BRPI0613621A2

BRPI0613621A2 - polipeptìdeo, composição e uso do sobrenadante de p. pastoris

Info

Publication number: BRPI0613621A2
Application number: BRPI0613621-4A
Authority: BR
Inventors: Jannel Acosta Alba; Mario Pablo Estrada Garcia; Yamila Carpio Gonzalez; Reynold Morales Fernandez
Original assignee: Ct Ingenieria Genetica Biotech
Priority date: 2005-07-21
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2012-11-06
Also published as: CA2615833C; DE602006008478D1; ZA200800924B; CA2615833A1; ES2331627T3; EP1911764A1; WO2007009403A1; CN101253194A; MX2008000962A; US20100167998A1; US7919463B2; KR101190022B1; AU2006272216B2; IL188864A0; RU2008106612A; CN101253194B; MY145699A; EP1911764B1; JP2009501735A; KR20080041656A

Abstract

POLIPEPTìDEO, COMPOSIçãO E USO DO SOBRENADANTE DE P.PASTORIS. A presente invenção está relacionada com polipeptídeos que apresentam uma atividade superior ao hormónio de crescimento de tilápia. Estes polipeptídeos são capazes de estimular o crescimento, a sobrevida e a qualidade das larvas de peixes e crustáceos. Ademais, eles incrementam a defesa do organismo contra agentes patogênicos e estimulam parâmetros relacionados com o sistema imune de organismos aquáticos. Os genes que codificam para ditos polipeptídeos foram clonados em um vetor de expressão em Pichia pastoris que permite a obtenção da proteína de forma extracelular. O sobrenadante de cultivo que contém os polipeptídeos de interesse foi administrado por banhos de imersão ou como suplemento na ração a organismo aquáticos.

Description

"POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO E USO DO SOBRENADANTE DE P. PASTORIS"

Campo da Técnica

A presente invenção diz respeito ao campo da biotecnologia aquática, em particular aos polipeptídeos com uma atividade superior em comparação com o hormônio de crescimento da tilápia e o uso destes polipeptídeos para aumentar a sobrevida e a qualidade das larvas mediante a administração via imersão ou como um suplemento no peso de sobrenadante de cultivo de Pichiapastoris.. Estado da Técnica Anterior

As pesquisas de agentes capazes de potenciar o crescimento em organismos aquáticos constitui um tema de atenção para numerosos laboratórios de investigação. O hormônio de crescimento (GH) tem sido o principal foco de atenção de ditas investigações. Foi relatada a existência de GH em mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes. O GH ou somatotropina é um polipeptídeo sintetizado e secretado pelos somatótrofos da glândula pituitária anterior em resposta a peptídeos hipotalâmicos (Barinaga, M. et ai. (1985) Independent effects of growth hormone releasing factor on growth hormone release and gene transcription. Nature 314: 279-281). O GH se acha envolvido na regulação do crescimento, desenvolvimento, metabolismo, apetite e osmorregulação em peixes (Donaldson, Ε. M. et al. (1979) Hormonal enhancement of growth. Fish Physiol. 8: 455-597). Além de seus efeitos anabólicos sobre o crescimento somático pós-natal, nos peixes ele também tem efeito sobre as células do sistema imune. Conhece-se a sua estimulação na proliferação das células T e sua atividade receptora de antígenos, atua como co-estimulador da maturação detes linfócitos (Harris, H. e Bird, D. J. (1997). Os efeitos de α-MSH e MCH sobre as proliferações dos linfócitos da truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) in vitro. Em: Kawashimai S., Kikuyamai S., (Eds.), Advances in Comparative Endoerinology. Monduzzi Editoire, Bologn pp. 1023-1026a).

E interessante sua semelhança estrutural com uma série de citocinas incluídas as interleucinas: IL-2, IL-4, IL-5, o fator estimulador de colônias de granulócitos, o fator estimulador de macrófagos-granulócitos, e o interferon (S rang, S. R. e Bazan, J. F. (1993) Cytokine structural taxonomy and mechanisms of receptor engagement. Curr. Opin. Struc. Biol 3: 815- 827). Em mamíferos, estimula a fagocitose, a maturação e a diferenciação de timócitos (Ortega, E. et ai. (1996) Effects of prolactin on the in vitro phagocytic capacity of macrophages. Comp. Immunol Immunopathol 61: 389-393) e a apoptose das células produtoras das células T (Murphy5 W. J. e Longo, D. L. (2000) Growth hormone as an immunodulating therapeutic agent. Immunol Today 121: 211-213). Similarmente, foi provado seu efeito estimulador da linfopoiese e da fagocitose em Sparus aurata e Sparus sarba unido à mitogênese dos leucócitos em Oncorhvnctus keta (Sakai. M. et al. (1996). Increase in Haemolytic activity of serum from rainbow trout Oncorhynctus mykiss injected with exogenous growth hormone. Fish Shellfish Immunol 6: 615-617), fagocitose, ativação das células NKi produção de anticorpos e a atividade hemolítica do complemento em Oncorhyncus mykiss ÍYada. T. et al. (1999) Effects of prolactin and growth hormone on plasma immunoglobulin M leveis of hipophysectomizes rainbow trout, Oncorhyncus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol 115: 46-52) e a explosão respiratória dos leucócitos na truta arco-íris (Oneorhvnehus mykiss) e Dieentrarchus labrax (Munoz, P. et al. (1998) Modulation of the respiratory burst activity of Mediterranean sea bass (Dicentrarchus labrax L.) phagocytes by growth hormone and parasitic status. Fish shellfish Immunol 8: 25-36). Além disso, foi demonstrado que ao transferir Salmo trutta da água doce para a água do mar, incrementa-se os níveis de GH no plasma enquanto se reduz o título de hormônios tireoidianos e este por sua vez se correlaciona com o incremento da atividade fagocítica dos leucócitos do rim e eleva a concentração de lisozima plasmática. Alguns estudos salientam a expressão dos receptores específicos para o GH na superfície do linfócito T (LØT) e receptores para os fatores de crescimento tipo insulina (em inglês "insulin-like growth factor-Γ, abreviado IGF-I) (Tapsonj V. F. et ai. (1988) Structural and functional characterization of the human T lymphocyte receptor for insulin- Iike growth factor I in vitro. Clin. C. Invest 82: 950-957). Foi comprovado in vitro seu efeito indutivo sobre a proliferação dos LØT. É conhecido o efeito indutivo do IGF-I sobre os linfócitos B, imunoglobulinas e células plasmáticas resultando os primeiros os de mais alto grau de expressão do receptor do GH de todas as células plasmáticas (Badolato, R. et ai. (1994) Differential expression of surface membrane growth hormome receptor on human peripheral blood lymphocytes detected by dual fluorochrome flow cytometry. J Clin Endocrinol Metab. 79: 984-990).

