BRPI0613387A2 - anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antìgeno deste e o seu uso, polinucleotìdeo isolado, composição, vetor, célula hospedeira, anticorpo anti-sp35 e método para a produção do mesmo, polipeptìdeo isolado, método in vitro para redução da inibição do crescimento axonal e método in vitro para inibição do crescimento do colapso do cone - Google Patents

anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antìgeno deste e o seu uso, polinucleotìdeo isolado, composição, vetor, célula hospedeira, anticorpo anti-sp35 e método para a produção do mesmo, polipeptìdeo isolado, método in vitro para redução da inibição do crescimento axonal e método in vitro para inibição do crescimento do colapso do cone Download PDF

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Abstract

ANTICORPO ISOLADO OU FRAGMENTO DE LIGAçãO DE ANTIGENO DESTE E O SEU USO, POLINUCLEOTIDEO ISOLADO, COMPOSIçãO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, ANTICORPO ANTI-SP35 E MéTODO PARA A PRODUçãO DO MESMO, POLIPEPTIDEO ISOLADO, MéTODO IN VITRO PARA INIBIçãO DO SINAL DE TRANSDUçãO POR NGRL, MéTODO IN VITRO PARA REDUçãO DA INIBIçãO DO CRESCIMENTO AXONAL E MéTODO IN WTRO PARA INIBIçãO DO CRESCIMENTO DO COLAPSO DO CONE. A presente invenção refere-se a Sp35 endógeno que é um regulador negativo para sobrevivência neuronal, regeneração do axónio, diferenciação oligodendrócita e mielinização (Regulador Negativo). Moíécutas que bíoqueiam a função endógena Sp35, como anticorpos anti-Sp35 podem ser utilizados como terapêutica para o tratamento de disfunção de neurónio e oligodendrócito. A presente invenção fornece anticorpos específicos para Sp35, bem como os métodos de utilização de tais anticorpos como antagonistas da função endógena Sp35. A invenção fornece ainda hibridomas específicos e biblioteca de fagos-derivados monoclonais de anticorpos, ácidos nucléicos que codificam esses anticorpos, e vetores e células hospedeiras compreendendo esses anticorpos. A invenção ainda fornece métodos de promoção de sobrevivência de oligodendrócitos e mielinização em vertebrados, compreendendo administrar a um vertebrado que necessite do referido tratamento uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-Sp35.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOISOLADO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DESTE E OSEU USO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, COMPOSIÇÃO, VETOR, CÉ-LULA HOSPEDEIRA, ANTICORPO ANTI-SP35 E MÉTODO PARA A PRO-DUÇÃO DO MESMO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, MÉTODO IN VITRO PA-RA INIBIÇÃO DO SINAL DE TRANSDUÇÃO POR NGRL, MÉTODO IN Vl-TRO PARA REDUÇÃO DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO AXONAL EMÉTODO IN VITRO PARA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DO COLAPSODO CONE".
O Antecedentes da Invenção
Campo da Invenção
Esta invenção refere-se a neurologia, neurobiologia e biologiamolecular. Mais particularmente, esta invenção refere-se a moléculas e amétodos para o tratamento de doenças, distúrbios e lesões neurológicos talcomo lesão da medula espinhal.
Antecedentes da Invenção
Axônios e dendritos se estendem a partir de neurônios. A extre-midade distai de um prolongamento de axôno ou neurito inclui uma regiãoespecializada, conhecido como o cone de crescimento. Cones de crescimen-to sentem o ambiente local e guiam crescimento axonal em direação a umacélula-alvo do neurônio. Cones de crescimento respondem a sugestões am-bientais, por exemplo, adesividade de superfície, fatores de crescimento,neurotransmissores e campos elétricos. Os cones de crescimento em geralavançam a uma taxa de um a dois milímetros por dia. O cone de cresciemn-to explora a área na frente dele e em qualquer lado, por meio de alongamen-tos classificados como lamelipódios e filopódios. Quando um alongamentocontata uma superfície desfavorável, ele se retira. Quando um alongamentocontata uma superfície de crescimento favorável, ele continha para prolongare guia o cone de crescimento naquela direção. Quando o cone de cresci-mento alcança uma célula-alvo apropriada uma ligação sináptica é criada.
Função da célula nervosa é influenciada por contato entre neu-rônios e outras células em seu ambiente imediato (Rutishauser, e outros,
Segue-se folha 1a1988, Physiol. Rev. 68:819). Essas células incluem células gliais especiali-zadas, oligodendrócitos no sistema nervoso central (CNS), e células de S-chwann em sistema nervoso perférico (PNS), que revestem o axônio commielina (Lemke, 1992, in An Introduction to Molecular Neurobiology, Z. Hall,Ed., p. 281, Sinauer).
Neurônios no CNS têm um potencial inerente para se regenerardepois da lesão, mas eles são inibidos de fazem assim por proteínas inibitó-Segue-se folha 2rias presentes em mielina (Brittis e outros, 2001, Neuron 30:11-14; Jones eoutros, 2002, J. Neurosci. 22:2792-2803; Grimpe e outros, 2002, J. Neuros-Ci.:22:3144-3160).
Várias proteínas inibitórias por mielina encontraram nos oligo-dendrócitos foram caracterizadas. Exemplos conhecidos de proteínas inibitó-rias de milenina incluem NogoA (Chen e outros, Nature, 2000, 403, 434-439;Grandpre e outros, Nature 2000, 403, 439-444), myelin associated glycopro-tein (MAG) (McKerracher e outros, 1994, Neuron 13:805-811; Mukhopadh-yay e outros, 1994, Neuron 13:757-767) e glicoproteína de oligodendrócito(OM-gp), Mikol e outros, 1988, J. CeH Biol. 106:1273-1279). Cada uma des-sas proteínas foi separadamente mostrada ser um Iigante para o receptor-1de Nogo neuronal (NgR1 (Wang e outros, Nature 2002, 417, 941-944;Grandpre e outros, Nature 2000, 403, 439-444; Chen e outros, Nature, 2000,403, 434-439; Domeniconi e outros, Neuron 2002, publicado online em 28 dejunho de 2002).
O receptor-1 de Nogo (NgR1) é uma proteína de membrana an-caroda por GPI que contém 8 repetições ricas em Ieucina (Fournier e outros,2001, Nature 409:341-346). Na interação com proteínas inibitórias (por e-xemplo, NogoA, MAG e OM-gp), o complexo de NgR1 traduz sinais que Ie-vam a cone de crescimento e inibição de crescimento de neurito.
Há uma necessidade não satisfeita por moléculas e métodospara a inibição de colapso de cone de crescimento mediado por NgR1 e ainibição resultante de crescimento de neurito. Adicionalmente há uma ne-cessidade de moléculas que aumentam a sobrevivência neuronal e regene-ração de axônio. Particularmente para o tratamento de doença, distúrbios oulesões que envolvem lesão axonal, morte de célula neuronal ou oligodendró-cito, desmielinação ou dismielinação ou em geral referem-se ao sistema ner-voso.
Tais doenças, distúrbios ou lesões incluem, mas não são Iimita-dos a, esclerose múltipla (MS), Ieucoencefalopatia multifocalprogressiva (P-ML), encefalomielite (EPL), mielólise de pontino central (CPM), adrenoleuco-distrofia, doença de Alexander, doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), cellLeucodistrofia de célula de globóide (doença de Krabbe) e Degeneração deWallerian, neurite ótica, mielite transversa, esclerose amilotrófica lateral(ALS), doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson,lesão da medula espinhal, lesão de cérebro traumático, lesão pós-radiação,complicações neurológicas de quimioterapia, acidente vascular cerebral,neuropatia ótica isquêmica aguda, deficiência de vitamina E, síndrome dedeficiência de vitamina E isolada, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, sín-drome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia tri-geminal, e paralisia de Bell. Entre essas doenças, MS é a mais difundida,que afeta cerca de 2,5 milhões de pessoas mundialmente.
MS em geral começa com um padrão reicindente-remitente deenvolvimento neurológico, que então se desenvolve para uma fase crônicacom dano neurológico crescente. MS está associada à destruição de mieli-na, oligodendrócitos e axônios localizados nas lesões crônicas. A desmieli-nação observada em MS não é já permanente e remielinação foi documen-tada em estágios precoces da doença. Remielinação de neurônios necessitaoligodendrócitos.
Vários tratamentos de modificação de doença estão disponíveispara MS, incluindo o uso de corticosteróides e imunomoduladores tais comointerferon beta e Tysabri®. Além disso, por causa da regra central de oligo-dendrócitos e mielinação em MS, tem havido esforços para desenvolver te-rapias para aumentar números de oligodendrócitos ou aumentam mielina-ção. Vide, por exemplo, Cohen e outros, a patente U.S. nQ 5.574.009; Change outros, N. Engl. J. Med. 346: 165-73 (2002). No entnto, permanece umanecessidade urgente de planejar terapias adicionais para MS e outras dis-túrbios de desmielinação e dismielinação.
Breve Sumário da Invenção
A presente invenção é com base na constatação que Sp35(Sp35 é também designado na literatura como LINGO-1 e LRRN6) é expres-so em oligodendrócitos e células neuronais e negativamente regula a dife-renciação neuronal/oligodendrócito, sobrevivência e mielinação de axônio.Além do mais, certos antagonistas de Sp35 promovem sobrevivência, proli-feração e diferenciação de oligodendrócitos e células neuronais, bem comomielinação de neurônios. Com base nessas constatações, a invenção refere-se em geral a anticorpos, fragmentos de ligação de antígeno ou seus deriva-dos que podem ser usados como um antagonista de Sp35. Adicionalmente,a invenção refere-se a métodos para o tatamento de várias doença, distúr-bios ou lesões associados a desmielinação, dismielinação, morte neuro-nal/oligodendrócito ou lesão axonal pela administração de um anticorpo deantagonista de Sp35 ou fragmento de ligação de antígeno.
Em certas concretizações, a invenção inclui um anticorpo isoladoou seu fragmento de ligação de antígeno que especificamente se liga aomesmo epitopo de Sp35 como um anticorpo monoclonal de referência sele-cionado do grupo que consiste em 201", 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11,2F3, 3P1 D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4,3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12(LiOI)1 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02(Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01(Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563(L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568(L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), and1968 (L1 a. 13).
Certas concretizações da invenção incluem um polipeptídeo iso-lado compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobu-Iina (VH) em que as regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 são selecionadas dasseqüências de polipeptídeos mostradas na tabela 4 ou pelo menos 80%,85%, 90 ou 95% idênticas às seqüências de polipeptídeos mostradas na ta-bela 4.
Certas concretizações da invenção incluem um polipeptídeo iso-lado compreendendo uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina(VL) em que as regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 são selecionadas das se-qüências de polipeptídeos mostradas na tabela 5 ou pelo menos 80%, 85%,90% ou 95% idênticas às seqüências de polipeptídeos mostradas na tabela 5.Certas concretizações da invenção incluem um polipeptídeo iso-lado compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobu-lina (VH) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158 a 172,372, 376, 380 e 384, como mostradas na tabela 6, ou pelo menos 80%,85%, 90% ou 95% idênticas às ditas SEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380e 384 como mostradas na tabela 6.
Certas concretizações da invenção incluem um polipeptídeo iso-lado compreendendo uma região variável de cadeia leva de imunoglobulina(VL) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373,377, 381 e 385, como mostradas na tabela 8, ou pelo menos 80%, 85%,90% ou 95% idênticas às ditas SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381 e385, como mostradas na tabela 8.
Em concretizações adicionais, a invenção inclui um polinucleotí-deo isolado compreendendo uma ácido nucléico que codifica uma regiãovariável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) em que as regiões deCDR1, CDR2 e CDR3 são selecionadas do grupo de seqüências de polinu-cleotídeos mostradas na tabela 4 ou pelo menos 80%, 85%, 90 ou 95% idên-ticas às seqüências de polinucleotídeos mostradas na tabela 4.
Em outras concretizações, a invenção inclui um polinucleotídeoisolado compreendendo uma ácido nucléico que codifica uma região variávelde cadeia leva de imunoglobulina (VL) em que as regiões de CDR1, CDR2 eCDR3 são selecionadas das seqüências de polinucleotídeos mostradas natabela 5 ou pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências depolinucleotídeos mostradas na tabela 5.
Outras concretizações da invenção incluem, um polinucleotídeoisolado compreendendo um ácido nucléico que codifica uma região variávelde cadeia pesada de imunoglobulina (VH) selecionada do grupo que consis-te em SEQ ID NOs: 173 a 184, 370, 374, 378 e 382, como mostradas natabela 7, ou pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às ditas SEQ IDNOs: 173 a 184, 370, 374, 378 e 382, como mostradas na tabela 7.
Outras concretizações da invenção incluem, um polinucleotídeoisolado compreendendo uma ácido nucléico que codifica an região variávelde cadeia leva de imunoglobulina (VL) selecionada do grupo que consisteem SEQ ID NOs: 185 a 194, 371, 375, 379 e 383, como mostradas na tabela9, ou pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às ditas SEQ ID NOs:185 to 194, 371, 375, 379 e 383, como mostradas na tabela 9.
Em certas concretizações, a invenção inclui composições com-preendendo os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno descritosaqui.
Em concretizações adicionais, a invenção inclui métodos de tra-tamento de lesão do CNS, ALS, doença de Huntington, doença de Alzhei-mer, doença de Parkinson, neuropatia diabética e acidente vascular cerebralcompreendendo a administração a um animal que necessita do dito trata-mento de uma quantidade eficaz de um agente selecionado do grupo queconsiste em um anticorpo de Sp35 isolado ou seu fragmento ou composi-ções compreendendo o dito anticorpo ou seu fragmento.
Em outras concretizações, a invenção inclui métodos para o tra-tamento de doença ou distúrbios associados a inibição de diferenciação oucrescimento de oligodendrócito; desmielinação ou dismielinação de neurô-nios no CNS incluindo esclerose múltipla (MS), Ieucoencefalopatia multifocalprogressiva (PML), encefalomielite (EPL), mielolise de pontina central(CPM), Degeneração de Wallerian, adrenoleucodistrofia, doença de Alexan-der, e doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ) por administração a um ani-mal que necessita do dito tratamento de uma quantidade eficaz de um agen-te selecionado do grupo que consiste em um anticorpo de Sp35 isolado ouseu fragmento ou composições compreendendo o dito anticorpo ou seufragmento.
Outras concretizações da presente invenção incluem um métodode inibição de transdução de sinal por receptor 1 de Nogo (NgR1), compre-endendo o contato do NgR1 com uma quantidade eficaz de um agente sele-cionado do grupo que consiste no anticorpo de Sp35 isolado ou seu frag-mento ou composições compreendendo o dito anticorpo ou seu fragmento.
Concretizações adicionais da presente invenção incluem um mé-todo de diminuição de inibição de crescimento axonal de um neurônio dosistema nervoso central (CNS)1 compreendendo o contato do neurônio comuma quantidade eficaz de um agente selecionado do grupo que consiste noanticorpo de Sp35 isolado ou seu fragmento ou composições compreenden-do o dito anticorpo ou seu fragmento.
Outras concretizações da presente invenção incluem um métodode inibição de colapso de cone de crescimento de um neurônio do CNS,compreendendo o contato do neurônio com uma quantidade eficaz de umagente selecionado do grupo que consiste no anticorpo de Sp35 isolado ouseu fragmento ou composições compreendendo o dito anticorpo ou seufragmento.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1: Gel de SDS-PAGE que mostra imunoprecipitação deSp35 por anticorpos monoclonais 1A7 e 2F3.
Figura 2: Resultado de FACS que mostra que MAbs 1A7 e 2F3se Iigarri a células de COS-7 ou 293 que expressam Sp35, mas não paracontrolar células com nenhuma expressão de Sp35.
Figura 3: Neurônios DRG protegidos por MAbs 1A7 e 2F3 contrainibição mediada por mielina de crescimento de neurito.
Figura 4A-G: Manchamento imunoistoquímico ("IHC") de co-culturas de neurônios de DRG e oligdendrócitos tratados com anticorposmonoclonais 1A7 e 2F3, ou anticorpo de controle. Painéis DeE são alarga-mentos de painéis B e C1 respectivamente. Manchamento com um anticorpode anti-3lll-tubulina para identificar axônios, ou anticorpo de anti-MBP paraidentificar oligodendrócitos. F: Quantificação de células de mielinação deMBP+ no tratamento de co-culturas com 1A7 ou 2F3. G: análise de Westernblot para quantificar o MBP produzido a partir do co-culturas de neurônios deDRG e oligodendrócitos tratados com anticorpos monoclonais 1A7 e 2F3.
Figura 5A-C: A: manchamento de anticorpo de CC1 dos oligo-dendrócitos de camundongo em modelo de cuprizona. B. Manchamento deproteína de Anti-MBP ou de Iuxol fast blue de neurônios de camundongo emmodelo de cuprizonal. C: Quantificação de oligodendrócitos positivos de an-ticorpo de CC1 a quatros semanas e 6 semanas.Figura 6: Sobrevivência de RGCs. Tratamento com animais tra-tados com anticorpo moncoclonal 1A7 Anti-Sp35 anticorpo 1A7 mostraramsobrevivência neuronal significativa (80%) quando comparado com anticorpode controle ou mais tratados com PBS, que cada um apenas mostrou cercade 50% de sobrevivência neuronal.
Figura 7. Classificações de BBB de camundongos que recebemanticorpo de anti-Sp35 1A7 depois de lesão de medula espinhal como des-crito no exemplo 8.
Figura 8. Western blot de oligodendrócitos co-cultivados e DRGsdepois da incubação com anticorpo de anti-Sp35 Li05, Li06 and 3, 10 e 30mg de Sp35-Fc (LINGO-1 -Ig) como descrito no exemplo 9.
Figura 9. Fotografias dos nervos óticos de A) ratos normais; B)ratos com encefalomielite autimune experimental (EAE) induzida por glico-proteína de oligodendrócito de mielina (MOG); e C) ratos com encefalomieli-te auto-imune experimental (FAE) induzida com glicoproteína de oligoden-drócito de mielina (MOG) tratados com o anticorpo de Sp35 1A7. Micrografi-as eletrônicas de cada nervo ótico são mostradas abaixo cada fotografia donervo ótico.
Figura 10. Gráfico do número de fibras neuronais regenerativaspor seção contado em animais que recebem uma injeção intravítrea do anti-corpo Sp35 1A7 depois da trituração no nervo ótico.
Descrição Detalhada da Invenção
Definições
Deve ser observado que o termo de entidade "um" ou "uma" re-fere-se a uma ou mais daquelas entidades; por exemplo, "um anticorpo deSp35", é entendido como representando um ou mais anticorpos de Sp35.Como tais, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" po-dem ser usados intercambeavelmente aqui.
Como usado aqui, o termo "polipeptídeo" destina-se a incluir um"polipeptídeo" singular bem cumo plural "polipeptídeos", e refere-se a umamolécula constituída de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados porligação de amida (também conhecido como ligações de peptídeo). O termo"polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais ami-noácidos e não refere-se a um comprimento específico do produto. Assim,peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia deaminoácido", ou qualquer outro termo usado para referir-se a uma cadeia oucadeias de dois ou mais aminoácidos, são incluídos dentro da definição do"polipeptídeo" e o termo "polipeptídeo" pode ser usado ao invés de, ou inter-cambeavelmente com qualquer um desses termos. O termo "polipeptídeo"também destina-se a referir-se aos produtos de modificações pós-expressãodo polipeptídeo incluindo sem limitação glicosilação, acetilação, fosforilação,amidação, derivatização por grupos de bloqueamento/proteção conhecidos,clivagem proteolítica ou modificação por aminoácidos de ocorrência natural.Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produ-zido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzida deuma seqüência de ácidos nucléicos designada . Pode ser gerada de qual-quer modo, incluindo por síntese química.
Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cercade 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2,000 oumais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensionaldefinida, são chamdos de dobrados, e polipeptídeos que não possuem umaestrutura tridimensional definida, mas certamente pode adotar um númerogrande de conformações diferentes, e são chamadas de não dobradas. Co-mo usado aqui, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada apelo menos uma porção de carboidrato que está ligado à proteína via umacadeia lateral contendo nitrogênio ou contendo oxigênio de um resíduo ami-noácido, por exemplo, resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.
Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante, ou seuderivado destina-se a um polipeptídeo que não está em seu meio natural.Nenhum nível particular de purificação é necessário. Por exemplo, um poli-peptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Pro-teínas e polipeptídeos recombinantemente produzidos expressos em célulashospedeiras são considerados isolados para a finalidade da invenção, comosão polipeptídeos nativos ou recombinante que foram separados, fraciona-dos ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquer técnicaadequada.
Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção sãofragmentos, derivados, análogos, ou variantes dos polipeptídeos expostosacima, e qualquer sua combinação. O termos "fragmento", "variante", "deri-vado" e "análogo" quando referindo-se a anticorpo de Sp35 ou polipeptídeosde anticorpo da presente invenção incluem quaisquer polipeptídeos que re-têm pelo menos algumas das propriedades de ligação de antígeno dos poli-peptídeo ou anticorpo nativo correspondente. Fragmentos de polipeptídeosda presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmen-tos de deleção, além de fragmentos de anticorpo específicos dicutidos emoutro lugar aqui. Variantes de anticorpos de Sp35 e polipeptídeos de anti-corpo da presente invenção incluem fragmentos como descritos acima, etambém polipeptídeos com seqüências de aminoácidos alteradas devido assubstituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Variantes pode ocor-rer naturalmente ou ser de ocorrência não natural. Variantes de ocorrêncianão natural podem ser produzidas usando-se técnicas de mutagênese co-nhecidas na técnica. Polipeptídeos de variante podem compreender adições,deleções ou substituições de aminoácidos não conservadores ou conserva-dores. Derivados de anticorpos de Sp35 e polipeptídeos de anticorpo dapresente invenção, são polipeptídeos que foram alterados de modo a exibircaracterísticas adicionais não encontrem no polipeptídeo nativo. Exemplosincluem proteínas de fusão. Polipeptídeos de variante podem também serchamados aqui de "análogos de polipeptídeo". Como usado aqui um "deri-vado" de um anticorpo de Sp35 ou polipeptídeo de anticorpo refere-se a umpolipeptídeo objeto tendo um ou mais resíduos quimicamente derivatizadospor reação de um grupo lateral funcional. Também incluídos como "deriva-dos" são aqueles peptídeos que contêm um ou mais derivados de ocorrêncianatural dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo, 4-hidroxiprolina podeser usada como substituto de prolina; 5-hidroxilisina pode ser usada comosubstituto de lisina; 3-metilistidina pode ser usada como substituta de histidi-na; homosserina pode ser usada como substituto de serina; e ornitina podeser usada como substituta de lisina.
O termo "polinucleotídeo" destina-se a incluir um ácido nucléicosingular bem como plural ácidos nucléicos, e refere-se a um construto oumolécula de ácido nucléico isolado, por exemplo, RNA de mensageiro (mR-NA) ou DNA de plasmídio (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreenderuma ligação de fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional(por exemplo, uma ligação de amida, tais como encontrados em ácidos nu-cléicos de peptídeo (PNA)). O termo "ácido nucléico" refere-se a qualquerum ou mais segmentos de ácido nucléico, por exemplo, fragmentos de DNAou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por "polinucleotídeo ou ácidonucléico "isolado" destina-se a uma molécula de ácido nucléico, DNA ouRNA, que foi removido de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polipeptí-deo recombinante que codifica um anticorpo de Sp35 contido em um vetor éconsiderado isolado para as finalidades da presente invenção. Outros exem-plos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantesmantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos (parcial-mente ou substancialmente) purificados em solução. Moléculas de RNA iso-ladas incluem RNA in vitro ou in vivo transcritos de polinucleotídeos da pre-sente invenção. Ácidos nucléicos ou polinucleotídeos isolados de acordocom a presente invenção ulteriormente incluem tais moléculas produzidassinteticamente. Além disso, polinucleotídeo ou um ácido nucléico pode serou pode incluir elemento regulatório tal como um promotor, sítio de ligaçãode ribosima ou um terminador de transcrição.
Como usado aqui, uma "região de codificação" é uma porção deácido nucléico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Emboraum "códon de parada" (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um ami-noácido, pode ser considerado ser parte de uma região de codificação, masquaisquer seqüências de flaqueamento, por exemplo, promotores, sítios deligação de ribossoma, terminadores transcritivos, íntrons, e similares, nãosão parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codifica-ção da presente invenção podem estar presentes em um construto de poli-nucleotídeo simples, por exemplo, em um vetor simples, ou em construtosde polinucleotídeo separados, por exemplo, nos vetores separados (diferen-tes). Além do mais, qualquer vetor pode conter uma região de codificaçãosimples, ou pode comprender duas ou mais regiões de codificação, por e-xemplo, um vetor simples separadamente codificam uma região variável decadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável de cadeia leve deimunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo, ou ácido nucléico dainvenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, ou fundidas ounão fundidas a um ácido nucléico que codifica um anticorpo de Sp35 oufragmento, variante ou seu derivado. Regiões de codificação heterólogasincluem sem limitação elementos e pedaços especializados, tal como umpeptídeo de sinal secretório ou um domínio funcional heterólogo.
Em certas concretizações, o polinucleotídeo ou ácido nucléico éDNA. No caso de DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nu-cléico que codifica polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ououtros elementos de controle de transcrição ou tradução operavelmente as-sociados a uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operável équando uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo,um polipeptídeo, está associado a uma ou mais seqüências reguladoras detal modo que para colocar expressão do produto de gene sob a influência oucontrole da(s) seqüência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tal co-mo região que codifica polipeptídeo e um promotor associado com o mesmo)são "operavelmente associados" se indução de função de promotor resultana transcrição de mRNA que codifica o produto de gene desejado e se anatureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não intefere com acapacidade das seqüências reguladoras de expressão para dirigir a expres-são do produto de gene ou interferir com a capacidade do modelo de DNA aser transcrito. Assim, uma região de promotor estaria operavelmente associ-ada a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo se o promotor fossecapaz de efetuar transcrição daquele ácido nucléico. O promotor pode serum promotor específico de célula que dirige transcrição substancial do DNAapenas em células predeterminadas. Outros elementos de controle transcri-ção, além de um promotor, por exemplo, aumentadores, operadores, repres-sores, e sinais de terminação de transcrição, podem ser operavalmente as-sociados com o polinucleotídeo à transcrição específica de célula direto.Promotores e outras regiões de controle de transcrição adequados são reve-lados aqui.
Uma variedade de regiões de controle de transcrição são conhe-cidos por aqueles versados na técnica. Esses incluem, sem limitação, regi-ões de controle de transcrição que funcionam em células de vértebra, taiscomo, mas não limitadas a, segmentos aumentadores e promotores de cito-megalovírus (o promotor anterior precoce, em combinação com íntron-A),vírus 40 de símio (o promotor precoce), e retrovírus (tal como o vírus de sar-coma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelesderivados de genes de vértebra tais como actina, proteína de choque térmi-co, hormônio de crescimento de bovino e beta-globina de coelho, bem comooutras seqüências capazes de controlar expressão de gene nas células eu-carióticas. Regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluemaumentadores e promotores específicos de tecido bem como promotoresinduzíveis de Iinfocina (por exemplo, promotores induzíveis por interferonsou interleucinas).
Similarmente uma variedade de elementos de controle de trans-crição são conhecidos por aqueles versados na técnica. Esses incluem, masnão são limitados a sítios de ligação de ribosima, iniciação de tradução ecódons de terminação, e elementos derivados de piconavírus (particularmen-te um sítio de entrada de ribossoma interno ou IRES, são também chamadosde uma seqüência de CITE).
Em outras concretizações, um polinucleotídeo da presente in-venção é RNA, por exemplo, na forma de RNA de mensageiro (mRNA).
Regiões de codificação de ácido nucleíco e polinucleotídeo dapresente invenção podem ser associados a regiões de codificação adicionaisque codificam peptídeos secretórios ou de sinal, que dirigem a secreção deum polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Deacordo com a hipótese de sinal, proteína secretadas por células de mamíferotêm uma seqüência líder secretória ou peptídeo de sinal que é clivada daproteína madura uma vez que exportam da cadeia de proteína de cresci-mento através da retículo endoplasmático rugoso foi iniciado. Aqueles ver-sados na técnica estão cientes que polipeptídeos secretados por células devértebra em geral têm um peptídeo de sinal fundido ao N-terminal do poli-peptídeo, que é clivado do polipeptídeo de "comprimento total" ou completopara produzir uma forma "madura" secretada do polipeptídeo. Em certasconcretizações, o peptídeo de sinal nativo, por exemplo, um peptídeo de si-nal de cadeia leve ou de cadeia pesada de imunoglobulina é usado, ou umderivado funcional daquela seqüência que retém a capacidade de dirigir se-creção do polipeptídeo que é operavelmente ligada a ele. Alternativamente,um peptídeo de sinal de mamífero heterólogo, ou um seu derivado funcional,pode ser usado. Por exemplo, uma seqüência líder de tipo selvagem podeser substituída com uma seqüência líder de ativador de plasminogênio detecido humano (TPA) ou beta-glucoronidase de camundogo.
A presente invenção refere-se a certos anticorpos de Sp35, oufragmentos de ligação de antígeno, variantes ou seus derivados. A não serque especificamente refere ri ndo-se a anticorpo de tamanho total tais comoanticorpos de ocorrência natural, o termo "anticorpos de Sp35" inclui anticor-po de tamanho total bem como fragmentos de ligação de antígeno, varian-tes, análogos e derivados de tais anticorpos, por exemplo, moléculas de i-munoglobulina ou anticorpo de ocorrência natural ou moléculas de anticorpoengenheiradas ou fragmentos que ligam antígeno de um modo similar a mo-léculas de anticorpo.
Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados intercam-beavelmente aqui. Um anticorpo ou uma imunoglobulina compreende pelomenos um domínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compre-ende pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeialeve. Estruturas de imunoglobulina básicas em sistemas vertebrados sãorelativamente bem-entendidos. Vide, por exemplo, Harlow e outros, Anticor-pos: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988).Como será discutido em mais detalhes abaixo, o termo "imuno-globulina" compreende várias amplas classes de polipeptídeos que podemser distinguidas bioquimicamente. Aqueles versados na técnica apreciarãoque cadeias pesadas são classificadas gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, (γ,μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre elasm (por exemplo, γ1-γ4). É anatureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM1IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isoti-pos), por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. são bem-caracterizadase são conhecidas como conferindo especialização funcional. Versões modifi-cadas de cada uma dessas classes e isotipos são prontamente discerníveispelo técnico versado em virtude da presente revelação e, correspondente-mente, estão dentro do escopo da presente invenção. Todas as classes deimunoglobulina estão claramente dentro da escopo da presente invenção, aseguinte discussão em geral refere-se à classe de IgG de moléculas de imu-noglobulina. Com relação a IgG, uma molécula de imunoglobulina padrãocompreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos de peso molecularde cerca de 23.000 Dáltons, e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticosde peso molecular de 53.000-70.000. As quatro cadeias são tipicamente u-nidas por ligações de dissulfeto em uma configuração de "Y" em que as ca-deias leves agrupam as cadeias pesadas que partem na entrada do "Y" eque continuam através da região variável.
Cadeias leves são classificadas ou kappa ou Iambda (κ, λ). Ca-da classe de cadeia pesada pode ser ligado com uma cadeia leve kppa oulambda. Em geral, as cadeias pesadas e leves estão covalentemente ligadasentre si, e as porções "finais" duas cadeias pesadas estão ligadas entre sipor ligações de dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quanto asimunoglobulinas são geradas ou por hibridomas, célula B ou células hospe-deiras geneticamente engenheiradas. Na cadeia pesada, as seqüências deaminoácidos passam de um N-terminal nas extremidades bifurcadas da con-figuração Y para o C-terminal no fundo de cada cadeia.
Tanto cadeias pesadas quanto cadeias leves são divididas emregiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variá-vel" são usados funcionalmente. A este respeito, será apreciado que os do-mínios variáveis tando das porções de cadeia leve (Vl) quando pesada (Vh)determinam especificidade e reconhecimento de antígeno. De modo inverso,os domínios constantes da cadeia leve (Cl) e a cadeia pesada (CH1, CH2 orCh3) conferem propriedades biológicas importantes tais como secreção,mobilidade transplacental, ligação de receptor de Fc, ligação de complemen-to e similares. Por convenção da numeração dos domínios de região cons-tantes acumenta quando elas se tornam mais distais a partir do sítio de liga-ção de antígeno ou amino-teminal do anticorpo. A porção N-terminal é umaregião variável na porção C-terminal é uma região constante; os domínios deCh3 e Cl realmente compreendem o carbóxi-terminal da cadeia pesada ecadeia leve, respectivamente.
Como indicado acima, a região variável permite que o anticorposeletivamente reconheça e especificamente ligue epitopos nos antígenos.Isto é, o domínio Vl e domínio VH, ou subconjunto das regiões de determina-ção de complementaridade (CDRs)1 de um anticorpo se combinam para for-mar a região variável que define um sítio de ligação de antígeno tridimensio-nal. Esta estrutura de anticorpo quaternária forma o sítio de ligação de antí-geno presente no fim de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio deligação de antígeno é definido por três CDRs em cada uma das cadeias deVh e VL. Em alguns casos, por exemplo, certas moléculas de imunoglobulinaderivadas da espécie camelid ou engenheiradas com base em imunoglobuli-nas de camelid, uma molécula de imunoglobulina completa pode consistirapenas em cadeias pesadas, com nenhuma cadeia leve. Vide, por exemplo,Hamers-Casterman e outros, Nature 363:446-448 (1993).
Em anticorpos de ocorrência natural, as seis "regiões de deter-minação de complementaridade" ou "CDRs" presentes em cada domínio deligação de antígeno são seqüências não contíguas, curtas de aminoácidosque estão especificamente posicionadas para formar o domínio de ligaçãode antígeno uma vez que o anticorpo assume sua configuração tridimensio-nal em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos no domínio deligação de antígenos, chamadas de regiões de "estrutura", mostram menosvariabilidade intra-molecular. As regiões da estrutura grandemente adotamuma conformação de folha β e as CDRs formam laços que se ligam, e emalguns casos fazem parte da estrutura de folha β. Assim, regiões da estrutu-ra agem para formar uma armação que provê o posicionamento das CDRsem orientação correta por interações não covalentes, inter-cadeia. O domí-nio de ligação de antígeno formado pelas CDRs posicionadas define umasuperfície complementar ao epitopo no antígeno imunorreativo. Esta superfí-cie complementar promove a ligação não covalente do anticorpo a seu epi-topo cognato. Os aminoácidos compreendendo as CDRs e as regiões daestrutura, respectivamente, podem ser prontamente identificadas para qual-quer região variável de cadeia leve ou de cadeia pesada por aquele versadona técnica, uma vez que elas foram precisamente definidas (vide, "Seqüên-cias of Proteínas of Immunological lnterest," Kabat, E., e outros, U.S. De-partment of Health and Human Services, (1983); e Chothia and Lesk, J. Mol.Biol., 196:901-917 (1987), que são incorporados aqui por referência em suastotalidades).
No caso onde há duas ou mais definições de um termo que éusado e/ou é aceito dentro da técnica, a definição do termo como usado aquidestina-se a incluir todos tais significados a não ser que explicitamente afir-mado ao contrário. Um exemplo específico é o uso do termo "região de de-terminação de complementaridade" ("CDR") para descrever os sítios decombinação de antígeno não contíguos encontrados dentro da região variá-vel de tanto polipeptídeos de cadeia leve quanto de cadeia pesada. Esta re-gião particular foi descrita por Kabat e outros, U.S. Dept. of Health and Hu-man Services, "Seqüências of Proteínas of Immunological lnterest" (1983) epor Chothia e outros, J. Mol. Bioi 196:901-917 (1987), que são incorporadosaqui por referência, onde as definições incluem sobreposição ou subconjun-tos de resíduos de aminoácido quando comparados entre si. No entanto,aplicação de qualquer definição para referir-se a uma CDR de um anticorpoou suas variantes destinam-se a estar dentro do escopo do termo como de-finido e usado aqui. Os resíduos de aminoácido apropriados que incluem asCDRs como definidas por cada uma das referências relatadas acima sãoindicadas abaixo na tabela I como uma comparação. O números de resíduoexato que incluem uma CDR particular variará dependendo da seqüência edo tamanho da CDR. Aqueles versados na técnica podem rotineiramentedeterminar que resíduos compreendem uma CDR particular dada a seqüên-cia de aminoácidos de região variável do anticorpo.
TABELA 1 - Definições de CDR1
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1 Numeração da totalidade de definições de CDR na Tabela 1 esta de acordocom as convenções de numeração indicadas por Kabat e outros (vide abaixo).Kabat e outros também definiram um sistema de numeração pa-ra as seqüências de domínio variáveis que é aplicável a qualquer anticorpo.
Aquele versado na técnica pode não ambiguamente designar esse sistemade "numeração de Kabat" para qualquer seqüência de domínio variável, semconfiança sobre quaisquer dados experimentais pertencem a própria se-qüência. Como usado aqui, "numeração de Kabat" refere-se ao sistema denumeração indicado por Kabat e outros,, U.S. Dept. of Health and HumanServices, "Seqüência of Proteínas of Immunological Interest" (1983). A nãoser que de outra maneira eespecíficoada, referências à numeração de posi-ções de resíduo de aminoácido específicas em um anticorpo de Sp35 oufragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado da presenteinvenção estão de acordo com com o sistema de numeração de Kabat.
Na espécie de camelid, a região variável de cadeia pesada,chamada de VhH, forma o domínio de ligação de antígeno total. As principaisdiferenças entre regiões variáveis de VhH de camelid e aquelas derivadas deanticorpos convencionais (Vh) incluem (a) aminoácidos mais hidrofóbicos nasuperfície de contato de cadeia leve de Vh quando comparados com a regi-ão correspondente em VhH, (b) uma CDR3 mais longa em VhHi e (c) a ocor-rência freqüente de uma ligação de dissulfeto entre CDR1 e CDR3 em VhH.
Anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ouseus derivados da invenção incluem, mas não são limitados a, anticorpospoliclonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primati-zados ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentação de ligaçãode epitopo, por exemplo, Fab, Fab1 e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia simples(scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligados com dissulfeto (sdFv),fragmentos compreendendo ou um domínio Vl ou Vh, fragmentos produzi-dos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos antiidiotípicos (an-ti-ld) (incluindo, por exemplo, anticorpos de anti-ld até anticorpos de Sp35revelados aqui). Moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descri-tas, por exemplo, na patente U.S. n9 5.892.019. Moléculas de anticorpo ouimunoglobulina da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG,IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), classes (por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4,IgAI e lgA2) ou subclasses de molécula de imunoglobulina.
Anticorpo fragmentos, incluindo anticorpos de cadeia simples,podem compreender uma região(ões) variável(éis) sozinha ou em combina-ção com a totalidade ou uma porção da seguinte: região principal, domíniosde Ch1, Ch2, e Ch3. Também incluídos na invenção são fragmentos de liga-ção de antígeno também compreendendo qualquer combinação de regi-ão(ões) variável (éis) com uma região principal, domínios de CH1, CH2, eCh3. Anticorpos ou seus fragmentos imunoespecíficos para o uso nos méto-dos de diagnóstico e terapêutico revelados aqui pode ser de qualquer origemanimal incluindo pássaros e mamíferos. De preferência, os anticorpos sãoanticorpos de humano, camundongo, asno, coelho, cabra, porquinho-da-índia, camelo, lhama, cavalo, ou galinha anticorpos. Em uma outra concreti-zação, a região variável pode ser de origem condrictóide (por exemplo, ori-undo de tubarões). Como usado aqui, anticorpos "humanos" incluem anti-corpos tendo a seqüência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana eincluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humanas ou deanimais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e quenão expressam imunoglobulinas endógenas, como descrita infra e, por e-xemplo, na patente U.S. ne 5.939.598 por Kucherlapati e outros
Como usado aqui, o termo "porção de cadeia pesada" inclui se-qüências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobuli-na. A polipeptídeo compreendendo a porção de cadeia pesada compreendepelo menos um de: um domínio de CH1, um domínio principal (por exemplo,região principal superior, de meio, e/ou inferior), um domínio CH2, um domí-nio de Ch3, ou uma variante ou seu fragmento. Por exemplo, um polipeptí-deo de ligação para o uso na invenção pode compreender uma cadeia depolipeptídeo empreendendo um domínio de CH1; uma cadeia de polipeptídeocompreendendo um domínio de CH1, pelo menos uma porção de um domí-nio principal, e um domínio de CH2; uma cadeia de polipeptídeo compreen-dendo um domínio de Ch 1 e um domínio de CH3; uma cadeia de polipeptí-deo compreendendo um domínio de Ch1, pelo menos uma porção de umdomínio principal, e um domínio de CH3, ou uma cadeia de polipeptídeocompreendendo um um domínio de CH1, pelo menos uma porção de umdomínio principal, um domínio de CH2, e um domínio de CH3. Em uma outraconcretização, um polipeptídeo da invenção compreende uma cadeia de po-lipeptídeo compreendendo um domínio de CH3. Além disso, um polipeptídeode ligação para o uso na invenção pode carecer de pelo menos uma porçãode um domínio de CH2 (por exemplo, a totalidade ou parte de um domínio deCh2). Como indicado acima, será entendido por aquele versado na técnicaque esses domínios (por exemplo, a porção de cadeia pesadas) podem sermodificados de modo que eles variem em seqüência de aminoácidos da mo-lécula de imunoglobulina de ocorrência natural.
Em certos anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de an-tígeno, variantes, ou seus derivados revelados aqui, as porções de cadeiapesada de uma cadeia de polipeptídeo de um multímero são idênticas àque-Ias em uma segunda cadeia de polipeptídeo do multímero. Alternativamente,monômeros contendo porção de cadeia pesada da invenção não são idênti-cos. Por exemplo, cada monômero pode compreender um sítio de ligação-alvo diferente, formando, por exemplo, um anticorpo específico.
As porções de cadeia pesada de um polipeptídeo de ligação pa-ra o uso no método de diagnóstico e do tratamento revelados aqui podemser derivadas de moléculas de imunoglobulina diferentes. Por exemplo, aporção de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domíniode CH1 derivado de uma molécula de IgGI e uma região principal derivadade uma molécula de lgG3. Em um outro exemplo, a porção de cadeia pesa-da pode compreender uma região principal derivada, em parte, de uma mo-lécula de IgGI e, em parte, de uma molécula de lgG3. Em um outro exem-pio, uma porção de cadeia pesada pode compreender um derivado quiméri-co principal, em parte, de uma molécula de IgG e, em parte, de uma molécu-la de lgG4.
Como usado aqui, o termo "porção de cadeia leve" inclui se-qüências de aminoácidos derivadas de uma imunoglobulina cadeia leve. Depreferência, a porção de cadeia leve compreende pelo menos um de umdomínio de Vl ou Cl.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados revelados aqui podem ser descritos ou especifica-dos em termos do(s) epitopo(s) ou porção(ões) de um antígeno, por exem-pio, um polipeptídeo-alvo (Sp35) que eles reconhecem ou especificamentese ligam. A porção de um polipeptídeo-alvo que especificamente interagecom o domínio de ligação de antígeno de um anticorpo é um "epitopo," ouum "determinante antigênico." Um polipeptídeo-alvo pode compreender umepitopo simples, mas tipicamente compreende pelo menos dois epitopos, epodem incluir qualquer número de epitopos, dependendo do tamanho, daconformação e do tipo de antígeno. Além do mais, seria observado que um"epitopo" em um polipeptídeo-alvo pode ser ou incluir elementos de não po-lipeptídeo, por exemplo, um "epitopo pode incluir uma cadeia lateral de car-boidrato.
O tamanho mínimo de um epitopo de polipeptídeo ou de peptí-deo para um anticorpo é pensado ser cerca de quatro a cinco aminoácidos.Epitopos de peptídeo ou de polipeptídeo de preferência contêm pelo menossete, mais de preferência pelo menos nove e mais de preferência entre pelomenos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Uma vez que uma CDR po-de reconhecer um polipeptídeo ou peptídeo antigênico em sua forma terciá-ria, os aminoácidos compreendendo um epitopo precisa não ser contíguo, eem alguns casos, podem ainda não estar na mesma cadeia de peptídeo. Napresente invenção, epitopo de polipeptídeo ou de peptídeo reconhecido poranticorpos de Sp35 da presente invenção contém uma seqüência de pelomenos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, mais de preferênciapelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20,pelo menos 25, ou entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos contíguosou não contíguos de Sp35.
Por "especificamente liga," em geral quer dizer que um anticorpose liga a um epitopo via seu domínio de ligação de antígeno, e que a ligaçãovincula alguma entrada de complementaridade entre o domínio de ligação deantígeno e o epitopo. De acordo com essa definição, um anticorpo é dito"especificamente se ligar" a um epitopo quando ele se liga àquele epitopo,via seu domínio de ligação de antígeno mais prontamente do que se ligariaum epitopo não relacionado, aleatório. O termo "especificidade" é usado aquipara qualificar a afinidade relativa pela qual um certo anticorpo se liga a umcerto epitopo. Por exemplo, anticorpo "A" pode ser considerado ter uma es-pecificidade mais alta para um dado epitopo do que o anticorpo "B," ou oanticorpo "A" pode ser dito se ligar a epitopo "C" com uma especificidademais alta do que tem para epitopo "D" relacionado.
Por "de preferência se liga," quer dizer que o anticorpo especifi-camente se liga a um epitopo mais prontamente do que ele se ligaria a umepitopo relacionado, similar, homólogo ou análogo. Assim, um anticorpo que"de preferência se liga" a um dado epitopo seria mais provável se ligar àque-le epitopo do que um epitopo relacionado, embora tal anticorpo possa reagircruzadamente com o epitopo relacionado.
A título de exemplo não limitante, um anticorpo pode ser consi-derado ser considerado ligar um primeiro epitopo de preferência se ele ligaro dito primeiro epitopo com uma constante de dissociação (K0) que é menosdo que o Kd de anticorpo para o segundo epitopo. Em um outro exemplo nãolimitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro antígeno depreferência se ele ligar o primeiro epitopo com uma afinidade que é pelomenos uma ordem de magnitude de menos do que o Kq de anticorpo para osegundo epitopo. Em um outro exemplo não limitante, um anticorpo pode serconsiderado ligar um primeiro epitopo de preferência se ele ligar o primeiroepitopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitudemenor do que o Kd de anticorpo para o segundo epitopo.
Em um outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser con-siderado ligar um primeiro epitopo de preferência se ele ligar o primeiro epi-topo com uma taxa "off" (k("off")) que é menor do que o k("off") de anticorpopara o segundo epitopo. Em um outro exemplo não limitante, um anticorpopode ser considerado ligar um primeiro epitopo de preferência Se ele ligar oprimeiro epitopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magni-tude menor do que o k("off") de anticorpo para o segundo epitopo. Em umoutro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar umprimeiro epitopo de preferência se ele ligar o primeiro epitopo com uma afi-nidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menor do que o kfoff")de anticorpo para o segundo epitopo.
Um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno, variante,ou derivado revelado aqui pode ser dito ligar um polipeptídeo-alvo reveladoaqui ou um fragmento ou sua variante com uma taxa "off" (k("off") de menosdo que ou igual a 5 X 10"2 sec"1, 10"2 sec"1, 5 X IO'3 sec"1 ou IO'3 sec"1. Mais depreferência, um anticorpo da invenção pode ser dito ligar um polipeptídeo-alvo revelado aqui ou um fragmento ou sua variante com uma taxa "off"(k("off")) menos do que ou igual a 5 X 10'4 sec"1, 10"4 sec"1, 5 X 10"5 sec"1, ou10"5 sec"1 5 X 10"6 sec"1, 10"6 sec"1, 5 X 10"7 sec"1 ou 10'7 sec"1.
Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ouderivado revelado aqui pode ser dito ligar um polipeptídeo-alvo revelado aquiou um fragmento ou sua variante com uma taxa "on" (k("on") de mais do queou igual a 103 M"1 sec"1, 5 X 103 M"1 sec"1, 104 M"1 sec"1 ou 5 X 104 M"1 sec"1.Mais de preferência, um anticorpo da invenção pode ser dito ligar um poli-peptídeo-alvo revelado aqui ou um fragmento ou sua variante com uma taxa"on" (k("on")) mais do que ou igual a 105 M'1 sec1, 5 X 105 M"1 sec"1, 106 M-1sec'1, or 5 X 106 M'1 sec"1 or 107 M1 sec'1.
Um anticorpo é dito competitivamente inibir ligação de um anti-corpo de referência a um dado epitopo se ele de preferência se liga àqueleepitopo a extensão que ele bloqueia, a algum grau, ligação do anticorpo dereferência ao epitopo. Inibição competitiva pode ser determinada por qual-quer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios de ELISA competi-ção. Um anticorpo pode ser dito competitivamente inibir ligação do anticorpode referência a um dado epitopo por pelo menos 90%, pelo menos 80%, pe-lo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%.
Como usado aqui, o termo "afinidade" refere-se a uma medidada resistência da ligação de um epitopo individual com uma CDR de umamolécula de imunoglobulina. Vide, por exemplo, Harlow e outros, Anticorpos:A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)nas páginas 27-28. Como usado aqui, o termo "avidez" refere-se à estabili-dade total do complexo entre uma população de imunoglobulinas e um antí-geno, isto é, uma resistência de combinação funcional de uma mistura deimunoglobulina com o antígeno. Vide, por exemplo , Harlow nas páginas 29-34. Avidez está relacionada com quanto as afinidade de moléculas de imu-noglobulina individuais na popualção com epitopos específicos, quanto tam-bém as valências das imunoglobulinas e dos antígeno. Por exemplo, a inte-ração entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma es-trutura de epitopo de alta repetição, tal como um polímero, seria uma de altaavidez.
Anticorpos de Sp35 ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes ou seus derivados da invenção podem também ser descritos ou espe-cificados em termos de sua reatividade cruzada. Como usado aqui, o termo"reatividade cruzada" refere-se à capacidade de um anticorpo, específicopara um antígeno, para reagir com um segundo antígeno; uma medida derelacionamento entre duas substâncias antigênicas diferentes. Assim, umanticorpo é cruzadamente reativo se ele se ligar a um epitopo outro que nãoaquele que induziu sua formação. O epitopo cruzadamente reativo em geralcontém muitas das mesmas características estruturais complementares co-mo a indução de epitopo, e em alguns casos, pode realmente se ajustar me-lhor do que o original.
Por exemplo, certos anticorpos têm algum grau de reatividadecruzada, pelo fato de que eles ligam epitopos relacionados, mas não idênti-cos, por exemplo, epitopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelomenos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo me-nos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50% de identi-dade (como calculado usando-se métodos conhecidos na técnica e descritosaqui) a um epitopo de referência. Um anticorpo pode ser dito ter pouca ounenhuma reatividade cruzada se ele não se ligar epitopos com menos doque 95%, menos do que 90%, menos do que 85%, menos do que 80%, me-nos do que 75%, menos do que 70%, menos do que 65%, menos do que60%, menos do que 55%, e menos do que 50% de identidade (como calcu-lado usando-se métodos conhecidos na técnica e descritos aqui) a um epito-po de referência. Um anticorpo pode ser considerado "altamente específico"para um certo epitopo, se ele não ligar qualquer outro análogo, ortólogo, ouhomólogo daquele epitopo.
Anticorpos de Sp35 ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes ou seus derivados da invenção podem também ser descritos ou espe-cificados em termos da sua afinidade de ligação a um polipeptídeo da inven-ção. Afinidades de ligação preferidos incluem aqueles com uma constantede dissociação ou Kd menor do que 5 χ 10'2M, 10'2M, 5 χ 10"3M, 10"3M, 5 χ10'4M, 10"4M, 5 χ 10"5M, 10"5M, 5 Χ 10"6M, 10"6M, 5 Χ 10"7M, 10'7M, 5X10"8M1 10"8M, 5 χ IO9M1 10"9M, 5 Χ 10"10M, 10"10M, 5 Χ 10"11 M, 10"11M,5X10"12 M, 10"12 M, 5 χ 10"13 M, 10"13 M, 5 χ 10"14 M1 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Anticorpos de Sp35 ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes ou seus derivados da invenção podem ser "multiespecífico," por e-xemplo, biespecífico, triespecífico ou mais multiespecificidade, significandoque ele reconhece e se liga a dois ou mais epitopos diferentes presentes emum ou mais antígenos diferentes (por exemplo, proteínas) ao mesmo tempo.Assim, se um anticorpo de Sp35 é "monoespecífico" ou "multiespecífico," porexemplo, "biespecífico," refere-se ao número de epitopos diferentes com osquais um polipeptídeo de ligação reage. Anticorpos multiespecíficos podemser específicos para epitopos diferentes de um polipeptídeo-alvo descritosaqui e podem ser específicos para um polipeptídeo-alvo bem como para umepitopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heterólogo ou um material desuporte sólido.
Como usado aqui o termo "valência" refere-se ao número dedomínios de ligação potenciais, por exemplo, domínios de ligação de antíge-no, presentes em um anticorpo de Sp35, anticorpo ou polipeptídeo de liga-ção. Cada domínio de ligação especificamente liga um epitopo. Quando umanticorpo de Sp35, anticorpo ou polipeptídeo de ligação compreende maisdo que um domínio de ligação, cada domínio de ligação pode especifica-mente se ligar o mesmo epitopo, para um anticorpo com dois domínios deligação, chamado "monoespecífico bivalente," ou a epitopos diferentes, paraum anticorpo com dois domínios de ligação, chamado "biespecífico bivalen-te." Um anticorpo pode ser biespecífico e bivalente para cada especificidade(chamado "anticorpos biespecíficos tetravalentes"). Em uma outra concreti-zação, domínio ou minicorpos tetravalentes deletavam anticorpos podem serfeitos.
Anticorpos bivalentes biespecíficos e métodos de produção de-les, são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. nos. 5.731.168;5.807.706; 5.821.333; e a publicação do pedido de U.S. Nos. 2003/020734and 2002/0155537, cujas revelações são incorporadas aqui por referência.Anticorpos tetravelentes bioespecíficos, e métodos de produção deles sãodescritos, por exemplo, nos WO 02/096948 e WO 00/44788, cuja ambas asrevelações são incorporadas por referência aqui. Vide em geral, publicaçõesde PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt eoutros, J. Immunol. 147:60-69 (1991); U.S. Pat. Nos. 4.474.893; 4.714.681;4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny e outros, J. Immunol. 148:1547-1553(1992).
Como anteriormente indicado, as estruturas de subunidades econfiguração tridimensional das regiões constantes das várias classes deimunoglobulina são bem-conhecidas. Como usado aqui, o termo "domínio deVh" inclui o domínio variável amino terminal de uma cadeia pesada de imu-noglobulina e o termo "domínio de Ch1" inclui o primeiro domínio de regiãoconstante (mais amino terminal) de uma cadeia pesada de imunoglobulina.
O domínio de CH1 é adjacente ao domínio de Vh e é amino terminal à regiãoprincipal de uma molécula de cadeia pesada de imunoglobulina.
Como usado aqui o termo "domínio de Ch2" inclui a porção deuma molécula de cadeia pesada que se prolonga, por exemplo, de cerca deresíduo 244 a resíduo 360 de um anticorpo usando-se esquemas de nume-ração convencionais (resíduos 244 a 360, Kabat sistema de numeração; eresíduos 231-340, sistema de numeração EU; vide Kabat EA e outros op. cit.
O domínio de Ch2 é único pelo fato de que ele não está proximamente em-parelhado com um outro domínio. Um tanto, duas Cadeias de carboidratoramificadas N-Iigadas são interpostas entre os dois domínios de Ch2 de umamolécula de IgG nativa intacta. É também bem documentado que o domínioCH3 se prolonga do domínio de CH2 ao C-terminal da molécula de IgG ecompreende cerca de 108 resíduos.
Como usado aqui, o termo "região principal" inclui a porção deuma molécula de cadeia pesada que une o domínio de ChI ao domínio deCh2. Esta região principal compreende cerca de 25 resíduos e é flexível, as-sim permitindo as duas regiões de ligação de antígeno N-terminal para mo-ver independentemente. Regiões principais podem ser subdivididas em trêsdomínios distintos: domínios principais superiores, do meio e inferior (Roux eoutros, J. Immunol. 161:4083 (1998)).
Como usado aqui o termo "ligação de dissulfeto" inclui a ligaçãocovalente formada entre dois átomos de enxofre. A cisteína de aminoácidocompreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte de dissul-feto com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG de ocor-rência natural, as regiões de ChI e Cl são ligadas por uma ligação de dissul-feto e as duas cadeias pesadas estão ligadas por duas ligações de dissulfetonas posições que correspondem a 239 e 242 usando-se o sistema de nume-ração de Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração de EU).
Como usado aqui, o termo "anticorpo quimérico" será mantidapara significar qualquer anticorpo em que o sítio ou região imunorreativo éobtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que podeser intacta, parcial ou modificada de acordo com a presente invenção) é ob-tido a partir de uma segunda espécie. Em concretizações preferidas o sítioou região de ligação-alvo será de uma fonte não humana (por exemplo, ca-mundongo ou primata) e a região constante é humana.
Como usado aqui, o termo "anticorpo engenheirado" refere-se aum anticorpo em que o domínio variável ou na cadeia leve e pesada ou am-bas é alterado por pelo menos substituição parcial de uma ou mais CDRs deum anticorpo de especificidade conhecida e, se necessário, por substituiçãode região de estrutura parcial e mudança de seqüência. Embora as CDRspossam ser derivadas de uma anticorpo da mesma classe ou ainda subclas-se como o anticorpo a partir do qual as regiões da estrutura são derivadas, éconsiderado que as CDRs serão derivadas de uma anticorpo de classe dife-rente e de preferência de um anticorpo de uma espécie diferente. Um anti-corpo engenheirado em que uma ou mais CDRs de "doador" de um anticor-po não humano de especificidade conhecida é enxertado para dentro deuma região de estrutura de cadeia leve ou de cadeia pesada humana échamado aqui de um "anticorpo humanizado." Pode não ser necessáriosubstituir a totalidade das CDRs com as CDRs completas da região variávelde doador para transferir a capacidade de ligação de antígeno de um domí-nio variável entre si. Um tanto, pode apenas ser necessário transferir aque-les resíduos que são necessários para manter a atividade do sítio de liga-ção-alvo. Dadas as explicações indicadas em, por exemplo, as patentes U.S.Nos. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762, e 6.180.370, estará bem dentro dacompetência daqueles versados na técnica, ou por realização de experimen-tação rotineira ou por testagem de erro ou experiência para se obter um an-ticorpo humanizado ou engenheirado funcional.
Como usado aqui o termo "polipeptídeo adequadamente dobra-do" inclui polipeptídeos (por exemplo, anticorpos de Sp35) em que todos osdomínios funcionais compreendendo o polipeptídeo são distintivamente ati-vos. Como usado aqui, o termo "polipeptídeo inadequadamente dobrado"inclui polipeptídeos em que pelo menos um dos domínios funcionais do poli-peptídeo não é ativo. Em uma concretização, um polipeptídeo adequada-mente dobrado compreende cadeias de polipeptídeo ligadas por pelo menosuma ligação de dissulfeto e, de modo inverso, um polipeptídeo inadequada-mente dobrado compreende cadeias de polipeptídeo não ligado por pelomenos uma ligação de dissulfeto.
Como usado aqui o termo "engenheirado" inclui manipulação demoléculas de polipeptídeo ou de ácido nucléico por meio sintético (por e-xemplo, por técnicas recombinantes, síntese de peptídeo in vitro, por aco-plamento enzimático ou químico de peptídeos ou alguma combinação des-sas técnicas).
Como usado aqui, os termos "ligado," "fundido" ou "fusão" sãousados intercambeavelmente. Esses termos referem-se à união entre si dedois elementos ou componentes, por qualquer que seja o meio incluindoconjugação química ou meio recombinante. Uma "fusão em quadro" refere-se à união de dois ou mais quadros de leitura abertos de polinucleotídeo(ORFs) para formar um ORF mais Iingo contínuo, de modo que mantém oquadro de leitura transcritivo correto do ORFs original. Assim, uma proteínade fusão recombinante é uma proteína simples contendo dois ou mais seg-mentos que correspondem a polipeptídeos codificados pelos ORFs originais(segmentos esses que não são normalmente assim encontrados na nature-za.) Embora o quadro de leitura é assim produzido contínuo através de todoos segmentos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou especial-mente separdaos por, por exemplo, seqüência Iigadora em quadro. Por e-xemplo, polinucleotídeos que codificam as CDRs de uma região variável deimunoglobulina podem ser fundidas, em quadro, mas são separadas por umpolinucleotídeo que codifica pelo menos uma região de estrutura de imuno-globulina ou regiões de CDR adicionais, contanto que as CDRs "fundidas"sejam co-traduzidas como parte de um polipeptídeo contínuo.
No contexto de polipeptídeos, uma "seqüência linear" ou uma"seqüência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em um aminopara diretação carboxila terminal em que resíduos que são vizinhos entre sina seqüência são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo.
O termo "expressão" como usado aqui refere-se a um processopelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um RNAou polipep-tídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional dogene dentro da célula incluindo, sem limitação, inativação de gene bem co-mo tanto expressão transitória quanto expressão estável. Inclui sem limita-ção transcrição do gene em RNA de mensageiro (mRNA), RNA de transfe-rência (tRNA), RNA de grampo pequeno (shRNA), RNA de interferência pe-queno (siRNA) ou qualquer outro produto de RNA, e a tradução de tal mRNAem polipeptídeo(s). Se o produto final for um bioquímico, expressão inclui acriação daquele bioquímico e quaisquer precursores. Expressão de um geneproduz um "produto de gene." Como usado aqui, um produto de gene podeser ou um ácido nucléico, por exemplo, um RNA de mensageiro produzidopor transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é traduzido a partir dotranscrito. Produtos de gene descritos aqui ulteriormente incluem ácidos nu-cléicos com pós-modificações transcritivas, por exemplo, poliadenilação, oupolipeptídeos como modificações transcritivas, por exemplo, metilação, gli-cosilação, a adição de lipídios, associação com outras subunidades de pro-teína, clivagem proteolítica e similares.
Como usado aqui, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-setanto um tratamento terapêutico quanto profilático ou medidas preventivas,em que o objetivo é prevenir ou diminuir (reduzir) umo distúrbio ou mudançafisiológica não desejada, tal como a progressão de esclerose múltipla. Resul-tados benéficos ou clínicos desejados incluem, mas não são limitados a, alí-vio de sintomas, diminuição da extensão de doença, estado de doença esta-bilizada (isto é, não piorar), atraso ou retardar a progressão da doença, me-lhoramento ou paliação do estado da doença, e remissão (se parcial ou to-tal), se detectável ou indectável. "Tratamento" pode também significar so-brevivência prolongada quando comparada com a sobrevivência esperadase não receber o tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluemaqueles já com a condição ou distúrbio bem como aqueles propensos a ter acondição ou distúrbio ou aqueles em que a condição ou distúrbio deve serprevenida.
Por "indivíduo" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "ma·mífero," quer se dizer qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo ma-mífero, para quem diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Indivíduosmamíferos incluem seres humanos, animais domésticos, animais de fazen-da, e zoo, esportes, ou animais de estimação tais como cachorros, gatos,cobaias, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas e assim pordiante.
Como usado aqui, frases tal como "um indivíduo que se benefi-ciaria da administração de um anticorpo de Sp35" e "um animal que necessi-ta de tratamento" inclui indivíduos, tais como indivíduos mamíferos, que sebeneficiariam da administração de um anticorpo de Sp35 usados, por exem-pio, para a detecção de um polipeptídeo de Sp35 (por exemplo, para umprocedimento de diagnóstico) e/ou do tratamento, isto é, paliação ou preven-ção de uma doença tal como MS, com um anticorpo de Sp35. Como descritoem mais detalhes aqui, o anticorpo de Sp35 pode ser usado em forma nãoconjugada ou pode ser conjugado, por exemplo, a um fármaco, pró-fármacoou um isótopo.
II. Sp35
Sp35 de ser humano de ocorrência natural (Sp35) é uma proteí-na específica do sistema nervoso central glicosilada que é prevista ter 614aminoácidos (SEQ ID NO: 2), incluindo uma seqüência de sinal de 33 ami-noácidos. Sp 35 é também conhecido na técnica pelos nomes LINGO-1,LRRN6, LRRN6A, FLJ14594, LERN1, MGC17422 e UNQ201. O polipeptí-deo de Sp35 de tipo selvagem de comprimento total, humano contém umdomínio de LRR que consiste em 14 repetições ricas em Ieucina (incluindocoberturas N- e C-terminais), um domínio de Ig, uma região de transmem-brana, e um domínio citoplásmico. O domínio citoplásmico contém um sítiode fosforilação de tirosina canonical. Além disso, a proteína de Sp35 de o-corrência natural contém uma seqüência de sinal, uma região básica curtaentre o domínio de Ig e LRRCT, e uma região de transmembrana entre the odomínio de Ig e o domínio citoplásmico. O gene de Sp35 gene humano(SEQ ID NO:1) contém códons de início de tradução alternativos, de modoque seis aminoácidos adicionais, isto é, MQVSKR (SEQ ID NO: 3) pode oupode não estar presente no N-terminal da seqüência de sinal de Sp35. Tabe-la 2 lista os domínios de Sp35 e outras regiões, de acordo com número deresíduo de aminoácido, com base na seqüência de aminoácidos de Sp35apresentada aqui como SEQ ID NO: 2. O polipeptídeo de Sp35 é caracteri-zado em mais detalhes na publicação de PCT Ne WO 2004/085648, que éincorporada aqui por referência em sua totalidade.
