PT1904635E - Il-7 glicosilada, preparação e usos - Google Patents

Description

ΡΕ1904635 1 DESCRIÇÃO "IL-7 GLICOSILADA, PREPARAÇÃO E USOS" O presente invento está relacionado com novos polipéptidos de interleucina-7 melhorados, assim como composições compreendendo os mesmos, com a sua preparação e usos. Mais particularmente, o invento está relacionado com polipéptidos de IL-7 hiperglicosilados tendo propriedades melhoradas, assim como a sua produção e usos terapêuticos. São aqui descritos novos polipéptidos de IL-7 tendo sequências de aminoácidos modificadas contendo um ou mais locais de glicosilação criados artificialmente, assim como moléculas de ácido nucleico correspondentes, vectores e hospedeiros ou células hospedeiras recombinantes. É ainda descrita a utilização de tais polipéptidos, células ou ácidos nucleicos para o tratamento curativo ou preventivo de mamíferos, incluindo seres humanos.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Os linfócitos B e T são as principais células efectoras das respostas imunes. Ambas as classes de células são consideradas como derivadas em última instância de células hematopoiéticas estaminais na medula óssea de mamíferos, via células progenitoras ou precursoras representando fases distintas na diferenciação de cada 2 ΡΕ1904635 classe. As células T maduras desenvolvem-se principalmente no timo numa fase precoce do desenvolvimento dos linfócitos T. 0 desenvolvimento das células linfóides está dependente de factores de crescimento, sobrevivência e diferenciação produzidos por várias células do estroma. Uma série de factores estão activos nas células B e T maduras periféricas, incluindo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, interferão gama, BSF-2, neuroleucina, factor de crescimento transformante e IL-7. "Interleucina-7" ou "IL-7" refere-se a uma glicoproteina secretória endógena de mamífero que é capaz de induzir a proliferação de progenitores e precursores de linfócitos derivados da medula óssea, incluindo os precursores especializados conhecidos como células pré-B. Originalmente derivados do elemento estrómico de uma linha celular da medula óssea, IL-7 é igualmente secretada por células do estroma tímico, células intestinais e outras células epiteliais, algumas células dendríticas e células dendríticas foliculares, queratinócitos e, de um modo geral, todos os tecidos linfóides. Designações alternativas para esta molécula são "factor de crescimento de células pré-B" e "linfopoietina-1". EP0314415 (ou US4965195) descreve proteínas de interleucina-7 de mamífero e correspondentes DNAs. A sequência de aminoácidos de IL-7 humana possui três locais putativos de glicosilação ligada em N, situados nos resíduos Asn nas posições 70, 91 e 116. A expressão recom- 3 ΡΕ1904635 binante transitória de hIL-7 (IL-7 humana) em células COS permitiu a visualização de r-huIL-7 (IL-7 humana recom-binante) como três bandas proteicas de peso molecular aparente de aproximadamente 20, 24 e 28 kDa (Cosman et al., Lymphokine Receptor Interactions; 1989; 179:229-236). A expressão recombinante estável de hIL-7 em células BHK foi igualmente descrita (Armitage et al. ; The Journal of Immunology; 1990; 144:938-941). No entanto, o estado de gi icosilação de IL-7 humana natural, particularmente a 0-gi icosilação, nunca foi documentada ou estudada e o impacto do perfil de glicosilação nas propriedades de IL-7 nunca foi considerado. Ainda, a IL-7 humana madura não glico-silada (r-hIL-7) produzida em E. coli, como descrito em EP0314415, apresenta uma massa molecular de 17387 Daltons e demonstra uma elevada actividade in vitro em bioensaios específicos com base na proliferação de várias populações de linfócitos. Outras citocinas e factores de crescimento, tais como G-CSF, GM-CSF, IFN, HGF, etc, também apresentam actividade terapêutica total sem glicosilação. W02004/018681 descreve um confórmero activo de IL-7 humana, compreendendo as seguintes pontes dissul-fureto: 1-4 (C2-C92), 2-5 (C34-C129) e 3-6 (C47-C141), assim como métodos de produção ou caracterização do mesmo e suas utilizações. IL-7 foi originalmente descrita como uma citocina cuja principal actividade era a indução da proliferação de células B precursoras (Namen A.E. et al. ; Journal of 4 ΡΕ1904635

Experimental Medicine; 1988; 167:988-1002). IL-7 foi mais recentemente descrita como estando envolvida na sobrevivência e proliferação de timócitos (células T) durante a fase inicial do desenvolvimento das células T (Schluns K.S. et al. ; Nature Immunology; 2000; 1(5):426-432). A via de IL-7 é essencial para o desenvolvimento de linfócitos principalmente para o desenvolvimento de timócitos (Maeurer M.J. et al.; Int. Ver. Immunol.; 1998; 16:309-22 - Fry T.J. et al.; Blood; 2002; 99:3892-904). Fry e colaboradores ainda identificaram IL-7 como um potente modulador da regeneração de células T independentes do timo numa acção multifactorial (Fry T.J. et al. ; 2001; 97(6):1525-1533). IL-7 potencialmente modula as células T maduras e para além deste efeito nas células T maduras, IL-7 pode influenciar o desenvolvimento de células apresentadoras de antigénio (Marquez C. et al.; J. Exp. Med.,; 1995; 181:475-83). IL-7 é essencial para a regeneração das células T de memória, em ambas as sub-séries CD4+ e CD8+ (Kondrack R.M. et al.; J. Exp. Med.; 2003; 198:1797-806 - Kaech S.M. et al. ; Nat. Immunol.; 2003; 4:1191-8). IL-7 tem assim um grande potencial terapêutico para usar na estimulação da proliferação dos precursores das células T, de células B secretoras de anticorpos, na estimulação da expansão periférica de células T conduzida por antigénios e na produção de células T naive, assim como de outros tipos de células hematopoiéticas. Um uso terapêutico particularmente interessante das moléculas de IL-7 activas é para a reconstituição imune de doentes 5 ΡΕ1904635 linfopénicos: doentes tratados para um cancro, doentes que receberam medula óssea ou uma transferência de células estaminais, doentes que apresentam uma deficiência imune adquirida ou qenética, doentes idosos ou quaisquer doentes tendo uma contagem baixa de células CD4. Outras utilidades residem na capacidade de IL-7 para produzir novas células T CD4 naives ou para expandir lotes específicos de modo a produzir ou aumentar respostas imunes específicas (estimulação de vacinas).

Face aos seus potenciais terapêuticos, existe considerável interesse no desenvolvimento de polipéptidos IL-7 biologicamente activos ou melhorados que sejam adequados para utilizações terapêuticas eficientes. Neste aspecto, entre as várias citocinas e factores de crescimento comerciais, alguns são pouco imunogénicos (e.g., interferão alfa "IFNa", factor estimulador de colónias de granulócitos "G-CSF") de forma que os fármacos correspondentes não requerem uma pureza muito específica do polipéptido para além do nível convencional geralmente aceite para as proteínas recombinantes. Pelo contrário, outros factores de crescimento são mais imunogénicos (e.g., interferão beta "β-IFN", factor estimulador das colónias de granulócitos macrófagos "GM-CSF") ou a sua actividade específica é tão crítica para a vida (e.g., eritropietina "EPO") que a pureza e perfil da substância polipeptídica devem ser especificamente estudados e mantidos dentro de limites estreitos para os preservar da imunogenicidade. 6 ΡΕ1904635 IL-7 é uma molécula única. Devido às suas propriedades intrínsecas de estimulação imune, IL-7 usada como agente terapêutico é particularmente susceptível à indução de imunogenicidade anti-IL-7 (anticorpos de ligação ou neutralização anti-IL-7). Esta imunogenicidade é prejudicial para a actividade terapêutica a longo prazo da proteína. Os anticorpos anti-IL-7 podem modificar a farma-cocinética de IL-7 e neutralizar a sua actividade terapêutica. Várias isoformas de IL-7 estão envolvidas na indução da imunogenicidade anti-IL-7, entre as quais: sequências polipeptídicas alteradas (e.g., formas oxidadas, reduzidas, desamidadas ou truncadas), multímeros de IL-7 covalentes ou não covalentes, tais como moléculas de IL-7 agregadas e similares. Assim, é crítico definir polipé-ptidos de IL-7 e fármacos que sejam mais estáveis, menos susceptíveis à agregação intermolecular, menos imunogénicos e ainda biologicamente activos. De facto, ainda que a actividade da maioria dos fármacos esteja correlacionada com o parâmetro AUC, a actividade de IL-7 está correlacionada com o parâmetro da semi-vida e mais particularmente com o tempo de residência médio.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento descreve novos polipéptidos, fármacos e composições de interleucina-7 melhorados. Mais particularmente, o invento descreve novas espécies mole- 7 ΡΕ1904635 culares de IL-7 tendo um elevado grau de glicosilação e um perfil de oligossacáridos desviados para uma massa molecular maior, com mais sialilação e fucosilação dos grupos de açúcar e um ponto isoeléctrico mais baixo. 0 invento mostra que estes novos perfis de oligossacáridos conferem maior estabilidade química e farmacêutica a estes novos fármacos e um perfil farmacocinético prolongado após administração in vivo, caracterizado por um maior tempo de residência médio (MRT), permitindo um regime de dosagem menos frequente. O presente invento proporciona assim novos poli-péptidos IL-7 altamente glicosilados ou hiperglicosilados tendo propriedades melhoradas. Descrevem-se polipéptidos IL-7 tendo sequências de aminoácidos modificadas, possuindo um ou mais locais de glicosilação artificialmente criados, assim como as correspondentes moléculas de ácido nucleico, vectores e hospedeiros ou células hospedeiras recombi-nantes. É ainda descrita a utilização de tais polipéptidos, células ou ácidos nucleicos para o tratamento curativo ou preventivo de mamíferos, incluindo seres humanos. O presente invento descreve assim novos polipéptidos IL-7 activos, fármacos e composições farmacêuticas, as quais apresentam maior estabilidade, susceptibilidade reduzida à proteólise e agregação, melhor actividade in vivo a longo prazo e imunidade reduzida, permitindo assim que sejam geradas melhores respostas imunes globais ou específicas em mamíferos. 8 ΡΕ1904635

Um objectivo deste invento reside numa composição de IL-7 hiperglicosilada.

Um outro objectivo deste invento reside num polipéptido IL-7 hiperglicosilado purificado.

Tal polipéptido IL-7 hiperglicosilado possui pelo menos três resíduos de aminoácidos N-glicosilados.

Um outro objectivo deste invento está relacionado com a utilização de IL-7 hiperglicosilada para a produção de um medicamento consistindo na referida IL-7 hiperglicosilada e num excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de um mamífero.

Um outro objectivo deste invento está relacionado com a utilização de uma composição de IL-7 hiperglicosilada para a produção de um medicamento para o tratamento de um mamífero. É ainda descrito um método para induzir ou estimular uma resposta imune num indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição de IL-7 hiperglicosilada. É ainda descrito um método para a potenciação da expansão ex-vivo das células T, este método compreendendo o contacto das células T com um polipéptido ou composição de IL-7 hiperglicosilada, aumentando assim a expansão das células T. 9 ΡΕ1904635

Numa realização particular, a composição de IL-7 hiperglicosilada é uma composição compreendendo pelo menos 80%, de preferência entre 80% e 95%, dos polipéptidos IL-7 glicosilados em pelo menos três resíduos de aminoácido distintos. Tais resíduos podem estar naturalmente presentes dentro de uma sequência do polipéptido IL-7 e/ou serem criados artificialmente locais de glicosilação.

Numa realização particular, a composição de IL-7 hiperglicosilada é uma composição compreendendo pelo menos 80%, de preferência entre 80% e 95%, de polipéptidos IL-7 que estão glicosilados em três a oito resíduos de aminoácidos distintos, incluindo um local de O-glicosilação e até sete locais de N-glicosilação. Tais resíduos podem estar naturalmente presentes dentro de uma sequência do polipéptido IL-7 e/ou serem locais de glicosilação criados artificialmente.

Neste contexto, um outro objectivo deste invento está relacionado com polipéptidos IL-7 tendo uma sequência de aminoácidos modificada, em que a referida sequência compreende pelo menos um local de glicosilação criado artificialmente. De acordo com realizações particulares, os polipéptidos IL-7 deste invento compreendem 1, 2, 3 ou 4 locais de glicosilação criados artificialmente, mais de preferência 1, 2 ou 3/ mesmo mais de preferência 1 ou 2. Como será ainda discutido, os locais de glicosilação artificialmente criados são, de preferência, locais de 10 ΡΕ1904635 glicosilação ligada em N. Os polipéptidos de IL-7 deste invento podem ser de mamífero de qualquer origem, particularmente de origem humana. Ainda, tais polipéptidos de IL-7 podem compreender a sequência de um polipéptido de IL-7 madura ou ainda compreender resíduos de aminoácidos adicionais, tais como um péptido de secreção, por exemplo. Ainda, ou em alternativa, o polipéptido de IL-7 é, de preferência, um confórmero específico compreendendo as três pontes dissulfureto seguintes: Cys:l-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-129); 3-6 (Cys47-Cysl41). Exemplos específicos de tais polipéptidos de IL-7 modificados compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido como descrito na Tabela 1 abaixo ou uma combinação dos mesmos. É ainda descrita uma molécula de ácido nucleico codificador de um polipéptido IL-7 como descrito atrás. A molécula de ácido nucleico pode ser qualquer molécula de DNA ou de RNA, tipicamente uma molécula de cDNA.

Descreve-se uma molécula de ácido nucleico codificadora de um sinal de secreção compreendendo SEQ ID NO:19.

Descreve-se um vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico como definido atrás. 0 vector pode ser qualquer vector procariótico ou eucariótico, tipicamente um vector eucariótico e pode ser seleccionado de um plasmídeo, DNA epissómico, cosmídeo, vector virai, cromossoma artifical, etc. 0 vector pode compreender qualquer sequên- 11 ΡΕ1904635 cia reguladora que permita a expressão correcta do ácido nucleico codificador numa célula hospedeira seleccionada, e.g., um promotor, terminador, poliA, origem de replicação, região homóloga, intrão, regiões não traduzidas 5' ou 3' (UTR) de genes, etc.

Os ácidos nucleicos e vectores atrás referidos podem ser usados, por exemplo, para produzir polipéptidos de IL-7 recombinantes de mamífero em várias células hospedeiras competentes, assim como para fins de terapia génica. É ainda descrito uma célula hospedeira recombi-nante compreendendo um ácido nucleico ou um vector como descrito atrás. Tal célula recombinante pode ser proca-riótica ou, mais de preferência, uma célula hospedeira recombinante transduzida para expressar ou expressar excessivamente um gene de glicosiltransferase e/ou de 2-6-sialiltransferase, e.g., de origem humana.

Descreve-se um fármaco compreendendo um polipéptido de IL-7 como atrás descrito, tipicamente um polipéptido de IL-7 hiperglicosilado. Mais de preferência, o fármaco contem menos de aproximadamente 10% de polipéptido IL-7 não glicosilado ou monoglicosilado e/ou essencialmente não contém impurezas relacionadas com o produto.

Descreve-se a utilização de um fármaco como atrás descrito na produção de um medicamento ("fármaco") ou composição farmacêutica. 12 ΡΕ1904635 O invento ainda está relacionado com uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido IL-7 ou composição ou fármaco como descrito atrás e um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Um outro aspecto deste invento é um método de produção de um polipéptido IL-7 como atrás descrito, a partir de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, assim como um método de detecção ou medição da presença de tal polipéptido IL-7 numa amostra, ou para caracterizar uma amostra.

Num aspecto particular, o método de produção de um polipéptido IL-7 como definido atrás compreende: a) cultura de uma célula hospedeira recombinante como definido atrás e b) colheita do polipéptido IL-7 produzido a partir da referida célula.

De acordo com uma realização preferida, a expressão é realizada em condições que permitem glicosilação eficiente de motivos a serem adicionados ao polipéptido IL-7, em particular resíduos de ácido siálico.

Numa outra realização preferida, a produção é realizada num modo de "fed-batch" (suplementação contínua 13 ΡΕ1904635 de nutrientes) ou de perfusão, mantendo as células no final da fase de crescimento exponencial. Tais condições aumentam a qualidade de modificações pós-tradução e contribuem para um grau mais elevado de sialilação por polipéptidos de IL-7. De acordo com realizações particulares, o ácido nucleico codificador compreende um sinal de secreção e/ou uma sequência de ácido nucleico optimizada e/ou a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica (e.g., uma célula de mamífero ou de insecto ou de levedura).

Um outro objectivo do invento está relacionado com a utilização de um polipéptido IL-7 ou uma composição de IL-7 hiperglicosilada, como definido atrás ou obtida por um método como descrito atrás, para a produção de uma composição farmacêutica para induzir ou modular uma resposta imune num indivíduo, particularmente para induzir estimulação de linfopoiese prolongada e/ou para amplificar uma resposta imune. 0 invento também está relacionado com a utilização de um polipéptido IL-7 como definido atrás ou obtido por um método como descrito atrás, para a produção de uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença associada a uma imunodeficiência.

Como será descrito abaixo, os polipéptidos deste invento apresentam uma semi-vida e tempo de residência média no plasma prolongados, os quais favorecem a interacção e actividade de receptor in vivo, e/ou uma esta- 14 ΡΕ1904635 bilidade melhorada e/ou menor imunogenicidade a longo prazo, permitindo assim a sua utilização para tratar uma variedade de condições patológicas em mamíferos, particularmente em seres humanos.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1: Plasmídeo ph-pgk.EP7-hIL-7: efla pA: "sequência poli A do "factor de elon-gação 1 alfa"; hgh pA: sequência poli A da "hormona de crescimento humana"; SpA: sequência poli A sintética; hph: resistência à higromicina; Amp: resistência à ampicilina; MAR β-globina de coelho: "Região de ligação à matriz" putativa da β-globina de coelho; pr.tk: promotor da cinase de timidina, sv40 enh.: estimulador de sv40; pr pgk: promotor da cinase de fosfoglicerato; 5'UTRIntl: região não traduzida 5' compreendendo um intrão quimérico (hBglobina-imunoglobulina); EP7-hIL7: cDNA de IL-7 humana optimizado a montante do péptido sinal EP7.

Figura 2: Plasmídeo pBh-pgk.EP7-hIL-7:

Bcl2: cDNA de Bcl2; IRES: Local interno de entrada do ribossoma

Figura 3: Expressão de hIL-7 recombinante em células de mamífero cultivadas em bio-reactor desde o dia 1 (Dl) até ao dia 10 (D10) . Transferência Western de IL-7 intracelular versus IL-7 secretada. 15 ΡΕ1904635

Figura 4: fraccionamento cromatográfico de glico-formas de rec-hIL-7 através do processo de purificação: análise por SDS-PAGE do teor proteico nas diferentes fracções de eluição (B1-B10). As glicoformas de IL-7 foram separadas durante os passos de captura e de HIC. Usaram-se gradientes de tampões de forma a eluir diferencialmente as glicoformas de hIL-7 de acordo com as suas propriedades fisico-quimicas ligeiramente diferentes. 0 fraccionamento e subsequente selecção da fracção adequada permitiram um enriquecimento da IL-7 recombinante totalmente glicosilada (3N ou 2N associado com o açúcar 10) . MWM, marcadores de massas moleculares (10/ 15/ 20/ 25/ 37/ 50/ 75/ 100/ 150/ 250 kDa)/ B1-B10, fracções e eluição/ B1-B4, fracções de eluição guardadas para posterior purificação/ CT, fracção BI obtida a partir de uma cultura da linha celular HEK293 transfectada com o mesmo cDNA de hIL-7 optimizado.