O GH pode afetar os linfócitos B (LØB) e LØT indiretamente por seu efeito indutor sobre os macrófagos (MØ) e os monócitos (Edwards, C. K. et ai. (1988) A newly defined property of so matotropin: priming of macrophages for production of superoxide anion. Science 239: 769-771) nestes últimos também promove a quimiotaxia. Estas células por sua vez influem sobre os linfócitos através das citocinas que secretam. Além disso, o GH reverte a deficiência de células NK (Davila5 D. R. et al. (1987) Role of growth hormone in regulating T-dependent immune events in aged, nude, and transgenic rodents. Neurosci. Res. 18: 108-116).

O DNA complementar (DNAc) de hormônios de crescimento de peixes foi clonado e seqüenciado e foi demonstrado que o GH recombinante exerce um potente efeito sobre o crescimento em peixes, por injeção (Tsai, H. J. et al. (1993). Expression of rainbow trout growth hormone cDNA in yeast. Bull Inst Zool Acad Sin. 32: 162-170) ou por imersão (Moriyama, S. e Kawauchi, H. (1990). Growth stimulation of juvenile salmonids by immersion in recombinant salmon growth hormone. Nippon Suisan Gakkaishi 56: 31-34).

O GH humano existe como um grupo heterogêneo de proteínas relacionadas estruturalmente que se encontram na glândula pituitária (Baumann, G. et al. (1983) The molecular nature of circulating growth hormone in normaland acromegalic man: evidence for a principal and minor monomeric forms. J. Clin. Endocrinol Metab. 56: 946-952), no plasma (Baumann, G. et al. (1985) Molecular forms of circulating growth hormone during spontaneous secretory episodes and in the basal state. J. Clin. Endocrinol Metab. 60: 1216-1220) e na urina (Baumann, G. e Abramson, (1983). Urinary growth hormone in man: evidence for multiple molecular forms. Endoerinology 56: 305-311). A forma predominante de GH humano é um polipeptídeo de 22 kDa formado por uma única cadeia polipeptídica e que constitui 85% dos GHs humanos imunorreativos (Lewis, U. J. et al. (1994) Variant forms and fragments of human growth hormone in serum. Acta Paediatr. Suppl 399: 29-31). Outras moléculas do GH humano incluem um polipeptídeo formado por uma única cadeia polipeptídica com um peso molecular de 20 kDa (Lewis, U. J. et al. (1978) A naturally occurring structural variant of human growth hormone. J. Biol Chem. 253: 2679-2687), formas de 22 KDa acetiladas e desamidadas da proteína de 22 kDa (Lewis, U. J. et al. (1981). Altered proteolytic cleavage of human growth hormone as a result of deamidation. J. Biol Chem. 256: 11645-11650) e uma variante cortada proteoliticamente para formar uma proteína de duas cadeias polipeptídicas unidas por pontes dissulfiiro (Singh, R. N. et al. (1974) Modified forms of human growth hormone with increased biological activities. Endoerinology 94: 883-891). Vários estudos demonstraram que a forma ativa é esta última variante que é o resultado de digestões limitadas por proteinases entre os resíduos de aminoácidos 134 e 150 do GH humano de 22 kDa (Wroblewski, V. J. et al. (1991) Proteolytic cleavage of human growth hormone (hGH) by rat tissues in vitro: influence on the kinetics of exogenously administered hGH. Endocrinology 129: 465-474). Sugere-se que a maior atividade biológica desta variante se deve a que ela é mais estável e é e é depurada da circulação mais lentamente que o resto das variantes (Baumann, G. (1979) Metabolic clearance rates of isohormones of human growth hormone inman. J. Clin. Endocrinol Metab. 49: 495-499).

O desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante permitiu empregar bactérias e leveduras como sistemas hospedeiros para a produção de proteínas de interesse em um processo relativamente barato. A levedura Pichia pastoris constitui atualmente um hospedeiro para produzir proteínas heterólogas. Este organismo oferece os benefícios de sistemas como Escheriehia coli consistentes em altos níveis de expressão, fácil manipulação e cultivo e é capaz de combinar estes com as vantagens de um sistema eucariótico que realiza modificações pós-translacionais como o processamento proteolítico, a reduplicação, a glicosilação e a formação de enlaces dissulfuro (Higginsj D. R. e Cregg, J. M. (1998) Introduction to Pichiapastoris. Pichia protocols, HumanaPress Inc., Towota 1-15).

