BRPI0614536A2 - conjugados quìmico-farmacêuticos de ácido hialurÈnico e/ou seus derivados, composições farmacêuticas, biomateriais tridimensionais, uso dos conjugados quìmicos-farmacêuticos, e, processo para a preparação dos conjugados quìmico-farmacêuticos - Google Patents
conjugados quìmico-farmacêuticos de ácido hialurÈnico e/ou seus derivados, composições farmacêuticas, biomateriais tridimensionais, uso dos conjugados quìmicos-farmacêuticos, e, processo para a preparação dos conjugados quìmico-farmacêuticos Download PDFInfo
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Abstract
CONJUGADOS QUìMICO-FARMACêUTICOS DE áCIDO HIALURÈNICO E/OU SEUS DERIVADOS, COMPOSIçõES FARMACêUTICAS, BIOMATERIAIS TRIDIMESIONAIS, USO DOS CONJUGADOS QUìMICO-FARMACêUTICOS, E, PROCESSO PARA A PREPARAçãO DOS CONJUGADOS QUìMICO-FARMACêUTICOS. A invenção refere-se a um novo grupo de bioconjugados que pode ser obtido por meio de síntises indireta, através de um espaçador molecular, entre ácido hialurónico e/ou seus derivados e drogas com uma atividade antitumoral que pertene a diferentes grupos, a seu processo de preparação e ao seu uso no campo oncológico. Os novos derivados, em relação ao tipo de ligação e grau de usbstituição, têm diferentes propriedades físico-químicas que melhoram sua tolerabilidade e eficiência e permitem uma modulação mais precisa da dosagem, explorando um mecanismo de alvejamento de ativo.
Description
"CONJUGADOS QUÍMICO-FARMACÊUTICOS DE ÁCIDO HIALURÔNICO E/OU SEUS DERIVADOS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, BIOMATERIAIS TRIDIMENSIONAIS, USO DOS CONJUGADOS QUÍMICO-FARMACÊUTICOS, E, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DOS CONJUGADOS QUÍMICO-FARMACÊUTICOS''
O desenvolvimento de um tumor, seu crescimento e progressão para metástases primárias e secundárias são processos biológicos altamente complexos que requerem uma organização seqüencial de eventos celulares (organo-seletivos) coordenados entre si.
A disseminação de células tumorais que leva à formação de uma metástase ocorre como resultado de sua remoção do sítio de crescimento primário seguida por sua penetração no leito circulatório e/ou no sistema linfático.
Nos últimos poucos anos, o conhecimento progressivo de processos vitais que provocam o início, desenvolvimento, disseminação e implante de um tumor e sua metástase, tem não somente oferecido aos pesquisadores a possibilidade de estudar, sintetizar e/ou experimentar novas moléculas químicas como novos agentes antitumorais, mas tem também facilitado o estudo e o aperfeiçoamento de novas terapias de tratamento que superam os problemas ligados à toxicidade de drogas anti-neoplásticas e, acima de tudo, um entendimento dos mecanismos químicos-biológicos que provocam resistência à droga acima.
Um dos principais problemas ligados ao tratamento de tumores, de fato, se refere à possível "resistência" do tumor ao tratamento farmacológico após uma resposta inicial positiva.
Estas "resistências" são associadas com variações no funcionamento da célula tumoral, tais como, por exemplo:
- alterações no transporte celular da droga;
- alterações na afinidade com relação a esta na parte de um inibidor metabólico possível;
- aumento substancial na capacidade da própria célula de desativar a droga.
Os experimentos científicos recentemente publicados (Misra et aL, The Journal of Biological Chemistryj 2003, 20 278(28):25285-25288) têm demonstrado como o pré/co-tratamento in vitro de células tumorais resistentes
a algumas drogas de quimioterapia com oligômeros de ácido hialurônico tendo um peso molecular muito baixo restabeleceu a sensibilidade inicial da célula à droga. Os dados experimentais assim obtidos, contudo, não têm esclarecido completamente como/porque a sensibilidade à quimioterapia é restabelecida, mesmo se tiver sido observado que estes oligômeros sejam capazes de interferir em vários eventos moleculares dentro da célula responsável pela aquisição de resistência à droga e, portanto, do crescimento e difusão do tumor.
