois, adicionam-se 100 μL de células diluídas para cada1,5 mL de metil-celulose mais amostra de peptídeo(concentração celular final em meio de ensaio é de 1000células/ml), e a mistura é turbilhonada. Faz-sedesaparecer as bolhas na mistura, e em seguida aspira-se1 mL usando agulha de ponta obtusa. Adiciona-se 0,25 mLde mistura aspirada de cada amostra em cada conjunto de 4poços de uma placa de 24 poços (Falcon brand). Incubar asmisturas plaqueadas a 370C em 5% de CO2 em uma incubadoraúmida por 14 dias. Contar a presença de colônias deeritróides usando um microscópio de fase (objetiva de 5X-10X, ampliação final de 100X). A concentração de peptídeode teste na qual o número de colônias formadas é de 90%de máximo, em relação àquela observada com o controlepositivo de EPO, é anotada como EC90 [Vide Tabela 3:
C/BFU-e EC90].
5. Ensaio de ligação competitiva de radioligante
Um ensaio de ligação competitiva de radioligantealternativo pode também ser usado para medir valores EC50para peptídeos da presente invenção. Este ensaio mede aligação de 125I-EPO a EPOr. O ensaio é, preferivelmente,executado de acordo com o protocolo exemplar a seguir:
A. Materiais:
<table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table>
Β. Determinação de concentração apropriada de receptor:
Um pequeno frasco de 5 0 μ5 de domínio extracelular deEPOr recombinante liofilizado fundido à porção Fc de IgG-1 humana é reconstituído em 1 mL de tampão de ensaio.
Para determinar a quantidade correta de receptor parausar no ensaio, diluições seriais de 100 μΙ. destapreparação de receptor são combinados com aproximadamente20.000 cpm em 200 μΐι de eritropoietina humanarecombinante iodada (125I-EPO) em tubos de teste depolipropileno de 12 χ 75 mm. Os tubos são tampados emisturados suavemente a 4°C de um dia para outro em umagitador rotatório LabQuake.
No dia seguinte, adicionam-se 50 yL de uma pastasemifluida a 50% de Sefarose de proteína-G em cada tubo.
Em seguida, os tubos são incubados por 2 horas a 4°C,misturando suavemente. Depois, os tubos são centrifugadospor 15 minutos a 4000 rpm (3297 χ G) para transformar empelotas a Sefarose de proteína G. Os sobrenadantes sãoremovidos cuidadosamente e descartados. Após lavar 3vezes com 1 mL de tampão de ensaio a 4°C, contam-se aspelotas em um contador gama Wallac Wizard. Os resultadosforam então analisados e calculou-se a diluição requeridapara atingir 50% do valor máximo de ligação.
C. Determinação de IC50 para peptídeo
Para determinar o IC50 de um peptídeo da presenteinvenção, combinam-se diluições seriais de 100 yL dopeptídeo com 100 yL de receptor de eritropoietinarecombinante (100 pg/tubo) em tubos de teste depolipropileno de 12 χ 75 mm. Em seguida adicionam-se 100yL de eri tropoietina humana recombinante iodada (125I-EPO)em cada tubo e os tubos são fechados e misturadossuavemente a 40C de um dia para outro.
No dia seguinte, 125I-EPO ligado é quantificado tal comodescrito acima. Os resultados são analisados e calcula-seo valor IC50 usando Graphpad Prism versão 4.0, deGraphPad Software, Inc. San Diego, CA). Preferivelmente,repete-se o ensaio duas ou mais vezes para cada peptídeotestado, por um total de três ou mais determinações deIC5Q replicadas.<table>table see original document page 108</column></row><table>Exemplo 4: Ensaios da atividade in vivo:
Este exemplo descreve vários ensaios in vivo que sãoúteis para avaliar a atividade e a potência de peptídeosagonistas de EPO-R da invenção. Os monômeros e dímerospeptidicos agonistas de EPO-R são preparados de acordocom os métodos providos no Exemplo 1 ou no Exemplo 2.
Avalia-se a atividade in vivo destes monômeros e dímerospeptidicos usando ensaios em série, incluindo um bio-ensaio de camundongo ex-hipóxico policitêmico e um ensaiode reticulócito. Estes dois ensaios estão descritos maisdetalhadamente abaixo.
1. Bio-ensaio de camundongo ex-hipóxico policitêmico
Os peptídeos de teste são ensaiados para atividade invivo no bio-ensaio de camundongo ex-hipóxico policitêmicoadaptado ao método descrito por Cotes e Bangham (1961),Nature 191: 1065-1067. Este ensaio examina a capacidadede um peptídeo de teste funcionar como um mimético deEPO, isto é, ativar EPO-R e induzir nova síntese decélulas sangüíneas vermelhas. A síntese de célulassangüíneas vermelhas é quantificada baseada naincorporação de radioisótopo de ferro em hemoglobina dascélulas sangüíneas vermelhas sintetizadas.
Camundongos BDFl são aclimatados em condições ambientespor 7-10 dias. Determinam-se os pesos corpóreos de todosos animais, e os animais de peso baixo (< 15 gramas) nãosão usados. Os camundongos são submetidos a ciclos decondicionamento sucessivos em uma câmara hipobárica porum total de 14 dias. Cada ciclo de 24 horas consiste de18 horas em pressão atmosférica de 0,40 ± 0,02% e 6 horasem pressão ambiente. Após condicionamento, os camundongossão mantidos em pressão ambiente por mais 72 horas antesda dosagem.
Os peptídeos de teste, ou padrões de EPO humanorecombinante, são diluídos em PBS + 0,1% de veículo BSA(PBS/BSA). Soluções de estoque de monômero peptídico sãoprimeiramente solubilizadas em sulfóxido de dimetila(DMSO). Grupos de controle negativo incluem um grupo decamundongos injetados apenas com PBS/BSA, e um grupoinjetado com 1% de DMSO. Cada grupo de dosagem contém 10camundongos. Os camundongos são injetados subcutaneamente(nuca) com 0,5 mL da amostra apropriada.
Quarenta e oito horas após a injeção de amostra,administram-se aos camundongos uma injeçãointraperitoneal de 0,2 mL de 59Fe (Dupont, NEN) , para umadose de aproximadamente 0,75 μCuries/camundongo.
Determinam-se os pesos corpóreos dos camundongos 2 4 horasapós a administração de 59Fe, e os camundongos sãosacrificados 48 horas após a administração de 59Fe.
Coleta-se sangue de cada animal por punção cardíaca edetermina-se os hematócritos (usou-se heparina comoanticoagulante). Analisa-se cada amostra de sangue (0,2mL) para incorporação de 59Fe usando um contador gamaPackard. Os camundongos não-responsivos (isto é, aquelescamundongos com incorporações radiativas menores que a dogrupo de controle negativo) são eliminados do conjunto dedados apropriados. Os camundongos que têm valores dehematócrito menores que 53% do grupo de controle negativotambém são eliminados.
Os resultados são derivados de conjuntos de 10 animaispara cada dose experimental. Calcula-se a quantidademédia de radioat ividade incorporada [contagens por minuto(CPM)] em amostras de sangue de cada grupo.
2. Ensaio de reticulócito
Camundongos BDFl normais são dosados (0,5 mL, injetadosubcutaneamente) em três dias consecutivos ou comcontrole de EPO ou com peptídeo de teste. No terceirodia, os camundongos são também dosados (0,1 mL, injetadointraperitonealmente) com dextrana de ferro (100 mg/mL).
No quito dia, os camundongos são anestesiados com CO2 ecoleta-se sangue por punção cardíaca. Determina-se aporcentagem (%) de reticulócitos para cada amostra desangue por coloração com laranja de tiazol e análise comcitômetro de fluxo (programa de contagem dereticul ócitos). Determinam-se manualmente oshematócritos. Determina-se a porcentagem corrigida dereticulócitos usando a fórmula seguinte:
% de RETICcorrigida= % de RETICobservada X (HematócritosindividuaiHematócri tosnormais)
3. Ensaio hematológico
Camundongos CDl normais são dosados quatro vezes porsemana com injeções intravenosas de bolo, de controlepositivo de EPO, peptídeo de teste ou de veículo. Umafaixa de doses de peptídeo de teste e de controlepositivo expressa em mg/kg, é testada variando aconcentração de composto ativo na formulação. Os volumesinjetados são de 5 mL/kg. 0 grupo de controle de veículocompreende doze animais, enquanto que 8 animais estão emcada um dos grupos de dosagem restantes. Registram-se aviabilidade diária e os pesos corpóreos semanais.
Os camundongos dosados jejuam e depois são anestesiadoscom isoflurano inalado e amostras de sangue terminal sãocoletadas via punção de aorta abdominal ou cardíaca no Iadia (para camundongos de controle de veículo) e no 152 e292 dias (4 camundongos/grupo/dia) . 0 sangue étransferido para tubos marca VACUTAINER®. 0anticoagulante preferido é o ácidoetilenodiaminatetraacético (EDTA).
Amostras de sangue são avaliadas para pontos finaismedindo fisiologia e síntese de sangue vermelho tais comohematócrito (Hct), hemoglobina (Hgb) e contagem deeritrócitos total (RBC) usando analisadores clínicosautomáticos bem conhecidos na técnica (por exemplo,aqueles fabricados por Coulter, Inc.).
Exemplo 5: Síntese dos homodímeros peptídicos agonistasde EPO-R dos monômeros peptídicos tendo a seqüência deaminoácidos (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO:1).
Etapa 1 - Síntese dos monômeros peptídicos: Os monômerospépticos são sintetizados usando química Fmoc padrão emum sintetizador de peptídeo ABI 431A, usando resina TG-RAM (0,18 mmol/g Rapp Polymere, Alemanha). Para a síntesedos monômeros peptídicos com um terminal carboxilamilado, a construção total do peptídeo é clivada apartir da resina com 82,5% de TFA, 5% de água, 6,52% deanisol, 6,2 5% de etanoditiol. 0 produto desprotegido éfiltrado a partir da resina e precipitado com dietiléter. Após passar pela secagem, o produto é purificadopela cromatografia de fase reversa líquida de altaperformance C18 com um gradiente de acetonitrila/água em0,1% de ácido trifluoroacético. A estrutura do peptídeo éconfirmada por espectrometria de massa electro-spray. Opeptídeo é dissolvido em uma solução 1:1 de DMSO:água emuma concentração de 1 mg/mL para afetar a formação debissulfeto. 0 produto é purificado através decromatograf ia líquida de fase reversa em C18 de altaperformance com um gradiente de acetonitrila/água em 0,1%de ácido trifluoroacético. Os monômeros peptídicos podemser ilustrados como a seguir:
<formula>formula see original document page 112</formula>
Etapa 2 - Síntese do ligante trifuncional: Para umasolução de dietil iminoacetato (10,0 g, 52,8 mmol) e Boc-beta-alanina (10, Og, 52,8 mmol) em 100 mL de DCM foramadicionados diisopropilcarbodiimida (8,0 mL, 51,1 mmol)durante 10 minutos a temperatura ambiente. A mistura dereação aquecida a -10 graus durante a adição, entãoresfriada até a temperatura ambiente durante 20 minutos.
A mistura de reação foi deixada em agitação de um diapara o outro e a diisopropiluréia precipitada foifiltrada. 0 solvente foi removido sob pressão reduzidapara garantir uma goma, e o resíduo dissolvido em acetatode etila e novamente filtrado para remover a uréiaprecipitada adicional. A fase orgânica foi colocada em umfunil separador, lavada (sat. NaHC03, salmoura, 0,5 NHCl, salmoura) seco (MgSO4), filtrada e concentrada sobpressão reduzida para conseguir o produto diéster como umóleo colorido. 0 diéster foi tomado em uma mistura de 1:1de MeOH: THF (100 mL) e a este foi adicionado água (25mL) , e então NaOH (5g, 12 5 mmol). 0 pH foi medido paraser > 10. A mistura de reação foi agitada a temperaturaambiente durante 2 horas, e então acidifiçada para um pH1 com 6N de HCl. A fase aquosa foi saturada com NaCl eextraída 4 vezes com acetato de etila. A fase orgânicacombinada foi lavada (salmoura), seca (MgSO4) , econcentrada sob pressão reduzida para dar um semi-sólidobranco. 0 sólido foi dissolvido em 50 mL de DCM e a esteforam adicionados 3 00 mL de hexano para criar um pastasemifluida branca. O solvente foi removido sob pressãoreduzda para conseguir o diácido como um sólido branco(14,7 g, 91,5% de rendimento para 2 etapas) . Para umasolução de diácido (lg, 3,29 mmol) em 2 0 mL de DMF foramadicionados N-hidroxisuccinimida (770mg, 6,69 mmol) ediisopropilcarbodiimida (1,00 mL, 6,3 8 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (3 mg, 0,02 mmol) . A mistura dereação foi agitada de um dia para o outro e o solventefoi removido sob pressão reduzida. 0 resíduo foi tomadoem acetato de etila e filtrado para remover a uréiaprecipitada. A fase orgânica foi colocada em um funilseparador, lavada com ((NaHCÜ3) saturado, salmoura, 0,5 NHCl, salmoura, seco (MgSO4)), filtrada e concentrada sobpressão reduzida para conseguir o produto di-NHS-estércomo um sólido branco (1,12 g, 68% de rendimento).
Etapa 3 - Acoplamento do ligante trifuncional aosmonômeros peptídicos: Para acoplamento do ligante, 2equivalentes de peptídeos são misturados com 1equivalente do ligante trifuncional em DMF seco pararesultar em uma solução límpida, 5 equivalentes de DIEAforam adicionados após 2 minutos. A mistura foi agitadaem uma temperatura ambiente durante 14 horas. 0 solventefoi removido sob pressão reduzida e o produto bruto foidissolvido em 80% de TFA em DCM durante 30 minutos pararemover o grupo Boc, seguido por purificação com HPLC defase reversa na C18. A estrutura do dímero foiconfigurada por espectrometria de massa por eletro-spray.
Esta reação de acoplamento se liga ao ligante em um átomode nitrogênio do grupo ε-amino do resíduo da lisina decada monômero. 0 processo é mostrado abaixo com aSEQ.ID.NO:1.
<formula>formula see original document page 114</formula><formula>formula see original document page 115</formula>
Etapa 4 - PEGlicosilação do dímero peptídico:
PEGlicosilação via ligação de carbamato: 0 dímeropeptídico foi misturado com uma quantidade igual (basemolar) de espécie de PEG ativado (mPEG-NPC de NOF Corp.Japão) em DMF seco para propiciar uma solução límpida.
Após 5 minutos 4 equivalentes de DIEA foram adicionados àsolução acima. A mistura foi agitada em temperaturaambiente por 14 horas, seguido por purificação com HPLCde fase reversa na C18. A estrutura de peptídeoPEGlicosado foi confirmada por massa MALDI. 0 peptídeopurificado foi também submetido à purificação através decromatografia de troca iônica de cátion tal como descritoabaixo. 0 mPEG-NPC de PEGlicosilação é mostrado abaixousando a SEQ.ID.N0:1.<formula>formula see original document page 116</formula>
PEGlicosilação via ligação de amida: 0 dímero peptidicofoi misturado com uma quantidade igual (base molar) deuma espécie de PEG ativado (PEG-SPA-NHS dda ShearwaterCorp., USA) em DMF seco para propiciar uma soluçãolímpida. Após 5 minutos 10 equivalentes de DIEA foramadicionados à solução acima. A mistura foi agitada emtemperatura ambiente por 2 horas, seguido por purificaçãocom HPLC de fase reversa na C18. A estrutura de peptídeoPEGlicosado foi confirmada por massa MALDI. 0 peptídeopurificado também foi submetido à purificação através decromatografia de troca iônica de cátion tal como descritoabaixo. 0 PEG-SPA-NHS de PEGlicosilação é mostrado abaixousando a SEQ.ID.N0:1.
