BRPI0613747A2 - polipeptìdeos de il-7 glicosilada, métodos de preparação e usos - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEOS DE IL-7 GLICOSILADA, NETODOS DE PREPARAçAO E USOS A presente invenção se refere a polipetídeos de interleucina-7, novos e melhorados, bem como de suas composições, suas preparações e seus usos. A invenção se refere, mais particularmente, a polipeptideos de IL-7 hiperglicosilada com propriedades melhoradas, bem como sua fabricação e seus usos terapêuticos. A invenção apresenta também novos polipeptídeos de IL-? com seqUências modificadas de aminoácidos, contendo sítios de glicosilação criados artificialmente, bem como moléculas de ácidos nucléicos, vetores e células hospedeiras recombinantes correspondentes. A invenção também se refere ao uso desses polipeptídeos, células ou ácidos nucléicos para tratamento curativo ou preventivo de mamíferos, incluindo seres humanos.

Description

POLIPEPTIDEOS DE IL-7 GLICOSILADA, MÉTODOS DE PREPARAÇÃO EUSOS

A presente invenção se refere a polipetídeos deinterleucina-7, novos e melhorados, bem como de suascomposições, suas preparações e seus usos. A invenção serefere, mais particularmente, a polipeptideos de IL-7hiperglicosilada com propriedades melhoradas, suafabricação e seus usos terapêuticos. A invenção divulgatambém novos polipeptideos de IL-7 com seqüênciasmodificadas de aminonoácidos, contendo sítios deglicosilação criados artificialmente, assim como asmoléculas de ácidos nucléicos, vetores e célulashospedeiras ou hospedeiras recombinantes correspondentes. Ainvenção também se refere ao uso desses polipeptideos,células ou ácidos nucléicos para tratamento curativo oupreventivo de mamíferos, incluindo seres humanos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os linfócitos BeT são as células efetoras primáriasda resposta imune. As duas classes de células sãoconsideradas como derivadas, em última instância, decélulas-tronco hematopoéticas da medula óssea de mamíferos,via células progenitoras ou precursoras, que representamestágios distintos na diferenciação de cada classe. CélulasT maduras desenvolvem-se principalmente no timo,presumivelmente a partir de uma célula precursora, quemigra da medula óssea para o timo em um estágio inicial dodesenvolvimento dos linfócitos Τ. O desenvolvimento decélulas linfóide depende de fatores de crescimento,sobrevivência e diferenciação produzidos por diversascélulas estromais. Vários fatores estão ativos nas célulasBeT periféricas maduras, incluindo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, gama interferon, BSF-2, neuroleucina, fator decrescimento beta transformador e IL-7.

Os termos interleucina-7 ou IL-7 se referem a umaglicoproteina secretada endogenamente em mamíferos, capazde induzir a proliferação de precursores e progenitores delinfócitos derivados da medula óssea, incluindo osprecursores especializados conhecidos como células pré-B.Derivada originalmente do elemento estromal de uma linhagemcelular de medula óssea, a IL-7 é secretada também porcélulas estromais do timo, do intestino e de outras célulasepiteliais, de algumas células dendríticas e dendríticasfoliculares, de queratinócitos e de todos os tecidoslinfóides em geral. Designações alternativas para essamolécula são "fator de crescimento de célula pré-B" e"linfopoietina-1".

As patentes EP0314415 (ou US4,965,195) descrevemproteínas interleucina-7 de mamíferos e seuscorrespondentes DNAs. A seqüência de aminoácidos da IL-7humana contém três sítios de glicosilação, supostamente Nligados, situados nos resíduos de Asn das posições 70, 91 e116. A expressão recombinante transiente de hIL-7 (IL-7humano) em células COS permitiu a visualização de r-huIL-7(IL-7 humano recombinante) sob a forma de três bandas deproteína, de peso molecular aparente de cerca de 20, 24 e28 kDa (Cosman et al. ; Lymphokine Receptor Interactions;1989; 179:229-236) . A expressão recombinante estável dehIL-7 em células BHK também foi relatada (Armitage et al.;The Journal of Immunology; 1990; 144:938-941). Contudo, ograu de glicosilação da IL-7 humana natural, principalmenteo de 0-glicosilação, nunca foi documentado ou estudado. 0impacto do perfil de glicosilação nas propriedades da IL-7também nunca foi considerado. Além disso, IL-7 humanamadura não-glicosilada (r-hIL-7), produzida em E. coli,como descrito na patente EP0314415, possui peso molecularde 17.387 Daltons e apresenta alta atividade in vitro embio-ensaios específicos baseados na proliferação dediversas populações de linfócitos. Outras citocinas efatores de crescimento como G-CSF, GM-CSF, IFN, HGF, etc,também apresentam atividade terapêutica plena semglicosilação.

A patente W02004/018681 apresenta um confôrmero ativoda IL-7 humana, contendo as pontes dissulfeto 1-4 (C2-C92),2-5 (C34-C129) e 3-6 (C47-C141), os métodos de produzi-lo ecaracterizá-lo, bem como seus usos.

A IL-7 foi descrita originalmente como uma citocinacuja principal atividade era induzir a proliferação decélulas do precursor B (Namen A. E. et al. ; Journal ofExperimental medicine; 1988; 167:988-1002). Maisrecentemente, foi descrito o envolvimento da IL-7 nasobrevivência e proliferação de timócitos (células T)durante os primeiros estágios do desenvolvimento dessascélulas (Schluns K.S. et al. ; Nature Immunology; 2000;1(5):426-432). O caminho da IL-7 é essencial para odesenvolvimento dos linfócitos, especialmente dos timócitos(Maeurer M.J. et al., Int. Rev. Immunol. 1998, 16:309-22;Fry T.J. et al., Blood 2002, 99:38 92-904). Fry ecolaboradores identificaram a IL-7 também como um potentemodulador da regeneração de células T independentes, dotimo, em uma ação multif atorial (Fry T.J. et al., Blood2001, 97 (6) :1525-1533) . A IL-7 modula fortemente as célulasT maduras e pode, ainda, influenciar o desenvolvimento decélulas apresentadoras de antigenos (Marquez C. et al., J.Exp. Med. 1995, 181:475-83). A IL-7 é essencial para aregeneração das células T de memória, tanto na subpopulaçãoCD4 quanto na CD8 (Kondrack R.M. et al., J. Exp. Med. 2003,198:1797-806; Kaech S.M. et al., Nat. Immunol. 2003,;4:1191-8).

A IL-7 tem, portanto, um enorme potencial terapêuticocomo estimulante da proliferação de precursores das célulasT, das células B secretoras de anticorpos, no estimulo daexpansão das células T periféricas direcionadas porantigenos e na produção de células T selvagens, bem como deoutros tipos de células hematopoiéticas. Uma aplicaçãoterapêutica particularmente interessante das moléculasativas de IL-7 é a reconstituição do sistema imunológico depacientes 1 infopênicos, tais como aqueles que receberamtratamento contra o câncer, os que foram submetidos atransplante de medula óssea ou de células-tronco, os queapresentam deficiência imunológica congênita ou adquirida,os idosos e quaisquer pacientes com contagem baixa de CD4.Outras utilizações derivam da capacidade que a IL-7 possuide produzir novas células T do tipo CD4 selvagem e deexpandir aglomerados específicos, a fim de provocar ouaumentar respostas imunológicas específicas (enhancer devacina).

Tendo em vista o seu potencial terapêutico, é degrande interesse desenvolver polipeptídeos de IL-7 ativosou melhorados, adequados a um uso terapêutico eficiente.Com relação a isso, entre as várias citocinas e fatores decrescimento disponíveis no mercado, alguns são fracamenteimunogênicos (por exemplo, o interferon alfa "IFNa" e ofator de crescimento de colônias de granulócitos "G-CSF"),de modo que as drogas correspondentes não necessitam que opolipeptídeo tenha um grau de pureza maior do que ousualmente aceito para as proteínas recombinantes. Poroutro lado, outros fatores de crescimento são maisimunogênicos (por exemplo, o interferon beta "ΙΓΝβ" e ofator de estimulação de colônias de granulócitos macrófagos"GM-CSF") ou, então, sua atividade específica é tãofundamental para a vida (por exemplo, a eritropoietina,EP0) que o grau de pureza e o perfil da droga polipeptídicatêm que ser determinados cuidadosamente e mantidos dentrode limites estreitos, a fim de protegê-la daimunogenicidade.A IL-7 é uma molécula única. Devido a suaspropriedades intrínsecas na ativação do sistemaimunológico, ao ser utilizada como agente terapêutico ela éparticularmente capaz de provocar uma ação imunogênica antiIL-7 (ligantes anti IL-7 ou anticorpos neutralizantes).Esse efeito imunogênico é prejudicial à atividadeterapêutica da proteína a longo prazo. Os anticorpos antiIL-7 podem modificar a farmacocinética da IL-7,neutralizando sua ação terapêutica.

Diversas isoformas da IL-7 estão envolvidas nesseprocesso de produção de resposta imunológica anti IL-7.Entre eles incluem-se seqüências modificadas depolipeptídeos (por exemplo, formas oxidadas, reduzidas,desaminadas ou truncadas) e multímeros covalentes, ou não—covalentes, de IL-7, como os seus agregados moleculares eassemelhados. Sendo assim, é fundamental determinar ospolipeptídeos de IL-7 e as drogas derivadas mais estáveis ecom menor probabilidade de formar agregadosintermoleculares, bem como os que apresentem menoratividade imunogênica, porém conservando sua atividadebiológica. De fato, enquanto a atividade da maioria dasdrogas está relacionada com o parâmetro AUC, a da IL-7correlaciona-se com a meia-vida e, mais particularmente,com o tempo de residência médio.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOA presente invenção apresenta polipeptídeos novos emelhorados de IL-7, drogas e composições farmacêuticasderivados deles. Mais particularmente, a presente invençãoapresenta novas espécies moleculares de IL-7 com alto graude glicosilação e perfil de oligossacarideos com maior pesomolecular, em que os carboidratos apresentam grau desialilação e fucosilação mais alto e ponto isoelétrico maisbaixo. A presente invenção demonstra que esses novos perfisde oligossacarideos confere às drogas que os contêm, maiorestabilidade química e farmacêutica, além de um perfilfarmacocinético mais prolongado após administração in vivo,caracterizado por um maior tempo de residência médio (TRM),que permite doses menos freqüentes.

Portanto, a presente invenção disponibiliza novospolipeptídeos de IL-7 altamente glicosilada ouhiperglicosilada, que possuem propriedades melhoradas. Ainvenção apresenta também novos polipeptídeos de IL-7 comseqüências modificadas de aminoácidos, contendo sítios deglicosilação criados artificialmente, bem como moléculas deácidos nucléicos, vetores e células hospedeiras ouhospedeiras recombinantes correspondentes. A invençãotambém se refere ao uso desses polipeptídeos, células ouácidos nucléicos para tratamento curativo ou preventivo demamíferos, incluindo seres humanos. A presente invençãoapresenta, portanto, novos polipeptídeos de IL-7 ativos,suas composições farmacêuticas e drogas derivadas, queapresentam maior estabilidade, menor susceptibilidade àproteólise e à agregação, maior atividade in vivo a longoprazo e menor atividade imunogênica, o que permite gerarrespostas imunes melhores, gerais ou especificas, emmamíferos.

Um objeto da presente invenção é uma composiçãocontendo IL-7 hiperglicosilada.

Um outro objeto da presente invenção é um polipeptídeode IL-7 hiperglicosilada purificado, caracterizado porconter, pelo menos, três resíduos de aminoácidos N-glicosilados.

Um outro objeto da presente invenção é um polipeptídeode IL-7 hiperglicosilada, utilizado na preparação de ummedicamento, que consiste desse polipeptídeo e umexcipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável, paratratamento de mamíferos.

Um outro objeto da presente invenção refere-se ao usode uma composição de IL-7 hiperglicosilada para apreparação de um medicamento para tratamento de mamíferos.

Outro objeto da presente invenção é um método paraprovocar ou estimular a resposta imune de um indivíduo,caracterizado pela administração de uma quantidade efetivada composição de IL-7 hiperglicosilada.

Outro objeto da presente invenção é um método paraestimular a expansão de células T, ex-vivo, caracterizadopor colocar as células T em contato com um polipeptídeo deIL-7 hiperglicosilada ou uma composição dele promovendo,assim, a expansão dessas células T.

Em uma modalidade especifica da presente invenção, acomposição de IL-7 hiperglicosilada é caracterizada porconter, pelo menos, 80%, preferencialmente entre 80 e 95%,de polipeptideos de IL-7 glicosilada em, pelo menos, trêsresíduos de aminoácidos diferentes. Tais resíduos podem sercomponentes naturais da seqüência polipeptídica de IL-7e/ou sítios de glicosilação artificialmente criados.

Em outra modalidade específica da presente invenção, acomposição de IL-7 hiperglicosilada é caracterizada porconter, pelo menos, 80%, preferencialmente entre 80 e 95%de polipeptideos de IL-7 glicosilada em resíduos deaminoácidos diferentes, em número de três a oito, incluindoum sítio de O-glicosilação e até sete sítios de N-glicosilação. Tais resíduos podem ser componentes naturaisda seqüência polipeptídica de IL-7 e/ou sítios de N-glicosilação artificialmente criados.

A esse respeito, outro objeto da presente invenção serefere a polipeptideos de IL-7 contendo uma seqüênciamodificada de aminoácidos, a qual é caracterizada porconter, pelo menos, um sítio de glicosilaçãoartificialmente criado. De acordo com modalidadesespecíficas, os polipeptideos de IL-7 da presente invençãocontêm um, dois, três ou quatro sítios de glicosilaçãoartificialmente criados, preferencialmente um, dois ou trêse, particularmente, um ou dois. Como será mostrado adiante,os sítios criados artificialmente são, de preferência, deN-glicosilação. Os polipeptídeos de IL-7 da presenteinvenção podem ser oriundos de qualquer mamífero,especialmente de origem humana. Além disso, essespolipeptídeos podem conter a seqüência de um polipeptídeode IL-7 maduro, ou ainda, possuir resíduos adicionais deaminoácidos como, por exemplo, de um peptídeo de secreção.Adicionalmente, ou como alternativa, o polipeptídeo de IL-7deve ser um confôrmero específico contendo as seguintestrês pontes dissulfeto: Cys: 1-4 (Cys2- Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); 3-6 (Cys47- Cysl41). Exemplos específicos dessespolipeptídeos de IL-7 modificados contêm, pelo menos, umamodificação de aminoácido, como mostrado na Tabela 1abaixo, ou uma combinação delas.

Outro objeto da presente invenção consiste em umamolécula de ácido nucléico contendo um polipeptídeo de IL-7, como discutido acima. Essa molécula de ácido nucléicopode ser qualquer molécula de DNA ou RNA sendo,tipicamente, uma de cDNA.

Outro objeto da presente invenção consiste em umamolécula de ácido nucléico, que codifica um sinal desecreção contendo SEQ ID NO: 19.

Outro objeto da presente invenção consiste em umvetor, que contém uma molécula de ácido nucléico, comodefinida acima. Esse vetor pode ser qualquer umprocariótico ou eucariótico sendo, tipicamente, um vetoreucariótico; ele pode ser selecionado a partir de umplasmideo, de DNA epissomal, de cosmideo, de vetor viral,de cromossomo artificial, etc. Tal vetor pode conterqualquer seqüência regulatória, que permita a expressãoadequada do ácido nucléico codificado em uma célulahospedeira selecionada. Por exemplo, um promotor, umterminador, um poli A, uma origem de replicação, um intron,regiões 5' ou 3' não-traduzidas de genes (UTR), etc.

Os ácidos nucléicos e vetores acima podem ser usados,por exemplo, para produzir polipeptideos de IL-7recombinante de mamíferos em diversas células hospedeirascompetentes, bem como para fins de terapia genética.

Outro objeto da presente invenção consiste em umacélula hospedeira recombinante contendo um ácido nucléicoou um vetor como apresentados acima. Essa célularecombinante pode ser procarionte ou, preferencialmente,eucarionte tal como uma célula de levedura, de inseto, deplanta ou de mamífero; de preferência, deve ser uma célulahospedei ra recombinante transduzida para expressar ousuperexpressar uma glicosiltransferase e/ou umasialiltransferase, por exemplo, uma de origem humana.

Outro objeto da presente invenção consiste em umadroga, que contém um polipeptídeo de IL-7 como descritoacima sendo, tipicamente, um polipeptídeo de IL-7hiperglicosilada. Preferencialmente, a droga contém menosde 10% de polipeptídeo mono-glicosilado ou não-glicosiladode IL-7 e/ou é, essencialmente, livre de impurezasrelacionadas ao produtos.

A presente invenção se refere, ainda, a uma composiçãofarmacêutica caracterizada por conter uma quantidadeefetiva de polipeptídeo de IL-7 ou uma composição, ou umadroga, como descritos acima e um, ou mais, veículos ouexcipientes farmaceuticamente compatíveis.

A invenção também se refere a um anticorpo, bem comofragmentos ou derivados dele, especificamente imunorreativoa um polipeptídeo de IL-7, como descrito acima; a linhagenscelulares de hibridoma, que produzem tal anticorpo, e acomposições utilizáveis em diagnóstico, análise ou terapia,que contenham o anticorpo, fragmentos ou derivados dele.

Outro aspecto da presente invenção é um método paraprodução de um polipeptídeo de IL-7 como descrito acima, apartir de células hospedeiras procariontes ou eucariontes,bem como um método para detecção ou medida da presença detal polipeptídeo em uma amostra, ou para caracterizaçãodessa amostra.Em uma modalidade especifica, o método para produçãode um polipeptideo de IL-7 como definido acima compreende:

a) cultivo de uma célula hospedeira recombinantecomo definida acima; e

b) isolamento do polipeptideo de IL-7 produzido poresta célula.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, aexpressão ocorre sob condições que permitam adicionarmotivos de glicosilação eficientes ao polipeptideo de IL-7,em particular, resíduos de ácido siálico.

Em outra modalidade da presente invenção, a produção éfeita em modo de alimentação por batelada ou por perfusão,mantendo-se as células no final da fase de crescimentoexponencial. Essas condições aumentam a qualidade dasmodificações pós-translacionais e contribuem para um maiorgrau de sialilação por polipeptideo de IL-7. De acordo commodalidades específicas da presente invenção, o ácidonucléico codificador contém um sinal de secreção e/ou umaseqüência otimizada de ácidos nucléicos e/ou a célulahospedeira é eucarionte (por exemplo, uma célula demamífero, de insetos ou de levedura).

Outro objeto da presente invenção se refere ao uso deum polipeptideo de IL-7 ou uma composição de IL-7hiperglicosilada, como definidos acima ou obtidos por ummétodo descrito acima, para a fabricação de uma composiçãofarmacêutica capaz de provocar ou de modular uma respostaimune em um indivíduo, especialmente, de induzirestimulação prolongada da linfopoiese e/ou de amplificaruma resposta imune.

A presente invenção se refere também ao uso de umpolipeptídeo de IL-7 como definido acima ou obtido por ummétodo descrito acima, para a fabricação de uma composiçãofarmacêutica, que previna ou trate doenças associadas àimunodeficiência.