Como sistema de expressão, requer um manejo genético e molecular simples. Ele é menos caro do que a expressão em células de insetos ou em cultivos celulares de mamíferos, porque os meios para seu crescimento e expressão não requerem suplementos especiais. Esta levedura se adapta facilmente a fermentações em grande escala e tem preferência pelo crescimento respiratório, uma característica fisiológica que facilita seu cultivo a altas densidades celulares.

Existem vários relatos de estimulação do crescimento mediante o uso de leveduras recombinantes que expressam hormônio de crescimento. Foi demonstrado o efeito sobre o crescimento de frangos alimentados com ração enriquecida com P. pastoris que expressa GH (Chen, C. M. et ai. (2000) Growth enhancement of fowls by dietary administration of recombinant yeast cultures containing enriched growth hormone. Life Sciences 67: 2103-2115). Além disso, Tsai e colaboradores reportaram em1993 um crescimento acelerado em tilápias por administração, como suplemento na dieta de levedura Saccharomyces cerevisiae que expressa GH (Tsai5 H. J. et ai. (1993) Enhancement of tilapia growth by dietary administration of recombinant yeast lysates as a supplement J. Fish Soe. Taiwan 20: 339-345).

Na patente US 6.239.100, protege-se um polipeptídeo com uma atividade similar ao hormônio de crescimento de peixes e seu uso para promover o crescimento e reduzir a mortalidade em larvas de peixes. Promover o crescimento, aumentar a sobrevida e melhorar a

qualidade das larvas se mantém como um problema importante a resolver na aquacultivo. Explicação da invenção

A presente invenção resolve o problema acima mencionado proporcionando polipeptídeos com as seqüências de aminoácidos SEQ ID NOS: 7 e 8, que mostram atividade superior ao hormônio do crescimento para seu uso em peixes e crustáceos.

Como resultado principal, encontrou-se que os polipeptídeos os quais compreendem as seqüências de aminoácidos mencionadas anteriormente, expressos de forma extracelular em Pichia pastoris, e administrados por banhos de imersão ou como suplemento da ração para peixes e crustáceos produz um incremento marcado no crescimento, aumenta a sobrevida e a qualidade das larvas e melhora o sistema imune. Além disso, foi demonstrada a superioridade dos com respeito ao hormônio do crescimento de tilápia.

O uso destes polipeptídeos na aquacultivo oferece várias vantagens: entre as quais se encontram (1) são moléculas menores que o hormônio de crescimento de peixes, pelo que podem ser absorvidas pelo organismo e chegar à corrente sangüínea com maior facilidade; (2) ao eles ser fragmentos do hormônio de crescimento de peixes, não têm atividade biológica em humanos; (3) têm um efeito significativamente maior sobre o crescimento do que o hormônio de crescimento de peixes; (4) exercem efeitos notáveis sobre o crescimento, a sobrevida e a qualidade das larvas em uma variedade de peixes.

Na patente US 6.239.100 protege-se o uso de um polipeptídeo com atividade similar ao hormônio do crescimento do peixe para estimular o crescimento e diminuir a mortalidade em larvas de peixes. A seqüência relatada para dito polipeptídeo tem 73% de homologia comparado com o hormônio do crescimento de tilápia e carece de 51 nucleotídeos da porção N- terminal. Os polipeptídeos da presente invenção foram obtidos a partir do hormônio de crescimento de tilápia. O polipeptídeo SEQ ID NO: 7 carece de um fragmento da porção C terminal correspondente a 46 aminoácidos e o polipeptídeo SEQ ID NO: 8 carece deste fragmento e ademais de um fragmento em sua porção N terminal correspondente a 17 aminoácidos. Diferentemente da Patente US 6.239.100, que relata um polipeptídeo com atividade similar ao hormônio do crescimento, os polipeptídeos da presente invenção têm uma atividade superior ao hormônio do crescimento a qual não é específica da espécie. Além disso, o polipeptídeo SEQ ID NO: 7, que carece de um fragmento da porção C terminal, tem uma atividade promotora do crescimento superior ao polipeptídeo SEQID NO: 8.

Em uma materialização da invenção, as composições que compreendem qualquer dos polipeptídeos definidos nas seqüências de aminoácidos SEQ ID NOS: 7 e 8 estimulam o crescimento de peixe e crustáceos.

A presente invenção envolveu a clonagem da seqüência codificadora dos polipeptídeos mencionados acima em um vetor de expressão de Pichiapastoris denominado pPSIO.

As seqüências codificadoras para ditos polipeptídeos foram obtidas mediante Reação em Cadeia da Polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction abreviado PCR) a partir de cDNA do hormônio do crescimento de tilápia anteriormente clonado no vetor pR17 (Guillén, Ι. I. et al. (1998) Physiological changes in the juvenile euryhaline teleost, the tilapia Oreochromis homorum, injected with E. coli-derived homologous growth hormone. J. Mar. Biotechnol 6: 142-151). O hormônio de crescimento de tilápia foi também amplificado por PCR a partir do mesmo vetor (pR17).

O vetor utilizado na construção genética para a expressão das proteínas de interesse em P. pastoris contém o promotor AOXl de P. pastoris (pAOXl), o sinal de secreção da sacarose invertase 2 de S. cerevisiae (spSUC2) e o sinal de terminação da enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPt) de S. cerevisiae. Está presente ainda uma seqüência de DNA cromossômico de P.pastoris correspondente à região 3 'AOX necessária para a recombinação de homólogos com a levedura e o gene HIS3 de S. cerevisiae, que constitui o marcador de seleção em leveduras. O vetor contém ainda uma origem de replicação funcional em E. coli e o gene de resistência a ampicilina como marcador de seleção em bactérias. Os vetores usados para gerar cepas recombinantes de P. pastoris são geralmente integrativos. Antes da transformação, os plasmídeos devem ser linearizados com vistas a favorecer a recombinação homóloga pelo gene AOX1.