A ação farmacológica do oligômero acima se torna possível porque, como ele se liga ao receptor de CD-44 (especificamente de ácido hialurônico), ele gerencia para interferir negativamente na ligação HA nativo- receptor, uma interação que é responsável pela coordenação de várias funções celulares e, acima de tudo, da célula tumoral.
Através de sua ligação (e internalização subseqüente) com seu receptor presente na membrana celular, o HA de fato precipita na ativação de muitos eventos que são de fundamental importância para a vida da célula, tais como, por exemplo, a regulação dos processos de adesão/crescimento e migração celular, ele entra no mecanismo quimiostático durante os processos inflamatórios, exerce um papel principal nos processos de cicatrização e, como mencionado acima, na migração de células tumorais para a formação de metástases.
Muitos tumores sólidos têm, na verdade, mostrado altas quantidades de HA que podem conseqüentemente facilitar a invasão de outros tecidos e órgãos na parte de células tumorais.
As formas tumorais, tais como, por exemplo, carcinomas, melanomas, linfomas, tumores de mama, tumores cólon-retais e de pulmão, sobre-expressam o receptor de transmembrana CD-44: nestas linhagens celulares, experimentos efetuados com anticorpos anti-receptor (que conseqüentemente "bloqueiam" o receptor evitando sua ligação com o HA nativo) têm mostrado a capacidade efetiva de inibir o crescimento e as metástases tumorais, isto demonstrando como a "interferência" da ligação de HA com seu receptor provoca um distúrbio de vários eventos de importância fundamental para a vida da célula e mostrando, conseqüentemente, a participação real do HA no desenvolvimento da massa tumoral.
É sabido que algumas drogas antitumorais que tenham sido usadas por anos no campo oncológico com resultados clínicos satisfatórios tenham sido quimicamente modificadas para:
- superar o problema de sua toxicidade intrínseca com o objetivo de efetuar uma nova estratégia de tratamento que consiste de guiar a droga antineoplástica diretamente para a célula tumoral que a liga ao HA pelo fato de que, como descrito acima, muitos fenótipos tumorais sobre-expressam o receptor de CD-44 específico para HA em sua superfície celular (este é um mecanismo de alveiamento ativo que aumenta a eficácia celular da droga pela redução de sua toxicidade sistêmica). A ligação e internalização do polímero também carregam a droga dentro da célula tumoral, aumentando sua eficácia;
- aumentar sua solubilidade (foi demonstrado que a ligação de drogas lipossolúveis com moléculas fortemente hidrofílicas, tais como, por exemplo, HA, aumenta consideravelmente a solubilidade da própria droga no sistema circulatório).
A solubilidade de drogas de quimioterapia no leito circulatório na verdade representa a condição essencial para sua eficácia farmacológica, algumas drogas, contudo, que têm provado ser extremamente ativas em vários tipos de tumores, tais como, por exemplo, camptotecinas e seus derivados de irinotecan e topotecan, paclitaxel e alcalóides, derivados de Vinca, como resultado de sua alta insolubilidade, têm problemas referentes à administração intravenosa (e, para hormônios e anti-hormônios também intra-muscular) que podem limitar e restringir sua aplicação clínica.
Pelas razões citadas acima (solubilidade e toxicidade), novas drogas de quimioterapia têm sido sintetizadas, que são criadas a partir da ligação química (direta ou indireta por meio de um espaçador que consiste de aminoácidos ou peptídeos com uma cadeia de aminoácidos curta) ou associação simples de algumas drogas antineoplásticas contendo um anel lactônico (tal como, por exemplo, doxorubicin, paclitaxel, vincristina, vinblastina e derivados de camptotecinas) com ácido hialurônico(HA) (Patente U.S. 6,291,671).
Outros conjugados compreendem drogas antineoplásticas tais como paclitaxel e camptotecinas ligadas a um polímero que consiste de ácido poliglutâmico possivelmente associado com HA (Patente U.S. 5.997.163).
Outros novos tipos de drogas de quimioterapia são também conhecidos, representados por doxorubicina antitumoral covalentemente ligada a HA (quimicamente modificado com diidrazida) e a um carreador tal como o polímero hidroxi-propil-metacrilamida (pedido internacional de patente WO 02/090390).
