BRPI0613375A2 - células progenitoras do fìgado - Google Patents
células progenitoras do fìgado Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0613375A2 BRPI0613375A2 BRPI0613375-4A BRPI0613375A BRPI0613375A2 BR PI0613375 A2 BRPI0613375 A2 BR PI0613375A2 BR PI0613375 A BRPI0613375 A BR PI0613375A BR PI0613375 A2 BRPI0613375 A2 BR PI0613375A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- cells
- oval
- culture medium
- cell line
- liver
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 60
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims abstract description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 92
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 claims abstract 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 25
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 21
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 8
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 8
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 claims description 7
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003969 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 claims description 7
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 7
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 7
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 7
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 6
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 6
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 claims description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 claims description 6
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 5
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims description 4
- 101001008874 Homo sapiens Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 claims description 4
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 4
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 4
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 4
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 4
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 claims description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100023126 Cell surface glycoprotein MUC18 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 claims description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000623903 Homo sapiens Cell surface glycoprotein MUC18 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 claims description 3
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 3
- 210000004524 haematopoietic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 claims description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 claims 3
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims 3
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 3
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 abstract 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 16
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 16
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 14
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 11
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 8
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 7
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 7
- 230000009762 endothelial cell differentiation Effects 0.000 description 5
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 3
- 108010066327 Keratin-18 Proteins 0.000 description 3
- 102000018329 Keratin-18 Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000003897 hepatic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018711 Facilitative Glucose Transport Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 108010066302 Keratin-19 Proteins 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 102100023162 L-serine dehydratase/L-threonine deaminase Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- URNSECGXFRDEDC-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-1,4-benzoquinone imine Chemical compound CC(=O)N=C1C=CC(=O)C=C1 URNSECGXFRDEDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 2
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 101150116689 Slc2a2 gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 102000016540 Tyrosine aminotransferases Human genes 0.000 description 2
- 108010042606 Tyrosine transaminase Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 206010019692 hepatic necrosis Diseases 0.000 description 2
- 230000007866 hepatic necrosis Effects 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108020000318 saccharopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100028789 Arabidopsis thaliana PBS1 gene Proteins 0.000 description 1
- -1 C-kit Proteins 0.000 description 1
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101150012619 FCS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000012752 Hepatectomy Methods 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100058550 Mus musculus Bmi1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100315586 Mus musculus Twf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 1
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000008790 VE-cadherin Human genes 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 229940050447 acetaminophen injection Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N beta-glycerol phosphate Natural products OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHRQXJHBXKYCLZ-UHFFFAOYSA-L beta-glycerolphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CC(CO)OOP([O-])([O-])=O GHRQXJHBXKYCLZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 108010018828 cadherin 5 Proteins 0.000 description 1
- 230000009743 cell cycle entry Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000006372 lipid accumulation Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 102000014898 transaminase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
- C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Células progenitoras do fígado. O presente invento se refere a linhagens celulares progenitoras pluripotentes de fígado humano que expressam marcadores celulares hepáticos tais como albumina e <244>-fetoproteína e não expressam alguns dos marcadores que são típicos de células-tronco ovais. Também são descritos um método para isolar as linhagens celulares do presente invento, métodos para diferenciar ditas células numa pluralidade de linhagens celulares diferentes, métodos para imortalização condicional e seleção metabólica de ditas células, bem como o uso das linhagens celulares do presente invento para preparar medicamentos com atividade de diferenciação osteogênica ou atividade de regeneração de dano no fígado.
Description
Células progenitoras do fígado.
Refere-se o presente invento a um método de isolamento decélulas progenitoras de um tecido de fígado adulto, células progenitoras do fígadoisoladas pelo método do presente invento, bem como a métodos de indução dediferenciação das células progenitoras do fígado isoladas e métodos de imortalizaçãocondicional e seleção metabólica das células progenitoras do fígado. Maisespecificamente, o presente invento se refere às células progenitoras do fígado que,embora sejam derivadas do fígado, são morfologicamente diferentes das células-troncohepáticas ovais e não expressam os marcadores típicos das células-tronco hepáticasovais. Adicionalmente, as células progenitoras do fígado de acordo com o presenteinvento exibem capacidade de auto-renovação e potencial de diferenciação multi-linhagem, características que permitem categorizar estas células como célulasprogenitoras pluripotentes.
As células-tronco do fígado, incluindo as células-tronco dofígado humano, são descritas no estado da técnica, por exemplo, nos pedidos de patenteWO 03/078588, WO 00/03001, EP 1394263, US 2003/0138951. As células-tronco dofígado mais conhecidas são designadas como células-tronco ovais hepáticas, devido aoseu formato oval característico. As células-tronco ovais são um tipo bem definido decélulas-tronco do fígado. As características principais delas são, além de sua morfologiaoval característica, a expressão de um ou mais marcadores de superfície que são típicosde células-tronco hematopoiéticas, tais como c-kit (CD117), CD34 e Sca-1, sugerindo queas células-trçnco ovais se originam de células-tronco hematopoiéticas. Além disso, ascélulas-tronco ovais são progenitores bipotentes capazes de gerar ambos hepatócitos ecolangiócitos in vivo (Petersen B. E., Goff J. P1 Greenberger J. S., Michalopoulos G. K.(1998) "Rat oval cells express the hematopoietic stem cell marker Thy-1 in the rat."Hepatology 27, 433-445; Petersen B. E., Grossbard B., Hatch H., Pi L., Deng J., ScottE.W. (2003) "Mouse A6-positive hepatic oval cells also express several hematopoieticstem cell markers". Hepatology 37, 632-640).
Os presentes inventores descobriram surpreendentementeum método para isolar células progenitoras de tecido de fígado adulto que resulta noisolamento de uma nova população de células progenitoras que é caracterizada pelaexpressão de alguns marcadores celulares que são típicos de células hepáticas, taiscomo albumina e α-fetoproteína, e pela ausência de características morfológicas emoleculares típicas das células-tronco ovais. As novas células progenitoras de fígado dopresente invento são de fato epitelióides no formato preferencialmente a serem deformato oval.
Além disso tais células não parecem expressar alguns dosmarcadores celulares hemopoiéticos que são típicos das células-tronco ovais hepáticas.Conseqüentemente, num primeiro aspecto, o presenteinvento provê um método de isolar uma linhagem celular progenitora de fígado humanoexpressando marcadores celulares hepáticos, preferencialmente albumina e a-fetoproteína, dita linhagem celular preferencialmente não expressando marcadorescelulares hemopoiéticos, o método compreendendo as etapas de:
(i) cultivar hepatócitos humanos maduros derivados do fígado em um meio de culturacelular até a morte dos hepatócitos maduros e seleção de uma população de célulassobreviventes tendo morfologia epitelióide;
(ii) expandir a população de células sobreviventes cultivando em um meio de culturacontendo soro, glicose, suplementado com hEGF (fator de crescimento epitelialhumano) e bFGF (fator de crescimento de fibroblasto básico) e compreendendo ossais inorgânicos usuais, aminoácidos e vitaminas necessários para o crescimento decélulas de mamíferos.
