BRPI0613279A2 - anticorpo manoclonal isolado, imunoconjugado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, método para preparar um anticorpo anti-cd19, método para inibir o crescimento de células tumorais expressando cd19, e método para depleção de celulas b num indivìduo - Google Patents

anticorpo manoclonal isolado, imunoconjugado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, método para preparar um anticorpo anti-cd19, método para inibir o crescimento de células tumorais expressando cd19, e método para depleção de celulas b num indivìduo Download PDF

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Abstract

"ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO, IMUNOCONJUGADO, MOLéCULA DE ACIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSAO, CéLULA HOSPEDEIRA, MéTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-CDl9, MéTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE CéLULAS TUMORAIS EXPRESSANDO CDl9 E MéTODO PARA DEPLEçAO DE CELULAS B NUM INDIVìDUO. A presente descrição provê anticorpos monoclonais isolados, especialmente anticorpos monoclonais humanos que ligam-se especificamente a CD19 com alta afinidade. As moléculas de ácido nucleico que codificam tais anticorpos CDl9, vetores de expressão, células hospedeiras e métodos para expressar os anticorpos CD19 são também providos. Imunoconjugados, moléculas biespecíficas e composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos CD19 são também providos. Métodos para detectar CDl9, bem como métodos para tratar diversas malignidades de célula B, incluindo linfoma nâo-Hodgkin, são também descritos.

Description

"ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULADE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULAHOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-CD19,MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAISEXPRESSANDO CDl9 E MÉTODO PARA DEPLEÇÃO DE CÉLULAS B NUMINDIVÍDUO".
HISTÓRICO DA INVENÇÃO
O CD19 é um receptor de membrana de 95 kDa que éexpressado inicialmente na diferenciação da célula B eque continua a ser expressado até que as célulasB sejam ativadas para diferenciação terminal(Pezzutto et al., (1987), I Immunol 138:2793; Tedder etal (1994) Immunol Today 15:437). O domínio extracelularCDl9 contém dois - domínios similares aimunoglobulina (IG) do tipo C2 separados por um domíniomenor ligado potencialmente a dissulfeto. O domíniocitoplásmico CD19 é estruturalmente inédito, porémaltamente conservado entre humano, de camundongo, e deporquinho-da-índia (Fujimoto et al.,(1998) Semin Imraunol.10:267). 0 CD19 é parte de um complexo protéicoencontrado na superfície celular de linfócitos Β. 0complexo protéico inclui CD19, CD21 (receptor decomplemento, tipo 2), CD81 (TAPA-I) e CD225 (Leu-13)(Fujimoto, supra).
0 CD19 é um importante regulador de sinaistransmembrânicos nas células B. Um aumento ou redução nadensidade da superfície celular de CD19 afeta odesenvolvimento e função da célula B, resultando emdoenças tais como autoimunidade ou hipogamaglobulinemia(Fujimoto, supra). 0 complexo CD19 potencializa aresposta de células B a antígeno in vivo através dareticulação de dois complexos de transdução de sinalseparados encontrados em membranas de células B. Os doiscomplexos de transdução de sinal, associados com amembrana IgM e CD19, ativam a fosfolipase C (PLC) atravésde mecanismos diferentes. A reticulação de CD19 e dereceptor célula B reduz o número de moléculas IgMnecessárias para ativar a PLC (Fujimoto, supra; Ghetie,supra). Adicionalmente, o CDl9 funciona como uma proteínaadaptadora especializada para a amplificação de quinasesda família Arc (Hasegawa et al.,(2001) J Immunol 167:3190).
A ligação a CDl9 demonstrou que não só aumenta como inibea ativação e proliferação de célula B, dependendo daquantidade de reticulação que ocorrer (Tedder, supra). 0CD19 é expressado em mais de 90% de linfomas de célula B,sendo previsto que afeta o crescimento de linfomas invitro e in vivo (Ghetie, supra) . Os anticorpos geradospara CD19 são anticorpos murinos. Uma desvantagem aoutilizar um anticorpo murino no tratamento de indivíduoshumanos é a resposta ao anticorpo humano anti-camundongo(HAMA) quando da administração ao paciente.
Conseqüentemente, existe a necessidade de anticorposterapêuticos melhorados contra CD19 que sejam maiseficazes no tratamento e/ou na prevenção de doençasmediadas por CDl9.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção prove anticorpos monoclonaisisolados, especialmente anticorpos monoclonais humanos,que liguem-se a CDlO e que exibam numerosas propriedadesdesejáveis. Essas propriedades incluem ligação de altaafinidade a CDl9 humano. São também providos métodos paratratar uma variedade de doenças mediadas por CD19utilizando os anticorpos e composições da invenção.
Em um aspecto, a invenção refere-se a um anticorpomonoclonal humano, ou a uma porção ou fragmento liganteao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo:
(a) liga-se a CD19 humano com um Kd de IxlO"7 M ou menos;
(b) liga-se a células-B tumorais de Raji e Daudi.
Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo humano,embora em concretizações alternativas, o anticorpo possaser um anticorpo murino, um anticorpo quimérico ou umanticorpo humanizado.
Numa concretização, o anticorpo liga-se a CD19 humanocom um K0 de 5 χ IO-8M ou menos, liga-se a CDl9 humano comum K0 de 2 χ IO-8M ou menos, liga-se a CD19 humano com umKd de 1 χ IO-8M ou menos, liga-se a CDl9 humano com um Kdde 5x10-9 M ou menos, liga-se a CDl9 humano com um Kd de4x10-9M ou menos, liga-se a CD19 humano com um Kd de3x10-9M ou menos, ou liga-se a CD19 humano com um Kd de 2χ IO-9M ou menos.
Em outra concretização, a invenção provê um anticorpomonoclonal isolado, ou a uma porção ligante ao antígenodo mesmo, sendo que o anticorpo faz competição cruzadapara ligar-se a CD19 com um anticorpo de referência,sendo que o anticorpo: (a) liga-se a CD19 humano com umKd de IxlO-7M ou menos; e (b) liga-se a células-B tumoraisde Raji e Daudi. Em diversas concretizações, o anticorpode referência compreende: (a) uma região variável decadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 1; e (b) uma região variável de cadeia levecompreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8;ou o anticorpo de referência compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 1; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:9;
ou o anticorpo de referência compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 2; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:10;
ou o anticorpo de referência compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 3; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:11;
ou o anticorpo de referência compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 4; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:12;
ou o anticorpo de referência compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 5; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:13;
ou o anticorpo de referência compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 6 e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:14;
ou o anticorpo de referência compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 7 e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:15.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpomonoclonal isolado, ou a uma porção ou fragmento liganteao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variávelde cadeia pesada que é o produto de ou derivada de umgene Vh 5-51 humano, sendo que o anticorpo liga-seespecificamente a CDl9. A invenção também provê umanticorpo monoclonal isolado, ou uma porção ou fragmentoligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma regiãovariável de cadeia pesada que é o produto de ou derivadade um gene Vh 1-69 humano, sendo que o anticorpo liga-seespecificamente a CD19. A invenção provê ainda umanticorpo monoclonal isolado, ou uma porção ou fragmentoligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma regiãovariável de cadeia leve que é o produto de ou derivada deum gene Vk L18 humano, sendo que o anticorpo liga-seespecificamente a CD19. A invenção provê ainda umanticorpo monoclonal isolado, ou uma porção ou fragmentoligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma regiãovariável de cadeia leve que é o produto de ou derivada deum gene Vk A27 humano, sendo que o anticorpo liga-seespecificamente a CDl9. A invenção provê ainda umanticorpo monoclonal isolado, ou uma porção ou fragmentoligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma regiãovariável de cadeia leve que é o produto de ou derivada deum gene Vk Ll 5 humano, sendo que o anticorpo liga-seespecificamente a CDl9.
Em uma concretização preferida, a invenção provê umanticorpo monoclonal isolado, ou uma porção ou fragmentoligante ao antígeno do mesmo, compreendendo (a) umaregião variável de cadeia pesada de um gene Vh 5-51 ou 1-69; e (b) uma região variável de cadeia leve de um VkLl8, A2 7, ou Vk Ll5 humano; sendo que o anticorpo liga-seespecificamente a CD19.
Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpomonoclonal isolado, ou porção ligante ao antígeno domesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesadaque compreende seqüências CDRl, CDR2 e CDR3; e uma regiãovariável de cadeia leve que compreende seqüências CDRl,CDR2 e CDR3; sendo que (a) a seqüência CDR3 da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de seqüênciasde aminoácido de SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36e suas modificações conservativas; (b) a seqüência CDR3da região variável de cadeia leve compreende umaseqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindode seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 50, 51, 52,53, 54, 55, 56, 57 e 58, e suas modificaçõesconservativas; (c) o anticorpo liga-se a CD19 humano comum Kd de IxlO-7M ou menos; e (d) liga-se a células-Btumorais de Raji e Daudi.
Preferivelmente, a seqüência CDR2 da região variável decadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo consistindo de seqüências deaminoácido de SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29, esuas modificações conservativas; e a seqüência CDR2 daregião variável de cadeia leve compreende uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo consistindo deseqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47,48, 49 e 50, e suas modificações conservativas.Preferivelmente, a seqüência CDRl da região variável decadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo consistindo de seqüências deaminoácido de SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22, esuas modificações conservativas; e a seqüência CDRl daregião variável de cadeia leve compreende uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo consistindo deseqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40,41, 42 e 43, e suas modificações conservativas.
Uma combinação preferida compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 16;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 23;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 30;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 37;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 44; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 51.
Outra combinação preferida compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 16;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 23;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 30;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 37;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 44; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 52.
Outra combinação preferida compreende:(a) uma CDRl de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 17;
(b) uma CDR2 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 24;
(c) uma CDR3 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 31;
(d) uma CDRl de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 38;
(e) uma CDR2 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 45; e
(f) uma CDR3 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 53.
Outra combinação preferida compreende:
(a) uma CDRl de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 18,
(b) uma CDR2 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 25;
(c) uma CDR3 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 32;
(d) uma CDRl de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 39;
(e) uma CDR2 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 46; e
(f) uma CDR3 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 54.
Outra combinação preferida compreende:
(a) uma CDRl de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 19;
(b) uma CDR2 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 26;
(c) uma CDR3 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 33;
(d) uma CDRl de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 40;
(e) uma CDR2 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 47; e(f) uma CDR3 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 55.
Outra combinação preferida compreende:
(a) uma CDRl de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 20;
(b) uma CDR2 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 27;
(c) uma CDR3 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 34;
(d) uma CDRl de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 41;
(e) uma CDR2 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 48; e
(f) uma CDR3 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 56.
Outra combinação preferida compreende:
(a) uma CDRl de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 21;
(b) uma CDR2 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 28;
(c) uma CDR3 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 35;
(d) uma CDRl de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 42;
(e) uma CDR2 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 49; e
(f) uma CDR3 de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 57.
Outra combinação preferida compreende:
(a) uma CDRl de região variávelcompreendendo SEQ ID NO: 22;
(b) uma CDR2 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 29;
(c) uma CDR3 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 36;
(d) uma CDRl de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 43;(e) uma CDR2 de regiãocompreendendo SEQ ID NO: 50; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 58.
Outros anticorpos preferidos da invenção, ou as porçõesligantes ao antígeno dos mesmos, compreendem:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendouma seqüência de aminoácido selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, e7; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo umaseqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindode SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15;sendo que o anticorpo liga-se especificamente a CD19.
Uma combinação preferida compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 1; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:8.
Outra combinação preferida compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 1; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:9.
Outra combinação preferida compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 2; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:10.
Outra combinação preferida compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 3; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:11.
Outra combinação preferida compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 4; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:12.Outra combinação preferida compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 5; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:13.
Outra combinação preferida compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 6; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:14.
Outra combinação preferida compreende: (a) uma regiãovariável de cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 7; e (b) uma região variável decadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO:15.
Em outro aspecto da invenção, anticorpos ou uma porção oufragmento ligante ao antígeno do mesmo, são providos ecompetem para ligar-se a CD19 com qualquer um dosanticorpos anteriormente mencionados.
Os anticorpos da invenção podem ser, por exemplo,anticorpos de extensão completa, como por exemplo, oisótipo IgGl ou IgG4. Alternativamente, os anticorpospodem ser fragmentos de anticorpo, tais como fragmentosFab, Fab' ou Fab'2, ou anticorpos de cadeia simples.
A invenção também provê um imunoconjugado compreendendoum anticorpo da invenção, ou uma porção ou um fragmentoligante ao antígeno do mesmo, ligado a um agenteterapêutico, tal como uma citotoxina ou um isótoporadioativo. A invenção também provê uma moléculabiespecífica compreendendo um anticorpo, ou uma porção ouum fragmento ligante ao antígeno do mesmo, da invenção,ligada a uma segunda porção funcional tendo umaespecificidade de ligação diferente da do dito anticorpo,ou da porção ligante ao antígeno do mesmo.
Também são providas composições compreendendo umanticorpo, ou uma porção ou um fragmento ligante aoantígeno do mesmo, ou imunoconjugado ou moléculabiespecífica da invenção e um portador farmaceuticaraenteaceitável.
As moléculas de ácido nucleico que codificam osanticorpos, ou as porções ou fragmentos ligante aoantigeno dos mesmos, da invenção são também abrangidospela invenção, bem como os vetores de expressãocompreendendo tais ácidos nucleicos e as célulashospedeiras compreendendo tais vetores de expressão.
Outras características e vantagens da presente invençãoserão evidentes a partir da descrição e exemplos a seguirdescritos, os quais não devem ser interpretados comorestritivos. Os conteúdos de todas as referências,registros no Genbank, patentes e pedidos de patentepublicados, citados em todo este pedido, são aquiexpressamente incorporados por referência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura IA mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 59) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID N0:1) daregião variável de cadeia pesada dos anticorposmonoclonais humanos 21D4 e 21D4a.São descritas as regiõesCDRl (SEQ ID NO:16), CDR2 (SEQ ID NO:23) e CDR3 (SEQ IDNO:30) e indicadas as derivações de linha germinal V, D e J;
A Figura IB mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 66) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 8) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 21D4. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 3 7) , CDR2 (SEQ ID NO:44) e CDR3 (SEQ ID N0:51) eindicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura IC mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 67) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 9) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 21D4a. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 3 7) , CDR2 (SEQ ID N0:44) e CDR3 (SEQ ID NO:52) eindicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura 2A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 60) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 2) daregião variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 47G4. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 17) , CDR2 (SEQ ID NO:24) e CDR3 (SEQ ID N0:31) eindicadas as derivações de linha germinal V, D e J;
A Figura 2B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO:68) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:10) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 47G4. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 3 8), CDR2 (SEQ ID NO:45) e CDR3 (SEQ ID NO:53) eindicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura 3A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 61) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID N0:3) daregião variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 27F3. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 18) , CDR2 (SEQ ID NO:25) e CDR3 (SEQ ID N0:32) eindicadas as derivações de linha germinal V, D e J;
A Figura 3B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 69) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 11) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 27F3. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 3 9), CDR2 (SEQ ID NO:46) e CDR3 (SEQ ID NO:54) eindicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura 4A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 62) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 4) daregião variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 3C10. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 19) , CDR2 (SEQ ID NO:26) e CDR3 (SEQ ID NO:33) eindicadas as derivações de linha germinal V, D e J;
A Figura 4B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 70) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 12) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 3C10. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 4 0), CDR2 (SEQ ID NO:47) e CDR3 (SEQ ID NO:55) eindicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura 5 mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 63) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 5) daregião variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 5G7. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID N0:20),CDR2 (SEQ ID NO: 27) e CDR3 (SEQ ID NO: 34) e indicadas asderivações de linha germinal V, D e J;
A Figura 5B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO:71) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:13) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 5G7. São descritas as regiões CDRl (SEQ ID N0:41),CDR2 (SEQ ID NO: 48) e CDR3 (SEQ ID NO: 56) e indicadas asderivações de linha germinal V e J;
A Figura 6A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 64) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 6) daregião variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 13F1. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 21) , CDR2 (SEQ ID NO:28) e CDR3 (SEQ ID NO:35) eindicadas as derivações de linha germinal V, D e J;
A Figura 6B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO:72) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:14) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 13F1. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 4 2) , CDR2 (SEQ ID NO:49) e CDR3 (SEQ ID NO:57) eindicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura 7A mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 65) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 7) daregião variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonalhumano 46E8. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 2 2) , CDR2 (SEQ ID NO:29) e CDR3 (SEQ ID NO:36) eindicadas as derivações de linha germinal V, D e J;
A Figura 7B mostra a seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO:73) e a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:15) daregião variável de cadeia leve do anticorpo monoclonalhumano 46E8. São descritas as regiões CDRl (SEQ IDNO: 4 3), CDR2 (SEQ ID N0<:50) e CDR3 (SEQ ID NO:58) eindicadas as derivações de linha germinal V e J;
A Figura 8 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia pesada de 21D4(SEQ ID N0:1) e 21D4a (SEQ ID N0:1) com a seqüência deaminoácido de linha germinal humana Vh 5-51 (SEQ IDNO: 74) . A linha germinal JH4b é descrita como SEQ IDNO:8 0;
A Figura 9 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia pesada de 47G4(SEQ ID NO: 2) com as seqüências de aminoácido de linhagerminal humana Vh 1-69 (SEQ ID N0:75). A linha germinalJH5b é descrita como SEQ ID NO:81;
A Figura 10 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia pesada de 27F3(SEQ ID NO: 3) , com a seqüência de aminoácido de linhagerminal humana Vh 5-51 (SEQ ID NO:74). A linha germinalJH6b é descrita como SEQ ID NO:82;
A Figura 11 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia pesada de 3C10(SEQ ID NO: 4) com a seqüência de aminoácido de linhagerminal humana Vh 1-69 (SEQ ID NO:75). A linha germinalJH6b é descrita como SEQ ID NO:82;
A Figura 12 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia pesada de 5G7(SEQ ID NO: 5) com a seqüência de aminoácido de linhagerminal humana Vh 5-51 (SEQ ID NO:74). A linha germinalJH6b é descrita como SEQ ID NO:83;
A Figura 13 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia pesada de 13F1(SEQ ID NO: 6) com a seqüência de aminoácido de linhagerminal humana Vh 5-51 (SEQ ID NO:74). A linha germinalJH6b é descrita como SEQ ID NO:82;
A Figura 14 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia pesada de 46E8(SEQ ID NO: 7) com a seqüência de aminoácido de linhagerminal humana Vh 5-51 (SEQ ID NO:74). A linha germinalJH6b é descrita como SEQ ID NO:82;
A Figura 15 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia leve de 21D4 (SEQID NO:8) com a seqüência de aminoácido de linha germinalhumana Vk Ll8 (SEQ ID NO: 76) . A linha germinal JK2 édescrita como SEQ ID NO:84;A Figura 16 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia leve de 21D4A(SEQ ID NO: 9) com a seqüência de aminoácido de linhagerminal humana Vk L18 (SEQ ID NO:76). A linha germinalJK3 é descrita como SEQ ID NO:85;
A Figura 17 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia leve de 47G4 (SEQID NO:10) com a seqüência de aminoácido de linha germinalhumana Vk A2 7 (SEQ ID NO: 77) . A linha germinal JK3 édescrita como SEQ ID NO:85;
A Figura 18 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia leve de 27F3 (SEQID NO:11) com a seqüência de aminoácido de linha germinalhumana Vk Ll8 (SEQ ID NO: 76). A linha germinal JK2 édescrita como SEQ ID NO:84;
A Figura 19 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia leve de 3C10 (SEQNO:12) com a seqüência de aminoácido de linha germinalhumana Vk L15 (SEQ ID NO:78). A linha germinal JK2 édescrita como SEQ ID NO:84;
A Figura 2 0 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia leve de 5G7 (SEQID NO:13) com a seqüência de aminoácido de linha germinalhumana Vk L18 (SEQ ID NO: 76) . A linha germinal JKl édescrita como SEQ ID NO:86;
A Figura 21 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia leve de 13F1 (SEQID NO:14) com a seqüência de aminoácido de linha germinalhumana Vk L18 (SEQ ID NO:76). A linha germinal JK2 édescrita como SEQ ID NO:87;
A Figura 22 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido da região variável de cadeia leve de 4 6E8 (SEQID NO:15) com a seqüência de aminoácido de linha germinalhumana Vk L18 (SEQ ID NO:76). A linha germinal JK2 édescrita como SEQ ID NO:87;
A Figura 23 é um gráfico mostrando os resultados deexperimentos que demonstram que o anticorpo monoclonalhumano 47G4, dirigido contra o CD19 humano, liga-seespecificamente a CD19 humano;
A Figura 24 é um gráfico onde constam os resultados deexperimentos demonstrando que os anticorpos monoclonaishumanos dirigidos contra o CD19 humano competem paraligar-se a células de Raji ;
A Figura 2 5A-D mostra os resultados de experimentos decitometria de fluxo demonstrando que os anticorposmonoclonais humanos 21D4, 21D4a, 47G4, 3C10, 5G7 e 13F1,dirigidos contra CD19 humano, ligam-se à superfíciecelular de linhagens celulares de tumor de célula B. (A)Citometria de fluxo de HuMAbs 21D4 e 47G4 em células CHOtransfectadas com CD19 humano. (B) Citometria de fluxo deHuMAb 47G4 em células tumorais B Daudi. (C) Citometria defluxo de HuMAbs e 47G4 em células-B tumorais de Raji. (D)Citometria de fluxo de HuMAbs 21D4, 21D4a, 3C10, 5G7 e13Fl em células-B tumorais de Raji;
As Figuras 2 6A-B mostram os resultados de experimentos deinternalização demonstrando que os anticorpos monoclonaishumanos 21D4 e 47G4, dirigidos contra CD19 humano penetranas células-B tumorais de Raji expressando CH0-CD19 eCDl9 através de um ensaio de liberação de 3H-timidina.(A) Internalização de HuMAb 47G4 em células CH0-CD19. (B)Internalização de HuMAbs 21D4 e 47G4 em células-Btumorais de Raji;
A Figura 27 mostra os resultados de um ensaio deincorporação de timidina demonstrando que os anticorposmonoclonais humanos dirigidos contra CD19 humano matam ascélulas-B tumorais de Raji;
A Figura 2 8 mostra um gráfico Kaplan-Meier desobrevivência de camundongo num modelo sistêmico Ramos.
A Figura 2 9 mostra a alteração no peso corporal decamundongo num modelo sistêmico Ramos;
A Figura 30A-B mostra os resultados de um estudo demodelo de tumor de camundongo in vivo, demonstrando que otratamento com o anticorpo 21D4 anti-CD19 desnudo possuium efeito inibitório direto sobre tumores de linfoma invivo. (A) tumores ARH-77 (B) tumores Raji;
A Figura 31 mostra os resultados de um ensaio decitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)demonstrando que os anticorpos anti-CD19 monoclonaishumanos não-fucosilados possuem citotoxicidade celularaumentada sobre as células da leucemia humana de formadependente de ADCC;
A Figura 32 mostra os resultados de um estudo de modelode tumor em camundongo in vivo demonstrando que osanticorpos anti-CD19 conjugados a toxina reduzem o volumedo tumor;
A Figura 33 mostra a alteração no peso corporal decamundongo num estudo de modelo de tumor Raji;
A Figura 34 mostra os resultados de um estudo em macacocinomolgo mostrando uma população reduzida de célulasCD20+ após tratamento de HuMAbs anti-CD19 fucosilados ounão-fucosilados;
A Figura 35 mostra os resultados de macacos cinomolgosindividuais após tratamento com HuMAbs anti-CD19fucosilados ou não-fucosilados; e
A Figura 36A-C mostra os resultados de um ensaio deincorporação de timidina, demonstrando que os anticorposmonoclonais humanos dirigidos contra CD19 humanoisoladamente ou conjugados a toxina matam células-Btumorais de Raji e SU-DHL-6.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente descrição refere-se a anticorpos monoclonaisisolados, especialmente anticorpos monoclonais humanosque ligam-se especificamente a CD19 com alta afinidade.
Em certas concretizações, os anticorpos da invenção sãoderivados de seqüências específicas de linha germinal decadeia leve e pesada e/ou compreendem característicasestruturais específicas tais como regiões CDRcompreendendo seqüências de aminoácido específicas. Ainvenção provê anticorpos isolados, métodos para preparartais anticorpos, imunoconjugados e moléculasbiespecíficas compreendendo tais anticorpos, bem comocomposições farmacêuticas contendo os anticorpos,imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Ainvenção também refere-se a métodos para utilizar osanticorpos, tal como para detectar CD19, bem como paratratar doenças associadas com expressão de CDl9, taiscomo malignidades de célula B que expressam CD19.
Conseqüentemente, a invenção também provê métodos parautilizar os anticorpos anti-CD19 da invenção para tratarde malignidades de célula B, como por exemplo, notratamento de linfoma não-Hodgkin, leucemias linfocíticascrônicas, Iinfornas foliculares, Iinfornas difusos degrandes células de linhagem B e mielomas múltiplos.
Para que a presente invenção possa ser melhorcompreendida, são definidos certos termos em primeirolugar. As definições adicionais constam em toda adescrição detalhada.
O termo nCDl9" refere-se, por exemplo, a variantes,isoformas, e homólogos de espécies de CD19 humano.
Conseqüentemente, os anticorpos humanos da presentedescrição podem, em certos casos, ter reatividade cruzadacom CD19 de espécies diferentes da humana. Em certasconcretizações, os anticorpos podem ser completamenteespecíficos para uma ou mais proteínas de CD19 humano epodem não exibir espécies ou outros tipos de reatividadecruzada não-humana. A seqüência completa de aminoácido deum CD19 humano representativo possui o número de registrono Genbank NM_001770 (SEQ ID NO:79).
O termo "resposta imune" refere-se à ação, por exemplo,de Iinfócitos, células apresentadoras de antígeno,células fagocíticas, granulócitos, e macromoléculassolúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado(incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) queresulta em dano seletivo a, destruição ou eliminação docorpo humano de patógenos invasores, células ou tecidosinfectados com patógenos, células cancerosas, ou, emcasos de autoimunidade ou inflamação patológica, célulasou tecidos humanos normais.Uma "via de transdução de sinal" refere-se à relaçãobioquímica entre diversas moléculas de transdução desinal que desempenham um papel na transmissão de um sinalde uma porção de uma célula para outra porção de umacélula. Conforme aqui utilizado, a expressão "receptor desuperfície celular" inclui, por exemplo, moléculas ecomplexos de moléculas capazes de receber um sinal e atransmissão de tal sinal através da membrana plasmáticade uma célula. Um exemplo de um "receptor de superfíciecelular" da presente invenção é o receptor CDl9.
O termo "anticorpo", conforme aqui citado, incluianticorpos inteiros e qualquer fragmento ligante aoantígeno (ou seja, "porção ligante ao antígeno") oucadeias simples dos mesmos. Um "anticorpo" refere-se auma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeiaspesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas porligações dissulfeto, ou uma porção ligante ao antígeno domesmo. Cada cadeia pesada compreende uma região variávelde cadeia pesada (aqui abreviada como Vh) e uma regiãoconstante de cadeia pesada. A região constante de cadeiapesada compreende três domínios, ChI , CH2 e CH3. Cadacadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve(aqui abreviada como Vl) e uma região constante de cadeialeve. A região constante de cadeia leve compreende umúnico domínio, Cl . As regiões Vh e Vl podem ainda sersubdivididas em regiões de hipervariabilidade,denominadas regiões determinantes de complementaridade(CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas,denominadas regiões estruturais (FR) . Cada Vh e Vl écomposta de três CDRs e de quatro FRs, dispostos determinal amino para terminal carboxi na seguinte ordem:FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 . As regiõesvariáveis das cadeias leves e pesadas contém um domíniode ligação que interage com um antígeno. As regiõesconstantes dos anticorpos podem mediar a ligação daimunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores,incluindo diversas células do sistema imune (ex: célulasefetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema decomplemento clássico.
O termo "porção ligante ao antígeno" de um anticorpo (ousimplesmente "porção de anticorpo"), conforme aquiutilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de umanticorpo que mantém a capacidade de ligar-seespecificamente a um antígeno (ex: CD19). Foi demonstradoque a função de ligação ao antígeno de um anticorpo podeser realizada através de fragmentos de um anticorpo deextensão completa. Exemplos de fragmentos ligantesabrangidos pelo termo "porção ligante ao antígeno" de umanticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmentomonovalente consistindo dos domínios VL, Vh, Cl e ChI ;(ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalentecompreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma pontede dissulfeto na região de dobra ("hinge"); (iii) umfragmento Fab' que é essencialmente um Fab com parte daregião de dobra (vide, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Paul ed. 3sup.rd ed.1993)); (iv) um fragmento Fd consistindo dosdomínios Vh e ChI ; (v) um fragmento Fv consistindo dosdomínios Vl e Vh de um braço único de um anticorpo, (vi)um fragmento dAb (Ward et al. , (1989) Nature 341:544-546) , que consiste de um domínio VH; (viii) um regiãodeterminante de complementaridade isolada (CDR) e (viii)um nanocorpo, uma região variável de cadeia pesadacontendo um domínio variável simples e dois domíniosconstantes. Além disso, embora os dois domínios dofragmento Fv, Vl e VH, sejam codificados por genesseparados, eles podem ser unidos utilizando métodosrecombinantes, através de um ligante sintético quepermite que sejam preparados como uma cadeia de proteínasimples na qual as regiões Vl e Vh emparelham-se paraformar moléculas monovalentes (conhecidas como cadeiasimples Fv (scFv) ; vide, por exemplo, Bird et al (1988)Science 242:423-426; e Huston et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883). Tais anticorpos decadeia simples também pretendem ser abrangidos pelo termo"porção ligante ao antígeno" de um anticorpo. Essesfragmentos de anticorpo são obtidos utilizando-setécnicas convencionais conhecidas pelos habilitados natécnica, e os fragmentos são identificados quanto âutilidade da mesma forma que os anticorpos intactos.
Um "anticorpo isolado", conforme aqui utilizado, pretendese referir a um anticorpo que é substancialmente livre deoutros anticorpos tendo especificidades antigênicasdiferentes (ex: um anticorpo isolado que especificamenteliga-se a CD19 é substancialmente livre de anticorpos queligam-se especificamente a antígenos que não o CDl9). Umanticorpo isolado que liga-se especificamente a CD19pode, porém, ter reatividade cruzada com outrosantígenos, tais como moléculas CD19 de outras espécies.
Além disso, um anticorpo isolado pode sersubstancialmente livre de outro material celular e/ousubstâncias químicas.
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição deanticorpo monoclonal" conforme aqui utilizados, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo decomposição molecular simples. Uma composição de anticorpomonoclonal exibe uma especificidade de ligação simples eafinidade por um epítopo específico.
0 termo "anticorpo humano", conforme aqui utilizado,pretende incluir anticorpos que possuem regiões variáveisnas quais tanto as regiões estruturais como as regiõesCDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina delinha germinal humana. Além disso, se o anticorpo conteruma região constante, a região constante também éderivada de seqüências de imunoglobulina de linhagerminal humana. Os anticorpos humanos da invenção podemincluir resíduos aminoácido não codificados porseqüências de imunoglobulina de linha germinal humana(ex: mutações introduzidas por mutagênese aleatória ousítio-específicas in vitro ou através de mutação somáticain vivo). Porém, o termo "anticorpo humano", conformeaqui utilizado, não pretende incluir anticorpos nos quaisas seqüências CDR derivadas de linha germinal de outrasespécies mamíferas, tal como um camundongo, foramenxertadas em seqüências estruturais humanas.
0 termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se aanticorpos exibindo uma especificidade de ligação simplese que possuem regiões variáveis nas quais tanto asregiões estruturais como as regiões CDR são derivadas deseqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Emuma concretização, os anticorpos monoclonais humanos sãoproduzidos por um hibridoma que inclui uma célula Bobtida de um animal não-humano transgênico, como porexemplo, um camundongo transgênico, tendo um genomacompreendendo um transgene humano de cadeia pesada e umtransgene de cadeia leve fundido com uma célulaimortalizada.