Novas drogas carreadoras são também conhecidas, consistindo de polissacarídeos quimicamente conjugados com cadeias de aminoácido, por sua vez, covalentemente ligadas a drogas antineoplásticas tais como doxorubicin (Patente U.S. 5,688,931). Além disso, pela mesma razão, outros sistemas de liberação têm sido aperfeiçoados, consistindo, por exemplo, na encapsulação de doxorubicina em lipossomos contendo derivados lipídicos de HA (Peer D. et ai, Neoplasia, 2004, 6(4):343-353; Eliaz R.E. et ai, Câncer Research, 2001, 61:2592-2601). É sabido, por exemplo, que para superar os problemas de derivados de camptotecinas, para alternar seu perfil farmacocinético e reduzir sua toxicidade aumentando sua eficácia terapêutica, irinotecan tem sido conjugado com o polímero/carreador carboxi-metil-dextrano por meio de um espaçador representado por um peptídeo de triglicina (Satoshi Okuno et al., Câncer Research, 2000, 60:2988-2995; Patente U.S. 5,892,043).
A pró-droga resultante provou ser ativa em sua eficácia terapêutica, pois ela permanece em circulação por um período de tempo prolongado, aumentando sua acumulação na massa tumoral, reduzindo contemporaneamente sua toxicidade sistêmica; para muitos dos conjugados previamente descritos, contudo, dados experimentais definitivos não são ainda disponibilizados, que documentam sua eficácia com relação à droga não- conjugada.
O derivado de paclitaxel é também conhecido, covalentemente ligado a HA previamente derivatizado com hidrazida (Patente U.S. 5.874.417), ou ligado diretamente a HA, ou indiretamente por meio de um espaçador de uma natureza variável capaz de formar diferentes tipos de ligações químicas que aumentam a solubilidade e conseqüentemente a eficácia da droga (pedido de patente EP 1560854).
A presente invenção descreve e reivindica novos conjugados de HA obtidos da ligação indireta entre o polissacarídeo e as drogas antineoplásticas lipossolúveis, tais como, por exemplo, irinotecan e alcalóides de Vinca, ou com drogas de quimioterapia solúveis ou parcialmente solúveis, tais como doxorubicina e produtos análogos de pirimidina, para superar problemas ligados à sua solubilidade (se presente), sua toxicidade e, acima de tudo, para restabelecer e aumentar a eficácia terapêutica da droga em células tumorais que têm resistência farmacológica adquirida à droga. O estado da técnica representado pelos derivados previamente descritos é conseqüentemente ultrapassado aqui pois o Requerente é capaz de demonstrar a superioridade farmacológica dos novos conjugados, objeto da presente invenção, graças à capacidade citotóxica extremamente alta destes derivados para as células neoplásticas.
Esta nova eficácia farmacológica permite a aplicação em farmacologia clínica de terapias quimioterápicas inovativas, para o tratamento de tumores primários e/ou secundários que não mais respondem a qualquer tratamento médico após a formação de Resistência Multi-Droga (MDR) que geralmente põe em risco a possibilidade de um tratamento efetivo do paciente e, conseqüentemente, em última análise, reduz drasticamente sua expectativa de vida.
Pela solução/superação de MDR, os novos derivados, objeto da presente invenção, mudam o prognóstico final do paciente, conseqüentemente permitindo a solução/redução da patologia tumoral.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve e reivindica um novo grupo de conjugados/derivados e seu processo de preparação, que consiste de ácido hialurônico (HA) (e/ou seus derivados) e drogas antitumorais, indiretamente conjugadas por meio de uma ponte molecular chamada "espaçador" que consiste de uma cadeia alifática, aralifática, alicíclica ou heterocíclica, linear ou ramificada com ou sem heteroátomos.
Em particular, são o objeto da presente invenção os conjugados químico-farmacêuticos de ácido hialurônico e/ou seus derivados obtidos através de uma ligação indireta entre o polissacarídeo e uma droga com uma ação antitumoral, através de um espaçador molecular que forma uma ligação de éster o amida com o grupo carboxílico de HA e/ou seu derivado, com a condição de que o dito espaçador não é uma hidrazida ou um polipeptídeo.