TABELA 2 - Domínio-Sp35
<table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table>
Distribuição de tecido e expressão de desenvolvimento de Sp35foi estudo em seres humanos e ratos. Biologia de Sp35 foi estudada em ummodelo de animal experimental animal (rato). Expressão de Sp35 rato estálocalizado em neurônios e oligodendrócitos, como determinados por man-chamento imuno-histoquímico e northern blot. Nível de expressão de mRNAde Sp35 de rato é regulado a partir do seu desenvolvimento, selecionadologo após o nascimento, isto é, cerca de pós-natal de um dia. Em um modelode lesão de transecção de medula espinhal de rato, Sp35 é regulado paracima no sítio de lesão, como determinado por RT-PCR. Vide Mi e outros Na-fure Neurosci. 7:221-228(2004).
No contexto dos aminoácidos compreendendo os vários domí-nios estruturais e funcionais de um polipeptídeo de Sp35, o termo "cerca de"inclui o valor particularmente relatado e valores maiores ou menores por vá-rios aminoácidos (por exemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1). Uma vez quea localização desses domínios como listados na Tabela 1 foram previstospor computador gráfico, aquele versado apreciaria que os resíduos de ami-noácidos que constituem os domínios podem variar levemente (por exemplo,por cerca de 1 a 15 resíduos) dependendo dos critérios usados para definir odomínio.
Os inventores têm revelados que Sp35 de tipo selvagem, decomprimento total se liga a NgR1. Vide a Publicação de PCT N9 WO2004/085648. Os inventores também revelavam que Sp35 é expresso emoligodendrócitos e que a proteína de Sp35 está envolvida na regulação demielinação mediada por oligodendrócito de axônios. Vide a Publicação dePatente U.S. N9 2006/0009388 A1, que é incorporada aqui por referência emsua totalidade.
A seqüência de nucleotídeos para a molécula de Sp35 de com-primento total é como se segue:
ATGCTGGCGGGGGGCGTGAGGAGCATGCCCAGCCCCCTCCTGGCCTGCTGGCAGCCCATCCTCCT^
tgctgggctcagtgctgtcaggcrcxsgccacgggctgcccgccccgctccgagtg^
CGCTGTGCTGTGCC^CCGCAAGCGCTTTGTGGCAGTCCCCGAC^CATCCCCACCGAGACG€GCCTG<^
GACCTAGGCAAGAACCGCATCAAAACGOTCAACCAGGACGAGTTCGCCAGCTTCCCXSCACCT^^
tggagctcaacgagaacatcgtgagcgccgtggagcccggcgccttcaacaacct
gctgggtctccücagc^ccgcctgaagctcatcccgctaggcgtcra
AAG<nH3GACATCAGCGAGAACAftGATTGTTATCCTGCTGGACTACATC
AGTCACTGG&GGTTGGCC^CAATGAC^
GGAGCAGCTGÃCGCTGGAGAAATGCAACCTGACCTCCATCCCCAC^
CTCMCGTCCTCAGGCTCCGGC^CCTCAACOT
GACTCAAGGTCTTGGAGATCTCCGftCTOGKX
CAACCTGACOTCCCTGTCCÁTC&CAC^CTGCAATCTGA
GTCTATCTCCGCTTCCTC^CCTCTCCTACAACCC^
TGCTCCGGCTCCAGGAGATCCAGCTGGTGGGCGGGCAGCTGGCCGTCGTGGAGCCCTATGCC^
CCTCAACTACCTGCGCGTGCTCAATGTCTCTGGCAACCAGCTGACCACACTGGAGGAATC^^
TCGGTGGGCAACCTGGAGACACTC^TCCTGGACTCCAACCCGC^
TGTTCCGGCGCCGCTGGCGGCTCAACTTCAACCGGCAGCTlGCCCACGTGCGCC^
gggcaaggagttcaaggactcccctgatgtgctactgccgsactacct
CGGGACCGCAAGGCCCAGCAGGTGTTTCTGGACGAGGGCCÃCACT
GCGACCCGCCGCCCGCC^TCCTCrGGCTCTCACCCCGAAAGCACCTGGTCTCAGCCAAGA
GCTCACAGTCTTCCCrGATGGCACGCriOGAGGTGCGCTACGCCCAGGTA^
tccatcgcggccaacgcgggckkjcaacgactccatgcccocccacctgca
ACTGGCCCCATCAGCCCAA<^GACCTTCGCTTTCATCTCC^
CACCCGCGCCACTGTGCCTTTCCCCTTCGAC^TCAAGA
TCTTTCCTGGGCGTCGTCCTCTTCTGCCTÇ^TGCTGCTGTT^
AGCACAAGATCGAGATCGAGTATGTCCGCCGAAAGTCGGACBC^GGCATCAGOT
CAAGTTCAACATGAAGATGATATGA (SEQIDN0:1).
A seqüência de polipeptídeos para o polipeptídeo de Sp35 decomprimento total é como se segue:
MIAGGVRSMPSPLLACWQPILLLVLGSVLSGSATGCPPRCECSAQDRAVLCHRKRFVAVPEGIPTETRLLDIiGKNRIKTmODEFASFPHLBBLEUiENIVSAVE PGAFHNLPNLRIXGLRSNRLKLIPLGVFrGLSNLTKI^ISENKIVILlXDYMFODLYNLKSLEVGDNDLWISHRAPSGLNSLEOLTLEKCNLTSIPTEALSH^GLIVLRLRHmimiRDYSFKRLYRL
VRHLVYLRFLNLSYNPISTIEGSMLHELLRI^EIQLVGGQLAVVEPYAFRGI^LRVLNVSGNQLTTLEESVFHSVGNLETLILDSNPIACDCRLLWFRRRWR^
CRÍIARIRDRKAQQVFVDEGHTVQFVCRAIXSDPPPAILWLSPRKHLVSAKSNGRLWFPDGTLE VRYAQ^QDNGT YLCIAANAGGNDSMPAHLHVRSYS PDWPHQPNKTFAFISNQPGEGEANSTRATVPFPFDIKTLIIATTMGFISPLGWLFCLVLLFLWSRGKGNTKHKIEIEYVPRKSDAGISSADAPRKFNMKMI (SEQ EDNO:2).
III. Anticorpos de Sp35
Em uma concretização, a presente invenção refere-se um anti-corpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seusderivados. Por exemplo, a presente invenção inclui pelo menos os domíniosde ligação de antígeno de certos anticorpos monoclonais, e fragmentos, va-riantes, e seus derivados mostram nas Tabelas 3A e 3B.
Tabela 3A descreve as regiões do polipeptídeo de Sp35 que es-tão Iiagadas por certos anticorpos derivados de biblioteca de fago de com-primento total. Esses anticorpos têm as mesmas regiões variáveis como osfragmentos de Fab derivados de Biblioteca-1 de Exibição de Fago, comoindicado na tabela 3B (por exemplo D05 na tabela 3A tem a mesma regiãovariável como Li05 na tabela 3B, D06 na tabela 3A tem a mesma região va-riável como Li06 na tabela 3B, etc.)· Os anticorpos foram testados quanto aligação de fragmentos de Sp35 como definidos na tabela 3A, usando-se mé-todos bem-conhecidos na técnica.
Tabela 3B descreve a capacidade dos chamados anticorposmonoclonais ou fragmentos de Fab para detectar Sp35 em vários ensaiostais como: Classificação de Célula Ativada Fluorescente (FACS), Imunopre-cipitação (IP), análise de Western blot, Imunoistoquímica (IHC) e Ensaio I-munossorvente Ligado a Enzima (ELISA). Protocolos descritos para essesensaios são descritos aqui ou são bem-conhecidos e entendidos por aquelesversado comum na técnica. Anticorpos monoclonais derivados de hibridomalistados na tabela 3B foram produzidos por injeção de Sp35 solúvel paradentro de camundongos e então foram isolados usando-se tecnologia dehibridoma que é bem-conhecida na técnica e descrita aqui. Anticorpos mo-noclonais e fragmentos de Fab de anticorpo listados na tabela 3B foram iso-lados de duas bibliotecas de exibição de faao diferentes usando-se técnicasconhecidas na área.TABELA 3A
<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table>Como usado aqui, o termo "domínio de ligação de antígeno" in-clui um sítio que espeicficamente liga um epitopo em um antígeno (por e-xemplo, um epitopo de Sp35). O domínio de ligação de antígeno de um anti-corpo tipicamente inclui pelo menos uma porção de uma região variável decadeia pesada de imunoglobulina e pelo menos uma porção de uma regiãovariável de cadeia leve de imunoglobulina. O sítio de ligação formado poressas these regiões variáveis determina a especificidade do anticorpo.
A presente invenção mais especificamente refere-se a um anti-corpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante ou seus deri-vados, onde o anticorpo de Sp35 se liga ao mesmo epitopo como um anti-corpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6,1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7,3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9,30-C12 (LiO'1), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05),34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10),30-B01 (Li 11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1),3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567(L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1 a. 10), 3571 (L1a.11), 3582(L1a.12), e 1968 (L1a.13).
A invenção ulteriormente refere-se a um anticorpo de Sp35, oufragmento de ligação de antígeno, variante ou seus derivados, onde o anti-corpo de Sp35 competitivamente inibe um anticorpo monoclonal selecionadodo grupo que consiste em 201", 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3,3P1 D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9,3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01(Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07(Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03(Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564(L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569(L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), e 1968 (L1a.13) a par-tir da ligação a Sp35.
A invenção também refere-se a um anticorpo de Sp35, ou frag-mento de ligação de antígeno, variante ou seus derivados, onde o anticorpode Sp35 compreende pelo menos a região de ligação de antígeno de umanticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em 2013A3, 3A6,1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7,3P2C9.2G4, 3P4A6.1 D9, 3Ρ4Α1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1 D8, 3P4C8.2G9,30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05),34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10),30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1),3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567(L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582(L1a.12), e 1968 (L1a.13).
Em certas concretizações, a presente invenção refere-se a umanticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivadoque especificamente ou de preferência se liga a um fragmento ou um domí-nio de polipeptídeo de Sp35 particular. Tais fragmentos polipeptídeo deSp35 incluem, mas não são limitados a, um polipeptídeo de Sp35 compre-endendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em aminoácidos 34a 532; 34 a 417; 34 a 425; 34 a 493; 66 a 532; 66 a 417; 66 a 426; 66 a493;66 a 532;417 a 532; 417 a 425 (a região básica de Sp35); 417 a 493;417 a 532;, 419 a 493 (a região de Ig de Sp35);, ou 425 a 532 de SEQ IDNO: 2; ou um polipeptídeo de variante de Sp35 de pelo menos 70%, 75%,80%, 85%, 90%, ou 95% idênticos a aminoácidos 34 a 532; 34 a 417; 34 a425; 34 a 493; 66 a 532; 66 a 417; 66 a 426; 66 a 493; 66 a 532; 417 a 532;417 a 425 (a região básica de Sp35); 417 a 493; 417 a 532; 419 a 493 (aregião de Ig de Sp35); ou 425 a 532 de SEQ ID NO: 2
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certosanticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus deriva-dos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àquelesfragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindoem uma ou mais repetições ricas em Ieucina (LRR) de Sp35. Tais fragmen-tos, incluem, por exemplo, fragmentos compreendendo, consistindo essenci-almente em, ou consistindo em aminoácidos 66 a 89; 66 a 113; 66 a 137; 90a 113; 114 a 137; 138 a 161; 162 a 185; 186 a 209; 210 a 233;, 234 a 257;258 a 281; 282 a 305; 306 a 329; ou 330 a 353 de SEQ ID NO: 2. Fragmen-tos correspondentes de um polipeptídeo de Sp35 variante de pelo menos70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idênticos a aminoácidos 66 a 89; 66 a113; 90 a 113; 114 a 137; 138 a 161; 162 a 185; 186 a 209; 210 a 233; 234 a257; 258 a 281; 282 a 305; 306 a 329; ou 330 a 353 de SEQ ID NO: 2 sãotambém completados.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certosanticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus deriva-dos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àquelesfragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindoem uma ou mais regiões ricas em cisteína que flaqueiam a LRR de Sp35.Tais fragmentos, incluem, por exemplo, um fragmento compreendendo, con-sistindo essencialmente em, ou consistindo em aminoácidos 34 a 64 de SEQID NO: 2 (a região de flaqueamento de LRR N-terminal (LRRNT)), ou umfragmento compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindoem aminoácidos 363 a 416 of SEQ ID NO: 2 (a região de flanqueamentoLRR C-terminal (LRRCT)), aminoácidos. Fragmentos correspondentes deum polipeptídeo de Sp35 variante de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%,90%, ou 95% idênticos a aminoácidos 34 a 64 e 363 a 416 de SEQ ID NO: 2são também contemplados.
Como conhecido na técnica, "identidade de seqüência" entredois polipeptídeos é determinada por comparação da seqüência de aminoá-cidos de um polipeptídeo com a seqüência de um segundo polipeptídeo.Quando discutido aqui, se qualquer polipeptídeo particular é pelo menoscerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticos a um outro polipeptí-deo pode ser determido o uso de métodos e programas/software de compu-tado conhecidos na técnica tais como, mas não limitado a, a programaBESTFIT (Wisconsin Seqüência Analysis Package, versão 8 for Unix, Gene-tics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madi-son, Wl 53711). BESTFIT usa um algoritmo de homologia local de Smith eWaterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encon-trar o melhor segmento de homologia entre duas seqüências. Quando douso de BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de seqüênciapara determinar se uma seqüência particular é, por exemplo, 95% idênticosa uma seqüência de referência de acordo com a presente invenção, os pa-râmetros são ajustados, naturalmente, tal que a percentagem de identidadeseja calculada sobre o comprimento total da seqüência de polipeptídeos dereferência e que lacunas em homologia de até 5% do número total de ami-noácidos na seqüência de referência são permitidas.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certosanticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus deriva-dos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àquelesfragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindoem aminoácidos 41 a 525 de SEQ ID NO: 2; 40 a 526 de SEQ ID NO: 2; 39a 527 de SEQ ID NO: 2; 38 a 528 de SEQ ID NO: 2; 37 a 529 de SEQ IDNO: 2; 36 a 530 de SEQ ID NO: 2; 35 a 531 de SEQ ID NO: 2; 34 a 531 deSEQ ID NO: 2; 46 a 520 de SEQ ID NO: 2; 45 a 521 de SEQ ID NO: 2; 44 a522 de SEQ ID NO: 2; 43 a 523 de SEQ ID NO: 2; e 42 a 524 de SEQ IDNO: 2.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 ainda adicionais aos quaiscertos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seusderivados da presente invenção bind incluem, mas não são limitados àque-les fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consis-tindo em aminoácidos 1 a 33 de SEQ ID NO: 2; 1 a 35 de SEQ ID NO: 2; 34a 64 de SEQ ID NO: 2; 36 a 64 de SEQ ID NO: 2; 66 a 89 de SEQ ID NO: 2;90 a 113 de SEQ ID NO: 2; 114 a 137 de SEQ ID NO: 2; 138 a 161 de SEQID NO: 2; 162 a 185 de SEQ ID NO: 2; 186 a 209 de SEQ ID NO: 2; 210 a233 de SEQ ID NO: 2; 234 a 257 de SEQ ID NO: 2; 258 a 281 de SEQ IDNO: 2; 282 a 305 de SEQ ID NO: 2; 306 a 329 de SEQ ID NO: 2; 330 a 353de SEQ ID NO: 2; 363 a 416 de SEQ ID NO: 2; 417 a 424 de SEQ ID NO: 2;419 a 493 de SEQ ID NO: 2; e 494 a 551 de SEQ ID NO: 2.
Além disso ainda, fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quaiscertos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seusderivados da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitadosàqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em aminoácidos 1 a 33 de SEQ ID NO: 2; 1 a 35 de SEQ ID NO:2; 1 a 64 de SEQ ID NO: 2; 1 a 89 de SEQ ID NO: 2; 1 a 113 de SEQ ID NO:2; 1 a 137 de SEQ ID NO: 2; 1 a 161 de SEQ ID NO: 2; 1 a 185 de SEQ IDNO: 2; 1 a 209 de SEQ ID NO: 2; 1 a 233 de SEQ ID NO: 2; 1 a 257 de SEQID NO: 2; 1 a 281 de SEQ ID NO: 2; 1 a 305 de SEQ ID NO: 2; 1 a 329 deSEQ ID NO: 2; 1 a 353 de SEQ ID NO: 2; 1 a 416 de SEQ ID NO: 2; 1 a 424de SEQ ID NO: 2; 1 a 493 de SEQ ID NO: 2; 1 a 551 de SEQ ID NO: 2; 1 a531 de SEQ ID NO: 2 e 1 a 532 de SEQ ID NO: 2.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certosanticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus deriva-dos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àquelesfragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindoem aminoácidos 34 a 64 de SEQ ID NO: 2; 34 a 89 de SEQ ID NO: 2; 34 a113 de SEQ ID NO: 2; 34 a 137 de SEQ ID NO: 2; 34 a 161 de SEQ ID NO:2; 34 a 185 de SEQ ID NO: 2; 34 a 209 de SEQ ID NO: 2; 34 a 233 de SEQID NO: 2; 34 a 257 de SEQ ID NO: 2; 34 a 281 de SEQ ID NO: 2; 34 a 305de SEQ ID NO: 2; 34 a 329 de SEQ ID NO: 2; 34 a 353 de SEQ ID NO: 2; 34a 416 de SEQ ID NO: 2; 34 a 424 de SEQ ID NO: 2; 34 a 493 de SEQ IDNO: 2; e 34 a 551 de SEQ ID NO: 2.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 mais adicionais aos quais cer-tos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seusderivados da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitadosàqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em aminoácidos 34 a 530 de SEQ ID NO: 2; 34 a 531 de SEQ IDNO: 2; 34 a 532 de SEQ ID NO: 2; 34 a 533 de SEQ ID NO: 2; 34 a 534 deSEQ ID NO: 2; 34 a 535 de SEQ ID NO: 2; 34 a 536 de SEQ ID NO: 2; 34 a537 de SEQ ID NO: 2; 34 a 538 de SEQ ID NO: 2; 34 a 539 de SEQ ID NO:2; 30 a 532 de SEQ ID NO: 2; 31 a 532 de SEQ ID NO: 2; 32 a 532 de SEQID NO: 2; 33 a 532 de SEQ ID NO: 2; 34 a 532 de SEQ ID NO: 2; 35 a 532de SEQ ID NO: 2; 36 a 532 de SEQ ID NO: 2; 30 a 531 de SEQ ID NO: 2; 31a 531 de SEQ ID NO: 2; 32 a 531 de SEQ ID NO: 2; 33 a 531 de SEQ IDNO: 2; 34 a 531 de SEQ ID NO: 2; 35 a 531 de SEQ ID NO: 2; e 36 a 531 deSEQ ID NO: 2.
Além disso ainda, fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quaiscertos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seusderivados da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitadosàqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em aminoácidos 36 a 64 de SEQ ID NO: 2; 36 a 89 de SEQ IDNO: 2; 36 a 113 de SEQ ID NO: 2; 36 a 137 de SEQ ID NO: 2; 36 a 161 deSEQ ID NO: 2; 36 a 185 de SEQ ID NO: 2; 36 a 209 de SEQ ID NO: 2; 36 a233 de SEQ ID NO: 2; 36 a 257 de SEQ ID NO: 2; 36 a 281 de SEQ ID NO:2; 36 a 305 de SEQ ID NO: 2; 36 a 329 de SEQ ID NO: 2; 36 a 353 de SEQID NO: 2; 36 a 416 de SEQ ID NO: 2; 36 a 424 de SEQ ID NO: 2; 36 a 493de SEQ ID NO: 2; e 36 a 551 de SEQ ID NO: 2.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certosanticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus deriva-dos da presente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àquelesfragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindoem aminoácidos 36 a 530 de SEQ ID NO: 2; 36 a 531 de SEQ ID NO: 2; 36a 532 de SEQ ID NO: 2; 36 a 533 de SEQ ID NO: 2; 36 a 534 de SEQ IDNO: 2; 36 a 535 de SEQ ID NO: 2; 36 a 536 de SEQ ID NO: 2; 36 a 537 deSEQ ID NO: 2; 36 a 538 de SEQ ID NO: 2; e 36 a 539 de SEQ ID NO: 2.
Mais fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quais certos anticor-pos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados dapresente invenção se ligam incluem, mas não são limitados àqueles frag-mentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo emaminoácidos 417 a 493 de SEQ ID NO: 2; 417 a 494 de SEQ ID NO: 2; 417a 495 de SEQ ID NO: 2; 417 a 496 de SEQ ID NO: 2; 417 a 497 de SEQ IDNO: 2; 417 a 498 de SEQ ID NO: 2; 417 a 499 de SEQ ID NO: 2; 417 a 500de SEQ ID NO: 2; 417 a 492 de SEQ ID NO: 2; 417 a 491 de SEQ ID NO: 2;412 a 493 de SEQ ID NO: 2; 413 a 493 de SEQ ID NO: 2; 414 a 493 de SEQID NO: 2; 415 a 493 de SEQ ID NO: 2; 416 a 493 de SEQ ID NO: 2; 411 a493 de SEQ ID NO: 2; 410 a 493 de SEQ ID NO: 2; 410 a 494 de SEQ IDNO: 2; 411 a 494 de SEQ ID NO: 2; 412 a 494 de SEQ ID NO: 2; 413 a 494de SEQ ID NO: 2; 414 a 494 de SEQ ID NO: 2; 415 a 494 de SEQ ID NO: 2;416 a 494 de SEQ ID NO: 2; 417 a 494 de SEQ ID NO: 2; e 418 a 494 deSEQ ID NO: 2.
Em uma concretização adicional fragmentos de peptídeo deSp35 aos quais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes, ou seus derivados da presente invenção se ligam incluem, umpolipeptídeo de Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ouconsistindo em peptídeos do domínio de Ig de Sp35 ou fragmentos, varian-tes, ou derivados de tais polipeptídeos. Especificamente, polipeptídeos com-preendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nas seguintesseqüências de polipeptídeos: ITXiX2X3 (SEQ ID NO: 287), ACXiX2X3 (SEQID NO: 288), VCXiX2X3(SEQ ID NO: 289) e SPX1X2X3CSEQ ID NO: 290) on-de Xi é lisina, arginina, histidina, glutamina, ou asparagina, X2 é lisina, argi-nina, histidina, glutamina, ou asparagina e X3 é lisina, arginina, histidina, glu-tamina, ou asparagina. Por exemplo, fragmentos de peptídeo de Sp35 aosquais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ouseus derivados da presente invenção se ligam incluem, aqueles fragmentoscompreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nas seguin-tes seqüências de polipeptídeos: SPRKH (SEQ ID NO: 291), SPRKK (SEQID NO: 292), SPRKR (SEQ ID NO: 293), SPKKH (SEQ ID NO: 294), SPHKH(SEQ ID NO: 295), SPRRH (SEQ ID NO: 296), SPRHH (SEQ ID NO: 297),SPRRR (SEQ ID NO: 298), SPHHH (SEQ ID NO: 299) SPKKK (SEQ ID NO:300), LSPRKH (SEQ ID NO: 301), LSPRKK (SEQ ID NO: 302), LSPRKR(SEQ ID NO: 303), LSPKKH (SEQ ID NO: 304), LSPHKH (SEQ ID NO: 305),LSPRRH (SEQ ID NO: 306), LSPRHH (SEQ ID NO: 307), LSPRRR (SEQ IDNO: 308), LSPHHH (SEQ ID NO: 309) LSPKKK (SEQ ID NO: 310), WLS-PRKH (SEQ ID NO: 311), WLSPRKK (SEQ ID NO: 312), WLSPRKR (SEQNO: 313), WLSPKKH (SEQ ID NO: 314), WLSPHKH (SEQ ID NO: 315),WLSPRRH (SEQ ID NO: 316), WLSPRHH (SEQ ID NO: 317), WLSPRRR(SEQ ID NO: 318), WLSPHHH (SEQ ID NO: 319) WLSPKKK (SEQ ID NO:320),. Esses polipeptídeos de Sp35 incluem o "laço de RKH" básico (Argini-na-Lisina-Histidina aminoácidos 456-458) no domínio de Ig de Sp35. Peptí-deos de Sp35 adicionais que incluem um tripeptídeo básico são ITPKRR(SEQ ID NO: 321), ACHHK (SEQ ID NO: 322) e VCHHK (SEQ ID NO: 323).
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certosanticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus deriva-dos da presente invenção se ligam incluem, um polipeptídeo de Sp35 com-preendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em peptídeosdo domínio de Ig de Sp35 ou fragmentos, variantes, ou derivados de taispolipeptídeos. Especificamente, peptídeos compreendendo, consistindo es-sencialmente em, ou consistindo nas seguintes seqüências de polipeptídeos:X4X5RKH (SEQ ID NO: 324), X4X5RRR (SEQ ID NO: 325), X4X5KKK (SEQID NO: 326), X4X5HHH (SEQ ID NO: 327), X4X5RKK (SEQ ID NO: 328),X4X5RKR (SEQ ID NO: 329), X4X5KKH (SEQ ID NO: 330), X4X5HKH (SEQID NO: 331), X4X5RRH (SEQ ID NO: 332) e X4X5RHH (SEQ ID NO: 333) on-de X4 é qualquer aminoácido e X5 é qualquer aminoácido.
Em outras concretizações fragmentos de peptídeo de Sp35 aosquais certos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ouseus derivados da presente invenção se ligam incluem, um polipeptídeo deSp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo empeptídeos do domínio de Ig de Sp35 ou fragmentos, variantes, ou derivadosde tais polipeptídeos. Especificamente, polipeptídeos compreendendo, con-sistindo essencialmente em, ou consistindo nas seguintes seqüências depolipeptídeos: ITX6X7X8 (SEQ ID NO: 334), ACX6X7X8 (SEQ ID NO: 335),VCX6X7X8 (SEQ ID NO: 336) e SPX6X7X8 (SEQ ID NO: 337) onde X6 é lisina,arginina, histidina, glutamina, ou asparagina, X7 é qualquer aminoácido e X8é lisina, arginina, histidina, glutamina, ou asparagina. Por exemplo, um poli-peptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindonas seguintes polipeptídeo seqüência: SPRLH (SEQ ID NO: 338).
Fragmentos de peptídeo de Sp35 aos quais certos anticorpos,ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da pre-sente invenção se ligam incluem, um polipeptídeo de Sp35 compreendendo,consistindo essencialmente em, ou consistindo em peptídeos que contêmaminoácidos 452-458 no domínio de Ig de Sp35,ou seus derivados, em queaminoácido 452 é um resíduo de fenilalanina ou triptofano.
Fragmentos de peptídeo de Sp35 adicionais aos quais certosanticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus deriva-dos da presente invenção se ligam incluem, um polipeptídeo de Sp35 com-preendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em peptídeosdo domínio básico de Sp35. Especificamente, peptídeos compreendendo,consistindo essencialmente em, ou consistindo nas seguintes seqüências depolipeptídeos: RRARIRDRK (SEQ ID NO: 339), KKVKVKEKR (SEQ ID NO:340), RRLRLRDRK (SEQ ID NO: 341), RRGRGRDRK (SEQ ID NO: 342) eRRIRARDRK (SEQ ID NO: 343).
Polipeptídeo de Sp35 solúveis exemplares adicionais e métodose materiais para a obtenção dessas moléculas para a produção de anticor-pos ou fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser encontra-dos, por exemplo, no pedido de patente internacional NsPCT/US2004/008323, incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Métodos de produção de anticorpos são bem-conhecidos natécnica e são descritos aqui. Uma vez que anticorpos para vários fragmentosde, ou para Sp35 de comprimento total em a seqüência de sinal, foram pro-duzidos, determinado quais aminoácidos, ou epitopo, de Sp35 aos quais oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno liga pode ser determinado porprotocolos de mapeamento de epitopo como descrito aqui bem como méto-dos conhecidos na técnica (por exemplo, ELISA de sanduíche de anticorpoduplo como descritos no "Capítulo 11 - Immunology," Current Protocols inMolecular Biology, Ed. Ausubel e outros, v.2, John Wiley & Sons, Inc.(1996)).
Protocolos de mapeamento de epitopo adicionais podem serencontrados em Morris, G. mapeamento de epitopo Protocols, New Jersey:Humana Press (1996), que são ambos incorporados aqui por referência emsua totalidade. Mapeamento de epitopo podem também ser realizado pormeios comercialmente disponíveis (isto é, ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee,Wisconsin)). Adicionalmente, anticorpos produzidos que se ligam a qualquerporção de Sp35 podem então ser triados quanto a sua capacidade de agircomo um antagonista de Sp35 e assim promover crescimento de neurito,sobrevivência neuronal e de oligodendrócito, proliferação e diferenciaçãobem como promover mielinação. Anticorpos podem ser triados quanto a so-brevivência de oligodendrócito/neuronal por uso do método como descritonos exemplos 10 e 11.
Adicionalmente, anticorpos podem ser triados quanto a sua ca-pacidade de promover mielinação por uso do método do exemplo 9. Final-mente, anticorpos podem ser triados quanto a sua capacidade de promoverproliferação e diferenciação de oligodendrócito, bem como crescimento deneurito por uso do método como descrito no exemplo 7. Outras funções deantagonista de anticorpos da presente invenção podem ser testados usando-se outros ensaios como descritos nos exemplos aqui.
Em outras concretizações, a presente invenção inclui um anti-corpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado queespecificamente ou preferencialmente se liga a pelo menos one epitopo deSp35, onde o epitopo compreende, consiste essencialmente de, ou consisteem pelo menos cerca de quatro a cinco aminoácidos de SEQ ID NO: 2, pelomenos sete, pelo menos nove, ou entre pelo menos cerca de 15 a cerca de30 aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Os aminoácidos de um dado epitopo deSEQ ID NO: 2 como descritos podem ser, mas não necessitam ser contí-guos ou lineares. Em certas concretizações, o pelo menos um epitopo deSp35 compreende, consiste essencialmente de, ou consiste em um epitoponão linear formado pelo domínio extracelular de Sp35 como expresso nasuperfície de uma célula ou como um fragmento solúvel, por exemplo, fundi-do a uma região de Fc de IgG. Assim, em certas concretizações o pelo me-nos um epitopo de Sp35 compreende, consiste essencialmente de, ou con-siste em pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelomenos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelomenos 25, entre cerca de 15a cerca de 30, ou pelo menos 10, 15, 20, 25,30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 aminoácidoscontíguos ou não contíguos de SEQ ID NO: 2, onde o aminoácidos não con-tíguos formam um epitopo através do dobramento da proteína.
Em outras concretizações, a presente invenção inclui um anti-corpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado queespecificamente ou preferencialmente se liga a pelo menos um epitopo deSp35, onde o epitopo compreende, consiste essencialmente de, ou consisteem, além de um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais aminoácidos contí-guos ou não contíguos of SEQ ID NO: 2 como descritos acima, e uma por-ção adicional que modifica a proteína, por exemplo, uma porção de carboi-drato pode incluir de modo que o anticorpo de Sp35 se Iige com afinidademais alta a proteína-alvo modificada do que ela faz para uma vesão não mo-dificada da proteína. Alternativamente, o anticorpo de Sp35 não liga a versãonão modificada da proteína-alvo sob qualquer condição.
Em certos aspectos, a presente invenção refere-se a um anti-corpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado queespecificamente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou seu fragmento, ou umpolipeptídeo variante de Sp35, com uma afinidade caracterizada por umaconstante de dissociação (K0) que é menos do que o K0 para o dito anticor-po monoclonal de referência.
Em certas concretizações, um anticorpo, ou fragmento de liga-ção de antígeno, variante, ou seu derivado da invenção se liga especifica-mente a pelo menos um epitopo de Sp35 ou fragmento ou variante descritoacima, isto é, se liga a tal um epitopo mais prontamente do que se ligaria aum epitopo aleatório, não relacionado; se liga preferencialmente a pelo me-nos um epitopo de Sp35 ou fragmento ou variante descrito acima, isto é, seliga a tal um epitopo mais prontamente do que se ligaria a um epitopo rela-cionado, similar, homólogo, ou análogo; competitivamente inibe a ligação deum anticorpo de referência que se liga especificamente ou preferencialmentea um certo epitopo de Sp35 ou fragmento ou variante descrito acima; ou seliga a pelo menos um epitopo de Sp35 ou fragmento ou variante descritoacima com uma afinidade caracterizada por uma constante dissociação deKd de menos do que cerca de 5 χ 10"2 M, cerca de 10"2 M, cerca de 5 χ 10"3Μ, cerca de 10'3 Μ, cerca de 5 χ 10"4 Μ, cerca de 10'4 Μ, cerca de 5 χ 10"5 Μ,cerca de 10'5 M, cerca de 5 χ 10"6 Μ, cerca de 10'6 M, cerca de 5 χ 10"7 M1cerca de 10'7 M, cerca de 5 χ 10"8 Μ, cerca de 10'8 M, cerca de 5 χ 10"9 Μ,cerca de 10"9M, cerca de 5 χ 10"10M, cerca de 10'10M, cerca de 5 χ 10"11 Μ,cerca de 10"11 M1 cerca de 5 χ 10"12M, cerca de 10'12M, cerca de 5 χ 10'13M,cerca de 10"13 M, cerca de 5 χ 10"14 M1 cerca de 10'14 M, cerca de 5 χ 10'15 Μ,ou cerca de 10"15 M. Em um aspecto particular, o anticorpo ou seu fragmentopreferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 de ser humano ou seufragmento, em relação a um polipeptídeo de Sp35 de camundongo ou seufragmento.
Como usado no contexto de constantes de dissociação de liga-ção de anticorpo, o termo "cerca de" permite o grau de variação inerente nosmétodos utilizados para a medição de afinidade de anticorpo. Por exemplo,dependendo do nível de precisão da instrumentação usada, erro padrão combase no número de amostras medidas e erro de arredondamento, o termo"cerca de 10'2 M" pode incluir, por exemplo, de 0,05 M a 0,005 M.
Em concretizações específicas, um anticorpo, ou fragmento deligação de antígeno, variante, ou seu derivado da invenção liga polipeptí-deos de Sp35 ou fragmentos ou suas variantes com uma taxa "off" (k("off"))de menos do que ou igual a 5 X 10'2 sec"1, 10"2 sec'1, 5 X IO 3 sec"1 ou IO 3sec"1. Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno,variante, ou seu derivado das ligações da invenção liga polipeptídeos deSp35 ou fragmentos ou suas variantes com uma taxa "off" (k("off")) de me-nos do que ou igual a 5 X 10'4 sec"1, 10"4 sec"1, 5 X 10"5 sec"1, ou 10'5 sec"1 5X 10"6 sec"1, 10"6 sec"1, 5 X 10"7 sec"1 ou 10"7 sec"1.
Em outras concretizações, um anticorpo, ou fragmento de liga-ção de antígeno, variante, ou seu derivado da invenção liga polipeptídeos deSp35 ou fragmentos ou suas variantes com uma taxa "on" (k("on")) de maisdo que ou igual a 103 M"1 sec"1, 5 X IO3M"1 sec"1, 104 M"1 sec"1 ou 5 X "IO4 M"1sec"1. Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno,variante, ou seu derivado da invenção liga polipeptídeos de Sp35 ou frag-mentos ou suas variantes com uma taxa "on" (k("on")) maior do que ou iguala 105 M1 sec"1, 5 X 105 M1 sec"1, 106 M"1 sec"1, ou 5 X 106 M1 sec'1 ou 107M"1 sec1.
Em várias concretizações, um anticorpo de Sp35, ou fragmentode ligação de antígeno, variante, ou seu derivado como descrito aqui é umantagonista de atividade de Sp35. Em certas concretizações, por exemplo,ligação de um anticorpo de antagonista de Sp35 a Sp35, como expresso nosneurônios, bloqueia inibição de crescimento de neurito associada a mielinaou morte de célula neuronal. Em outras concretizações, ligação do anticorpode Sp35 a Sp35, como expresso nos oligodendrócitos, bloqueia inibição decrescimento ou diferenciação de oligodendrócito, ou bloqueia desmielinaçãoou dismielinação de neurônios do CNS.
A não ser que de outra maneira é especificamente observado,como usado aqui a "seu fragmento" em referência a um anticorpo refere-se aum fragmento de ligação de antígeno, isto é, uma porção do anticorpo queespecificamente se liga ao antígeno. Em uma concretização, um anticorpode Sp35, por exemplo, um anticorpo da invenção é um anticorpo de Sp35biespecífico, polipeptídeo de ligação, ou anticorpo, por exemplo, um anticor-po biespecífico, minicorpo, anticorpo apagado de domínio, ou proteína defusão tendo especificidade de ligação para mais do que um epitopo, por e-xemplo, mais do que um antígeno ou mais do que um epitopo no mesmoantígeno. Em uma concretização, um anticorpo de Sp35 biespecífico, ligaçãode polipeptídeo, ou anticorpo tem pelo menos um domínio de ligação especí-fico para pelo menos um epitopo em um polipeptídeo-alvo revelado aqui, porexemplo, Sp35. Em uma outra concretização, um anticorpo de Sp35 biespe-cífico, ligação de polipeptídeo, ou anticorpo tem pelo menos um domínio deligação específico for um epitopo em um polipeptídeo-alvo e pelo menos umdomínio de ligação específico alvo para um fármaco ou uma toxina. Em ain-da uma outra concretização, um anticorpo de Sp35 biespecífico, ligação depolipeptídeo, ou anticorpo tem pelo menos um domínio de ligação específicopara um epitopo em um polipeptídeo-alvo revelado aqui, e pelo menos umdomínio de ligação específico para um pró-fármaco. Um anticorpo de Sp35biespecífico, ligação de polipeptídeo, ou anticorpo pode ser um anticorpotetravalente que tem dois domínios de ligação específicas para um epitopode a polipeptídeo-alvo revelado aqui e dois domínios de ligação específicospara um segundo alvo. Assim, um anticorpo de Sp35 biespecífico tetravalen-te, ligação de polipeptídeo, ou anticorpo pode ser bivalente para cada espe-cificidade.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou derivados da invenção, como conhecidos por aqueles versados natécnica, podem compreender uma região constante que media uma ou maisfunções efetoras. Por exemplo, ligação do componente de C1 do comple-mento a uma região constante de anticorpo pode ativar o sistema de com-plemento. Ativação do complemento é importante na opsonização e Iise depatógenos de célula. A ativação de complemento também estimula respostainflamtaória e pode também estar envolvida em hipersensibilidade auto-imune. Além disso, anticorpos se ligam a receptores em várias células via aregião de Fc, com um sítio de ligação de receptor de Fc na região de Fc deanticorpo que se liga a um receptor de Fc (FcR) em uma célula. Há numero-sos receptores de Fc que são específicos para diferentes classes de anticor-po, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores épsilon), IgA (recepto-res alfa) e IgM (receptores mu). Ligação de anticorpo a Fc receptores emsuperfícies de célula dispara numerosas respostas biológicas importantes ediversas incluindo engulhimento e destruição de partículas revestidas de an-ticorpo, depuração de complexos imunes, Iise de células-alvo revestidas comanticorpo por células assassinas (chamadas citotoxicidade mediada por cé-lula denpendente de anticorpo, ou ADCC), liberação de mediadores inflama-tórios, transferência placental e controle de produção de imunoglobulina.
Correspondentemente, certas concretizações da invenção inclu-em um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ouseu derivado, em que pelo menos uma fração de um ou mais dos domíniosde região constantes foi apagado ou de outra maneira foi alterado de modoa prover características bioquímicas desejadas tais como funções de efetorreduzidas, a capacidade de não covalentemente dimerizar, capcidade au-mentada de localizar no sítio de um tumor, semi-vida de soro reduzida, ousemi-vida aumentada de soro quando em comparação com um anticorpoinalterado, inteiro de aproximadamente da mesma imunogenicidade. Porexemplo, certos anticorpos para o uso nos métodos de tratamento de diag-nóstico descritos aqui são anticorpos apagados de domínio que compreen-dem uma cadeia de polipeptídeo similar a uma cadeia pesada de imunoglo-bulina, mas que carece de pelo menos uma porção de um ou mais domíniosde cadeia pesada. Por exemplo, em certos anticorpos, um domínio inteiro daregião constante do anticorpo modificado será apagado, por exemplo, a tota-lidade ou parte do domínio de CH2 será apagado.
Em certos anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de an-tígeno, variantes, ou seus derivados descritos aqui, a porção de Fc pode sermutada para diminuir a função efetora usando-se técnicas conhecidas naárea. Por exemplo, a deleção ou inativação (através de mutações de pontoou outro meio) de um domínio de região constante pode reduzir ligação dereceptor de Fc do anticorpo modificado circulante desse modo aumentandoa localização de tumor. Em outros casos pode ser que modificações de regi-ão constante consistentes com a presente invenção moderem ligação de decomplemento e assim reduzem a semi-vida do soro e associação não espe-cífica de uma citotoxina conjugada. Ainda outras modificações da regiãoconstante podem ser usadas para modificar ligação de dissulfeto ou porçõesde oligossacarídeo que permitem localização melhorada devido a especifici-dade de antígeno aumentada ou flexibilidade de anticorpo. O perfil fisiológi-co, biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, taiscomo localização de tumor, biodistribuição e semi-vida do soro, podem fa-cilmente ser medidas e quantificadas usando-se técnica imunológicas bem-conhecidas sem experimentação imprópria.
Formas modificadas de anticorpos de Sp35, ou fragmentos deligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem serproduzidos a partir de precursores inteiros ou anticorpos de origem usando-se técnicas conhecidas na área. Técnicas exemplares são discutidas emmais detalhes aqui.
Em certas concretizações ambas as regiões variáveis e constan-tes de anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes,ou seus derivados são totalmente de ser humano. Anticorpos totalmente deser humano podem ser produzidos usando-se técnicas que são conhecidasna área e como descritas aqui. Por exemplo, anticorpos totalmente de serhumano contra um antígeno específico podem ser preparados por adminis-tração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzirtais anticorpos em resposta a um desafio antigênico, mas cujos locais endó-genos foram invalidados. Técnicas exemplares que podem ser usadas paraproduzir tais anticorpos são descritos nas patentes U.S. nos: 6.150.584;6.458.592; 6.420.140 que são incorporadas por referência em sua totalida-de. Outras técnicas são conhecidas na técnica. Anticorpos totalmente de serhumano podem do mesmo modo ser produzidos por várias tecnologias deexibição, por exemplo, sistemas de exibição de fago ou outros sistemas deexibição viral, como descritos em mais detalhes em qualquer lugar aqui.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados da invenção podem ser produzidos ou fabricadosusando-se técnicas que são conhecidas na técnica. Em certas concretiza-ções, moléculas de anticorpo ou seus fragmentos são "recombinantementeproduzidos," isto é, são produzidos usando-se tecnologia de DNA recombi-nante. Técnicas exemplares para a produção de moléculas de anticorpo ouseus fragmentos são discutidas em mais detalhes em qualquer lugar aqui.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados da invenção também incluem derivados que sãomodificados, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molé-cuia ao anticorpo de modo que a ligação covalente não evita que anticorpoespecificamente se ligue a seu epitopo cognato. Por exemplo, mas não atítulo de limitação, os derivados de anticorpo incluem anticorpos que forammodificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, pegilação, fosforila-ção, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos,clivagem proteolítica, ligação a uma Iigante celular ou outra proteína, etc.Qualquer de numerosas modificações químicas podem ser realizadas portécnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a clivagem química espe-cífica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adi-cionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
Em certas concretizações, anticorpos de Sp35, ou fragmentosde ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção não eleci-tarão uma resposta imune nociva no animal a ser tratado, por exemplo, emum ser humano. Em uma concretização, anticorpos de Sp35, ou fragmentosde ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção são modi-ficados para reduzir sua imunogenicidade usando-se técnicas reconhecidasna técnica. Por exemplo, anticorpos podem ser anticorpos humanizados,primatizados, desimunizados, ou quiméricos podem ser produzidos. Essestipos de anticorpos são derivados de um anticorpo não humano, tipicamenteum anticorpo de camundongo ou de primata, que retém ou substancialmenteretém as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo de origem, masque é menos imunogênico em seres humanos. Isto pode ser alcançado porvários métodos, incluindo (a) enxerto dos domínios variáveis não humanostotais sobre regiões constantes de ser humano para gerar anticorpos quimé-ricos; (b) enxerto de pelo menos uma parte de uma ou mais das regiões dedeterminação de complementaridade de não ser humano (CDRs) em umaestrutura humana e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos deestrutura críticos; ou (c) transplante dos domínios variáveis não humanostotais, mas "difarçando-os" com uma seção de tipo humana por substituiçãode resíduos de superfície. Tais métodos são revelados em Morrison e ou-tros, Proc. Natl. Acad. Sei. 81:6851-6855 (1984); Morrison e outros, Adv.Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen e outros, Science 239:1534-1536(1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun.31:169-217 (1994), e as patentes U.S. nos. 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762,e 6,190,370, cuja totalidade é incorporada por referência.
Desumanização pode também ser usada para diminuir a imuno-genicidade de um anticorpo. Como usado aqui, o termo "desumanização"inclui alteração de um anticorpo para modificar epitopos de célula T (vide,por exemplo, W09852976A1, W00034317A2). Por exemplo, seqüências deVh e Vl oriundas doe anticorpo de partida são analisadas e um "mapa" deepitopo de célula T de ser humano de cada região V que mostra a localiza-ção de epitopos em relação a regiões de determinação de complementari-dade (CDRs) e outros resíduos chave dentro da seqüência. Epitopos de cé-lula T individuais oriundos do mapa de epitopo de célula T são analisados afim de identificar substituições de aminoácidos alternativas com um baixorisco de alteração de atividade no anticorpo final. Uma faixa de seqüênciasde Vh e Vl alternativas são projetadas compreendendo combinações desubstituições de aminoácidos e essas seqüências são subseqüentementeincorporadas em uma faixa de ligação de polipeptídeos, por exemplo, anti-corpos específicos de Sp35 ou seus fragmentos imunoespecíficos para ouso nos métodos de tratamento e diagnóstico revelados aqui, que são entãotestados quanto a função. Tipicamente, entre 12 e 24 anticorpos variantessão gerados e são testados. Genes de cadeia pesada ou leve completoscompreendendo região C humanas e V modificadas são então clonados emvetores de expressão e os plasmídios subseqüentes são introduzidos paradentro de linhas de células para a produção de anticorpo inteiro. Os anticor-pos são então comparados em ensaios bioquímicos e biológicos apropria-dos, a variante ótima é identificada.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados da invenção podem ser gerados por qualquer mé-todo adequado conhecido na técnica. Anticorpos policlonais para um antíge-no de interesse podem ser produzidos por vários procedimentos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo de Sp35, por exemplo, aligação de polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo específico de Sp35 ouseu fragmento imunoespecífico pode ser administrado a vários animais hos-pedeiros incluindo, mas não limitados a, coelhos, camundongos, ratos, gali-nhas, hamsters, cabras, asnos, etc., para induzir a produção de soros con-tendo anticorpos policlonais específicos para o antígeno. Vários auxiliarespodem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo daespécie de hospedeiro, e incluem mas não são limitados a, Freund1S (com-pleto e incompleto), géis minerais tal como hidróxido de alumínio, substân-cias tensoativas tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptí-deos, emulsões oleosas, hemocianinas de lapa "keyhole", dinitrofenol, e au-xiliares humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Tais auxiliares são também bem-conhecidos na técnica.
Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando-se umaampla variedade de técnicas conhecidas na área incluindo o uso de tecnolo-gias de exibição de fago, recombinante e hibridoma, ou uma sua combina-ção. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando-setécnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na técnica e ensinadas,por exemplo, em Harlow e outros, Anticorpos: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling e outros, in:Anticorpos monoclonais e T-Ce// Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981)(as ditas referências incorporadas por referência em sua totalidade). O termo"anticorpo monoclonal" como usado aqui não é limitado a anticorpos produ-zidos através de tecnologia de hibridoma. O termo "anticorpo monoclonal"refere-se a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qual-quer clone eucariótico, procariótico ou de fago, e não o método pelo qual eleé produzido. Assim, o termo "anticorpo monoclonal" não é limitado a anticor-pos produzidos através de tecnologia de hibridoma. Anticorpos monoclonaispodem ser preparados usando-se camundongos de inativação de Sp35 paraaumentar as regiões de reconhecimento de epitopo. Anticorpos monoclonaispodem ser preparados usando-se uma ampla variedade de técnicas conhe-cidas na área incluindo o uso de tecnologia de hibridoma e recombinante ede exibição de fago como descritos em qualquer lugar aqui.
Usando-se protocolos reconhecidos na técnica, em um exemplo,anticorpos são criados em mamíferos por múltiplas injeções subcutâneas ouintraperitoneais do antígeno relevante (por exemplo, antígenos associados atumor purificados tais como Sp35 ou células ou extratos celulares compre-endendo tais antígenos) e um auxiliar. Esta imunização tipicamente eliciauma resposta imune que compreende a produção de anticorpos reativos aantígeno a partir de esplenócitos e linfócitos ativados. Enquanto os anticor-pos resultantes podem ser coletados do soro do animal para prover prepara-ções policlonais, é freqüentemente desejável isolar linfócitos individuais dobaço, Iinfonodos ou sangue periférico para prover preparações homogêneasde anticorpos monoclonais (MAbs). De preferência, os linfócitos são obtidosa partir do baço.
Neste processo bem-conhecido (Kohler e outros, Nature 256:495(1975)) os linfócitos de vida relativamente curta, ou mortais, oriundo de ummamífero que foi injetado com antígeno são fundidos com uma linha de célu-la de tumor imortal (por exemplo uma linha de célula de mieloma), assim,produção de células híbridas ou "hibridomas" que são tanto imortais quantocapazes de produzir o anticorpo geneticamente codificado da célula B. Oshíbridos resultantes são segregados em cepas genéticas simples por sele-ção, diluição, e crescimento com cada cepa individual compreendendo ge-nes específicos para a formação de um único anticorpo. Eles produzem anti-corpos que são homogêneos contra um antígeno desejado e, em referênciaa sua ascêndencia genética, são chamados "monoclonais."
Células de hibridoma assim pararadas são semadas e são de-senvolvidas em meio de cultra adequado que de preferência contém uma oumais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células demieloma parental, não fundidas. Aqueles versados na técnica apreciarão quereagentes, linhas de células e meios para a formação, seleção e crescimentode hibridomas estão comercialmente disponíveis de numerosas fontes e pro-tocolos padronizados são bem-estabelecidos. Em geral, meio de cultura emque as células de hibridoma são desenvolvidas é analisado quanto a produ-ção de anticorpos monoclonais contra o antígeno desejado. De preferência,a especificidade de ligação do anticorpos monoclonais produzida por célulasde hibridoma é determinada por ensaios in vitro tal como imunoprecipitação,radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELI-SA). Depois que células de hibridoma são identificadas que produzem anti-corpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones po-dem ser subclonados por limitação dos procedimentos de diluição e desen-volvidos por métodos padrão (Goding, Anticorpos monoclonais: Principies ePractice, Academic Press, pp 59-103 (1986)). Será apreciado que os anti-corpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser separados domeio de cultura, fluido de ascite ou soro por procedimentos de purificaçãoconvencionais tal como, por exemplo, proteína-A, cromotafria de hidroxilapa-tita, eletroforese de gel, dialise ou cromatografia por afinidade.
Fragmentos de anticorpo que reconhecem epitopos específicospodem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, Fab e F(ab')2fragmentos podem ser produzidos por clivagem proteolítica das molécula deimunoglobulina, usando-se enzimas tal como papaína (para produzir frag-mentos de Fab) ou pepsina (para produzir F(ab')2 fragmentos). F(ab')2 frag-mentos contêm a região variável, a região constante de cadeia leve o domí-nio de Cr1 da cadeia pesada.
Aqueles versados na técnica também apreciarão que anticorposde codificação de DNA ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, sítios deligação de antígeno) podem também ser derivados de bibliotecas de anticor-po, tais como bibliotecas de exibição de fago. Em particular, tal fago podeser utilizado para exibir domínios de ligação de antígeno expressos a partirde um repertório ou uma biblioteca de anticorpo combinatória (por exemplo,ser humano ou de camundogo). Fago que expressa um domínio de ligaçãode antígeno que se liga o antígeno de interesse pode ser selecionado ouidentificado com um antígeno, por exemplo, usando-se antígeno marcado ouantígeno ligado ou capturado para uma conta ou superfície sólida. Fago u-sado nesses métodos são tipicamente fago filamentoso incluindo domíniosde ligação de fd e M13 expressos a partir de fago com Fab, Fv OE DAB (re-gião de Fv individiual de cadeias pesadas ou leves) ou domínios de anticor-po de Fv estabilizados por dissulfeto recombinantemente fundidos ou à geneIII de fago ou proteína de gene VIII. Métodos exemplares são indicados, porexemplo, na EP 368 684 B1; na patente U.S. 5.969.108, Hoogenboom, H.R.e Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy e outros Nat. Med. 8:801(2002); Huie e outros, Proc. Nati Acad. Sei. USA 98:2682 (2001); Lui e ou-tros, J. Mol. Biol. 315:1063 (2002), cada um dos quais é incorporado aqui porreferência. Várias publicações (por exemplo, Marks e outros, Bio/Technology10:779-783 (1992)) descreviam a produção de anticorpos humanos de altaafinidade por embaralhamento de cadeia, bem como infecção combinatória erecombinação in vivo como uma estratégia para a contrução de grandes bi-bliotecas de fago. Em uma outra concretização, exibição ribossomal podeser usada para substituir bacteriófago como a plataforma de exibição (vide,por exemplo, Hanes e outros, Nat. Biotechnol. 18:1287 (2000); Wilson e ou-tros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:3750 (2001); ou Irving e outros, J. Immu-nol. Métodos 248:31 (2001)). Em ainda uma outra concretização, bibliotecasde superfície de célula podem ser triadas para anticorpos (Boder e outros,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:10701 (2000); Daugherty e outros, J. Immunol.Métodos 243:211 (2000)). Tais procedimentos provêem alternativas a técni-cas de hibridoma tradicionais para o isolamento e clonagem subseqüente deanticorpos monoclonais.
Em métodos de exibição de fago, domínios de anticorpo funcio-nais são exibidos sobre a superfície de partículas de fago que portam as se-qüências de polinucleotídeos que codificam eles. Por exemplo, seqüênciasde DNA que codificam regiões de Vh e Vl são ampliadas a partir de bibliote-cas de cDNA de animal (por exemplo, bibliotecas de cDNA de de ser huma-no ou de camundongo de tecidos linfóides) ou bibliotecas de cDNA sintéti-cas. Em certas concretizações, o DNA que codifica as regiões de Vh e Vlsão unidos entre si por um Iigador de scFv por PCR e são clonados em umvetor de fagomídio (por exemplo, ρ CANTAB 6 ou pComb 3 HSS). O vetor éeletroporado em E. coli e o E. coli é infectado com um fago auxiliar. Fagousado nesses métodos são tipicamente fago filamentoso incluindo fd e M13e as regiões de Vh ou Vl são usualmente recombinantemente fundidas ou agene Ill de fago ou gene VIII. Fago que expressa um domínio de ligação deantígeno que se liga a um antígeno de interesse (isto é, um polipeptídeo deSp35 ou um seu fragmento) pode ser selecionado ou identificado com umantígeno, por exemplo, usando-se antígeno marcado ou antígeno ligado oucapturado para uma conta ou superfície sólida.
Exemplos adicionais de métodos de exibição de fago que podemser usados para produzir os anticorpos incluem aqueles revelados emBrinkman e outros, J. Immunol. Métodos 182:41-50 (1995); Ames e outros, J.Immunol. Métodos 184:177-186 (1995); Kettleborough e outros, Eur. J. Im-munol. 24:952-958 (1994); Persic e outros, Gene 187:9-18 (1997); Burton eoutros, Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT Application N5PCT/GB91/01134; publicações de PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e aspatentes U.S. nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908;5.750.753; 5.821.047; 5.571,698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225;5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; cada um dos quais é incorporado aquipor referência em sua totalidade.
Como descritos nas referências acima, depois da seleção defago, as regiões de codificação de anticorpo do fago podem ser isoladas eusadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ouqualquer outro fragmento de ligação de antígeno desejado, e expressas emqualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células deinseto, células de planta, levedura e bactérias. Por exemplo, técnicas paraproduzir recombinantemente fragmentos de Fab, Fab' e F(ab')2 podem tam-bém ser empregados usando-se métodos conhecidos na técnica tais comoaqueles revelados na publicação de PCT WO 92/22324; Mullinax e outros,BioTécnicas 12(6):864-869 (1992); e Sawai e outros, AJRI 34:26-34 (1995);e Better e outros, Science 240:1041-1043 (1988) (as ditas referências incor-poradas por referência em sua totalidade).
Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir anti-corpos e Fvs de cadeia simples e incluem aqueles descritos nas patentesU.S. nos. 4.946.778 e 5.258.498; Huston e outros, Métodos in Enzymology203:46-88 (1991); Shu e outros, PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra e ou-tros, Science 240:1038-1040 (1988). Para alguns usos, incluindo uso in vivode anticorpos em seres humanos e ensaios de detecção in vitro, pode serpreferível usar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anti-corpo quimérico é uma molécula em que porções diferentes do anticorpo sãoderivados de espécie de animal diferente, tais como anticorpos tendo umaregião variável derivada de um anticorpo monoclonal de camundongo e umaregião constante imunoglobulina de ser humano. Métodos para a produçãode anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo,Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi e outros, BioTécnicas 4:214 (1986);Gillies e outros, J. Immunol. Métodos 125:191-202 (1989); as patentes U.S.nos. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816397, que são incorporados aqui por refe-rência em sua totalidade. Anticorpos humanizados são moléculas de anti-corpo derivadas de anticorpo de espécie não humana que ligam o antígenodesejado tendo uma ou mais regiões de determinação de complementarida-de (CDRs) da espécie não humana e regiões de estrutura de uma moléculade imunoglobulina de ser humana. Freqüentemente, resíduos de estruturana regiões de estrutura de ser humano serão substituídos com o resíduocorrespondente do anticorpo de doador de CDR para alterar, de preferênciaaperfeiçoar, ligação de antígeno. Essas substituições de estrutura são identi-ficadas por métodos bem-conhecidos na técnica, por exemplo, por modela-gem das interações dos resíduos de estrutura e CDR para identificar resí-duos de estruturaes importantes para a ligação de antígeno e comparaçãode seqüência para identificar resíduos de estrutura incomum a posições par-ticulares. (Vide, por exemplo, Queen e outros, a patente U.S. nQ 5.585.089;Riechmann e outros, Nature 332:323 (1988), que são incorporadas aqui porreferência em sua totalidade.) Anticorpos podem ser humanizados usando-se uma variedade de técnicas conhecidas na área incluindo, por exemplo,enxerto de CDR (EP 239,400; publicação de PCT WO 91/09967; as patentesU.S. nos. 5.225.539; 5.530,101; e 5.585.089), folheamento ou recapeamento(EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991); Studnicka e outros, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Rogus-ka. e outros, PNAS 91:969-973 (1994)), e embaralhamento de cadeia (a pa-tente U.S. n9 5.565.332, que é incorporada por referência em sua totalidade).
Anticorpos totalmente humanos são particularmente desejáveispara tratamento terapêutico de pacientes humanos. Anticorpos humanospodem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos na técnicaincluindo métodos de exibição de fago descritos acima usando-se bibliotecasde anticorpo derivadas de seqüências de imunoglobulinas humanas. Videtambém, as patentes U.S. nos. 4.444.887 e 4.716.111; e PCT publicationsWO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096,WO 96/33735, e WO 91/10741; cada uma das quais é incorporada aqui porreferência em sua totalidade.
Anticorpos humanos podem também ser produzidos usando-secamundongos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobuli-nas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobu-Iina de ser humano. Por exemplo, os complexos de gene de imunoglobulinade cadeia leve e pesada de ser humano podem ser introduzidos aleatoria-mente por recombinação homóloga em células tronco embriônicas de ca-mundongo. Alternativamente, a região variável humana, região constante, eregião de diversidade podem ser introduzidas para dentro de células troncoembriônicas de camundongo além dos genes de cadeia pesada ou leve hu-manos. Os genes de imunoglobulina de cadeia leve e pesada podem sertornados não funcionais separadamente ou simultâneamente com a introdu-ção de locais de imunoglobulina de ser humano por recombinação homólo-ga. Em particular, deleção homozigota da região de JH previne produção deanticorpo endógeno. The células tronco embriônicas modificadas são ex-pandidas e são microinjetadas para dentro de blastócitos para produzir ca-mundongos quiméricos. Os camundongos quiméricos são então criados pa-ra produzir prole homozigota que expressam anticorpos humanos. Os ca-mundongos transgênicos são humanizados na forma normal com um antí-geno selecionado, por exemplo, a totalidade ou uma porção de um polipeptí-deo-alvo desjado. Anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno podemser obtidos a partir dos camundongos transgênicos, imunizados usando-setecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina deser humano contidos pelos camundongos transgênicos redispõem durante adiferenciação de célula B, e subseqüentemente sofrem mudança de classe emutação somática. Assim, usando-se tal técnica, é possível para produziranticorpos de IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma visãodesta tecnologia para a produção de anticorpos humanos, vide Lonberg eHuszar Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para uma discussão detalhadadesta tecnologia para a produção de anticorpos humanos e anticorpos hu-manos monoclonais e protocolos para a produção de tais anticorpos, vide,por exemplo, publicações de PCT WO 98/24893; WO 96/34096; WO96/33735; as patentes U.S. nos. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425;5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; e 5.939.598, que são incorpo-radas por referência aqui em sua totalidade. Além disso, companhias taiscornos Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) e GenPharm (San Jose, Calif.) po-dem ser empregadas para prover anticorpos humanos directed against aselected antígeno usando-se tecnologia similar àquela descrita acima.
Anticorpos totalmente humanos que reconhecem um epitoposelecionado podem ser gerados usando-se uma técnica chamada de "sele-ção guiada." Nesta abordagem um anticorpo monoclonal não humano sele-cionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar aseleção de um anticorpo totalmente humano que reconhece o mesmo epito-po. (Jespers e outros, Bio/Tecnologia 12:899-903 (1988). Vide também, apatente U.S. n9 5.565.332, que é incorporada por referência em sua totalida-de.)
Além disso, anticorpos para polipeptídeo-alvos da invenção po-dem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpo anti-idiotipo que "imi-tam" polipeptídeos-alvo usando-se técnicas bem-conhecidas por aquelesversados na técnica. (Vide, por exemplo, Greenspan & Bona, FASEB J.7(5):437-444 (1989) e Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438 (1991)). Porexemplo, anticorpos que se ligam a e competitivamente inibem multimeriza-ção de polipeptídeo e/ou ligação de um polipeptídeo da invenção a um Iigan-te pode ser usada para gerar anti-idiotipos que "imitam" a multimerização depolipeptídeo e/ou domínio de ligação e, como uma conseqüência, se ligam ae neutralizam polipeptídeo e/ou seus ligantes. Tais anti-idiotipos neutralizan-tes ou fragmentos de Fab de tais anti-idiotipos podem ser usados em regi-mes terapêuticos para neutralizar Iigante de polipeptídeo. Por exemplo, taisanticorpos anti-idiotípicos podem ser usados para ligar um polipeptídeo-alvodesejado e/ou para ligar seus ligantes/receptores, e desse modo bloquearsua atividade biológica.
Em uma outra concretização, DNA que codifica anticorpos mo-noclonais desejados podem ser prontamente isolados e seqüenciados usan-do-se procedimentos convencionais (por exemplo, por uso de sondas denucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codi-ficam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de camundongo). As célulasde hibridoma subclonados e isolados servem como uma fonte preferida detal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expres-são, que são então transferidos em células hospedeiras eucarióticas ou pro-carióticas tais como células de E. coli, células de COS símio, células de ová-rio de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem deoutra maneira imunoglobulinas. Mais particularmente, o DNA isolado (quepode ser sintético como descrito aqui) pode ser usado para clonar seqüên-cias de região variável e constante para a fabricação de anticorpos comodescritos em Newman e outros, a patente U.S. n9 5.658.570, depositada emde janeiro 1995, que é incorporada por referência aqui. Essencialmente,isso vincula a extração de RNA das células selecionadas, conversão emcDNA, e ampliação por PCR usando-se iniciadores específicos de lg. Inicia-dores adequados para esta finalidade são também descritos na patente U.S.n9 5.658.570. Como será discutido em mais detalhes abaixo, células trans-formadas que expressam o anticorpo desejado podem desenvolvidas emquantidades relativamente grandes para prover clinicai e fornecimentos co-merciais da imunoglobulina.
Em uma concretização, um anticorpo de Sp35 da invenção com-preende pelo menos um CDR de cadeia leve ou pesada de uma molécula deanticorpo. Em uma outra concretização, um anticorpo de Sp35 da invençãocompreende pelo menos duas CDRs de uma ou mais moléculas de anticor-po. Em uma outra concretização, um anticorpo de Sp35 da invenção com-preende pelo menos tres CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo.
Em uma outra concretização, um anticorpo de Sp35 da invençãocompreende pelo menos quatro CDRs de uma ou mais moléculas de anti-corpo. Em uma outra concretização, um anticorpo de Sp35 da invençãocompreende pelo menos cinco CDRs de uma ou mais moléculas de anticor-po. Em uma outra concretização, um anticorpo de Sp35 da invenção com-preende pelo menos seis CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo.Moléculas de anticorpo exemplares compreendendo pelo menos um CDRque pode ser incluída nos anticorpos de Sp35 objetos são descritos aqui.
