ES2331627T3

ES2331627T3 - Polipeptidos estimulantes del crecimiento para uso en peces y crustaceos.

Info

Publication number: ES2331627T3
Application number: ES06753160T
Authority: ES
Inventors: Jannel Acosta Alba; Mario Pablo Estrada Garcia; Yamila Carpio Gonzalez; Reynold Morales Fernandez
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2005-07-21
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2010-01-11
Anticipated expiration: 2026-06-23
Also published as: US20100167998A1; EP1911764A1; MY145699A; AU2006272216B2; EP1911764B1; CU23577A1; CN101253194A; US7919463B2; JP4939536B2; CA2615833A1; BRPI0613621A2; ATE439374T1; IL188864A0; DE602006008478D1; AU2006272216A1; RU2008106612A; MX2008000962A; JP2009501735A; KR101190022B1; ZA200800924B

Abstract

La presente invención está relacionada con polipéptidos que muestran una actividad superior a la hormona de crecimiento de tilapia. Estos polipéptidos son capaces de estimular el crecimiento, lasobrevida y calidad de las larvas de peces y crustáceos. Además,incrementan la defensa del organismo contra agentes patógenos y estimulan parámetros relacionados con el sistema inmune de organismos acuáticos. Los genes que codifican para dichos polipéptidos fueron clonados en un vector de expresión en Pichia pastoris que permite la obtención de la proteína de forma extracelular. El sobrenadante de cultivo que contiene los polipéptidos de interés fueadministrado por baños de inmersión o como suplemento en el pienso a organismos acuáticos.

Description

Polipéptidos estimulantes del crecimiento para uso en peces y crustáceos.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología acuática, en particular a polipéptidos con una mayor actividad en comparación con la hormona de crecimiento de tilapia, y al uso de estos polipéptidos para aumentar la supervivencia y calidad de larvas tratadas por inmersión o como aditivo alimentario.

\vskip1.000000\baselineskip

Técnica anterior

La búsqueda de agentes que promueven el crecimiento en organismos acuáticos ha sido un centro de atención para varios laboratorios de investigación. La hormona de crecimiento (GH) ha sido el objeto principal de esta investigación.

Se ha informado de la presencia de GH en mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. La GH o somatotropina es un polipéptido sintetizado y secretado por los somatotrofos de la hipófisis anterior en respuesta a péptidos hipotalámicos (Barinaga M., y col. (1985) Independent effects of growth hormone releasing factor on growth hormone release and gene transcription. Nature 314: 279-281). La GH está implicada en la regulación del crecimiento, el desarrollo, el metabolismo, el apetito y la osmorregulación en peces (Donaldson E. M., y col. (1979) Hormonal enhancement of growth. Fish Physiol. 8: 455-597). Aparte de sus efectos anabólicos sobre el crecimiento somático postnatal, en peces también tiene efecto sobre las células del sistema inmune. La GH promueve la proliferación de células T. Está bien documentada su actividad receptora de antígenos y su papel como coestimulador en la maduración de linfocitos (Harris H. y Bird D. J. (1997) The effects of \alpha-MSH and MCH on the proliferations of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) lymphocytes in vitro. En: Kawashima, S., Kikuyama, S., (Eds), Advances in Comparative Endocrinology. Monduzzi Editoire, Bologn págs. 1023-1026a).

Es muy interesante su similitud estructural con varias citocinas tales como: IL-2, IL-4, IL-5, el factor estimulante de colonias de granulocitos, el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos e interferón (Sprang S. R. y Bazan J. F. (1993) Cytokine structural taxonomy and mechanisms of receptor engagement. Curr. Opin. Struc. Biol. 3: 815-827).

En mamíferos, la GH estimula la fagocitosis, la maduración y la diferenciación de timocitos (Ortega E., y col. (1996) Effects of prolactin on the in vitro phagocytic capacity of macrophages. Comp. Immunol. Immunopathol. 61: 389-393) y la apoptosis de células productoras de células T (Murphy W. J. y Longo D. L. (2000) Growth hormone as an immunodulating therapeutic agent. Immunol. Today 121: 211-213). De forma similar, se ha estudiado el efecto de GH como estimuladora de la linfopoyesis y la fagocitosis en Sparus aurata y Sparus sarba junto con la mitogénesis de los leucocitos en O. keta (Sakai M., y col (1996) Increase in Haemolytic activity of serum from rainbow trout Oncorhyncus mykiss injected with exogenous growth hormone. Fish Shellfish Immunol. 6: 615-617), la fagocitosis, la activación de células NK, la producción de anticuerpos, la actividad hemolítica del complemento en Oncorhynchus mykiss (Yada T., y col. (1999) Effects of prolactin and growth hormone on plasma immunoglobulin M levels of hipophysectomized rainbow trout, Oncorhyncus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol. 115: 46-52) y el estallido respiratorio de leucocitos en trucha arco iris (Oncorhyncus mykiss) y Dicentrarchus labrax (Muñoz P., y col. (1998) Modulation of the respiratory burst activity of Mediterranean sea bass (Dicentrarchus labrax L.) phagocytes by growth hormone and parasitic status. Fish Shellfish Immunol. 8: 25-36).