Como será discutido adiante, os polipeptídeos dapresente invenção apresentam meia-vida plasmática e tempode residência médio estendidos, o que favorece a atividadee a interação com o receptor in vivo; também apresentammaior estabilidade e menor ação imunogênica a longo prazopermitindo, assim, seu uso no tratamento de diversaspatologias em mamíferos, especialmente em seres humanos.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1: Plasmideo ph-pgk.EP7-hIL-7: efla pA:seqüência "fator de alongamento 1 alfa" poli A; hgh pA:seqüência "hormônio de crescimento humano" poli A; SpA:seqüência poli A sintética; hph: resistência à higromicina;Amp: resistência à ampicilina; MAR Pglobina de coelho:provável "Região Matriz de Ligação" de Pglobina de coelho;pr. tk: promotor de timidinaquinase; sv40 enh.: enhancer desv40; pr pgk: promotor de fosfogliceratoquinase; 5'UTRintl:região 5' não-traduzida contendo um intron quimérico (ϊιβ-globina-imunoglobulina); EP7-hIL7:upstream de IL-7 cDNAhumano otimizado a partir do peptideo-sinal EP7.

Figura 2: Plasmideo pBh-pgk.EP7-hIL-7 : Bcl2: Bcl2cDNA ; IRES: Sitio interno de Entrada de Ribossoma

Figura 3: Expressão de hIL-7 recombinante em célulasde mamíferos cultivadas em biorreator desde o dia 1 (Dl)até o dia 10 (DlO) . Western blot de IL-7 intracelularversus secretado.

Figura 4: Fracionamento cromatográfico de glicoformasde rec-hIL-7 ao longo do processo de purificação: AnáliseSDS PAGE do conteúdo protéico em diferentes frações eluídas(BI- B10) . As glicoformas de IL-7 foram separadas duranteas etapas de captura e de HIC. Gradientes de tampão foramusadas de modo a eluir diferencialmente as glicoformas dehIL-7, de acordo com pequenas diferenças em suaspropriedades físico-químicas. 0 fracionamento e subseqüenteseleção das frações adequadas permitiu o enriquecimento nohIL-7 recombinante triplamente glicosilado (3N- ou 2N-associado com 10-resíduo de açúcar). MPM, marcadores depeso molecular de proteínas (10 ; 15 ; 20 ; 25 ; 37 ; 50 ;75 ; 100 ; 150 ; 250kDa); B1-B10, frações eluídas; B1-B4,frações eluídas, separadas para purificação adicional; CT,fração Bl obtida de uma cultura de linhagem celular HEK293transfectada com o mesmo hIL-7 cDNA otimizado.

Figura 5: Análise, em SDS PAGE, do hIL-7 recombinantepurificado. Amostras de hIL-7 recombinante purificado foramsubmetidas a SDS PAGE sob condições redutoras. Os géisforam revelados por:

A. Corante Coomassie

B. Western blot

MPM: marcadores de peso molecular (10 ; 15 ; 20 ; 25 ; 37 ;50 ; 75 ; 100 ; 150 ; 250kDa) . Linha 1: HG-37-147 ; Linha2: HG-4 0-104 ; Linha 3: HG-hIL-7 ; Linha 4: hIL-7 de E.coli.

Figura 6: Comparativo de peso molecular aparente,obtido por SDS-PAGE, de produtos de rec-hIL-7 glicosilada,purificados.

Linha M = Marcador de peso molecular; Linha 1 =representação esquemática do produto purificado comodescrito por Namen et al. na patente US 5 328 988 (cerca deKDa); Linha 2 = produto CHO rec-sIL-7 purificado peloRequerente; Linha 3 = produto CHO rec-hIL-7 purificado peloRequerente; Linha 4 = glicoformas IN- e 2N-hIL-7, usadascomo padrões para efeito de comparação dos pesosmoleculares aparentes; Linha 5 = produto rec-hIL-7 deE.coli purificado pelo Requerente (CYT 99 007).Figura 7: Análise de IL-7 recombinante humanopurificado, por SDS PAGE sob condições redutoras, apósdesglicosilação.

As amostrasde IL-7 recombinante humano, purificadas,foram digeridas por PNGase F : Amostras recolhidas deestudo cinético, de 2 minutos a 24 horas, foram aplicadasno gel.

Outra amostra (OO/N) foi digerida durante 24h comPNGase F + O-glicosidase/β(1-4)galactosidase/neuraminidase/N-Acetilglicosaminidase.

Amostras de IL-7 humana glicosilada e de IL-7 humanaderivadas de E. coli também foram aplicadas no gel, comocontrole.

As glicoformas 3N+10, 2N+10, 1N+10, 10 e a formadesglicosilada de IL-7 humana foram, então, separadas, deacordo com seu PM estimado no gel, respectivamente, 33, 27,24, 18 e 17 kDa.

Figura 8: Análise por espectrometria de massas dediferentes glicoformas purificadas de rec-hIL-7.

- 23 kDa (23179 Da): Rec-hIL-7(CHO S,2N+3N)

- 25 kDa (25127 Da): Rec-hIL-7(CHO S,3N)Figura 9: Análise por eletroforese 2D do polipeptideode IL-7 recombinante humana hiperglicosilada, purificado.Após focalização isoelétrica (pH entre 3 e 10), asglicoformas foram separadas por SDS PAGE sob condiçõesredutoras (corante azul Coomassie).

Figura 10: Análise por espectrometria de massas decomplexo recombinante de hIL-7 N-glucana. Amostraspurificadas de hIL-7 glicosilada foram digeridasenzimaticamente com uma endoglucosidase, como a peptídeo-N-glucosidase F (PNGaseF, Roche). Os oligossacarideos N-ligados e amostras de proteínas liberados pela digestãoenzimática foram separados da estrutura peptídica eanalisados por espectrometria de massas usando a técnicaMALDI-TOF. Os valores de m/z correspondentes a cada picoforam comparados com bancos de dados internacionais, o quepermitiu uma identificação precisa das N-glicanas presentesna molécula de hIL-7.

Figura 11: Caracterização das O-glicanas presentes nohIL-7 recombinante, por meio do uso de lecitinasespecíficas (blot de lecitina). Após separação das amostrasde proteínas e blot em membrana, os produtos foramrevelados com uma das duas lecitinas seguintes: MAA, deMaackia amurensis e PNA, de Arachis hypogea) . Linha 1:padrão de fetuína, uma proteína sialilada; Linha 2: fetuínatratada com uma sialidase; Linha 3: hIL-7; Linha 4: hIL-7tratada com sialidase.Figura 12: Afinidade do peptideo de IL-7hiperglicosilada por lecitina (teste ELISA). Placascontendo lecitinas (LEA de Lycopersicon esculentum, WGA deTriticum vulgare, UEA.I de Ulex europeus, MAA de Maackiaamurensis, ACA de Amaranthus caudatus, AIA de Artocarpusintergrifolia, ABA de Agarieus bisporus, PHA.L dePhaseolus vulgaris), usadas para ligar quantidadesidênticas de preparações de hIL-7 recombinante purificada.

Amostras de IL-7 ligada, dependendo da especificidade dalecitina frente à porção glicana, foram reveladas por meiode um anticorpo anti hIL-7 especifico (Ab) combinado combiotina. O "sanduíche" de lecitina-IL-7-Ab foi revelado porum complexo de streptavidina-peroxidase.

Figura 13: Bio-ensaio de atividade da IL-7recombinante humana. Cinética de dose-resposta docrescimento de células PB-I induzido por r-hIL-7 não-glicosilada (expressada em E. eoli) ou por r-hIL-7altamente glicosilada (produzida em células de mamíferos).

Figura 14: Bio-ensaio de atividade da IL-7recombinante humana. Dados cinéticos de dose-resposta ecurvas obtidas como rotina em um bio-ensaio típico: ocrescimento de células PB-I foi induzido por r-hIL-7 nãoglicosilada (expressada em E. eoli), altamente glicosiladaou hiperglicosilada (produzida em células de mamíferos). Ospontos representam a média ± SD de determinações emtriplicata.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a composições de IL-7hiperglicosilada, sua fabricação e suas aplicações naindústria farmacêutica. A presente invenção demonstra, pelaprimeira vez, que a atividade e/ou as propriedades da IL-7podem ser melhoradas, dependendo do perfil de glicosilaçãodo polipeptideo. A presente invenção mostra também,surpreendentemente e ao contrário dos dados obtidos invitro, que a melhor atividade in vivo pode ser obtida compolipeptiedos de IL-7 que contenham, pelo menos dois ou,preferencialmente, três sitios de N-glicosilação ocupados eum sitio de O-glicosilação, além de máxima sialilaçãoterminal das porções de oligossacarideo. A presenteinvenção ainda se refere a polipeptideos de IL-7hiperglicosilada criados artificialmente, que apresentamatividade prolongada (permitindo, assim, menor freqüênciade administração), e/ou menor atividade imunogênica a longoprazo. Tendo em vista a utilidade da IL-7, essespolipeptideos e suas composições representam moléculasativas de grande valor e utilidade para uso na regulação daresposta imune, inclusive em seres humanos.

Um primeiro objeto da presente invenção, portanto,consiste em uma composição de IL-7 hiperglicosilada.

Um outro objeto da presente invenção se refere aoemprego da IL-7 hiperglicosilada para fabricação de ummedicamento, que consiste dessa IL-7 hiperglicosilada e de,pelo menos um excipiente ou veiculo farmaceuticamenteaceitável, para tratamento de mamíferos.

Outro objeto da presente invenção é um método paraprovocar ou estimular uma resposta imune em um indivíduo,método este caracterizado pela administração de umaquantidade efetiva da composição de IL-7 hiperglicosilada.

Um outro objeto da presente invenção refere-se ao usode uma composição de IL-7 hiperglicosilada e,preferencialmente, altamente sialilada, para a fabricaçãode um medicamento, que provoque ou estimule uma respostaimune nos pacientes.

No contexto da presente invenção, um "polipeptídeo deIL-7" designa um polipeptídeo de IL-7 de mamíferos (porexemplo, seres humanos, símios, bovinos, eqüinos, felinosou caninos). De preferência, o polipeptídeo de IL-7 deveser de origem humana, especialmente para uso comomedicamento ou como vacina. Como alternativa, especialmentepara uso em primatas não-humanos ou em aplicaçõesveterinárias, o polipeptídeo de IL-7 pode provir dequalquer outro mamífero como, por exemplo, um polipeptídeode IL-7 de símios, ou um polipeptídeo canino.

Os polipeptídeos humanos de IL-7 preferidos napresente invenção são caracterizados por possuir umaseqüência de aminoácidos como descrita nas patentes EP 314415 ou W02004/018681 A2, suas variantes naturais ou seushomólogos. A seqüência de IL-7 humana está disponíveltambém em bancos genéticos. A proteína de tipo selvagemtípica contém 152 aminoácidos e, opcionalmente, um resíduoadicional de metionina N-terminal (SEQ ID NO: 1) . Suasvariantes incluem, de preferência, variantes alélicasnaturais resultantes de polimorfismo natural, incluindoSNPs, variantes excisadas, etc. Em uma modalidadeespecífica da presente invenção, o termo peptídeo de IL-7 éusado para designar um polipeptídeo que contenha aseqüência de SEQ ID NO: 1 ou suas variantes naturais.

Em outra modalidade da presente invenção, opolipeptídeo de IL-7 é de origem canina. A esse respeito, ainvenção apresenta, pela primeira vez, a seqüência de umpolipeptídeo de IL-7 isolado, a qual representa mais umobjeto dessa invenção. Em particular, a presente invençãose refere a um polipeptídeo de IL-7, caracterizado porconter a seqüência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 7,bem como suas variantes naturais, homólogos ou fragmentosdistintivos delas. Os termos "variantes" ou "homólogos" sereferem a polipeptídeos que difiram da SEQ ID NO: 7 porremoção, substituição ou adição de um, ou de um númerolimitado de aminoácidos. De preferência, essas variantes ouhomólogos apresentam um percentual de identidade com SEQ IDNO: 7 superior a 85%, especialmente, maior que 90%,particularmente, superior a 95% e, mais particularmente,superior a 98%.O polipeptideo de IL-7 usado na presente invenção é,de preferência, uma IL-7 recombinante. O termo"recombinante", como utilizado aqui, significa que opolipeptideo seja obtido ou derivado de um sistema deexpressão recombinante, ou seja, de uma cultura de célulashospedeiras (por exemplo, microbiano, ou de inseto, ou deplanta, ou de mamífero) , ou de plantas ou de animaistransgênicos produzidos para conter uma molécula de ácidonucléico que codifique um polipeptideo de IL-7. O termo"microbiano" se refere a proteínas recombinantes produzidaspor sistemas de expressão de bactérias O termo "mamíferos"se refere a glicoproteínas recombinantes produzidas porsistemas de expressão de mamíferos. Como será discutidoadiante, todas essas células hospedeiras devem expressar depreferência, naturalmente ou após transgênese, um geneapropriado de glicosiltransferase e/ou sialiltransferase. Opolipeptideo de IL-7 pode, também, ser glicosilado pelaação, in vitro ou in vivo, da glicosiltransferase e/ousialiltransferase apropriadas, ou pela incorporação deestruturas de oligossacarídeos.

Um exemplo específico de polipeptideo de IL-7 humano éum polipeptideo da SEQ ID NO: 1 contendo as pontesdissulfeto Cys2-Cys92; Cys34-Cysl29 e Cys47-Cysl41.

Os polipeptídeos de IL-7 da presente invenção tambémpodem conter a seqüência de um polipeptideo de IL-7 maduroou, ainda, resíduos adicionais de aminoácidos como, porexemplo, um peptídeo secretado. Exemplos preferidos dessespeptideos secretados incluem, entre outros, um peptídeo-sinal selecionado entre EPO, SEAP, IgGkappa,Lactotransferina/vitronectina, VlP/vitronectina e cistatinabis. As seqüências desses peptideos-sinais estão mostradas,respectivamente, nas SEQ ID NO 13 a 18. Em uma modalidadeespecifica da presente invenção, o peptideo-sinal é umhíbrido, construído pelos inventores desta, entreseqüências derivadas dos peptídeos-sinais EPO e 11,-1. Aseqüência desse peptideo-sinal, denominado EPy7 ou EP7, éapresentada na SEQ ID NO: 19 e representa um objetoparticular da presente invenção.

No contexto da presente invenção, o termo "IL-7hiperglicosilada" designa um polipeptídeo de IL-7 contendo,pelo menos, três sítios de glicosilação ocupados, ou seja,contendo pelo menos três resíduos de aminoácidosglicosilados.

Um "sítio de glicosilação" designa qualquer resíduo deaminoácido ou região de um polipeptídeo sujeito aglicosilação, ou seja, ligação à estrutura de umcarboidrato. Tais sítios são, tipicamente, de N-glicosilação (ou seja, qualquer resíduo de aminoácido ouregião de um polipeptídeo, que permita ligação de umcarboidrato através de uma ligação com o átomo de N) e/ousítios de 0-glicosilação (ou seja, qualquer resíduo deaminoácido ou região de um polipeptídeo, que permitaligação de um carboidrato através de uma ligação com oátomo de 0). Seqüências de consenso para sítios deglicosilação são conhecidas, per se, no estado da técnica.

A titulo de ilustração, um sitio consensual de N-glicosilação possui, tipicamente, a seguinte estrutura:Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido, excetoprolina. Como será mostrado adiante, tais sítios deglicosilação podem ser componentes naturais da seqüênciapolipeptídica de IL-7 e/ou serem adicionados ou criadosartificialmente nessa seqüência.

O termo "composição de IL-7 hiperglicosilada" designauma composição de IL-7 em que, pelo menos 80% dospolipeptídeos de IL-7 têm, no mínimo, três sítios deglicosilação ocupados, ou seja, contem pelo menos trêsresíduos de aminoácidos glicosilados. De preferência, talcomposição contém, pelo menos, 80% de polipeptídeosglicosilados em, no mínimo, três sítios de N-glicosilaçãoe, opcionalmente, em um sítio de O-glicosilação. Essacomposição é, de preferência, essencialmente desprovida depolipeptídeos de IL-7 não-glicosilados ou monoglicosiladose contém, no máximo 20% de polipeptídeos de IL-7diglicosilados. Em uma modalidade preferida da presenteinvenção, uma composição de IL-7 hiperglicosilada designauma composição de IL-7 em que, pelo menos, 90% dospolipeptídeos de IL-7 são glicosilados em três sítios de N-glicosilação e, opcionalmente, em um sítio de O-glicosilação. Essa composição é, de preferência,essencialmente desprovida de polipeptídeos de IL-7 não-glicosilados ou monoglicosilados e contém, no máximo 10% depolipeptideos de IL-7 bis-N-glicosilados com, ou sem,polipeptideos de IL-7 mono-O-glicosilados.

A seqüência primária de aminoácidos de IL-7 contémtrês supostos sítios de N-glicosilação, a saber, resíduosde asparagina (Asn) nas posições 70, 91 e 116 (com relaçãoà seqüência do tipo selvagem humano, veja SEQ ID NO: 1).Além disso, a presente invenção mostra que a seqüência deIL-7 contém, também, um sítio de O-glicosilação, que é umresíduo de treonina (Thr) na posição 110. Em uma modalidadeparticular da presente invenção, o polipeptídeo de IL-7hiperglicosilada é um polipeptídeo de IL-7 contendo os trêssítios de N-glicosilação acima, ocupados e associados, ounão, a um sítio de O-glicosilação também ocupado. Nessamesma modalidade, a composição de IL-7 hiperglicosilada éuma composição na qual, pelo menos, 80% dos polipeptideosde IL-7 são glicosilados nos sítios de N-glicosilação acimae, opcionalmente, também no sítio de O-glicosilação.

Em uma modalidade da presente invenção, umpolipeptídeo de IL-7 hiperglicosilada pode conter sítios deglicosilação criados ou adicionados artificialmente. Assim,um polipeptídeo de IL-7 hiperglicosilada da presenteinvenção é um polipeptídeo de IL-7 contendo, pelo menos,três sítios de N-glicosilação e um de O-glicosilaçãoocupados, sendo esses sítios de ocorrência natural e/oucriados/adicionados artificialmente; uma composição de IL-7hiperglicosilada é uma composição na qual pelo menos 80%dos polipeptideos de IL-7 são glicosilados em, no mínimo,quatro sítios de glicosilação de ocorrência natural e/ouadicionados/criados artificialmente.

A esse respeito, a presente invenção apresentapolipeptídeos de IL-7 contendo uma seqüência modificada deaminoácidos, a qual é caracterizada por possuir, pelomenos, um sítio de glicosilação artificialmente criado. Deacordo com modalidades específicas, os polipeptídeos de IL-7 da presente invenção contêm um, dois, três ou quatrosítios de glicosilação artificialmente criados,preferencialmente um, dois ou três e, particularmente, umou dois.

Os sítios criados artificialmente são, de preferência,de N-glicosilação. Um sítio consensual de N-glicosilaçãopossui, tipicamente, a seguinte estrutura: Asn-X-Ser/Thr,onde X pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina.

Os sítios de glicosilação podem ser criados ouadicionados quimicamente, a partir de oligonucleotídeossintéticos ou utilizando técnicas diversas, incluindométodos mutagênicos, em várias posições da seqüênciaprimária de aminoácidos de IL-7, e seguindo técnicasconhecidas, per se, no estado da técnica. Uma vez que opolipeptídeo de IL-7 modificada deve manter a capacidade dese ligar a um receptor de IL-7, os sítios de glicosilaçãosão, preferencialmente, criados em regiões ou domínios daseqüência de polipeptídeo de IL-7, que não alterem essacapacidade. De preferência, esses sítios são introduzidosdo lado de fora das hélices alfa do polipeptideo e,particularmente, não devem ser introduzidos nasproximidades imediatas dos residuos de glicina. Depreferência, eles devem ser introduzidos na região maisflexível, evitando as regiões mais rígidas e maisimportantes para a estrutura terciária do polipeptideo.