Figura 5: Análises da hIL-7 recombinante purificada em SDS-PAGE. As amostras de hIL-7 recombinante purificada foram aplicadas em SDS-PAGE em condições redutoras. Os géis foram revelados por: A. Coloração com Coomassie B. Transferência Western MWM: marcadores de massa molecular (10/ 15/ 20/ 25/ 37/ 50/ 75/ 100/ 150/ 250 kDa). Pista 1: HG-37-147/ 16 ΡΕ1904635

Pista 2: HG-40-104; Pista 3: HG-hIL-7; Pista 4: E. coli hIL-7.

Figura 6: SDS-PAGE comparativo das massas moleculares aparentes dos produtos rec-hIL-7 glicosilados purificados.

Pista M = Marcador de massas moleculares, Pista 1 = representação esquemática do produto purificado como descrito por Namen et al. Na patente #US 5328988 (cerca de 25 kDa), Pista 2 = produto rec-sIL7 de CHO purificado pelo Requerente, Pista 3 = produto rec-hIL7 de CHO purificado pelo Requerente, Pista 4 = hIL-7 glicoformas ln e 2N como padrão para comparação da massa molecular aparente, Pista 5 = produto rec-hIL-7 de E. coli purificado pelo Requerente (CYT 99 007).

Figura 7: Análises de IL-7 humana recombinante purificada por SDS-PAGE em condições redutoras após desglicosilação.

Amostras de IL-7 humana recombinante glicosilada purificada foram digeridas por PNGase F: amostras de cinética entre 2 minutos e 24 h foram aplicadas no gel. Uma outra amostra (OO/N) foi digerida durante 24 h com PNGase F + O-glicosidase/β(1-4)galactosidase/neuraminidase/N-acetil-glucosaminidase. Como controlo, IL-7 humana glicosilada e IL7 humana de E. coli foram igualmente aplicadas no gel. IL-7 humana glicoformas 3N+10, 2N+10, 1N+10, 10 e 17 ΡΕ1904635 desglicosilada foram então separadas de acordo com a sua MM estimada no gel como 33, 27, 24, 18 e 17 kDa, respec-tivamente.

Figura 8: Análise do espectro de massa de diferentes glicoformas de rec-hIL-7 purificadas. - 23 kDa (23179 Da): Rec-hIL-7 (CHO S, 2N+3N) - 25 kDa (25127 Da): Rec-hIL-7 (CHO S,3N)

Figura 9: análise por electroforese 2D do polipéptido IL-7 humano hiperglicosilado recombinante purificado. Após isoelectrofocagem (gama de pH 3-10), as glicoformas foram separadas em SDS-PAGE em condições redutoras (coloração com azul Coomassie).

Figura 10: Análise do espectro de massa da complexidade de N-glicanos de hIL-7 recombinante. Amostras de hIL-7 glicosilada purificada foram digeridas enzimati-camente com uma endoglicosidase como seja péptido-N-glicosidase F (PNGaseF, Roche). Oligossacáridos ligados em N libertados, amostra de proteína libertada por digestão enzimática foram separados da estrutura peptídica e analisados por espectrometria de massa MALDI-TOF. Os valores m/z correspondendo a cada pico foram pesquisados contra bases de dados internacionais e permitiu a identificação precisa do painel de N-glicanos na molécula de hIL-7.

Figura 11: Caracterização de O-glicanos em hIL-7 18 ΡΕ1904635 recombinante, usando lectinas especificas (transferência de lectinas). Após separação das amostras proteicas e transferência para membrana, os produtos foram revelados com uma das duas lectinas (MAA, de Maackia amurensis, PNA, de Arachis hypogea) . Pista 1: padrão de proteína fetuina, uma proteína sialilada, Pista 2, fetuina tratada com uma sialidase, Pista 3, hIL-7, Pista 4, hIL-7 tratada com sialidase.

Figura 12: Afinidade para lectinas do polipéptido IL-7 hiperglicosilado (rastreio por ELISA) . Placas revestidas com lectinas (LEA de Lycopersicon esculentum, WGA de Triticum vulgare, UEA.I de Ulex europeus, MAA de Maackia amurensis, ACA de Amaranthus caudatus, AIA de Artocarpus intergrifolia, ABA de Agaricus bisporus, PHA.L de Phaseolus vulgarís) foram usadas para ligar quantidades idênticas de preparações de IL-7 recombinante purificada. Quantidades de IL-7 ligada, dependendo da especificidade de lectinas para os grupos de glicano, foram reveladas com um anticorpo (Ab) específico anti-hIL-7 acoplado a biotina. A sanduíche Lectina-IL-7-Ab foi revelada com um conjugado de estreptavidina-peroxidase.

Figura 13: Bioensaio da actividade de IL-7 humana recombinante. Cinéticas de dose-resposta do crescimento de células PB-1 induzido por r-IL-7 não glicosilado (expressa em E. coli) ou r-IL-7 altamente glicosilada (produzida em células de mamífero). 19 ΡΕ1904635

Figura 14: Bioensaio da actividade de IL-7 humana recombinante. Os dados das cinéticas de dose-resposta e as curvas obtidas de rotina num bioensaio típico: o crescimento de células PB-1 foi induzido por r-hIL-7 não gi icosilado (expresso em E. coli), r-IL-7 altamente glicosilado ou hiperglicosilado (produzido em células de mamífero). (Os pontos dos dados representam a média ± DP de determinações em triplicado).

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento está relacionado com composições de IL-7 hiperglicosilada, sua produção e suas utilizações na indústria farmacêutica. O presente invento, pela primeira vez, mostra que a actividade e/ou propriedades de IL-7 podem ser estimuladas dependendo do perfil de glicosilação do polipéptido. O presente invento também descreve, surpreendentemente e contrariamente aos dados in vitro, que a melhor actividade in vivo pode ser conseguida com polipéptidos de IL-7 tendo pelo menos 2 a, preferencialmente, 3 locais de glicosilação em N ocupados e um local de glicosilação ligado em 0 e sialilação terminal maximizada dos grupos de oligossacárido. 0 presente invento também descreve polipéptidos IL-7 hiperglicosilados criados artificialmente, os quais apresentam actividade prolongada (permitindo assim uma frequência de administração reduzida) e/ou uma imunogenicidade a longo prazo diminuída. Considerando a utilidade de IL-7, tais polipéptidos e composições representam moléculas activas altamente 20 ΡΕ1904635 valiosas e úteis para usar na regulação de uma resposta imune num indivíduo, incluindo um ser humano.

Um primeiro objectivo deste invento reside assim numa composição de IL-7 hiperglicosilada.

Um outro objectivo deste invento está relacionado com a utilização de IL-7 hiperglicosilada para a produção de um medicamento consistindo na referida IL-7 hiperglicosilada e pelo menos um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de um mamífero. É ainda descrito um método para induzir ou estimular uma resposta imune num indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição de IL-7 hiperglicosilada.

Um outro objectivo deste invento está relacionado com a utilização de uma composição de IL-7 hiperglicosilada (e de preferência altamente sialilada) para a produção de um medicamento que induz ou estimula uma resposta imune num indivíduo.

Polipéptido IL-7

No contexto do presente invento, um "polipéptido IL-7" designa um polipéptido IL-7 de mamífero (e.g., humano, símio, bovino, equino, felino ou canino). Mais de 21 ΡΕ1904635 preferência, o polipéptido IL-7 é um polipéptido IL-7 humano, especialmente para usar como fármaco ou vacina. Como alternativa, especialmente para usar em experiências com primatas não humanos ou em aplicações veterinárias, o polipéptido IL-7 pode ser quaisquer outros polipéptidos IL-7 de mamífero, como seja um polipéptido IL-7 símio ou um polipéptido canino.

Os polipéptidos IL-7 humanos preferidos deste invento compreendem uma sequência de aminoácidos como descrito em EP 314 415 ou em W02004/018681 A2, assim como quaisquer variantes naturais e seus homólogos. A sequência de IL-7 humana está também disponível em bancos de genes. A proteína selvagem típica compreende 152 aminoácidos e, facultativamente, um resíduo de metionina N-terminal adicional (SEQ ID N0:1). As suas variantes incluem, mais de preferência, variantes alélicas naturais resultantes de polimorfismo natural, incluindo SNPs, variantes de "splicing", etc. numa realização específica, o termo polipéptido IL-7 pretende designar um polipéptido tendo a sequência de SEQ ID NO:l ou suas variantes naturais.

Numa outra realização, o polipéptido IL-7 é um polipéptido IL-7 canino. Neste contexto, o invento descreve, pela primeira vez, a sequência de uma polipéptido IL-7 isolado, o qual representa um outro objectivo deste pedido de patente. Em particular, o invento está relacionado com um polipéptido IL-7 compreendendo a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO:7, assim 22 ΡΕ1904635 como quaisquer variantes naturais, homólogos ou fragmentos distintos das mesmas. O termo "variantes" ou "homólogos" refere-se a polipéptidos que diferem de SEQ ID NO: 7 numa deleção, substituição ou adição de um ou de um número limitado de aminoácidos. De preferência, tais variantes ou homólogos apresentam uma percentagem de identidade que é superior a 85%, de preferência superior a 90%, de preferência superior a 95%, mais de preferência superior a 98% com SEQ ID NO:7. O polipéptido IL-7 usado no presente invento é, de preferência, uma IL-7 recombinante. O termo "recom-binante", como aqui usado, significa que o polipéptido é obtido ou derivado de um sistema de expressão recombinante, i.e., de uma cultura de células hospedeiras (e.g., microbianas ou de insecto ou vegetais ou de mamífero) ou de plantas ou animais transgénicos manipulados de forma a conterem uma molécula de ácido nucleico codificadora de um polipéptido IL-7. "Microbiano" refere-se a proteínas recombinantes produzidas em sistemas de expressão bacteria-nos. "Mamífero" refere-se a glicoproteínas recombinantes produzidas em sistemas de expressão de mamífero. Como será discutido abaixo, todas estas células hospedeiras deverão preferencialmente expressar, naturalmente ou após trans-génese, um gene de glicosiltransferase e/ou sialiltrans-ferase. O polipéptido de IL-7 pode ser também glicosilado através da utilização adequada, in vitro ou in vivo, de moléculas de glicosiltransferase e/ou sialiltransferase ou através do enxerto de estruturas de oligossacáridos. 23 ΡΕ1904635

Um exemplo especifico de um polipéptido IL-7 humano é um polipéptido de SEQ ID N0:1 compreendendo as pontes dissulfureto Cys2-Cys92; Cys34-Cysl29 e Cys47-Cysl41.

Igualmente, os polipéptidos IL-7 do presente invento podem compreender a sequência de um polipéptido IL-7 maduro ou ainda compreender resíduos de aminoácidos adicionais, tais como um péptido de secreção, por exemplo. Exemplos preferidos de tais péptidos de secreção incluem, sem limitações, um péptido sinal seleccionado do grupo consistindo do péptido sinal EPO, péptido sinal SEAP, péptido sinal IgGkappa, péptido sinal de lactotransfer-rina/vitronectina, péptido sinal VIP/vitronectina e péptido sinal de biscitostatina. A sequência destes péptidos sinal está descrita, respectivamente, em SEQ ID NO:13 a 18. Numa realização específica, o péptido sinal é uma construção híbrida preparada pelos inventores, entre sequências derivadas dos péptidos sinal EPO e IL-7. A sequência deste péptido sinal, designada EPy7 ou EP7, está descrita em SEQ ID NO:19 e representa um objectivo particular deste invento. IL-7 hiperglicosilada e composições

Dentro do contexto do presente invento, o termo "IL-7 hiperglicosilada" designa um polipéptido de IL-7 tendo pelo menos três locais de glicosilação ocupados, 24 ΡΕ1904635 i.e.f tendo pelo menos três resíduos de aminoácidos glicosilados.

Um "local de glicosilação" designa qualquer resíduo de aminoácido ou região num polipéptido que é sujeito a glicosilação, i.e., a ligação de uma estrutura de açúcar. Tais locais são tipicamente locais de N-glicosilação (i.e., qualquer resíduo de aminoácido ou região num polipéptido que permite a ligação de uma estrutura de açúcar através de ligação em N) e/ou locais de O-glicosilação (i.e., qualquer resíduo de aminoácido ou região num polipéptido que permite a ligação de uma estrutura de açúcar através de ligação em 0). As sequências de consenso para os locais de glicosilação são conhecidas per se na área. Como ilustração, um local de N-glicosilação de consenso tipicamente possui a seguinte estrutura: Asn-X-Ser/Thr, em que X é qualquer aminoácido excepto prolina. Como será descrito abaixo, tais locais de glicosilação podem estar naturalmente presentes dentro da sequência do polipéptido de IL-7 e/ou serem artificialmente adicionados ou criados dentro da referida sequência. 0 termo "composição de IL-7 hiperglicosilada" designa uma composição de IL-7 em que pelo menos 8 0% dos polipéptidos de IL-7 possui pelo menos três locais de glicosilação ocupados, i.e., tendo pelo menos três resíduos de aminoácidos glicosilados. De preferência, tal composição compreende pelo menos 80% de polipéptidos de IL-7 que são glicosilados, pelo menos, em três locais de N-glicosilação 25 ΡΕ1904635 e, facultativamente, num local de O-glicosilação. Tal composição, de preferência, não possui polipéptidos de IL-7 não glicosilados ou monoglicosilados e assim compreende no máximo 20% dos polipéptidos de IL-7 biglicosilados. Numa realização preferida, uma composição de IL-7 hiperglicosi-lada designa uma composição de IL-7 em que pelo menos 90% dos polipéptidos de IL-7 são glicosilados em pelo menos três locais de glicosilação e, facultativamente, num local de O-glicosilação. Tal composição, de preferência, essencialmente não compreende polipéptidos IL-7 não glicosilados ou monoglicosilados e, assim, compreende no máximo 10% de polipéptidos de IL-7 bi-N-glicosilados com ou sem mono-O-glicosilados. A sequência de aminoácidos primária de IL-7 compreende três locais de N-glicosilação putativos, nomeadamente os resíduos de Asparagina (Asn) nas posições 70, 91 e 116 (relativamente à sequência selvagem humana, ver SEQ ID N0:1). Ainda, o presente invento mostra que a sequência de IL-7 também possui um local de O-glicosilação, nomeadamente o resíduo Treonina (Thr) na posição 110. Numa realização particular, um polipéptido de IL-7 hiperglico-silado do presente invento é um polipéptido de IL-7 tendo os três locais de N-glicosilação ocupados associados ou não a um local de O-glicosilação ocupado e uma composição de IL-7 hiperglicosilada é uma composição de IL-7 em que pelo menos 80% dos polipéptidos de IL-7 são glicosilados nos locais de N-glicosilação atrás referidos e, facultativamente, também no local de O-glicosilação. 26 ΡΕ1904635

Numa realização particular, um polipéptido de IL-7 hiperglicosilado pode compreender locais de glicosilação adicionais, adicionados ou criados artificialmente. Assim, um polipéptido de IL-7 hiperglicosilado do presente invento é um polipéptido de IL-7 tendo pelo menos três locais de N-glicosilação e um local de O-glicosilação ocupado, os referidos locais sendo naturais e/ou adicionados/criados artificialmente; e uma composição de IL-7 hiperglicosilada é uma composição de IL-7 em que pelo menos 8 0% dos polipéptidos de IL-7 são glicosilados em pelo menos quatro locais de glicosilação, os referidos locais sendo naturais e/ou adicionados/criados artificialmente.

Neste contexto, o presente invento descreve agora os polipéptidos de IL-7 tendo uma sequência de aminoácidos modificada, em que a referida sequência compreende pelo menos um local de glicosilação artificialmente criado. De acordo com realizações particulares, os polipéptidos de IL-7 deste invento compreendem 1, 2, 3 ou 4 locais de glicosilação criados artificialmente, mais de preferência 1, 2 ou 3; mesmo mais de preferência 1 ou 2.

Os locais de glicosilação criados artificialmente são, de preferência, locais de glicosilação ligados em N. Os locais de N-glicosilação de consenso tipicamente possuem a seguinte estrutura: Asn-X-Ser/Thr, em que X é qualquer aminoácido excepto Prolina. 27 ΡΕ1904635

Os locais de glicosilação podem ser criados ou adicionados quimicamente a partir de oligonucleótidos sintéticos montados ou usando várias técnicas incluindo métodos de mutagénese em várias posições dentro da sequência de aminoácidos primária de IL-7 e seguindo técnicas conhecidas per se na área. Devido ao polipéptido IL-7 modificado dever manter a capacidade de se ligar a um receptor de IL-7, o ou os locais de glicosilação são, de preferência, criados dentro de uma ou mais regiões ou domínios da sequência polipeptídica de IL-7 que não altera a capacidade de IL-7 se ligar a um receptor de IL-7. Mais de preferência, o ou os locais são introduzidos fora das hélices alfa do polipéptido, de preferência excepto na proximidade imediata dos resíduos de glicina. De preferência, eles são introduzidos na região mais flexível, evitando regiões que são mais rígidas e importantes para a estrutura terciária do polipéptido. De preferência, a criação de um local de glicosilação não afecta qualquer resíduo de Cisteína envolvido numa ponte dissulfureto (e.g., Cys 2, 34, 47, 92, 129 e 141), nem qualquer resíduo crítico envolvido na interacção do polipéptido de IL-7 com o seu receptor cognato (e.g., Ser 19, Leu 23 e 77, Tyr 12, Vai 15, Gin 22, Lys 81 e Glu 84) nem qualquer resíduo conservado envolvido na actividade do polipéptido (e.g., Arg 133, Gin 136, Glu 137, Lys 139 e 144, Thr 140 e Asn 143). Os locais de glicosilação são tipicamente criados por mutação, deleção ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos dentro da sequência primária de um polipéptido IL-7 de referência, para criar um local de glicosilação de consenso típico. 28 ΡΕ1904635

Numa realização particular, o presente invento está relacionado com polipéptidos IL-7 compreendendo a sequência de um polipéptido IL-7 humano (ou de mamífero) compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos seleccionadas entre Lys28Asn - Ile30Ser - Ile30Thr - Ile30-Asn - Ser32Thr - Leu35Ser - Leu35Thr - Glu38Ser - Glu38Thr - Phe39Ser - Phe42Ser - Phe42-Thr - Glu52Ser - Glu52Ser -Glu52Thr - Val82Asn - Glu84Thr - Glu84Ser - Lys97Asn -Arg99Thr - Arg99Ser - Alal02Asn - Leul04Thr - Leul04Ser -Leul04Asn - Glul06Thr - Glul06Ser - Leul28Ser - Leul28Thr -Ilel45Asn - Metl47Thr - Metl47-Ser - Metl47Asn - Thrl49Ser (ou de entre as correspondentes composições de outros polipéptidos IL-7 de mamífero).