Se ha demostrado el aumento en los niveles plasmáticos de GH como resultado de la transferencia de Salmo trutta de agua dulce a agua salada, acompañado de niveles reducidos de hormonas tiroideas en correlación con un aumento en la actividad fagocítica de los leucocitos de pronefros y un aumento en la concentración de lisozima plasmática. Algunos estudios señalaron la expresión de receptores de GH y receptores de IGF específicos en linfocitos (Tapson V. F., y col. (1988) Structural and functional characterization of the human T lymphocite receptor for insulin-like growth factor I in vitro. Clin, C. Invest. 82: 950-957). Se ha demostrado el efecto in vitro del IGF-I en la proliferación de células T. Se conoce bien el efecto inductor de IGF-I sobre células B, inmunoglobulina y células plasmáticas. Las células B muestran el mayor nivel de expresión de receptor de GH (Badolato R., y col. (1994) Differential expression of surface membrane growth hormone receptor on human peripheral blood lymphocytes detected by dual fluorochrome flow cytometry. J Clin Endocrinol Metab. 79: 984-990).

La GH puede afectar a linfocitos B y T indirectamente a través de su efecto activador sobre macrófagos y monocitos (Edwards C. K., y col. (1988) A newly defined property of somatotropin: priming of macrophages for production of superoxide anion. Science 239: 769-771). En los últimos también promueve la quimiotaxis. Estas células también actúan sobre los linfocitos por secreción de citocinas. La GH revierte la deficiencia de células NK (Davila D. R., y col. (1987) Role of growth hormone in regulating T-dependent immune events in aged, nude, and transgenic rodents, Neurosci. Res. 18: 108-116).

El ADN complementario de varias hormonas de crecimiento de peces se ha clonado y secuenciado. Se ha demostrado el efecto potente de la GH recombinante sobre el crecimiento en peces por inyección (Tsai H. J., y col. (1993) Expression of rainbow trout growth hormone cDNA in yeast. Bull. Inst. Zool. Acad. Sin. 32: 162-170) o por inmersión (Moriyama S. y Kawauchi H. (1990) Growth stimulation of juvenile salmonids by immersion in recombinant salmon growth hormone. Nippon Suisan Gakkaishi 56: 31-34). El documento EP0387457 describe las proteínas hormonales de la hipófisis prolactina y hormonas de crecimiento de peces de agua caliente producidas por microorganismos.

La GH humana existe como un grupo heterogéneo de proteínas estructuralmente relacionadas que pueden encontrarse en la glándula hipofisaria (Baumann G., y col. (1983) The molecular nature of circulating growth hormone in normal and acromegalic man: evidence for a principal and minor monomeric forms, J. Clin. Endocrinol. Metab. 56: 946-952), plasma (Bauman G., y col. (1985) Molecular forms of circulating growth hormone during spontaneous secretory episodes and in the basal state. J. Clin. Endocrinol. Metab. 60: 1216-1220) y orina (Baumann G. y Abramson E. C. (1983) Urinary growth hormone in man: evidence for multiple molecular forms. Endocrinology 56: 305-311). La variante predominante de la GH humana es un polipéptido de 22 kDa compuesto por una cadena polipeptídica única. Este polipéptido constituye el 85% de las GH humanas inmunorreactivas (Lewis U. J., y col. (1994) Variant forms and fragments of human growth hormone in serum. Acta Paediatr. Suppl. 399: 29-31). Otras variantes de GH humana comprenden un polipéptido con una sola cadena polipeptídica con un peso molecular de 20 kDa (Lewis U. J., y col. (1978) A naturally occurring structural variant of human growth hormone J. Biol. Chem. 253: 2679-2687), formas de 22 kDa acetiladas y desaminadas (Lewis U. J., y col. (1981) Altered proteolytic cleavage of human growth hormone as a result of deamidation. J. Biol. Chem. 256: 11645-11650) y una variante truncada que es el resultado de la escisión proteolítica que tiene dos cadenas polipeptídicas conectadas por un enlace disulfuro (Singh R. N. y col. (1974) Modified forms of human growth hormone with increased biological activities. Endocrinology 94: 883-891). Varios estudios demostraron que la última variante es la más activa. Esta molécula es el resultado de digestiones con proteinasas entre los aminoácidos 134 y 150 de la hGH de 22 kDa (Wroblewski V. J., y col. (1991) Proteolytic cleavage of human growth hormone (hGH) by rat tissues in vitro: influence on the kinetics of exogenously administered hGH. Endocrinology 129: 465-474). Se ha sugerido que la actividad biológica aumentada de esta variante truncada se debe a su estabilidad aumentada y al hecho de que tiene una tasa de aclaramiento metabólico inferior que las otras (Baumann G. (1979) Metabolic clearance rates of isohormones of human growth hormone in man. J. Clin. Endocrinol. Metab. 49: 495-499).

El desarrollo de la tecnología de ADN recombinante permite el uso de bacterias y levaduras como sistemas huéspedes para la producción de proteínas de interés en un procedimiento relativamente económico. La levadura Pichia pastoris se usa ampliamente como un huésped para producir proteínas heterólogas. Este organismo ofrece los beneficios de otros sistemas tales como E. coli en relación con los altos niveles de expresión, la manipulación y el cultivo sencillos, y es capaz de combinar éstos con las ventajas de un sistema eucariota que realiza las modificaciones postraduccionales tales como procesamiento proteolítico, replegamiento, glicosilación y formación de enlaces disulfuro (Higgins D. R. y Cregg J. M. (1998) Introduction to Pichia pastoris. Pichia protocols. Human Press Inc., Towota 1-15).