O HA (e/ou um dos seus derivados) e a droga são, portanto, indiretamente conjugados por meio de uma ou mais ligações covalentes do tipo éster ou amida que parcialmente ou totalmente envolvem os grupos carboxílicos do polissacarídeo e uma função química (por exemplo, uma hidroxila, uma carboxila, um grupo amina, etc.) que pertence ao espaçador que, por sua vez, é ligado à droga antitumoral selecionada, como descrito em detalhes abaixo.
Os derivados que podem ser obtidos de acordo com a presente invenção têm diferentes propriedades físico-químicas diferentes que podem ser moduladas através da seleção do tipo de ligação e grau de substituição, de forma
a melhorar as características da droga de quimioterapia inicial, tal como:
- solubilidade,,
- características mecânicas e reológicas,
- resistência à degradação hidrolítica, tornando o novo conjugado mais eficiente em sua ação citotóxica, um derivado que vai ter um novo mecanismo de ação, assim superando a resistência farmacológica à droga adquirida pela célula tumoral (como descrito acima).
Como é sabido, muitas drogas de quimioterapia antitumorais têm uma solubilidade limitada, se não for inexistente, em água ou soluções salinas; isto significa que para a sua administração, uma reclassificação deve ser feita para solventes orgânicos e óleos que, embora trazendo a droga em solução, têm uma toxicidade intrínseca com efeitos colaterais que requerem intervenções de medicamento antes da administração do produto.
Em alguns casos, para a droga de quimioterapia Irinoteearu a forma ativa (SN38) é ainda quimicamente modificada (pró-droga) para torná- la solúvel e para promover a liberação de seu metabólito, que é ativo após a administração intravenosa. Isto, contudo, provoca uma baixa disponibilidade do metabólito SN38 no sítio alvo, portanto, requerendo a administração de altas dosagens citotóxicas com uma conseqüente amplificação de efeitos laterais indesejados. <formula>formula see original document page 9</formula>
A literatura internacional (Mathijssen RH et al.; Clin Câncer Resj 2001, 7:2182-2194) indica que a atividade antitumoral de SN38 é de 100 a 1000 vezes maior com relação à sua pró-droga comercial; conseqüentemente a possibilidade de conjugar SN38 com ácido hialurônico ou um de seus derivados de acordo com a presente invenção, permite compostos com uma eficácia aumentada a ser obtida e, graças à necessidade de menores doses de administração, com menores efeitos colaterais ligados à dispersão da droga em áreas não ligadas por neoplasia. A conjugação de drogas de quimioterapia antitumoral com HA também permite que o princípio ativo seja "direcionado" para seu alvo, e conseqüentemente para o tecido neoplástico. Ênfase é portanto dada a um mecanismo de alveiamento ativo entre o conjugado e a célula neoplástica que aumenta a concentração local de droga próxima á área neoplástica e conseqüentemente a eficácia. Desta forma, além disso, pela redução da distribuição do derivado aos tecidos saudáveis, uma maior tolerabilidade do produto é garantida com relação à droga livre.
Uma segunda vantagem fundamental que deriva da presente invenção é a possibilidade, principalmente graças à presença de HA quimicamente modificado, tecnologicamente transformando o conjugado em um biomaterial tridimensional (a ser aplicado localmente) processado em várias formas, tais como, por exemplo, hidrogel, nano- ou microesferas ou de fibras por sua vez fiadas como produtos tecidos ou não-tecidos; neste caso, a
<formula>formula see original document page 9</formula> matriz de polissacarídeo quimicamente modificada está em próximo contato com a massa tumoral, age como um sistema de liberação controlado da droga no local de aplicação e, portanto, favorece uma maior eficiência na parte da droga sozinha. Quando a ação antineoplástica tiver sido exercida, o derivado se degrada naturalmente e seguramente para o organismo, liberando completamente o princípio ativo antitumoral e ácido hiarulônico. Os produtos gerados pela presente invenção, se estiverem na forma de composições farmacêuticas clássicas ou de biomateriais degradáveis, são portanto caracterizados por uma capacidade de tolerância com relação com princípio ativo não-modificado e uma maior atividade farmacológica, em alguns casos ainda por várias ordens de grandeza com relação àquela expressada pelo princípio ativo que os forma; ambos os efeitos podem ser atribuídos à afinidade específica de ácido hialurônico com receptores tais como CD44 presente nas células tumorais. Estes efeitos são sobressaltados quando a droga conjugada é administrada na forma de um material tridimensional, em contato direto com a neoplasia. A combinação destas características é tal que os derivados/conjugados da presente invenção distintamente superam o que está disponibilizado no estado da técnica na terapia local ou sistêmica de vários tipos de neoplasia e de diferentes origens, que também se tornaram resistentes a uma terapia quimioterápica tradicional.