Em uma concretização específica, a seqüência de aminoácidosdos domínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve podem ser inspeciona-dos para identificar as seqüências das regiões de determinação de comple-mentaridade (CDRs) por métodos que são bem-conhecidos na técnica, porexemplo, por comparação com as seqüências de aminoácidos conhecidasde outras regiões variáveis de cadeia leve e pesada para determinar as regi-ões de hipervariabilidade de seqüência. Usando-se técnicas de DNA recom-binantes rotineiras, uma ou mais das CDRs podem ser inseridas dentro dasregiões de estrutura, por exemplo, para dentro de regiões de estrutura de serhumano para humanizar um anticorpo não humano. As regiões de estruturapode ser regiões de estrutura de consenso ou de ocorrência natural, e depreferência regiões de estrutura de ser humano (vide, por exemplo, Chothiae outros, J. Moi Biol. 278:457-479 (1998) para uma listagem de regiões deestrutura de ser humano). De preferência, o polinucleotídeo gerado pelacombinação das regiões de estrutura e CDRs codifica um anticorpo que es-peicficamente se liga a pelo menos um epitopo de um polipeptídeo desejado,por exemplo, Sp35. De preferência, uma ou mais substituições de aminoáci-dos podem ser feitas dentro das regiões de estrutura, e, de preferência, assubstituições de aminoácidos aperfeiçoam a ligação do anticorpo a seu antí-geno. Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para produzir substi-tuições ou deleções de aminoácidos de um ou mais resíduos de cisteína deregião variável que participam em uma ligação de dissulfeto de intracadeiapara gerar moléculas de anticorpo que carecem de uma ou mais ligações dedissulfeto de intraceia. Outras alterações para o polinucleotídeo estão incluí-das pela presente invenção e dentro da habilidade da técnica.
Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticor-pos quiméricos" (Morrison e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. 81:851-855(1984); Neuberger e outros, Nature 312:604-608 (1984); Takeda e outros,Nature 314:452-454 (1985)) por união de genes a partir de uma molécula deanticorpo de camundongo de antígeno especificidade apropriada juntamentecom genes genes oriundos de uma molécula de anticorpo humana de ativi-dade atividade biológica apropriada podem ser usados. Como usado aqui,um anticorpo quimérico é uma molécula em que porções diferentes são deri-vadas de espécies de animais diferentes, tais como aqueles tendo um regiãovariável derivada de um anticorpo monoclonal de camundongo e uma regiãoconstante imunoglobulina de ser humano, por exemplo, anticorpos humani-zados.
Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticor-pos de cadeia simples (a patente U.S. nQ 4.694.778; Bird1 Science 242:423-442 (1988); Huston e outros, Proc. Nati Acad. Sei. USA 85:5879-5883(1988); e Ward e outros, Nature 334:544-554 (1989)) podem ser adaptadaspara produzir anticorpo de cadeia simples. Anticorpo de cadeia simples sãoformados por ligação dos fragmentos de de cadeia leve e pesada da regiãode Fv via uma ponte de aminoácido, que resulta em um anticorpo de cadeiasimples. Técnicas para o conjunto de fragmentos de Fv funcionais em E. colipodem também ser usadas (Skerra e outros, Science 242:1038-1041(1988)).
Ainda outras concretizações da presente invenção compreen-dem a geração de anticorpos humanos ou substancialmente humanos emanimais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são incapazes deprodução de imunoglobulina endógena (vide por exemplo, as patentes U.S.nos. 6.075.181, 5.939.598, 5.591.669 e 5.589.369 cada uma das quais éincorporada aqui por referência). Por exemplo, foi descrito que a deleçãohomozigota da região de união cadeia pesada de anticorpo em camundon-gos mutantes de linha de germe e quiméricos resulta em inibição completade produção de anticorpo endógeno. Transferência do ensaio de gene deimunoglobulina de ser humano para tais camundongos mutantes de linha degerme resultarão na produção de anticorpos humanos no desafio de antíge-no. Um outro meio preferido de gerar anticorpos humanos usando-se ca-mundongos SCID é revelado na patente U.S. ne 5.811.524 que é incorpora-da aqui por referência. Será apreciado que o material genético associado aesses anticorpos humanos pode também ser isolado e manipulado comodescrito aqui.
Ainda um outro meio altamente eficiente para gerar anticorposrecombinantes é revelado por Newman1 Biotecnologia 10: 1455-1460 (1992).
Especificamente, essa técnica resulta na geração de anticorpos primatizadosque contêm domínios variáveis de macaco e seqüências constantes huma-nas. Esta referência, é incorporada por referência em sua totalidade aqui.Além do mais, essa técnica é também descrita nas patentes U.S. nos.5.658.570, 5.693.780 e 5.756.096 comumente cedidas cada uma das quaisé incorporada aqui por referência.
Em uma outra concretização, linfócitos podem ser selecionadospor micromanipulação do genes variáveis isolados. Por exemplo, célulasmononucleares de sangue periférico podem ser isoladas de um mamíferoimunizado e cultivadas por cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem sertríadas quando a IgGs específicas que satisfazem os critérios de triagem.Células oriundas de cavidades positivas podem ser isoladas. Células B deprodução de Ig individuais podem ser isoladas por FACS ou por indenficaçãodelas em um ensaio de placa hemolítico mediada por complemento. CélulasB de produção de Ig podem ser micromanipuladas em um tubo e os genesde Vh e Vl podem ser ampliados usando-se, por exemplo, RT-PCR. Os ge-nes de Vh e Vl podem ser clonados em um vetor de expressão de anticorpoe transfectados em células (por exemplo, células eucarióticas ou procarióti-cas) para a expressão.
Alternativamente, linhas de células de produção de anticorpopodem ser selecionadas e cultivadas usando-se técnicas bem-conhecidaspelo técnico versado. Tais técnicas são descritas em uma variedade de ma-nuais de laboratório e publicações primárias. Neste aspecto, técnicas ade-quada para o uso na invenção como descritas abaixos são descritas em Cur-rent Protocols in Immunology, Coligan e outros, Eds., Green Publishing As-sociates e Wiley-lnterscience, John Wiley e Sons, New York (1991) que éincorporado por referência em sua totalidade, incluindo suplementos.
Anticorpos para o uso nos métodos de diagnóstico e terapêuti-cos revelados aqui podem ser produzidos por qualquer método conhecido natécnica para a síntese de anticorpos, em particular, por síntese química oude preferência, por técnicas de expressão recombinante como descritas aqui.
Em uma concretização, um anticorpo de Sp35, ou fragmento deligação de antígeno, variante, ou seu derivado da invenção compreende umaregião constante sintética que um ou mais domínios são parcialmente outotalmente apagados ("anticorpos apagados de domínio"). Em certas concre-tizações anticorpos modificados compatíveis compreenderão construtos ouvariantes apagados de domínio em que o domínio de C»2 total foi removido(construtos de ACh2). Para outras concretizações um peptídeo de ligaçãocurta pode ser usado como substituto do domínio apagado para prover flexi-bilidade e liberdade de movimento para a região variável. Aqueles versadosna técnica apreciarão que tais construtos são particularmente preferidos de-vido às propriedades reguladoras do domínio de CH2 sobre a taxa catabólicado anticorpo. Construtos apagados de domínio podem ser derivados usan-do-se um vetor (por exemplo, da Biogen IDEC Incorporated) que codifica umdomínio constante de ser humano de IgGi (vide, por exemplo, WO02/060955A2 e W002/096948A2, que são incorporadas por referência emsua totalidade). Este vetor exemplar foi engenheirado para deletar o domíniode Ch2 e prover um vetor sintético que expressa uma região constante deIgGi deletada de domínio região.
Em certas concretizações, anticorpos de Sp35, ou fragmentosde ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção são mini-corpos. Minicorpos podem ser produzidos usando-se métodos descritos natécnica (vide, por exemplo, vide por exemplo, a patente U.S. nQ 5.837.821 ouWO 94/09817A1, que são incorporadas por referência em sua totalidade).
Em uma concretização, um anticorpo de Sp35, ou fragmento deligação de antígeno, variante, ou seu derivado da invenção compreende umacadeia pesada de imunoglobulina tendo deleção ou substituição de pouco ouainda um aminoácido simples tanto quanto ele permite associação entre assubunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação de um aminoácido sim-pies em áreas selecionadas do domínio de Ch2 podem ser suficiente parasubstancialmente reduzir ligação de Fc e desse modo aumentar localizaçãode tumor. Similarmente, pode ser desejável simplismente deletar parte umou mais domínios de região constante que controlam a função efetora (porexemplo, ligação de complemento) a ser modulada. Tais deleções parciaisdas regiões constantes podem aperfeiçoar características selecionadas doanticorpo (semi-vida do soro) enquanto deixando outras funções desejáveisassociadas ao domínio de região constante objeto intacto. Além do mais,como aludido acima, as regiões constantes dos anticorpos revelados podemser sintéticos através da mutação ou substituição de um ou mais aminoáci-dos que aumenta o perfil do construto resultante. Neste aspecto pode serpossível romper a atividade provida por um sítio de ligação conservado (porexemplo, ligação de Fc) enquanto substancialmente mantendo a configura-ção e perfil imunogênico do anticorpo modificado. Ainda outras concretiza-ções compreendem a adição de um ou mais aminoácidos à região constantepara aumentar características desejáveis tal como função efetora ou provermais ligação de carboidrato ou citotoxina. Em tais concretizações pode serdesejável inserir ou replicar seqüências específicas derivadas dos domíniosde região constante selecionados.
A presente invenção também provê anticorpos que compreen-dem, consistem essencialmente de, ou consiste em, variantes (incluindo de-rivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões de Vh e/ou re-giões de VL) descritas aqui, os anticorpos ou seus fragmentos imunoespeci-ficamente se ligam a um polipeptídeo de Sp35 ou fragmento ou sua variante.Técnicas-padrão conhecidas por aqueles versados na técnica podem serusadas para introduzir mutações na seqüência de nucleotídeos que codificaum anticorpo de Sp35, incluindo, mas não limitadas a, mutagênese de sítio-dirigia e mutagênese mediada por PCR que resultam em substituições deaminoácido. De preferência, as variantes (incluindo derivados) codificammenos do que 50 substituições de aminoácido, menos do que 40 substitui-ções de aminoácido, menos do que 30 substituições de aminoácido, menosdo que 25 substituições de aminoácido, menos do que 20 substituições deaminoácido, menos do que 15 substituições de aminoácido, menos do que10 substituições de aminoácido, menos do que 5 substituições de aminoáci-do, menos do que 4 substituições de aminoácido, menos do que 3 substitui-ções de aminoácido, ou menos do que 2 substituições de aminoácido emrelação à região de Vh region, VhCDRI , VHCDR2, VHCDR3, Vl region, VlC-DR1, VLCDR2, ou VLCDR3 de referência. Uma " substituição de aminoácidoconservadora" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído com umresíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral com uma carga similar. Fa-mílias de resíduo de aminoácidos tendo cadeias laterais com cargas simila-res foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com ca-deias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias late-rais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias lateraispolares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina,treonina, tirosina, cisteína), nonpolar cadeias laterais (por exemplo, alanina,valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadei-as laterais beta-ramif içadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e ca-deias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histi-dina). Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente aolongo de toda ou parte da seqüência de codificação, tal como mutagênesede saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados quanto a ativida-de biológica para identificar mutantes que retêm atividade (por exemplo, acapacidade para ligar um polipeptídeo de Sp35).
Por exemplo, é possível para introduzir mutações apenas emregiões de estrutura ou apenas em regiões de CDR de uma molécula de an-ticorpo. Mutações introduzidas podem ser silenciosas ou mutações "missen-se" neutras, isto é, não têm, ou têm pouco, efeito sobre uma capacidade doanticorpo de ligar antígeno. Esses tipos de mutações podem ser úteis paraotimizar uso de códon, ou aperfeiçoar uma produção de anticorpo do hibri-doma. Alternativamente, mutações "missense" não neutras podem alteraruma capacidade do anticorpo para ligar antígeno. A localização de mutações"missense" neutras e mais silenciosas é provável estar nas regiões de estru-tura, enquanto a localização de mutações "missense" não neutras deve serprovável em CDR, embora isso não seja uma exigência absoluta. Aqueleversado na técnica seria capaz de projetar e moléculas mutante de testecom propriedades desejadas tal como nenhuma alteração na atividade oualteração de ligação de antígeno na atividade de ligação (por exemplo, aper-feiçoamentos na atividade ou mudança na ligação de antígeno no anticorpoespecificidade). Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expres-sa e a atividade biológica e/ou funcional da proteína codificada, (por exem-plo, capacidade de imunoespecificamente se ligar pelo menos um epitopo deum polipeptídeo de Sp35) pode ser determinada usando-se técnicas descri-tas aqui ou por técnicas de modificação rotineiras conhecidas na técnica.
IV. POLINUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM ANTICORPOS DE Sp35
A presente invenção também provê para moléculas de ácidonucléico que codificam anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de an-tígeno, variantes, ou seus derivados da invenção.
Em uma concretização, a presente invenção provê um polinu-cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con-sistindo em um ácido nucléico que codificam uma região variável de cadeiapesada de imunoglobulina (VH), onde pelo menos uma das CDRs da regiãovariável de cadeia pesada ou pelo menos duas das CDRs da região variávelde cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a se-qüências de aminoácidos de cadeia pesada de CDR1, CDR2, ou CDR3 dereferência de anticorpos de Sp35 monoclonais revelados aqui. Alternativa-mente, as regiões de CDR1, CDR2, e CDR3 do VH são pelo menos 80%,85%, 90% ou 95% idênticas a seqüências de aminoácidos de cadeia pesadade CDR1, CDR2, e CDR3 de referência de anticorpos de Sp35 monoclonaisrevelados aqui. Assim, de acordo com esta concretização a região variávelde cadeia pesada da invenção tem seqüências de polipeptídeos de CDR1,CDR2, ou CDR3 relacionadas com as seqüências de polipeptídeos mostra-das na tabela 4:TABELA 4: seqüências de aminoácidos de VH CDR1, CDR2, e CDR3 dereferência*
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*Determinado pelo sistema de Kabat (vide supra)
N=seqüência de nucleotídeos, P=seqüência de polipeptídeos.Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno compreendendo a VH codificada pelo polinucleotídeo especifi-camente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em uma outra concretização, a presente invenção provê um po-linucleotídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ácido nucléico que codifica uma região variável de ca-deia pesada de imunoglobulina (VH) em que as regiões de CDR1, CDR2, eCDR3 têm seqüências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos CDR1,CDR2, e CDR3 mostrados na tabela 4. Em certas concretizações, um anti-corpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VH codificadapelo polinucleotídeo especificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em um outro aspecto, a presente invenção provê um polinucleo-tídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou que con-siste em um ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia pesa-da de imunoglobulina (VH) em que as regiões de CDR1, CDR2, e CDR3 sãocodificadas pela seqüência de nucleotídeos que são idênticas à seqüênciade nucleotídeos que codificam os grupos CDR1, CDR2, e CDR3 mostradosna tabela 4. Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmento de liga-ção de antígeno compreendendo a VH codificada pelo polinucleotídeo espe-cificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se ligam ao mesmoepitopo que um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consisteem: 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7,3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2,3P4C5.1 D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (LÍ022), 35-E04 (LÍ033), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33,Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5),3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571(L1a.11), 3582 (L1a.12), e 1968 (L1a.13), ou competitivamente inibirá tal umanticorpo monoclonal de ligação a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga a um polipep-tídeo de Sp35 ou seu fragmento, ou um polipeptídeo de variante de Sp35,com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) nãomais do que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10'7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9M1 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ1(Τ13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10'15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em uma outra concretização, a presente invenção provê um po-linucleotídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ácido nucléico que codificam uma região variável decadeia leve de imunoglobulina (VL), onde pelo menos uma das CDRs daregião variável de cadeia leve ou pelo menos duas das CDRs da região vari-ável de cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a se-qüências de aminoácidos de CDR1, CDR2, ou CDR3 de cadeia leve de refe-rência de anticorpos de Sp35 monoclonais revelados aqui. Alternativamente,as regiões de CDR1, CDR2, e CDR3 da VL são pelo menos 80%, 85%, 90%ou 95% idênticas a seqüências de aminoácidos de CDR1, CDR2, ou CDR3de cadeia leve de referência de anticorpos de Sp35 monoclonais reveladosaqui. Assim, de acordo com essa concretização uma região variável de ca-deia leve da invenção tem seqüência de polipeptídeos de CDR1, CDR2, ouCDR3 relacionadas com a seqüência de polipeptídeos mostrados na tabela 5:
TABELA 5: Seqüências de aminoácido de VL CDR1, CDR2, e CDR3 de refe-rência*
<table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table>
*Determinado pelo sistema de Kabat (vide supra).
N=seqüência de nucleotídeos, P=seqüência de polipeptídeos.
Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno compreendendo a VL codificada pelo polinucleotídeo especifi-camente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em uma outra concretização, a presente invenção prove um po-linucleotídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ácido nucléico que codificam uma região variável decadeia leve de imunoglobulina (VL) em que as regiões de CDR1, CDR2, eCDR3 têm seqüências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos CDR1,CDR2, e CDR3 mostrados na tabela 5. Em certas concretizações, um anti-corpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VL codificadapelo polinucleotídeo especificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em um outro aspecto, a presente invenção provê um polinucleo-tídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou que con-siste em um ácido nucléico que codificam uma região variável de cadeia levede imunoglobulina (VL) em que as regiões de CDR1, CDR2, e CDR3 sãocodificadas pela seqüência de nucleotídeos que são idênticas à seqüênciade nucleotídeos que codificam os grupos CDR1, CDR2, e CDR3 mostradosna tabela 5. Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmento de liga-ção de antígeno compreendendo the VL codificado pelo polinucleotídeo es-pecificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga ao mesmoepitopo que um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7,3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2,3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33,Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5),3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571(L1a.11), 3582 (L1a.12), e 1968 (L1a.13), ou competitivamente inibirá tal an-ticorpo monoclonal de ligação a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga a um polipep-tídeo de Sp35 ou seu fragmento, ou um polipeptídeo de variante de Sp35,com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) nãomais do que 5 χ 10"2 Μ, 10'2 M1 5 χ 10'3 Μ, 10'3 Μ, 5 χ 10'4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5Μ, 10"5 Μ, 5 χ 10"6 Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10'8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10'14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em uma outra concretização, a presente invenção inclui um poli-nucleotídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ácido nucléico que codifica uma VH codificada pelo me-nos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à seqüência de polipeptídeos de VH dereferência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158 a 172,372, 376, 380, e 384 mostradas na tabela 6. Em certas concretizações, umanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VH codifi-cada pelo polinucleotídeo especificamente ou preferencialmente se liga aSp35.
Em um outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleo-tídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou que con-siste em um seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma VH codificadatendo a seqüência de polipeptídeos selecionada do grupo que consiste emSEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380 e 384 mostradas na tabela 6. Emcertas concretizações, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenocompreendendo a VH codificada pelo polinucleotídeo especificamente oupreferencialmente se liga a Sp35.
TABELA 6 - VH Seqüência de polipeptídeos
VH Seqüência δΝΟ·°
Li02 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYEMI 158WVRQ A PG KG LEWVSSIG PSGGLTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRIDDSSGWAFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLi09 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYSM 159VWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTMYADSVKGRFTISRDNSKNTFYLQMNSLRAEDTA VYYCARDSRRRYYDFWSGYHNYYYYYMDVWGKGTTVTVS-SASTKG PS VFPLAP
Li06 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYPM 160DWVRQAPGKGLEWVSSIYSSGGSTVYADSIKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAREGDSDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPLi05 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYAM 161G WVRQAPG KG LEWVSSIVSSGGYTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAREGDHNAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPLi04 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYNM 162GWVRQAPG KG LEWVSVIYPSGGGTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCASSIADDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPVH Seqüência
Li08 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYEM 163VWVRQAPGKGLEWVSSIRSSGGATKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKESPDDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPLi 11 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM 164YW VRQAPG KG LEWVSSISTSGGYTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCA RDTSDNDYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPLi10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYPM 165VWVRQAPGKGLEWVSWIGPSGGVTA YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPYSSGWWDFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPLi01 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYQM 166"TWVRQAPG KG LEWVSSIYPSGGNTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGTTEAVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPLi07 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYFM 167GWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGFTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARDRHAFDIWGQGTM VTVSSASTKG PS VFPLAPLi03 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYPM 168EWVRQAPG KG LEWVSGIYPSGGSTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARAGQWLG D FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPLi12 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYNM 169FWVRQ A PG KG LEWVS RISSSGGMTMYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREALRPYCSGGSCYSDYYYYGMDVWGQGTTVTVS-SASTKGPSVFPLAP1A7 QVQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYT FTNYGMN 170WVKQAPGKGLKWMGW
INTDTGEPTYTEDFQGRFAFSLETSASTVYLQFNNLKNEDTATYFCAREGVHFDYWGQGTTVTVSS2F3 EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWL 171DWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATNYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYFCTPSFA YWGQGTTVTVSS<table>table see original document page 92</column></row><table>
Em uma outra concretização, a presente invenção inclui um poli-nucleotídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ácido nucléico que codifica uma VH codificada pelo me-nos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à seqüência de polipeptídeos de VH dereferência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158-172,372, 376, 380, e 384. Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmentode ligação de antígeno compreendendo a VH codificada pelo polinucleotídeoespecificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em um outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleo-tídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou que con-siste em um seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma VH codificadada invenção, selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 158-172,372, 376, 380, e 384. Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmentode ligação de antígeno compreendendo a VH codificada pelo polinucleotídeoespecificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga ao mesmoepitopo que um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consisteem,(201') 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7,3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2,3P4C5.1 D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li.10), 30-B01 (LiH)1 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33,Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5),3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571(L1a.11), 3582 (L1a.12), e 1968 (L1a.13), ou competitivamente inibirá tal an-ticorpo monoclonal de ligação a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga a um polipep-tídeo de Sp35 ou seu fragmento, ou um polipeptídeo de variante de Sp35,com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (K0) nãomais do que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5Μ, 10-5 Μ, 5 χ 10-6 Μ, 10-6 Μ, 5 χ 10-7 Μ, 10-7 Μ, 5 χ IO-8 Μ, 10-8 Μ, 5 χ 10"9Μ, ΙΟ"9 Μ, 5 χ 10'10 Μ, ΙΟ"10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ IO'12 Μ, 10'12 Μ, 5 χ10·13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou ΙΟ-15 Μ.
Em concretizações adicionais, a presente invenção inclui umpolinucleotídeo isolado que codifica uma região variável de cadeia pesada(VH), onde o polinucleotídeo compreende uma VH codificada seqüência deácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs 173 a184, 370, 374, 378 e 382, como mostrada na tabela 7. Em certas concretiza-ções, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo aVH codificada pelo polinucleotídeo especificamente ou preferencialmente seliga a Sp35.TABELA 7 - Polisseqüência de nucleotídeos de VH
<table>table see original document page 94</column></row><table>VH Seqüência
Li05 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTG 176TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGCTTACGCTATGG GTTGG GTTCGCCAAG CTCCTG GTAAAG GTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCGTTTCTTCTGGTGGCTATACTGATTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTG C AG ATG AAC AGCTTAAG G GCTG AG G ACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGAGGGTGACCATAATG CTTTTG ATATCTG GG GCCAAG G G AC AATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC
Li04 G AAGTTC AATTGTTAG AGTCTG GTG G CG GTCTTG 177TTC AG CCTG GTG GTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTG CTTCCG G ATTCACTTTCTCTCGTTAC AATATGG GTTG G GTTCG CCAAGCTCCTG GTAAAG GTTTGG AGTGGGTTTCTGTTATCTATCCTTCTGGTGGCGGTACTCATTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACG GCCGTGTATTACTGTG CG AGTTCTATAG CAGATGATG CTTTTG ATATCTG G G GCC AAG G G AC AATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC
Li08 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTG 178TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCATTACGAGATGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGG AGTG GGTTTCTTCTATCCGTTCTTCTG GTG GCGCTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTG C AG ATG AAC AGCTTAAG G G CTG AG G ACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGAGTCGCCAGACGACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCVH Seqüência
Lil 1 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTG 179TTC AGCCTG GTG GTTCTTTACGTCTTTCTTGCG CTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTTCTTACGCTATGTATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCTCTACTTCTGGTGGCTATACTGGTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATACCAGCGATAATGACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAG G G ACC ACG GTC ACCGTCTC AAGCG CCTCC ACCAAG GGCCCATCG GTCTTCCCG CTAG CACCC
Li 10 G AAGTTC A ATTGTTAG AGTCTG GTG G CGGTCTTG 180TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTG CTTCCG G ATTC ACTTTCTCTACTTACCCTATGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTGGATCGGTCCTTCTGGTGGCGTTACTG CTTATG CTG ACTCCGTTAAAG GTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACCCTATAGCAGTGGCTGGTGGGACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC
Li01 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTG 181TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAAGTACCAGATGACTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCTATCCTTCTGGTGGCAATACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTGGGACTACAGAGG C AGTCTTTG ACT ACTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCVH Seqüência
Li07 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTG 182TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTATGTACTTTATGGGTTG GGTTCG CCAAGCTCCTG GTAAAG GTTTG GAGTG G GTTTCTTCTATCTCTCCTTCTG GTGGCTTTACTTCTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACTGCAGTCTACTATTGTGCGAGAGATCGGCATGCTTTTGAT ATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC
Li03 G AAGTTC AATTGTTAG AGTCTG GTG GCG GTCTTG 183TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCAGTACCCTATGGAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGGTATCTATCCTTCTGGTGGCTCTACTGTTTATG CTG ACTCCGTT AAAG GTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTG C AG ATG A AC AG CTTAAG G G CTG AG G ACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCGGGGCAGTGGCTGGGGGACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGG G CCC ATCG GTCTTCCCG CTAG CACCC
Li12 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTG 184TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTG CTTCCG G ATTC ACTTTCTCTCAGTACAATATGTTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTG G GTTTCTCGTATCTCTTCTTCTG GTG G CATGACTATGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGCGTTACGG CCTT ATTGTAGTG GTG GTAG CTGCTACTCCG ACTACTACTACTACG GTATGG ACGTCTG G G GCC AAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCVH Seqüência
SEQ IDNO:
Li 13 G AAGTTC A ATTGTTAG AGTCTG GTG GCG GTCTTG 370TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCATTACGAGATGTATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTG G GTTTCTCGTATCGTTTCTTCTGGTG GCTTTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACAGAGGGTGATAATG ATG CTTTTG ATATCTG GGGCC AAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGC
Li32 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTG 374TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGCTTACATGATGCAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTG G GTTTCTTCTATCTCTCCTTCTG GTG GC AATACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGATTATGGATACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
Li33 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTG 378TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTATTTACCCTATGTTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTGGATCGGTCCTTCTGGTGGCATTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCGAGAGAGGGGCATAACG ACTG GTACTTCG ATCTCTG G G GCCGTG G CACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
Li34 G AAGTTC AATTGTTAG AGTCTG GTG G CG GTCTTG 382TTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTG CTTCCG G ATTC ACTTTCTCTAATTACG AG ATGTATTG G GTTCG CC AAG CTCCTG GTAAAGGTTTG GAGTGGGTTTCTGGTATCTATTCTTCTGGTGGCATTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCTAGGGCAGCCATCCTCG ACTG GTACTTCG ATCTCTG GGG CCGTG GC ACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
Em uma outra concretização, a presente invenção inclui um poli-nucleotídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ácido nucléico que codifica VH pelo menos 80%, 85%,90% ou 95% idêntico à seqüência de ácidos nucléicos de referência selecio-nada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 173-184, 370, 374, 378 e 382da TABELA 7. Em certas concretizações, o polinucleotídeo codifica um poli-peptídeo de VH que especificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga ao mesmoepitopo que um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consisteem,(201') 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7,3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2,3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOI)1 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33,Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5),3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571(L1a.11), 3582 (L1a.12), e 1968 (L1a.13), ou competitivamenté inibirá tal an-ticorpo monoclonal de ligação a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VH codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga a um polipep-tídeo de Sp35 ou seu fragmento, ou um polipeptídeo de variante de Sp35,com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) nãomais do que 5 χ 10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10'4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10 5Μ, 10-5 Μ, 5 χ 10'6 Μ, 10-6 Μ, 5 χ 107 Μ, 10-7 Μ, 5 χ 10-8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ IO-9Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, ΙΟ"10 Μ, 5 χ 1.0'11 Μ, 10·11 Μ, 5 χ 10'12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10"14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em uma outra concretização, a presente invenção inclui um poli-nucleotídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ácido nucléico que codifica uma VL pelo menos 80%,85%, 90% ou 95% idêntico a a reference VL seqüência de polipeptídeos se-lecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381e 385, mostrados na tabela 8. Em certas concretizações, um anticorpo oufragmento de ligação de antígeno compreendendo the VL codificado pelopolinucleotídeo especificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em um outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleo-tídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou que con-siste em um seqüência de ácidos nucléicos que codifica a VL tendo a se-qüência de polipeptídeos selecionado do grupo que consiste em SEQ IDNOs: 273 to 286, 373, 377, 381 e 385, mostrados na tabela 8. Em certasconcretizações, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compre-endendo a VL codificada pelo polinucleotídeo especificamente ou preferen-cialmente se liga a Sp35.
TABELA 8 - Seqüência de polipeptídeos de VL
VL Sequence SEQID NO:
Li02 FYSHSAQYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGD 273KFASWYQQKAGQSPVLVIFQDRKRLSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDTNTVVFGGGTKLTVLGQPKAAPLi09 FYSHSAQDIQMTQSPSSLSAFVGDRVAITCRASQS 274IDTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASKLEDGVPSRFSGSGTGTDFTLTIRSLQPEDFGTYYCQQSYSPPLTFGGGTKVEIKRTV AAPLi06 FYSHSAQDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQS 275ISSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLRTGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYSYPLTFGQGTKLEIKRTV AAPLi05 FYSHSAQSVLTQPPSVSVAPGQTARISCGGDNIGS 276KSVHWYQQRPGQAPVLVVYDDYDRPSGIPERFSGSNSGDTAILTITRVEVGDEADFYCQVRDSRTEERVFGGGTKVTVLGQPKAAPLi08 FYSHSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQD 277ISYYLNWYQQKPGKAPKVLIYDVSNLQTGVPSRFSGSASATDFTLTISSLQPEDIATYYCQQSDNLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPVL Sequence SEQID NO:
Li11 FYSHSAQDIQMTQSPSSVSAPIGDRVTITCRASQEI 278ANYLAWYQQKPGKAPK
LLIYDTYTLQTDVPPRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDTATYFCQQADIFPLSFGGGTKVEIKRTVAAPLi10 FYSHSAQDIQMTQSPSSMSASVGDTVTITCRASQ 279GIGNWLAWYQQKPGKAPTLLIYAASSLESGVPSRFTGSGSSSGIDFTLTISDLHPEDLATYYCQQAQTFPLTFGGGTRVDLKRTVAAPLi01 FYSHSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQD 280ISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFS
FGGGTKVEIKRTVAAPLi07 FYSHSAQSELTQPPSVSVSPGQTAIITCSGDQLGD 281KHVAWYQQKPGQSPVLVIYLDIKRPAGISERFSGSNSG NTATLTIRGTQAM D E AD YYCQ AW DIKTVFG GGTKLTVLSQPKAAPLi03 FYSHSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQS 282ISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAP1A7 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHW 283YQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGT-KLEIK
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIYNYLAW 284FQQKQGKSPQLLVYNAKTLPDGVPSRFSGSGSGTQYFLKINSLQPEDFGSYYCQHFWAIPYTFGGGT-KLEIKR
3P1 DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGN 285D10 QKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRF.2C TGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLF3 TFGSGTKLEIR
3P1 DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGN 286E11. QKSYLTWYQQKPGQPPK3B7 LLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLFTFGSGTKLEIR
Li13 DIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLA 373WYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFA VYYCQ-QRSNWPMYTFGQGTKLEIK
2F3VL Sequence SEQID NO:
Li32 DIQMTQSPDSLSASVGDRVTITCQASQDISYYLNW 377YQQKPGMAPKLLIYDAFILEGGAPSRFSGSGSGTDFSFTISNLQPEDIATYFCQQSDQLPVTFGQGTK-VEIR
□33 DIQMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLA 381WYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDKW-PLTFGGGTKVEIKLi34 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQDISNYLSW 385YQQKPG KAPKLLIYDAFNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQHYDNLPFTFGPGTRVA-IR
Em uma outra concretização, a presente invenção inclui um poli-nucieotídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ácido nucléico que codifica a VL pelo menos 80%, 85%,90% ou 95% idêntico à seqüência de polipeptídeos de VL de referência se-5 lecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381e 385,. Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmento de ligação deantígeno compreendendo a VL codificada pelo polinucleotídeo especifica-mente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em um outro aspecto, a presente invenção inclui um polinucleo-10 tídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou que con-siste em um seqüência de ácidos nucléicos que codifica a VL da invenção,selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377,381 e 385. Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno compreendendo a VL codificada pelo polinucleotídeo especifi-15 camente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga ao mesmo20 epitopo que um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7,3P2C6 3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2,3P4C5.1 D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOI)f 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, LÍ33,Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5),3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571(L1a.11), 3582 (L1a.12), e 1968 (L1a.13), ou competitivamente inibirá tal an-ticorpo monoclonal de ligação a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga a um polipep-tídeo de Sp35 ou seu fragmento, ou um polipeptídeo de variante de Sp35,com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) nãomais do que 5 χ 10"2 M, 10"2M, 5x10"3 Μ, 10"3 M, 5 χ 10'4 M, 10'4M, 5x10"5Μ, 10"5 M, 5 χ 10"6 Μ, 10'6 M, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10'9Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10 Μ, 10"10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10-14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em concretizações adicionais, a presente invenção inclui umpolinucleotídeo isolado que codifica uma região variável de cadeia leve (VL),onde o polinucleotídeo compreende uma seqüência de ácidos nucléicos deVl selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs 185 a 194, 371, 375,379 e 383, como mostrado na tabela 9. Em certas concretizações, um anti-corpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo a VL codificadapelo polinucleotídeo especificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
TABELA 9 - Polisseqüência de nucleotídeos de VL
VL Seqüência SEQID NO:
Li02 TTCTATTCTCACAGTGCACAGTACGAATTGACTC 185AGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATTTGCTTCCTGGTATCAGCAGAAGGCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTTTCAAGATAGGAAGCGTCTCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTG G CTCC A ACTCTG GGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACACCAACACTGTGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCVL Seqüência SEQID NO:
Li09 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGA 186CCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATTTGTGGGAGACAGAGTCGCCATCACTTGCCGCGCAAGTCAGAGCATCGACACCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAG G G AAAG CCCCTAAACTCCTG ATCTATGCTG C ATCCAAGTTG G AAG ACG G G GTCCC ATC AAGATTCAGTGGCAGTGGAACTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGAAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGGAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTCCCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCALi06 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGA 187CCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATG CTG C ATCC AGTTTACG AACTG G G GTCCC ATCAAGATTCAGGGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTG C AACGTATTACTGTCTAC AAG ATTAC AGTTACCCTCTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCALi05 TTCTATTCTCACAGTGCACAGAGCGTCTTGACTC 188AGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGCCAGACGGCCAGGATTTCCTGTGGGGGAGACAACATTGGAAGTAAGAGTGTCCACTGGTACCAGCAGAGGCCAGGCCAGGCCCCTGTCCTGGTCGTGTATGATGATTATGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTG G CTCC AACTCTG G G G ACACG GCCATCCTGACCATCACCAGGGTCGAAGTCGGGGATGAGGCCGACTTTTATTGTCAGGTGAGGGACAGCCGTACTGAGGAACGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCTTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCLi08 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGA 189CCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGTTACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTACGATGTATCCAATTTGCAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGCGTCTGCGACAGATTTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCGACATATTACTGTCAACAGTCTGATAATCTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATTAAACGAACTGTGGCTGCACCAVL Seqüência SEQID NO:
Li 11 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGA 190CCCAGTCTCC ATCTTCTGTGTCTG CACCTATAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGAGATTGCCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATACATACACTTTGCAGACTGACGTCCCACCGAGGTTCAGCGGCAGTGGTTCGGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATACTGCAACTTACTTTTGTCAACAGGCTGACATTTTCCCGCTCTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG GCTG CACCALi 10 TTCTATTCTCACAGTGCACAAG ACATCCAG ATG A 191CCCAGTCTCCATCTTCCATGTCTGCTTCTGTAGGGGACACAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAG G GTATTG GCAACTG GTTAGCCTG GTATC AGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCAACTCTCCTGATCTATG CTG C ATCC AGTTTG G AAAGTGG G GTCCC ATCAAGGTTCACCGGCAGCGGCAGTTCCTCTGGG ATAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGCACCCTGAAGATTTGGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTCAGACTTTCCCGCTCACCTTCGGCGGAGGGACCAGGGTGGACCTCAAGCGAACTGTGGCTGCACCALi01 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGA 192CCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAG G AC ATTAG C AACTATTTAAATTG GTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACG ATG C ATCC A ATTTG G AAACAG G G GTCCC ATC AAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTGACAGGTTCCCTGCGGTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGG AG ATC AAACG AACTGTG G CTG CACCALi07 TTCTATTCTCACAGTGCACAGAGCGAATTGACTC 193AGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGAC AGCC ATC ATC ACCTG CTCTG G AG ATC AGTTG GGTGACAAACATGTGGCTTGGTATCAACAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCTAGACATTAAGAGGCCCGCAGGGATTTCTGAGCGATTCTCTG G CTCC AACTCTG G AAATAC AGCC ACTCTG ACCATCAGAGGGACCCAGGCTATGGATGAAGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACATCAAGACGGTCTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGACCGTCCTGAGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCVL Seqüência SEQID NO:
Li03 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGA 194CCC AGTCTCC ATCCTCCCTGTCTG CATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTG C ATCCAGTTTGC AAAGTG G GGTCCCATC AAG GTTC AGTG G CAGTGG ATCTG GG AC AG ATTTC ACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCALi 13 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTG 371TCTTTGTCTCC AGG G G AAAG AG CCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTG GTACCAAC AG AAACCTG GCC AG G CTCCCAG G CTCCTC ATCTATG ATG C ATCC A AC AG G GCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTG G G ACAG ACTTC ACTCTC ACC ATC AGC AG CCTAG AG CCTG AAG ATTTTG C AGTTTATTACTGTC AGCAGCGTAGCAACTGGCCGATGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAALi32 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGT 375CTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAAGACATTAGCTACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGATGGCCCCTAAACTCCTCATCTACGATGCCTTCATTTTGGAAGGAGG G G CCCC ATC ACG GTTC AGTG GG AGCG GCTCTGG G AC AG ATTTTTCTTTC ACC ATC AG C A ATCTAC AGCCTGAGGATATTGCAACTTATTTCTGTCAACAGTCTGATCAACTGCCCGTGACCTTCGGCCAAGGGACC A AG GTG G AAATC AG ALi33 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGGCACCCTG 379TCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTG GTACC AAC AG AAACCTGGCC AG G CTCCCAG G CTCCTC ATCTATG ATG C ATCC A AC AG G GCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAGGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGATAAGTGGCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAVL Seqüência SEQID NO:
Li34 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGT 383CTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAGTTGGTATCAGCAGAAACCAGGTAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGATGCTTTCAATTTGGAGACAGGAGTCCCATCGAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGCACAGATTTTACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACATATTACTGTCAGCACTATGAT AATCTCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAGAGTGGCGATCAGA
Em uma outra concretização, a presente invenção inclui um poli-nucleotídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ácido nucléico que codifica uma VL pelo menos 80%,85%, 90%, ou 95% idêntica ao polinucleotídeo de VL selecionado do grupoque consiste em SEQ ID NOs: 185-194, 371, 375, 379 e 383 da TABELA 9.Em certas concretizações, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de VLque especificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga ao mesmoepitopo que um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7,3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2,3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOI)1 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33,Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5),3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571(L1a.11), 3582 (L1 a. 12), e 1968 (L1 a. 13), ou competitivamente inibirá tal an-ticorpo monoclonal de ligação a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em uma VL codificada por um ou mais dos polinucleotídeosdescritos acima especificamente ou preferencialmente se liga a um polipep-tídeo de Sp35 ou seu fragmento, ou um polipeptídeo de variante de Sp35,com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) nãomais do que 5 χ 10"2 Μ, 10"2M, 5x10'3 Μ, 10'3 M, 5 χ 10"4 M1 10"4M,5x10"5Μ, 10"5 M1 5 χ 10"6 M1 10"6 M, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 M, 5 Χ 10"8 Μ, 10"8 M, 5 Χ 10"9Μ, 10"9 Mf 5 χ 10"10 M1 10"10 M, 5 χ 10"11 Μ, 1.0"11 M1 5 χ 10"12 Μ, 10'12 M1 5 χ10"13 Μ, 10'13 Μ, 5 χ 10"14 Μ, 10'14 Μ, 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Qualquer um dos polinucleotídeos descritos acima pode ulteri-ormente incluir ácidos nucléicos adicionais, que codificam, por exemplo, umsinal de peptídeo para dirigir secreção do polipeptídeo codificado, regiõesconstantes de anticorpo como descritos aqui, ou outros polipeptídeos heteró-Iogos como descritos aqui.
Também, como descritos em mais detalhes em outro lugar aqui,a presente invenção inclui composições compreendendo os polinucleotídeoscompreendendo um ou mais dos polinucleotídeos descritos acima, em umaconcretização, a invenção inclui composições compreendendo um primeiropolinucleotídeo e segundo polinucleotídeo em que o dito primeiro polinucleo-tídeo codifica um polipeptídeo de VH como descrito aqui e em que o dito se-gundo polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de VL como descrito aqui.
Especificamente uma composição que compreende, consiste essencialmen-te de, ou consiste em um polinucleotídeo de VH, como mostrado na tabela 7,e um polinucleotídeo de VL, como mostrado na tabela 9, em que o dito poli-nucleotídeo de VH e o dito polinucleotídeo de VL são selecionados do grupoque consiste em:
i) SEQ ID NO:173 e SEQ ID NO: 185;
ii) SEQ ID NO: 174 e SEQ ID NO: 186;
iii) SEQ ID NO: 175 e SEQ ID NO: 187;
iv) SEQ ID NO: 176 e SEQ ID NO: 188;
v) SEQ ID NO: 178 e SEQ ID NO: 189;
vi) SEQ ID NO: 179 e SEQ ID NO: 190;
vii) SEQ ID NO: 180 e SEQ ID NO: 191;
viii) SEQ ID NO: 181 e SEQ ID NO: 192;
ix) SEQ ID NO: 182 e SEQ ID NO: 193;χ) SEQ ID NO: 183 e SEQ ID NO: 194;
xi) SEQ ID NO: 370 e SEQ ID NO: 371;
xii) SEQ ID NO: 374 e SEQ ID NO: 375;
xiii) SEQ ID NO: 378 e SEQ ID NO: 379; e
xiv) SEQ ID NO: 382 e SEQ ID NO: 385.
A presente invenção também inclui fragmentos dos polinuçleotí-deos da invenção, como descritos em outro lugar, polinucleotídeos adicio-nalmente que codificam polinucleotídeos de fusão, fragmentos de Fab1 eoutros derivados, como descritos aqui, são também contemplados pela in-venção.
Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados porqualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a seqüência de nu-cleotídeos do anticorpo for conhecida, um polinucleotídeo que codifica o po-lipeptídeo pode ser agrupada de oligonucleotídeos quimicamente sintetiza-dos (por exemplo, como descrito em Kutmeier e outros, BioTechniques17:242 (1994)), que, resumidamente, envolve a síntese de sobreposição deoligonucleotídeos contendo porções da seqüência que codifica o polipeptí-deo, anelamento e ligação daqueles oligonucleotídeos, e então ampliaçãodos oligonucleotídeos ligados por PCR.
Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpode Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivadopode ser gerado a partir de ácido nucléico de uma fonte adequada. Se umclone contendo um ácido nucléico que codifica um anticorpo particular nãoestiver disponível, mas a seqüência da molécula de é conhecida, um ácidonucléico que codifica o polipeptídeo pode ser quimicamente sintetizado ouobtido a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cD-NA de anticorpo, ou uma biblioteca de cDNA gerada a partir de, ou ácidonucléico, de preferência poli A+RNA, isolado de, qualquer tecido ou célulasque expressem o polipeptídeo ou outro anticorpo de Sp35, tais como célulasde hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo) por ampliação dePCR usando-se iniciadores sintéticos hibridizáveis para dar as extremidades3' e 5' da seqüência ou por clonagem usando-se uma sonda de oligonucleo-tídeo específica para a seqüência de genes particular para identificar, porexemplo, um clone de cDNA oriundo de uma biblioteca de cDNA que codifi-ca o polipeptídeo ou outro anticorpo de Sp35. Ácidos nucléicos ampliadosgerados por PCR podem então ser clonados em vetores de clonagem repli-cáveis usando-se qualquer método bem-conhecido na técnica.
Uma vez que a seqüência de nucleotídeos e seqüência de ami-noácidos correspondente do anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação deantígeno, variante, ou seu derivado é determinado, sua seqüência de nucle-otídeos pode ser manipulada usando-se métodos bem-conhecidos na técni-ca para a manipulação de seqüência de nucleotídeos, por exemplo, técnicasde DNA recombinante, mutagênese de sítio-dirigida, PCR, etc. (vide, porexemplo, as técnicas descritas em Sambrook e outros, Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har-bor, N.Y. (1990) e Ausubel e outros, eds., Current Protocols in MoIecuIarBio-logy, John Wiley & Sons, NY (1998), que são ambos incorporados por refe-rência aqui em suas totalidades), para gerar anticorpos tendo uma seqüên-cia de aminoácidos diferente, por exemplo para criar substituições, deleçõese/ou inserções de aminoácidos.
Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de Sp35, ou frag-mento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado pode ser constituídode qualquer poliribonucleotídeo ou polideoxribonucleotídeo, que pode serRNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, umpolinucleotídeo que codifica anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação deantígeno, variante, ou seu derivado pode ser constituído de DNA de fio únicoou duplo, DNA que é uma mistura de regiões de fio duplo e único, RNA defio único ou duplo, e RNA que é uma mistura de regiões de fio único e duplo,moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de fio únicoou, mais tipicamente, de fio duplo ou uma mistura de regiões de fio único eduplo. Além disso, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de Sp35, oufragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado pode ser consti-tuído de regiões de fio triplo compreendendo RNA ou DNA ou tanto RNAquanto DNA. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de Sp35, oufragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado pode tambémconter uma ou mais bases modificadas ou cadeias principais de DNA ouRNA modificdas para estabilidade ou por outras razões. Bases "modificadas"incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns tal como inosina.
Uma variedade de modificações podem ser feitas para DNA e RNA; assim,"polinucleotídeo" inclui quimicamente, enzimaticamente, ou metabolicamenteformas modificadas.
Um polinucleotídeo isolado que codifica uma variante não natu-ral de um polipeptídeo derivado de um imunoglobina (por exemplo, uma por-ção de cadeia pesada de imunoglobina ou porção de cadeia leve de imuno-globina) pode ser criado por introdução de uma ou mais substituições, adi-ções ou deleções de nucleotídeo na seqüência de nucleotídeos da imuno-globina tais que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoá-cido são introduzidos para dentro da proteína codificada. Mutações podemser introduzidas por Técnicas-padrão, tais como mutagênese de sítio-dirigidae mutagênese mediada por PCR. de preferência, substituições de aminoáci-do conservadoras são feitas a um ou mais resíduos de aminoácido não es-senciais.
V. Polipeptídeos de anticorpo de Sp35
A presente invenção ulteriormente refere-se a polipeptídeos iso-lados que fabricam anticorpos de Sp35, fragmentos de ligação de antígeno,variantes ou seus derivados, anticorpos de Sp35 da presente invenção com-preendem polipeptídeos, por exemplo, seqüência de aminoácidos que codifi-ca regiões de ligação de antígeno Sp35-específicas derivadas de moléculasde imunoglobulina. Uma seqüência de aminoácidos ou de polipeptídeos "de-rivado de" uma proteína designada refere-se à origem do polipeptídeo. Emcertos casos, uma seqüência de aminoácidos ou de polipeptídeos que é de-rivado de uma seqüência de aminoácidos ou de polipeptídeos de partida par-ticular tem uma seqüência de aminoácidos que é essencialmente idênticaàquela da seqüência de partida, ou uma sua porção, em que a porção con-siste em pelo menos de 10-20 aminoácidos, pelo menos de 20-30 aminoáci-dos, pelo menos de 30-50 aminoácidos, ou que é de outra maneira identífi-cável por aquele versado na técnica como tendo sua origem na seqüênciade partida.
Em uma concretização, a presente invenção provê um polipeptí-deo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou que con-siste em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH)1 on-de pelo menos uma das CDRs da região variável de cadeia pesada ou pelomenos duas das CDRs da região variável de cadeia pesada são pelo menos80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a seqüência de aminoácidos de CDR1,CDR2 ou CDR3 de cadeia pesada de referência oriunda de anticorpos deSp35 monoclonais revelados aqui. Alternativamente, as regiões de CDR1,CDR2 e CDR3 da VH são pelo menos de 80%, 85%, 90% ou 95% idênticasa seqüência de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada dereferência oriunda de anticorpos de Sp35 monoclonais revelados aqui. As-sim, de acordo com essa concretização uma região variável de cadeia pesa-da da invenção tem seqüência de polipeptídeos de CDR1, CDR2, e CDR3relacionada com os grupos mostrados na tabela 4, supra. Em certas concre-tizações, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendoo polipeptídeo de VH especificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em uma outra concretização, a presente invenção provê um po-lipeptídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou queconsiste em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH)em que as regiões de CDR1, CDR2, e CDR3 têm seqüências de polipeptí-deos que são idênticas aos grupos CDR1, CDR2, e CDR3 mostrados na ta-bela 4. Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmento de ligação deantígeno compreendendo o polipeptídeo de VH especificamente ou prefe-rencialmente se liga a Sp35.
Em uma outra concretização, a presente invenção inclui um poli-peptídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou queconsiste em um polipeptídeo de VH pelo menos 80%, 85%, 90% 95% ou100% idêntico à seqüência de polipeptídeos de VH de referência seleciona-da do grupo que consiste em SEQ ID NOs:158 a 172, 372, 376, 380 e 384as mostradas na tabela 6. Em certas concretizações, um anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno compreendendo o polipeptídeo de VH especi-ficamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em um outro aspecto, a presente invenção inclui um polipeptí-deo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou que con-siste em um polipeptídeo de VH selecionado do grupo que consiste em SEQID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380 e 384 como mostradas na tabela 6. Emcertas concretizações, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenocompreendendo o polipeptídeo de VH especificamente ou preferencialmentese liga a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ou mais dos polipeptídeos de VH descritos acima espe-cificamente ou preferencialmente se ligam ao mesmo epitopo que um anti-corpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6,1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7,3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9,30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05),34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10),30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li13, LÍ32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1),3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567(L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582(L1a.12), e 1968 (L1a.13), ou competitivamente inibirá tal anticorpo mono-clonal de ligação a Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em um ou mais dos polipeptídeos de VH descritos acima espe-cificamente ou preferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ou seufragmento, ou um polipeptídeo de variante de Sp35, com uma afinidade ca-racterizada por uma constante de dissociação (K0) não mais do que 5 χ 10"2Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10-3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10 4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10'5 Μ, 5 χ 10"6Μ, 10"6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10"9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ 10"10Μ, ΙΟ-10 Μ, 5 χ 10'11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10"13 Μ, 5 χ10"14 Μ, 10"14 M1 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em uma outra concretização, a presente invenção provê um po-lipeptídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou queconsiste em uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), on-de pelo menos uma das CDRs da região variável de cadeia leve ou pelomenos duas das CDRs da região variável de cadeia leve são pelo menos80%, 85%, 90% ou 95% idênticas a seqüência de aminoácidos de CDR1,CDR2, ou CDR3 de cadeia pesada de referência oriunda de anticorpos deSp35 monoclonais revelados aqui. Alternativamente, as regiões de CDR1,CDR2 e CDR3 da VL são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas aseqüências de aminoácidos de CDR1, CDR2, ou CDR3 de cadeia leve dereferência oriundas anticorpos de Sp35 monoclonais revelados aqui. Assim,de acordo com essa concretização uma região variável de cadeia leve dainvenção tem seqüência de polipeptídeos de CDR1, CDR2, e CDR3 relacio-nadas com os polipeptídeos mostrados na tabela 5, supra. Em certas con-cretizações, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreen-dendo o polipeptídeo de VL especificamente ou preferencialmente se liga a Sp35.
Em uma outra concretização, a presente invenção provê um po-lipeptídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou queconsiste em uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) emque as regiões de CDR1, CDR2, e CDR3 têm seqüências de polipeptídeosque são idênticas aos grupos CDR1, CDR2, e CDR3 mostrados na tabela 5.
Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmento de ligação de antíge-no compreendendo o polipeptídeo de VL especificamente ou preferencial-mente se liga a Sp35.
Em uma outra concretização, a presente invenção inclui um poli-peptídeo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou queconsiste em um polipeptídeo de VL pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% i-dêntico à seqüência de polipeptídeos de VL de referência selecionada dogrupo que consiste em SEQ ID NOs: 273 to 286, 373, 377, 381 e 385, mos-tradas na tabela 8. Em certas concretizações, um anticorpo ou fragmento deligação de antígeno compreendendo o polipeptídeo de VL especificamenteou preferencialmente se liga a Sp35.
Em um outro aspecto, a presente invenção inclui um polipeptí-deo isolado compreendendo, que consiste essencialmente de, ou que con-siste em um polipeptídeo de VL selecionado do grupo que consiste em SEQID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381 e 385,mostrados na tabela 8. Em certasconcretizações, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compre-endendo o polipeptídeo de VL especificamente ou preferencialmente se ligaa Sp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, umou mais dos polipeptídeos de VL descritos acima especificamente ou prefe-rencialmente se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo monoclonal sele-cionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11,2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4,3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12(Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02(Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01(Li11), 34-B03 (Li12), Li13, Li32, Li33, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563(L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568(L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), e 1968(L1a.13), ou competitivamente inibirá tal anticorpo monoclonal de ligação aSp35.
Em certas concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreendendo, que consiste essencialmente de, ouque consiste em a um ou mais dos polipeptídeos de VL descritos acima es-pecificamente ou preferencialmente se liga a um polipeptídeo de Sp35 ouseu fragmento, ou um polipeptídeo de variante de Sp35, com uma afinidadecaracterizada por uma constante de dissociação (Kd) não mais do que 5 χ10"2 Μ, 10"2 Μ, 5 χ 10"3 Μ, 10"3 Μ, 5 χ 10"4 Μ, 10"4 Μ, 5 χ 10"5 Μ, 10"5 Μ, 5 χ10"6 Μ, 10'6 Μ, 5 χ 10"7 Μ, 10"7 Μ, 5 χ 10"8 Μ, 10"8 Μ, 5 χ 10'9 Μ, 10"9 Μ, 5 χ10"10 Μ, 10'10 Μ, 5 χ 10"11 Μ, 10"11 Μ, 5 χ 10"12 Μ, 10"12 Μ, 5 χ 10"13 Μ, 10"13Μ, 5 χ 10'14 Μ, 10'14 M1 5 χ 10"15 Μ, ou 10"15 Μ.
Em outras concretizações, um anticorpo ou seu fragmento deligação de antígeno compreende, consiste essencialmente de ou consisteem um polipeptídeo de VH1 como mostrado na tabela 6, e um polipeptídeode VL, como mostrado na tabela 8, selecionado do grupo que consiste em:
i) SEQ ID NO: 170 e SEQ ID NO: 283;
ii) SEQ ID NO: 171 e SEQ ID NO: 284;
iii) SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO: 285;
iv) SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO: 286;
v) SEQ ID NO: 158 e SEQ ID NO: 273;
vi) SEQ ID NO: 159 e SEQ ID NO: 274;
vii) SEQ ID NO: 160 e SEQ ID NO: 275;
viii) SEQ ID NO: 161 e SEQ ID NO: 276;
ix) SEQ ID NO: 163 e SEQ ID NO: 277;
x) SEQ ID NO: 164 e SEQ ID NO: 278;
xi) SEQ ID NO: 165 e SEQ ID NO: 279;
xii) SEQ ID NO: 166 e SEQ ID NO: 280;
xiii) SEQ ID NO: 167 e SEQ ID NO: 281;
xiv) SEQ ID NO: 168 e SEQ ID NO: 282;
xv) SEQ ID NO: 372 e SEQ ID NO: 373;
xvi) SEQ ID NO: 376 e SEQ ID NO: 377;
xvii) SEQ ID NO: 380 e SEQ ID NO: 381; e
xviii) SEQ ID NO: 384 e SEQ ID NO: 385.
Qualquer um dos polipeptídeos descritos acima pode ulterior-mente incluir polipeptídeos adicionais, por exemplo, um sinal de peptídeopara dirigir secreção do polipeptídeo codificado, regiões constantes de anti-corpo como descritos aqui, ou outros polipeptídeos heterólogos como descri-tos aqui. Adicionalmente, polipeptídeos da invenção incluem fragmentos depolipeptídeo como descritos em outro lugar. Adicionalmente polipeptídeos dainvenção incluem polipeptídeo de fusão, fragmentos de Fab, e outros deriva-dos, como descritos aqui.
Também, como descritos em mais detalhes em outro lugar aqui,a presente invenção inclui composições compreendendo os polipeptídeosdescritos acima.
Será bem entendido por aquele versado na técnica que polipep-tídeos de anticorpo de Sp35 como revelados aqui podem ser modificados demodo que eles variem na seqüência de aminoácidos do polipeptídeo de liga-ção de ocorrência natural a partir dos quais eles são derivados. Por exem-plo, uma seqüência de aminoácidos ou de polipeptídeos derivada de umaproteína designada pode ser similar, por exemplo, ter uma percentagem deidentidade à seqüência de partida, por exemplo, pode ser 60%, 70%, 75%,80%, 85%, 90%, ou 95% idêntica à seqüência de partida.
Além do mais, substituições, deleções ou inserções de aminoá-cido ou de nucleotídeo que levam a mudanças ou substituições conservado-ras a regiões de aminoácido "não essenciais" podem ser feitas. Por exem-plo, uma seqüência de aminoácidos ou de polipeptídeos derivada de umaproteína designada pode ser idêntica à seqüência de partida exceto quantoa uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido individu-al, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez,quinze, vinte ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidoindividual. Em certas concretizações, uma seqüência de aminoácidos ou depolipeptídeos derivada de uma proteína designada tem uma a cinco, uma adez, uma a quinze ou uma a vinte substituições, inserções ou deleções deaminoácido individual em relação à seqüência de partida.
Certos polipeptídeos de anticorpo de Sp35 da presente invençãocompreendem, consistem essencialmente de, ou consistem em uma se-qüência de aminoácidos derivado de uma seqüência de aminoácidos huma-na. No entanto, certos polipeptídeos de anticorpo de Sp35 compreendemuma ou mais aminoácidos contíguos derivados de uma outra espécie demamífero. Por exemplo, um anticorpo de Sp35 da presente invenção podeincluir uma porção de cadeia pesada de primata, porção principal, ou regiãode ligação de antígeno. Em um outro exemplo, uma ou mais aminoácidos decamundongo podem estar presentes em um polipeptídeo de anticorpo denão camundongo, por exemplo, em um sítio de ligação de antígeno de umanticorpo de Sp35. Em certas aplicações terapêuticas, anticorpos específi-cos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus aná-logos são projetados de modo que não seja imunogênico no mamífero aoqual o polipeptídeo é administrado.
Em certas concretizações, um polipeptídeo de anticorpo de Sp35compreende uma seqüência de aminoácidos ou uma ou mais porções nãonormalmente associadas a um anticorpo, modificações exemplares são des-critas em mais detalhes abaixo. Por exemplo, um fragmento de fv de cadeiasimples da invenção pode compreender uma seqüência de Iigador flexível,ou pode ser modificada para adicionar uma porção funcional (por exemplo,PEG, um fármaco, uma toxina, ou um rótulo).
Um polipeptídeo de anticorpo de Sp35 da invenção pode com-preender, consistir essencialmente de, ou consisir de uma proteína de fusão.
Proteínas de fusão são moléculas quiméricas que compreendem, por exem-pio, um domínio de ligação de antígeno de imunoglobulina com pelo menosum sítio de ligação-alvo, e pelo menos uma porção heteróloga, isto é, umaporção com a qual ela não está naturalmente ligada na natureza. A seqüên-cia de aminoácidos podem existir em proteínas separadas que estão juntasno polipeptídeo de fusão ou elas podem normalmente existir na mesma pro-teína mas são colocadas em uma nova disposição no polipeptídeo de fusão.Proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, por síntese química, oupor criação e tradução de um polinucleotídeo em que as regiões de peptídeosão codificadas na relação desejada.
O termo "heterólogo" como aplicado a um polinucleotídeo ou umpolipeptídeo, significa que o polinucleotídeo ou o polipeptídeo é derivado deuma entidade distinta daquela do resto da entidade á qual está sendo com-parada. Por exemplo, como usado aqui, um "polipeptídeo heterólogo" a serfundido a um anticorpo de Sp35, ou um fragmento de ligação de antígeno,variante, ou seu análogo é derivado de um polipeptídeo de não imunoglobu-Iina da mesma espécie, ou polipeptídeo de imunoglobulina ou de não imu-noglobina de uma espécie diferente.
Uma "substituição de aminoácido conservadora" é uma em queo resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendouma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo ca-deias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias lateraisbásicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (porexemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não car-regadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosi-na, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, Ieu-cina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias lateraisbeta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias lateraisaromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim,um resíduo de aminoácido não essencial em um polipeptídeo de imunoglo-bina é de preferência substituído com um outro resíduo de aminoácido damesma família de cadeia lateral. Em uma outra concretização, um cordão deaminoácidos pode ser substituído com um cordão estruturalmente similarque difere em ordem e/ou composição de membros da família de cadeia la-teral.
Alternativamente, em uma outra concretização, mutações podemser introduzidas aleatoriamente ao longo da totalidade ou parte da seqüên-cia de codificação de imunoglobulina, tal como mutagênese de saturação, eos mutantes resultantes podem ser incorporados em anticorpos de Sp35para o uso nos métodos de tratamento e de diagnóstico revelados aqui etriados quanto sua capacidade de se ligar ao antígeno desejado, por exem-plo, Sp35.
VI. PROTEÍNAS DE FUSÃO E CONJUGADOS DE ANTICORPO
Como discutido em mais detalhes em outro lugar aqui, anticor-pos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus deri-vados da invenção podem ulteriormente ser recombinantemente fundidos aum polipeptídeo heterólogo no N- ou C-terminal ou quimicamente conjuga-dos (incluindo conjugações covalente e não covalentes) a polipeptídeos ououtras composições. Por exemplo, anticorpos de Sp35 de Sp35-específicopodem ser recombinantmente fundidos ou conjugados a moléculas úteiscomo rótulos em ensaios de detecção e moléculas efetoras tais como poli-peptídeo heterólogos, fármacos, radionuclídeos, ou toxinas. Vide, por exem-plo, publicações de PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; a pa-tente U.S. ns 5.314.995; e EP 396,387, que são incorporadas aqui por refe-rência em suas totalidades.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados da invenção incluem derivados que são modifica-dos, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao polipeptí-deo de modo que ligação covalente não previne o Sp35 de ligação de poli-peptídeo. Por exemplo, mas a título de limitação os derivados de polipeptí-deo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosila-ção, acetilação, pegilação, fosfilação, fosforilação, amidação, derivatizaçãopor grupos de proteção/bloqueamento conhecidos, clivagem proteolítica,ligação a um Iigante celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma de numeo-rosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas,incluindo, mas não limitadas a clivagem química específica, acetilação, for-milação, síntese metabólico de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivadopode conter uma ou mais aminoácidos não clássicos.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados da invenção podem ser constituídos de aminoáci-dos unidos entre si por ligações de peptídeo ou ligações de peptídeo modifi-cados, isto é, isoésteres de peptídeo, e podem conter aminoácidos outrosque não os 20 aminoácidos codificados por gene. Anticorpos de Sp35-específicos podem ser modificados por processos naturais, tais como pro-cessamento pós-transcritivo ou por técnicas de modificação química que sãobem-conhecidas na técnica. Tais modificações são bem descritas em textosbásicos e em monografias mais detalhadas, bem como em uma literatura depesquisa volumosa. Modificações podem ocorrer em qualquer lugar no anti-corpo de Sp35-específico, incluindo a cadeia principal de peptídeo, as ca-deias laterais de aminoácido e os terminais amino ou carboxila, ou nas por-ções tais como carboidratos. Será apreciado que o mesmo tipo de modifica-ção pode estar presente nos mesmos graus ou graus variáveis a vários sí-tios em um dado anticorpo de Sp35-específico. Também, um dado anticorpode Sp35-específico pode conter muitos tipos de modificações. Anticorposespecíficos de Sp35 podem ser ramificados, por exemplo, como um resulta-do de ubiquinação, e eles podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Anti-corpos específicos de Sp35 cíclicos, ramificados e cíclicos aleatoriamenteresultam de processos naturais de pós-tradução ou podem ser produzidospor métodos sintéticos. Modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente deuma porção de heme, ligação covalente de um derivado de nucleotídeo ounucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, ligaçãocovalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dedissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação decisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosi-lação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoi-lação, oxidação, pegilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenila-ção, racemização, selenoilação, sulfanação, adição medidada por RNA detransferência de aminoácidos a proteínas tais como arginilação, e ubiquina-ção. (Vide, por exemplo, Proteins - Structure E Molecular Properties, Τ. E.Creighton, W. H. Freeman e Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttrans-lational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., AcademicPress, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter e outros, Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan e outros, Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)).