Exemplos específicos de polipéptidos IL-7 (humanos) deste invento compreendem as modificações de aminoácidos descritas na tabela 1 abaixo:

Tabela 1

Análogo do polipéptido IL-7 Alterações de aminoácidos HG2 8a Lys28Asn; Ile30Ser HG2 8b Lys28Asn; Ile30Thr HG30 Ile30Asn; Ser32Thr HG33a Leu35Ser HG33b Leu35Thr HG3 6a Glu38Ser HG3 6b Glu38Thr 29 ΡΕ1904635 (continuação)

Análogo do polipéptido IL-7 Alterações de aminoácidos HG37a Phe39Ser HG37b Phe39Thr HG40a Phe42Ser HG4 0b Phe42Thr HG50a Glu52Ser HG50b Glu52Thr HG82a Val82Asn; Glu84Ser HG82b Val82Asn; Glu84Thr HG97a Lys97Asn; Arg99Ser Hg97B Lys97Asn; Arg99Thr HG102a Alal02Asn; Leul04Ser HG102b Alal02Asn; Leul04Thr HG104a Leul04Asn; Glul06Ser HG104b Leul04Asn; Glul06Thr HG12 6a Leul28Ser HG12 6b Leul28Thr HG145a Ilel45Asn; Metl47Ser HG145b Ilel45Asn; Metl47Thr HG147 Metl47Asn; Thrl49Ser

As modificações de aminoácidos atrás descritas criam locais de N-glicosilação sem alteração substancial da afinidade de ligação de IL-7, criando assim polipéptidos IL-7 melhorados de acordo com o presente invento. 0 termo "sem alteração substancial da afinidade 30 ΡΕ1904635 de ligação" significa que a afinidade de ligação não é alterada ou pode ser reduzida sem impacto nos efeitos in vivo resultantes da interacção com o receptor. Quando quantificada in vitro, a afinidade de ligação pode ser reduzida em menos de 50%, de preferência menos de 40%, de preferência menos de 30%, de preferência menos de 20%, de preferência menos de 5%.

Igualmente, as modificações atrás referidas podem ser combinadas para criar vários locais de glicosilação adicionais dentro do polipéptido IL-7 deste invento. Neste contexto, o invento está relacionado com qualquer polipéptido IL-7 biologicamente activo tendo a sequência primária de interlecuina-7 (humana ou de mamífero) modificada pela adição de pelo menos um a quatro locais adicionais de glicosilação (ligada em N) . Uma outra realização preferida deste invento é um polipéptido de IL-7 biologicamente activo compreendendo a sequência primária de interleucina-7 compreendendo um ou dois locais adicionais de glicosilação (ligada em N).

Os polipéptidos IL-7 mais preferidos deste invento são biologicamente activos, i.e., eles são capazes de se ligar a um receptor de interlecuina-7 e mostram actividade in vivo num bioensaio especifico e/ou possuem um tempo médio de residência (MRT) aumentado in vivo. A comparação das actividades entre o padrão não glicosilado e a IL-7 hiperglicosilada foi avaliada num 31 ΡΕ1904635 estudo de bioensaio de dose/resposta em que um valor de ED50 corresponde a uma dose igual a metade da actividade máxima. A hiperglicosilação, geralmente conduz a um decréscimo de actividade no bioensaio, o qual não se traduz num decréscimo da actividade in vivo. Na presente situação, o perfil cinético prolongado de facto melhorará a actividade in vivo.

Apesar do facto de ED50 não reflectir a actividade da IL-7 in vivo, permite a comparação entre diferentes amostras com o mesmo nível de glicosilação. Neste contexto, valores de ED50 típicos para um padrão não glicosilado variaram entre 0,5 e 2,0 nh de IL-7/ml, enquanto os valores de ED50 para a forma hiperglicosilada variaram entre 1,5 e 3,5 de IL-7 hiperglicosilada/ml.

Os polipéptidos IL-7 hiperglicosilados do invento mostram uma melhor estabilidade e uma semi-vida e tempo de residência média prolongados in vivo em hospedeiros mamíferos. O termo "estabilidade melhorada", "semi-vida e tempo de residência média prolongados" deve ser entendido em comparação com formas não glicosiladas. De preferência, o aumento da semi -vida é de pelo menos cerca de 3x, de preferência pelo menos cerca de 5 a 20x. 0 tempo de residência média (MRT) significa a média do tempo de

residência de cada molécula de IL-7 no sangue de doentes após administração da dosagem inicial. De preferência, o aumento de MRT é pelo menos cerca de 2x, ou de preferência pelo menos cerca de 4 a lOx comparado com as formas de MRT 32 ΡΕ1904635 não glicosiladas. Por exemplo, a semi-vida plasmática da forma hiperglicosilada calculou-se como sendo na gama de 30 a 40 horas, enquanto a semi-vida plasmática da forma não glicosilada é geralmente entre 5 e 8 horas (quando ambas as formas são administradas nas mesmas condições, i.e. numa injecção, subcutaneamente). O tempo de residência média (MRT) foi cerca de 40 horas versus cerca de 10 horas com a forma não glicosilada.

Deverá ser entendido que o invento também inclui qualquer fragmento distintivo de um polipéptido IL-7 deste invento, i.e., qualquer fragmento compreendendo uma modificação de aminoácido como descrito atrás, ou qualquer fragmento compreendendo um local de glicosilação criado artificialmente como descrito atrás. Tais fragmentos tipicamente possuem pelo menos 5 resíduos de aminoácidos, tipicamente pelo menos 8, 9, 10, 11, 12 ou 15 resíduos e podem conter até 20, 30, 40, 50 ou mais resíduos de aminoácidos consecutivos. Tais fragmentos podem ser usados como antagonistas ou como imunogénios para gerar anticorpos específicos.

Igualmente, apesar das posições de aminoácidos atrás referidas terem sido dadas como referência da sequência do polipéptido IL-7 humano, deverá ser entendido que o presente invento também inclui polipéptidos « IL-7 tendo a sequência primária de IL-7 de mamífero modificada por mutações homólogas em sequências de mamífero baseadas no alinhamento de sequências contra a sequência humana. 33 ΡΕ1904635

Uma realização preferida deste invento está relacionada com novos polipéptidos IL-7 biologicamente activos compreendendo uma ou várias modificações de aminoácidos seleccionadas do grupo consistindo em:

Phe39Ser - Phe39Thr - Phe42Ser - Phe42Thr - Leul04Asn -Glul06Thr - Glul06Ser - Leul28Ser - Leul28Thr - Metl28Thr -Metl47Asn e uma combinação do mesmo ou um seu fragmento distintivo.

Os polipéptidos de IL-7 modificados mais preferidos deste invento estão descritos na Tabela 2 abaixo:

Tabela 2

Análogo do polipéptido IL-7 Alterações de aminoácidos HG37a Phe39Ser HG37b Phe39Thr HG40a Phe42Ser HG4 0b Phe42Thr HG104a Leul04Asn; Glul06Ser HG104b Leul04Asn; Glul06Thr HG12 6a Leul28Ser HG12 6b Leul28Thr HG147 Metl47Asn; Thrl49Ser

Um outro objectivo particular deste invento é um 34 ΡΕ1904635 polipéptido IL-7 hiperglicosilado compreendendo uma sequência de aminoácidos primária como descrito atrás.

Unidades de oligossacáridos A estrutura e o número de unidades de oligossacáridos ligados a um local de glicosilação particular num polipéptido IL-7 hiperglicosilado deste invento pode ser variável. Estes podem ser, por exemplo, N-acetilgluco-samina, N-acetilgalactosamina, manose, galactose, glucose, fucose, xilose, ácido glucurónico, ácido idurónico e/ou ácidos siálicos.

Mais de preferência, os polipéptidos IL-7 hiper-glicosilados compreendem (ou são enriquecidos em) cadeias de açúcar ligadas em N e/ou ligadas em O seleccionadas entre: a) Uma cadeia de açúcar tipo mamífero, de preferência do tipo expresso pelas células CHO; b) uma cadeia de açúcar compreendendo uma cadeia de N-açúcar complexa (e.g., uma estrutura triantenária ou biantenária), mais de preferência contendo moléculas de manose e de acetilglucosamina elevadas e resíduos de ácido siálico terminal elevados; c) uma cadeia de açúcar compreendendo uma cadeia de O-açúcar sem e, de preferência, com um resíduo de ácido siálico terminal; 35 ΡΕ1904635 d) uma cadeia de açúcar sialilada por alfa2,6-sialiltransferase ou alfa2,3-sialiltransferase; e/ou e) uma cadeia de açúcar sialilada apresentando entre 3 e 30 sialil-N-acetilgalactosamina, de preferência 7 a 23.

Cadeias de açúcar particularmente preferidas compreendem uma estrutura triantenária ou biantenária com sialilação terminal parcial ou completa. Ainda, cadeias de açúcar preferidas compreendem estruturas triantenárias e tri ou bi-sialilação e/ou uma estrutura diantenária com disialilação. Exemplos de tais açúcares estão descritos na Tabela 4, incluindo os motivos #2420, 2623, 2785 e 3092.

De acordo com uma outra realização especifica, o polipéptido interleucina-7 hiperglicosilada deste invento possui um ponto isoeléctrio médio inferior a 6,5 e uma massa molecular média aparente superior a 27 kDa, entre 28 kDa e 65 kDa (teórico para uma glicosição 7N + 10) , de preferência entre 28 kDa e 35 kDa (como se mostra para uma glicosilação 3N+10), por electroforese em gel (confirmado por transferência Western) que é traduzido em 25 kDa por análise de espectrometria de massa.

Numa realização particular, o polipéptido de IL-7 hiperglicosilado deste invento é produzido por um mutante de glicosilação de mamífero que expressa estavelmente a2,6 36 ΡΕ1904635 sialiltransferase e apresenta uma deficiência em actividade de hidrolase CMP-Neu5Ac, de preferência um mutante de glicosilação CHO. Tal glicosilação tipicamente inclui N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, manose, galacto-se, glucose, fucose, xilose, ácido glucurónico, ácido idu-rónico e/ou ácidos siálicos.

Numa outra realização, o polipéptido IL-7 hiper-glicosilado é produzido por tecnologia recombinante numa célula hospedeira humana, o qual pode ser seleccionado de linhas celulares de estroma ou de epitélio humano, HEK-293 (Rim Embrionário Humano), HER (Retina Embrionária Humana), HEK (Queratinócitos Epidérmicos Humanos), timo humano ou linhas celulares de epitélio cortical humano, medula óssea humana ou linhas celulares do estroma de medula óssea humana.

Os polipéptidos de interleucina-7 hiperglico-silados mais preferidos deste invento apresentam as seguintes características: a) possuem perfil de secreção e velocidade de secreção melhoradas em linhas celulares produtoras recombinante/ e/ou b) possuem um elevado grau de resíduos de ácido siálico por polipéptido IL-7, conduzindo a decréscimo do valor do ponto isoeléctrico e a um tempo de residência médio melhorado; e/ou 37 ΡΕ1904635 c) estão protegidos da agregação inter-molecular; e/ou d) possuem susceptibilidade reduzida à proteó- lise; e/ou e) possuem locais antigénicos mascarados, reflec-tindo sensibilidade imunogénica reduzida, vulnerabilidade reduzida à captura por APC (células apresentadoras de antigénio), processamento e apresentação através da molécula MHCII; e/ou f) possuem estabilidade química aumentada; e/ou g) possuem uma semi-vida biológica prolongada in vivo (isoforma de IL-7 de acção prolongada) comparativamente com o péptido parental não glicosilado; e/ou h) possuem uma maior actividade farmacológica in vivo comparativamente com a proteína parental não glico-silada, principalmente devido a um melhor tempo de residência média (MRT); e/ou i) Permitem um esquema de dosagem menos frequente, de três/quatro vezes por semana para duas a uma vez por semana ou uma vez todas as duas semanas para os produtos de actuação mais prolongada; e/ou 38 ΡΕ1904635 j) apresentam um perfil farmacocinético melhorado (decréscimo da concentração no pico e melhor tempo de residência média) e/ou k) apresentam uma massa molecular média acima de 25 kDa como determinado por análise de espectrometria de massa ou 27 kDa conforme determinado por análise de SDS-PAGE e um ponto isoeléctrico médio abaixo de 6,5.

Os polipéptidos deste invento podem ser na forma de um monómero, ou associados ou complexados com um composto particular seleccionado. Neste contexto, numa realização particular, o confórmero de IL-7 está associado ao factor de crescimento de hepatócitos ("HGF"), como heterodimero. 0 heterodímero pode ser obtido quimicamente, através da complexação ou por tecnologia recombinante (i.e., por fusão genética).

Numa outra realização particular, o polipéptido IL-7 está funcionalmente ligado a uma porção Fc de uma cadeia pesada de IgG, tipicamente através de uma região peptidica de charneira. Tais moléculas de fusão possuem estabilidade e semi-vida in vivo potencialmente melhoradas. 0 grupo IgG é, de preferência, uma IgGl ou IgG4 humana.

Numa outra realização particular, o polipéptido IL-7 está funcionalmente associado a uma albumina sérica humana ("HSA") ou a uma porção de um HSA, como uma proteína de fusão. Tais moléculas de fusão possuem estabilidade e semi-vida in vivo potencialmente melhoradas. 39 ΡΕ1904635

Um outro objectivo deste invento é uma composição de IL-7 hiperglicosilado. Tais composições, de preferência, compreendem pelo menos 80%, de preferência entre 80% e 95%, dos polipéptidos IL-7 que são glicosiladas em pelo menos três residuos de aminoácidos distintos, os quais podem estar naturalmente presentes dentro de uma sequência do polipéptido IL-7 (e.g., locais de consenso para açúcares ligados em N e ligados em 0) e/ou em locais de glicosilação criados artificialmente como descrito atrás.

De acordo com realizações específicas particulares, o invento está relacionado com composições de IL-7 hiperglicosiladas compreendendo: a) Uma maioria (>80%, de preferência mais de 90%, mais de preferência mais de 95%) de interleucina-7 glicosilada nos 3 locais de consenso para açúcares ligados em N (Asn 70/91/116) e ainda glicosilado ou não no local do açúcar ligado em O (Thr 110); de preferência, a composição possui uma minoria (<20%, de preferência menos de cerca de 10%) de interleucina-7 glicosilada em apenas dois locais de consenso de açúcar ligado em N (associada ou não a um local de açúcar ligado em 0) e/ou essencialmente não possui proteína monoglicosilada ou não glicosilada; ou b) uma maioria (>80%, de preferência mais de 90%, mais de preferência mais de cerca de 95%) de um análogo de interleucina-7 biologicamente activo, tendo a sequência de 40 ΡΕ1904635 aminoácidos primária de IL-7 modificada para introduzir um local adicional de glicosilação, glicosilado em 4 locais de açúcares ligados em N e ainda glicosilado ou não em 1 local de açúcar ligado em 0 (Thr 110) ; de preferência, a composição possui uma minoria do mesmo análogo (<20%, de preferência menos de cerca de 10%) glicosilado em apenas 3 ou 2 locais de açúcar ligado em N (associados ou não a um local de açúcar ligado em 0) e/ou essencialmente não possui proteína monoglicosilada ou não glicosilada; ou c) uma maioria (>80%, de preferência mais de 90%, mais de preferência mais de cerca de 95%) de um análogo de interleucina-7 biologicamente activo, tendo a sequência de aminoácidos primária de IL-7 modificada para introduzir dois locais adicionais de glicosilação, glicosilado em 5 locais de açúcares ligados em N e ainda glicosilado ou não em 1 local de açúcar ligado em 0 (Thr 110); de preferência, a composição possui uma minoria do mesmo análogo (<20%, de preferência menos de cerca de 10%) glicosilado em apenas 4, 3 ou 2 locais de açúcar ligado em N, associados ou não a um local de açúcar ligado em 0, e/ou essencialmente não possui proteína monoglicosilada ou não glicosilada; ou d) uma maioria (>80%, de preferência mais de 90%, mais de preferência mais de cerca de 95%) de um análogo de interleucina-7 biologicamente activo, tendo a sequência de aminoácidos primária de IL-7 modificada para introduzir três locais adicionais de glicosilação, glicosilado em 6 locais de açúcares ligados em N e ainda glicosilado ou não 41 ΡΕ1904635 em 1 local de açúcar ligado em 0 (Thr 110); de preferência, a composição possui uma minoria do mesmo análogo (<20%, de preferência menos de cerca de 10%) glicosilado em apenas 5, 4, 3 ou 2 locais de açúcar ligado em N, associados ou não a um local de açúcar ligado em O, e/ou essencialmente não possui proteína monoglicosilada ou não glicosilada; ou e) uma maioria (>80%, de preferência mais de 90%, mais de preferência mais de cerca de 95%) de um análogo de interleucina-7 biologicamente activo, tendo a sequência de aminoácidos primária de IL-7 modificada para introduzir dois locais adicionais de glicosilação, glicosilado em 7 locais de açúcares ligados em N e ainda glicosilado ou não em 1 local de açúcar ligado em O (Thr 110); de preferência, a composição possui uma minoria do mesmo análogo (<20%, de preferência menos de cerca de 10%) glicosilado em apenas 6, 5, 4, 3 ou 2 locais de açúcar ligado em N, associados ou não a um local de açúcar ligado em 0, e/ou essencialmente não possui proteína monoglicosilada ou não glicosilada. 0 invento também está relacionado com composições farmacêuticas compreendendo as composições atrás referidas como a substância activa. Ácidos nucleicos É ainda descrita uma molécula de ácido nucleico codificadora de um polipéptido IL-7 como descrito atrás. A molécula de ácido nucleico pode ser qualquer molécula de DNA ou RNA, tipicamente uma molécula de cDNA. 42 ΡΕ1904635 É ainda especificamente descrito um ácido nucleico compreendendo resíduos de nucleótidos desde a posição 79 até ao FIM de SEQ ID NO:2, assim como fragmentos distintivos e a sua cadeia complementar.

Descreve-se um ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:4, assim como qualquer seu fragmento distintivo, variantes do mesmo (tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO:4) e a sua cadeia complementar.

Descreve-se um ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:6, assim como qualquer seu fragmento distintivo, variantes do mesmo (tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO:6) e a sua cadeia complementar. É ainda especificamente descrito um ácido nucleico compreendendo resíduos de nucleótidos desde a posição 79 até ao FIM de SEQ ID NO:6, assim como variantes do mesmo (tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 6) e a sua cadeia complementar. O invento também inclui um polipéptido codificado por tais sequências (e.g., SEQ ID NO:7). O termo "variante" como usado atrás relativamente a um ácido nucleico, mais especificamente designa uma sequência nucleotídica que híbrida com a sequência de referência em condições restringentes e/ou codifica um polipéptido tendo o mesmo tipo de actividade do polipéptido codificado pela sequência de referência. Variantes mais preferidas apresentam pelo menos entre 92 e 99% (e.g., 92%, 43 ΡΕ1904635 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade com a sequência de referência.

Um outro objectivo especifico deste invento é um ácido nucleico compreendendo a sequência de: CTG AAT AAC GAA ACT AAC SEQ ID NO:8 AAC TTC ACT AAG SEQ ID NO:9 GCC AAC GGT ACC SEQ ID NO:10 CTG AAC GAC AGC TGT SEQ ID NO:11 ou ATC TTG AAC GGG SEQ ID NO:12, ou uma combinação dos mesmos.

Exemplos específicos de ácidos nucleicos compreendem a sequência nucleotidica como descrito em qualquer uma de SEQ ID NOs: 8 a 12.

Descreve-se um vector de clonagem e/ou expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico como definido atrás. O vector pode ser qualquer vector procariótico ou eucariótico, tipicamente um vector eucariótico e pode ser seleccionado entre um plasmídeo, cosmídeo, vector virai, cromossoma artificial, etc. O vector pode compreender qualquer sequência reguladora que permita a expressão correcta do ácido nucleico codificador numa célula hospedeira seleccionada, e.g., um promotor, terminador, poli A, origem de replicação, região de integração (e.g., região homóloga), intrão, sequências UTR, gene marcador, etc. 44 ΡΕ1904635

Descreve-se um vector de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico como definido atrás, incluindo um péptido sinal, operacionalmente ligado a elementos reguladores permitindo a expressão do referido ácido nucleico num hospedeiro ou célula hospedeira de mamífero.