A cepa MP36 de P. pastoris foi utilizada para a produção extracelular das proteínas recombinantes. Dita cepa é um mutante auxotrófico his3 obtido da cepa de Pichia pastoris BKM-90 (EP 00438200) a qual, após a transformação com o vetor de expressão, adquire um fenótipo His+ (Yong, V. et al. (1992) HIS-3 gene of Saccharomyces cerevisiae complement his mutation in yeast Pichia pastoris. Biotecnologia Aplicada 9: 55-61).

Vários estudos têm demonstrado um efeito estimulador do crescimento pela administração via imersão de hormônio do crescimento recombinante em várias espécies de peixes. Não obstante, esta invenção constitui o primeiro relato sobre a estimulação do crescimento em peixes por imersão em sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris contendo polipeptídeos com atividade superior ao hormônio do crescimento sem purificação prévia das proteínas de interesse.

O efeito dos polipeptídeos que são o objetivo da presente invenção sobre o crescimento, a resistência a patógenos e os parâmetros do sistema imune, foi testado em larvas de tilápias e comparado com o hormônio de crescimento de tilápia. A via de administração foi por imersão. Os grupos experimentais eram: sobrenadante de cultivo da cepa recombinante MP36 de P. pastoris, que contém os polipeptídeos, sobrenadante de cultivo da cepa recombinante MP36 de P. pastoris, que contém o hormônio do crescimento de tilápia, um controle negativo a que se administrou sobrenadante de cultivo da cepa negativa de MP36 de P. pastoris e um grupo não tratado. Os resultados mostram que o grupo de larvas de tilápia tratado com os polipeptídeos incrementou significativamente seu peso comparado com o hormônio do crescimento de tilápia, o controle negativo e o grupo não tratado.

Para analisar o efeito sobre o sistema imune, foram macerados animais por grupo e mediu-se diferentes parâmetros de estresse oxidante e a presença de diferentes fatores humorais não específicos como lisozima e a presença de lecitinas.

Mediu-se

• Glutationa reduzida (GSH): É um cofator da Glutationa peroxidase e portanto um dos sistemas de defesa do organismo contra o estresse oxidante. Não se encontrou diferenças significativas entre os grupos, ainda que exista uma tendência a aumentar nos polipeptídeos 1 e 2.

• Superóxido dismutase: Enzima dos sistemas de defesa antioxidante. Ela captura radicais livres de superóxido. Não se encontrou diferenças significativas entre os grupos ainda que exista uma tendência a aumentar nos polipeptídeos 1 e 2. • Organoperóxidos totais: É um dos elementos do sistema pró- oxidante, constitui um precursor de radicais hidroxila e pode ser ainda indutor de genes, mecanismos de ativação celular e regulador das fosfatases e cinases. É também cofator da Glutationa S transferase que intervém na destoxificação de xenobióticos. Não existem diferenças significativas não estatísticas entre os grupos.

• Catalase: É um indicador do estresse oxidante que se expressa na oxidação das biomoléculas. Quando os níveis estão aumentados, é um indicador da presença de radicais livres que não podem ser metabolizados pela via da glutationa peroxidase. Em 21 dias, não se observou diferenças significativas entre os grupos. Todavia, em 45 dias, houve uma diminuição significativa dos níveis de catalase nos grupos tratados com os polipeptídeos em relação aos grupos não tratados.

• Potencial de peroxidação: Proporciona uma medida do deslocamento dos lipídios a lipídios oxidados. Obteve-se diferenças significativas dos grupos experimentais com respeito ao grupo não tratado, com uma maior tendência para os grupos tratados com os polipeptídeos 1 e 2.

• Produtos avançados da oxidação protéica. Proporciona uma medida do deslocamento das proteínas a proteínas oxidadas. Não se encontrou diferenças significativas entre os grupos.

Uma vez que o potencial de peroxidação é uma medida do estresse oxidante nos organismos, os polipeptídeos ensaiados produzem um estresse oxidante de leve a moderado em comparação com o grupo não tratado. O estresse oxidante é um importante evento fisiológico regulador, isto é demonstra o fato de que em 45 dias do início do tratamento, ainda que se mantivesse o estresse oxidante com efeito sobre a oxidação lipídica, começam a diminuir os níveis de catalase significativamente nos grupos tratados com os polipeptídeos 1 e 2 com respeito ao grupo não tratado o qual é um indicador da diminuição de radicais livres e portanto do estresse oxidante. Os lipídeos proporcionam o maior quociente energia/massa com respeito às outras biomoléculas que armazenam energia. Foi também demonstrado que o GH inibe a lipogênese e ativa a lipólise, e que os ácidos graxos resultantes são substratos oxidantes ideais, desviando desta forma os aminoácidos do processo oxidante para o de crescimento, pelo que a oxidação dos lipídeos observada na experiência da requerente pode estar relacionada com este processo.

Outros parâmetros relacionados com o sistema imune são as lisozima e a lectinas. Sabe-se que a lisozima é um componente das funções imunes não específicas contra infecções virais e bacterianas e foi observada correlação entre os níveis de lisozima e de hormônio do crescimento em peixes (Yadas T. et al. (2002) ImmunomoduIatory effects of prolactin and growth hormone in the tilapia. Oreochromis mossambicus. J. Endocrinol 173:483-492.

As lectinas reagem com um número diversos de patógenos e se pensa que conferem imunidade inata (Alexander, J. B. e Ingran, G. A. (1992) Noncellular nonspecific defence mechanism of fish. Annu. Rev. Fisk Dis. 2:249-279).

Tanto nas lisozimas quanto nas lectinas, observou-se 20 diferenças significativas entre os grupos tratados com os polipeptídeos 1 e 2 com respeito ao grupo não tratado.