A presente invenção também provê proteínas de fusão compre-endendo um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, vari-ante, ou seu derivado, e um polipeptídeo heterólogo. O polipeptídeo heteró-logo ao qual o polipeptídeo é fundido pode ser útil para a função ou é útilpara direcionar as células de expressão de polipeptídeo de Sp35. Em umaconcretização, uma proteína de fusão da invenção compreende, consisteessencialmente de, ou consiste em, um polipeptídeo tendo a seqüência deaminoácidos de qualquer uma ou mais das regiões de Vh de um anticorpoda invenção ou a seqüência de aminoácidos de qualquer umaou mais dasregiões de Vl de um anticorpo da invenção ou fragmentos ou suas variantes,e uma seqüência de polipeptídeos heteróloga. Em uma outra concretização,a proteína de fusão para o uso nos métodos de tratamento e de diagnósticorevelados aqui compreende, consiste essencialmente de, ou consiste em umpolipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de qualquer uma, dois, trêsdas Vh CDRs de um anticorpo de Sp35-específico, ou fragmentos, variantes,ou seus derivados, ou a seqüência de aminoácidos de qualquer uma, duas,três das Vl CDRs de um anticorpo de Sp35-específico, ou fragmentos, vari-antes, ou seus derivados, e uma seqüência de polipeptídeos heteróloga. Emuma concretização, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendoa seqüência de aminoácidos de um anticorpo de Sp35-específico VH deCDR3 da presente invenção, ou fragmento, derivado, ou sua variante, e umaseqüência de polipeptídeos heteróloga, proteína de fusão essa que especifi-camente se liga a pelo menos um epitopo de Sp35. Em uma outra concreti-zação, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a seqüên-cia de aminoácidos de pelo menos uma região de Vh de um anticorpo deSp35-específico da invenção e a seqüência de aminoácidos de pelo menosuma região de Vl de um anticorpo de Sp35-específico da invenção ou frag-mentos, derivados ou suas variantes, e uma seqüência de polipeptídeos he-teróloga. De preferência, as regiões de Vh e Vl da proteína de fusão corres-pondem a um anticorpo de fonte simples (ou fragmento de scFv ou de Fab)que especificamente liga pelo menos um epitopo de Sp35. Em ainda umaoutra concretização, uma proteína de fusão para o uso nos métodos de tra-tamento e de diagnóstico revelados aqui compreende um polipeptídeo tendoa seqüência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das VhCDRs de um anticorpo de Sp35-específico e a seqüência de aminoácidos dequalquer uma, duas, três òu mais das Vl CDRs de um anticorpo de Sp35-específico, ou fragmentos ou suas variantes, e uma seqüência de polipeptí-deos heteróloga. De preferência, duas, três, quatro, cinco, seis, ou mais dasVhCDR(S) ou VlCDR(S) correspondem a anticorpo de fonte simples (oufragmento de scFv ou de Fab) da invenção. Moléculas de ácido nucléico quecodificam essas proteínas de fusão são também incluídas pela invenção.
Proteínas de fusão exemplares relatados na literatura incluemfusões de receptor de célula T (Gascoigne e outros, Proc. NatL Acad. Sei.USA 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon e outros, Nature 337:525-531(1989); Traunecker e outros, Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl e outros,DNA Célula Biol. USA 9:347-353 (1990); e Byrn e outros, Nature 344:667-670 (1990)); L-selectina (receptor residente) (Watson e outros, J. Célula. Bi-ol. 110:2221-2229 (1990); e Watson e outros, Nature 349:164-167 (1991));CD44 (Aruffo e outros, Célula 61:1303-1313 (1990)); CD28 e B7 (Linsley eoutros, J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley e outros, J. Exp.Med. 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic e outros, Célula 66:1133-1144 (1991)); receptor de TNF (Ashkenazi e outros, Proc. NatL Acad. Sei.USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer e outros, Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991); e Peppel e outros, J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); e re-ceptor a de IgE (Ridgway e Gorman, J. Célula. Biol. Vol. 115, Resumo Ng1448(1991)).
Em certas concretizações, anticorpos de Sp35, fragmentos deanticorpo, derivados e suas variantes ulteriormente compreendem uma por-ção de direcionamento. Porções de direcionamento incluem uma proteína ouum peptídeo que dirige localização a uma certa parte do corpo, por exemplo,ao cérebro ou compartimentos ali. Em certas concretizações, anticorpos deSp35, fragmentos de anticorpo, derivados e suas variantes são ligados ousão fundidos a uma porção de direcionamento de cérebro. As porções dedirecionamento de cérebro estão ligadas covalentemente (por exemplo, dire-tas, fusão transcritiva, ou por ligação química ou diretamente ou através deuma molécula espaçadora, que podem ser opcionalmente cliváveis) ou nãoligadas covalentemente (por exemplo, através de interações reversíveis taiscomo avidina, biotina, proteína A, IgG, etc.). Em outras concretizações, osanticorpos de Sp35, fragmentos de anticorpo, derivados e suas variantesestão ligadas a uma ou mais porções de direcionamento de cérebro. Emconcretizações adicionais, a porção de direcionamento de cérebro é ligada auma pluralidade de anticorpos de Sp35, fragmentos de anticorpo, derivadose suas variantes.
Uma porção de direcionamento de cérebro associada a um anti-corpo de Sp35, fragmento de anticorpo, derivado ou sua variante aumenta ofornecimento de cérebro de tais anticorpos de Sp35, fragmentos de anticor-po, derivados e suas variantes. Numerosos polipeptídeos foram descritosque, quando fundidos a uma proteína ou agente terapêutico, fornecedoresda proteína ou agente terapêutico através da barreira de sangue cérebro(BBB). Exemplos não Iimitantes incluem o anticorpo de domínio simples FC5(Abulrob e outros (2005) J. Neurochem. 95, 1201-1214); mAB 83-14, um an-ticorpo monoclonal ao receptor de insulina de ser humano (Pardridge e ou-tros (1995) Pharmacol. Res. 12, 807-816); os peptídeos de B2, B6 e B8 quese ligam ao receptor de transferrina de ser humano (hTfR) (Xia e outros(2000) J. Virol. 74, 11359-11366); o anticorpo monoclonal 0X26 ao receptorde transferrina (Pardridge e outros (1991) J. Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70); e SEQ ID NOs: 1-18 of U.S. Patent Ne 6,306,365. O conteúdo das refe-rências acima é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
O fornecimento de cérebro aumentado de um anticorpo de Sp35,fragmento de anticorpo, derivado ou sua variante é determinado por nume-rosos meios bem-estabelecidos na técnica. Por exemplo, a administração aum animal de um anticorpo de Sp35 radioativamente, enzimaticamente oufluorescentemente marcado, fragmento de anticorpo, derivado e sua varianteligada a uma porção de direcionamento de cérebro; determinação de Iocali-zação de cérebro; e comparação da localização com um anticorpo de Sp35radioativamente, enzimaticamente ou fluorescentemente marcado equivalen-te, fragmento de anticorpo, derivado ou sua variante que não está associadoa uma porção de direcionamento de cérebro. Outros meio de determinaçãode direcionamento aumentado são descritos nas referências acima.
Como discutido em outro lugar aqui, anticorpos de Sp35, oufragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da inven-ção podem ser fundidos a polipeptídeos heterólogos para aumentar a semi-vida in vivo dos polipeptídeos ou para o uso nos imunoensaios usando-semétodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma concretização, PEGpode ser conjugado aos anticorpos de Sp35 da invenção para aumentar suasemi-vida in vivo. Leong, S.R., e outros, Cytokine 16:106 (2001); Adv. inFármaco Deliv. Rev. 54:531 (2002); ou Weir e outros, Biochem. Soe. Tran-sactions 30:512 (2002).
Além do mais, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação deantígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser fundidos aseqüências marcadoras, tal como um peptídeo para facilitar sua purificaçãoou detecção. Em concretizações preferidas, a seqüência de aminoácidosmarcadora é um peptídeo de hexa-histidina, tal como a etiqueta provida emum vetor de pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif.,91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis.
Como descrito em Gentz e outros, Proc. NatL Acad. Sei. USA 86:821-824(1989), por exemplo, hexa-histidina provê purificação conveniente da proteí-na de fusão. Outras etiquetas de peptídeo úteis para a purificação incluem,mas não são limitadas à etiqueta de "HA", que corresponde a um epitopoderivado da proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson e outros, Célula37:767 (1984)) e a etiqueta de "flag".
Proteínas de fusão podem ser preparadas usando-se métodosque são bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, as patentes U.S.nos. 5.116.964 e 5.225.538). O sítio preciso em que a fusão é feita pode serselecionado empiricamente para otimizar a secreção ou ligação de caracte-rísticas da proteína de fusão. DNA que codifica a proteína de fusão é entãotransfectada para dentro de uma célula hospedeira para a expressão.
Anticorpos de Sp35 ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados da presente invenção podem ser usados na formanão conjugada ou podem ser conjugados a pelo menos uma de uma varie-dade de moléculas, por exemplo, para aperfeiçoar as propriedades terapêu-ticas da molécula, para facilitar detecção alvo, ou para formação de imagemou terapia do paciente. Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação deantígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser marcados ouconjugados antes ou depois da purificação, quando a purificação é realizada.
Em particular, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação deantígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser conjugados aagentes terapêuticos, pró-fármacos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus,lipídios, modificadores de resposta biológica, agentes farmacêuticos, ouPEG.
Aqueles versados na técnica apreciarão que conjugados podemtambém ser montados usando-se uma variedade de técnicas dependendodo agentes selecionado a ser conjugado. Por exemplo, conjugados com bio-tina são preparados, por exemplo, por reação de uma polipeptídeo de liga-ção com um éster ativado de biotina tal como o éster de biotina N-hidroxissuccinimida. Similarmente, conjugados com um marcador fluores-cente podem ser preparados na presença de um agente de acoplamento,por exemplo aqueles listados aqui, ou por reação com um isotiocianato, depreferência fluoresceína-isotiocianato. Conjugados dos anticorpos de Sp35,ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da in-venção são preparados de um modo análogo.
A presente invenção ulteriormente inclui anticorpos de Sp35, oufragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da inven-ção conjugados a um agente terapêutico ou de diagnóstico. Os anticorposde Sp35 podem ser usados diagnosticamente para, por exemplo, monitoraro desenvolvimento ou a progressão de uma doença neurológica como partede um procedimento de testagem clínica para, por exemplo, determinar aeficácia de um dado regime de tratamento e/ou prevenção. Detecção podeser facilitada por acoplamento do anticorpo de Sp35, ou fragmento de liga-ção de antígeno, variante, ou seu derivado a uma substância detectável. E-xemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos proféti-co, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais biolumines-centes, materiais radioativos, metais de emissão de pósitron usando-se vá-rias tomografias de emissão de pósitron, e íons de metal paramagnéticosnão radioativos. Vide, por exemplo, a patente U.S. ne 4.741.900 para íons demetal que podem ser conjugados a anticorpos para o uso como diagnósticode acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas adequadas in-cluem peroxidade de rábano-silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ouacetillcolinaesterase; exemplos de complexos de grupo protético adequadosincluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluo-rescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, fluoresceína isoti-ocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ouficoeritrina; um exemplo de material Iuminescente inclui luminol; exemplos demateriais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e e-xemplos de material radioativo adequado incluem 1251,131I1111In ou 99Tc.
Um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno,variante, ou seu derivado também pode ser detectavelmente marcado poracoplamento dele a um composto quimioluminescente. A presença do anti-corpo de Sp35 etiquetado quimioluminescente é então determinado por de-tecção da presença de luminescência que aumenta durante o curso de umareação química. Exemplos de compostos de marcação quimioluminescenteparticularmente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático,imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.
Um dos meios em que um anticorpo de Sp35, ou fragmento deligação de antígeno, variante, ou seu derivado podem ser detectavelmentemarcados é por ligação do mesmo a uma enzima e usando-se o produto li-gado em um imunoensaio de enzima (EIA) (Voller, A., "The Enzima LinkedImmunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publi-cation, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978)); Voller e outros,J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enrymol. 73:482-523(1981); Maggio1 E. (ed.), Enzima Immunoassay1 CRC Press, Boca Raton1Fla., (1980); Ishikawa, E. e outros, (eds.), Enzima lmmunoassay, Kgaku Sho-in, Tokyo (1981). A enzima, que é ligada ao anticorpo de Sp35 reagirá comum substrato apropriado, de preferência um substrato cromogênico, de talmodo que para produzir uma porção química pode ser detectada, por exem-plo, por meio espectrofotométrico, fluorimétrico ou por meio visual. Enzimasque podem ser usados para detectavelmente marcar o polipeptídeo incluem,mas não são limitadas a, desidrogenase de malato, stafilococcal nuclease,isomerase de delta-5-esteróide, desidrogenase de álcool de levedura, alfa-glicerofosfato, desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidade de rába-no-silvestre, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, desidrogenase de glicose-6-fosfato, glucoamilase e aceti Icoli neste rase. Adicionalmente, a detecção podeser realizada por métodos colorimétricos que empregam um substrato cro-mogênico para a enzima. Detecção pode também ser realizada por compa-ração visual da extensão de reação enzimática de um substrato em compa-ração com padrões similarmente preparados.
Detecção pode também ser realizada usando-se qualquer deuma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, por marcação radioa-tiva do anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ouseu derivado, é possível detectar o polipeptídeo através do uso de um radio-imunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioi-munoensaios, Seventh Training Course on Radioligand Assay Técnicas, TheEndocrine Society, (March, 1986)), que é incorporada por referência aqui). Oisótopo radioativo pode ser detectado por meios incluindo, mas não limitadoa, um contador gama, um contador de cintilação, ou autorradiografia.
Um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno,variante, ou seu derivado pode também ser detectavelmente marcado usan-do-se metais de emissão de fluorescência tais como 152Eu, ou outros dasérie de lantanídeo. Esses metais podem ser ligados ao polipeptídeo usan-do-se tais grupos de quelação de metal como ácido dietilenotriaminepenta-cético (DTPA) ou ácido etilenodiaminatetracético (EDTA).
Técnicas para a conjugação de várias porções a um anticorpode Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivadosão bem-conhecidos, vide, por exemplo, Arnon e outros, "Monoclonal Anti-bodies For Immunotargeting Of Fármacos In Câncer Therapy", in MonoclonalAntibodies E Câncer Therapy, Reisfeld e outros (eds.), pp. 243-56 (Alan R.Liss, Inc. (1985); Hellstrom e outros, "Antibodies For Fármaco Delivery", inControlled Fármaco Delivery (2nd Ed.), Robinson e outros (eds.), MareeiDekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic A-gents In Câncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: BiologicalE Clinicai Applications, Pinchera e outros (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analy-sis, Results, E Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Câncer Detec-ção E Therapy, Baldwin e outros (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985),e Thorpe e outros, "The Preparation E Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugados", lmmunol. Rev. 62:119-58 (1982).
VII. EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS DE ANTICORPO
Como é bem-conhecido, RNA pode ser isolado das células dehibridoma originais ou de outras células transformadas por Técnicas-padrão,tais como precipitação e extração de isotiocianato de guanidínio seguido porcentrifugação ou cromatografia. Onde desejável, mRNA pode ser isolado deRNA total por Técnicas-padrão tal como cromatografia sobre oligo dT celulo-se. Técnicas adequadas são familiares na técnica.
Em uma concretização, cDNAs que codificam as cadeias leves ecadeias pesadas do anticorpo podem ser produzidos, ou simultaneamenteou separadamente, usando-se transcriptase reversa e polimerase de DNAde acordo com métodos bem-conhecidos. PCR pode ser iniciada por inicia-dores de região constante de consenso ou por iniciadores mais específicoscom base na seqüência de aminoácidos e DNA de seqüência de cadeia levee pesada publicado. Como discutido acima, PCR também pode ser usadapara isolar clones de DNA que codificam as cadeias leves e pesadas de po-lipeptídeo. Neste caso as bibliotecas podem ser tríadas por iniciadores deconsenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas de região cons-tante de camundongo.
DNA, tipicamente DNA de plasmídio, pode ser isolado das célu-lass usando-se técnicas conhecidas na área, restrição mapeada e seqüencí-ada de acordo com técnicas bem-conhecidas, padrão indicadas em deta-lhes, por exemplo, nas referências expostas acima que se relacionam comtécnicas de DNA recombinante. Naturalmente, o DNA pode ser sintético deacordo com a presente invenção em qualquer ponto durante o processo deisolamento ou análise subseqüente.
Após a manipulação do material genético isolado para proveranticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ouseus derivados da invenção, os polinucleotídeos que codificam os anticorposde Sp35 são tipicamente inseridos em um vetor de expressão par a introdu-ção para dentro de células hospedeiras que podem ser usadas para produzira quantidade desejada de anticorpo de Sp35.
Expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, deriva-do ou seu análogo, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticor-po que se liga a uma molécula-alvo descrito aqui, por exemplo, Sp35, exigeconstrução de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codi-fica o polipeptídeo. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um anti-corpo molécula ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou sua por-ção (de preferência contendo o domínio variável de cadeia leve ou pesada),da invenção foi obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpopode ser produzido pela tecnologia de DNA recombinante usando-se técni-cas bem-conhecidas na técnica. Assim, métodos para a prpearação de umaproteína por expressão de um polinucleotídeo contendo um anticorpo quecodifica seqüência de nucleotídeos são decritos aqui. Métodos que são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para contruirvetores de expressão contendo seqüências de codificação de anticorpo esinais de controle de traducionais ou transcritivos apropriados. Esses méto-dos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicassintéticas, e recombinação genética in vivo. A invenção, assim, provê veto-res replicáveis compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codificaum anticorpo molécula da invenção, ou uma sua cadeia pesada ou leve, ouum domínio variável de cadeia pesada ou leve, operavelmente ligados a umpromotor. Tais vetores podem incluir a seqüência de nucleotídeos que codi-fica a região constante da molécula de anticorpo (vide, por exemplo, publica-ção de PCT WO 86/05807; publicação de PCT WO 89/01036; e a patenteU.S. ns 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em talvetor para a expressão da cadeia leve ou pesada total.
A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetoresde expressão da invenção, o primeiro vetor que codifica um polipeptídeo de-rivado de cadeia pesada e o segundo vetor que codifica um polipeptídeo de-rivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores adequadosidênticos que permitem expressão igual de polipeptídeos de cadeia leve epesada. Alternativamente, um vetor simples pode ser usado que codificatanto polipeptídeos de cadeia leve quanto pesada. Em tais situações, a ca-deia leve é vantajosamente colocada antes da cadeia pesada para evitar umexcesso de cadeia pesada livre de tóxico (Proudfoot, Nature 322:52 (1986);
Kohler, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2197 (1980)). As seqüências de codifi-cação para as cadeias leve e pesada podem compreender cDNA ou DNAgenômico.
O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é usado aqui para signi-ficar vetores usados de acordo com a presente invenção como um veículopara a introdução para dentro de e expressão de um gene desejado em umacélula hospedeira. Como conhecido por aqueles versados na técnica, taisvetores podem facilmente ser selecionados do grupo que consiste em plas-mídios, fagos, vírus e retrovírus. Em geral, vetores compatíveis com a pre-sente invenção compreenderão um marcador de seleção, sítios de restriçãoapropriados para facilitar clonagem do gene desejado e a capacidade deentrar e/ou replicar em célula eucarióticas ou procarióticas.
Para as finalidades desta invenção, numerosos sistemas de ve-tor de expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetorutiliza elementos de DNA que são derivados de vírus de animal tal como pa-pilloma vírus de bovino, vírus de polioma, adenovírus, vírus de vacínia, bacu-lovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus de SV40. Outros envol-vem o uso de sistemas policistrônicos com sítios de ligação de ribossomainternos. Adicionalmente, células que integraram o DNA em seus cromos-somas podem ser selecionadas por introdução de uma ou mais marcadoresque permitem seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcadorpode prover prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocida(por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados tal como cobre.O gene marcador selecionável pode ou diretamente ser ligado às seqüên-cias de DNA a serem expressas, ou introduzidas para dentro da mesma cé-lula por co-transformação. Elementos adicionais podem também ser neces-sários de síntese de mRNA ótima. Esses elementos podem incluir seqüên-cias de sinal, sinais de união, bem como promotores transcritivos, aumenta-dores e sinais de terminação.
Em concretizações particularmente preferidas os genes de regi-ão variáveis clonados são inseridos em um vetor de expressão juntamentecom genes de região constante de cadeia leve ou pesada (de preferênciaser humano) sintéticos como discutido acima. Em uma concretização, é efe-tuada usando-se a de expressão proprietário da Biogen IDEC, Inc., chamadode NEOSPLA (a patente U.S. ns 6.159.730). Este vetor contém o aumenta-dor/promotor de citomegalovírus, o promotor principal de beta-globina decamundongo, a origem de SV40 de replicação, a seqüência de poliadenila-ção de hormônio de crescimento de bovino, éxon 1 e éxon 2 de fosfotransfe-rase de neomicina, o gene de redutase diidrofolato e seqüência líder. Essevetor demonstrou resultar em expressão de nível mais alto de anticorpos naincorporação de genes de região constante e variável, transfecção em célu-las de CHO, seguido por seleção em meio contendo G418 e ampliação demetotrexato. Naturalmente, qualquer vetor de expressão que é capaz de eli-ciar expressão em células eucarióticas pode ser usado na presente inven-ção. Exemplos de vetores adequados incluem, mas não são limitados aplasmídios pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS,pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, e pZe-oSV2 (disponíveis da Invitrogen, San Diego, CA), e plasmídio pCI (disponívelda Promega, Madison, Wl). Em geral, triagem de grandes números de célu-las transformadas para aquelas que expressam adequadamente altos níveisse cadeias leves e pesadas de imunoglobulina for experimentação rotineiraque podem ser realizadas, por exemplo, por sistemas robóticos. Sistemas devetor são também mostrados nas patentes U.S. nos. 5.736.137 e 5.658.570,cada uma das quais é incorporada por referência em sua totalidade aqui.Este sistema provê níveis altos de expressão, por exemplo, > 30pg/célula/dia. Outros sistemas exemplares de vetor são revelados, por e-xemplo, na patente U.S. n9 6.413.777.
Em outras concretizações preferidas os anticorpos de Sp35, oufragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da inven-ção podem ser expressos usando-se construtos policistrônicos tais comoaqueles revelados na publicação de petido de patente U.S. n9 2003-0157641A1, depositado em 18 de novembro de 2002 e incorporado aqui em sua tota-lidade. Nesses novos sistemas de expressão, produtos de múltiplos genesde interesse tais como cadeias leves e pesadas de anticorpos podem serproduzidos a partir de um construto policistrônico. Esses sistemas vantajo-samente usam um sítio de entrada interna (IRES) para prover níveis relati-vamente altos de anticorpos de Sp35, por exemplo, polipeptídeos de ligação,por exemplo, anticorpos específicos de Sp35 ou seus fragmentos imunoes-pecíficos em células hospedeiras eucarióticas. Seqüências de IRES compa-tíveis são descritas na patente U.S. nQ 6.193.980 que é também incorporadaaqui. Aqueles versados na técnica apreciarão que tais sistemas de expres-são podem ser usados para eficazmente produzir a faixa total de anticorposde Sp35 revelados no presente pedido.
Mais em geral, uma vez que o vetor ou seqüência de DNA quecodifica uma subunidade monomérica do anticorpo de Sp35 foi preparada, ovetor de expressão pode ser introduzida para dentro de uma célula hospe-deira apropriada. Introdução doe plasmídio em uma célula hospedeira podeser realizada por várias técnicas bem-conhecidas por aqueles versados natécnica. Esses incluem, mas não são limitadas, transfecção (incluindo elec-troforese e electroporação), fusão de protoplasto, precipitação de fosfato decálcio, fusão de célula com DNA envelopado, microinjeção, e infecção comvírus intacto. Vide, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors", Ro-driguez e Denhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., capítula 24.2, pági-nas 470-472 (1988). Tipicamente, introdução de plasmídio para dentro dohospedeiro é via eletroporção. As células hospedeiras que abrigam o cons-truto de expressão são desenvolvidas sob condições apropriadas para aprodução das cadeias leves e cadeias pesadas, são analisadas quanto asíntese de proteína de cadeia pesada e/ou leve. Técnicas de ensaio exem-plares incluem ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimm-noensaio (RIA), ou análise de classificador de célula ativada por fluorescên-cia (FACS), imunoistoquímica e similares.
O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeirapor técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadaspor técnicas convencionais para produzir um anticorpo para o uso nos méto-dos descritos aqui. Assim, a invenção inclui células hospedeiras contendoum polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção, ou uma sua ca-deia pesada ou leve, operavelmente ligado a um promotor heterólogo. Emconcretizações preferidas para a expressão de anticorpos de cadeia dupla,vetores que codificam tanto as cadeias leves quanto pesadas podem ser co-expressos em uma célula hospedeira para a expressão de molécula de imu-noglobina molécula total, como descrito abaixo.
Como usado aqui, "célula hospedeiras" refere-se a células quecontêm vetores construídos usando-se técnicas de DNA recombinante e quecodificam pelo menos um gene heterólogo. Nas descrições de processospara o isolamento de anticorpos de hospedeiros recombinantes, os termos"célula" e "cultura de célula " são usados intercambeavelmente para signifi-car a fonte de anticorpo a não ser que esteja claramente especificada deoutra maneira. Em outras palavras, recuperação de polipeptídeo a partir das"células" pode significar ou das células totais giradas por rotação ou da cul-tura de célula contendo tanto o meio quanto as células suspensas.
Uma variedade de sistemas vetor de expressão de hospedeiropodem ser utilizadoso para expressar moléculas de anticorpo para o uso nosmétodos descritos aqui. Tais sistemas de expressão de hospedeiro repre-sentam veículos pelos quais as seqüências de codificação de interesse po-dem ser produzidas e subseqüentemente purificadas, mas também repre-sentam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com asseqüências de codificação de nucleotídeo apropriadas, expressam um anti-corpo molécula da invenção in situ. Esses incluem mas não são limitados amicroorganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) trans-formados com DNA de bacteriófago recombinante, vetores de expressão deDNA de cosmídio ou DNA de plasmídio contendo seqüências de codificaçãode anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadacomvetores de expressão de levedura recombinante contendo seqüênciasde codificação de anticorpo; sistemas de célula de inseto infectados comvetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovirus) con-tendo seqüências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de plantainfectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo,vírus de mosaico de couve-flor, CaMV; vírus de mosaico de tobaco, TMV) outransformados com vetores de expressão de plasmídio recombinante (porexemplo, Ti plasmídio) contendo seqüências de codificação de anticorpo; ousistemas de célula de mamífero (por exemplo, células de COS, CHO, BLK,293, 3T3) contendo construtos de expressão recombinante contendo promo-tores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotorde metalotioneína) ou de vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardiode adenovírus; o promotor de 7,5 K de vírus de vacínia). De preferência, cé-lulas bacterianas tais como Escherichia coli, e mais de preferência, célulaseucarióticas, especialmente para a expressão de molécula de anticorpo re-combinante inteira, são usadas para a expressão de uma molécula de anti-corpo recombinante. Por exemplo, células de mamífero de tais como célulasde ovário de hamster chinês (CHO), em combinação com um vetor tal comoo elemento de promotor de gene precoce intermediário a partir de citomega-lovírus de ser humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos(Foecking e outros, Gene 45:101 (1986); Cockett e outros, Bio/Technology8:2(1990)).
Uma linha de célula hospedeira usada para a expressão de pro-teína é freqüentemente de origem de mamífero; aqueles versados na técnicasão reconhecidos o mérito da capacidade de preferencialmente determinarlinhas de células hospedeiras particulares que são adequadas para o produ-to de gene desejado a ser expresso ali. Linhas de células hospedeiras e-xemplares incluem, mas não são limitadas a, CHO (Ovário de hamster chi-nês), DG44 e DUXB11 (linhas de ovário de hamster chinês, menos DHFR),HELA (carcinoma cervical de ser humano), CVI (linha de rim de macaco),COS (um derivado de CVI com antígeno de SV40 T), VERY, BHK (rim dehamster de bebê), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasto de hamster chinês)BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linha de rim de hamster),SP2/0 (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundon-go), BFA-1c1BPT (células endoteliais bovinas), RAJI (linfócito humano) e293 (rim humano). Células de CHO são particularmente preferidas. Linhasde células hospedeiras estão tipicamente disponíveis serviços comerciais, aAmerican Tissue Culture Collection ou a literatura publicada.
Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhidaque modula a expressão das seqüências inseridas, ou modifica e processa oproduto de gene na forma específica desejada. Tais modificações (por e-xemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtosde proteína podem ser importantes para a função da proteína. Células hos-pedeiras diferentes têm mecanismos específicos e característicos para amodificação e processamento pós-traducionais de proteínas e produtos degene. Sistemas de hospedeiro ou linhas de células apropriados podem serescolhidos para assegurar a modificação e processamento corretos da pro-teína estranha expressa. Para esse fim, células hospedeiras eucarióticasque possuem a maquinária celular para o processamento adequado dotranscrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto de gene podem serusadas.
Para a produção de alto rendimento, longo prazo de proteínasrecombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhas de célu-las que estavelmente expressam a molécula de anticorpo podem ser enge-nheiradas. Ao invés de usar vetores de expressão que contêm de origensvirais de replicação, células hospedeiras podem ser transformadas com DNAcontroladas por elementos de controle de expressão apropriados (por exem-plo, promotor, aumentador, seqüências, terminadores de transcrição, sítiosde poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Após a introdução doDNA estranho, células engenheiradas podem ser deixadas se desenvolve-rem por 1-2 dias em um meio enriquecido, e então são mudadas em ummeio seletivo. O marcador selecionável no plasmídio recombinante confereresistência à seleção e permite que células estavelmente se integrem noplasmídio em seus cromossomas e se desenvolvem para formar focais quepor sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas de células. Essemétodo pode vantajosamente ser usado para engenheirar linhas de célulasque estavelmente expressam a molécula de anticorpo.
Numerosos sistemas de seleção podem ser usados, incluindomas não são limitados a cinase de timidina de vírus de herpes simplex (Wi-gler e outros, Cell 11:223 (1977)), fosforribosiltransferase de hipooxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, Proc. Nati Acad. Sei. USA 48:202 (1992)),e fosforibosiltransferase de adenina (Lowy e outros, Cell 22:817 1980) genespodem ser empregados em células de tk, hgprt ou aprt, respectivamente.Também, resistência a antimetabólito pode ser usado como a base de sele-ção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato(Wigler e outros, Nat. Acad. Sei. USA 77:357 (1980); O1Hare e outros, Proc.Nati Acad. Sei. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confere resistência a ácidomicofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Nati Acad. Sei. USA 78:2072 (1981));neo, que confere resistência a a aminoglicosídeo G-418 Clinicai Pharmacy12:488-505; Wu e Wu, Biotherapi 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev.Pharmacoi Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932(1993); e Morgan e Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993);, TIBTECH 11 (5): 155-215 (May, 1993); e higro, que confere resistência a higro-micina (Santerre e outros, Gene 30:147 (1984). Métodos normalmente co-nhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser u-sados são descritos em Ausubel e outros (eds.), Current Protocols in Mole-cular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer e Ex-pression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e in Chapters 12e 13, Dracopoli e outros (eds), Current Prolocols in Human Genetics, JohnWiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin e outros, J. Moi Bioi 150:1(1981), que são incorporados por referência aqui em sua totalidade.
Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podemser aumentados por ampliação de vetor (para uma revisão, vide Bebbingtone Hentschel. The use of Vectors base don Gene amplification for the expres-sion of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press,New York, Vol. 3. (1987)). Quando um marcador no anticorpo de expressãode sistema de vetor é ampliável, aumento no nível de inibidor presente nacultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marca-dor. Uma vez que a região ampliada está associada ao gene de anticorpo,produção do anticorpo também aumentará (Crouse e outros, Mol. CeH Biol.3:257(1983)).
Produção in vitro permite aumento de escala para dar quantida-des grandes dos polipeptídeos desejados. Técnicas para o cultivo de célulade mamífero sob condições de cultura de tecido são conhecidas na técnica eincluem cultura de suspensão homogênea, por exemplo, em um reator deelevação de ar ou em um reator de agitador contínuo, ou cultura de célulaimobilizada ou enlaçada, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, emmicrocontas de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou de-sejado as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodosde cromotografia habituais, por exemplo, cromatografia de filtração de gel,cromatografia de troca de íons, cromatografia sobre DEAE-celulose ou cro-matografia por (imuno)afinidade, por exemplo, depois de biossíntese prefe-rencial de um polipeptídeo de região principal sintética ou antes da ou sub-seqüente à etapa de cromatografia de HIC descrita aqui.
Genes que codificam anticorpos de Sp35, ou fragmentos de li-gação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem tam-bém ser expressos em células de não mamífero tais como bactérias ou Ie-vedura ou células de planta. Bactérias que prontamente aceitam ácidos nu-cléicos incluem membros da enterobacteriasceae, tais como cepas de Es-cherichia coli ou Salmonella-, Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis; Pneu-mococcus; Streptococcus, e Haemophilus influenzae. Será ulteriormenteapreciado que, quando expressos em bactérias, os polipeptídeos heteroló-gos tipicamente se tornam parte dos corpos de inclusão. Os polipeptídeosheterológos devem ser isolados, purificados e então montados em moléculasfuncionais. Onde formas tetravalentes de anticorpos são desejadas, as su-bunidades então se automontarão em anticorpos tetravalentes (WO02/096948A2).
Em sistemas bacterianos, numerosos vetores de expressão po-dem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido paraa molécula de anticorpo sendo expressa. Por exemplo, quando uma grandequantidade de tal proteína deve ser produzida, para a geração de composi-ções farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que diregem aexpressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são pronta-mente purificados podem ser desejáveise. Tais vetores incluem, mas nãosão limitados, ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther e outros,EMBO J. 2:1791 (1983)), em que o anticorpo que codifica seqüência podeser ligado individualmente no vetor em quadro com a região de codificaçãode IacZ de modo que uma proteína de fusão é produzida; vetores de pIN(Inouye & lnouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke &Schuster, J. Biol Chem. 24:5503-5509 (1989)); e similares. Vetores depGEX podem também ser usados para expressar polipeptídeos estranhoscomo proteínas de fusão com S-transferase de glutationa (GST). Em gene-ral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificadosde células Iisadas por adsorção e ligação a uma matriz de contas de glutati-ona-agarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetoresde pGEX são projetados para incluir sítios de clivagem de protease de fatorXa ou trombina de modo que target produto de gene-alvo clonado possa serliberado a partir da porção de GST.
Além dos procarióticos, micróbios eucarióticos podem tambémser usados. Saccharomyces eerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é omais comumente usado entre microorganismos eucarióticos embora nume-rosas outras cepas estejam comumente disponíveis, por exemplo, Piehiapastoris.
Para a expressão em Saeeharomyees, o plasmídio YRp7, porexemplo, (Stinchcomb e outros, Nature 282:39 (1979); Kingsman e outros,Gene 7:141 (1979); Tschemper e outros, Gene 10:157 (1980)) é comumenteusado. Este plasmídio já contém o gene de TRP1 que provê uma marcadorde seleção para uma cepa mutante de levedura que carece da capacidadede se desenvolver em triptofano, por exemplo ATCC N9 44076 ou PEP4-1(Jones, Geneties 85:12 (1977)). A presença da lesão de trpl como uma ca-racterística do genoma de célula hospedeira de levedura então provê umaambiente eficaz para a detecção de transformação por crescimento na au-sência de triptofano.
Em um sistema de inseto, vírus de poliedrose nuclear Autogra-pha californica (AcNPV) é tipicamente usado como um etor para expressargenes estranhos. O vírus se desenvolve em células de Spodoptera frugiper-da. A seqüência de codificação de anticorpo pode ser clonada individual-mente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene de poliedrina) dovírus e colocada sob controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, opromotor de poliedrina).
Uma vez que uma molécula de anticorpo da invenção foi recom-binantemente expressa, pode ser purificada por qualquer método conhecidona técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por e-xemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca de íons, afi-nidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico depois daProteína A, e coluna de tamanho), centrifugação, solublidade diferencial, oupor qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Alternati-vamente, um método preferido para o aumento da afinidade de anticorposda invenção é revelado na patente U.S. ns 2002 0123057 A1.
VIII. MÉTODOS DE TRATAMENTO USANDO-SE ANTICORPOS DE Sp35TERAPÊUTICOS
Como descrito aqui, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de liga-ção de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem aliviar ainibição mediada por NgR1 de extensão axonal que normalmente ocorre emneurônios do CNS. Isto é benéfico em situações onde extensão axonal ouneurito que brota é necessário no cérebro ou medula espinhal. Lesão damedula espinhal, incluindo esmagamento ou rompimento parcial ou comple-to, exemplifica uma situação em que extensão axonal é necessária, mas énormalmente inibida através da operação da trajetória de Nogo. Exemplosde doenças ou distúrbios em que extensão axonal e/ou brotamento de neuri-to no cérebro seriam benéficos incluem acidente vascular cerebral, esclerosemúltipla, e outras doenças ou distúrbios neurodegenerativos tais como escle-rose múltipla (MS), Ieucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), encefa-lomielite (EPL), mielose pontino central (CPM), adrenoleucodistrofia, doençade Alexander, doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), Leucodistrofia decélula globóide (doença de Krabbe) e degeneração de Wallerian, neurite óti-ca, mielite transversa, esclerose lateral amilotrófica (ALS), doença de Hun-tington, doença de Alzheimer, Doença de Parkinson, lesão da medula espi-nhal, lesão de cérebro traumática, lesão pós-radiação, complicações neuro-lógicas de quimioterapia, acidente vascular cerebral, neuropatia, neuropatiaótica isquêmica aguda, deficiência de vitamina E, síndrome de deficiência devitamina E isolada, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Mar-chiafava-Bignami, Ieucodistrofia metacromática, neuralgia trigeminal, parali-sia de Bell, lesão da medula espinhal e todas as doenças neurológicas rela-cionadas com morte de célula neuronal.
Os inventores ulteriormente revelaram que Sp35 é expresso emoligodendrócitos, e contribui para a biologia de oligodendrócito. Derivadossolúveis de Sp35, certos polinucleotídeos (por exemplo RNAi), bem comocertos anticorpos que especificamente se ligam a Sp35, como descritos aquiagem como antagonistas a função de Sp35 em oligodendrócitos, que pro-movem proliferação, diferenciação e sobrevivência de oligodendrócitos e quepromovem mielinação de neurônios in vitro e in vivo. Isto é benéfico em paradoenças, distúrbios ou condições que envolvem desmielinação e dismielina-ção. Exemplos de doenças ou distúrbios em que proliferação, diferenciaçãoe sobrevivência, e/ou mielinação ou remielinação de oligodendrócito seriambenéficos incluem esclerose múltipla (MS), Ieucoencefalopatia multifocalprogressiva (PML), encefalomielite (EPL), mielose pontino central (CPM),adrenoleucodistrofia, doença de Alexander, doença de Pelizaeus Merzba-cher (PMZ), Ieucodistrofia de célula globóide (Krabbe's disease), Degenera-ção de Wallerian, neurite ótica, mielite transversa, esclerose lateral amilotró-fica (ALS), doença de Huntington, doença de Alzheimer, Doença de Parkin-son, lesão da medula espinhal, lesão de cérebro traumática, lesão pós-radiação, complicações neurológicas de quimioterapia, acidente vascularcerebral, neuropatia ótica isquêmica aguda, deficiência de vitamina E, sín-drome de deficiência de vitamina E isolada, AR1 síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, Ieucodistrofia metacromática,neuralgia trigeminal, e paralisia de Bell.
Correspondentemente, uma concretização da presente invençãoprovê métodos para o tratamento de lesão, doenças ou distúrbios da medulaespinhal associados a inibição de crescimento neuronal no CNS1 doenças oudistúrbios associados a inibição de crescimento ou diferenciação oligoden-drócito, e doenças que envolvem desmielinação ou dismielinação de neurô-nios do CNS em um animal que sofre de tal lesão ou doença ou predispostoa contato de tal doença, o método compreendendo, que consiste essencial-mente de, ou que consiste em administração ao animal de uma quantidadeeficaz de um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, vari-ante, ou seu derivado. Anticorpos da invenção são descritos aqui, e incluemos anticorpos monoclonais listados nas tabelas 3A e 3B, anticorpos que es-pecificamente se ligam ao mesmo epitopo que os anticorpos monoclonaislistados na tabela 3A e 3B, anticorpos que competitivamente inibem a Iiga-ção dos anticorpos monoclonais listados nas tabelas 3A e 3B a Sp35, e anti-corpos compreendendo polipeptídeos derivados dos anticorpos monoclonaislistados nas tabelas 3A e 3B.
Um anticorpo de Sp35 terapêutico a ser usado nos métodos detratamento revelados aqui pode ser preparado e usado como um agente te-rapêutico que promove crescimento de neurito no CNS, sobrevivência neu-ronal, direção de axônio e regeneração de axônio, que promove sobrevivên-cia de oligodendrócito, crescimento, e/ou diferenciação, e que promove mie-linação ou remielinação de neurônios do CNS. Características de anticorposde Sp35 terapêuticos adequados incluem: ligação a epitopos de Sp35 queresultam no bloqueio de atividade de Sp35, ligação a Sp35 com afinidadesuficiente para eliciar um efeito terapêutico, e ligação a Sp35 preferencial-mente para normalizar pares de ligação, por exemplo, receptor de Nogo.
Anticorpos de Sp35 terapêuticos podem ser anticorpos mono-clonais, quiméricos ou humanizados, ou fragmentos de anticorpos que seligam especificamente a Sp35. Os anticorpos podem ser anticorpos monova-lentes, bivalentes, polivalentes, ou bifunctionais. Fragmentos de anticorpoincluem sem limitação fragmentos de Fab F(ab')2, e Fv.Anticorpos de Sp35 terapêuticos, ou fragmentos de ligação deantígeno, variantes ou seus derivados de acordo com a invenção podem serusados em forma não marcada ou não conjugada, ou podem ser acopladosou ligados a fármacos, rótulos ou agentes de estabilização que podem ounão podem excercer efeitos terapêuticos adicionais.
Um regime de tratamento e dosagemm específica para qualquerpaciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo do an-ticorpo de Sp35 particular, ou do fragmento de ligação de antígeno, da vari-ante ou de seu derivado usado, da idade do paciente, de peso de corpo, desaúde geral, do sexo e da dieta, e do tempo de administração, da taxa deexcreções da combinação de fármacos, e da severidade da doença particu-lar a ser tratada. Julgamento de tais fatores por profissionais encarregadosda prescrição médica está dentro da habilidade normal na técnica. A quanti-dade também dependerá do paciente individual a ser tratado, da rota de ad-ministração, do tipo de formulação, das características do composto usado,da severidade da doença, e do efeito desejado. A quantidade usada podeser determinada por princípios farmacológicos e farmacocinéticos bem-conhecidos na técnica.
Nos métodos da invenção os anticorpos de Sp35, ou fragmentosde ligação de antígeno, variantes ou seus derivados podem ser administra-dos diretamente ao sistema nervoso, intracerebroventricular, ou intrateca-mente, por exemplo em uma lesão crônica de MS, como discutido em maisdetalhes abaixo.
Em várias concretizações, um anticorpo de Sp35 como descritoacima é um antagonista de atividade de Sp35. Em certas concretizações,por exemplo, ligação de antagonista de anticorpo de Sp35 a Sp35, comoexpresso em neurônios, bloqueia inibição de crescimento de neurito associ-ada a mielina ou morte de célula neuronal. Em outras concretizações, liga-ção do anticorpo de Sp35 a Sp35, como expressa em oligodendrócitos, blo-queia inibição de crescimento ou diferenciação oligodendrócito, ou bloqueiadesmielinação ou dismielinação de neurônios do CNS.
Em métodos da presente invenção, um anticorpo de Sp35, ouum fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado, em particu-lar os anticorpos de Sp35 descritos aqui, podem ser administrados direta-mente como um polipeptídeo pré-formado, ou indiretamente através de umvetor de ácido nucléico, para permitir beneficiai axonal crescimento, promo-ver oligodendrócito proliferação, diferenciação, e sobrevivência, e/ou promo-ver mielinação ou remielinação.
Em certas concretizações, um indivíduo pode ser tratado comuma molécula de ácido nucléico que codifica um anticorpo de Sp35, oufragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu análogo, por exemplo,em um vetor. Doses para ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos vari-am de cerca de 10 ng a 1 g, de 100 ng a 100 mg, de 1 μg a 10 mg, ou de 30-300 μg de DNA por paciente. Doses para vetores virais infecciosos variamde 10-100, ou mais, vírions por dose.
Em algumas concretizações da presente invenção um anticorpode Sp35, ou um fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivadoé administrado em um método de tratamento que inclui: (1) transformaçãoou transfecçao de uma célula hospedeira implantável com um ácido nucléi-co, por exemplo, um vector, que expressa um anticorpo de Sp35, ou umfragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado; e (2) implanta-ção da célula hospedeira transformada para dentro de um mamífero, no sítiode uma doença, distúrbio ou lesão. Por exemplo, a célula hospedeira trans-formada pode ser implantada no sítio de uma lesão da medula espinhal ou aum sítio de dismielinação. Em algumas concretizações da invenção, a célulahospedeira implantável é removida a partir de um mamífero, temporariamen-te é cultivada, é transformada ou é transfectada com um ácido nucléico iso-lado que codifica um anticorpo de Sp35, e é implantado de volta para dentrodo mesmo mamífero a partir do qual ele foi removido. A célula pode ser, masnão é necessária ser, removida a partir do mesmo sítio em que ela é implan-tada. Tais concretizações, algumas vezes conhecida como terapia de geneex vivo, pode prover fornecimento contínuo do polipeptídeo de Sp35, locali-zado no sítio de ação, por um período de tempo limitado.
Os métodos para o tratamento de lesão da medula espinhal, do-enças ou distúrbios associados a inibição de crescimento neuronal no CNS,doenças ou distúrbios associados a inibição de crescimento ou diferenciaçãooligodendrócito, e doenças que envolvem desmielinação ou dismielinação deneurônios do CNS compreendendo administração de um anticorpo de Sp35,ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado da invençãosão tipicamente testados in vitro, e então in vivo em um modelo de animalaceitável, para a atividade atividade terapêutica ou profilática desejada, an-tes do uso em seres humanos. Modelos de animais adequados, incluindoanimais transgênicos, são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica.
Por exemplo, ensaios in vitro para demonstrar a utilidade terapêutica de an-ticorpo de Sp35 descritos aqui incluem o efeito de um anticorpo de Sp35 so-bre uma linha de célula ou uma amostra de tecido de paciente. O efeito doanticorpo de Sp35 sobre uma linha de célula e/ou uma amostra de tecidopode ser determinado utlizando-se técnicas conhecidas por aqueles versa-dos na técnica, tais como os ensaios revelados em outro lugar aqui. De a-cordo com a invenção, ensaios in vitro que podem ser usados para determi-nar se admistração de um anticorpo de Sp35 específico é indicado, incluemensaios de cultura de célula in vitro em que uma amostra de tecido de paci-ente é desenvolvida em cultura, e é exposta a ou de outra maneira adminis-trada um composto, e o efeito de tal composto na amostra de tecido é ob-servado.
Compostos ativos suplementares também podem ser incorpora-dos nas composições da invenção. Por exemplo, um anticorpo de Sp35, oufragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado da invençãopode ser coformulado com e/ou coadministrado com um ou mais agentesterapêuticos adicionais.
A invenção inclui qualquer método de fornecimento adequadopara um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante,ou seu derivado da invenção a um tecido-alvo selecionado, incluindo injeção"bolus" de uma solução aquosa ou implantação de um sistema de liberaçãocontrolada. Uso de um implante de liberação controlada reduz a necessida-de de injeções repetidas.IX. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO
Métodos de preparação e administração de anticorpos de Sp35,ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da in-venção a um indivíduo que necessita são bem-conhecidos por ou são pron-tamente determinados por aqueles versados na técnica. A rota de adminis-tração do anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante,ou seu derivado pode ser, por exemplo, oral, parenteral, por inalação ou to-pical. O termo parenteral como usado aqui inclui, por exemplo, administra-ção intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea,retal ou vaginal. Enquanto todas essas formas de administração estão cla-ramente contemplados como estando dentro do escopo da invenção, umaforma para a administração seria uma solução para a injeção, em particularpara a injeção ou gotejamento intravenosa ou intra-arterial. Usualmente,uma composição farmacêutica adequada para a injeção pode compreendeum tampão (por exemplo acetato, tampão de fosfato ou citrato), um tensoati-vo (por exemplo polissorbato), opcionalmente um agente estabilizador (porexemplo, albumina humana), etc. No entanto, em outros métodos compatí-veis com os ensinamentos aqui, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de Iiga-ção de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser forne-cidos diretamente ao sítio da população celular adversa desse modo aumen-tando a exposição de tecido doente ao agente terapêutico.
Como anteriormente discutido, anticorpos de Sp35, ou fragmen-tos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podemser administrados em uma quantidade farmaceuticamente eficaz para o tra-tamento in vivo de lesão da medula espinhal de mamífero, doenças ou dis-túrbios associados a inibição de crescimento neuronal no CNS, doenças oudistúrbios associados a inibição de crescimento ou diferenciação oligoden-drócito, e doenças que envolvem desmielinação ou dismielinação de CNS.Neste aspecto, será apreciado que os anticorpos revelados serão formula-dos a fim de facilitar administração e promover estabilidade do agente ativo.De preferência, composições farmacêuticas de acordo com a presente in-venção compreendem a veículo estéril, não tóxico, farmaceuticamente acei-tável tais como solução salina fisiológica, tampões não tóxicos, conservantese similares. Para as finalidades do presente pedido de patente, uma quanti-dade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo de Sp35, ou fragmento deligação de antígeno, variante, ou seu derivado, conjugado ou não cojuntado,sustentarão para significa uma quantidade suficiente para alcançar ligaçãoeficaz a um alvo e para alcançar um benefício, por exemplo, melhorar sinto-mas de uma doença ou distúrbio ou para detectar uma substância ou umacélula.
As composições farmacêuticas usadas nesta invenção compre-endem veículos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, trocade íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas de soro, tal comoalbumina de soro de ser humano, substâncias de tampão tais còmo fosfatos,glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeos parciaisde ácido graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sul-fato de protamina, fosfato de hidrogênio de dissódiio, fosfato de hidrogêniode potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato demagnésio, polivinil pirrolidona, substâncias à base de celulose polietilenoglicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros por blo-cos de polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e gordura de lã.
Preparações para a administração parenteral inclui suspensões,emulsões e soluções aquosas ou não aquosas estéreis. Exemplos de sol-ventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais taiscomo óleo de oliva, ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etila. Ve-ículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões oususpensões, incluindo solução salina e meio tamponado. Na presente inven-ção, veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitadosa, tampão de fosfato a 0,01-0,1 M e de preferência a 0,05 M ou solução sali-na a 0,8%. Outros veículos parenterais comuns incluem soluções de fosfatode sódio, dextrose de Ringer, cloreto de sódio e dextrose, Ringer lactado, ouóleos fixos. Veículos intravenoso incluem reabastecedores de fluido e denutriente, eabastecedores de eletrólito, tais como aqueles à base de dextro-se de Ringer, e similares. Conservantes e outros aditivos podem tambémestar presentes tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, a-gentes de quelação, gases inertes e similares.
Mais particularmente, composições farmacêuticas adequadaspara o uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde solúvel emágua) ou dispersões ou pós estéreis para preparação extemporânea de dis-persões ou soluções injetáveis estéreis. Em tais casos, a composição deveser estéril e seria fluida para a extensão que seringabilidade fácil existe. Se-ria estável sob as condições de fabricação e armazenagem de preferênciaseria preservada contra a ação de contaminantes de microorganismos, taiscomo bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente, um mio de disper-são contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propi-leno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares), e suas misturas adequa-das. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um re-vestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula ne-cessária no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Formulações ade-quadas para o uso nos métodos terapêuticos revelados aqui são descritosem Remington1S Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16th ed.(1980).
Prevenção da ação de microorganismos pode ser alcançada porvários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clo-robutanol, genol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos,será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois,tal como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorção pro-longada das composições injetáveis pode ser realizada por incluir na com-posição um agente que retarda absorção, por exemplo, monoestearato dealumínio e gelatina.
Em qualquer caso, soluções injetáveis estéreis podem ser pre-paradas por incorporação de um composto ativo (por exemplo, um anticorpode Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado,por si mesmo ou em combinação com outros agentes ativos) na quantidadeexibida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredi-entes enumerados aqui, quando exigido, seguido por esterilização filtrada.Em geral, dispersões as preparados por incorporação do composto ativo emum veicul estéril, que conté um meio de dispersão básico e os outros ingre-dientes exigidos a partir daqueles enumeros acima. No caso de pós estéreispara a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos dapreparação de secagem a vácuo, secagem por congelamento, que forneceum pó de um ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicionalde uma sua solução anteriormente filtrada estéril. As preparações para asinjeções são processadas, são introduzidas em recipientes, tais como ampo-las, bolsas, garrafas, seringas ou frascos, e são seladas sob condições as-sépticas condições de acordo com métodos conhecido na técnica. Além dis-so, as preparações podem ser embaladas e vendidas na forma de um kit taiscomo aquelas descritas na patente U.S.S.N co-pendente ne 09/259.337 (US-2002-0102208 A1), que é incorporada aqui por referência em sua totalidade.Tais artigos de fabricação de preferência terão rótulos ou insertos de emba-lagem que indicam que as composições associadas são úteis para o trata-mento de um indivíduo que sofre de, ou são predispostos paro distúrbiosauto-imunes ou neoplásicos.
Formulações Parenterais podem ser dose de "bolus" única, umadose de "bolus"de carregamento ou infusão seguido com uma dose de ma-nutenção. Essas composições podem ser administradas a intervaloos fixosou variáveis específicos, por exemplo, uma vez por dia, ou em uma base"quando necessária".
Certas composições farmacêuticas usadas nesta invenção po-dem ser oralmente administradas em uma forma de dosagemm aceitávelincluindo, por exemplo, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluçõesaquosas. Certas composições farmacêuticas também podem ser administra-das por inalação ou aerossol nasal. Tais composições podem ser prepara-das como solução em solução salina, que empregam álcool benzílico ou ou-tros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar bio-disponibilidade, e/ou outros agentes de dispersão ou solubilização conven-cionais.A quantidade de um anticorpo de Sp35, ou fragmento, variante,ou seu derivado que pode ser combinado com os materiais de veículo paraproduzir uma forma de dosagemm única variará dependendo do hospedeirotratado e do modo particular da administração. A composição podem seradministradas como uma dose única, múltiplas doses ou durante um períodode tempo estabelecido em uma infusão. Regimes de dosagemm tambémpodem ser ajustadas para prover a ótima resposta desejada (por exemplo,uma resposta terapêutica ou profilática).
De acordo com o escopo da presente revelação, anticorpos deSp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivadosda invenção podem ser administrados a um ser humano ou outro animal deacordo com os métodos acima mencionados de tratamento em uma quanti-dade suficiente para produzir um efeito terapêutico. Os anticorpos de Sp35,ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da in-venção podem ser administrados a tal ser humano ou outro animal de umaforma de dosagemm convencional preparada por combinação do anticorpoda invenção com um veículo ou diluente farmaceuticamente convencional deacordo com técnicas conhecidas. Será reconhecido por aquele versado natécnica que a forma e caráter do veículo ou diluente farmaceuticamente acei-tável é ditada por um quantidade de ingrediente ativo com a qual deve sercombinada, a rota de administração e outras variáveis bem-conhecidas. A-queles versados na técnica ulteriormente apreciarão que um coquetel com-preendendo uma ou mais espécies de anticorpos de Sp35, ou fragmentos deligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem proverser particularmente eficazes.
Doses eficazes das composições da presente invenção, para otratamento de lesão da medula espinhal, doenças ou distúrbios associados ainibição de crescimento neuronal no CNS, doenças ou distúrbios associadosa inibição de crescimento ou diferenciação oligodendrócito, e doenças queenvolvem desmielinação ou dismielinação do CNS variam dependendo demuitos fatores diferentesw, incluindo meios de administração, sítio-alvo, es-tado fisiológico do paciente, se a paciente é um ser humano ou um animal,outras medicações administração, e se tratamento é profilático ou terapêuti-co. Usualmente, o paciente é um ser humano mas mamíferos não humanosincluindo mamíferos transgênicos podem também ser tratados. Dosagens detratamento podem ser tituladas usando-se métodos rotineiros conhecidaspor aqueles versados na técnica para otimizar segurança e eficácia.
Para o tratamento de lesão da medula espinhal, doenças ou dis-túrbios associados a inibição de crescimento neuronal no CNS, doenças oudistúrbios associados a inibição de crescimento ou diferenciação oligoden-drócito, e doenças que envolvem desmielinação ou dismielinação de CNScom um anticorpo de Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante,ou seu derivado, a dosagemm pode variar, por exemplo, de cerca de 0,0001a 100 mg/kg, e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, de 0,02mg/kg, de 0,25 mg/kg, de 0,5 mg/kg, de 0,75 mg/kg, de 1 mg/kg, de 2 mg/kg,etc.), do peso de corpo do hospedeiro. Por exemplo, dosagens podem serde 1 mg/kg de peso de corpo ou 10 mg/kg de peso de corpo ou dentro dafaixa de 1-10 mg/kg, de preferência pelo menos 1 mg/kg. Doses intermediá-rias nas faixas acima também destinam-se estar dentro do escopo da inven-ção. A indivíduos podem ser administrados tais doses diariamente, em diasalternados, semanalmente ou de acordo com qualquer outra escala determi-nada por análise empírica. Um tratamento exemplar vincula a administraçãoem múltiplas dosagens durante um período prolongado, por exemplo, depelo menos seis meses. Regimes de tratamento exemplar adicionais vincu-lam a administração uma vez por cada duas semanas ou uma vez ao mêsou uma vez a cada 3 a 6 meses. Escalas de dosagemm exemplar incluemde 1-10 mg/kg ou de 15 mg/kg em dias consecutivos, de 30 mg/kg em diasalternados ou de 60 mg/kg semanalmente. Em alguns métodos, dois ou maisanticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são admi-nistrados simultaneamente, caso esse em que a dosagemm de cada anti-corpo administrado cai dentro das faixas indicadas.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados da invenção podem ser administrados em múltiplasocasiões. Intervalos entre dosagens únicas podem ser diária, semanal, men-sal ou anualmente. Intervalos podem também ser irregulares como indicadopor medição de níveis de sangue da molécula-alvo ou do polipeptídeo-alvono paciente. Em alguns métodos, dosagem é ajustada para alcançar umaconcentração de polipeptídeo no plasma de 1-1000 μg/ml e em alguns mé-todos 25-300 Mg/ml. Alternativamente, anticorpos de Sp35, ou fragmentos deligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem seradministrados como uma formulação de liberação sustentada, caso esse emque administração menos freqüente é exigida. Dosagem e freqüência variamdependendo da semi-vida do anticorpo no paciente. A semi-vida de um anti-corpo de Sp35 pode também ser prolongada via fusão a um polipeptídeoestável ou porção, por exemplo, albumina ou PEG. Em geral, anticorposhumanizados mostram a semi-vida mais longa, após os anticorpos quiméri-cos e anticorpos não humanizados. Em uma concretização, os anticorpos deSp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivadosda invenção podem ser administrados em forma não conjugada, Em umaoutra concretização, os anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação deantígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser administra-dos em múltiplas horas em forma conjugada. Em ainda uma outra concreti-zação, anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes,ou seus derivados da invenção podem ser administrados em forma não con-jugada, então na forma conjugada, ou vice versa.
As composições da presente invenção pode ser administradapor qualquer método adequado, por exemplo, parenteral, intraventricularl,oral, por spray de inalação, tópical, retal, nasal, bucal ou vaginalmente ou viaum reservatório implantado. O termo "parenteral" como usado aqui incluitécnicas de infusão ou injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intra-esternal, intratecal, intra-hepática, intralesional eintracraniana. Como descrito anteriormente, anticorpos de Sp35, ou frag-mentos de ligação de antígeno, variantes, ou seus derivados da invençãoagem no sistema nervoso central para promover sobrevivência, proliferaçãoe diferenciação de oligodendrócitos e mielinação de neurônios e sobrevivên-cia neuronal, regeneração de axônio e direção de axônio. Correspondente-mente, nos métodos da invenção, os anticorpos de Sp35, ou fragmentos deligação de antígeno, variantes, ou seus derivados são administrados de talmodo que eles cruzam a barreira de sangue-cérebro. Esse cruzamento poderesultar das propriedades físico-química inerentes na própria molécula deanticorpo de Sp35, de outros componentes em uma formulação farmacêuti-ca, ou do uso de um dispositivo mecânico tais como agulha, cânula ou ins-trumentos cirúrgicos para romper a barreira de sangue-cérebro. Onde o anti-corpo de Sp35 é uma molécula que não ineretemente cruza a barreira desangue-cérebro, por exemplo, uma fusão a um porção que facilita o cruza-mento, rotas adequadas de administração são, por exemplo, intratecal ouintracraniana, por exemplo, diretamente em uma lesão crônica de MS. Ondeo anticorpo de Sp35 é uma molécula que inerentemente cruza a barreira desangue-cérebro, a rota de administração pode ser por uma ou mais das vá-rias rotas descritas abaixo. Em alguns métodos, anticorpos são administra-dos como um dispositivo ou composição de liberação sustentada, tal comoum dispostivo Medipad®. Fornecimento através da barreira de sangue cére-bro pode ser aumentada por uma molécula portador, tal como um receptorde anti-Fc, transferrina, receptor de antiinsulina ou um aumentador de pene-tração ou conjugado de toxina.
Os anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno,variantes, ou seus derivados usados nos métodos da invenção podem serdiretamente infundidos para dentro do cérebro. Vários implantes para a infu-são de cérebro direta de compostos são conhecidos e são eficazes no for-necimento de compostos terapêuticos a pacientes humanos que sofrem dedistúrbios neurológicos. Esses incluem infusão crônica para dentro do cére-bro usando-se uma bomba, cateteres intersticiais temporários, esteretatica-mente implantados, implantes de catater intracraniano permanentes, e im-plantes biodegradáveis cirurgicamente implantados. Vide, por exemplo, Gill eoutros, "Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor inParkinson doença," Nature Med. 9: 589-95 (2003); Scharfen e outros, "HighActivity lodine-125 Interstitial Implant For Gliomas," Int. J. Radiation Onco-Iogy Biol. Phys. 24(4):583-91 (1992); Gaspar e outros, "Permanent 125I Im-plants for Recurrent Malignant Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol.Phys. 43(5):977-82 (1999); chapter 66, pages 577-580, Bellezza e outros,"Stereotactic Interstitial Brachytherapi," in Gildenberg e outros, Textbook ofStereotactic e Funetional Neurosurgery, MeGraw-HiII (1998); e Brem e ou-tros, "The Safety of Interstitial Chemotherapi with BCNU-Loaded Polimer Se-guido by Radiation Therapi in the Treatment of Newly Diagnosed MalignantGliomas: Phase I Trial," J. Neuro-Oncology 26:111-23 (1995).
As composições pode também compreender um anticorpo deSp35 dispersas em um material de veículo biocompátival que funciona comoum sistema de suporte ou fornecimento adequado para os compostos. E-xemplos adequados de veículos de liberação sustentada incluem matrizesde polímero semipermeáveis na forma de artigos modelados tais como su-positórios ou cápsulas. Matrizes de liberação sustentada implantável ou mi-crocapsular incluem polilactídeos (a patente U.S. ne 3.773.319; EP 58,481),copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman e outros,Biopolimers 22:547-56 (1985)); poli(2-hidroxietil-metacrilato), acetato de vini-Ia de etileno (Langer e outros, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981);Langer1 Chem. Tech. 12:98-105 (1982)) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico(EP 133,988).
Em algumas concretizações da invenção, um anticorpo de Sp35,ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado da invençãoé administrado a um paciente por infusão direta em uma região apropriadado cérebro. Vide, por exemplo, Gill e outros, supra. Técnicas alternativasestão disponíveis e podem ser aplicadas para administrar um anticorpo deSp35 de acordo com a invenção. Por exemplo, colocação estereotática deum cateter ou implante pode ser realizado usando-se a unidade de Riechert-Mundinger e a unidade de localização de múltiplas finalidades ZD (Zamora-no-Dujovny). Uma varredura de tomografia computadorizada (CT) aumenta-da por contraste, injeção de 120 ml de omnipaque, 350 mg de iodo/ml, comespessura de fatia 2 mm pode permitir planejamento de tratamento multipla-nar (STP, Fischer, Freiburg, Alemanha). Este equipamento permite planeja-mento com base em estudos de ressonância de imagem magnética, incorpo-rando a informação de CT e MRI-alvo para a confirmação de alvo clara.
O sistema esterotático (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA) modi-ficado para o uso com um scanner GE CT (General Electric Company, Mil-waukee, Wl) bem como o sistema estereitático Brown-Roberts-Wells (BRW)(Radionics, Burlington, MA) podem ser usados para esta finalidade. Assim,na manhã do implante, o anel de base anular do quadro estereotático deBRW pode ser ligado ao crânio do paciente. Seções de CT em série podemser obtidas a intervalos de 3 através da região (tecido-alvo) com um quadrode localizador de barra de grafite prendido na placa de base. Um programade planejamento de tratamento computadorizado pode ser realizado em umcomputador VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.)usando-se coordenadas de CT das imagens de barra de grafite para mapearentre espaço de CT e espaço de BRW.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados da invenção podem opcionalmente ser administra-dos em combinação com outros agentes que são eficazes no tratamento dodistúrbio ou condição que necessita de tratamento (por exemplo, profiláticoou terapêutico).
X. DIAGNÓSTICOS
A invenção ulteriormente provê um método de diagnóstico útildurante a diagnose de distúrbios ou lesões neuronais, que envolve a medi-ção de um nível de expressão de transcrito ou proteína de Sp35 em tecidoou outras células ou fluido de corpo a partir de um indivíduo e comparaçãocom nível de expressão medido com um padrão de níveis de expressão deSp35 em tecido normal ou fluido de corpo, pelo que um aumento em um ní-vel de expressão comparado com o padrão é indicativo de um distúrbio.