Elementos reguladores preferidos incluem um promotor, o qual pode ser seleccionado, sem limites, entre promotores virais, celulares e sintéticos, incluindo promotores constitutivos, específicos de tecidos ou regulados, em particular do grupo consistindo no promotor de CMV, promotor Elfa e promotor da metalotioneina. Ainda outros elementos reguladores que podem estar contidos nos vectores deste invento incluem, sem limitação, um gene Bcl-2, sequências UTR e sequências MAR.

Numa realização preferida, o vector é um vector de expressão epissómico.

Os ácidos nucleicos e vectores atrás referidos podem ser usados, por exemplo, para produzir polipéptidos IL-7 de mamífero recombinante em vários hospedeiros ou células hospedeiras competentes, assim como para fins de terapia génica. É ainda descrita uma célula hospedeira recombinante compreendendo um ácido nucleico ou um vector como 45 ΡΕ1904635 atrás descrito. Tal célula recombinante pode ser proca-riótica ou, mais de preferência, eucariótica, como seja, por exemplo, uma célula de levedura, insecto, planta ou de mamífero.

Numa realização preferida, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, de preferência seleccionada entre PERC6, células NSO e células BHK, de preferência células CHO; ou uma linha celular de mamífero. Os vectores, construções e células recombinantes serão descritos mais detalhadamente, mas sem lhe estar limitado, numa secção subsequente deste pedido de patente. Fármacos e composições farmacêuticas É ainda descrito um fármaco compreendendo, como produto pretendido, um polipéptido de IL-7 como descrito atrás, tipicamente um polipéptido de IL-7 hiperglicosilado. Mais de preferência, o fármaco possui menos de cerca de 10% de polipéptido IL-7 não glicosilado ou monoglicosilado e/ou essencialmente não possui impurezas relacionadas com o produto.

Uma substância fármaco como descrito atrás é útil na produção de um medicamento ("produto fármaco") ou composição farmacêutica.

Um fármaco preferido não possui impurezas substanciais relacionadas com o processo. 46 ΡΕ1904635

Dentro do contexto do presente pedido de patente, o termo "substância fármaco" refere-se a um produto adequado para usar como principio activo de um medicamento. A "substância fármaco" de acordo com este invento é, por natureza, um produto complexo, i.e., como resultado do seu método de produção (e.g., tecnologia de DNA recombinante). 0 presente invento descreve agora que, de forma a produzir efeitos terapêuticos eficientes e efeitos potenciadores de vacinas, uma substância fármaco de IL-7 ou composição farmacêutica deverá conter, como principal espécie molecular, uma composição de polipéptido IL-7 hiperglicosilado. 0 termo "substancialmente sem", como aqui usado, indica que a substância fármaco não possui quantidade significativa ou adversa de impurezas relacionadas com o produto e impurezas relacionadas com o processo. Mais especificamente, a substância fármaco deverá conter menos de 5%, mais de preferência menos de 3%, mesmo mais de preferência menos de 2% de impurezas relacionadas com o produto e impurezas relacionadas com o processo. As substâncias fármacos mais preferidas possuem menos de cerca de 1% de impurezas relacionadas com o produto e apenas quantidades vestigiais de impurezas relacionadas com o processo.

Substâncias relacionadas com o produto IL-7 47 ΡΕ1904635 designadas variantes moleculares de IL-7, as quais incluem, por exemplo, fragmentos de péptidos ou polipéptidos activos ou inactivos de IL-7. As impurezas relacionadas com IL-7 incluem, por exemplo, polipéptidos IL-7 humanos compreendendo pontes mono ou bissulfureto, IL-7 truncada, IL-7 recombinante desamidada, proteína dimérica ou multimérica compreendendo IL-7, forma de metionina oxidada ou uma combinação das mesmas.

Qualquer que seja a sua actividade biológica, estas variantes moleculares de IL-7 e impurezas relacionadas com IL-7 deverão ser estritamente minimizadas ou rejeitadas da substância fármaco.

As impurezas relacionadas com o processo incluem DNA, endotoxinas, detritos celulares, vírus, etc.

Uma substância fármaco preferida é assim uma substância fármaco em que a quantidade total por peso de uma composição de IL-7 hiperfosoforilada compreende pelo menos 95% por peso, de preferência pelo menos 98% por peso, mais de preferência pelo menos 99,5% por peso de uma composição de IL-7 hiperfosforilada de acordo com o invento. O invento também está relacionado com uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de uma substância fármaco ou composição de IL-7 hipergli-cosilada como descrito atrás e um ou mais veículos, 48 ΡΕ1904635 excipientes ou diluentes farmaceuticamente compatíveis ou aceitáveis. O invento mostra que as composições farmacêuticas compreendendo uma composição de IL-7 hiperglicosilada como descrito atrás claramente aumenta as propriedades de vacina de IL-7 e a sua capacidade para estimular respostas imunes específicas de antigénio. 0 veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente compatível ou fisiologicamente aceitável deve ser seleccionado entre soluções ou suspensões neutras ou ligeiramente acídicas, isotónicas, soro fisiológico tamponado e, mais de preferência, de entre sucrose, tre-halose e aminoácido. O veículo farmaceuticamente compatível está, de preferência, contido num tampão adequado para formar uma solução isotónica. Um tampão adequado tem, de preferência, uma gama de pH compreendida entre 4,5 e 7,5, de preferência entre 5,0 e 7,0, mesmo mais de preferência cerca de 5,5 e é, de preferência, um sal orgânico seleccionado entre um tampão citrato de sódio ou um tampão acetato de amónio. A composição farmacêutica pode ser na forma de uma suspensão, solução, gel, pó, sólido, etc. A composição é, de preferência, uma forma líquida. A composição pode compreender agentes estabilizadores, tais como açúcares, aminoácidos, proteínas, tensio-activos, etc. A composição pode compreender qualquer solução de soro fisiológico incluindo fosfatos, cloreto, etc. 49 ΡΕ1904635

Uma composição farmacêutica particular de acordo com o invento compreende, para além da substância fármaco activa, uma proteína e/ou um tensioactivo. Esta presença de uma proteína ou de qualquer outra molécula natural de massa molecular elevada, reduz a exposição de IL-7 ao sistema imunitário do hospedeiro e assim evita efeitos secundários. Mais de preferência, a proteína não é imunogénica no indivíduo, tal como qualquer proteína de origem humana. Um exemplo mais preferido de proteína é albumina sérica humana. O tensioactivo pode ser seleccionado entre tensio-activos conhecidos tais como produtos de polissorbato, de preferência Tween20™ ou Tween80™. Uma composição específica deste invento compreende albumina sérica humana (de preferência 2 a 5 mg/ml) ou polissorbato (Tween 20 ou 80 (tipicamente 0,005%)) ou qualquer outra substância como seja uma substância tensioactiva ou aminoácido (e.g., arginina, glutamato ou uma mistura de arginina e glutamato) ou açúcar (e.g., sucrose, tre-halose, sorbitol), capaz de impedir a imunogenicidade de IL-7 devido à agregação da proteína e/ou persistência localizada do produto fármaco no local de injecção após administração da composição.

Neste contexto, objectivos particulares deste invento residem em composições farmacêuticas contendo uma composição de interleucina-7 hiperglicosilada numa concentração de aproximadamente lmg/ml a 50 mg/ml, de preferência entre cerca de 3 mg/ml e 20 mg/ml. De preferência, a quantidade eficaz de interleucina-7 glicosilada a ser 50 ΡΕ1904635 administrada está compreendida entre cerca de 10 e 200 pg/kg/semana, de preferência entre cerca de 10 e 60 pg/kg/semana, e. g. , para tratamento ou prevenção doenças infecciosas.

Face às propriedades melhoradas dos polipéptidos composições deste invento, as composições farmacêuticas necessitam de ser administradas menos frequentemente que composições ou produtos anteriormente descritos, numa quantidade equivalente, para obter efeitos terapêuticos comparáveis. Mais especificamente, numa realização típica, as composições são administradas 3 vezes por semana, 2 vezes por semana, uma vez por semana, uma vez cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez ou duas vezes antes da vacinação ou antes e após a vacinação. Um regime de dosagem preferido consiste na administração da composição farmacêutica uma vez cada 7, 10 ou 14 dias.

As vias de administração preferidas são as vias parentéricas. A via parentérica é, de preferência uma administração intratumoral, mais de preferência intravenosa ou subcutânea. Inclui também injecções intra-arteriais, intraperitoneais ou intramusculares. Deverá ser entendido, no entanto, que qualquer outra via de administração adequada pode ser considerada, dependendo do estado de saúde e da reactividade do doente.

Numa realização particular, a via de administração é a via oral. Numa comparação com outras hormonas 51 ΡΕ1904635 polipeptídicas, a via oral é de facto aceitável para IL-7 hiperglicosilada devido à excepcional estabilidade desta proteína. As composições do invento são então, de preferência, numa forma sólida, como seja um comprimido ou um pó ou uma cápsula, ou na forma de um líquido, como seja um xarope ou uma emulsão, preparada num veículo farmaceu-ticamente aceitável adequado. De preferência, o próprio veículo é estável no trato gastrointestinal e no sistema circulatório e apresenta uma semi-vida aceitável no plasma. São vantajosas as cápsulas resistentes ao ácido gástrico, tais como cápsulas resistentes ao ácido gástrico contendo uma micro-emulsão ou uma formulação de lipossomas do polipéptido IL-7 hiperglicosilado. A composição farmacêutica pode compreender ingredientes activos adicionais, tais como agentes imuno-estimuladores, de preferência seleccionados de entre um factor de crescimento de células hematopoiéticas, uma cito-cina, uma molécula antigénica (ou antigénio) e um adjuvante, para a utilização combinada, separada ou sequen-ciada.

Tais ingredientes activos adicionais podem ser formulados em combinação com a IL-7 ou, separadamente, para uso combinado, separado ou sequenciado. Numa primeira variante, os ingredientes activos são formulados em conjunto, no mesmo recipiente ou vaso. Numa outra variante preferida, são condicionados separadamente, i.e., em vasos 52 ΡΕ1904635 ou recipientes distintos. De acordo com esta realização, os ingredientes podem ser administrados separadamente, e.g., simultaneamente ou sequenciadamente (e.g., em diferentes locais de injecção ou em diferentes pontos de tempo) para produzir o efeito biológico mais eficiente. Igualmente, como atrás referido, podem ser efectuadas administrações repetidas de um ou dos dois ingredientes activos.

Neste aspecto, o invento está relacionado com uma composição farmacêutica compreendendo uma composição de IL-7 hiperglicosilada como atrás descrito e um ingrediente activo seleccionado de uma molécula imuno-estimuladora e de uma molécula antigénica, para uso combinado, separado ou sequenciado. Os adjuvantes foram, de preferência, formulados separadamente. O factor de crescimento de células hematopoié-ticas é, preferencialmente, seleccionado de entre o Factor de Células Estaminais (SCF) , particularmente a forma solúvel do ligando SCF, G-CSF, GM-CSF, Flt-3, IL-15 e IL-2. Exemplos típicos de citocinas ou de quimiocinas para a estimulação de vacinas incluem citocinas que induzem e/ou estimulam uma resposta imune tipo Thl. A citocina é, de preferência, seleccionada entre interferão a ou γ, IL-2, IL-12, RANTES, B7-1, MIP-2 e ΜΙΡ-Ια. Deverá ser entendido que outros factores, tais como activadores de células NK e/ou activadores de células NKT, FGF7 ou FGF-10, interleucinas e/ou hormonas podem ser usados em combinação com IL-7 para proporcionar outros benefícios terapêuticos. 53 ΡΕ1904635

Uma composição especifica deste invento compreende uma composição de IL-7 hiperglicosilada como atrás descrito e o Factor de Células Estaminais, particularmente a sua forma solúvel, IL-15 e/ou ligando Flt-3 e/ou FGF-10.

Uma outra composição especifica deste invento compreende uma composição de IL-7 hiperglicosilada como atrás descrito e uma citocina seleccionada entre interferão α ou Y, IL-2, IL-12, RANTES e MlP-la.

Uma outra composição especifica deste invento compreende uma composição de IL-7 hiperglicosilada como atrás descrito, um Factor de Células Estaminais e uma citocina.

Como indicado atrás, a composição farmacêutica pode ainda compreender um ou vários antigénios (ou moléculas antigénicas), para utilização combinada, separada ou sequenciada. O antigénio pode ser qualquer péptido sintético ou natural, uma proteína recombinante, um agente patogénico morto, inactivado ou atenuado, um microrganismo, um parasita, um lípido, etc., uma porção do mesmo e uma sua combinação. 0 antigénio pode ser uma proteína completa ou um seu fragmento contendo um epitopo ou porção do mesmo, particularmente péptidos que são apresentados ao sistema imune através de moléculas MHC classe I ou de MHC classe II. O antigénio pode ser qualquer antigénio virai, antigénio bacteriano, antigénio de parasita, antigénio de 54 ΡΕ1904635 tumores, etc. Exemplos específicos de antigénios incluem antigénios derivados de HIV, vírus da Varicela Zoster, vírus da gripe, vírus de Epstein Barr, vírus Herpes simples tipo I ou II, citomegalovírus humano, vírus da Dengue, vírus da hepatite A, B, C, D ou E, vírus dos sincícios respiratórios, vírus do papiloma humano, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma e Chlamydia.

Um objectivo particular deste invento está relacionado com uma composição compreendendo uma composição de IL-7 hiperglicosilada como atrás descrito e uma molécula antigénica, para uso combinado, separado ou sequenciado. A composição pode ainda compreender um ou mais agentes imuno-estimuladores como descrito atrás, para o uso combinado, separado ou sequenciado.

Um outro objectivo particular do presente invento diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo a composição de IL-7 hiperglicosilada como atrás descrito, em que a referida composição farmacêutica é administrada simultaneamente, alguns dias antes ou após, com uma ou mais moléculas antigénicas, de forma a obter e/ou estimular uma resposta imune específica de antigénio num indivíduo. É ainda descrito um método para induzir ou estimular uma resposta imune especifica de antigénio num indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo do referido antigénio (ou um seu fragmento contendo um epitopo) e uma composição de IL-7 hiperglicosilada como 55 ΡΕ1904635 descrito atrás. A composição pode ser administrada simultaneamente, alguns dias antes ou após, mais de preferência antes, do referido antigénio de forma a obter e/ou estimular uma resposta imune especifica de antigénio num indivíduo.

Numa outra realização preferida, a composição do invento ainda compreende um adjuvante. 0 adjuvante pode ser seleccionado de qualquer substância, mistura, soluto ou composição que facilite ou aumente a imunogenicidade de um antigénio e capaz de induzir uma resposta imune tipo Thl, como seja CpG, Qs21, ISCOM e lípido A monofosforilado. Tais adjuvantes são particularmente adequados para produzir e/ou amplificar uma resposta imune específica contra antigénios em mamíferos, particularmente em humanos. O adjuvante é preferencialmente acondicionado e administrado separadamente relativamente à composição contendo IL-7 e/ou num local de injecção distinto, de preferência com o ou os antigénios pretendidos. O presente invento também diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de uma composição de IL-7 humana hiperglicosilada de acordo com o invento numa mistura com um diluente, excipiente ou veículo adequado, para administração parentérica a um doente humano para a estimulação, profiláctica ou terapêutica, do desenvolvimento e proliferação de linfócitos B ou T ou para o aumento de uma resposta imune. As composições farmacêuticas do invento induzem uma estimulação prolongada da linfopoiese e/ou respostas imunes amplificadas. 56 ΡΕ1904635

Uma composição farmacêutica de acordo com o invento pode também ser usada num doente humano para estimulação, profiláctica ou terapêutica, do desenvolvimento e proliferação de linfócitos B ou T, para estimular a reconstituição imune global e/ou especifica ou para estimular respostas imunes humorais e/ou celulares.

Uma composição farmacêutica particular de acordo com o invento é para usar na prevenção ou redução de infecções oportunistas em doentes imunodeficientes.

Uma outra composição farmacêutica particular de acordo com o invento é para usar no prolongamento da estimulação da linfopoiese e/ou para produzir resposta imune especifica, não só contra epitopos dominantes como também contra epitopos subdominantes ou menos imunogénicos, epitopos tendo uma menor afinidade para o receptor de células T, o que permitirá alargar o reportório de uma resposta imune especifica em doentes humanos. 0 invento é particularmente adequado para produzir uma resposta imune preventiva ou curativa em indivíduos, tais como doentes imunodeficientes, doentes com cancro, doentes sujeitos a transplantes, doentes infectados com um vírus ou um parasita, doentes idosos ou quaisquer doentes tendo uma contagem baixa de CD4, etc.

Utilizações específicas e preferidas dos polipé- 57 ΡΕ1904635 ptidos IL-7 e composições deste invento incluem a utilização: - como estimulador de uma vacina (administração da referida composição antes, durante ou quase simultaneamente com a administração do antigénio) numa quantidade eficaz para induzir a estimulação de resposta imune especifica contra células malignas ou agentes infecciosos; e - para induzir a reconstituição imune de doentes qualquer que seja a origem: infecciosa, radiações, transplantes (BMT, SCT) ou fármacos.

Os polipéptidos IL-7 e composições deste invento podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros ingredientes activos, tais como factores linfopoiéticos incluindo, sem limitação, SCF, Flt3-L, a-IFN, γ-IFN, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-15, IL-18 e/ou IL-21. Sempre que seja usada terapia combinada, os vários ingredientes podem ser administrados simultaneamente, separadamente ou sequenciadamente e podem ser acondicionados em conjunto ou separadamente.

Os polipéptidos IL-7 e composições deste invento podem ser usados em várias áreas, incluindo para estimular a vacinação no campo da saúde animal e para minimizar o número de administrações da substância activa. 58 ΡΕ1904635 É ainda descrito um método para o tratamento de uma infecção virai, como seja infecção por HIV, hepatite virai, febre do Nilo Ocidental, Dengue, método esse que compreende a administração, a um doente infectado, de uma composição do polipéptido IL-7 hiperglicosilado.

Numa realização particular, o polipéptido IL-7 hiperglicosilado é administrado em associação com uma molécula de interferão. A molécula de interferão pode ser, por exemplo, IFN alfa (IFN de leucócitos), IFN beta (IFN de fibroblastos) , IFN gama (IFN imune), IFN ómega ou tau (factor trofoblástico). É ainda descrito um método para a melhoria de uma recuperação timopoiética em indivíduos imunocomprometidos, este método compreendendo a administração, a um indivíduo imunocomprometido, de uma composição do polipéptido IL-7 hiperglicosilado.