Os hepatócitos maduros empregados no método dopresente invento são obtidos a partir de tecido de fígado adulto de acordo com qualquerprocedimento conhecido per se para o isolamento de hepatócitos do fígado de mamífero,preferencialmente do fígado humano. O significado da expressão "tecido de fígadoadulto" como usado aqui está bem estabelecido no estado da técnica e significa tecido defígado obtido a partir de um organismo pós-natal. O significado da expressão "hepatócitosmaduros" é também bem estabelecido no estado da técnica. Esta expressão abrangehepatócitos completamente diferenciados que não têm a habilidade de se proliferar invitro. Os marcadores de diferenciação freqüentemente usados para hepatócitos madurossão marcadores bioquímicos, tais como albumina, tirosina aminotransferase (TAT),citocromo P450, TO, serina desidratase (SDH), Cxs 32 e 26, bem como marcadoresmorfológicos, tais como formação de dutos biliares, junções de hiato, peroxisomas comnucleóides cristalinos, um alto número de mitocôndrias (vide por exemplo Mitaka T.(2002). "Reconstruction of hepatic organoid by hepatic stem cells". J. HepatobiliaryPancreat Surg.; 9 (6): 697-703).
Os hepatócitos maduros podem ser opcionalmentecongelados em um meio de cultura contendo soro na presença de um agente crioprotetorantes da cultivação. Os hepatócitos são preferencialmente congelados num meio líquidocompreendendo 20% de soro fetal de bezerro (FCS) ou soro humano (HS) termo-inativado e contendo dimetilsulfóxido (DMSO) como agente crioprotetor. Alternativamente,qualquer outro composto conhecido por ter propriedades crioprotetoras pode ser usadocomo agente crioprotetor, tais como por exemplo glicerol, etilenoglicol, poli(etilenoglicol),ou polivinilpirrolidona. O congelamento é preferencialmente executado em temperaturasmuito baixas, por exemplo colocando a amostra das células a -80°C e subseqüentementeem nitrogênio líquido.O método de isolamento do presente invento compreendeuma primeira etapa em que a cultura primária de hepatócitos maduros é submetida àseleção negativa e numa segunda etapa em que a população de células sobreviventes éexpandida.
Na primeira etapa, os hepatócitos são cultivados emcondições severas até que seja induzida a morte da cultura primária de hepatócitosmaduros. Para este fim, os hepatócitos podem ser semeados numa densidade de cercade 1,0 a 1,5 χ 105 células viáveis por cm2 sobre placas de cultura revestidas comcolágeno e cultivadas num meio de cultura celular de hepatócitos por cerca de pelomenos 2 semanas. Após cerca de 2 semanas, a grande maioria dos hepatócitos moremas uma população de células formadoras de aglomerados sobrevive. Tais célulasformadoras de aglomerados são prontamente distinguíveis dos hepatócitos maduros porsua morfologia epitelióide.
Na segunda etapa, os aglomerados de células sobreviventessão removidos, plaqueados em diluição Iimitante e cultivados em um meio de cultura ricocontendo soro e glicose suplementado com hEGF e bFGF, o meio sendo capaz desustentar o crescimento dos aglomerados celulares. A concentração de hEGF no meiorico é preferencialmente compreendida entre 2 e 10 ng/mL; a concentração de bFGF épreferencialmente compreendida entre 10 e 50 μg/mL. Mais preferencialmente, o meio decultura rico usado na etapa de expansão é uma mistura de alfa Meio Essencial Mínimo(aMEM) e Meio Basal Endotelial (EBM) (3:1 v/v), suplementado com FCS e/ou HS1glutamina e antibióticos. O Meio Basal Endotelial (EBM) compreende concentraçõesadequadas dos fatores de crescimento hEGF e bFGF. Um agente tampão pode seradicionado ao meio rico a fim de manter o pH em cerca de valores neutros(preferencialmente pH 7,4). A aparência de colônias individuais anexadas é observadaapós cerca de 3 semanas em cultura. Os clones individuais são sub-cultivados,expandidos e analisados quando se aproximam da confluência.
As células progenitoras do fígado humano obtidas pelométodo descrito acima são incapazes de crescer em aMEM suplementado com 10% FCSe 10% HS, que é o meio de cultura freqüentemente usado para células-troncomesenquimais.
Vinte e quatro clones celulares diferentes foram obtidos pelométodo descrito acima. Os clones foram mantidos em cultura e em meio nãodiferenciador por de 2 a 3 meses. Cerca de 200 milhões de células foram geradas a partirde um único clone, indicando uma longevidade de 200 a 250 duplicações. Estes dadosindicam que as células progenitoras derivadas do fígado do presente invento sãocapazes de auto-renovação.
De acordo com uma forma preferida de realização dométodo do presente invento, as células tendo morfologia epitelióide obtidas na etapa (ii)podem opcionalmente ser submetidas a imortalização condicional e seleção metabólica.
A imortalização condicional prove linhagens celularesimortalizadas com funções metabólicas estáveis. A imortalização condicional pode seralcançada por exemplo pela sub-clonagem de antígenos Grande T de SV40 ou dequalquer outro gene tendo a atividade de induzir ou manter a entrada no ciclo celular, taiscomo, p.ex., Bmi-1, h-TERT ou c-Myc, em um vetor não viral tal como pcDNA4/TO(Invitrogen) que inclui os elementos regulatórios do operon de resistência tetraciclina (Tet)codificado por E. coli TnIO (Hillen and Berens, 1994; Hillen et al., 1983). A adição de umsegundo vetor regulatório tal como pcDNA6/TR (Invitrogen) que expressa altos níveis degene TetR, induz a expressão do gene imortalizante e do crescimento celular controlado.
As células imortalizadas são então submetidas a seleçãometabólica pela substituição de glicose no meio de cultura celular por galactose que émetabolisada somente pelas células hepáticas.
Um outro aspecto do presente invento são as célulasderivadas do fígado obtidas como descrito acima. Tais células mostraram diferenciaçãosob condições de cultura adequadas em hepatócitos maduros ou células produtoras deinsulina, marcando estas células como células progenitoras do fígado. Adicionalmente, aslinhagens celulares do presente invento mostraram sofrer diferenciação osteogênica eendotelial quando cultivadas no meio de diferenciação apropriado. Além disso, aslinhagens celulares do presente invento são caracterizadas por um perfil único deexpressão de marcador celular que, do conhecimento do depositante, nunca foi descritoaté agora e que é diferente do perfil de expressão das células-tronco ovais do fígado,sugerindo que um novo tipo de células foi identificado.