O termo "anticorpo recombinante humano", conforme aquiutilizado, inclui todos os anticorpos humanos que sãopreparados, expressados, criados ou isolados através demeios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados deum animal (ex: um camundongo), que é transgênico outranscromossômico para genes de imunoglobulina humana ouum hibridoma preparado com o mesmo (descrito abaixo) , (b)anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformadapara expressar o anticorpo humano, como por exemplo, deum transfectoma, (c) anticorpos isolados de um banco deanticorpo humano combinatorial, e (d) anticorpospreparados, expressados, criados ou isolados através dequaisquer outros meios que envolvem alinhamento deseqüências gênicas de imunoglobulina humana com outrasseqüências de DNA. Tais anticorpos recombinantes humanospossuem regiões variáveis nas quais as regiõesestruturais e CDR são derivadas de seqüências deimunoglobulina de linha germinal humana. Em certasconcretizações, porém, tais anticorpos recombinanteshumanos podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ouquando for utilizado um animal transgênico paraseqüências Ig humana, mutagênese somática in vivo) eassim as seqüências de aminoácido das regiões Vh e Vl dosanticorpos recombinantes são seqüências que, emboraderivadas de e relacionadas com seqüências Vh e Vl delinha germinal humana, não podem existir naturalmente norepertório de linha germinal de anticorpo humano in vivo.
Conforme aqui utilizado, "isótipo" refere-se à classe deanticorpo (ex: IgM ou IgGl) que é codificada pelos genesda região constante de cadeia pesada.
As expressões "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e"um anticorpo específico para um antígeno" são utilizadasreciprocamente na presente invenção com o termo "umanticorpo que liga-se especificamente a um antígeno".
O termo "derivados de anticorpo humano" refere-se aqualquer forma modificada do anticorpo humano, como porexemplo, um conjugado do anticorpo e outro agente ouanticorpo.
O termo "anticorpo humanizado" pretende referir-se aanticorpos nos quais as seqüências CDR derivadas da linhagerminal de outra espécie mamífera, tal como umcamundongo, foram enxertadas em seqüências estruturaishumanas. Modificações adicionais da região estruturalpodem ser feitas nas seqüências estruturais humanas.
0 termo "anticorpo quimérico" pretende se referir aanticorpos nos quais as seqüências de região variável sãoderivadas de uma espécie e as seqüências de regiãoconstante são derivadas de outra espécie, tal como umanticorpo no qual as seqüências de região variável sãoderivadas de um anticorpo de camundongo e as seqüênciasde região constante são derivadas de um anticorpo humano.
Conforme aqui utilizado, um anticorpo que "liga-seespecificamente a CD19 humano" pretende referir-se a umanticorpo que liga-se a CD19 humano com um K0 de IxlO-7Mou menos, mais preferivelmente 5 χ IO-8M ou menos, maispreferivelmente 3 χ IO-8M ou menos, mais preferivelmenteIx IO-8 M ou menos, ainda mais preferivelmente 5 χ IO-9Mou menos.
0 termo "Kassoc" OU "Ka", conforme aqui utilizado, pretendese referir à taxa de associação de uma interaçãoanticorpo-antígeno especifica, ao passo que o termo "Kdis"ou "Kd" conforme aqui utilizado, pretende se referir àtaxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígenoespecífica. 0 termo "KD" conforme aqui utilizado,pretende se referir à constante de dissociação, que éobtida da relação de K0 para Ka (ou seja, KD/Ka) e éexpressada como uma concentração molar (M) . Valores K0para anticorpos podem ser determinados utilizando-semétodos estabelecidos no estado da técnica. Um métodopreferido para determinar o K0 de um anticorpo consisteem utilizar ressonância de plásmon de superfície,preferivelmente utilizar um sistema biosensor tal como umsistema Biacore®.
Conforme aqui utilizado, o termo "alta afinidade" por umanticorpo IgG refere-se a um anticorpo com um Kd de Ix10"7M ou menos, mais preferivelmente 5 χ IO-8M ou menos eainda mais pref erivelmente IxlO-9M ou menos e ainda maispref erivelmente 5 χ IO-9M ou menos, para um antígenoalvo. Porém, a ligação de "alta afinidade" pode variarpara outros isótipos de anticorpo. Por exemplo, ligaçãode "alta afinidade" por um isótipo IgM refere-se a umanticorpo com um K0 de 10"6M ou menos, maispreferivelmente IO-7M ou menos, ainda maispreferivelmente IO-8M ou menos.
Conforme aqui utilizado, o termo "indivíduo" incluiqualquer animal humano ou não-humano. O termo "animalnão-humano" inclui todos os vertebrados, como porexemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatasnão-humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas,frangos, anfíbios, répteis, etc.
Anticorpos Anti-CDl9
Os anticorpos da invenção são definidos porcaracterísticas ou propriedades funcionais específicasdos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos ligam-seespecificamente a CD19 humano. Preferivelmente, umanticorpo da invenção liga-se a CD19 com alta afinidade,por exemplo, com um K0 de 1 χ IO-7M ou menos. Osanticorpos anti-CD19 da invenção exibem preferivelmenteuma ou mais das seguintes características:
(a) ligam-se a CD19 humano com um K0 de IxlO-7M ou menos;
(b) ligam-se a células-B tumorais de Raji e Daudi.
Preferivelmente, o anticorpo liga-se a CD19 humano com umK0 de 5 χ IO-8M ou menos, liga-se a CD19 humano com um Kdde 1 χ IO-8M ou menos, liga-se a CD19 humano com um Kd de5 χ IO-9M ou menos, liga-se a CD19 humano com um Kd de 4 χIO-9M ou menos, liga-se a CDl9 humano com um Kd de3 χ IO-9M ou menos, ou liga-se a CD19 humano com um Kd de2 χ IO-9M ou menos, ou liga-se a CD19 humano com um Kd de1 χ IO-9M ou menos.
Ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dosanticorpos a CD19 são conhecidos no estado da técnica,incluindo, por exemplo, ELISAs, Western Blots, RIAs, eanálise de citometria de fluxo. Ensaios adequados sãodescritos detalhadamente nos Exemplos. A cinética deligação (ex: afinidade de ligação) dos anticorpos tambémpode ser avaliada através de ensaios padrão conhecidos noestado da técnica, tal como através da análise porsistema Scatchard ou Biacore®. Para avaliar a ligação acélulas-B tumorais de Raji ou Daudi, células de Raji(Depósito ATCC No.CCL-86) ou de Daudi (Depósito ATCCNo.CCL-213) podem ser obtidas de fontes publicamentedisponíveis, tal como a "American Type CultureCollection", e utilizadas em ensaios padrão, tal como aanálise citométrica de fluxo.
Anticorpos Monoclonais 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10,5G7, 13F1 e 46E8.
Anticorpos preferidos da invenção são os anticorposmonoclonais humanos 21D4, 21D4a, 4 7G4, 2 7F3, 3C10, 5G7,13 Fl e 46E8, isolados e estruturalmente caracterizadosconforme descrito nos Exemplos 16, 17, 18, 19, 20, 21 e22. As seqüências de aminoácido Vh de 21D4, 21D4a, 47G4,27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e 46E8 são mostradas nas SEQ IDNOs: 1,1,2,3,4,5,6 e 7, respectivamente. As seqüências deaminoácido Vl de 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1e 46E8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12,13, 14 e 15, respectivamente.
Dado que cada um desses anticorpos pode ligar-se a CD19,as seqüências Vh e Vl podem ser "misturadas oucombinadas" para criar outras moléculas ligantes a anti-CD19 da invenção. A ligação a CD19 de tais anticorpos"misturados ou combinados" pode ser testada utilizando osensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (ex:ELISAs). Preferivelmente, quando as cadeias Vh e Vl sãomisturadas e combinadas, uma seqüência Vh de umemparelhamento VH/VL é substituída por uma seqüência Vh deestrutura similar. Da mesma forma, preferivelmente umaseqüência Vl de um emparelhamento VH/VL específico ésubstituída por uma seqüência Vl de estrutura similar.
Conseqüentemente, num aspecto, a invenção provê umanticorpo monoclonal isolado, ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo compreendendo:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendouma seqüência de aminoácido selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, e7; e
(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo umaseqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindode SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15;sendo que o anticorpo liga-se especificamente a CD19,preferivelmente CD19 humano. Combinações preferidas decadeia pesada e leve incluem:
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO:8; ou
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO:9; ou
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2; e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO:10; ou
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:3; e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO:11; ou
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4; e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO:12; ou
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 5; e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO:13; ou
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO:14; ou
(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:7; e (b) uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO:15.
Em outro aspecto, a invenção provê anticorpos quecompreendem a cadeia pesada e a cadeia leve CDRls, CDR2se CDR3s de 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e46E8, ou suas combinações. As seqüências de aminoácido deCDRls Vh de 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e46E8 são mostradas em SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21e 22. As seqüências de aminoácido de CDR2s Vh de 21D4,2lD4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e 46E8 são mostradasnas SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29. Asseqüências de aminoácido de CDR3s Vh de 21D4, 21D4a,47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e 46E8 são mostradas em SEQID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36. As seqüências deaminoácido de CDRls Vk de 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10,5G7, 13F1 e 46E8 são mostradas em SEQ ID NOs: 37, 38, 39,40, 41, 42 e 43. As seqüências de aminoácido de CDR2s Vkde 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e 46E8 sãomostradas em SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50. Asseqüências de aminoácido das CDR3s Vk de 21D4, 21D4a,47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e 46E8 são mostradas em SEQID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 e 58. As regiões CDRsão delineadas utilizando o sistema Kabat (Kabat, E.A.,et al(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, Fifth Edition, U.S.Department of Health andHuman Services, NIH Publication No.91-3242).Dado que cada um desses anticorpos podem ligar-se a CD19e que a especificidade de ligação a antígeno é providaprincipalmente pelas regiões CDRl, CDR2 e CDR3, asseqüências CDRl, CDR2 e CDR3 Vh e as seqüências CDRl,CDR2 e CDR3 Vk podem ser "misturadas e combinadas" (ouseja, as CDRs de anticorpos diferentes podem sermisturadas e combinadas, embora cada anticorpo devaconter uma CDRl, CDR2 e CDR3 Vh e uma CDRl, CDR2 e CDR3VK) para criar outras moléculas ligantes ao anti-CD19 dainvenção. A ligação a CD19 de tais anticorpos "misturadose combinados" pode ser testada utilizando os ensaios deligação descritos acima e nos Exemplos (ex: ELISAs,análise Biacore®). Preferivelmente, quando as seqüênciasCDR Vh são misturadas e combinadas, a seqüência CDRl,CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência Vh específica ésubstituída por uma seqüência (s) CDR de estruturasimilar. Da mesma forma, quando seqüências CDR Vk sãomisturadas e combinadas, a seqüência CDRl, CDR2 e/ou CDR3de uma seqüência Vk específica é preferivelmentesubstituída por uma seqüência (s) CDR de estruturasimilar. Será evidente para o habilitado na técnica queseqüências Vh e Vl novas podem ser criadas substituindo-seuma ou mais seqüências da região CDR Vh e/ou Vl porseqüências de estrutura similar das seqüências CDR aquidescritas para os anticorpos monoclonais 21D4, 21D4a,47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e 46E8.
Conseqüentemente, em outro aspecto, a invenção provê umanticorpo monoclonal isolado ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, compreendendo:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49,e 50; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56,57 e 58;
sendo que o anticorpo liga-se especificamente a CD19,preferivelmente CDl9 humano.
Numa concretização preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 16;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 23;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 30;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 37;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 44; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 51.
Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 16;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 23;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 30;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 37;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 44; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 52.
Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 17;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 24;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 31;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 3 8;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 45; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 53.
Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 18,
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 25;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 32;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 39;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 46; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 54 .
Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 19;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 26;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 33;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 40;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 47; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 55.
Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 20;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 27;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 34;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 41;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 48; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 56.
Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 21;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 28;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 35;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 42;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 49; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 57.
Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:
(a) uma CDRl de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 22;
(b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 29;
(c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO: 36;
(d) uma CDRl de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 43;
(e) uma CDR2 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 50; e
(f) uma CDR3 de região variável de cadeia levecompreendendo SEQ ID NO: 58.
É bastante conhecido no estado da técnica que o domínioCDR3, independentemente do(s) domínio(s) CDRl e/ou CDR2,isoladamente pode determinar a especificidade de ligaçãode um anticorpo por um antígeno cognato e que anticorposmúltiplos podem previsivelmente ser gerados tendo a mesmaespecificidade de ligação baseada numa seqüência CDR3comum. Vide7 por exemplo, Klimka et al. , British J. ofCâncer 83(2):252-260 (2000) (descrevendo a produção de umanticorpo anti-CD30 humanizado utilizando apenas odomínio variável de cadeia pesada CDR3 de anticorpo anti-CD30 murino Ki-4); Beiboer et al.,J.Mol.Biol. 296:833-849(2000) (descrevendo anticorpos de glicoproteína-2epitelial recombinante (EGP-2) utilizando apenas aseqüência CDR3 de cadeia pesada do anticorpo anti-EGP-2MOC-31 murino parental) ; Rader et al. ,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 95:8910-8915 (1998) (descrevendoum painel de anticorpos αν/33 anti-integrina humanizadosutilizando um domínio CDR3 variável de cadeia leve epesada de um anticorpo LM609 αν/33 anti-integrina murino,sendo que cada anticorpo membro compreende uma seqüênciadistinta fora do domínio CDR3 e capaz de ligar o mesmoepítopo como o anticorpo murino parental com afinidadestão altas ou mais altas que o anticorpo murino parental);Barbas et al., J.Am.Chem.Soc. 116:2161-2162 (1994)(revelando que o domínio CDR3 provê a contribuição maissignificativa para ligação ao antígeno) ; Barbas et al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92:2529-2533 (1995)(descrevendo o enxerto de seqüências CDR3 de cadeiapesada de três Fabs (SI-1, SI-40 e SI-32) contra DNAplacentário humano sobre a cadeia pesada de um Fabtoxóide anti-tetânico, substituindo assim a CDR3 decadeia pesada existente e demonstrando que o domínio CDR3isoladamente conferiu a especificidade de ligação); eDitzel et al., J.Immunol., 157-739-749 (1996)(descrevendo estudos de enxerto em que a transferênciaapenas de CDR3 de cadeia pesada de um Fab LNA3poliespecífico parental para uma cadeia pesada de umanticorpo Fab p313 ligante ao toxóide tetânico IgGmonoespecífico foi suficiente para reter a especificidadede ligação do Fab parental). Cada uma dessas referênciasé aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Conseqüentemente, a presente invenção provê anticorposmonoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 decadeia pesada e/ou leve de um anticorpo derivado de umanimal humano ou não-humano, sendo que o anticorpomonoclonal é capaz de ligar-se especificamente a CD19. Emcertos aspectos, a presente invenção provê anticorposmonoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 decadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não-humano, talcomo um anticorpo de camundongo ou de rato, sendo que oanticorpo monoclonal é capaz de ligar-se especificamentea CDl9. Em algumas concretizações, tais anticorposinventivos compreendendo um ou mais domínios CDR3 decadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não-humano (a)são capazes de competir para ligação com; (b) mantém ascaracterísticas funcionais; (c) ligam-se ao mesmoepítopo; e/ou (d) possuem uma afinidade de ligaçãosimilar à do anticorpo parental não-humanocorrespondente.
Em outros aspectos, a presente invenção provê anticorposmonoclonais compreendendo um ou mais domínios CDR3 decadeia pesada e/ou leve de um anticorpo humano, tal como,por exemplo, um anticorpo humano obtido de um animal não-humano, sendo que o anticorpo humano é capaz de ligar-seespecificamente a CDl9. Em outros aspectos, a presenteinvenção provê anticorpos monoclonais compreendendo um oumais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou de cadeia levede um primeiro anticorpo humano, tal como, por exemplo,um anticorpo humano obtido de um animal não-humano, sendoque o primeiro anticorpo humano é capaz de ligar-seespecificamente a CD19 e sendo que o domínio CDR3 doprimeiro anticorpo humano substitui um domínio CDR3 numanticorpo humano no qual falta especificidade de ligaçãopara CD19 para gerar um segundo anticorpo humano que sejacapaz de ligar-se especificamente a CD19. Em algumasconcretizações, tais anticorpos inventivos compreendendoum ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve doprimeiro anticorpo humano (a) são capazes de competirpara ligar-se com; (b) mantém as característicasfuncionais; (c) ligam-se ao mesmo epítopo; e/ou (d)possuem uma afinidade de ligação similar à do primeiroanticorpo humano parental correspondente.
Anticorpos com Seqüências de Linha Germinal Específicas
Em certas concretizações, um anticorpo da invençãocompreende uma região variável de cadeia pesada de umgene de imunoglobulina de cadeia pesada de linha germinalespecífico e/ou uma região variável de cadeia leve de umgene de imunoglobulina de cadeia leve de linha germinalespecífico.
Por exemplo, numa concretização preferida, a invençãoprovê um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porçãoligante ao antígeno do mesmo, compreendendo uma regiãovariável de cadeia pesada que é o produto de ou derivadade um gene Vh 5-51 humano, sendo que o anticorpo liga-seespecificamente a CDl9. Em outra concretização preferida,a invenção prove um anticorpo monoclonal isolado, ou umaporção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo umaregião variável de cadeia pesada que é o produto de ouderivada de um gene Vh 1-69 humano, sendo que o anticorpoliga-se especificamente a CDl9. Em outra concretizaçãopreferida ainda, a invenção prove um anticorpo monoclonalisolado, ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo,compreendendo uma região variável de cadeia leve que é oproduto de ou derivada de um gene Vk L18 humano, sendoque o anticorpo liga-se especificamente a CDl9. Em outraconcretização preferida, a invenção prove um anticorpomonoclonal isolado, ou uma porção ligante ao antígeno domesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leveque é o produto de ou derivada de um gene Vk A2 7 humano,sendo que o anticorpo liga-se especificamente a CD19. Emoutra concretização preferida ainda, a invenção provê umanticorpo monoclonal isolado, ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, compreendendo uma região variável decadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene VkL15, sendo que o anticorpo liga-se especificamente aCDl9. Em outra concretização preferida ainda, a invençãoprovê um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porçãoligante ao antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo:
(a) compreende uma região variável de cadeia pesada que éo produto de ou derivada de um gene Vh 5-51 ou 1-69humano (cujos genes codificam as seqüências de aminoácidoestabelecidas nas SEQ ID NOs: 74 e 75, respectivamente);
(b) compreende uma região variável de cadeia leve que é oproduto de ou derivada de um gene Vk Ll8, Vk A2 7 ou Vk Ll5(cujos genes codificam as seqüências de aminoácidoestabelecidas nas SEQ ID NOs: 76, 77 e 78,respectivamente); e
(c) liga-se especificamente a CD19, preferivelmente aCDl9 humano.
Exemplos de anticorpos tendo Vh e Vk de Vh 5-51 e Vk L18,respectivamente, são 21D4, 21D4a, 27F3, 5G7, 13F1 e 46E8.Um exemplo de anticorpo tendo Vh e Vk de Vh 1-69 e Vk A2 7,respectivamente, é o 47G4. Um exemplo de um anticorpotendo Vk de Vh de Vh 1-69 e Vk L15, respectivamente, é o3C10.
Conforme aqui utilizado, um anticorpo humano compreenderegiões variáveis de cadeia pesada ou leve que é "oproduto de" ou "derivado de" uma seqüência de linhagerminal específica se as regiões variáveis do anticorpoforem obtidas de um sistema que utiliza genes deimunoglobulina de linha germinal humana. Tais sistemasincluem imunizar um camundongo transgênico portando genesde imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ouidentificar um banco de gene de imunoglobulina humanaexibido no fago com o antígeno de interesse. Um anticorpohumano que é "o produto de" ou "derivado de" umaseqüência de imunoglobulina de linha germinal humana podeser identificado como tal comparando-se a seqüência deaminoácido do anticorpo humano com as seqüências deaminoácido de imunoglobulinas de linha germinal humanas eselecionando-se a seqüência de imunoglobulina de linhagerminal humana que está mais próxima em seqüência (ouseja, com a maior % de identidade) da seqüência doanticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produtode" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina delinha germinal humana específica pode conter diferençasde aminoácido se comparada com a seqüência de linhagerminal, devido, por exemplo, a mutações somáticas deocorrência natural ou introdução intencional de mutaçãosítio-dirigida. Porém, um anticorpo humano selecionado étipicamente pelo menos 90% idêntico em seqüência deaminoácidos a uma seqüência de aminoácido codificada porum gene de imunoglobulina de linha germinal humana econtém resíduos aminoácido que identificam o anticorpohumano como sendo humano quando comparado com asseqüências de aminoácido de imunoglobulina de linhagerminal de outras espécies (ex: seqüências de linhagerminal murina). Em certos casos, um anticorpo humanopode ser pelo menos 95%, ou ainda pelo menos 96%, 97%,98%, ou 99% idêntico em seqüência de aminoácido àseqüência de aminoácido codificada pelo gene deimunoglobulina de linha germinal. Tipicamente, umanticorpo humano derivado de uma seqüência de linhagerminal humana específica exibirá não mais que 10diferenças de aminoácido das seqüências de aminoácidocodificadas pelo gene de imunoglobulina de linha germinalhumana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibirnão mais que 5, ou ainda não mais que 4, 3, 2 ou 1diferença de aminoácido da seqüência de aminoácidocodificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal.
Anticorpos Homólogos
Em outra concretização ainda, um anticorpo da invençãocompreende regiões variáveis de cadeia pesada e levecompreendendo seqüências de aminoácido que são homólogasâs seqüências de aminoácido dos anticorpos preferidosaqui descritos, e sendo que os anticorpos mantém aspropriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-CD19 da invenção.
Por exemplo, a invenção provê um anticorpo monoclonalisolado, ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo,compreendendo uma região variável de cadeia pesada e umaregião variável de cadeia leve, sendo que:
(a) a região variável de cadeia pesada compreende umaseqüência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga auma seqüência de aminoácido selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7;
(b) a região variável de cadeia leve compreende umaseqüência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga auma seqüência de aminoácido selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15;
(c) o anticorpo liga-se a CD19 humano com um K0 de IxlO-7Mou menos;(d) liga-se a células-B tumorais de Raji e Daudi.
Em diversas concretizações, o anticorpo pode ser, porexemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, ouum anticorpo quimérico.
Em outras concretizações, as seqüências de aminoácido Vhe/ou Vl podem ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%homólogas às seqüências acima citadas. Um anticorpo tendoregiões Vh e Vl com alta homologia (ou seja, de 80% oumais) com as regiões Vh e Vl das seqüências acimacitadas, pode ser obtido através de mutagênese (ou seja,mutagênese sítio-dirigida ou mediada por PCR) demoléculas de ácido nucleico codificando SEQ ID NOs: 59,60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 ou 73,seguido de teste do anticorpo codificado alterado quantoà função retida (ou seja, as funções citadas de (c) a (d)acima) utilizando os ensaios funcionais aqui descritos.
Conforme aqui utilizada, a homologia percentual entre asseqüências de aminoácido é equivalente à identidadepercentual entre as duas seqüências. A identidadepercentual entre as duas seqüências é uma função donúmero de posições idênticas compartilhadas pelasseqüências (ou seja, % homologia =# de posiçõesidênticas/total de # de posições χ 100), levando emconsideração o número de espaços ("gaps") e a extensão decada espaço, que precisam ser introduzidos paraalinhamento ótimo das duas seqüências. A comparação deseqüências e a determinação da identidade percentualentre as duas seqüências pode ser realizada utilizando-seum algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplosnão restritivos abaixo.
A identidade percentual entre as duas seqüências deaminoácido pode ser determinada utilizando-se o algoritmode E.Meyers e W.Miller (Comput. Appl.Biosci.4:11-17(1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão2.0) utilizando a tabela de resíduo de peso PAM120, umapenalidade de extensão de espaço de 12 e uma penalidadepor inserção de espaço de 4. Além disso, a identidadepercentual entre as duas seqüências de aminoácido podeser determinada utilizando-se o algoritmo de Needleman eWunsch (J.Mol.Biol.48:444-453 (1970)) que foi incorporadoao programa GAP no pacote de software CGC (disponível emwww.gcg.com), utilizando ou uma matriz Blossum 62 ou umamatriz PAM250 e um peso de espaço de 16, 14, 12, 10, 8, 6ou 4 e um peso de extensão de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
Adicionalmente ou alternativamente, as seqüências deproteína da presente invenção podem ser ainda utilizadascomo "seqüência de pesquisa/consulta ("query")" parabusca em bancos de dados públicos para, por exemplo,identificar seqüências relacionadas. Tais buscas podemser efetuadas utilizando-se o programa XBLAST (versão2.0) de Altschul, et al.(1990) J.Mol.Biol.215:4 03-10 . Asbuscas BLAST de proteína podem ser efetuadas com oprograma XBLAST, escore=50, extensão de palavra=3 paraobter seqüências de aminoácido homólogas às moléculas deanticorpo da invenção. Para obter alinhamentos com espaçopara fins de comparação, o "Gapped BLAST" pode serutilizado conforme descrito em Altschul et al., (1997)Nucleic Acids Res. 25 (17) :3389-3402 . Ao utilizar osprogramas BLAST e "Gapped BLAST", podem ser utilizados osparâmetros de valor padrão dos respectivos programas (ex:XBLAST e NBLAST). Vide www.ncbi.nlm.nih.gov.
Anticorpos com Modificações Conservativas
Em certas concretizações, um anticorpo da invençãocompreende uma região variável de cadeia pesadacompreendendo seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 e uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo seqüências CDRl,CDR2 e CDR3, sendo que uma ou mais dessas seqüências CDRcompreendem seqüências de aminoácido especificadas combase nos anticorpos preferidos aqui descritos (ex: 21D4,2lD4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 ou 46E8), ou suasmodificações conservativas, e sendo que os anticorposmantém as propriedades funcionais desejadas dosanticorpos anti-CD19 da invenção. Conseqüentemente, ainvenção provê um anticorpo monoclonal isolado, ou umaporção ligante ao antígeno do mesmo, compreendendo umaregião variável de cadeia pesada compreendendo seqüênciasCDRl, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia levecompreendendo seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, onde:
(a) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia pesadacompreende uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ IDNOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36, e suas modificaçõesconservativas;
(b) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia levecompreende uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo de seqüência de aminoácido de SEQ IDNOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 e 58 e suas modificaçõesconservativas;
(c) o anticorpo liga-se a C D19 humano com um K0 de 1x10"7M ou menos;
(d) liga-se a células-B tumorais de Raji e Daudi.
Numa concretização preferida, a seqüência CDR2 da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de seqüênciasde aminoácido de SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, e 29e suas modificações conservativas; e a seqüência CDR2 daregião variável de cadeia leve compreende uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo consistindo deseqüências de aminoácido de SEQ ID NOS: 44, 45, 46, 47,48, 49 e 50 e suas modificações conservativas. Em outraconcretização preferida, a seqüência CDRl da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de seqüênciasde aminoácido de SEQ ID NOs: 16, 17,18, 19, 20, 21 e 22,e suas modificações conservativas; e a seqüência CDRl daregião variável de cadeia leve compreende uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo consistindo deseqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40,41, 42 e 43, e suas modificações conservativas.
Em diversas concretizações, o anticorpo pode ser, porexemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados ouanticorpos quiméricos.
Conforme aqui utilizado, o termo "modificaçõesconservativas de seqüência" pretende se referir amodificações de aminoácido que não afetam nem alteramsignificativamente as características de ligação doanticorpo contendo a seqüência de aminoácido. Taismodificações conservativas incluem substituições, adiçõese deleções de aminoácido.As modificações podem serintroduzidas num anticorpo da invenção através detécnicas padrão conhecidas no estado da técnica, taiscomo mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada porPCR. Substituições conservativas de aminoácido sãoaquelas em que o resíduo aminoácido é substituído por umresíduo aminoácido que possui uma cadeia lateral similar.
Famílias de resíduos aminoácido com cadeias lateraissimilares foram definidas no estado da técnica. Essasfamílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas(ex: lisina, arginina, histidina), cadeias lateraisácidas (ex: ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeiaslaterais polares não carregadas (ex: glicina, asparagina,glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína,triptofano), cadeias laterais não-polares (ex: alanina,valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,metionina), cadeias laterais com ramificação beta (ex:treonina, valina, isoleucina) e cadeias lateraisaromáticas (ex: tirosina, fenilalanina, triptofato,histidina). Assim, um ou mais resíduos aminoácido dentrodas regiões CDR de um anticorpo da invenção podem sersubstituídos por outros resíduos aminoácido da mesmafamília de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode sertestado quanto à função retida (ou seja, a funçãoestabelecida de (c) a (d) acima) utilizando os ensaiosfuncionais aqui descritos.
Anticorpos que Ligam-se ao mesmo Epítopo como Anticorpos
Anti-CDl9 da Invenção
Em outra concretização, a invenção provê anticorpos queligam-se ao mesmo epítopo em CDl9 humano como qualquer umdos anticorpos monoclonais CD19 da invenção (ou seja,anticorpos que possuem a capacidade de fazer competiçãocruzada para ligar-se a CD19 com qualquer um dosanticorpos monoclonais da invenção). Em concretizaçõespreferidas, o anticorpo de referência para estudos decompetição cruzada pode ser o anticorpo monoclonal 21D4tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ IDNOs: 1 e 8, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal21D4a (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQID NOs: 1 e 9, respectivamente), ou o anticorpomonoclonal 4 7G4 (tendo seqüências Vh e Vl conformemostrado nas SEQ ID NOs: 2 e 10, respectivamente), ou oanticorpo monoclonal 27F3 (tendo seqüências Vh e Vlconforme mostrado nas SEQ ID NOs: 3 e 11respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 3C10 (tendoseqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ ID NOs:4 e12, respectivamente) ou o anticorpo monoclonal 5G7 (tendoseqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 5 e13, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 13F1(tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQ IDNOs: 6 e 14, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal4 6E8 (tendo seqüências Vh e Vl conforme mostrado nas SEQID NOs: 7 e 15, respectivamente). Tais anticorpos decompetição cruzada podem ser identificados com base emsua capacidade de fazer competição cruzada com 21D4,2lD4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 ou 46E8, nos ensaiospadrão de ligação a CD19. Por exemplo, a análiseBIAcore®, ensaios ELISA ou a citometria de fluxo podemser usados para demonstrar a competição cruzada com osanticorpos da presente invenção. A capacidade de umanticorpo de teste inibir a ligação, por exemplo, de21D4, 2 lD4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 ou 46E8 a CD19humano demonstra que o anticorpo de teste pode competircom 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 ou 46E8 paraligar-se a CD19 humano e assim liga-se ao mesmo epítopoem CDl9 humano como 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7,13F1 ou 46E8. Numa concretização preferida, o anticorpoque se liga ao mesmo epítopo em CD19 humano como 21D4,2lD4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 ou 46E8 é um anticorpomonoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanospodem ser preparados e isolados conforme descrito nosExemplos.
Anticorpos Construídos e Modificados
Um anticorpo que possui uma ou mais das seqüências Vh eVl aqui descritas pode ser usado como material de partidapara construir um anticorpo modificado que pode terpropriedades alteradas se comparado com o anticorpo departida. Um anticorpo pode ser construído através damodificação de um ou mais aminoácidos dentro de uma ou deambas as regiões (ou seja, Vh e/ou Vl) , por exemplo,dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma oumais regiões estruturais. Adicionalmente, oualternativamente, um anticorpo pode ser construídoatravés da modificação de resíduos dentro da região(s)constante (s) , por exemplo, para alterar a função(ões)efetoras do anticorpo.