Preferencialmente, a criação do sítio de glicosilação nãodeve afetar qualquer resíduo de cistina envolvido em pontedissulfeto (por exemplo, Cys 2, 34, 47, 92, 129 e 141), nemqualquer resíduo criticamente envolvido na interação dopolipeptideo de IL-7 com seu receptor cognato (por exemplo,Ser 19, Leu 23 and 77, Tyr 12, Val 15, Gln 22, Lys 81 eGlu 84); também não deve afetar qualquer resíduoconservado, envolvido na atividade do polipeptideo (porexemplo, Arg 133, Gln 136, Glu 137, Lys 139 e 144, Thr 140e Asn 143). Os sítios de glicosilação são criados,tipicamente, por mutação, remoção ou adição de um, ouvários, resíduos de aminoácidos da seqüência primária de umpolipeptideo de IL-7 de referência, a fim de criar um sítiode glicosilação consensual típico.

Em uma modalidade específica, a presente invenção serefere a polipeptídeos de IL-7 contendo a seqüência de umpolipeptideo de IL-7 humano (ou de outro mamífero) com uma,ou várias, modificações de aminoácidos selecionadas entreLys28Asn - Ile30Ser - Ile30Thr - Ile30Asn - Ser32Thr -Leu35Ser - Leu35Thr - Glu38Ser - Glu38Thr - Phe39Ser -Phe39Thr - Phe42Ser - Phe42Thr - Glu52Ser - Glu52Thr -Val82Asn - Glu84Thr - Glu84Ser - Lys97Asn - Arg99Thr -Arg99Ser - Alal02Asn - Leul04Thr - Leul04Ser - Leul04Asn -Glul06Thr - Glul06Ser - Leul28Ser - Leul28Thr - Ilel45Asn -Metl47Thr - Metl47Ser - Metl47Asn - Thrl49Ser (ou deposições correspondentes em polipeptídeos de IL-7 de outrosmamíferos).

Exemplos específicos de polipeptídeos de IL-7 (humano)da presente invenção possuem as modificações nosaminoácidos mostradas na Tabela 1 abaixo.

TABELA 1

<table>table see original document page 30</column></row><table><table>table see original document page 31</column></row><table>

As modificações acima nos aminoácidos geram sítios deN-glicosilação sem alterar, substancialmente, a afinidadede ligação do IL-7 criando, assim, polipeptídeos de IL-7melhorados, de acordo com a presente invenção.

A expressão "sem alterar, substancialmente, aafinidade de ligação" significa que essa afinidade não éalterada, ou que ela pode ser reduzida sem que os efeitosin vivo resultantes da interação com o receptor soframimpacto. Quando quantificada in vitro, a afinidade deligação pode ser reduzida em menos de 50%, de preferênciaem menos de 40%, particularmente, em menos de 30%,especialmente, em menos de 20% e, preferencialmente, emmenos de 5%.

Além disso, as modificações acima podem ser combinadaspara criar diversos sítios adicionais de glicosilação em umpolipeptídeo de IL-7 da presente invenção. A esse respeito,a invenção se refere a qualquer polipeptídeo de IL-7biologicamente ativo, que contenha a seqüência primária deinterleucina-7 (humana ou de outro mamífero) modificadapela adição de, pelo menos, entre um e quatro sítios deglicosilação (N-Iigados). Outra modalidade preferida dapresente invenção é um polipeptídeo de IL-7 biologicamenteativo, contendo uma seqüência primária de interleucina-7,que possua um ou dois sítios de glicosilação (N-Iigados)adicionais.

Os polipeptídeos de IL-7 preferidos da presenteinvenção são biologicamente ativos, ou seja, são capazes dese ligar a um receptor de interleucina-7, apresentamatividade in vitro em um bio-ensaio específico e/ou possuemmaior tempo de residência médio (TRM) in vivo.

As atividades do padrão não-glicosilado e da IL-7hiperglicosilada foram comparadas por meio de um bio-ensaiodo tipo dose-resposta, no qual um valor de ED50 correspondea uma dose igual à metade da atividade máxima.A hiperglicosilação, geralmente, leva a uma atividademenor no bio-ensaio, o que não se traduz em menor atividadein vivo. Na verdade, na presente situação, o perfilcinético estendido aumenta a atividade in vivo.

A despeito da ED50 não refletir a atividade do IL-7 invivo, ela permite comparar diferentes amostras com o mesmonivel de glicosilação. Nesse estudo, valores típicos deED50 para o padrão não-glicosilado variaram entre 0,5 e2,Ong de IL-7/mL, enquanto os valores para o materialhiperglicosilado variaram entre 1,5 e 3,5ng de IL-7hiperglicosilada/mL.

Os polipeptídeos de IL-7 hiperglicosilada da presenteinvenção apresentam maior estabilidade, maior meia-vida emaior tempo de residência médio, in vivo, em hospedeirosmamíferos. Os termos "maior estabilidade", "maior meia-vida" e "maior tempo de residência médio" devem serentendidos em comparação com as formas não-glicosiladas.Preferencialmente, o aumento na meia-vida é de, pelo menos,3x, especialmente, pelo menos, entre 5 e 20x. 0 tempo deresidência médio (TRM) indica a média do tempo deresidência de cada molécula de IL-7 no sangue dospacientes, após a dose inicial. De preferência, o aumentono TRM deve ser de, pelo menos, cerca de 2x ou, maisparticularmente, de pelo menos, cerca de 4 a IOx, emcomparação com o TRM das formas não-glicosiladas.Por exemplo, a meia-vida plasmática da formahiperglicosilada ficou entre 30 e 40 horas, enquanto a daforma não-glicosilada é, geralmente, de 5 a 8 horas (quandoas duas formas são administradas nas mesmas condições, ouseja, uma injeção subcutânea).0 tempo de residência médio(TRM) ficou em torno de 40 horas, contra cerca de 10 horaspara a forma não-glicosilada.

Deve ser entendido que esta invenção engloba tambémqualquer fragmento distintivo de um polipeptideo de IL-7 dapresente invenção, ou seja, qualquer fragmento que contenhauma das modificações de aminoácidos mostradas acima, bemcomo qualquer fragmento contendo um sitio de glicosilaçãocriado artificialmente, como mostrado acima. Taisfragmentos contêm, tipicamente, pelo menos cinco resíduosde aminoácidos - geralmente, pelo menos, 8, 9, 10, 11, 12ou 15 resíduos -, e podem conter até 20, 30, 40, 50 ou maisresíduos de aminoácidos consecutivos. Esses fragmentospodem ser usados como antagonistas ou como imunogenes, paragerar anticorpos específicos.

Embora as posições dos aminoácidos dadas acima serefiram à seqüência de polipeptideo de IL-7 humano, deve-seentender que a presente invenção engloba tambémpolipeptídeos com seqüências primárias de IL-7 de outrosmamíferos, modificadas por mutações homólogas em seqüênciasde mamíferos, baseadas em alinhamento de seqüências contraa seqüência humana.Uma modalidade preferida da presente invenção serefere a novos polipeptídeos de IL-7 biologicamente ativoscontendo uma, ou várias, modificações nos aminoácidos,selecionados do grupo de Phe39Ser - Phe39Thr- Phe42Ser -Phe42Thr - Leul04Asn - Glul06Thr - Glul06Ser - Leul28Ser -Leul28Thr - Metl47Asn, uma combinação deles e/ou umfragmento distintivo deles.

Os polipeptídeos de IL-7 modificados preferidos napresente invenção são apresentados na Tabela 2.

TABELA 2

<table>table see original document page 35</column></row><table>Outro objeto particular da presente invenção é umpeptideo de IL-7 hiperglicosilada contendo uma seqüênciaprimária de aminoácidos como apresentada acima.

A estrutura e o número de unidades de oligossacarideoligadas a um certo sitio de glicosilação em um polipeptideode IL-7 hiperglicosilada da presente invenção podem variar.Podem ser, por exemplo, N-acetilglicosamina, N-acetilgalactosamina, manose, galactose, glicose, fucose,xilose, ácido glicurônico, ácido idurônico e/ou ácidossiálicos.

Preferencialmente, polipeptideos de IL-7hiperglicosilada contêm (ou são enriquecidos em) cadeias decarboidratos ligadas a N- e/ou a O-, selecionadas de:

a) uma cadeia de açúcares típica de mamíferos,preferencialmente do tipo expresso por célulasCHO ;

b) uma cadeia de açúcares contendo uma cadeiacomplexa de N-carboidrato (por exemplo, umaestrutura biantenária ou triantenária),preferencialmente contendo muitas moléculas demanose e acetilglicosamina, bem como muitosresíduos terminais de ácido siálico;c) uma cadeia de açúcar contendo uma cadeia de 0-carboidrato sem, e preferencialmente com, umresíduo terminal de ácido siálico;

d) uma cadeia de açúcar sialilada por alfa-2,6-sialiltransferase ou alfa-2,3-sialitransferase;e/ou

e) uma cadeia de açúcar sialilada apresentando entre3 e 30 sialil-N-acetilgalactosamina,preferencialmente, entre 7 e 23.

Cadeias de carboidratos particularmente preferidascompreendem estruturas triantenárias ou biantenárias comsialilação terminal completa ou parcial. Outras cadeias decarboidratos preferidas compreendem estruturastriantenárias e tri- ou di-sialilação, e/ou uma estruturadiantenária com di-sialilação Exemplos desses carboidratossão apresentados na Tabela 4, incluindo os motivos denúmeros 2420, 2623, 2785 e 3092.

De acordo com outra modalidade específica, opolipeptídeo de interleucina-7 hiperglicosilada da presenteinvenção possui ponto isoelétrico médio menor que 6,5 epeso molecular aparente médio, superior a 27kDa, entre28kDa e 65kDa (teórico para um índice de 7N + 10glicosilações), especialmente entre 28kDa e 35kDa (comomostrado para um índice de 3N + 10 glicosilações) ,determinado por eletroforese em gel (confirmado por Westerblot), que pode ser modificado para 25kDa na análise porespectrometria de massas.

Em uma modalidade especifica, o polipeptideo de IL-7hiperglicosilada da presente invenção é produzido por ummutante de glicosilação de mamífero, que expressa, de modoestável, alfa-2,6-sialiltransferase e apresenta um déficitna atividade da CMP-Neu5Ac hidrolase, preferencialmente, ummutante de gli cosilação CHO. Essas glicosilações incluem,tipicamente, N-acetilglicosamina, N-acetilgalactosamina,manose, galactose, glicose, fucose, xilose, ácidoglicurônico, ácido idurônico e/ou ácidos siálicos.

Em outra modalidade, o polipeptideo de IL-7hiperglicosilada é produzido por tecnologia recombinante emuma célula hospedeira humana, que pode ser selecionada delinhagens celulares estromais ou epiteliais humanas, HEK-293 (rim embrionário humano), HER (retina embrionáriahumana), HEK (queratinócitos epidermais humanos), linhagenscelulares do timo ou do córtex-epitelial humanos, medulaóssea humana ou linhagens celulares estromais de medulaóssea humana.

Os polipeptídeos de interleucina-7 hiperglicosilada dapresente invenção apresentam as seguintes características:

a) possuem perfil de secreção e taxa de produçãomelhoradas em linhagens celulares produtivasrecombinadas; e/oub) possuem alto grau de resíduos de ácido siálicopor polipeptideo de IL-7, levando à diminuição doponto isoelétrico e maior tempo de residênciamédio; e/ou

c) são protegidos por agregação intermolecular; e/ou

d) são menos suscetíveis à proteólise; e/ou

e) contêm sítios antigênicos mascarados, refletindomenor tendência imunogênica, reduzidavulnerabilidade à captura APC (célulasapresentadoras de antígenos), processamento eapresentação através de uma molécula NHC II; e/ou

f) têm maior estabilidade química; e/ou

g) têm meia-vida biológica estendida in vivo(isoforma de IL-7 de ação prolongada) , emcomparação com o peptídeo original, não-glicosilado; e/ou

h) têm maior atividade farmacológica in vivo,comparada com a da proteína original não-glicosilada, principalmente devido ao melhortempo de residência médio (TRM); e/oui) permitem esquema de doses menos freqüentes:reduzindo de três a quatro vezes para uma ou duaspor semana ou, para produtos de ação prolongada,uma vez a cada quinzena; e/ou

j) apresentam melhor perfil farmacocinético (menorpico de concentração e melhor tempo de residênciamédio) e/ou

k) apresentam peso molecular médio acima de 25kDa(como determinado por espectrometria de massas),ou 27kDa (como determinado por SDS-PAGE), e pontoisoelétrico médio menor que 6,5.

Os polipeptideos da presente invenção podem seapresentar sob a forma monomérica, ou associados, oucomplexados com um dado composto de escolha. A esserespeito, em uma modalidade especifica da presenteinvenção, o confôrmero de IL-7 está associado ao fator decrescimento de hepatócitos (HGF), sob a forma deheterodimero. Este pode ser obtido quimicamente porcomplexação, ou por tecnologia de recombinação (ou seja,fusão genética).

Em outra modalidade especifica da presente invenção, opolipeptideo de IL-7 está ligado, funcionalmente, à porçãoFc de uma cadeia pesada de um IgG, tipicamente através daregião flexível de um peptídeo. Essas moléculas de fusãotêm, potencialmente, estabilidade e meia-vida maiores, invivo. O resíduo de IgG é, preferencialmente, um IgGl ouIgG4 humano.

Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de IL-7está funcionalmente associado à albumina sérica humana(HSA) ou a uma porção dela, sob a forma de proteína defusão. Essas moléculas de fusão têm, potencialmente, maiorestabilidade e meia-vida prolongada, in vivo.

Outro objeto da presente invenção é uma composiçãocontendo IL-7 hiperglicosilada com preferencialmente, pelomenos 80%, especialmente entre 80 e 95% de polipeptídeos deIL-7 glicosilados em, pelo menos três resíduos deaminoácidos distintos; estes podem ser aminoácidosnaturalmente presentes na seqüência de polipeptídeo de IL-7(por exemplo, sít ios consensuais de N— e O—ligação decarboidrato) e/ou serem sítios de glicosilaçãoartificialmente criados, como discutido acima.

De acordo com modalidades específicas, a presenteinvenção se refere a composições de IL-7 hiperglicosiladacontendo:

a) como componente principal (> 80%, especialmentemais de 90%, preferencialmente mais de 95%)interleucina-7 glicosilada nos três sítiosconsensuais de N-ligação de carboidratos (Asn70/91/116) e com, ou sem, mais um glicosídeo nosítio de O-ligação de carboidrato (Thr 110) . Depreferência, a composição terá como componenteminoritário (<20%, preferencialmente menos de10%) interleucina-7 glicosilada apenas nos doissítios consensuais de N-ligação de carboidratos(associados, ou não, a um sítio de O-glicosilação) e/ou será essencialmente livre deproteína mono- ou não-glicosilada; ou

como componente principal (> 80%, especialmentemais de 90%, preferencialmente mais de 95%) umanálogo da interleucina-7 biologicamente ativo,contendo a seqüência primária de aminoácidos daIL-7 modificada a fim de introduzir um sítio deglicosilação adicional, glicosilado nos quatrosítios de N-ligação de carboidratos e, ainda,glicosilado ou não em um sítio de O-ligação decarboidrato (Thr 110). Essa composição contém, depreferência, um teor menor do mesmo análogo(<20%, preferencialmente menos de 10%)glicosilado apenas em três ou dois sítios de N-ligação de carboidratos (associados ou não a umsítio de carboidrato O-ligado) e/ou

essencialmente livre de proteína mono- ou não-glicosilada; ou

como componente principal (> 80%, especialmentemais de 90%, preferencialmente mais de 95%) de umanálogo da interleucina-7 biologicamente ativo,contendo a seqüência primária de aminoácidos daIL-7 modificada a fim de introduzir dois sitiosde glicosilação adicionais, glicosilados noscinco sitios de N-ligação de carboidratos e,ainda, glicosilados ou não em um sitio de O-ligação de carboidrato (Thr 110). Essa composiçãocontém, de preferência, um teor menor do mesmoanálogo (<20%, preferencialmente menos de 10%)glicosilado apenas em quatro, três ou dois sitiosde N-ligação de carboidratos (associados ou não aum sitio de carboidrato 0-ligado) e/ouessencialmente livre de proteína mono- ou não-glicosilada; ou

como componente principal (> 80%, especialmentemais de 90%, preferencialmente mais de 95%) de umanálogo da interleucina-7 biologicamente ativo,contendo a seqüência primária de aminoácidos daIL-7 modificada a fim de introduzir três sítiosde glicosilação adicionais, glicosilados nos seissítios de N-ligação de carboidratos e, ainda,glicosilados ou não em um sítio de 0-ligação decarboidrato (Thr 110). Essa composição contém, depreferência, um teor menor do mesmo análogo(<20%, preferencialmente menos de 10%)glicosilado apenas em cinco, quatro, três ou doissítios de N-ligação de carboidratos (associadosou não a um sítio de carboidrato 0-ligado) e/ouessencialmente livre de proteína mono- ou não-glicosilada; oue) como componente principal (> 80%, especialmentemais de 90%, preferencialmente mais de 95%) de umanálogo da interleucina-7 biologicamente ativo,contendo a seqüência primária de aminoácidos daIL-7 modificada a fim de introduzir quatro sítiosde glicosilação adicionais, glicosilados nos setesítios de N-ligação de carboidratos e, ainda,glicosilados ou não em um sítio de 0-ligação decarboidrato (Thr 110). Essa composição contém, depreferência, um teor menor do mesmo análogo(<20%, preferencialmente menos de 10%)glicosilado apenas em seis, cinco, quatro, trêsou dois sítios de N-ligação de carboidratos(associados ou não a um sítio de carboidrato O-ligado) e/ou essencialmente livre de proteínamono- ou não-glicosilada.

A presente invenção se refere também a composiçõesfarmacêuticas contendo as composições acima como princípiosativos.

Outro objeto da presente invenção consiste de umamolécula de ácido nucléico, que codifica um polipeptídeo deIL-7, como discutido acima. Essa molécula de ácido nucléicopode ser qualquer molécula de DNA ou RNA sendo,tipicamente, uma de cDNA.Um objeto específico dessa invenção é um ácidonucléico contendo resíduos nucleotídicos de 79 ao Final daSEQ ID NO: 2, seus fragmentos distintivos e sua fitacomplementar.

Outro objeto dessa invenção é um ácido nucléicocontendo SEQ ID NO: 4, bem como qualquer de seus fragmentosdistintivos, variantes (contendo, pelo menos 90% deidentidade com SEQ ID NO: 4) e suas fitas complementares.

Outro objeto dessa invenção é um ácido nucléicocontendo SEQ ID NO: 6, bem como qualquer de seus fragmentosdistintivos, variantes (contendo, pelo menos 90% deidentidade com SEQ ID NO: 6) e suas fitas complementares.

Um objeto específico dessa invenção é um ácido nucléicocontendo resíduos nucleotídicos de 79 ao Fim da SEQ ID NO:6, bem como suas variantes (contendo, pelo menos 90% deidentidade com SEQ ID NO: 6) e suas fitas complementares. Ainvenção também compreende um polipeptídeo, que codificaessas seqüências (por exemplo, SEQ ID NO:7).

O termo "variante", como usado acima em relação aoácido nucléico designa, mais especificamente, uma seqüênciade nucleotídeos que se hibridiza à seqüência de referência,sob condições rigorosas e/ou codifica um polipeptídeo quepossui o mesmo tipo de atividade do polipeptídeo codificadopela seqüência de referência. As variantes preferidas têm,pelo menos, entre 92 e 99% (por exemplo, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade com a seqüência dereferência.