De preferência, o polipéptido IL-7 hiperglicosilado é então administrado em associação com um factor de crescimento de queratinócitos, um factor de células estaminais, um antagonista de gonadostimulina ou uma hormona de crescimento. O polipéptido IL-7 hiperglicosilado pode também ser usado num método para proporcionar uma imunização terapêutica contra células malignas, vírus ou bactérias, em que o polipéptido IL-7 hiperglicosilado será administrado 59 ΡΕ1904635 em associação com um antigénio ou uma mistura de antigénios, e.g., os descritos atrás. Nesta situação, o polipéptido IL-7 hiperglicosilado pode ser ainda administrado em associação com GM-CSF. É ainda descrito um método para estimular ex vivo a expansão de células T, este método compreendendo o contacto das células T com um polipéptido IL-7 hiperglicosilado ou composição, estimulando assim a expansão das células T. Este método é particularmente útil para preparar células T adequadas para o tratamento de doentes, com cancro ou infecção virai, por imunoterapia adoptiva. A imunoterapia adoptiva é uma metodologia ex vivo para a expansão selectiva de células T especificas tendo como alvo antigénios específicos (malignos ou virais). Esta técnica imunoterapêutica geralmente inclui o isolamento de linfócitos T específicos de Ag a partir de sangue total do doente, expansão ex vivo destas células T usando polipéptidos IL-7, facultativamente activação ex vivo destas células T por outras citocinas e administração ao doente. São possíveis outras técnicas. Os polipéptidos IL-7 aumentam a sobrevivência destas populações de células T que ainda apresentam uma actividade citotóxica aumentada. Métodos de produção e ferramentas

Um outro aspecto do presente invento é proporcionar construções e métodos adequados para a produção das composições atrás referidas, particularmente os polipé- 60 ΡΕ1904635 ptidos IL-7 hiperglicosilados, composições e substâncias fármacos, em quantidade e qualidade suficientes para a sua utilização farmacêutica.

Em particular, como descrito atrás, o presente invento proporciona vectores assim como células hospedeiras recombinantes que podem ser usadas para produzir polipé-ptidos IL-7 humanos recombinantes deste invento em várias células hospedeiras competentes, assim como para fins de terapia génica. O vector pode ser um plasmideo, vírus, fago, cosmídeo, epissoma, etc. Os vectores virais (e.g., adenovírus recombinantes) e plasmídeos são os vectores preferidos, os quais podem ser produzidos com base em esqueletos comerciais, tais como pBR, pcDNA, pUC, pET, pVITRO, etc. O vector tipicamente compreende elementos reguladores ou sequências para controlar ou mediar a expressão de um polipéptido IL-7. As sequências reguladoras podem ser escolhidas entre promotores, estimuladores, silenciadores, sinais específicos de tecido, péptidos sinal, intrões, terminadores, sequências poli A, regiões GC, etc., ou uma combinação dos mesmos. Tais elementos ou sequências reguladoras podem derivar de genes de mamífero, fungos, plantas, bactérias, leveduras, bacteriófagos ou vírus, ou de fontes artificiais. Promotores úteis para a expressão procariótica (como seja em E. coli) incluem o promotor da RNA polimerase de T7 (pT7), promotor TAC (pTAC), promotor Trp, promotor Lac, promotor Tre, promotor 61 ΡΕ1904635

PhoA, por exemplo. Promotores adequados para a expressão em células de mamífero incluem promotores virais (e.g., CMV, LTR, RSV, SV40, TK, pCAG, etc.), promotores de genes domésticos (e.g., Elfa, β3σίίη3 de galinha, ubiquitina, INSM1, etc.), promotores híbridos (e.g., actina/globina, etc.), etc. Um vector pode compreender mais de um promotor. Os promotores podem ser induzíveis ou regulados. Por exemplo, a utilização de promotores induzíveis ou regulados permite um melhor controlo da produção através da dissociação das fases de cultura e produção. Promotores induzíveis ou regulados podem ser encontrados na literatura, como seja o sistema Tetraciclina, o sistema Geneswitch, o sistema Ecdysone, o sistema Oestradiol, o sistema RU486, o sistema Cumate, o promotor da metalo-tioneina, etc. Outros sistemas baseiam-se em correntes eléctricas ou micro-ondas, tais como um sistema de ultrassons focalizado, sistema de expressão induzida AIR e similares. Estes sistemas podem ser usados para controlar a expressão de um polipéptido IL-7 de acordo com o invento. A IL-7 pode ser coexpressa com um factor anti-apoptótico (e.g., lex, Bcl2, BclXL, etc.) ou ciclina (e.g. p21, p27, etc) . Os cDNAs codificadores da referida IL-7 e para o referido factor anti-apoptótico podem ser colocados a jusante do mesmo promotor, mas separados por uma sequência IRES ou cada um deles a jusante do seu próprio promotor. 0 vector pode ainda compreender uma origem de 62 ΡΕ1904635 replicação e/ou um gene marcador, o qual pode ser selec-cionado de entre sequências convencionais. Uma marca de selecção da amplificação, como seja o gene DHFR, pode ser inserida no esqueleto do vector. 0 vector pode ainda compreender várias combinações destes diferentes elementos que podem ser organizadas de diferentes maneiras. 0 presente invento também proporciona células hospedeiras recombinantes compreendendo um ácido nucleico ou um vector como descrito atrás. A célula hospedeira pode ser seleccionada de quaisquer células eucarióticas e procarióticas, tipicamente de entre uma célula de mamífero (em particular uma célula humana, de roedor, canina), uma célula bacteriana (em particular E. coli, Bacillus brevis, Bacillus subtilis), uma célula de levedura, uma célula vegetal e uma célula de insecto. Estas células hospedeiras podem ser adaptadas a meio sem soro. A produção pode também ser conseguida num animal ou planta transgénico.

As células hospedeiras recombinantes são selecci-onadas de entre células de mamífero, em particular células humanas assim como derivados ou mutantes dos mesmos.

Exemplos específicos de células hospedeiras adequadas incluem células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de Rim de Hamster Bebé (BHK), células de Rim Embrionário Humano (HEK-293), queratinócitos epidérmicos 63 ΡΕ1904635 humanos (HEK), células de estroma humano ou células epiteliais, PERC6, etc. Em tais células de mamífero, IL-7 pode ser produzido como uma proteína secretada usando sequências de péptido sinal funcionais.

Um objectivo específico deste invento é uma célula hospedeira eucariótica compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:2, 4 ou 6.

Um outro objectivo do presente invento está relacionado com processos que podem ser usados, à escala industrial, para a produção de um polipéptido IL-7 hiperglicosilado substancialmente puro de grau de pureza farmacêutico como descrito atrás. 0 processo conduz a rendimentos elevados do confórmero IL-7 recombinante adequado para fins terapêuticos. O invento também proporciona novos métodos de controlo das composições contendo IL-7, para determinar a presença de quantidade de polipéptido IL-7 hiperglicosilado como descrito atrás.

Num aspecto particular, o método de produção de polipéptidos IL-7 hiperglicosilados ou composições como definidas atrás compreende: a) cultura de uma célula hospedeira recombinante como descrito atrás e b) colheita de um polipéptido IL-7 produzido pelas referidas células. A amostra pode ser sujeita a vários tratamentos 64 ΡΕ1904635 ou condições de forma a aumentar a pureza de IL-7, para remover detritos celulares ou partículas virais, etc. Exemplos típicos de tais tratamentos incluem centrifugação, clarificação e/ou dia-ultrananofiltração. A amostra pode assim ser enriquecida no polipéptido IL-7.

Para aumentar os rendimentos ou eficiência do método, é altamente desejável produzir uma amostra contendo ou enriquecida em polipéptidos IL-7 correctamente enrolados e glicosilados. 0 polipéptido IL-7 hiperglicosilado pode ser purificado por técnicas diferentes conhecidas per se, mas que não foram ainda usadas na presente combinação para produzir um polipéptido IL-7 hiperglicosilado. Estas técnicas são mais preferencialmente seleccionadas de entre cromatografia de interacção hidrofóbica, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade e cromatografia de filtração em gel, sozinha ou em várias combinações. Tais métodos permitem a remoção de DNA da célula hospedeira e de outras impurezas que poderão baixar a recuperação. Numa realização preferida, o passo ii) compreende um passo de cromatografia de interacção hidrofóbica. Tal cromatografia pode ser realizada usando HIC butilo. 0 passo ii) pode ser realizado em qualquer suporte, de preferência em bloco ou em coluna usando um gel adequado.

Numa realização preferida, o passo de purificação compreende aplicação da amostra numa coluna cheia com um gel específico (por exemplo Sephadex). 65 ΡΕ1904635

Numa outra realização preferida, o passo de purificação compreende um passo de polimento envolvimento a aplicação da amostra numa coluna contendo um gel especifico (Source 15S) para concentrar a proteína recuperada de interesse e eliminar possíveis contaminantes residuais.

Numa outra realização particular o passo de purificação compreende aplicação da amostra numa coluna contendo um gel específico compreendendo um anticorpo monoclonal anti-IL-7 imobilizado numa resina (sulfato de dextrano ou heparina, por exemplo).

Estes métodos permitem a produção reprodutível e eficiente de um polipéptido IL-7 hiperglicosilado substancialmente puro como descrito atrás. Os métodos são particularmente vantajosos uma vez que a IL-7 recombinante pode ser obtida com uma pureza de pelo menos 95% por peso, de preferência pelo menos 98% por peso e mesmo mais de preferência pelo menos 99% ou mesmo 99,5% por peso relativamente à quantidade total de IL-7.

Cada um dos passos do processo atrás descrito pode ser controlado por métodos analíticos, incluindo análise por SDS-PAGE. A estrutura primária da IL-7 optimizada pode ser controlada e caracterizada através da determinação da sequência nucleotídica ou de aminoácidos, por análise de mapeamento de péptidos após digestão com tripsina, através da determinação da massa molecular com 66 ΡΕ1904635 SDS-PAGE, HPLC de exclusão por tamanho, espectrometria de massa como seja MALDI TOF ou electrovaporização ou similares, através da determinação da hidrofobicidade com HPLC de fase reversa, por exemplo, e/ou através da determinação da carga eléctrica por cromatografia de permuta catiónica, HPLC ou análise por isoelectrofocagem, por exemplo.

Uma outra realização do invento está relacionada com métodos de produção de IL-7 como descrito atrás, em que a expressão de IL-7 pelas células hospedeiras recombinantes é induzivel, regulada ou transitória, de forma que as fases de cultura celular e de expressão de IL-7 podem ser dissociadas. Mais particularmente, numa realização particular, a expressão de IL-7 pode ser reprimida ou minimizada durante o crescimento, expansão e/ou cultura de células recombinantes, para permitir a produção de grandes quantidades de células hospedeiras recombinantes sem qualquer potencial efeito tóxico mediado por IL-7. Em seguida, a expressão de IL-7 pode ser induzida na cultura celular (ou numa amostra da mesma), permitindo a síntese e secreção eficientes do polipéptido IL-7 recombinante.

Um objectivo deste invento também reside num método de produção de um polipéptido IL-7 recombinante, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira recombinante como atrás descrito contendo uma molécula de ácido nucleico codificadora do referido polipéptido IL-7 e recuperação do polipéptido IL-7 recombinante produzido, em 67 ΡΕ1904635 que a referida molécula de ácido nucleico proporciona uma expressão regulada ou induzivel do referido polipéptido IL-7, de forma que a expressão do referido polipéptido IL-7 pode ser reprimida ou minimizada durante o crescimento das células recombinantes e induzida durante a fase de produção. 0 ácido nucleico tipicamente compreende um promotor induzivel, o qual pode ser reprimido ou activado na presença ou na ausência de um agente especifico contido ou adicionado ao meio de cultura. O método é particularmente adequado para produzir um confórmero de IL-7 hiperglicosilado como descrito atrás. Vários sistemas de expressão regulados ou induziveis foram descritos na literatura, os quais são funcionais em células hospedeiras de mamífero e podem ser usados no presente invento. Estes incluem o sistema TetOn/Off, o sistema Geneswitch (Invitrogen) com Mife-pristone como agente indutor e o promotor GAL4-Elb, o sistema Ecdysone (indução com ponasterona A ou muristerona A, análogos de hormonas esteróides de insectos) (Invi-trogen), promotor de metalotioneina (induzivel por zinco), sistema Oestradiol, sistema RU486, sistema de ultrassons focalizado, sistema de expressão induzido AIR (regulação induzida por acetaldeído), sistema Cumate (Q-mate; Qbiogen), sistema Cre-Lox, etc. Estes sistemas de expressão regulados ou induziveis podem ser usados em várias células, tais como, por exemplo, as linhas celulares HEK293, HEK293 EBNA, HEK, T-REX™-2 93, T-REX™-HeLa, T-REX™-CH0 ou T-REX™-Jurkat, transformadas com um vector recombinante destinado a expressar IL-7 recombinante após indução. 68 ΡΕ1904635

Como alternativa, a transfecção transitória pode ser usada para dissociar a expansão celular da produção de IL-7. Neste contexto, os vectores eficazes de entrega de genes são usados para introduzir uma sequência codificadora de IL-7 nas células quando da sua expansão. Mais de preferência, o sistema vector para a transfecção transitória é um vector virai, como seja um adenovírus recombinante ou um vector epissómico [e.g., pCEPH (Invitrogene) , pTT (IRB: Durocher Y. et al., Nucl. Acids Res., 2002, 30(2)) ou usando sequências MAR]. Os adenovírus (e outros vectores virais tais como AAVs, por exemplo) podem ser produzidos de acordo com técnicas conhecidas na área. Tipicamente, os adenovírus defectivos em EI são produzidos numa linha celular que complementa El, como seja HEK293, células PERC6, etc. Tal processo de transfecção transitória pode ser implementado em várias células de mamífero em cultura, como sejam, por exemplo, células A549, HeLa, VERO, BHK ou CHO transformadas (como descrito no exemplo A4). Um método de expressão transitório alternativo adequado para a utilização no presente invento está descrito, por exemplo, no artigo que se segue: Durocher Y. et al., Nucle. Acids Res., 2002, 30(2) em células HEK293 EBNA ou HEK293.

Numa realização preferida, os métodos de produção deste invento compreendem um passo adicional c) de caracterização e medição ou quantificação do polipéptido IL-7 hiperglicosilado particular como descrito atrás 69 ΡΕ1904635 contido no produto resultante. A caracterização física e biológica do polipéptido IL-7 hiperglicosilado pretendido pode ser obtida por espectrometria de massa (MALDI-TOF ou electrovaporização), espectroscopia de infravermelhos, ressonância magnética nuclear (NMR), através da determinação de dicroísmo circular, através da avaliação da actividade biológica da IL-7 num bioensaio específico, através da medição de afinidade para um anticorpo mono-clonal específico induzido contra o referido polipéptido IL-7 hiperglicosilado ou HPLC de afinidade com heparina. Uma vez caracterizado, a quantificação do referido confórmero pode ser realizada por ELISA, bioensaio, afinidade do referido polipéptido IL-7 hiperglicosilado para o receptor de IL-7 e qualquer método de quantificação de proteína se aplicado ao confórmero isolado.

Neste contexto, o invento também proporciona e está relacionado com um método para identificar e/ou medir a quantidade de polipéptido IL-7 hiperglicosilado e/ou impurezas relacionadas numa amostra, particularmente numa preparação farmacêutica. Tais métodos de caracterização podem ser usados para inicialmente caracterizar e qualificar a proteína para uma utilização terapêutica, no controlo de qualidade de lotes farmacêuticos. 0 invento propõe, pela primeira vez, um método de caracterização e controlo de preparações contendo IL-7, para determinar a presença e/ou quantidade relativa do polipéptido IL-7 hiperglicosilado deste invento. Os métodos preferidos usam o ensaio de proteínas com ácido bicinchonínico (BCA), SDS- 70 ΡΕ1904635 PAGE, transferência Western, HPLC de exclusão por tamanho, HPLC de fase reversa, HPLC de permuta iónica, HPLC de interacção hidrofóbica, Ensaio de Aminoácidos (AAA), isoelectrofocagem (IEF), ELISA, absorção de UV e/ou um bioensaio. Estes métodos podem ser realizados isoladamente ou em várias combinações. O invento também proporciona um método de produção de uma substância fármaco IL-7 ou composição farmacêutica, o referido método compreendendo (i) cultura de uma célula hospedeira recombinante codificadora de um polipéptido IL-7, (ii) isolamento do referido polipéptido recombinante para produzir uma substância fármaco de IL-7 e (iii) acondicionamento da referida substância fármaco de IL-7 para produzir uma composição farmacêutica adequada ao uso terapêutico ou como vacina, o referido método compreendendo ainda um passo de identificação, caracterização ou medição, na referida substância fármaco ou composição farmacêutica, da quantidade e/ou qualidade de polipéptido IL-7 hiperglicosilado como definido atrás e mais de preferência, um passo de selecção da substância fármaco ou composição farmacêutica que compreende, como ingrediente activo, mais de aproximadamente 90%, de preferência 95%, mais de preferência 98% do referido polipéptido IL-7 hiperglicosilado. O passo de caracterização pode ser realizado por uma variedade de técnicas, mais de preferência por métodos relacionados com espectrometria de massa, com ou sem 71 ΡΕ1904635 digestão por tripsina, Cromatografia de Afinidade com Lectinas, Ensaio de Aminoácidos (AAA), digestões com endo-e exo-N- e O-glicanase (PGNase A/F, O-glicosidase, neuraminidase), electroforese de açúcares assistida por fluoróforos, MALDI TOF ou espectrometria de massa por electrovaporização, análise com anticorpos monoclonais específicos para pontes dissulfureto e/ou caracterização da conformação. A identificação das variantes moleculares e das impurezas relacionadas com o produto é, de preferência, realizada usando um ou vários métodos seleccionados entre electroforese bidimensional, focagem isoeléctrica e cromatografia de permuta iónica para formas desamidadas, cromatografia de exclusão por tamanho e análise de SDS-PAGE para formas multiméricas e HPLC de fase reversa com ou sem pré-digestão enzimática para as formas truncadas. 0 passo é particularmente adequado para o controlo de qualidade de composições clínicas ou farmacêuticas, pelo que apenas composições compreendendo mais de cerca de 95% do polipéptido IL-7 hiperglicosilado atrás referido são mantidos, de preferência mais de cerca de 96%, 98% ou 99,5%. Todo este polipéptido IL-7 hiperglicosilado apresenta um ponto isoeléctrico médio abaixo de 6,5.

Um outro objectivo do presente invento está relacionado com a utilização de um polipéptido IL-7 recombinante hiperglicosilado obtido com processos como os descritos atrás, para a produção de uma composição 72 ΡΕ1904635 farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença associada a uma imunodeficiência, particularmente para induzir uma estimulação prolongada de linfopoiese, para induzir e/ou amplificar uma resposta imune, particularmente uma resposta imune especifica de antigénio.

Um outro objectivo do invento está relacionado com a utilização de um polipéptido IL-7 hiperglicosilado como uma ferramenta experimental e uso farmacológico em mamíferos para aplicações veterinárias.

Outros aspectos e vantagens do presente invento serão descritas nos exemplos que se seguem, os quais deverão ser considerados como ilustrativos e não limitantes do âmbito do presente pedido de patente.