Em certas concretizações, o enxerto em CDR pode ser usadopara construir regiões variáveis de anticorpos. Osanticorpos interagem com antígenos alvo predominantementeatravés de resíduos aminoácido que estão localizados nasseis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) decadeia pesada e leve. Por essa razão, as seqüências deaminoácido dentro das CDRs são mais diversas entreanticorpos individuais do que as seqüências fora dasCDRs. Uma vez que as seqüências de CDR são responsáveispela maioria das interações anticorpo-antígeno, épossível expressar anticorpos recombinantes que imitem aspropriedades de anticorpos específicos de ocorrêncianatural construindo-se vetores de expressão que incluamseqüências CDR do anticorpo específico de ocorrêncianatural enxertado nas seqüências estruturais de umanticorpo diferente com propriedades diferentes (vide,por exemplo, Riechmann, L.et al.(1998) Nature 332:323-327; Jones, P.et al.(1986) Nature 321:522-525; Queen,C.et al.(1989) Proc.Natl.Acad.vide U.S.A. 86:10029-10033;Patente americana 5.225.539 a Winter, e patentesamericanas Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e6.180.370 a Queen et al.).
Conseqüentemente, outra concretização refere-se a umanticorpo monoclonal isolado, ou a uma porção ligante aoantígeno do mesmo, compreendendo uma região variável decadeia pesada que compreende seqüências CDRl, CDR2, eCDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 16, 17,18, 19, 20, 21 e 22, SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 e29 e SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36,respectivamente, e uma região variável de cadeia levecompreendendo seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 compreendendouma seqüência de aminoácido do grupo consistindo de SEQID NOS: 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43, SEQ ID NOs: 44, 45,46, 47, 48, 49 e 50 e SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56,57 e 58, respectivamente. Assim, tais anticorpos contémas seqüências CDR Vh e Vl de anticorpos monoclonais 21D4,2lD4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 ou 46E8 e ainda podemconter seqüências estruturais diferentes dessesanticorpos.
Tais seqüências estruturais podem ser obtidas de bancosde dados públicos de DNA ou de referências publicadas queincluam seqüências gênicas de anticorpo na linhagerminal. Por exemplo, as seqüências de DNA na linhagerminal para genes humanos da região variável de cadeiapesada e leve podem ser encontradas no banco de dados deseqüência de linha germinal humana "VBase" (disponível nainternet no www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como emKabat, E. A. et al.(1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department ofHealth and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;Tomlinson, I.M.,et al.(1992) "The Repertoire of HumanGermlina Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of VhSegments with Different Hypervariable Loops"J.Mol.Biol.227:776-798; e Cox, J.P.L.et al . (1994) "ADirectory of Human Germ-Iine Vh segments Reveals a StrongBias in Their Usage" Eur.J.Immunol.24:82 7-836 ; cujoconteúdo de cada um foi aqui expressamento incorporadopor referência. Como outro exemplo, as seqüências de DNAda linha germinal para genes humanos da região variávelde cadeia pesada e leve podem ser encontradas no banco dedados Genbank. Por exemplo, as seqüências da linhagerminal de cadeia pesada a seguir descritas, encontradasno camundongo HCo7 HuMAb estão disponíveis nos números deregistro do Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 eBC070333) , 3-33 (NG_0010109 e NT_024637) e 3 - 7(NH_0010109e NT_024 63 7). Como outro exemplo, as seqüências da linhagerminal de cadeia pesada a seguir descritas, encontradasno camundongo HCol2 HuMAb estão disponíveis nos númerosde registro do Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 eBC070333) , 5-51 (NG_0010109 e NT_024637) , 4-34(NG_0 01010 9 e NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) e 3-23(AJ406678).
As seqüências de proteína de anticorpo são comparadascontra um banco de dados compilado de seqüência deproteínas utilizando um dos métodos de busca porsimilaridade de seqüência denominado Gapped BLAST(Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402) que é bastante conhecido no estado da técnica.BLAST é um algoritmo heurístico em que um alinhamentoestatisticamente significativo entre a seqüência doanticorpo e a seqüência do banco de dados provavelmentecontém pares de segmentos de alta classificação (HSP) depalavras alinhadas. Os pares de segmentos cujasclassificações não podem ser melhoradas por extensão ouadaptação são denominados "hit" (resultado).
Resumidamente, as seqüências de nucleotídeos de origemVBASE (http://vbase.mrc-cpe.cam.aca.uk/vbasel/list2.php)são traduzidas e a região entre e incluindo a regiãoestrutural de FRl a FR3 fica retida. As seqüências debanco de dados possuem uma extensão média de 98 resíduos.Seqüências em duplicata que são combinações exatas portoda a extensão da proteína são removidas. Uma buscaBLAST por proteínas utilizando o programa blastp comvalor padrão, parâmetros padrão com exceção do filtro debaixa complexidade que é desativado, e a matriz desubstituição de BLOSUM62, filtra as combinações deseqüência produzindo os 5 primeiros resultados ("hits").
As seqüências de nucleotídeo são traduzidas em todas asseis estruturas e a estrutura sem códons de parada nosegmento combinante da seqüência do banco de dados éconsiderada o resultado ("hit") em potencial. Isso éconfirmado utilizando o programa tblastx BLAST que traduza seqüência de anticorpo em todas as seis estruturas ecompara essas traduções com as seqüências de nucleotídeosVBASE dinamicamente traduzidas em todas as seisestruturas.
As identidades são pares exatos de aminoácido entre aseqüência de anticorpo e o banco de dados de proteínaspor toda a extensão da seqüência. Os positivos(identidades + par de substituição) não são idênticos massubstituições de aminoácido orientadas pela matriz desubstituição BLOSUM62. Se a seqüência de anticorpocombinar duas seqüências do banco de dados com a mesmaidentidade, o resultado com mais positivos seria decididocomo o resultado de seqüência combinante.
Seqüências estruturais preferidas para uso nos anticorposda invenção são estruturalmente similares às seqüênciasestruturais utilizadas por anticorpos selecionados dainvenção, como por exemplo, similares às seqüênciasestruturais Vh 5-51 (SEQ ID NO: 74) e/ou as seqüênciasestruturais Vh 1-69 (SEQ ID NO: 75) e/ou as seqüênciasestruturais Vk L18 (SEQ ID NO:76) e/ou a seqüênciaestrutural Vk A27 (SEQ ID NO:77) e/ou a seqüênciaestrutural Vk L15 (SEQ ID NO: 78) utilizadas poranticorpos monoclonais preferidos da invenção. Asseqüências CDRl, CDR2 e CDR3 Vh e as seqüências CDRl,CDR2 e CDR3 Vk podem ser enxertadas em regiõesestruturais que possuam a seqüência idêntica à encontradano gene de imunoglobulina de linha germinal do qualderiva a seqüência estrutural, ou as seqüências de CDRpodem ser enxertadas em regiões estruturais que contenhamuma ou mais mutações se comparadas com as seqüências delinha germinal. Por exemplo, descobriu-se que em certoscasos, é benéfico mutar resíduos dentro das regiõesestruturais para manter ou aumentar a capacidade deligação do anticorpo ao antígeno (vide, por exemplo, aspatentes americanas 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e6.180.370 de Queen et al).
Outro tipo de modificação na região variável consiste emmutar resíduos aminoácido dentro das regiões CDRl, CDR2e/ou CDR3 Vh e/ou Vk para assim melhorar uma ou mais daspropriedades de ligação (ex: afinidade) do anticorpo deinteresse. A mutagênese sítio-dirigida ou a mutagênesemediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s)mutação(ões) e o efeito sobre a ligação do anticorpo, ououtra propriedade funcional de interesse, pode seravaliado em ensaios in vitro ou in vivo, conforme aquidescrito e fornecido nos Exemplos. São introduzidasmodificações conservativas preferidas (conforme discutidoacima). As mutações podem ser substituições, adições oudeleções de aminoácido, porém, são preferivelmentesubstituições. Além disso, tipicamente não são alteradosmais que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos numaregião CDR.
Conseqüentemente, em outra concretização, a presentedescrição provê anticorpos monoclonais anti-CD19isolados, ou porções ligantes ao antígeno dos mesmos,compreendendo uma região variável de cadeia pesadacompreendendo: (a) uma região CDRl Vh compreendendo umaseqüência de aminoácido do grupo consistindo de SEQ IDNOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22, ou uma seqüência deaminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, deleções ou adições de aminoácido, secomparada com as SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22;(b) uma região CDR2 Vh compreendendo uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOS: 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29, ou uma seqüência deaminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, deleções ou adições de aminoácido, secomparada com as SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29;
(c) uma região CDR3 Vh compreendendo uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36, ou uma seqüência deaminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, deleções ou adições de aminoácido secomparada com SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36;
(d) uma região CDRl Vk compreendendo uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43, ou uma seqüência deaminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, deleções ou adições de aminoácido secomparada com SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43;
(e) uma região CDR2 Vk compreendendo uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50, ou uma seqüência deaminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, deleções ou adições de aminoácido, secomparada com SEQ ID NOS: 44, 45, 46, 47, 48, 49, e 50; e
(f) uma região CDR3 Vk compreendendo uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 e 58, ou uma seqüência deaminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cincosubstituições, deleções ou adições de aminoácido, secomparada com SEQ ID NOS: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 e 58 .
Anticorpos construídos da invenção incluem aqueles cujasmodificações foram efetuadas em resíduos estruturais emVh e/ou VK, como por exemplo, para melhorar aspropriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificaçõesestruturais são feitas para reduzir a imunogenicidade doanticorpo. Por exemplo, um método consiste em fazerretro-mutação ("backmutate") em um ou mais resíduosestruturais para a seqüência de linha germinalcorrespondente. Mais especificamente, um anticorpo quetiver sido submetido à mutação somática poderá conterresíduos estruturais que diferem da seqüência da linhagerminal da qual deriva o anticorpo. Tais resíduos podemser identificados comparando-se as seqüências estruturaisdo anticorpo com as seqüências de linha germinal da qualderiva o anticorpo.
Por exemplo, a Tabela 1 abaixo mostra diversas alteraçõesde aminoácido dentro das regiões estruturais dosanticorpos anti-PD-1 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 e 5F4que diferem da seqüência de linha germinal parental decadeia pesada. Para retornar um ou mais dos resíduosaminoácido nas seqüências da região estrutural à suaconfiguração de linha germinal, as mutações somáticaspodem ser retro-mutadas ("backmutated") para a seqüênciade linha germinal, por exemplo, através de mutagênesesítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR.
Tabela 1 - Modificações nos anticorpos 17D8, 2D3, 4H1,5C4, 4A11, 7D3 e 5F4 da configuração de linha germinal de
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Outro tipo de modificação estrutural envolve mutar um oumais resíduos dentro da região estrutural ou ainda dentrode uma ou mais regiões CDR, para remover os epítopos decélula T para assim reduzir a imunogenicidade potencialdo anticorpo. Esse método é também designado como"desimunização" e é descrito em maiores detalhes napatente americana No. 20030153043 de Carr et al.
Além de e como alternativa às modificações feitas dentrodas regiões estruturais ou CDR, os anticorpos da invençãopodem ser construídos para incluir modificações na regiãoFc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedadesestruturais do anticorpo, tal como meia vida sérica,fixação de complemento, ligação a receptor Fci e/oucitotoxicidade celular dependente de antígeno. Alémdisso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamentemodificado (ex: uma ou mais porções químicas podem serligadas ao anticorpo) ou modificado para alterar suaglicosilação, novamente para alterar uma ou maispropriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessasconcretizações é descrita em maiores detalhes abaixo. Anumeração dos resíduos na região Fc é a do índice EU deKabat.
Numa concretização, a região de dobra de CHl é modificadade forma tal que o número de resíduos cisteína na regiãode dobra é alterado, como por exemplo, aumentado oureduzido. Esse método é descrito mais detalhadamente napatente americana No. 5.677.425 de Bodmer et al. 0 númerode resíduos cisteína na região de dobra de CHl éalterado, por exemplo, para facilitar a montagem dascadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir aestabilidade do anticorpo.
Em outra concretização, a região de dobra Fc de umanticorpo é mutada para reduzir a meia-vida biológica doanticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações deaminoácido são introduzidas na região interfacial dedomínio CH2-CH3 do fragmento de dobra Fc até que oanticorpo tenha danificado a ligação a proteína Aestafilocócica (SpA) em relação à ligação a SpA dedomínio de dobra Fc nativo. Esse método é descrito maisdetalhadamente na patente americana No. 6.165.745 de Wardet al.
Em outra concretização, o anticorpo é modificado paraaumentar sua meia-vida biológica. Diversos métodos sãopossíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintesmutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F,conforme descrito na patente americana No. 6.277.375 deWard. Alternativamente, para aumentar a meia-vidabiológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da regiãoCHl ou Cl para conter um epítopo ligante ao receptor deresgate tomado de dois laços de um domínio CH2 de umaregião Fc de uma IgG, conforme descrito nas patentesamericanas Nos. 5.869.046 e 6.121.022, de Presta et al.
Em outras concretizações ainda, a região Fc é alteradasubstituindo-se pelo menos um resíduo aminoácido por umresíduo aminoácido diferente para alterar a(s)função(ões) efetoras do anticorpo. Por exemplo, um oumais aminoácidos selecionado de resíduos aminoácido 234,235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídospor um resíduo aminoácido diferente, de forma que oanticorpo tenha uma afinidade alterada por um liganteefetor, mas que mantenha a capacidade de ligação aoantígeno do anticorpo parental. 0 ligante efetor no quala afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptorFc ou o componente de complemento Cl. Esse método édescrito com maiores detalhes nas patentes americanasNos. 5.624.821 e 5.648.260, ambas de Winter et al.
Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionado deresíduos aminoácido 329, 331 e 322 podem ser substituídospor um resíduo aminoácido diferente, de forma que oanticorpo altere a ligação a Clq e/ou reduza ou anule acitotoxicidade dependente de complemento (CDC). Essemétodo é descrito com maiores detalhes na patenteamericana No. 6.194.551 de Idusogie et al.
Em outro exemplo, um ou mais resíduos aminoácido nasposições de aminoácido 2316, 17, 18, 19, 20, 21 e 2239são alterados para assim alterar a capacidade de oanticorpo fixar o complemento. Esse método é descrito napublicação PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.
Em outro exemplo ainda, a região Fc é modificada paraaumentar a capacidade de o anticorpo mediar acitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)e/ou aumentar a afinidade do anticorpo por um receptorFcy modificando um ou mais aminoácidos nas seguintesposições: 238, 239, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265,267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286,289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305,307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330,331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378,382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437,438 ou 439. Esse método é descrito mais detalhadamente naPublicação PCT WO 00/42072 de Presta. Além disso, ossítios de ligação em IgGl humana para FcyRl, FcyRII,FcyRIII e FcRn foram mapeados e as variantes com ligaçãomelhorada foram descritas (vide Shields, R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem 276:6591-6604). Mutações específicas nasposições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 demonstrarammelhorar a ligação a FcyRIII. Além disso, os seguintesmutantes de combinação demonstraram melhorar a ligação aFcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A eS298A/E333A/K334A.
Em outra concretização, a glicosilação de um anticorpo émodificada. Por exemplo, pode-se preparar um anticorpoaglicosilado (ou seja, o anticorpo carece deglicosilação). A glicosilação pode ser alterada, porexemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo peloantígeno. Tais modificações em carboidrato podem serrealizadas, por exemplo, alterando-se um ou mais sítiosde glicosilação na seqüência do anticorpo. Por exemplo,podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácidoque resultem em eliminação de um ou mais sítios deglicosilação na estrutura da região variável para assimeliminar a glicosilação naquele sítio. Essa aglicosilaçãopode aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Talmétodo é descrito mais detalhadamente nas patentesamericanas Nos. 5.714.350 e 6.350.861 de Co et al.
Adicionalmente ou alternativamente, pode-se preparar umanticorpo que tenha um tipo alterado de glicosilação, talcomo um anticorpo hipofucosilado tendo quantidadesreduzidas de resíduos fucosila ou um anticorpo comestruturas GlcNac bisegmentantes aumentadas. Tais padrõesde glicosilação alterada demonstraram aumentar acapacidade de ADCC dos anticorpos. Tais modificações decarboidrato podem ser efetuadas, por exemplo,expressando-se o anticorpo numa célula hospedeira commaquinário de glicosilação alterada. As células commaquinário de glicosilação alterada foram descritas noestado da técnica e podem ser usadas como célulashospedeiras nas quais são expressados os anticorposrecombinantes da invenção, para assim produzir umanticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, aslinhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 carecem de genede fucosiltransferase, FUT8(alfa(1,6)fucosiltransferase), de forma que os anticorposexpressados nas linhagens celulares Ms704, Ms705, e Ms709carecem de fucose em seus carboidratos. As linhagenscelulares FUT8+ Ms704, Ms705, e Ms709 foram criadas peladisrupção direcionada do gene FUT8 em células CHO/DG44utilizando dois vetores de substituição (vide Publicaçãode patente americana No. 20040110704 de Yamana et al eYamame-Ohnuki et al (2004) Biotechnol Bioeng. 87:614-22).
Outro exemplo, EP 1.176.195 de Hanai et al. descreve umalinhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente rompido,que codifica uma fucosil transferase, de forma que osanticorpos expressados em tal linhagem celular exibemhipofucosilação mediante redução ou eliminação da enzimarelacionada à ligação alfa 1,6. Hanai et al tambémdescrevem as linhagens celulares que possuem baixaatividade enzimática para adicionar fucose à N-acetilglucosamina que liga-se à região Fc do anticorpo ouque não possuem atividade enzimática, por exemplo alinhagem celular de mieloma de rato YB2/0(ATCC CRL 1662).
A Publicação PCT WO 03/035835 de Presta descreve umalinhagem celular CHO variante, células Lecl3, comcapacidade reduzida de ligar fucose a carboidratosligados a Asn(297), o que também resulta emhipofucosilação de anticorpos expressados naquela célulahospedeira (vide também Shields, R.L. et al(2002)J.Biol.Chem. 277:2 6733-26740). A publicação PCT WO99/54342 de Umana et al., descreve linhagens celularesconstruídas para expressar glicosil transferasesmodificadoras de glicoproteína (ex: beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII) de forma queos anticorpos expressados nas linhagens celularesconstruídas exibam estruturas GlcNac bisegmentantesaumentadas, o que resulta em atividade aumentada de ADCCdos anticorpos (vide também Umana et al.(1999) Nat.Biotech. 17?176-180). Alternativamente, os resíduosfucose do anticorpo podem ser clivados utilizando-se umaenzima fucosidase. Por exemplo, a fucosidase alfa-L-fucosidase remove resíduos fucosila de anticorpos(Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).
Outra modificação dos anticorpos prevista na presenteinvenção é a peg-glicosilação ("pegylation"). Umanticorpo pode ser submetido à peg-glicosilação para, porexemplo, aumentar a meia-vida biológica (ex: sérica) doanticorpo. Para tratar o anticorpo com peg-glicosilação,o anticorpo ou o fragmento, é tipicamente reagido compolietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ouderivado de aldeído de PEG, sob condições nas quais um oumais grupos PEG ficam ligados ao anticorpo ou aofragmento de anticorpo. Preferivelmente, a peg-glicosilação é conduzida via reação de acilação ou reaçãode alquilação com uma molécula de PEG reativo (ou umpolímero reativo análogo solúvel em água). Conforme aquiutilizado, o termo "polietileno glicol" pretende abrangerqualquer uma das formas de PEG que tenha sido utilizadapara derivatizar outras proteínas, tais como mono(Cl-C10)alcoxi- ou ariloxi-polietileno glicol ou polietileno-glicol-maleimida. Em certas concretizações, o anticorpo aser tratado com PEG é um anticorpo aglicosilado. Métodospara tratar proteínas com PEG-glicosilação são conhecidosno estado da técnica e podem ser aplicados aos anticorposda invenção. Vide, por exemplo, EP O 154 316 de Nishimuraet al. e EP O 401 384 de Ishikawa et al.
Propriedades Físicas do Anticorpo
Os anticorpos da presente invenção podem ser aindacaracterizados pelas várias propriedades físicas dosanticorpos anti-CD19. Diversos ensaios podem ser usadospara detectar e/ou diferenciar diferentes classes deanticorpos com base nessas propriedades físicas.
Em algumas concretizações, os anticorpos da presenteinvenção podem conter um ou mais sítios de glicosilaçãona região variável de cadeia leve ou pesada. A presençade um ou mais sítios de glicosilação na região variávelpode resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpoou numa alteração do pK do anticorpo devido à ligação aoantígeno alterado (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem41:673-702; Gala FA e Morrison SL (2004) J Immunol172:5489-94; Wallick et al . (1988), J.Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh etal (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al.(2000) MolImmunol. 37:697-706). Sabe-se que a glicosilação ocorreem padrões contendo uma seqüência N-X-S/T. A glicosilaçãoem região variável pode ser testada utilizando um ensaioGlycoblot que cliva o anticorpo para produzir um Fab, eque então testa a glicosilação utilizando um ensaio quemede a oxidação de periodato e a formação de base Schiff.
Alternativamente, a glicosilação em região variável podeser testada utilizando-se cromatografia de luz Dionex(Dionex-LC) que cliva sacarídeos de um Fab emmonossacarídeos e analisa o teor de sacarídeo individual.
Em alguns casos, é preferido ter um anticorpo anti-CD19que não contenha glicosilação em região variável. Issopode ser obtido selecionando-se anticorpos que naocontenham o padrão de glicosilação na região variável oumutando-se resíduos dentro do padrão de glicosilaçãoutilizando técnicas padrão conhecidas no estado datécnica.
Numa concretização preferida, os anticorpos da presenteinvenção não contém sítios de isomerismo de asparagina.
Um efeito de desamidação ou de ácido isoaspártico podeocorrer em seqüências N-G ou D-G, respectivamente. 0efeito de desamidação ou de ácido isoaspártico resulta nacriação de ácido isoaspártico que reduz a estabilidade deum anticorpo, criando uma estrutura dobrada fora de umterminal carboxi de cadeia lateral ao invés de na cadeiaprincipal. A criação de ácido isoaspártico pode sermedida utilizando-se um ensaio iso-quant que utiliza umaHPLC de fase reversa para testar o ácido aspártico.
Cada anticorpo terá um ponto isoelétrico inédito (pl) ,mas geralmente os anticorpos enquadram-se na faixa de pHde 6 e 9,5. O pi para um anticorpo IgGl enquadra-setipicamente na faixa de pH de 7-9,5 e o pi para umanticorpo IgG4 enquadra-se tipicamente na faixa de pH de6-8. Os anticorpos podem ter um pi que esteja fora dessafaixa. Embora os efeitos sejam geralmente desconhecidos,existe uma especulação de que os anticorpos com um pifora da faixa normal possam apresentar alguma não-revelação e instabilidade nas condições in vivo. O pontoisoelétrico pode ser testado utilizando-se um ensaio defocalização isoelétrica capilar que cria um gradiente depH e que pode utilizar focalização a laser para aumentara precisão (Janini et al.(2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2 001) Chromatographia 53:S75:89; Hunt etal. (1998) J.Chromatogr A 800:355-67). Em alguns casos, épreferido ter um anticorpo CD19 que contenha um valor depi enquadrado na faixa normal. Isso pode ser obtidoselecionando-se anticorpos com um pi na faixa normal, oumutando-se resíduos de superfície carregada, utilizandotécnicas padrão bastante conhecidas no estado da técnica.Cada anticorpo terá uma temperatura de fusão indicativade estabilidade térmica (Krishnamurthy R and Manning MC(2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Uma estabilidadetérmica mais alta indica maior estabilidade global doanticorpo in vivo. 0 ponto de fusão de um anticorpo podeser medido utilizando-se técnicas tais como calorimetriadiferencial exploratória (Chen et al.(2003) Pharma Res20:1952-60; Ghirlando et al(1990) Immunol Lett 68:47-52).TM1 indica a temperatura de não-revelação inicial doanticorpo. TM2 indica a temperatura de não-revelaçãocompleta do anticorpo. Geralmente, é preferido que a TMide um anticorpo da presente invenção seja superior a6O0C, preferivelmente superior a 65°C, e ainda maispreferivelmente superior a 70°C. Alternativamente, aestabilidade térmica de um anticorpo pode ser medidautilizando-se dicroismo circular (Murray et al.(2002)J.Chromatogra Sci 40:343-9).
Numa concretização preferida, são selecionados osanticorpos que não se degradam rapidamente. Afragmentação de um anticorpo anti-CD19 pode ser medidautilizando-se eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS,conforme é entendido no estado da técnica (Alexander AJ eHughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
Em outra concretização preferida, são selecionados osanticorpos que possuam efeitos de agregação mínimos. Aagregação pode levar à ativação de uma resposta imuneindesejada e/ou a propriedades farmacocinéticas alteradasou desfavoráveis. Geralmente, são aceitáveis osanticorpos com agregação de 25% ou menos, preferivelmente20% ou menos, ainda mais preferivelmente 15% ou menos,ainda mais pref erivelmente 10% ou menos ou ainda maispreferivelmente 5% ou menos. A agregação pode ser medidaatravés de diversas técnicas bastante conhecidas noestado da técnica, incluindo cromatografia líquida dealto desempenho (HPLC) com coluna de exclusão pordimensão (SEC) e dispersão de luz para identificarmonômeros, dímeros, trímeros ou multímeros.Métodos para Construir Anticorpos
Conforme discutido acima, os anticorpos anti-CD19 tendoseqüências Vh e Vk aqui descritos podem ser usados paracriar novos anticorpos anti-CD19 modificando-se asseqüências Vh e/ou VK, ou a(s) região (ões) constantes aelas ligadas. Assim, em outro aspecto da invenção, ascaracterísticas estruturais de um anticorpo anti-CD19 dainvenção, por exemplo, 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10,5G7, 13F1 e 46E8 são usadas para criar anticorpos anti-CDl9 estruturalmente relacionados que retenham pelo menosuma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, talcomo ligação a CDl 9 humano. Por exemplo, uma ou maisregiões CDR de 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e4 6E8 ou suas mutações, podem ser combinadasrecombinantemente com regiões estruturais conhecidas e/oucom outras CDRs para criar anticorpos anti-CD19adicionais recombinantemente construídos da invenção,conforme discutido acima. Outros tipos de modificaçõesincluem as descritas na seção anterior. 0 material departida para o método de construção é uma ou mais dasseqüências Vh e/ou Vk aqui providas, ou uma ou mais desuas regiões CDR. Para criar o anticorpo construído, nãoé necessário efetivamente preparar (ou seja, expressarcomo proteína) um anticorpo tendo uma ou mais dasseqüências Vh e/ou Vk aqui providas, ou uma ou mais desuas regiões CDR. Em vez disso, as informações contidasna(s) seqüência(s) são utilizadas como o material departida para criar uma seqüência(s) de "segunda geração"derivada(s) da seqüência(s) original e então aseqüência(s) de "segunda geração" é preparada eexpressada como uma proteína.
Conseqüentemente, em outra concretização, a invençãoprovê um método para preparar um anticorpo anti-CD19compreendendo:
(a) prover: (i) uma seqüência de anticorpo de regiãovariável de cadeia pesada compreendendo uma seqüênciaCDRl selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 16,17, 18, 19, 20, 21 e 22, uma seqüência CDR2 selecionadado grupo consistindo de SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27,28, e 29, e/ou uma seqüência CDR3 selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34 e 35; e/ou(ii) uma seqüência de anticorpo de região variável decadeia leve compreendendo uma seqüência CDRl selecionadado grupo consistindo de SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41,42 e 43, uma seqüência CDR2 selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50,e/ou uma seqüência CDR3 selecionada do grupo consistindode SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 e 58;
(b) alterar pelo menos um resíduo aminoácido dentro daseqüência de anticorpo da região variável de cadeiapesada e/ou da seqüência de anticorpo da região variávelde cadeia leve para criar pelo menos uma seqüência deanticorpo alterado; e
(c) expressar a seqüência de anticorpo alterado como umaproteína.
Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadaspara preparar e expressar a seqüência de anticorpoalterado.
Preferivelmente, o anticorpo codificado pela(s)seqüência(s) de anticorpo alterado(s) é aquele que retémuma, algumas ou todas as propriedades funcionais dosanticorpos anti-CD19 aqui descritos, cujas propriedadesfuncionais incluem, porém não se restringem a:
(i) ligar-se a CD19 humano com um K0 de IxlO-7M ou menos;
(ii) ligar-se a células-B tumorais de Raji e Daudi.
As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podemser avaliadas utilizando-se ensaios padrão disponíveis noestado da técnica e/ou aqui descritos, tais como osestabelecidos nos Exemplos (ex: citometria de fluxo,ensaios de ligação).
Em certas concretizações dos métodos para construiranticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidasaleatória ou seletivamente ao longo de toda ou de partede uma seqüência de codificação de anticorpo anti-C D19 eos anticorpos anti-CD19 modificados resultantes podem seridentificados quanto à atividade de ligação e/ou outraspropriedades funcionais conforme aqui descrito. Métodosmutacionais foram descritos no estado da técnica. Porexemplo, a publicação PCT WO 02/092780 de Short descrevemétodos para criar e identificar mutações de anticorposutilizando mutagênese de saturação, montagem de ligaçãosintética, ou uma combinação dos mesmos.
Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 de Lazaret al., descreve métodos para utilizar métodoscomputacionais de identificação para otimizar aspropriedades fisioquímicas dos anticorpos.
Moléculas de Ácido Nucleico que Codificam Anticorpos
Outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácidonucleico que codificam os anticorpos da invenção. Osácidos nucleicos podem estar presentes em célulascompletas, num lisado de células, ou numa formaparcialmente purificada ou substancialmente pura. Umácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmentepuro" quando purificado à distância de outros componentescelulares ou outros contaminantes, como por exemplo,outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, atravésde técnicas padrão, incluindo o tratamento alcalino/SDS,bandeamento CsCl, cromatografia de coluna, eletroforeseem gel de agarose e outros bastante conhecidos no estadoda técnica. Vide, F.Ausubel et al., ed. (1987)CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing andWiley Interscience, New York. Um ácido nucleico dainvenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou nãoconter seqüências intrônicas. Numa concretizaçãopreferida, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.
Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidosutilizando-se técnicas padrão de biologia molecular. Paraanticorpos expressados por hibridomas (ex: hibridomaspreparados a partir de camundongos transgênicos portandogenes de imunoglobulina humana conforme descrito logoabaixo) cDNAs codificando as cadeias leve e pesada doanticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidosatravés de amplificação PCR padrão ou técnicas declonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de um banco degene de imunoglobulina (ex: utilizando técnicas deexibição de fago), um ou mais ácidos nucleicos quecodificam o anticorpo podem ser recuperados do banco.
Moléculas de ácido nucleico preferidas da invenção são asque codificam as seqüências Vh e Vl dos anticorposmonoclonais 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 ou46E8. As seqüências de DNA que codificam as seqüências Vhde 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e 46E8 sãomostradas nas SEQ ID NOs: 59, 60, 61, 62, 63, 64 e 65,respectivamente. Seqüências de DNA que codificam asseqüências Vl de 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1e 46E8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 66, 67, 68, 69, 70,71, 72 e 73, respectivamente.
Uma vez obtidos os fragmentos de DNA que codificam ossegmentos Vh e Vl , esses fragmentos de DNA podem serainda manipulados através de técnicas padrão de DNArecombinante, por exemplo, para converter os genes deregião variável em genes de cadeia de anticorpo deextensão completa, em genes de fragmento Fab, ou num genescFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNAcodificador de Vl ou Vh é operativamente ligado a outrofragmento de DNA que codifica outra proteína, tal comouma região constante de anticorpo ou um ligante flexível.
0 termo "operativamente ligado", utilizado nestecontexto, pretende significar que os dois fragmentos deDNA são unidos de forma tal que as seqüências deaminoácido codificadas pelos dois fragmentos de DNApermaneçam na estrutura ("in-frame").