Como sistema de expresión, este sistema requiere una manipulación genética y molecular sencilla; es menos costoso que la expresión en células de insecto o cultivos de tejidos de mamífero debido a que los medios para el cultivo y la expresión no requieren complementos especiales. Esta levadura se adapta fácilmente a fermentaciones a gran escala y tiene preferencia por el crecimiento respiratorio, una característica fisiológica que facilita su cultivo a altas densidades.

Se han publicado varios estudios de estimulación del crecimiento usando levadura recombinante que expresa hormona de crecimiento. Se ha demostrado el efecto sobre el crecimiento de pollos después de la administración de piensos enriquecidos con Pichia pastoris recombinante que expresa GH (Chen C. M. y col. (2000) Growth enhancement of fowls by dietary administration of recombinant yeast cultures containing enriched growth hormone. Life Sciences 67: 2103-2115). Aparte, Tsai y col., 1993 obtuvieron un crecimiento acelerado por administración dietética de Saccharomyces cerevisiae recombinante que expresaba GH (Tsai H. J., y col. (1993) Enhancement of tilapia growth by dietary administration of recombinant yeast lysates as a supplement. J. Fish. Soc. Taiwan 20: 339-345).

Se ha protegido en la patente US 6.239.100 un polipéptido con una actividad similar a la hormona de crecimiento de peces y su uso para promover el crecimiento y reducir la mortalidad larvaria en peces.

Acelerar el crecimiento, aumentar la supervivencia y mejorar la calidad de las larvas constituyen todavía uno de los problemas principales en la acuicultura.

\vskip1.000000\baselineskip

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una solución para el problema mencionado anteriormente con polipéptidos con las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7 y 8 que muestran una mayor actividad en comparación con la GH de tilapia, y su aplicación en peces y crustáceos. Como resultado principal, se descubrió que estos polipéptidos expresados extracelularmente en Pichia pastoris, que comprenden las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente, producen un aumento en la velocidad de crecimiento, la supervivencia y la calidad de las larvas cuando se administran mediante baños de inmersión o como un aditivo alimentario a peces y crustáceos. Además, mejoran el estado inmune. Se demostró la superioridad de los polipéptidos en comparación con la hormona de crecimiento de tilapia.

El uso de estos polipéptidos en acuicultura tiene varias ventajas: 1) son moléculas más pequeñas que la GH de peces, entonces pueden absorberse por el organismo y alcanzar el torrente sanguíneo fácilmente; 2) como son fragmentos de la GH de peces, no tienen actividad biológica en seres humanos; 3) tienen un efecto más fuerte sobre el crecimiento que la GH de peces; 4) tienen efectos perceptibles sobre el crecimiento, la supervivencia y la calidad de las larvas en una amplia variedad de especies de peces.

La patente US 6.239.100 protege el uso de un polipéptido con una actividad similar respecto a la GH de peces para estimular el crecimiento y reducir la mortalidad de larvas de peces. La secuencia descrita para este polipéptido tiene una homología del 73% en comparación con la GH de tilapia y carece de 51 nucleótidos del N-terminal. Los polipéptidos de la invención se obtuvieron a partir de la hormona de crecimiento de tilapia. El polipéptido de la SEC ID Nº: 7 carece de un fragmento de 46 aminoácidos que se corresponde con el C-terminal. El polipéptido de la SEC ID Nº: 8 carece del mismo fragmento en el C-terminal y de 17 aminoácidos en el N-terminal.

Distintos al polipéptido presentado en la patente US 6.239.100 que tiene una actividad similar a GH, los polipéptidos de la invención tienen una mayor actividad en comparación con GH. Esta actividad no es específica de especie. Aparte, el polipéptido de la SEC ID Nº: 7 que carece de un fragmento en el C-terminal tiene una actividad promotora del crecimiento superior al polipéptido de la SEC ID Nº: 8.

En la materialización de la invención, la composición que comprende cualquiera de los polipéptidos definidos en las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 7 y 8 estimula el crecimiento en peces y crustáceos.

La presente invención implicaba la clonación de la secuencia codificante de los polipéptidos mencionados anteriormente en un vector de expresión en Pichia pastoris pPS10.

La secuencia codificante para estos polipéptidos se obtuvo por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) usando el ADNc de tiGH previamente clonado en pR17 como molde (Guillén I. I., y col. (1998) Physiological changes in the juvenile euryhaline teleost, the tilapia Oreochromis hornorum, injected with E. coli-derived homologous growth hormone. J Mar. Biotechnol. 6: 142-51). La hormona de crecimiento de tilapia también se amplificó por PCR a partir del mismo vector (pR17).