O ácido hialurônico usado na presente invenção tem um peso molecular que varia de 400 a 3.000.000 Da, preferivelmente variando de 5.000 a 1.000.000 Da, e ainda mais preferivelmente de 30.000 a 500.000 Daj pode ser de uma origem extrativa, fermentativa ou biossintética. A ligação covalente com o espaçador envolve o grupo carboxílico de ácido D- glucurônico da unidade repetitiva do polímero, em uma percentagem que varia de 1 a 100% (grau de substituição), que forma uma ligação éster ou amida com o grupo funcional do espaçador molecular selecionado que conseqüentemente age como uma conexão entre o ácido hialurônico e uma droga quimioterápica.
O agente espaçador consiste de uma cadeia alifática, aralifática,alicíclica ou heterocíclica, linear ou ramificada, contendo heteroátomos ou não, que pode compreender hidroxila, carboxila, carbonila, amina (com a exclusão de hidrazidas e polipeptídeos), grupos epoxú cloretos de ácidos, tióis. nitrilas. halogênios, anidridos, isocianatos e isotiocianatos; brometos, iodetos e cloretos de ácidos carboxílicos com uma cadeia alifática C2 a ClO são preferidos, e, particularmente, brometos, tais como ácido bromopropiônico ou ácido bromobutírico. O grau de substituição preferivelmente varia de 1 a 50% e, ainda mais preferivelmente, de 1 a 20%; para conjugação com doxorubicina uma substituição de 3 a 15% é preferível, enquanto que para conjugação com SN38 uma substituição de 1 a 10% é preferida.
Os derivados de HA que podem ser usados nos novos conjugados, objeto da presente invenção, são listados abaixo:
1. HA salinifícado com bases orgânicas e/ou inorgânicas tendo um peso molecular de 50-730 kDa (EP0138572 BI) ou um alto peso molecular 750-1230 kDa, (EP 535200 BI);
2. Hvaff®: ésteres de HA com álcoois da série alifático, aralifático, cicloalifático, aromático, cíclico e heterocíclico, com uma percentagem de esterificação que pode variar, dependendo do tipo e do comprimento de álcool usado, de 1 a 75%, preferivelmente de 30 a 50% (EP 216453 BI);
3. Hvadd™; amidas de HA com aminas da série alifático, aralifático, cicloalifático, aromático, cíclico e heterocíclico, com uma percentagem de amidação de 1 a 10%, preferivelmente de 4% (EP 1095064 BI);
4. Derivados O-sulfatados de HA até o 4o grau de sulfatação (EP 0702699 BI); 5. ACP®: ésteres internos de HA com uma percentagem de esterificação interna variando de 0,5 a 10% e preferivelmente 5% (EP 0341745 BI);
6. Desacetilados de HA: derivam da desacetilação da fração de N-acetil-glucosamina com uma percentagem de desacetilação preferivelmente variando de 0,1 a 30%, enquanto que todos os grupos carboxila de HA podem ser salinificados com bases orgânicas e/ou inorgânicas (EP 1313772 BI);
7. Hvoxx™: derivados percarboxilados de HA obtidos da oxidação da hidroxila primária da fração de N-acetil-glucosamina com um grau de percarboxilação que varia de 0,1 a 100%, preferivelmente de 25 a 75%. Todos os grupos carboxílicos de HA podem ser salinificados com bases orgânicas e/ou inorgânicas (pedido de patente EP 1339753).