Outro objeto especifico da presente invenção é umácido nucléico contendo a seguinte seqüência:

CTG AAT AAC GAA ACT AAC SEQ ID NO:8

AAC TTC ACT AAG SEQ ID NO:9

GCC AAC GGT ACC SEQ ID NO:10

CTG AAC GAC AGC TGT SEQ ID NO:11, ou

ATC TTG AAC GGG SEQ ID NO: 12, ou uma combinaçãodelas.

Exemplos específicos de ácidos nucléicos da presenteinvenção incluem as seqüências de nucleotídeos de quaisquerdas SEQ ID NOs: 8 a 12.

Outro objeto da presente invenção consiste em um vetorde clonagem e/ou de expressão, que contém uma molécula deácido nucléico, como definida acima. Esse vetor pode serqualquer um, procarionte ou eucarionte sendo, tipicamente,um vetor eucarionte. Ele pode ser selecionado a partir deum plasmídeo, de um cosmídeo, de um vetor viral, de umcromossomo artificial, etc., e conter qualquer seqüênciaregulatória, que permita a expressão adequada do ácidonucléico codificado em uma célula hospedeira selecionada;por exemplo, um promotor, um terminador, um poli A, umaorigem de replicação, uma região de integração (porexemplo, região homóloga), um intron, seqüências UTR, umgene marcador, etc.

Um objeto especifico da presente invenção é um vetorde expressão, contendo uma molécula de ácido nucléico comodefinida acima, incluindo um peptideo-sinal ligadooperacionalmente a elementos reguladores, permitindo aexpressão desse ácido nucléico em mamíferos hospedeiros ouem células hospedeiras.

Elementos reguladores preferidos incluem um promotor,o qual pode ser selecionado entre promotores virais,celulares e sintéticos, incluindo os constitutivos, ostecido-especificos e os regulados, especialmente entre osdo grupo que consiste em um promotor CMV, um ElFa e ummetalotioneina, sem se limitar a estes. Outros elementosreguladores, que podem estar contidos nos vetores dapresente invenção incluem, sem se limitar a estes, um geneBcl-2, seqüências UTR e seqüências MAR.

Em uma modalidade da presente invenção, o vetor é deexpressão epissômica.

Os ácidos nucléicos e vetores acima podem ser usados,por exemplo, para produzir polipeptídeos de IL-7recombinantes de mamíferos em diversos hospedeiros oucélulas hospedeiras competentes, bem como para fins deterapia genética.Outro objeto da presente invenção consiste em umacélula hospedeira recombinante contendo um ácido nucléicoou um vetor como apresentados acima. Essa célularecombinante pode ser procariótica ou, preferencialmente,eucariótica como, por exemplo, célula de levedura, deinseto, de planta ou de mamífero.

Em uma modalidade preferida da prsente invenção, acélula hospedeira é de mamífero, selecionada depreferência, entre células de PERC6, NSO e BHK,especialmente, CHO, ou de linhagem celular humana. Osvetores, construtos e células recombinantes serãoapresentados em mais detalhes em uma seção subsequentedeste documento, mas não se limitam aos apresentados.

Outro objeto da presente invenção consiste em umadroga, que contém como produto-alvo, um polipeptídeo de IL-7 como descrito acima sendo, tipicamente, um polipeptídeode IL-7 hiperglicosilada. Preferencialmente, a droga contémmenos de 10% de polipeptídeo de IL-7 mono-glicosilado ounão-glicosilado e/ou é, essencialmente, livre de impurezasrelacionadas aos produtos.

A presente invenção também se refere ao uso de umadroga como a descrita acima para fabricação de ummedicamento (produto da droga) ou de uma composiçãofarmacêutica.Uma droga deve ainda, de preferência, sersubstancialmente livre de impurezas relacionadas com oprocesso.

No contexto da presente aplicação, o termo "droga" serefere a um produto adequado para ser utilizado comoprincipio ativo de um medicamento. A "droga", de acordo coma presente invenção é um produto complexo por natureza, ouseja, em decorrência do seu método de produção (porexemplo, tecnologia de DNA recombinante).

A presente invenção mostra que, para produzir efeitoterapêutico e de enhancer de vacinas eficientes, uma drogaou composição farmacêutica de IL-7 deve conter como espéciemolecular principal, uma composição de polipeptideo de IL-7hiperglicosilada.

O termo "substancialmente livre", como usado nessedocumento, indica que a droga não contém quantidadessignificantes ou prejudiciais de impurezas relacionadas como produto ou com o processo. Mais especificamente, a drogadeve conter menos de 5%, especialmente menos de 3% e,preferencialmente, menos de 2% de impurezas relacionadas aoproduto ou ao processo. As drogas preferidas contêm menosde cerca de 1% de impurezas relacionadas ao produto eapenas traços de impurezas relacionadas ao processo.

A expressão "substâncias relacionadas com o produto deIL-7" designa variantes moleculares de IL-7, que incluem,por exemplo, peptídeos ativos ou inativos, ou fragmentospolipeptidicos de IL-7. Impurezas relacionadas com IL-7incluem, por exemplo, polipeptideos de IL-7 humano contendopontes mono- ou dissulfeto, IL-7 truncado, IL-7recombinante desaminado, IL-7 contendo proteínas diméricasou multiméricas, forma oxidada de metionina, ou umacombinação destas.

Seja qual for sua atividade biológica, essas variantesmoleculares e impurezas relacionadas a IL-7 devem serrigidamente minimizadas ou eliminadas da droga.

Impurezas relacionadas ao processo incluem DNA,endotoxinas, debris celular, vírus, etc.

Assim, uma droga preferida é aquela em que aquantidade total, em peso, de uma composição de IL-7hiperglicosilada contém, pelo menos, 95% em peso,particularmente pelo menos 98% em peso, especialmente pelomenos 99,5% em peso de uma composição de IL-7hiperglicosilada de acordo com a invenção.

A presente invenção também se refere a uma composiçãofarmacêutica contendo uma quantidade efetiva da droga ou dacomposição de IL-7 hiperglicosilada, como descritas acima,e um ou mais veículos, excipientes ou diluentesfarmaceuticamente compatíveis ou aceitáveis.A invenção mostra que composições farmacêuticascontendo uma composição de IL-7 hiperglicosilada comodescrita acima aumenta, claramente, as propriedades davacina de IL-7 e sua capacidade de estimular respostasimunes a antigenos específicos.

O veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamentecompatível ou fisiologicamente aceitável pode serselecionado entre soluções ou suspensões neutras oulevemente ácidas, isotônicas, tamponadas e,preferencialmente, entre sacarose, trealose e aminoácidos.

O veículo farmaceuticamente compatível deve,preferencialmente, estar em um tampão apropriado, de modo aformar uma solução isotônica. Um tampão apropriado deve,preferencialmente, ter uma faixa de pH entre 4,5 e 7,5,especialmente entre 5,0 e 7,0, particularmente.em torno de5,5 e ser, de preferência, um sal orgânico escolhido entretampão de citrato de sódio ou de acetato de amônio. Acomposição farmacêutica pode apresentar-se sob a forma desuspensão, solução, gel, pó, sólido, etc. A composiçãodeve, preferencialmente, ter a forma líquida.

A composição pode conter estabilizantes - comoaçúcares, aminoácidos e proteínas surfactantes, etc. Elapode, também, conter qualquer solução salina, incluindofosfatos, cloreto, etc.

Uma composição farmacêutica específica, de acordo coma presente invenção contém, além da droga ativa, umaproteína e/ou um surfactante. A presença de uma proteína,ou de qualquer outra molécula natural de alto pesomolecular, reduz a exposição da IL-7 ao sistema imue dohospedeiro evitando, assim, efeitos secundários. Depreferência, a proteína deve ser não-imunogênica, tal comoqualquer uma de origem humana. Um exemplo especialmentepreferido de proteína é a albumina sérica humana. 0surfactante pode ser selecionado entre os conhecidos, comoos polissorbatos, de preferência Tween20™ ou Tween80™. Umacomposição específica da presente invenção contém albuminasérica humana (de preferência entre 2 e 5mg/mL) oupolissorbato (Tween 20 or 80, tipicamente a 0,005%) ouqualquer outra substância, como um surfactante, ou umaminoácido (por exemplo, arginina, glutamato, ou misturados dois), ou um açúcar (por exemplo, sacarose, trealose,sorbitol) capaz de evitar a imunogenicidade de IL-7, devidaà agregação protéica e/ou persistência local da droga nolocal da injeção, após administração da composição.

A esse respeito, objetos particulares da presenteinvenção são composições farmacêuticas contendo umacomposição de interleucina-7 hiperglicosilada emconcentração entre lmg/mL e 50mg/mL, de preferência entrecerca de 3mg/mL e 20mg/mL. Preferencialmente, a quantidadeefetiva de interleucina-7 glicosilada a ser administradadeve estar compreendida entre 10 e 200 μg/kg/semana,particularmente entre cerca de 10 e 60 pg/kg/semana para,por exemplo, tratamento ou prevenção de doençasinfecciosas.Em vista das melhores propriedades dos polipeptideos ecomposições da presente invenção, as composiçõesfarmacêuticas precisam ser administradas com menosfreqüência que as composições ou produtos disponíveisanteriormente, em quantidade equivalente, para obtenção deefeitos terapêuticos comparáveis. Mais especificamente, emuma modalidade típica da presente invenção, as composiçõessão administradas três vezes por semana, duas vezes porsemana, uma vez por semana, uma vez em semanas alternadas,uma vez por mês, uma ou duas vezes antes da vacinação ouantes e após vacinação. Um regime de dose preferidoconsiste na administração da composição farmacêutica umavez a cada 7, 10 ou 14 dias.

As vias de administração preferidas são as parenteraisEntre elas, a preferida é a intratumoral, sendoparticularmente preferida a administração intravenosa ou asubcutânea, incluindo também injeções intra-arteriais,intraperitoniais ou intramusculares. Deve-se entender,contudo, que qualquer outra via de administração adequadapode ser usada, dependendo do estado de saúde e da reaçãodo paciente.

Em uma modalidade particular, a via de administração éa oral. Essa via é aceitável para a IL-7 hiperglicosiladadevido à excepcional estabilidade dessa proteína emcomparação com outros hormônios polipeptídicos. Ascomposições da presente invenção são apresentadas, então,na forma sólida (comprimido, pó ou cápsula), ou na formaliquida (como xarope ou emulsão), preparadas em um veiculoapropriado e farmaceuticamente aceitável. De preferência, oveiculo deve manter-se estável no trato gastro-intestinal eno sistema circulatório, além de possuir meia-vidaplasmática aceitável. Cápsulas resistentes ao sucogástrico, tais como aquelas contendo o polipeptideo de IL-7hiperglicosilada formulado como micro-emulsão ou emlipossoma são vantajosas.

A composição farmacêutica pode conter ingredientesativos adicionais, tais como agentes imunoestimulantes,preferencialmente selecionados entre um fator decrescimento de célula hematopoiética, uma citoquina, umamolécula antigênica (ou antigeno) e um adjuvante, para usocombinado, separado ou seqüencial.

Tais ingredientes ativos adicionais podem serformulados combinados com a IL-7, ou em separado, para usocombinado, separado ou seqüencial. Em uma primeiravariação, os ingredientes ativos são formulados juntos, nomesmo recipiente ou vaso. Em outra, preferida, eles sãoacondicionados separadamente, ou seja, em recipientes ouvasos separados. De acordo com essa modalidade, osingredientes podem ser administrados separadamente, porexemplo, simultânea ou seqüencialmente (ou seja, injetadosem lugares ou tempos diferentes), para produzir o efeitobiológico mais eficiente. Também, como dito acima,administrações repetidas de um ou dois ingredientes ativospodem ser feitas.

Com relação a isso, a invenção se refere a umacomposição farmacêutica contendo uma composição de IL-7hiperglicosilada como descrita acima e um ingrediente ativoselecionado entre um imunoestimulante e uma moléculaantigênica, para uso combinado, separado ou seqüencial. Depreferência, os adjuvantes devem ser preparadosseparadamente.

O fator de crescimento de células hematopoiéticas deveser selecionado, preferencialmente, entre Fator de Células-Tronco (SCF), particularmente de sua forma solúvel, G-CSF,GM-CSF, ligante Flt-3, IL-15 e IL-2. Exemplos típicos decitoquinas ou quimioquinas usadas como enhancer de vacinaincluem citoquinas indutoras e/ou estimuladoras de respostaimune do tipo Thl. A citoquina deve ser, preferencialmente,selecionada entre a.ou γ interferon, IL-2, IL-12, RANTES,B7-1, MIP-2 e MIP-Ia. Deve-se compreender que outrosfatores, como ativadores de células NK e/ou NKT, FGF7 ouFGFlO, interleucinas e/ou hormônios podem ser usados emcombinação com IL-7 para fornecer benefício terapêuticoadicional.

Uma composição específica da presente invenção contémuma composição de IL-7 hiperglicosilada como descrita acimae Fator de Célula-Tronco, particularmente sua formasolúvel, IL-15 e/ou ligante Flt-3 e/ou FGFlO.Outra composição específica dessa invenção contém umacomposição de IL-7 hiperglicosilada como descrita acima euma citoquina, selecionada entre α. ou γ interferon, IL-2,IL-12, RANTES e ΜΙΡ-Ια.

Outra composição específica dessa invenção contém umacomposição de IL-7 hiperglicosilada como descrita acima, umFator de Célula-Tronco e uma citoquina.

Como indicado acima, a composição farmacêutica podeconter, ainda, um ou mais antígenos (ou moléculasantigênicas), para uso combinado, separado ou seqüencial. Oantígeno pode ser qualquer peptídeo natural ou sintético,uma proteína recombinante, um produto de patógeno morto,inativado ou atenuado, um microorganismo, um parasita, umlipídeo, etc., uma porção e uma combinação deles. Oantígeno pode ser uma proteína integral, ou qualquerfragmento ou porção de proteína contendo epítopo,especialmente peptídeos presentes no sistema imune atravésde moléculas das classes MHC I ou II. Pode-se utilizarqualquer antígeno viral, bacteriano, parasitário, tumoral,etc. Exemplos específicos de antígenos incluem aquelesderivados de HIV, Varicella Zoster, Influenza, EpsteinBarr, Herpes Simplex tipo I ou II, citomegalovírus humano,vírus da dengue, da hepatite A, B, C, D ou E, vírusSyncytium respiratório, papilomavírus humano, mycobacteriumtuberculosis, Toxoplasma e Chlamydia.Um objeto particular da presente invenção se refere auma composição contendo uma composição de IL-7hiperglicosilada como descrita acima e uma moléculaantigênica, para uso combinado, separado ou seqüencial. Acomposição pode conter, ainda, um ou mais agentesimunoestimuladores como apresentado acima, para usocombinado, separado ou seqüencial.

Outro objeto particular da presente invenção se referea uma composição farmacêutica contendo uma composição deIL-7 hiperglicosilada como descrita acima, onde acomposição farmacêutica é administrada simultaneamente,poucos dias antes ou seqüencialmente com uma ou maismoléculas antigênicas, a fim de obter e/ou estimular umaresposta imunológica antigeno-especifica, no paciente.

Outro objeto particular da presente invenção se referea um método que provoque ou intensifique a respostaimunológica antigeno-especifica em pacientes. Método este,que consiste na administração desse antigeno (ou de umfragmento dele contendo epitopo) e uma composição de IL-7hiperglicosilada, como descrito acima. A composição podeser administrada simultaneamente, poucos dias antes ou emseqüência com o antigeno, preferencialmente antes dele, afim de obter ou estimular uma resposta imunológicaantigeno-especifica no paciente.

Em outra modalidade preferida, a composição dapresente invenção contém um adjuvante. Este pode serselecionado de qualquer substância, mistura, soluto oucomposição que facilite ou aumente a imunogenicidade doantigeno e consiga induzir uma resposta imune do tipo Thl,como CpG, QS21, ISCOM e monofosforil lipide A. Taisadjuvantes são especialmente adequados para produção e/ouamplificação de resposta imune antigeno-especifica, emmamíferos, de modo especial em seres humanos. 0 adjuvantedeve, preferencialmente, ser acondicionado e administradoseparadamente da composição que contém a IL-7 e/ou em umlocal de injeção diferente, de preferência junto com o(s)antigeno(s) desejado(s).

A presente invenção também se refere a uma composiçãofarmacêutica contendo uma quantidade efetiva de umacomposição de IL-7 humana hiperglicosilada, de acordo com apresente invenção, misturada com um diluente, excipiente ouveículo adequado para administração parenteral a pacienteshumanos, para estimulação profilática ou terapêutica dodesenvolvimento e proliferação de linfócitos B ou T, ouainda, para intensificação de uma resposta imune. Ascomposições farmacêuticas da presente invenção induzemestimulação prolongada da linfopoiese e/ou respostas imunesampliadas.

Uma composição farmacêutica de acordo com a presenteinvenção também pode ser utilizada em seres humanos, paraestimulação profilática ou terapêutica do desenvolvimento eproliferação de linfócitos B ou T, para incremento daimuno-reconstituição global e/ou especifica, ou ainda, paraaumento das respostas imunes humorais e/ou celulares.

Uma composição farmacêutica particular, de acordo coma presente invenção, tem aplicação na inibição ou reduçãode infecções oportunistas em pacientes imunodeficientes.

Outra composição farmacêutica particular, de acordocom a presente invenção, aplica-se no prolongamento daestimulação de linfopoiese e/ou na produção de respostaimune especifica, não somente contra epitopos dominantes,mas também contra os subdominantes ou epitopos menosimunogênicos, que possuem menor afinidade pelo receptor decélulas T; isso permite ampliar o repertório de respostasimuno-especificas em seres humanos.

A presente invenção é particularmente adequada paraproduzir uma resposta imune preventiva ou curativa, emindivíduos tais como os imunodeficientes, cancerosos,transplantados, infectados por vírus ou parasitas, idososou quaisquer outros pacientes com contagem reduzida de CD4,etc.

Usos específicos e preferidos dos polipeptídeos de IL-7 e composições dessa invenção incluem:

enhancer de vacina (administração da composiçãoantes, durante ou simultaneamente à administraçãodo antígeno) em quantidade efetiva para induzir oaumento da resposta imune especifica contracélulas malignas ou agentes infecciosos; e

para induzir imuno-reconstituição de pacientes,

independente da causa do problema advir de:

Infecção, radiação, transplante (BMT, SCT) oudrogas;

Os polipeptideos de IL-7 e composições da presenteinvenção podem ser usados isolados ou combinados com outrosingredientes ativos, tais como fatores Iinfopoiéticos,incluindo, mas não se limitando a, SCF, Flt3-L, α-IFN, γ-IFN, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-15, IL-18 e/ou IL-21.

Quando for usada a terapia combinada, os váriosingredientes podem ser administrados simultaneamente,separados ou em seqüência, e podem ser acondicionadosjuntos ou separados.

Os polipeptideos de IL-7 e composições da presenteinvenção podem ser usados em várias áreas, incluindointensificação de vacina em saúde animal, e para diminuir onúmero de administrações da substância ativa.

A presente invenção fornece, ainda, um método paratratamento de infecções virais, tais como infecção por HIV,hepatite viral, febre do Nilo ocidental e dengue, queconsiste na administração da composição do polipeptideo deIL-7 hiperglicosilada ao paciente infectado.Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de IL-7hiperglicosilada deve ser administrado em associação comuma molécula de interferon, que pode ser, por exemplo, IFN-alfa (IFN leucócito), IFN-beta (IFN fibroblasto), IFN-gama(IFN imune) IFN-ômega ou IFN-tau (fator trofoblástico).