El vector usado en la construcción genética para la expresión de proteínas diana en Pichia pastoris contiene el promotor de AOX1 de Pichia pastoris (pAOX1), el péptido señal de la sacarosa invertasa 2 de S. cerevisiae (spSUC 2) y la señal de terminación de la enzima gliceraldehído-3P-deshidrogenasa (GAPt) de S. cerevisiae. También contiene un fragmento de ADN cromosómico correspondiente a la región de AOX 3' necesaria para la recombinación homóloga entre la levadura y el gen de HIS3 de S. cerevisiae que es el marcador de selección de levaduras. El vector tiene un origen de replicación funcional en E. coli y el gen de resistencia a ampicilina como marcador de selección en bacterias. Los vectores usados para generar cepas de Pichia pastoris recombinantes generalmente son vectores de integración. Antes de la transformación los plásmidos deberían linealizarse para facilitar la recombinación homóloga por el gen AOX1.

La cepa MP36 de Pichia pastoris se usó para la producción extracelular de las proteínas recombinantes. Esta cepa es un mutante auxótrofo de his3 obtenido de la cepa BKM-90 de Pichia pastoris (documento EP 00438200) que adquirió el fenotipo His+ después de la transformación con el vector de expresión (Yong V., y col. (1992) HIS-3 gene of Saccharomyces cerevisiae complement his mutation in yeast Pichia pastoris. Biotecnología aplicada 9: 55-61).

Varios estudios han demostrado un efecto estimulante del crecimiento por administración por inmersión de GH recombinante en diferentes especies de peces. No obstante, esta invención es la primera descripción de la estimulación del crecimiento en peces por inmersión en sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen polipéptidos con una mayor actividad en comparación con GH sin una purificación previa de las proteínas diana.

El efecto de los polipéptidos descritos en la presente invención sobre el crecimiento, la resistencia a patógenos y los parámetros del sistema inmune se ensayó en larvas de tilapia y se comparó con la hormona de crecimiento de tilapia.

\vskip1.000000\baselineskip

Los tratamientos se administraron por inmersión. Los grupos experimentales eran:

\ding{226} Sobrenadantes de cultivo de cepa MP36 de Pichia pastoris recombinante que contienen los polipéptidos.

\ding{226} Sobrenadantes de cultivo de cepa MP36 de Pichia pastoris recombinante que contienen la GH de tilapia.

\ding{226} Un control negativo que contiene sobrenadantes de cultivo de MP36 de Pichia pastoris no transformada.

\ding{226} Grupo no tratado.

\vskip1.000000\baselineskip

Los resultados mostraban que el grupo tratado con los polipéptidos aumenta significativamente su peso en comparación con grupos con tiGH, control negativo y no tratados.

\vskip1.000000\baselineskip

Para analizar el efecto sobre el sistema inmune, se homogeneizaron 20 animales. Se midió la presencia de diferentes factores humorales inespecíficos tales como lisozima y lectinas y los siguientes parámetros de estrés oxidativo.

\ding{226} Glutatión reducido: LA GSH es un cofactor de la enzima glutatión peroxidasa. Es uno de los mecanismos de defensa contra el estrés oxidativo. No se encontró ninguna diferencia estadística entre grupos. No obstante, existe una tendencia a aumentar en los grupos tratados con polipéptidos 1 y 2.

\ding{226} Superóxido dismutasa: La SOD es una enzima que pertenece a las defensas antioxidantes. Captura los radicales superóxido libres. No se encontró ninguna diferencia estadística entre grupos. Existe una tendencia a aumentar en los grupos tratados con polipéptidos 1 y 2.

\ding{226} Organoperóxidos totales: Es uno de los elementos del sistema prooxidante y uno de los precursores de radicales hidroxilo. También podía ser un inductor de la expresión génica, la activación del mecanismo celular y regulador de fosfatasas y quinasas. También es un cofactor para la Glutatión-S-transferasa que está implicada en la detoxificación de xenobióticos. No existen diferencias estadísticas significativas entre grupos.

\ding{226} Catalasa: Es un indicador de estrés oxidativo que produce oxidación de biomoléculas. Cuando los niveles de catalasa están aumentados indican la presencia de radicales libres que no pueden metabolizarse mediante la glutatión peroxidasa. A los 21 días desde el comienzo del experimento no había diferencias estadísticas entre grupos. A los 45 días, los niveles de catalasa disminuían en los grupos tratados con los polipéptidos respecto a los controles.

\ding{226} Potencial de peroxidación. Es un indicativo de oxidación de lípidos. Se obtuvieron diferencias estadísticas significativas en grupos tratados en comparación con no tratados, con una mayor tendencia en los grupos tratados con polipéptidos 1 y 2.

\ding{226} Oxidación de proteínas. Es un indicativo de oxidación de proteínas. No se encontraron diferencias estadísticas entre grupos.

\vskip1.000000\baselineskip

Puesto que el potencial de peroxidación es un indicativo de estrés oxidativo en los organismos, se puede deducir que los polipéptidos ensayados producían cierto estrés oxidativo en comparación con el grupo no tratado. El estrés oxidativo es un acontecimiento regulador importante. A los 45 días desde el comienzo del experimento, aún cuando existe estrés oxidativo con un efecto sobre la oxidación de lípidos, los niveles de catalasa disminuyen significativamente entre grupos tratados en comparación con no tratados. Este acontecimiento indica niveles disminuidos de radicales libres y estrés oxidativo.

Los lípidos proporcionan la mayor relación de energía/masa en comparación con otras biomoléculas que almacenan energía. Se ha demostrado que la GH inhibe la lipogénesis y activa la lipólisis y los ácidos grasos producidos son sustratos oxidativos ideales. Como consecuencia, los aminoácidos pasan del procedimiento oxidativo al crecimiento. La oxidación de lípidos observada en el experimento podía estar relacionada con este procedimiento.