As drogas usadas na reação de conjugação com HA preferivelmente pertencem às seguintes categorias:
- nitrosuréias,
- antimetabólitos: tais como, por exemplo, produtos análogos de ácido fólico (dentre os quais metotrexato), produtos análogos de pirimidina (dentre os quais fluorouracila e Ι-β-D-arabino-fluorosilcitosina: Ara-C),
- alcalóides: tais como, por exemplo, vincristina e vinblastina (alcalóides de Vinca) e o metabólito ativo de irinotecan, SN38,
- antibióticos e produtos análogos: tais como, por exemplo, doxorubicina e epirubicina,
- modifícadores de resposta biológica,
- diterpenóides,
- hormônios sintéticos e anti-hormônios: tais como, por exemplo, estradiol.
Doxorubicina e o metabólito de irinotecan, SN38, são particularmente adequados para os propósitos da presente invenção.
As drogas identificadas e ácido hialurônico (e/ou um de seus derivados) são ligadas indiretamente por meio de um espaçador através da formação de ligações de éster com os seguintes procedimentos:
1. um grupo funcional do espaçador adequadamente selecionado (tal como, por exemplo, um grupo carboxila, um grupo amina, um halogeneto, etc.), também contendo um segundo grupo (chamado "grupo de partida") capaz de reagir com a função carboxila de HA (por exemplo, um halogeneto: bromo, iodo ou cloro) reage com um grupo funcional que pertence à molécula antitumoral representada, por exemplo, por uma hidroxila, uma amina, uma carboxila ou um mercaptano. A reação pode possivelmente requerer a ativação de uma das funções envolvidas por meio de um agente de ativação (por exemplo, a ativação de um grupo carboxila por meio de carbodiimidas). Em uma segunda fase, por contato direto com um sal de tetraalquilamônio (preferivelmente tetrabutilamônio) de HA em um ambiente anidro, o composto consistindo da droga modificada reage dando origem a uma substituição nucleofilica do grupo de partida (por exemplo, brometo) na carboxila do HA, provocando a formação de uma ligação éster entre HA e o espaçador;
2. o grupo carboxila de ácido hialurônico ou um de seus derivados é ligado por ligação nucleofílica a um espaçador adequado que é subseqüentemente ligado a uma função da molécula antitumoral (em todas as formas conhecidas por versados na técnica);
3. o grupo carboxila de HA ou um de seus derivados é ativado com um agente de ativação, por exemplo, uma carbodiimida, e é reagido com uma função hidroxila do espaçador adequadamente selecionado, previamente ou subseqüentemente ligado à droga (em todas as formas conhecidas no campo).
As drogas identificadas e ácido hialurônico (e/ou um de seus derivados) são ligados indiretamente por meio de um espaçador através da formação de ligações amida com os seguintes procedimentos: 1. o grupo carboxila de ácido hialurônico ou um de seus derivados é ativado com um agente de ativação, tal como, por exemplo, uma carbodiimida, e reagido com uma função amina do espaçador adequadamente selecionado, previamente ou subseqüentemente ligado à droga selecionada (em todas as formas conhecidas por versados na técnica).
As aplicações oncológicas referentes ao uso de conjugados que consistem de ácido hialurônico (e/ou um de seus derivados) e princípio ativo antitumoral são proximamente ligadas à resposta da neoplasia à droga conjugada. De acordo com os usos pretendidos, os bioconjugados podem, portanto, ser administrados oralmente, intravenosamente, intra-arterialmente, intratecalmente, intramuscularmente, subcutaneamente, intraperitonealmente, intra-articularmente, topicamente, transdermicamente, loco-regionalmente, ou em uma combinação destes (em ambas um procedimento de administração local e sistêmica é portanto reivindicado). As neoplasias envolvidas no tratamento podem, por exemplo, ser (sem limites) tumores do pâncreas, da mama, cólon-retal, de pulmão e do sistema respiratório in toto, cabeça- pescoço, fígado, estômago, testículos, ovário, endométrio, próstata, bexiga, cérebro, leucemia, linfomas, melanoma, sarcoma de Kaposi, osteosarcoma, neuroblastoma e câncer de pele.
Alguns exemplos de preparação de bioconjugados entre ácido hialurônico e/ou seus derivados e drogas de quimioterapia com uma atividade antitumoral são fornecidos para propósitos meramente ilustrativos e não limitantes.