Os anticorpos de Sp35-específicos podem ser usados para ana-lisar níveis de proteína em uma amostra biológica usando-se métodos imu-noistológicos clássicos conhecidos por aqueles versados na técnica (por e-xemplo, vide Jalkanen, e outros, J. CeH Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen,e outros, J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)). Outros métodos à base de an-ticorpo úteis para a detecção de expressão de proteína incluem imunoensai-os, tal como o ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), imunopreci-pitação, ou western blotting. Ensaios adequados são descritos em mais de-talhes em outro lugar aqui.
Por "análise de um nível de expressão de polipeptídeo de Sp35"é destinado qualitativa ou quantitativamente a medir ou estimar o nível depolipeptídeo de Sp35 em uma primeira amostra biológica ou diretamente(por exemplo, por determinação ou estimação do nível de proteína absoluta)ou relativamente (por exemplo, por comparação com o câncer associado anível de polipeptídeo em uma segunda amostra biológica). De preferência,nível de expressão de polipeptídeo de Sp35 em uma primeira amostra bioló-gica é medido ou é estimado e é comparado com um nível de polipeptídeode Sp35 padrão, o padrão sendo tirado de uma segunda amostra biológicaobtida a partir de um indivíduo não tendo o distúrbio ou sendo determinadopela média de níveis a partir de uma população de indivíduos não tendo odistúrbio. Como será apreciado na técnica, uma vez que o nível de polipeptí-deo de Sp35 "padrão" é conhecido, ele pode ser usado repetidamente comoum padrão para a comparação.
Por "amostra biológica" destina-se a qualquer amostra biológicaobtida a partir de um indivíduo, linha de célula, cultura de tecido, ou outrafonte de células potencialmente que expressam Sp35. Métodos para a ob-tenção de biópsias de tecido e fluidos de corpo a partir de mamíferos sãobem-conhecidos na técnica.
Anticorpos de Sp35 para o uso nos métodos described de diag-nósticos acima incluem qualquer anticorpo de Sp35 que especificamente seliga a um produto de gene de Sp35, como descrito em outro lugar aqui.
XI. IMUNOENSAIOS
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados da invenção podem ser analisados quanto a liga-ção imunoespecífica por qualquer método conhecido na técnica. Os imuno-ensaios que podem ser usados incluem mas não são limitados a sistemasde ensaio competitivos e não competitivos usando-se técnicas tais comowestern blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaios imunossorvente ligado aenzima), imunoensaios de "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, rea-ções de precipitina, reações de precipitina de difusão de gel, ensaios de i-munodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento,ensaios de imunorradiométrico, imunoensaios fluorescentes, imunoensaiosde proteína A, para designar alguns. Tais ensaios são rotineiros e bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ausubel e outros, eds, CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol. 1(1994), que é incorporada por referência aqui em sua totalidade). Imunoen-saios exemplares são descritos resumidamente abaixo (mas não destina-seà título de limitação).
Protocolos de imunoprecipitação em geral compreendem Iise deuma população de células em uma tampão de Iise tais como tampão de RI-PA (1% de NP-40 ou Triton X-100, 1% de desoxicolato de sódio, 0,1% deSDS, NaCI a 0,15 M, fosfato de sódio a 0,01 M a pH 7,2, 1% de Trasylol)suplementado com inibidores de fosfatase e/ou protease de proteína (porexemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sódio), adição do anticorpode interesse a um Iisado de célula, incubação por um período de tempo (porexemplo, de 1-4 horas) a 4°C, adição de contas de sefarose de proteína Ae/ou proteína G a um Iisado de célula, incubação por cerca de uma hora oumais a 4°C, lavagem das contas em tampão de Iisado e ressuspensão dascontas em tampão de amostrada/SDS. A capacidade do anticorpo de inte-resse para imunoprecipitar um antígeno particular pode ser avaliado por, porexemplo, análise de westem blot. Aquele versado na técnica seria instruídoquanto aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar a ligaçãodo anticorpo a um antígeno e diminuir a base (por exemplo, pré-claremaentode um Iisado de célula com contas de sefarose). Para outra discussão emrelação a protocolos de imunoprecipitação vide, por exemplo, Ausubel e ou-tros, eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.,NewYork, Vol. 1 (1994) a 10.16.1.
Análise de Western blot em geral compreende a preparação deamostas de proteína, eletroforese das amostras de proteína em um gel depoliacrilamida (por exemplo, 8%-20% de SDS-PAGE dependendo do pesomolecular do antígeno), transferência da amostra de proteína do gel de poli-acrilamida para uma membran tal com nitrocelulose, PVDF ou náilon, blo-queamento da membrana na solução de bloqueamento (por exemplo, PBScom 3% de BSA ou leite desnatado), lavagem da membrana no tampão delavagem (por exemplo, PBS-Tween 20), bloqueamento da membrana comanticorpo prirmário (o anticorpo de interesse) diluído no tampão de bloquea-mento, lavagem da membrana no tampão de lavagem, bloqueamento damembrana com um segundo anticorpo (que reconhece o anticorpo primário,por exemplo, um anticorpo anti-humano) conjugado a um substrato enzimá-tico (por exemplo, peroxidade de rábano-silvestre ou fosfatase alcalina) oumolécula radioativa (por exemplo, 32p ou 1251) diluído no tampão de blo-queamento, lavagem da membrana no tampão de lavagem, e detecção dapresença do antígeno. Aquele versado na técnica seria instruído quanto aosparâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectadopara reduzir o ruído de base. Para outra discussão em relação a protocoloswestern blot vide, por exemplo, Ausubel e outros, eds, Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York Vol. 1 (1994) at10,8.1.
ELISAs compreendem preparação de antígeno, revestimento dacavidade de uma placa de microtítulo de 96 cavidades com o antígeno, adi-ção do anticorpo de interesse conjugado a um composto detectável tal comoum substrato enzimático (por exemplo, peroxidade de rábano-silvestre oufosfatase alcalina) à cavidade e incubação por um período de tempo, e de-tecção da presença do antígeno. Em ELISAs o anticorpo de interesse nãotem de ser conjugado a um composto detectável; ao invés disso, um segun-do anticorpo (que reconhece o anticorpo de interesse) conjugado a um com-posto detectável pode ser adicionado à cavidade. Além disso, ao invés dissodo revestimento da cavidade com o antígeno, o anticorpo pode ser revestidoà cavidade. Neste caso, um segundo anticorpo conjugado a um compostodetectável pode ser adicionado após a adição do antígeno de interesse àcavidade revestida. Aquele versado na técnica seria instruído quanto aosparâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectadobem como outras variações de ELISAs conhecidoas na técnica. Para outradiscussão com relação a ELISAs vide, por exemplo, Ausubel e outros, eds,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York,Vol. 1 (1994) a 11.2.1.
A afinidade de ligação de um anticorpo a um antígeno e o índicede ocorrência de uma interação de anticorpo-antígeno pode ser determinadapor ensaios de ligação competitivas. Um exemplo de um ensaio de ligaçãocompetitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de antíge-no marcado (por exemplo, 3H ou 125I) com o anticorpo de interesse na pre-sença de aumento de quantidades de antígeno não marcado, e a detecçãodo anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anticorpo de inte-resse para um antígeno particular e a ligação de índice de ocorrência podeser determinada dos dados por análise de diagrama de scatchard. Competi-ção com um segundo anticorpo podem também ser determinada usando-seradioimunoensaios. Neste caso, o antígeno é incubado com anticorpo deinteresse é conjugado a um composto marcado (por exemplo, 3H ou 125I) napresença de aumento de quantidades de um segundo anticorpo não anticor-po.
Anticorpos de Sp35, ou fragmentos de ligação de antígeno, vari-antes, ou seus derivados da invenção, adicionalmente, são empregados his-tologicalmente, como em imunofluorescência, microscopia imunoeletrônicaou ensaios não imunológicos, para detecção in situ de produtos de gene deantígeno de câncer ou variantes conservadas ou seus fragmentos de peptí-deo. Detecção in situ pode ser realizada por remoção de uma espécie histo-lógica a partir de um paciente, e aplicação ao mesmo de um anticorpo deSp35 marcado, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu deri-vado, de preferência aplicado por sobreposição do anticorpo marcado (oufragmento) sobre uma amostra biológica. Através do uso de tal procedimen-to, é possível determinar apenas a presença de proteína de Sp35, ou varian-tes conservadas ou fragmentos de peptídeo, mas também sua distribuiçãono tecido examinado. Usando-se a presente invenção, aqueles versadosprontamente perceberão que qualquer uma ampla variedade de métodoshistológicos (tais como procedimentos de manchamento) podem ser modifi-cados a fim de alcançar tal detecção in situ.
Imunoensaios e não imunoensaios para os produtos de gene deSp35 ou variantes conservadas ou seus fragmentos de peptídeo tipicamentecompreenderão incubação de uma amostra, tais como fluido biológico, a ex-trato de tecido, células frescamente coletadas, Iisados de células que foramincubados em cultura de células, na presença de um anticorpo detectavel-mente marcado capaz de ligar a Sp35 ou variantes conservadas ou seusfragmentos de peptídeo, e detecção do anticorpo ligado por qualquer umadas numerosas técnicas bem-conhecidas na técnica.
A amostra biológica pode ser posta em contato com e imobiliza-da sobre um suporte ou veículo de fase sólida tal como nitrocelulose, ou ou-tro suporte sólido que é capaz de imobilizar células, partículas de células ouproteínas solúveis. O suporte pode então ser lavado com tampões adequa-dos seguido por tratamento com o anticorpo detectavelmente marcado deSp35, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado. Osuporte de fase sólia pode então ser lavado com o tampão uma segunda vezpara remover anticorpo não ligado. Opcionalmente o anticorpo é subseqüen-temente marcado. A quantidade de rótulo marcado no suporte sólido podeentão ser detectada por meio convencional.
Por "veículo ou suporte de fase sólida" destina-se a qualquersuporte capaz de ligar um antígeno ou um anticorpo. Suportes ou veículosbem-conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dex-trano, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas,gabros, e magnetita. A natureza do veículo pode ser ou solúvel em algumaextensão ou insolúvel para as finalidades da presente invenção. O suportematerial pode ter virtualmente qualquer configuração estrutural possível con-tanto que a molécula acoplada seja capaz de ligar a um antígeno ou um an-ticorpo. Assim, a configuração de suporte pode ser esférica, como em umaconta ou cilíndrica, como na superfície interna de um tubo de teste, ou a su-perfície externa de uma barra. Alternativamente, a superfície pode ser planatal como uma folha, tira de teste, etc. Suportes preferidos incluem contas depoliestireno. Aqueles versados na técnica reconhecerão muitos outros veícu-los adequados para a ligação de anticorpo ou de antígeno, ou serão capa-zes de determinar a mesma por uso de experimentação rotineira.
A atividade de ligação de um dado lote de anticorpo de Sp35, oufragmento de ligação de antígeno, variante, ou seu derivado pode ser deter-minada de acordo com métodos bem-conhecidos. Aqueles versados na téc-nica serão capazes de determinar condições de ensaio operativas ou ótimaspara cada determinação por emprego de experimentação rotineira.
Há uma variedade de métodos disponíveis para a medição daafinidade de uma interação de anticorpo-antígeno, mas relativamente poucopara a determinação de constantes de taxa. A maioria dos métodos contamcom ou ligação de anticorpo ou de antígeno, que inevitavelmente complicamedições rotineiras e introduz invariabilidades nas quantidades medidas.
Ressonância de plasmônio de superfície (SPR) como realizadaem BIAcore oferece numerosas vantagens sobre métodos convencionais damedição da afinidade de interações de anticorpo-antígeno: (i) nenhum requi-remento para marcar ou anticorpo ou antígeno; (ii) anticorpos não necessi-tam ser purificados antecipadamente, sobrenadante de cultura de célula po-de ser usado diretamente; (iii) medições de tempo real, permissão de com-pração semi-quantitativa rápida de interações de anticorpo monoclonal dife-rentes, são permtidas e são suficientes para muitas finalidades de avaliação;(iv) superfície bioespecífica pode ser regenerada de modo que uma série deanticorpos monoclonais diferentes possam ser facilmente comparados sobcondições idênticas; (v) procedimentos analíticos são totalmente automati-zados, e uma serie extensiva de medições pode ser realizada sem interven-ção do usuário BlAappIications Handbook, versão AB (reimpresso 1998),BIACORE código Nq BR-1001-86; BIAtechnoIogy Handbook, verão AB (re-impresso 1998), BIACORE código N5 BR-1001-84.
Estudos de ligação à base de SPR que um membro de um parde ligação a ser imobilizado sobre uma superfície de sensor. O par de liga-ção imobilizado é chamado do ligante. O par de ligação na solução é cha-mado do análito. Em alguns casos, o ligante é ligado indiretamente à super-fície através de ligação a uma outra molécula imobilizada, que é chamada damolécula de captura. Resposta de SPR reflete uma mudança em uma con-centração de massa na superfície de detecção como análitos se ligam ou sedissociam.
Com base em SPR, medições de BIAcore de tempo real moni-tram interações diretamente como elas acontecem. A técnica é bem-adequada para a determinação de parâmetros cinéticos. Classificação deafinidade comparativa é extremamente simples para realizar, e tanto cons-tantes cinéticas quanto constantes para afinidade podem ser derivadas dosdados de sensograma.
Quando análito é injetado em um pulso discreto através de umasuperfície de ligante, o sensorgrama resultante pode ser dividido em trêsfases essenciais: (i) Associação de análito com ligante durante a injeção deamostra; (ii) Estado constante ou de equilíbrio durante a injeção de amostra,onde a taxa de ligação de análito é equilibrada por dissociação do complexo;(iii) Dissociação de análito da superfície durante o fluxo de tampão.
As fases de associação e de disssociação provêem informaçãona cinética de interação de interação de análito-ligante (kg e kd, as taxas dedissociação e formação complexa, Mka = KD). A fase de equilíbrio provê in-formação sobre a afinidade da interação de análito-ligante (KD).
Software de BIAevaIuation provê facilidades compreensivas parao ajuste de curva usando-se tanto integração numérica quanto algoritmos deajuste global. Com análise adequada dos dados, taxa separada e constantede afinidade para a interação podem ser obtidas a partir de investigações deBIAcore simples. A faixa de afinidades mensurável por esssa técnica é vari-ação muito ampla de mM a pM.
Especificidade de epitopo é uma característica importante de umanticorpo monoclonal. Mapeanamento de epitopo com BIAcore, em contras-te com as técnicas convencionais usando-se radioimunoensaio, ELISA ououtros métodos de adsorção de superfície, não exige marcação ou anticor-pos purificados, e permite testes de especificidade de múltiplos sítios usan-do-se uma seqüência de vários anticorpos monoclonais. Adicionalmente,grandes números de análises podem ser processados automaticamente.
Experiências de ligação aos pares testam a capacidade de doisMAbs se ligar simultaneamente ao mesmo antígeno. MAbs dirigido contraepitopos separados se ligarão independentemente, enquanto que MAbs diri-gido contra epitopos idênticos ou proximamente relacionados interferirãocom a ligação entre si. Essas experiências de ligação com BIAcore estarãoevidentes para realizar.
Por exemplo, pode-se usar um molécula de captura para ligar oprimeiro Mab, seguido por adição de antígeno e segundo MAb seqüencial-mente. Os sensorgramas revelarão: 1. quanto do antígeno se liga a primeiroMab, 2. ao qual estende o segundo MAb se liga ao antígeno ligado a super-fície, 3. se o segundo MAb não se ligar, se reversão da ordem em teste empares altera os resultados.
Inibição de peptídeo é uma outra técnica para o mapeamento deepitopo. Este método pode complementar estudos de ligação de anticorpoaos pares, e pode relacionar epitopos funcionais com características estrutu-rais quando a seqüência primária do antígeno é conhecida. Peptídeos oufragmentos de antígeno são testados quanto a inibição de ligação de MAbsdiferentes em antígeno imobilizado. Peptídeos que interferem com ligaçãode um dado MAb são admitidos a serem estruturalmente relacionados com oepitopo definido por aquele MAb.
A prática da presente invenção empregará, a não ser que deoutra maneira indicado, técnicas convencionais de biologia celular, a não serque de outra maneira indicadas, técnicas convencionais de biologia celular,cultura de célula, biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante, eimunologia, que estão dentro da habilidade na técnica. Tais técnicas sãoexplicadas totalmente na literatura. Vide, por exemplo, Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook e outros, ed., Cold Spring HarborLaboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambro-ok e outros, ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNACloning, D. N. Glover ed., Volumes I e Il (1985); Oligonucleotide Synthesis,M. J. Gait ed., (1984); Mullis e outros U.S. Pat. No: 4,683,195; Ácido nucléicoHybridization, Β. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription AndTranslation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture OfAnimaI Cel-Is, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To MolecuIarCIoning (1984);the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; GeneTransfer Veetors For Mammalian Cells, J. H. Miller e Μ. P. Calos eds., ColdSpring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155(Wu e outros eds.); Imunochemieal Métodos In Cell And Molecular Biology,Mayer e Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Expe-rimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds.,(1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); e in Ausubel e outros, Current Pro-toeols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Baltimore, Maryland (1989).
Princípios gerais de engenheiramento de anticorpo são indica-dos em Antibody Engineering, 2nd edition, C.A.K. Borrebaeck, Ed., OxfordUniv. Press (1995). General principies of proteína engineering are set forth inEngineering Protein, A Practical Approach, Rickwood, D., e outros, Eds., IRLPress at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995). General principies of anti-corpos e anticorpo-hapten binding are set forth in: Nisonoff, A., MolecularImmunology, 2nd ed., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); e Ste-ward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman e Hall, NewYork, NY (1984). Adicionalmente, métodos padrão em imunologia conheci-dos na técnica e não especificamente descritos em geral seguido como emCurrent Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites eoutros (eds) , Basic e Clinicai -Immunology (8th ed.), Appleton & Lange,Norwalk, CT (1994) e Mishell e Shiigi (eds), Selected Methods in CellularImmunology, W.H. Freeman e Co., New York (1980).
Tabalhos de referência padrão que indica princípios geral deimunologia incluem Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons,New York; Klein, J., Immunology. The Science of Self-Nonself Discrimination,John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R., e outros, eds., Monoclo-nal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, PlenumPress, New York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" inBurden, R., e outros, eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Mole-cular Bioiogy, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immunnology 4thed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt e Barbara A. Osborne, H. Fre-emand & Co. (2000); Roitt, I., Brostoff, J. e Male D., ImmunoIogyQvn ed. Lon-don: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. e Lichtman, A., CelluIarandMoIecuIarImmunology Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); Kontermann eDubel, antibody Engineering, Springer Verlan (2001); Sambrook e Russell,Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001);Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow e Lane, Antibodies: A Labo-ratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach e Dveksler,PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003).
Todas as referências citadas acima, bem como todas as refe-rências citadas aqui, são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.
Exemplos
Exemplo 1
Sp35 está envolvido em biologia de oligodendrócito
Oligodendrócitos maduros através de vários estágios em desen-volvimento oriundos de células progenitoras de A2B5 (que expressamA2B5), diferenciação em oligodendrócitos de pré-mielinação (que expressam01 e 04) e finalmente em oligodendrócitos de mielinação maduros (que ex-pressam 01, 04 e MBP). Assim, por monitoração da presença e ausênciados marcadores de A2B5, 01, 04 é possível determinar um dado estágio dedesenvolvimento da célula e para avaliar a regra de Sp35-Fc em biologia deoligodendrócito. Para uma revisão geral de biologia de oligodendrócito, vide,por exemplo, Baumann and Pham-Dinh, Physiol. Rev. 81: 871-927 (2001).
Anticorpos monoclonais contra 04, MBP e CNPase eram deSternberger Monoclonais; anticorpo a APC (clone CC-1; ref. 29) era da Cal-biochem. Outros anticorpos eram a tubulina βΙΙΙ (Covance), Sp35 (Biogenldec), Fyn (Santa Cruz Biotechnology) e fosfo-Fyn (Biosource). Anticorposmonoclonais contra A2B5 estão disponíveis da Chemicon.Sp35 é expresso em oligodendrócitosA expressão de Sp35 em culturas de neurônio de P13 CG derato purificado, oligodendrócito P2, e astrócito P4 foi analisada por reação decadeia de polimerase depois de transcrição reversa (RT-PCR). Um kit daAmbion, Inc. foi usado para extrair mRNA das células de cérebro de rato deacordo com as instruções do fabricante. RT-PCR semi-quantitativo foi reali-zado usando-se iniciador para frente 5' AGAGACATGCGATTGGTGA 3'(SEQ ID NO:344), e iniciador reverso 5' AGAGATGTAGACGAGGTCATT 3'(SEQ ID NO:345) mostraram alto expressão em neurônios, expressão inferi-or em oligodendrócitos, e nenhuma expressão em astrócitos.
A expressão de Sp35 em oligodendrócitos foi confirmada porhibridização in situ em seções derivadas de nervo ótico de rato adulto. Se-ções de nervo ótico de rato foram preparadas e foram processadas comodescritos em Mi e outros, "Sp35 is a component of the Nogo-66 receptor/p75signaling complex," Nat. Neurosci. 7: 221-28 (2004) e foram sondadas comRNAs de sentido ou de sem sentido de Sp35 marcado com digoxigenina u-sando-se os primeiros 500 nucleotídeos da seqüência de codificação deSp35. As seções são manchadas de acordo com as instruções do fabricanteusando-se um kit de Tyramide Signal Amplification (Amersham Biosciences)e um kit de anticorpo conjugado com antidigoxigenina fluorescente (PerkinElmer). Para análises de imunofluorescência e in situ combinadas, as se-ções foram primeiramente sondadas com RNAs marcadas com digoxigeninae então anticorpos, por exemplo anticorpo de CC1 (Calbiochem; a marcadorde oligodendrócitos maduros) ou anticorpo de anti-Sp35. Nós observamosque oligodendrócitos que hibridizavam para dar uma sonda de Sp35 de semsentido também foi co-manchada com um anticorpo a CC1 (dados não mos-trados). Nenhuma marcação específica foi observada usando-se uma sondade Sp35 de sentido. Expressão de Sp35 em oligodendrócitos também foiconfirmada por estudos imunoistoquímicos de seções de tecido da a partirde região de ventrículo lateral de córtex de rato P7. Uma maior parte dascélulas corticais que marcavam com anticorpo de CC1 também marcadascom anticorpo de anti-Sp35. Dados não mostrados. A eespecíficaidade dainteração foi confirmada por pré-adsorção do anticorpo de anti-Sp35 comSp35-Fc (vide Exemplo 2), que eliminou o sinal.
Inativação de RNAi Sp35-específica RNAi de expressão de Sp35promove crescimento e diferenciação de oligodendrócito RNAi de Sp35-específica foi usado para remover expressão de Sp35 em células precurso-ras de oligodendrócito para examinar como Sp35 contribuir para crescimentoe diferenciação de oligodendrócito. 50.000 células precursoras de oligoden-drócito de A2B5 foram infectadas com lentivírus que porta seqüência deRNAi de Sp35-específica ou RNAi controle preparado como se segue.
Seqüências de DNA de Sp35 de rato e camundongo foram com-paradas para encontrar regiões homólogas para usar RNAs de grampo pe-queno candidato (shRNA). CH324, para a expressão de lentivírus de RNAide Sp35, foi construído por anelamento de oligonucleotídeos LV1-035 eLV1 -036 e ligação a pLL3.7 digerido por Hpal e Xhol. O vetor de pLL3.7, me-todologia adicional e produção de vírus eram como descritos em Rubinson eoutros, Nat. Genet. 33, 401-06 (2003). Os oligonucleotídeos RNAi de Sp35foram adquiridos da MWG e têm as seguintes seqüências: LV1 -035 (oligo desentido) 5" - TGA TCG TCA TCC TGC TAG ACT TCA AGA GAG TCT AGCAGG ATG ACG ATC TTT TTT C - 3" (SEQ ID NO:346) and LV1-036 (oligode sem sentido) 5'- TCG AGA AAA AAG ATC GTC ATC CTG CTA GACTCT CTT GAA GTC TAG CAG GAT GAC GAT CA - 3' (SEQ ID NO:347).
RNAi de controle foi projetado com as mesmas seqüências deoligonucleotídeos exceto quanto a mudanças de nucleotídeo indicadas emletras minúsculas: 5'-TGA TCc TCA TcC ttC Tat ACT TCA AGA GAG TgTAGC AGG ATG AcG ATC TTT TTT CTC GA-3' (SEQ ID NO:348) and 5'-TCG AGA AAA AAG ATC GTC ATC CTG CTA GAC TCT CTT GAA GTaTAG aAG GAT GAC GAT CA-3'. (SEQ ID NO:349).
Antes da produção do lentivírus, DNA de pLL3.7 ou shRNA can-didato em pLL3.7 foram cotransfectados com plasmídio etiquetado comSp35-HA de camundongo a uma taxa de 5 a 1 em células de CHO em umformato de 6 cavidades. Inativação foi analisada por detecção de westernblot de etiqueta de Sp35-HA a partir de Iisados de célula de CHO tranfecta-dos bem como por northern blot de RNA total preparado a partir de cavida-des em duplicata. O blot foi sondado com um fragmento de cDNA de Sp35cDNA. Ensaios foram realizados 48 horas pós-transfecção. Como esperado,houve uma redução 10 vezes de mRNA de Sp35 de células de CHO trata-das com CH324 RNAi em relação a células tratadas com controle. Dadosnão mostrados. Lentivírus de RNAi que portam proteína fluorescente verde(GFP) foram gerados como descritos em Rubinson e outros. Em culturastratadas com ou controle ou RNAi de Sp35, aproximadamente 80% dos oli-godendrócitos eram GFP positivo. Número de célula total não foi alteradopelos tratamentos com RNAi. Para quantificar os efeitos de RNAi na diferen-ciação, apenas oligodendrócitos de expressão de GPF foram contados.
Populações enriquecidas de oligodendrócitos foram desenvolvi-das a partir de ratos Long Evans P2 fêmeas como descritas por Conn, Meth.Neurosci. 2:1-4 (Academic Press; 1990) com modificações como se segue.Resumidamente, o cérebro anterior foi dissecado e foi colocado em soluçãosalina tamponada por Hank (HBSS; Invitrogen). O tecido foi cortado emfragmentos de 1 mm e foi incubado a 37°C por 15 min em 0,01% de tripsinaand 10 μg/ml DNase. Células dissociadas foram laminadas em frascos decultura de tecido 715 revestidos como poli-L-lisina e foram desenvolvidas a37°C por 10 d em meio de DMEM com 20% de soro de bezerro fetal (Invitro-gen). Precursores de oligodendrócito (A2B5+) foram coletados por agitaçãodo frasco de um dia para o outro a 200 rpm a 37°C, resultando em uma po-pulação 95% pura. Culturas foram mantidas em meio Eagle modificado porDulbecco com alto teor de glicose (DMEM) com FGF/PDGF (10 ng/ml; Pe-protech) por 1 semana. Remoção de FGF/PDGF deixou que células deA2B5+ se diferençem em oligodendrócitos de premileninação de 04+ depoisde 3-7 d, e para se diferençar oligodendrócitos maduros de 04+ e MBP+ de-pois de 7-10 d. Estes estados de diferenciação são prontamente evidentes apartir de mudanças em morfologia: células de A2B5+ são bipolare na forma,oligdendrócitos de premileninação de 04+ têm processo mais longos e maisramificados e oligodendrócitos maduros de MBP+ contêm estruturas de folhade mielina entre os processos.
Células precursoras de oligodendrócito de A2B5 foram infecta-das com o lentivírus contendo o CH324 RNAi. As células resultantes foramcultivadas por 3 dias e o número de oligodendrócitos positivos 04 (um mar-cador para diferenciação de oligodendrócito) foi contado. Expressão de Sp35endógena foi reduzida por infecção om RNAi de lentivírus de Sp35 e foi con-firmada por RT-PCR. Redução Sp35 resultou em oligodendrócitos madurosmais altamente diferenciados, quando comparados com células infecatadasde controle, como era evidente por aumentos no comprimento de processosde célula e pela presená abundante de estruturas de folha de mielina (dadosnão mostrados). Em células que expressavam RNAi de Sp35, havia três ve-zes tanto oligodendrócitos maduros (positivo a 04) quanto em culturas decélula. Esses dados inciam que Sp35 podem negativamente regular diferen-ciação de oligodendrócito.
Dominante negativo Sp35 promove crescimento e diferenciaçãode oligodendrócito
Vetores Lentivirais que expressam tipo selvagem e uma formadominante de Sp35 foram construídos. Seqüência de DNA que codifica Sp35de comprimento total de camundongo (FL-Sp35, resíduos de aminoácidos34-614 de SEQ ID N0:2) foi ampliada por PCR usando-se iniciadores 5'-GAG GAT CTC GAC GCG GCC GCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TG -3' (SEQ ID N0:350) e 5' - GGG GCG GAA TTG GAT CCT CAC AGA TCCTCT TCT GAG ATG AG-3' (SEQ ID NO:351) e inseridos para dentro do ve-tor Ientivaral de HRST-IRES e GFP nos sítios de Notl e BamHI. Similarmen-te, seqüência de DNA que codifica Sp35 negativo dominante (DN-Sp35, re-síduos de aminoácidos 34-581 of SEQ ID N0:2) foi ampliada por PCT usan-do-se iniciadores 5' - GAG GAT CTC GAC GCG GCC GCA TGG AGA CAGACA CAC TCC TG - 3' (SEQ ID NO:352) e 5' - GAT ACG GAT CCT CAGCCT TTG CCC CGG CTC CAT AGA AAC AGC -3' (SEQ ID NO:353). Osplasmídios de FL-Sp35 e DN-Sp35 foram transfectados em células 293 paraproduzir lentivírus como descrito por Rubinson e outros, "A lentivirus-basedsystem to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells etransgenic mice by RNA interference," Nat. Genet. 33: 401-06 (2003). Oligo-dendrócitos foram infectadas com lentivírus a 2 MOI por célula e confirma-vam expressão de FL-Sp35 e DN-Sp35 por western blot.
Diferenciação de oligodendrócito promovida por DN-Sp35, pro-dução de um aumento no número de oligodendrócitos maduros. Em contras-te com isso, ultra-expressão de gth Sp35 de comprimento longo (FL-Sp35)tinha o efeito oposto e inibia diferenciação, como era evidente por uma redu-ção no número de oligodendrócitos maduros quando comparado com o con-trole (dados não mostrados).
Exemplo 2
Construção e purificção de proteína de fusão de Sp35-Fc
Um construto foi produzido fusando-se a porção extra-celular deSp35 de ser humano (resíduos 1-532) para região principal e de Fc de IgGIde ser humano para estudas função biológica de Sp35. Uma seqüência decodificação parcial para Sp35 de ser humano foi obtida por PCR a partir declone 227.2 usando-se o iniciador para frente 5' - CAG CAG GTC GAC GCGGCC GCA TGC TGG CGG GGG GCG T- 3' (SEQ ID NO:354) e iniciadorreverso 5' - CAG CAG GTC GAC CTC GCC CGG CTG GTT GGC CAACCA GCC GGG CGA GGT CGA CCT CGA GG - 3' (SEQ ID NO:355).
O produto de PCR de extremidade abrupta foi subclonado nosítio de Srfl do vetor de PCR SCRIPT AMP (Stratagene) para criar PCR S-CRIPT AMP-Sp35. Um fragmento de Sall foi isolado de PCR SCRIPT AMP-Sp35 e foi subclonado no vetor de Ig de PCRCAMP (derviado de Stratagenevector PCR SCRIPT AMP). No vetor de Ig de PCRCAMP, a seqüência Fcgama e principal é subclonada como um fragmento de Sall(5') a Notl(3'). Ofragmento de Sall Sp35 foi subclonado no sito de Sall do vetor de Ig de P-CRCAMP desse modo fundido a seqüência de sinal de Sp35 e domínio ex-tracelular (códons 1-532) em quadro com seqüências que codificam a regiãoprincipal e de Fc de Ig 1 de ser humano. Isolados corretos foram identifica-dos, e um fragmento de Notl que inclui o fragmento de Fc de Sp35 foi sub-clonado no sítio de clonagem de Notl simples do vetor de expressão deCHO, PV90 (Biogen ldec). O plasmídio resultante foi confirmado por se-qüenciação de DNA e GT123 designado.
Linhas de células estáveis que expressão proteína de fusão deeSp35-Fc foram geradas por eletroporação de células hospedeiras de CHODG44 com plamídio GT123. Células de CHO transfectadas foram cultivadasem alfa menos MEM na presença de 10% de soro dialisado e glutamina a 4mM para selecionar crescimento independente de nucleotídeo. Quatorzedias pós-transfecção, células foram alimentadas de meio fresco. Para triarquanto a células que expresam Sp35-Fc, células de CHO foram marcadascom IgG de anti-humana de cabra marcada com ficoeritrina (PE) (JacksonLabs) e submetidas a classificação de citometria de fluxo de alta velocidadeem um FACS Mo-Flo (Cytomation). As células que expressavam os níveismais altos de Sp35-Fc foram selecionadas. Essas células foram expandidasem culura por 7 dias, então foram remarcadas e foram reclassificadas. Célu-las que expressam os níveis mais altos de Sp35-Fc foram isoladas comoclones individuais em placas de 96 cavidades. Esses clones foram desen-volvidos por duas semanas e então alimentados com meio fresco um diaantes da análise de FACS para checar níveis de expressão. Clones que ex-pressavam níveis de Sp35-Fc foram expandidos, e conjuntos de célulascongeladas foram estabelecidos. As linhas de células foram adaptadas parase desenvolver em cultura de suspensão no meio livre de soro BCM16. Otítulo de Sp35-Fc produzido por esses clones foi determinado por desenvol-vimento de linhas de células a 37°C por 4-5 passagens, então o desenvolvi-mento das células a 50% de densidade de célula máxima e cultivo delas por10-15 dias a 28°C até que densidade de célula viável caisse a 75%. Nessahora, os meios de cultura foram coletados, foram clareados células e frag-mentos por centrifugação, e os sobrenadantes de cultura titulados para ní-veis de Sp35-Fc por análise de Western blot usando-se um anticorpo de Igde anti-ser humano (Jackson Lab) como a sonda.
Proteína de fusão de Sp35-Fc foi purificada do meio de culturaclarificada como se segue: 9 ml de HEPES a1 MpH 7,5 foram adicionadosa 900 ml de meio condicionado. O meio foi carregado por batelada por 3 hr a4°C sobre 3 ml de Proteína A Sepharose (Amersham Bioscience). A resinafoi coletada em uma coluna de 1,5 cm (I.D.), e foi lavada quatro vezes com 3ml de PBS, duas vezes com 4 ml de PBS contendo NaCI a 800 mM, e entãonovamente com 3 ml de PBS. O Sp35-Fc foi eluído a partir da coluna comNaH2PC>4 a 25 mM, pH 2,8 e NaCI a 100 mM em 1,5 ml de frações e foramneutralizados por adição de 75 μΙ de NaH2P04 a 0,5 M, pH 8,6. Fraçõescontendo proteína de pico foram identificadas por absorbência a 280 nm,foram combinadas, e foram submetidas a outra purificação sobre uma colu-na de 1 mL Proteína A. Antes do carregamento, NaCI foi adicionado a 600mM e HEPES, pH 7,5 a 50 mM. A coluna foi lavada duas vezes com 600 μΙde HEPES a 10 mM pH 7,5 e NaCI a 1 M, e então com 1 ml de PBS. Sp35-Fc foi eluído a partir da coluna com NaH2P04a 25 mM, pH 2,8 e NaCI a 100mM, coletando frações de 0,5 mL, e foi neutralizada por adição de 25 μΙ deNaH2P04 a 0,5 Mi pH 8,6. Frações contendo proteína de pico foram identifi-cadas por absorbência a 280 nm e foram combinadas. Por redução de SDS-PAGE, a proteína de Sp35-Fc migrou com uma tira única (>95% pura) comuma massa aparente de 90 kDa. Sob condições de não redução, a proteínaoperada como um dímero com uma massa aproximada de 180 kDa. A prote-ína de Sp35-Fc purificada por tranformada em alíquota e foi armazenada a -70°C.
Exemplo 3
Produção de anticorpos monoclonais Sp35-específicos
Anticorpos de anti-Sp35 que especificamente ligam um polipep-tídeo de Sp35 da invenção foram produzidos usando-se os seguintes méto-dos e procediemtnos.
A. Ensaios de triagem de anticorpo
1. Ensaio de ELISA
Sp35-Fc (0,5 μg em 50 μΙ de tampão de bicarbonato de sódio a0,1 M, pH 9,0) foi adicionado a cada cavidade de placas de MaxiSorp® de 96cavidades (Nunc®). As placas foram então incubadas a 37°C por 1 hora ou4°C por 16 horas. Sítios de ligação não específicos nas placas foram blo-queados usando-se HEPES a 25 mM, pH 7,4 contendo 0,1% de BSA, 0,1%de ovalbumina, 0,1% (5% (p/v) de leito em pós desnatado em NACE a 150mM) e 0,001% de azida. Diluições de sobrenadantes de hibridoma e de soro(por exemplo, diluições três vezes em série) foram adicionadas através decada buraco da placa, foram incubadas a 25°C por 1 hora. Depois da lava-gem por três vezes com PBS1 50 μΙ de uma diluição de 1:10,000 de anticor-po secundário de anticamundongo de carba conjugado com peroxidase derábano-silvestre (Jackson ImmunoResearch Inc.) foi adicionado a cada cavi-dade e foi incubados por outra 1 hora. Depois de três lavagens, a cor foi de-senvolvida por TMB (Pierce) e foi para com ácido sulfúrico a 2 M. Intensida-de de cor foi monitorada em um espectrofotômero a 450 nm.
2. Ensaios de FACS
Células de COS-7 foram marcadas com CellTracker® GreenCMFDA a 0,1 μΜ (Sondas moleculares, Eugene, OR) como descrito pelovendor. Volumes iguais de células de controle marcadas com CellTracker®foram misturados com células de Sp35-COS-7 lavadas (produzidas portransfecção transitória do vetor de expressão de Sp35) antes da incubaçãocom sobrenadantes de hibridoma ou soros de teste de anti-Sp35. Cinqüentamicrolitros da mistura de célula foram distribuídos em cada cavidade de umaplaca de poliestireno de fundo em V de 96 cavidades (Costar® 3877, Cor-ning, NY) e 100 μΙ de soro de camundongo, sobrenadante de hibridoma, ouum anticorpo de anti-Sp35 de controle foi adicionado. Depois da incubação a4°C por 30 minutos, as células foram lavadas e foram incubadas com 50 μΙde segundo anticorpo específico de IgG Fc gama de anticamundongo decarneiro de fragmento de F(ab')2 puro de afinidade conjugado com ficoeritri-na (1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratory1 West Grove, PA) em PBS.
No fim da incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e foramsuspensas em 200 μΙ de PBS contendo 1% de soro bovino fetal (FBS), eforam submetidas a análise de FACS. Alternativamente, Células de Sp35-COS-7 foram misturadas com soro de camundongo ou sobrenadante de hi-bridoma e então foram tratadas com anticorpo secundário de anticamundon-go de carbra conjugado com ficoeritrina e diretamente foram submetidas aanálise de FACS padrão.
B. Produção de hibridoma de anticorpos de Anti-Sp35 monoclonais de ca-mundongo
Camundongos RBF fêmeas de oito semanas de idade (JacksonLabs, Bar Harbor1 ME) foram imunizados intraperitoneamente com emulsãocontendo 50 μς de Sp35-Fc (aminoácidos 34 a 532 de SEQ ID N0:2 fundi-dos à região principal e de Fc de IgGI de ser humano), produzida comodescrita no Exemplo 2 ou foram imunizados intraperitoneamente com umaemulsão contendo 50 pg de Sp35-Fc de ser humano, e 50 μΙ de auxiliar deFreund completo (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) uma vez a cada du-as semanas. Soros oriundos dos camundongos imunizados foram coletadosantes da primeira imunização e 1 semana depois da segunda e terceira imu-nizações, e títulos de anticorpo de anti-Sp35 foram medidos por ensaio deFACS nas células de COS-7 de expressão de Sp35 como descrito acima.Uma dose final de reforçador foi dada depois da terceria imunização e trêsdias antes quando fusões de hibridoma foram iniciadas.
Soros oriundos de camundongos imunizados com os vários pep-tídeos de Sp35 foram triados by ELISA como descrito acima. Camundongosque eram positivos para anticorpos que especificamente ligou células deCOS-7 de expressão de Sp35 foram identificados por citometria de fluxo(FACS) como descrito acima, e foram sacrificados. Esplenócitos foram isola-dos dos camundongos e foram fundidos à mieloma de FL653 (um derivadode APRT de um mieloma de camundongo de lg-/HGPRT-Balb/c, mantido emDMEM contendo 10% de FBS, 4500 mg/L de glicose, L-glutamina a 4 mM, e20 mg/ml de 8-azaguanina) como descrito no Monoclonal Antybodies. Hybri-domas: A New Dimension in Biological Analyses, ed. Kennett, R.H., McKe-arn, T.J. e Bechtol, K.B. New York: Plenum Press (1982). Células fundidasforam laminadas em placas de 24- ou 48 de cavidades (Corning GlassWorks, Corning, NY), e foram alimentadas com adenina, aminopterina e ti-midina (AAT, disponível da Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) contendomeio de cultura. Culturas resistentes a AAT foram tríadas por ELISA ou ci-tometria de fluxo como descrito acima para a ligação a ou Células de Sp35-COS-7- ou a Sp35-Fc. Hibridomas positivos foram ulteriormente subclona-dos por limitação de diluição.
Dezessete linhas de células de hibridoma que produzem anti-corpos monoclonais produzidos a partir de camundongos imunizados comSp35-Fc foram isolados. Propriedades dos anticorpos monoclonais deriva-dos de hibridoma são mostrados nas tabelas 3A e 3B.
Polinucleotídeos que codificam os domínios variáveis (VH e VL)de anticorpos monoclonais 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3 e 3P1E11.3B7 foram iso-lados por PCR1 foram clonados e foram submetidos a análise de seqüênciapelo seguinte método. RNA total foi extraído de células de hibridoma usan-do-se minikit Qiagen® RNeasy® e cDNA foi gerado a partir do RNA isoladopor RT PCR1 usando-se condições padrão. Um coquetel de iniciadores fo-ram usados para a RT-PCR. Um conjunto preferido de iniciadores incluía uminiciador com o 5' do iniciador que hibridiza para dar a seqüência de sinal e aextremidade 3' do iniciador que hibridiza para dar o domínio constante 3' dajunção de domínio constante/FR4. Isso permite uma ampliação de um domí-nio variável intacto com nenhum ambigüidades sobre o N-terminal de anti-corpo monoclonal e a junção de V/C. Aquele versado na técnica reconhece-rá que conjuntos de iniciador necessitam ser modificados para a ampliaçãode modelos diferentes e para condições de PCR diferentes. Ocasionalmente,a presença de mensagens não produtivas altamente abundantes (por exem-plo, a cadeia leve não produtiva de deslocamento de quadro de CDR3-FR4oriunda do par de fusão) ou mensagens produtivas não específicas podemser produzidas e complicam a clonagem de cadeias variáveis. Uma soluçãoé para usar dados de seqüência N-terminal do anticorpo purificado autênticopara projetar um iniciador degenerado para permitir a clonagem. Alternati-vamente, pode-se usar iniciadores de "estrutura universal", tais como aquelesdescritos em Orlandi e outros, PNAS 86:3833 (1989), que "fixam" os N- eC-terminais dos domínios variáveis (isto é, o N-terminal de FR1 e o C-terminal de FR4 são determinados pelo iniciador).
Adicionalmente, dados de seqüência, para a projeção de inicia-dores mais eficazes, podem ser obtidos a partir dos produtos de RT-PCR agranel que foram puriricados com gel e foram então seqüenciados. O produ-to de PCR pode também ser subclonado usando-se, por exemplo, o kit declonagem TOPO (Invitrogen) então seqüência. Dados de seqüência são en-tão obtidos a partir de múltiplos subclones independentes ou fragmentos pu-rificados por gel para firmemente estabelecer a seqüência de consenso.
A seqüência da cadeia leve do P1E11.3B7 foi determinada poruso de um coquetel de iniciadores de seqüência de sinal de cadeia leve dekapa de camundongo 5': (i) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGA TTT TCAGGT GCA GAT TTT CAG 3' (SEQ ID NO:356), (ii) 5' GGG GAT ATC CACCAT GRA GTC ACA KAC YCA GGT CTT YRT A 3' (SEQ ID NO:357), (iii) 5'GGG GAT ATC CAC CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT G 3' (SEQ IDNO:358), e (iv) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GAG GKC CCC WGC TCA GYTYCT KGG A 3' (SEQ ID NO:359), com iniciador de domínio constante decapa de camundongo 3' único: 5" GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAGATG GA 3' (SEQ ID NO:4), onde K=G/T, R=A/G, W=A/T e Y=C/T. O produtode PCR resultante foi subclonado e múltiplos subclones independentes fo-ram seqüenciados. A seqüência de consenso deduzida era consistente comos dados de seqüenciação de degradação Edman. Sequenciação indicou oiniciador 5'de seqüência de sinal degenerado 5' GGG GAT ATC CAC CATGRA GTC ACA KAC YCA GGT CTT YRT A 3' (SEQ ID NO:357) foi aqueleque tinha fornecido o domínio variável de cadeia leve de 3P1E11.3B7 duran-te a ampliação.
A seqüência de cadeia pesada de 3P1E11.3B7 foi determinadausando-se um coquetel de iniciadores de PCR 5' de seqüência de sinal decadeia pesada: (i) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGTMAT SCT CTT 3\ (SEQ ID N0:360) (ii) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GRACTT CGG GYT GAG CTK GGT TTT 3' (SEQ ID NO:361), e (iii) 5' GGG GATATC CAC CAT GGC TGT CTT GGG GCT GCT CTT CT 3' (SEQ IDNO:362), com um iniciador 3' de domínio constante de IgG CH1 de camun-dongo degenerado 5' AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAGTGG ATA GAC 3' (SEQ ID NO:363), onde K=G/T,.M= A/C, R=A/G, e Y=C/T.PCR usando-se esse coquetel de iniciadores, com uma variedade de condi-ções de ciclagem diferentes, não conseguiram fornecer uma seqüência dedomínio variável de cadeia pesada em que o N-terminal deduzido era con-sistente com aquele determinado por seqüência de degradação de Edmando anticorpo de 3P1E11.3B7 purificado. Portanto, se usará iniciadores uni-versais de cadeia pesada: FR1 5" AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3'(SEQ ID NO:364) e FR4 5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTGGCC CCA G 3' (SEQ ID NO:365), onde M= A/C, R=A/G, S=C/G, e W=A/T.Este conjunto forneceu um domínio variável de cadeia pesada de camun-dongo cuja seqüência deduzida era consistente com os dados de3P1E11.3B7 empíricos.
A fim de verificar que o domínio variável de cadeia pesada N- eC-terminais eram autênticos e determinados por não iniaciador, uma outrareação de PCR foi realizada com iniciador de seqüência de sinal degenerado5' ATG GAR TGY AAY TGG ATH CTN CCN TTY A 3' (SEQ ID NO:366) e oiniciador 3'de domínio constante acima mencionado 5' AGG TCT AGA AYCTCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (SEQ ID NO:367), ondeH=A/C/T, N=A/C/G/T, R=A/G, e Y=C/T. O projeto do iniciador de seqüênciade sinal degenerado era baseado nas seqüências de sinal dos melhores im-pactos derivados de uma pesquisa TFASTA da base de dados de seqüênciade roedor de Genbank indagado com a seqüência de FR1 deduzida de con-senso de 3P1E11.3B7 da reação de PCR com o "iniciador universal" descritoacima. Este PCR rendeu um produto com um domínio variável de cadeiapesada de murina completo.
Os domínios variáveis de camundongo de 3P1E11.3B7 comple-tos foram usados (com mutagênese silenciosa quando necessária para in-troduzir sítios de restrição) em combinação com cDNAa constante de kapa eIgGI de ser humano para construir cDNAs de cadeia pesada e leve quiméri-cos, respectivamente. Os cDNAs de imunoglobulina de comprimento totalforam subclonados em um vetor de expressão chamado pNEOOl, um deri-vado do vetor de expressão episomal de célula de mamífero de EBV comer-cial pCEP4. Os vetores de expressão de cadeia pesada e leve (chamadospXW372 e pXW363, respectivamente) foram co-transfectados em células de293-EBNA. Análise de Western blot (sondada com reagentes IgG-específicos de ser humano) de meio condiciional de células transitoriamentetransfectadas confirmaram a expressão de 3P1E11.3B7-hulgG1 quimérico,kappa mAb. As seqüências de polipeptídeos de 3P1E11.3B7 VH e VL resul-tantes são mostradas nas tabelas 6 e 8 e são SEQ ID NOs: 173 e 209, res-pectivamente. As seqüências de cadeia pesada e leve leve para os anticorpomonoclonais de 1A7, 2F3, e 3P1D10.2C3 foram determinados por métodossimilares similar methods.
C. Identificação de anticorpos monoclonais de anti-Sp35 por exibição de fa-go
Fragmentos de Fab de anticorpo monoclonal de Anti-Sp35 foramidentificados e foram isolados de bibliotecas de exibição de fago como des-crito no Hoet e outros, Nat. Biotech. 23:344-348 (2005); Rauchenberger, eoutros, J. Biol. Chem. 278:194-205 (2003); e Knappik, e outros, J. MoL BioL296:57-86 (2000), todos os quais são incorporados aqui por referência emsua totalidade.
A biblioteca de exibição de Fab-fago MorphoSys HuCAL® GOLD("Biblioteca de exibição de fago-2" na tabela 3B), que compreende anticorposintético humanizado de regiões variáveis foi triado contra proteína de Sp35-Fc solúvel de ser humano recombinante por ELISA padrão e métodos detriagem de IHC. Vide, por exemplo, Ostendorp, R., Frisch, C. e Urban M,"Generation, engineering e producing human antibodies using HuCAL®." An-tibodies, Volume 2 Novel Technologies e Therapeutic Use. New York: KluwerAcademic/Plenum 13-52 (2004). Fagos de Fab que especificamente se ligama Sp35 foram purificados e foram caracterizados. Propriedades dessesfragmentos de Fab de anticorpo mononclonal derivados de exibição de fagosão mostradas na tabela como "fragmentos de Fab monoclonal derivados debiblioteca de exibição 2." Fago de Fab isolado 1968 foi selecionado para ou-tra análise.
Exemplo 4
Imunoprecipitação de Sp35 por anticorpos monoclonais de anti- Sp35
Para realizar a imunoprecipitação, células de COS-1 que ex-pressam Sp35, fundiram a um etiqueta de hemaglutinina (HA) no N-terminal,foram produzidas por células de COS-1 de transfecção transitória com umconstruto de DNA que expressa a proteína de Sp35 de comprimento totalcom uma etiqueta de HA. Células foram coletadas 48 hr depois da transfec-ção e foram Iisadas em 1 ml de tampão de Iise (HEPES a 50 mM, pH 7,5,NaCI a 150mM, MgCl2 a 1.5 mM, EGTA a 1 mM, 1% de Triton X-100 e 10%de glicerol) por 30 min a 4°C. Depois da centrifugação a 14.000 xg por 15min, os sobrenadantes foram incubadas com contas de G-Sefarose/ProteínaA (Santa Cruz) a 4°C por 1 hr, e então foram incubadas a 4°C por 1 hr comou anticorpos monoclonais de camundongo de anti-Sp35 de 2F3 ou 1A7. Ascontas foram lavadas 3 vezes com tampão de lise, foram fervidas em tam-pão de amostra de Laemmli, foram submetidas a 4-20% de SDS-PAGE, eforam analisadas por Western blotting usando-se um anticorpo que reconhe-ce a etiqueta de HA. Como mostrado no gel de SDS-PAGE, anticorpos mo-noclonais 1A7 e 2F3, imunoprecipitaram Sp35 de camundongo e de ser hu-mano (figura 1). Como mostrado na figura 1, anticorpo monoclonal 2F3 for-temente imunoprecipitou tanto Sp35 de ser humano quanto de camundongo,enquanto anticorpo monoclonal 1A7, que fortemente imunoprecipitou Sp35de humano, apenas reconheceu a proteína de Sp35 de camundongo fraca-mente. Similarmente, anticorpos monoclonais 1G7, 2B10, 2F3, 3P4C2.2D2,3P4C8.2G9, Li01, Li03, Li05, Li06, Li07, Li08, Li11 e Li12 immunoprecipitamser humano ou camundongo ou SP35 de ser humano ou camundongo (Videa tabela 3B). Adicionalmente, Li08 immunoprecipitados AP-Sp35 e anticor-pos monoclonais 1B6.4 e 3E3.1 immunoprecipitatam Sp35 endógeno Sp35(Vide Tabela 3B).
Exemplo 5
Anticorpo de anti-Sp35 que se liga especialmente a Sp35 determinado porELISA
A fim de determinar quais regiões do polipeptídeo de Sp35 eramligadas pelos vários anticorpos monoclonais derivados de exibição de fago ede hibridom produzidos no Exemplo 2, um ensaio de ELISA foi realizado u-sando-se um painel de polipeptídeos de Sp35 truncados, cada um fundido àregião principal e de Fcs de IgGI pelo métodos descritos no Exemplo 1. Opainel consistia nos seguintes fragmentos de Sp35: aminoácidos 34-425 deSEQ ID NO: 2, aminoácidos 417-532 de SEQ ID NO: 2, aminoácidos 417-493 de SEQ ID NO: 2, e aminoácidos 34-532 de SEQ ID NO:2. Ovalbuminae BSA foram usados como controles. Como mostrado na Tabela 3B, mAbsderivado de hibridoma de 2F3, 2B10, 3A3, 3P4c2.2d2, e 3P4c8.2g9, e mAbsderivado de fago de Fab de 3383, 3563, 3564, 3565, 3568, 3569, 3570, e3582 todos especificamente se ligam aos fragmentos de Sp35 de 1-417 e 1-534, sugerindo que esses anticorpos se ligam a epitopos na região de LRRde Sp35. Mabs derivado de hibridoma 1A7, 3P1B11F9, 3P1D10.2C3,3P1E11.3B7, 3P2C63G10,2H7, 2P2C9.2G4, 3P4A61D9, e 394C51D8, eMabs derivado de fago de Fab 3495, 3566, 3567, e 1968 especificamente seligam ao fragmento de Sp35 de 34-532 Sp35 e fracamente se ligam ao Sp35de 417-532, sugerindo que esses anticorpos provavelmente se ligam a epi-topos que pelo menos incluem uma porção de Sp35 C-terminal na região deLRR. Em experiências similares, esses últimos anticorpos também especifi-camente ligavam um polipeptídeo de Sp35 que consiste em aminoácidos 34-534 de Sp35 de ser humano e baixa afinidade para Sp35 de camundongo erato. A afinidade desses últimas anticorpos para Sp35 de camundongo e ratofoi restaurada para o nível visto usando-se Sp35 de ser humano quando a-minoácido 419 do Sp35 de camundongo e rato é mudado de histidina (H) emarginina (R). Arginina é o aminoácido na posição 419 em Sp35 de ser huma-no. O Kd para anticorpo monoclonal 1A7 foi determinado ser 10 nM (1 χ 10"9Μ) para a ligação de Sp35 de ser humano e 20 μΜ (2 χ 10'5 M} para a ligaçãode Sp35 de camundongo. Para ELISA de Ap-Sp35 para detectar os anticor-pos se ligam à região de 417 a 532, a ELISA foi realizada como se segue:
Os Mabs foram revestidos sobre placas de ELISA, então foram incubadoscom ou uma proteína de fusão de Sp35-AP a 4°C de um dia para o outroseguido por anti-humano ligado á AP (H+L) (1:5,000, Jackson ImmunoRese-arch) a temperatura ambiente por 1 hr, ou com proteína de fusão de AP a4°C de um dia para o outro, substrato de AP foi então desenvolvido por 10mg/ml de 4NPP em Glicina a 0,1 M, MgCI2 a 1 mM, ZnCI2 a 1 mM, pH 10,5, elida a O.D. 405.
Exemplo 6
Anticorpo de anti-Sp35 que liga especificamente a Sp35 determinado porFACS
Para ulteriormente cararacterizar propriedade de ligação demAbs de anti-Sp35 derivado de hibridoma 1A7 e 2F3 produzidas como des-critas no Exemplo 3, ligação tanto a células de COS-7 ou 293 vivas quantofixadas que expressam Sp35 de ser humano ou de camundongo foi compa-rado. Células de Sp35 tranfectadas e não tranfectadas foram fixadas a e fo-ram submetidas a análise de FACS (FACS: Células tranfectadas com Sp35de ser humano ou de camundongo ou controle de vetor foram dissociadasde placas de cultura, foram lavadas com 2% de FBS/PBS, e foram incuba-das com anticorpo primário a 1 ^g/ml sobre gelo por 1 hr. As células foramlavadas 3 vezes com 2% de FBS/PBS, então foram incubadas com anticorposecundário marcado com PE (1:100, Jackson Immuno Research) sobre gelpor 30 min. Depois de 2 lavagens com 2% de FBS/PBS, células foram fixa-das em 2% de PFA e foram submetidas a análise de FACS por PE.) Resul-tado de FACS mostrou que MAbs 1A7 e 2F3 se ligam a células de COS-7 ou293 que expressam Sp35, mas não se ligam a células controle com nenhu-ma expressão de Sp35 (Fig 2).
Exemplo 7
Ensaio de crescimento de neurito
Para testar a capacidade dos anticorpos monoclonais derivadosde fago de Fab e derivados de hibridoma produzidos acima para reverter oefeito inibitório de inibidores de mielina no CNS, por exemplo, OMgp, emneurônios, lâminas de cultura Lab-Tek® (4 cavidades) foram revestidas com0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). Ap-OMgp (1 pg/mancha) ou PBS foimanchado como gotas de 3 μΙ. Lâminas Lab-Tek® foram então enxaguadase foram revestidas com 10 pg/ml de Iaminina (Gibco®). Gânglio de raiz dor-sal (DRG's) oriundos de rebentos de rato P6-7 Sprague Dawley foram disso-ciados com 1 mg/ml de colagenase tipo 1 (Worthington), foram trituradoscom pipetas Pateur polidas com fogo pré-laminadas para enriquecer célulasneuronais e finalmente foram laminadas a 10.000 células/cavidade nas lâmi-nas de cultura Lab-Tek® pré-revestidas. Dez pg/ml de 1A7 ou 2F3 foram adi-cionados imediatamente depois da laminação dos DRGs. O meio de culturaera F12 (disponível da Gibco/lnvitrogen) contendo 5% de soro de cavalo dedoador inativado, 5% de soro de bovino fetal inativado quente e 50 ng/ml defator de crescimento de nervo de camundongo (mNGF) e foi incubado a37°C e 5% de CO2 por 6 horas. Após incubação, as lâminas foram fixadasem 4% de paraformaldeído/20% de sacarose e foram manchadas com anti-corpo de TUJ1 de anti-3lll-tubulina (Covance) depois de 16 horas.
Uma vez que Alexa-Fluor® 594 de anticamundongo de anticorposecundário (Sondas moleculares) diluído de 1:300 foi adicionado às lâminase foram incubadas por 2 horas a temperatura ambiente. As lâminas foramtransformadas em lamínulas com Gel/Mount® (Biomeda®). Imagens digitais5x foram adquiridas com software OpenLab® (Improvision, Inc., Lexington,MA), e as imagens foram analisadas quanto a quantificação de crescimentode enurito usando-se o software OPENLAB®, todas de acordo com parâme-tros especificados pelo fabricante.
Tanto MAbs 1A7 quanto 2F3 protegeram neurônios de DRGcontra inibição mediada por Omgp de crescimento de neurito. (Fig 3).
Exemplo 8
Anticorpo monoclonal 1A7 promove recuperação funcional no modelo delesão de medula espinhal de rato
Lesão de medula espinhal ("SCI") foi induzida por dorsal ultra-hemi-secção como se segue, modificada a partir de métodos anteriormentedescritos (Li, S. e outros J. Neurosci. 24, 10511-10520 (2004)). A ratos LongEvans fêmeas anestesiadas (7 semanas de idade, Charles River) foram da-dos analgesia pré-operatória (Buprenorfina/Buprenex, 0,05 mg/kg s.c.) e fo-ram tranqüilizados (Midazolam, 2,5 mg/kg i.p.) e uma hemi-secção dorsal foirealizada na 6/7 vetebra toráxica interrompendo totalmente o dorsomedialprincipal e o trato corticoesponhal dorsolateral (CST). Os componentes dedorso e dorso-lateral do trato corticoespinal (CST) foram totalmente inter-rompidos e a porção ventral do CST foi deixada intacta. A ponte de tecidoventral que permanece depois de hemi-secção constituía aproximadamente20% do cordão em ambos os grupos de tratamento (dados não mostrados).
Função de membro traseiro foi quantificada usando-se o métodode classificação de campo aberto Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Eby,M.T. e outros, J. Biol. Chem. 275, 15336-15342 (2000), incorporado aqui porreferência) e todos os animais sutentaram déficits funcionais marcados de-pois de SCI, com paralisia quase completa de membro traseiro no dia depoisa cirurgia. Imediatamente depois de transfecção de CST, um cateter intrate-cal foi inserido para dentro do espaço subaracnóide a T7 e foi ligado a umbomba miniosmótica inicializada (Alzet model 2004, Alza Corp) foi inseridopara dentro do espaço subcutâneo. Bombas miniosmóticas forneceram pro-teína de contro de isotipo de IgG de ser humano (5 mg/ml) ou anticorpo mo-noclonal 1A7 (4,8 mg/ml) continuamente a uma taxa de 0,25 μΙ/h durante 5semanas. Animais de controle (tratados com IgG de ser humano) recupera-ram a função substancial pela duração de 5 semanas da experiência, masficaram em um platô em 3-4 semanas, finalmente alcançando uma classifi-cação média de BB de 9 ± 0,45 (figura 7). Em contraste com isso, infusãointratecal contínua de 1A7 por 5 semanas depois de transecção da medulaespinhal resultou em classificações de BB significativamente aperfeiçoadassobre os animais de controle por 5 semanas com um aperfeiçoamento conti-nuada na função no quadro de tempo de 2-5 semanas, alcançando umaclassificação de BBB média de 11,1 ± 0,7 (figura 4). Esses resultados de-monstram que o tratamento com anticorpo monoclonal de anti-Sp35 1A7promove recuperação da função depois de lesão de medula espinhal comodemonstrado por um aumento na classificação de BBB, regeneração de a-xônio e menos retração de axônio foram observadas por manchamento imu-noistoquímico dos axônios.
Exemplo 9
Anticorpos de Anti-Sp35 de 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7,6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, Li05, Li06, Li08, Li13, Li28, Li33, D05 eD08 promovem mielinação in vitro
A regra de anticorpos de anti-Sp35 1A7 e 2F3 em mielinação foiinvestigada in vitro por tratamento de co-culturas de neurônios e oligoden-drócitos de gânglio de raiz dorsal (DRG) com anticorpos de anti-Sp35 1A7 e2F3 e testagem quanto a mielinação por imunoistoquímica e Western blot-ting. Para esses estudos, foi necessário primeiramente gerar culturas primá-rias de neurônios e de oligodendrócitos de DRG.
Gângilos de raiz dorsal embriônica de rato Long Evans fêmeasforam cultivados como descrito por Plant e outros, J. Neurosci. 22:6083-91(2002). DRGs foram dissecados foram laminadas em tiras de cobertura re-vestidas com poli-L-lisina- (100 pg/ml) por 2 semanas. As células foram in-cubadas na presença de fluorodeoxiuridina por dias 2-6 e em meio de NLAcontendo 1 χ B27, 100 ng/ml de NGF (Gibco) por dias 8-11.
Oligodendrócitos de rato nascidos a 2 dias (P2) Female LongEvans foram cultivados como descrito porConn, Meth. Neurosci. 2:1-4 (Aca-demic Press; 1990) com modificações como se segue. Resumidamente, omembro traseiro foi extirpado do rato P2 e foi colocado em meio de HBSSfrio (Gibco). Os fragmentos de tecido foram cortados em pedaços de 1 mm eforam incubados a 37°C por 15 min em 0,01% de tripsina e 10 pg/ml deDNase. Células dissociadas foram laminadas em um frasco de cultura detecido T75 revestidos com poli-L-lisina e foram desenvolvidas em DMEMcom 20% de soro bovino fetal a 37°C por 10 dias. Oligodendrócitos positivosa A2B5 foram coletados por agitação dos frascos de um dia para o outro a200 rpm a 37°C. Os oligodendrócitos de A2B5 foram cultivados por 7 diasem DMEM (Gibco) contendo D-glicose a 25 mM, L-glutamina a 4 mM, piru-vato de sódio a 1 mM, 50 pg/ml de apo-transferrina humana, 5 pg/ml de in-sulina pancreática bovina, selenato de sódio a 30 nM, hidrocortisona a 10nM, D-biotina a 10 nM, 1 mg/ml de BSA, 10 ng/ml de FGF e PDGF (Peprote-ch). As células foram então coletadas por tripsinização. As células então co-cultivadas com os neurônios de DRG na presença ou na ausência de 1, 3,10, ou 30 Mg/ml de anticorpos monoclonais de anti-Sp35 1A7 ou 2F3, ou umanticorpo de controle negativo em meio de NLA contendo 2% de soro bovinofetal, 50 pg/ml de ácido ascórbico, 100 ng/ml de NGF (Gibco). Uma dose deanticorpo eficaz para administrar em tal ensaio foi determinada estar na faixade 0,1 pg /ml a 10 pg/ml, dependendo do anticorpo. Aquele versado na técni-ca seria capaz de determinar uma dose eficaz usando-se ensaios descritosaqui.O meio de cultura foi mudado e os vários anticorpos monoclo-nais foram reabastecidos a cada três dias. Depois de 30 dias a 37°C, as cé-lulas co-cultivadas foram manchadas por manchamento imunoistoquímico("IHC") por neurofilamentos com anticorpo de anti-BIII-tubulina para identifi-car axônios, ou anticorpo de anti-MBP para identificar oligodendrócitos (figu-ra 4A-E). Células co-cultivadas foram também Iisadas e foram submetidas aanálise de Western blot para quantificar o MBP (figura 4G). Com base emanálises de IHC e Western, células co-cultivadas tratadas com anticorpos deanti-Sp35 1A7 e 2F3 mostraram sobrevivência aumentada de oligodendróci-to e neurônios, números aumentados de axônios transformados em feixes enúmeros aumentados de células positivas a MBP (figura 4F, células positi-vas a MBP 10 vezes mais quando comparadas co-culturas tratadas com an-ticorpo de controle.