<formula>formula see original document page 117</formula>
Etapa 5 - Purificação de peptídeos por troca iônica:
Diversos suportes de troca foram examinados para suacapacidade de separar o conjugado peptídeo-PEG acima apartir de PEG não-reagido (ou hidrolisado) , além de suacapacidade de reter os peptídeos diméricos iniciais. Aresina de troca iônica (2-3 g) foi carregada em umacoluna de 1 cm, seguido por conversão à forma sódio (NaOH0,2 N carregado sobre coluna até que o eluente fosse umpH 14, ca. 5 volumes de coluna), e depois para a formahidrogênio (eluído ou com HCl 0,1 N ou com HOAc 0,1 M atépH de carga ajustada de eluente, ca. 5 volumes decoluna), seguido por lavagem com 25% de ACN/agua ate pH6. Dissolveu-se ou o peptídeo antes da conjugação ou oconjugado peptídeo-PEG em 25% de ACN/água (10 mg/mL) e opH foi ajustado para <3 com TFA, depois carregado nacoluna. Após lavagem com 2-3 volumes de coluna de 25% deACN/água e coleta de frações de 5 mL, o peptídeo foiliberado da coluna por eluição com NH4Oac 0,1 M em 25% deACN/água, coletando novamente frações de 5 mL. A análisevia HPLC revelou que as frações continham o peptídeodesejado. A análise com detector de espalhamento de luzevaporativa (ELSD) indicou que quando o peptídeo foiretido na coluna e foi eluído com a solução de NH4Oac(geralmente entre frações 4 e 10), não se observou nenhumPEG não conjugado como um contaminante. Quando o peptídeoeluiu no tampão de lavagem inicial (geralmente asprimeiras 2 frações), não se observou nenhuma separaçãode PEG de conjugado e nenhum excesso de PEG.
As colunas seguintes retiveram com sucesso tanto opeptídeo como o conjugado peptídeo-PEG, e purificou comsucesso o conjugado peptídeo-PEG do peptídeo nãoconjugado:
Tabela 3: Resinas de troca iônica
<table>table see original document page 118</column></row><table>
Exemplo 6: Síntese de homodímeros de peptídeos agonistasde EOPO-R dos monômeros peptídicos tendo a seqüência deaminoácidos (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K(SEQ.ID.NO:2) são sintetizados como descrito no Exemplo1, exceto que na Etapa 1 os monômeros peptídicossintetizados são:
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ.ID.NO:2)Onde o PEG é ligado ao ligante via uma ligação carbamato,o produto final desta síntese usando a SEQ.ID.N0:2 podeser ilustrado estruturalmente como a seguir:
<formula>formula see original document page 119</formula>
Onde o PEG é ligado ao ligante via uma ligação amida, oproduto final desta síntese usando a SEQ.ID.N0:2 pode serilustrado estruturalmente como a seguir:
<formula>formula see original document page 119</formula>Exemplo 7: Ensaios de atividade in vitro
Este exemplo descreve vários ensaios in vitro que sãoúteis na avaliação da atividade e da potência dospeptídeos agonistas de EPO-R da invenção. Os resultadospara estes ensaios demonstram que os novos peptídeosdesta invenção se ligam ao EPO-R e ativam o sinal de EPO-R. Além disso, os resultados destes ensaios mostram queas novas composições de peptídeos apresentam um aumentosurpreendente na afinidade de ligação ao EPO-R e naatividade biológica comparado com os peptídeos miméticosde EPO que foram previamente descritos.
Os monômeros e os dímeros peptídicos agonistas EPO-R sãopreparados de acordo com os métodos providos no Exemplo 1ou no Exemplo 2. A potência destes dímeros peptídicos éavaliada usando uma série de ensaios de atividade invitro, incluindo: ensaio repórter, um ensaio deproliferação, um ensaio de ligação competitiva, e umensaio C/BFU-e. Estes quatro ensaios são descritos aseguir em detalhes.
Os resultados destes ensaios de atividade in vitro sãoresumidos na Tabela 2.
1. Ensaio repórter
Este ensaio baseia-se numa célula repórter derivada delinhagem celular pré-B de murino, Baf3/EpoR/GCSFRfos/Iux. Esta linhagem celular repórter expressa umreceptor quimérico compreendendo a porção extracelular doreceptor de EPO humano até a porção intracelular doreceptor de GCSF humano. Esta linhagem celular é aindatransfectada com um constructo de gene repórter deluciferase dirigida a promotor fos. A ativação destereceptor quimérico através de adição de agenteeritropoiético resulta na expressão do gene repórter deluciferase e, conseqüentemente, na produção de luz devidoà adição da luciferina substrato da luciferase. Assim, onível de ativação de EPO-R em tais células pode serquantificado através da mensuração de atividade deluciferase.As células Baf3/EpoR/GCSFR fos/Iux são cultivadas em meioDMEM/F12 (Gibco) suplementado com 10% de soro bovinofetal (FBS; Hyclone), 10% de sobrenadante WEHI-3 (osobrenadante de uma cultura de células WEHI-3, ATCC #TIB-68), e penicilina/estreptomicina. Aproximadamente 18horas antes do ensaio, as células foram desnutridastransferindo-as para meio DMEM/F12 suplementado com 10%de FBS e 0,1% de sobrenadante WEHI-3. No dia do ensaio,as células são lavadas uma vez com meio DMEM/F12suplementado com 10% de FBS (nenhum sobrenadante WEHI-3),depois 1 χ IO6 células/mL são cultivadas em presença deuma concentração conhecida de peptídeo de teste, ou comEPO (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) como umcontrole positivo, em meio DMEM/F12 suplementado com 10%de FBS (nenhum sobrenadante WEHI-3). Diluições seriais dopeptídeo de teste são correntemente testadas nesteensaio. Placas de ensaio são incubadas por 4 horas a 37°Cnuma atmosfera de 5% de CO2, após o que se adicionaluciferina (Steady-Glo; Promega, Madison, WI) em cadapoço. Após 5 minutos de incubação, mede-se a emissão deluz num luminômetro Topcount Packard (Packard InstrumentCo., Downers Grove, 111). Contagens de luz são locadas emrelação à concentração de peptídeo de teste e analisadasusando um software Graph Pad. A concentração de peptídeode teste que resulta numa emissão semi-máxima de luz éregistrada como o EC50.
2. Ensaio de proliferação
Este ensaio baseia-se numa linhagem celular pré-B demurino, Baf3, transfectada para expressar EPO-R humano. Aproliferação da linhagem celular resultante,Baf3/Gal4/Elk/EPOR, é dependente da ativação de EP0-R. 0grau de proliferação celular é quantificado usando MTT,onde o sinal no ensaio MTT é proporcional ao número decélulas viáveis.
As células Baf3/Gal4/Elk/EPOR são cultivadas em frascoscônicos em meio DMEM/F12 (Gibco) suplementado com 10% deFBS (Hyclone) e 10% de sobrenadante WEHI-3 (ATCC # TIB-68). Células cultivadas foram desnutridas de um dia paraoutro, num frasco cônico em uma densidade celular deIxlO6 células/mL, em meio DMEM/F12 suplementado com 10%de FBS e 0,1% de sobrenadante WEHI-3. As célulasdesnutridas são então lavadas duas vezes com PBS deDulbecco (Gibco), e re-suspensas até uma densidade deIxlO6 células/mL em DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS(nenhum sobrenadante WEHI-3). Alíquotas de 50 μΐ; (-50.000células) da suspensão celular são plaqueadas, emtriplicata, em placas de ensaio de 96 poços. Alíquotas de50 μ L de série de diluição de peptídeos miméticos de EPOde teste, ou 50 μΐ; de EPO (R & D Systems Inc.,Minneapolis, MN) ou ARANE SP™ (darbepoetina alfa, umagonista de EPO-R obtenível comercialmente de Amgen) emmeio DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS (nenhumsobrenadante WEHI-3) são adicionados em placas de ensaiode 96 poços (volume final de poço de 100 μΐι) . Porexemplo, 12 diluições diferentes podem ser testadas ondea concentração final de peptídeo de teste (ou peptídeoEPO controle) varia de 810 pM a 0,045 pM. As célulasplaqueadas são então incubadas por 48 horas a 37°C. Emseguida, adiciona-se 10 μΙ. de MTT (Roche Diagnostics) emcada poço de placa de cultura, e depois permite-seincubar por 4 horas. Depois a reação foi interrompidaadicionando 10% de SDS + HCl 0,01 N. Depois, as placassão incubadas de um dia para outro a 37°C. A absorbânciade cada poço em um comprimento de onda de 595 nm é entãomedida através de espectrofotometria. Gráficos dasleituras de absorbância versus concentração de peptídeode teste são construídos e calcula-se EC50 usando osoftware Graph Pad. A concentração de peptídeo de testeque resulta em uma absorbância semi-máxima é registradacomo o EC5 0.
3. Ensaio de ligação competitiva
São feitos cálculos de ligação competitiva usando umensaio em que um sinal luminoso é gerado como uma funçãoda proximidade de duas contas: uma conta doadora deestreptavidina transportando um marcador de peptídeoligante de EPO-R biotinilado e uma conta aceptora que seliga a EPO-R. A luz é gerada por transferência de energianão radiativa, durante a qual um oxigênio singleto éliberado de uma primeira conta devido à iluminação, e ocontato com o oxigênio singleto liberado faz com que asegunda conta emita luz. Estes conjuntos de contas sãoobteníveis comercialmente (Packard). A proximidade deconta é gerada pela ligação do marcador de peptídeoligante de EPO-R com o EPO-R. 0 peptídeo de teste quecompete com o marcador de peptídeo ligante de EPO-R paraligar com EPO-R impedirá esta ligação, causando umadiminuição na emissão luminosa.
Em mais detalhes, o método é como a seguir: Adicionar 4yL de diluições seriais do peptídeo agonista de EPO-R deteste, ou controles positivos ou negativos, nos poços deuma placa de 384 poços. Depois disso, adicionar 2 μ]^/ροςοde coquetel de receptor/conta. 0 coquetel de receptor deconta consiste de: 15 μΐ; de contas doadoras deestreptavidina de 5 mg/mL (Packard) , 15 μΙ* de anticorpomonoclonal abl7 9 de 5 mg/mL (este anticorpo reconhece aporção da proteína fosfatase alcalina placental humanacontida no EPO-R recombinante), contas aceptorasrevestidas com a proteína A (proteína A se ligará aoanticorpo abl79; Packard) , 112,5 μ]^ de uma diluição 1:6,6de EPO-R recombinante (produzido em células de ovário dehamster chinês como uma proteína de fusão a uma porção daproteína fosfatase alcalina placental humana que contém oepítopo alvo abl79) e 607,5 μΙ, de tampão AL PHAQUE ST(HEPES 40 mM, pH 7,4; MgCl2 1 mM; 0,1% de BSA, 0,05% deBSA, 0,05% de TWEEN 20). Descobrir para misturar.
Adicionar 2 μL/poço do marcador peptídico de ligação EPO-R biotinilado, AF33068 (concentração final 30 nM). 0peptídeo tracer, um peptídeo de ligação com EPO-R (videnas tabelas "EC50 repórter (pM)"), é preparado de acordocom os métodos descritos no Exemplo 1, usando aSEQ.ID.NO:4.Traço de peptídeo
<formula>formula see original document page 124</formula>
Centrifugar 1 minuto para misturar. Selar a placa comvedação de topo Packard e envolver em folha metálica.Incubar de um dia para outro em temperatura ambiente.
Após 18 horas ler emissão luminosa usando leitor
AlphaQuest (Packard). Plotar emissão luminosa versusconcentração de peptídeo e analisar com Graph Pad ouExcel.
4. Ensaio de C/BFU-e
A sinalização EPO-R, estimula a diferenciação das célulastronco, da medula óssea, em precursores de proliferaçãodas células sangüíneas vermelhas. Este ensaio mede acapacidade de peptídeos de teste estimularem aproliferação e a diferenciação de precursores de célulassangüíneas vermelhas a partir de células-troncopluripotentes de medula óssea humana primária.Para este ensaio, diluições seriais de peptídeo de testesão feitas em meio IMDM (Gibco) suplementado com 10% deFBS (Hyclone). Estas diluições seriais, ou peptídeo EPOde controle positivo, são então adicionados em metil-celulose para obter um volume final de 1,5 mL.
Turbilhonar inteiramente a mistura de peptídeo e metil-celulose. Alíquotas (100,000 células/mL) de células CD34+derivadas de medula óssea humana (Poietics/Camcrex) sãodescongeladas. As células descongeladas são adicionadassuavemente a 0,1 mL de DNase de lmg/mL (células tronco)em um tubo de 5 0 mL. Em seguida adicionam-se, suavemente,40-50 mL de meio IMDM às células: o meio é adicionadogota a gota ao longo da parede do tubo de 50 mL, nosprimeiros 10 mL, e depois, o volume restante de meio édistribuído lentamente pela parede do tubo. Em seguida,as células são então giradas a 900 rpm por 2 0 minutos, eo meio removido cuidadosamente por aspiração suave. Ascélulas são re-suspensas em 1 mL de meio IMDM e faz-se acontagem da densidade celular por mL em lâmina dehemocitômetro (alíquotas de 10 μΙ. de suspensão celular nalâmina, e a densidade celular é a contagem média χ 10.000células/mL). Em seguida, as células são diluídas em meioIMDM até uma densidade celular de 15.000 células/mL. 100μΐ; de células diluídas são então diluídos em cada 1,5 mLde metil-celulose mais amostra de peptídeo (aconcentração celular final em meio de ensaio é de 1000células/mL), e a mistura é turbilhonada. Faz-sedesaparecerem as bolhas na mistura, e em seguida aspira-se 1 mL usando agulha de ponta obtusa. Adiciona-se 0,2 5mL de mistura aspirada de cada amostra em cada conjuntode 4 poços de uma placa de 24 poços (Falcon brand).
Incubar as misturas plaqueadas a 370C em 5% de CO2 em umaincubadora úmida por 14 dias. Contar a presença decolônias de eritróides usando um microscópio de fase(objetiva de 5X-10X, ampliação final de 100X). Aconcentração de peptídeo de teste na qual o número decolônias formadas é de 90% de máximo, em relação àquelaobservada com o controle positivo de EPO, é anotada comoEC90 [Vide Tabela 2: C/BFU-e EC90].<table>table see original document page 126</column></row><table>EXEMPLO 8: Ensaios da atividade in vivo
Este exemplo descreve vários ensaios in vivo que sãoúteis na avaliação da atividade e da potência dospeptídeos agonistas de EPO-R da invenção. Monômeros edímeros peptídicos agonistas de EPO-R são preparados deacordo com os métodos providos no Exemplo 1. A atividadein vivo destes monômeros e dímeros peptídicos é avaliadausando uma série de ensaios, incluindo um bio-ensaio decamundongo ex-hipóxico policitêmico e um ensaio dereticulócito. Estes dois ensaios estão descritos maisdetalhadamente abaixo.