EXEMPLOS

Exemplo A. Construção e expressão de sequências nucleotídicas optimizadas codificadoras de IL-7 humana (h) e símia (s) em células de mamífero. AI. Construção de uma sequência nucleotídica optimizada codificadora de IL-7 humana: 1.1 Optimização do péptido sinal:

Uma vez que a expressão dos fragmentos de cDNA de IL-7 ligados ao extremo 5' do péptido sinal de IL-7 natural 73 ΡΕ1904635 foi muito baixa, testámos várias sequências de péptidos sinal. As novas sequências de cDNA codificadoras de IL-7 humana foram obtidas quimicamente a partir de oligonu-cleótidos sintéticos montados. Várias sequências de péptidos sinal foram testadas: péptido sinal (SP) de proteínas altamente secretadas (Barash et al.; 2002; Biochemical and Biophysical Research Communications 294:835-842):

IL-7 SP MFHVSFRYIF GLPPLILVLL PVASS (SEQ ID NO:13)

EPO SP MGVHECPAWL WLLLSLLSLP LGLPVLG (SEQ ID NO:14)

SEAP SP MLLLLLLLGL RLQLSLG (SEQ ID NO:15)

IgGkappa SP METDTLLLWV LLLWVPGSTG (SEQ ID NO:16)

Lactotransferina/vitronectina SP MKLVFLVLLF LGALGVALA (SEQ ID NO:18)

Uma nova SP híbrida EPO/IL-7 MGVHECPAWL WLLLSLLSLV LLPVAS (SEQ ID NO:19)

As sequências de cDNA obtidas foram inseridas no vector pTT5 (Durocher et al., 2002; Nucl. Acids Res.; 30) para a expressão transitória em células de mamífero, como sejam as células HEK293 e as células CHO.

Para avaliar a boa clivagem do péptido sinal, o aminoácido N-terminal foi determinado para cada uma das proteínas obtidas; a integridade de hIL-7 foi mantida. Cistatina, IgG, EPO e o híbrido EP/7 parecem ser as 74 ΡΕ1904635 melhores sequências de péptido sinal. De facto a expressão de hIL-7 é aumentada em, pelo menos, um factor de 10. 1.2. Optimização da sequência nucleotídica codi-ficadora de IL-7 humana:

Mantendo a sequência de aminoácidos EP/7hIL-7, a sequência de ácido nucleico foi optimizada por - eliminação de codões humanos raros (usando o programa informático Graphical Codon Usage Analyser) aumento da estabilidade do mRNA através do aumento do conteúdo "GC" da sequência, excepto para a sequência do péptido sinal (Kim et al.; 1997/ Gene; 199) e minimizando a sucessão de dinucleótidos "CA". A sequência está descrita em SEQ ID NO:2. A2. Construção de uma sequência nucleotídica optimizada codificadora de IL-7 símia:

Tal como descrito para a sequência codificadora de IL-7 humana, foi sintetizada uma sequência optimizada EP/7-SIL-7 (SEQ ID N0:3). A3. Construção da sequência nucleotídica codi-ficadora de IL-7 canina: cDNA de IL-7 canina foi amplificado por PCR a 75 ΡΕ1904635 partir de uma biblioteca de cDNA de rim humano (Biochain), clonado e sequenciado como descrito atrás para a sequência codificadora de IL-7 humana, uma sequência IL-7SP ou EP/7SP-COL-7 foi sintetizada (SEQ ID NO:6). A4. Expressão em mamifero (expressão em células BHK ou expressão em células CHO ou expressão em células HEK-293):

As sequências de cDNA codificadoras de IL-7 foram amplificadas por reacção em cadeia da polimerase (PCR) (Mullis et al.,; 1987; Methods in Enzymoloqy; 155-335-350) para criar os locais de restrição (NotI/SwaI) para clonagem no vector de expressão. 0 sistema de expressão ph-pgk.EP7-hIL-7 (Fig. 1) ou pBh-pgk.EP7-hIL-7 (Fig. 2) foi projectado para expressar uma proteína IL-7 deduzida a partir da tradução da sequência do gene de IL-7 humana natural. A selecção de células contendo vector recombinante foi feita com base em genes de marcas de resistência a antibióticos (ampicilina para a clonagem em E. coli e higromicina para a expressão em células de mamífero) transportados no vector.

Este vector de expressão foi totalmente construído pela CYTHERIS, partindo do plasmídeo pIC20H (ATCC) conferindo resistência à ampicilina ao sistema. Possui 2 unidades de produção em mamífero:

1/ uma para a expressão das sequências codificadoras de IL-7, sob o controlo do promotor pgk e uma sequência poli A 76 ΡΕ1904635 sintética que evita a transcrição para além do promotor pgk. 2/ uma para a expressão do gene de resistência à higro-micina, sob o controlo do "estimulador de SV40-promotor de tk" .

As seguintes sequências foram inseridas neste vector preliminar: -"hph-efla pA" fragmento HindIII/Sbfl derivado de pVitro2.mcs (Invitrogen); - promotor tk: fragmento de PCR EcoRI/HindIII derivado de pMEP4 (Invitrogen); estimulador de sv40: fragmento de PCR BssHI/EcoRI derivado de pVitro2.mcs (Invitrogen); - MAR Bglobina de coelho: uma "Região de ligação à matriz" putativa para uma melhor integração em região altamente transcrita da cromatina, fragmento de PCR EcoRV/Agel contendo o intrão 2 de Pglobina derivado de pSG5 (Stratagene); -SpA: fragmento StuI/BspEI derivado do controlo pCAT3 (Promega) - Promotor Pgk: fragmento de PCR Kpnl/BssHII derivado de pQBI.pgk (Q-biogen); - 5'UTRintl: fragmento de intrão quimérico HindIII derivado de pCAT3-controlo (Promega); cDNA NotI/SwaI ou NotI/PmlI codificador de IL-7 e mutantes; hghpA: síntese de NruI/SwaI sintético derivado da sequência de cDNA da hormona de crescimento humana descrita 77 ΡΕ1904635 por M. Goodman (DeNoto et al.; 1981; Nucl. Acid Res.; 9(51) :3719-3730) .

Algumas variantes do vector foram preparadas com outro promotor de IL-7 diferente do promotor pgk: Eflalfa, snRNA Ul, actina, ubiquitina, promotores de CMV, etc., ou outra marca selectiva: neomicina, etc. O vector de expressão em mamífero (HEK-293, CHO ou BHK) compreendendo SEQ ID NO:2, foi designado ph-pgk.EP7-hIL-7 ou pBh-pgk.EP7-hIL-7. A expressão estável de IL-7 humana em células HEK-293 ou CHO transfectadas foi conseguida usando o vector de expressão ph-pgk.EP7-hIL-7 ou pBh-pgk.EP7-hIL-7. Após linearização com Ndel, o vector de expressão ph-pgk.EP7-hIL-7 ou pBh-pgk.EP7-hIL-7 foi usado para transfectar células hospedeiras de mamífero através de métodos conhecidos dos familiarizados com a área. A marca seleccionável usada para estabelecer transformantes estáveis foi higromicina (Invitrogen). A5. Expressão induzível em mamífero (promotor da metalotioneina "MT1"):

No mesmo vector de expressão, o promotor pgk foi também substituído por uma sequência BspEI/BssHI "MTl de Mus musculus" sintetizada quimicamente, conforme referido no PubMed (N° X53530) (Cárter et ai.; 1984; Proc. Natl. Acad. Sei. USA; 81:7392-7396). MTl é um promotor do factor de transcrição dependente de metais. A expressão de clones estáveis é assim dependente de zino. 78 ΡΕ1904635 Α6. Co-expressão de IL-7 e Bcl2 ou BclXL em mamífero (expressão em células BHK ou expressão em células CHO ou expressão em células HEK-293):

Para aumentar a viabilidade celular em culturas de células hospedeiras de mamífero e assim optimizar as quantidades de produção de IL-7, um plasmídeo de expressão variante foi preparado através da inserção da sequência de cDNA de Bcl2 entre o promotor tk e o cDNA de hph de forma que a acção anti-apoptótica de Bcl2 pudesse ser testada na produção em bio-reactor (Zhong et al.; 1993/ Proc. Natl. Acad. Sei. USA; 90:4533-4537 - Lee et al.; 2000; Journal of Cell Science; 114(4):677-684). (Ver Fig. 2).

Exemplo B. Construção e expressão de sequências nucleotídicas de análogos hiperqlicosilados de IL-7 em células de mamífero: BI. Construção de sequências de cDNA de análogos de IL-7 hiperglicosilados

Os análogos de IL-7 hipeglicosilados foram obtidos usando várias técnicas incluindo métodos de mutagénese. Os análogos de IL-7 hiperglicosilados (alternativamente: HG37 -40 -104 -126 e -147) foram construídos quimicamente a partir de oligonucleótidos sintéticos montados. Vários análogos foram obtidos através da introdução de uma ou mais mutações pretendidas de forma a originar análogos de IL-7 79 ΡΕ1904635 tendo um ou mais locais de glicosilação adicionais. Assim, a sequência de cDNA completa resultante, contendo um ou múltiplos locais de glicosilação adicionais pretendidos, após digestão com as enzimas de restrição Notl e Pmll, foi inserida entre os locais de restrição NotI/PmlI para a clonagem directa no vector de expressão (semelhante à Fig. 1 ou 2 mas contendo a sequência de IL-7 adequada). B2. Expressão de sequências de cDNA de análogos de IL-7 hiperglicosilados A expressão de análogos de IL-7 hiperglicosilados foi conduzida como descrito atrás nas secções A4 a A6.

Exemplo C. Produção de hIL-7 recombinante em condições de cultura em bio-reactor 0 clone positivo mais estável, como no exemplo A4, foi adaptado a cultura em suspensão sem soro através de rastreio de vários meios e componentes de forma a produzir um clone optimizado para a produtividade e crescimento em culturas de elevada densidade celular. Antes da sementeira do bio-reactor de 100 a 2000 1, foram efectuadas pré-culturas no sistema "saco ondulado". A cultura celular foi realizada num bio-reactor de 100 a 2000 litros com um sistema de perfusão ou um sistema de alimentação continua durante 10 a 15 dias. As células foram amplificadas até uma concentração de 10 milhões de células/ml num meio com baixo teor de glutamina suplementado com peptonas vegetais. 80 ΡΕ1904635

Num primeiro passo de expansão, a temperatura da cultura foi regulada a 37°C para aumentar a densidade celular. Após alguns dias, a temperatura foi baixada para cerca de 28/32°C para inibir o crescimento celular e permitir um melhor nivel de expressão. Ainda, o decréscimo da temperatura diminui a velocidade da via de secreção, favorecendo melhor glicosilação da IL-7 expressa com maior ocupação dos locais. Alguns dias antes do fim da cultura, a expressão de IL-7 foi reforçada pela adição de butirato de sódio 0,5-10 mM no meio. Nas condições atrás descritas, a expressão de IL-7 foi monitorizada dentro das células e no meio de cultura (Fig. 3).

Para produzir glicoformas de IL7 de massa molecular elevada, 3 g/1 de glucose e glutamina 3 mM foram mantidos no meio durante a cultura assim como uma boa oxigenação. Também se monitorizou o consumo de aminoácidos e alimentou-se a cultura com os aminoácidos consumidos. A cultura foi colhida assim que a viabilidade celular diminui abaixo de 90%.

Exemplo D. Purificação do produto IL-7 humano recombinante expresso em células HEK-293 e CHO O meio de cultura celular bruto foi colhido e centrifugado para sedimentar células completas e detritos celulares. Como alternativa, isto pode ser conseguido por filtração profunda em cápsulas ou módulos de clarificação 81 ΡΕ1904635 tais como a cápsula Mustang XT (Pll), Sartoclear P (Sartorius), Millistack+ Opticap (Millipore) ou cassetes de fibras ocas (AXH cross flow 10 (GE)) ou equivalentes. O meio de cultura centrifugado foi concentrado aproxima-damente 10 vezes com o sistema Centrasette Cassette, limite de exclusão da membrana de 10 kDa (Pall Life Sciences) para reduzir o volume de sobrenadante. Pode ser usado qualquer outro sistema de filtração/concentração com porosidade semelhante. 0 sobrenadante concentrado foi centrifugado, ajustado a pH 7,5 e aplicado numa coluna Q Sepharose Fast Flow (General Electric Healthcare) equilibrada com fosfato de sódio 50 mM pH 7,5. A proteína foi então recuperada no efluente. Durante este passo cromatográfico negativo, vários contaminantes, entre os quais DNA, foram eliminados. Uma alternativa a este passo foi usar cassetes de membranas validadas Mustang Q (Pall) em condições semelhantes, para melhor rendimento e/ou processo ligeiramente mais rápido. Uma outra alternativa a este passo é capturar a proteína numa resina de permuta aniónica forte (Q Ceramic Hyper D (Biospra), Capto Q (GE)) ou numa membrana (Sartobind Q, Sartorius).

Após este passo de pré-purificação, foi realizado um passo de captura numa resina de permuta catiónica forte. 0 efluente colhido no final do passo anterior foi aplicado numa coluna Fractogel EMD S03- (Merck) equilibrada com tampão de aplicação (fosfato de sódio 50 mM pH 7,5) e 82 ΡΕ1904635 lavado com fosfato de sódio 50 mM pH 7,5. A eluição foi realizada usando um gradiente linear de NaCl (15 volumes de coluna) em fosfato de sódio 50 mM pH 7,5.

As fracções activas foram reunidas e inactivadas durante 30 minutos a pH 3,5, à temperatura ambiente, para eliminar vírus. Uma alternativa a este processo é substituir este passo de inactivação virai por uma nanofiltração em múltiplas camadas no final do processo. Após inactivação virai, as fracções proteicas reunidas foram diluídas 2 vezes em tampão (fosfato de sódio 200 mM, pH 7, sulfato de amónio 3M) e o pH foi ajustado a 7. Em seguida, a solução proteica foi aplicada numa coluna de cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC) Butyl Toyopearl 650-M (Tosoh) equilibrada com o tampão de aplicação (fosfato de sódio 50 mM pH 7 + sulfato de amónio 1,5M) . Após lavagem com o tampão de aplicação, a IL-7 foi eluída com 25 volumes de coluna de um gradiente de sal, variando entre sulfato de amónio 1,5M e 0M, em fosfato de sódio 50 mM pH 7.

Resinas HIC alternativas tais como hexil Toyopearl 650-M (Tosoh), Butil/Octil Sepharose™ 4 Fast Flow (General Electric Healthcare), podem ser utilizadas para este passo. Uma outra alternativa a HIC para fins de aumento de escala foi usar uma outra matriz como seja MEP HyperCel (Pall Biosepra) para resultados semelhantes. A combinação do passo de captura atrás referido e 83 ΡΕ1904635 a cromatografia de interacção hidrofóbica permitiu a separação óptima das diferentes isoformas de IL-7 glicosilada (desde BI a B10 como indicado na Fig. 4), de acordo com as suas propriedades físico-químicas intrínsecas. A selecção adequada das fracções de eluição (fracções entre BI e B4) conduz a um enriquecimento na entidade hIL-7 3N-glico-silada, associada ou não a 10-glicosilada. Um exemplo de tal separação de glicoformas está apresentado na Figura 4.

As fracções de IL-7 altamente glicosiladas foram reunidas e aplicadas numa coluna de Sephadex G25 (General Electric Healthcare) equilibrada com tampão de baixo teor salino (acetato de sódio 20 mM pH 6) . Uma alternativa a este passo é diafiltrar o conjunto de fracções proteicas com elevado teor de sal usando membranas TFF com um limite de exclusão de 5 ou 10 kDa (membranas Quick start, (GE) , Centramate TFF (Pall)). As fracções proteicas obtidas no passo G25 foram aplicadas numa coluna Source 15S (General Electric Healthcare) equilibrada com o tampão de aplicação (acetato de sódio 20 mM pH 6) . Este passo de polimento resultou em concentração da proteína e eliminação dos contaminantes residuais. A coluna foi lavada com tampão de aplicação acetato de sódio e a proteína IL-7 foi eluída com 15 volumes de coluna de um gradiente de sal, variando entre 0 e 1M NaCl em acetato de sódio 20 mM pH 6. As fracções eluídas foram separadas por SDS-PAGE e coradas com azul Coomassie ou nitrato de prata. Apenas as fracções contendo IL-7 foram reunidas para dar origem ao lote final de proteína IL-7 purificada. 84 ΡΕ1904635

Se a inactivação virai não for conduzida efec-tuada antes, o processo de purificação pode também incluir uma combinação adicional de duas filtrações para garantir uma eliminação óptima do virus. A remoção virai pode ser conseguida por filtração usando um sistema de pré-filtração (Planova 75, Asahi Kasei Medicai) seguido de membranas de celulose nanoporosas (Planova 20N, Asahi Kasei Medicai) ou através de outras membranas de remoção de virus (Virosart, Sartorius; DV20, Millipore). SDS-PAGE de hIL-7 glicosilada e hiperglicosilada purificada a partir de E. coli estão apresentados na Figura 5.

Os desvios no gel ilustram o nivel de glicosi-lação da proteína. De facto, as formas hiperglicosiladas aqui testadas (HG-37-147 e HG-40-104) possuem uma massa molecular mais elevada que a hIL-7 totalmente glicosilada.

Exemplo E. Análise de açúcares de glicoproteínas A produção de IL-7 humana recombinante foi conduzida num sistema de expressão baseada em células CHO pelas razões que se seguem mas não lhes estando limitadas. As células CHO são presentemente o hospedeiro mais validado e mais comum usado para a produção de glicoproteína terapêutica humana recombinante. Ainda, uma grande série de trabalho detalhado descreve que as células CHO, incluindo linhas celulares CHO geneticamente modificadas expressando sialil-a-1-6 transferase, foram capazes de glicosilar pro- 85 ΡΕ1904635 teinas recombinantes numa forma qualitativamente semelhante à observada nas células humanas. Esta caracteristica particular foi de grande importância para reduzir a imunogenicidade potencial da glicoproteina recombinante quando injectada a doentes humanos. O produto IL-7 humano recombinante ou fracções enriquecidas em glicorformas particulares (3N ou 3N+2N, associadas ou não a um grupo 10-glicano) obtidas a partir de células CHO transfectadas foram analisadas por transferência Western para confirmar o estado de glicosilação comparativamente com IL-7 humana recombinante derivada de E. coli.

As diferentes glicoformas da IL-7 produzidas em CHO e purificadas foram caracterizadas diferencialmente usando electroforese em gel de poliacrilamida. A massa molecular aparente das entidades de glicoproteina variaram entre 2 0 kDa e 35 kDa, com uma banda principal à volta de 27 kDa (observado em SDS-PGE, ver Fig. 5 e Fig. 6) , mais provavelmente correspondendo a uma forma 3N-glicosilada compreendendo ou não um grupo O-glicano. Este aspecto foi especificamente avaliado por desglicosilação enzimática do produto purificado (Fig. 7).

Estas glicoformas (3N ou 3N + 2N, associadas ou não a um grupo 10-glicano) de IL-7 produzidas em CHO e purificadas foram diferencialmente caracterizadas usando espectrometria de massa, dando massa molecular superior a 86 ΡΕ1904635 25 kDa para a glicoforma 3N associada ou não a um grupo 10-glicano e superior a 23 kDa para a glicoforma 2N associada ou não a 10-glicano (Fig. 8) . Ainda, as formas glicosiladas apresentaram um ponto isoeléctrico médio de 5,8 reflectindo um perfil de sialilação elevado (ver Fig. 9) .

Como comparação, uma análise semelhante com IL-7 derivada de E. coli não glicosilada deu uma proteína com uma massa molecular aparente de aproximadamente 18 kDa e as células de mamífero derivadas de hIL-7 hiperglicosilada mostraram uma massa molecular aparente compreendida entre 27 e 37 kDa. A complexidade da glicosilação em geral e a heterogeneidade dos N-glicanos da hIL-7, derivada de CHO e purificada, foram avaliadas por desglicosilação enzimática enzimática total seguido de separação cromatográfica e análise por espectrometria de massa dos oligossacáridos gerados.