Em uma experiência similar, oligodendrócito e co-culturas deforam incubados na presença ou na ausência de anticorpos de anti-Sp35Li05 e Li06, ou um anticorpo de controle negative. Células co-cultivadas fo-ram Iisadas e foram submetidas a análise de Western blot para quantificar oMBP (figura 8). Com base em análise de Western blot, células co-cultivadastratadas com anticorpos de anti-Sp35 Li05 e Li06 mostraram números au-mentados de célula positivas a MBP, similares a células co-cultivadas trata-das com 3, 10 e 30 μg de Sp35-Fc (LINGO-1-Fc).
Em experiências similares oligodendrócito e co-culturas de DRGforam incubados na presença ou na ausência de anticorpos de anti-Sp353P1 D10,2C3, 3P1E11.3B7, 6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, LÍ08, Li13,Li28, e Li33 e também promoveram mielinação. Similarmente, anticorposD05 e D08 de comprimento total também promoveram mielinação.
Esses resultados indicavam que o tratamento de co-culturas deoligodendrócito de DRG com anticorpos de anti-Sp35 1A7, 2F3,3P1D10,2C3, 3P1E11.3B7, 6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, Li05, Li06,Li08, Li13, Li28, Li33, D05 e D08 promoveram mielinação e interações deaxônio de oligodendrócito maduro em comparação com co-culturas tratadascom anticorpo de controle.Exemplo 10
Anticorpo de anti-Sp35 1A7 promoveem sobrevivência de oligodendrócito emielinação in vivo
Camundongos fêmeas adultas C57BI/6 de tipo selvagem foramalimentadas cuprizona (0,2% em peso moído com comida de camundongomoída) por 6 semanas para induzir desmielinação dentro do corpo caloso deacordo com o método descrito por by Morell P e outros, Mol Cell Neurosci.12:220-7 (1998). Resumidamente, anticorpo monoclonal de anti-Sp35 1A7foi estereotaticamente injetado para dentro do corpo calos de desmieliniza-ção nas semanas 2, 2,5, e 3 semanas de alimentação com cuprizona, pelométodo descrito abaixo. Camundongos de controle foram estereotaticamenteinjetados nos mesmos intervalos com meios esterilizados contendo anticorpode controle. Depois das 6 semanas de alimentação de cuprizona foi comple-tada, os camundongos foram retornados para uma dieta normal por 2, 4 e 6semanas (apenas alimento de camundongo moído) para permitir remielinação.
Os anticorpos monoclonais de 1A7 e de controle foram forneci-dos como se segue. Os camundongos tratados com cuprizona foram anes-tesiados com cetamina (80 mg/kg em peso de corpo) e xilazina (10 mg/kgem peso de corpo) e posicionados em um aparelho de imobilização paracirurgia esterotática (David Kopf Instruments). O escalpo foi aberto e com-postos estéreis foram injetados (1 μΜ em 1 ml de HBSS) unilateralmentepara dentro do corpo caloso finamente desmielinado dos camundongos re-ceptores de tipo selvagem com uma seringa Hamilton de 10 μΙ usando-secoordenadas estereotáticas de 0,7 mm posterior e 0,3 mm lateral a bregma auma profundidade de 1,7 mm (Messier e outros, PharmacoL Biochem. Be-hav. 63: 313-18 (1999)). Camundongos receptores de controle adicionaisforam estereotaticamente injetados com HBSS contendo nenhum composto.A abertura no crânio foi enchida com Gelfoam, e a área foi esfregada compenicilina e estreptomicina (Gibco) e o ferimento foi suturado. Camundongosforam sacrificados a cada semana da experiência depois da injeção e seuscérebros removidos e processados para análise molecular, bioquímica e his-tológica.
Os animais que receberam tratamento com anticorpo de anti-Sp35 1A7 mostraram sobrevivência de oligodendrócito maduro aumentado(com base no manchamento de anticorpo de CC1, figura 5A) e mielinaçãode axônio por IHC usando-se anticorpo de proteína de anti-MBP ou azul Iu-xol fast (figura 5B). Oligodendrócitos positivos a anticorpo CC1 foram quanti-ficados a quatro semanas e 6 semanas (figura 5C). Esses resultados indica-vam que tratamento com anticorpo de anti-Sp35 1A7 promoviam sobrevi-vência de oligodendrócito maduro e mielinação de axônio em comparaçãocom camundongos tratados com anticorpo de controle. Similarmente, ani-mais que receberam o anticorpo de 1A7 em um modelo de Iisocetina de de-mielinação também promoveu mielinação de axônio em comparação comanimais de controle (dados não mostrados).
Exemplo 11
Anticorpo de anti-Sp35 1A7 promove sobrevivência de célula de gânglio reti-nal (RGC) no modelo de transecção de nervo ótico
Anticorpo de anti-Sp35 1A7 foi testado em um modelo transec-ção de nervo ótico, que investiga os fatores que afetam a função neuronal.Ratos fêmeas adultos e jovens Sprague Dawley (SD) foram usados nesteestudo. O nervo ótico direito de cada animal foi transeccionado intraorbital-mente 1,5 mm do disco ótico. Um pedaço de espuma de gel enchardadacom 6% de Fluoro-Gold (FG) foi aplicado sítio recentemente transeccionadoo disco ótico atrás a direita para marcar as células de gânglio retinal sobrevi-ventes (RGCs). Os animais foram divididos em três grupos (n=6 em cadagrupo) que receberam ou anticorpo de anti-Sp35 1A7, anticorpo de controle,ou apenas PBS, por injeção intravitreal. O volume de cada injeção intravitre-al era de 4 μΙ enquanto a dosagem de cada injeção era de 2 pg. As injeçõesintravitreais foram realizadas imediatamente depois da transecção de nervoótico.
Todos os animais foram deixados sobreviver por 1 semana. Doisdias antes de se sacrificar os animais, o nervo ótico esquerdo de cada ani-mal foi transeccionado e 6% de FG foi administrado como descrito acimapara marcar os RGCs sobreviventes, para servir como o controle interno.Animais foram sacrificados como uma overdose de Nembutal e as retinasdissecadas em 4% de paraformaldeído. Quatro cortes radiais foram produzi-dos para dividir as retinas em quatro quadrantes (superior, inferior, nasal etemporal). As retinas foram então pós-fixadas no fixador por 1 hora antesque elas fossem montadas planas com o meio de montagem (Dako). As lâ-minas foram examinadas sob um microscopio fluorescência usando-se umfiltro ultravioleta (comprimento de excitação = 330-380 nm). RGCs marcadosforam contados ao longo da linha mediana de cada quadrante que parte dodisco ótico para a borda periférica da retina a intervalos de 500 μιτι, sob umagrade de peças de olho de 200 X 200 μηι2. A percentagem de RGCs sobre-viventes que resultam de cada tratamento foi expressa por comparação donúmero de RGCs sobreviventes nos olhos Iesionados com seu olhos contra-laterais. Todos os dados foram expressos como mídia ± desvio padrão. Sig-nificância estatística foi avaliada por um meio ANOVA1 seguido por um testeTukey-Kramer post hoc test. Diferenças foram consideradas significativaspor p<0,05. Animais tratados com anticorpo de anti-Sp35 1A7 mostrarammais sobrevivência neuronal (80%) quando comparados com animais trata-dos com BBS ou anticorpo de controle, que cada um mostrou aproximada-mente 50% de sobrevivência neuronal (Fig 6).
Exemplo 12
Testagem de anticorpos de anti-Sp35 por remielinação no mode-lo de trituração de nervo ótico
O nervo ótico direito recebe trituração completa por fórceps N9 5por 10 segundos ao redor 1,5 mm atrás do globo ocular intraorbitalmenteapenas antes da administração de 2 μΙ de anticorpo monoclonal 1A7, 2F3,Li05 e Li06 em 2 ml por injeção intravitreal.
Os animais receberam uma segunda injeção injeção intravitrealdo mesmo tratamento uma semana depois da cirurbia. Duas semanas de-pois da cirurgia, os animais são perfundidos com fixadores de EM, são pós-fixados e são processados por secções semifinas e ultrafinas. As secções denervo ótico longitudinal são manchadas e são preparadas por observação demielina. A mielinação das partes proximais e distais do nervo ótico trituradosão comparadas entre diferentes grupos de tratamento. Animais tratadoscom Sp35-Fc e 1A7, 2F3, Li05 e Li06, bem como controles apropriados, se-rão analisados por remielinação na parte distai do nervo ótico em compara-ção com os controles.
Exemplo 13
Testagem de anticorpos de anti-Sp35 por regeneração de axônio no modelode trituração de nervo ótico
O nervo ótico direito foi triturado por fórceps Ns 5 por 10 segun-do por volta de 1,5-2 mm atrás do globo ocular intraorbitalmente apenas an-tes administração de 2 μg de anticorpo monoclonal 1A7 em PBS via injeçãointravitreal. 4 ratos foram testados com o anticorpo de 1A7 e 8 ratos foramusados como animais de controle. Os animais receberam uma segunda inje-ção intravitreal do mesmo tratamento uma semana depois da cirurgia. Trêsdias antes de se sacrificar os animais de teste (dia 11 da experiência), 2 mlde CTB-FITC foram injetados intravitrealmente para marcar, anterógrado, aregeneração do nervo ótico axônios. No décimo quarto dia pós-cirurgia, osanimais foram perfundidos e pós-fixados. O nervo ótico triturado foi processopor secções longitudinais congeladas. Os axônios marcados com CTB-FITC,que atravessam o sítio de lesão foram contados como fibras regenerativas avárias distâncias além do sítio de trituração. Quando 1A7 foi injetado paradentro do olho, a regeneração de axônios foi observada até 250 μιτι além dosítio de trituração. Vide figura 10.
Exemplo 14
Anticorpos de anti-Sp35 promovem remielinação e reparo no nervo ótico u-sando-se o modelo de rato EAE induzido por MOG.
Para essas experiências, um modelo de rato com encefalite au-to-imune (EAI) induzida por Glicoproteína de Oligodendrócito de Mielina(MOG) foi usado. Este é o modelo de animal para esclerose múltipla huma-na. 50 μΙ de 200 ng de auxiliar de Freund completo (Chondrex Inc.) mais 50μΙ de 50 μg de MOG em solução salina foram emulsicados (1:1) e forammantidos sobre gelo antes de serem injetados intradermicamente na base dorabo para cada animal. Ratos fêmeas marrons Norway, de 8-10 semanas deidade, foram usados para todas as experiências. Observação geral na técni-ca indica que o modelo de EAE é induzido por volta de 15 dias depois dainjeção de MOG. Ratos são classificados quanto a sinais clínicos de EAE.
Os sinais são classificados como se segue: grau 0.5, paresia do rabo distai;grau 1, paralesia de rabo completa; grau 1.5, paresia do rabo e paresia deperna traseira média; grau 2.0, paresia de perna traseira severa unilateral;grau 2.5, paresia de membro transeiro severa bilateral; grau 3.0; paralesiade membro traseiro bilateral completa; grau 3.5, paresia e paralisia de mem-bro traseiro bilateral completa um membro da frente; grau paralesia completa(tetraplegia), estado moribundo ou morto. Os animais receberam tratamentouma vez que o modelo de EAE é indicado.
2 μg/μl de um anticorpo de anti-Sp35 (1A7) foram injetados in-travitrealmente no dia 15 na indução por MOG-EAE . 2 μg/μl do anticorpo deanti-Sp35, 1A7, foram injetados duas vezes adicionais no dia 22 e no dia 28.
No término da experiência, os animais foram perfundidos com 4% de PFA.
Os nervos óticos foram pós-fixados em 1% de OsO4, foram desidratados eforam implantados em Epon. Secções semifinas (1 μΜ) foram cortadas eforam manchadas com azul de Toluidina para a avaliação de mielinação. Osnervos óticos de animais tratados foram comparados com animais não trata-dos para a regeneração e remielinação de axônio no nervo ótico. Todos osprocedimentos foram realizados após um protocolo aprovado por um comitêde uso e cuidado de animal institucional (IACUC).
Animais que receberam tratamento com o anticorpo de anti-Sp35 1A7 mostraram remielinação e reparo do nervo ótico quando compa-rados com nervos óticos normais ou animais que foram foram submetidas aEAE induzido por MOG, mas não receberam tratamento (figura 9). Na figura9C, as setas apontam para axônios mielinizados. Animais que receberamum anticorpo que reconhece domínio Ill de Proteína G de Streptococcus(M0PC21), não específico por Sp35, não mostrou sinais de remielinizaçãoou reparo do nervo ótico quando em comparação com nervos óticos normaisou os nervos óticos de animais não tratados (dados não mostrados). O anti-corpo de antagonista de Sp35 1A7 promoveu remielinação e reparo de ner-vos óticos em um modelo de neurito ótico de EAE induzido por MOG de rato(figura 9).
Exemplo 15
Testagem de anticorpos de anti-Sp35 para a promoção de remielinação doCNS usando-se modelo de camundongo de EAE induzido por MOG
EAE é induzido na cepa mista de 129B6 de camundongos porimunização intradérmica (dia 0) com 100 μg de proteína de MOG1-125 e-mulsificada com auxiliar de Freund completo (CFA). O volume injetado é de100 μΙ por camundongo e é distrbuído sobre 3 sítios (orelhas, costa e pele).
A emulsão é preparada com base em uma razão de volume de 1:1 e contém1 mg/ml de MOG1-125 e 2 mg/ml M. tuberculosis (strain cepa H37Ra, Chon-drex). Toxina Pertussis (200 ng/camundongo) é administrada intraperitone-almente no tempo imunização e 2 dias aqui depois disso. Peso de corpo eclassificações de EAE clínicas (0 = nenhum sinal clínico; 1 = rabo mole; 2 =fraquez de membro traseiro, marcha com andar gingado ou reflexo direitoprejudicado; 3 = paralisia de membro traseiro completa ou ausência de refle-xo direito; 4 = paralisia de membro traseiro completo com algum grau de en-volvimento do membro dianteiro; 5 = animal totalmente paralisador; 6 = mo·ribundo ou morto) são registrados diariamente. Todos os procedimentos sãorealizado após um protocolo aprovado por nosso comitê de uso e cuidado deanimal instritucional (IACUC). Os animais receberam o tratamento com anti-corpos monoclonais 1A7, 2F3, Li05 e Li06 ou anticorpo de controle no dia 0do estudo. Amostras de sangue são tiradas a várias vezes através de todaas experiências por técnica de sangramento retro-orbital. Plasma é separadade PBMC por centrifugação e fenotipagem de célula é realizada por man-chamento com FACS. Perfil da resposta de anticorpo de anti-MOG humoralé realizada por ELISA usando-se mAbs de subclasse-/isotipo-específico(Pharmingen). No fim de cada experiência, cérebro, medula espinhal, nervosóticos e nervos ciáticos são coletados após a perfusão.
Esse mesmo protocolo é usado para induzir o EAE em machosou fêmeas de ninhada e camundongos de inativação de Sp35. Camundon-gos de inativação de Sp35 tipicamente mostram classificação de EAE maisbaixa (1,5), e nenhuma recaída comparada com controle (durante um perío-do de 45 dias), então machos e fêmeas de ninhada de tipo selvagem (classi-ficação de EAE 3.5).
Animais tratados com Sp35-Fc e 1A7, 2F3 serão analisados porremielinação comparando com o controle.
A proteína MOG1.125 etiquetada com His foi expressa em Pichiapastoris usando-se um promotor de TetO-AOXI induzível por doxiciclina (M.Levesque, D. Krushinskie e K. Strauch, manuscrito na preparação). A se-qüência de codificação extracelular (Gly1 através de Gly125 da proteína ma-dura depois da remoção de seqüência de sinal) de MOG de rato foi ampliadopr PCR usando-se os seguintes iniciadores:
5'G G G GTATCTCTCG AG AAAAG AG AG C ATC ATCATC ATC ATCATATG GGACAGTTCAGAGTGATAGGG 3' (SEQ ID NO:368), e5'TTCGCGGCCGCTATTAGCCAGGGTTGATCCAGTAGAAGGG3' (SEQ ID NO:369).
A presente invenção não deve ser limitada no escopo pelas con-cretizações específicas descritas que destina-se a ilustrações simples deaspectos individuais da invenção, e quaisquer composições ou métodos quesão funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo dessa invenção.
De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descri-tas aqui se tornarão evidentes por aqueles versados na técnica a partir dadescrição e desenhos anexos expostos acima. Pretende-se que tais modifi-cações caiam dentro do escopo da reivindicações anexas.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesterelatório são aqui incorporados por referência na mesma extensão que secada pedido de patente ou publicação individual fosse específica e individu-almente indicada ser incorporada por referência.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Biogen IDEC MA, Inc.SHR, Mi
PEPINSKY, R. BlakeSHAO, Zbaohui
<120> "ANTICORPOS SP35 E USO DOS MESMOS"
<130> 2159.036PC02
<150> 60/697,336<151> 2005-07-08
<150> 60/771,900<151> 2006-02-10
<150> 60/814,522<151> 2006-06-19
<160> 409
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1845
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4Ó0> 1
atgctggcgg ggggcgtgag gagcatgccc agccccctcc tggcctgctg gcagcccatc 60ctcctgctgg tgctgggctc agtgctgtca ggctcggcca cgggctgccc gccccgctgc 120gagtgctccg cccaggaccg cgctgtgctg tgccaccgca agcgctttgt ggcágtcccc 180gagggcatcc ccaccgagac gcgcctgctg gacctaggca agaaccgcat caaaacgctc 240aaccaggacg agttcgccag cttcccgcac ctggaggagc tSgaSCtcaa cgagaacatc 300gtgagcgccg tggagcccgg cgccttcaac aacctcttca acctceggac gctgggtctc 360cgcagcaacc gcctgaagct catcccgcta ggcgtcttca ctggcctcag caacctgacc 420aagctggaca tcagcgagaa caagattgtt atcctgctgg actacatgtt tcaggacctg 480tacaacctca agtcactgga ggttggcgac aatgacctcg tctacatctc tcaccgcgcc 540ttcagcggcc tcaacagcct ggagcagctg acgctggaga aatgcaacct gacctccatc 600cccaccgagg cgctgtccca cctgcacggc ctcatcgtcc tgagsictccg gcacctcaac 660atcaatgcca tccgggacta ctccttcaag aggctctacc gactcaaggt cttggagatc 720tcccactggc cctacttgga caccatgaca cccaactgcc tctacggcct caacctgacg 780tccctgtcca tcacacactg caatctgacc gctgtgccct acctggccgt ccgccaccta 840gtctatctcc gcttcctcaa cctctcctac aaccccatca gcaccattga gggctccatg 900ttgcatgagc tgctccggct gcaggagatc cagctggtgg gcgggcagct ggccgtggtg 960gagccctatg ccttccgcgg cctcaactac ctgcgcgtgc tcaatgtctc tggcaaccag 1020ctgaccacac tggaggaatc agtcttccac tcggtgggca acctggagac actcatcctg 1080gactccaacc cgctggcctg cgactgtcgg ctcctgtggg tgttccggcg ccgctggcgg 1140ctcaacttca accggcagca gcccacgtgc gccacgcccg agtttgtcca gggcaaggag 1200ttcaaggact tccctgatgt gctactgccc aactacttca cctgccgccg cgcccgcatc 1260cgggaccgca aggcccagca ggtgtttgtg gacgagggcc acacggtgca gtttgtgtgc 1320ogggccgatg gçgacccgcc gcccgccatc ctctggctct caccccgaaa gcacctggtc 1380tcagccaaga gcaatgggcg gctcacagtc ttccctgatg gcacgctgga ggtgcgctac 1440gcccaggtac aggacaacgg cacgtacctg tgcatcgcgg ccaacgcggg cggcaacgac 1500tccatgcccg cccacctgca tgtgcgcagc tactcgcccg actggcccca tcagcccaac 1560aagaccttcg ctttcatctc caaccagccg ggcgagggag aggccaacag cacccgcgcc 1620actgtgcctt tccccttcga catcaagacc ctcatcatcg ccaccaccat gggcttcatc 1680tctttcctgg gcgtcgtcct cttctgcctg gtgctgctgt ttctctggag ccggggcaag 1740ggcaacacaa agcacaacat cgagatcgag tatgtgcccc gaaagtcgaa cgcaggcatc 1800agctccgccg acgcgccccg caagttcaac atgaagatga tatga 1845
<210> 2
<211> 614
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Leu Ala Gly Gly Val Arg Ser Met Pro Ser Pro Leu Leu Ala Cys1 5 ίο IS
Trp Gln Pro Ile Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Ser20 25 30
Ala Thr Gly Cys Pro Pro Arg Cys Glu Cys Ser Ala Gln Asp Arg Ala35 40 45
Val Leu Cys His Arg Lys Arg Phe Val Ala Val Pro Glu Gly Ile Pro50 55 60
Thr Glu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Gly Lys Asn Arg Xle Lys Thr Leu65 70 75 80
Asn Gln Aep Glu Phe Ala Ser Phe Pro His Leu Glu Glu Leu Glu Leu85 90 95Asn Glu Asn Ile Val Ser Ala Val Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu100 105 110
Phe Asn Leu Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ser Asn Arg Leu Lys Leu Ile115 120 125
Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile130 135 140
Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu145 150 155 160
Tyr Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr Ile165 170 175
Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu Asn Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu180 185 190
Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ser Ile Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu195 200 205
His Gly Leu Ile Val Leu Arg Leu Arg His Leu Asn Ile Asn Ala Ile210 215 220
Arg Asp Tyr Ser Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Leu Lys Val Leu Glu Ile22S 230 235 240
Ser His Trp Pro Tyr Leu Asp Thr Met Thr Pro Asn Cys Leu Tyr Gly245 250 255
Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Ile Thr His Cys Asn Leu Thr Ala Val260 265 270
Pro Tyr Leu Ala Val Arg His Leu Val Tyr Leu Arg Phe Leu Asn Leu275 280 285
Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile Glu Gly Ser Met Leu His Glu Leu290 295 300
Leu Arg Leu Gln Glu Ile Gln Leu Val Gly Gly Gln Leu Ala Val Val305 310 315 320
Glu Pro Tyr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Tyr Leu Arg Val Leu Asn Val325 330 335Ser Gly Asn Gla Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser Val Phe His Ser Val340 345 350
Gly Asn Len Glu Thr Leu Ile Leu Asp Ser Asn Pro Leu Ala Cys Asp355 360 365
Cys Arg Leu Leu Trp Val Phe Arg Arg Arg Trp Arg Leu Asn Phe Asn370 375 380
Arg Gln Gln Pro Thr Cys Ala Thr Pro Glu Phe Val Gln Gly Lys Glu385 390 395 400
Phe Lys Asp Phe Pro Asp Val Leu Leu Pro Asn Tyr Phe Thr Cys Arg405 410 415
Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys Ala Gln Gln Val Phe Val Asp Glu420 425 430
Gly His Thr Val Gln Phe Val Cys Arg Ala Asp Gly Asp Pro Pro Pro435 440 445
Ala Ile Leu Trp Leu Ser Pro Arg Lys His Leu Val Ser Ala Lys Ser450 455 460
Asn Gly Arg Leu Thr Val Phe Pro Asp Gly Thr Leu Glu Val Arg Tyr465 470 475 480
Ala Gln Val Gln Asp Asn Gly Tlir Tyr Leu Cys Ile Ala Ala Asn Ala485 490 495
Gly Gly Asn Asp Ser Met Pro Ala His Leu Hie Val Arg Ser Tyr Ser500 505 510
Pro Asp Trp Pro His Gln Pro Asn Lys Thr Phe Ala Phe Ile Ser Asn515 520 525
Gln Pro Gly Glu Gly Glu Ala Asn Ser Thr Arg Ala Thr Val Pro Phe530 535 540
Pro Phe Asp Ile Lys Thr Leu Ile Ile Ala Thr Thr Met Gly Phe Ile545 550 555 560
Ser Phe Leu Gly Val Val Leu Phe Cys Leu Val Leu Leu Phe Leu Trp565 570 575Ser Arg Gly Lys GXy Asn Thr Lys His Asn Ile Glu Xle Glu Tyr Val580 585 590
Pro Arg Lys Ser Asp Ala Gly Ile Ser Ser Ala Asp Ala Pro Arg Lys595 600 605
Phe Asn Met Lys Met Ile610
<210><211><212><213>
<400>
36
PRT
Homo sapiens
Met Gln Val Ser Lys Arg1 5
<210> 4<211> 29<212> DNA
<213> Murinae gen. sp.<400> 4
gcgtctagaa ctggatggtg ggagatgga
29
<210> 5<211> 15<212> DNA<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDRl (LilO)
<400> 5
acttacccta tggtt
15
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (LilO)
<400> 6
Thr Tyr Pro Met Val1 5
<210> 7<211> 51<212> DWA<213> Artificial seguence<220>
<223> VH-CDR2 (LilO)<400> 7
tggateggtc cttctggtgg cgttactgct tatgctgact ccgttaaagg t
<210> 8<211> 17<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (LilO)<400> 8
Trp Ile Gly Pro Ser Qly Qly Val Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial seguence<220>
<223> VH-CDR3 (LilO)
<400> 9
ccctatagca gtggctggtg ggacttcgat ctc
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial seguence<220>
<223> VH-CDR3 (LilO)
<400> 10
Pro Tyr Ser Ser Gly Trp Trp Asp Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial seguence<220>
<223> VH-CDRl (LÍ07)<400> 11atgtacttta tgggt
IS
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (LÍ07)
<40 0> 12
Met Tyr Phe Met Gly1 5
<210> 13
<211> 51
<212 s. DNA
<213> Artificial sequence
<220><223 >
VH-CDR2 (LiO7)
< 4 O O > 13
tctatctctc cttctggtgg ctttacttct tatgctgact ccgttaaagg t
51
<210> 14.<211> 17<212 > PRT<213 > Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (LÍ07)<400> 14
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 ■ . 10 15
Gly
<210><211><212>
1521DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ07)
<400> 15
gatcggcatg cttttgatat c
21
<210> 16<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220 >
<223> VH-CDR3 (Iii07)
<400> 16
Asp Arg His Ala Phe Asp Ile
1. 5
«210> 17
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (LÍ05)
<400> 17cttacgctat gggt
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (LiOS)
<400> 18
Ala Tyx Ala Met Gly1 5
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ05)
<400> 19
tctatcgttt cttctggtgg ctatactgat tatgctgact ccgttaaagg t
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ05)
<400> 20Ser Ile Val Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 27
<212> ENA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ05)
<400> 21 27
gagggtgacc ataatgcttt tgatatc
<210> 22<211> 9<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR3 (LÍ05)
<400> 22
Glu Gly Asp His Asn Ala Phe Asp Ile1 5
2315DHA
Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (Lill)
<400> 23tcttacgcta tgtat
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (Lill)
<400> 24
Ser Tyr Ala Met Tyr
1 5
<210><211><212><213>
<210> 25<211> Sl
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (Lill)
<400> 25
tctatctcta cttctggtgg ctatactggt tatgctgact ccgttaaagg t 51
<210> 26<211> 17<212 > PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (Lill)<400> 26
Ser Ile Ser Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lysι 5 10 15
Gly
<210><211><212>
2736DNA
<213> Artificial sequence
<220><223>
VH-CDR3 (Lill)
<400> 27
gataccagcg ataatgacta ctactacatg gacgtc
36
<210> 28<211> 12<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR3 (Lill)<400> 28
Asp Thr Ser Asp Asn Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Val1 5 10
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220><223> VH-CDRl (LiOl)
<400> 29aagtaccaga tgact
<210? 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence<22 0>
<223> VH-CDRl (IiiOl)
<400> 30
Lys Tyr Gln Met Thr1 5
<210> 31
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223 > VH-CDR2 (LiOl)
<400> 31
tctatctatc cttctggtgg caatactgtt tatgctgact ccgttaaagg t
<210> 32<211> 17<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (LiOl)<400> 32
Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15
Gly
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (LiOl)
<4 00> 33
gggactacag aggcagtctt tgactac<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (LiOl)
<400> 34
Gly Thr Thr Glu Ala Val Phe Asp Tyr1 5
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213 > Artificial sequence<22 0>
<223> VH-CDRl (LÍ12)
<400> 35cagtacaata tgttt
<210> 36<211> 5<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDRl (tiil2)<400> 36
Gln Tyr Asn Met Phe1 5
<210> 37
<21i> Sl
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ12)
<400> 37
cgtatctctt cttctggtgg catgactatg tatgctgact ccgttaaagg
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
sequence
<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ12)<400> 38
Arg Ile Ser Ser Ser Gly Gly Met Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 39<211> 69<212> DMA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 ÍLÍ12)<400> 39
gaagcgttac ggccttattg tagtggtggt agctgctact ccgactacta ctactacggtatggacgtc
<210> 40
<211> 23
<212> PRT
«213> Artificial sequence<22Q>
<223> VH-CDR3 (LÍ12)
<400> 40
Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Aep Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val20
<210> 41
<211> 1.5
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (LÍ06)
<400> 41
gagtacccta tggat
<210> 42
<211> 5
<212>. PRT
<213 > Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (LÍ06)<400> 42
Glu Tyr Pro Met Asp1 5
<210> 43<211> Sl<212> DKA<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 {Li06)<400> 43
tctatctatt cttctggtgg ctctactgtt tatgctgact ccattaaagg t
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Bequence<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ06)
<400> 44
Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Xle Lysα 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ06)
<400> 45
gagggtgact ctgatgcttt tgatatc
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (Ι>±06)
<400> 46
Glu Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile1 5<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213 > Artificial sequence<220>
<223> VH-CURl (LiOS)
<400> 47cattacgaga tggtt
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (LiOB)
<400> 48
His Tyx Glu Met Val1 5
<210> 49
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223 > VH-CDR2 (I/Í08)
<400> 49
tctatccgtt cttctggtgg cgctactaag tatgctgact ccgttaaagg t
<210> 50<211> 17<212 > PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ08)<400> 50
ser Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ala Tbr Lys Tyr Ala AbP Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210><211><212>
5127DNA<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-C DR3 (I.Í08)
<400> 51
gagtcgccag acgactactt tgactac
<210> 52
<211> 9
<212 > PRT
<213> Artificial seguence<220>
<223> VH-CDR3 (LiiOS)
<400> 52
Glu Ser Pro Asp Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5<210> 53<21:l> 15<212> DNA<213> Artificial seguence<220> <223 > Affl-CDRl {1,103)<400> S3cagtacccta tggag
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial seguence<220>
<223> VH-CDRl CLiO3)
<4Q0> 54
Gln Tyr Pro Met Glu1 5
< 21Q > 55
<211> 51
<212> DSA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ03)
<400> 55
ggtatctatc cttctggtgg ctctactgtt tatgctgact ccgttaaagg<210> 56<211> 17<212> PRT<213> Artificial seqüence<220> <223> VH-CDR2 (LÍ03)<400> 56
Qly Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Oly
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial seqüence
<22 0>
<223> VH-CDR3 (LÍ03)
<40Ò> 57
gcggggcagt ggctggggga ctttgactac 3 0
<210> 58<211> 10<212> PRT<213> Artificial seqüence<220> <223> VH-CDR3 (Li03)<400> 58
Ala Gly Gln Trp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr1 5 10
<210> 59
<211> 15
<212 > DHA
<213> Artificial seqüence<220>
<223> VH-CDRl (LÍ09)
<400> 59atgtactcta tggtt
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial seqüence<220>
<223> VH-CDRl (LÍ09)<400> 60
Met Tyr Ser Met Val1 5
<210> 61
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial seguence<220>
<223 > VH-CDR2 (LÍ09)
<400> 61
tatatctctc cttctggtgg caagactatg tatgctgact ccgttaaagg t
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (Li09)
<400> 62
Tvr Xle Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lysς 10 15
Gly
<210><211><212><213>
<220><223>
6369DNA
Artificial sequence
VH-CDR3 (LiO9)
<400> 63 ^
gattcgagac gccggtatta cgatttttgg agtggttatc acaactacta ctactactac
atggacgtc
6069
<210> 64
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial seguence
<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ09)<400> 64
Asp Ser Arg Arg Arg Tyr Tyx Aep Phe Trp Ser Gly Tyr His Asn Tyr1 S 10 15
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val20
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial secjuence<220>
<223> VH-CDRl {Li04)
<400> 65cgttacaata tgggt
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial aequence<220>
<223> VH-CDRl (LÍ04)
<400> 66
Arg Tyr Asn Met Gly1 5
<210> 67<211> 51<212> DNA<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (Li04)<400> 67
gttatctatc cttctggtgg cggtactcat tatgctgact ccgttaaagg t
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (Li04)
<400> 68
Val Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Gly Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Bys1 5 io 15Gly
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ04)
<400> 69
tctatagcag atgatgcttt tgata
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (Li04>
<400> 70
Ser Ile Ala Asp Asp Ala Phe Asp Ile
i 5
<210> 71
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (LÍ02)
<400> 71acttacgaga tgatt
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence<22 0>
<223> VH-CDRl (I»i02>
<400> 72
Thr Tyr Glu Met Ile1 5
<210> 73
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
sequence<22O >
<223> VH-CDR2 <Li73)<400> 73
tctatcggtc cttctggtgg ccttacttgg tatgctgact ccgttaaa
7417PRT
Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ02)<400> 74
Ser Ile Gly Pro Ser Gly Gly Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lysι 5 10 15
<210><211><212><213>
Gly
<210> 75<211> 51<212 > DNA<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR3 {Li02)<400> 75atgtattact gtgtacggat tgatgatagt <210> 76<211> 17<212» PRT<213> Artificial sequence<220> <223 > VH-CDR3 (LÍ02)<4r00> 76
Met Tyr Tyr Cys Val Arg Ile Asp Asp Ser Ser Gly Trp Ala Phe Asp1 5 IQ . 15
Ile
<210> 77
<211> S
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 77Asn Tyr Gly Met Asxi 1 5<210> 78<211> 17<212> PRT<213> Murinae gen.<400> 78
Trp Ile Aan Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe Gln1 5 10 15
Gly <210> 79 <211> 7 < 212 > PRT <213> Murinae gen. sp.<400> 79 Glu Gly Val His Phe Asp1 5 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Murinae gen. sp.<400> 80 Phe Ser Asp Ala Trp Leu 1 5 <210> 81 <211> 19 <212> PRT <213> Murinae gén. sp.<400> 81
Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 82<211> 4<212> PRT<213> Murinae geti. sp.
<400> 82
Ser Phe Ala Tyr1
<210> 83
c211> 5
<212> PRT
<213 > Murinae gen. sp.
<400> 83
Ser Ser Trp Thr Gln1 5
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 84
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Qly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys1 5 10 15
Gly
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> Murinae gen. ep.
<400> 85
His Asn Ser Tyr Gly Met Aep Tyr1 5
<210> 86<211> 33<212> DNA<213 > Artificial sequence<220> <223> VH-CDRl (LilO)<400> 86
cgggcgagtc agggtattgg caactggtfca gcc
<210> 87
<211> 11
<212 > PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDRl (LilO)<400> 87
Arg TQa Ser Gln Gly Ile Gly Asn Trp Leu Ala1 5 10
<210> 88<211> 21<212> DUA<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDR2 (LilO)
<400> 88
gctgcatcca gtttggaaag t
<210> 89<211> 7<212> PRT<213 > Artificial sequence<220> <223 > VL-CDR2 (LilO)
<4 00> 89
Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser1 5
<210> 90
<211> 27
<212> DFA
<213> Artificial sequence<22 0>
<223 > VL-CDR3 (LilO)
<400 > 90
caacaggctc agactttccc gctcacc
<210> 91<211> 9<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDR3 (LilO)<400> 91
Gln Gln Ala Gln Thr Phe Pro Beu Thr1 5<210> 92<211> 33<212> CNA<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (LÍ07)<400> 92
tctggagatc agttgggtga caaacatgtg gct
<210> 93<211> 11<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDRl (LÍ07)<400> 93
Ser Qly Asp Gln Leu Gly Asp Lys His Val Ala1 5 10
<21Ó> 94<211> 21<212> DNA<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDR2 (LÍ07)<400> 94
ctagaoatta agaggcccgc a
<210> 95<211> 7<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDR2 (LÍ07)<400> 95
Leu Asp Xle Lys Arg Pro Ala1 5
<210> 96
<211> 24
<212> DNA
<2l3> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ07) .<400> 96
caggcgtggg acatcaagac ggtc
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ07)
<400> 97
GXxi Ala Trp Asp Ile Lys Thr Val1 5
<210> 98<211> 33< 212 > DNA<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (LÍ05)<400> 98
gggggagaca acattggaag taagagtgtc cac
<210> 99<211> 11<212 > PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VIt-CDRl (Iii05)<400> 99
Gly Gly Asp Asn. Ile Gly Ser Xiys Ser Val His1 5 10
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VIi-CDR2 (M05)
<400> 100
gatgattatg accggccctc a
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> Arcificial eequence<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ05)<400> IOX
Asp Asp Tyr Asp Arg Pro Ser1 5
<210> 102<211> 33<212> DNA<213> Artificial seguence<220> <223> VL-CDR3 (Lios)<400> 102
caggtgaggg acagccgtac tgaggaacgg gtg
<210> 103<211> 11<212> PJRT<213> Artificial seguence<220> <223> VL-CDR3 (Li05)<400> 103
Gln Val Arg Asp Ser Arg Thr Glu Glu Arg Val15 10
<210> 104<211» 33<212> DHA<213> Artificial sequence<220> <223> VrL-CDRl (Lill)<400> 104
cgggcgagtc aggagattgc caactactta gcc
<210> 105<211> 11<212> PRT<213? Artificial seguence<220> <223> VL-CDRl (Lill)<4 0 0 > 105
Arg Ala Ser Gln Glu Xle Ala Asn Tyr Leu Ala15 10<21Q> 106
<211> 21
<212> DWA
<213> Artificial sequence<22 0>
<223> VL-CDR2 (Lill)
<400> 106
gatacataca ctttgcagac t 21
1077
PRT
Artificial seguence
<210><211><212><213>
<2 2 0>
<223> VL-CDR2 (Lill)<400> 107
Asp Thr Tyr Thr Leu Gln Thr1 5
<210> 108<211> 27<212> DNA<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDR3 (Lill)<400> 108
caacaggctg acattttccc gctctct 27
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 (Bill)
<400> 109
Gln Gln Ala Asp Ile Phe Pro Leu Ser
1 5
<21Q> 110
<211> 33
<212> DMA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDRl (LiOl)
<400>
110caggcgagtc aggacattag caactattta aat
<210> 111<211> 11<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (LiOl)
<400> 111
Glxi Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn1 5 10
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223 > VIi-CDR 2 (LiOl)
<4 00> 112
gatgcatcca atttggaaac a
<210> 113
<211> 7
<212 > PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 (LiOl)
<400> 113
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr1 5
<210> 114
<211> 30
<212> DKA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 (LiOl)
<400> 114
caacaggctg acaggttccc tgcggtcact
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220><223> VXi-CDR3 (LiOl)<400> 115
Gln Gln Ala Αερ Arg Phe Pro Ala Val Thr15 10
<210> 116<211> 33<212> DMA<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (LÍ06)<400> 116
cgggccagtc agagtattag tagctggttg gcc 33
<210> 117<211> 11<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (Li06)<400> 117 ■
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5<210> 118<211> 21<212> DNA<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDR2 (Li06)<400> 118gctgcatcca gtttacgaac t <210> 119<211> 7<212 > PRT<213 > Artificial sequence<220> <223 > VL-CDR2 (LÍ06)
<400> 119
Ala Ala Ser Ser Leu Arg Thr1 5
<210> 120<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ06)
<400> 120
ctacaagatt acagttaccc tctcact
<210> 121<211> 9<212> PRT<213 > Artificial sequence<220> <223> VL-CDR3 (LÍ06)<400> 121
Leu Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr1 5
<210 > 122<211> 33<212> DKA<213> Artificial sequence<220> <223 > VXi-CDRl (Li08)<400> 122
caggcgagtc aggacattag ttactattta aat
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Beguence<220>
<223> VL-CDRl (LÍ08)
<400> 123
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 124
<211> 21
<212> DKA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ08)
<4G0> 124
gatgtatcca atttgcaaac a<210> 125<211> 7<212 > PRT<213 > Artificial sequence<220> <223> VL-CDR2 (Li08)<400> 125
Asp Val Ser Asn Leu Gln Thr1 5
<210> 126
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence<22 0>
<223> VL-CDR3 (LÍ08)
<400> 126
caacagtctg ataatctccc tctcact
<210> 127<211> 9<212> PRT<213 > Artificial sequence<220> <223 > VL-CDR3 (LiOS)<400> 127
Gln Qln Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr1 5
<210> 12 8<211> 32<212> DNA<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (Li03)<400> 128
gggcaagtca gagcattagc agctatttaa at
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDRl (LÍ03)<400> 129
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Jjeu Asn1 5 10
<210> 130
<211> 21
<212> DWA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 <t.Í03)
<400> 130
gctgcatcca gtttgcaaag t 21
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 ÍLÍ03)
<400> 131
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5
<210> 132
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 <LÍ03)
<400> 132
caacagagtt acagtacccc gtggacg 27
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ03)
<400> 133
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tzp Thr1 5
<210> 134<211> 33<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> Vli-CDRl (LÍ09)<400> 134
cgcgcaagtc agagcatcga cacctattta aat
<210> 135<211> 11<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDRl (LiOS)<400> 135
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Thr Tyr Leu Asn15 10
<210> 136
<211> 21
<212> DKA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 {Bi09)
<400> 136
gctgcatcca agttggaaga c
<210> 137
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence<22 0>
<223> VL-CDR2 <LÍ09)
<400> 137
Ala Ala Ser Lys Leu Olu Asp1 5
<210> 138<211> 26<212> DNA<213> Artificial sequence<22 0> <223 > VL-CDR3 (LÍ09)<400> 138
caacagagtt acagtccccc tctcac<210> 139<211> 9<212> PRT<213> Artificial sequence<22G> <223> VIi-CDR3 (LÍ09)<400> 139
Gln Oln Ser Tyr Ser Pro Pro Leu Thr
5
<210 > 140<211> 33<212 > DNA<213 > Artificial sequence<220> <223 > VIi-CDRl (Li02)<400> 140
tctggagata aattggggga taaatttgct tcc
<210> 141<211> 11<212> PRT<213 > Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (Li02}<400> 141
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lye Phe Ala Ser1 5 10
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ02)
<400> 142
caagatagga agcgtctctc a
<210> 143
<211> 7
<212? PRT
<213> Artificial sequence<22 0>
<223> VL-CDR2 (LÍ02)<400> 143Gln Asp Arg Xiys Arg Leu Ser 1 5<210> 144<211> 27<212 > DHA<213 > Artificial sequence<220> <223> VL-CDR3 (LÍ02)
<400> 144
caggcgtggg aeaccaacac tgtggtc
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence<22 0>
<223 > VL-CDR3 (LÍ02)
<400> 145
Gln Ala Trp Aep Thr Aen Thr Val Val
<21'0> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> Murínae gen. sp.
<400> 146
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyx Met His
10
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp,
<4 00> 147
Asp Thr Ser Lys teu Ala Ser1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 148Gln Gln Trp Ser Ser Aen Pro Phe Thr1 5
<210> 149<211> 11<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 149
Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala1 5 10
<210> 150 <211> 7 <212> PRT <213> Murinae gen. sp.<400> 150 Asn Ala Lys Thr Leu Pro1 5 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Murinae gen. sp.<400> 151 Gln His Phe Trp Ala Ile1 5 <210> 152 <211> 17 <212> PRT <213> Murinae gen. sp.<400> 152 Lys Ser Ser Gln Ser Leu1 5 Thr <210> 153 <211> 7 <212> PRT <213> Murinae gen. sp.<400> 153 Tzp Ala Ser Thr Arg Glu1 5
10 15<210> 154<211> 10<212 > PRT<213> Murinae geri. sp.<400> 154Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr 1 5<210> 155<211> 17<212> PRT<213> Murinae gen. sp.
ίο
<400> 155
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asa Gln Lys Ser Tyr Leu1 5 10 15
Thr
<210> 156 <211> 7 <2X2> PRT <213> Muriaae gen. sp.<400> 156 Trp Ala Ser Thr Arg Glu1 5 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Murinae gen. sp.<400> 157
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr1 5 io
<210> 158
<211> 133
<212> PHT
<213 > Artificial sequence
<220>
<223> VH {LÍ02)<400> 158
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr20 25 30
Glu Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ser Ile Gly Pro Ser Gly Gly Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95
Val Arg Ile Asp Asp Ser Ser Gly Trp Ala Phe Αερ Ile Trp Gly Gln100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro130
<210> 159
<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH (LiOS)
<400> 159
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Sex Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30
Ser Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr Met Tyr Ala Αερ Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr IXe Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Arg Arg Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr His100 105 110
Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val115 120 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala130 135 140
Pro145
<210> 160
<2 lis» 131
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223 > VH (LÍ06)
<400> 160
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr20 25 30
Pro Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Ile50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 ao 95
Ala Arg Glu Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Hir Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125
Leu Ala Pro130
<210> 161<211> 131<212> PRT<213> Artificial<220> <223> VH (LiOS)<400> 161
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ser Ile Val Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp His Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr100 105 lio
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125
Leu Ala Pro130
<210> 162
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220><223> VH {Li04)<400> 162
Glu Val Qln Leu Iteu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe fhr Phe Ser Arg Tyr20 25 30
Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Val Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Gly Thr Hie Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lye Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 60
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 SO 95
Ala Ser Ser Ile Ala Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
Met Val Thx Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125
Leu Ala Pro130
<210> 163
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial sequence<22Q>
<223> VH (LÍ08)
<400> 163
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr20 25 30
Glu Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 BO
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Lys Glu Ser Pro Asp Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125
Leu Ala Pro130
<210> 164<211> 134<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH (Lill)<400> 164
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ser Ile Ser Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ilir Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asp Thr Ser Asp Asn Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly10 0 105 HOLys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 12 0 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro130
<210> 165<211> 133<212> PRT<213> Artificial<220> <223> VH (LilO)<40G> 165
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr20 25 30
Pro Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val50 SS 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Ser Ser Gly Trp Trp Asp Phe Asp Leu Trp Gly Arg100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro130
<210> 166
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial
sequence<220>
<223> VH (LiOl)<400> 166
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr20 25 30
Gln Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Ser Gly Thr Thr Glu Ala Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125
Leu Ala Pro130
<210> 167<211> 129<212> PRT<213> Artificial<220> <223> VH (LÍ07)<400> 167
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30
Phe Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asp Arg His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala115 120 125
Pro
<210> 168<211> 132<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH (Li 03)<400> 168
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr20 25 30
Pro Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lye Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Ala Gly Gln Trp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr VaX Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe115 120 125
Pro Leu Ala Pro130
<210> 169
<211> 145
<212» PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VE (Liil2)
<400> 169
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr20 25 30
Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Arg Ile Ser Ser Ser Gly Gly Met Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cye Tyr Ser100 105 110
Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val115 120 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala130 135 140
Pro145<210> 170<211> 116<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 170
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lye Pro Gly Glu1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp PheSO 55 60
Gln Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr65 70 75 80
Leu Gln Phe Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Gys85 90 95
Ala Arg Glu Gly Val His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val100 105 110
Thr Val Ser Ser115
<210> 171
<211> 115
<212> PRT
<213> Murxnae gen. sp.
<400> 171
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala20 25 30
Trp Leu Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Tip Val35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Bys Ser Ser65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Xle Tyr85 90 95
Phe Cys Thr Pro Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr100 105 lio
Val Ser SerIlS
<210> 172
<211> 117
<212> PRT
<213 > Murinae gen. sp.
<400> 172
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ihr Phe Thr Ser Ser20 25 30
Trp Thr Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg His Asn Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser100 105 110
Val Thr Val Ser Ser115
<210> 173
<211> 399
<212> DMA
<213> Artificial seguence<220>
<223> VH (X.Í02)<400> 173
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct acttaegaga tgatttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcggtcctt Ctggtggcct tacttggtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac accgccatgt attactgtgt acggattgat 300gatagtagtg gttgggcttt tgatatctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcaagc 360gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccc 399
<210> 174
<211? 435
<212> DNA
<213? Artificial sequence<220>
<223> VH (LÍ09)
<400> 174
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtactcta tggtttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactatgtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactttctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagattcg 300agacgccggt attacgattt ttggagtggt tatcacaact actactacta ctacatggac 360gtctggggca aagggaccac ggtcaccgtc tcaagcgcct ccaccaaggg cccatcggtc 420ttcccgctag caccc 435
<210> 175<211> 393<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH (IiiOS)<400> 175
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt SOtcttgcgctg cttccggatt cactttctct gagtacccta tggattgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctattctt ctggtggctc tactgtttat 180
gctgactcca ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc cagagagggt 300gactctgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393
<210> 176
<211> 393
<212> DNTA
<213> Artificial seguence<220>
<223> VH (LÍ05)
<400> 176
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacgcta tgggttgggt tcgccaagct 12 0cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcgtttctt ctggtggcta tactgattat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc cagagagggt 300gaccataatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393
<210> 177
<21Ι> 393
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH (LÍ04)
<400> 177
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cgttacaata tgggttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atctatcctt ctggtggcgg tactcattat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagttctata 300gcagatgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393
<210> 178
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220> <223> VH (LiOS) <400> 178 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacgaga tggtttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atccgttctt ctggtggcgc tactaagtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagagtcg 300ccagacgact actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360accaagggcc catcggtctt cecgctagca CCC 393
<210> 179
<211> 402
<212> DHA
<213> Artificial seguence<220>
<223> VH (Lill)
<4Ό0> 179
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tcttacgcta tgtattgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctactt ctggtggcta tactggttat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatacc 300agcgataatg actactacta catggacgtc tggggcaaag ggaccacggt caccgtctca 360agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc ccgctagcac cc 402
<210> 180
<211> 399
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH (LilO)
<400> 180
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct acttacccta tggtttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atcggtcctt ctggtggcgt tactgettat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaccctat 300agcagtggct ggfcgggactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac cgtctcaagc 360gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccc 399<210> 181 <211> 3 93 <212> DNA <213> TLrtificial sequence <220> <223> VH (LiOl) <4,00> 181 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aagtaccaga tgacttgggt tcgccaagct 12 0cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctatcctt ctggtggcaa tactgtttat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgggact 300acagaggcag tctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360accaagggcc catcggtctt cccgctagca CCC 393<210> 182 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> VH (LÍ07) <400> 182 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtacttta tgggttgggt tcgccaagct 12 0cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggctt tacttcttat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagatcgg 300catgcttttg atatctgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcaagcgc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttcccgct agcaccc 387
<210> 183
<211> 396
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> VH (1,103)<400> 103 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cagtacccta tggagtgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctatcctt ctggtggctc tactgtttat 100gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca ãctctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagcgggg 300cagtggctgg gggactttga ctactggggc Cagggaaccc tggtcaccgt ctcaagcgcc 360tccaccaagg gcccatcggt cttcccgcta gcaccc 396
<210> 184
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<22 3 > VH (Li 12)
<4 00> 184
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cagtacaata tgttttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctcttctt ctggtggcat gactatgtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagcg 300ttacggcctt attgtagtgg tggtagctgc tactccgact actactacta cggtatggac 360gtctggggcc aagggaecac ggtcaccgtc tcaagcgcct ccaccaaggg cccatcggtc 420ttcccgctag caccc 435
185357DNA
Artificial sequence<220>
<223> VL (Iii02)<400> 185
ttctattctc acagtgcaca gtacgaattg actcagccac cctcagtgtc cgtgtcccca 60ggacagacag ccagcatcac ctgctctgga gataaattgg gggataaatt tgcttcctgg 120tatcagcaga aggcaggcca gtcccctgtg ctggtcatct ttcaagatag gaagcgtetc 180tcagggatcc ctgagcgatt ctctggctcc aactctggga acacagccac tctgaccate 240
<210><211><212><213 >agcgggaccc aggctatgga tgaggctgac tattactgtc aggcgtggga caccaacact 300gtggtcttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccc 357
<210> 186<211> 360<212> DKA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL (Li09)<400> 186
ttctattctc acagtgcaca agacatceag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 60tttgtgggag acagagtcgc catcacttgc cgcgcaagtc agagcatcga cacctattta 120aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaaactcc tgatctatgc tgcatccaag 180ttggaagacg gggtcccatc aagattcagt ggcagtggaa ctgggacaga tttcactctc 240accatcagaa gtctgcaacc tgaagatttt ggaacttact actgtcaaca gagttacagt 300ccccctctca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360
<210> 187<211> 360<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL (LÍ06)<400> 107
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccttccac cctgtctgca 60tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggccagtc agagtattag tagctggttg 120gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaacctcc tgatctatgc tgcatccagt 180ttacgaactg gggtcccatc aagattcagg ggcagtggat ctggcacaga tttcactctc 240accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt gcaacgtatt actgtctaca agattacagt 300taccctctca cttttggcca ggggaccaag ctggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360
<21Ó> 188<211> 363<212> DHA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL (LiOS)<400> 188
ttctattctc acagtgcaca gagcgtcttg actcagccac cctcggtgtc agtggcccca 60ggccagacgg ccaggatttc ctgtggggga gacaacattg gaagtaagag tgtccactgg 120taccagcaga ggccaggcca ggcccctgtc ctggtcgtgt atgatgatta tgaccggccc IBOtcagggatcc ctgagcgatt ctctggctcc aactctgggg acacggccat cctgaccatc 240accagggtcg aagtcgggga tgaggccgac ttttafctgtc aggtgaggga cagccgtact 300gaggaacggg tgttcggcgg agggaccaag gtgaccgtct taggtcagcc caaggctgcc 360ccc 363
<210> 189
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL (LÍ08)
<400> 189
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc cctgtctgca 60tctgtaggag acagagtcac catcacttgc caggcgagtc aggacattag ttactattta 120aattggtatc agcagaagcc agggaaagcc cctaaggtcc tgatctacga tgtatccaat 180ttgcaaacag gggtcccatc aaggttcagt ggaagtgcgt ctgcgacaga ttttactctc 240accatcagca gcctgcagcc tgaagatatt gcgacatàtt actgtcaaca gtctgataat 300ctccctctca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatta aacgaactgt ggctgcacca 360
<210> 190
<211> 360
<212> DHA
<213> Artificial seguence<220 >
<223> VL (Lill)
<400> 190
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc tgtgtctgca 60cctataggag acagagtcac catcacttgt cgggcgagtc aggagattgc caactactta 12 0gcctggtatC agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatga tacatacact 180ttgcagactg acgtcccacc gaggttcagc ggcagtggtt cggggacaga tttcactctc 240actatcagca gcctgcagcc tgaagataet gcaacttact tttgtcaaca ggctgacatt 300ttcccgctct ctttcggcgg agggaccaag Stggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360
<210> 191
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL (IiilO)<400> 191
ttctattctc acagtgoacatctgtagggg acacagtcacgcctggfeatc agcagaaaccttggaaagtg gggtcccatcactctcacca tcagcgacctcagactttcc cgctcaccttgcacca
<210> 192
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial· seguence
<220>
<223> VL (LiOl)<4 00> 192
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt CtCCâtCCtC cctgtctgca 60tctgtaggag acagagtcac catcacttgc caggcgagtc aggacattag caactattta 120aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatetacga tgcatccaat 180ttggaaacag gggtcccatc aaggttcagc ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 240accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt gcaacttact attgtcaaca ggctgacagg 300ttccctgcgg tcactttcgg cggagggacc aaggtggaga tcaaacgaac tgtggctgca 360cca 363
<210> 193
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial seguence<220>
<223> VL (LÍ07)
<400> 193
ttctattctc acagtgcaca gagcgaattg actcagccac cctcagtgtc cgtgtcccca 60ggacagacag ccatcatcac ctgctctgga gatcagttgg gtgacaaaca tgtggcttgg 12 0tatcaacaga agccaggcca gtcccctgtg ctggtcatct atctagacat taagaggccc 180gcagggattt ctgagcgatt ctctggctcc aactctggaa atacagccac tctgaccatc 240agaggsaccc aggctatgga tgaagctgac tattactgtc aggcgtggga catcaagacg 300
agacatccag atgacccagt ctccatcttc catgtctgct 60catcacttgt cgggcgagtc agggtattgg caactggtta .120agggaaagcc ccaactctcc tgatctatgc tgcatccagt 180aaggttcacc ggcagcggca gttcctctgg gatagatttc 240gcaccctgaa gatttggcaa cttactattg tcaacaggct 300cggcggaggg accagggtgg acctcaagcg aactgtggct 360 366gtcttcggcg gggggaccaa gctgaccgtc ctgagtcagc ccaaggctgc cccc 354<210> <211> <212> <213> 194 360 DNA Artificial sequence <220> <223> VL (Li03) <400> 194 ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgàcccagt ctccatcctc cctgtctgca 60tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc agagcattag cagctattta 120aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt 180ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 240accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt 300accccgtgga cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca aacgaactgt ggctgcacca 360
<210> 195<211> 10<212> PRT
<213> Artificial sequence<22 0>
<223> VH-CDRl (Lia.01)<400> 195
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly15 10
<210> 196<211> 17<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (Lia.01)<400> 196
Ile Ile Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15
Gly
<210> 197<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.01)<400> 197
Ala Glu Phe Tyr Trp Gly Ala Tyr Asp Gly1 5 10
<210> 198<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDRl (Lia.02)<400> 198
Gly Gly Ser Ile Arg Gly Asn Tyr Trp Ser15 io
<210> 199<:211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (Lia.02)c400> 199
Ser Ile Asn Tyr Ser Gly Plie Thr Asrv Pro Ser Leu Lys Gly3. 5 10
<210> 200<211> 8<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> ■ VH-CDB3 (MLa.02)<400> 200
Val Arg His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 201
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (Lia.03)<400> 201
Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Phe Asp Met His
1 5<210> 202<211> 17<212 > PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (Lia.03)<400> 202
Trp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1 5 10 15
<210> 203<211> 13<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.03)<400> 203
Asp Phe Tyr Met Asp Gly His Tyr Tyr lie Phe Asp Val15 10
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence«;220>
<223> VH-CDRl (Lia.04)
<400> 204
Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 205<211> 17<212 > PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 {Lia.04)<400> 205Ile Ile Asp Pro Gly Asp Ser Phe Thr Ser Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15
Gly
<210> 206
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.04)
<4 00> 206
Asp Leu Ala Trp Xle Asp Tyr Gly Phe Asp Tyr1 5 10
<210> 207
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223 > VH-CDRl (Lia.05)
<400> 207
Gly Phe Thr Phe Thr Ser His Thr Val Ser
1 5 10
<210> 208<211> 17<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 {Lia.05)<400> 208
Ser Ile Thr Gly Asn Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 209
<211> 7
<212* PRT
<213 > Artificial sequence<220><223> VH-CDR3 (Lia.05)<400> 209
Phe Tyr Gly Asp Phe Asp Ser
1 5
<210> 210<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-GDRl (Lia.06)<4 00> 210
GXy Phe Thr Phe Ser Ser Asn Trp Met Ser1.5 10
<210> 211<211> 17<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (Lia.06)<400=· 211
Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 212
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.06)
<400> 212
Asp Leu Pro Met Lys Gly Phe Ile Gln Gln Arg Tyr Gly Phe Asp Asp1 5 10 15
Val
<210> 213<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (Lia.07)<400> 213
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Ile Ser1 5 10
<210> 214
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.07)
<400> 214
Thr Ile Trp Gly Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 215
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.07)
<400> 215
Glu Tyr Trp Tyr Tyr Asp Gln Phe Thr Ala Val1 5 10
<210> 216<211> 12<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDRl (Lia.08)<400> 216Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 1 5<210> 217<211> 18<212> PRT<213> Artificial sequence
10<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.08}<400> 217
Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val1 5 10 15
Lys Ser
<210> 218<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence<22 0> < 2 2 3 > VH-CDR3 (Lia.08)<400> 218Glu Val Tyr Ser Ala Gly Ile 1 5<210> 219<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDRl (Lia.09)<400> 219
10
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn His Tarp Ile Gly1 5 10
<210> 220
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.09)
<400> 220
Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 221<211> 11<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (Lia,OS)<400> 221
Gly Phe Tyr Gly Xle Ala Asp Thr Phe Asp Val15 10
<210> 222<211> 10<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (Lia.10)<400=- 222
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Xle Ala15 10
<210> 223<211> 17<212> PRT<213> Artificial seguence<220> <223 > VH-CDR2 (Lia.10)<400> 223
Met Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asn Thr Aen Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15
Gly
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.10)
<400> 224
Thr Asn Tyr Leu Gly Phe Tyr Asp Ser1 5
<210> 225<211> 10<212> PRT
<213> Artificial seguence<220>
<223> VH-CDRl (Lia.11)
<40 Q> 225
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Ile Ser
1 5 10
<210> 226
<211> 17
<212> PRT
<213:» Artificial seguence<22 0>
<223> VH-CDR2 (1,1a. 11)'
<400> 226
Asn Ile Leu Tyr Asp Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 3.5
Gly
<210> 227<211> 11<212> PRT<213> Artificial seguence<220> <223> VH-CDR3 (Lia.11)<400> 227
Gly Tyr Pro Thr Asp Asp Tyr Ser Phe Asp Ile1 5 10
<210> 228<211> 12<212> PRT<213> Artificial seguence<22 0> <223> VH-CDRl (Lia.12)<400> 228
Gly Asp Ser Val Ser Asp Asn Ser Ala Ala Trp Gly1 5 10
<210><2ll><212>
229
18
PRT<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.12)<400> 229
Arg Ile Tyx Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Aep Tyr Ala Val Ser Val1 5 10 15
Lys Ser
<210> 230
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.12)
<400> 230
Gly Arg His Glu Tyr Gly Gly Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Met Asp His
1 5 10 15
<210> 231<211> 10<212> PRT<213 > Artificial sequence<220> <223 > VH-CDRl (Lia.13)<400> 231
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser15 10
<210> 232<211> 17<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (Lia.13)<400> 232
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys15 10 15
Gly<210> 233<211> 10<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<22 3 > VH-CDR3 {Lia.13)<400> 233
His Tyr Thr Tyr Met His Phe Glu Asp Tyr1 5 10
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VI.-CDR1 (Lia. 01)
<400> 234
Ser Qly Asp Ser Leu Pro Ser Lys Phe Val His
1 5 10
<210> 235<211> 7<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <22 3 > VL-CDR2 {Lia.01)<40 0> 235
Arg Asp Asn Asn Arg Pro Ser1 S-
<210> 23 S<211> 8<212> PRT<213 > Artificial sequence<220> <223> VL-CDR3 (Lia.01)
<400> 236
Ser Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Asp1 5
<210> 237
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
sequence<220>
<223> VXi-CDRl (Lia, 02)<400> 237
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Asn Ser Tyr Leu Gly1 5 10
<210> 238
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.02)
<400> 238
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5
<210> 239
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.02)
<400> 239
Gln Gln Ala Ser Asp Ala Pro Glu1 S
<210> 240<211> 11<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (Lia.03)<400> 240
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Phe Trp Leu Asn15 10
<210> 241<211> 7<212 > PRT<213> Artificial sequence<22 0> <223> VL-CDR2 (Lia-03)<400> 241AIa Gly Ser Asn Leu Gln Ser1 5
<210> 242
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence<22 0>
<223> VL-CDR3 {Lia.03)
<400:> 242
Mefc Gln Asp Ser Asp Phe Pro Phe
1 5<210> 243<211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (Lia.04)<4 00> 243
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val Ser1 5 10
<210> 244
<211> 7
<212 > PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.04)
<400> 244
Arg Asn Asn Aen Arg Pro Ser1 5
<210> 245
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.04)
<400> 245
Gln Thr Tyr Asp Asn Ser Thr Asp1 5
<210> 246<211> 11
<212> PRT
<213 > Artificial sequen.ce<220>
<223> VL-CDRl (Lia.05)
<400> 246
Ser Gly Asp Asn Ile Arg Ser Tyr Tyr Val His1 5 10
<210> 247
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 (1,1a. 05)
<400> 247
Glu Asp Ser Asn Arg Pro Ser1 5
<210> 248<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VI»-CDR3 (Lia. 05)<400> 248Gln Ser Tyr Asp Ser Ala Ile 1 5<210> 249<211> 16<212 > PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (Lia.06)<400> 249
10
Arg Ser Ser GXa Ser Leu Val Leu Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn1 S ίο 15
<210> 250
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220><223> VL-CDR2 (Lla.OS)<400> 250
Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser1 5
<210> 251
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 {Lia.OS)
<400> 251
Gln Gln Tyr Tyr Gly Met Pro Leu1 5
<2105- 252
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence<22 0>
<223> VL-CDRl (Lia.07)
<4 00> 252
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala3- 5 10
<210> 253
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.07)
<400> 253
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5
<210> 254<211> 8<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDR3 (Lia.07)<400> 254
Gln Gln Tyr Gly Ser Val Pro Arg1 5
<21Q> 255<211> 11<212> PRT<213> Artificial sequence<22 0> <223 > VL-CDRl (Lia. 08)<400> 255
Ser Gly Aep Ser Leu Gly Ser Tyr Tyr Val His15 10
<210> 256
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VXi-CDR2 (Lia.08)
<4 00> 2S6
Asp Asp Asn Asp Arg Pro Serl 5
<210> 257<211> 9<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223 > VL-CDR3 (Lia.08)<400> 257
Ser Ala Tyr Asp Tyr Ser Ala Arg Thr1 5
<210> 258<211> 11<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (Lia.09)<400> 258
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Lys Tyr Val Ser1 5 10
<210> 259<211> 7<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220> <223> VL-CDR2 (Lia, 09)<400> 259 Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser1 B <210> 260 <211> 10 <212> PRT <213 > Artificial sequence <22 0> <223> VL-CDR3 (Lia. 09)<400> 260 Ser Ser Tyr Asp Phe Leu Asn1 S <210> 261 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223 > VL-CDRl {Lia. 10)<400> 261
10
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Lys Lys Ser Val His1 S 10
<210> 262<211> 7<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDR2 (Lia.10)<400> 262Glu Asp Ser Glu Arg Pro Ser 1 S<210> 263<211> S<212> PRT<213> Artificial sequence
<22 0><223 >
VL-CDR3 (Lia.10)<400> 263
Ser Ser Tyx Thr Asn Ser Val Asp1 S
<210> 264<211> 11<212> PRT<213> Artificial seqyence<220> <223> VL-CDRl (Lia.11)<400> 264
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Tyr Val Gly1 5 10
<210> 265<211> 7<212> PRT<213> Artificial seguence<220> <223> VL-CDR2 (Lia.11)<400> 265
Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser1 5
<210> 266<211> e<212> PRT<213> Artificial seguence<220> <223> VL-CDR3 (Lia.11)<400> 266
Gln Ser Tyr Asp Asp Thr Ser Ile1 5
<210> 267<211> 11<212> PRT<213 > Artificial seguence<220> <223> VL-CDRl (Lia.12)<400> 267
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Asn Lys Tyr Val His15 io<210> 268<211> 7<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223 > VL-CDR2 (Lia.12)<400> 268
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser1 5
<210> 269<211> 8<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDR3 (Lia.12)<400> 269
Gln Thr Trp Asp Tyr Val Gly Tyr1 5
<210> 270<211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (Lia.13)<4Q0> 270
Thr Glv Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val1 5 10
<210> 271
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223 > VL-CDR2 (Lia.13)
<400> 271
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser1 5
<210> 272<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 <Lla.l3)<400> 272
Gln Ser Tyr Asp Arg Tyr Arg Leu Lys Asn1 5 10
<210> 273<211> 119<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> LÍ02 (VL)<400> 273
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val15 10 15
Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys20 25 30
Leu Gly Asp Lye Phe Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser35 40 45
Pro Val Leu Val Ile Phe Gln Asp Arg Lys Arg Leu Ser Gly Ile ProSO 55 €0
Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile65 70 75 80
Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp85 90 95
Asp Thr Asn Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro115
<210> 274
<211> 120
< 212 > PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223 > LÍ09 (VL)<400> 274
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser1 5 10 15
Ser Leu Ser Ala Phe Val Gly Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala20 25 30
Ser Gln Ser Ile Asp Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Glu Asp Gly50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Thr Leuss 70 75 80
Thx Ile Arg Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln85 90 95
Gln Ser Tyr Ser Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu100 105 HO
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
<210> 275
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> LÍ06 (VL)
<400> 275
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser1 5 10 15
Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala20 25 30
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly35 40 45
Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Arg Thr Gly50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu85 90 95
Qln Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro115 120
<210> 276
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> Li05 (VL)
<400> 276
Phe Tytr Ser His Ser Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val
1 5 10 15
Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Asp Asn20 25 30
Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala35 40 45
Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Tyr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro50 55 60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Ile Leu Thr Ile65 70 75 80
Thr Arg Val Glu Val Gly Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Gln Val Arg85 90 95
Asp Ser Arg Thr Glu Glu Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr100 105 110
Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro115 120
<210> 277
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> LÍ08 (VL)<400> 277
Phe Tyr Ser Híb Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser1 5 10 15
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala20 25 30
Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys .Pro Gly35 40 45
Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Asp Val Ser Asn Leu Gln Thr Gly50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln85 90 95
Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu100 , 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro115 120
<210> 278<211> 120<212> PRT<213> Artificial<220> <223> Lill (VL)<400> 278
Phe Tyr Ser Hxs Seir Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser1 5 10 15
Ser Val Ser Ala Pro Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala20 25 30
Ser Gln Glu Ile Ala Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Tyr Thr Leu Gln Thr AspVal Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln85 90 95
Gln Ala Asp Ile Phe Pro Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro115 120
279122PRT
Artificial sequence<22 0>
<223> LilO (VL)<4 00> 279
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser15 10 15
<210><211><212><213>
Ser Met Ser Ala Ser Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala20 25 30
Ser Gln Gly Ile Gly Asn Trp Leu Ala Trp Tyx Gln Gln Lys Pro Gly35 40 45
Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ile Asp Phe65 70 75 80
Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu His Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr85 90 95
Cys Gln Gln Ala Gln Thr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg100 105 lio
Val Asp Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro115 120<210> 280<211> 121<212> PHT<213> Artificial<220> <223> LiOl (VL)<400> 280
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser1 S 10 15
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ABp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala20 25 30
Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Aep Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln85 90 95
Gln Ala Asp Arg Phe Pro Ala Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val100 105 110
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro115 120
<210> 281<2ii> lie
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> Li07 <VL)<400> 281
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val15 10 15
Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ile Ile Thr Cys Ser Gly Asp Gln20 25 30
Leu Gly Asp Lys His Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
Pro Val Leu Val Ile Tyr Leu Asp Ile Lys Arg Pro Ala Gly Ile Ser50 55 60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp85 90 95
Asp Ile Lys Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro115
<210> 282<211> 120<212> PRT<213> Ii χ £ α c â -L<220> <223> L103 (VL)<400> 282
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser1 5 10 15
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala20 25 30
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln85 90 95
Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu100 105 110Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro115 120
<210> 283
<211> 106
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 283
Gln lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 ' 30
His Trp Tyr Gln Gln Lye Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 .40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210> 284
<211> 108
<212 > PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 284
Aep Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Pro Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Phe Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ala Ile Pro Tyr85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 285<211> 114<212> PRT
<2!3> Murinae gen. sp.<4 00> 285
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 SO
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Itr Asp Phe Thr Leu ThrS5 70 75 80
Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu100 105 110
Ile Arg
<210> 286
<211> 114
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 286
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30
Gly Asn Glri Lys Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80
Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu100 105 110
Ile Arg
<210> 287
<211> 5
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISÇJFEATÜRE
<222> (3)..(5)
<223> Xaa is lys, arg, bis, glu, or asp.