Otros parámetros relacionados con el sistema inmune son lisozimas y lectinas. La lisozima es uno de los componentes de las funciones inmunes inespecíficas contra infecciones víricas y bacterianas. Se ha observado una correlación entre los niveles de lisozima y la GH en peces (Yada T., y col. (2002) Immunomodulatory effects of prolactin and growth hormone in the tilapia, Oreochromis mossambicus. J. Endocrinol. 173: 483-492).

Las lectinas reaccionan con una serie diversa de patógenos y confieren inmunidad innata a los organismos (Alexander J. B. e Ingram G. A., (1992) Noncellular nonspecific defence mechanism of fish. Annu. Rev. Fish. Dis. 2: 249-279).

Los inventores observaron diferencias estadísticas significativas en ambos parámetros en los grupos tratados con polipéptidos 1 y 2 en comparación con el grupo no tratado.

El efecto de estos polipéptidos también se ensayó en larvas de peces ornamentales. Eran capaces de estimular el crecimiento y la supervivencia en grupos tratados con polipéptidos en comparación con controles. También mejoran la pigmentación de los peces. Este parámetro es crucial para la comercialización de peces ornamentales. Se demostró que el efecto producido por estos polipéptidos era visible 15 días después de que se interrumpieran los tratamientos.

\vskip1.000000\baselineskip

Breve descripción de la figuras

Figura 1. Estrategia de clonación en el vector de expresión en Pichia pastoris.

Figura 2. Análisis de la expresión de transformantes que muestran un fenotipo Mut^{s}. La transferencia de Western de las proteínas diana expresada en sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris. Carril 1: MP36 sin transformar; Carril 2: Polipéptido 1; Carril 3: Polipéptido 2; Carril 4: hormona de crecimiento de tilapia.

\newpage

Figura 3. Experimento de crecimiento en larvas de tilapia por inmersión en sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen las proteínas de interés a la dosis de 0,1 mg/litro de agua. La gráfica representa el peso corporal medio de grupos tratados en comparación con controles negativos.

Figura 4. Experimento de crecimiento en larvas de carpa dorada por inmersión en sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen las proteínas de interés a la dosis de 0,1 mg/litro de agua. La gráfica representa el peso corporal medio de grupos tratados en comparación con controles negativos.

Figura 5. Experimento de crecimiento en larvas de carpa dorada por inmersión en sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen las proteína de interés a la dosis de 0,1 mg/litro de agua. La gráfica representa el porcentaje de supervivencia de los grupos experimentales a los 45 días desde el comienzo del experimento.

Figura 6. Experimento de crecimiento en larvas de carpa dorada por inmersión en sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen las proteínas de interés a la dosis de 0,1 mg/litro de agua. Los peces tratados muestran colores más brillantes que los controles negativos.

Figura 7. Experimento de crecimiento en larvas de carpa por inmersión en sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen polipéptido 1 a tres dosis diferentes (0,02; 0,1 y 0,5 mg por litro de agua). La gráfica representa el peso corporal medio del grupo tratado en comparación con un control negativo.

Figura 8. Experimento de crecimiento en tilapia por administración en pienso de los sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen polipéptido 1 a dos dosis diferentes (4,8 mg del polipéptido/kg de pienso y 38,4 mg del polipéptido/kg de pienso). La gráfica representa el peso corporal medio de los grupos tratados en comparación con el control negativo.

Descripción detallada de realizaciones particulares/Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de los vectores de expresión de Pichia pastoris que contienen las secuencias codificantes para los polipéptidos que son los objetos de la presente invención y hormona de crecimiento de tilapia, transformación en la cepa MP36 y expresión de la proteínas de interés

Las secuencias codificantes para los polipéptidos mencionados anteriormente se obtuvieron por PCR con oligonucleótidos específicos usando ADNc de tilapia como molde previamente clonado en el vector pR17. Para amplificar la secuencia codificante para el polipéptido de la SEC ID Nº: 7, se usaron los oligonucleótidos correspondientes a las secuencias de la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2. Para amplificar la secuencia codificante para el polipéptido de la SEC ID Nº: 8, se usaron los oligonucleótidos correspondientes a las secuencias de la SEC ID Nº: 3 y SEC ID Nº: 4.

La secuencia codificante para tiGH se amplificó por PCR a partir del vector pR17 usando los oligonucleótidos correspondientes a las secuencias de la SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6. Los productos de PCR se trataron con la enzima polinucleótido quinasa para fosforilar los extremos del gen y facilitar su clonación en un vector de expresión. El vector de expresión en Pichia pastoris pPS10 se digirió enzimáticamente con la endonucleasa de restricción Nae I y se trató con fosfatasa alcalina para desfosforilar los extremos. Los genes que codifican los polipéptidos de interés y tiGH se ligaron en el vector de expresión usando ADN ligasa de T4 (Figura 1).

Antes de la transformación, los plásmidos se linealizaron con la enzima Sph I. La cepa MP36 de Pichia pastoris se transformó por electroporación con el vector de expresión recombinante. Esta cepa es un mutante auxótrofo de his3 que adquirió un fenotipo His^{+} después de la transformación.