0 DNA isolado que codifica a região Vh pode serconvertido num gene de cadeia pesada de extensão completaligando-se operativamente o DNA codificador de VH emoutra molécula de DNA que codifica as regiões constantesde cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As seqüências de geneshumanos de região constante de cadeia pesada sãoconhecidas no estado da técnica (vide, por exemplo, Kabatet al.(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, Fifth Edition, U.S.Department of Health andHuman Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentosde DNA abrangendo essas regiões podem ser obtidos atravésde amplificação PCR padrão. A região constante de cadeiapesada pode ser uma região constante IgGl, IgG2, IgG3,IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, porém, o mais preferivelmenteé uma região constante IgGl ou IgG4. Para um gene decadeia pesada de fragmento Fab, o DNA codificador de Vhpode ser operativamente ligado a outra molécula de DNAque codifica apenas a região constante CHl de cadeiapesada.
O DNA isolado que codifica a região Vl pode serconvertido num gene de cadeia leve de extensão completa(bem como um gene de cadeia leve Fab) ligando-seoperativamente o DNA codificador de Vl a outra moléculade DNA que codifica a região constanter de cadeia leve,CL. As seqüências de genes humanos da região constante decadeia leve são conhecidos no estado da técnica (vide,por exemplo, Kabat, E. A. et al.(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services, NIHPublication No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo25 essas regiões podem ser obtidos através de amplificaçãoPCR padrão. Em concretizações preferidas, a regiãoconstante de cadeia leve pode ser uma região constantekappa ou lambda.
Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA quecodificam Vh e Vl são operat ivamente ligados a outrofragmento que codifica um ligante flexível, como porexemplo, que codifica a seqüência de aminoácido (Gly4-Ser) 3, de forma que as seqüências de Vh e Vl possam serexpressadas como uma proteína de cadeia simples contígua,com as regiões Vl e Vh unidas pelo ligante flexível(vide, por exemplo, Bird et al. , (1988) Science 242:423-426; Huston et al.(1988) Proc. Natl.Acad. Sei.USA85:5879-5883; McCafferty et al. , (1990) Nature 348:552-554).
Produção de Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos monoclonais (mAbs) da presente invenção5 podem ser produzidos através de uma variedade detécnicas, inclusive a metodologia convencional deanticorpo monoclonal, como por exemplo, a técnica padrãode hibridação de célula somática de Kohler e Milstein(1975) Nature 256:495. Embora os procedimentos dehibridação de célula somática sejam preferidos, emprincípio, outras técnicas para produzir anticorpomonoclonal podem ser empregadas, como por exemplo, atransformação viral ou oncogênica de linfócitos B.
0 sistema animal preferido para preparar hibridomas é osistema murino. A produção de hibridoma no camundongo éum procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos etécnicas de imunização para isolamento de esplenócitosimunizados para fusão são conhecidos no estado datécnica. Pares de fusão (ex: células de mieloma murino) eprocedimentos de fusão são também conhecidos.
Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invençãopodem ser preparados com base na seqüência de umanticorpo monoclonal não-humano preparado conforme acimadescrito. 0 DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeialeve e pesada pode ser obtido de um hibridoma não-humanode interesse e construído para conter seqüências deimunoglobulina não-murina (ex: humana) utilizando astécnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, paracriar um anticorpo quimérico, regiões murinas variáveispodem ser ligadas a regiões humanas constantes utilizandoos métodos conhecidos no estado da técnica (vide, porexemplo, a patente americana No. 4.816.567 de Cabilly etal. ). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDRmurinas podem ser inseridas numa estrutura humanautilizando os métodos conhecidos no estado da técnica(vide, por exemplo, a patente americana No. 5.225.539 deWinter, e as patentes americanas Nos. 5.530.101;5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al.).
Numa concretização preferida, os anticorpos da invençãosão anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorposmonoclonais humanos dirigidos contra CD19 podem sergerados utilizando camundongos transgênicos outranscromossômicos portando partes do sistema imunehumano ao invés do sistema camundongo. Esses camundongostransgênicos e transcromossômicos incluem camundongosaqui designados como HuMAb Mouse® e KM Mouse®,respectivamente, e são coletivamente designados11 camundongos com Ig humana".
0 HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) contém minilocais("miniloci")de gene de imunoglobilina humana quecodificam seqüências de imunoglobulina humana nãorearranjadas de cadeia pesada (μ e γ) e leve κ., juntamentecom mutações direcionadas que inativam os locais decadeia μ e κ endógena (vide, por exemplo, Lonberg, et al.(1994) Nature 368(6474):856-859). Conseqüentemente, oscamundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ decamundongo e, em resposta à imunização, os transgeneshumanos introduzidos de cadeia pesada e leve sofremmudança de classe e mutação somática para geraranticorpos monoclonais IgG κ de alta afinidade (Lonberg,N.et al. (1994) , supra; revisado em Lonberg, N. (1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; LonbergN. e Huszar, D. (1995) Intern.Rev.Immunol.13:65-93 eHarding, F. e Lonberg, N.(1995) Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546). A preparação e uso do HuMAb Mouse® bem como asmodificações genômicas carregadas pelos camundongos, sãoainda descritas em Taylor, L.et al.(1992) Nucleic AcidsResearch 20:6287-6295; Chen, JH.et al.(1993)International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724; Choi et al.(1993)Nature Genetics 4:117-123; Chen, J.et al.(1993) EMBOJ.12:821-830; Tuaillon et al.(1994) J.Immunol.152:2912-2920; Taylor, L.et al.(1994) International Immunology6:579-591; e Fisgwild, D.et al.(1996) NatureBiotechnology 14:845-851, cujos conteúdos foram aquiincorporados especificamente por referência em suatotalidade. Vide, ainda, as patentes americanas Nos.5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650;5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429;todos de Lonberg e Kay; patente americana No. 5.54 5.8 07de Surani et al.; Publicação PCT Nos. WO 92/03918,WO93/1222 7, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO99/45962, todos de Lonberg e Kay; e Publicação PCT No. WO01/14424 de Korman et al.
Em outra concretização, os anticorpos humanos da invençãopodem ser produzidos utilizando um camundongo que carregaseqüências de imunoglobulina humana em transgenes etranscromossomos, tal como um camundongo que carrega umtransgene humano de cadeia pesada e um transcromossomohumano de cadeia leve. Tais camundongos, aqui designadoscamundongos "KM mice™" são descritos detalhadamente naPublicação PCT WO 02/43478 de Ishida et al.
Os sistemas animais transgênicos alternativos expressandogenes de imunoglobulina humana estão disponíveis noestado da técnica e podem ser usados para produziranticorpos anti-CD19 da invenção. Por exemplo, um sistematransgênico alternativo designado Xenomouse (Abgenix,Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descritos, porexemplo, nas patentes americanas Nos. 5.939.598;6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 deKucherlapati et al.
Além disso, sistemas animais transcromossômicosalternativos expressando genes de imunoglobulina humanapara produzir anticorpos anti-CD19 da invenção. Porexemplo, camundongos carregando tanto um transcromossomohumano de cadeia pesada como um transcromo humano decadeia leve, designados como "camundongos TC" podem ser usados; tais camundongos são descritos em Tomizuka etal.(2000) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727. Além disso,vacas portando os transcromossomos humanos de cadeia levee pesada foram descritas no estado da técnica (Kuroiwa etal.(2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e podem serusados para produzir anticorpos anti-CD19 da invenção.
Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem tambémser preparados utilizando métodos de exibição de fagopara identificar bancos de genes de imunoglobulinahumana. Tais métodos de exibição de fago para isolaranticorpos humanos são estabelecidos no estado datécnica. Vide, por exemplo, as patentes americanas Nos.5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 de Ladner et al;Patentes americanas Nos. 5.427.908 e 5.580.717 de Doweret al.; Patentes Americanas Nos. 5.9698.108 e 6.172.197de McCafferty et al. ; e patentes americanas Nos.5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.9130,31, 32, 33, 34, 35 e 36.593.081 de Griffiths et al.
Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podemtambém ser preparados utilizando camundongos SCID nosquais as células imunes humanas foram reconstituídas deforma que uma resposta a anticorpo humano possa sergerada quando da imunização. Tais camundongos sãodescritos, por exemplo, nas patentes americanas NOs.5.476.996 e 5.698.767 de Wilson et al.
Imunização de Camundongos com Ig Humana
Quando camundongos com Ig humana são utilizados paraproduzir anticorpos humanos da invenção, tais camundongospodem ser imunizados com uma preparação purificada ouenriquecida de antígeno CD19 e/ou CD19 recombinante, oucélulas expressando CDl9, ou uma proteína de fusão CD19,conforme descrito por Lonberg N.et al.(1994) Nature368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al.(1996) NatureBiotechnology 14:845-851; e publicação PCT WO 98/24884 eWO 01/14424. Preferivelmente, os camundongos terão de 6-16 semanas de vida quando da primeira infusão. Porexemplo, uma preparação purificada ou recombinante (5-50μg) de antígeno CD19 pode ser utilizada para imunizar ocamundongo com Ig humana intraperitonealmente.
Procedimentos detalhados para gerar anticorposmonoclonais totalmente humanos para CDl9 são descritos noExemplo 1 abaixo. A experiência cumulativa com diversosantígenos tem demonstrado que os camundongos transgênicosrespondem quando inicialmente imunizadosintraperitonealmente (IP) com antígeno em adjuvante deFreund completo, seguido de imunizações IP semana sim,semana não, (até um total de 6) com antígeno em adjuvantede Freund incompleto. Porém, adjuvantes outros que não ode Freund também se mostraram eficazes. Além disso,células completas na ausência de adjuvante demonstraramser altamente imunogênicas. A resposta imune pode sermonitorada durante o curso do protocolo de imunização comamostras de plasma sendo obtidas por sangramentosretroorbitais. 0 plasma pode ser identificado através deteste ELISA (conforme descrito abaixo) e camundongos comtítulos suficientes de imunoglobulina humana anti-CD19podem ser usados para as fusões. Os camundongos podemreceber antígeno intravenosamente 3 dias antes dosacrifício e remoção do baço. Espera-se que 2-3 fusõespara cada imunização precisem ser realizadas. Entre 6 e24 camundongos são tipicamente imunizados para cadaantígeno.
Geralmente, são utilizadas tanto as cepas HCo7como HCol2. Além disso, tanto o transgene HCo7 como oHCol2 podem ser produzidos juntos num único camundongoque tenha dois transgenes humanos diferentes de cadeiapesada (HCo7/HCol2). Alternativamente, ou adicionalmente,a cepa do KM Mouse® pode ser usada, conforme descrito noExemplo 1.
Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos MonoclonaisHumanos
Para gerar hibridomas que produzam os anticorposmonoclonais humanos da invenção, esplenócitos e/oucélulas de nódulos linfáticos de camundongos imunizadospodem ser isolados e fundidos a uma linhagem celularimortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular demieIoma de camundongo. Os hibridomas resultantes podemser identificados quanto à produção de anticorposantígeno-específicos. Por exemplo, suspensões celularessimples de linfócitos esplênicos de camundongosimunizados podem ser fundidas a um sexto do número decélulas de mieloma de camundongo não-secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com PEG a 50%. Alternativamente,a suspensão celular simples de linfócitos esplênicos decamundongos imunizados pode ser fundida utilizando ummétodo de eletrofusão baseado em campo elétrico,utilizando um eletroporador para fusão de células emcâmara grande CytoPulse (Cytopulse Sciences, Inc., GlenBurnie Maryland). As células são plaqueadas aaproximadamente 2 χ IO5 em placa de microtitulação defundo plano, seguido de incubação por duas semanas emmeio seletivo contendo soro fetal Clone Serum a 20%,meios condicionados "653" a 18%, 5% origem (IGEN), 4mM L-glutamina, ImM piruvato de sódio, 5mM HEPES, 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/mlestreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina, e IX HAT(Sigma; HAT é adicionado 24 horas após fusão) . Apósaproximadamente duas semanas, as células podem sercultivadas em meio no qual HAT é substituído por HT. Ascavidades individuais podem então ser identificadasatravés de ELISA quanto aos anticorpos monoclonaishumanos IgM e IgG. Ocorrido o crescimento extensivo dohibridoma, o meio pode ser observado geralmente após 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpos podem serreplaqueados, identificados novamente, e se ainda forempositivos para IgG humana, os anticorpos monoclonaispodem ser subclonados pelo menos duas vezes através dediluição limitada. Os subclones estáveis podem então sercultivados in vitro para gerar pequenas quantidades deanticorpo em meio de cultura de tecidos paracaracterização.
Para purificar os anticorpos monoclonais humanos,hibridomas selecionados podem ser crescidos em frascostipo "spinner" de dois litros para purificação deanticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem serfiltrados e concentrados antes da cromatografia porafinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway,N.J.). A IgG eluída pode ser examinada através deeletroforese em gel e cromatografia líquida de altodesempenho para garantir a pureza. A solução tampão podeser trocada por PBS e a concentração pode ser determinadapor OD 280 utilizando coeficiente de extinção de 1,43. Osanticorpos monoclonais podem ser aliquotados earmazenados a -80°C.
Geração de Anticorpos Monoclonais Produtores deTransfectomas
Os anticorpos da invenção podem também ser produzidos numtransfectoma de célula hospedeira utilizando, porexemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante emétodos de transfecção gênica conforme é conhecido noestado da técnica (ex: Morrison, S.(1985) Science229:1202).
Por exemplo, para expressar anticorpos, ou os fragmentosde anticorpos dos mesmos, os DNAs que codificam cadeiasleves e pesadas de extensão parcial ou completa, podemser obtidos através de técnicas padrão de biologiamolecular (ex: amplificação PCR ou clonagem CDNAutilizando um hibridoma que expresse o anticorpo deinteresse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores deexpressão de forma que os genes sejam operativamenteligados às seqüências de controle transcricionais etranslacionais. Neste contexto, o termo "operativamenteligado" pretende significar que um gene de anticorpo éligado num vetor de forma que as seqüências de controletranscricionais e translacionais dentro do vetor realizemsua função pretendida de regular a transcrição etranslação do gene de anticorpo. 0 vetor de expressão eas seqüências de controle de expressão são selecionadaspara serem compatíveis com a célula hospedeira deexpressão usada. 0 gene de cadeia leve do anticorpo e ogene de cadeia pesada do anticorpo pode ser inserido emvetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes sãoinseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes deanticorpo são inseridos no vetor de expressão através demétodos padrão (ex: ligação de sítios de restriçãocomplementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor,ou ligação da extremidade enfraquecida ("blunt-endligation"" se nenhum sítio de restrição estiverpresente). As regiões variáveis de cadeia leve e pesadados anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas paracriar genes de anticorpo de extensão completa de qualquerisótipo de anticorpo inserindo-os em vetores de expressãojá codificando regiões constantes de cadeia pesada e decadeia leve do isótipo desejado, de forma que o segmentoVh seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) Ch dentrodo vetor e o segmento Vk seja operat ivamente ligado aosegmento Cl dentro do vetor. Adicionalmente oualternativamente, o vetor de expressão recombinante podecodificar um peptídeo sinal que facilite a secreção dacadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. 0 gene decadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de formaque o peptídeo sinal seja ligado na estrutura ("in-frame") ao terminal amino do gene de cadeia de anticorpo.
0 peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal deimunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (ou seja,um peptídeo sinal de uma proteína não de imunoglobulina).
Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores deexpressão recombinantes da invenção carregam seqüênciasregulatórias que controlam a expressão dos genes decadeia de anticorpo numa célula hospedeira. 0 termo"seqüência regulatória" pretende incluir promotores,intensificadores e outros elementos de controle deexpressão (ex: sinais de poliadenilação) que controlam atranscrição ou translação dos genes de cadeia deanticorpo. Tais seqüências regulatórias são descritas,por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology.Mewthods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)). Será apreciado pelos habilitados na técnica queo desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção deseqüências regulatórias, podem depender de fatores taiscomo a seleção da célula hospedeira a ser transformada, onível de expressão da proteína desejada, etc. Asseqüências regulatórias preferidas para expressão decélula hospedeira de mamífero incluem os elementos viraisque dirigem altos níveis de expressão de proteína emcélulas de mamífero, tais como os promotores e/ouintensificadores derivados de citomagalovírus (CMV),Vírus Símio (SV40), adenovírus (ex: o promotor tardiomaior do adenovírus (AdMLP)e polioma. Alternativamente,as seqüências regulatórias não-virais podem ser usadas,tal como o promotor de ubiquitina ou promotor de β-globina. Outrossim, os elementos regulatórios compostosde seqüências de fontes diferentes, tal como o sistemapromotor SRa, que contém seqüências do promotor precoceSV40 e o terminal de repetição longa do vírus de leucemiade célula T humana do tipo 1 (Takebe, Y. et al.(1988) MolCell Biol.8:466-472).
Além dos genes de cadeia de anticorpo e das seqüênciasregulatórias, os vetores de expressão recombinante dainvenção podem carregar seqüências adicionais, tais comoseqüências que regulam a replicação do vetor em célulashospedeiras (ex:origens de replicação) e genes marcadoresselecionáveis. 0 gene marcador selecionável facilita aseleção de células hospedeiras nas quais o vetor foiintroduzido (vide, por exemplo, as patentes americanasNos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todos de Axel etal.). Por exemplo, tipicamente o gene marcadorselecionável confere resistência a fármacos, tais comoG418, higromicina ou metotrexato, num célula hospedeirana qual o vetor foi introduzido. Genes marcadoresselecionáveis incluem o gene de dihidrofolato reductase(DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr comseleção/amplificação de metotrexato) e o neo gene (paraseleção de G418).
Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es)de expressão que codificam as cadeias leve e pesada étransfectado numa célula hospedeira através de técnicaspadrão. As diversas formas do termo "transfecção"pretendem abranger uma ampla variedade de técnicascomumente utilizadas para a introdução de DNA exógenodentro de uma célula hospedeira procariótica oueucariótica, como por exemplo, eletroporação,precipitação cálcio-fosfato, transfecção DEAE-dextrano esimilares. Embora seja teoricamente possível expressar osanticorpos da invenção em células hospedeirasprocarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorposem células eucarióticas, e o mais preferivelmente emcélulas hospedeiras de mamífero, é a mais preferida poistais células eucarióticas e, em especial, células demamífero, têm mais probabilidade do que as célulasprocarióticas de montar e secretar um anticorpoadequadamente revelado e imunologicamente ativo. Aexpressão procariótica de genes de anticorpo foireportada como ineficaz para produção de altosrendimentos de anticorpo ativo (Boss, M.A. e Wood,C.R.(1985) Immunology Today 6:12-13).
Células hospedeiras de mamífero preferidas para expressaros anticorpos recombinantes da invenção incluem célulasde Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindocélulas CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin, (1980)Proc. Natl.Acad.Sci. USA 77:16-4220, utilizadas com ummarcador selecionável DHFR, como por exemplo, conformedescrito em R.J.Kaufman e P.A.Sharp (1982)J.Mol.Biol.159:601-621), células de mieloma NSO, célulasCOS e células SP2. Em especial, para uso com células demieloma NSO, outro sistema de expressão preferido é osistema de expressão gênica GS descrito em WO 87/04462(Wilson), WO 89/01036 (a Bebbington) e EP 338.841(Bebbington). Quando os vetores de expressão recombinantecodificando genes de anticorpo são introduzidos emcélulas hospedeiras de mamífero, os anticorpos sãoproduzidos cultivando-se as células hospedeiras por umperíodo de tempo suficiente para permitir expressão doanticorpo nas células hospedeiras ou, maispreferivelmente, secreção do anticorpo no meio de culturano qual as células hospedeiras são crescidas. Osanticorpos podem ser recuperados do meio de culturautilizando-se métodos padrão de purificação de proteína.
Caracterização de Ligação do Anticorpo ao Antígeno
Os anticorpos da invenção podem ser testados quanto àligação a CD19, por exemplo, através de ELISA padrão.
Resumidamente, placas de microtitulação são revestidascom CDl 9 purificado a 0,25^g/ml em PBS, e entãobloqueadas com albumina de soro bovino a 5% em PBS. Asdiluições de anticorpo (ex: diluições de plasma decamundongos CDl9-imunizados) são adicionadas a cadacavidade e incubadas durante 1-2 horas a 3 7°C. As placassão lavadas com PBS/Tween e então incubadas com reagentesecunário (ex: para anticorpos humanos, um reagentepoliclonal Fc-específico IGc anti-humano de cabra)conjugado a fosfatase alcalina durante 1 hora a 3 7°C.
Após lavagem, as placas são desenvolvidas com substratopNPP (1 mg/ml) e analisadas em OD de 405-650.Preferivelmente, os camundongos que desenvolverem astitulações mais altas serão usados nas fusões.Um ensaio ELISA, conforme acima descrito, pode também serusado para identificar hibridomas que mostram reatividadepositiva com imunógeno CDl9. Hibridomas que ligam-se comalta avidez a CDl9 são subclonados e entãocaracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém areatividade das células parentais (através de ELISA) podeser selecionado para preparar um banco de células de 5-10frascos armazenado a -140°C e para purificação deanticorpo.
Para purificar anticorpos anti-CD19, hibridomasselecionados podem ser crescidos em frascos tipo"spinner" de dois litros para purificação de anticorposmonoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados econcentrados antes da cromografia de afinidade comproteína A-sefarose (Pharmacia Piscataway, NJ) . A IgGeluída pode ser verificada através de eletroforese em gele cromatografia líquida de alto desempenho para garantira pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS e aconcentração pode ser determinada por OD 280 utilizandocoeficiente de extinção de 1,43. Os anticorposmonoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.
Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-CD19selecionados ligam-se a epítopos inéditos, cada anticorpopode ser biotinilado utilizando reagentes disponíveis nomercado (Pierce, Rockford, IL). Os estudos de competiçãoutilizando anticorpos monoclonais não marcados eanticorpos monoclonais biotinilados podem ser conduzidosutilizando-se placas ELISA revestidas com CD19 conformeacima descrito. A ligação a mAb biotinilado pode serdetectada com uma sonda de estrepavidina-fosfatasealcalina.
Para determinar o isótipo de anticorpos purificados,ensaios ELISA de isótipo podem ser conduzidos utilizandoreagentes específicos para anticorpos de um isótipoespecífico. Por exemplo, para determinar o isótipo de umanticorpo monoclonal humano, cavidades de placas demicrotitulação podem ser revestidas com lμg/ml deimunoglobulina anti-humana da noite para o dia a 4°C.
Após bloqueio com BSA 1%, as placas são reagidas comou menos de anticorpos monoclonais de teste oucontroles de isotopos purificados, à temperatura ambientepor uma ou duas horas. As cavidades podem então serreagidas com IgGl humana ou sondas de conjugado defosfatase alcalina IgM-específica humana. As placas sãodesenvolvidas e analisadas conforme descrito acima.IgGs anti-CD19 humanas podem ainda ser testadas quanto àreatividade com o antígeno CD19 através do método WesternBlot. Resumidamente, o CD19 pode ser preparado esubmetido à eletroforese em gel de dodecil sulfato desódio-poliacrilamida. Após eletroforese, os antígenosseparados são transferidos para membranas denitrocelulose, bloqueados com soro fetal bovino a 10%, esondadas com os anticorpos monoclonais a serem testados.
A ligação a IgG humana pode ser detectada utilizandofosfatase alcalina de IgG anti-humana e desenvolvida comcomprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem.Cp.,St.Louis, Mo).
Imunoconj ugados
Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza umanticorpo anti-CD19 ou um fragmento do mesmo, conjugado auma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, umfármaco (ex: um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Taisconjugados são aqui designados "imunoconjugados". Osimunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas sãodesignados "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agentecitotóxico inclui qualquer agente que seja nocivo (ex:que mate) às células. Exemplos incluem taxol,citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio,emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo,vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina,daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona,mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrostestosterona,glucocorticóides, procalna, tetracaína, lidocaína,propanolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos.
Agentes terapêuticos também incluem, por exemplo,antimetabólitos (ex: metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina) ,agentes alquilantes, (ex: mecloretamina, tioepaclorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina(CCNU) , ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol,estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiaminaplatina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (ex:daunorubicina (anteriormente denominada daunomicina) edoxorubicina), antibióticos (ex: dactinomicina(anteriormente denominada Actinomicina), bleomicina,mitramicina, e antramicina (AMC) e agentes anti-mitóticos(ex:vincristina e vinblastina).
Outros exemplos preferidos de citotoxinas terapêuticasque podem ser conjugadas a um anticorpo da invençãoincluem duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas eauristatinas, e seus derivados. Um exemplo de conjugadode anticorpo de caliqueamicina está disponível no mercado(Mylotarg®; American Home Products).
As citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos dainvenção utilizando tecnologia de ligante disponível noestado da técnica. Exemplos de tipos de ligante que foramutilizados para conjugar uma citotoxina a um anticorpoincluem, porém não se restringem a hidrazonas, tioéteres,ésteres, dissulfetos, e ligantes contendo peptídeo. Pode-se selecionar um ligante que seja, por exemplo,suscetível à clivagem por pH baixo dentro docompartimento lisossômico ou suscetível à clivagem porproteases, tais como proteases preferencialmenteexpressadas em tecido tumoral tal como catepsinas (ex:catepsinas B, C, D).
Para mais discussão sobre os tipos de citotoxinas,ligantes e métodos para conjugar agentes terapêuticos aanticorpos, vide também Saito, G. et al.(2003) Adv DrugDeliv.Rev. 55:199-215; Trail, P.A.et al.(2003) CâncerImmunol. Immunother. 52:328-337; Payne G.(2003) CâncerCell 3:207-212 ; Allen, T.M. (2002) Nat Rev.Câncer 2:750-763; Pastan, I. e Kreitman, R.J. (2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. eSpringer, C.J-. (2001) Adv.Drug Delivery Rev. 53:247-264.
Os anticorpos da presente invenção podem também serconjugados a um isótopo radioativo para gerarradiofarmacêuticos, também designadosradioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativosque podem ser conjugados a anticorpos para usodiagnóstico ou terapêutico incluem, porém não serestringem a iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. 0método para preparar radioimunoconjugados sãoestabelecidos no estado da técnica. Exemplos deradioimunoconjugados estão disponíveis no mercado,inclusive Zevalin®(IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar®(CorixaPharmaceuticals) e métodos similares podem ser usadospara preparar radioimunoconjugados utilizando osanticorpos da invenção.
Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usadospara modificar uma dada resposta biológica, e a porção defármaco não deve ser interpretada como limitada a agentesterapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção defármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo que possuauma atividade biológica desejada. Tais proteínas podemincluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa,ou um fragmento ativo da mesma, tal como abrina, ricinaA, exotoxina de pseudomonas, ou toxina de difteria; umaproteína tal como fator de necrose tumoral ou interferon-γ; ou modificadores de resposta biológica tais como, porexemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"),interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6("IL-6"), fatorestimulante de colônias de macrófagos e granulócitos("GM-CSF"), fator estimulante de colônia de granulócitos("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.
Técnicas para conjugar tal porção terapêutica aanticorpos são conhecidas, vide, por exemplo, Arnon etal., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugsin Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies and CâncerTherapy, Reisfeld et al.(eds), pp.243-56 (Alan R.Liss,Inc.1985); Hellstrom et al. , "Antibodies for DrugDelivery" in Controlled Drug Delivery (2nd.ed), Robinsonet al.(eds.), pp.623-53 (Mareei Dekker, Inc.1987);Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in CâncerTherapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84:Biological and Clinicai Applications, Pinchera et al(eds), pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, and FutureProspective of the Therapeutic Use of RadiolabeledAntibody in Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies forCâncer Detection and Therapy, Baldwin et al.(eds.)pp.303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al. ,Immunol.Rev. 62:119-58 (1982).
Moléculas Biespecíficas
Em outro aspecto, a presente invenção caracterizamoléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-CDl9, ou um fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpoda invenção, ou porções ligantes ao antígeno do mesmo,pode ser derivatizado ou ligado a outra moléculafuncional, como por exemplo, a outro peptídeo ou proteína(ex: outro anticorpo ou ligante para um receptor) paragerar uma molécula biespecífica que se ligue pelo menos adois sítios de ligação diferentes ou moléculas alvo. Oanticorpo da invenção pode, de fato, ser derivatizado ouligado a mais de uma outra molécula funcional para gerarmoléculas multiespecíficas que se ligam a mais de doissítios de ligação diferentes e/ou moléculas alvo; taismoléculas multiespecíficas também pretendem serabrangidas pelo termo "molécula biespecífica" conformeaqui utilizado. Para criar uma molécula biespecífica dainvenção, um anticorpo da invenção pode serfuncionalmente ligado (ex: por acoplamento químico, fusãogenética, associação não-covalente ou de outra forma) auma ou mais outras moléculas ligantes, tal como outroanticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou miméticade ligação, de forma a resultar numa moléculabiespecífica.
Conseqüentemente, a presente invenção inclui moléculasbiespecíficas compreendendo pelo menos uma primeiraespecificidade de ligação para CD19 e uma segundaespecificidade de ligação para um segundo epítopo alvo.
Numa concretização específica da invenção, o segundoepítopo alvo é um receptor Fc, como por exemplo, FcyRIhumano (CD64) ou um receptor Fca humano (CD89). Portanto,a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes deligar-se a células efetoras expressando tanto FcyR comoFcaR (ex: monócitos, macrófagos ou célulaspolimorfonucleares (PMNs)) e a células alvo expressandoCDl9. Essas moléculas biespecíficas direcionam as célulasexpressando CD19 à célula efetora e disparam atividadesde célula efetora mediada por receptor Fc, tal como afagocitose de células expressando CD19, citotoxicidademediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ,liberação de citocinas, ou geração de ânion superóxido.
Numa concretização da invenção, na qual a moléculabiespecífica é multiespecífica, a molécula pode aindaincluir uma terceira especificidade de ligação, além deuma especificidade de ligação anti-Fc e umaespecificidade de ligação anti-CD19. Numa concretização,a terceira especificidade de ligação é uma porção defator anti-intensificador (EF), como por exemplo, umamolécula que se liga a uma proteína superficial envolvidaem atividade citotóxica e assim aumenta a resposta imunecontra a célula alvo. A "porção de fator anti-intensif icador" pode ser um anticorpo, um fragmento deanticorpo funcional ou um ligante que se liga a uma dadamolécula, como por exemplo, um antígeno ou um receptor, eassim resulta numa intensificação no efeito dosdeterminantes de ligação para o receptor Fc ou para oantígeno de célula alvo. A "porção de fator anti-intensif icador " pode ligar-se a um receptor Fc ou a umantígeno de célula alvo. Alternativamente, a porção defator anti-intensificador pode ligar-se a uma entidadeque seja diferente da entidade à qual a primeira esegunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo,a porção de fator anti-intensificador pode ligar-se a umacélula T citotóxica (ex: via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4,CD4 0, ICAM-I ou outra célula imune que resulte numaresposta imune aumentada contra a célula alvo).
Numa concretização, as moléculas biespecíficas dainvenção compreendem como especificidade de ligação apelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo domesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab")2, Fv,Fd, dAb ou um Fv de cadeia simples. 0 anticorpo podetambém ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada,ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ouum construto de cadeia simples, conforme descrito napatente americana No. 4.946.778 de Ladner et al. cujoconteúdo foi aqui incorporado expressamente porreferência.
Numa concretização, a especificidade de ligação para umreceptor Fcy é provida por um anticorpo monoclonal, cujaligação não é bloqueada pela imunoglobulina G humana(IgG). Conforme aqui utilizado, o termo "receptor de IgG"refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia-γlocalizados no cromossomo 1. Esses genes codificam umtotal de doze isoformas transmembrânicas ou de receptorsolúvel que são agrupadas em três classes de receptorFcy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) e FcyRIII (CD16) . Numaconcretização preferida, o receptor Fcy é um FcyRI humanode alta afinidade.. 0 FcyRI é um molécula de 72 kDa, quemostra alta afinidade pela IgG monomérica (IO8 - IO9 M"1).