As amostras de IL-7 glicosiladas purificadas foram digeridas enzimaticamente com uma endoglicosidase como seja péptido-N-glicosidase F (PNGaseF, Roche). Os oligossacáridos ligados em N libertados foram separados da estrutura do péptido e separados usando uma coluna de grafite Carbograph 200-300 μΐ (Alltech), seguido de espectrometria de massa MALDI-TOF (Voyager Spec, Applied Biosystems) . Os valores de m/z correspondendo a cada pico do espectro MS permitiram identificar a estrutura geral do ΡΕ1904635 87 N-glicano da molécula de hIL-7 completa. Para a detecção especifica dos glicanos contendo ácido siálico, foi efectuada uma carboximetilação dos oligossacáridos gerados por PNGase (como descrito em Powell AK & Harvey DJ, Rap. Com. Mass Spec. 1996) antes da análise de espectrometria de massa. A análise do espectro gerado a partir de hIL-7 derivada de CHO e purificada revelou massas de N-glicanos variando entre 1340 Da e 3516 Da. (Ver Fig. 10). Do espectro, pode ser determinada a estrutura de glicanos que se segue (ver Tabela 3).

Tabela 3

Sinal m/z Iões moleculares observados 1338 HexâHexNÀCd + Na* 1448 Hex4ÍdHex)HexNAc4 + Na* 1485 HexsfdHex)HexNAc4 ♦ Na* 1647 Hex4ÍdHex)HexNAc4 + Na* 1809 Hexsíd Hex)HexNAC4 * Na* 1824 Hex3ídHôX2)HexNAcs * Na* 1970 HexEÍdHex)HexNAc4{SuÍDh)2+2Na* 2012 Hexsíd Hex)HexN Acs + Na* 2157 NeuAcCarboxyHex4(dHex)HexNAcs + Na* 2182 N euAcHexsídHexiHexNAOíSuJph + Na* ‘...............2318 NeuAcCarboxyHexsídHex)HexNAcs + Na* 2421 Hex3fdHex)HexNAc8(Sulph)+ Na* 2636 NeuAcCarboxyHexeHexNAce + Na* 2624 NeuAc2CarboxyHexs{dHex)HexNAcs + Na* 2786 N©uAc2CarboxyHeX6ÍdHex)HexNÀcs + Na* 2843 NedAc2CarboxyHeXfsHexNAce + Na* 3092 H NeiiAc3CarboxyHax6ÍdHex)HexNAcs+ Na* 3153 NeuAcSCarboxyHexeHexNAce + Na* ΡΕ1904635

Hex: hexose (galactose ou manose), HexNAc: N-acetil- hexosamina (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), dHex: desoxi-hexose (Fucose), Sulph: grupo sulfato, NeuAc: ácido N-acetilneuraminico.

Considerando i) as respectivas massas dos grupos oligossacáridos observados, ii) a massa de cada monos-sacárido e iii) as leis das vias de biossintese de glicano como são actualmente conhecidas, podem ser assumidas com grande probabilidade as seguintes estruturas de N-glicanos altamente complexas.

Tabela 4: N-glicanos complexos bi e triantenários carac-terizados em hIL-7 derivada de CHO (mas não lhe estando limitado):

3149 89 ΡΕ1904635 O Manose □ N-acetilglucosamina · galactose 0 al-3-Fucose Δ ácido siálico A complexidade da glicosilação foi igualmente avaliada via determinação da proporção molar dos diferentes monossacáridos encontrados em todos os glicanos (N- e 0-glicanos se aplicáveis) da hIL-7 purificada derivada de CHO.

Todos os glicanos das amostras de hIL-7 glico-silada purificada foram tratados quimicamente por reacção de metanólise de forma a hidrolisar todas as ligações glicosidicas entre açúcares. Os monossacáridos libertados foram desligados da estrutura peptidica e separados usando um aparelho de cromatografia gasosa-espectrometria de massa Automass (Finnigan). A proporção molar foi determinada como referência a um padrão interno conhecido e a um teor de 3 manoses de um N-glicano clássico de mamífero.

Tal análise deu a seguinte proporção molar para hIL-7 derivada de CHO

Tabela 5

Monossacárido Fuc GcL 1 Man GalMan GlcNAc NeuAc Massa molecular 164 180 180 221 221 309 Superfície do pico 43382 179120 310124 33650 344476 423587 N° de nanomoles 5,41 24,76 22,15 5,26 27,29 20, 94 Proporção molar 0,73 3,35 3 0,71 3, 69 2,83 90 ΡΕ1904635 A heterogeneidade do padrão de N-glicanos específicos de locais da hIL-7 derivada de CHO foi testada por digestão por endoproteases, seguido de fraccionamento e análises de espectrometria de massa dos péptidos gerados.

As amostras purificadas foram digeridas com tripsina ou com outras endoproteases de forma a gerar glicopéptidos correspondendo a cada local de N-glicosilação da IL-7 expressa. Cada glicopéptido foi identificado por micro-sequenciação N-terminal e pelo tempo de retenção específica quando analisado por HPLC de fase reversa. Cada glicopéptido foi assim purificado de entre os outros. A heterogeneidade dos N-glicanos existentes no glicopéptido foi analisada por MALDI-TOF MS (Q Star, Applied Bio-systems) . Os valores m/z correspondendo a cada pico do espectro MS permitiu a identificação do padrão de N-glicanos num local previsto da hIL-7. A O-glicosilação foi testada através da utilização de lectinas específicas de O-glicanos (Transferência de lectinas, ver Fig. 11).

Amostras de hIL-7 derivadas de CHO e purificadas foram separadas por análise de SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF. As proteínas imobilizadas foram testadas com PNA (aglutinina de amendoim) marcada com peroxidase (mas não lhe estando limitado) e coradas para visualização. A heterogeneidade e a composição dos glicanos foram igualmente determinadas através da utilização de afinidade das lectinas para a hIL-7 derivada de CHO e purificada. 91 ΡΕ1904635

Um arranjo de lectinas tendo afinidade para estruturas de N- e 0-glicanos foi seleccionado e usado para revestir microplacas de 96 alvéolos. Quantidades idênticas de preparações de IL-7 recombinante purificada foram incubadas em alvéolos de microplacas revestidas com lectinas. Durante este passo, de acordo com a afinidade de uma determinada lectina para a decoração de glicanos de IL-7, diferentes quantidades de IL-7 foram mantidas ligadas à lectina. A revelação foi conduzida por incubação de um

anticorpo especifico de IL-7 acoplado a Biotina. A sanduíche lectina-IL-7-Ab foi revelada com um conjugado de estreptavidina-peroxidase.

Oito lectinas diferentes foram usadas para caracterizar as amostras de IL-7 purificadas. Cada uma das lectinas reconhece especificamente grupos de açúcar. Os motivos de glicano e a especificidade da estrutura estão apresentados na Tabela 6.

Tabela 6: sumário do padrão de grupos de açúcar reconhecidos por lectinas e inventário dos seus motivos de glicano e especificiadade de estrutura. LEA é a lectina de Lycopersicon esculentum, WGA de Triticum vulgare, UEA.I de Ulex europeus, MAA de Maackia amurensis, ACA de Amaranthus caudatus, AIA de Artocarpus intergrifolia, 92 ΡΕ1904635 ABA de Agaricus bisporus, PHA.L de Phaseolus vulgaris.

Tabela 6:

Nome Glc GlcN Ac Man Fuc Neu Ac Gal NAc Gal Especificidade da estrutura glicano LEA + Oligómeros de GlcNacPGlcNAc e N-acetilactosamina WGA + + GlcNAc, núcleo de glicanos ligados em N, Neu5ac UEAI + Fucose MAA + Neu5Aca-3Galb4GlcNAc- ACA + Galb3GalNAca-0-R (antigénio T), lactose AIA + Gala6 ou Galp3GalNAc (antigénio T), lactose ABA + Gal-GalNAcoí-O-R, glicanos ligados em 0 PHAL 63ΐΒ461οΝΑοβ6Μ3η, N-glica-nos ramificados complexos

Os resultados estão apresentados na Fig. 12.

As lectinas claramente demonstram afinidade diferencial, proporcionando informação sobre a estrutura geral da decoração de glicanos acessível da proteína IL-7 purificada em solução. Assim, ACA, ABA e AIA possuem afinidade para Gal e GalNAc. As três lectinas responderam positivamente sugerindo a presença de estruturas de N- e 0- 93 ΡΕ1904635 glicanos possuidores destes monossacáridos. O sinal especifico obtido com ABA revela a presença de estruturas de 0-glicanos. ACA possui um sinal fraco comparativamente com AIA e em menor grau com ABA. Isto revela que os 0-glicanos são prolongados com pouco GalNAc como resíduo terminal. LEA possui afinidade para GalNAc indicando a presença de estruturas N-glicanos. Entre as lectinas específicas de GlcNAc específicas testadas (dados não apresentados), apenas os possuidores de afinidade para N-acetilgalactosamina revelam um sinal positivo. WGA apresentou um sinal fraco devido a uma baixa afinidade de ligação para estruturas centrais de glicanos ligados em N. Os N-glicanos altamente complexos mascaram a estrutura central e tornam difícil o funcionamento da afinidade das lectinas. UEA. I possui actividade específica para a presença de fucose ramificada. A ligação é muito fraca indicando uma fucosilação incompleta mas eficaz dos N-glicanos. MAA possui afinidade para ácidos siálicos terminais. 0 sinal MAA é forte, indicando uma sialilação eficaz em N- e 0-glicanos. PHA.L possui afinidade para estruturas complexas ramificadas de N-glicanos e mostrou um sinal forte, corroborando os resultados de MAA. 0 sinal PHA-L sugere a presença de grandes N-glicanos tri- ou tetra-antenários. 94 ΡΕ1904635 O-glicanos mais típicos de mamíferos caracterizados em hIL-7 derivada de CHO (quando aplicável):

Galactose

N-acetilgalactosamina Ácido siálico

Em conjunto, estas análise indicam que o sistema de expressão baseado em células CHO usado gera IL-7 humana com oligossacárido N-ligado complexo (triantenário), como descrito na figura que se segue, ramificado no seu resíduo ASN na posição 70, 91 e 116 com sialilação parcial a completa, até 10 resíduos de ácido siálico. Igualmente, IL-7 derivado de CHO possui um O-glicano na posição T110.

Assim, o lote de hIL-7, apesar de portador dos N-glicanos e O-glicanos sialilados complexos, ainda contém uma mistura de proteínas totalmente e parcialmente glicosiladas.

Exemplo F: Substância fármaco até produto fármaco: Formulação, armazenamento e estabilidade a longo prazo de hIL-7 recombinante expressa em células CHO. A pesquisa da formulação óptima da substância fármaco foi conduzida através de um estudo de matriz 95 ΡΕ1904635 combinatória para avaliar o impacto de várias condições de stress (temperatura, tampão, pH, concentração modificadora da tonicidade, agitação, iluminação intensa) na estabilidade a longo prazo da proteína purificada. IL-7 humana recombinante purificada altamente complexa mostrou-se estável em tampão acetato assim como em tampão succinato, numa concentração que varia entre 5 e 50 mM. Os pHs adequados foram escolhidos entre pH = 5,0 e 7,0 e um armazenamento ideal a temperaturas entre cerca de -20°C e +4°C.

Os açúcares e tensioactivos (polímeros de polis-sorbato) podem ser adicionados à preparação em concentração baixa para evitar a agregação solúvel não covalente.

Em tais condições, IL-7 pode ser guardada a +4°C (na forma líquida) numa concentração que varia entre 0,5 e 8,0 mg/ml, de preferência entre 2,0 e 4,0 mg/ml, durante mais de 12 meses. A composição farmacêutica na forma líquida possui melhor perfil de estabilidade

Exemplo G. Análise da actividade proliferativa de IL-7 humana recombinante derivada de células de mamífero num bioensaio específico A actividade biológica de IL-7 humana recombinante derivada de células de mamífero foi avaliada num 96 ΡΕ1904635 bioensaio específico numa linha de células pré-B murina derivada de células da medula óssea de murganhos CBA/C57BL, PB-1 (German Cell Bank DSMZ, Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen und Zellkulturen), estritamente dependentes de IL-7 para o crescimento (Mire-Sluis et al. ; 2000; J.

Immunol. Methods; 236:71-76). Estas células foram mantidas em cultura em meio contendo IL-7 comercial e que jejuaram relativamente a IL-7 para se realizar o bioensaio.

Os bioensaios foram corridos com amostras de IL-7 a serem testadas, em paralelo com controlo positivo de IL-7 derivada de E. coli e um controlo negativo sem IL-7. IL-7, derivada do controlo ou de amostras, adicionada à cultura celular que jejuou, induziu a re-iniciação dependente de dose da proliferação celular durante a qual a timidina marcada radioactivamente (3H-Tdr, Amersham) foi incorporada pelas células em divisão. A quantidade de marcação foi pulsada e medida em contagens por minuto (cpm) num contador de radiação beta de cintilação liquida (Wallack).

Como alternativa, este bioensaio pode ser con duzido usando um marcador corado que reflecte o metabolismo geral da célula, como seja corante MTT (3-(4,5-dime-tiltiazole-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, reduzido pela acti-vidade RedOx mitocondrial) ou corante MTS (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio).

Diluições seriadas do controlo positivo e das amostras a serem testadas permitiu a representação do nú- 97 ΡΕ1904635 mero de cpm em função da quantidade de amostra/controlo testado. A Figura 13 apresenta os dados e curvas cinéticas de dose-resposta obtidos de rotina num bioensaio típico: o crescimento de células PB-1 foi induzido por r-hIL-7 não glicosilado (expresso em E. coli) ou r-IL-7 altamente glicosilado (produzido em células de mamífero). (Os dados representam a média ± DP de determinações em triplicado). A Figura 14 apresenta os dados e curvas cinéticas de dose-resposta obtidos de rotina num bioensaio típico: o crescimento de células PB-1 foi induzido por r-hIL-7 não glicosilado (expresso em E. coli) ou r-IL-7 altamente glicosilado ou hiperglicosilado (produzido em células de mamífero) . (Os dados representam a média ± DP de determinações em triplicado). O parâmetro a ser considerado para cada amostra foi o ED50 = concentração (ng/ml) que origina metade da actividade máxima. Uma ED50 mais elevada significa uma actividade mais baixa. A comparação da actividade entre os lotes de IL-7 é abordada através da análise do parâmetro curva dose-resposta, como seja o coeficiente de declive, actividade máxima. A partir de todos os parâmetros da curva, uma concentração ED50 (em ng/ml) reúne toda a variação de parâmetros. ED50 corresponde à dose de IL-7 necessária para 98 ΡΕ1904635 induzir metade da actividade de indução máxima possível in vitro. Neste contexto, as moléculas altamente bioactivas correspondem a valores de ED50 baixos, enquanto concentrações de ED50 mais elevadas serão típicas de preparações de IL-7 menos bioactivas in vitro.

No entanto, as diferenças de bioactividade in vitro não são necessariamente representativas de diferenças de bioactividade in vivo semelhantes no presente invento.

Exemplo Η. A avaliação in vivo da imunogenicidade do polipéptido IL-7 hiperglicosilado em primatas IL-7 símia hiperglicosilada (sIL-7) expressa na linha celular CHO (Exemplos A2, A6 e B) e purificada de acordo com o Exemplo D, foi avaliada in vivo relativamente à ocorrência de potencial imunogenicidade, após administrações repetidas de sIL-7 em primatas normais.

Macacos cinomologos (Macaca fascicularis) adultos jovens naives (n=4) entraram no estudo e receberam sIL-7 hiperglicosilada ao nível da dose de 100 pg/kg/injecção. Os animais tratados receberam um total de 6 administrações subcutâneas de IL-7 ao longo de um período de cinco semanas consecutivas. Os animais foram observados do ponto de vista clínico ao longo de um período de dois meses. As amostras de sangue foram colhidas, em diferentes pontos de tempo, ao longo do estudo: no dia 1 antes da administração de sIL-7, no dia 37 e no final do estudo. 99 ΡΕ1904635

Todos os animais sobreviveram ao estudo e não tiveram reacção adversa à terapia com sIL-7. A administração de sIL-7 foi bem tolerada localmente. Quando testados para interferência num ensaio de ELISA especifico tendo como objectivo a detecção da ligação de anticorpos, nenhuns anticorpos anti-sIL-7 foram detectados no soro de todos os animais tratados. Comparativamente, IL-7 recombinante derivado de E. coli, ainda que produzida como produto fármaco altamente purificado, induziu, num protocolo semelhante, a produção em soros de títulos elevados de anticorpos que se ligam a IL-7, variante entre 1:400 e 1:5000.

Exemplo I. Actividade biológica in vivo do polipéptido IL-7 hiperglicosilado em primatas IL-7 humana (hIL-7) hiperglicosilada expressa na linha celular CHO (Exemplos Al, A6 e B) e purificada como no Exemplo D, foi avaliada in vivo para determinação dos perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos de hIL-7 em primatas humanos. Macacos cinomologos (Macaca fascicularis) adultos jovens naives foram incluídos no estudo e divididos em dois grupos: não tratados n=2 e tratados como hIL-7 100 pg/kg/injecção n=2. Os animais tratados receberam uma única administração subcutânea de hIL-7. Os animais foram observados em termos clínicos durante 45 dias. Colheram-se amostras de sangue, em diferentes pontos de tempo, ao longo do estudo: nos dias 1 (0, 3, 6, 9 e 12 horas pós-injecção), 2, 3, 4, 7, 21 e 45. 100 ΡΕ1904635 A administração de hIL-7 foi bem tolerada sem reacção local no local da injecção. Após uma única administração subcutânea de hIL-7 em macacos, o padrão e parâmetros farmacocinéticos de hIL-7 foram estabelecidos a partir das primeiras 72 horas: 0 perfil no plasma mostrou um declínio bi-exponencial após o pico de absorção. - A semi-vida do produto observada no plasma foi na gama de 30/40 horas. Esta semi-vida foi significativamente aumentada quando comparada com a semi-vida observada para IL-7 recombinante derivada de E. coli (5 a 8 horas) administrada nas mesmas condições. Isto reflecte uma maior estabilidade in vivo do polipéptido IL-7 hiper-glicosilado no sangue. - 0 tempo de residência média (MRT) foi de 40 horas versos cerca de 10 hrs com o produto de E. coli. - 0 tempo para atingir uma concentração máxima foi de 180 minutos.