1. Bio-ensaio de camundongo ex-hipóxico policitêmico
Os peptídeos de teste são ensaiados para atividade invivo no bio-ensaio de camundongo ex-hipóxico policitêmicoadaptado do método descrito por Cotes e Bangham (1961),Nature 191: 1065-1067. Este ensaio examina a capacidadede um peptídeo de teste funcionar como um mimético deEPO, isto é, ativar EPO-R e induzir nova síntese decélulas sangüíneas vermelhas. A síntese de célulassangüíneas vermelhas é quantificada baseada naincorporação de radioisótopo de ferro em hemoglobina dascélulas sangüíneas vermelhas sintetizadas.
Camundongos BDFl são aclimatados em condições ambientespor 7-10 dias. Determinam-se os pesos corpóreos de todosos animais, e os animais de peso baixo (< 15 gramas) nãosão usados. Os camundongos são submetidos a ciclos decondicionamento sucessivos numa câmara hipobárica por umtotal de 14 dias. Cada ciclo de 24 horas consiste de 18horas em pressão atmosférica de 0,40 ± 0,02% e 6 horas empressão ambiente. Após condicionamento os camundongossão mantidos em pressão ambiente por mais 72 horas antesda dosagem.
Os peptídeos de teste, ou padrões de EPO humanorecombinante, são diluídos em PBS + 0,1% de veículo BSA(PBS/BSA). Soluções de estoque de monômero peptídico sãoprimeiramente solubilizadas em sulfóxido de dimetila(DMSO). Grupos de controle negativo incluem um grupo decamundongos injetados apenas com PBS/BSA, e um grupoinjetado com 1% de DMSO. Cada grupo de dosagem contém 10camundongos. Os camundongos são injetados subcutaneamente(nuca) com 0,5 mL da amostra apropriada.
Quarenta e oito horas após a injeção de amostra,administram-se aos camundongos uma injeçãointraperitoneal de 0,2 mL de 59Fe (Dupont, NEN), para umadose de aproximadamente 0,75 μCuries/camundongo.
Determinam-se os pesos corpóreos dos camundongos 24 horasapós a administração de 59Fe, e os camundongos sãosacrificados 48 horas após a administração de 59Fe.
Coleta-se sangue de cada animal por punção cardíaca edeterminam-se os hematócritos (usou-se heparina comoanticoagulante). Analisa-se cada amostra de sangue (0,2mL) para incorporação de 59Fe usando um contador gamaPackard. Os camundongos não responsivos (isto é, aquelescamundongos com incorporações radiativas menores que a dogrupo de controle negativo) são eliminados do conjunto dedados apropriados. Os camundongos que têm valoreshematócritos menores que 53% do grupo de controlenegativo são também eliminados.
Os resultados derivam de conjuntos de 10 animais paracada dose experimental. Calcula-se a quantidade média deradioatividade incorporada [contagens por minuto (CPM)]em amostras de sangue a partir de cada grupo.
2. Ensaio de reticulócito
Camundongos BDFl normais são dosados (0,5 mL, injetadosubcutaneamente) em três dias consecutivos ou comcontrole de EPO ou com peptídeo de teste. No terceirodia, os camundongos são também dosados (0,1 mL, injetadointraperitonealmente) com dextrana de ferro (100 mg/mL).
No quito dia, os camundongos são anestesiados com CO2 ecoleta-se sangue por punção cardíaca. Determina-se aporcentagem (%) de reticulócitos para cada amostra de35 sangue por coloração com laranja de tiazol e análise comcitômetro de fluxo (programa de contagem dereticulócitos). Determinam-se manualmente oshematócritos. Determina-se a porcentagem corrigida dereticulócitos usando a fórmula a seguir:
% de RETICcorrigida= % de RETI Cobservada X (HematócritosindividuaiHema tócr i tosnormais)
3. Ensaio hematológico
Camundongos CDl normais são dosados quatro vezes porsemana com injeções intravenosas de bolo ou de controlepositivo de EPO, peptídeo de teste ou de veículo. Umafaixa de doses de peptídeo de teste e de controlepositivo, expressa em mg/kg, é testada pela variação daconcentração de composto ativo na formulação. Os volumesinjetados são de 5 ml/kg. 0 grupo de controle de veículocompreende doze animais, enquanto que 8 animais estão emcada um dos grupos de dosagem restantes. Registra-se aviabilidade diária e os pesos corpóreos semanais.
Os camundongos dosados jejuam e depois são anestesiadoscom isoflurano inalado e amostras de sangue terminal sãocoletadas via punção de aorta abdominal ou cardíaca no I2dia (para camundongos de controle de veículo) e no 152 eno 292 dias (4 camundongos/grupo/dia). 0 sangue étransferido para tubos marca VACUTAINER®. 0anticoagulante preferido é o ácido etilenodiamina-tetraacético (EDTA).
Amostras de sangue são avaliadas para pontos finaismedindo fisiologia e síntese de sangue vermelho tais comohematócrito (Hct), hemoglobina (Hgb) e contagem deeritrócitos total (RBC) usando analisadores clínicosautomáticos bem conhecidos na técnica (por exemplo,aqueles fabricados por Coulter, Inc.).
Exemplo 9: Síntese dos homodímeros de peptídeos agonistasEPO-R dos monômeros peptídicos tendo a seqüência deaminoácido (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ.ID.NO:1).
Etapa 1 - Síntese dos monômeros peptídicos: Os monômerospépticos são sintetizados usando química Fmoc padrão emum sintetizador de peptídeo ABI 43IA, usando resina TG-RAM (0,18 mmol/g Rapp Polymere, Alemanha). Para a síntesedos monômeros peptídicos com um terminal carboxilamilado, a construção total do peptídeo é clivada apartir da resina com 82,5% de TFA, 5% de água, 6,52% deanisol, 6,2 5% de etanoditiol. 0 produto desprotegido éfiltrado a partir da resina e precipitado com dietiléter. Após passar pela secagem, o produto é purificadopela cromatografia de fase reversa líquida de altaperformance em C18 com um gradiente de acetonitrila/águaem 0,1% de ácido trifluoroacético. A estrutura dopeptídeo é confirmada por espectrometria de massaelectro-spray. Os monômeros peptídicos podem serilustrados como a seguir:
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK-NH2 (SEQ.ID.NO:1)
Etapa 2 - Síntese do ligante trifuncional: Para umasolução de dietil iminoacetato (10,0 g, 52,8 mmol) e Boc-beta-alanina (10, Og, 52,8 mmol) em 100 mL de DCM foramadicionados diisopropilcarbodiimida (8,0 mL, 51,1 mmol)durante 10 minutos a temperatura ambiente. A mistura dereação aquecida a -10 graus durante a adição, entãoresfriada até a temperatura ambiente durante 20 minutos.
A mistura de reação foi deixada em agitação de um diapara o outro e a diisopropiluréia precipitada foifiltrada. 0 solvente foi removido sob pressão reduzidapara garantir uma goma, e o resíduo dissolvido em acetatode etila e novamente filtrado para remover a uréiaprecipitada adicional. A fase orgânica foi colocada em umfunil separador, lavada (sat. NaHCO3, salmoura, 0,5 NHCl, salmoura) seco (MgSO4), filtrada e concentrada sobpressão reduzida para conseguir o produto diéster como umóleo colorido. 0 diéster foi tomado em uma mistura de 1:1de MeOH: THF (100 mL) e a este foi adicionado água (25mL) , e então NaOH (5g, 125 mmol) . 0 pH foi medido paraser > 10. A mistura de reação foi agitada a temperaturaambiente durante 2 horas, e então acidifiçada para um pH1 com 6N de HCl. A fase aquosa foi saturada com NaCl eextraída 4 vezes com acetato de etila. A fase orgânicacombinada foi lavada (salmoura), seca (MgSO4) , econcentrada sob pressão reduzida para dar um semi-sólidobranco. O sólido foi dissolvido em 50 mL de DCM e a esteforam adicionados 3 00 mL de hexano para criar um pastasemifluida branca. 0 solvente foi removido sob pressãoreduzida para conseguir o diácido como um sólido branco(14,7 g, 91,5% de rendimento para 2 etapas). Para umasolução de diácido (lg, 3,29 mmol) em 20 mL de DMF foramadicionados N-hidroxisuccinimida (770mg, 6,69 mmol) ediisopropilcarbodiimida (1,00 mL, 6,38 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (3 mg, 0,02 mmol). A mistura dereação foi agitada de um dia para o outro e o solventefoi removido sob pressão reduzida. 0 resíduo foi tomadoem acetato de etila e filtrado para remover a uréiaprecipitada. A fase orgânica foi colocada em um funilseparador, lavada com NaHCC>3 saturado, salmoura, 0,5 NHCl, salmoura, seca (MgSCU) / filtrada e concentrada sobpressão reduzida para conseguir o produto di-NHS-estércomo um sólido branco (1,12 g, 68% de rendimento).
<formula>formula see original document page 131</formula>
Etapa 3 - Acoplamento do ligante trifuncional aosmonômeros peptídicos: Para acoplamento do ligante, 2equivalentes de peptídeos são misturados com 1equivalente do ligante trifuncional em DMF seco pararesultar em uma solução límpida, 5 equivalentes de DIEAforam adicionados após 2 minutos. A mistura foi agitadaem uma temperatura ambiente durante 14 horas. 0 solventefoi removido sob pressão reduzida e o produto bruto foidissolvido em 80% de TFA em DCM durante 30 minutos pararemover o grupo Boc, seguido por purificação com HPLC defase reversa na C18. A estrutura do dímero foiconfigurada por espectrometria de massa por eletro-spray.
Esta reação de acoplamento se liga ao ligante em um átomode nitrogênio do grupo ε-amino do resíduo da lisina decada monômero. 0 acoplamento usando a SEQ.ID.N0:1 émostrado abaixo:
<formula>formula see original document page 132</formula>
Etapa 4 - Síntese da porção PEG compreendendo duascadeias PEG lineares ligadas pela lisina mPEG2-Lisinol-NPC.Lisionol, que pode ser obtido comercialmente, é tratadocom um excesso de mPEG2-NPC para obter mPEG2-lisinol, queé então reagido com NPC para formar mPEG-2-Iisinol-NPC.
mPEG2-Iis-NHS
Este produto pode ser obtido comercialmente, por exemplo,a partir de um Catálogo de Engenharia Molecular (2003) daNektar Therapeutics (490 Discovery Drive, Huntsville,alabama 35806), item No.: 2Z3X0T01.
Etapa 5 - PEGlicosilação do dímero peptídico:
PEGlicosilação via ligação de carbamato: 0 dímeropeptídico e a espécie PEG (mPEG2-lisinol-NPC) sãomisturados em uma proporção molar de 1:2 em DMF seco parapropiciar uma solução límpida. Após 5 minutos 4equivalentes de DIEA foram adicionados à solução acima. Amistura foi agitada em temperatura ambiente por 14 horas,seguido por purificação com HPLC de fase reversa na C18.
A estrutura de peptídeo PEGlicosado foi confirmada pormassa MALDI. 0 peptídeo purificado foi também submetido àpurificação através de cromatografia de troca iônica decátion tal como descrito abaixo. A PEGlicosilação usandomPEG-lisionol-NPC é mostrada abaixo usando a SEQ.ID.N0:1.
<formula>formula see original document page 133</formula><formula>formula see original document page 134</formula>
PEGlicosilação via ligação de amida: 0 dímero peptídico ea espécie PEG (mPEG2-Lis-NHS da Shearwater Corp., USA)são misturados em uma proporção molar de 1:2 em DMF secopara propiciar uma solução límpida. Após 5 minutos 10equivalentes de DIEA foram adicionados à solução acima. Amistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas,seguido por purificação com HPLC de fase reversa na C18.
A estrutura de peptídeo PEGlicosado foi confirmada pormassa MALDI. 0 peptídeo purificado também foi submetido àpurificação através de cromatografia de troca iônica decátion tal como descrito abaixo. A PEGlicosilação usandoItiPEG2-Lis-NHS usando a SEQ.ID.N0:1 é mostrada abaixo:
<formula>formula see original document page 134</formula><formula>formula see original document page 135</formula>
Etapa 6 - Purificação por troca iônica dos peptídeos:
Diversos suportes de troca foram examinados por suacapacidade de separar o conjugado peptídeo-PEG acima apartir de PEG não-reagido (ou hidrolisado) , além de suacapacidade de reter os peptídeos diméricos iniciais. Aresina de troca iônica (2-3 g) foi carregada em umacoluna de 1 cm, seguido por conversão à forma sódio (NaOH0,2 N carregado sobre a coluna até que o eluente fosse pH14, ca. 5 volumes de coluna), e depois para a formahidrogênio (eluído ou com HCl 0,1 N ou com HOAc 0,1 M atépH de carga ajustada de eluente, ca. 5 volumes decoluna), seguido por lavagem com 25% de ACN/água até pH6. Dissolveu-se ou o peptídeo antes da conjugação ou oconjugado peptídeo-PEG em 25% de ACN/água (10 mg/mL) e opH ajustado para <3 com TFA, depois carregado na coluna.
Após lavagem com 2-3 volumes de coluna de 25% de ACN/águae coleta de frações de 5 mL, o peptídeo foi liberado dacoluna por eluição com NH4OAc 0,1 M em 25% de ACN/água,coletando novamente frações de 5 mL. A análise via HPLCrevelou que as frações continham o peptídeo desejado. Aanálise com detector de espalhamento de luz evaporativa(ELSD) indicou que quando o peptídeo foi retido na colunae foi eluído com a solução de NH4OAc (geralmente entrefrações 4 e 10), não se observou nenhum PEG não conjugadocomo um contaminante. Quando o peptídeo eluiu no tampãode lavagem inicial (geralmente as primeiras 2 frações),não se observou nenhuma separação de PEG de conjugado enenhum excesso de PEG.
As colunas seguintes retiveram com sucesso tanto opeptídeo como o conjugado peptídeo-PEG, e purificou comsucesso o conjugado peptídeo-PEG do peptídeo nãoconjugado:
Tabela 5: Resinas de troca iônica
<table>table see original document page 136</column></row><table>
EXEMPLO 10: Síntese dos homodimeros de peptídeosagonistas de EPO-R dos monômeros peptídicos tendo aseqüência de aminoácido (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ.ID.NO:2).
Os homodimeros de peptídeos do agonista EPO-R dosmonôemros peptídicos tendo a seqüência de aminoácido(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ.ID.NO:2) sãosintetizados como descrito no Exemplo 1, exceto que na
Etapa 1 dos monômeros peptídicos sintetizados são:
(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ.ID.NO:2)Onde o PEG é ligado ao espaçador via ligação decarbamato, o produto final desta síntese usando aSEQ.ID.N0:2, pode ser ilustrado estruturalmente como aseguir:<formula>formula see original document page 137</formula>
Onde o PEG é ligado ao espaçador via ligação de amida, oproduto final desta síntese usando a SEQ.ID.N0:2 pode serilustrada etruturalmente como a seguir:
EXEMPLO 11: Ensaios da atividade in vitro
Este exemplo descreve vários ensaios in vitro que sãoúteis na avaliação da atividade e da potência dospeptídeos agonistas de EPO-R da invenção. Os resultadosdestes ensaios demonstram que os novos peptídeos destainvenção se ligam ao EPO-R e ao sinal de EPO-R ativado.