O efeito dos polipeptídeos foi testado ainda em larvas de peixes ornamentais, demonstrando-se que eram capazes de estimular significativamente o crescimento e a sobrevida dos peixes tratados comparadp 25 com o controle negativo, assim como melhorar a coloração de ditos peixes, o qual é um parâmetro crucial para sua comercialização. Foi demonstrado também que o efeito produzido por estes polipeptídeos se mantinha no tempo após de eliminados os tratamentos. Breve Descrição das Figuras

Figura 1. Estratégia de clonagem das proteínas de interesse no vetor de expressão de Picchia pastoris.

Figura 2. Análise de expressão dos clones transformantes que mostram um fenótipo Muts. Western Blot das proteínas de interesse presentes no sobrenadante de cultivo de P. pastoris. Linha 1: MP36 não transformado; Linha 2: Polipeptídeo 1; Linha 3: Polipeptídeo 2; Linha 4: hormônio do crescimento de tilápia.

Figura 3. Experiência de crescimento em larvas da tilápia por imersão em sobrenadantes de cultivo contendo as proteínas de interesse em uma dose de 0,1 mg/litro de água. O gráfico representa a média do peso corporal dos grupos tratados em comparação com seus controles negativos.

Figura 4. Experiência de crescimento em larvas de peixinhos dourados por imersão em sobrenadante de cultivo contendo as proteínas de interesse em uma dose de 0,1 mg/litro de água. O gráfico representa a média do peso corporal dos grupos tratados em comparação com o controle negativo.

Figura 5. Experiência de crescimento em larvas de peixinhos dourados por imersão em sobrenadante de cultivo contendo as proteínas de interesse na dose de 0,1 mg/litro de água. O gráfico representa o percentual de sobrevida dos grupos experimentais a 45 dias de iniciados os tratamentos.

Figura 6. Experiência de crescimento em nas larvas de peixinhos dourados por imersão em sobrenadante de cultivo contendo as proteínas de interesse na dose de 0,1 mg/litro de água. Os peixes tratados mostram uma coloração mais brilhante do que os controles negativos.

Figura 7. Experiência de crescimento em larvas de carpa por imersão em sobrenadante de cultivo contendo o polipeptídeo 1 em três doses diferentes (0,02, 0,1 e 0,5 por litro de água). O gráfico representa a média do peso corporal dos grupos tratados em comparação com o controle negativo. Figura 8. Experiência de crescimento em tilápia por administração na ração de sobrenadante de cultivo contendo o polipeptídeo 1 em duas doses diferentes (4,8 mg do polipeptídeo/kg de ração e 38,4 mg do polipeptídeo/kg de ração). O gráfico representa a média do peso corporal dos grupos tratados em comparação com o controle negativo. Exposição Detalhada de modos de realização/exemplos

Exemplo 1: Construção dos vetores de expressão em Pichia pastoris contendo as seqüências codificadoras para os polipeptídeos objetivo desta invenção, e o hormônio de crescimento de tilápia, transformação da cepa MP36 e expressão das proteínas de interesse.

As seqüências codificadoras para os polipeptídeos acima mencionados foram obtidas por PCR a partir do DNA complementar do hormônio do crescimento de tilápia previamente clonado no vetor pR17 com oligonucleotídeos específicos. Para amplificar a seqüência codificadora para o polipeptídeo SEQ ID NO: 7, utilizou-se os oligonucleotídeos cevadores correspondentes às seqüências SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Para amplificar a seqüência codificadora para o polipeptídeo SEQ ID NO: 8, utilizou-se os oligonucleotídeos cevadores correspondentes às seqüências SEQID NO: 3 e SEQID NO: 4.

A seqüência codificadora para o hormônio do crescimento de tilápia foi amplificada por PCR a partir do vetor pR17 usando os oligonucleotídeos cevadores correspondentes às seqüências SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6. Os produtos de PCR foram tratados com a enzima polinucleotídeo cinase com o objetivo de fosforilar as extremidades do gene e facilitar sua clonagem no vetor de expressão. O vetor de expressão de Pichia pastoris pPSIO foi digerido enzimaticamente com a endonuclease de restrição Nae I e submetido a um tratamento com fosfatase alcalina para a desfosforilação das extremidades e a inserção dos genes que codificam para os polipeptídeos de interesse e o hormônio do crescimento de tilápia (Fig 1). Antes da transformação, os plasmídeos são linearizados com a enzima de restrição Sphi. A cepa MP36 de P. pastoris foi transformada mediante eletroporação com o vetor de expressão recombinante. Dita cepa é um mutante auxotrófico his3 que, após a transformação, adquire um fenótipo His^÷.

Os clones transformantes, identificados mediante Dot Blot, foram analisados por Southern Blot para determinar em quais havia ocorrido a integração mediante substituição do gene AOXl de P. pastoris pelo cassete de expressão do plasmídeo recombinante, o qual corresponde com um fenótipo Mut^3 (baixa utilização do metanol) e His+. A substituição gênica de AOXl ocorre por entrecruzamentos das regiões do promotor AOXl e VAOXl entre o vetor e o genoma. Como resultado destes, ocorre a deleção da região codificadora do gene AOX1. As cepas recombinantes com fenótipo Muts baseiam a produção da álcool oxidase (AOX) no gene AOX2 e sua taxa de crescimento em metanol é baixa.