A produção e caracterização de certos anticorposmonoclonais anti-Fcy preferidos são descritas naPublicação PCT WO 88/00052 e na patente americana No.4.954.617 de Fanger et al. , cujos ensinamentos são aquitotalmente incorporados por referência. Esses anticorposligam-se a um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII numsítio que é distinto do sitio de ligação Fcy do receptore, assim, sua ligação não é bloqueada substancialmentepor níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRIespecíficos úteis na presente invenção são mAb 22, mAb32,mAB 44, mAb 62 e mAb 197. 0 hibridoma que produz mAb 32está disponível na American Type Culture Collection,registro ATCC No. HB9469. Em outras concretizações, oanticorpo de receptor anti-Fcy é uma forma humanizada deanticorpo monoclonal 22 (H22). A produção ecaracterização do anticorpo H22 é descrita em Graziano,R.F.et al . (1995) J.Immunol 155(10) :4996-5002 e PublicaçãoPCT WO 94/10332 de Tempest et al. A linhagem celularprodutora de anticorpo H22 foi depositada no "AmericanType Culture Collection" sob a designação HA022CL1 e temo número de registro CRL 11177.
Em outras concretizações preferidas ainda, aespecificidade de ligação para um receptor Fc é providapor um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humana,como por exemplo, receptor Fc-alfa (FcaRI(CD89)), cujaligação é preferivelmente não bloqueada porímunoglobulina A humana (IgA). 0 termo "receptor de IgA"pretende incluir o produto gênico de um α-gene (FcaRI)localizado no cromossomo 19. Esse gene é conhecido porcodificar diversas isoformas transmembrânicasalternativamente alinhadas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89)é constitutivamente expressado em monócitos/macrófagos,granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, porém não empopulações de células não-efetoras. O FcaRi possui umaafinidade pelo meio (~5 χ IO7M"1) tanto para IgAl comopara IgA2, que aumenta mediante exposição a citocinastais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al (1996)Criticai Review in Immunology 16: 423-440). Quatroanticorpos monoclonais FcaRI-específicos, identificadoscomo A3, A59, A62 e A77, que ligam-se a FcaRI fora dodomínio de ligação a ligante IgA, foram descritos(Monteiro, R.C. et al.(1992) J.Immunol.148:1764).FcaRI e FcyRI são receptores gatilho (de ativação) parauso nas moléculas biespecíficas da invenção, pois (1) sãoexpressados principalmente em células efetoras imunescomo por exemplo monócitos, PMNs, macrófagos, e célulasdendríticas; (2) são expressados em altos níveis (ex:5.000-100.000 por célula); (3) são mediadores deatividades citotóxicas (ex: ADCC, fagocitose); e (4)mediam a apresentação aumentada de antígenos, incluindoos auto-antígenos, a eles direcionados.
Embora os anticorpos monoclonais humanos sejampreferidos, outros anticorpos que podem ser empregadosnas moléculas biespecíficas da invenção são anticorposmonoclonais murinos, quiméricos e humanizados.
As moléculas biespecíficas da presente invenção podem serpreparadas conjugando-se as especificidades de ligaçãoconstituintes, como por exemplo, as especificidades deligação anti-FcR e anti-CD19, utilizando métodosconhecidos no estado da técnica. Por exemplo, cadaespecificidade de ligação da molécula biespecífica podeser gerada separadamente e então conjugada entre si.
Quando as especificidades de ligação forem proteínas oupeptídeos, uma variedade de agentes acoplantes oureticuladores podem ser usados para conjugação covalente.
Exemplos de agentes reticuladores incluem proteína A,carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA),5,5"-ditiobis(2-ácido nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2 -piridiltio)propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato(sulfo-SMCC)(vide, por exemplo, Karpovsky et al.(1984) J.Exp.Med160:1686; Liu, MA et al.(1985) Proc.Nat1.Acad.Sci.USA82:8648). Outros métodos incluem os descritos em Paulus(1985) Behring Ins.Mitt.No. 78, 118-132; Brennan etal.(1985) Science 229:81-83, e Glennie et al.(1987)J.Immunol. 139:2367-2375). Agentes conjugantes preferidossão SATA e sulfo-SMCC, da Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação foremanticorpos,eles podem ser conjugados via ligação desulfidrila das regiões de dobra de terminal C das duascadeias pesadas. Numa concretização especialmentepreferida, a região de dobra é modificada para conter umnúmero ímpar de resíduos sulfidrila, preferivelmente um,antes da conjugação.
Alternativamente, ambas especificidades de ligação podemser codificadas no mesmo vetor e expressadas e montadasna mesma célula hospedeira. Esse método é especialmenteútil quando a molécula biespecífica for um mAb χ mAb, mAbχ Fab, Fab χ F(ab')2 ou ligante χ proteína de fusão Fab.Uma molécula biespecífica da invenção pode ser umamolécula de cadeia simples compreendendo um anticorpo decadeia simples e um determinante de ligação, ou umamolécula biespecífica de cadeia simples compreendendodois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficaspodem compreender pelo menos duas moléculas de cadeiasimples. Métodos para preparar moléculas biespecíficassão descritos, por exemplo, nas patentes americanas Nos.5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513;5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; e 5.482.858, todas aquiexpressamente incorporadas por referência.
A ligação de moléculas biespecíficas a seus alvosespecíficos pode ser confirmada, por exemplo, através doensaio por enzimas imuno-adsorvidas (ELISA),radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio(ex:inibição de crescimento) ou ensaio Western Blot. Cadaum desses ensaios geralmente detecta a presença decomplexos proteína-anticorpo de interesse específicoempregando um reagente marcado (ex: um anticorpo)específico para o complexo de interesse. Por exemplo, oscomplexos de anticorpo FcR podem ser detectadosutilizando, por exemplo, um anticorpo ligado a enzima ouum fragmento de anticorpo que reconheça e queespecificamente ligue-se aos complexos de anticorpo-FcR.
Alternativamente, os complexos podem ser detectadosutilizando-se qualquer um de uma variedade de outrosimunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode serradioativamente marcado e utilizado num radioimunoensaio(RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principies ofRadioimmunoassays, Seventh Training Course on RadioligandAssay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986,aqui incorporado por referência). 0 isótopo radioativopode ser detectado por meios tal como o uso de contador γou um contador de cintilação ou através deautoradiografia.
Composições Farmacêuticas
Em outro aspecto, a presente invenção provê umacomposição, por exemplo, uma composição farmacêutica,contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais,ou porção(ões) ligantes ao antígeno dos mesmos, dapresente invenção, formulada juntamente com um portadorfarmaceuticamente aceitável. Tais composições podemincluir um ou uma combinação de (ex: dois ou maisdiferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculasbiespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composiçãofarmacêutica da invenção pode compreender uma combinaçãode anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) queligam-se a diferentes epítopos no antígeno alvo ou quetenham atividades complementares.
Composições farmacêuticas da invenção podem também seradministradas em terapia de combinação, ou seja,combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia decombinação pode incluir um anticorpo anti-CD19 dapresente invenção combinado com pelo menos um outroagente antiinflamatõrio ou imunossupressor. Exemplos deagentes terapêuticos que podem ser usados na terapia decombinação são descritos em maiores detalhes abaixo naseção que trata dos usos dos anticorpos da invenção.
Conforme aqui utilizado, "portador farmaceuticamenteaceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios dedispersão, revestimentos, agentes antibacterianos eantifúngicos, agentes isotônicos e agentes retardantes deabsorção, e similares que sejam fisiologicamentecompatíveis. Preferivelmente, o portador é adequado paraadministração intravenosa, intramuscular, subcutânea,parenteral, espinhal ou epidérmica (ex: por injeção ouinfusão). Dependendo da via de administração, o compostoativo, ou seja, o anticorpo, imunoconjugado, ou moléculabiespecífica, pode ser depositado sobre um material paraproteger o composto da ação de ácidos e de outrascondições naturais que possam inativar o composto.
Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir umou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "salfarmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retéma atividade biológica desejada do composto parental e quenão causa nenhum efeito toxicológico indesejado (vide,por exemplo, Berge, S.M.et al (1977) J.Pharm.Sci. 66:1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição deácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácidoincluem os derivados de ácidos inorgânicos atóxicos, taiscomo clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico,bromídríco, iodídrico, fosforoso e similares, bem como deácidos orgânicos atóxicos tais como os ácidos alifáticosmono e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídos comfenila, ácido hidroxi alcanóicos, ácidos aromáticos,ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares.Sais de adição de base incluem os derivados de saismetálicos alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio,magnésio, cálcio, e similares, bem como de aminasorgânicas atóxicas, tais como NiN'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína,colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína esimilares.
Uma composição farmacêutica da invenção pode tambémincluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável.
Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveisincluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais comoácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bisulfato desódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio esimilares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais comopalmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA),hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil gaiato,alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes quelantesmetálicos, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácidofosfórico, e similares.
Exemplos de portadores aquosos e não-aquosos apropriadosque podem ser empregados nas composições farmacêuticas dainvenção incluem água, etanol, polióis (tais comoglicerol, propileno glicol, polietileno glicol, esimilares), e misturas apropriadas dos mesmos, óleosvegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicosinjetáveis, tal como oleato de etila. A fluidezapropriada pode ser mantida, por exemplo, mediante o usode materiais de revestimento, tais como lecitina, pelamanutenção do tamanho de partícula necessário no caso dedispersões, e mediante o uso de surfactantes.
Essas composições podem também conter adjuvantes taiscomo preservativos, agentes umectantes, agentesemulsificantes, e agentes dispersantes. A prevenção dapresença de microorganismos pode ser garantida tantopelos procedimentos de esterilização acima citados comopela inclusão de diversos agentes antibacterianos eantifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenolácido ascórbico, e similares. Pode também ser desejávelincluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloretode sódio, e similares nas composições. Além disso, aabsorção prolongada da forma farmacêutica injetável podeser obtida pela inclusão de agentes que retardam aabsorção, tais como o monoestearato de alumínio e agelatina.
Portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluçõesou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para apreparação extemporânea de soluções ou dispersõesinjetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes parasubstâncias farmaceuticamente ativas é conhecido noestado da técnica. Exceto se qualquer meio ou agenteconvencional for incompatível com o composto ativo, éprevisto o uso dos mesmos nas composições farmacêuticasda invenção. Compostos ativos suplementares podem tambémser incorporados às composições.
As composições terapêuticas devem ser tipicamenteestéreis e estáveis sob as condições de fabricação earmazenamento. A composição pode ser formulada na formade uma solução, microemulsão, lipossoma ou outraestrutura ordenada adequada para alta concentração defármaco. O portador pode ser um solvente ou meio dedispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol(por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietilenoglicol líquido, e similares) e suas misturas apropriadas.
A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo,mediante o uso de um revestimento tal como lecitina, pelamanutenção do tamanho de partícula requerido no caso dedispersão e mediante o uso de surfactantes. Em muitoscasos, será preferível incluir agentes isotônicos, porexemplo, açúcares, poliálcoóis, tais como manitol,sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorçãoprolongada das composições injetáveis pode ser obtidaincluindo-se na composição um agente que retarde aabsorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Soluções estéreis injetáveis podem ser preparadasincorporando-se o composto ativo na quantidade requeridanum solvente apropriado com um ou uma combinação deingrediente enumerados acima, conforme necessário,seguido de microfiltração para esterilização. Geralmente,as dispersões são preparadas incorporando-se o compostoativo num veículo estéril que contenha um meio dedispersão básico e os outros ingredientes necessáriosdaqueles citados acima. No caso de pós estéreis para apreparação de soluções estéreis injetáveis, os métodospreferidos de preparação são secagem a vácuo eliofilização que produzem um pó do ingrediente ativo maisqualquer outro ingrediente desejado de uma soluçãoestéril previamente filtrada do mesmo.
A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinadacom um material portador para produzir uma forma dedosagem única variará dependendo do indivíduo a sertratado, e do modo específico de administração. Aquantidade de ingrediente ativo que pode ser combinadacom um material portador para produzir uma forma dedosagem única será geralmente aquela quantidade dacomposição que produza um efeito terapêutico. Geralmente,de cem por cento, essa quantidade variará de cerca de0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento doingrediente ativo, preferivelmente de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 por cento, o mais pref erivelmente decerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento deingrediente ativo em combinação com um portadorfarmaceuticamente aceitável.
Regimes de dosagem são ajustados para prover a respostaótima desejada (ex: uma resposta terapêutica). Porexemplo, um bolus simples pode ser administrado, diversasdoses divididas podem ser administradas ao longo do tempoou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ouaumentada conforme indicado pelas exigências da situaçãoterapêutica. É especialmente vantajoso formularcomposições parenterais em forma unitária de dosagem parafacilidade de administração e uniformidade de dosagem. Aforma unitária de dosagem, conforme aqui utilizada,refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas comodosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados;cada unidade contém uma quantidade predeterminada decomposto ativo calculada para produzir o efeitoterapêutico desejado em associação com o portadorfarmacêutico requerido. A especificação para as formasunitárias de dosagem da invenção são ditadas por ediretamente dependente(s) (a) das característicasinéditas do composto ativo e o efeito terapêuticoespecífico a ser obtido, e (b) das limitações inerentes àtécnica de se combinar tal composto ativo para otratamento de sensibilidade em indivíduos.
Para administração do anticorpo, a dosagem varia de cercade 0,0001 a 100 mg/kg e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kgdo peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagenspodem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg pesocorporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de pesocorporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixade 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento representativoenvolve a administração uma vez por semana, uma vez acada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez acada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada trêsmeses, ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes dedosagem preferidos para um anticorpo anti-CD19 dainvenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg depeso corporal via administração intravenosa, com oanticorpo sendo administrado utilizando-se um dosseguintes esquemas de dosagem: (i) a cada quatro semanaspara seis dosagens, e então a cada três meses; (ii) acada três semanas; (iii) 3 mg/kg peso corporal uma vezseguido de 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.
Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonaiscom diferentes especificidades de ligação sãoadministrados simultaneamente, e neste caso a dosagem decada anticorpo administrado enquadra-se nas faixasindicadas. 0 anticorpo é geralmente administrado emocasiões múltiplas. Intervalos entre dosagens únicaspodem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cadatrês meses ou anualmente. Os intervalos também podem serirregulares conforme indicado medindo-se os níveissangüíneos de anticorpo em relação ao antígeno alvo nopaciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada paraalcançar uma concentração plasmática de anticorpo decerca de 1-1000 μg/ml e em alguns métodos de cerca de 25-300 μ9/τη1.
Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado comouma formulação de liberação sustentada, onde é necessáriaa administração menos freqüente. A dosagem e a freqüênciavariam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente.
Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida maislonga, seguido dos anticorpos humanizados, anticorposquiméricos, e anticorpos não-humanos. A dosagem efreqüência de administração podem variar dependendo se otratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicaçõesprofiláticas, uma dosagem relativamente baixa éadministrada em intervalos relativamente não freqüentesdurante um longo período de tempo. Alguns pacientescontinuam a receber tratamento pelo resto da vida. Emaplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente altaem intervalos relativamente curtos é às vezes necessáriaaté que a progressão da doença seja reduzida ou extinta,e preferivelmente até que o paciente mostre melhoraparcial ou completa dos sintomas da doença. Em seguida, opaciente pode receber um regime profilático.
Os níveis efetivos de dosagem dos ingredientes ativos nascomposições farmacêuticas da presente invenção podemvariar de forma a se obter uma quantidade do ingredienteativo que seja eficaz para obter a resposta terapêuticadesejada para um paciente, composição e modo deadministração específicos, sem ser tóxica para opaciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de umavariedade de fatores farmacocinéticos incluindo aatividade das composições específicas da presenteinvenção empregadas, ou do éster, sal ou amida dasmesmas, da via de administração, do tempo deadministração, da taxa de excreção do composto específicoque estiver sendo empregado, da duração do tratamento, deoutros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados emcombinação com as composições específicas empregadas, dafaixa etária, do sexo, peso, condição, saúde geral ehistórico médico prévio do paciente em tratamento, efatores similares bastante conhecidos no estado datécnica médica.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpoanti-CD19 da invenção preferivelmente resulta em reduçãona severidade dos sintomas da doença, em um aumento nafreqüência e duração dos períodos livres de sintomas dadoença, ou na prevenção de deficiência ou incapacidadedevido à aflição causada pela doença. Por exemplo, para otratamento de tumores mediados por CD19*, uma "dosagemterapeuticamente eficaz" preferivelmente inibe ocrescimento celular ou o crescimento tumoral em cerca depelo menos 2 0%, mais pref erivelmente em cerca de pelomenos 4 0%, ainda mais pref erivelmente em cerca de pelomenos 60%, e ainda mais preferivelmente em cerca de pelomenos 80% em relação aos indivíduos não tratados. Acapacidade de um composto inibir o crescimento tumoralpode ser avaliada num sistema de modelo animal preditivode eficácia em tumores humanos. Alternativamente, essapropriedade de uma composição pode ser avaliadaexaminando-se a capacidade de o composto inibir ocrescimento celular, tal inibição podendo ser medida invitro através de ensaios conhecidos no estado da técnica.
Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um compostoterapêutico pode reduzir o tamanho do tumor, ou de outraforma melhorar sintomas num indivíduo. Um habilitado natécnica seria capaz de determinar tais quantidades combase em fatores tais como, tamanho do indivíduo,severidade dos sintomas do indivíduo, e a composiçãoespecífica ou via de administração escolhida.
Uma composição da presente invenção pode ser administradaatravés de uma ou mais vias de administração utilizandoum ou mais de uma variedade de métodos conhecidos noestado da técnica. Conforme será apreciado peloshabilitados na técnica, a via e/ou o modo deadministração variarão dependendo dos resultadosdesejados. Vias preferidas de administração paraanticorpos da invenção incluem as vias intravenosa,intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea,espinhal ou outras vias parenterais de administração,como por exemplo, através de injeção ou infusão. Aexpressão "administração parenteral" conforme aquiutilizada significa os modos de administração que não aadministração enteral e tópical, geralmente através deinjeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusãointravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal,intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica,intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular,intraarticular, subcapsular, subaraquinóide,intraespinhal, epidural e intraesternal.
Alternativamente, um anticorpo da invenção pode seradministrado através de uma via não parenteral, tal comoa via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, porexemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal,sublingual ou tópica.
Os compostos ativos podem ser preparados com portadoresque protejam o composto contra liberação rápida, tal comoformulação de liberação controlada, incluindo osimplantes, adesivos transdérmicos, e sistemas deliberação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis ebiocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinilacetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno,poliortoésteres e ácido polilãctico. Muitos métodos paraa preparação de tais formulações são patenteados ougeralmente conhecidos no estado da técnica. Vide, porexemplo, Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems, J.R.Robinson, ed. Mareei Dekker, Inc.New York,1978.
As composições terapêuticas podem ser administradas comdispositivos médicos conhecidos no estado da técnica. Porexemplo, numa concretização preferida, uma composiçãofarmacêutica da invenção pode ser administrada com umdispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tais comoos dispositivos descritos nas patentes americanas Nos.5.3 99.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.O64.413; 4.941 . 880;4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulosbastante conhecidos e úteis na presente invenção incluem:patente americana No. 4.487.603 que descreve uma bomba demicro-infusão implantãvel para dispensar medicação a umataxa controlada; a patente americana No. 4.486.194, quedescreve um dispositivo terapêutico para administrarmedicamentos através da pele; a patente americana No.4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicaçãopara liberar medicação a uma taxa de infusão precisa; apatente americana 4.447.224 que descreve um aparelho deinfusão implantável de fluxo variável para liberaçãocontínua de fármaco; a patente americana No. 4.439.196que descreve um sistema osmótico de liberação de fármacotendo compartimentos de câmaras múltiplas; e a patenteamericana No. 4.475.196, que descreve um sistema osmóticode liberação de fármaco.Essas patentes são aquiincorporadas por referência. Muitos outros dessesimplantes, sistemas de liberação, e módulos sãoconhecidos no estado da técnica.
Em certas concretizações, os anticorpos monoclonaishumanos da invenção podem ser formulados para garantir adistribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreirahemato-encefálica (BBB) exclui muitos compostos altamentehidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticosda invenção atravessem a barreira hemato-encefálica (BBB)(se desejado) eles podem ser formulados, por exemplo, emlipossomas. Para métodos de preparação de lipossomas,vide, por exemplo, as patentes americanas Nos. 4.522.811;5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreenderuma ou mais porções que são seletivamente transportadaspara dentro de células ou órgãos específicos, para assimaumentar a liberação direcionada de fármaco (vide, porexemplo, V.V.Ranade (1989) J.Clin.Pharmacol.29:685) .
Porções direcionadoras representativas incluem o folatoou a biotina (vide, por exemplo, a patente americana No.5.416.016 de Low et al.); manosídeos (Umezawa etal. , (1988) Biochem.Biophys.Res.Commun. 153:1038);anticorpos (P.G.Bloeman et al.(1995) FEBS Lett.357:140;M.Owais et al. (1995) Antimicrob.Agents Chemother.39:180); receptor de proteína A de surfactante (Briscoeet al. (1995) Am.J.Physiol.1233:134) ; pl20 (Schreier etal. (1994) J.Biol.Chem.269:9090) ; vide também K.Keinanen;M.L.Laukkanen (1994) FEBS Lett.346:123; J.J.Killion;I.J.Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Usos e Métodos
Os anticorpos, especialmente os anticorpos humanos, ascomposições de anticorpos e os métodos da presenteinvenção possuem numerosas utilidades terapêuticas ediagnosticas in vitro e in vivo, envolvendo o diagnósticoe o tratamento de distúrbios mediados por CD19. Porexemplo, essas moléculas podem ser administradas acélulas em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduoshumanos, como por exemplo, para tratar, prevenir oudiagnosticar uma variedade de distúrbios.
Conforme aqui utilizado, o termo "indivíduo" pretendeincluir animais humanos e não-humanos. Animais não-humanos incluem todos os vertebrados, como por exemplo,mamíferos e não-mamíferos, tais como os primatas não-humanos, carneiros, cães, vacas, cavalos, frangos,anfíbios, e répteis. Indivíduos preferidos incluempacientes humanos que apresentam distúrbios mediados pelaatividade de CD19. Os métodos são especialmenteapropriados para tratar pacientes humanos que apresentamum distúrbio associado com expressão aberrante de CDl9.
Quando anticorpos contra CD19 são administradosjuntamente com outro agente, os dois podem seradministrados em qualquer ordem ou simultaneamente.
Dada a ligação específica dos anticorpos da invenção aCDl9, os anticorpos da invenção podem ser usados paraespecificamente detectar a expressão de CD19 nasuperfície de células e, além disso, podem ser usadospara purificar CD19 via purificação de imunoafinidade.
Outrossim, dada a expressão de CD19 em diversas célulastumorais, os anticorpos humanos, as composições deanticorpos e os métodos da presente invenção podem serusados para tratar um indivíduo com um distúrbiotumorigênico, como por exemplo, um distúrbiocaracterizado pela presença de células tumoraisexpressando CD19 incluindo, por exemplo, linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemialinfocítica crônica (CLL), linfoma de Burkitt, linfomasanaplásticos de grandes células (ALCL), mieloma múltiplo,linfomas cutâneos de célula T, linfomas nodulares depequenas células clivadas, linfomas Iinfocíticos,linfomas de células T periféricos, linfomas de Lennert,linfomas imunoblásticos, leucemia/linfomas de células T(ATLL), leucemia de células T do adulto (T-ALL),cânceres, linfomas folicularesentroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas difusos degrandes células de linhagem B, linfoma de células Tsimilar à Iinfadenopatia angioimunoblástica (AILD) ,linfomas em cavidade corporal associados ao HIV,carcinomas embrionários, carcinomas indiferenciados darinofaringe (ex: tumor de Schmincke), doença deCastleman, Sarcoma de Kaposi, Mieloma Múltiplo,macroglobulinemia de Waldenstrom, e outros linfomas decélulas B.Adicionalmente, a superexpressão de CD19 pode levar àperda de tolerância à células B e à geração de distúrbiosautoimunes (Tedder et al.(2005) Curr Dir Autoimmun.8:55) .Esse efeito autoimune foi observado pelo acúmulo deCD19+células-B nas articulações inflamadas em pacientescom artrite reumatóide (He et al.(2001) J.Rheumatol28:2168). Como tal, os anticorpos humanos, as composiçõesde anticorpos e os métodos da presente invenção podem serusados para tratar um indivíduo com um distúrbioautoimune, como por exemplo, um distúrbio caracterizadopelo presença de células B expressando CD19 incluindo,por exemplo, artrite reumatóide.
Em uma concretização, os anticorpos (ex: anticorposmonoclonais humanos, moléculas multiespecíficas ebiespecíficas e composições) da invenção podem ser usadospara detectar níveis de CD19 ou níveis de células quecontenham CD19 em sua superfície membrânica, cujos níveispossam então ser ligados a certos sintomas de doenças.
Alternativamente, os anticorpos podem ser usados parainibir ou bloquear a função de CDl9 que, por sua vez,pode estar ligada à prevenção ou melhora nos sintomas decertas doenças, implicando assim CD19 como um mediador dadoença. Isso pode ser obtido contatando-se uma amostra euma amostra de controle com o anticorpo anti-CD19 sobcondições que permitam a formação de um complexo entre oanticorpo e o CD19. Quaisquer complexos formados entre oanticorpo e CD19 são detectados e comparados na amostra eno controle.
Em outra concretização, os anticorpos (ex: anticorposhumanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas ecomposições) da invenção podem ser inicialmente testadosquanto à atividade de ligação associada com o usoterapêutico ou o diagnóstico in vitro. Por exemplo, ascomposições da invenção podem ser testadas utilizando-seos ensaios citométricos de fluxo descritos nos exemplosabaixo.
Os anticorpos (ex: anticorpos humanos, moléculasmultiespecíficas e biespecíficas, imunoconjugados ecomposições)da invenção possuem atividade adicional naterapia e diagnóstico de doenças relacionadas com CDl9.
Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos, asmoléculas multiespecíficas e biespecificas e osimunoconjugados podem ser usados para induzir in vivo ouin vitro uma ou mais das seguintes atividades biológicas:inibir o crescimento de e/ou matar uma célula expressandoCDl 9; mediar a fagocitose ou ADCC de uma célulaexpressando CDl9 na presença de células efetoras humanas,ou bloquear a ligação de ligante CD19 a CD19.
Numa concretização específica, os anticorpos (ex:anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ebiespecíficas e composições) são usados in vivo paratratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doençasrelacionadas com CDl9. Exemplos de doenças relacionadascom CD19 incluem, entre outras, distúrbios autoimunes,artrite reumatóide, câncer, Iinfoma não-Hodgkin, leucemialinfocítica aguda (ALL), linfoma de Burkitt, linfomasanaplásticos de grandes células (ALCL), mieloma múltiplo,linfomas cutâneos de célula T, linfomas nodulares depequenas células clivadas, linfomas Iinfocíticos,linfomas de células T periféricos, linfomas de Lennert,linfomas imunoblásticos, leucemia/linfornas de células T(ATLL), leucemia de células T do adulto (T-ALL), linfomasfoliculares entroblásticos/centrocíticos (cb/cc),linfomas difusos de grandes células de linhagem B,linfoma de células T similar à Iinfadenopatiaangioimunoblástica (AILD), linfomas em cavidade corporalassociados ao HIV, carcinomas embrionários, carcinomasindiferenciados da rinofaringe (ex: tumor de Schmincke) ,doença de Castleman, Sarcoma de Kaposi, Mieloma Múltiplo,macroglobulinemia de Waldenstrom, e outros linfomas decélulas B.
Vias apropriadas para administração das composições deanticorpo (ex: anticorpos monoclonais humanos, moléculasmultiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) dainvenção in vivo e in vitro são bastante conhecidos noestado da técnica e podem ser selecionados pelohabilitado na técnica. Por exemplo, as composições deanticorpos podem ser administradas através de injeção(ex: intravenosa ou subcutânea). Dosagens apropriadas dasmoléculas utilizadas dependerão da faixa etária e do pesodo indivíduo e da concentração e/ou formulação dacomposição de anticorpo.
Conforme previamente descrito, os anticorpos anti-CD19humanos da invenção podem ser co-administrados com um oumais outros agentes terapêuticos, como por exemplo, umagente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agenteimunossupressor. O anticorpo pode ser ligado ao agente(na forma de imunocomplexo) ou pode ser administradoseparadamente do agente. No último caso (administraçãoseparada), o anticorpo pode ser administrado antes, apósou concomitantemente com o agente ou pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, como porexemplo, uma terapia anti-câncer, como por exemplo,radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entreoutros, agentes antineoplásicos tais como doxorubicina(adriamicina), sulfato de bleomicina, cisplatina,carmustina, clorambucil, e ciclofosfamida hidroxiuréiaque, por si só são eficazes apenas a níveis tóxicos ousubtóxicos para o paciente. A cisplatina éintravenosamente administrada como uma dose de 100 mg/mluma vez a cada quatro semanas e a adriamicina éintravenosamente administrada como uma dose de 60-75mg/ml uma vez a cada 21 dias. A co-administração dosanticorpos anti-CD19 humanos, ou os fragmentos ligantesao antígeno dos mesmos, da presente invenção com agentesquimioterápicos provê dois agentes anti-câncer que operamatravés de diferentes mecanismos que produzem um efeitocitotóxico para as células tumorais humanas. Tal co-administração pode resolver problemas devido aodesenvolvimento de resistência a fármacos ou umaalteração na antigenicidade das células tumorais o que astornaria não reativas com o anticorpo.
Células efetoras alvo-específicas, como por exemplo ascélulas efetoras ligadas a composições (ex: anticorposhumanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) dainvenção podem também ser usadas como agentesterapêuticos. Células efetoras alvo-específicas podem serleucócitos humanos tais como macrõfagos, neutrófilos oumonócitos. Outras células incluem eosinófilos, célulasmatadoras naturais, e outras células portando receptorIgG ou IgA. Se desejado, as células efetoras podem serobtidas do indivíduo a ser tratado. As células efetorasalvo-específicas podem ser administradas na forma desuspensão de células numa solução fisiologicamenteaceitável. 0 número de células administradas pode ser naordem de IO8-IO9 mas variará dependendo do fimterapêutico. Em geral, a quantidade será suficiente paraobter localização na célula alvo, como por exemplo, umacélula tumoral expressando CD19, e para efetuar morte decélulas, como por exemplo, fagocitose. As vias deadministração podem também variar.
A terapia com células efetoras alvo-específicas pode serrealizada em conjunto com outras técnicas para remoção decélulas atingidas. Por exemplo, a terapia anti-tumoralutilizando as composições (ex: anticorpos humanos,moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invençãoe/ou as células efetoras armadas com essas composiçõespode ser utilizada juntamente com a quimioterapia.
Adicionalmente, a imunoterapia de combinação pode serusada para direcionar duas populações efetorascitotóxicas distintas para rejeição de célula tumoral.
Por exemplo, os anticorpos anti-CD19 ligados a anti-Fc-gama ou anti-CD3 podem ser usados em conjunto com agentesligantes específicos ao receptor IgG ou IgA.
Moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invençãopodem também ser usadas para modular FcyR ou níveis deFcyR em células efetoras, tal como capeando e eliminandoreceptores da superfície da célula. Misturas dereceptores anti-Fc podem também ser usados para essafinalidade.
As composições (ex: anticorpos humanos, moléculasmultiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) dainvenção que possuem sítios de ligação a complemento,tais como as porções de IgGl, 2 ou 3 ou IgM que ligam-seao complemento, podem também ser usadas na presença decomplemento. Em uma concretização, o tratamento ex vivode uma população de células compreendendo células alvocom um agente ligante da invenção e células efetorasapropriadas pode ser complementado pela adição decomplemento ou soro contendo complemento.
A fagocitose de células alvo revestidas com um agenteligante da invenção pode ser melhorada através de ligaçãode proteínas de complemento. Em outra concretização, ascélulas alvo revestidas com as composições (ex:anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ebiespecíficas) da invenção podem também ser lisadas pelocomplemento. Em outra concretização ainda, as composiçõesda invenção não ativam o complemento.
As composições (ex: anticorpos humanos, moléculasmultiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) dainvenção podem também ser administrados juntamente com ocomplemento. Em certas concretizações, a presentedescrição provê composições compreendendo anticorposhumanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas esoro ou complemento. Essas composições podem servantajosas quando o complemento está localizado emestreita proximidade com os anticorpos humanos, moléculasmuitiespecíficas ou biespecíficas. Alternativamente, osanticorpos humanos, as moléculas muitiespecíficas oubiespecíficas da invenção e o complemento ou soro podemser administrados separadamente.