A invenção se refere, ainda, a um método para melhoriada recuperação timopoiética em indivíduos com o sistemaimune comprometido; método esse, que consiste naadministração ao paciente, da composição do polipeptídeo deIL-7 hiperglicosilada.

De preferência, o polipeptídeo de IL-7hiperglicosilada deve, então, ser administrado emassociação com um fator de crescimento de queratinócito, umfator de célula-tronco, um antagonista da gonadoestimulinaou com um hormônio de crescimento.

0 polipeptídeo de IL-7 hiperglicosilada também podeser utilizado em um método para imunização terapêuticacontra células malignas, vírus ou bactérias, em que opolipeptídeo de IL-7 hiperglicosilada deve ser administradoassociado a um antígeno, ou mistura de antígenos como, porexemplo, os descritos acima. Nessa situação, o polipeptídeode IL-7 hiperglicosilada pode ser administrado emassociação com GM-CSF.

Outro objeto da presente invenção é um método paraestimular a expansão de células T, ex-vivo, caracterizadopor colocar essas células em contato com um polipeptídeo deIL-7 hiperglicosilada ou uma composição dele promovendo,assim, a expansão das células. Esse método éparticularmente útil no preparo de células T adequadas paratratamento de pacientes com câncer ou infecção viral, viaimunoterapia adotiva. Essa imunoterapia é uma metodologiaex vivo para expansão seletiva de células T especificasvisando antigenos específicos (malignos ou virais). Taltécnica imunoterapêutica inclui, geralmente, o isolamentode linfócitos T Ag-especificos do sangue do paciente,expansão ex vivo dessas células T com o emprego dospolipeptídeos de IL-7, ativação opcional, ex vivo, dessascélulas por outras citoquinas, e administração ao paciente.

Outras técnicas são possíveis. Os polipeptídeos de IL-7melhoram a sobrevivências dessas populações de células Tque, posteriormente, apresentam maior atividade citotóxica.

Outro aspecto da presente invenção se refere àdisponibilização de construtos e métodos adequados àprodução das composições citadas acima, especialmente dospolipeptídeos de IL-7 hiperglicosilada, suas composições eprodutos, em quantidade suficiente e qualidade adequada aouso farmacêutico.

Em particular, como discutido acima, a presenteinvenção fornece vetores e células hospedeirasrecombinantes, que podem ser usadas na produção dospolipeptídeos de IL-7 recombinante humano dessa invenção,em diversas células hospedeiras competentes, bem como parafins de terapia genética.

O vetor pode ser um plasmideo, um virus, um fago, umcosmideo, um epissomo, etc. Vetores preferenciais são osvirais (por exemplo, adenovirus recombinantes) e osplasmídeos, que podem ser produzidos a partir de estruturasdisponíveis comercialmente, como pBR, pcDNA, pUC, pET,pVITRO, etc. O vetor contém, tipicamente, elementosreguladores ou seqüências capazes de controlar ou mediar aexpressão de um polipeptídeo de IL-7. As seqüênciasreguladoras podem ser escolhidas entre promotores,estimuladores, silenciadores, sinais específicos detecidos, peptídeos-sinais, introns, terminadores,seqüências poli A, regiões GC, etc., ou combinação deles.

Tais elementos ou seqüências reguladores podem serderivados de genes de mamíferos, fungos, plantas,bactérias, leveduras, bacteriófagos ou vírus; ou, ainda, defontes artificiais. Promotores úteis para expressão deprocariontes (como E. coli) incluem, por exemplo, a T7 RNApolimerase (pT7), TAC (pTAC), Trp, Lac, Ter e PhoA.

Promotores adequados à expressão em células de mamíferosincluem os promotores virais (por exemplo, CMV, LTR, RSV,SV40, TK, pCAG, etc.), os de genes domésticos (por exemplo,ElfD, beta-actina de frango, ubiquitina, INSMl, etc.), oshíbridos (por exemplo, actina/globina, etc.), etc. Um vetorpode conter mais de um promotor, o qual pode ser indutívelou regulado. Por exemplo, o uso de promotores indutíveis ouregulados permite um controle melhor da produção, pelo fatode dissociar as fases de cultura e produção. Promotoresindutiveis ou regulados podem ser encontrados naliteratura. São exemplos, os sistemas Tetraciclina, Switch-Gene, Ecdisona, Estradiol, RU485, Cumato, o promotormetalotioneina, etc. Outros sistemas, como os de ultra-somfocalizado, expressão induzida de AIR e assemelhadosbaseiam-se em correntes elétricas ou microondas. Essessistemas podem ser usados para controlar a expressão de umpolipeptideo de IL-7 de acordo com a presente invenção.

A IL-7 pode ser co-expressada com um fator anti-apoptótico (por exemplo, iex, Bcl2, BclXL, etc.) ou ciclina(por exemplo, p21, p27, etc.) . Os c-DNAs que codificamesses IL-7 e fatores anti-apoptóticos podem serposicionados na parte inferior do mesmo promotor, masseparados por uma seqüência IRES, ou cada um em seupromotor.

O vetor pode conter, ainda, uma origem de replicaçãoe/ou gene marcador, os quais podem ser selecionados dasseqüências convencionais. Um marcador de amplificação deseleção, como o gene DHFR, pode ser inserido na estruturado vetor. Este pode conter, ainda, várias combinaçõesdesses diversos elementos, os quais podem ser organizadosde diferentes modos.

A presente invenção se refere também a célulashospedeiras recombinantes contendo um ácido nucléico ou umvetor, como descrito acima. A célula hospedeira pode serescolhida entre quaisquer células eucarionte e procarionte,tipicamente de uma célula de mamíferos (particularmente, deseres humanos, roedores ou caninos), de bactéria (emespecial, de E. coli, Bacillus Brevis, Bacillus Subtilis) ,de levedura, de planta e de inseto. Essas célulashospedeiras podem ser adaptadas para meio sem soro. Aprodução pode ser feita também em um animal ou plantatransgênicos.

As células hospedeiras recombinantes preferidas sãoselecionadas de células de mamíferos, em especial, decélulas humanas, bem como de derivados ou mutantes delas.

Exemplos específicos de células hospedeiras adequadasincluem células de ovário de hamster chinês (CHO), de rimde hamsters recém-nascidos (BHK), de rim de embrião humano(HEK-293), de queratinócitos de epiderme humana (HEK), deepitélio ou estroma humanos, PERC6, etc. Nessas células demamíferos, a IL-7 pode ser produzida sob a forma deproteína secretada, usando seqüências funcionais depeptídeos-sinais.

Um objeto específico da presente invenção é uma célulahospedeira eucarionte contendo uma molécula de ácidonucléico com a SEQ ID NO: 2, 4 ou 6.

Outro objeto da presente invenção se refere aanticorpos imunoreativos com uma composição ou polipeptídeode IL-7, como descrito anteriormente. Esses anticorpospodem ser produzidos por métodos convencionais, inclusiveimunização de animais e coleta do soro (policlonal) oupreparação de hibridomas de células do baço (monoclonal)Fragmentos (por exemplo, Fab' ) ou derivados de anticorposobtidos por bioengenharia (por exemplo, ScFv or diabodiesou minibodies) podem ser produzidos pelos métodos químicose biológicos conhecidos. Anticorpos preferidos sãoespecificamente imunoreativos com um polipeptídeo de IL-7hiperglicosilada, como já descrito, ou seja, podem ligar-seao polipeptídeo de IL-7 hiperglicosilada sem ligar-se,substancialmente, a polipeptídeos mono- ou não-glicosilados. Embora se possa observar ligações não-específicas ou menos efetivas a esses outros antígenos,tais ligações podem ser distinguidas daquela específicafeita com polipeptídeos de IL-7 hiperglicosilados dapresente invenção.

O anticorpo deve, preferencialmente, ser de origemsímia, murínica ou humana ou, então, ter sido humanizado.

A invenção se refere também a uma linhagem celular dehibridoma, que produz um anticorpo monoclonal como descritoacima.

Esses anticorpos são úteis para detectar polipeptídeosde IL-7 hiperglicosilada ou para neutralizar a atividadebiológica da IL-7 em ensaios ou experimentos, que envolvamlinfoquinas múltiplas. Uma composição adequada paradiagnóstico, análise ou terapia com esses anticorposmonoclonais também é objeto da presente invenção.

Outro objeto da presente invenção se refere aprocessos, que podem ser utilizados em escala industrial,para produção de um polipeptideo de IL-7 hiperglicosilada,substancialmente puro, com grau farmacêutico, como descritoacima. O processo leva a alto rendimento do confôrmero deIL-7 recombinante adequado ao uso terapêutico. A invençãofornece também, novos métodos de controle das composiçõescontendo IL-7, de modo a determinar a presença de umaquantidade de polipeptideo de IL-7 hiperglicosilada, comodescrito acima.

Em particular, o método para produção de polipeptideosde IL-7 hiperglicosilada ou suas composições, como definidoacima compreende:

a) cultivo de uma célula hospedeira recombinantecomo descrito acima; e

b) isolamento do polipeptideo de IL-7 produzido poressas células.

A amostra pode ser submetida a diversos tratamentos,ou condições, a fim de aumentar a pureza da IL-7, removerdebris celular ou partículas virais, etc. Exemplos típicosdesses tratamentos incluem centrifugação, clarificação e/oudia-, ultra-, e nanofiltração. A amostra pode, assim, serenriquecida no polipeptideo de IL-7.

A fim de aumentar o rendimento ou a eficiência dométodo, é altamente desejável produzir uma amostra rica empolipeptideos de IL-7 glicosilados e com folding correto.

O polipeptideo de IL-7 hiperglicosilada pode serpurificado por diversas técnicas já conhecidas, mas queainda não foram usadas na combinação aqui apresentada paraproduzir um polipeptideo de IL-7 hiperglicosilada. Essastécnicas são, de preferência, escolhidas entrecromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia detroca-iônica, cromatografia por afinidade e cromatografiade filtração em gel, sozinhas ou em combinações diversas.

Esses métodos permitem a remoção do DNA da célulahospedeira e de outras impurezas, que diminuiriam arecuperação do material de interesse. Em uma modalidadepreferida, a etapa ii) é o uso de cromatografia deinteração hidrofóbica. Essa técnica cromatográfica pode serrealizada utilizando-se vários suportes e formatos, depreferência usando HlC-butila. A etapa ii) pode serdesenvolvida sobre qualquer suporte, de preferência embatelada, ou em coluna utilizando um gel apropriado.

Em uma modalidade preferida, a etapa de purificação écaracterizada pela passagem da amostra através de umacoluna empacotada com um gel especifico (Sephadex, porexemplo).Em outra modalidade, a etapa de purificação compreendeuma etapa de "polimento", que envolve a passagem da amostraatravés de uma coluna empacotada com um gel especifico(fonte 15S), a fim de concentrar a proteína de interesse eeliminar possíveis resíduos de contaminantes protéicos.

Em outra modalidade, a etapa de purificação consisteem passar a amostra através de uma coluna empacotada com umgel específico, que contenha um anticorpo monoclonal anti-IL7 imobilizado em resina (por exemplo, sulfato de dextranaou heparina).

Esses métodos permitem uma produção eficiente ereprodutível do polipeptídeo de IL-7 hiperglicosiladasubstancialmente puro, como descrito acima. Os métodos sãoparticularmente vantajosos, já que a IL-7 recombinante podeser obtida com pureza de, pelo menos, 95% em peso,especialmente pelo menos, 98% em peso e, particularmentepelo menos, 99% ou até mesmo 99,5% em peso em relação àquantidade total de IL-7.

Cada etapa do processo acima descrito pode sercontrolada por métodos analíticos, inclusive análise porSDS-PAGE. A estrutura primária da IL-7 otimizada pode sercontrolada e caracterizada determinando-se a seqüência degenes e/ou de aminoácidos, pela análise do mapa depeptídeos, após digestão trípsica; pela determinação dopeso molecular usando SDS-PAGE; por HPLC de exclusão detamanho de partículas; por espectrometria de massas com atécnica MALDI-TOF ou eletrospray, ou outra semelhante; pordeterminação da hidrofobicidade usando, por exemplo, HPLCde fase reversa, e/ou determinando-se a carga elétrica pormeio de HPLC de troca catiônica ou iso-eletrofocalização,por exemplo.

Outra modalidade da presente invenção se refere amétodos de produção de IL-7, como descritos acima, onde aexpressão dessa interleucina por células hospedeirasrecombinantes é indutível, regulada ou transiente, de modoque as fases de cultura celular e expressão de IL-7 podemser dissociadas. Especialmente, em outra modalidade, aexpressão de IL-7 pode ser reprimida ou reduzida durante ocrescimento, expansão e/ou cultura da célula recombinante,a fim de permitir a produção em grandes quantidades, dessascélulas, sem qualquer efeito tóxico potencial mediado pelaIL-7. Assim, a expressão dessa interleucina pode serinduzida na cultura celular (ou em uma amostra dela),permitindo a síntese e liberação eficientes de IL-7recombinante.

Um objeto da presente invenção reside, assim, também,em um método de produção de um polipeptídeo de IL-7recombinante, que consiste no cultivo de célulashospedeiras recombinantes como apresentado acima - contendouma molécula de ácido nucléico, que codifica o ditopolipeptídeo de IL-7-, e na recuperação desse polipeptídeorecombinante produzido, onde a citada molécula de ácidonucléico fornece uma expressão regulada ou induzida dopolipeptideo de IL-7, de modo que a expressão dessepolipeptideo possa ser reprimida ou reduzida durante ocrescimento da célula recombinante e induzida durante afase de produção. O ácido nucléico, tipicamente, contém umpromotor indutivel, que pode ser reprimido ou ativado napresença, ou ausência, de um agente especifico contido, ouadicionado, no meio de cultura. O método é particularmenteadequado para a produção de um confôrmero de IL-7hiperglicosilada como mostrado acima.

Vários sistemas de expressão regulada ou indutivel jáforam disponibilizados, os quais funcionam em célulashospedeiras de mamíferos, e que podem ser usados napresente invenção. Esses incluem os sistemas TetraciclinaTet-On/Off, Switch-Gene (Invitrogen) com Mifepristona comoagente indutor e promotor GAL4-Elb, ecdisona (indução componasterona A ou muristerona A, análogos de hormôniosesteroidais de insetos) (Invitrogen) , promotormetalotioneína (indutivel por zinco), estradiol, RU486,ultra-som focalizado, sistema de expressão induzida AIR(regulação indutivel por acetaldeído), cumato (Q-mate;Qbiogen), Cre-Lox, etc. Esses sistemas de expressãoregulada ou indutivel podem ser utilizados em diversascélulas como, por exemplo, as linhagens celulares HEK293,HEK293 EBNA, HEK, T-REX™-293, T-REX™-HeLa, T-REXtm-CHO ouT-REX™-Jurkat, transformadas com um vetor recombinanteadequado para expressar IL-7 recombinante após a indução.Alternativamente, a transfecção transiente pode serusada para dissociar a expansão celular da produção de IL-7. A esse propósito, vetores eficientes de liberação degenes são usados para introduzir a seqüência codificadorade IL-7 nas células após a expansão delas. De preferência,o sistema vetor para a transfecção transiente é um vetorviral, como um adenovirus recombinante ou um vetorepissomal - por exemplo, pCEPH (Invitrogen), pTT (IRB:Durocher Y. et al. , Nucl. Acids. Res. 2002, 30(2)), ou queutilize seqüências MAR. Adenovirus (e outros vetores viraiscomo, por exemplo, AAVs) podem ser produzidos por técnicasdisponíveis, já conhecidas. Tipicamente, adenovirus El-deficientes são produzidos em uma linhagem celular El-complementadora, como HEK293, PERC6, etc. Esses processosde transfecção transiente podem ser implementados emdiversas células cultivadas de mamíferos, como por exemploas células transformadas A54 9-, HeLa-, VERO-, BHK- ou CHO-(como mostrado no exemplo A4) . Um método alternativo eadequado para uso na presente invenção está apresentado,por exemplo, no artigo Durocher Y. et al., Nucl. Acids.Res. 2002, 30(2) em células HEK293 EBNA ou HEK293.

Em uma modalidade da presente invenção, os métodos deprodução possuem uma etapa adicional, etapa c) , decaracterização e quantificação do polipeptídeo de IL-7hiperglicosilada, como descrito acima, no produtoresultante. A caracterização física e biológica dopolipeptídeo de IL-7 hiperglicosilada desejado pode serfeita por espectrometria de massas (MALDI-TOF oueletrospray), espectroscopia no infra-vermelho, ressonânciamagnética nuclear (RMN), por dicroismo circular, poranálise da atividade biológica da IL-7 em um bio-ensaioespecifico, por medidas de afinidade frente a um anticorpomonoclonal especifico desenvolvido contra o ditopolipeptideo de IL-7 hiperglicosilada, ou por HPLC deafinidade por heparina. Uma vez caracterizado, aquantificação do confôrmero em questão pode ser feita pormeio de ELISA, bio-ensaio, afinidade do polipeptideo de IL-7 pelo receptor de IL-7, ou por qualquer método dequantificação de proteina aplicado sobre o confôrmeroisolado.

Em relação a isso, a invenção também apresenta ummétodo de identificação e quantificação do polipeptideo deIL-7 hiperglicosilada e/ou impurezas relacionadas, em umaamostra; especialmente, em uma preparação farmacêutica.Tais métodos de caracterização podem ser usados,inicialmente, para caracterizar e qualificar a proteinaquanto a um uso terapêutico, em controle de qualidade delotes farmacêuticos. A invenção propõe um método inéditode caracterização e controle de preparações contendo IL-7,para determinação da presença e/ou da quantidade relativado polipeptideo de IL-7 hiperglicosilada da presenteinvenção. Os métodos de preferência utilizam ensaio deproteina pelo método do ácido bicinconinico (BCA), SDS-PAGE, western blot, HPLC de exclusão, HPLC em fase reversa,HPLC de troca-iônica, HPLC de interação hidrofóbica, ensaiode aminoácido (AAA), iso-eletrofocalização (IEF), ELISA,absorção no u.v. e/ou bio-ensaio. Esses métodos podem serusados isolados ou em combinações diversas.

A invenção também disponibiliza um método paraprodução de uma droga ou composição farmacêutica contendoIL-7, composto das seguintes etapas: i) cultura de umacélula hospedeira recombinante, que expresse umpolipeptideo de IL-7; ii) isolamento do polipeptideo, a fimde produzir uma droga contendo IL-7; iii) formulação dessadroga, a fim de produzir uma composição farmacêuticaadequada para uso terapêutico ou como vacina. O métodoinclui, ainda, etapas de identificação, caracterização oumensuração, na droga ou na composição farmacêutica obtida,da quantidade e/ou qualidade do polipeptideo de IL-7hiperglicosilada como definido acima; de preferência, umaetapa de seleção da droga ou composição farmacêutica, quecontenha como ingrediente ativo, mais de 90%, especialmente95%, preferencialmente 98% do polipeptideo de IL-7hiperglicosilada.

A etapa de caracterização pode utilizar diversastécnicas, particularmente métodos relacionados com aespectrometria de massas, com ou sem digestão tripsica,cromatografia de afinidade com lecitina, ensaio deaminoácido (AAA), digestão com endo- e exo- N- e O-glicanase (PNGase A/F, O-glucosidase, neuraminidase),eletroforese de carboidratos assistida por Fluorophore,espectroscopia de massas por MALDI-TOF ou eletrospray,análise de anticorpo monoclonal especifico para pontedissulfeto e/ou caracterização de conformação. Aidentificação de variantes moleculares e impurezasrelacionadas ao produto é feita, preferencialmente, pormeio de um ou mais dos seguintes métodos: eletroforesebidimensional, focalização isoelétrica e cromatografia detroca-iônica, para as formas desaminadas; cromatografia deexclusão e SDS-PAGE, para formas multiméricas, e HPLC emfase reversa, com ou sem pré-digestão enzimática, para asformas truncadas.