A caracterização por FACS (Ordenação celular ativada porfluorescência), Imunofluorescência e RT-PCR do perfil de expressão de váriosmarcadores celulares das linhagens celulares progenitoras humanas derivadas do fígadodo presente invento mostra a presença de vários marcadores de células-tronco emarcadores específicos de tecido do fígado. Os seguintes antígenos celulares foramtestados: CD34, C-kit, SCA-1, CD29, CD73, CD45, CD133, CD146, CD105, CD44, CD90,CD117, CD14, HLA-A,B,C, α-fetoproteína, citoqueratina 19, albumina e citoqueratina 18.
Os resultados são resumidos na tabela I abaixo.
TABELA I
<table>table see original document page 5</column></row><table><table>table see original document page 6</column></row><table>
Os resultados indicam que as células progenitoras humanasderivadas do fígado do presente invento expressam marcadores de ambas células-troncoe células do fígado, confirmando com isso que tais células são precursoras do fígado.Particularmente, a fig. 1 mostra que as células progenitoras humanas do fígado não ovaisobtidas (chamadas na Tabela I e nas seguintes como "HuHEP") expressam albumina (A),α-fetoproteína (C) e citoqueratina 18 (E) como detectado pela imunofluorescência usandoanticorpos específicos. B, D e F são os respectivos controles isotípicos negativos (x 400).
A expressão de albumina, α-fetoproteína e citoqueratina 18é típica de células hepáticas e caracteriza as linhagens celulares do presente inventocomo células progenitoras do fígado, na ausência de marcadores típicos de célulasmaduras do fígado tais como citocromo P450 e a capacidade de sintetizar uréia.
A morfologia e os marcadores de superfície detectados elistados na tabela I acima, caracterizam uma população que é diferente das células-tronco ovais hepáticas. Particularmente, as linhagens celulares do presente invento nãoexpressam CD-117 (c-Kit) nem CK19 (citoqueratina 19), que são marcadores típicos decélulas-tronco ovais. Um outro marcador típico de células-tronco ovais, i.e., CD34,também está ausente das linhagens celulares do presente invento.
Além disso, as linhagens celulares do presente invento nãoexpressam marcadores celulares de superfície que são típicos de células-troncohematopoiéticas (tais como CD117, CD34, CD45 e CD133) contrário a outras células-tronco do fígado tais como as células-tronco hepáticas primitivas humanas descritas nopedido de patente WO 03/078588 e as células-tronco ovais. Por outro lado, as linhagenscelulares do presente invento expressam vários marcadores celulares de superfície quesão típicos de outras células-tronco, por exemplo CD29, CD73, CD146, CD105(endoglina), CD44, CD90 (Thy-1) e HLA-A1B1C.
Uma característica extremamente vantajosa das linhagenscelulares progenitoras do presente invento é que elas são capazes de se diferenciarnuma pluralidade de linhagens celulares diferentes. Particularmente, as linhagenscelulares progenitoras do presente invento são capazes de se diferenciar em célulasmaduras do fígado, células produtoras de insulina, células osteogênicas e célulasendoteliais quando cultivadas sob condições adequadas de diferenciação.
Para diferenciação em células maduras de fígado, as célulasdo presente invento são cultivadas em um meio de cultura contendo soro,preferencialmente MEM-EBM (3:1) + 10% FCS e/ou HS1 suplementados com fator decrescimento de hepatócito (HGF) e fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGF-4).
Para diferenciação em células produtoras de insulina, ascélulas do presente invento são cultivadas em um meio de cultura contendo soro,preferencialmente DMEM suplementado com 2% FCS e/ou HS, na presença de pelomenos 2g/L de glicose, preferencialmente de 4,5 g/L de glicose. Mais preferencialmente,a nicotinamida é adicionada ao meio de cultura contendo soro após cerca de 1 mês decultura na presença de glicose. Uma concentração adequada de nicotinamida no meio decultura é de cerca de 10 mM.
Para diferenciação osteogênica, as células do presenteinvento são cultivadas em um meio de cultura contendo soro, preferencialmente a-MEM,suplementado com ascorbato-2-fosfato e dexametasona com fosfato inorgânico.
Para diferenciação endotelial, as células do presente inventosão cultivadas em um meio basal celular endotelial, preferencialmente EBM-2,suplementado com VEGF (fator de crescimento endotelial vascular).
As células progenitoras de fígado não ovais do presenteinvento foram inoculadas subcutaneamente em camundongos SCID para avaliar osurgimento de tumores. Nenhum tumor foi observado após seis meses. Uma vez que,como mencionado acima, as linhagens celulares progenitoras do fígado não ovais dopresente invento podem ser expandidas, mantidas em cultura por várias passagens,criopreservadas e diferenciadas, e também em vista de suas propriedades dediferenciação, tais células são úteis em várias aplicações incluindo, entre outras, o usocomo um substrato para culturas de vírus de hepatite, o uso como um modelo in vitropara teste de drogas, a aplicação na terapia regenerativa e a aplicação nodesenvolvimento de um fígado bioartificial.
Os seguintes exemplos são fornecidos a título de ilustraçãoe não se destinam a limitar o escopo do presente invento, como determinado pelasreivindicações anexas.
EXEMPLOS
Criopreservação
Os hepatócitos maduros humanos normais obtidos de tecidode fígado humano adulto foram criopreservados em soro fetal de bezerro (FCS) termoinativado suplementado com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) esterilizado a filtro e osfrascos foram armazenados em nitrogênio líquido. Os hepatócitos foram degelados paracontrolar a viabilidade celular após congelamento, determinando o número de célulasviáveis pelo ensaio de exclusão por corante usando o corante azul Trypan. Osexperimentos mostraram que a viabilidade celular foi de > 90% e que as célulasdegeladas mantinham seu fenótipo e capacidades de diferenciação.
Isolamento e cultura de células progenitoras de fígado humano não ovais (HuHEP)
Os hepatócitos foram obtidos a partir de 8 preparaçõesdiferentes de fígado humano normal, incluindo 2 preparações a partir de fígado fresco e 6preparações de hepatócitos criopreservados (obtidos de Cambrex Bio Science, Verviers,Bélgica, http://www.cambrex.com).
Preparação do tecido de fígado fresco
Os hepatócitos humanos foram isolados de amostrascirúrgicas de pacientes sofrendo hepatectomia. O tecido de fígado sadio (de 5 a 20 g) foiusado para isolar hepatócitos por digestão com colagenase. Brevemente, os tecidos defígado foram isolados e irrigados com 350 mL de tampão morno (37°C) isento de Ca(Liver Perfusion Médium, Gibco, Grand Island1 NY; http://www.invitrogen.com/).