Estão também no escopo da presente invenção os kitscompreendendo as composições de anticorpo da invenção(ex: anticorpos humanos, moléculas biespecíficas emultiespecíficas, ou imunoconjugados) e as instruções deuso. 0 kit pode ainda conter um ou mais reagentesadicionais, tal como um reagente imunossupressor, umagente citotóxico ou um agente radiotóxico, ou um ou maisanticorpos humanos adicionais da invenção (ex: umanticorpo humano tendo uma atividade complementar que seliga a um epítopo no antígeno CD19 distinto do primeiroanticorpo humano).
Conseqüentemente, os pacientes tratados com ascomposições de anticorpo da invenção podem seradicionalmente administrados (antes de ou simultaneamentecom ou após administração de um anticorpo humano dainvenção) com outro agente terapêutico, tal como umagente citotóxico ou radiotóxico, que intensifica ouaumenta o efeito terapêutico dos anticorpos humanos.
Em outras concretizações, o indivíduo pode seradicionalmente tratado com um agente que modula, como porexemplo, intensifica ou inibe a expressão ou atividade deFcy ou de receptores Fcy como por exemplo tratando oindivíduo com uma citocina. Citocinas preferidas paraadministração durante o tratamento com a moléculamultiespecífica incluem fator estimulante de colônias degranulócitos ("G-CSF"), fator estimulante de colônias degranulócitos-macrófagos ("GM-CSF"), interferon-γ (IFN-γ)e fator de necrose tumoral (TNF).
As composições (ex: anticorpos humanos, moléculasmultiespecíficas e biespecíficas) da invenção podemtambém ser usadas para direcionar células expressando Fcyou CD19, por exemplo, para marcar tais células. Para esseuso, o agente ligante pode ser ligado a uma molécula quepossa ser detectada. Assim, a invenção provê métodos paralocalizar células ex vivo ou in vitro expressandoreceptores Fc, tais como FcyR ou CD19. 0 marcadordetectável pode ser, por exemplo, um radioisótopo, umcomposto fluorescente, uma enzima ou um co-fatorenzimãtico.
Numa concretização específica, a invenção provê métodospara detectar a presença de antígeno CD19 numa amostra,ou medir a quantidade de antígeno CDl9, compreendendocontatar a amostra, e a amostra de controle, com umanticorpo monoclonal humano, ou uma porção ligante aoantígeno do mesmo, que especificamente liga-se a CDl9,sob condições que permitam a formação de um complexoentre o anticorpo e a porção do mesmo e CDl9. A formaçãode um complexo é então detectada, sendo que uma formaçãode complexo diferente entre a amostra comparada com aamostra de controle indica a presença de antígeno CDl9 naamostra.
Em outras concretizações, a invenção provê métodos paratratar um distúrbio mediado por CD19 num indivíduo, porexemplo, um distúrbio autoimune, artrite reumatóide,câncer, linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocítica aguda(ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma deBurkitt, linfomas anaplásticos de grandes células (ALCL),mieIoma múltiplo, linfomas cutâneos de célula T, linfomasnodulares de pequenas células clivadas, linfomasIinfocíticos, linfomas de células T periféricos, linfomasde Lennert, linfomas imunoblásticos, leucemia/linfornas decélulas T (ATLL) , leucemia de células T do adulto (T-ALL), cânceres, linfomas folicularesentroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas difusos degrandes células de linhagem B, linfoma de células Tsimilar à Iinfadenopatia angioimunoblástica (AILD),linfomas em cavidade corporal associados ao HIV,carcinomas embrionários, carcinomas indiferenciados darinofaringe (ex: tumor de Schmincke), doença deCastleman, Sarcoma de Kaposi, Mieloma Múltiplo,macroglobulinemia de Waldenstrom, e outros linfomas decélulas B, administrando-se ao indivíduo os anticorposhumanos descritos acima. Tais anticorpos e seus derivadossão usados para inibir atividades induzidas por CD19associadas com certos distúrbios, como por exemplo,proliferação e diferenciação. Ao se contatar o anticorpocom CDl9 (ex: administrando-se o anticorpo ao indivíduo),a capacidade de o CD19 induzir tais atividades é inibidae, assim, ο distúrbio associado é tratado. A composiçãode anticorpo pode ser administrada isoladamente oujuntamente com outro agente terapêutico, tal como umagente citotóxico ou radiotóxico que atua em conjunto ousinergicamente com a composição de anticorpo para tratarou prevenir a doença mediada por CD19.
Em outra concretização ainda, os imunoconjugados dainvenção podem ser usados para direcionar compostos (ex:agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas,radiotoxinas, imunossupressores, etc.) a células quepossuam receptores de superfície celular de CD19, ligandotais compostos ao anticorpo. Por exemplo, um anticorpoanti-CD19 pode ser conjugado a qualquer um dos compostosde toxina descritos nas patentes americanas Nos.6.281.354, e 6.548.530, publicação de patente americanaNos. 20030050331, 20030064984, 20030073852 e 20040087497ou publicado em WO 03/022806. Assim, a invenção tambémprovê métodos para localizar células ex vivo ou in vivoexpressando CD19 (ex: com um marcador detectável, talcomo um radioisótopo, um composto fluorescente, umaenzima ou um co-fator enzimático). Alternativamente, osimunoconjugados podem ser usados para matar células quetenham receptores de superfície celular de CD19direcionando citotoxinas ou radiotoxinas a CDl9.
EXEMPLOS
Exemplo 1 : Geração de Anticorpos Monoclonais Humanoscontra CDl9
Antígeno
As linhagens de células-B tumorais de Raji (Registro ATCC#CCL-86) e de Daudi (Registro ATCC #CCL-213) foram usadascomo antígeno para imunização.
KM-MOUSE® Camundongo Transcromossômico Transgênico
Anticorpos monoclonais totalmente humanos contra CD19foram preparados utilizando a cepa KM de camundongostranscromossômicos transgênicos, que expressa os genes deanticorpo humano. Nessa cepa de camundongo, o gene decadeia leve kappa de camundongo endógeno foihomo ζ i go t ame ηt e rompido conforme descrito em Chen etal. (1993) EMBO J.12:811-820 e o gene de cadeia pesada decamundongo endógeno foi homozigotamente rompido conformedescrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187 paracamundongos HuMab. 0 camundongo carrega um transgene decadeia leve kappa humano, o KCo5( conforme descrito emFishwild et al.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851. 0camundongo também carrega um transcromossomo de cadeiapesada humano, o SC2 0, conforme descrito na PublicaçãoPCT WO 02/43478.
Imunizações de KM-M0USE®
Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanoscontra CD19, grupos de camundongos KM-M0USE® foramimunizados com linhagem de células-B tumorais de Raji ouDaudi. Esquemas gerais de imunização são descritos emLonberg, N. et al.(1994) Nature 368 (6474): 856-859;Fishwildf D. et al.(1996) Nature Biotechnology 14;845-851e publicação PCT WO 98/24884. Os camundongos tinham de 6-16 semanas de vida quando da primeira infusão de antígeno. Uma preparação de células foi utilizada paraimunizar os camundongos (KM-MOUSE®)intraperitonealmente(IP).
Os camundongos transgênicos foram imunizados duas vezescom antígeno em adjuvante de Freund completo ou adjuvantede Ribi IP, seguido de 3-21 dias IP (até um total de 11imunizações) com o antígeno em adjuvante de Freund ouRibi incompleto. A resposta imune foi monitorada atravésde sangramentos retroorbitais. 0 plasma foi examinadoatravés do teste ELISA (conforme descrito abaixo) e oscamundongos com títulos suficientes de imunoglobulinahumana anti-CD19 foram usados para as fusões. Oscamundongos foram reforçados intravenosamente comantígeno 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço.Seleção de um KM-MOUSE® Produtor de Anticorpos Anti-CD19:
Para selecionar um KM-MOUSE® produtor de anticorpos quese ligam a CDl9, os soros de camundongos imunizados foramtestados através de um teste ELISA modificado conformeoriginalmente descrito por Fishwild, D.et al.(1996),supra. Resumidamente, as placas de microtitulação foramrevestidas com proteína de fusão CD19 recombinantepurificada a 1-2/zg/ml em PBS, 50 μΐ/cavidades incubadas a4 0C da noite para o dia e então bloqueadas com 200μΐ/cavidade de BSA 5% em PBS. As diluições de plasma decamundongos imunizados contra CD19 foram adicionadas acada cavidade e incubadas durante 1-2 horas à temperaturaambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e entãoincubadas com um anticorpo policlonal de cadeia levekappa anti-humano de cabra conjugado com fosfatasealcalina durante 1 hora à temperatura ambiente. Apóslavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato pNPPe analisadas através de espectrofotômetro a OD 415-650.
Os camundongos que desenvolveram os títulos mais elevadosde anticorpos ao anti-CD19 foram usados para as fusões.
As fusões foram realizadas conforme descrito abaixo e ossobrenadantes de hibridoma foram testados quanto àatividade anti-CD19 através de teste ELISA.
Geração de Hibridomas Produtores de AnticorposMonoclonais Humanos contra CD19
Esplenócitos de camundongo, isolados de camundongo KM-M0USE® foram fundidos com PEG numa linhagem celular demieIoma de camundongo utilizando PEG com base emprotocolos padrão ou eletrofusão baseada em campoelétrico utilizando um eletroporador para fusão decélulas em câmara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences,Inc., Glen Burnic, MD). Os hibridomas resultantes foramentão examinados quanto à produção de anticorposantígeno-específicos. Suspensões de células simples delinfócitos esplênicos de camundongos imunizados foramfundidas a um quarto do número de células de mieloma decamundongo não-secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) com 50%PEG (Sigma). As células foram plaqueadas emaproximadamente lxl05/cavidade em placa de microt itulaçãode fundo plano, seguido de cerca de duas semanas deincubação em meio seletivo contendo soro fetal bovino a10%, meio condicionado P388D1 a 10% (ATCC, CRL TIB-63),3-5% origem (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013 com altaglicose, L-glutamina e piruvato de sódio) mais 5 mMHEPES, 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml gentamicina eIx HAT (Sigma, CRL P-7185) . Após 1-2 semanas, as célulasforam cultivadas em meio no qual HAT foi substituído porHT. Cavidades individuais foram então examinadas atravésde teste ELISA (descrito acima) para detectar anticorposIgG monoclonais anti-CD19 humanos. Ocorrido o crescimentoextensivo do hibridoma, o meio foi monitorado geralmenteapós 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpoforam replaqueados, novamente examinados e, se aindapositivos para IgG humana, os anticorpos monoclonaisanti-CD19 foram subclonados pelo menos duas vezes atravésde diluição limitada. Os subclones estáveis foram entãocultivados in vitro para gerar pequenas quantidades deanticorpo em meio de cultura de tecidos paracaracterização posterior.
Os clones de hibridoma 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10,5G7, 13F1 e 46E8 foram selecionados para análiseadicional.
Exemplo 2 : Caracterização Estrutural de AnticorposMonoclonais Humanos 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 3C10, 5G7,13F1 e 46E8
As seqüências de cDNA codificando as regiões variáveis decadeia pesada e leve dos anticorpos monoclonais 21D4 e2lD4a foram obtidas do hibridoma 21D4 utilizando técnicasPCR padrão e foram seqüenciadas utilizando-se as técnicasde seqüenciamento de DNA padrão. Observa-se que ohibridoma 21D4 produz anticorpos contendo uma cadeiapesada que emparelha com uma de duas cadeias leves (SEQID NOs 8 e 9). Ambos anticorpos (ou seja, 21D4 comseqüências Vh e Vl de SEQ ID NOs 1 e 8, respectivamente,e 2 lD4a com seqüências Vh e Vl de SEQ ID NOs: Ie 9,respectivamente) ligam-se a CD19. As seqüências de cDNAcodificando as regiões variáveis de cadeia pesada e levedos anticorpos monoclonais 47G4, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e46Ε8 foram obtidas dos hibridomas 21D4, 21D4a, 47G4,27F3, 3C10, 5G7, 13F1 e 46E8, respectivamente, utilizandotécnicas PCR padrão e foram seqüenciadas utilizandotécnicas padrão de seqüenciamento de DNA.
As seqüências de nucleotídeos e de aminoácido da regiãovariável de cadeia pesada de 21D4 são mostradas na FiguraIA e em SEQ ID NO: 59 e 1, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e de aminoácido da regiãovariável de cadeia leve de 21D4 são mostradas na FiguraIB e em SEQ ID NO: 66 e 68, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 21D4 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrouque a cadeia pesada 21D4 utiliza um segmento Vh de linhagerminal humana Vh 5-51, um segmento D da linha germinalhumana 3-10, e um segmento Jh de linha germinal humana JH4b. O alinhamento da seqüência Vh 21D4 com a seqüência Vh5-51 de linha germinal é mostrado na Figura 8. Outraanálise da seqüência Vh 21D4 utilizando o sistema Kabatde determinação da região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CD3, conformemostrado nas Figuras IA e 8, e nas SEQ ID NOs: 16, 23, e30, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 21D4 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana conhecidasdemonstrou que a cadeia leve 21D4 utiliza um segmento Vlde Vk Ll8 de linha germinal humana e um segmento Jk delinha germinal humana JK 2. 0 alinhamento da seqüência21D4 Vl com a seqüência Vk Ll 8 de linha germinal émostrado na Figura 15. Outra análise da seqüência Vl 21D4utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDRlevou ao delineamento das regiões de cadeia leve CDRl,CDR2 e CD3 conforme mostram as Figuras IB e 15, e nas SEQID NOs: 37, 44 e 51, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 21D4a com as conhecidas seqüências de cadeiapesada de imunoglobulina de linha germinal humanademonstrou que a cadeia pesada 21D4a utiliza um segmentoVh da linha germinal humana Vh 5-51, um segmento D dalinha germinal humana 3-10, e um segmento Jh da linhagerminal humana JH 4b. O alinhamento da seqüência 21D4aVh com a seqüência Vh 5-51 de linha germinal é mostrado naFigura 8. Outra análise da seqüência Vh 21D4a utilizandoo sistema Kabat de determinação de região CDR levou aodelineamento das regiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 eCD3 conforme mostram as Figuras IA e 8, e as SEQ ID NOs:16, 23 e 30, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 2lD4a com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 21D4a utiliza um segmento Vl da linhagerminal humana Vk Ll8 e um segmento Jk da linha germinalhumana JK3. O alinhamento da seqüência Vl 21D4a com aseqüência de linha germinal Vk L18 é mostrado na Figura16. Outra análise da seqüência Vl 21D4a utilizando osistema Kabat de determinação de região CDR levou aodelineamento das regiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CD3conforme mostram as Figuras IC e 16, e as SEQ ID NOs: 37,44 e 52, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia pesada de 47G4 são mostradas na Figura2 e nas SEQ ID NOs: 60 e 2, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia leve de 47G4 são mostradas na Figura2B e SEQ ID NO: 68 e 10, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobilina de cadeiapesada 47G4 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia pesada 47G4 utiliza um segmento Vh da linhagerminal humana Vh 1-69, um segmento D da linha germinalhumana 6-19, e um segmento Jh da linha germinal humana JH5b. 0 alinhamento da seqüência Vh 47G4 com a seqüência Vh1-69 de linha germinal é mostrado na Figura 9. Outraanálise da seqüência Vh 47G4 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CD3 nas Figuras 2Ae 9, e nas SEQ ID NOs: 17, 24 e 31, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 47G4 com as conhecidas seqüências de cadeia levede imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia leve 47G4 utiliza um segmento Vl de linhagerminal humana Vk A2 7 e um segmento JK de linha germinalhumana JK 3. 0 alinhamento da seqüência Vl 47G4 com aseqüência de linha germinal Vk A2 7 é mostrado na Figura17. Outra análise da seqüência Vl 47G4 utilizando osistema Kabat de determinação de região CDR levou aodelineamento das regiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CD3conforme mostram as Figuras 2B e 17, e as SEQ ID NOs: 38,45 e 53, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia pesada de 27F3 são mostradas na Figura3A e nas SEQ ID NOs: 61 e 3, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia leve de 2 7F3 são mostradas na Figura 3e nas SEQ ID NOs: 69 e 11, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 27F3 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia pesada 27F3 utiliza um segmento Vh de linhagerminal humana Vh 5-51, um segmento D da linha germinalhumana 6-19, e um segmento Jh de linha germinal humana JH6b. 0 alinhamento da seqüência Vh 27F3 com a seqüência dalinha germinal Vh 5-51 é mostrado na Figura 10. Outraanálise da seqüência Vh 27F3 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CD3 nas Figuras 3Ae 10, e nas SEQ ID NOs: 18, 25 e 32, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 27F3 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 2 7F3 utiliza um segmento Vl de linha germinalhumana Vk Ll8 e um segmento Jk de linha germinal humanaJK 2. 0 alinhamento da seqüência Vl 2 7F3 com a seqüênciaVk L18 de linha germinal humana é mostrado na Figura 18.
Outra análise da seqüência Vl 27F3 utilizando o sistemaKabat de determinação de região CDR levou ao delineamentodas regiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CD3 conformemostram as Figuras 3B e 18, e as SEQ ID NOs: 39, 46 e 54,respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia pesada de 3C10, são mostradas naFigura 4A e nas SEQ ID NOs: 62 e 4, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia leve de 3C10, são mostradas na Figura4B e nas SEQ ID NOs: 70 e 12, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 3C10 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia pesada 3C10 utiliza um segmento Vh de linhagerminal humana Vh 1-69, um segmento D da linha germinalhumana 1-26, e um segmento Jh de linha germinal humana JH6b. 0 alinhamento da seqüência Vh 3C10 com a seqüência Vh1-69 de linha germinal é mostrado na Figura 11. Outraanálise da seqüência Vh 3C10 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CD3 conformemostram as Figuras 4A e 11, e as SEQ ID NOs: 19, 26 e 33,respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 3C10 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 3C10 utiliza um segmento Vl de linha germinalhumana Vk Ll5 e um segmento JK de linha germinal humanaJK2. O alinhamento da seqüência Vl 3C10 com a seqüênciaVk L15 da linha germinal é mostrado na Figura 19. Outraanálise da seqüência Vl 3C10 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CD3 conforme mostramas Figuras 4B e 19, e as SEQ ID NOs: 40, 47 e 55,respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia pesada de 5G7, são mostradas na Figura5A e nas SEQ ID NOs: 63 e 5, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia leve de 5G7, são mostradas na Figura5B e nas SEQ ID NOs: 71 e 13, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 5G7 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia pesada 5G7 utiliza um segmento Vh de linhagerminal humana Vh 5-51, um segmento D da linha germinalhumana 3-10, e um segmento Jh de linha germinal humana JH6b. 0 alinhamento da seqüência Vh 5G7 com a seqüência Vh5-51 de linha germinal é mostrado na Figura 12. Outraanálise da seqüência Vh 5G7 utilizando o sistema Kabat dedeterminação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CD3 conformemostram as Figuras 5A e 12, e as SEQ ID NOs: 20, 27 e 34,respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 5G7 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 5G7 utiliza um segmento Vl de linha germinalhumana Vl Ll8 e um segmento Jk de linha germinal humanaJKl. 0 alinhamento da seqüência Vl 5G7 com a seqüência VkL18 de linha germinal é mostrado na Figura 20. Outraanálise da seqüência Vl 5G7 utilizando o sistema Kabat dedeterminação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CD3 conforme mostramas Figuras 5B e 20, e as SEQ ID NOs: 41, 48 e 56,respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia pesada de 13F1, são mostradas naFigura 6A e nas SEQ ID NOs: 64 e 6, respectivamente.As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia leve de 13F1, são mostradas na Figura6B e nas SEQ ID NOs: 72 e 14, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 13F1 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia pesada 13F1 utiliza um segmento Vh de linhagerminal humana Vh 5-51, um segmento D da linha germinalhumana 6-19 e um segmento Jh de linha germinal humanaJH6b. 0 alinhamento da seqüência Vh 13F1 com a seqüênciaVh 5-51 da linha germinal é mostrado na Figura 13. Outraanálise da seqüência Vh 13F1 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CD3 conforme mostramas Figuras 6A e 13, e as SEQ ID NOs: 21, 28 e 35,respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 13F1 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 13F1 utiliza um segmento Vl de linha germinalhumana Vk Ll8, e um segmento Jk de linha germinal humanaJK2. 0 alinhamento da seqüência Vl 13F1 com a seqüênciaVk L18 da linha germinal é mostrado na Figura 21. Outraanálise da seqüência Vl 13F1 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CD3 conforme mostramas Figuras 6B e 21, e as SEQ ID NOs: 42, 49 e 57,respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia pesada de 46E8, são mostradas naFigura 7A e nas SEQ ID NOs: 65 e 7, respectivamente.
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido da regiãovariável de cadeia leve de 46E8, são mostradas na Figura7B e nas SEQ ID NOs: 73 e 15, respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeiapesada 46E8 com as conhecidas seqüências de cadeia pesadade imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou quea cadeia pesada 46E8 utiliza um segmento Vh de linhagerminal humana Vh 5-51, um segmento D da linha germinalhumana 6-19 e um segmento Jh de linha germinal humana JH6b. 0 alinhamento da seqüência Vh 46E8 com a seqüência Vh5-51 da linha germinal é mostrado na Figura 14. Outraanálise da seqüência Vh 46E8 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CD3 conformemostram as Figuras 7A e 14, e as SEQ ID NOs: 22, 29 e 36,respectivamente.
A comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeialeve 46E8 com as conhecidas seqüências de cadeia leve deimunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que acadeia leve 46E8 utiliza um segmento Vl de linha germinalhumana Vk L18, e um segmento Jk de linha germinal humanaJK2. 0 alinhamento da seqüência Vl 46E8 com a seqüênciaVk L18 da linha germinal é mostrado na Figura 22. Outraanálise da seqüência Vl 46E8 utilizando o sistema Kabatde determinação de região CDR levou ao delineamento dasregiões de cadeia leve CDRl, CDR2 e CD3 conforme mostramas Figuras 7B e 22, e as SEQ ID NOs: 43, 50 e 58,respectivamente.
Exemplo 3 : Caracterização de Especificidade de Ligação eCinética de Ligação de Anticorpos Monoclonais HumanosAnti-CDl9.
Neste exemplo, a afinidade de ligação dos anticorposanti-CD19 21D4 e 47G4 foi examinada através de análiseELISA.
Especificidade de Ligação através de ELISAPlacas de microtitulação foram revestidas com 50 μΐ deproteína de fusão CD19-Fc purificada de extensão completaem 1,0 Mg/ml em PBS, e então bloqueadas com 150 μΐ dealbumina de soro bovino a 1% em PBS. As placas foramdeixadas incubar de 3 0 minutos a 1 hora e lavadas trêsvezes. As diluições do anticorpo anti-CD19 HuMAb 47G4foram adicionadas a cada cavidade e incubadas durante 1hora a 37°C. Um anticorpo anti-CD19 murino conhecido foiusado como controle positivo. As placas foram lavadas comPBS/Tween e então incubadas com um reagente secundário deIgG Kappa-específico anti-humano de cabra conjugado comhorseradish peroxidase durante 1 hora a 37°C. Apóslavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato ABTS(1,46 mMol/L) e analisadas em OD de 490 nm. Os resultadosconstam da Figura 23. 0 HuMaB CD19 47G4 ligou-seespecificamente ao peptídeo CD19 humano.
Mapeamento de Epítopo de Anticorpos Anti-CD19Citometria de fluxo foi utilizada para determinar oagrupamento de epítopo de HuMAbs anti-CD19. A ligação aoepítopo dos anticorpos monoclonais humanos anti-CD1921D4, 21D4a, 3C10, 5G7, 5G7-N19K, 5G7-N19Q e 13F1 foiavaliada incubando-se células-B tumorais de Raji com 0,3Mg/ml de anticorpo monoclonal humano anti-CD19biotinilado 21D4 ou 21D4a, seguido de lavagem e da adiçãode um anticorpo monoclonal humano anti-CD19 frio. Umanticorpo de controle de isótipo foi usado como controlenegativo. A ligação foi detectada com um Ab IgG anti-humano marcado com FITC. As análises citométricas defluxo foram conduzidas utilizando citometria de fluxoFACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA) . Os resultadossão mostrados na Figura 24. Quando da análise dos dados,os anticorpos anti-CD19 21D4, 21D4a, 3C10, 5G7 e 13F1competem pela mesma região de epítopo.
Exemplo 4 : Ligação de Anticorpos CD19 a uma Linhagem deCélula-B Tumoral
Foi avaliada a ligação de HuMAbs CDl9 através decitometria de fluxo a linhagens de célula-B tumoral deRaji e Daudi, ou a linhagem celular transfectada CHO-CD19. As células de CHO foram transfectadas com umplasmídeo de expressão contendo o cDNA de extensãocompleta codificando a forma transmembrânica de CD19. Aslinhagens celulares de Raji, Daudi, e CD19-CH0 foramincubadas com um dos seguintes HuMAbs CDl9: 21D4, 21D4a,47G4, 5G7, 5G7-N19K, 5G7-N19Q, 3C10 ou 13F1. Um anticorpoanti-CD19 murino conhecido foi usado como controlepositivo. As células foram lavadas e detectadas atravésde um anticorpo secundário anti-camundongo ou anti-humanomarcado com ficoeritrina e analisadas através decitometria de fluxo. Os resultados para ligação àlinhagem celular CH0-CD19, à linhagem de célula-B deDaudi, à linhagem de célula-B de Raji e uma ligaçãoexpandida estabelecida contra a linhagem de célula B deRaji são mostradas nas Figuras 25A, 25B, 25C e 25D,respectivamente. Os anticorpos monoclonais humanos anti-CD19, 21D4 e 47G4, ligaram-se à linhagem celular CHO-CD19. Os anticorpos monoclonais humanos anti-CD19, 21D4,21D4a, 47G4, 5G7, 5G7-N19K, 5G7-N19Q, 3C10 e 13F1ligaram-se à linhagem de célula-B de Raji. Os anticorposHuMAb anti-CDl9 21D4, 21D4a, 3C10, 5G7-N19K, 5G7-N19Q e13F1 tiveram valores EC50 calculados de 0,1413, 0,1293,0,2399, 0,1878, 0,2240, 0,2167 e 0,2659, respectivamente.47H4 também demonstrou ligar-se à linhagem de célula-Btumora1 de Daudi. Todos os resultados são mostrados comomedidos através de intensidade fluorescente geométricamédia (GMFI) de coloração. Esses dados mostram que aproteína CD19 é expressada na superfície das linhagens decélulas tumorais originárias de célula B e que osanticorpos HuMAb anti-CD19 21D4, 21D4a, 47G4, 5G7, 5G7-N19K, 5G7-N19Q, 3C10 e 13F1 ligam-se a CD19 expressado nasuperfície da célula.
Exemplo 5 : Análise de Ligação Scatchard dos AnticorposHumanos Anti-CD19 21D4 e 47G4 a Células-B Tumorais deRaji
Células de Raji foram obtidas de ATCC (Registro #CCL-86)e crescidas em RPMI contendo soro fetal bovino a 10%(FBS). As células foram lavadas duas vezes com RPMIcontendo FBS a 10% a 4°C e as células foram ajustadas em4xl07 células/ml em meios RPMI contendo soro fetal bovinoa 10% (tampão de ligação contendo 24 mM Tris pH 7,2,137mM NaCl, 2, 7mN KCl, 2 mM glicose, 1 mM CaCl2, 1 mMMgCl2, BSA 0,1%). Placas Millipore (MAFB NOB) foramrevestidas com leite em pó desnatado em água a 1% earmazenadas a 4°C da noite para o dia. As placas foramlavadas com tampão de ligação e 25 μΐ de anticorpo nãomarcado (excesso de 1000 vezes) em tampão de ligaçãoforam adicionados para controlar as cavidades numa placade filtro de fibra de vidro de 96 cavidades Millipore(ligação não-específica NSB) . Vinte e cinco microlitrosde tampão isoladamente foram adicionados à cavidade decontrole de ligação máxima (ligação total). Foramadicionados vinte e cinco microlitros de concentraçõesvariadas de anticorpo 125I-anti-CD19 21D4 ou 47G4 e 25 μΐde células de Raji (4 χ IO7 células/ml) em tampão deligação. As placas foram incubadas durante 2 horas a 2 00RPM num agitador a 4°C. No final da incubação, as placasMillipore foram lavadas três vezes com 0,2 ml de tampãode lavagem frio (24 mM Tris pH 7,2, 500 mM NaCl, 2, 7mNKCl, 2 mM glicose, 1 mM CaCl2, ImM MgCl2, 0,1% BSA) . Osfiltros foram removidos e contados num contador gama. Aavaliação da ligação de equilíbrio foi conduzidautilizando-se parâmetros de ligação de sítio único com osoftware Prism (San Diego, CA) . Ao utilizar o ensaio deligação Scatchard acima, o K0 do anticorpo para célulasde Raji foi de aproximadamente 2,14 nM para 21D4 e 12,02nM para 4 7G4.
Exemplo 6 : Internaiização de Anticorpo Monoclonal Anti-CDl9.
HuMAbs Anti-CDl9 foram testados quanto à sua capacidadede internalização em células-B tumorais de Raji oucélulas de CHO humanas transfectadas com CD19 utilizandoum ensaio de internalização Hum-Zap. 0 Hum-Zap testa ainternalização de um anticorpo humano primário através deligação de um anticorpo secundário com afinidade pela IgGhumana conjugada à toxina saporina.
A linhagem celular CH0-CD19 ou a linhagem de célula-Btumoral de Raji foi inoculada a 1,OxlO4 células/cavidadeem cavidades de 100 μΐ da noite para o dia ou no diaseguinte durante um período de duas horas. 0 anticorpoanti-CD19 21D4 ou 47G4 foram adicionados às cavidades auma concentração inicial de 30 nM e titulado em diluiçõesseriais de 1:3. Um anticorpo de controle de isótipohumano que é não-específico para CD19 foi utilizado comocontrole negativo. O Hum-Zap (Advanced Targeting Systems,IT-22-25) foi adicionado a uma concentração de IlnM e asplacas foram deixadas incubar durante 48 horas. As placasforam então pulsadas com 1,0 μΟί de 3H-timidina por 18-24horas, coletadas e lidas num Contador de Cintilação TopCount (Packard Instruments) . Os resultados deinternalização em células tumorais CH0-CD19 e B sãomostrados nas Figuras 26A e 26B, respectivamente. Somenteo HuMAb 47G4 foi testado em células CH0-CD19. 0 anticorpoanti-CD19 47G4 mostrou uma redução dependente deconcentração de anticorpo na incorporação de 3H-timidinaem células CH0-CD19. Tanto os HuMAbs 21D4 como 47G4mostrou uma redução dependente de concentração deanticorpo na incorporação de 3H-timidina em células-Btumorais de Raji. Esses dados demonstram que osanticorpos anti-CD19 21D4 e 47G4 internalizam em célulastransfectantes CH0-CD19 e células B tumorais expressando CDl9.
Exemplo 7 : Avaliação de Morte de Células de um AnticorpoAnti-CDl9 conjugado a Toxina
Neste exemplo, os anticorpos monoclonais anti-CD19conjugados a uma toxina foram testados quanto a suacapacidade de matar linhagens celulares CD19+ num ensaiode incorporação de timidina.
Um anticorpo monoclonal anti-CD19 foi conjugado a umatoxina através de um ligante, tal como um ligante depeptidila, hidrazona ou dissulfeto. A linhagem celular deRaji expressando CD19+ foi inoculada em 2,5xl04células/cavidades durante 3 horas. Um conjugado deanticorpo anti-CD19-toxina foi adicionado às cavidades auma concentração inicial de 3 0 nM e titulado em diluiçõesseriais 1:3. Um anticorpo de controle de isótipo que énão-específico para CD19 foi usado como controlenegativo. 0 excesso de dez vezes do anticorpo frio, 21D4aou um anticorpo de controle de isótipo, é usado paracompetição de ligação. As placas foram deixadas incubardurante 69 horas. As placas foram então pulsadas com 1,0μα de 3H-timidina durante 24 horas, colhidas e lidas numContador de Cintilação Top Count (Packard Instruments,Meriden, CT). Os resultados são mostrados na Figura 27juntamente com os valores EC5 0. Esses dados demonstramque o anticorpo anti-CD19 21D4 mata as células B tumoraisde Raji.