Além disso, os resultados para estes ensaios mostram queas novas composições de peptídeos apresentam um aumentosurpreendente na afinidade de ligação do EPO-R e naatividade biológica comparado aos peptídeos EPOmiméticos que foram previamente descritos.
Os monômeros e dímeros peptídicos agonistas EPO-R sãopreparados de acordo com os métodos providos no Exemplo 1
<formula>formula see original document page 137</formula>ou no Exemplo 2. A potência destes dímeros peptídicos éavaliada usando uma série de ensaios de atividade invitro, incluindo, ensaio repórter, um ensaio deproliferação, um ensaio de ligação competitiva, e umensaio C/BFU-e. Estes quatro ensaios são descritos emdetalhes a seguir.
Os resultados destes ensaios de atividade in vitro sãoresumidos na Tabela 2.
1. Ensaio repórter
Este ensaio baseia-se numa célula repórter derivada delinhagem celular pré-B de murino, Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux. Esta linhagem celular repórter expressa umreceptor quimérico compreendendo a porção extracelular doreceptor de EPO humano até a porção intracelular doreceptor de GCSF humano. Esta linhagem celular é aindatransfectada com um constructo de gene repórter deluciferase dirigida a promotor fos. A ativação destereceptor quimérico através de adição de agenteeritropoiético resulta na expressão do gene repórter deluciferase e, conseqüentemente, na produção de luz devidoà adição da luciferina substrato da luciferase. Assim, onível de ativação de EPO-R em tais células pode serquantificado através da mensuração de atividade deluciferase.
As células Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux são cultivadas em meioDMEM/F12 (Gibco) suplementado com 10% de soro bovinofetal (FBS; Hyclone), 10% de sobrenadante WEHI-3 (osobrenadante de uma cultura de células WEHI-3, ATCC #TIB-68), e penicilina/estreptomicina. Aproximadamente 18horas antes do ensaio, as células foram desnutridastransferindo-as para meio DMEM/F12 suplementado com 10%de FBS e 0,1% de sobrenadante WEHI-3. No dia do ensaio,as células são lavadas uma vez com meio DMEM/F12suplementado com 10% de FBS (nenhum sobrenadante WEHI-3),depois 1 χ IO6 células/mL são cultivadas na presença deuma concentração conhecida de peptídeo de teste, ou comEPO (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) como umcontrole positivo, em meio DMEM/F12 suplementado com 10%de FBS (nenhum sobrenadante WEHI-3). Diluições seriais dopeptídeo de teste são correntemente testadas nesteensaio. Placas de ensaio são incubadas por 4 horas a 37°Cnuma atmosfera de 5% de CO2, após o que se adicionaluciferina (Steady-Glo; Promega, Madison, WI) em cadapoço. Após 5 minutos de incubação, mede-se a emissão deluz num luminômetro Topcount Packard (Packard InstrumentCo., Downers Grove, Ill). Contagens de luz são locadas emrelação à concentração de peptídeo de teste e analisadasusando um software Graph Pad. A concentração de peptídeode teste que resulta em uma emissão semi-máxima de luzregistrada como o EC50.
2. Ensaio de proliferação
Este ensaio baseia-se em uma linhagem celular pré-B demurino, Baf3, transfectada para expressar EPO-R humano. Aproliferação da linhagem celular resultante,Baf3/Gal4/Elk/EPOR, é dependente da ativação de EPO-R. 0grau de proliferação celular é quantificado usando MTT,onde o sinal no ensaio MTT é proporcional ao número decélulas viáveis.
As células Baf3/Gal4/Elk/EPOR são cultivadas em frascoscônicos em meio DMEM/F12 (Gibco) suplementado com 10% deFBS (Hyclone) e 10% de sobrenadante WEHI-3 (ATCC # TIB-68). Células cultivadas foram desnutridas de um dia paraoutro, em um frasco cônico em uma densidade celular deIxlO6 células/mL, em meio DMEM/F12 suplementado com 10%de FBS e 0,1% de sobrenadante WEHI-3. As célulasdesnutridas são então lavadas duas vezes com PBS deDulbecco (Gibco), e re-suspensas até uma densidade deIxlO6 células/mL em DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS(nenhum sobrenadante WEHI-3). Alíquotas de 50 yL (-50.000células) da suspensão celular são colocadas em placas, emtriplicata, em placas de ensaio de 96 poços. Alíquotas de50 yL de série de diluição de peptídeos miméticos de EPOde teste, ou 50 yL de EPO (R & D Systems Inc.,Minneapolis, MN) ou ARANESP™ (darbepoetina alfa, umagonista de EPO-R obtenível comercialmente de Amgen) emmeios DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS (nenhumsobrenadante WEHI-3) são adicionados em placas de ensaiode 96 poços (volume de poço final de 100 μΐ.) . Porexemplo, 12 diluições diferentes podem ser testadas ondea concentração final de peptídeo de teste (ou peptídeoEPO controle) varia de 810 pM a 0,045 pM. As célulascolocadas nas placas são então incubadas por 48 horas a37°C. Em seguida, adiciona-se 10 μΐι de MTT (RocheDiagnostics) em cada poço de placa de cultura, e depoispermite-se incubar por 4 horas. Depois a reação foiinterrompida adicionando 10% de SDS + HCl 0,01 N. Emseguida, as placas foram incubadas de um dia para outroa 37°C. Mede-se por espectrofotometria a absorbância decada poço em um comprimento de onda de 595 nm. Gráficosdas leituras de absorbância contra concentração depeptídeo de teste são construídos e calcula-se EC50usando o software Graph Pad. A concentração de peptídeode teste que resulta em uma absorbância semi-máxima éregistrada como o EC50.
3. Ensaio de ligação competitiva
São feitos cálculos de ligação competitiva usando umensaio em que um sinal luminoso é gerado como uma funçãoda proximidade de duas contas: uma conta doadora deestreptavidina transportando um marcador de peptídeoligante de EPO-R biotinilado e uma conta aceptora que seliga a EPO-R. A luz é gerada por transferência de energianão radiativa, durante a qual um oxigênio singleto éliberado de uma primeira conta devido à iluminação, e ocontato com o oxigênio singleto liberado faz com que asegunda conta emita luz. Estes conjuntos de contas sãoobteníveis comercialmente (Packard). A proximidade deconta é gerada pela ligação do marcador de peptídeoligante de EPO-R com o EPO-R. 0 peptídeo de teste quecompete com o marcador de peptídeo ligante de EPO-R paraligar com EPO-R impedirá esta ligação, causando umadiminuição na emissão luminosa.Em mais detalhes, o método é como a seguir: Adicionar 4μΙ; de diluições seriais do peptídeo agonista de EPO-R deteste, ou controles positivos ou negativos, nos poços deuma placa de 384 poços. Depois disso, adicionar 2 μίνροςοde coquetel de receptor/conta. 0 coquetel dereceptor/conta consiste de: 15 μΐι de contas doadoras deestreptavidina de 5 mg/mL (Packard) , 15 μΙ. de anticorpomonoclonal abl79 de 5 mg/mL (este anticorpo reconhece aporção da proteína fosfatase alcalina placental humanacontida no EPO-R recombinante), contas aceptorasrevestidas com a proteína A (proteína A se ligará aoanticorpo abl79; Packard) , 112,5 μΙ* de uma diluição 1:6,6de EPO-R recombinante (produzido em células de ovário dehamster chinês como uma proteína de fusão a uma porção daproteína fosfatase alcalina placental humana que contém oepítopo alvo abl79) e 607,5 μΐ, de tampão AL PHAQUE S T(HEPES 40 mM, pH 7,4; MgCl2 1 mM; 0,1% de BSA, 0,05% deBSA, 0,05% de TWEEN 20). Descobrir para misturar.
Adicionar 2 μL/poço do marcador peptídico de ligação EPO-R biotinilado, AF33068 (concentração final 30 nM) . 0peptídeo de ligação com EPO-R (ver nas Tabelas "EC50repórter (pM)"), é preparado de acordo com os métodosdescritos no Exemplo 1, usando a SEQ.ID.N0:4.
<formula>formula see original document page 141</formula>
Centrifugar 1 minuto para misturar. Selar a placa comvedação de topo Packard e envolver em folha metálica.Incubar de um dia para outro em temperatura ambiente.
Após 18 horas ler emissão luminosa usando leitorAlphaQuest (Packard). Plotar emissão luminosa versusconcentração de peptídeo e analisar com Graph Pad ouExcel.
A concentração do peptídeo de teste que resulta em umaumento de 50% em emissão luminosa relativa àquelaobservada sem o peptídeo de teste, é registrada comoIC50.
4. Ensaio de C/BFU-e
A sinalização com EPO-R estimula a diferenciação decélulas-tronco da medula óssea em precursores deproliferação de células sangüíneas vermelhas. Este ensaiomede a capacidade de peptídeos de teste estimular aproliferação e a diferenciação de precursores de célulassangüíneas vermelhas de células-tronco pluripotentes demedula óssea humana principal.
Para este ensaio, são feitas diluições seriais depeptídeo de teste em meio IMDM (Gibco) suplementado com10% de FBS (Hyclone). Estas diluições seriais, oupeptídeo EPO de controle positivo são então adicionadosem metil-celulose para obter um volume final de 1,5 mL.
Turbilhonar inteiramente a mistura de peptídeo e metil-celulose. Alíquotas (100.000 células/mL) de células CD34+derivadas de medula óssea humana (Poietics/Camcrex) sãodescongeladas. As células descongeladas são adicionadassuavemente a 0,1 mL de DNase de lmg/mL (células-tronco)em um tubo de 50 mL. Em seguida adicionam-se, suavemente,40-50 mL de meio IMDM às células: o meio é adicionadogota a gota ao longo da parede do tubo de 5 0 mL, nosprimeiros 10 mL, e depois, o volume restante de meio édistribuído lentamente pela parede do tubo. Em seguida,as células são giradas a 900 rpm por 20 minutos, e osmeios removidos cuidadosamente por aspiração suave. Ascélulas são re-suspensas em 1 mL de meio IMDM e faz-se acontagem da densidade celular por mL em lâmina dehemocitômetro (alíquota de 10 pL de suspensão celular nalâmina, e a densidade celular é a contagem média χ 10.000células/mL). Em seguida, as células são diluídas em meioIMDM até uma densidade celular de 15.000 células/mL.
Depois, adicionam-se 100 pL de células diluídas para cada1,5 mL de metil-celulose mais amostra de peptídeo(concentração celular final em meio de ensaio é de 1000células/ml), e a mistura é turbilhonada. Faz-sedesaparecer as bolhas na mistura, e em seguida aspira-se1 mL usando agulha de ponta obtusa. Adiciona-se 0,25 mLde mistura aspirada de cada amostra em cada conjunto de 4poços de uma placa de 24 poços (Falcon brand). Incubar asmisturas plaqueadas a 37°C em 5% de CO2 em uma incubadoraúmida por 14 dias. Contar a presença de colônias deeritróides usando um microscópio de fase (objetiva de 5X-10X, ampliação final de 100X). A concentração de peptídeode teste na qual o número de colônias formadas é de 90%de máximo, em relação àquela observada com o controlepositivo de EPO, é anotada como EC90 [Vide Tabela 2:C/BFU-e EC90].TABELA 6
<table>table see original document page 144</column></row><table>EXEMPLO 12: Ensaios de atividade in vivo
Este exemplo descreve vários ensaios in vivo que sãoúteis na avaliação da atividade e da potência dospeptídeos agonistas de EPO-R da invenção. Monômeros edimeros peptidicos agonistas de EPO-R são preparados deacordo com os métodos providos no Exemplo 1. A atividadein vivo destes monômeros e dimeros peptidicos é avalidadausando uma série de ensaios, incluindo um bio-ensaio decamundongo ex-hipóxico policitêmico e um ensaio dereticulócito. Estes dois ensaios estão descritos maisdetalhadamente abaixo.
1. Bio-ensaio de camundongo ex-hipóxico policitêmicoOs peptídeos de teste são ensaiados para atividade invivo no bio-ensaio de camundongo ex-hipóxico policitêmicoadaptado ao método descrito por Cotes e Bangham (1961),Nature 191: 1065-1067. Este ensaio examina a capacidadede um peptídeo de teste funcionar como um mimético deEPO, isto é, ativar EPO-R e induzir nova síntese decélulas sangüíneas vermelhas. A síntese de célulassangüíneas vermelhas é quantificada baseada naincorporação de radioisótopo de ferro em hemoglobina dascélulas sangüíneas vermelhas sintetizadas.
Camundongos BDFl são aclimatados em condições ambientespor 7-10 dias. Determinam-se os pesos corpóreos de todosos animais, e os animais de peso baixo (< 15 gramas) nãosão usados. Os camundongos são submetidos a ciclos decondicionamento sucessivos em uma câmara hipobárica porum total de 14 dias. Cada ciclo de 24 horas consiste de18 horas em pressão atmosférica de 0,40 ± 0,02% e 6 horasem pressão ambiente. Após condicionamento, os camundongossão mantidos em pressão ambiente por mais 72 horas antesda dosagem.
Os peptídeos de teste, ou padrões de EPO humanorecombinante, são diluídos em PBS + 0,1% de veículo BSA(PBS/BSA). Soluções de estoque de monômero peptídico sãoprimeiramente solubilizadas em sulfóxido de dimetila(DMSO). Grupos de controle negativo incluem um grupo decamundongos injetados apenas com PBS/BSA, e um grupoinjetado com 1% de DMSO. Cada grupo de dosagem contém 10camundongos. Os camundongos são injetados subcutaneamente(nuca) com 0,5 mL da amostra apropriada.
Quarenta e oito horas após a injeção de amostra,administram-se aos camundongos uma injeçãointraperitoneal de 0,2 mL de 59Fe (Dupont, NEN) , para umadose de aproximadamente 0,75 μCuries/camundongo.
Determinam-se os pesos corpóreos dos camundongos 24 horasapós a administração de 59Fe, e os camundongos sãosacrificados 48 horas após a administração de 59Fe.
Coleta-se sangue de cada animal por punção cardíaca edetermina-se os hematócritos (usou-se heparina comoanticoagulante). Analisa-se cada amostra de sangue (0,2mL) para incorporação de 59Fe usando um contador gamaPackard. Os camundongos não-responsivos (isto é, aquelescamundongos com incorporações radiativas menores que a dogrupo de controle negativo) são eliminados do conjunto dedados apropriados. Os camundongos que têm valores dehematócrito menores que 53% do grupo de controle negativotambém são eliminados.
Os resultados são derivados de conjuntos de 10 animaispara cada dose experimental. Calcula-se a quantidademédia de radioatividade incorporada [contagens por minuto(CPM)] em amostras de sangue de cada grupo.
2. Ensaio de reticulócito
Camundongos BDFl normais são dosados (0,5 mL, injetadosubcutaneamente) em três dias consecutivos ou comcontrole de EPO ou com peptídeo de teste. No terceirodia, os camundongos são também dosados (0,1 mL, injetadointraperitonealmente) com dextrana de ferro (100 mg/mL).