Então os tecidos de fígado foram digeridos em meio dedigestão de fígado (Gibco) a 37°C. Isto resultou no empalidecimento, amolecimento edissociação do tecido do fígado e proveu a completa digestão do fígado dentro de 10 a12 min. Os hepatócitos foram liberados por moagem e pipetagem com uma pipeta de furogrande. A suspensão celular foi filtrada através de uma tela esterilizada de nylon de 100μm em um béquer colocado em gelo, sedimentada por centrifugação a 50g por 5 min.,resuspendida e lavada de 2 a 3 vezes em meio de lavagem frio (Hepatocyte WashMédium, Gibco).
Seleção negativa
Os hepatócitos obtidos como descrito acima foraminicialmente plaqueados em meio Williams Médium E (Gibco) adicionalmentesuplementado com glutamina e com 5% de soro fetal de bezerro (FCS, Euroclone,Wetherby1 UK, http://www.euroclone.net). As células não anexadas foram vertidas de 2 a3 h mais tarde e então foi substituído por um meio hepatócito isento de soro(Hepatozyme-SFM, Gibco), um meio de Chees altamente modificado suplementado com1,25 μς/αη2 de colágeno para prover uma matriz sanduíche. As culturas foramrealímentadas com Hepatozyme SFM (sem colágeno) a 24 h e a cada 48 h depois disso.Os hepatócitos foram semeados numa densidade de 1,0 a 1,5 χ 105 células viáveis [80%de células viáveis determinado pelo azul Trypan (Gibco)] por cm2 sobre as placas decultura revestidas com colágeno em Hepatozyme-SFM mantido a 37°C, 5% de CO2 por 2semanas. Após cerca de 2 semanas em cultura, foi observada a extensiva morte doshepatócitos.
Expansão
O meio de cultura foi substituído por alfa-Meio EssencialMínimo/Meio Basal Endotelial-1 (aMEM/EBM) (3:1) (Gibco/Cambrex) suplementado comL-glutamina (5 mM), Hepes (12 mM, ph 7,4), penicilina (50 UI/mL), estreptomicina (50μg/mL) (todos de Sigma-AIdrich, St. Louis, MO; http://www.sigmaaldrich.com/), FCS(10%) e soro de cavalo (10%, HS1 Gibco). As células anexadas individuais foramidentificadas no disco de cultura após outras 3 semanas. Quando as colônias estavamevidentes, os anéis de clonagem foram postos em torno delas, e elas foram sub-cultivadas numa cavidade individual de uma placa de cultura de 24 cavidades. As célulasexpandidas foram transferidas para um frasco de 75 cm2 e analisadas quando seaproximaram da confluência.
Hepatócitos criopreservados
Hepatócitos humanos normais criopreservados foramcultivados sob as mesmas condições de cultura (seleção negativa e expansão) descritasacima, proporcionando resultados similares.
Imortalização condicional
As células cultivadas por cerca de 10 passagens foramdestacadas e submetidas a eletroporação a 180 V por 20 ms usando 5 μg de vetorpcDNA4/TO (Invitrogen) portando o antígeno grande T de SV40 subclonado. As célulasforam selecionadas com zeocina (5 μg/mL) por 3 semanas.
As células foram então submetidas a uma segundaeletroporação a 180 V por 20 ms com 5 μg de vetor pcDNA6/TR (Invitrogen) e escolhidaspor 3 semanas com blasticidina (5 μg/mL) na presença de desoxiciclina (1 μg/mL). Ascélulas foram alimentadas a cada 3 dias em meio DMEM (DMEM: MEM de Dulbecco)suplementado com 10% FCS na presença de desoxiciclina (1 μg/mL).
Seleção metabólica
As células imortalizadas obtidas como descrito acimainduzidas a crescer com desoxiciclina (1 μg/mL) foram cultivadas em meio RPMI isentode glicose compreendendo 1 μg/mL de galactose e 3% de FCS por 30 dias, a fim deescolher as células que são especificamente capazes de usar galactose em vez deglicose, que é uma característica típica de células hepáticas. As células foram testadas ecriopreservadas.
Diferenciação de HuHEP em hepatócitos e em células produtoras de insulina
A fim de verificar se as células HuHEP eram capazes de sediferenciar em hepatócitos maduros, foi avaliada a expressão de citocromo P450, i.e., aenzima de oxidação metabólica, sob diferentes condições de cultura. As células foramcultivadas por 15 dias nas seguintes condições de cultura:
As células HuHEP foram cultivadas num bioreator com meioMEM/EBM suplementado com 10% de FCS/HS + HGF/FGF-4. Após 15 dias de cultura,as células HuHEP foram avaliadas se positivas para citocromo P450. De 20 a 25% dapopulação total de HuHEP cultivada em MEM/EBM com 10% de FCS/HS + HGF/FGF-4eram positivas para citocromo P450. A concentração de uréia estava na faixa de 3 a 4mg/dL, a glicose estava na metade da glicose total inicialmente presente no meio fresco,e não havia modificação no total de proteína, indicando que os hepatócitos diferenciadosestavam metabolicamente ativos.
Além disso, as células HuHEP foram diferenciadas emcélulas produtoras de insulina com incubação em meio DMEM (DMEM: MEM deDulbecco) suplementado com 2% de FCS/HS e um alto teor de glicose (pelo menos 2 g/Lde glicose, preferencialmente 4,5 g/L de glicose) por 1 mês, e opcionalmente por de 5 a 7dias na presença de 10 mM de nicotinamida. As células começaram a formar pequenosaglomerados celulares esferóides no topo da monocamada celular confluente quemorfologicamente lembravam ilhotas pancreáticas. Estes aglomerados celularestridimensionais mancharam positivamente com o anticorpo policlonal contra insulinahumana e com o anticorpo monoclonal contra transportador de glicose humano do tipo 2(Glut2) que é um transportador de glicose (fig. 2). Além disso, os aglomerados celularestridimensionais mancharam com o Zn-ditizona, que é específico para grânulos contendoinsulina. Estes resultados são mostrados na fig. 2, que mostra a aparência morfológica deHuHEP não estimulada (painel A), HuHEP estimulada com o meio diferenciador queinduz a formação de estruturas similares às ilhotas pancreáticas (painel B). Fig. 2, painéisCeD: manchamento por imunofluorescência para insulina humana; painéis EeF:manchamento por imunofluorescência para Glut2 humano; painéis GeH: manchamentocom controles isotípicos negativos; painel I: manchamento com Zn-ditizona. (A, B, D, F, G,H, 1x250; Ce Ex 150).