Os genes que codificam para os polipeptídeos de interesse e o hormônio de crescimento de tilápia acham-se sob a regulação do promotor AOX1, o qual é indutível por metanol, e têm um sinal de secreção. A P. pastoris secreta somente baixos níveis de proteínas próprias e seu meio de cultivo não necessita suplementos potéico, portanto, pode-se esperar que uma proteína heteróloga que se secreta constitua a maioria do total de proteínas no meio (até mais de 80%) (Tschopp e colegas; Bio/Technology 1987, 5: 1305- 1308; Barr et ai; Pharm. Eng. 1992, 12: 48-51). A produção das proteínas recombinantes presentes nesta invenção foi realizou-se em biorreatores de 5 1, mediante a adição de metanol à cultura. Como se mostra na Fig 2, para checar a expressão das proteínas no sobrenadante de cultivo, realizou-se Western Blot utilizando um anticorpo monoclonal específico para hormônio do crescimento de tilápia.

Exemplo 2 Experiência de estimulação do crescimento e efeito sobre o sistema imune em larvas de tilápia por banhos de imersão com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo os polipeptídeos de interesse..

Tomou-se quatro grupos de larvas de tilápia e a elas se aplicou três banhos de imersão semanais, de uma hora e meia de duração. A dose administrada era de 0,1 mg de proteína de interesse/litro de água. Os grupos experimentais eram:

1. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo o polipeptídeo 1 (Tratamento 1).

2. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo o polipeptídeo 2 (Tratamento 2).

3. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo o hormônio do crescimento de tilápia (Tratamento 3).

4. Grupo de controle tratado com sobrenadante de cultivo de P. pastoris negativa (controle negativo).

5. Grupo não tratado.

A dose administrada de cada um dos polipeptídeos e do hormônio do crescimento de tilápia era sobrenadante de cultivo correspondente a 0,1 mg de proteína de interesse/litro de água.

Como resultado, obteve-se que em 45 dias de iniciado o tratamento as larvas tratadas com o polipeptídeo SEQ ID NO: 7 tiveram um i incremento em peso de 3,6 vezes superior com respeito ao grupo não tratado, 2,1 vezes superior com respeito ao controle negativo e 1,6 vez superior com respeito ao grupo tratado com hormônio do crescimento de tilápia. Por outro lado, as larvas tratadas com o polipeptídeo SEQ ID NO: 8 tiveram um incremento de peso 3,2 vezes superior com respeito ao grupo não tratado, 1,9 vez superior com respeito ao controle negativo, e 1,4 vez superior com respeito ao o grupo tratado com hormônio do crescimento de tilápia (Fig. 3). Tabela 1 Peso das larvas <table>table see original document page 17</column></row><table>

Os dados se apresentam como a média do peso ± o desvio padrão

Tabela 1.1 Análise estatística dos dados em 45 dias de iniciados os tratamentos

<table>table see original document page 17</column></row><table>

Estes resultados são de grande importância, já que ao acelerar o crescimento dos peixes de importância econômica nos estágios iniciais de sua vida, provoca-se uma maior sobrevida na fase do cultivo que é vital para aumentar a produtividade.

Para analisar o efeito sobre o sistema imune, em 21 e 45 dias

do início da experiência, tomou-se 20 animais por grupo, macerou-se e mediu-se diferentes parâmetros do estresse oxidante

• Glutação reduida (GSH),

• Superoxido dismutase

• Organoperóxidos totais

• Catalase

• Potencial de peroxidação

• Produtos avançados da oxidação protéica.

Dos parâmetros analisados em 21 dias, só se observou diferenças significativas no potencial de peroxidação entre os grupos tratados e o controle negativo

Mediu-se a atividade da lisozima nos extratos de larvas em 45 dias de iniciados os tratamentos. Para isso, utilizou-se um método baseado na habilidade da lisozima de lisar a bactéria Micrococcus lysodeiktieus. (Ellis5 Technques in Fish immunology,. Fair haven, NJ:SOS Publications 1990:101-103) Em uma placa de 96 poços, aplicou-se 100 μl de amostras e misturou-se com 100 μl de uma suspensão de 3 mg/ml de Mierococeus lysodeiktieus (Sigma) em tampão de fosfato 0,05 M, pH 6,2, a placa foi incubada a 22°C e a D.O. foi lida em 450 nm em 2, 3, 5 10, 15, 30 e 45 minutos. Como controle positivo, utilizou-se lisozima de clara de ovo de galinha em diluições seriadas a partir de 8 μg/ml e como controle negativo, utilizou-se tampão em lugar dos extratos de larvas. Definiu-se como uma unidade de atividade de lisozima a quantidade de extrato das larvas que causa um decréscimo na D.O. de 0,001 min"1. Foram observadas diferenças significativas entre os grupos tratados com os polipeptídeos SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 com respeito ao grupo não tratado (Tabela 2).

Foi realizado também um ensaio de hemoaglutinação para determinar a presença de lectinas nos extratos. Para isto, realizou-se diluições duplas seriadas partindo de 100 μΐ de extrato, utilizando PBS, pH 7,2 em uma placa de 96 poços com fundo em U (Costar). Adicionou-se quantidade igual de uma solução de eritrócitos de coelho a 2%. Incubou-se a placa 1 h à temperatura ambiente e o título de hemoaglutinação foi lido visualmente. A atividade das lectinas foi expressa como o título: a recíproca da diluição mais alta que mostrou hemoaglutinação completa.Observou-se diferenças significativas entre os grupos tratados com os polipeptídeos SEQ ID NO: 7 e SEQID NO: 8 com respeito ao grupo não tratado (Tabela 3). Tabela 2: Concentração de lisozima μg/ml) nos extratos de larvas em 45 dias do início da experiência <table>table see original document page 19</column></row><table>

A concentração está dada apresentada como a média ± o desvio padrão

*ANOVA, teste de Tukey; Denota diferenças significativas (P<0,05)

Tabela 3

Título de hemaglutinação (a recíproca da diluição mais alta que mostrou hemoaglutinação completa) nos extratos de larvas em 45 dias do início da experiência.