Exemplo 8 : Tratamento de Tumores de célula B in vivoutilizando Anticorpos Anti-CD19
Neste Exemplo, camundongos SCID implantados com tumorescancerosos de célula B foram tratados in vivo comanticorpos anti-CD19 desnudos ou anticorpos anti-CD19conjugados à toxina para examinar o efeito in vivo dosanticorpos sobre o crescimento do tumor.
Os anticorpos anti-CD19 conjugados a toxina forampreparados conforme acima descrito. Diversos camundongosimuno-deficientes combinados que não possuíam linfócitosBeT funcionais foram usados no estudo de malignidadesde célula B. As células da linhagem de célula-B tumoralde Ramos foram injetadas intravenosamente. Os camundongosforam tratados com 19,6 mg/kg de anticorpo anti-CD19conjugado a toxina ou 30 mg/kg de anticorpo anti-CD19desnudo. Um anticorpo de controle de isótipo ou tampão deformulação foi usado como controle negativo. Os animaisforam dosados através de injeção intraperitoneal comaproximadamente 200 μΐ de PBS contendo anticorpo ouveículo. 0 conjugado anticorpo-toxina foi injetado emdose única no dia 7, ao passo que o anticorpo desnudo foiinjetado como modelo profilático em dose única no dia 1ou como um modelo de tratamento nos dias 7, 14 e 21. Oscamundongos foram monitorados diariamente quanto àparalisia em pata traseira por aproximadamente 6 semanas.
Utilizando um calibrador eletrônico, os tumores forammedidos tridimensionalmente (altura χ largura χcomprimento) e o volume do tumor calculado. Oscamundongos foram submetidos à eutanásia ao apresentaremparalisia em pata traseira.
Conforme documentado por análise Kaplan-Meier (Figura28), houve um aumento no tempo médio de sobrevivênciamediante tratamento com anticorpos anti-CD19 conjugados àtoxina, anticorpos anti-CD19 desnudos administradosprofilaticamente ou anticorpos anti-CD19 administradoscomo regime de tratamento. 0 maior aumento no tempo médiode sobrevivência mostrado foi através de tratamentoprofilático utilizando o anticorpo anti-CD19 desnudo.
A alteração no peso corporal foi também medida ecalculada como alteração percentual de peso. Os dados sãomostrados na Figura 29. Durante um período de 3 0 dias,houve uma alteração de aumento líquido no peso corporalcom um anticorpo conjugado à toxina e uma alteração deredução líquida no peso corporal com anticorpo e toxina(não conjugado). Houve uma alteração de aumento líquidono peso corporal com o regime de tratamento utilizando oanticorpo anti-CD19 desnudo profilático ou o anticorpoanti-CD19.
Exemplo 9 : Tratamento de Modelo de Xenoenxerto Tumoralutilizando Anticorpos Anti-CD19 desnudos
Camundongos implantados com um tumor de Iinfoma foramtratados in vivo com anticorpos anti-CD19 desnudos paraexaminar o efeito in vivo dos anticorpos sobre ocrescimento do tumor.
Células ARH-77 (leucemia de linfoblasto B humano;
Registro ATCC No. CRL-1621) e de Raji (linfoma de Burkittde linfócito B humano; Registro ATCC No. CCL-86) foramexpandidas in vitro utilizando procedimentoslaboratoriais padrão. Camundongos CB17.SCID machos(Taconic, Hudson, NY) com 6-8 semanas de vida foramimplantados subcutaneamente no flanco direito com 5 χ IO6ARH-77 ou células de Raji em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1)por camundongo. Os camundongos foram pesados e medidosquanto aos tumores tridimensionalmente utilizando umcalibrador eletrônico duas vezes por semana apósimplantação. Os volumes de tumor foram calculados comopeso χ largura χ comprimento. Os camundongos com tumoresARH-77 tendo em média 80 mm3 ou tumores de Raji tendo emmédia 170 mm3 foram randomizados em grupos de tratamento.
Os camundongos foram dosados intraperitonealmente comveículo PBS, anticorpo de controle de isótipo ou HuMAb 2H5 anti-CD19 desnudo no dia 0. Os camundongos foramsubmetidos à eutanásia quando os tumores atingiram ameta(ponto máximo) (2000 mm3). Os resultados sãomostrados na Figura 30A (tumores ARH-77) e 30B (tumoresde Raji). O anticorpo anti-CD19 21D4 desnudo ampliou otempo médio para atingir o volume de ponto máximo (meta)de tumor (2 000 mm3) e retardou a progressão decrescimento do tumor. Assim, o tratamento com umanticorpo anti-CD19 isoladamente possui um efeitoinibitório in vivo sobre o crescimento do tumor.
Exemplo 10 : Produção de HuMAbs Não-Fucosilados
Os anticorpos com quantidades reduzidas de resíduosfucosila demonstraram aumentar a capacidade de ADCC doanticorpo. Neste exemplo, o HuMAb anti-CD19 21D4 foiproduzido com ausência de resíduos fucosila.
A linhagem celular CHO Ms704-PF, onde falta o genefucosiltransferase, FUT 8 (Biowa, Inc., Princeton, NJ)foi eletroporada com um vetor que expressa as cadeiaspesada e leve do anticorpo 21D4. Os clones resistentes afármaco foram selecionados através de crescimento emmeios CHO Ex-Cell 325-PF (JRH Biosciences, Lenexa, KS)com 6 mM L-glutamina e 500 ^g/ml G418 (Invitrogen,Carlsbad, CA).Os clones foram identificados quanto àexpressão de IgG através de ensaio ELISA padrão.
Caracterização de Oligossacarídeo de MAbs através de CE-LIF
A análise comparativa de oligossacarídeos N-Iigadosderivados de anticorpos anti-CD19 de uma linhagem celularfucosilante CHO e amostras de anticorpo monoclonal anti-CDl9 derivado de Ms704-PF foi realizada através deeletroforese capilar com fluorescência induzida a laser(cLIF) (Chen and Evangelista (1998) Electrophoresis15:1892). Os oligossacarídeos N-Iigados do anticorpopurificado foram liberados das amostras de IgG (100 Mg)através de incubação da noite para o dia das amostras com12,5 raU PMGaseF (Prozyme) a 40° C. Sob as condiçõesutilizadas, os glicanos N-Iigados da porção Fc de HuMAb21D4 expressada em células CHO fucosilantes e não-fucosilantes foram liberados. Após precipitação cometanol para remover a proteína MAb, o sobrenadantecontendo os glicanos foi secado através de centrifugaçãoa vácuo e resuspensos em 19 mM de 8-aminopireno-1,3,6 -trissulfonato (APTS) (Beckman) sob condições de aminaçãoredutiva leve onde a desalilação e perda de resíduosfucose foi minimizada (ácido acético a 15% e IMciaboborohidreto de sódio em THF (Sigma) ) . A reaçãomarcadora de glicano foi deixada prosseguir da noite parao dia a 40°C seguida de diluição de 25 vezes da amostraem água. Os glicanos marcados com APTS foram aplicados aeletroforese capilar com fluorescência induzida a lasernum sistema P/ACE MDQ CE (Beckman) com polaridadereversa, utilizando um capilar revestido com N-CHO comdiâmetro interno de 50 μτα (Beckman) com 50 cm decomprimento efetivo. As amostras foram injetadas apressão (8 seg) e a separação foi realizada a 20°Cutilizando um Tampão Gel de Separação de Carboidratos(Beckman) a 25 kV durante 20 minutos. As separações forammonitoradas utilizando um sistema de detecção defluorescência induzida a laser (Beckman) com um laser deíon argônio de 3 mW e comprimento de onda de excitação de488 nm e emissão de 520 mm. (Ma e Nashabeh (1999)Anal.Chem.71:5185). Diferenças no perfil deoligossacarídeo foram observadas entre o anticorpo obtidoda linhagem celular fucosilante em comparação com alinhagem celular Ms704-PF, consistente com uma ausênciade resíduos fucose nos anticorpos anti-CD19 derivados deMs704 -PF.
Análise de Monossacarídeo através de HPLC com HPAE-PADAmostras de IgG (200 ug) foram submetidas à hidróliseácida utilizando ou TFA 2N (para calcular açúcaresneutros) ou HCl 6N (para calcular amino açúcares) a IOO0Cdurante 4 horas. As amostras foram secadas através decentrifugação a vácuo à temperatura ambiente ereconstituídas em 200 μΐ de água antes da análise atravésde HPAE-PAD (Dionex). Os monossacarídeos foram separadosutilizando uma coluna CarboPac PAIO 4 χ 2 50 mm com pré-coluna Amino Trap e Borate Trap (Dionex) . Osprocedimentos foram seguidos de acordo com a Nota Técnica53 Dionex. A identidade de pico de monossacarídeo e aabundância relativa foram determinadas utilizando padrõesde monossacarídeo (Dionex).
0 anticorpo anti-CD19 21D4 não-fucosilado foi tambémtestado utilizando um kit de ensaio de focalizaçãoisoelétrica capilar padrão (Beckman Coulter). O ensaioretornou valores pi observados de pH 8,45 para 21D4fucosilado, 8,44 e 8,21 para 21D4a fucosilado, e 8,52 e8,30 para os anticorpos 21D4 não-fucosilados.
Exemplo 11: Avaliação de Atividade de ADCC de AnticorpoAnti-CDl9
Neste exemplo, os anticorpos monoclonais anti-CD19fucosilados e não-fucosilados foram testados quanto àcapacidade de matar células CD19+ na presença de célulasefetoras através de citotoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC) num ensaio de citotoxicidade defluorescência.
0 anticorpo monoclonal anti-CD19 humano não-fucosilado21D4 foi preparado conforme descrito acima. As célulasefetoras humanas foram preparadas a partir de sanguetotal como segue. As células mononucleares de sangueperiférico humano foram purificadas de sangue totalheparinizado através de separação com Ficoll-paquepadrão. As células foram resuspensas em meios RPMI1640contendo FBS 10% (meios de cultura) e 200 U/ml de IL-2humana e incubadas da noite para o dia a 3 7°C. No diaseguinte, as células foram coletadas e lavadas uma vez emmeios de cultura e resuspensas a 2 χ IO7 células/ml. Ascélulas alvo CD19+ foram incubadas com reagente BATDA(Perkin Elmer, Wellesley, MA) a 2,5μ1 BATDA por 1 χ IO6células alvo/mL em meios de cultura suplementados com 2,5mM probenecid (meios de ensaio) durante 20 minutos a3 7°C. As células alvo foram lavadas quatro vezes em PBScom 20 mM HEPES e 2,5 ιΛ probenecid, agitadas por rotaçãoe trazidas para um volume final de 1 χ IO5 células/ml emmeios de ensaio.
A linhagem celular de CD19+ ARH-77 (leucemia deIinfoblasto B humano; Registro ATCC No. CRL-1621) foitestada quanto à ADCC específica de anticorpo aoanticorpo monoclonal anti-CD19 humano fucosilado e não-fucosilado 21D4 utilizando a análise de emissão defluorescência Delfia como segue. A linhagem celular alvoARH77 (100 μΐ de células alvo marcadas) foi incubada com50 μΐ de células efetoras e 50 μΐ de anticorpo 21D4 ou21D4 não-fucosilado. Uma meta para a relação de efetor de1:50 foi usada em todos os experimentos. Um controle deisótipo IgGl humano foi usado como controle negativo.
Após rotação de pulso a 2100 rpm e uma hora de incubaçãoa 3 7°C, os sobrenadantes foram coletados, aplicadarotação rápida novamente e 2 0 μΐ de sobrenadante foramtransferidos para uma placa de fundo plano, na qual 180μΐ de solução Eu (Perkin Elmer, Wellesley, MA) foramadicionados e lida num leitor de placa Fusion Alpha TRF(Perkin Elmer) . A % Iise foi calculada como segue:(liberação da amostra - liberação espontânea *100) /(liberação máxima - liberação espontânea), onde aliberação espontânea é a fluorescência das cavidades quecontém somente células alvo e a liberação máxima é afluorescência das cavidades contendo células alvo e foramtratadas com Lysol 3%. A % de Iise específica decitotoxicidade celular para a linhagem celular ARH-77 émostrada na Figura 31. A linhagem celular ARH-77expressando CD19+ mostrou citotoxicidade mediada poranticorpo com o anticorpo anti-CD19 HuMAb 21D4 e umaporcentagem aumentada de Iise específica associada com aforma não-fucosilada do anticorpo anti-CD19 21D4. Essesdados demonstram que os anticorpos anti-CD19 HuMAb não-fucosilados mostram citotoxicidade específica aumentada acélulas expressando CD19+.
Exemplo 12 : Termoestabilidade de Anticorpos MonoclonaisAnti-CDl9 através de Calorimetria DiferencialExploratória
A estabilidade térmica dos anticorpos monoclonais anti-CDl9 foi comparada utilizando análise calorimétrica desuas temperaturas de fusão.
As medições calorimétricas de temperaturas de tusaoforam realizadas numa plataforma de microcalorímetrodiferencial exploratório VP-Capillary DSC combinado comum amostrador automático (MicroCal LLC, Northampton, MA,USA). O volume celular da amostra é de 0,144 ml. Os dadosde desnaturação sobre as formas glicosiladas edesglicosiladas dos anticorpos foram obtidos aquecendo-seas amostras, a uma concentração de 2,3μΜ, de 30 a 95°C auma taxa de l°C/min. As amostras de proteína estavampresentes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) aum pH de 7,4. 0 mesmo tampão foi utilizado na célula dereferência para obter a capacidade térmica molar atravésde comparação. Os termogramas observados foram corrigidospor linha de referência e os dados normalizadosanalisados com base num modelo de 2 estados, utilizando osoftware Origin V7.0. Os dados constam da Tabela 2.
Tabela 2 - Medição de estabilidade térmica de anticorposanti-CD19
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Exemplo 13 - Avaliação de Sítios de Glicosilação
0 anticorpo anti-CD19 HuMAb 5G7 demonstrou ter um padrãode glicosilação N-X-S/T na região variável através deanálise de seqüência. A presença de um sítio de seqüêncialigado a N (N-X-S/T) é necessária porém não suficientepara a adição de carboidrato a MAb. Ou seja, é possívelter uma seqüência N-X-S/T que não adicione um carboidratodevido à ligação de proteína e acessibilidade dosolvente. A confirmação de um sítio de glicosilação naregião variável de 5G7 foi examinada através de LC-MS eanálise Western.
A Cromatografia Liquida-Espectrometria de Massa (LC-MS) éuma ferramenta padrão para determinar a massa de umaproteína, tal como um anticorpo. Antes da análise, osoligossacarídeos N-Iigados dos HuMAbs anti-CD19 5G7 e13F1 foram liberados de amostras de IgG (100 ^g) atravésde incubação da noite para o dia com 12,5 mU PNGaseF(Prozyme) a 40°C. Sob as condições utilizadas, os glicanosN-Iigados da porção Fc dos HuMAbs foram liberados. Para ocIone 5G7, observamos duas massas em alta abundância; umadelas (49.855 Da) correspondia à massa prevista apósdigestão de PNGaseF para remover açúcares na regiãoconstante no sítio N-Iigado conservado (N297) e umasegunda massa (52.093 Da) consistente com a adição decarboidrato num segundo sítio. Descobrimos que osglicanos da região Fab não são removidos pela digestão dePNGaseF; portanto, esses dados corroboram a presença decarboidratos na região variável do clone 5G7. Para ocIone 13 Fl, a massa observada combinava com a massaprevista da seqüência de proteína sem carboidratosligados.
Para confirmar o resultado acima, concluímos um ensaioWestern Blot em fragmentos Fab dos clones 5G7 e 13F1, comum método de coloração carboidrato-específico. Osfragmentos Fab e Fc foram produzidos adicionando-se 1,2 5μ<3 de papai na ativada a 25 ^g de amostras IgG contendo 1mM de cisteína. As amostras foram incubadas a 40°Cdurante 4 horas e as reações interrompidas com 3 0 mMiodoacetamida. As amostras foram analisadas por SDS-PAGETris-Glicina 4-20% seguido de eletroblotting sobremembrana PVDF. A coloração específica de carboidrato do"blot" foi conduzida utilizando-se o Kit de Coloração deGlicoproteína GelCode (Pierce) após protocolo sugeridopelo fabricante. Os resultados detectaram glicosilação deFab no anticorpo 5G7, mas não no anticorpo 13F1. Essesresultados mostraram que o anticorpo 5G7 é glicosilado naregião Fab.
Conforme discutido acima, o anticorpo monoclonal anti-CDl 9 5G7 contém uma região variável com um sítio deglicosilação. Uma vez que os sítios de glicosilação naregião variável podem levar a um aumento naimunogenicidade do anticorpo ou a valores pK alteradosdevido à ligação a antígeno alterada, pode ser vantajosomutar a seqüência de padrão de glicosilação N-X-S/T naregião variável para reduzir a glicosilação. Utilizandotécnicas padrão de biologia molecular, a seqüência doanticorpo 5G7 foi modificada para alterar a seqüência N-I-S iniciando na posição 19 até K-I-S (5G7-N19K) ou Q-I-S(5G7-Nl9Q).
Exemplo 14 : Estabilidade de Anticorpos Monoclonais Anti-CDl9 através de Espectroscopia de Fluorescência
A estabilidade de anticorpos monoclonais anti-CD19 foicomparada medindo-se o ponto médio de desnaturaçãoquímica através de espectroscopia de fluorescência.
As medições de fluorescência de desnaturação químicaforam conduzidas num SPEX Fluorolog 3.22 com um leitor deplacas Micromax (SPEX, Edison, NJ). As medições foramrealizadas em amostras de anticorpo que tinham sidodeixadas durante 24 horas para equilibrar em 16concentrações diferentes de cloridrato de guanidínio emtampão PBS. As medições foram feitas em placas de 384cavidades de baixo volume, pretas de superfície não-ligante (Corning, Acton, MA) e requereram 2 μΜ deanticorpo num volume de cavidade de 12 μΐ. Afluorescência foi excitada a 280 nm e os espectros deemissão foram medidos entre 300 e 400 nm. A velocidade devarredura foi de 1 segundo por nm e as fendas foramajustadas em 5 nm de passagem de banda. Um branco tampãofoi realizado utilizando PBS e automaticamente subtraídodos dados. Os dados constam da Tabela 3.
Tabela 3 - Estabilidade de Fluorescência de anticorposAnt i -CD19
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Exemplo 15 : Tratamento de Tumores de Célula B de Raji invivo utilizando Anticorpos anti-CD19
Neste exemplo, camundongos SCID implantados com tumorescancerosos de célula B são tratados in vivo comanticorpos anti-CD19 desnudos ou anticorpos anti-CD19conjugados a toxina para examinar o efeito in vivo dosanticorpos sobre o crescimento do tumor.
Os anticorpos anti-CD19 conjugados a toxina forampreparados conforme acima descrito. Diversos camundongosimunodeficientes combinados (SCID) sem linfócitos BeTfuncionais foram usados no estudo de malignidades decélula B. As linhagens de células-B tumorais de Rajiforam injetadas subcutaneamente. Os camundongos foramtratados com 3 0 mg/kg de anticorpo ou 0,3 μΓηοΙ/kg deconjugado anticorpo-toxina. Um anticorpo de controle deisótipo ou o tampão de formulação foi usado como controlenegativo. Os animais foram dosados através de injeçãointraperitoneal com aproximadamente 200 μΐ de PBScontendo anticorpo ou veículo. 0 anticorpo foi injetadocomo dose única (SD) no dia 0 ou como dose repetida (RD)nos dias 0, 7 e 14. Os camundongos foram monitoradosdiariamente quanto ao crescimento do tumor utilizando umcalibrador eletrônico; os tumores foram medidostridimensionalmente (altura χ largura χ comprimento/2) eo volume do tumor calculado. Os camundongos foramsubmetidos à eutanásia quando os tumores atingiram a meta(ponto máximo) (2000 mm3) ou quando apresentaram mais de20% de perda de peso. Os resultados constam da Figura 32.
Em cada caso, o anticorpo anti-CD19 exibe volumes menoresde tumor em comparação com os controles negativos, com osanticorpos conjugados a toxina mostrando volumes menoresde tumor do que o tratamento com anticorpo desnudo.
A alteração no peso corporal foi também medida ecalculada como alteração percentual no peso. Osresultados são mostrados na Figura 33. Os resultadosmostraram uma alteração de redução líquida no pesocorporal com os anticorpos conjugados a toxina e aumentolíquido no peso com veículo ou com anticorpos desnudos.
Exemplo 16 : Estudos de Célula B em Macacos Cinomolgos
Neste exemplo, macacos cinomolgos foram injetadosintravenosamente com anticorpo anti-CD19 parental ouanticorpos anti-CD19 não-fucosilados (nf) . As contagensabsolutas de leucócitos e os subconjuntos de leucócitoforam determinados após dosagem e comparados com valorespré-dose.
As amostras de sangue colhidas de macacos cinomolgosforam coradas com anticorpo CD19 parental ou anticorpoanti-CD19 nf e analisadas através de FACS utilizandométodos padrão. As células B de todos os macacosincluídas no estudo tiveram coloração positiva comanticorpos anti-CD19 tanto parentais como nf. Doismacacos e duas macacas foram incluídos em cada grupo. Asamostras de sangue foram colhidas no dia 7 e na pré-dosagem. Uma injeção intravenosa lenta de bolus numa veiasafena foi realizada e os animais dosados com 1 mg/kg deanticorpo anti-CD19 parental ou nf. As amostras desangue foram colhidas 24 horas, 48 horas, 72 horas e nosdias 7, 14, 21 e 2 8 após dosagem. As amostras de sangueforam colhidas para determinação de PK, hematologia ecitometria de fluxo. Em cada ponto de tempo, os seguintesantigenos de superfície celular foram monitorados nosangue: CD2+/CD20+(todos linfócitos), CD20+(linfócitosΒ) , CD3+(Linfócitos Τ) , CD3 + /CD4+(linfócitos T-auxiliares("helper")), CD3+/CD8+(Iinfócitos citotóxicosΤ), CD3-/CD16+ (células NK), CD3-/CD14+ (monócitos).
A Figura 34 mostra a alteração no número de célulaspositivas CD20 quando comparadas com os valores médios dodia 7 e pré-dose. Embora o anticorpo anti-CD19 parentaltenha induzido uma redução de 55% no número de células BCD2 0 positivas após 24 horas, o anticorpo não-fucosiladoproduziu uma inibição mais profunda, baixando ascontagens de célula B em aproximadamente 90%. No grupoanti-CD19 nf, as contagens de célula B permaneceram nestenível nos dias 2, 3 e no dia 7 pós-tratamento enquanto oanticorpo parental parece começar a retornar à linha dereferência. A Figura 35 mostra a % alteração da linha dereferência para células CD20 positivas para cada um dosmacacos individuais. Todos os quatro macacos tratados comanticorpo anti-CD19 nf mostraram uma queda maissignificativa na % de células positivas CD20 quandocomparados com o anticorpo anti-CD19. Juntos esses dadosimplicam que o anticorpo anti-CD19 nf é mais eficaz nadepleção de células B circulantes quando comparado com oanticorpo parental
Exemplo 17 : Estudos Imunoistoquímicos de AnticorposAnti-CDl9
Para avaliar os perfis de ligação a tecido de anti-CD19HuMab, 21D4 conjugado a FITC (21D4-FITC, F:P=4) e 21D4não-fucosilado (nf21D4) (nf21D4-FITC; F:P=3) foramexaminados num painel de tecidos humanos normais (nãoneoplásicos), incluindo o baço, amígdala, intestinodelgado, cerebelo, cérebro, coração, fígado, pulmão e rim(1-2 amostra/cada) bem como neoplasmas de célula B,leucemia linfocítica crônica, linfoma folicular, linfomade zona marginal, linfoma da célula do manto, e linfomadifuso de grandes células B (1-2 amostra/cada). Osanticorpos 21D4 não-fucosilados foram preparados conformeacima descrito. Hu-IgGl conjugado a FITC (Hu-IgGl-FITC)foi usado como anticorpo de controle de isótipo.
Tecidos normais e de Iinfoma congelados e embebidos emOCT foram adquiridos da Cooperative Human Tissue Network(Phi1adelphia, PA) ou National Disease Research Institute(PhiIadeIphia, PA) . Cortes por criostato de 5 μτα foramfixados com acetona durante 10 minutos à temperaturaambiente e armazenados a -80°C até o uso. Aimunocoloração de peroxidase indireta usandoEnVision+System (Dako, Carpinteria, CA) foi conduzidaapós nosso protocolo de rotina. Resumidamente, as lâminasforam lavadas com PBS (Sigma, St. Louis, MO) duas vezes,e então incubadas com bloco de peroxidase fornecido nosistema Dako EnVision+System durante 10 minutos. Apósduas lavagens com PBS, as lâminas foram incubadas combloco de proteína Dako suplementada com gamaglobulinashumanas a 1% e 1 mg/ml de IgG humana termicamenteagregada durante 2 0 minutos para bloquear os sítios deligação não-específica. Posteriormente, os anticorposprimários (21D4-FITC e nf21D4 FITC a 0,4 ou 2 μ9/πι1) ou ocontrole de isótipo (Hu-IgGl-FITC a 0,4 ou 2 μς/πΐ) foramaplicados sobre os cortes e incubados durante 1 hora.
Após três lavagens com PBS, as lâminas foram incubadascom anticorpo anti-FITC de camundongo (20 //g/ml) durante30 minutos. Após outras três lavagens com PBS, as lâminasforam incubadas com o polímero IgG anti-camundongoconjugado a peroxidase fornecido no sistema DakoEnVision+System durante 30 minutos. Finalmente, aslâminas foram lavadas conforme acima citado e reagidascom solução de substrato DAB-cromógeno fornecido nosistema Dako EnVision+System durante 6 minutos. Aslâminas foram então lavadas com água deionizada,contracõradas com hematoxilina Mayer (Dako),desidratadas, clareadas e montadas com Permount (FischerScientific, Fair Lawn, NJ) após procedimento histológicode rotina.
A coloração específica tanto com 21D4-FITC como comnf21D4-FITC foi observada em tecidos linfóides ou ricosem linfóide (baço, amígdala e intestino delgado) etecidos de Iinforna. No baço e amígdala, a coloração forteespecífica foi principalmente distribuída nas regiões decélula B, ou seja, nódulos linfáticos do baço, zona domanto e centro germinal da amígdala. No intestinodelgado, a forte imunoreatividade específica foiprincipalmente localizada na placa de Peyer ou agregadoslinfóides, bem como a coloração de fraca a forte emlinfócitos difusos em lâmina própria da mucosa. Acoloração forte também foi observada em células tumoraisde Iinfoma folicular e linfoma de zona marginal, bem comoa coloração de moderada a forte em leucemia linfocíticacrônica, linfoma difuso de grandes células B e linfoma decélula do manto.
Em tecidos normais do cerebelo, cérebro, coração, fígado,pulmão e rim, nenhuma coloração significativa foiobservada quando corados com 21D4-FITC ou nf21D4-FITCexceto alguma coloração em células linfóides focais ouagregados em tecidos do pulmão e rins.Além disso, essestecidos foram corados em concentrações mais altas de até10 μ9/ιη1. De forma similar, nenhuma coloração específicafoi observada se comparada com o anticorpo de controle deisótipo.
As comparações de 21D4-FITC e nf21D4-FITC exibirampadrões similares de coloração em todos os tecidos. Acoloração específica estava saturada ou próxima dasaturação a 0,4. Porém, a intensidade de coloraçãocom 21D4-FITC é de cerca de 0,5-1 grau mais forte do quea de nf21D4-FITC, o que, em parte, pode ser devido àrelação F:P mais alta de 21D4-FITC (4 vs. 3).
Exemplo 18 : Avaliação de Exterminação de Células de umAnticorpo Anti-CD19
Neste exemplo, os anticorpos monoclonais anti-CD19isoladamente ou conjugados a uma toxina foram testadosquanto à sua capacidade de exterminar linhagens celularesCD19+ num ensaio de incorporação de timidina.Um anticorpo monoclonal anti-CD19 foi conjugado a umatoxina via ligante, tal como um ligante de peptidila,hidrazona ou dissulfeto. As linhagens celulares de Rajiou de SU-DHL-6 expressando CD19+ foram inoculadas emIxlO4 células/cavidade. 0 anticorpo anti-CD19isoladamente ou um conjugado anticorpo anti-CDl9-toxinafoi adicionado às cavidades a uma concentração inicial de30 nM e titulado em diluições seriais 1:3 para 8diluições. Um anticorpo de controle de isótipo que é nãoespecífico para CD19 foi usado como controle negativo. Asplacas foram deixadas incubar durante 69 horas. As placasforam então pulsadas com 0,5/xCi de 3H-timidina durante 24horas, colhidas e lidas num contador de cintilação TopCount (Packard Instruments, Meriden, CT) . Os resultadossão mostrados na Figura 36 juntamente com os valoresEC50. A Figura 36A mostra o anticorpo desnudo sobrecélulas de Raji. A Figura 36B mostra o anticorpo desnudosobre células SU-DHL-6. A Figura 36C mostra o anticorpoanti-CD19 conjugado a toxina sobre células SU-DHL-6.
Esses dados demonstram que o anticorpo anti-CD19 21D4liga-se a e extermina células tumorais B de Raji e possuium nível inesperadamente alto de exterminação celularsobre células SU-DHL-6.
Exemplo 19: Estudos de Depleção de Célula B
Para determinar se os anticorpos anti-CD19 eram capazesde depleção de células B, foi montado um ensaio dedepleção de célula B em sangue total.
Sangue total humano foi adquirido de AllCellsInc. (Berkeley, CA) e entregue no mesmo dia à temperaturaambiente. Dois ml de sangue total foram incubados naausência ou presença de 1-30 mg/ml dos anticorposindicados, ou PBS como o grupo não tratado. A misturasangue-anticorpo foi incubada da noite para o dia a 37°Ccom CO2 a 5%. No dia do experimento, o sangue foi lisadoduas vezes com tampão de Iise RBC à razão de 1:10 atravésde incubação por 10 minutos seguida de centrifugação.
Após a segunda rotação, as pelotas de célula foramlavadas uma vez com tampão FACS (PBS mais cálcio emagnésio com FBS a 2% e versene a 20%) seguido decoloração FACS com anticorpo anti-CD3 (catálogo BectonDickinson # 555332) como os marcadores de célula T eanticorpo anti-CD22 (catálogo Becton Dickinson # 340708)como marcadores de célula B utilizando os protocolos decitometria de fluxo padrão. As células foram incubadas emgelo durante 20 minutos antes das lavagens finais eresuspensas em 5 mg/ml de solução de iodeto de propídio(cat# P4864 da Sigma) em tampão FACS. Os dados foramcoletados através de citometria de fluxo utilizando umsistema FASCalibur e software CellQuest da BectonDickinson, e analisados através do software FlowJoutilizando "gating" do tamanho do linfócito. A alteraçãopercentual foi calculada determinando-se a % de células Bpositivas no grupo não tratado menos a % de células Bpositivas no grupo tratado com anticorpo dividido pela %de células B positivas no grupo não tratado vezes 100. Osresultados constam da Tabela 4. De um doador de sanguesadio, 8,7% das células B permaneceram no sangue apósincubação da noite para o dia (sem anticorpo) . Aincubação do sangue total com 3 0 mg/ml de controlepositivo Rituxan levou a uma depleção de 46% no número decélulas B em comparação ao grupo não tratado e semanticorpo. 0 grupo tratado com anticorpo não-fucosilado(nf) e anticorpo anti-CD19 apresentou um efeitopronunciado sobre a depleção de células B, inibindo ascélulas B em -40%. 0 anticorpo parental teve um efeitomodesto sobre as contagens de células B.