Diferenciação osteogênica in vitro
Para induzir a diferenciação osteogênica, as células foramcultivadas em aMEM suplementado com 10% de FCS1 10% de HS1 100 UI/mL depenicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 12 mM de L-glutamina, 20 mM de fosfato de β-glicerol, 50 ng/mL de tiroxina, 1 nM de dexametasona e 0,5 μΜ de ascorbato 2-fosfato(todos de Sigma-AIdrich). O meio foi substituído com meio fresco duas vezes por semanapor 3 semanas. Para avaliar a diferenciação, as células foram fixadas com 4% deparaformaldeído por 20 minutos em temperatura ambiente e manchada com vermelho dealizarina, pH 4,1 (Sigma) por 20 minutos em temperatura ambiente.
As células cultivadas por 3 semanas em meio dediferenciação osteogênica exibiram depósitos de cálcio e expressão de osteocalcina eosteopontina, indicando diferenciação osteogênica. Além disso, as células se tornaramnegativas para albumina, AFP e CK18.
Após 6 semanas no mesmo meio mas sem fosfatoinorgânico, não foi detectada a acumulação de lipídeo.
Diferenciação endotelial in vitro
A diferenciação celular endotelial foi obtida cultivando ascélulas em meio EBM-2 (Cambrex) por 10 dias com fator de crescimento endotelialvascular (VEGF, 10 ng/mL, Sigma). Quando cultivadas em EBM suplementado comVEGF, as células expressaram os marcadores endoteliais CD31, CD34, KDR (VEGFR-2),CD114 (VE-caderina), e fator de von Willebrand que estavam negativos nas condiçõesnão diferenciadas, indicando uma diferenciação endotelial. Durante a diferenciaçãoendotelial, a albumina, AFP e CK18 foram perdidas.
Efeitos da injeção de HuHEP em dano ao fígado induzido por acetaminofeno em SCID
A hepatotoxicidade de acetaminofeno é um modelo bemreconhecido de necrose hepática. Os níveis aumentados de N-acetil-p-benzoquinona-imina (NAPQI), o metabólito tóxico de acetaminofeno, são responsáveis pela necrosehepática.
Modelo animal e transplante de HuHEP
Os camundongos SCID eram de Charles River (JacksonLaboratories, Bar Harbor, ME). Eles foram alojados num ambiente isento de patógenosespecíficos. Os camundongos SCID de 8 semanas de idade foram usados para osexperimentos. Os experimentos foram realizados de acordo com as orientações doNational Institute of Health. Após um período de 16 horas, os camundongos foraminjetados intraperitonealmente com 250 mg/kg de acetaminofeno (Sigma, St. Louis, MO)dissolvido em tampão salino esterilizado ou somente com tampão salino esterilizadocomo controle de veículo. Após a injeção com acetaminofeno, os camundongos foramalimentados ad Iibitum com ração.
O pico de dano ao fígado foi observado 1 dia após a injeçãode acetaminofeno. Após este tempo, as células HuHEP (passagem lll-IV) foram colhidasusando tripsina-EDTA, lavadas com PBS1 rotuladas com o kit Iigante de células vermelhofluorescente PKH26 (Sigma), contadas numa câmara microcitométrica e ressuspensasem PBS (1 χ 106 em 250 μL de PBS).
Medidas de aminotransferase no plasmaOs níveis de plasma ou soro de aspartato deaminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) foram medidos em 37°C comum kit disponível no mercado (Sigma Diagnostic).
Histologia
O tecido hepático foi fixado com formalina e embebido emparafina antes de seccionar. As seções do fígado foram manchadas com hemotoxilina-eosina.
Para preservação criostática, os tecidos hepáticos forammantidos em solução 4% de formaldeído de um dia para o outro. No dia seguinte, oformaldeído foi removido e substituído por 70% de EtOH. Então os tecidos foram fixadosem OCT.
A análise quantitativa da extensão da necrose do tecido foirealizada após a obtenção de imagens digitais de três campos de alta potência por slidede forma aleatória e cega. As áreas de necrose de tecido ou de necrose iminente foramidentificadas de acordo com a presença de eosinofilia diminuída, perda de arquiteturacelular, vacuolização, rompimento celular ou cariólise.
Imunofluorescência
As seções criostáticas de fígado foram incubadas comanticorpo monoclonal de camundongos anti HLA-A1B1C humano conjugado a FITC(BioLegend1 San Diego1 CA) (1:200), ou com o IgGi monoclonal de camundongos decontrole, por 1 hora à temperatura ambiente. Três seções não seqüenciais foramexaminadas para cada amostra.
Resultados para os experimentos in vivo
Dano necrótico extensivo do fígado induzido poracetaminofeno. A injeção das células HuHEP rotuladas 24 horas após a indução dedanos hepáticos resultou no recrutamento local de HuHEP no local do dano ao fígado. Ascélulas contribuíram para a regeneração do fígado uma vez que estavam detectáveis nofígado dos camundongos SCID após 15 dias do dano ao fígado.
Os resultados experimentais in vitro e in vivo acima indicamque as linhagens celulares progenitoras de fígado humano do presente invento sãoadequadas para uso para preparar um medicamento tendo atividade de diferenciaçãoosteogênica bem como um medicamento tendo atividade de regeneração de dano aofígado.
Claims (30)
1. "Linhagem de células progenitoras pluripotentes não ovaisdo fígado humano", caracterizada pelo fato de expressar marcadores celulareshepáticos.
2. "Linhagem", de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de expressar os marcadores celulares hepáticos albumina e a-fetoproteína.
3. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de expressar o marcador celular hepático CK18.
4. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de expressar os marcadores de células-tronco CD44, CD29, CD73, CD146, CD105 e CD90.
5. "Linhagem", de acordo com qualquer uma das sreivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de não expressar marcadores celulareshemopoiéticos.
6. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de não expressar o marcador de célula-tronco hematopoiética CD133.
7. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de não expressar os marcadores decélula oval CD117 (C-kit), CK 19 e CD34.
8. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de não expressar o marcador de célulahepatócita madura citocromo P450 e não sintetizar uréia.
9. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de se diferenciar em células maduras dofígado e em células produtoras de insulina.
10. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de ser imortalizada.
11. "Método para isolar uma linhagem celular progenitorapluripotente não-oval de fígado humano", a linhagem de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(i) cultivar hepatócitos humanos maduros derivados do fígado adulto em um meio decultura celular até a morte dos hepatócitos maduros e seleção de uma população decélulas sobreviventes tendo morfologia epitelióide;(ii) expandir a população de células sobreviventes cultivando em um meio de culturacontendo soro, glicose, suplementado com hEGF (fator de crescimento epitelialhumano) e bFGF (fator de crescimento de fibroblasto básico) e compreendendo ossais inorgânicos usuais, aminoácidos e vitaminas necessários para o crescimento decélulas de mamíferos.