Los transformantes, identificados por transferencia puntual, también se analizaron mediante transferencia de Southern para determinar en cuales se producía la integración por sustitución del gen AOX1 de P. pastoris por el casete de expresión del plásmido recombinante.

Este acontecimiento de integración produce un fenotipo Mut^{s} (bajos niveles de utilización de metanol) e His^{+}. La sustitución genética de AOX1 se produce por recombinación entre las regiones promotoras de AOX1 y 3' AOX1 en el vector y genoma. Como resultado de la recombinación, se produce una deleción en la región codificante de AOX1. Las cepas recombinantes con un fenotipo Mut^{s} sostienen la producción de alcohol oxidasa en el gen AOX2 y tienen una velocidad de crecimiento reducida en metanol.

Los genes que codifican los polipéptidos de interés y la hormona de crecimiento de tilapia están bajo la regulación del promotor de AOX1, inducible por metanol, y tienen un péptido señal. Pichia pastoris secreta bajos niveles de proteínas propias y su medio de cultivo no necesita proteínas como complementos. Por lo tanto, puede esperarse que una proteína heteróloga secretada constituirá un alto porcentaje de las proteínas totales en el medio (más del 80%) (Tschopp y col.; Bio/Technology 1987, 5: 1305-1308; Barr y col.; Pharm. Eng. 1992, 12: 48-51). La producción de las proteínas recombinantes explicada en esta invención se realizó en biorreactores de 5 l con la adición de metanol al cultivo. Como se muestra en la figura 2, se usó una transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal específico para GH de tilapia para comprobar la expresión de la proteína en sobrenadantes de cultivo.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Experimento de crecimiento en tilapia por inmersión con sobrenadantes de cultivo de P. pastoris que contienen polipéptidos de interés. Efectos sobre el sistema inmune

El experimento se realizó por inmersión, tres veces por semana durante 90 min. La dosis era de 0,1 mg de proteína diana/litro de agua. Los grupos experimentales eran:

1. Grupo tratado con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris que contiene polipéptido 1 (tratamiento 1).

2. Grupo tratado con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris que contiene polipéptido 2 (tratamiento 2).

3. Grupo tratado con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris que contiene GH de tilapia (tratamiento 3).

4. Grupo de control negativo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris sin transformar (control negativo).

5. Grupo no tratado.

\vskip1.000000\baselineskip

A los 45 días desde el comienzo del experimento las larvas tratadas con el polipéptido de la SEC ID Nº: 7 tenían un aumento de peso 3,6, 2,1 y 1,6 veces superior en comparación con el grupo no tratado, el control negativo y el grupo tratado con tiGH, respectivamente. Por otro lado, las larvas tratadas con el polipéptido de la SEC ID 8 tenían un aumento de peso 3,2 veces superior en comparación con el grupo no tratado, 1,9 veces en comparación con el control negativo y 1,4 veces en comparación con el grupo tratado con tiGH (Tabla 1, Tabla 1.1, Figura 3).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Promedio del peso corporal de los grupos (g)

1

TABLA 1.1 Análisis estadístico a los 45 días desde el comienzo del experimento

2

\vskip1.000000\baselineskip

Estos son resultados muy importantes puesto que la aceleración del crecimiento en fases tempranas del desarrollo de peces económicamente importantes produce un aumento de supervivencia que es crucial para aumentar las productividades de cultivos.

Para analizar el efecto sobre el sistema inmune, se tomaron 20 animales por grupo a los días 21 y 45 desde el comienzo del experimento. Las larvas se homogeneizaron y se midieron diferentes parámetros del estrés oxidativo: GSH, SOD, organoperóxidos totales, catalasa, peroxidación potencial y oxidación de proteínas.

Los inventores observaron diferencias en el potencial de peroxidación entre grupos tratados en comparación con control negativo a los 21 días desde el comienzo del experimento.

Los inventores midieron la actividad de lisozima en extractos de larvas de 45 días desde el comienzo del experimento. La actividad de lisozima de muestras (homogeneizados larvarios) se midió usando un procedimiento basado en la capacidad de la lisozima para lisar la bacteria Micrococcus lysodekticus. En una microbandeja de 96 pocillos, se mezclaron 100 \mul de muestras en cuatro diluciones seriadas de dos veces en tampón fosfato (0,05 M, pH 6,2) con 100 \mul de una suspensión 3 mg/ml de Micrococcus lysodeikticus (Sigma). La microbandeja se incubó a 22ºC y la D. O. se leyó a 450 nm a los 0, 15, 30 y 60 min. Para un control positivo, los homogeneizados larvarios se sustituyeron por lisozima de clara de huevo de gallina (comenzando las diluciones seriadas a 8 \mug/ml) y para un control negativo, el tampón sustituyó a los homogeneizados larvarios. Una unidad de actividad lisozima se definió como la cantidad de homogeneizados larvarios que causaban una disminución en la lectura de D. O. de 0,001 min^{-1}. Se observaron diferencias estadísticas significativas entre los grupos tratados con los polipéptidos de la SEC ID Nº: 7 y SEC ID Nº: 8 en comparación con el grupo no tratado (Tabla 2).