Essa etapa é particularmente adequada para controle dequalidade de composições clinicas ou farmacêuticas, ondesão retidas apenas as composições que possuem mais de 95%do polipeptideo de IL-7 hiperglicosilada, de preferência,mais de 96, 98 ou 99,5%. Em média, todos essespolipeptideos de IL-7 hiperglicosilada apresentam pontoisoelétrico abaixo de 6,5.

Outro objeto da presente invenção se refere ao uso deum polipeptideo de IL-7 hiperglicosilada recombinanteobtido pelos processos descritos acima, para fabricação deuma composição farmacêutica, que evite ou trate doençasassociadas à imunodeficiência, particularmente, que induzauma estimulação prolongada da linfopoiese, a fim de causare/ou amplificar uma resposta imune, particularmente, umaresposta imune antigeno-especifica.

Outro objeto da presente invenção se refere ao empregode um polipeptideo de IL-7 hiperglicosilada, comoferramenta para uso experimental e farmacológico emmamíferos, para aplicações veterinárias.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção serãodescritos nos exemplos a seguir, os quais devem ser vistoscomo ilustrativos e não limitativos do escopo deste pedido.

EXEMPLOS

EXEMPLO A. CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DE SEQÜÊNCIAS DENUCLEOTÍDEOS OTIMIZADAS, QUE CODIFICAM IL-7, HUMANA(H) ESÍMIA (S), EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS

Al. Construção de uma seqüência de nucleotídeosotimizada, que codifica IL-7 humana:

1.1. Otimização do peptídeo-sinal:

Várias seqüências de peptídeo-sinal foram testadas,porque a expressão de fragmentos de cDNA de IL-7 ligadospela posição 5' final ao peptídeo-sinal natural de IL-7 foimuito baixa.

As novas seqüências de cDNA codificadoras de IL-7humana foram obtidas quimicamente, a partir de matrizes deoligonucleotídeos sintéticos.

Diversas seqüências de peptídeo-sinal foram testadas:peptídeo-sinal (PS) de proteínas de alta secreção (Barashet al.f Biochemical and Biophysical Research Communications2002, 294:835-842) :

PS IL-7

MFHVSFRYIF GLPPLILVLL PVASS (SEQ ID NO:13)PS EPO

MGVHECPAWL WLLLSLLSLP LGLPVLG (SEQ ID NO:14)PS SEAP

MLLLLLLLGL RLQLSLG (SEQ ID NO:15)PS IgGkappa

METDTLLLWV LLLWVPGSTG (SEQ ID NO:16)PS Lactotransferina/vitronectinaMKLVFLVLLF LGALGVALA (SEQ ID NO:17)PS Cistatina bis

MARPLCTLLL LMATLAVALA (SEQ ID NO:18)Um novo PS híbrido EPO/IL-7

MGVHECPAWL WLLLSLLSLV LLPVAS (SEQ ID NO:19)

As seqüências de cDNAs obtidas foram inseridas novetor pTT5 (Durocher et al.; 2002; Nucl. Ac.Res.; 30) paraexpressão transiente em células de mamíferos, como HEK293 eCHO.

A fim de verificar a boa clivagem do peptideo-sinal, oaminoácido N-terminal foi determinado em cada proteínaobtida; a integridade da hIL-7 foi mantida.

Cistatina, IgC, EPO e o EP0/IL-7 mostraram ser asmelhores seqüências de peptídeo-sinal. Na verdade, aexpressão de hIL-7 foi aumentada por um fator de, pelomenos, 10.

1.2. Otimização da seqüência de nucleotideoscodificadora da IL-7 humana:

Mantendo-se a seqüência de aminoácidos do EP/7hIL-7, aseqüência de ácidos nucléicos foi otimizada por:

- eliminação de códons humanos raros (usando osoftware Graphical Codon Usage Analyseranalisador gráfico de uso de códons);

aumento da estabilidade do mRNA pelo aumento doconteúdo em viGC" da seqüência, exceto para aseqüência do peptideo-sinal (Kim et ai.; 1997;Gene; 199), e minimização da sucessão dedinucleotideo "CA".

A seqüência é apresentada na SEQ ID NO:2.A2. Construção de uma seqüência de nucleotideosotimizada, que codifica IL-7 simia:

Como descrito para a seqüência codificadora de IL-7humana, sintetizou-se uma seqüência otimizada EP/7-sIL-7(SEQ ID NO:3).Α3. Construção de uma seqüência de nucleotídeosotimizada, que codifica IL-7 canina:

cDNA de IL-7 canino foi amplificada por PCR a partirde uma biblioteca de CDNA de rim de cão (Biochain), clonadae seqüenciada como descrito acima para a seqüênciacodificadora da IL-7 humana; sintetizou-se uma seqüência dePSIL-7 ou PSEP/7-CIL-7 (SEQ ID NO:6).

A4. Expressão em mamíferos (Expressão de células BHKou CHO ou HEK-293):

As seqüências de cDNA codif icadoras de IL-7 foramamplificadas por reação em cadeia de polimerase (PCR)(Mullis et ai.·, 1987; Methods in Enzymology; 155:335-350),a fim de criar os sítios de restrição (NotI/SwaI) paraclonagem no vetor de expressão.

O sistema de expressão ph-pgk.EP7-hIL-7 (Fig. 1) oupBh-pgk.EP7-hIL-7 (Fig. 2) foi criado para expressar umaproteína IL-7 predita pela tradução da seqüência genéticanatural da IL-7 humana. A seleção das células recombinantescontendo o vetor foi feita com base nos genes marcadores deresistência a antibiótico (ampicilina para clonagem em E.coli e higromicina para expressão em células de mamíferos),carregados no vetor.

Esse vetor de expressão foi construído inteiramente naCYTHERIS, começando pelo plasmídeo plC20H (ATCC), queconfere ao sistema resistência à ampicilina. Ele contémduas unidades de produção em mamíferos:

1) uma para expressão das seqüências codificadorasda IL-7, sob controle do promotor pgk, e umaseqüência sintética poli A, que evita atranscrição através daquele promotor;

2) uma para expressão da resistência à higromicina,sob controle do "enhancer sv40- promotor tk".

As seqüências a seguir foram inseridas nesse vetorpreliminar:

- "hph-efIa pA": Fragmento HindIII/SbfI depVitro2.mcs (Invitrogen);

Promotor tk: Fragmento EcoRI/HindIII PCR de pMEP4(Invitrogen);

Enhancer sv40: Fragmento BssiíII/£co.RI PCR depVitro2.mcs (Invitrogen);

RLM de β-globina de coelho: Uma provável "Regiãode Ligação de Matriz" para melhor integração emregião de alta transcrição da cromatina,fragmento EcoRV/AgeI PCR intron2 de β-globina decoelho, da pSG5 (Stratagene);SpA: fragmento StuI/BspEI do controle pCAT3(Promega);

Promotor Pgk: fragmento Kpnl/BssHII PCR, dopQBI.pgk (Q-biogen);

5'UTRintl: Fragmento quimérico de intron HindIII,do controle pCAT3 (Promega);

- cDNA e mutantes, que codificam sítios NotI/SwaIou NotI/PmlI de IL-7;

hghpA: síntese de NruI/SwaI a partir de seqüênciade cDNA de hormônio de crescimento humanodescrita por M. Goodman (DeNoto et al.; 1981;Nucl. Acid. Res.; 9 (51):3719-3730).

Algumas variantes do vetor foram preparadas com outrospromotores de IL-7 e não com pgk: Eflalfa, snRNA Ul,actina, Ubiquitina, promotores CMV, etc.; ou com outromarcador genético: Neomicina, etc.

O vetor de expressão em mamíferos (HEK-293, CHO ouBHK) contendo SEQ ID NO: 2 é chamado ph-pgk. EP7-hIL-7 oupBh-pgk. EP7-hIL-7. Expressão estável de IL-7 humano emcélulas HEK-293 ou CHO transfectadas foi obtida usando-se ovetor de expressão ph-pgk.EP7-hIL-7 ou pBh-pgk.EP7-hIL-7.Após linearização com NdeI, o vetor de expressão ph-pgk . EP7-hIL-7 ou pBh-pgk.EP7-hIL-7 foi transfectdo emcélulas hospedeiras de mamíferos, utilizando-se métodos jáconhecidos pelas versadas na técnica. O marcador genéticousado para estabelecer transformantes estáveis foi ahigromicina (Invitrogen).

A5. Expressão indutível em mamíferos (promotor dematalotioneína, MTl):

No mesmo vetor de expressão, o promotor pgk também foisustituído por uma seqüência quimicamente sintetizada deBspEI/BssHII "Mus musculus MTl", como descrito na PubMed(N° X53530) (Carter et al.; 1984; Proc.Natl. Acad. Sei.USA; 81:7392-7396).

MTl é um promotor dependente de metal, do fator detranscrição. A expressão de clones estáveis é, portanto,dependente de zinco.

A6. Co-expressão em mamíferos de IL-7 e Bcl2 ouBclXL (Expressão de células BHK ou CHO ou HEK-293):

A fim de aumentar a viabilidade celular na cultura decélulas hospedeiras de mamíferos e, assim, otimizar asquantidades produzidas de IL-7, um plasmídeo de expressãovariante foi preparado, enxertando-se a seqüência cDNA Bcl2entre o promotor tk e hph cDNA, de modo que a ação anti-apoptótica de Bcl2 pudesse ser testada em produção via bio-reator (Zhong et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993,90:4533-4537 ; Lee et al., Journal of Cell Science 2000,114 (4) :677-684) . (ver Fig. 2).

EXEMPLO B. CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DE SEQÜÊNCIAS DENUCLEOTÍDEOS CODIFICADORAS DE ANÁLOGOS HIPERGLICOSILADOS DEIL-7, EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS:

BI. Construção de seqüências de cDNA de análogos deIL-7 hiperglicosilada

Os análogos de IL-7 hiperglicosilada foram obtidosatravés de diversas técnicas, incluindo métodos demutagênese. Análogos de IL-7 hiperglicosilada(alternativamente: HG37 -40 -104 -126 e -147) foramconstruídos, quimicamente, a partir de matrizes deoligonucleotideos sintéticos. Diversos análogos foramobtidos pela introdução de uma ou mais mutações desejadas,de modo a se obter análogos de IL-7 contendo um ou maissitios de glicosilação adicionais. Com isso, a seqüênciaintegral de cDNA, com um ou com múltiplos sitios adicionaisde glicosilação, foi inserida após digestão com enzimas derestrição de NotI and PmII, no meio dos sitios de restriçãode NotI/PmlI para clonagem direta no vetor de expressão(similar às Fig. 1 ou 2, mas com a seqüência de IL-7apropriada).

B2. Expressão de seqüências de cDNA de análogos deIL-7 hiperglicosiladaA expressão dos análogos de IL-7 hiperglicosilada foiconduzida como descrito nas seções A4 a A6.

EXEMPLO C. PRODUÇÃO DE HIL-7 RECOMBINANTE EM CONDIÇÕESDE CULTURA EM BIO-REATOR

O clone positivo mais estável, como no exemplo A4, foiadaptado para cultura em suspensão livre de soro por meiode seleção de diversos meios e componentes, a fim deproduzir um clone otimizado para produtividade ecrescimento em cultura de alta densidade celular. Antes desemear o bio-reator de 100 a 2000L, foram feitas pré-culturas no sistema "wave bag". A cultura celular foi feitaem bio-reator de 100 a 2000 litros, com sistemas deperfusão ou de batelada durante 10 a 15 dias. As célulasforam amplificadas até a concentração de 10 milhões decélulas/mL em meio com baixo teor de glutamina,suplementado por peptonas de plantas.

Em uma primeira etapa da expansão, a temperatura dacultura foi mantida em 37°C, para aumentar a densidadecelular. Após alguns dias, a temperatura foi diminuída paracerca de 28 a 32°C, a fim de inibir o crescimento celular epermitir melhor nível de expressão. Além disso, odecréscimo da temperatura diminui a velocidade do caminhode secreção, favorecendo a glicosilação da IL-7 expressada,com aumento da ocupação dos sítios.Poucos dias antes do fim da cultura, a expressão deIL-7 foi intensificada com a adição de butirato de sódio0,5 a IOmM ao meio.

A expressão de IL-7 foi monitorada tanto no interiordas células como no meio de cultura (Fig. 3), nas condiçõesdescritas acima.

Para produzir glicoformas de IL7 de alto PM, manteve-se glicose (3g/L) e glutamina (3mM) no meio, assim como boaoxigenação durante a cultura. Também se monitorou o consumode aminoácidos e se acrescentou à cultura, os aminoácidosescassos. A cultura celular foi terminada assim que aviabilidade das células desceu abaixo de 90%.

EXEMPLO D. PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE IL-7 HUMANORECOMBINANTE, EXPRESSADO EM CÉLULAS HEK-2 93 E CHO

O meio de cultura celular foi recolhido, em estadobruto, e contrifugado, a fim de precipitar as célulasinteiras e os debris celulares. Alternativamente, o mesmopode ser feito por filtração em cápsulas de filtração ouclarificação, como cápsulas Mustang XT (Pall), Sartoclear P(Sartorius), Millistak+ Opticap (Millipore) ou cartuchos defibra porosa (AXH de fluxo cruzado 10 (GE)) ou equivalente.

0 meio de cultura centrifugado foi concentrado, em aparelhoCentrasette Cassette com cut off de membrana de IOkDa (PallLife Sciences), para reduzir o volume do sobrenadante acerca de um décimo do inicial. Qualquer outro sistema defiltração/concentração com porosidade semelhante poderiater sido usado.

O supernadante concentrado foi centrifugado, seu pHajustado a 7,5 e aplicado em coluna de Q Sepharose de fluxorápido (General Electric Healthcare) equilibrada comfosfato de sódio 50mM (pH 7,5), sendo a proteína recuperadano eluato. Nessa etapa de cromatografia negativa, diversoscontaminantes, entre os quais DNA, foram eliminados. Umaalternativa a essa etapa foi o emprego de cartuchos demembrana validados Mustang Q (Pall), em condiçõessimilares; esse processo é ligeiramente mais rápido epossui melhor rendimento. Outra alternativa é a captura daproteína por meio de uma resina fortemente trocadora deânions, como Q Ceramic Hyper D (Biosepra), Capto Q (GE), oude membrana (Sartobind Q, Sartorius).

Após essa etapa de purificação, o passo de captura foirealizado com uma resina fortemente trocadora de cátions. 0eluato coletado ao final da etapa anterior foi aplicado emuma coluna Fractogel EMD S03" (Merck) equilibrada comtampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 7,5) e lavada com amesma solução. A eluição foi feita com gradiente linear deNaCl (15 vêzes o volume da coluna) em fosfato de sódio5OmM, pH 7,5.

As frações ativas foram reunidas e inativadas, duranteminutos, em pH 3,5 à temperatura ambiente, paraeliminação de vírus. Uma alternativa a esse processo é asubstituição da etapa de inativação viral por umananofiltração em multi-camada ao final do processo.

Após a inativação viral, as frações protéicas reunidasforam diluídas à metade com tampão de fosfato de sódio2OOmM (pH 7) + sulfato de amônio 3M, e o pH ajustado a 7. Asolução de proteína foi, então, aplicada em coluna decromatografia de interação hidrofóbica (CIH) - ButylToyopearl 650-M (Tosoh) -, equilibrada com tampão defosfato de sódio 50mM (pH 7) + sulfato de amônio 1,5M. Apóslavagem com o tampão, a IL-7 foi eluída com 25 vêzes · ovolume da coluna, de um gradiente salino de sulfato deamônio em fosfato de sódio 50mM (pH 7), variando de 1,5 a OM.

Outras colunas de CIH, como hexyl Toyopearl 650-M(Tosoh), Butyl/Octyl Sepharose™ 4 Fast Flow (GeneralElectric Healthcare), podem ser utilizadas para essa etapa.Outra alternativa à CIH, visando aumento de escala, foi autilização de outra matriz, como a MEP HyperCel (PallBiosepra), com resultados semelhantes.

A combinação da etapa de captura mencionada acima coma cromatografia de interação hidrofóbica levou a uma ótimaseparação das diferentes isoformas de IL-7 glicosilada (deBl a B10, como indicado na Fig. 4), de acordo com suaspropriedades físico-químicas intrínsecas. A seleçãoadequada das frações eluídas (frações Bl a B4) levou aoenriquecimento do material em hIL-7 3N-associado, ou não, àforma 10-glicosilada. Um exemplo de separação dessaglicoforma está mostrado na Figura 4.

As frações altamente glicosiladas de IL-7 foramreunidas e aplicadas em coluna Sephadex G25 (GeneralElectric Healthca re), equilibrada com tampão de baixo teorsalino (acetato de sódio 20mM, pH 6) . Uma alternativa paraessa etapa é filtrar o concentrado de alto teor salinousando membranas TFF com limite dos poros para pesomolecular de 5 ou IOkDa, como as membranas Qvick start (GE)e Centramate TFF (Pall).

As frações protéicas obtidas da G25 foram aplicadas emcoluna Source 15S (General Electric Healthcare),equilibrada com tampão de acetato de sódio 20mM (pH 6).

Essa etapa resultou em concentração da proteína eeliminação dos contaminantes residuais.

A coluna foi lavada com tampão de acetato de sódio e aproteína IL-7 eluída com 15 vezes o volume da coluna, de umgradiente salino de NaCl, variando de 0 a 1M, em acetato desódio 2OmM (pH 6). As frações eluídas foram separadas porSDS-PAGE e coradas com azul Coomassie ou nitrato de prata.Apenas as frações contendo IL-7 foram reunidas parafornecer a porção final de proteína IL-7 purificada.

Se a inativação viral não tiver sido realizada antes,o processo de purificação pode incluir uma combinaçãoadicional de duas filtrações, a fim de garantir uma ótimaeliminação dos vírus. Remoção destes pode ser feita porfiltração, usando um dispositivo de pré-filtração (Planova75, Asahi Kasei Medicai), seguido de membranas de celulosenanoporosa (Planova 20N, Asahi Kasei Medicai) ou outrasmembranas de remoção de vírus (Virosart, Sartorius ; DV20,Millipore).

SDS-PAGE de hIL-7 glicosilada e hiperglicosiladapurificadas, derivadas de E. coli, estão apresentados naFigura 5.

Os deslocamentos no gel ilustram o nível deglicosilação da proteína. Em verdade, as formashiperglicosiladas testadas (HG-37-147 e HG-40-104) têmpeso molecular mais alto do que a IL-7 totalmenteglicosilada.

EXEMPLO E. ANÁLISE DOS CARBOIDRATOS DA GLICOPROTEÍNA

A produção da IL-7 recombinante humana foi feita em umsistema de expressão baseado em células CHO pelas seguintesrazões, embora não apenas por elas: As células CHO são,atualmente, as hospedeiras mais comuns e mais validadaspara produção de glicoproteína recombinante humana para usoterapêutico. Além disso, um grande número de trabalhosdetalhados relataram que as células CHO, inclusive aslinhagens geneticamente modificadas para expressar sialil-a-1-6 transferase, são capazes de glicosilar proteínasrecombinantes de modo qualitativamente semelhante aoobservado em células humanas. Esse aspecto particular foide importância fundamental para reduzir a imunogenicidadepotencial da glicoproteina recombinante quando injetada emseres humanos.