12. "Método", de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato que os hepatócitos maduros são congelados em um meio decultura contendo soro na presença de um agente crioprotetor e então degelados antes dacultura de acordo com a etapa (í).
13. "Método", de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato que o agente crioprotetor é dimetilsulfóxido.
14. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 11 a 13, caracterizado pelo fato que o meio de cultura celular da etapa(i) é um meio de cultura celular de hepatócitos.
15. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 11 a 14, caracterizado pelo fato que o meio de cultura contendo soroda etapa (ii) é uma mistura de aMEM-EBM (3:1 v/v) suplementado com soro fetal debezerro (FCS) ou soro humano (HS), antibióticos e glutamina.
16. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 11 a 15, caracterizado pelo fato que os hepatócitos maduros sãocultivados de acordo com a etapa (i) por pelo menos duas semanas.
17. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 11 a 16, caracterizado pelo fato que a linhagem celular progenitorapluripotente não-oval de fígado humano isolada é adicionalmente submetida aimortalização condicional.
18. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 11 a 17, caracterizado pelo fato que a linhagem celular progenitorapluripotente não-oval de fígado humano isolada é adicionalmente submetida a seleçãometabólica substituindo glicose por galactose no meio de cultura.
19. "Método de diferenciação de linhagem celularprogenitora pluripotente não-oval de fígado humano em células maduras de fígadocapazes de expressar o marcador celular de hepatócito humano citocromo P450 ecapazes de sintetizar uréia", a linhagem sendo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de compreender cultivar dita linhagemcelular em um meio de cultura contendo soro suplementado com fator de crescimento dehepatócito (HGF) e fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGF-4).
20. "Método", de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato que dito meio de cultura contendo soro é MEM-EBMsuplementado com 10% FCS ou HS, HGF e FGF-4.
21. "Método de diferenciação de linhagem celularprogenitora pluripotente não-oval de fígado humano em células produtoras de insulina", alinhagem sendo de acordo com as reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato decompreender cultivar dita linhagem celular em um meio de cultura contendo soro napresença de pelo menos 2 g/L de glicose.
22. "Método", de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato que o meio de cultura contendo soro adicionalmente compreendenicotinamida.
23. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo fato que o meio contendo soro é DMEMsuplementado com 2% de FCS ou HS1 4,5 g/L de glicose e 10 mM de nicotinamida.
24. "Método de diferenciação de linhagem celularprogenitora pluripotente não-oval de fígado humano em células osteogênicas", alinhagem sendo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10,caracterizado pelo fato de compreender cultivar dita linhagem celular em um meio decultura contendo soro suplementado com ascorbato-2 - fosfato e dexametasona comfosfato inorgânico.
25. "Método", de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato que o meio de cultura contendo soro é aMEM suplementado com ^ 10% FCS, 10% HS, 1 nM de dexametasona e 0,5 μΜ de ascorbato 2 - fosfato.
26. "Método de diferenciação de linhagem celularprogenitora pluripotente não-oval de fígado humano em células endoteliais", a linhagemsendo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelofato de compreender cultivar dita linhagem celular em um meio de cultura basal celularendotelial suplementado com fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).
27. "Método", de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato que o meio basal celular endotelial é EBM-2 suplementado com 10 ng/mLde VEGF.
28. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 19 a 27, caracterizado pelo fato que dita linhagem celular progenitorapluripotente não-oval de fígado humano é cultivada em um bioreator.
29. "Uso de linhagem celular progenitora pluripotente não-oval de fígado humano", de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10,caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento tendo atividade dediferenciação osteogênica.
30. "Uso de linhagem celular progenitora pluripotente não-oval de fígado humano", de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10,caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento tendo atividade deregeneração de dano hepático.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITPCT/IT2005/000303 | 2005-05-26 | ||
| PCT/IT2005/000303 WO2006126219A1 (en) | 2005-05-26 | 2005-05-26 | Liver progenitor cells |
| PCT/IT2006/000391 WO2006126236A1 (en) | 2005-05-26 | 2006-05-24 | Liver progenitor cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0613375A2 true BRPI0613375A2 (pt) | 2011-01-11 |
| BRPI0613375B1 BRPI0613375B1 (pt) | 2021-07-27 |
Family
ID=35462653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0613375-4A BRPI0613375B1 (pt) | 2005-05-26 | 2006-05-24 | Método para isolar uma linhagem celular progenitora pluripotente não-oval de fígado humano e métodos de diferenciação de uma linhagem celular progenitora pluripotente não-oval de fígado humano que expressa marcadores celulares hepáticos em células maduras de fígado capazes de expressar o marcador celular de hepatócito humano citocromo p450 e capazes de sintetizar uréia, células produtoras de insulina, células osteogênicas e em células endoteliais, bem como uso de linhagem celular progenitora pluripotente não-oval de fígado humano que expressa marcadores celulares hepáticos |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9334479B2 (pt) |
| EP (1) | EP1888742B1 (pt) |
| JP (1) | JP5144505B2 (pt) |
| CN (2) | CN101228266B (pt) |
| AT (1) | ATE486126T1 (pt) |
| BR (1) | BRPI0613375B1 (pt) |
| CA (1) | CA2609523C (pt) |
| DE (1) | DE602006017833D1 (pt) |
| DK (1) | DK1888742T3 (pt) |
| ES (1) | ES2355327T3 (pt) |
| PL (1) | PL1888742T3 (pt) |
| WO (2) | WO2006126219A1 (pt) |