También los inventores realizaron un ensayo de hemaglutinación para medir lectinas en homogeneizados larvarios. Se realizaron diluciones seriadas de dos veces de extractos de larvas usando PBS a pH 7,2 en pocillos de microtitulación con fondo en forma de U (96 pocillos, Greiner, Microlon) a los que se añadió un volumen equivalente de suspensión de eritrocitos al 2% recién preparada (de conejo en PBS). Los pocillos se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y el título se leyó a simple vista y era igual a la dilución en el último pocillo que mostraba aglutinación (según se manifestaba por una capa de células distribuida uniformemente sobre el fondo del pocillo entero). Se examinó la actividad de hemaglutinina de muestras y se obtuvo para cada valor de título. La actividad se expresó como título, es decir, el recíproco de la mayor dilución que muestra aglutinación completa.

Los inventores observaron diferencias estadísticas significativas entre grupos tratados con los polipéptidos de la SEC ID Nº: 7 y SEC ID Nº: 8 en comparación con el grupo no tratado (Tabla 3).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Concentración de lisozima (\mug/ml) en los extractos de larvas a los 45 días desde el comienzo del experimento

3

ANOVA, ensayo de Turkey; * indica una diferencia significativa P < 0,05.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Título de actividad de hemaglutinina (el recíproco de la mayor dilución que muestra aglutinación completa) en los extractos de larvas a los 45 días desde el comienzo del experimento

4

Ejemplo 3 Experimento de estimulación del crecimiento y mejora en la calidad de las larvas en carpa dorada mediante baños de inmersión con sobrenadantes de cultivo de P. pastoris que contienen los polipéptidos de interés

Se diseñaron cuatro grupos experimentales. Los tratamientos consistían en baños de inmersión, tres veces por semana durante 90 min. La dosis era de 0,1 mg de proteína diana/litro de agua. Los grupos experimentales eran:

A los 45 días desde el comienzo del experimento, los tratamientos 1 y 2 mostraban un aumento de peso significativo en comparación con los tratamientos 3 y 4.

A los 75 días, las larvas tratadas con los polipéptidos de la SEC ID Nº: 7 y de la SEC ID Nº: 8 tenían un aumento de peso 2 veces superior en comparación con el control negativo y 1,5 veces en comparación con el grupo tratado con tiGH (Tabla 4; Tabla 4.1; Figura 4). Aparte, los tratamientos 1, 2 y 3 mostraban un aumento en la supervivencia en comparación con el control negativo (Figura 5).

El color del pez ornamental es un parámetro muy importante para su comercialización. En este experimento, se observó que las larvas bajo los tratamientos 1 y 2 mostraban color en una fase temprana del desarrollo en comparación con el controlo negativo. A los 75 días después desde el comienzo del experimento tenían colores más brillantes (Figura 6).

Se obtuvieron resultados similares con otras especies de peces ornamentales.

TABLA 4 Promedio del peso corporal de los grupos (g)

5

La masa se muestra como media \pm D. T.

TABLA 4.1 Análisis estadístico a los 75 días desde el comienzo del experimento

6

Ejemplo 4 Experimento de crecimiento en carpas mediante baños de inmersión con diferentes dosis de polipéptido 1

Los inventores examinaron el efecto de diferentes dosis del polipéptido 1 sobre el crecimiento en larvas de carpa. Se diseñaron cuatro grupos experimentales:

1. Grupo tratado con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris que contenía el polipéptido de la SEC ID 7 a la dosis de 0,02 mg de polipéptido/litro de agua (tratamiento 1).

2. Grupo tratado con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris que contenía el polipéptido de la SEC ID 7 a la dosis de 0,1 mg de polipéptido/litro de agua (tratamiento 2).

3. Grupo tratado con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris que contenía el polipéptido de la SEC ID 7 a la dosis de 0,5 mg de polipéptido/litro de agua (tratamiento 3).

4. Grupo no tratado.

A los 30 días desde el comienzo del experimento las larvas tratadas con la dosis de 0,5 mg de polipéptido de la SEC ID 7/litro de agua tenían un aumento de peso 2,75 veces superior en comparación con el grupo no tratado. Por otro lado, las larvas tratadas con 0,1 mg de polipéptido de la SEC ID 7/litro de agua tenían un aumento de peso 1,8 veces superior en comparación con el grupo no tratado. No existen diferencias estadísticas entre el grupo no tratado y el grupo tratado con la dosis mínima (Tabla 5; Tabla 5.1; Figura 7).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Promedio del peso corporal de los grupos (g)

7

La masa se muestra como media \pm D. T.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5.1 Análisis estadístico a los 30 días desde el comienzo del experimento

8

Ejemplo 5 Experimento de crecimiento en larvas de camarón Litopenaeus schmitti mediante inmersión en sobrenadantes de cultivo de P. pastoris que contienen los polipéptidos de interés

Se diseñaron tres grupos experimentales. Los tratamientos consistían en baños de inmersión tres veces por semana durante 1:30 h. La dosis era de 0,1 mg de proteína de interés/litro de agua. Los grupos experimentales eran:

1. Grupo tratado con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris que contiene polipéptido de la SEC ID 7 (tratamiento 1).

2. Grupo tratado con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris que contiene polipéptido de la SEC ID 8 (tratamiento 2).