Os produtos ou frações de IL-7 recombinante humanopurificado, enriquecidos em glicoformas particulares (3N ou3N+2N, associados, ou não, à porção 10-glicana), obtidas decélulas CHO transfectadas, foram analisados por westernblot a fim de confirmar o grau de glicosilação, emcomparação com o IL-7 recombinante humano derivado de E.coli.

As diferentes glicoformas . de IL-7 purificadas,produzidas por meio de células CHO, foram caracterizadaspor eletroforese em gel de poliacrilamida. Os pesosmoleculares aparentes das glicoproteinas variaram entre 20kDa e 35kDa, com uma banda mais intensa ao redor de 27kDa(observada no SDS-PAGE. Ver Fig. 5 e 6), provavelmentecorrespondendo à forma 3N-glicosilada contendo, ou não, umaporção 0-glicana. Esse aspecto especificamente, foi tratadopor desglicosilação enzimática do produto purificado (Fig.7).

Essas glicoformas (3N ou 3N+2N associadas, ou não, àporção 10-glicana) da IL-7 purificada, produzida por meiode células CHO, foram caracterizadas por espectrometria demassas, fornecendo massa molar superior a 25kDa para a 3N-glicoforma associada, ou não, à porção 10-glicana, e maiorque 23kDa para a 2N-glicoforma associada, ou não, à porção10-glicana (v. Fig. 8).

Além disso, as formas glicosiladas acima apresentamponto isoelétrico médio de 5,8, refletindo um perfil dealta sialilação (v. Fig. 9).

Para efeito de comparação, uma análise semelhante foiefetuada com hIL-7 não-glicosilada, derivada de E. coli,fornecendo uma proteina de peso molecular aparente de,aproximadamente, 18kDa, e com hIL-7 hiperglicosiladaderivada de células de mamíferos, que apresentaram pesomolecular aparente entre 27 e 37kDa.

A complexidade geral da glicosilação e aheterogeneidade total de N-glicanas do hIL-7 purificado,derivado de células CHO, foram avaliadas pordesglicosilação total enzimática seguida de separaçãocromatográfica e análise por espectrometria de massas dosoligossacarídeos gerados.

Amostras purificadas de hIL-7 glicosilada foramdigeridas enzimaticamente com uma endoglicosidase, como apeptídeo-N-glicosidase F (PNGaseF, Roche). Osoligossacarídeos N-Iigados obtidos foram separados daestrutura peptídica e agrupados por tamanho com uma colunade grafite, Carbograph 200-300μ1 (Alltech), seguida porespectrometria de massas usando a técnica MALDI-T0F(Voyager Spec, Applied Biosystems). Os valores de m/zcorrespondentes a cada pico no espectro de massaspermitiram a identificação da estrutura geral de N-glicanada molécula integral de hIL-7.

Para detecção especifica das glicanas contendo ácidosiálico, foi feita uma carboximetilação dosoligossacarideos gerados com a PNGase (segundo o métododescrito por Powell AK & Harvey DJ, Rap. Com. Mass Spec.1996) antes da análise por espectrometria de massas.

Análise do espectro gerado pela hIL-7 derivada decélulas CHO revelou massas entre 1340 e 3516Da para as N-glicanas. (v. Fig. 10).

Pelo espectro pode-se determinar a seguinte estruturaglicânica (v. Tabela 3) :

TABELA 3

<table>table see original document page 92</column></row><table><table>table see original document page 93</column></row><table>

Hex: hexose (galactose ou manose), HexNAc : N-acetilhexosamina (N-acetil glucosamina ou N-acetilgalactosamina), dHex : desoxihexose (Fucose), Sulph : gruposulfato, NeuAc : ácido N-acetil neuraminico

Levando-se em conta i) as massas respectivas dasporções de oligossacarideos observados; ii) a massa de cadamonossacarideo, e iii) as regras dos caminhosbiossintéticos das glicanas, como conhecidas atualmente,podem-se admitir, com boa probabilidade de acerto, asseguintes estruturas para as N-glicanas altamentecomplexas.TABELA 4:

<table>table see original document page 94</column></row><table>

Complexos bi- e triantenários de N-glicanas de mamíferos,caracterizadas com base em hIL-7 derivado de células CHO(mas não limitadas a ela)

A complexidade da glicosilação foi avaliada, também,por meio da determinação da razão molar de diversosmonossacarídeos encontrados em todas as glicanas (N- e 0-glicanas, quando aplicável) da hIL-7 purificada derivada decélulas CHO.Todas as glicanas das amostras de hIL-7 glicosiladapurificada, foram tratadas quimicamente, por reação demetanólise, a fim de hidrolisar todas as ligaçõesglicosidicas entre os açúcares. Os monossacarideos obtidosforam separados da estrutura peptidica e agrupados portamanho, usando equipamento de cromatografia em fase gasosaacoplada a espectrometria de massas (Gas Chromatography-Mass Spectrometry Automass, Finnigan). A razão molar foideterminada em relação a padrão interno conhecido e aoconteúdo de 3-manose de uma N-glicana clássica de mamífero.

Essa análise forneceu a seguinte razão molar para ahIL-7 derivada de células CHO.

TABELA 5

<table>table see original document page 95</column></row><table>

A heterogeneidade do padrão de N-glicanas de sítiosespecíficos da hIL-7 derivada de células CHO foi avaliadapor meio de digestão com endoprotease, seguida porfracionamento e análise por espectrometria de massas dospeptideos gerados.

Amostras purificadas foram digeridas com tripsina, ououtra endo-protease, a fim de gerar os glicopeptideoscorrespondentes a cada sitio de N-glicosilação da IL-7expressada. Cada glicopeptideo foi identificado através domicro-sequenciamento N-terminal e de seu tempo de retençãoespecifico em HPLC em fase reversa. Cada glicopeptideo foi,assim, purificado. A heterogeneidade das N-glicanas, obtidaatravés dos glicopeptideos, foi analisada por EM-MALDI-TOF(Q Star, Applied Biosystems) . Os valores de m/zcorrespondentes a cada pico no espectro de massaspermitiram a identificação do padrão da N-glicana de cadasitio especificado na hIL-7.

0 padrão de 0-glicosilação foi avaliado através do usode lecitinas especificas para O-glicanas (blot de lecitina,Fig. 11).

Amostras puras de hIL-7 derivadas de células CHO foramseparadas por SDS-PAGE e aplicadas em membranas PVDF.Proteínas imobilizadas foram testadas com PNA (aglutininade amendoim) e/ou MAA (aglutinina de Maackia amurensis)marcadas com peroxidase (mas não só com elas) e coradaspara visualização.A heterogeneidade e composição das glicanas foramdeterminadas, também, através da afinidade de lecitina pelahIL-7 derivada de células CHO, pura.

Um conjunto de lecitinas com afinidade por estruturasde N- e O-glicanas foi selecionado e usado para recobrir 96cavidades em microplacas de testes. Quantidades idênticasde preparações de IL-7 recombinante purificadas foramincubadas nessas microplacas. Durante essa etapa,quantidades diferentes de IL-7 mantiveram-se ligadas àlecitina de acordo com a afinidade de cada lecitina àglicana ligada à IL-7. A revelação foi feita incubando-seum anticorpo especifico para IL-7, junto com biotina. O"sanduíche" de lecitina-IL-7-Ab foi revelado por umcomplexo de streptavidina-peroxidase.

Oito lecitinas diferentes foram utilizadas nacaracterização das amostras purificadas de IL-7. Cadalecitina reconhece porções específicas de açúcares. Osmotivos e as especificidades estruturais das glicanas estãoapresentadas na Tabela 6.

Tabela 6: resumo do padrão de açúcares reconhecidospelas lecitinas e inventário dos motivos e especificidadesestruturais das glicanas correspondentes

LEA é a lecitina de Lycopersicon esculentum,

WGA de Triticum vulgare,

UEA.I de Ulex europeus,MAA de Maackia amurensis,ACA de Amaranthus caudatus,AIA de Artocarpus intergrifolia,ABA de Agaricus bisporus,PHA.L de Phaseolus vulgaris.

TABELA 6

<table>table see original document page 98</column></row><table>

Os resultados estão mostrados na Fig. 12.As lecitinas demonstram, claramente, afinidadediferencial, fornecendo informações sobre a estrutura geraldo padrão de glicanas acessíveis na proteína purificada deIL-7, em solução.

Assim, ACA, ABA e AIA têm afinidade por Gal e GalNAc.As três lecitinas respondem positivamente, sugerindo apresença de estruturas de N- e O-glicanas contendo essesmonossacarídeos. O sinal específico obtido com ABA revela apresença de estruturas de O-glicanas. ACA apresentou umsinal fraco, em comparação com o de AIA; ABA apresentousinal ainda mais fraco. Isso mostra que as O-glicanas estãoespalhadas, havendo pouco GalNAc como resíduo terminal.

LEA tem afinidade por GalNAc, indicando a presença deestruturas de N-glicana. Entre as lecitinas específicaspara GlcNAc testadas (dados não apresentados), apenasaquelas com afinidade pela N-acetil lactosaminaapresentaram sinal positivo.

A WGA apresentou um sinal fraco, devido à baixaafinidade por estruturas internas de glicanas N-Iigadas. N-glicanas altamente complexas mascaram a estrutura interna etornam a afinidade de lecitina difícil de operar.

A UEA.I tem afinidade específica por fucoseramificada. A ligação foi relativamente fraca, indicandofucosilação incompleta, porém efetiva, das N-glicanas.A MAA tem afinidade por acidos sialicos terminais. Seusinal foir forte, indicando sialilacao efetiva tanto nas N-quanto nas O-glicanas.Assim, embora contendo N- e O-glicanas sialiladascomplexas, a amostra de IL-7 purificada ainda contém umamistura de proteínas total e parcialmente glicosiladas.

EXEMPLO F. DA SUBSTÂNCIA ATIVA AO PRODUTO ATIVO:

FORMULAÇÃO, ESTOCAGEM E ESTABILIDADE DE LONGO PRAZO DO HIL-7 RECOMBINANTE EXPRESSADO EM CÉLULAS CHO.

A pesquisa pela formulação ideal da droga foiconduzida através de um estudo de matriz combinatória, afim de avaliar o impacto de diversas condições estressantes(temperatura, tampão, pH, concentração de modificador detonicidade, agitação, iluminação intensa) sobre aestabilidade de longo prazo da proteína purificada.

A IL-7 recombinante humana purificada, altamentecomplexa, mostrou-se estável em tampões de acetato e desuccinato, em concentrções entre 5 e 50mM. Os valores de pHadequados ficaram entre 5,0 e 7,0 e as temperaturas ideaisde estocagem, entre -20°C e +4°C.

Açúcares e pequena concentração de surfactantes(polímeros de polissorbato) podem ser adicionados àpreparação a fim de evitar formação de agregado não-covalente solúvel.

Nessas condições, a IL-7 pode ser estocada a +40C (soba forma líquida) em concentrações entre 0,5 e 8,0 mg/mL,preferencialmente entre 2,0 e 4,0mg/mL, por mais de 12meses. A composição farmacêutica na forma liquida apresentaum melhor perfil de estabilidade.

EXEMPLO G. ANÁLISE DA ATIVIDADE PROLIFERATIVA DE IL-7RECOMBINANTE HUMANA, DERIVADA DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS, EMBIO-ENSAIO ESPECÍFICO

A atividade biológica especifica de IL-7 recombinantehumana, derivada de células de mamíferos, foi avaliada emum bio-ensaio específico frente à linhagem de célulasmurínicas pré-B, PB-I (German Cell Bank DSMZ, DeutscheSammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen), derivadas decélulas da medula óssea de camundongos CBA/C57BL, sendoessa linhagem celular estritamente dependente de IL-7 parao seu crescimento (Mire-Sluis et ai.; 2000; J. Immunol.Methods; 236:71-76). Essas células foram mantidas emcultura em meio comercial contendo IL-7, e privadas de IL-7antes do início do bio-ensaio.Este foi conduzido emamostras de IL-7 a serem testadas, em paralelo com umcontrole positivo contendo IL-7 derivado de E. coli, e umcontrole negativo isento de IL-7.

A IL-7, dos controles ou das amostras, adicionada àcultura celular induziu o re-início da proliferação dascélulas, dependente da dose. Durante esse processo, houveincorporação de timidina radiomarcada (3H-Tdr, Amersham)pela células em divisão. 0 teor de marcação foi medido porcontagem beta, em contagens por minuto (cpm), em cintiladorlíquido (Wallack).Alternativamente, esse bio-ensaio pode ser realizadousando um corante marcador, que reflita o metabolismo geralda célula, tal como o MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2 , 5-difenil tetrazol, reduzido pela atividade redoxmitocondrial) ou o MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazol).

Diluições em série do controle positivo e das amostrasde teste permitiram a plotagem do número de cpm em relaçãoà quantidade de amostra/controle ensaiada.

A Figura 13 apresenta dados cinéticos de dose-respostae curvas obtidas como rotina em um bio-ensaio típico: ocrescimento de células PB-I foi induzido por r-hIL-7 não-glicosilada (expressada em E. coli), ou por r-hIL-7altamente glicosilada (produzida em células de mamíferos).(Os pontos representam a média ± SD de determinações emtriplicata).

A Figura 14 apresenta dados cinéticos de dose-respostae curvas obtidas como rotina em um bio-ensaio típico: ocrescimento de células PB-I foi induzido por r-hIL-7 não-glicosilada (expressada em E. coli) , altamente glicosiladaou hiperglicosilada (produzida em células de mamíferos).(Os pontos representam a média ± SD de determinações emtriplicata).O parâmetro importante a ser considerado para cadaamostra foi a ED50, que é igual à concentração (ng/mL) quefornece a metade da atividade máxima. Um valor mais alto deED50 significa menor atividade.

A comparatibilidade das atividades entre os lotes deIL-7 foi avaliada pela análise dos parâmetros da curva dedose-resposta, como coeficiente de inclinação, no ponto deatividade máxima. A concentração ED50 (em ng/mL) aglutinaas variações de todos os parâmetros de curva. A ED50corresponde à dose de IL-7 necessária para induzir metadeda atividade máxima de indução possível, in vitro. Comrelação a isso, a moléculas altamente reativas correspondembaixos valores de ED50, enquanto altas concentrações ED50serão características de preparações de IL-7 menosbioativas in vitro.

Apesar disso, na presente invenção, diferenças debioatividade in vitro não representam, necessariamente,diferenças semelhantes in vivo.

EXEMPLO H. AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE IN VIVO DEPOLIPEPTíDEOS DE IL-7 HIPERGLICOSILADA EM PRIMATAS

IL-7 hiperglicosilada de símios (sIL-7), expressa emlinhagem celular CHO (exemplos A2, A6 e B) e purificadaconforme o exemplo D, foi avaliada in vivo, quanto àocorrência de imunogenicidade potencial após administraçõesrepetidas em primatas normais.Macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis) (n=4) jovensadultos, não previamente tratados, foram incorporados aoestudo e receberam sIL-7 hiperglicosilada na dose de 100pg/kg/injeção. Esses animais receberam um total de seisadministrações subcutâneas de IL-7 em um período de cincosemanas consecutivas. Os animais foram observadosclinicamente durante dois meses. Amostras de sangue foramcolhidas durante o estudo, em diferentes épocas: um diaantes da administração de sIL-7, no dia 37 e no final doestudo.

Todos os animais sobreviveram e não apresentaramreações adversas à terapia com sIL-7. A administração desIL-7 foi localmente bem tolerada. Quando os soros dosanimais tratados foram testados quanto à interferência emum teste ELISA específico para detectar anticorpos deligação, nenhum anticorpo anti-IL-7 foi detectado. Emcomparação, em um protocolo semelhante, IL-7 recombinantederivada de E. coli, embora produzida como um produto dealta pureza, induziu a produção de altos títulos deanticorpos de ligação a IL-7 em soros, entre 1:400 e1:5000.

EXEMPLO I. ATIVIDADE BIOLÓGICA IN VIVO DE POLIPEPTÍDEODE IL-7 HIPERGLICOSILADA EM PRIMATAS

IL-7 hiperglicosilada humana (hIL-7) expressa emlinhagem celular CHO (exemplos Al, A6 e B) e purificadacomo no exemplo D foi avaliada, in vivo, para determinaçãodos perfis farmacodinâmico e farmacocinético em primatasnormais.

Macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis) adultosjovens, não previamente tratados, foram incorporados àpesquisa e divididos em dois grupos: não-tratados (n=2) etratados com 100 yg de hIL-7 por kg por injeção (n=2) .Amostras de sangue foram colhidas durante o estudo, emdiferentes épocas: nos dias 1 (0, 3, 6, 9 e 12 horas após ainjeção), 2, 3, 4, 7, 21 e 45.

A administração de hIL-7 foi bem tolerada, sem reaçãono local da injeção. Após administração subcutânea de doseúnica de hIL-7 nos macacos, o padrão e os parâmetrosfarmacocinéticos da hIL-7 foram estabelecidos, após asprimeiras 72 horas:

0 perfil plasmático mostrou declínio bi-exponencial após pico de absorção.

A meia-vida observada para o produto no plasmaficou entre 30 e 40 horas. Esse valor ésignificativamente alto, quando comparado com ameia-vida observada para IL-7 recombinantederivado de E. coli (5 a 8 horas) administradonas mesmas condições. Isso reflete uma maiorestabilidade do polipeptídeo de IL-7hiperglicosilada no sangue, in vivo.O tempo de residência médio (TRM) foi de 40horas, contra cerca de 10 horas para o produtoderivado de E. coli.

O tempo necessário para atingir a concentraçãomáxima foi de 180 minutos.

Em resumo, o estudo farmacocinético mostrou que opolipeptideo de IL-7 hiperglicosilada da presente invençãoapresenta perfil farmacocinético melhor e mais prolongado,o que se traduz em melhores efeitos farmacodinâmicos.