<table>table see original document page 19</column></row><table>

ANOVA*, teste de Tukey; denota diferenças significativas (p<0,05)

Exemplo 3 Experiência de estimulação do crescimento e melhoria na qualidade de larvas nos peixinhos dourados por banhos de imersão com o sobrenadante de cultivo de ρ pastoris contendo os polipeptídeos de interesse.

Tomou-se quatro grupos larvas de peixinhos dourados e aplicou-se a eles três banhos de imersão semanais de uma hora e meia de duração. A dose administrada era de OsI mg de proteína de interesse/litro de água. Os grupos experimentais eram:

1. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo o polipeptídeo SEQID No. 7(Tratamento 1).

2. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo o polipeptídeo SEQID No. 8 (Tratamento 2).

3. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo hormônio do crescimento de tilápia (Tratamento 3).

4. Grupo de controle negativo tratado com sobrenadante de cultivo de P. pastoris negativo (controle negativo).

A dose administrada de cada um dos polipeptídeos da presente invenção e do hormônio do crescimento de tilápia era sobrenadante de cultivo correspondente a 0;1 mg de proteína de interesse/litro de água.

A 45 dias de iniciada a experiência, os tratamentos 1 e 2 mostraram um incremento significativo no peso corporal comparados com os tratamentos 3 e 4. A 75 dias, as larvas tratadas com os polipeptídeos SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 tiveram um incremento de peso 2 vezes superior em com respeito ao controle negativo e 1,5 vez superior com respeito ao grupo tratado com hormônio do crescimento de tilápia (Tabela 4; Tabela 4.1; Fig. 4). Além disso, os tratamentos I5 2 e 3 apresentaram um aumento da sobrevida em comparação com o controle negativo (Fig. 5). A coloração dos peixes ornamentais é um parâmetro importante a ter em conta para sua comercialização. Nesta experiência, observou-se que as larvas submetidas aos tratamentos 1 e 2 adquiria a coloração em um estágio mais prematuro de desenvolvimento que as do controle negativo. A 75 dias do início da experiência, eles tinham uma coloração mais brilhante (Fig. 6).

Estes resultados se repetiram em outras espécies de peixes ornamentais.

Tabela 4 Pesos das larvas

<table>table see original document page 20</column></row><table>

Os dados se apresentam como a média ± o desvio padrão

Tabela 4.1 Análise estatística dos dados em 75 dias do início das experiências

<table>table see original document page 20</column></row><table>

Exemplo 4 Experiência de crescimento em carpas por banhos de imersão com diferentes doses de polipeptídeo 1.

Determinou-se -se o efeito de diferentes doses do polipeptídeo .1 sobre o crescimento em larvas de carpa. Quatro grupos experimentais foram tomados:

1. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo o polipeptídeo SEQ ID NO: 7 a uma dose de 0,02 mg de polipeptídeo/litro de água (Tratamento 1).

2. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo o polipeptídeo SEQ ID NO: 7 a uma dose de 0,1 mg de polipeptídeo/litro de água (Tratamento 2).

3. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo o polipeptídeo SEQ ID NO: 7 a uma dose de 0,5 mg de polipeptídeo/litro de água (Tratamento 3).

4. Grupo não tratado.

A 30 dias do início da experiência, as larvas tratadas com a dose de 0,5 mg de polipeptídeo SEQ ID NO: 7/litro de água tiveram um incremento de peso 2,75 vezes superior com respeito ao grupo não tratado e as larvas tratadas com 0,1 mg de polipeptídeo SEQ ID NO: 7/litro de água tiveram um incremento de peso 1,8 vez superior com respeito ao grupo não tratado. Não se observou diferenças significativas entre o grupo não tratado e o grupo tratado e a dose mínima (Tabela 5; Tabela 5.1; Figxara 7).

Tabela 5 Peso das larvas (g) __ <table>table see original document page 21</column></row><table>

Os dados se apresentam como a média ± o desvio padrão. Tabela 5.1 Análise estatística dos dados em 30 dias do início da experiência

<table>table see original document page 21</column></row><table> Exemplo 5 Experiência do crescimento em camarões Litopenaeus Schmitti por banhos imersão com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo os polipeptídeos de interesse.

Três grupos de larvas de camarões foram tomados e eles foram aplicados três banhos de imersão semanais de uma hora e meia de duração. A dose administrada era de 0,1 mg de proteína de interesse/litro de água. Os grupos experimentais eram:

1. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo o polipeptídeo SEQID NO: 7 (Tratamento 1).

2. Grupo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris contendo o polipeptídeo SEQID NO: 8 (Tratamento 2).

3. Grupo de controle negativo tratado com o sobrenadante de cultivo de P. pastoris negativo (controle negativo).

Como resultado, observou-se que nos grupos tratados com os polipeptídeos da presente invenção, melhorava a qualidade das larvas dos camarões Litopenaeus Schmitti. Isto evidenciado porque as larvas tratadas com os polipeptídeos SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 tiveram um incremento no peso corporal 2,3 vezes superior com respeito ao controle negativo, um maior número de ramificações branquiais e modificações rostrais. Para cada parâmetro realizou-se o teste estatístico correspondente encontrando-se em todos os casos diferenças significativas.

Exemplo 6 Experiência de crescimento em tilápias mediante a inclusão na dieta de diferentes doses do polipeptídeo SEQ ID no: 7.