<400> 287
Ile Thr Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 288
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATÜRE
<222> (3)..(5)
<223> Xaa is lys, arg, his, glu, or asp.
<400> 288
Ala Cys Xaa Xaa Xaa<210> 289
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE
<222> (3)..(S)
< 2 2 3 > Xaa is lys, arg, bis, glu, or asp
<400> 289
Val Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 290
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(5)
<223> Xaa is lys, arg, bds, glu, or asp
<400> 290
Ser Pro Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 291
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 291
Ser Pro Arg Lys His1 5
<210> 292
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 292
Ser Pro Arg Lys Lys1 5
<210> 293<211> 5<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 293
Ser Pro Arg Lys Arg1 5
<210> 294
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 294
Ser Pro Lys Lys His1 5
<210> 295 <211> 5 <212> PRT <213> Hotno sapiens<400> 295 Ser Pro His Lys His1 5<210> 296 ί211> 5 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 296
Ser Pro Arg Arg His1 S
<210> 297
<211> S
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 297
Ser Pro Arg His His1 S
<210> 298
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 298
Ser Pro Arg Arg Arg1 5
<210> 299
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 299
Ser Pro His His His1 5
<210> 300
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 300
Ser Pro Ijys Lys Lys1 5
<210> 301
<211? 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 301
Leu Ser Pro Arg Lys His1 5
<210> 302<211> 6<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 302
Leu Ser Pro Arg Lys Lys1 5
3036
PRT
Homo sapiens<400> 303
Leu Ser Pro Arg Lys Arg1 5
<210><211><212><213>
<210><211><212>
3046
PRT<213> Homo sapiens
<400> 304
Leu Ser Pro Lys Lys His1 5
<210> 305
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 305
Leu Ser Pro His Lys His1 5
<210> 306
<211> 6
<212> PRT
<213> Horao sapiens
<400> 306
Leu Ser Pro Arg Arg His1 5
<210> 307
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 307
Leu Ser Pro Arg His His
α 5
<210> 30β
<211> δ
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 308
Leu Ser Pro Arg Arg Arg1 5
<210> 309
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 309
Leu Ser Pro His His His1 5<210> 310<211> 6<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 310
Leu Ser Pro Lys Lys Lys1 5
<210> 311
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 311
Trp Leu Ser Pro Arg Lys His1 S
<210> 312
<211> 7
<212> PRT
<213? Homo sapiens
<400> 312
Trp Leu Ser Pro Arg Lys Lys1 5
<210> 313
<211> 7
<212> PRT
<213> HottKS sapiens
<400> 313
Trp Leu Ser Pro Arg Lys Arg1 5
<210> 314
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 314
Trp Leu Ser1
Lys Lys His5
Pro
<210> 315
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 315
Trp Leu Ser Pro His Lys His1 S
<210> 316<211> 7<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 316
Trp Leu Ser Pro Arg Arg His1 5
<210> 317
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo Bapiens
<400> 317
Trp Leu Ser Pro Arg His Hie1 5
<210> 318
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 318
Trp Leu Ser Pro Arg Arg Arg1 5
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo eapiens
<400> 319
Trp Leu Ser Pro His His His1 5
<210> 320
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 320
Trp Leu Ser Pro Lys Lys Lys1 5<210> 321
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 321
Ile Thr Pro Lye Arg Arg1 5
<210> 322
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 322
Ala Cys His His Lys1 5
<210> 323
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 323
Val Cys His Hie Lys1 S
<210> 324
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATÜRE
<222> (1)..(2)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 324
Xaa Xaa Arg Lys His1 5
<210> 325
<211> S
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURB
<222> (1) , . {2}
<223> Xaa is any amino acid<400> 325
Xaa Xaa Arg Arg Arg1 5
<210> 326
<211> S
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1) . . {2}
<223> Xaa Í8 any amino acid.
<400s· 326
Xaa Xaa Lys Lys Lys
1 5
<210> 327
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATÜRE
<222> <1)..(2)
<223> Xaa is any amino acid.
<400> 327
Xaa Xaa His His His
1 5
<210> 328
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISCJPEATURE
<222> (1).. (2)
<223> Xaa is any amino acid.
<400> 328
Xaa Xaa Arg Lys Lys
1 5
<210> 329<211> S<212> PRT<213>
Homo sapiens
<220>
<22Χ> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 329
Xaa Xaa Arg Lys Arg
1 5
<210> 330
<211> 5
<212> PRT
<2X3> Homo sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE
<222> (1)··(2)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 330
Xaa Xaa Lys Lys His
1 5
<210> 331
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISCJPEATURE
<222> (X)..(2)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 33 X
Xaa Xaa His LyB His
1 5
<210> 332
<2XX> 5
<212> PRT
<2X3> Homo sapiens
<22 0>
<221> MIS C_FE ATURE
<222> (1)..(2)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 332Xaa Xaa Arg Arg His1 5
<210> 333
<211> 5
<212> PRT
<213 > Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_PEATURE
<222> (1)..(2)
<223> Xaa 1ε any amino acid.
<400> 333
Xaa Xaa Arg His His
1 5
<210> 334
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MIS C__P EATURE<222> (3).. (3)
<223> Xaa XB lys, arg, his, glu, or asp.<220>
<221> MXSC FEATURE
<222> (4).7(4)
<223> Xaa ±B any amino acid.
<220>
<22X> MISC_FEATURE
<222> (5).,(5)
<223> Xaa is lys, arg, his, glu, or asp.
<400> 334
Ile Thr Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 335
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is lys, arg, his, glu, or asp.<220>
<22X> MIS C_FEATURB<222> (4)..(4)
<223> Xaa is any amino acid.
<220>
<221> MISC_FEATÜRE
<222> (5).,(5)
<223> Xaa is IyB, arg, his, glu, or asp.
<400> 335
Ala Cys Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 336
<211> 5
<212> PRT
<213> Horao sapiens
<220>
<221> MXSC_FEATURE
<222> {3}.. (3)
<223> Xaa is Iys, arg, his, glu, or asp.<220>
<221> MIS C_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is any amino acid.
<220>
<221> MIS C_FEATURE
<222> (5).. (5)
<223> Xaa is Iys, arg, his, glu, or asp.
<400> 336
Val Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 337
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3).. (3)
<223> Xaa is Iys, arg, his, glu, or asp<220>
<221> MIS C_FEATUR E
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is any amino acid.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> <5).,(5)
<223> Xaa is Iys, arg, his, glu, or asp.<400> 337
Ser Pro Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 338
<211> 5
<212> PRT
<213 > Homo sapiens
<400> 338
Ser Pro Arg Leu His1 S
<210> 339
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 339
Arg Arg Ala Arg Xle Arg Asp Arg Lys1 S
<210> 340
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 340
Lys Lys Val Lys Val Lys Glu Lys Arg1 S
<210> 341
<211> 9
<212> PRT
<213 > Homo sapiens
<400> 341
Arg Arg Leu Arg Leu Arg Asp Arg Lys15
<210> 342<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 342
Arg Arg Gly Arg Gly Arg Asp Arg Lys1 5<210> 343
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 343
Arg Arg Ile Arg Ala Arg Asp Arg Lys1 5
<210> 344<211> 19<212> DNA<213> Artificial sequence<220> <223> RT-PCR Primer<400> 344agagacatgc gattggtga <210> 345<211> 21<212> DHA<213> Artificial sequence<220> <223> RT-PCR primer<400> 345agagatgtag acgaggtcat t <210> 346<211> 55<212> DNA<213> Artificial sequence<220> <223> LV1-036 {eenee oligo)<400> 346tgatcgtcat cctgctagac ttcaagagag
19
21
BS
<210> 347
<211> 59
<212> DNA
<2Χ3> Artificial sequence<220>
<223 > LV1-036 (antisense oligo)
<400> 347
tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tctagcagga tgacgatca 59
<210> 348<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> Oligonucleotide
<400> 348
tgatcctcat ccttctatãc ttcaagagag tgtagcagga tgacgatctt ttttctcga 59
<210> 349<211> 59<212> DNA<213> Artificial sequence<220> <223> Oligonucleotide<400> 349
tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tatagaagga tgacgatca 59
<210> 350
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR Primer
<400> 350
gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g 41
<210> 351
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> PCR Primer
<400> 351
ggggcggaat tggatcctca cagatcctct tctgagatga g
41
<210> 352
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial eeguence<220>
<223> PCR primer
<400> 352
gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g
41
<210> 353<211> 42<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> PCR primer<400> 353
gatacggatc ctcagccttt gccccggctc catagaaaca gc 42
<210> 354
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> PCR primer
<400> 354
cagcaggtcg aegcggccgc atgctggcgg ggggcgt
37
<210> 355<211> 59<212> DNA<213> Artificial<220> <223> PCR primer<400> 355
cagcaggtcg acctcgcccg gctggttggc caaccagccg ggcgaggtcg acctcgagg
59
<210> 356<211> 39<212> DNA<213> Artificial<22 0> <223> PCR primer<400> 356
ggggatatcc accatggatt ttcaggtgca gattttcag
39
<210> 357
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> PCR primer<220>
<22l> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> R is A Or Q.
<220>
<221> misc feature<222 > (25) . . (25)
<223 > K is G or Τ.
<220>
<22ι> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Y is C Or Τ.
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> Y is C or Τ.
<220>
<221> misc_feafcüre
<222> (38)..(38)
<223> R is A or G.
<400> 357
ggggatatcc accatgragt cacakacyca ggtcttyrta
<210> 358
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> PCR primer
<400> 358
ggggatatcc accatgaagt tgcctgttag gctgttg
<210> 359
<211> 40
<212 > DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> PCR primer<220>
<221> raisc_feature
<222> (20)..(20)
<223> K is G or T.
<220>
<221> raisc_featuxe
<222> (25) .. (25)
<223> W is A or T.
<220>
<221> misc_feature
<222> (32).. (32)
<223 > Y is C or T.
<220>
<221> misc_feature
<222> (34),.(34)
<223> Y is C or T.<220>
<221> misc_feature
<222> (37).. (37)
<223> K is G or Τ.
<400> 359
ggggatatcc accatgaggk ccccwgctca gytyctkgga
<210> 360
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial seguence<220>
<223> PCR primer<220>
<22l> miec_£eature
<222> (18)..(18)
<223> R is A or G.
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)7.(28)
<223> K is G or T.
<220>
<221> misc_feature
<222> (31) . . (31) -
<223> M is A or C.
<400> 360
ggggatatcc accatggrat gsagctgkgt matsctctt
<210> 361
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> PCR primer<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> R is A or G.
<220>
<221> misc_feature
<222 > (26) ..(26)
<223> Y is C or T.
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> K is G or T.
<400> 361ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt 39
<210> 362<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer<400> 362
ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct
38
<210><211><212>
363
39
DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> PCR primer
<220><221><222><223>
misc_feature(11) · . (H)Y is C or T.
<220>«221><222><223>
misc_feature(25)..(26)R is A or G.
<400> 363
aggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac
39
<210> 364
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> Primer FRl
<220>
<221> misc_feature
<222> (S).. (5)
<223> S is C or G.
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> M is A or C.
<220>
<221> raisc_feature
<222> (8).. (8)
<223> R is A or G.<220>
<22l> misc_feature
<222> (15).. (15)
<223> S is C or G.
<220>
<22l> miec_feature
<222> (20)..(20)
<223> W is A Or Τ.
<400> 364
aggtemarct gcagsagtcw gg
<210> 365
<211> 34
<212> DKA
<213> Artificial Beguence<220>
<223> Primer FR4
<400> 365
tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag
34
<210> 366
<211> 27
<212> DNA
<2X3> Artificial eequence<220>
<223> PCR Primer
<220>
<221> «tisc_£eature
<222> (6),.(6)
<223> R is A or G.
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223 > Y is C or T.
<220>
<22l> misc_feature
<222 > (12).. (12)
<223> Y is C or T.
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> H is Ai C, or T.
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> H is A, G, C, or T.
<220><221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> w ib α, g, c, or τ.
<220>
<221> misc_feature
<222> (27),.(27)
<223> Y is C or Τ.
<400> 366
atggartgya aytggathct nccntty
27
<210> 367
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> PCR primer
<220><221><222><223 >
misc_feature(11)..(11)Y is C or Τ.
<220><221><222><223>
misc_feature(25)..(26)R is A or Q.
<400> 367
aggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac
39
<210> 368<211> 66<212> DNA
<213> Artificial seguence<220>
<223> PCR primer<400> 368
ggggtatctc tcgagaaaag agagcatcat catcatcatc atatgggaca gttcagagtg 60ataggg 66
<210> 369
<211><212>
40DNA
<213> Artificial seguence<220>
<223> PCR primer
<400> 369
ttcgcggccg ctattagcca gggttgatcc agtagaaggg
40<210> 370
<211> 354
<212> DHA
<213> Artificial sequence<220>
<223> LÍ13 (VH)
<400> 370
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt ettgttcagc ctggtggttc tttacgtctt SOtcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacgaga tgtattgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atcgtttctt ctggtggctt tactaagtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagggt 300gataatgatg cttttgatat ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc aagc 354
<210> 371
<211> 324
<212> DHA
<2Χ3> Artificial sequence<220>
<223> LÍ13 (VL·)
<400> 371
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctea ccatcagcag cctagagcct 240gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatgta cacttttggc 300caggggacca agctggagat caaa 324
<210> 372<211> 118<212> PRT<213> Artificial<220> <223> LÍ13 (VH)<400> 372
Glu Val Gln Leu Leu GXu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Plie Thr Phe Ser His Tyr20 25 30Glu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Arg Ile Val Ser Ser Gly Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asa Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Aan Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Thr Glu Gly Asp Asn ABp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr100 105 lio
Thr Val Thr Val Ser Ser115
<210> 373
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> LÍ13 (VL)
<400> 373
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tytr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Met85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210> 374
<211> 354
<212> DHA
<213> Artificial sequence<220>
<223> LI32 (VH)
<400> 374
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacatga tgcagtgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggcaa tactaagtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggagat 300tatggatact ggttcgaccc ctggggccag ggeaccctgg tcaccgtctc aagc 354
<210> 375<211> 321<212> DKA
<213> Artificial sequence<220>
<223> LÍ32 (VL)<400> 375
gacatccaga tgacccagtc tccagaetcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60atcacttgcc aggcgagtca agacattagc tactatttaa attggtatca gcagaaacca 120gggatggcec ctaaactcct catctacgat gccttcattt tggaaggagg ggccccatca 180cggttcagtg ggagcggctc tgggacagat ttttotttca ccatcagcaa tctacagcct 240gaggatattg caacttattt ctgtcaacag totgatcaac tgcccgtgac cttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcag a 321
<210> 376<211> 118<212> PRT<213> Artificial<220> <223> Li32 (VH)<400> 376
Glu Val Qln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr20 25 30
Met Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Xle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Trp Phe Asp Pro Tip Gly Gln Gly Thr100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 377<211> 107<212> PRT
<213> Ajrfclf iClâl Se(JU6HC6<220>
<223> LÍ32 (VL)<400> 377
Asp Ile Gln Mefc Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Met Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Phe Ile Leu Glu Gly Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Gln Leu Pro Val85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg100 105
<210> 378<211> 357<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> Li33 (VH)<4Ο0> 378
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atttacccta tgttttgggt tcgccaagct 12 0cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atcggtcctt ctggtggcat tactaagtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 24 0fctgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccacat attactgtgc gagagagggg 300cataacgact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcaagc 3 57
<210> 379<211> 321<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> Li33 (VL)<400> 379
gaoatccaga tgacccagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240gaggattttg cagtttatta ctgtcagcag tatgataagt ggccgctcac tttcggcgga 300gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 380
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220 >
<223> LÍ33 (VH)
<400> 380
Glu Val Glri Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr20 25 30
Pro Met Phe Trp Val Árg Gln Ala Pro Gly Lye Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Aan Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Glu Gly His Asn Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 381<211> 107<212> PRT<213> Artificial<220> <223> Li33 (VL)<400> 381
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Leu85 90 95
Thr Phe Gly Sly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lye100 105
<210> 382<211> 357<212> DHA
<213> Artificial sequence<220>
<223> LÍ34 (VH)<400> 382
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgetg cttccggatt cactttctct aattacgaga tgtattgggt tcgccaagct X20cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctattctt ctggtggcat tactgtttat 180gctgactccg. ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc tagggcagcc 300atcctcgact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcaagc 357
<210> 383<211> 321<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> Li 34 (VB)<400> 383
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc atgcgagtca ggacattagc aactatttaa gttggtatca gcagaaacca 120ggtaaagccc ctaaactcct gatctacgat gctttcaatt tggagacagg agtcccatcg 180aggttcagtg gaagtggatc tggcacagat tttacattca ccatcagcag cctgcagcct 240gaagattttg caacatatta ctgtcagcac tatgataatc tcccattcac tttcggccct 300gggaccagag tggcgatcag a 321
<210> 384
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> LÍ34 (VH)
<400> 384Olu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Glu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Xle Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lye Asn Thx Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Ala Ala Ile Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 385
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> Li 34 (VL)
<400> 385
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro1 5
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Phe Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe AIa Tlir Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Val Ala Ile Arg100 105
<210> 386<211> 11<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> Vlt-CDRl (Lil3)<400> 386
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10
<210> 387
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<22Q>
<223 > Vti-CDR2 (Lil3)<400> 387
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
<210> 388
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ13)
<400> 388
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Met Tyr Thr1 5 10
<210> 389
<211> S
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl {LÍ13)
<400> 389Hls Tyr Glu Met Tyr1 5
<210> 390
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ13)
<400> 390
Arg Ile Val Ser Ser Gly Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 391
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ13)
<400> 391
Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Xle1 5
<210> 392
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VXi-CDRl (LÍ32)
<400> 392
Gln Ala Ser Qln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn
1 5 10 -
3937
PRT
Artificial sequence<220>
<223> VL-C0R2 (LÍ32)
<210><211><212><213>
<400> 393
Asp Ala Phe Ile Leu Glu Gly1 5
<210> 394<211> 9<212> PRT<213> Artificial seguence<220> <223> VL-CDR3 <Li32)
<400> 394
Gln Gln Ser Asp Gln Leu Pro Val Thr1 5
<210> 395<211> 5
<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDRl (Li32)<400> 395Ala Tyr Met Met Gln 1 5<210> 396<211> 17<212> PRT<213 > Artificial seguence<220> <223> VH-CDR2 (LÍ32)<400> 396
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Trtxr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 io 15
Giy
<210s> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial seguence<220>
<223 > VH-C3DR3 (LÍ32)
<400 > 397
Gly Asp Tyr Gly Tyr Trp Phe Asp Pro1 5<210> 398<211> 11<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (Li33)<400> 398
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10
<210> 399
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ33)
<400> 399
Aap Ala Ser Asn Arg Ala Thr
<210> 400<211> 9<212> PRT<213 > Artificial sequence<22 0> 1<223> VL-CDR3 (Li33)<400> 400
Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Leu Thr1 5
<210> 401
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence<22 0>
<223> VH-CDRl (LÍ33)
<400> 401
Xle Tyr Pro Met Phe1 5
<210> 402<211> 17<212> PRT<213> Artificial sequence<220>
<223 > VH-CDR2 (LÍ33)<400> 402
Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 403<211> 10<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR3 (LÍ33)<400> 403Glu Gly His Asn Asp Trp Tyr 1 5<210> 404<211> 11<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDRl (LÍ34)<400> 404
His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser1 5 10
<210> 405<211> 7<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VL-CDR2 (LÍ34)<400> 405
Asp Ala Phe Asn Leu Glu Thr1 5
<210> 406
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ34)<400> 406
Gln His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe Tlir
<210> 407
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDRl (LÍ34)
<400> 407
Asn Tyr Glu Met Tyr
<210> 408<211> 17<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> VH-CDR2 (Li34)<400> 408
Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 409
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence<220>
<223> VH-CDR3 (I»i34)
<400> 409
Ala Ala Ile Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu1 5 10LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Biogen IDEC MA, Inc.SHA, Mi
PEPINSKY, R. BlakeSHAO, Zhaohui
<120> "ANTICORPOS SP35 E USO DOS MESMOS"
<130> 2159.036PC02<150> 60/697,336<151> 08-07-2005<150> 60/771,900<151> 10-02-2006<150> 60/814,522<151> 19-06-2006<160> 409<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1<211> 1845<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 1
atgctggcgg ggggcgtgag gagcatgccc agccccctcc tggcctgctg gcagcccatc 60ctcctgctgg tgctgggctc agtgctgtca ggctcggcca cgggctgccc gccccgctgc 120
gagtgctccg cccaggaccg cgctgtgctg tgccaccgca agcgctttgt ggcagtcccc 180
gagggcatcc ccaccgagac gcgcctgctg gacctaggca agaaccgcat caaaacgctc 240
aaccaggacg agttcgccag cttcccgcac ctggaggagc tggagctcaa cgagaacatc 300
gtgagcgccg tggagcccgg cgccttcaac aacctcttca acctccggac gctgggtctc 360
cgcagcaacc gcctgaagct catcccgcta ggcgtcttca ctggcctcag caacctgacc 420
aagctggaca tcagcgagaa caagattgtt atcctgctgg actacatgtt tcaggacctg 480
tacaacctca agtcactgga ggttggcgac aatgacctcg tctacatctc tcaccgcgcc 540
ttcagcggcc tcaacagcct ggagcagctg acgctggaga aatgcaacct gacctccatc 600
cccaccgagg cgctgtccca cctgcacggc ctcatcgtcc tgaggctccg gcacctcaac 660
atcaatgcca tccgggacta ctccttcaag aggctctacc gactcaaggt cttggagatc 720tcccactggc cctacttgga caccatgaca cccaactgcc tctacggcct caacctgacg 780tccctgtcca tcacacactg caatctgacc gctgtgccct acctggccgt ccgccaccta 840gtctatctcc gcttcctcaa cctctcctac aaccccatca gcaccattga gggctccatg 900ttgcatgagc tgctccggct gcaggagatc cagctggtgg gcgggcagct ggccgtggtg 960gagccctatg ccttccgcgg cctcaactac ctgcgcgtgc tcaatgtctc tggcaaccag 1020ctgaccacac tggaggaatc agtcttccac tcggtgggca acctggagac actcatcctg 1080gactccaacc cgctggcctg cgactgtcgg ctcctgtggg tgttccggcg ccgctggcgg 1140ctcaacttca accggcagca gcccacgtgc gccacgcccg agtttgtcca gggcaaggag 1200ttcaaggact tccctgatgt gctactgccc aactacttca cctgccgccg cgcccgcatc 1260cgggaccgca aggcccagca ggtgtttgtg gacgagggcc acacggtgca gtttgtgtgc 1320cgggccgatg gcgacccgcc gcccgccatc ctctggctct caccccgaaa gcacctggtc 1380tcagccaaga gcaatgggcg gctcacagtc ttccctgatg gcacgctgga ggtgcgctac 1440gcccaggtac aggacaacgg cacgtacctg tgcatcgcgg ccaacgcggg cggcaacgac 1500tccatgcccg cccacctgca tgtgcgcagc tactcgcccg actggcccca tcagcccaac 1560aagaccttcg ctttcatctc caaccagccg ggcgagggag aggccaacag cacccgcgcc 1620actgtgcctt tccccttcga catcaagacc ctcatcatcg ccaccaccat gggcttcatc 1680tctttcctgg gcgtcgtcct cttctgcctg gtgctgctgt ttctctggag ccggggcaag 1740ggcaacacaa agcacaacat cgagatcgag tatgtgcccc gaaagtcgga cgcaggcatc 1800agctccgccg acgcgccccg caagttcaac atgaagatga tatga 1845
<210> 2
<211> 614<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2
Met Leu Ala Gly Gly Val Arg Ser Met Pro Ser Pro Leu Leu Ala Cys1 5 10 15
Trp Gln Pro Ile Leu Leu Leu Val Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Ser
20 25 30
Ala Thr Gly Cys Pro Pro Arg Cys Glu Cys Ser Ala Gln Asp Arg Ala35 40 45
Val Leu Cys His Arg Lys Arg Phe Val Ala Val Pro Glu Gly Ile Pro50 55 60Thr Glu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Gly Lys Asn Arg Ile Lys Thr Leu65 70 75 80
Asn Gln Asp Glu Phe Ala Ser Phe Pro His Leu Glu Glu Leu Glu Leu
85 90 95
Asn Glu Asn Ile Val Ser Ala Val Glu Pro Gly Ala Phe Asn Asn Leu
100 105 110
Phe Asn Leu Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ser Asn Arg Leu Lys Leu Ile
115 120 125
Pro Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Ser Asn Leu Thr Lys Leu Asp Ile
130 135 140
Ser Glu Asn Lys Ile Val Ile Leu Leu Asp Tyr Met Phe Gln Asp Leu145 150 155 160
Tyr Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Gly Asp Asn Asp Leu Val Tyr I.le
165 170 175
Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu Asn Ser Leu Glu Gln Leu Thr Leu
180 185 190
Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ser Ile Pro Thr Glu Ala Leu Ser His Leu
195 200 205
His Gly Leu Ile Val Leu Arg Leu Arg His Leu Asn Ile Asn Ala Ile
210 215 220
Arg Asp Tyr Ser Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Leu Lys Val Leu Glu Ile
225 230 235 240
Ser His Trp Pro Tyr Leu Asp Thr Met Thr Pro Asn Cys Leu Tyr Gly
245 250 255
Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Ile Thr His Cys Asn Leu Thr Ala Val
260 265 270
Pro Tyr Leu Ala Val Arg His Leu Val Tyr Leu Arg Phe Leu Asn Leu
275 280 285
Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile Glu Gly Ser Met Leu His Glu Leu
290 295 300
Leu Arg Leu Gln Glu Ile Gln Leu Val Gly Gly Gln Leu Ala Val Val305 310 315 320Glu Pro Tyr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Tyr Leu Arg Val Leu Asn Val
325 330 335
Ser Gly Asn Gln Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser Val Phe His Ser Vai.
340 345 350
Gly Asn Leu Glu Thr Leu Ile Leu Asp Ser Asn Pro Leu Ala Cys Asp
355 360 365
Cys Arg Leu Leu Trp Val Phe Arg Arg Arg Trp Arg Leu Asn Phe Asn
370 375 380
Arg Gln Gln Pro Thr Cys Ala Thr Pro Glu Phe Val Gln Gly Lys Glu385 390 395 400
Phe Lys Asp Phe Pro Asp Val Leu Leu Pro Asn Tyr Phe Thr Cys Arg
405 410 415
Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys Ala Gln Gln Val Phe Val Asp Glu
420 425 430
Gly His Thr Val Gln Phe Val Cys Arg Ala Asp Gly Asp Pro Pro Pro
435 440 445
Ala Ile Leu Trp Leu Ser Pro Arg Lys His Leu Val Ser Ala Lys Ser
450 455 460
Asn Gly Arg Leu Thr Val Phe Pro Asp Gly Thr Leu Glu Val Arg Tyr465 470 475 480
Ala Gln Val Gln Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Cys Ile Ala Ala Asn Ala
485 490 495
Gly Gly Asn Asp Ser Met Pro Ala His Leu His Val Arg Ser Tyr Ser
500 505 510
Pro Asp Trp Pro His Gln Pro Asn Lys Thr Phe Ala Phe Ile Ser Asn
515 520 525
Gln Pro Gly Glu Gly Glu Ala Asn Ser Thr Arg Ala Thr Val Pro Phe
530 535 540
Pro Phe Asp Ile Lys Thr Leu Ile Ile Ala Thr Thr Met Gly Phe Ile
545 550 555 560
Ser Phe Leu Gly Val Val Leu Phe Cys Leu Val Leu Leu Phe Leu Trp565 570 575Ser Arg Gly Lys Gly Asn Thr Lys His Asn Ile Glu Ile Glu Tyr Val
580 585 590
Pro Arg Lys Ser Asp Ala Gly Ile Ser Ser Ala Asp Ala Pro Arg Lys595 600 605
Phe Asn Met Lys Met Ile610<210> 3<211> 6<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 3
Met Gln Val Ser Lys Arg1 5
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Murinae gen. sp.<400> 4
gcgtctagaa ctggatggtg ggagatgga 2 9
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LilO)
<400> 5
acttacccta tggtt 15
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> VH-CDRl (LilO)<400> 6
Thr Tyr Pro Met Val1 5
<210> 7
<211> 51<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LilO)<400> 7
tggatcggtc cttctggtgg cgttactgct tatgctgact ccgttaaaggt 51
<210> 8<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LilO)<400> 8
Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LilO)
<400> 9
ccctatagca gtggctggtg ggacttcgat ctc 33
<210> 10<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LilO)
<400> 10
Pro Tyr Ser Ser Gly Trp Trp Asp Phe Asp Leu1 5 10
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ07)
<400> 11
atgtacttta tgggt 15
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ07)
<400> 12
Met Tyr Phe Met Gly1 5
<210> 13
<211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ07)
<400> 13tctatctctc cttctggtgg ctttacttct tatgctgact ccgttaaagg t<210> 14<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ07)<400> 14
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val1 5 10 15
Gly
<210> 15<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ07)<400> 15
gatcggcatg cttttgatat c
<210> 16<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ07)<400> 16
Asp Arg His Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 17
<211> 14
<212> DNA<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CDRl (Li05)<400> 17cttacgctat gggt<210> 18<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ05)<400> 18
Ala Tyr Ala Met Gly1 5
<210> 19<211> 51<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Li05)<400> 19
tctatcgttt cttctggtgg ctatactgat tatgctgact ccgttaaagg t<210> 20<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Li05)<400> 20
Ser Ile Val Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ05)
<400> 21
gagggtgacc ataatgcttt tgatatc
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ05)
<400> 22
Glu Gly Asp His Asn Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lill)
<400> 23tcttacgcta tgtat
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lill)<400> 24
Ser Tyr Ala Met Tyr1 5
<210> 25<211> 51<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lill)<400> 25
tctatctcta cttctggtgg ctatactggt tatgctgact ccgttaaagg t<210> 26<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lill)<400> 26
Ser Ile Ser Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val1 5 10 15
Gly
<210> 27<211> 36<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lill)<400> 27
gataccagcg ataatgacta ctactacatg gacgtc<210> 28<211> 12<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lill)<400> 28
Asp Thr Ser Asp Asn Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Val
1 5 10
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LiOl)<400> 29aagtaccaga tgact
<210> 30<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LiOl)<400> 30
Lys Tyr Gln Met Thr1 5
<210> 31<211> 51<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LiOl)<400> 31
tctatctatc cttctggtgg caatactgtt tatgctgact ccgttaaagg<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CDR2 (LiOl)
<400> 32
Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LiOl)
<400> 33
gggactacag aggcagtctt tgactac
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LiOl)
<400> 34
Gly Thr Thr Glu Ala Val Phe Asp Tyr1 5
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ12)<400> 35cagtacaata tgttt<210> 36<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ12)<400> 36
Gln Tyr Asn Met Phe1 5
<210> 37<211> 51<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ12)<400> 37
cgtatctctt cttctggtgg catgactatg tatgctgact ccgttaaagg t<210> 38<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lil2)<400> 38
Arg Ile Ser Ser Ser Gly Gly Met Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly<210> 39<211> 69<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ12)<400> 39
gaagcgttac ggccttattg tagtggtggt agctgctact ccgactacta ctactacggt
atggacgtc
<210> 40
<211> 23
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CDR3 (Lil2)<400> 40
Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Asp Tyr1 5 10 15
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val20
<210> 41<211> 15<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Li06)<400> 41gagtacccta tggat<210> 42<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ06)
<400> 42
Glu Tyr Pro Met Asp
1 5
<210> 43
<211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ06)
<400> 43
tctatctatt cttctggtgg ctctactgtt tatgctgact ccattaaagg t
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Li06)
<400> 44
Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Ile Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Li06)
<400> 45
gagggtgact ctgatgcttt tgatatc<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ06)
<400> 46
Glu Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ08)
<400> 47cattacgaga tggtt
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Li O 8)
<400> 48
His Tyr Glu Met Val
1 5
<210> 49
<211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ08)<400> 49
tctatccgtt cttctggtgg cgctactaag tatgctgact ccgttaaaggt 51
<210> 50<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ08)<400> 50
Ser Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-C DR3 (LÍ08)
<400> 51
gagtcgccag acgactactt tgactac 27
<210> 52<211> 9<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ08)<400> 52
Glu Ser Pro Asp Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5
<210> 53<211> 15<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LiO 3)<400> 53cagtacccta tggag<210> 54<211> 5
<212> PRT · ·
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ03)<400> 54
Gln Tyr Pro Met Glu1 5
<210> 55<211> 51<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ03)<400> 55
ggtatctatc cttctggtgg ctctactgtt tatgctgact ccgttaaagg t<210> 56<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Li0(3)<400> 56
Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ03)
<400> 57
gcggggcagt ggctggggga ctttgactac
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ03)
<400> 58
Ala Gly Gln Trp Leu Gly Asp Phe Asp
1 5
<210> 59
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ09)
<400> 59atgtactcta tggtt
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> VH-CDRl (Li09)<400> 60
Met Tyr Ser Met Val1 5
<210> 61<211> 51<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ09)<400> 61
tatatctctc cttctggtgg caagactatg tatgctgact ccgttaaagg t<210> 62<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Li09)<400> 62
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 63<211> 69<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Li09)<400> 63
gattcgagac gccggtatta cgatttttgg agtggttatc acaactacta ctactactacatggacgtc<210> 64
<211> 23
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ09)<400> 64
Asp Ser Arg Arg Arg Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr His Asn Tyr1 5 10 15
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val20
<210> 65<211> 15<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ04)<400> 65
cgttacaata tgggt 15
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ04)
<400> 66
Arg Tyr Asn Met Gly1 5
<210> 67
<211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ04)<400> 67
gttatctatc cttctggtgg cggtactcat tatgctgact ccgttaaagg t<210> 68<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ04)<400> 68
Val Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Gly Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 69<211> 25<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Li04)<400> 69
tctatagcag atgatgcttt tgata<210> 70<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Li04)<400> 70
Ser Ile Ala Asp Asp Ala Phe Asp Ile1 5<210> 71
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ02)
<400> 71acttacgaga tgatt
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ02)
<400> 72
Thr Tyr Glu Met Ile
1 5
<210> 73
<211> 48
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ73)
<400> 73
tctatcggtc cttctggtgg ccttacttgg tatgctgact ccgttaaa
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Li02)
<400> 74Ser Ile Gly Pro Ser Gly Gly Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 75<211> 51<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Li02)<400> 75
atgtattact gtgtacggat tgatgatagt agtggttggg cttttgatat c 51
<210> 76<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ02)<400> 76
Met Tyr Tyr Cys Val Arg Ile Asp Asp Ser Ser Gly Trp Ala Phe Asp1 5 10 15
Ile
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 77
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 78
<211> 17<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 78
Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 79
Glu Gly Val His Phe Asp Tyr1 5
<210> 80
<211> 7<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 80Phe Ser Asp Ala Trp Leu Asp1 5
<210> 81<211> 19<212> PRT<213> Murinae gen. sp.<400> 81
Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 82
<211> 4<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 82
Ser Phe Ala Tyr
1
<210> 83
<211> 5
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<4 00> 83
Ser Ser Trp Thr Gln1 5
<210> 84<211> 17<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 84
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys1 5 10 15
Gly
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 85
His Asn Ser Tyr Gly Met Asp Tyr1 5
<210> 86
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LilO)<400> 86
cgggcgagtc agggtattgg caactggtta gcc<210> 87<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LilO)<4 00> 87
Ar,g Ala Ser Gln Gly Ile Gly Asn Trp Leu Ala1 5 10
<210> 88<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LilO)<400> 88
gctgcatcca gtttggaaag t<210> 89<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LilO)<4 00> 89
Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser1 5
<210> 90<211> 27<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LilO)<400> 90
caacaggctc agactttccc gctcacc<210> 91<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LilO)<400> 91
Gln Gln Ala Gln Thr Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 92
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LÍ07)<400> 92
tctggagatc agttgggtga caaacatgtg gct<210> 93<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Li07)<400> 93
Ser Gly Asp Gln Leu Gly Asp Lys His Val15 10<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ07)
<400> 94
ctagacatta agaggcccgc a
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ07)
<400> 95
Leu Asp Ile Lys Arg Pro Ala
1 5
<210> 96
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ07)
<400> 96
caggcgtggg acatcaagac ggtc
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ07)
<400> 97Gln Ala Trp Asp Ile Lys Thr Val
1 5
<210> 98
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LÍ05)<400> 98
gggggagaca acattggaag taagagtgtc cac<210> 99<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Li05)<400> 99
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val1 5 10
<210> 100<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Li05)<400> 100
gatgattatg accggccctc a<210> 101<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> VL-CDR2 (LÍ05)<400> 101
Asp Asp Tyr Asp Arg Pro Ser1 5
<210> 102<211> 33<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ05)<400> 102
caggtgaggg acagccgtac tgaggaacgg gtg<210> 103<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Li05)<4 00> 103
Gln Val Arg Asp Ser Arg Thr Glu Glu Arg Val15 10
<210> 104<211> 33<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lill)<400> 104
cgggcgagtc aggagattgc caactactta gcc<210> 105<211> 11<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lill)<4 00> 105
Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ala Asn Tyr Leu Ala1 5 10
<210> 106<211> 21<212> DNA10 <213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Lill)<4 00> 106
gatacataca ctttgcagac t 21
15 <210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
0 <223> VL-CDR2 (Lill)
<4 00> 107
Asp Thr Tyr Thr Leu Gln Thr1 5
<210> 108
25 <211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lill)
30 <4 00> 108
caacaggctg acattttccc gctctct 27
<210> 109<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lill)
<400> 109
Gln Gln Ala Asp Ile Phe Pro Leu Ser
1 5
<210> 110
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LiOl)
<400> 110
caggcgagtc aggacattag caactattta aat
<210> 111
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LiOl)
<400> 111
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn15 10
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LiOl)
<4 00> 112gatgcatcca atttggaaac a 21
<210> 113<211> 7<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LiOl)<400> 113
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VL-CDR3 (LiOl)<400> 114
caacaggctg acaggttccc tgcggtcact 30
<210> 115<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LiOl)<400> 115
Gln Gln Ala Asp Arg Phe Pro Ala Val Thr1 5 10
<210> 116<211> 33<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220><223> VL-CDRl (Li06)<400> 116
cgggccagtc agagtattag tagctggttg gcc<210> 117<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Li06)<400> 117
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu15 10
<210> 118<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ06)<4 00> 118
gctgcatcca gtttacgaac t<210> 119<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Li06)<400> 119
Ala Ala Ser Ser Leu Arg Thr1 5
<210> 120<211> 27<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Li06)
<400> 120
ctacaagatt acagttaccc tctcact 27
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Li06)
<400> 121
Leu Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 122
<211> 33<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Li08)<400> 122
caggcgagtc aggacattag ttactattta aat 33
<210> 123<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Li08)<400> 123
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn1 5 10
<210> 124<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ08)
<400> 124
gatgtatcca atttgcaaac a
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ08)
<4 00> 125
Asp Val Ser Asn Leu Gln Thr
1 5
<210> 126
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ08)
<4 00> 126
caacagtctg ataatctccc tctcact
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ08)
<400> 127
Gln Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu1 5
<210> 128
<211> 32
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LÍ03)
<400> 128
gggcaagtca gagcattagc agctatttaa at 32
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LÍ03)
<400> 129
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn1 5 10
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Li03)
<400> 130
gctgcatcca gtttgcaaag t 21
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ03)<400> 131
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 132
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VL-CDR3 (Li03)
<400> 132
caacagagtt acagtacccc gtggacg
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ03)
<400> 133
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 134
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LÍ09)
<400> 134
cgcgcaagtc agagcatcga cacctattta aat
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LÍ09)
<400> 135
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Thr Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 136
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ09)
<400> 136
gctgcatcca agttggaaga c 21
<210> 137
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ09)
<400> 137
Ala Ala Ser Lys Leu Glu Asp
1 5
<210> 138
<211> 26
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ09)
<400> 138
caacagagtt acagtccccc tctcac 26
<210> 139
<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Li09)<400> 139
Gln Gln Ser Tyr Ser Pro Pro Leu Thr
1 5
<210> 140
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LÍ02)
<400> 140
tctggagata aattggggga taaatttgct tcc<210> 141<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Li02)<400> 141
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Phe Ala1 5 10
<210> 142<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Li02)<400> 142
caagatagga agcgtctctc a<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ02)
<400> 143
Gln Asp Arg Lys Arg Leu Ser1 5
<210> 144
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ02)
<400> 144
caggcgtggg acaccaacac tgtggtc 27
<210> 145
<211> 9
20 <212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ02)
<400> 145
Gln Ala Trp Asp Thr Asn Thr Val Val1 5
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 146
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His1 5 10
<210> 147<211> 7<212> PRT<213> Murinae gen. sp.<400> 147
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 148
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr1 5
<210> 149<211> 11<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.
<400> 149
Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala1 5 10
<210> 150<211> 7<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 150
Asn Ala Lys Thr Leu Pro Asp1 5
<210> 151
<211> 9<212> PRT<213> Murinae gen. sp.<400> 151
Gln His Phe Trp Ala Ile Pro Tyr Thr1 5
<210> 152
<211> 17<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 152
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu1 5 10 15
Thr
<210> 153
<211> 7
<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 153
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5
<210> 154<211> 10<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 154
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr1 5 10
<210> 155<211> 17<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 155Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu1 5 10 15
Thr
<210> 156<211> 7<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 156
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5
<210> 157<211> 10<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 157
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr1 5 10
<210> 158<211> 133<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LÍ02)<400> 158
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Glu Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Gly Pro Ser Gly Gly Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 -80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ile Asp Asp Ser Ser Gly Trp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro
130
<210> 159<211> 145<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LÍ09)<400> 159
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Ser Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Arg Arg Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr His100 105 110Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala130 135 140
Pro145
<210> 160<211> 131<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Li06)<400> 160
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Pro Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Ile
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro
130
<210> 161<211> 131
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LÍ05)<400> 161
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Val Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp His Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro
130
<210> 162<211> 131<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LÍ04)<400> 162
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySer Leu Arg
Asn Met Gly35
Ser Val Ile50
Lys Gly Arg65
Leu Gln Met
Ala Ser Ser
Met Val Thr115
Leu Ala Pro
130<210> 163<211> 131<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Li08)<400> 163
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Glu Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
5
Leu Ser Cys Ala Ala Ser20 25
Trp Val Arg Gln Ala Pro40
Tyr Pro Ser Gly Gly Gly55
Phe Thr Ile Ser Arg Asp70
Asn Ser Leu Arg Ala Glu85
Ile Ala Asp Asp Ala Phe100 105
Val Ser Ser Ala Ser Thr120
10 15
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val45
Thr His Tyr Ala Asp Ser Val60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys90 95
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro125Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Pro Asp Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro
130<210> 164<211> 134<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Lill)<400> 164Glu Val Gln Leu1
Ser Leu Arg Leu20
Ala Met Tyr Trp35
Ser Ser Ile Ser50
Lys Gly Arg Phe65
Leu Gln Met Asn
Ala Arg Asp Thr100
Lys Gly Thr Thr
Leu Glu Ser Gly Gly Gly5 10
Ser Cys Ala Ala Ser Gly25
Val Arg Gln Ala Pro Gly40
Thr Ser Gly Gly Tyr Thr55
Thr Ile Ser Arg Asp Asn70
Ser Leu Arg Ala Glu Asp85 90
Ser Asp Asn Asp Tyr Tyr105
Val Thr Val Ser Ser Ala
Leu Val Gln Pro Gly Gly15
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr30
Lys Gly Leu Glu Trp Val45
Gly Tyr Ala Asp Ser Val60
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr75 80
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys95
Tyr Met Asp Val Trp Gly110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro
130<210> 165<211> 133<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LilO)<400> 165
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Pro Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Ser Ser Gly Trp Trp Asp Phe Asp Leu Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro
130<210> 166<211> 131<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LiOl)<400> 166
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Gln Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Thr Thr Glu Ala Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro
130<210> 167<211> 129<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LÍ07)<400> 167
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr20 25 30Phe Met Gly Trp Val Arg Gln Ala
35 40
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly
50 55
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg65 70
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala85
Ala Arg Asp Arg His Ala Phe Asp100
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys115 120
Pro
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val45
Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val60
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
75 80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val105 110
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala125
<210> 168<211> 132<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Li03)<400> 168
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr
20 25 30
Pro Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Ala Gly Gln Trp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro
130
<210> 169<211> 145<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Lil2)<400> 169
Glu Val Gln Leu Leu Glu1 5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys20
Asn Met Phe Trp Val Arg35
Ser Arg Ile Ser Ser Ser50
Lys Gly Arg Phe Thr Ile65 70
Leu Gln Met Asn Ser Leu85
Ala Arg Glu Ala Leu Arg100
Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly115
Thr Val Ser Ser Ala Ser130
Ser Gly Gly Gly Leu10
Ala Ala Ser Gly Phe25
Gln Ala Pro Gly Lys40
Gly Gly Met Thr Met
55
Ser Arg Asp Asn Ser75
Arg Ala Glu Asp Thr90
Pro Tyr Cys Ser Gly105
Met Asp Val Trp Gly120
Thr Lys Gly Pro Ser135
Val Gln Pro Gly Gly15
Thr Phe Ser Gln Tyr30
Gly Leu Glu Trp Val45
Tyr Ala Asp Ser Val
60
Lys Asn Thr Leu Tyr80
Ala Val Tyr Tyr Cys95
Gly Ser Cys Tyr Ser110
Gln Gly Thr Thr Val125
Val Phe Pro Leu Ala140Pro145
<210> 170<211> 116<212> PRT<213> Murinae gen.<400> 170Gln Val Gln Leu1
Thr Val Lys Ile20
Gly Met Asn Trp35
Gly Trp Ile Asn50
Gln Gly Arg Phe65
Leu Gln Phe Asn
Ala Arg Glu Gly100
Thr Val Ser Ser
115<210> 171<211> 115<212> PRT<213> Murinae gen.<4 00> 171Glu Val Lys Leu Glu1 5
Ser Met Lys Leu Ser20
Val5
Ser
Val
Thr
Ala
Asn
85
Valsp.
Gln Ser Gly Pro Glu10
Cys Lys Ala Ser Gly25
Lys Gln Ala Pro Gly40
Asp Thr Gly Glu Pro55
Phe Ser Leu Glu Thr70
Leu Lys Asn Glu Asp90
His Phe Asp Tyr Trp105
Leu Lys Lys Pro Gly Glu15
Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr30
Lys Gly Leu Lys Trp Met45
Thr Tyr Thr Glu Asp Phe60
Ser Ala Ser Thr Val Tyr75 80
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys95
Gly Gln Gly Thr Thr Val110sp.
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala25 30Trp Leu Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Phe Cys Thr Pro Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr100 105 110
Val Ser Ser115<210> 172<211> 117<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<4 00> 172
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Thr Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asn Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser115<210> 173<211> 399<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Li 02)<400> 173
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct acttacgaga tgatttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcggtcctt ctggtggcct tacttggtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac accgccatgt attactgtgt acggattgat 300gatagtagtg gttgggcttt tgatatctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcaagc 360gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccc 399
<210> 174<211> 435<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LiO 9)<400> 174
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtactcta tggtttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactatgtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactttctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagattcg 300agacgccggt attacgattt ttggagtggt tatcacaact actactacta ctacatggac 360gtctggggca aagggaccac ggtcaccgtc tcaagcgcct ccaccaaggg cccatcggtc 420ttcccgctag caccc 435
<210> 175<211> 393<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Li 06)<400> 175
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gagtacccta tggattgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctattctt ctggtggctc tactgtttat 180gctgactcca ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc cagagagggt 300gactctgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393
<210> 176<211> 393<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Li05)<400> 176
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacgcta tgggttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcgtttctt ctggtggcta tactgattat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc cagagagggt 300gaccataatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393
<210> 177<211> 393<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Li04)<400> 177
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cgttacaata tgggttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atctatcctt ctggtggcgg tactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagttctata 300
gcagatgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360
accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393<210> 178<211> 393
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LÍ08)<400> 178
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacgaga tggtttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atccgttctt ctggtggcgc tactaagtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagagtcg 300ccagacgact actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393
<210> 179<211> 402<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Lill)<400> 179
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tcttacgcta tgtattgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctactt ctggtggcta tactggttat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatacc 300
agcgataatg actactacta catggacgtc tggggcaaag ggaccacggt caccgtctca 360
agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc ccgctagcac cc 402
<210> 180
<211> 399<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LilO)<400> 180
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct acttacccta tggtttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atcggtcctt ctggtggcgt tactgcttat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaccctat 300agcagtggct ggtgggactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac cgtctcaagc 360gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccc 399
<210> 181<211> 393
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (LiOl)
<400> 181
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aagtaccaga tgacttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctatcctt ctggtggcaa tactgtttat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgggact 300
acagaggcag tctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360
accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393<210> 182
<211> 387
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH (LÍ07)<400> 182
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtacttta tgggttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggctt tacttcttat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagatcgg 300
catgcttttg atatctgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcaagcgc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttcccgct agcaccc 387
<210> 183
<211> 396<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Li03)<400> 183
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cagtacccta tggagtgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctatcctt ctggtggctc tactgtttat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagcgggg 300cagtggctgg gggactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcaagcgcc 360tccaccaagg gcccatcggt cttcccgcta gcaccc 396
<210> 184<211> 435
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH (Lil2)<400> 184
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cagtacaata tgttttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctcttctt ctggtggcat gactatgtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagcg 300ttacggcctt attgtagtgg tggtagctgc tactccgact actactacta cggtatggac 360gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcaagcgcct ccaccaaggg cccatcggtc 420ttcccgctag caccc 435
<210> 185<211> 357<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL (LÍ02)<400> 185
ttctattctc acagtgcaca gtacgaattg actcagccac cctcagtgtc cgtgtcccca 60ggacagacag ccagcatcac ctgctctgga gataaattgg gggataaatt tgcttcctgg 120tatcagcaga aggcaggcca gtcccctgtg ctggtcatct ttcaagatag gaagcgtctc 180tcagggatcc ctgagcgatt ctctggctcc aactctggga acacagccac tctgaccatc 240agcgggaccc aggctatgga tgaggctgac tattactgtc aggcgtggga caccaacact 300gtggtcttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccc 357
<210> 186
<211> 360
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL (Li09)
<400> 186
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 60tttgtgggag acagagtcgc catcacttgc cgcgcaagtc agagcatcga cacctattta 120aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaaactcc tgatctatgc tgcatccaag 180ttggaagacg gggtcccatc aagattcagt ggcagtggaa ctgggacaga tttcactctc 240accatcagaa gtctgcaacc tgaagatttt ggaacttact actgtcaaca gagttacagt 300ccccctctca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360<210> 187<211> 360<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL (LÍ06)<400> 187
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccttccac cctgtctgca 60
tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggccagtc agagtattag tagctggttg 120gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaacctcc tgatctatgc tgcatccagt 180ttacgaactg gggtcccatc aagattcagg ggcagtggat ctggcacaga tttcactctc 240accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt gcaacgtatt actgtctaca agattacagt 300taccctctca cttttggcca ggggaccaag ctggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360<210> 188<211> 363
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL (Li05)
<400> 188
ttctattctc acagtgcaca gagcgtcttg actcagccac cctcggtgtc agtggcccca 60
ggccagacgg ccaggatttc ctgtggggga gacaacattg gaagtaagag tgtccactgg 120
taccagcaga ggccaggcca ggcccctgtc ctggtcgtgt atgatgatta tgaccggccc 180
tcagggatcc ctgagcgatt ctctggctcc aactctgggg acacggccat cctgaccatc 240
accagggtcg aagtcgggga tgaggccgac ttttattgtc aggtgaggga cagccgtact 300
gaggaacggg tgttcggcgg agggaccaag gtgaccgtct taggtcagcc caaggctgcc 360
ccc 363<210> 189<211> 360<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL (LÍ08)<400> 189
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc cctgtctgca 60
tctgtaggag acagagtcac catcacttgc caggcgagtc aggacattag ttactattta 120aattggtatc agcagaagcc agggaaagcc cctaaggtcc tgatctacga tgtatccaat 180ttgcaaacag gggtcccatc aaggttcagt ggaagtgcgt ctgcgacaga ttttactctc 240accatcagca gcctgcagcc tgaagatatt gcgacatatt actgtcaaca gtctgataat 300ctccctctca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatta aacgaactgt ggctgcacca 360<210> 190
<211> 360
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL (Lill)<400> 190
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc tgtgtctgca 60
cctataggag acagagtcac catcacttgt cgggcgagtc aggagattgc caactactta 120gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatga tacatacact 180ttgcagactg acgtcccacc gaggttcagc ggcagtggtt cggggacaga tttcactctc 240actatcagca gcctgcagcc tgaagatact gcaacttact tttgtcaaca ggctgacatt 300ttcccgctct ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360<210> 191<211> 366<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL (LilO)<400> 191
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc catgtctgct 60
tctgtagggg acacagtcac catcacttgt cgggcgagtc agggtattgg caactggtta 120
gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc ccaactctcc tgatctatgc tgcatccagt 180
ttggaaagtg gggtcccatc aaggttcacc ggcagcggca gttcctctgg gatagatttc 240
actctcacca tcagcgacct gcaccctgaa gatttggcaa cttactattg tcaacaggct 300
cagactttcc cgctcacctt cggcggaggg accagggtgg acctcaagcg aactgtggct 360
gcacca 366
<210> 192
<211> 363
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL (LiOl)
<400> 192
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 60tctgtaggag acagagtcac catcacttgc caggcgagtc aggacattag caactattta 120aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctacga tgcatccaat 180ttggaaacag gggtcccatc aaggttcagc ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 240accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt gcaacttact attgtcaaca ggctgacagg 300ttccctgcgg tcactttcgg cggagggacc aaggtggaga tcaaacgaac tgtggctgca 360cca 363
<210> 193<211> 354<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL (Li07)<400> 193
ttctattctc acagtgcaca gagcgaattg actcagccac cctcagtgtc cgtgtcccca 60ggacagacag ccatcatcac ctgctctgga gatcagttgg gtgacaaaca tgtggcttgg 120tatcaacaga agccaggcca gtcccctgtg ctggtcatct atctagacat taagaggccc 180gcagggattt ctgagcgatt ctctggctcc aactctggaa atacagccac tctgaccatc 240agagggaccc aggctatgga tgaagctgac tattactgtc aggcgtggga catcaagacg 300gtcttcggcg gggggaccaa gctgaccgtc ctgagtcagc ccaaggctgc cccc 354
<210> 194<211> 360<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL (Li 0 3)<400> 194
ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 60tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc agagcattag cagctattta 120aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt 180ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 240accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt 300accccgtgga cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca aacgaactgt ggctgcacca 360<210> 195<211> 10<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.01)<400> 195
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 196
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.01)<400> 196Ile Ile Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15
Gly
<210> 197<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.01)<400> 197
Ala Glu Phe Tyr Trp Gly Ala Tyr Asp Gly1 5 10
<210> 198
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.02)<400> 198
Gly Gly Ser Ile Arg Gly Asn Tyr Trp Ser1 5 10
<210> 199<211> 14<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.02)<400> 199
Ser Ile Asn Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Pro Ser Leu Lys Gly1 5 10
<210> 200<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.02)
<400> 200
Val Arg His Trp Tyr Phe Asp Val1 5
<210> 201
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.03)
<400> 201
Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Phe Asp Met His1 5 10
<210> 202<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.03)<400> 202
Trp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1 5 10 15
Gly
<210> 203<211> 13
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.03)<400> 203
Asp Phe Tyr Met Asp Gly His Tyr Tyr Ile Phe Asp Val
1 5 10
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<223> VH-CDRl (Lia.04)<400> 204
Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr Tyr Ile His1 5 10
<210> 205
<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.04)<400> 205
Ile Ile Asp Pro Gly Asp Ser Phe Thr Ser Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15
Gly
<210> 206
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.04)
<400> 206Asp Leu Ala Trp Ile Asp Tyr Gly Phe Asp Tyr1 5 10
<210> 207<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.05)<400> 207
Gly Phe Thr Phe Thr Ser His Thr Val Ser1 5 10
<210> 208<211> 17<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.05)<400> 208
Ser Ile Thr Gly Asn Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 209
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.05)
<400> 209Phe Tyr Gly Asp Phe Asp Ser1 5
<210> 210<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.06)<400> 210
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn Trp Met Ser1 5 10
<210> 211<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.06)<400> 211
Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 212<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.06)<4 00> 212
Asp Leu Pro Met Lys Gly Phe Ile Gln Gln Arg Tyr Gly Phe Asp Asp15 10 15
Val
<210> 213<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.07)<400> 213
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Ile Ser1 5 10
<210> 214<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.07)<400> 214
Thr Ile Trp Gly Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 215<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.07)
<400> 215
Glu Tyr Trp Tyr Tyr Asp Gln Phe Thr Ala Val1 5 10
<210> 216
<211> 12
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> VH-CDRl (Lia.08)<400> 216
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Ser1 5 10
<210> 217<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.08)<400> 217
Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val1 5 10 15
Lys Ser
<210> 218<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.08)<400> 218
Glu Val Tyr Ser Ala Gly Ile Met Asp Tyr1 5 10
<210> 219
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.09)
<400> 219
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn His Trp Ile Gly1 5 10
<210> 220
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.09)
<400> 220
Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 221
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.09)
<400> 221
Gly Phe Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 222
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.10)
<400> 222
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Ala
1 5 10
<210> 223
<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.10)
<400> 223
Met Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asn Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15
Gly
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.10)
<400> 224
Thr Asn Tyr Leu Gly Phe Tyr Asp Ser
1 5
<210> 225
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.11)
<400> 225
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Ile Ser1 5 10
<210> 226<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> VH-CDR2 (Lia.11)<400> 226
Asn Ile Leu Tyr Asp Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 227
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.11)
<400> 227
Gly Tyr Pro Thr Asp Asp Tyr Ser Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 228<211> 12<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.12)<400> 228
Gly Asp Ser Val Ser Asp Asn Ser Ala Ala Trp Gly1 5 10
<210> 229
<211> 18
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.12)
<400> 229
Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val1 5 10 15
Lys Ser
<210> 230
<211> 16
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.12)
<400> 230
Gly Arg His Glu Tyr Gly Gly Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Met Asp His1 5 10 15
<210> 231<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (Lia.13)<400> 231
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 232<211> 17<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (Lia.13)<400> 232
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly<210> 233
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CDR3 (Lia.13)<400> 233
His Tyr Thr Tyr Met His Phe Glu Asp Tyr1 5 10
<210> 234<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.01)<400> 234
Ser Gly Asp Ser Leu Pro Ser Lys Phe Val His1 5 10
<210> 235
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.01)
<400> 235
Arg Asp Asn Asn Arg Pro Ser1 5
<210> 236
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> VL-CDR3 (Lia.01)<400> 236
Ser Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Asp1 5
<210> 237<211> 12<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.02)<400> 237
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Asn Ser Tyr Leu Gly1 5 10
<210> 238
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.02)
<400> 238Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 239
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.02)
<400> 239
Gln Gln Ala Ser Asp Ala Pro Glu
1 5
<210> 240<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.03)
<400> 240
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Phe Trp Leu Asn1 5 10
<210> 241
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.03)
<400> 241
Ala Gly Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210> 242
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.03)
<400> 242
Met Gln Asp Ser Asp Phe Pro Phe
1 5
<210> 243
<211> 14
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VL-CDRl (Lia.04)<400> 243
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val Ser
1 5 10
<210> 244
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.04)<400> 244
Arg Asn Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 245
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.04)<400> 245
Gln Thr Tyr Asp Asn Ser Thr Asp
1 5
<210> 246
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.05)<400> 246
Ser Gly Asp Asn Ile Arg Ser Tyr Tyr Val His15 10
<210> 247<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.05)
<400> 247
Glu Asp Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 248
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.05)
<400> 248
Gln Ser Tyr Asp Ser Ala Ile Leu Leu His1 5 10
<210> 249
<211> 16
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.06)
<400> 249
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Leu Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn1 5 10 15
<210> 250
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.06)
<400> 250Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser1 5
<210> 251<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.06)<400> 251
Gln Gln Tyr Tyr Gly Met Pro Leu1 5
<210> 252
<211> 12
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.07)<400> 252
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 253
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.07)<400> 253
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 254
<211> 8
<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.07)
<400> 254
Gln Gln Tyr Gly Ser Val Pro Arg
1 5
<210> 255
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.08)
<400> 255
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Ser Tyr Tyr Val His1 5 10
<210> 256
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.08)
<400> 256
Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser1 5
<210> 257
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.08)
<400> 257
Ser Ala Tyr Asp Tyr Ser Ala Arg Thr1 5
<210> 258<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.09)<4 00> 258
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Lys Tyr Val Ser1 5 10
<210> 259<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.09)<400> 259
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser1 5
<210> 260<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.09)<4 00> 260
Ser Ser Tyr Asp Phe Leu Asn Ile Gly Leu15 10
<210> 261<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.10)<4 00> 261
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Lys Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 262
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.10)
<4 00> 262
Glu Asp Ser Glu Arg Pro Ser1 5
<210> 263
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia. 10)
<400> 263
Ser Ser Tyr Thr Asn Ser Val Asp1 5
<210> 264
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.11)
<400> 264
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Tyr Val Gly1 5 10<210> 265
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.11)
<400> 265
Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser1 5
<210> 266
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.11)
<400> 266
Gln Ser Tyr Asp Asp Thr Ser Ile1 5
<210> 267
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.12)
<4 00> 267
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Asn Lys Tyr Val His1 5 10
<210> 268
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> VL-CDR2 (Lia.12)<400> 268
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser1 5
<210> 269
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.12)
<400> 269
Gln Thr Trp Asp Tyr Val Gly Tyr1 5
<210> 270
<211> 14
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Lia.13)<400> 270
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser1 5 10
<210> 271<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Lia.13)<400> 271
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser1 5
<210> 272<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Lia.13)<400> 272
Gln Ser Tyr Asp Arg Tyr Arg Leu Lys Asn1 5 10
<210> 273<211> 119<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LÍ02 (VL)<400> 273
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val1 5 10 15
Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Gly Asp Lys Phe Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Val Leu Val Ile Phe Gln Asp Arg Lys Arg Leu Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile65 70 75 80
Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp
85 90 95
Asp Thr Asn Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro
115<210> 274<211> 120<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LÍ09 (VL)<400> 274
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser1 5 10 15
Ser Leu Ser Ala Phe Val Gly Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala
20 25 30
Ser Gln Ser Ile Asp Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Glu Asp Gly
50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80
Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gln Ser Tyr Ser Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro115 120
<210> 275<211> 120<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LÍ06 (VL)<4 00> 275
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser15 10 15
Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala20 25 30
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Arg Thr Gly
50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
85 90 95
Gln Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro115 120
<210> 276<211> 121<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Li05 (VL)<4 00> 276
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val15 10 15
Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Asp Asn
20 25 30
Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Tyr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Ile Leu Thr Ile65 70 75 80
Thr Arg Val Glu Val Gly Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Gln Val Arg85 90 95Asp Ser Arg Thr Glu Glu Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr
100 105 110
Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro
115 120
<210> 277<211> 120<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Li08 (VL)<400> 277
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser1 5 10 15
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala
20 25 30
Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Asp Val Ser Asn Leu Gln Thr Gly
50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro115 120
<210> 278<211> 120<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> Lill (VL)<400> 278
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser1 5 10 15
Ser Val Ser Ala Pro Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
20 25 30
Ser Gln Glu Ile Ala Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Tyr Thr Leu Gln Thr Asp
50 55 60
Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln
85 90 95
Gln Ala Asp Ile Phe Pro Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro115 120
<210> 279<211> 122<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LilO (VL)<4 00> 279
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser15 10 15
Ser Met Ser Ala Ser Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
20 25 30
Ser Gln Gly Ile Gly Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ile Asp Phe65 70 75 80
Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu His Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gln Gln Ala Gln Thr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg
100 105 110
Val Asp Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
115 120
<210> 280<211> 121<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LiOl (VL)<4 00> 280
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser15 10 15
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala
20 25 30
Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly
50 55 60
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Gln Ala Asp Arg Phe Pro Ala Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
115
120<210> 281<211> 118<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LÍ07 (VL)<400> 281
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val1 5 10 15
Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ile Ile Thr Cys Ser Gly Asp Gln
20 25 30
Leu Gly Asp Lys His Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Val Leu Val Ile Tyr Leu Asp Ile Lys Arg Pro Ala Gly Ile Ser
50 55 60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp
85 90 95
Asp Ile Lys Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro
115<210> 282<211> 120<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LÍ03 (VL)<400> 282
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser15 10 15Ser Leu Ser
Ser Gln Ser35
Lys Ala Pro50
Val Pro Ser65
Thr Ile Ser
Gln Ser Tyr
Ile Lys Arg115<210> 283<211> 106<212> PRT<213> Murinae gen. sp.<4 00> 283
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
Ala Ser Val Gly Asp Arg20 25
Ile Ser Ser Tyr Leu Asn40
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala55
Arg Phe Ser Gly Ser Gly70
Ser Leu Gln Pro Glu Asp85
Ser Thr Pro Trp Thr Phe100 105
Thr Val Ala Ala Pro120
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly45
Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly60
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
75 80
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu110100 105
<210> 284<211> 108<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 284
Asp Lle Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Pro Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Phe Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ala Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg100 105
<210> 285<211> 114<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<400> 285
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80
Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu100 105 110
Ile Arg
<210> 286<211> 114<212> PRT
<213> Murinae gen. sp.<4 00> 286
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80
Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu100 105 110
Ile Arg<210> 287
<211> 5<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (3)..(5)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.