A injeção única de hIL-7 na dose de 100 ug/kg induziuum aumento significativo no número de células T CD3+CD4+ eCD3+CD8+ periféricas. Esse aumento foi de, respectivamente,200% e 170% em relação aos valores observados antes doinicio do tratamento. O número de linfócitos T (CD4 e CD8)que expressam, transientemente, a cadeia alfa do receptorespecifico da IL-7 (CD127) diminui no sangue periféricoseis horas após a injeção. Os linfócitos T que expressamCD127 reaparecem no sangue periférico 48 horas após ainjeção, retornando aos valores iniciais somente 7 diasapós a dose. Após a administração subcutânea, em doseúnica, da IL-7 recombinante derivada de E. coli, os valoresiniciais de linfócitos T que expressam CD127 só voltamintegralmente aos valores iniciais depois de 4 dias. Acinética de ocupação do receptor do polipeptideo de IL-7hiperglicosilada é mais demorada, em comparação com a daIL-7 recombinante derivada de E. coli, refletindo a meia-vida maior daquele peptideo em primatas, como mostradoabaixo. Esses resultados estão de acordo com dadosanteriores, que mostram que embora a administração i.v. deIL-7 resulte em maior biodisponibilidade, não se traduz emmelhores efeitos farmacocinéticos. Na verdade, o perfil deliberação prolongada obtido pela injeção subcutânea é maiseficiente do que o perfil de liberação rápida obtido com ainjeção i.v. Nesse caso, a hiperglicosilação da proteínainduz um perfil cinético prolongado que, por sua vez, setraduz em melhor atividade farmacodinâmica. Em virtudedesse perfil prolongado, espera-se também uma maiortolerância clínica, uma vez que os efeitos colaterais dasdrogas estão, geralmente, ligados a picos de concentração.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Requerente: Cytheris

<120> Título: POLIPEPTíDEOS DE IL-7 GLICOSILADA, MÉTODOS DE PREPARAÇÃOE USOS

<130> Referência do documento: B0346WO

<160> Quantidade de SEQ ID NOs.: 19

<170> Software: PatentIn Version 3.1

<210> SEQ ID NO.: 1<211> Comprimento: 152<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Homo sapiens

<400> Seqüência: 1

Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu1 5 10 15

Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser20 25 30

Asii Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp35 40 45

Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg50 55 60

Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu65 70 75 80

Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val

85 90 95

Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser100 105 110

Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu115 120 125

Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys

130 135 140

Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His145 150

<210> SEQ ID NO.: 2<211> Comprimento: 540<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Homo sapiens<220> Características:

<221> Nome/chave: CDS

<222> Localização: (1)...(537)

<223> Outras informações: EPy7-hIL7 otimizada

<400> Seqüência: 2

atg ggt gtt cat gaa tgt cct gct tgg ttg tgg ttg ttg ttg tct ttg 48

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15

ttg tct ttg gtt ctg ttg cct gta gcc tct gat tgc gat att gaa ggg 96

Leu Ser Leu Val Leu Leu Pro VaX Ala Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly20 25 30

aaa gat ggg aag cag tat gag tcc gtg ctg atg gtg age ate gat caa 144

Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln35 40 45

ttg ttg gac tcc atg aaa gaa att ggg agt aac tgc ctg aat aac gaa 192

Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu50 55 60

ttt aac ttc ttt aag cgc cat ate tgt gat gct aat aag gaa ggt atg 240

Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met65 70 75 80

ttt ttg ttc cgc gct gct cgg aag ttg cgc cag ttc ctt aag atg aac 288

Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn85 90 95

tct act ggt gat ttc gat ctc cac ctc ctg aaa gtt tcc gaa ggg act 336

Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly ThrIOO 105 110

act ate ctg ttg aac tgc act ggc cag gtt aaa gga aga aaa ccc gct 384

Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala115 120 125

gcc ctg ggt gaa gcc caa ccg aca aag agt ttg gaa gaa aat aaa tct 432

Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser130 135 140

ttg aag gaa cag aag aag ctg aac gac ttg tgt ttc ctg aag cgc ctg 480

Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu145 150 155 160

ttg cag gag att aag act tgt tgg aat aag ate ttg atg ggg act aag 528

Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys165 170 175

gag cat tga taa 540

Glu His

<210> SEQ ID NO.: 3

<211> Comprimento: 178

<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Homo sapiens

<400> Seqüência: 3Mefc Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15

Leu Ser Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly20 25 30

Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln35 40 45

Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asri Glu50 55 60

Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met65 70 75 80

Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn85 90 95

Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr100 105 lio

Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala115 120 125

Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser130 135 140

Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu145 150 155 160

Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys

165 170 175

Glu His

<210> SEQ ID NO.: 4<211> Comprimento: 537<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Símio

<220> Características:

<221> Nome/chave: CDS

<222> Localização: (1)...(537)

<223> Outras informações: EPy7-sIL-7 otimizada

<400> Seqüência: 4atg ggt gtt cat gaa tgt cct gct tgg ttg tgg ttg ttg ttg tct ttg 48

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15

ttg tct ttg gtt ctg ttg cct gta gcc tct gat tgc gat att gaa ggg 96

Leu Ser Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly20 25 30

aaa gat ggg aag cag tat gag tcc gtg ctg atg gtg age ate gat caa 144

Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln35 " 40 45

ttg ttg gac tcc atg aaa gaa att ggg agt aac tgc ctg aat aac gaa 192

Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu50 55 60

ttt aac ttc ttt aag cgc cat ctg tgt gat gat aat aag gaa ggt atg 240

Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Leu Cys Asp Asp Asn Lys Glu Gly Met65 70 75 80

ttt ttg ttc cgc gct gct cgg aag ttg cgc cag ttc ctt aag atg aac 288

Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn85 90 95

tct act ggt gat ttc gat ctc cac ctc ctg aaa gtt tcc gaa ggg act 336

Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr100 105 110

act ate ctg ttg aac tgc act ggc aag gtt aaa gga aga aaa ccc gct 384

Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Lys Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala115 120 125

gcc ctg ggt gaa ccc caa ccg aca aag agt ttg gaa gaa aat aaa tct 432

Ala Leu Gly Glu Pro Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser130 135 140

ttg aag gaa cag aag aag ctg aac gac tcc tgt ttc ctg aag cgc ctg 480

Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser Cys Phe Leu Lys Arg Leu145 150 155 160

ttg cag aag att aag act tgt tgg aat aag ate ttg atg ggg act aag 528

Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys165 170 175

gag cat tga 537

Glu His

<210> SEQ ID NO.: 5<211> Comprimento: 178<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Símio

<400> Seqüência: 5

Met Gly Val His GXu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu15 10 15

Lau Ser Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly20 25 30Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Xle Asp Gln35 40 45

Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu50 55 60

Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Leu Cys Asp Asp Asn Lys Glu Gly Met65 70 75 80

Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn85 90 95

Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr100 105 110

Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Lys Val LysGly Arg Lys Pro Ala115 120 125

Ala Leu Gly Glu Pro Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser130 135 140

Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asr Asp Ser Cys Phe Leu Lys Arg Leu145 150 155 160

Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys165 170 175

Glu His

<210> SEQ ID NO.: 6<211> Comprimento: 480<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Canino

<220> Características:<221> Nome/chave: CDS<222> Localização: (1)...(480)<223> Outras informações: EPy7-cIL-7

<400> Seqüência: 6

atg ggt gtt cat gaa tgt cct gct tgg ttg tgg ttg ttg ttg tct ttg 48

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Txp Leu Leu teu Ser Leu15 10 15ttg tct ttg gtt ctg ttg cct gta gcc tct gat tgt gat att gaa ggc 96

Leu Ser Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly20 25 30

aaa gac ggc aga gag tat cag cac gtt cta atg ate age ate aat gac 144

Lys Asp Gly Arg Glu Tyr Gln His Val Leu Met lie Ser Ile Asn Asp35 40 45

ttg gac ate atg ata aaa aat cgt acc aat tgc tcg aat aat gaa cct 192

Leu Asp Ile Met Ile Lys Asn Arg Thr Asn Cys Ser Asn Asn Glu Pro50 55 60

aac att tta aaa aaa cat gea tgt gat gat aat aag gaa ggt atg ttt 240

Asn Ile Leu Lys Lys His Ala Cys Asp Asp Asn Lys Glu Gly Met Phe65 70 75 80

tta tat cgt gct gct cac aag ttg aag caa ttt gtt aaa gtg aat aac 288

Leu Tyr Arg Ala Ala His Lys Leu Lys Gln Phe Val Lys Val Asn Asn85 90 95

agt gag gat ttc aat ctc cac tta tca aga gtt tca cag ggc aca tta 336

Ser Glu Asp Phe Asn Leu His Leu Ser Arg Val Ser Gln Gly Thr Leu100 105 110

caa ttg ttg aac tgt act ccc aag gaa gac aat aaa tct tta aag gaa 384

Gln Leu Leu Asn Cys Thr Pro Lys Glu Asp Asn Lys Ser Leu Lys Glu115 120 125

cag aga aaa cag aag age ttg tgt tcc cta ggg ata cta cta caa aag 432

Gln Arg Lys Gln Lys Ser Leu Cys Ser Leu Gly Ile Leu Leu Gln Lys130 135 140

ata aaa act tgt tgg aac aaa att ttg agg ggc tct aaa gaa cat tga 480

Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Arg Gly Ser Lys Glu His145 150 155

<210> SEQ ID NO.: 7

<211> Comprimento: 159<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Canino

<400> Seqüência: 7

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15

leu Ser Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly20 25 30

Lys Asp Gly Arg Glu Tyr Gln His Val Leu Met Ile Ser Ile Asn Asp35 40 45

Leu Asp Ile Met Ile Lys Asn Arg Thr Asn Cys Ser Asn Asn Glu Pro50 55 60Asn Ile Leu Lys Lys His Ala Cys Asp Asp Asn Lys Glu Gly Met Phe65 70 75 80

Leu Tyr Arg Ala Ala His Lys Leu Lys Gln Phe Val Lys Val Asn Asn

85 90 95

Ser Glu Asp Phe Asn Leu His Leu Ser Arg Val Ser Gln Gly Thr Leu100 105 110

Gln Leu Leu Asn Cys Thr Pro Lys Glu Asp Asn Lys Ser Leu Lys Glu115 120 125

Gln Arg Lys Gln Lys Ser Leu Cys Ser Leu Gly Ile Leu Leu Gln Lys130 135 140

Ile Lys Thr Cys Txp Asn Lys Ile Leu Arg Gly Ser Lys Glu His145 150 155

<210> SEQ ID NO.: 8<211> Comprimento: 185 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Descrição da seqüência artificial: Domínio10 mutado

<400> Seqüência: 8

ctgaataacg aaactaac

15

<210> SEQ ID NO.: 9<211> Comprimento: 12<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

20

<220> Características:

<223> Outras informações: Descrição da seqüência artificial: Domíniomutado

25 <400> Seqüência: 9

aacttcacta ag

<210> SEQ ID NO.: 1030 <211> Comprimento: 12<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:35 <223> Outras informações: Descrição da seqüência artificial: Domíniomutado<400> Seqüência: 10

gccaacggta cc 12

<210> SEQ ID NO.: 11<211> Comprimento: 15<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Descrição da seqüência artificial: Domíniomutado

<400> Seqüência: 11ctgaacgaca gctgt

<210> SEQ ID NO.: 12

<211> Comprimento: 12

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:<223> Outras informações: Descrição da seqüência artificial: Domíniomutado

<400> Seqüência: 12atcttgaacg gg

<210> SEQ ID NO.: 13

<211> Comprimento: 25

<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Homo sapiens

<400> Seqüência: 13

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ila Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser20 25

<210> SEQ ID NO.: 14

<211> Comprimento: 27

<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Homo sapiens

<400> Seqüência: 14Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu15 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly20 25

<210> SEQ ID NO.: 15

<211> Comprimento: 17

<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Homo sapiens

<400> Seqüência: 15

Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu Ser Leu1 5 10 15

Gly

<210> SEQ ID NO.: 16<211> Comprimento: 20<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Homo sapiens

<400> Seqüência: 16

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15

Gly Ser Thr Gly

<210> SEQ ID NO.: 17

<211> Comprimento: 19

<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Homo sapiens

<400> Seqüência: 17

Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Val15 10 15

Ala Leu Ala

<210> SEQ ID NO.: 18

<211> Comprimento: 20

<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Homo sapiens

<400> Seqüência: 18

Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala1 5 10 15

Val Ala Leu Ala20

<210> SEQ ID NO.: 19<211> Comprimento: 2 6<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Descrição da seqüência artificial: Peptideode sinal quimérico

<400> Seqüência: 19

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu15 10 15

Leu Ser Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser20 25

Claims (38)

1. Polipeptideo de IL-7 hiperglicosilada, de mamíferos,caracterizado pelo fato de que contém, pelo menos, trêsresíduos de aminoácidos N-glicosilados.

2. Composição de IL-7 hiperglicosilada, caracterizadapelo fato de que contém, pelo menos, 80% de polipeptídeosde IL-7 N-glicosilados em, pelo menos, três resíduos deaminoácidos diferentes.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que contém entre 80% e 95% depolipeptídeos de IL-7 N-glicosilados em, pelo menos, trêsresíduos de aminoácidos diferentes.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2 ou 3,caracterizada pelo fato de que contém, pelo menos, 80% depolipeptídeos de IL-7 glicosilados em resíduos deaminoácidos diferentes, em número de três a oito, incluindoum sítio de O-glicosilação e até sete sítios de N-glicosilação.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que contém entre 80% e 95% depolipeptídeos de IL-7 glicosilados em resíduos deaminoácidos diferentes, em número de três a oito, incluindoum sítio de O-glicosilação e até sete sítios de N-glicosilação.

6. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que opolipeptideo de IL-7 é de seres humanos.

7. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 6, caracterizada pelo fato de que ossítios de glicosilação são aqueles naturalmente presentesna seqüência polipeptídica da IL-7 ou são criadosartificialmente.

8. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 7, caracterizada pelo fato de que opolipeptideo de IL-7 é de ser humano e em que os sítios deglicosilação são selecionados entre os resíduos de Asn dasposições 70, 91 e 116, ou de Thr da posição 110, ou aindade quaisquer dos sítios de glicosilação artificialmentecriados listados na Tabela 1 e, preferencialmente, naTabela 2, ou uma combinação deles.

9. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 7, caracterizada pelo fato de que osreferidos polipeptídeos de IL-7 contêm, ou sãoenriquecidos, em substituintes N-Iigados selecionadosentre:a) uma cadeia de açúcares típica de mamíferos,preferencialmente do tipo expresso por célulasCHO;b) uma cadeia de açúcares contendo uma cadeiacomplexa de N-carboidrato (por exemplo, umaestrutura biantenária ou triantenária),preferencialmente contendo muitas moléculas demanose e acetilglicosamina, bem como muitosresíduos terminais de ácido siálico;c) uma cadeia de açúcar sialilada por alfa-2,6-sialiltransferase ou alfa-2,3-sialiltransferase;e/oud) uma cadeia de açúcar sialilada apresentando entre-3 e 30, preferencialmente, entre 7 e 23 grupossialil-N-acetilgalactosamina.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que os referidos polipeptídeoscontêm, ou são enriquecidos em, cadeias de carboidratos O-ligados, com um resíduo de ácido siálico terminal.

11. Composição de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que as cadeias de carboidratoscontêm estruturas variando de tetrantenária a biantenária,com sialilação terminal completa ou parcial,preferencialmente uma estrutura triantenária e tri- ou bi-sialilação e/ou uma estrutura diantenária com di-sialilação.

12. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 11, caracterizada pelo fato de que osreferidos polipeptideos de IL-7 possuem ponto isoelétricomédio inferior a 6,5 e peso molecular aparente médiosuperior a 25kDA determinado por espectrometria de massas,ou peso molecular médio superior a 27kDa determinado poreletroforese em gel SDS.

13. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 12, caracterizada pelo fato de que osreferidos polipeptideos de IL-7 hiperglicosilada apresentammeia-vida e tempo de residência médio maiores, emmamíferos, in vivo.

14. Polipeptideo de IL-7, caracterizado pelo fato de quepossui uma seqüência modificada de aminoácidos, a qual écontém, pelo menos, um sítio de glicosilaçãoartificialmente criado.

15. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que contém um, dois, três ouquatro sítios de glicosilação artificialmente criados,preferencialmente um, dois ou três e, particularmente, um 1ou dois 2.

16. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 14 ou 15,caracterizado pelo fato de que contém a seqüência de umpolipeptídeo de IL-7 de seres humanos, o qual écaracterizado por possuir uma ou várias modificações nosaminoácidos selecionadas entre Lys28Asn - Ile30SerIle30Thr - Ile30Asn - Ser32Thr - Leu35Ser - Leu35Thr -Glu38Ser - Glu38Thr - Phe39Ser - Phe39Thr - Phe42Ser -Phe42Thr - Glu52Ser - Glu52Thr - Val82Asn - Glu84Thr -Glu84Ser - Lys97Asn - Arg99Thr - Arg99Ser - Alal02Asn -Leul04Thr - Leul04Ser - Leul04Asn - Glul06Thr - Glul06Ser -Leul28Ser - Leul28Thr - Ilel45Asn - Metl47Thr - Metl47Ser -Metl47Asn - Thrl49Ser, ou um fragmento característico delescontendo, pelo menos, cinco resíduos de aminoácidos,tipicamente pelo menos 8, 9, 10, 11, 12 ou 15 resíduos.

17. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fdatode que codifica o polipeptídeo de IL-7 como definido emqualquer uma das reivindicações 14 e 15.

18. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato deque codifica um polipeptídeo contendo a SEQ ID NO: 19.

19. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato deque contém a SEQ ID NO: 2 ou 4, ou uma fita complementardelas.

20. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato deque possui a seqüência de SEQ ID NO: 6.

21. Vetor, caracterizado pelo fato de que contém amolécula de ácido nucléico como definida em qualquer umadas reivindicações 17 a 20.

22. Célula hospedeira ou hospedeira recombinante,caracterizada pelo fato de que possui o vetor como definidona reivindicação 21.

23. Célula hospedeira ou hospedeira recombinante de acordocom a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de queexpressa ou superexpressa, naturalmente ou apóstransgênese, um gene de glicosiltransferase e/ousialiltransferase apropriado, preferencialmente um gene a-2-6-sialiltransferase.

24. Método de produção do polipeptideo de IL-7 comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16,caracterizado pelo fato de que compreende:a) cultivar uma célula hospedeira recombinante,possuindo uma molécula de ácido nucléicorecombinante que codifica um polipeptideo de IL-7; eb) isolar o polipeptideo de IL-7 produzido por estacélula;em que a cultura é feita em modo de batelada ou deperfusão, permitindo a produção de um polipeptideo deIL-7 hiperglicosilada.

25. Fármaco, caracterizado pelo fato de que contém acomposição de polipeptideo de IL-7 como definida emqualquer uma das reivindicações 2 a 16, em que o fármacocontém menos de cerca de 10% de um polipeptideo de IL-7monoglicosilada ou não-glicosilada e/ou essencialmenteisenta de impurezas relacionadas com o produto.

26. Anticorpo, bem como fragmentos ou derivados dele,caracterizado pelo fato de que é especificamenteimunoreativo a um polipeptideo de IL-7 como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 16.

27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato deque contém o anticorpo como definido na reivindicação 26.

28. Uso do anticorpo como definido na reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que é na fabricação de ummedicamento que trata desordens linfoproliferativas oudoenças auto-imunes em mamíferos.

29. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato deque contém uma quantidade eficaz do fármaco como definidona reivindicação 25, e um ou mais veículos ou excipientesfarmaceuticamente compatíveis.

30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a composição éadministrada três vezes por semana, duas vezes por semana,uma vez por semana, uma vez em semanas alternadas, uma vezpor mês, uma ou duas vezes antes de vacinação, ou antes eapós vacinação.

31. Uso da composição de polipeptideo de IL-7hiperglicosilada como definida em qualquer uma dasreivindicações 2 a 13, caracterizado pelo fato de que é nafabricação de um medicamento que provoca ou modula umaresposta imune no indivíduo.

32. Uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o medicamento se destina a induzir aestimulação de linfopoiese prolongada e/ou amplificar umaresposta imune.

33. Uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o medicamento se destina ao tratamento deuma infecção viral, como a infecção por HIV, hepatiteviral, febre do Nilo ocidental, dengue.

34. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o polipeptideo de IL-7 hiperglicosiladadeve ser administrado em associação com uma molécula deinterferon.

35. Uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o medicamento se destina a melhorar arecuperação timopoiética em indivíduos com o sistema imunecomprometido.

36. Uso de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que o polipeptideo de IL-7 hiperglicosiladadeve ser administrado em associação com um fator decrescimento de queratinócitos, um fator de célula-tronco,um antagonista da gonadoestimulina ou com um hormônio decrescimento.

37. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o polipeptideo de IL-7 hiperglicosiladadeve ser administrado em associação com um antigeno, oumistura de antigenos a fim de fornecer imunizaçãoterapêutica contra células malignas, virus ou bactéria.

38. Uso de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato de que o polipeptideo de IL-7 hiperglicosiladadeve ser administrado em associação com GM-CSF.