Families Citing this family (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7781186B2 (en) * | 2000-09-25 | 2010-08-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Screening methods using normal human liver cell line |
| MX369594B (es) | 2005-08-26 | 2019-11-13 | Univ Minnesota | Descelularizacion y recelularizacion de organos y tejidos. |
| US8673635B2 (en) * | 2005-12-21 | 2014-03-18 | Universite Catholique De Louvain | Isolated liver stem cells |
| WO2009139419A1 (ja) * | 2008-05-14 | 2009-11-19 | 公立大学法人横浜市立大学 | ヒト肝幹細胞、その調製方法、分化誘導方法及び利用方法 |
| BRPI0909866B1 (pt) * | 2008-06-11 | 2021-08-24 | Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh | Método de produção de um meio condicionado de células progenitoras de fígado, meio condicionado e composição farmacêutica |
| MX2011010197A (es) * | 2009-03-31 | 2011-11-18 | Univ Minnesota | Descelularizacion y recelularizacion de organos y tejidos. |
| CN102159744B (zh) | 2009-06-24 | 2013-05-29 | 日立金属株式会社 | 高温强度优异的发动机阀用耐热钢 |
| EP2333047A1 (en) | 2009-12-09 | 2011-06-15 | Fresenius Medical Care Deutschland GmbH | Adult stem cell derived conditioned medium and/or adult stem cells for use in the therapeutic treatment of a tumor disease |
| EP2363136A1 (en) | 2010-03-02 | 2011-09-07 | Fresenius Medical Care Deutschland GmbH | Microvesicles (MVs) derived from adult stem cells for use in the therapeutic treatment of a tumor disease |
| US9719068B2 (en) | 2010-05-06 | 2017-08-01 | Children's Hospital Medical Center | Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation |
| US8415149B2 (en) * | 2010-05-06 | 2013-04-09 | Gwo Xi Stem Cell Applied Technology Co., Ltd. | Hepatic progenitor cells and uses thereof |
| RU2611361C2 (ru) | 2010-09-01 | 2017-02-21 | Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Миннесота | Способы рецеллюляризации ткани или органа для улучшения приживления трансплантата |
| SG192124A1 (en) | 2011-01-25 | 2013-08-30 | Univ Catholique Louvain | Compositions and methods for cell transplantation |
| EP2806879B1 (en) | 2012-01-25 | 2019-03-06 | Université Catholique de Louvain | Compositions and methods for cell transplantation |
| WO2014055121A1 (en) | 2012-10-05 | 2014-04-10 | Life Technologies Corporation | Markers capable of distinguishing cell pluripotency and uses thereof |
| JP2016513465A (ja) | 2013-03-15 | 2016-05-16 | ミロマトリックス メディカル インコーポレイティド | 膵島細胞の再細胞化のための灌流型脱細胞化肝臓の使用 |
| ES2759228T3 (es) | 2013-07-05 | 2020-05-08 | Univ Catholique Louvain | Medio acondicionado de células madre de hígado de adultos y su uso en el tratamiento de trastornos del hígado |
| JP6643993B2 (ja) * | 2013-12-16 | 2020-02-12 | フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 膵島様細胞構造体及びそれを調製する方法 |
| SG10201801654RA (en) | 2014-05-28 | 2018-04-27 | Childrens Hospital Med Ct | Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation |
| WO2015190522A1 (ja) * | 2014-06-12 | 2015-12-17 | 国立大学法人京都大学 | 内胚葉性幹細胞の製造方法 |
| AU2015331848B2 (en) | 2014-10-17 | 2022-03-03 | Children's Hospital Medical Center, D/B/A Cincinnati Children's Hospital Medical Center | In vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells and methods of making and using same |
| JP7174408B2 (ja) | 2016-02-10 | 2022-11-17 | ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ | 肝線維症のモデル系ならびにその作製および使用方法 |
| CN108779440A (zh) | 2016-03-02 | 2018-11-09 | 鲁汶大学 | 改进的成体肝脏祖细胞制备物 |
| CN109415685B (zh) | 2016-05-05 | 2023-07-04 | 儿童医院医疗中心 | 用于体外制造胃底组织的方法和与其相关的组合物 |
| EP3452100B1 (en) | 2016-05-06 | 2020-12-16 | Unicyte EV AG | Pharmaceutical carriers containing mirnas for use in the treatment of fibrotic diseases caused by hyperglycemia |
| US11278643B2 (en) | 2016-09-06 | 2022-03-22 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Use of resected liver serum for whole liver-engineering |
| EP4553082A3 (en) | 2016-11-04 | 2025-08-20 | Children's Hospital Medical Center | Liver organoid compositions and methods of making and using same |
| EP3548507A4 (en) | 2016-12-05 | 2020-07-15 | Children's Hospital Medical Center | COLON ORGANOIDS AND PROCESSES FOR THE PREPARATION AND USE THEREOF |
| JP7248586B2 (ja) | 2017-04-14 | 2023-03-29 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 複数ドナー幹細胞組成物およびそれを作製する方法 |
| EP3694603B1 (en) | 2017-10-10 | 2026-04-08 | Children's Hospital Medical Center | Esophageal tissue and/or organoid compositions and methods of making same |
| CN111601890B (zh) | 2017-12-14 | 2024-04-19 | 联合细胞Ev股份公司 | 用于治疗肾癌的包含miRNA的药物载体 |
| EP3727394A4 (en) | 2017-12-21 | 2021-09-08 | Children's Hospital Medical Center | DIGITALIZED HUMAN ORGANOIDS AND METHOD OF USING THEREOF |
| WO2019197442A1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-17 | Unicyte Ev Ag | A combination of active ingredients for the treatment of tumor |
| WO2019241499A1 (en) | 2018-06-13 | 2019-12-19 | Miromatrix Medical Inc. | Fistula filler and deployment system |
| EP4678727A3 (en) | 2018-07-26 | 2026-03-11 | Children's Hospital Medical Center | Hepato-biliary-pancreatic tissues and methods of making same |
| US20210238552A1 (en) | 2018-08-10 | 2021-08-05 | Unicyte Ev Ag | Extracellular vesicles loaded with an exogenous molecule |
| WO2020035480A1 (en) | 2018-08-16 | 2020-02-20 | Unicyte Islet Ag | Viable pancreatic islet-like cell structures and a method of preparing thereof |
| CA3112026A1 (en) | 2018-09-12 | 2020-03-19 | Children's Hospital Medical Center | Organoid compositions for the production of hematopoietic stem cells and derivatives thereof |
| US12600943B2 (en) | 2019-02-01 | 2026-04-14 | The University Of Hong Kong | Innervated organoid compositions and methods of making same |
| AU2020283048A1 (en) | 2019-05-31 | 2021-12-23 | Children's Hospital Medical Center | Shaped organoid compositions and methods of making same |
| US12497597B2 (en) | 2019-05-31 | 2025-12-16 | Children's Hospital Medical Center | Methods of generating and expanding hematopoietic stem cells |
| CN113966392A (zh) | 2019-06-10 | 2022-01-21 | 联合细胞Ev股份公司 | 用于降低细胞衰老的来自人肝干细胞的胞外囊泡(hlsc-ev) |
| CN111394391B (zh) * | 2019-07-11 | 2022-12-06 | 上海赛立维生物科技有限公司 | 肝祖细胞样细胞库的构建方法及其制备的细胞株与应用 |
| EP3816276A1 (en) | 2019-10-31 | 2021-05-05 | Unicyte Islet AG | Viable pancreatic islet-like cell structures and a method of preparing thereof |
| CA3175071A1 (en) | 2020-03-11 | 2021-09-16 | Bit Bio Limited | Method of generating hepatic cells |