Determinou-se -se o efeito de duas doses do polipeptídeo SEQ ID NO: 7 sobre o crescimento na tilápias juvenis que tinham um peso inicial de 72,99 ± 3,25 g. As doses testadas foram de 4,8 mg do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7/kg de alimento e de 38,4 mg do polipeptídeo SEQ ID NO: 7/kg de ração. A formulação oral foi preparada por inclusão na dieta básica do sobrenadante cultivo de P. pastoris contendo a dose correspondente do polipeptídeo de interesse. O controle negativo foi de tilápias alimentada com dieta básica enriquecida com sobrenadante de cultivo de P. pastoris negativo. Durante a experiência, os peixes foram alimentados duas vezes por dia com uma quantidade de ração eqüivalente a 5% de seu peso corporal durante 6 semanas.

A 45 dias de iniciada a experência, o polipeptídeo SEQ ID NO: 7 incluído na dieta na dose de 4,8 mg de polipeptídeo SEQ ID NO: 7/kg de ração, incrementou o crescimento das tilápias em 22% com respeito ao controle. Com diferenças altamente significativas (p < 0,001). A dose de 38,4 mg do polipeptídeo SEQ ID NO: 7/kg de ração não apresentou diferenças signiticatrivas em relação ao controle negativo (Tabela 6; Tabela 6.1; Fig. 8). Tabela 6 Pesos dos peixes (g)__

<table>table see original document page 23</column></row><table> Os dados se apresentam como a média ± o desvio padrão

Tabela 6.1 Análise estatística dos dados em 30 dias do início da experiência

<table>table see original document page 23</column></row><table> Os organismos aquáticos são atualmente uma fonte importante de proteínas, porém sua captura de forma natural se encontra no limite máximo de sua exploração, pelo que, para aumentar sua produção, torna-se necessário seu cultivo. Foi demonstrado que na maioria dos organismos existe uma ampla margem em que se pode manipular o crescimento pela administração de hormônios, a modificação genética dos animais, entre outras vias. (Pullin e col.; Conference Proceeding 7, 432 p. International Center for living Aquatic Resources Management. Manila, Filipinas. 1982, ISSN 0115-4389).

Os polipeptídeos apresentados nesta invenção têm como vantagens que não têm especificidade de espécie e, portanto, podem ser aplicados em diferentes organismos aquáticos para funções múltiplas entre elas aumentar o crescimento, a sobrevida e a qualidade das larvas, assim como melhorar parâmetros envolvidos no sistema imune. Além disso, foi demonstrado que eles possuem um efeito sobre o crescimento significativamente superior ao hormônio de crescimento. Por outro lado, ditos polipeptídeos não têm atividade biológica em humanos, diminuindo os inconvenientes que têm os produtos que são aplicadpos a espécies para consumo humano. Além do mais, seu uso em peixes ornamentais resulta muito atrativo não apenas porque reduz o tempo de cultivo ao acelerar o crescimento, mas também pelo efeito destes polipeptídeos sobre a coloração dos peixes. LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

<110> Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia

<120> "POLIPEPTíDEOS ESTIMULADORES DO CRESCIMENTO

PARA USO EM PEIXES E CRUSTÁCEOS"

<130> JANNEL

<140>

<141>

<160> 8

<170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo que hibridiza com a extremidade 5' do gene codificador para o polipeptídeo 1.

<400> 1

atgaactcag tcgtcctcct gc <210> 2 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

Oligonucleotideo que hibridiza com a extremidade 3' do gene codificador para o polipeptídeo 1.

<400> 2

tcaatagttt ccgtaaggag cg <210> 3 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

Oligonucleotideo que hibridiza com a extremidade 5' do gene codificador para o polipeptídeo 2.

<400> 3

atgcagcaga tcacagacag cc <210> 4 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

Oligonucleotídeo que hibridiza com a extremidade 3' do gene codificador para o polipeptídeo 2. <400> 4

tcaatagttt ccgtaaggag cg <210> 5 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

Oligonucleotídeo que hibridiza com a extremidade 5' do gene codificador para o hormônio de crescimento da tilápia

<400> 5

atgaactcag tcgtcctcct gctgtcgg <210> 6 <211> 29 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

Oligonucleotideo que hibridiza com a extremidade 3' do gene codificador para o hormônio de crescimento da tilápia

<400> 6

ccggaattcc aatgcaacac atttatttc

<210> 7

<211> 158

<212> PRT

<213> tilápia

<220>

<221> PEPTÍDEO

<222> (1)..(158)

<223> Fragmento do hormônio de crescimento da tilápia

<400> 7

(copiar das páginas 2/3 e 3/3)

<210> 8

<211> 142

<212> PRT

<213> tilápia

<220>

<221> PEPTÍDEO

<222> (1) . . (142)

<223> Fragmento do hormônio de crescimento da tilápia

<400> 8

(copiar da página 3/3)

Claims

1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende em sua cadeia polipeptídica uma seqüência de aminoácidos contida em uma das seqüências seguintes: SEQ. ID No.7 e SEQ. ID No.8

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é obtido em P. pastoris.

3. Composição caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um dos polipeptídeos definidos na reivindicação 1 , para estimular o crescimento de peixes e crustáceos.

4. Uso do sobrenadante de P. pastoris que contém os polipeptídeos descritos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é em formulações de ração para estimular o crescimento e/ou a resistência a enfermedades dos peixes e crustáceos em uma quantidade eficiente como 4,8 mg de polipeptídeo/kg de ração.

5. Uso do sobrenadante de P. pastoris que contém os polipeptídeos descritos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento por banhos de imersão de espécies de peixes e crustáceos para estimular o crescimento, a sobrevida e a qualidade das larvas em uma faixa de concentração entre 0,05 e 0,5 mg de polipeptídeo/L de água.

6. Composição caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um dos polipeptídeos definidos na reivindicação 1, para estimular o sistema imune inato humoral dos peixes e crustáceos.

7. Composição caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um dos polipeptídeos definidos na reivindicação 1, para sua aplicação a peixes ornamentais.