<400> 287Ile Thr Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 288
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (3)..(5)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.
<400> 288
Ala Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 289
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (3) .. (5)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.
<400> 289Val Cys Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 290<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (3)..(5)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.
<400> 290
Ser Pro Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 291
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 291
Ser Pro Arg Lys His1 5
<210> 292
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 292Ser Pro Arg Lys Lys1 5
<210> 293
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 293
Ser Pro Arg Lys Arg1 5
<210> 294<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 294
Ser Pro Lys Lys His
1 5
<210> 295
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 295
Ser Pro His Lys His
1 5
<210> 296
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 296
Ser Pro Arg Arg His
1 5
<210> 297
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 297
Ser Pro Arg His His
1 5
<210> 298
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 298Ser Pro Arg1
<210> 299
<211> 5<212> PRT<213> Homo<400> 299Ser Pro His1
<210> 300<211> 5<212> PRT<213> Homo<400> 300Ser Pro Lys1
<210> 301<211> 6<212> PRT<213> Homo<400> 301Leu Ser Pro1
<210> 302<211> 6<212> PRT<213> Homo<400> 302Leu Ser Pro1
<210> 303<211> 6
Arg Arg5
sapiens
His His5
sapiens
Lys Lys5
sapiens
Arg Lys His
5
sapiens
Arg Lys Lys5<212> PRT<213> Homo<4 00> 303Leu Ser Pro1
<210> 304<211> 6<212> PRT<213> Homo<400> 304Leu Ser Pro1
<210> 305<211> 6<212> PRT<213> Homo<4 00> 305Leu Ser Pro1
<210> 306<211> 6<212> PRT<213> Homo<400> 306Leu Ser Pro1
<210> 307<211> 6<212> PRT<213> Homo<400> 307Leu Ser Pro
sapiens
Arg Lys Arg5
sapiens
Lys Lys His5
sapiens
His Lys His5
sapiens
Arg Arg His5
sapiensArg His His1 5
<210> 308
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 308
Leu Ser Pro Arg Arg Arg1 5
<210> 309
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 309
Leu Ser Pro His His His
1 5
<210> 310
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 310
Leu Ser Pro Lys Lys Lys1 5
<210> 311
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 311
Trp Leu Ser Pro Arg Lys His1 5
<210> 312
<211> 7
<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 312
Trp Leu Ser Pro Arg Lys Lys1 5
<210> 313<211> 7<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 313
Trp Leu Ser Pro Arg Lys Arg1 5
<210> 314<211> 7<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 314
Trp Leu Ser Pro Lys Lys His1 5
<210> 315
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 315
Trp Leu Ser Pro His Lys His
1 5
<210> 316
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 316
Trp Leu Ser Pro Arg Arg His1 5<210> 317
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 317
Trp Leu Ser Pro Arg His His
1 5
<210> 318
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 318
Trp Leu Ser Pro Arg Arg Arg
1 5
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 319
Trp Leu Ser Pro His His His
1 5
<210> 320
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 320
Trp Leu Ser Pro Lys Lys Lys1 5
<210> 321
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 321
Ile Thr Pro Lys Arg Arg
1 5
<210> 322
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 322Ala Cys His His Lys
1 5
<210> 323
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 323Val Cys His His Lys
1 5
<210> 324
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido.
<400> 324
Xaa Xaa Arg Lys His
1 5
<210> 325
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido.
<400> 325
Xaa Xaa Arg Arg Arg
1 5
<210> 326
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (1) . . (2)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido.
<400> 326
Xaa Xaa Lys Lys Lys1 5
<210> 327
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido.
<400> 327
Xaa Xaa His His His
1 5
<210> 328
<211> 5
<212> PRT<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido
<4 00> 328
Xaa Xaa Arg Lys Lys
1 5
<210> 329
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (1) . . (2)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido
<4 00> 329
Xaa Xaa Arg Lys Arg
1 5
<210> 330
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (1)..(2)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido
<4 00> 330
Xaa Xaa Lys Lys His
1 5
<210> 331
<211> 5<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido
<400> 331Xaa Xaa His Lys His1 5
<210> 332
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido
<4 00> 332
Xaa Xaa Arg Arg His
1 5
<210> 333
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (1) .. (2)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido
<400> 333
Xaa Xaa Arg His His
1 5
<210> 334<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (3) .. (3)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (4) . . (4)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (5)..(5)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.
<400> 334Ile Thr Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 335
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (3) . . (3)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (4) .. (4)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS<222> (5) . . (5)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.
<400> 335
Ala Cys Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 336
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (3) .. (3)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (4) . . (4)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido.
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (5) . . (5)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.
<400> 336
Val Cys Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 337
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (3).. (3)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (4) . . (4)
<223> Xaa é qualquer Aminoácido.
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (5) .. (5)
<223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp.
<400> 337Ser Pro Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 338
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 338Ser Pro Arg Leu His
1 5
<210> 339
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 339
Arg Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys
1 5
<210> 340
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 340
Lys Lys Val Lys Val Lys Glu Lys Arg
1 5<210> 341
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 341
Arg Arg Leu Arg Leu Arg Asp Arg Lys
1 5
<210> 342
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 342
Arg Arg Gly Arg Gly Arg Asp Arg Lys
1 5
<210> 343
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 343
Arg Arg Ile Arg Ala Arg Asp Arg Lys
1 5
<210> 344
<211> 19
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> RT-PCR Iniciador
<400> 344
agagacatgc gattggtga
<210> 345
<211> 21
<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> RT-PCR Iniciador
<400> 345
agagatgtag acgaggtcat t 21
<210> 346
<211> 55
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LV1-036 (sense oligo)
<400> 346
tgatcgtcat cctgctagac ttcaagagag tctagcagga tgacgatctt ttttc 55
<210> 347
<211> 59
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LV1-036 (antisense oligo)
<400> 347
tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tctagcagga tgacgatca 59
<210> 348
<211> 59
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Oligonucleotideo
<400> 348
tgatcctcat ccttctatac ttcaagagag tgtagcagga tgacgatctt ttttctcga 59
<210> 349
<211> 59
<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Oligonucleotideo
<400> 349
tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tatagaagga tgacgatca 59
<210> 350
<211> 41
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Xniciador
<400> 350
gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g 41
<210> 351
<211> 41
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador
<400> 351
ggggcggaat tggatcctca cagatcctct tctgagatga g 41
<210> 352
<211> 41
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador
<400> 352
gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g 41
<210> 353
<211> 42
<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador
<400> 353
gatacggatc ctcagccttt gccccggctc catagaaaca gc 42
<210> 354
<211> 37
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador
<400> 354
cagcaggtcg acgcggccgc atgctggcgg ggggcgt 37
<210> 355
<211> 59
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador
<400> 355
cagcaggtcg acctcgcccg gctggttggc caaccagccg ggcgaggtcg acctcgagg 59
<210> 356
<211> 39
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador
<400> 356
ggggatatcc accatggatt ttcaggtgca gattttcag 39
<210> 357
<211> 40
<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (17) .. (17)
<223> R é A ou G.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (25)..(25)
<223> K é G ou T.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (28)..(28)
<223> Y é C ou T.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (37) .. (37)
<223> Y é C ou T.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (38) .. (38)
<223> R é A ou G.
<400> 357
ggggatatcc accatgragt cacakacyca ggtcttyrta
<210> 358
<211> 37
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador
<400> 358ggggatatcc accatgaagt tgcctgttag gctgttg
<210> 359
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (20)..(20)
<223> K é G ou Τ.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (25)..(25)
<223> W é A ou Τ.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (32) .. (32)
<223> Y é C ou Τ.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (34) .. (34)
<223> Y é C ou Τ.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (37) .. (37)
<223> K é G ou Τ.
<400> 359
ggggatatcc accatgaggk ccccwgctca gytyctkgga
<210> 360
<211> 39
<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (18)..(18)
<223> R é A ou G.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (28)..(28)
<223> K é G ou T.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (31) .. (31)
<223> M é A ou C.
<400> 360
ggggatatcc accatggrat gsagctgkgt matsctctt
<210> 361
<211> 39
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (17)..(17)
<223> R é A ou G.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (26)..(26)
<223> Y é C ou T.<220><221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (33)..(33)
<223> K é G ou T.
<400> 361
ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt
<210> 362
<211> 38
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador
<400> 362
ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct
<210> 363
<211> 39
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (11) .. (11)
<223> Y é C ou T.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (25)..(26)
<223> R é A ou G.
<400> 363
aggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac
<210> 364
<211> 22
<212> DNA<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Iniciador FRl<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (5) .. (5)
<223> S é C ou G.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (6)..(6)
<223> M é A ou C.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (8) .. (8)
<223> R é A ou G.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (15)..(15)
<223> S é C ou G.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (20) .. (20)
<223> W é A ou T.
<4 00> 364
aggtsmarct gcagsagtcw gg
<210> 365
<211> 34
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador FR4
<400> 365tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag
<210> 366
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (6)..(6)
<223> R é A ou G.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (9) .. (9)
<223> Y é C ou Τ.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (12) .. (12)
<223> Y é C ou Τ.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (18) . . (18)
<223> H é Α, C, ou Τ.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (21)..(21)
<223> N é Α, G, C, ou Τ.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (24) . . (24)
<223> N é Α, G, C, ou Τ.
<220><221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (27) .. (27)
<223> Y é C ou T.
<400> 366
atggartgya aytggathct nccntty 27
<210> 367
<211> 39
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (11) .. (11)
<223> Y é C ou T.<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (25)..(26)
<223> R é A ou G.
<400> 367
aggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39
<210> 368
<211> 66
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador
<400> 368
ggggtatctc tcgagaaaag agagcatcat catcatcatc atatgggaca gttcagagtg 60
ataggg 66
<210> 369
<211> 40<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> PCR Iniciador
<400> 369
ttcgcggccg ctattagcca gggttgatcc agtagaaggg 40
<210> 370<211> 354<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Lil3 (VH)<400> 370
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacgaga tgtattgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atcgtttctt ctggtggctt tactaagtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagggt 300gataatgatg cttttgatat ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc aagc 354
<210> 371
<211> 324<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Lil3 (VL)<400> 371
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatgta cacttttggc 300caggggacca agctggagat caaa 324<210> 372<211> 118<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LÍ13 (VH)<400> 372
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Glu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Val Ser Ser Gly Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115<210> 373<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LÍ13 (VL)<400> 373
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Met
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210> 374<211> 354<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LI32 (VH)<400> 374
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacatga tgcagtgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggcaa tactaagtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggagat 300tatggatact ggttcgaccc ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc aagc 354
<210> 375<211> 321<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Li32 (VL)<400> 375gacatccaga tgacccagtc tccagactcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60atcacttgcc aggcgagtca agacattagc tactatttaa attggtatca gcagaaacca 120gggatggccc ctaaactcct catctacgat gccttcattt tggaaggagg ggccccatca 180cggttcagtg ggagcggctc tgggacagat ttttctttca ccatcagcaa tctacagcct 240gaggatattg caacttattt ctgtcaacag tctgatcaac tgcccgtgac cttcggccaa 300gggaccaagg tggaaatcag a 321
<210> 376<211> 118<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> Li32 (VH)<400> 376
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Met Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 377<211> 107<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> Li32 (VL)<400> 377
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Met Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Asp Ala Phe Ile Leu Glu Gly Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Gln Leu Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg100 105
<210> 378<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Li33 (VH)<400> 378
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atttacccta tgttttgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atcggtcctt ctggtggcat tactaagtat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccacat attactgtgc gagagagggg 300cataacgact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcaagc 357
<210> 379<211> 321<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LÍ33 (VL)<400> 379
gacatccaga tgacccagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240gaggattttg cagtttatta ctgtcagcag tatgataagt ggccgctcac tttcggcgga 300gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 380<211> 119<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Li33 (VH)<400> 380
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Pro Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly His Asn Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115<210> 381<211> 107<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Li33 (VL)<400> 381
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105
<210> 382<2U> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Li34 (VH)<4 00> 382
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctttcttgcgctg cttccggatt cactttctct aattacgaga tgtattgggt tcgccaagct 120cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctattctt ctggtggcat tactgtttat 180gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc tagggcagcc 300atcctcgact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcaagc 357
<210> 383<211> 321<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LÍ34 (VL)<400> 383
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc atgcgagtca ggacattagc aactatttaa gttggtatca gcagaaacca 120ggtaaagccc ctaaactcct gatctacgat gctttcaatt tggagacagg agtcccatcg 180aggttcagtg gaagtggatc tggcacagat tttacattca ccatcagcag cctgcagcct 240gaagattttg caacatatta ctgtcagcac tatgataatc tcccattcac tttcggccct 300gggaccagag tggcgatcag a 321
<210> 384<211> 119<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Li34 (VH)<400> 384
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30
Glu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Xle Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ala Ile Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 385<211> 107<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Li 34 (VL)<400> 385
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Phe Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Val Ala Ile Arg
100 105
<210> 386<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LÍ13)<400> 386
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10
<210> 387<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ13)<4 00> 387
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 388
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ13)<4 00> 388
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Met Tyr Thr15 10
<210> 389<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ13)<4 00> 389His Tyr Glu Met Tyr1 5
<210> 390<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ13)<400> 390
Arg Ile Val Ser Ser Gly Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 391<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ13)<400> 391
Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 392
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LÍ32)<400> 392
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn15 10
<210> 393<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (LÍ32)
<400> 393
Asp Ala Phe Ile Leu Glu Gly
1 5
<210> 394
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ32)
<400> 394
Gln Gln Ser Asp Gln Leu Pro Val Thr
1 5
<210> 395
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ32)
<400> 395
Ala Tyr Met Met Gln
1 5
<210> 396
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ32)<400> 396
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (Li32)
<400> 397
Gly Asp Tyr Gly Tyr Trp Phe Asp Pro
1 5
<210> 398
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (LÍ33)
<400> 398
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala15 10
<210> 399
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Li33)
<400> 399
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VL-CDR3 (LÍ33)
<400> 400
Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Leu Thr1 5
<210> 401
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ33)
<400> 401
Ile Tyr Pro Met Phe1 5
<210> 402
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ33)
<400> 402
Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 403
<211> 10
<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ33)<400> 403
Glu Gly His Asn Asp Trp Tyr Phe Asp Leu1 5 10
<210> 404<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDRl (Li34)<400> 404
His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser1 ' 5 10
<210> 405<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR2 (Li34)<4 00> 405
Asp Ala Phe Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 406
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VL-CDR3 (Li34)<400> 406
Gln His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe Thr1 5
<210> 407
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDRl (LÍ34)
<400> 407
Asn Tyr Glu Met Tyr
1 5
<210> 408
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VH-CDR2 (LÍ34)
<400> 408
Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15
Gly
<210> 409
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VH-CDR3 (LÍ34)
<400> 409
Ala Ala Ile Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10

Claims (50)

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao mesmoepítopo Sp35 como um anticorpo monoclonal de referência selecionado apartir do grupo consistindo em Li33, 1A7, Li13, 20Ϊ, 3A3, 3A6, 1G7, 2B10,-2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4,-3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12(LiOI)1 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02(Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01(Li11), 34-B03 (Li12), Li32„ Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3),-3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569(L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), e 1968 (L1a.13).
2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que se liga especificamente ao Sp35, caracterizado pelo fato de queo referido anticorpo ou fragmento do mesmo inibe competitivamente um an-ticorpo monoclonal de referência selecionado a partir do grupo consistindoem Li33, 1A7, Li13, 20Í, 3A3, 3A6, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3,-3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9,-3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01 (Li02), 35-E04(Li03), 36-C09 (LÍ04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04(Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (Li10), 30-B01 (Li11), 34-B03 (Li12), Li32, Li34,-3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4), 3565 (L1a.5), 3566(L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570 (L1a.10), 3571(L1a.11), 3582 (L1a.12), e 1968 (L1a.13) de se ligar especificamente ao Sp35.
3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo que se liga especificamente ao Sp35, caracterizado pelo fato de queo referido anticorpo ou fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupoconsistindo em Li33, 1A7, Li13, 20Í, 3A3, 3A6, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3,-3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9,-3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (Li01), 38-D01(Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07(Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (LiIO)1 30-B01 (LÍ11), 34-B03(Li12), Li32, Li34, 3383 (L1a.1), 3495(L1a.2), 3563 (L1a.3), 3564 (L1a.4),- 3565 (L1a.5), 3566 (L1a.6), 3567 (L1a.7), 3568 (L1a.8), 3569 (L1a.9), 3570(L1a.10), 3571 (L1a.11), 3582 (L1a.12), e 1968 (L1a.13).
4. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é um antago-nista da inibição da mielinação mediada por Sp35
5. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é um antago-nista da morte celular de oligodendrócitos mediada por Sp35.
6. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH e umaregião VL em que as referidas regiões VH e VL compreendem, respectiva-mente, seqüências de polipeptídeos pelo menos 90% idênticas aos polipep-tídeos de referência selecionados a partir do grupo consistindo em:i) SEQ ID N0:380 e SEQ ID NO:381;ii) SEQ ID NO:170eSEQ ID NO:283;iii) SEQ ID NO: 372 e SEQ ID NO:373;iv) SEQ ID NO:171 e SEQ ID NO:284;v) SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO:285;vi) SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO:286;vii) SEQ ID NO:158 e SEQ ID NO:273;viii) SEQ ID NO:159 e SEQ ID NO:274;ix) SEQ ID N0:160 e SEQ ID NO:275;x) SEQ ID NO:161 e SEQ ID NO:276;xi) SEQ ID NO:163eSEQ ID NO:277;xii) SEQ ID NO:164eSEQ ID NO:278;xiii) SEQ ID NO:165 e SEQ ID NO:279;xiv) SEQ ID NO:166 e SEQ ID N0:280;xv) SEQ ID NO:167eSEQ ID NO:281;xvi) SEQ ID NO:168eSEQ ID NO:282;xvii) SEQ ID NO:376 e SEQ ID NO:377; exviii) SEQ ID NO:384 e SEQ ID NO:385;e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmocompreendendo as referidas VH e VL se liga especificamente ao Sp35.
7. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH e umaregião VL em que as referidas regiões VH e VL1 respectivamente, são idênti-cas, exceto por menos que 20 substituições conservativas de aminoácido,aos polipeptídeos de referência selecionados a partir do grupo consistindoem:i) SEQ ID N0:380 e SEQ ID NO:381;ii) SEQ ID N0:170 e SEQ ID NO:283;iii) SEQ ID NO: 372 e SEQ ID NO:373;iv) SEQ ID NO:171 e SEQ ID NO:284;v) SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO:285;vi) SEQ ID NO:172eSEQ ID NO:286;vii) SEQ ID NO:158eSEQ ID NO:273;viii) SEQ ID NO:159 e SEQ ID NO:274;ix) SEQ ID N0:160 e SEQ ID NO:275;x) SEQ ID NO:161 e SEQ ID NO:276;xi) SEQ ID NO:163eSEQ ID NO:277;xii) SEQ ID NO:164 e SEQ ID NO:278;xiii) SEQ ID NO:165 e SEQ ID NO:279;xiv) SEQ ID NO:166eSEQ ID N0:280;xv) SEQ ID N0:167eSEQ ID NO:281;xvi) SEQ ID NO:168eSEQ ID NO:282;xvii) SEQ ID NO:376 e SEQ !D NO:377; exviii) SEQ ID NO:384 e SEQ ID NO:385;e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmocompreendendo as referidas VH e VL se liga especificamente ao Sp35.
8. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH e umaregião VL em que as referidas regiões VH e VL compreendem, respectiva-mente, polipeptídeos selecionados a partir do grupo consistindo em:SEQ ID N0:380 e SEQ ID NO:381;SEQ ID N0:170 e SEQ ID NO:283;SEQ ID NO: 372 e SEQ ID NO:373;SEQ ID NO:171 e SEQ ID NO:284;SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO:285;SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO:286;SEQ ID NO: 158 e SEQ ID NO:273;SEQ ID NO:159 e SEQ ID NO:274;SEQ ID N0:160 e SEQ ID NO:275;SEQ ID NO:161 e SEQ ID NO:276;SEQ ID NO:163 e SEQ ID NO:277;SEQ ID NO:164 e SEQ ID NO:278;SEQ ID NO:165 e SEQ ID NO:279;SEQ ID NO: 166 e SEQ ID N0:280;SEQ ID NO:167 e SEQ ID NO:281;SEQ ID NO:168 e SEQ ID NO:282;SEQ ID NO:376 e SEQ ID NO:377; eSEQ ID NO:384 e SEQ ID NO:385.
9. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que com-preende um ácido nucléico que codifica uma região variável da cadeia pesa-da da imunoglobulina (VH)1 em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 dareferida VH são pelo menos 90% idênticas, respectivamente, às seqüênciasde polipeptídeo CDR1, CDR2, e CDR3 das cadeias pesadas de referênciaselecionadas a partir do grupo consistindo em:a) SEQ ID N0:401, SEQ ID N0:402 e SEQ ID N0:403;b) SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, e SEQ ID NO:79c) SEQ ID NO:389, SEQ ID N0:390 e SEQ ID NO:391d) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, e SEQ ID N0:10,e) SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, e SEQ ID NO:16,f) SEQ ID NO:18, SEQ ID N0:20, e SEQ ID NO:22,g) SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, e SEQ ID NO:28,h) SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:34, i) SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, e SEQ ID N0:40, j) SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, e SEQ ID NO:46, k) SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:50, e SEQ ID NO:52, I) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, e SEQ ID NO:58, m) SEQ ID N0:60, SEQ ID NO:61, e SEQ ID NO:62, n) SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, e SEQ ID NO:68, o) SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, e SEQ ID N0:70, P) SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, e SEQ ID NO:76, q) SEQ ID N0:80, SEQ ID NO:81, e SEQ ID NO:82, r) SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, e SEQ ID NO:85; s) SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196 e SEQ ID NO:197; t) SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199 e SEQ ID N0:200; u) SEQ ID N0:201, SEQ ID N0:202 e SEQ ID N0:203; v) SEQ ID N0:204, SEQ ID N0:205 e SEQ ID N0:206; w) SEQ ID N0:207, SEQ ID N0:208 e SEQ ID N0:209; x) SEQ ID N0:210, SEQ ID NO:211 e SEQ ID NO:212; y) SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214 e SEQ ID NO:215; z) SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217 e SEQ ID NO:218; aa) SEQ ID NO:219, SEQ ID N0:220 e SEQ ID NO:221; bb) SEQ ID NO:219, SEQ ID N0:220 e SEQ ID NO:221; cc) SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 e SEQ ID NO:224; dd) SEQ ID NO:225, SEQ ID NO:226 e SEQ ID NO:227; ee) SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229 e SEQ ID N0:230; ff) SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232 e SEQ ID NO:233; gg) SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:396 e SEQ ID NO:397; hh) SEQ ID N0:407, SEQ ID NQ:408 e SEQ ID NQ:409; e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo a referida VH se liga especificamente ao Sp35.
10. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que com-preende um ácido nucléico que codifica uma região variável da cadeia pesa-da da imunoglobulina (VH)1 em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 dareferida VH são idênticas, respectivamente, exceto por menos que 20 substi-tuições conservativas de aminoácido, às seqüências CDR1, CDR2, e CDR3das cadeias pesadas de referência selecionadas a partir do grupo consistin- do em: a) SEQ ID N0:401, SEQ ID N0:402 e SEQ ID N0:403; b) SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, e SEQ ID NO:79 c) SEQ ID NO:389, SEQ ID N0:390 e SEQ ID NO:391 d) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, e SEQ ID N0:10, e) SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, e SEQ ID NO:16, f) SEQ ID NO:18, SEQ ID N0:20, e SEQ ID NO:22, g) SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, e SEQ ID NO:28, h) SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:34, i) SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, e SEQ ID N0:40, j) SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, e SEQ ID NO:46, k) SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:50, e SEQ ID NO:52, I) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, e SEQ ID NO:58, m) SEQ ID N0:60, SEQ ID NO:61, e SEQ ID NO:62, n) SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, e SEQ ID NO:68, o) SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, e SEQ ID N0:70, P) SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, e SEQ ID NO:76, q) SEQ ID N0:80, SEQ ID NO:81, e SEQ ID NO:82, r) SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, e SEQ ID NO:85; s) SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196 e SEQ ID NO:197; t) SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199 e SEQ ID N0:200; u) SEQ ID N0:201, SEQ ID N0:202 e SEQ ID N0:203; v) SEQ ID N0:204, SEQ ID N0:205 e SEQ ID N0:206; w) SEQ ID N0:207, SEQ ID N0:208 e SEQ ID N0:209; x) SEQ ID N0:210, SEQ ID NO:211 e SEQ ID NO:212; y) SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214 e SEQ ID NO:215; z) SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217 e SEQ ID NO:218; aa) SEQ ID NO:219, SEQ ID N0:220 e SEQ ID NO:221; bb) SEQ ID NO:219, SEQ ID NQ:220 e SEQ ID NO:221;cc) SEQ ID ΝΟ:222, SEQ ID ΝΟ:223 e SEQ ID ΝΟ:224;dd) SEQ ID ΝΟ:225, SEQ ID ΝΟ:226 e SEQ ID ΝΟ:227;ee) SEQ ID ΝΟ:228, SEQ ID ΝΟ:229 e SEQ ID Ν0:230;ff) SEQ ID ΝΟ:231, SEQ ID ΝΟ:232 e SEQ ID ΝΟ:233;gg) SEQ ID ΝΟ:395, SEQ ID ΝΟ:396 e SEQ ID ΝΟ:397;hh) SEQ ID Ν0:407, SEQ ID Ν0:408 e SEQ ID Ν0:409;e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmocompreendendo a referida VH se liga especificamente ao Sp35.
11. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que com-preende um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada da imuniglobuli-na (VH), em que as referidas regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da referida VHsão codificadas por seqüências de ácido nucléico selecionadas a partir dogrupo consistindo em:a) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, e SEQ ID NO:9;b) SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, e SEQ ID NO:15;c) SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, e SEQ ID NO:21;d) SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:27;e) SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, e SEQ ID NO:33;f) SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, e SEQ ID NO:39,g) SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, e SEQ ID NO:45;h) SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, e SEQ ID NO:51;i) SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, e SEQ ID NO:57;j) SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, e SEQ ID NO:63;k) SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, e SEQ ID NO:69; eI) SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, e SEQ ID NO:75.
12. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que com-preende um ácido nucléico que codifica uma região VH pelo menos 90%idêntica à seqüência de polipeptídeo da VH de referência selecionada a par-tir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 380, 170, 372, 158 a 169, 171,-172, 376 e 384, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo compreendendo a referida VH se liga especificamente ao Sp35.
13. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que com-preende um ácido nucléico que codifica uma região VH idêntica à seqüênciade polipeptídeo da VH de referência selecionada a partir do grupo consistin-do nas SEQ ID NOs: 380, 170, 372, 158 a 169, 171 - 172, 376 e 384, excetopor menos que 20 substituições conservativas de aminoácido, e em que umanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo areferida VH se liga especificamente ao Sp35.
14. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que com-preende um ácido nucléico que codifica uma região variável da cadeia leveda imunoglobulina (VL)1 em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da referi-da VL são pelo menos 90% idênticas, respectivamente, às seqüências C-DR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve de referência selecionadas a partir dogrupo consistindo em: a) SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, e SEQ ID N0:400; b) SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, e SEQ ID NO:148 c) SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:387, e SEQ ID NO:388 d) SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, e SEQ ID NO:91; e) SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, e SEQ ID NO:97; f) SEQ ID NO:99, SEQ ID N0:101, e SEQ ID N0:103; g) SEQ ID N0:105, SEQ ID N0:107, e SEQ ID N0:109; h) SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, e SEQ ID NO:115; i) SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, e SEQ ID NO:121; j) SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, e SEQ ID NO:127; k) SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, e SEQ ID NO:133; I) SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, e SEQ ID NO:139; m) SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, e SEQ ID NO:145; n) SEQ ID NO:149, SEQ ID N0:150, e SEQ ID NO:151; o) SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:153, e SEQ ID NO:154; P) SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156, e SEQ ID NO:157; q) SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, e SEQ ID NO:236, r) SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, e SEQ ID NO:239; s) SEQ ID N0:240, SEQ ID NO:241, e SEQ ID NO:242; t) SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, e SEQ ID NO:245;u) SEQ ID ΝΟ:246, SEQ ID ΝΟ:247, e SEQ ID ΝΟ:248;ν) SEQ ID ΝΟ:249, SEQ ID Ν0:250, e SEQ ID ΝΟ:251;w) SEQ ID ΝΟ:252, SEQ ID ΝΟ:253, e SEQ ID ΝΟ:254;χ) SEQ ID ΝΟ:255, SEQ ID ΝΟ:256, e SEQ ID ΝΟ:257;y) SEQ ID ΝΟ:258, SEQ ID ΝΟ:259, e SEQ ID Ν0:260;z) SEQ ID ΝΟ:261, SEQ ID ΝΟ:262, e SEQ ID ΝΟ:263;aa) SEQ ID ΝΟ:264, SEQ ID ΝΟ:265, e SEQ ID ΝΟ:266;bb) SEQ ID ΝΟ:267, SEQ ID ΝΟ:268, e SEQ ID ΝΟ:269;cc) SEQ ID Ν0:270, SEQ ID ΝΟ:271, e SEQ ID ΝΟ:272;dd) SEQ ID ΝΟ:392, SEQ ID ΝΟ:393, e SEQ ID ΝΟ:394;ee) SEQ ID Ν0:404, SEQ ID Ν0:405, e SEQ ID Ν0:406;e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmocompreendendo a referida VL se liga especificamente ao Sp35.
15. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que com-preende um ácido nucléico que codifica uma região variável da cadeia leveda imunoglobulina (VL)1 em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da referi-da VL são idênticas, respectivamente, exceto por menos que 20 substitui-ções conservativas de aminoácido, às seqüências CDR1, CDR2, e CDR3das cadeias leves de referência selecionadas a partir do grupo consistindoem: a) SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, e SEQ ID N0:400 b) SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, e SEQ ID NO:148 c) SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:387, e SEQ ID NO:388 d) SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, e SEQ ID NO:91; e) SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, e SEQ ID NO:97; f) SEQ ID NO:99, SEQ ID N0:101, e SEQ ID NQ:103; 9) SEQ ID N0:105, SEQ ID NO 107, e SEQ IDNO 109h) SEQ ID NO:111, SEQ ID NO 113, e SEQ IDNO 115i) SEQ ID NO:117, SEQ IDNO 119, e SEQ ID NO 121j) SEQ ID NO:123, SEQ ID NO 125, e SEQ IDNO 127k) SEQ ID NO:129, SEQ ID NO 131, e SEQ IDNO 133I) SEQ ID NO:135, SEQ ID NO 137, e SEQ IDNO 139m) SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, e SEQ ID NO:145;n) SEQ ID NO:149, SEQ ID N0:150, e SEQ ID NO:151;o) SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:153, e SEQ ID NO: 154;P) SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156, e SEQ ID NO:157;q) SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, e SEQ ID NO:236,r) SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, e SEQ ID NO:239;s) SEQ ID N0:240, SEQ ID NO:241, e SEQ ID NO:242;t) SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, e SEQ ID NO:245;u) SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, e SEQ ID NO:248;v) SEQ ID NO:249, SEQ ID N0:250, e SEQ ID NO:251;w) SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:253, e SEQ ID NO:254;x) SEQ ID NO:255, SEQ ID NO:256, e SEQ ID NO:257;y) SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:259, e SEQ ID N0:260;z) SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:262, e SEQ ID NO:263;aa) SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:265, e SEQ ID NO:266;bb) SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:268, e SEQ ID NO:269;cc) SEQ ID N0:270, SEQ ID NO:271, e SEQ ID NO:272;dd) SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:393, e SEQ ID NO:394;ee) SEQ ID NQ:404, SEQ ID NQ:405, e SEQ ID NQ:406;e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmocompreendendo a referida VL se liga especificamente ao Sp35.
16. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que com-preende um ácido nucléico que codifica uma região variável da cadeia leveda imunoglobulina (VL)1 em que as referidas regiões CDR1, CDR2, e CDR3da referida VL são codificadas por seqüências de ácido nucléico seleciona-das a partir do grupo consistindo ema) SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, e SEQ ID N0:90;b) SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, e SEQ ID NO:96;c) SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:100, e SEQ ID N0:102;d) SEQ ID N0:104, SEQ ID N0:106, e SEQ ID N0:108;e) SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, e SEQ ID NO:114;f) SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, e SEQ ID NQ:120;g) SEQ ID ΝΟ:122, SEQ ID ΝΟ:124, e SEQ ID ΝΟ:126;h) SEQ ID ΝΟ:128, SEQ ID Ν0:130, e SEQ ID ΝΟ:132;I) SEQ ID ΝΟ:134, SEQ ID ΝΟ:136, e SEQ ID ΝΟ:138; ej) SEQ ID Ν0:140, SEQ ID ΝΟ:142, e SEQ ID ΝΟ:144.
17. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que com-preende um ácido nucléico que codifica uma região VL pelo menos 90% i-dêntica à seqüência de polipeptídeo VL de referência selecionada a partir dogrupo consistindo nas SEQ ID NOs: 381, 283, 373, 273 a 282, 284 a 286, 377 e 385, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno domesmo compreendendo a referida VL se liga especificamente ao Sp35.
18. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que com-preende um ácido nucléico que codifica uma região VL idêntica à seqüênciade polipeptídeo VL de referência selecionada a partir do grupo consistindonas SEQ ID NOs: 381, 283, 373, 273 a 282, 284 a 286, 377 e 385, excetopor menos que 20 substituições conservativas de aminoácido, e em que umanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo areferida VL se liga especificamente ao Sp35.
19. Composição caracterizada pelo fato de que compreende opolinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 18.
20. Composição caracterizada pelo fato de que compreendeuma VH que codifica um polinucleotídeo e uma VL que codifica um polinu-cleotídeo, em que a referida VH que codifica o polinucleotídeo e a referidaVL que codifica o polinucleotídeo, respectivamente, compreendem polinu-cleotídeos que codificam seqüências de amino ácidos pelo menos 90% idên-ticas aos polipeptídeos de referência selecionados a partir do grupo consis-tindo em:i) SEQ ID N0:380 e SEQ ID NO:381;ii) SEQ ID NO:170eSEQ ID NO:283;iii) SEQ ID NO:372 e SEQ ID NO:373;iv) SEQ ID NO:171 e SEQ ID NO:284;v) SEQ TD NO: 172 e SEQ ID NO:285;vi) SEQ ID NO:172eSEQ ID NO:286;vii) SEQ ID NO:158eSEQ ID NO:273;viii) SEQ ID NO:159 e SEQ ID NO:274;ix) SEQ ID N0:160 e SEQ ID NO:275;x) SEQ ID N0:161 e SEQ ID NO:276;xi) SEQ ID NO:163eSEQ ID NO:277;xii) SEQ ID NO:164 e SEQ ID NO:278;xiii) SEQ ID NO:165eSEQ ID NO:279;xiv) SEQ ID NO:166 e SEQ ID N0:280;xv) SEQ ID NO:167eSEQ ID NO:281;xvi) SEQ ID NO:168eSEQ ID NO:282;xvii) SEQ ID NO:376 e SEQ ID NO:377; exviii) SEQ ID NO:384 e SEQ ID NO:385;e em que as referidas VH e VL que codificam polinucleotídeos, juntas codifi-cam um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo que se liga especifi-camente ao Sp35.
21. Composição caracterizada pelo fato de que compreendeuma VH que codifica um polinucleotídeo e uma VL que codifica um polinu-cleotídeo, em que a referida VH que codifica o polinucleotídeo e a referidaVL que codifica o polinucleotídeo, respectivamente, compreendem polinu-cleotídeos que codificam seqüências de aminoácidos idênticas, exceto pormenos que 20 substituições conservativas de aminoácido, aos polipeptídeosde referência selecionados a partir do grupo consistindo em:i) SEQ ID N0:380 e SEQ ID NO:381;ii) SEQ ID NO:170eSEQ ID NO:283;iii) SEQ ID NO:372 e SEQ ID NO:373;iv) SEQ ID NO:171 e SEQ ID NO:284;v) SEQTD NO: 172 e SEQ ID NO:285;vi) SEQ ID NO:172eSEQ ID NO:286;vii) SEQ ID NO:158eSEQ ID NO:273;viii) SEQ ID NO:159 e SEQ ID NO:274;ix) SEQ ID N0:160 e SEQ ID NO:275;x) SEQ ID NO:161 e SEQ ID NO:276;xi) SEQ ID NO:163 e SEQ ID NO:277;xii) SEQ ID NO: 164 e SEQ ID NO:278;xiii) SEQ ID NO:165 e SEQ ID NO:279;xiv) SEQ ID NO:166 e SEQ ID N0:280;xv) SEQ ID NO:167eSEQ ID NO:281;xvi) SEQ ID NO:168eSEQ ID NO:282;xvii) SEQ ID NO:376 e SEQ ID NO:377;xviii) SEQ ID NO:384 e SEQ ID NO:385;e em que as referidas VH e VL que codificam polinucleotídeos, juntas codifi-cam um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo que se liga especifi-camente ao Sp35.
22. Composição caracterizada pelo fato de que compreendeuma VH que codifica um polinucleotídeo e uma VL que codifica um polinu-cleotídeo, em que a referida VH que codifica o polinucleotídeo e a referidaVL que codifica o polinucleotídeo, respectivamente, compreendem polinu-cleotídeos que codificam seqüências de aminoácidos idênticas aos polipep-tídeos de referência selecionados a partir do grupo consistindo em :i) SEQ ID N0:380 e SEQ ID NO:381ii) SEQ ID N0:170 e SEQ ID NO:283iii) SEQ ID NO:372 e SEQ ID NO:373iv) SEQ ID NO:171 e SEQ ID NO:284v) SEQ TD NO: 172 e SEQ ID NO:285;vi) SEQ ID NO:172 e SEQ ID NO:286;vii) SEQ ID NO:158 e SEQ ID NO:273;viii) SEQ ID NO:159 e SEQ ID NO:274;ix) SEQ ID NO:160eSEQ ID NO:275x) SEQ ID NO:161 e SEQ ID NO:276xi) SEQ ID NO:163eSEQ ID NO:277xii) SEQ ID NO:164eSEQ ID NO:278xiii) SEQ ID NO:165 e SEQ ID NO:279xiv) SEQ ID NO:166eSEQ ID N0:280xv) SEQ ID NO:167 e SEQ ID NO:281xvi) SEQ ID NO:168 e SEQ ID NO:282;xvii) SEQ ID NO:376 e SEQ ID NO:377; exviii) SEQ ID NO:384 e SEQ ID NO:385.
23. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o polinu-cleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 18.
24. Composição caracterizada pelo fato de que compreende ovetor como definido na reivindicação 23.
25. Composição caracterizada pelo fato de que compreende umprimeiro vetor compreendendo uma VH que codifica um polinucleotídeo co-mo definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 13 e um segundo vetorcompreendendo uma VL que codifica um polinucleotídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 14 a 18.
26. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreen-de o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 18 ou vetor como definido na reivindicação 23.
27. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreen-de pelo menos um primeiro e um segundo vetor, em que os referidos primei-ro e segundo vetor não são idênticos, em que o referido primeiro vetor com-preende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindica-ções 9 a 13 que codifica uma região variável da cadeia pesada da imunoglo-bulina, e em que o referido segundo vetor compreende o polinucleotídeocomo definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 18 que codifica umaregião variável da cadeia leve da imunoglobulina.
28. Método para a produção de um anticorpo anti-Sp35, caracte-rizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira comodefinida na reivindicação 26 ou 27, e a recuperação do referido anticorpo.
29. Anticorpo anti-Sp35, ou fragmento de ligação de antígeno domesmo, caracterizado pelo fato de que é produzido como definido no méto-do da reivindicação 28.
30. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de que compre-ende uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina (VH), em queas regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da referida VH são pelo menos 90% idên-ticas, respectivamente, às seqüências CDR1, CDR2, e CDR3 das cadeiaspesadas de referência selecionadas a partir do grupo consistindo em: a) SEQ ID N0:401, SEQ ID N0:402 e SEQ ID N0:403; b) SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, e SEQ ID NO:79 c) SEQ ID NO:389, SEQ ID N0:390 e SEQ ID NO:391 d) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, e SEQ ID N0:10, e) SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, e SEQ ID NO:16, f) SEQ ID NO:18, SEQ ID N0:20, e SEQ ID NO:22, g) SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, e SEQ ID NO:28, h) SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:34, i) SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, e SEQ ID N0:40, j) SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, e SEQ ID NO:46, k) SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:50, e SEQ ID NO:52, I) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, e SEQ ID NO:58, m) SEQ ID N0:60, SEQ ID NO:61, e SEQ ID NO:62, n) SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, e SEQ ID NO:68, o) SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, e SEQ ID N0:70, P) SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, e SEQ ID NO:76, q) SEQ ID N0:80, SEQ ID NO:81, e SEQ ID NO:82, r) SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, e SEQ ID NO:85; s) SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196 e SEQ ID NO:197; t) SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199 e SEQ ID N0:200; u) SEQ ID N0:201, SEQ ID N0:202 e SEQ ID N0:203; v) SEQ ID N0:204, SEQ ID N0:205 e SEQ ID N0:206; w) SEQ ID N0:207, SEQ ID N0:208 e SEQ ID N0:209; x) SEQ ID N0:210, SEQ ID NO:211 e SEQ ID NO:212; y) SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214 e SEQ ID NO:215; z) SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217 e SEQ ID NO:218; aa) SEQ ID NO:219, SEQ ID N0:220 e SEQ ID NO:221; bb) SEQ ID NO:219, SEQ ID N0:220 e SEQ ID NO:221; cc) SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 e SEQ ID NO:224; dd) SEQ ID NO:225, SEQ ID NO:226 e SEQ ID NO:227;ee) SEQ ID ΝΟ:228, SEQ ID ΝΟ:229 e SEQ ID Ν0:230;ff) SEQ ID ΝΟ:231, SEQ ID ΝΟ:232 e SEQ ID ΝΟ:233;gg) SEQ ID ΝΟ:395, SEQ ID ΝΟ:396 e SEQ ID ΝΟ:397;hh) SEQ ID Ν0:407, SEQ ID Ν0:408 e SEQ ID Ν0:409;e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmocompreendendo a referida VH se liga especificamente ao Sp35.
31. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de que compre-ende uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina (VH)1 em queas regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da referida VH são idênticas, respectiva-mente, exceto por menos que 20 substituições conservativas de aminoácido,às seqüências CDR1, CDR2, e CDR3 das cadeias pesadas de referênciaselecionadas a partir do grupo consistindo em:a) SEQ ID N0:401, SEQ ID N0:402 e SEQ ID N0:403;b) SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, e SEQ ID NO:79c) SEQ ID NO:389, SEQ ID N0:390 e SEQ ID NO:391d) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, e SEQ ID N0:10,e) SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, e SEQ ID NO:16,f) SEQ ID NO:18, SEQ ID N0:20, e SEQ ID NO:22,g) SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, e SEQ ID NO:28,h) SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:34,i) SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, e SEQ ID N0:40,j) SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, e SEQ ID NO:46,k) SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:50, e SEQ ID NO:52,I) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, e SEQ ID NO:58,m) SEQ ID N0:60, SEQ ID NO:61, e SEQ ID NO:62,n) SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, e SEQ ID NO:68,o) SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, e SEQ ID N0:70,p) SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, e SEQ ID NO:76,q) SEQ ID N0:80, SEQ ID NO:81, e SEQ ID NO:82,r) SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, e SEQ ID NO:85;s) SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196 e SEQ ID NO:197;t) SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199 e SEQ ID N0:200;u) SEQ ID Ν0:201, SEQ ID Ν0:202 e SEQ ID Ν0:203;ν) SEQ ID Ν0:204, SEQ ID Ν0:205 e SEQ ID Ν0:206;w) SEQ ID Ν0:207, SEQ ID Ν0:208 e SEQ ID Ν0:209;χ) SEQ ID Ν0:210, SEQ ID ΝΟ:211 e SEQ ID ΝΟ:212;y) SEQ ID ΝΟ:213, SEQ ID ΝΟ:214 e SEQ ID ΝΟ:215;z) SEQ ID ΝΟ:216, SEQ ID ΝΟ:217 e SEQ ID ΝΟ:218;aa) SEQ ID ΝΟ:219, SEQ ID Ν0:220 e SEQ ID ΝΟ:221;bb) SEQ ID ΝΟ:219, SEQ ID Ν0:220 e SEQ ID ΝΟ:221;cc) SEQ ID ΝΟ:222, SEQ ID ΝΟ:223 e SEQ ID ΝΟ:224;dd) SEQ ID ΝΟ:225, SEQ ID ΝΟ:226 e SEQ ID ΝΟ:227;ee) SEQ ID ΝΟ:228, SEQ ID ΝΟ:229 e SEQ ID Ν0:230;ff) SEQ ID ΝΟ:231, SEQ ID ΝΟ:232 e SEQ ID ΝΟ:233;gg) SEQ ID ΝΟ:395, SEQ ID ΝΟ:396 e SEQ ID ΝΟ:397; ehh) SEQ ID Ν0:407, SEQ ID Ν0:408 e SEQ ID Ν0:409;e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmocompreendendo a referida VH se liga especificamente ao Sp35.
32. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de que compre-ende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH)1 em queas regiões CDR1, CDR2, e CDR3 da referida VH são selecionadas a partirdo grupo consistindo em:a) SEQ ID N0:401, SEQ ID N0:402 e SEQ ID N0:403;b) SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, e SEQ ID NO:79c) SEQ ID NO:389, SEQ ID N0:390 e SEQ ID NO:391d) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, e SEQ ID N0:10,e) SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, e SEQ ID NO:16,f) SEQ ID NO:18, SEQ ID N0:20, e SEQ ID NO:22,g) SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, e SEQ ID NO:28,h) SEQ ID N0:30, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:34,i) SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, e SEQ ID N0:40,j) SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, e SEQ ID NO:46,k) SEQ ID NO:48, SEQ ID N0:50, e SEQ ID NO:52,I) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, e SEQ ID NO:58,m) SEQ ID N0:60, SEQ ID NO:61, e SEQ ID NO:62,n) SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, e SEQ ID NO:68,o) SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, e SEQ ID NOJO,P) SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, e SEQ ID NO:76,q) SEQ ID N0:80, SEQ ID NO:81, e SEQ ID NO:82,r) SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, e SEQ ID NO:85;s) SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196 e SEQ ID NO:197;t) SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199 e SEQ ID N0:200;u) SEQ ID N0:201, SEQ ID N0:202 e SEQ ID N0:203;v) SEQ ID N0:204, SEQ ID N0:205 e SEQ ID N0:206;w) SEQ ID N0:207, SEQ ID N0:208 e SEQ ID N0:209;x) SEQ ID N0:210, SEQ ID NO:211 e SEQ ID NO:212;y) SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214 e SEQ ID NO:215;z) SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217 e SEQ ID NO:218;aa) SEQ ID NO:219, SEQ ID N0:220 e SEQ ID NO:221;bb) SEQ ID NO:219, SEQ ID N0:220 e SEQ ID NO:221;cc) SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 e SEQ ID NO:224;dd) SEQ ID NO:225, SEQ ID NO:226 e SEQ ID NO:227;ee) SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229 e SEQ ID N0:230;ff) SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232 e SEQ ID NO:233;gg) SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:396 e SEQ ID NO:397; (hh) SEQ ID NQ:407, SEQ ID NQ:408 e SEQ ID NQ:409.
33. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de ende uma VH pelo menos 90% idêntica à seqüência VH de referência sele-cionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 380, 170, 372, 158 a- 169, 171, 172, 376 e 384 em que um anticorpo ou fragmento de ligação deantígeno do mesmo compreendendo a referida VH se liga especificamenteao Sp35.
34. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de que compre-ende uma VH idêntica a uma seqüência VH de referência selecionada a par-tir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 380, 170, 372, 158 a 169, 171,- 172, 376 e 384, exceto por menos que 20 substituições conservativas deaminoácido, e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno domesmo compreendendo a referida VH se liga especificamente ao Sp35.
35. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de que compre-ende uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina (VL), em que asregiões CDR1, CDR2, e CDR3 da referida VL são pelo menos 90% idênti-cas, respectivamente, às seqüências CDR1, CDR2, e CDR3 das cadeiasleves de referência selecionadas a partir do grupo consistindo em: a) SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, e SEQ ID N0:400; b) SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, e SEQ ID NO:148 c) SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:387, e SEQ ID NO:388 d) SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, e SEQ ID NO:91; e) SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, e SEQ ID NO:97; f) SEQ ID NO:99, SEQ ID N0:101, e SEQ ID N0:103; g) SEQ ID N0:105, SEQ ID N0:107, e SEQ ID N0:109; h) SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, e SEQ ID NO:115; i) SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, e SEQ ID NO:121; j) SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, e SEQ ID NO:127; k) SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, e SEQ ID NO:133; I) SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, e SEQ ID NO:139; m) SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, e SEQ ID NO:145; n) SEQ ID NO:149, SEQ ID N0:150, e SEQ ID NO:151; o) SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:153, e SEQ ID NO:154; P) SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156, e SEQ ID NO:157; q) SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, e SEQ ID NO:236, r) SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, e SEQ ID NO:239; s) SEQ ID N0:240, SEQ ID NO:241, e SEQ ID NO:242; t) SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, e SEQ ID NO:245; u) SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, e SEQ ID NO:248; v) SEQ ID NO:249, SEQ ID N0:250, e SEQ ID NO:251; w) SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:253, e SEQ ID NO:254; x) SEQ ID NO:255, SEQ ID NO:256, e SEQ ID NO:257; y) SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:259, e SEQ ID NQ:260;z) SEQ ID ΝΟ:261, SEQ ID ΝΟ:262, e SEQ ID ΝΟ:263;aa) SEQ ID ΝΟ:264, SEQ ID ΝΟ:265, e SEQ ID ΝΟ:266;bb) SEQ ID ΝΟ:267, SEQ ID ΝΟ:268, e SEQ ID ΝΟ:269;cc) SEQ ID Ν0:270, SEQ ID ΝΟ:271, e SEQ ID ΝΟ:272;dd) SEQ ID ΝΟ:392, SEQ ID ΝΟ:393, e SEQ ID ΝΟ:394; eee) SEQ ID Ν0:404, SEQ ID Ν0:405, e SEQ ID Ν0:406;e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmocompreendendo a referida VH se liga especificamente ao Sp35.
36. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de que compre-ende uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina (VL)1 em que asregiões CDR1, CDR2, e CDR3 da referida VL são idênticas, respectivamen-te, exceto por menos do que 20 substituições conservativas de aminoácidos,às seqüências CDR1, CDR2, e CDR3 das cadeias leves de referência sele-cionadas a partir do grupo consistindo em:a) SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, e SEQ ID N0:400;b) SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, e SEQ ID NO:148c) SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:387, e SEQ ID NO:388d) SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, e SEQ ID NO:91;e) SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, e SEQ ID NO:97;f) SEQ ID NO:99, SEQ ID N0:101, e SEQ ID N0:103;g) SEQ ID N0:105, SEQ ID N0:107, e SEQ ID N0:109;h) SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, e SEQ ID NO:115;i) SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, e SEQ ID NO:121;j) SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, e SEQ ID NO:127;k) SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, e SEQ ID NO:133;I) SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, e SEQ ID NO:139;m) SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, e SEQ ID NO:145;n) SEQ ID NO:149, SEQ ID N0:150, e SEQ ID NO:151;o) SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:153, e SEQ ID NO:154;P) SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156, e SEQ ID NO:157;q) SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, e SEQ ID NO:236,r) SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, e SEQ ID NO:239;s) SEQ ID Ν0:240, SEQ ID ΝΟ:241, e SEQ ID ΝΟ:242;t) SEQ ID ΝΟ:243, SEQ ID ΝΟ:244, e SEQ ID ΝΟ:245;u) SEQ ID ΝΟ:246, SEQ ID ΝΟ:247, e SEQ ID ΝΟ:248;ν) SEQ ID ΝΟ:249, SEQ ID Ν0:250, e SEQ ID ΝΟ:251;w) SEQ ID ΝΟ:252, SEQ ID ΝΟ:253, e SEQ ID ΝΟ:254;χ) SEQ ID ΝΟ:255, SEQ ID ΝΟ:256, e SEQ ID ΝΟ:257;y) SEQ ID ΝΟ:258, SEQ ID ΝΟ:259, e SEQ ID Ν0:260;z) SEQ ID ΝΟ:261, SEQ ID ΝΟ:262, e SEQ ID ΝΟ:263;aa) SEQ ID ΝΟ:264, SEQ ID ΝΟ:265, e SEQ ID ΝΟ:266;bb) SEQ ID ΝΟ:267, SEQ ID ΝΟ:268, e SEQ ID ΝΟ:269;cc) SEQ ID Ν0:270, SEQ ID ΝΟ:271, e SEQ ID ΝΟ:272;dd) SEQ ID ΝΟ:392, SEQ ID ΝΟ:393, e SEQ ID ΝΟ:394; eee) SEQ ID Ν0:404, SEQ ID Ν0:405, e SEQ ID Ν0:406;e em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmocompreendendo a referida VL se liga especificamente ao Sp35.
37. Polipeptideo isolado caracterizado pelo fato de que compre-ende uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina (VL)1 em que asregiões CDR1, CDR2, e CDR3 da referida VL são selecionadas a partir dogrupo consistindo em:a) SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, e SEQ ID N0:400;b) SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, e SEQ ID NO:148c) SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:387, e SEQ ID NO:388d) SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, e SEQ ID NO:91;e) SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, e SEQ ID NO:97;f) SEQ ID NO:99, SEQ ID N0:101, e SEQ ID N0:103;g) SEQ ID N0:105, SEQ ID N0:107, e SEQ ID N0:109h) SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, e SEQ ID NO:115i) SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, e SEQ ID NO:121j) SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, e SEQ ID NO:127k) SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, e SEQ ID NO:133l) SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, e SEQ ID NO:139m) SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, e SEQ ID NO:145n) SEQ ID NO:149, SEQ ID N0:150, e SEQ ID NO:151;o) SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:153, e SEQ ID NO:154;P) SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156, e SEQ ID NO:157;q) SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, e SEQ ID NO:236,r) SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, e SEQ ID NO:239;s) SEQ ID N0:240, SEQ ID NO:241, e SEQ ID NO:242;t) SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, e SEQ ID NO:245;u) SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, e SEQ ID NO:248;v) SEQ ID NO:249, SEQ ID N0:250, e SEQ ID NO:251;w) SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:253, e SEQ ID NO:254;x) SEQ ID NO:255, SEQ ID NO:256, e SEQ ID NO:257;y) SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:259, e SEQ ID N0:260;z) SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:262, e SEQ ID NO:263;aa) SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:265, e SEQ ID NO:266;bb) SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:268, e SEQ ID NO:269;cc) SEQ ID N0:270, SEQ ID NO:271, e SEQ ID NO:272;dd) SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:393, e SEQ ID NO:394;ee) SEQ ID NQ:404, SEQ ID NQ:405, e SEQ ID NQ:406.
38. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de ende uma VL pelo menos 90% idêntica à seqüência VL de referência sele-cionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 381, 283, 373, 273 a-282, 284 a 286, 377 e 385, em que um anticorpo ou fragmento de ligação deantígeno do mesmo compreendendo a referida VL se liga especificamenteao Sp35.
39. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de que compre-ende uma VL idêntica à seqüência de referência VL, exceto por menos doque 20 substituições conservativas de aminoácidos, selecionada a partir dogrupo consistindo em SEQ ID NOs: 381, 283, 373, 273 a 282, 284 a 286,-377 e 385, em que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno domesmo compreendendo a referida VL se liga especificamente ao Sp35.
40. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno domesmo caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações 30 a 39.
41. Composição caracterizada pelo fato de que compreende umpolipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 39 ouanticorpo como definido nas reivindicações 1 a 8, 29 oe 40.
42. Uso de um agente selecionado do grupo consistindo em umanticorpo isolado Sp35 ou fragmento do mesmo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 8, 29 e 40, o polinucleotídeo isolado como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 9 a 18, o polipeptídeo isolado co-mo definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 39, ou a composiçãocomo definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 22, 24, 25 e 41,caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento pa-ra tratar injurias ao SNC.
43. Uso de um agente selecionado do grupo consistindo em umanticorpo isolado Sp35 ou fragmento do mesmo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 8, 29 e 40, o polinucleotídeo isolado como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 9 a 18, o polipeptídeo isolado co-mo definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 39, ou a composiçãocomo definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 22, 24, 25 e 41,caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento pa-ra tratar doenças ou desordens associadas com a inibição do crescimentoneuronal no SNC.
44. Uso de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelofato de que as referidas doenças ou desordens são selecionadas a partir dogrupo consistindo em ELA, doença de Huntington, mal de Alzheimer, mal deParkinson, neuropatia diabética, e derrame.
45. Uso de um agente selecionado do grupo consistindo em umanticorpo isolado Sp35 ou fragmento do mesmo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 8, 29 e 40, o polinucleotídeo isolado como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 9 a 18, o polipeptídeo isolado co-mo definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 39, ou a composiçãocomo definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 22, 24, 25 e 41,caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento pa-ra tratar doenças ou desordens associadas com a inibição do crescimentoou diferenciação dos oligodendrócitos.
46. Uso de um agente selecionado do grupo consistindo em umanticorpo isolado Sp35 ou fragmento do mesmo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 8, 29 e 40, o polinucleotídeo isolado como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 9 a 18, o polipeptídeo isolado co-mo definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 39, ou a composiçãocomo definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 22, 24, 25 e 41,caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento pa-ra tratar doenças ou desordens associadas com a desmielinização ou dismi-elinização de neurônios do SNC.
47. Uso de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelofato de que as referidas doenças ou desordens são selecionadas a partir dogrupo consistindo em esclerose múltipla, Ieucoencefalopatia multifocal pro-gressiva, encefalomielite, mielinólise central pontina, degeneração de Walle-rian, adrenoleucodistrofia, síndrome de Alexander, e doença de Pelizaeus.
48. Método in vitro para inibição do sinal de transdução por N-gRI, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o NgRI com umaquantidade eficaz de um agente selecionado a partir do grupo consistindo noanticorpo isolado Sp35 ou fragmento do mesmo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 8, 29 e 40, o polinucleotídeo isolado como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 9 a 18, o polipeptídeo isolado co-mo definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 39, ou a composiçãocomo definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 22, 24, 25 e 41.
49. Método in vitro para redução da inibição do crescimento a-xonal de um neurônio do sistema nervoso central (SNC), caracterizado pelofato de que compreende contatar o neurônio com uma quantidade eficaz deum agente selecionado a partir do grupo consistindo no anticorpo Sp35 iso-lado ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindi-cações 1 a 8, 29 e 40, o polinucleotídeo isolado como definido em qualqueruma das reivindicações 9 a 18, o polipeptídeo isolado como definido emqualquer uma das reivindicações 30 a 39, ou a composição como definidaem qualquer uma das reivindicações 19 a 22, 24, 25 e 41.
50. Método in vitro para inibição do crescimento do colapso docone de um neurônio do SNC1 caracterizado pelo fato de que compreendecontatar o neurônio com uma quantidade eficaz de um agente selecionado apartir do grupo consistindo no anticorpo Sp35 isolado ou fragmento do mes-mo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, 29 e 40, o po-linucleotídeo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a- 18, o polipeptídeo isolado como definido em qualquer uma das reivindica-ções 30 a 39, ou a composição como definida em qualquer uma das reivindi-cações 19 a 22, 24, 25 e 41.
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