No quito dia, os camundongos são anestesiados com CO2 ecoleta-se sangue por punção cardíaca. Determina-se aporcentagem (%) de reticulócitos para cada amostra desangue por coloração com laranja de tiazol e análise comcitômetro de fluxo (programa de contagem dereticulócitos). Determinam-se manualmente oshematócritos. Determina-se a porcentagem corrigida dereticulócitos usando a fórmula seguinte:
% de RETICcorrigida= % de RETIC0bservada X (HematócrItosindiViduaiHematÓCritOSnorrnais)
3. Ensaio hematológico
Camundongos CDl normais são dosados quatro vezes porsemana com injeções intravenosas de bolo, de controlepositivo de EPO, peptídeo de teste ou de veículo. Umafaixa de doses de peptídeo de teste e de controlepositivo expressa em mg/kg, é testada variando aconcentração de composto ativo na formulação. Os volumesinjetados são de 5 mL/kg. 0 grupo de controle de veículocompreende doze animais, enquanto que 8 animais estão emcada um dos grupos de dosagem restantes. Registram-se aviabilidade diária e os pesos corpóreos semanais.
Os camundongos dosados jejuam e depois são anestesiadoscom isoflurano inalado e amostras de sangue terminal sãocoletadas via punção de aorta abdominal ou cardíaca no I2dia (para camundongos de controle de veículo) e no 152 e292 dias (4 camundongos/grupo/dia) . 0 sangue étransferido para tubos marca VACUTAINER®. 0anticoagulante preferido é o ácidoetilenodiaminatetraacético (EDTA).
Amostras de sangue são avaliadas para pontos finaismedindo fisiologia e síntese de sangue vermelho tais comohematócrito (Hct), hemoglobina (Hgb) e contagem deeritrócitos totais (RBC) usando analisadores clínicosautomáticos bem conhecidos na técnica (por exemplo,aqueles fabricados por Coulter, Inc.).
EXEMPLO 13: Aumento nos níveis de hemoglobina em animaise em voluntários humanos saudáveis normais (NHV).
1. Geral
Com base nos dados não-clínicos e clínicos, o peptídeo I,um agonista do receptor EPO completamente sintético, teveo potencial para segurança e eficácia aliviando a anemiasecundária para a produção de EPO inadequada. Éantecipado que o peptídeo I pode ter várias vantagenspotências sobre os produtos Epo atualmente disponíveis,incluindo: meia-vida prolongada e atividadefarmacodinâmica com um intervalo de dosagem esperado acada 3-4 semanas, a qual pode traduzir em umaconveniência e submissão melhorada; potencial reduzidopara a aplasia celular vermelha pura mediada peloanticorpo (PRCA) uma vez que não é comum a seqüência deaminoácidos fazer parte do EPO endógeno; potencial para otratamento de pacientes com PRCA causado por anticorpospara EPOs comercialmente disponível que têm reaçãocruzada com o EPO endógeno; e estabilidade melhorada coma vida de prateleira prolongada em temperatura ambientecomparada com as proteínas terapêuticas.
Uma vez que a seqüência de aminoácidos do peptídeo Idifere daquela do EPO humano recombinate (rHuEPO), émenos provável induzir uma resposta imuno com reatividadecruzada contra o EPO endógeno. Apesar de muito raro, umaresposta imune com reatividade cruzada pode causar sériosefeitos colaterais associados com perda de potência paraambas a ESAs humana recombinantes e o Epo endógeno.
Adicionalmente, uma vez que o peptídeo I é um peptídeosintético, sua produção evita o risco potencial decontaminação do fármaco com o material celular hospedeiroque pode ocorrer com os produtos de proteínarecombinante.
2. Farmacocinética do peptídeo I em Animais
0 peptídeo I é um estimulador potente de eritropoiese comatividade dose-dependente observada após a administraçãode uma dose única ou uma dose repetida em camundongos,ratos (normocitêmico e nefrectomizado), cachorros,coelhos, e macacos. Os estudos fármaco-cinéticos em ratose macacos indicam que o aumento nos reticulócitos (RBCsimaturos) e RBCs como medido pelos níveis de hemoglobinasem doses proporcionais.
Os estudos fármaco-cinéticos em ratos, cachorros emacacos demonstraram a persistência sustentada no plasmado peptídeo I em comparação com os produtos rHuEPOatualmente comercializados. As faixas de eliminação dameia-vida (Ti/2) abrangem de 21,5 -30,7 horas em ratos, de73,7 horas em cachorros. A bio-distribuição do peptídeo Ié primariamente à fração do plasma. Após a administraçãoIV de 9,87 mg do peptídeo I /Kg em cinco-seis ratosnefroctomizados, o ti/2 foi de aproximadamente 48 horas ea liberação foi inferior a 0,763 mL/h/kg (comparado com1,44 mL/h/kg em ratos normocitêmicos) resultando em umamagnitude AUC aumentada de 1,8.
2 . Farmacodinâmica e Farmacocinética do Peptídeo I emHumanos
2.1 Visão geral e Métodos:
O peptídeo I foi testado em 2 0 NHV em um estudo de Fase
I. Este estudo primeiro em humano com o peptídeo I foiuma triagem aleatória, de dupla-ligação, placebocontrolado, dose única, IV, dose escalonada, exame desegurança e de tolerabilidade. Os objetivos primários doestudo foram para avaliar a segurança e a farmacocinéticado peptídeo I, e para estabilizar uma dose ativafarmacologicamente (PAD). 0 Coorte (grupo) de setemachos voluntários foi programado para receber dosesúnicas do peptídeo I ou placebo em uma proporção de 5:2.
Os coortes foram adicionados em níveis de dosesaumentadas até um PAD, como determinado através doaumento na hemoglobina a partir dos valores de linha debase, foi observado, nos quais o ponto de níveis de doseidentificados como PAD seriam repetidos em um outrocoorte (grupo) de voluntários.
0 estudo foi iniciado em quatro coortes (grupos)arrolados de uma maneira consecutiva de doses do Peptídeo1 de 0,02 5, 0,05, 0,1 mg/kg e 0,1 mg/kg, respectivamente(dose simples por grupo). 0 resultado do estudodemonstrou que o aumento na contagem dos reticulócitos eno nível da hemoglobina foi conseguido após o terceirogrupo receber 0,1 mg/kg do peptídeo I. Esta dose foirepetida no quarto grupo, para confirmar os resultadosobservados no terceiro grupo. Como tal, o estudo foiterminado. Resultados não-ligados são resumidos abaixo.
2.2 Resultados farmacodinâmica
A contagem de reticulócito (número absoluto eporcentagem) demonstrou um aumento na dose-dependente comaumento da dose do peptídeo I. A contagem do reticulócitoalcançou um máximo em aproximadamente 7 dias após a doseem todas as doses dos grupos. Uma comparação da respostados reticulócitos máxima, e reticulócito versus curva dotempo (AUCo-14 dias e AUC0-28 dias) demonstrou diferençassignificantes dentre os grupos de doses (p<0,05).
A resposta da hemoglobina e a mudança da linha de base(ambos médio e máximo) durante os 2 8 dias pós-dosedemonstraram aumentos dose-dependentes do aumento da dosedo peptídeo I enquanto que o grupo controle exibiu umadiminuição suave na hemoglobina sobre o tempo secundáriopara o estudo relacionado a perda de sangue sem estímulosexógenos concomitantes de eritropoiese [uma via deAnálise de variação (ANOVA) valor ρ de 0,0001]. Uma viade análise de co-variação (ANCOVA) usando modelosmisturados foi utilizada para comparar alteraçõesindividuais a partir da linha de base durante o tempoentre todos os quatro grupos. Os resultados desta análisedemonstraram que uma resposta da dose significante dentretodos os quatro grupos dosados (p = 0,0001), comdiferenças significantes entre o 0,025 versus 0,1 mg/kgdos grupos (p=0,0027), bem como o 0,05 versus 0,1 mg/kggrupos (p=0,0113). 0 PAD do peptídeo I que foi associadocom pelo menos 1,0 g/dL de aumento na hemoglobina foi de0,1 mg/kg.
Adicionalmente, os indivíduos nos grupos 3 e 4 (0,1 mg/kgdo peptídeo I ou placebo) foram seguidos durante 42 diasapós a dose. No dia 42, a média de nível de hemoglobinaretornou a linha de base no indivíduo tratado com 0,1mg/kg do peptídeo I, mas foi ainda abaixo dos valores delinha de base nos indivíduos placebo. Assim, no dia 42, edurante o estudo, a diferença na alteração da hemoglobinada linha de base foi de > 0,5 g/dL entre os indivíduosdosados com 0,1 mg/kg do peptídeo I versus àquelesdosados com o placebo.
Os níveis de EPO no soro diminuíram transitoriamente como aumento da dose do peptídeo I. Alternações e outrosparâmetros fármaco-cinéticos (contagem de célula vermelhaaumentada e hematócrito, diminuição transitória emferritina e conteúdo de hemoglobina reticulócito, aumentotransitório na proteína receptora de transferrina, ediminuição transitória de EPO) foram consistentes com oestímulo de eritropoiese.
2.3 Resultados fármaco-cinéticos.
Após as doses IV de 0,025, 0,05, e 0,1 mg/kg do peptídeo1 durante um período de 5 minutos, as concentrações dofármaco geralmente chegaram ao máximo entre 5 minutos e 1hora após o início da infusão. Em grupos de doses de0,025 mg/kg, a concentração do peptídeo atingiu o máximoentre 5 e 15 minutos, enquanto o tmax alcançou 1 hora paraa dose de 0,1 mg/kg. Após o Cmax ser alcançada, aconcentração no plasma diminuiu e foi, geralmente,quantificável (> 25 ng/mL) até 96 horas após a dose de0,025 mg/kg, no quinto dia para a dose de 0,05 mg/kg. Eaté o sétimo dia, para a dose de 0,1 mg/kg. As meias-vidacalculadas demonstraram um pequeno aumento na dose de 0,1mg/kg, com uma variação de: 16,7-21,9 horas (média de19,2 horas) seguido de uma dose de 0,025 mg/kg; 15,3-25,1horas (média de 18,7 horas) seguido da dose de 0,05mg/kg; e 17,7-33,1 horas (média de 23,5 horas) após adose de 0,1 mg/kg.
A distribuição do fármaco e a eliminação mostram nãoseguir o padrão de comportamento cinético um ou dois. Aprimeira ordem cinética foi observada em concentraçõesinferiores do fármaco apenas, sugerindo uma saturação dosprocessos metabólicos/eliminação nas concentrações emexcesso no plasma de aproximadamente 400 ng/mL. O volumede distribuição demonstrou pequena alteração com a dose(média de 2165, 1903 e 2010 mL para as doses 0,025, 0,05e 0,1 mg/kg, respectivamente). A limpidez do plasmademonstrou um pequeno declínio com a dose, com médiageométrica de 78,0, 70,7 e 59,1 mL/hora para as doses de0,025, 0,05 e 0,01 mg/Kg, respectivamente. ANOVA da dosedos dados normalizados de Cmax/ e AUC(o-infinito) demonstrouevidências de não-linearidade em doses elevadas de 0,1mg/kg, associadas possivelmente, com a pequena diminuiçãoobservada na limpidez do fármaco em doses maiores.
2.4 Resultados de segurança.
Quinze indivíduos (4 de 8 receberam placebo e 11 de 2 0receberam o peptídeo I) experimentando um total de 2 8efeitos colaterais (Aes) (6 no grupo placebo e 22 nogrupo do peptídeo I). Para os indivíduos dosados com opeptídeo I, dores de cabeça (4/20, 20,0%) e doresabdominais (2/20, 10,0%), náusea (2/20, 10,0%), enasofaringite (2/20, 10,0%) foram os eventos maisfreqüentemente relatados. Todos os Aes, exceto um, foramclassificados como suaves (Grade 1) . A maioria dos Aesobservados, dentre os receptores do peptídeo I (15/22),foi considerada como não estando, provavelmente,relacionados ao estudo do fármaco, o peptídeo I. Nãoexiste diferença na freqüência, severidade ou padrão deAes entre os quatro grupos. Não foram sérios os efeitoscolaterais (SAEs) ou retrocesso do estudo devido ao AE;entretanto, o estudo do fármaco foi descontinuado para umindivíduo assinalado em uma dose de 0,025 mg/kg do grupopeptídeo I devido a uma reação moderada ao fármaco. Estareação que iniciou dentro de 2 minutos da infusão foi uminício de ruborização no tórax expandido para a face, comuma sensação de muito calor, desconforto e uma irritaçãona garganta. Como uma precaução de segurança, a infusãofoi descontinuada para este indivíduo. Os sintomasresolveram espontânea e rapidamente. Nenhuma intervençãoterapêutica foi requerida. Não existiu alteração nossinais vitais. Os parâmetros de laboratório foram normaisincluindo teste imunológico adicional; portanto, anatureza específica desta reação não pode ser elucidada.
Reações similares do fármaco (ou mais severas) foramobservadas com muitos fármacos, incluindo outros ESAs.
Adicionalmente, os pacientes foram observados durante aadministração IV do peptídeo I. Uma injeção seriadescontinuada se um paciente desenvolvesse sintamossimilares.
Um receptor do placebo e um receptor do peptídeo Itiveram medicações concomitantes para a dor de cabeçamoderada e espamos abdominais moderados, respectivamente.
Não existiu alterações clinicamente significantes nossinais vitais, eletrocardiograma (ECGs) ou valoreslaboratoriais. Nenhum dos indivíduos nesta triagemdesenvolveu anticorpos específicos para o peptídeo I.
2.5. Sumário
Em resumo, o peptídeo I parece seguro e bem tolerado apósdoses IV únicas de 0,025, 0,05, ou 0,1 mg/kg, com umperfil de segurança similar ao do placebo. Os resultadosfármaco-cinéticos mostram uma vida-média na faixa deaproximadamente 15 a 33 horas, com uma média de 23,5horas em uma dose de 0,1 mg/kg. A média foi comparávelpara todas as doses, ocorrendo 15 minutos após o inícioda infusão. Cmax parece ter uma relação linear com dose;AUC(o-ínfinito) parece ser não-linear em doses de 0, mg/kg.
Na primeira ordem cinética foram observados emconcentrações menores da droga apenas, sugerindosaturação dos processos metabólicos/eliminação nasconcentrações do plasma > 400 ng/mL. O Peptídeo I mostrouuma atividade farmacológica para os reticulócitos detodas as doses avaliadas; geralmente as respostas foramdose-dependentes com respostas maiores e mais longas comaumento da dose. O grupo de dose de 0,1 mg/kg foidefinido como o PAD em NHV como sendo associado com umaumento significante clinicamente e estatisticamente nahemoglobina a partir da linha de base, com uma médiamáxima de aumento a partir da linha de base de 1,3 6 +0,39 g/dL entre os 10 receptores dos peptídeos I.
Alterações em outros parâmetros farmacodinâmicos(contagem aumentada das células vermelhas, diminuição datransição na ferritina e conteúdo de hemoglobina dosreticulócitos, aumento da transição na proteína doreceptor de transferrina solúvel, e diminuição datransição em EPO) foram consistentes com estímulo deeritropoiese.
Incorporado aqui por referência em sua íntegra é o pôstere o resumo #0470 apresentado para a "European HematologyAssociation IOth Annual Congress in Stockholm" em Junho4, 2005.
EXEMPLO 14:
Aumento nos níveis de hemoglobina na pré-diálise,diálise, e pacientes da oncologia.