| CN113999876B (zh) * | 2021-08-31 | 2023-09-05 | 四川大学华西医院 | 一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型及其建立方法和应用 |
| EP4534649A1 (en) | 2023-10-03 | 2025-04-09 | Unicyte AG | A method of qualifying as pharmaceutically active a batch of undifferentiated adult stem cells having the potential to differentiate along the hepatic lineage |
| EP4560009A1 (en) | 2023-11-27 | 2025-05-28 | Cellaïon SA | Method for the preparation of isolated liver-derived cells |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6129911A (en) | 1998-07-10 | 2000-10-10 | Rhode Island Hospital, A Lifespan Partner | Liver stem cell |
| AU779706B2 (en) | 1999-01-19 | 2005-02-10 | University Of North Carolina At Chapel Hill, The | Human liver progenitors |
| US7456017B2 (en) * | 1999-10-01 | 2008-11-25 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Processes for clonal growth of hepatic progenitor cells |
| US20040152095A1 (en) | 2001-05-16 | 2004-08-05 | Naoki Tanimizu | Method of detecting and seperating of undifferentiated liver cellss using dlk |
| CA2463914A1 (en) * | 2001-10-18 | 2003-04-24 | Ixion Biotechnology, Inc. | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
| JP2003208195A (ja) * | 2002-01-16 | 2003-07-25 | Sharp Corp | 連続音声認識装置および連続音声認識方法、連続音声認識プログラム、並びに、プログラム記録媒体 |
| HUE032238T2 (en) * | 2002-03-15 | 2017-09-28 | Univ North Carolina Chapel Hill | Primitive and proximal liver stem cells |
| US20050074876A1 (en) * | 2003-10-03 | 2005-04-07 | Inserm | Bipotential liver cell lines from wild-type mammalian liver tissue |
| CN101550406B (zh) * | 2008-04-03 | 2016-02-10 | 北京大学 | 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途 |
-
2005
- 2005-05-26 WO PCT/IT2005/000303 patent/WO2006126219A1/en not_active Ceased
-
2006
- 2006-05-24 US US11/921,030 patent/US9334479B2/en active Active
- 2006-05-24 DE DE602006017833T patent/DE602006017833D1/de active Active
- 2006-05-24 EP EP06756297A patent/EP1888742B1/en active Active
- 2006-05-24 PL PL06756297T patent/PL1888742T3/pl unknown
- 2006-05-24 CA CA2609523A patent/CA2609523C/en active Active
- 2006-05-24 WO PCT/IT2006/000391 patent/WO2006126236A1/en not_active Ceased
- 2006-05-24 JP JP2008513014A patent/JP5144505B2/ja active Active
- 2006-05-24 CN CN200680026672.3A patent/CN101228266B/zh active Active
- 2006-05-24 AT AT06756297T patent/ATE486126T1/de active
- 2006-05-24 ES ES06756297T patent/ES2355327T3/es active Active
- 2006-05-24 CN CN201310311898XA patent/CN103396989A/zh active Pending
- 2006-05-24 BR BRPI0613375-4A patent/BRPI0613375B1/pt active IP Right Grant
- 2006-05-24 DK DK06756297.5T patent/DK1888742T3/da active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5144505B2 (ja) | 2013-02-13 |
| WO2006126219A1 (en) | 2006-11-30 |
| PL1888742T3 (pl) | 2011-04-29 |
| CA2609523C (en) | 2015-01-06 |
| WO2006126236A1 (en) | 2006-11-30 |
| DK1888742T3 (da) | 2011-01-24 |
| EP1888742B1 (en) | 2010-10-27 |
| ES2355327T3 (es) | 2011-03-24 |
| DE602006017833D1 (de) | 2010-12-09 |
| CN103396989A (zh) | 2013-11-20 |
| CA2609523A1 (en) | 2006-11-30 |
| ATE486126T1 (de) | 2010-11-15 |
| WO2006126219A8 (en) | 2007-02-08 |
| CN101228266B (zh) | 2015-07-29 |
| BRPI0613375B1 (pt) | 2021-07-27 |
| JP2008541717A (ja) | 2008-11-27 |
| EP1888742A1 (en) | 2008-02-20 |
| US9334479B2 (en) | 2016-05-10 |
| CN101228266A (zh) | 2008-07-23 |
| US20100003752A1 (en) | 2010-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BRPI0613375A2 (pt) | células progenitoras do fìgado | |
| JP6990462B2 (ja) | 器官芽 | |
| JP5250423B2 (ja) | 単離肝幹細胞 | |
| Oh et al. | Bone Marrow–Derived Hepatic Oval Cells Differentiate Into Hepatocytes in 2-Acetylaminofluorene/Partial Hepatectomy–Induced Liver Regeneration | |
| Sigal et al. | The liver as a stem cell and lineage system | |
| Banas et al. | Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes | |
| Henderson et al. | Hepatic fibrogenesis: from within and outwith | |
| Russo et al. | The bone marrow functionally contributes to liver fibrosis | |
| Choi et al. | In vitro trans-differentiation of rat mesenchymal cells into insulin-producing cells by rat pancreatic extract | |
| Basma et al. | Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell–derived hepatocytes | |
| Turner et al. | Successful transplantation of human hepatic stem cells with restricted localization to liver using hyaluronan grafts | |
| Kumashiro et al. | Enrichment of hepatocytes differentiated from mouse embryonic stem cells as a transplantable source | |
| Bhang et al. | Mutual effect of subcutaneously transplanted human adipose-derived stem cells and pancreatic islets within fibrin gel | |
| US20140234276A1 (en) | Means and methods for liver regeneration | |
| KR20180114073A (ko) | 향상된 성체 간 전구 세포 제제 | |
| Brückner et al. | A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research | |
| ES2394261T3 (es) | Materiales y métodos relacionados con terapias basadas en células | |
| Huling et al. | Comparing adult renal stem cell identification, characterization and applications | |
| TW201000110A (en) | Method of differentiating mammalian progenitor cells into insulin producing pancreatic islet cells | |
| Lian et al. | Prevention of liver fibrosis by intrasplenic injection of high-density cultured bone marrow cells in a rat chronic liver injury model | |
| El-Hossary et al. | Intravenous vs intraperitoneal transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells from Wharton’s jelly in the treatment of streptozotocin-induced diabetic rats | |
| Furth et al. | Stem cell populations giving rise to liver, biliary tree, and pancreas | |
| Aurich et al. | Functional characterization of serum-free cultured rat hepatocytes for downstream transplantation applications | |
| Kao et al. | Fibronectin suppresses lipopolysaccharide-induced liver damage and promotes the cytoprotection abilities of hepatocyte-like cells derived from human bone marrow mesenchymal stem cells | |
| Schwartz et al. | Hepatic stem cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B07G | Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] | ||
| B12B | Appeal against refusal [chapter 12.2 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 24/05/2006, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO. |