<table>table see original document page 133</column></row><table>]SUMÁRIO DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<table>table see original document page 134</column></row><table>]LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> MEDAREX, INC.
<12O> "ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULADE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULAHOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-CD19,MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE CÉLULAS TUMORAISEXPRESSANDO CDl 9 E MÉTODO PARA DEPLEÇÃO DE CÉLULAS B NUMINDIVÍDUO".
<130> 0428 0/2203058-w00
<140><141>
<150> 60/804,083<151> 2006-06-06
<150> 60/748,956<151> 2005-12-08
<150> 60/692,531<151> 2005-06-20
<160> 87
<170> PatentIn Ver. 3.3
<210> 1<211> 121<212> PRT
<213> Homo sapiens<4OO> 1
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Val Thr Met Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe Trp Gly
100 105 HO
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400 > 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
1 5
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Asp20
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala35 40
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly
50 55
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala
65 70
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
85
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
10 15
Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
45
Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Gln Phe60
Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr75 80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys90 95Ala Arg Glu Ala Val Ala Ala Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 HO
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 3<211> 124<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
jeu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Asp Ser Tyr Tyr Gly Met Gly
100 105 HO
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 4<211> 123<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 4 0 0 > 4Gln Val Gln1
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser5 10 15Val Lys
Ile Asn35
Gly Ile
50Gly Arg
Glu Leu
Arg Ala
Gly Gln115
<210> 5
<211> 121
<212 > PRT
< 213 > Homo
<400> 5Jlu Val1
Ser Leu
Trp Ile
Gly Ile50
Gln Gly65
Leu GlnAla ArgGln Gly
Ser
Thr
Gly
Gln65Met
AlaTrp
Gln
Asn
Gly35Ile
Gln
Trp
Gly
Thr115
Val Ser Cys Lys Ala Ser20 25
Trp Val Arg Gln Ala Pro
40
Ile Pro Ile Phe Gly Ile55
Val Thr Ile Thr Ala Asp70
Ser Ser Leu Arg Ala Glu85
Ser Gly Gly Ser Ala Asp100 105
Gly Thr Ala Val Thr Val
120
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
30
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met45
Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe60
Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Val110
Ser Ser
sapiens
Leu Val Gln Ser Gly5
Ile Ser Cys Lys Gly20
Trp Val Arg Gln Met
40
Tyr Pro Gly Asp Ser55
Val Thr Ile Ser Ala70
Ser Ser Leu Lys Ala85
Val Ser Met Ile Trp100
Thr Val Thr Val Ser
120
Ala Glu Val Lys10
Ser Gly Tyr Ser25
Pro Gly Lys Gly
Asp Thr Arg Tyr60
Asp Lys Ser Ile75
Ser Asp Thr Ala90
Gly Val Ile Met
105
Ser
Lys Pro Gly Glu15
Phe Thr Ser Tyr30
Leu Glu Trp Met45
Ser Pro Ser Phe
Asn Thr Ala Tyr80
Met Tyr Tyr Cys95
Asp Val Trp Gly110<210> 6<211> 124<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Gln Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Gly
100 105 HO
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 7<211> 124<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Gln Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Gly
100 105 HO
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 8<211> 107<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens<4OO> 9
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
1 5
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg20
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
50 55
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val100
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
25 30
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
45
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly60
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro75 80Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe
90 95
Asp Ile Lys105
<210> 10
<211> 108
<212 > PRT
<213 > Homo sapiens
<4 0 0 > 10Glu Ile Val Leu1
Glu Arg Ala Thr20
Tyr Leu Ala Trp35
Ile Tyr Gly Ala50
Gly Ser Gly Ser65
Pro Glu Asp Phe
Phe Thr Phe Gly100
Thr Gln Ser Pro5
Leu Ser Cys Arg
Tyr Gln Gln Lys40
Ser Ser Arg Ala55
Gly Thr Asp Phe70
Ala Val Tyr Tyr85
Pro Gly Thr Lys
Gly Thr Leu Ser10
Ala Ser Gln Ser25
Pro Gly Gln Ala
Thr Gly Ile Pro60
Thr Leu Thr Ile75
Cys Gln Gln Tyr90
Val Asp Ile Lys105
Leu Ser Pro Gly15
Val Ser Ser Ser30
Pro Arg Leu Leu45
Asp Arg Phe Ser
Ser Arg Leu Glu80
Gly Ser Ser Arg95<210 > 11<211> 107<212 > PRT
<213> Homo sapiens<400> 11
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
.<210> 12*211> 107<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 0 0 > 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210> 13<211> 107<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
<210> 14<211> 107<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
1 5
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg20
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210 > 15
<211> 107
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<4 0 0 > 15
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
kLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210 > 16<211> 5<212> PRT
<213> Homo sapiens<4OO > 16
Ser Ser Trp Ile Gly1 5
<210 > 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 0 0 > 17
Ser Tyr Ala Ile Ser1 5
<210 > 18
<211> 5<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 0 0 > 18
Ser Tyr Trp Ile Ala1 5
w<210> 19<211> 5<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<4 0 0 > 19
Ser Tyr Thr Ile Asn1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens<4OO> 20
Ser Tyr Trp Ile Gly1 5
<210> 21<211> 5<212> PRT
<213 > Homo sapiens<4C0> 21
Asn Tyr Trp Ile Ala1 5
<210> 22<211> 5<212 > PRT
<213> Homo sapiens<400> 22
Asn Tyr Trp Ile Ala1 5
r<210> 23<211> 17< 212 > PRT
<213 > Homo sapiens<400> 23
Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
15 10 15
Gly
<210> 24<211> 17<212 > PRT
<213> Homo sapiens<4OO> 24Gly Ile Ile1
Gly
<210> 25<211> 17<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 25
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Gln Phe Gln5 10 15
<210> 26<211> 17< 212 > PRT
<213> Homo sapiens
<4C0> 26
^3ly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe GlnW1 5 10 15
Gly
<210> 27<211> 17<212 > PRT< 213 > Homo
sapiens
<400> 27
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
I- 5 10 15
Gly
<210> 28<211> 17<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp
1 5
Gly
Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln10 15
<210> 29<211> 17<212 > PRT<213> Homo
sapiens
<4C0> 29
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp
1 5
Gly
Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln10 15
<210> 30<211> 12<212> PRT<213> Homo
sapiens
<400> 30
His Val Thr Met Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe15 10
<210> 31
< 21.1 > 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Glu Ala Val Ala Ala Asp Trp Leu Asp Pro15 10
<210> 32<211> 15
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Asp Ser Tyr Tyr Gly Met Gly Val1 5 10 15
<210> 33
<211> 14
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Ala Ser Gly Gly Ser Ala Asp Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Val15 10
<210> 34<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens^:400> 34
Gly Val Ser Met Ile Trp Gly Val Ile Met Asp Val15 10
<210> 35<211> 15<212 > PRT
<213> Homo sapiens<400> 35
Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Gly Valχ5 10 15
<210> 36<211> 15<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 36
Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Gly Val1 5 10 15
<210> 37<211> 11<212 > PRT
<213 > Homo sapiens<400> 37
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala15 10
<210> 38<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens
Í<400> 38
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala15 10
<210 > 3 9<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 39
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala15 10
<210><211><212 >
4011PRT<213> Homo sapiens
<400> 40
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 4 C 0 > 41
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala15 10
<210> 42<211> 11< 21.2 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
kArg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala1 5 10
<210> 43<211> 11< 212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala15 10
<210> 44< 211 > 7<212 > PRT
<213> Homo sapiens<400> 44
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser1 5
<210> 45<211> 7<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5
<210> 46<211> 7<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser1 5
<210> 47
<211> 7
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens<4OO> 48
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser1 5
<210> 49<211> 7<212 > PRT
<213> Homo sapiens<400> 49
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser1 5
<210> 50<211> 7<212 > PRT
<213> Homo sapiens<400> 50
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser1 5
<210> 51<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 51
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr1 5
<210> 52<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe Thr1 5
<210> 53<211> 9<212 > PRT
<213> Homo sapiens<400> 53
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg Phe Thr1 5
<210> 54<211> 9<212 > PRT
<213> Homo sapiens<400> 54
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr1 5
•<210> 55<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 55
Gln Gln Tyr Lys Arg Tyr Pro Tyr Thr1 5
<210> 56
<211> 9
<212 > PRT
<213> Homo sapiens<4OO> 56
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Trp Thr1 5
<210> 57<211> 9<212 > PRT
<213> Homo sapiens<400> 57
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His Thr1 5
<210> 58<211> 9<212> PRT
<213 > Homo sapiens<400> 58
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His Thr1 5
210 > 59<211> 363<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1) . . (363)
<400> 59
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu!5 10 15tct ctg aag ate tcc tgt aag ggt tet gga tac age ttt age age age 96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser
20 25 30
tgg ate ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg ate ate tat cct gat gac tct gat acc aga tac agt ccg tcc ttc 192
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
caa ggc cag gtc acc ate tca gcc gac aag tcc ate agg acc gcc tac 240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag tgg age age ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga cat gtt act atg att tgg gga gtt att att gac ttc tgg ggc 336
Ala Arg His Val Thr Met Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 60
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<22 0 >
<221> CDS
<222 > (1) . . (357)
<4 00> 60
cag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gac tct gga ggc acc ttc age age tat 96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Asp Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
gct ate age tgg gtg cga cag gcc cct gga caa gga ctt gag tgg atg 144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga ggg ate ate cct ate ttt ggt aca aca aac tac gea cag cag ttc 192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Gln Phe50 55 60
^^ cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc acg age aca gcc tac 240Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
atg gag ctg age agt ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga gaa gea gta gct gcg gac tgg tta gac ccc tgg ggc cag gga 33 6Ala Arg Glu Ala Val Ala Ala Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
®<210> 61<211> 372<212 > DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222 > (1) . . (372)
<400> 61
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gea gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu15 10 15tct ctg aag ate tcc tgt aag ggt tet gga tac age ttt acc age tac 96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
tgg ate gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg ate ate tat cct ggt gac tct gat acc aga tac age ccg tcc ttc 192
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
^^ caa ggc cag gtc acc ate tca gcc gac aag tcc ate age acc gcc tac 240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag tgg age age ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga cag ggg tat age agt ggc tgg gac tcc tac tac ggt atg ggc 336
Ala Arg Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Asp Ser Tyr Tyr Gly Met Gly
100 105 HO
gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 372
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120
^^<210> 62<211> 369<212 > DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1) . . (369)
<400> 62
cag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc age age tat 96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
act ate aac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga ggg ate att cct ate ttt ggt ata cct aac tac gea cag aag ttc 192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
cag ggt aga gtt acg att acc gcg gac gaa tcc acg aac aca gcc tac 240Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80
atg gag ctg age age ctg aga gct gag gac acg gcc gtt tat tac tgt 288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga gcc agt ggt ggg age gcg gac tat tcc tac ggt atg gac gtc 33 6Ala Arg Ala Ser Gly Gly Ser Ala Asp Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Val
100 105 HO
tgg ggc caa ggg acc gcg gtc acc gtc tcc tca 369
Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser115 120
r<210> 63<211> 363<212> DNA<213> Homo sapiens
<22 0 >
<221> CDS
<222 > (1) . . (363)
<400> 63
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gea gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15tct ctg aac ate tcc tgt aag ggt tet gga tac age ttt acc age tac 96Ser Leu Asn Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
tgg ate ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg ate ate tat cct ggt gac tct gat acc aga tac age ccg tcc ttc 192Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
caa ggc cag gtc acc ate tca gcc gac aag tcc ate aac acc gcc tac 240Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80
ctg cag tgg age age ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga ggg gtt tct atg att tgg gga gtt att atg gac gtc tgg ggc 33 6Ala Arg Gly Val Ser Met Ile Trp Gly Val Ile Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 363
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 64<211> 372<212 > DNA<213> Homo sapiens
<22 0 >
<221> CDS
<222 > (1) . . (372)
<4 0 0 > 64
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gea gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu15 10 15tct ctg cag ate tcc tgt aag ggt tet gga tac acc ttt acc aac tac 96Ser Leu Gln Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
tgg ate gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg ate ate tat cct ggt gac tct gat acc aga tac age ccg tcc ttc 192Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
caa ggc cag gtc acc ate tca gcc gac aag tcc ate age acc gcc tac 240Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
cta cag tgg age ggc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga cag gga tat age agt ggc tgg cgc tcc tac tac ggt atg ggc 336Ala Arg Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Gly
100 105 HO
gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 372
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120
<210 > 65<211> 372<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1) . . (372)
<400> 65
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gea gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu15 10 15tct ctg cag ate tcc tgt aag ggt tet gga tac acc ttt acc aac tac 96
Ser Leu Gln Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
tgg ate gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
ggg ate ate tat cct ggt gac tct gat acc aga tac age ccg tcc ttc 192
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
caa ggc cag gtc acc ate tca gcc gac aag tcc ate age acc gcc tac 240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
cta cag tgg age ggc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga cag gga tat age agt ggc tgg cgc tcc tac tac ggt atg ggc 336
Ala Arg Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Gly
100 105 110
gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 372
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 321
<212 > DNA
<213> Homo sapiens
<22 0 >
<221> CDS
<222 > (1) . . (321)
<400> 66
gcc ate cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gea tct gta gga 48Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15gac aga gtc acc ate actAsp Arg Val Thr Ile Thr20
tta gcc tgg tat cag cagLeu Ala Trp Tyr Gln Gln35
tat gat gcc tcc agt ttgTyr Asp Ala Ser Ser Leu50
agt gga tet ggg aca gatSer Gly Ser Gly Thr Asp65 70
gaa gat ttt gea act tatGlu Asp Phe Ala Thr Tyr
85
act ttt ggc cag ggg accThr Phe Gly Gln Gly Thr100
tgc cgg gea agt cag ggcCys Arg Ala Ser Gln Gly25
aaa cca ggg aaa gct cctLys Pro Gly Lys Ala Pro40
gaa agt ggg gtc cca tcaGlu Ser Gly Val Pro Ser55 60ttc act ctc acc ate agePhe Thr Leu Thr Ile Ser
75
tac tgt caa cag ttt aatTyr Cys Gln Gln Phe Asn90
aag ctg gag ate aaaLys Leu Glu Ile Lys105
att age agt gct 96Ile Ser Ser Ala30
aag ctc ctg ate 144Lys Leu Leu Ile45
agg ttc age ggc 192Arg Phe Ser Gly
age ctg cag cct 240Ser Leu Gln Pro80
agt tac ccg tac 288Ser Tyr Pro Tyr95
321
<210> 67<211> 321|<212> DNA<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222 > (1) . . (321)
<400> 67
gcc ate cag ttg acc cag tet cca tccAla Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
1 5
gac aga gtc acc ate act tgc cgg geaAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala20 25
tcc ctg tet gea tet gta gga 48Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
agt cag ggc att age agt gct 96Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
30tta gcc tgg tat cagLeu Ala Trp Tyr Gln35
tat gat gcc tcc agtTyr Asp Ala Ser Ser50
agt gga tct ggg acaSer Gly Ser Gly Thr65
gaa gat ttt gca actGlu Asp Phe Ala Thr
85
act ttc ggc cct gggThr Phe Gly Pro Gly100
cag aaa cca ggg aaa gctGln Lys Pro Gly Lys Ala40
ttg gaa agt ggg gtc ccaLeu Glu Ser Gly Val Pro55
gat ttc act ctc acc ateAsp Phe Thr Leu Thr Ile70 75
tat tac tgt caa cag tttTyr Tyr Cys Gln Gln Phe
90
acc aaa gtg gat ate aaaThr Lys Val Asp Ile Lys105
cct aag ctc ctg ate 144Pro Lys Leu Leu Ile45
tca agg ttc age ggc 192Ser Arg Phe Ser Gly60
age age ctg cag cct 240Ser Ser Leu Gln Pro
80
aat agt tac cca ttc 288Asn Ser Tyr Pro Phe95
321
<210> 68
<211> 324
<212 > DNA
<213> Homo sapiens
^<221> CDS
<222> (1)..(324)
<400> 68
gaa att gtg ttg acg cagGlu Ile Val Leu Thr Gln
1 5
gaa aga gcc acc ctc tccGlu Arg Ala Thr Leu Ser20
tac tta gcc tgg tac cagTyr Leu Ala Trp Tyr Gln35
tct cca ggc acc ctgSer Pro Gly Thr Leu10
tgc agg gcc agt cagCys Arg Ala Ser Gln25
cag aaa cct ggc cagGln Lys Pro Gly Gln40
tct ttg tct cca ggg 48Ser Leu Ser Pro Gly15
agt gtt age age age 96Ser Val Ser Ser Ser30
gct ccc agg ctc ctc 144Ala Pro Arg Leu Leu45ate tat ggt gea tcc age agg gcc act ggc ate cca gac agg ttc agt 192Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt ggg tet ggg aca gac ttc act ctc acc ate age aga ctg gag 240Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80
cct gaa gat ttt gea gtg tat tac tgt cag cag tat ggt age tca cga 288Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg
85 90 95
ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat ate aaa 324
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105
<210> 69
<211> 321
<212 > DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1) . . (321)
<400> 69
gcc ate cag ttg acc cag tet ccaAla Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
1 5
gac aga gtc acc ate act tgc cggAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg20
tta gcc tgg tat cag cag aaa ccaLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40
tat gat gcc tcc agt ttg gaa agtTyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser50 55
tcc tcc ctg tet gea tet gta gga 48Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
gea agt cag ggc att age agt gct 96Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
25 30
ggg aaa gct cct aag ctc ctg ate 144Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
45
ggg gtc cca tca agg ttc age ggc 192Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly60agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc ate age age ctg cag cct 240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
gaa gat ttt gea act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg tac 288Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag ate aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210> 70<211> 321<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222 > (1) . . (321)
<400> 70
gac ate cag atg acc cag^^Asp Ile Gln Met Thr Gln~ 1 5
gac aga gtc acc ate actAsp Arg Val Thr Ile Thr20
tta gcc tgg tat cag cagLeu Ala Trp Tyr Gln Gln35
tat gct gea tcc agt ttgTyr Ala Ala Ser Ser Leu50
agt gga tct ggg aca gatSer Gly Ser Gly Thr Asp65 70
tct cca tcc tca ctgSer Pro Ser Ser Leu10
tgt cgg gcg agt cagCys Arg Ala Ser Gln25
aaa cca gag aaa gccLys Pro Glu Lys Ala40
caa agt ggg gtc ccaGln Ser Gly Val Pro55
ttc act ctc acc atePhe Thr Leu Thr Ile
75
tct gea tct gta gga 48Ser Ala Ser Val Gly15
ggt att age age tgg 96Gly Ile Ser Ser Trp30
cct aag tcc ctg ate 144Pro Lys Ser Leu Ile45
tca agg ttc age ggc 192Ser Arg Phe Ser Gly60
age age ctg cag cct 240Ser Ser Leu Gln Pro
80gaa gat ttt gca act tac tac tgc caa cag tat aag aga tac ccg tac 288Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag ate aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210 > 71
<211> 321
<212 > DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222 > (1) . . (321)
<4 0 0 > 71
gcc ate cag ttg acc cagAla Ile Gln Leu Thr Gln
1 5
gac aga gtc acc ate act^^Asp Arg Val Thr Ile Thr^^ 20
tta gcc tgg tat cag cagLeu Ala Trp Tyr Gln Gln35
tat gat gcc tcc agt ttgTyr Asp Ala Ser Ser Leu50
agt gga tet ggg aca gatSer Gly Ser Gly Thr Asp65 70
gaa gat ttt gca act tatGlu Asp Phe Ala Thr Tyr
85
tet cca tcc tcc ctgSer Pro Ser Ser Leu10
tgc cgg gca agt cagCys Arg Ala Ser Gln25
aaa cca ggg aaa gctLys Pro Gly Lys Ala40
gaa agt ggg gtc ccaGlu Ser Gly Val Pro55
ttc act ctc acc atePhe Thr Leu Thr Ile
75
tac tgt caa cag tttTyr Cys Gln Gln Phe90
tet gca tet gta gga 48Ser Ala Ser Val Gly15
ggc att age agt gct 96Gly Ile Ser Ser Ala30
cct aag ctc ctg ate 144Pro Lys Leu Leu Ile45
tca agg ttc age ggc 192Ser Arg Phe Ser Gly60
age age ctg cag cct 240Ser Ser Leu Gln Pro
80
aat agt tac ccg tgg 288Asn Ser Tyr Pro Trp95acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
<210> 72
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222 > (1) . . (321)
<400> 72
gcc ate cag ttg acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gea tet gta gga 48
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
gac aga gtc acc ate act tgc cgg gea agt cag ggc att age agt gct 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gct cct aag ctc ctg ate 144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc age ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tet ggg aca gat ttc act ctc acc ate age age ctg cag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gea act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac cct cac 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His
85 90 95
act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag ate aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105<210> 73<211> 321<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222 > (1) . . (321)
<400> 73
gcc ate cag ttg accAla Ile Gln Leu Thr1 5
gac aga gtc acc ateAsp Arg Val Thr Ile20
tta gcc tgg tat cagLeu Ala Trp Tyr Gln35
tat gat gcc tcc agtTyr Asp Ala Ser Ser50
agt gga tet ggg acaSer Gly Ser Gly Thr65
gaa gat ttt gea actGlu Asp Phe Ala Thr
85
act ttt ggc cag gggThr Phe Gly Gln Gly100
<210> 74<211> 98<212> PRT
<213> Homo sapiens
cag tet cca tcc tccGln Ser Pro Ser Ser
10
act tgc cgg gea agtThr Cys Arg Ala Ser25
cag aaa cca ggg aaaGln Lys Pro Gly Lys40
ttg gaa agt ggg gtcLeu Glu Ser Gly Val55
gat ttc act ctc accAsp Phe Thr Leu Thr70
tat tac tgt caa cagTyr Tyr Cys Gln Gln
90
acc aag ctg gag ateThr Lys Leu Glu Ile105
ctg tet gea tet gta gga 48Leu Ser Ala Ser Val Gly
15
cag ggc att age agt gct 96Gln Gly Ile Ser Ser Ala30
gct cct aag ctc ctg ate 144Ala Pro Lys Leu Leu Ile45
cca tca agg ttc age ggc 192Pro Ser Arg Phe Ser Gly60
ate age age ctg cag cct 240Ile Ser Ser Leu Gln Pro75 80ttt aat agt tac cct cac 288Phe Asn Ser Tyr Pro His
95
aaa 321
Lys<4OO> 74Glu Val Gln Leu1
Ser Leu Lys Ile20
Trp Ile Gly Trp35
Gly Ile Ile Tyr50
Gln Gly Gln Val65
Leu Gln Trp SerAla Arg
Val Gln Ser Gly5
Ser Cys Lys Gly
Val Arg Gln Met40
Pro Gly Asp Ser55
Thr Ile Ser Ala70
Ser Leu Lys Ala85
Ala Glu Val Lys10
Ser Gly Tyr Ser25
Pro Gly Lys Gly
Asp Thr Arg Tyr60
Asp Lys Ser Ile75
Ser Asp Thr Ala90
Lys Pro Gly Glu15
Phe Thr Ser Tyr30
Leu Glu Trp Met45
Ser Pro Ser Phe
Ser Thr Ala Tyr80
Met Tyr Tyr Cys95
<210> 75<211> 98<212> PRT<213> Homo
sapiens
<400> 75
Jln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 76<211> 95<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 76
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 77<211> 95<212> PRT<213> Homo
sapiens
<400> 77
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
1 5
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys35 40
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala
50 55
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
85
Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
10 15
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
25 30
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
45
Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser60
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu75 80Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser90 95<210> 78
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
1 5
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg20
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
50 55
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
85
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
25 30
Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
45
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly60
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro75 80
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro90 95
<210> 79
<211> 556
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
15 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95Cys Gln Pro Gly100
Val Asn Val Glu115
Leu Gly Gly Leu130
Ser Ser Pro Ser145
Lys Asp Arg Pro
Arg Asp Ser Leu180
Gly Ser Thr Leu195
Arg Gly Pro Leu210
Leu Leu Ser Leu225
Val Met Glu Thr
Gly Lys Tyr Tyr260
Glu Ile Thr Ala275
Gly Trp Lys Val290
Cys Ser Leu Val305
Arg Lys Arg Lys
Thr Pro Pro Pro340
Ser Leu Pro Thr355
Ala Gly Leu Gly370
Pro Pro Ser Glu
Gly Ser Gly Glu120
Gly Cys Gly Leu135
Gly Lys Leu Met150
Glu Ile Trp Glu165
Asn Gln Ser Leu
Trp Leu Ser Cys200
Ser Trp Thr His215
Glu Leu Lys Asp230
Gly Leu Leu Leu245
Cys His Arg Gly
Arg Pro Val Leu280
Ser Ala Val Thr295
Gly Ile Leu His310
Arg Met Thr Asp325
Gly Ser Gly Pro
Pro Thr Ser Gly360
Gly Thr Ala Pro375
39
Lys Ala Trp Gln105
Leu Phe Arg Trp
Lys Asn Arg Ser140
Ser Pro Lys Leu155
Gly Glu Pro Pro170
Ser Gln Asp Leu185
Gly Val Pro Pro
Val His Pro Lys220
Asp Arg Pro Ala235
Pro Arg Ala Thr250
Asn Leu Thr Met265
Trp His Trp Leu
Leu Ala Tyr Leu300
Leu Gln Arg Ala315
Pro Thr Arg Arg330
Gln Asn Gln Tyr345
Leu Gly Arg Ala
Ser Tyr Gly Asn380
Pro Gly Trp Thr110
Asn Val Ser Asp125
Ser Glu Gly Pro
Tyr Val Trp Ala160
Cys Leu Pro Pro175
Thr Met Ala Pro190
Asp Ser Val Ser205
Gly Pro Lys Ser
Arg Asp Met Trp240
Ala Gln Asp Ala255
Ser Phe His Leu270
Leu Arg Thr Gly285
Ile Phe Cys Leu
Leu Val Leu Arg320
Phe Phe Lys Val335
Gly Asn Val Leu350
Gln Arg Trp Ala365
Pro Ser Ser AspVal Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly385 390 395 400
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu
405 410 415
Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu
420 425 430
Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly
435 440 445
Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu
450 455 460
Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser465 470 475 480
Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly
485 490 495
Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln
500 505 510
Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala
515 520 525
Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp
530 535 540
Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg^545 550 555
<210> 80
<211> 13
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser15 10
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 81
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser1 5 10 15
<210> 82<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
1 5
Ser Ser
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val10 15
<210> 83<211> 14<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser15 10
<210> 84<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys15 10
<210> 85< 211> 12< 212 > PRT
<213> Homo sapiens<4OO> 85
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys1 5 10
<210> 86<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
10
<210> 87<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 87
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys15 10

Claims (27)

1. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção oufragmento ligante ao antigeno do mesmo, caracterizadopelo fato de:(a) ligar-se a CD19 humano com um K0 de IxlO"7 M ou menos;e(b) ligar-se a células-B tumorais de Raji e Daudi.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de o anticorpo ser nãofucosilado.
3. Anticorpo monoclonal isolado, ou fragmento ligante aoantigeno do mesmo, caracterizado pelo fato de o anticorpofazer competição cruzada para ligar-se a CD19 com umanticorpo de referência, sendo que o anticorpo:(a) liga-se a CD19 humano com um Kd de IxlO-7M ou menos; e(b) liga-se a células-B tumorais de Raji e Daudi, e ondeo anticorpo de referencia compreende uma região variávelde cadeia pesada compreendendo uma sequencia deaminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNO:1,2,3,4,5,6, e 7; e uma região variável de cadeia levecompreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NO: 8,9,10,11,12,13,14, E 15.
4. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção oufragmento ligante ao antigeno do mesmo, caracterizadopelo fato de compreender uma região variável de cadeiapesada que é derivada de um gene Vh 5-51 humano ou umgene Vh 1-69 humano e uma região variável de cadeia leveque é derivada de um gene VKL18, VKA27 ou um gene VKL15humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente aCDl9.
5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma seqüência de CDRl de região variável de cadeiapesada selecionada de um grupo consistindo de SEQ ID NO:-16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22;(b) uma seqüência de CDR2 de região variável de cadeiapesada selecionada de um grupo consistindo de SEQ ID NO:-23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29;(c) uma seqüência de CDR3 de região variável de cadeiapesada selecionada de um grupo consistindo de SEQ ID NO:-30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36;(d) uma seqüência de CDRl de região variável de cadeialeve selecionada de um grupo consistindo de SEQ ID NO:-37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43;(e) uma seqüência de CDR2 de região variável de cadeialeve selecionada de um grupo consistindo de SEQ ID NO:-44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50; e(f) uma seqüência de CDR3 de região variável de cadeiapesada selecionada de um grupo consistindo de SEQ ID NO:-51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 e 58.
6. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção oufragmento ligante ao antigeno do mesmo, caracterizadopelo fato de compreender:uma região variável de cadeia pesada que compreendeseqüências CDRl, CDR2 e CDR3; e uma região variável decadeia leve que compreende seqüências CDR1, CDR2 e CDR3,onde:(a) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia pesadacompreende uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ IDNOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36 e suas modificaçõesconservativas;(b) a seqüência CDR3 da região variável de cadeia levecompreende uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo de seqüências de aminoácido de SEQ IDNOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 e 58 e suas modificaçõesconservativas;(c) o anticorpo liga-se a CD19 humano com um K0 de IxlO-7Mou menos; e(d) liga-se a células-B tumorais de Raji e Daudi.
7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de a seqüência CDR2 da regiãovariável de cadeia pesada compreender uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de seqüênciasde aminoácido SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29, esuas modificações conservativas; e a seqüência CDR2 daregião variável de cadeia leve compreende uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo consistindo deseqüências de aminoácido de SEQ ID NOS: 44, 45, 46, 47,-48, 49 e 50, e suas modificações conservativas.
8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de a seqüência CDRl da regiãovariável de cadeia pesada compreender uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo de seqüênciasde aminoácido de SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22,e suas modificações conservativas; e a seqüência CDRl daregião variável de cadeia leve compreender uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo consistindo deseqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40,-41, 42 e 43, e suas modificações conservativas.
9. Anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção oufragmento ligante ao antigeno do mesmo, caracterizadopelo fato de compreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendouma seqüência de aminoácido selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo umaseqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindode SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15;sendo que o anticorpo liga-se especificamente a CD19.
10. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:l; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8.
11. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:l; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9.
12. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:2; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.
13. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:3; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11.
14. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:4; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 12.
15. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:5; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 13.
16. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:6; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
17. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO:7; e(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 15.
18. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato decompreender o anticorpo, a porção ou fragmento ligante aoantigeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1,ligado a um agente terapêutico.
19. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de o agente terapêutico ser umacitotoxina ou um isotopo radioativo.
20. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizadapelo fato de codificar o anticorpo, ou a porção liganteao antigeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1.
21. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato decompreender a molécula de aminoácido, conforme definidana reivindicação 20.
22. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato decompreender o vetor de expressão, conforme definido nareivindicação 21.
23. Método para preparar um anticorpo anti-CD19,caracterizado pelo fato de compreender expressar oanticorpo na célula hospedeira, conforme definida nareivindicação 54, e isolar o anticorpo da célulahospedeira.
24. Método para inibir o crescimento de células tumoraisexpressando CD19, caracterizado pelo fato de compreendercontatar as células com o anticorpo, ou a porção oufragmento ligante ao antigeno do mesmo, conforme definidona reivindicação 1, numa quantidade eficaz para inibir ocrescimento das células tumorais.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de ditas células tumorais seremmalignidades de célula B.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de dita malignidade de célula Bser Iinfoma não-Hodgkin ou um Iinfoma de célula do manto.
27. Método para depleção de células B num indivíduo,caracterizado pelo fato de compreender administrar aoindivíduo o anticorpo anti-CD19, conforme definido nareivindicação, numa quantidade eficaz para depletarcélulas B do indivíduo.
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