1. Pacientes da pré-diálise
Um estudo de segurança para as doses seqüenciaisescalonadas, aleatórias, dupla-ligação, placebo-controlado, farmacodinâmica e farmacocinética de dosesintravenosas únicas de uma injeção do peptídeo I empacientes com doença de rim crônica (CKD) que não estavaem diálise e que não tinha passado antes por tratamentocom agente estimulante de eritropoiese (ESA) foiconduzido. Este estudo irá avaliar o perfil de segurançados níveis de dose (IV) intravenosas únicas do peptídeo Iem pacientes CKD não em diálise (pacientes em pré-diálise). Este estudo também irá: avaliar a relação deresposta da dose de uma dose única do peptídeo I nosparâmetros farmacodinâmicos incluindo, hemoglobina,reticulócitos, e armazenamento de ferro; avaliar o perfilfármaco-cinético dos níveis de doses únicas do peptídeo Iintravenosamente em paciente de pré-diálise; determinar adose ativa farmacologicamente (PAD) intravenosamente empacientes de pré-diálise, por exemplo, a dose que resultaem >7 0% dos pacientes conseguindo um aumento nahemoglobina de > 1 g/dL a partir da linha de base.
0 ponto final do estudo irá concluir: efeitos colaterais(Eas); efeitos colaterais sérios (SAES); parâmetrosf ármaco-cinético incluindo Cmax; AUC0-tAUC0-infinito; ti/2p,Vd, e CL; parâmetros farmacológicos incluindoreticulócitos, hemoglobina, conteúdo de hemoglobina noreticulócito, e medida do soro do ferro armazenado (porexemplo, ferritina no soro, saturação de transferrina, eproteína receptora de transferrina); média de alteraçãoda hemoglobina a partir da linha de base; alteraçãomáxima da hemoglobina a partir da linha de base;proporção dos pacientes tratados que alcançaram > 1 g/dLde aumento na hemoglobina a partir da linha de base; efreqüência de transfusão de células sangüíneas vermelhas.
Os pacientes selecionados para o estudo serão àquelespacientes da pré-diálise com idades entre 18-75 anos comhemoglobina > 9 g/dL e < 11 g/dL secundária para doençarenal crônica, os quais não tiveram tratamento prévio comESAs e os quais encontraram critério de elegibilidade15 serão arrolados. Em cada grupo de 9 pacientes, ospacientes serão escolhidos aleatoriamente para receberuma dose única do peptídeo I (n = 7) ou placebo (n = 2).
Para assegurar a disponibilidade dos dados para um mínimode 22 dias em 5 pacientes tratados com peptídeo I porgrupo, o terceiro e os pacientes subseqüentes em um grupoque terminaram o estudo antes do dia 22 foramsubstituídos. Cada paciente substituído será designadopara o mesmo grupo de tratamento que o paciente queabandonou. Os pacientes que terminaram o estudo após dodia 22 não foram substituídos.
Até o nível de 6 doses por grupo (até 4 níveis de dosesplanejadas e LIP para 2 níveis de dose inferior) ,intermediário, e/ou repetida (nível de doseconfirmatória) são planejadas para serem arroladas,seqüencialmente, como determinado pelo monitor desegurança independente "Independent Safety Monitor",investigador e patrocinador. Um máximo de 54 pacientesavaliados pode ser arrolado nesta triagem.
Cada paciente no estudo é esperado para participar porpelo menos 2 8 dias seguidos da dosagem.
Cada paciente irá receber uma dosagem única do peptídeo Iou placebo. Os níveis de dose do peptídeo I planejadosseqüencialmente são:
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Dose adicional, confirmatória, intermediária, ou inferiorDose adicional, confirmatória, intermediária, ou inferior
Este estudo foi realizado com dose escalonada, aleatória,de dupla ligação, placebo controlado, doses seqüenciaiscom a dose G nos grupos de 9 pacientes de pré-diálise porgrupo. Em cada grupo, os pacientes irão seguir através de29 dias, ou até estabilizar os efeitos colaterais,qualquer um que ocorrer depois. Os níveis de hemoglobinairão seguir em todos os pacientes até os níveis elevadosretornaram para dentro de 0,5 g/dL dos níveis da linha debase.
A concentração da hemoglobina na linha de base é definidacomo a média de três valores mais recentes de hemoglobinaantes do estudo da dosagem do fármaco. Durante o estudo,alterações na hemoglobina para um grupo de iniciação oude decisão final requer a confirmação através do próximovalor de hemoglobina consecutivo.
Se um nível de hemoglobina do paciente alcançar 14 g/dL,o paciente seria flebotomizado se indicado clinicamente.Se um nível de hemoglobina do paciente alcançar 16 g/dL(confirmado), o paciente seria flebotomizado.
Após a dosagem do primeiro grupo, registro subseqüente dopróximo grupo no nível de dose seguinte será baseado noprotocolo especificado no critério de dose escalonado. Aescala de dose para o próximo nível de dose do grupo seráfinalizada no critério de protocolo especificado. Ummonitor de segurança independente, com conhecimento, irárever os dados clínicos e laboratoriais conhecidos em umabase avançada para determinar quando a escala de dose ouo critério final foi encontrado.
0 técnico clínico investigador e o responsável clínicopatrocinador serão ocultados do tratamento do pacienteindividualmente identificado PK, hematológico, e osresultados de parâmetro do ferro incluindo hematócrito,hemoglobina, MCHC (média da concentração de hemoglobinacorpuscular), MCH (média de hemoglobina corpuscular), MCV(média do volume corpuscular), contagem de reticulócito,e conteúdo de hemoglobina de reticulócito, ou o resultadodo armazenamento de ferro incluindo ferritina, saturaçãode transferrina, e proteína do receptor de transferrina;contudo, esta pessoa pode revisar os resultadosidentificados para estes parâmetros, como resultado, seidentificado pelo paciente, poderia, potencialmente, como conhecimento para o tratamento fornecido.
Iniciando quando todos os pacientes avaliados (não menosque 7) em um grupo alcançando o 222 dia, a escala de dosepara o próximo grupo é deixada se nenhuma preocupação desegurança foi identificada e: nenhum paciente no grupoalcançou um aumento na hemoglobina >1,0 g/dL; ou todosos pacientes que receberam o peptídeo I e conseguiram umaumento na hemoglobina > 1,0 g/dL a partir da linha debase demonstrou tanto estabilidade (dentro de 0,5 g/dL dopico do valor de hemoglobina) ou reversibilidade(diminuição do pico do valor de hemoglobina) sobre ummínimo de dois pontos de tempo.
0 registro de novos pacientes no grupo atual e a escalapara uma nova dose serão interrompidos se qualquer doscritérios a seguir for encontrado: dois ou mais pacientesem um grupo tem uma grade de 3 ou 4 do peptídeo Irelacionado com efeito colateral; dois ou mais pacientesque receberam o peptídeo I em um grupo tendo um aumentode > 2,0 g/dL na hemoglobina (início com aumento acima donível da linha de base) sobre qualquer período de 4semanas; ou dois ou mais pacientes que receberam opeptídeo I em um grupo excedendo acima do limite da faixaalvo de hemoglobina (> 13 g/dL).
Se nenhuma preocupação com segurança foi identificada, umgrupo adicional de 9 pacientes pode ser iniciado apóstodos os pacientes serem avaliados (não menos que 7) emum grupo alcançaram os 22 dias para confirmação de estudoem doses (repetidas), inferiores, ou intermediárias.
É esperado que para os pacientes de pré-diálise, um PADde 0,025 a 0,2 mg/kg, possivelmente 0,05-,l mg/kg,possivelmente de 0,067 a 0,075 mg/kg, será determinado.
2. Pacientes de diálise.
Uma dose de abertura marcada, multi-centro, seqüencial,foi encontrada no estudo para a segurança,farmacodinâmica, e farmacocinética da injeção do peptídeoI administrado intravenosamente para o tratamento demanutenção de anemia em pacientes em hemodiálise crônicaserá realizado para determinar a faixa de administraçãointravenosa mensal de doses do peptídeo I que mantém ahemoglobina dentro de 1,0 g/dL acima ou abaixo da linhade base dos pacientes em hemodiálise cujos valores dehemoglobina foram estável em alfa Epoietina. Este estudotambém irá avaliar o perfil de segurança até 3 doses dopeptídeo I administrado intravenosamente em pacientes emhemodiálise; avaliar o perfil em farmacocinética em até 3doses do peptídeo I administrado intravenosamente empacientes de hemodiálise (em um sub-sistema de estudo dospacientes).
0 ponto final do estudo inclui: média semanal dealteração da hemoglobina a partir da linha de base;número (%) de pacientes com hemoglobina dentro de 1,0g/dL acima ou abaixo da linha de base através da 13semana; número (%) de pacientes que mantém a hemoglobinadentro de 9,5 - 13,0 g/dL através da 13 semana; número(%) dos pacientes sem o ajuste de dose durante o estudo eo número (%) de pacientes com aumento da dose oudiminuição durante o estudo; freqüência de transfusão dascélulas sangüíneas vermelhas; parâmetros farmacológicosadicionais incluindo contagem de reticulócito (absoluto eAUC) , conteúdo de hemoglobina no reticulócido, e medidado sro do armazenamento do ferro (por exemplo, ferritinaη soro, saturação de transferrina, e proteína receptorada transferrina solúvel); efeitos colaterais; efeitoscolaterais sérios, e parâmetros fármaco-cinéticosincluindo Cmax; AUC0^t AUC0-Infinito, ti/2p; Vd, Vss e CL (em umsub-sistema de estudo de pacientes). Os resultados daanálise fármaco-cinética e farmacodinâmica será usadopara determinar o fator de conversão preliminar quemelhor prevê a dose mensal do peptídeo I com base na dosesemanal de alfa Epoietina.
Os pacientes selecionados para o estudo serão àquelespacientes de hemodiálise com idade de 18 anos ou maisvelhos com hemoglobina estável mantida em uma doseestável de alfa Epoietina disponível comercialmente eàqueles que encontraram o critério de elegibilidade serãoarrolados. Até 4 níveis de dose seqüenciais nos grupos de15 pacientes por grupo são planejados para seremarrolados em 3 a 10 centros clínicos.
Para garantir a disponibilidade dos dados em um mínimo de10 pacientes por grupo, que receberam as 3 doses dopeptídeo I, a 62 e os pacientes subseqüentes em um grupoque terminam o estudo antes de receber a 3 a dose serãosubstituídos, ate'um máximo de 4 substituições. Ospacientes que terminam o estudo após receber as 3 dosesnão serão substituídos.
Dois níveis de dose nos grupos são inicialmentesubstituídos para serem arrolados seqüencialmente.
Dependendo do perfil de segurança observado e da respostafarmacológica, até 2 grupos adicionais de 15 pacientes emcada um podem ser adicionados ao estudo dos níveis dedose inferior, intermediária, e/ou repetidas(confi rmatoria), e/ou a freqüência de administração.
Um mínimo de 30 e um máximo de 60 pacientes avaliadospodem ser arrolados nesta triagem. Cada paciente noestudo é esperado por participar em aproximadamente 15semanas seguindo um período de varredura de 4 semanas.
Uma modificação na extensão da duração de dose por umadicional de 12 semanas é planejada dependendo dos dadosde suporte disponibilizados.
As doses do peptídeo I serão administradas a cada 4semanas por um total de três doses em injeções de bolointravenoso rápido por 30 segundos durante os últimos 15minutos de diálise. Cada paciente em um grupo receberádoses de abertura marcadas do peptídeo I iniciando em umnível de conversão pré-especifiçado de alfa Epoetina paraPeptídeo I. A dose será escalada ou não para o próximogrupo com base na relação de resposta à dose observada nogrupo anterior. As conversões do nível de dose dopeptídeo I inicial planejadas são:
<table>table see original document page 160</column></row><table>
A dose do peptídeo I pode ser ajustada em pacientesindividuais como a seguir. Iniciando com a 3 a dose dopeptídeo I do estudo do fármaco, a dose será aumentada em25% se a diminuição da hemoglobina confirmada do pacientefor > 1,0 g/dL a partir da linha de base ou umadiminuição da hemoglobina confirmada em > 0,5 g/dL apartir da linha de base para um nível inferior a 11 g/dL.
Iniciando com a 3a dose do estudo do fármaco, a dose seráreduzida em 25% se um aumento da hemoglobina confirmadado paciente for > 1,5 g/dL a partir da linha de base ouum aumento da hemoglobina confirmado no paciente > 0,5g/dL a partir da linha de base até um nível acima de 12g/dL. A próxima dose será reduzida em 25% se em qualquertempo durante o estudo um aumento de hemoglobina forconfirmado no paciente (aumento iniciando acima da linhade base) em > 1,0 g/dL dentro de qualquer período nas 2semanas. Se em qualquer período durante o estudo, umahemoglobina confirmada no paciente exceder 12,5 g/dL, apróxima dose será adiada até a hemoglobina diminuir em12,0 g/dL e a dose será reduzida em 25%.A concentração de hemoglobina na linha de base é definidacomo a média de 3 mais os valores de hemoglobina atuaisde pré-diálise médios da semana colhidos nas 3 semanasantes da administração do fármaco do estudo. Durante oestudo, a alteração no nível da hemoglobina para ajustesdas doses individuais ou grupo de início ou decisões decritério de finalização requerem confirmação com um valorde hemoglobina repetido em qualquer tempo dentro dos 7 dias.
Esta é uma triagem para encontrar a dose de aberturamarcada, seqüencial, com 2-4 grupos de tratamento com 15pacientes de hemodiálise por grupo. Cada pacientereceberá uma dose intravenosa de peptídeo I a cada 4semanas por um total de 3 doses. Após receber a primeiradose do peptídeo I, os pacientes serão visitados pelomenos semanalmente durante o estudo. Durante o estudo, ostatus do ferro será mantido pelo guia de tratamento por"Kidney Outcomes Quality Initiative (K/DOQI)".
Os pacientes serão deixados por um mínimo de 42 dias apósa última administração do peptídeo I, ou até estabilizaros efeitos colaterais, qualquer um que ocorrer porúltimo. Após cessar o tratamento, os níveis dehemoglobina serão deixados em todos os pacientes até oretorno da faixa alvo.
Se um nível de hemoglobina do paciente alcançar 14 g/dL(confirmado), o paciente pode ser flebotomizado pelojulgamento do investigador. Se um nível de hemoglobina dopaciente alcançar 16 g/dL (confirmado) , o paciente seráflebotomizado. 0 método de flebotomia será feito pelaprática clínica padrão de sítio. 0 volume de sangueflebotomizado será documentado. Os pacientesflebotomizados serão descontinuado de receber o peptídeoI e os dados farmacodinâmicos pós-flebotomia serãoexcluídos da análise.
Após a dosagem do primeiro grupo, a lista subseqüente dopróximo grupo é baseada em um escala de dose protocolo-específica e pelo critério de não-escalonamento. Uma vezque o fator de conversão do nível de dose apropriado éidentificado, o fator de conversão do nível de dose podeser repetido em um grupo de confirmação. 0 monitor desegurança independente e o patrocinador irá rever osdados clínicos e de laboratório em uma base avançada paradeterminar quando a escala de dose, a não-escala, o grupoadicional, ou o critério de finalização serãoencontrados.