Concluindo, o estudo farmacocinético mostra que o polipéptido IL-7 hiperglicosilado deste invento apresenta um perfil farmacocinético melhorado e prolongado, o qual se traduz em efeitos farmacodinâmicos melhorados. A injecção única de hIL-7 a 100 pg/kg induziu um aumento significativo nos números de células T periféricas CD3+CD4+ e CD3+CD8+. 101 ΡΕ1904635

Respectivamente 200% e 170% de alterações dos valores da linha de base pré-tratamento. O número de células linfó-citos T (CD4 e CD8) expressando a cadeia alfa específica do receptor de IL-7 (CD127) decresce transitoriamente no sangue periférico logo às 6 horas pós-injecção. As células linfócitos T CD127 reapareceram, no sangue periférico, 48 horas após injecção e voltaram aos valores de linha de base apenas 7 dias pós-injecção. Após administração única subcutânea de IL-7 recombinante derivada de E. coli, o retorno total para valores de linha de base das células linfócitos T expressando CD127 ocorreu 4 dias após injec-ção. A cinética de ocupação de receptores do polipéptido IL-7 hiperglicosilado é mais longo comparativamente com IL-7 recombinante derivado de E. coli, reflectindo a semi-vida mais longa do polipéptido IL-7 hiperglicosilado em primatas como mostrado abaixo. Estes resultados estão em linha com resultados anteriores mostrando que, apesar da administração IV de IL-7 resultar numa melhor biodisponibilidade, isto não se traduz em efeitos farmacocinéticos melhorados, de facto o perfil de entrega melhorado obtido por injecção subcutânea é mais eficiente que o perfil de entrega agudo obtido após injecção IV. Aqui a hiperglicosilação da proteína induz um perfil cinético prolongado, o qual por sua vez se traduz numa melhor actividade farmacodinâmica. Face a este perfil prolongado espera-se igualmente uma melhor tolerância clínica, devido aos efeitos secundários do fármaco estarem geralmente associados às concentrações dos picos. 102 ΡΕ1904635 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Chytheris <120> IL-7 glicosilada, preparação e usos <130> B0346WO <160> 19 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Asp Cys Asp Ile GXu Gly Lys Asp Gly Lys Gin Tyr Glu Ser Vai Leu 1 5 10 15

Met Vai Ser Xle Asp Gin Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30

Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg Eis Ile Cvs Asp 35 40 45

Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60

Gin Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu Bis Leu Leu 65 70 75 80

Lys Vai ser Glu Gly Thr Thr lie Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gin Vai 85 90 95

Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gin Prò Thr Lys Ser 100 105 · 110

Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gin Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125

Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gin Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140

Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu Eis 145 150 103 ΡΕ1904635 <210> 2 <211> 537

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(537) <223> EPy-7-hIL-7 optimizado <400> 2 atg ggt gtt cat gaa tgt cet gct tgg Met 1 Gly vai His Glu 5 Cys Pro Ala Trp ttg tct ttg gtt ctg ttg cct gta gcc Leu Ser Leu Vai Leu Leu Pro Vai Ala 2.0 25 âââ gat ggg aag cag tat gag tcc gtg Lys Asp Gly Lys Gin Tyr Glu Ser Vai 35 40 ttg ttg gee tec atg aaa gaa att ggg Leu Leu Asp Ser Hat Lys Glu Xle Gly 50 55 ttt aac ttc ttt aag ege cat ate tgt Phe Asn Phe Phe Lys 'Arg His Xle Cys 65 70 ttt ttg tte ege gct gct cgg eecf ttg Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu 85 tct act ggt gat ttc gat ctc cac ctc Ser Thr Qiy Asp Phe Asp Leu Ris Leu 100 105 act ate ctg ttg aac tgc act ggc cag Thr Xle Leu Leu Asn Cya Thr Gly Gin 115 120 gcc ctg ggt gaa gcc caa ccg a ca aag Ala Leu Gly Glu Ala Gin Pro Thr' Lys 130 135 ttg aag gaa cag aag aag ctg aac gac teu Lys Glu Gin Lys Lys Leu Asn Asp 145 150 ttg cag gag afct aag act tgt tgg aat Leu Gin Glu Xle Lys Thr Cys Trp Asn 165 gag cat tga taa

Gin Bis <210> 3 ttg tgg ttg ttg ttg tct ttg 48 Leu 10 Trp Leu Leu Leu Ser 15 Leu tct gat tgc gat att gaa ggg 96 Ser Asp Cys Asp Xle 30 Glu Gly ctg atg gtg age ate gat caa 144 Leu Met Val Ser 45 Xle Asp Gin agt aac tgc ctg aat aac gaa 192 Ser Asn Cys 60 Leu Asn Asn Glu gat gct aat aag gaa ggt atg 240 Asp Ala Asn 75 Lys Glu Gly Met 80 ege cag ttc ctt aag atg aac 288 Arg 90 Gin Phe Leu Lys Met 95 Asn ctg aaa gtt tcc gaa ggg act 336 Leu Lys Val Ser Glu 110 Gly Thr gtt aaa gga aga aaa coo gct 384 val Lys Gly Arg 125 Lys Pro Ala agt ttg gaa gaa aat aaa tct 432 Ser Leu Glu 140 Glu Asn Lys Ser ttg tgt ttc ctg aag ege ctg 480 Leu Cys Phe 155 Leu Lys Arg Leu 160 aag ate ttg atg ggg act aag 528 Lys 170 Xle Leu Met Gly Thr 175 Lys 540 104 ΡΕ1904635

<211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15

Leu Ser Leu Vai Leu Leu Pro Vai Ala Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly 20 25 30

Lys Asp Gly Lys Gin Tyr Glu Ser Vai Leu Met Vai Ser Ile Asp Gin 35 40 45

Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asa Glu 50 55 60

Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met 65 ‘ 70 75 80

Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gin Phe Leu Lys Met Asn 85 ÔQ 95

Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Vai Ser Glu Gly Thr 100 105 110

Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gin Vai Lys Gly Arg Lys Pro Ala 115 120 125

Ala Leu Gly Glu Ala Gin Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser 130 135 140

Leu Lys Glu Gin Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu 145 “ 150 155 160

Leu Gin Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys 165 170 175

Glu His <210> 4 <211> 537 <212> DNA <213> simio 48 ΡΕ1904635 105 <22 0> <221> CDS <222> (D · · (537) <223> EPy7- sIL-7 optimizado <400> 4 atg ggt gtt cat gaa tgt cet gct tgg ttg tgg ttg ttg ttg tct ttg Hat Gly Vai Sis Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu i; 5 10 15 fetg tct ttg gtt ctg ttg cet gta gcc tct gat tgc gat att gaa ggg Leu Ser Leu Vai Leu Leu Pro vai Ala Ser Asp Cys Asp lie Glu Gly 30 25 30 aaa gafe ggg aag cag tafc gag tce gtg ctg atg gtg age ate gat caa Lys Asp Gly Lys Gin Tyr Glu Ser Vai Leu frfet Vai Ser Ile Asp Gin 35 40 45 fetg ttg gac tce atg aaa gaa att 9W agt aac tgc ctg aat aac gaa Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu 50 55 60 fett aac ttc ttt aag ege cat ctg tgt gat gat aat aag gaa ggt atg Ph® Asr. Phe Phe Lys Arg His Leu Cys Asp Asp Asn Lys Glu Gly Met 65 70 75 80 ttt ttg ttc ege gct gct cgg aag ttg ege cag fcte ctt aag atg aac Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gin Phe Leu Lys t4et Asn 85 90 95 tct act ggt gat ttc gat etc cac cfcc ctg aaa gtt tcc gaa ggg act Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Vai Ser Glu Gly Thr 100 105 110 act ate ctg ttg aac tgc act ggc aag gtt aaa gga aga aaa ccc gct Thr Ue Leu Leu Asn Cys Thr Gly Lys Vai Lys Gly Arg Lys Pro Ala 115 120 125 gcc ctg ggt gaa ccc ca a ccg acra aag agt ttg gaa gaa aat aaa tct Ala Leu Gly Glu Pro Gin Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser 130 135 140 ttg aag gaa cag aag aag ctg aac gac tcc tgt ttc ctg aag ege ctg Leu Lys G2 u Gin Lys Lys Leu Asn Asp Ser Cys Phe Leu Lys Arg Leu 145 150 155 160 ttg cag aag att aag act tgt tgg aat aag ate ttg atg ggg act aag Leu Gin Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ue Leu Met oiy Thr Lys 165 270 175 96 144192 240 288 336 384 432480 528 gag cat tga Glu His <210> 5 <211> 178 <212> PRT <213> símio <400> 5 537 106 ΡΕ1904635 Mét Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15

Leu Ser Leu Vai Leu Leu Pro Vai Ala Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly '20 25 30

Lys Asp Gly Lys Gin Tyr Glu Ser Vai Leu Met Vai Ser Ile Asp Gin 35 40 45

Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu SO . 55 60

Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Leu Cys Asp Asp Asn Lys Glu Gly Met 65 70 75 80

Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gin Phe Leu Lys Met Asn 85 90 95

Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Vai Ser Glu Gly Thr 100 105 110

Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Lys Vai Lys.Gly Arg Lys Pro Ala 115 120 125

Ala Leu Gly Glu Pro Gin Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser 130 135 140

Leu Lys Glu Gin Lys Lys Leu Asn Asp Ser Cys Phe Leu Lys Arg Leu 145 150 155 ISO

Leu Gin Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys 165 170 · 175

Glu His <210> 6 <211> 480 <212> DNA <213> canino <22 0> <221> CDS <222> (1)..(480) <223> Epy7-cIL-7 107 ΡΕ1904635 <400> 6 atg ÇfÇft gtt cat gaa tgt cct gct tgg ttg tgg ttg ttg ttg tct ttg 48 Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 ttg tct ttg gtt ctg ttg cct gta gee tct gat tgt gat att gaa ggc 96 Leu Ser Leu Vai Leu Leu Pro Vai Ala Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly' 20 25 30 aaa gac ggc aga gag tat cag cac gtt cts atg ate age ate aat gac 144 Lys As p Gly Arg Glu Tyr Gin His Vai Leu Met Ile Ser Ile Asn Asp 35 40 45 ttg gac ate atg ata aaa aat cgt acc aat tgc teg aat aat gaa cct 192 Leu Asp Ile Met Ile Lys Asn Arg Thr Asn Cys Ser Asn Asn Glu Pro 5Ô 55 60 aac att tta aaa cat gea tgt gat gat aat aag gaa ggt atg ttt 240 Asn Ile Leu Lys Lys ftis Ala Cys Asp Asp Asn Lys Glu Gly Met Phe 65 70 75 80 fcfca tat cgt gct gct eac aag ttg aag caa ttt gtt aaa gtg aat aac 288 Leu Tyr Arg Ala Ala His Lys Leu Lys Gin Phe Val Lys Val Asn Asn 85 90 95 agt gag gat ttc aat ctc cac tta tea aga gtt tea cag ggc aca tta 336 Ser Glu Asp Phe Asn Leu His Leu Ser Arg Vai Ser Gin Gly Thr Leu 100 105 110 caa ttg ttg aac tgt act ccc aag gaa gac aat â.íàâ tct tta aag gaa 384 Gin Leu Leu Asn Cys Thr Pro Lys Glu Asp Asn Lys Ser Leu Lys Glu 115 120 125 cag aga aaa cag aag age ttg tgt tcc cta ggg ata cta cta caa aag 432 Gin Arg Lys Gin Lys Ser Leu Cys Ser Leu Gly Ile Leu Leu Gin Lys 130 135 140 ata aaa act tgt tgg aac aaa att ttg agg ggC tct aaa gaa cat tga 480 lie Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Arg Gly Ser Lys Glu His 145 150 155 <210> 7 <211> 159 <212> PRT <213> canino <400> 7 108 ΡΕ1904635

Met Giy Vai His Slu Cys Pro Ma Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 15 10 15

Leu Ser Leu Vai Leu Leu Pro Vai Ma Ser Asp Cys Asp Xle Glu Giy 20 25 30

Lys Asp Giy Arg Glu Tyr Gin His Vai Leu Met Ile Ser Xle Asn Asp 35 40 45

Leu Asp Ile Met Ile Lys- Asn Arg Thr Asa Cys Ser Asn Asn Glu Pro 50 ,55 60

Asn Xle Leu Lys Lys His Ala Cys Asp Asp Asn Lys Glu Giy Met Phe 65 70 75 80

Leu Tyr Arg Ala Ala His Lys Leu Lys Gin Phe Vai Lys Vai Asn Asn 85 90 95

Ser Glu Asp Phe Asn Leu fiis Leu Ser Arg Vai Ser Gin Giy Thr Leu 100 105 . 110

Gin· Leu Leu Asn Cys Thr Pro Lys Glu Asp Asn Lys Ser Leu Lys Glu 115 120 125

Gin Arg Lys Gin Lys Ser Leu Cys Ser Leu Giy Ile Leu Leu Gin Lys 130 135 140

Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Arg Giy Ser Lys Glu His 145 150 155

<210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> sequência artificial <220> <223> descrição da sequência artificial: domínio mutado <400> 8 ctga&taaeg aaactaac 18

<210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> sequência artificial 109 ΡΕ1904635 <22 0> <223> descrição da sequência artificial: domínio mutado <400> 9 aacttcacta ag 12 <210> <211> <212> <213> 10 12 DNA sequência artificial <22 0> <223> descrição da sequência artificial: domínio mutado <400> 10 gecaacggta ce 12 <210> <211> <212> <213> 11 15 DNA sequência artificial <22 0> <223> descrição da sequência artificial: domínio mutado <400> 11 otgaacgaca gctgt 15 <210> <211> <212> <213> 12 12 DNA sequência artificial <22 0> <223> descrição da sequência artificial: domínio mutado <400> 12 atcttgaacg gg 12

<210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13

Met Phe His Vai Ser Phe Arg Tyr Xle Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile 3- 5 10 15

Leu Vai Leu Leu Pro Vai Ala Ser Ser 20 25 <210> 14 110 ΡΕ1904635

<211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met Gly Vai His Glu Cys Pro Ma Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu X 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Vai Leu Gly 20 25

<210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gin Leu Ser Leu X s 10 15

Gly

<210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pro 1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly 20

<210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Met Lys Leu Vai Phe Leu Vai Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Vai 1 5 10 15

Ala Leu Ala <210> 18 <211> 20 111 ΡΕ1904635

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Met Ma Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ma Tiir Leu Ma 15 10 15

Vai Ma Leu Mà 20

<210> 19 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> descrição da sequência artificial: péptido sinal quimérico <400> 19

Met Oly Vai His Glu Cys Pro Ma Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 .15

Leu Ser Leu Vai Leu Leu Pro Vai Ma Ser 20 25

Lisboa, 24 de Fevereiro de 2012

Claims (19)

1 ΡΕ1904635 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipéptido IL-7 de mamífero hiper-glicosilado purificado, em que o referido polipéptido IL-7 hiperglicosilado possui pelo menos três resíduos de amino-ácidos glicosilados, possui um ponto isoeléctrico médio inferior a 6,5 e um peso molecular médio superior a 27 kDa conforme determinado por electroforese em gel de SDS.

2. Uma composição de IL-7 hiperglicosilada, em que a referida composição compreende pelo menos 80% de polipéptidos IL-7 de mamífero tendo pelo menos três resíduos de aminoácidos glicosilados, um ponto isoeléctrio médio inferior a 6,5 e um peso molecular médio superior a 27 kDa conforme determinado por electroforese em gel de SDS .

3. A composição da reivindicação 2, em que a referida composição compreende entre 80% e 95% de polipéptidos IL-7 de mamífero, os quais são N-glicosilados em pelo menos três resíduos de aminoácidos distintos.

4. A composição da reivindicação 2 ou 3, a qual compreende pelo menos 80% de polipéptidos IL-7 de mamífero, os quais estão glicosilados em três a oito resíduos de aminoácidos distintos, incluindo um local de O-glicosilação e até sete locais de N-glicosilação. 2 ΡΕ1904635

5. A composição da reivindicação 4, que compreende entre 80% e 95% dos polipéptidos IL-7 de mamífero os quais estão glicosilados em três a oito resíduos de aminoácidos distintos, incluindo um local de 0-glicosilação e até sete locais de N-glicosilação.

6. A composição de qualquer uma das reivindicações 2 a 5, em que o polipéptido IL-7 de mamífero é um polipéptido IL-7 humano.

7. A composição de qualquer uma das reivindicações 2 a 5, em que o polipéptido IL-7 de mamífero é um polipéptido IL-7 canino.

8. A composição ou polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que os locais de glicosilação estão naturalmente presentes e/ou são artificialmente criados na sequência polipeptídica de IL-7.

9. A composição ou polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o polipéptido IL-7 de mamífero é um polipéptido humano e em que os locais de glicosilação são seleccionados entre resíduos Asn nas posições 70, 91 e 116; Thre na posição 110, assim como quaisquer locais de glicosilação criados artificialmente apresentados na Tabela abaixo ΡΕ1904635 3 Lys28Asn; íieSGThr i!e3DAsn; Ser32Thr Leu35Ser IÍu35Thr G!u38Ser G!u38Thr Phe39Ser Phe39Thr Phe42Ser Phe42Thr G!u52Sêf GkJ52fhT Val82Asn ; Giu84Ser Val82Àsn; C5íu84inhr Lys97Asn:Arg99Ser Lys97Asn; Arg99Thr ASa102Asn; Leu1Q4$er Àia 102Àsn ; Leu 104Thr teu104Asn ; Glu108Ser Leui 04Àsn ;Gi u106Thr Leu128Ser Leu128Thr liei 46Asn ; Met 147Ser ile145Asn; M^WThT Met147Asn; Thr149$er e, de preferência como apresentado na tabela abaixo 4 ΡΕ1904635 Phe39Ser Phe39Thr " _____ Phe42Thr Leu1Õ4Àsn; Glu1Q6Ser Leu104Asn ; Giu106Thr _____ LeuÍ28Thr Mei147Asn ; Thr149Ser ou uma combinação dos mesmos.

10. A composição ou polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que os referidos polipéptidos IL-7 compreendem ou estão enriquecidos em açúcares ligados em N seleccionados entre: a) Uma cadeia de açúcar tipo mamífero, de preferência do tipo expresso pelas células CHO; b) Uma cadeia de açúcar compreendendo uma cadeia de N-açúcar complexa (e.g.r uma estrutura triantenária ou biantenária), mais de preferência contendo moléculas de manose e acetilglucosamina elevadas e resíduos de ácido siálico terminais elevados; c) Uma cadeia de açúcar sialilada por alfa2,6-sialiltransferase ou alfa2,3-sialiltransferase; e/ou d) uma cadeia de açúcar sialilada apresentando 5 ΡΕ1904635 entre 3 e 30 sialil-N-acetilgalactosamina, de preferência 7 a 23.

11. A composição ou polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que os referidos polipéptidos IL-7 compreendem ou estão enriquecidos em cadeias de açúcar ligados em O com um resíduo de ácido siálico terminal.

12. A composição ou polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que as cadeias de açúcar compreendem estruturas tetra-antenárias a biantenárias com sialilação terminal parcial ou completa, mais de preferência uma estrutura triantenária e tri- ou bi-sialilação e/ou uma estrutura diantenária com disialilação.

13. A composição ou polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que os referidos polipéptidos IL-7 hiperglicosilados mostram in vivo uma semi-vida e um tempo de residência média prolongados em hospedeiro mamífero.

14. A composição ou polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o referido polipéptido IL-7 hiperglicosilado compreende as seguintes três pontes Cys : 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5(Cys34.Cysl29); 3-6(Cys47-Cysl41).

15. A composição ou polipéptido da reivindicação 14, em que o referido polipéptido IL-7 hiperglicosilado é um polipéptido de SEQ ID NO:l. 6 ΡΕ1904635

16. Um método de produção de um polipéptido IL-7 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, compreendendo: a) Cultura, num modo de alimentação continua ou perfusão, de uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante codificador de um polipéptido IL-7, b) Colheita do polipéptido IL-7 produzido a partir da referida célula e c) purificação do referido polipéptido IL-7 por um método compreendendo pelo menos um passo de cromatografia de interacção hidrofóbica, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade ou cromatografia de filtração em gel, sozinho ou várias combinações.

17. Uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido ou composição de IL-7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente compatíveis.

18. Um polipéptido ou composição de IL-7 hiper-glicosilado de qualquer uma das reivindicações 1 a 15 para usar na indução ou modulação de uma resposta imune num indivíduo. 7 ΡΕ1904635

19. O polipéptido ou composição de IL-7 hiper-glicosilado da reivindicação 18, para usar na indução de estimulação de linfopoiese prolongada e/ou amplificação de uma resposta imune. Lisboa, 24 de Fevereiro de 2012