3. Grupo de control negativo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris sin transformar (control negativo).

Como resultado del experimento, los inventores obtuvieron una mejora en la calidad de las larvas en los camarones tratados con los polipéptidos de interés. Las larvas tratadas con los polipéptidos de la SEC ID Nº: 7 y SEC ID Nº: 8 tenían un aumento en el peso corporal 2,3 veces superior respecto al control negativo, más ramificaciones branquiales y modificaciones rostrales. El ensayo estadístico correspondiente se realizó para cada parámetro y se encontraron diferencias estadísticas significativas en todos los casos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Experimento de crecimiento en tilapia por administración en pienso de polipéptido de la SEC ID 7 a diferentes dosis

Los inventores midieron el efecto de dos dosis del polipéptido de la SEC ID Nº: 7 sobre el crecimiento en tilapias juveniles con un peso inicial de 72,99 \pm 3,25 g. Las dosis ensayadas eran de 4,8 mg del polipéptido de la SEC ID Nº: 7/kg de pienso y 38,4 mg del polipéptido de la SEC ID Nº: 7/kg de pienso. Se preparó una formulación oral por incorporación del sobrenadante de cultivo de Pichia pastoris que contenía el polipéptido de interés en la dieta basal. El control negativo eran tilapias alimentadas con dieta basal enriquecida con sobrenadante de cultivo de P. pastoris sin transformar. Durante el experimento los animales se alimentaron dos veces al día con el pienso equivalente al 5% del peso corporal durante 6 semanas.

El polipéptido de la SEC ID Nº: 7 incluido en la dieta a la dosis de 4,8 mg del polipéptido de la SEC ID Nº: 7/kg de pienso aumentaba el crecimiento en el 22% en comparación con el grupo de control con diferencias muy estadísticamente significativas (p < 0,001). La dosis de 38,4 mg del polipéptido de la SEC ID Nº: 7/kg de pienso no mostraba diferencias en relación con el control negativo. (Tabla 6; Tabla 6.1; Figura 8).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Peso medio de los peces (g)

9

La masa se muestra como media \pm D. T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6.1 Análisis estadístico a los 45 días desde el comienzo del experimento

10

Actualmente, los organismos acuáticos son una fuente importante de proteínas, pero la captura a partir de su entorno natural está totalmente explotada. Por esta razón, para aumentar la producción es necesario el cultivo de estas especies acuáticas. Se ha demostrado que en la mayoría de los organismos existe un amplio intervalo en el que es posible manipular el crecimiento por administración de hormonas, modificación genética, etc. (Pullin y col.; Conference Proceeding 7, 432 p. International Center for living Aquatic Resources Monagement. Manila, Philippines. 1982, ISSN 0115-4389). Los polipéptidos que se presentan en este documento tienen la ventaja de que no son específicos de especie y, por lo tanto, son aplicables para diferentes organismos acuáticos para múltiples funciones como aumento del crecimiento, la supervivencia y la calidad de las larvas y mejora de diferentes parámetros implicados en la respuesta inmune. Además, se demostró que tienen un efecto sobre el crecimiento significativamente superior en comparación con la hormona de crecimiento. Por otro lado, estos polipéptidos no tienen actividad biológica en seres humanos, disminuyendo los inconvenientes que tienen los productos aplicables a animales para consumo humano. Además, el uso de estos polipéptidos en peces ornamentales es muy atractivo no sólo porque reducen el tiempo de cultivo como consecuencia de la aceleración del crecimiento sino porque también tienen un efecto sobre los colores de los peces.

<110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> "POLIPÉPTIDOS ESTIMULANTES DEL CRECIMIENTO PARA USO EN PECES Y CRUSTÁCEOS"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> JANNEL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido que hibrida con el extremo 5' del gen codificante para el polipéptido 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido que hibrida con el extremo 3' del gen codificante para el polipéptido 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido que hibrida con el extremo 5' del gen codificante para el polipéptido 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido que hibrida con el extremo 3' del gen codificante para el polipéptido 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido que hibrida con el extremo 5' del gen codificante para la hormona de crecimiento de tilapia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido que hibrida con el extremo 3' del gen codificante para la hormona de crecimiento de tilapia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> tilapia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(158)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de hormona de crecimiento de tilapia

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> tilapia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(142)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de hormona de crecimiento de tilapia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

18

Claims

1. Un polipéptido caracterizado porque su cadena polipeptídica consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia con la SEC ID Nº: 7 o SEC ID Nº: 8.

2. Un procedimiento para producir el polipéptido de la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido se expresa extracelularmente en Pichia pastoris.

3. Una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos definidos en la reivindicación 1 para estimular el crecimiento en peces y crustáceos.

4. El uso de sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen los polipéptidos descritos en la reivindicación 1, en formulaciones de pienso para estimular el crecimiento y/o la resistencia a enfermedades en peces y crustáceos a una dosis tan eficaz como de 4,8 mg del polipéptido/kg de pienso.

5. El uso de sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen los polipéptidos descritos en la reivindicación 1 para los tratamientos de inmersión en peces y crustáceos para estimular el crecimiento, la supervivencia y la calidad de las larvas en una concentración entre 0,05 y 0,5 mg del polipéptido/litro de agua.

6. Una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos de la reivindicación 1 para estimular el sistema inmune humoral innato de los peces y crustáceos.

7. Una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos definidos en la reivindicación 1 para el tratamiento de peces ornamentales.