Iniciando na 1- semana, os dados de revisão de 6 ou maispacientes arrolados em um grupo, o arrolamento no grupoatual pode ser interrompido e a escala da dose ao próximogrupo será deixada se nenhuma preocupação de segurançafor identificada pelo monitor de segurança independente euma combinação de 6 ou mais pacientes tiveram umadiminuição de hemoglobina confirmada a partir da linha debase de mais que 1,0 g/dL na Ί- semana ou mais tarde.Iniciando na Ί- semana, os dados de revisão de 6 ou maispacientes arrolados em um grupo, o arrolamento no grupoatual pode ser interrompido e uma dose não-escalonada aopróximo grupo será deixada se nenhuma preocupação desegurança for identificada pelo monitor de segurançaindependente e uma combinação de 6 ou mais pacientestiverem um aumento da hemoglobina confirmada em > 1,0g/dL a partir da linha de base para um valor dehemoglobina > 13,0 g/dL ocorrendo na 1- semana ou maistarde ou um aumento de hemoglobina confirmado > 1,0 g/dL(inicio do aumento acima da linha de base) dentro dequalquer período de tempo nas duas semanas após a entradado estudo.
Iniciando na 7â semana, os dados de revisão de 10 ou maispacientes arrolados em um grupo, se nenhuma preocupaçãode segurança for identificada pelo monitor de segurançaindependente, um grupo adicional pode ser iniciado para oestudo do fator de conversão de dose inferior,intermediária (entre o atual e o estudo prévio), e/oufreqüência de administração. Um máximo de dois gruposadicionais pode ser arrolado.Após a revisão dos dados da 1- semana de 10 ou maispacientes arrolados em um grupo, um grupo de confirmaçãoutilizando o mesmo fator de conversão pode ser iniciadopara repetir o mesmo fator de conversão e/ou a freqüênciade administração se nenhuma preocupação com a segurançafoi identificada pelo monitor de segurança independente enenhuma escala de dose ou regra de dose não-escalonadafoi encontrada.
O arrolamento de novos pacientes no grupo atual e naescala para uma nova dose será interrompido se oscritérios a seguir forem encontrados: 3 pacientes em umgrupo tiverem uma grade 3 ou uma grade 4 do peptídeo Irelacionado com efeitos colaterais.
É esperado que para os pacientes de diálise, um PAD de0,025 a 0,2 mg/kg, possivelmente 0,05-0,1 mg/kg,possivelmente de 0,067 a 0,075 mg/kg, será determinado.
3. Pacientes da oncologia
Um estudo de segurança de uma dose de abertura marcada,multi-centro, dose-escalonada, farmacodinâmica, efarmacocinética de peptídeo I administradosubcutaneamente em pacientes com câncer com anemiainduzida por quimioterapia (CIA) será conduzido paradeterminar a dose do peptídeo I a ser administrado a cadatrês semanas por injeção subcutânea (SC) associada comuma resposta da hemoglobina em pacientes com anemiainduzida por quimioterapia. Outros objetivos incluem:avaliar o perfil de segurança até 4 doses do peptídeo Iadministrado subcutaneamente a cada três semanas empacientes com câncer recebendo quimioterapiamielosupressiva concomitante; determinar a alteração apartir da linha de base em Hgb em pacientes com CIA emníveis de dose diferentes do peptídeo I; determinar aproporção de pacientes que tiveram uma resposta de Hgbpara o peptídeo I (como definido no ponto final);determinar a dose do peptídeo I administradosubcutaneamente que aumenta e mantém a hemoglobina nafaixa alvo de 11-13 g/dL em pacientes CIA; avaliar operfil farmacocinético em até 4 doses do peptídeo Iadministrado subcutaneamente em pacientes CIA (em um sub-sistema de estudo de pacientes); e explorar o efeito dafreqüência da dose e a reposição de ferro parenteral emuma dose ativa do peptídeo I.
0 ponto final do estudo irá concluir: proporção depacientes por grupo de tratamento que tiveram um aumento> 2 g/dL no OR da hemoglobina, os quais tiveram umaumento de Hgb de > 1 g/dL a pelo menos 12 g/dL em 4semanas, 9 semanas e 12 semanas na ausência de transfusãoRBC nos 2 8 dias prévios; proporção de pacientes quetiveram um aumento de Hgb de > 1 g/dL a partir da linhade base em 4 semanas, 9 semanas e 12 semanas na ausênciade transfusão RBC nos 2 8 dias prévios; proporção depacientes que tiveram um Hgb na faixa alvo de 11-13 g/dLem 4 semanas, 9 semanas e 12 semanas; proporção dosvalores de Hgb na faixa alvo de 11-13 g/dL após 4semanas; alteração média de hemoglobina a partir da linhade base; freqüência de transfusão de células sangüíneas
vermelhas; parâmetros farmacológicos adicionais incluindocontagem de reticulócito (absoluto e AUC), conteúdo dehemoglobina em reticulócito; alteração na medida doarmazenamento de ferro, por exemplo, saturação detransferrina e ferritina no soro; efeitos colaterais(Aes); efeitos colaterais sérios (SAEs); e em um sub-sistema de estudo dos parâmetros fármaco-cinéticos dospacientes incluindo Cmax, AUC0-t, AUC0-Infinito, ti/2p(eliminação da meia-vida), Vd (volume aparente dadistribuição) , Vss (volume estável confirmado), e CL(libertação).
Os pacientes selecionados para o estudo serão àqueles comtumores sólidos ou Iinfornas, idades de 18-80 anos comhemoglobina > 9 g/dL e < 11 g/dL secundário àquimioterapia, os quais não tiveram tratamento prévio comESA dentro dos próximos 90 dias e os quais encontraram ocritério de elegibilidade e serão designados para opeptídeo I na dose inicial ou nível de dose seqüencialsubseqüente aprovada pelo monitor médico (MM). Paragarantir a disponibilidade dos dados nas 12 semanas em ummínimo de 10 pacientes tratados por grupo de tratamento,o 62 e o paciente subseqüente em um grupo, que terminou oestudo antes da 8â semana, será substituído, até ummáximo de 5 substituições. Cada paciente substituído serádesignado para o mesmo grupo de tratamento que o dopaciente que foi eliminado. Até 4 grupos de tratamentocom abertura marcada de 15 pacientes podem sersubseqüentemente adicionados ao estudo de dose inferior,intermediária, e/ou nível de dose repetida e/oufreqüência de administração do peptídeo I e/ou reposiçãode ferro parenteral para manter o nível de saturação datransferina em 2 5-50%. Um mínimo de 30 e um máximo de 90pacientes (não incluindo as substituições) podem serarrolados nesta triagem se todos os possíveis regimes dedosagens foram explorados.
Cada paciente no estudo é esperado participar de até 12semanas seguindo até um período de 4 semanas devarredura.
Grupos seqüenciais de 15 pacientes serão recebidos naescala de doses do peptídeo I. As doses de aberturamarcadas serão administradas por injeção SC a cada 3semanas por um total de quatro doses (semanas de estudo1, 4, 7, 10). Tipicamente, o peptídeo I seriaadministrado no dia 1 de um ciclo de quimioterapia. Opeptídeo I iniciando a dose e a freqüência de dosagem foibaseada nos dados da fase 1 em voluntários saudáveis bemcomo as respostas previsíveis modeladas dos dados PK/PDdas respostas de eritropoiético para o peptídeo I eoutros agentes de estímulo da eritropoiese (ESAs). Osníveis de dose do peptídeo I planejados e o número depacientes em cada grupo são:
<table>table see original document page 165</column></row><table>Os pacientes serão deixados por 2 8 dias após a últimainjeção, ou até a estabilização dos efeitos colaterais,ou valores de hemoglobina estarem entre 11-13 g/dL osquais sempre sucedem por último. Nenhum aumento da doseserá deixado. Após 4 semanas; se as transfusões RBC sãorequeridas para manter o Hgb na faixa alvo, o pacienteserá removido do estudo do fármaco, retornando ao padrãode cuidados, e será deixado por um adicional de 28 diaspor segurança. Se em qualquer período durante o estudo,um aumento de hemoglobina no paciente for > 1,0 g/dLdentro de qualquer período nas 2 semanas, a próxima doseirá reduzir a demora até a hemoglobina estabilizar (umaumento de < 0,5 g/dL em uma semana) e a dose seráreduzida em 50%. A concentração de hemoglobina na linhade base é definida como a média de 2 valores semanaismais recentes da hemoglobina colhidos na semana antes daadministração do fármaco do estudo (por exemplo, valoresde varredura e de linha de base). Durante o estudo,alterações no nível de hemoglobina para o grupo inicialou decisões para o critério de finalização requeremconfirmação por um valor de hemoglobina consecutivoseguinte, próximo dos 7 dias.
Esta é uma triagem de abertura marcada, multi-centro, comaté 6 grupos de tratamento com 15 pacientes de CIA porgrupo. Nos grupos de tratamento iniciais, o peptídeo I deabertura, marcado, será administrado por injeçãosubcutânea a cada 3 semanas por um total de até 4 doses.
Após a primeira dose, os pacientes será visitados pelomenos uma vez semanalmente durante o estudo. Os pacientesserão deixados por um mínimo de 2 8 dias após a últimaadministração do fármaco do estudo, ou até aestabilização dos efeitos colaterais, ou os valores dehemoglobina estejam entre 11-13 g/dL ou qualquer um queocorra por último. Se um nível de hemoglobina do pacientealcançar 14 g/dl (confirmado), o paciente pode serflebotomizado se indicado clinicamente e o volume deflebotomia documentado. Os pacientes flebotomizadosdescontinuarão o recebimento do fármaco do estudo e osdados farmacodinâmicos pós-flebotomia serão excluídos daanálise. 0 monitor médico (MM), e o patrocinador serãorevisados para a segurança e os dados farmacodinâmicos emuma base avançada para determinar se e quanto o critériode interrupção deve ser encontrado.
Após 6 ou mais pacientes arrolados em um grupo teremcompletado pelo menos 6 semanas de tratamento (ou seja,pelo menos três semanas seguindo a segunda dose) , osarrolados no grupo atual podem ser interrompidos e a doseescalada para o próximo grupo é deixada se: nenhumapreocupação com a segurança for identificada pelo MM; e 6ou mais pacientes foram de transfusão após a 4 semana outiveram um aumento de hemoglobina confirmado < 1 g/dL na6 semana.
Após 6 ou mais pacientes arrolados em um grupo teremcompletado pelo menos 6 semanas de tratamento (ou seja,pelo menos três semanas seguindo a segunda dose) , osarrolados no grupo atual podem ser interrompidos e a dosenão-escalonada para um nível inferior no próximo grupopode ser deixado se: uma ocorrência de pelo menos Grade 3ou Grade 4 de AES relacionada, possivelmente, ao PeptídeoI ou se o MM identificar qualquer preocupação específicacom o peptídeo I; ou um total de 6 ou mais pacientestiverem confirmado um nível de hemoglobina > 13,0 g/dL(não relacionado com a transfusão) , ou um aumento dehemoglobina confirmado > 1,0 g/dL dentro de qualquerperíodo das 2 semanas (não relacionado com transfusão).Se nenhuma preocupação com a segurança for identificadapelo MM e pelo patrocinador, até dois grupos detratamento adicionais de abertura marcados de 15pacientes podem ser introduzidos no estudo de níveis dedose inferior, intermediária (entre o atual e o estudoprévio) ou níveis de doses repetidas. Adicionalmente, umavez que a dose ativa, administrada a cada três semanas édeterminada, até 2 grupos adicionais podem ser arroladospara determinar o efeito relativo da mesma dose totaladministrada em frações em uma freqüência diferente (porexemplo, 4/3 a cada 3 semanas, doses administradas a cada4 semanas). 0 efeito da administração do ferro parenteralpara conseguir uma saturação de transferrina de 25-50%pode também ser explorado em um grupo separado.
É esperado que para os pacientes da oncologia, um PAD de0,075-0,5 mg/kg, possivelmente de 0,2-0,4 mg/kg,possivelmente 0,2 5 mg/kg, será determinado.
A invenção presente não será limitada no escopo pelasconfigurações específicas descritas aqui. De fato, váriasmodificações da invenção além daquelas aqui descritastornar-se-ão aparentes para aqueles treinados na técnicaa partir da descrição anterior e das figuras queacompanham o pedido. Tais modificações tencionam cairdentro da abrangência das reivindicações anexas.
Entenda-se ainda que todos os valores são aproximados, esão providos para descrição.
Numerosas referências, incluindo patentes, pedidos depatente, e várias publicações são citadas e discutidas nadescrição desta invenção. Provê-se a citação e/oudiscussão de tais referências meramente para clarificara descrição da invenção presente e não uma admissão deque qualquer tal referência da técnica anterior seja"técnica anterior" à invenção presente. Todas asreferências citadas e discutidas nesta especificação sãoaqui incorporadas por referência em sua totalidade e namesma extensão como se cada referência fosse incorporadaindividualmente por referência.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Affymax, Inc.
Duliege, Anne-MarieStead, RichardLeuther, KerstinWoodburn, KathrynBarnett, Robert
<120> "Composto para tratar um paciente tendo umdistúrbio".
<130> 04279/2202975-WOO
<150> 60/687,655
<151> 2005-06-03
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> peptideo sintético<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é N-acetilglicina
<220>
<221> MISC FEATURE<223> Xaa é 1-naftilalanina<400> 1
Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln1 5 10 15
Pro Leu Arg Lys20
<210> 2<211> 21<212> PRT<213> artificial
<22 0>
<223> proteína sintética<22 0>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é N-acetilglicina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13) . . (13)
<223> Xaa é 1-naftilalanina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa é N-metilglicina
<400>
2Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln1 5 10 15
Pro Leu Arg Xaa Lys20
<210> 3<211> 20<212> PRT<213> artificial
<220>
<223> proteína sintética<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é N-acetilglicina
<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (13) . . (13)
<223> Xaaé 1-naftilalanina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa é N-metilglicina
<400> 3
Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln15 10 15
Pro Leu Arg Xaa20<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> peptídeo sintético
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> biotinilado
<400> 4
Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Gln15 10 15
Pro Leu Arg Gly20
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<22 0>
<223> peptídeo sintético<22 0>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é N-acetilglicina<22 0>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4) . . (4)
<223> Y cadeia lateral de tBu protegido
<400> 5
Xaa Gly Leu Tyr Ala1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> peptídeo sintético<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> NH2 protegido por Fmoc
<22 0>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> cadeia lateral Acm protegida<22 0>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2) . . (2)
<223> cadeia lateral Trt protegida
<400> 6
Cys His Met Gly1<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> peptídeo sintético<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> NH2 protegido por Fmoc
<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (3) . . (3)
<223> cadeia lateral tBu protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaaé 1-naftilalanina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> cadeia lateral Acm protegida<22 0>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7) . . (7)
<223> cadeia lateral Trt protegida
<400> 7Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln Pro1 5
<210> 8
<211> 3
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> peptídeo sintético<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2) . . (2)
<223> cadeia lateral Pbf protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa é N-metilglicina
<22 0>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3) . . (3)
<223> COOH Bn protegido
<400> 8
Leu Arg Xaa1
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial<220>
<223> peptídeo sintético<20>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é N-acetilglicina
<22 0>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> cadeia lateral tBu protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> cadeia lateral Acm protegida<2 2 0>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (7)..(7)
<223> cadeia lateral Trt protegida
<400> 9
Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly
1 5
<210> 10
<211> 11
<212 > PRT
<213 > artificial
<220><223>
peptídeo sintético<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> ΝΗ2 protegido por Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> cadeia lateral tBu protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaaé 1-naftilalanina
<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (6)..(6)
<223> cadeia lateral Acm protegida<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (7)..(7)
<223> cadeia lateral Trt protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> cadeia lateral Pbf protegida<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa é N-metilglicina<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> COOH Bn protegida
<400> 10
Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln Pro Leu Arg Xaa1 5 10
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> peptídeo sintético
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é N-acetiIglicina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> cadeia lateral tBu protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> cadeia lateral Acm protegida<220>
<221> MISC_FEATURE<222><223>
<220><221><222><223>
<220><221><222><223>
<220><221><222><223>
<220><221><222><223>
<22 0><221><222><223>
<220><221><222><223>
<220><221><222><223>
(7) . . (7)
cadeia lateral Trt protegida
MISC_FEATURE(12)..(12)
cadeia lateral tBu protegida
MIS C_F EATURE(13) . . (13)
Xaaé 1-naftilalanina
MISC_FEATURE(15)..(15)
cadeia lateral Acm protegida
MIS C_F EATURE(16)..(16)
cadeia lateral Trt protegida
MIS C_F EATURE(19)..(19)
cadeia lateral Pbf protegida
MIS C_F EATURE(20)..(20)
Xaa é N-metilglicina
MISC_FEATURE(20)..(20)COOH Bn protegido<400> 11
Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln1 5 10 15
Pro Leu Arg Xaa20
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> peptídeo sintético
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é N-acetilglicina
<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (4)..(4)
<223> cadeia lateral tBu protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> cadeia lateral Acm protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> cadeia lateral Trt protegida<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (12) . . (12)
<223> cadeia lateral tBu protegida
<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaaé 1-naftilalanina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> cadeia lateral Acm protegida
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> cadeia lateral Trt protegida
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> cadeia lateral Pbf protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223 > Xaa é N-metilglicina
<400> 12
Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln1 5 10 15
Pro Leu Arg Xaa20<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> peptídeo sintético<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é N-acetilglicina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> cadeia lateral tBu protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> cadeia lateral Trt protegida<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> cadeia lateral tBu protegida<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (13) . . (13)
<223> Xaa é 1-naftilalanina
<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (16) . . (16)<223> cadeia lateral Trt protegida<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (19)..(19)
<223> cadeia lateral Pbf protegida<220>
<221> MIS C_F EATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa é N-metilglicina
<400> 13
Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln1 5 10 15
Pro Leu Arg Xaa20

Claims (21)

1. Composto para tratar um paciente tendo um distúrbio,definido -por uma deficiência de eritropoietina ou umabaixa ou deficiente população de células vermelhassangüíneas, com uma quantidade terapeuticamente eficaz deum composto que se liga a e ativa o receptor deeritropoietina (EPO-R), dita quantidade terapeuticamenteeficaz sendo administrada em uma dosagem de 0,025 a 0,5miligrama do composto por 1 quilograma do peso do corpode um paciente, dito composto sendo caracterizado pelofato de compreender:(a) uma porção do peptídeo dimérico compreendendo umprimeiro monômero peptídico e um segundo monômeropeptídico, onde o primeiro e o segundo monômerospeptídicos compreendem a seqüência de aminoácido(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR;(b) uma porção ligante covalentemente ligada ao referidosmonômeros peptídicos;(c) pelo menos um poli(etileno glicol) (PEG)compreendendo um PGE linear, não-ramifiçado tendo pesomolecular de 10,000 a 60,000 Daltons; e(d) uma porção espaçadora covalentemente unida à referidapelo menos um PEG ligada à porção ligante e tendo afórmula selecionada a partir do grupo consistindo de:onde cada R4 é independemente selecionado do grupoconsistindo de NH, NHCO, CO, C00, e NHCOO.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de a seqüência de aminoácidocompreender, adicionalmente, (MeG), K, ou (MeG)K.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de a seqüência de aminoácido ser(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de a seqüência de aminoácidos ser(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG).
5. Composto, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de a seqüência de aminoácidos ser(AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o espaçador ser um liganteiminodiacético.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o espaçador ser Tem-átomo-PEG(2,2'-(etilenodioxi(bis(etilamina)).
8. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o ligante ser lisina.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o PEG ter 10, 000 a 60, 000Daltons.
10. Composto, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de o PEG ter 20, 000 a 40,000Daltons.
11. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de compreender ainda, um veiculofarmaceuticamente aceitável.
12. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o distúrbio ser falha renal oudiálise.
13. Composto, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de a quantidade terapeuticamenteeficaz ser uma dosagem de 0,025 a 0,2 miligrama docomposto por 1 quilograma do peso do corpo do paciente.
14. Composto, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de a dosagem ser de 0,05 a 0,1miligrama do composto por 1 quilograma do peso do corpodo paciente.
15. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o distúrbio ser anemiaassociada com uma malignidade.
16. Composto, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de a quantidade terapeuticamenteeficaz ser uma dosagem de 0, 075 a 0,5 miligrama docomposto por 1 quilograma do peso do corpo do paciente.
17. Composto, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de a dosagem ser de 0,2 a 0,4miligrama do composto por 1 quilograma do peso do corpodo paciente.
18. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de a quantidade terapeuticamenteeficaz ser administrada uma vez a cada 3 a 4 semanas.
19. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o distúrbio ser uma aplasia decélulas vermelhas puras (PRCA).
20. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o ligante ser um liganteamida terciário.
21. Composto, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 5, 6, 8 a 18 e 19 a 20,caracterizado pelo fato de o composto ser: <formula>formula see original document page 186</formula>
BRPI0613233-2A 2005-06-03 2006-06-05 composto para tratar um paciente tendo um distúrbio BRPI0613233A2 (pt)

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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7919461B2 (en) * 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
EP2076290B1 (en) 2006-10-27 2016-12-14 Sunnybrook Health Sciences Center Multimeric tie 2 agonists and uses thereof in stimulating angiogenesis
EP2118127A4 (en) * 2007-01-31 2010-12-01 Affymax Inc NICKET-BASED LINKER FOR BONDING MODIFYING GROUPS OF POLYPEPTIDES AND OTHER MACROMOLECULES
WO2009025958A1 (en) * 2007-08-22 2009-02-26 Affymax, Inc. Erythropoietin rceptor peptide formulations and uses
JP2009191056A (ja) * 2008-02-15 2009-08-27 Affymax Inc 合成ペプチドをベースとするｅｐｏレセプターアゴニストを用いた抗エリスロポエチン抗体に媒介された障害の治療
CN103044539B (zh) * 2010-04-09 2014-10-22 苏州元基生物技术有限公司 重组促红细胞生成素及制备方法
CN102838677B (zh) * 2010-04-09 2014-10-22 苏州元基生物技术有限公司 重组促红细胞生成素及制备方法
CN102210872A (zh) * 2011-05-30 2011-10-12 深圳翰宇药业股份有限公司 一种聚乙二醇修饰肽药物制剂及其制备方法
CN103450348B (zh) * 2012-05-29 2016-03-30 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种促红细胞生成素模拟肽、其制备方法和用途
CN104231067B (zh) * 2013-06-07 2017-08-11 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 促红细胞生成素模拟肽化学二聚体及其用途
CN105837681B (zh) * 2015-01-13 2019-04-19 天津药物研究院 一种促红细胞生成素模拟肽衍生物、其制备方法和用途
CN106279398B (zh) * 2015-06-26 2019-06-28 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其制备方法和应用
CN106317217B (zh) * 2015-06-26 2019-06-28 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其制备方法和应用
CN105085653B (zh) * 2015-08-26 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其制备方法和应用
CN105085654B (zh) * 2015-08-26 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其制备方法和应用
CN105153293B (zh) * 2015-08-26 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽及其二聚体、以及制备方法和应用
CN105418754A (zh) * 2015-09-30 2016-03-23 天津药物研究院有限公司 羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽及其制备和应用
CN106608911B (zh) * 2015-10-22 2020-01-07 天津药物研究院有限公司 一种二硫键修饰的epo拟肽衍生物及其制备方法和应用
CN106608913B (zh) * 2015-10-22 2020-05-05 天津药物研究院有限公司 一种1，2，3-丙三酸偶联的epo拟肽衍生物及其制备方法和应用
CN106608912B (zh) * 2015-10-22 2019-09-20 天津药物研究院有限公司 一种脂肪二羧酸偶联的epo模拟肽衍生物及其制备方法和应用
CN105367629B (zh) * 2015-11-09 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种促红细胞生成素模拟肽以及其制备方法和用途
CN116077741A (zh) * 2022-08-24 2023-05-09 深圳先进技术研究院 一种可固定细胞并在体内实现细胞增殖和释放的微米级3d细胞生物支架及其应用

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4677195A (en) 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
JP2876058B2 (ja) 1986-08-18 1999-03-31 エミスフィア・テクノロジーズ・インコーポレイテッド 薬物送達システム
US5006333A (en) 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
WO1990008822A1 (en) 1989-02-03 1990-08-09 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin receptor
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
EP0400472B1 (en) 1989-05-27 1996-04-03 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Process for preparing polyethylene glycol derivatives and modified protein.
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US5292654A (en) 1990-12-13 1994-03-08 Whitehead Institute For Biomedical Research Mutant EPO receptor and uses therefor
JP3507486B2 (ja) 1991-03-15 2004-03-15 アムジエン・インコーポレーテツド 顆粒球コロニー刺激因子の肺内投与
DK0575545T3 (da) 1991-03-15 2003-09-15 Amgen Inc Pegylering af polypeptider
WO1992016555A1 (en) 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
ATE148889T1 (de) 1991-09-18 1997-02-15 Affymax Tech Nv Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
US6153407A (en) 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
US5888511A (en) * 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5830851A (en) 1993-11-19 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5773569A (en) 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5747446A (en) 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5919758A (en) 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5869451A (en) 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5767078A (en) 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
US5654276A (en) 1995-06-07 1997-08-05 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5668110A (en) 1995-06-07 1997-09-16 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5683983A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
ATE254138T1 (de) 1995-06-07 2003-11-15 Ortho Pharma Corp An den erythropoietin-rezeptor bindende zusammensetzungen und peptide
US6251864B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
ATE390439T1 (de) 1995-06-07 2008-04-15 Glaxo Group Ltd An einem thrombopoietin rezeptor bindende peptide und zusammensetzungen
US5677280A (en) 1995-06-07 1997-10-14 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
YU34196A (sh) 1995-06-07 1999-03-04 Glaxo Group Limited Peptidi i jedinjenja koja se vezuju za receptor
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6346390B1 (en) 1996-03-08 2002-02-12 Receptron, Inc. Receptor derived peptides involved in modulation of response to ligand binding
US6103879A (en) 1996-06-21 2000-08-15 Axys Pharmaceuticals, Inc. Bivalent molecules that form an activating complex with an erythropoietin receptor
SI0964702T1 (sl) 1996-08-02 2007-02-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Polipeptidi, ki imajo posamezen kovalentno vezan N-terminalni vodotopni polimer
US5932546A (en) 1996-10-04 1999-08-03 Glaxo Wellcome Inc. Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
EP0935663A2 (en) * 1996-10-25 1999-08-18 G.D. SEARLE &amp; CO. Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists
US6221608B1 (en) 1997-01-22 2001-04-24 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods for identifying erythropoietin receptor binding protein
JP4304757B2 (ja) 1998-04-24 2009-07-29 株式会社デンソー Ａｂｓアクチュエータ
DK2316475T3 (da) 1998-08-06 2017-11-20 Mountain View Pharmaceuticals Inc Isoleret tetramer urikase
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
PL220873B1 (pl) 1998-08-06 2016-01-29 Mountain View Pharmaceuticals Roztwór chromatograficznie oczyszczonej tetramerycznej urykazy
EP1008355A1 (en) 1998-12-08 2000-06-14 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Method for identifying or analyzing polymer linkage sites on macromolecules using amino acid report binding
DE69914611T2 (de) 1998-08-28 2004-12-23 Gryphon Therapeutics, Inc., South San Francisco Verfahren zur herstellung von polyamidketten von genauer länge und deren konjugate mit proteinen
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
KR100719202B1 (ko) 1998-10-23 2007-05-16 키린-암젠 인코포레이티드 ＭＰｌ 수용체에 결합하는 화합물 및 이를 함유하는 제약학적 조성물
JP2002529502A (ja) 1998-11-17 2002-09-10 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 血小板減少症の治療法
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
AUPQ873300A0 (en) 2000-07-12 2000-08-03 Medvet Science Pty. Ltd. A binding motif of a receptor (2)
ATE350044T1 (de) 1999-09-24 2007-01-15 Smithkline Beecham Corp Thrombopoietinmimetika
DE60025241T2 (de) 1999-09-27 2007-01-11 Chugai Seiyaku K.K. HäMOPOIETINREZEPTOR-PROTEIN, NR12
US6703480B1 (en) * 1999-11-24 2004-03-09 Palani Balu Peptide dimers as agonists of the erythropoientin (EPO) receptor, and associated methods of synthesis and use
US6858630B2 (en) 1999-12-06 2005-02-22 Smithkline Beecham Corporation Naphthimidazole derivatives and their use as thrombopoietin mimetics
JP2004512258A (ja) 2000-03-21 2004-04-22 ウィスコンシン　アルムニ　リサーチ　ファンデイション 生物系における細胞応答の調節のための方法および試薬
US6777387B2 (en) 2000-03-31 2004-08-17 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Terminally-branched polymeric linkers containing extension moieties and polymeric conjugates containing the same
DK1311285T4 (en) 2000-05-15 2017-07-24 Hoffmann La Roche Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative
EP1296702A4 (en) 2000-05-26 2005-05-11 Ortho Mcneil Pharm Inc NEUROPROTECTIVE PEPTIDES
RU2003102887A (ru) 2000-08-02 2004-07-27 Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. (Us) Усовершенствованная противовирусная и противоопухолевая химиотерапии путем введения эритропоэтина
AU2001273388B2 (en) 2000-09-08 2005-01-13 Gryphon Therapeutics, Inc. "Pseudo"-native chemical ligation
MXPA03005406A (es) 2000-12-20 2003-09-25 Hoffmann La Roche Conjugados de eritropoyetina.
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US6531121B2 (en) 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
AU2002251988A1 (en) 2001-02-20 2002-09-04 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
FR2823220B1 (fr) 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
US20020169128A1 (en) 2001-04-09 2002-11-14 Geroge Sigounas Erythropoietin ameliorates chemotherapy-induced toxicity in vivo
DE60229958D1 (de) 2001-06-28 2009-01-02 Mountain View Pharmaceuticals Polymerstabilisierte proteinasen
US6784154B2 (en) 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US7122189B2 (en) 2002-08-13 2006-10-17 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US20050176627A1 (en) 2002-09-09 2005-08-11 Anthony Cerami Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US7396913B2 (en) * 2002-10-14 2008-07-08 Abbott Laboratories Erythropoietin receptor binding antibodies
US7560449B2 (en) * 2002-11-06 2009-07-14 Schering Corporation Methods and therapeutic combinations for the treatment of demyelination
GEP20084486B (en) 2002-12-26 2008-09-25 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
AU2003303636B2 (en) 2002-12-26 2010-08-05 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
US7084245B2 (en) 2003-05-12 2006-08-01 Affymax, Inc. Peptides that bind to the erythropoietin receptor
SI1625156T1 (sl) 2003-05-12 2013-02-28 Affymax, Inc. Peptidi, ki se veĹľejo k eritropoetinskemu receptorju
KR20060028675A (ko) 2003-05-12 2006-03-31 아피맥스, 인크. 신규한 폴리 (에틸렌 글리콜) 개질 화합물 및 그의 용도
CA2525399A1 (en) 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Novel spacer moiety for poly(ethylene glycol)-modified peptide-based co mpounds
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses

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