Exemplo 1: Preparação de um derivado de éster de ácido hialurônico tendo um MW de 200 kDa e SN-38 com um grau de substituição de cerca de 15% (Figura 1).
199 mg de SN-38 são dissolvidos em 50 ml de acetonitrila e 383 mg de l-(3-dimetilaminopropil)-3etilcarbodiimida (EDC), 258 mg of ácido 4-bromobutírico e 40 mg of DMAP são adicionados à solução. O desenvolvimento da solução é seguido por meio de cromatografia de TLC (fase estacionária de sílica com indicador de fluorescência e eluente de clorofórmio-acetonitrila 60:40). O produto é recuperado por meio de precipitação e purificado por cromatografia em uma coluna de sílica usando ciorofórmio: metanol 99:1 como eluente. O intermediário assim obtido é seco à temperatura ambiente sob alto vácuo. 0,84 g de sal de tetrabutilamônio de ácido hialurônico (HATBA) são dissolvidos em 43 ml de N-metil-2- pirrolidona (NMP) à temperatura ambiente. O intermediário é adicionado à solução e toda a mistura é deixada reagir à temperatura ambiente. Após 7 dias de reação, a solução é diluída com 5 ml de água e 5 ml de cloreto de sódio saturado. Toda a mistura é deixada sob agitação por 1 hora para permitir a troca do sódio com o íon de TBA. Etanol é subseqüentemente adicionado em gotas e o produto filamentoso obtido é dissolvido em água, dialisado, em no final, liofilizado.
Exemplo 2: Preparação de um derivado de éster de ácido hialurônico TMW de 31 kPa) e SN-38 com um grau de substituição na carboxila de cerca de 10%.
200 mg de SN-38 são dissolvidos em 50 ml de DMSO e 1,00 g de carbonato de etileno é adicionado à solução. A solução é aquecida até 50°C e o desenvolvimento da solução é seguido por meio de cromatografia de TLC em placas de sílica. No final da reação, o produto é recuperado por meio de precipitação e seco à temperatura ambiente sob alto vácuo. 175 mg de intermediário assim obtido são dissolvidos em uma mistura anidra de DMSO/piridina 90:10 com 85 mg de cloreto de p-toluenosulfonil. Quando o intermediário tiver sido convertido no toxilato correspondente, ele é recuperado por precipitação e dissolvido em uma solução de HATBA em NMP (0,68 g de polímero em 34 ml de NMP). Toda a mistura é deixada reagir por 7 dias à temperatura ambiente. 4 ml de uma solução saturada de NaCl são adicionados à solução e a mistura é deixada sob agitação por 1 horas para permitir a troca do sódio com o íon de TBA. Etanol é subseqüentemente adicionado em gotas e o produto filamentoso obtido é dissolvido em água, dialisado e, no final, liofilizado.
Exemplo 3: Preparação de um derivado de éster de ácido hialurônico com um MW de 55 kDa com vinblastina com um grau de substituição na carboxila de cerca de 10%.
308 mg de vinblastina são dissolvidos em 30 ml de clorofórmio e 120 mg de ácido 4-bromobutírico e 150 mg de EDC são então adicionados. Após um período, água é adicionada à solução para a eliminação do brometo e da carbodiimida. A solução orgânica é anidrificada por meio de sulfato de sódio e o solvente é eliminado em um rotavapor. 300 mg de intermediário assim obtido são adicionados a 1,70 g de HATBA dissolvido em um NMP anidro e a solução é mantida sob agitação à temperatura ambiente por sete dias. No final, toda a mistura é deixada sob agitação por 1 hora com 6 ml de solução saturada de NaCl para permitir a troca do sódio com o íon de TBA. Etanol é subseqüentemente adicionado em gotas e o produto filamentoso obtido é dissolvido em água, dialisado e, no final, liofilizado.
Exemplo 4: Preparação de um derivado de éster de ácido hialurônico com um MW de 440 kDa e 5-fluorouracila com um grau de substituição na carboxila de cerca de 15%.
680 mg de carbonato de etileno e cerca de 10 mg de NaOH são adicionados a 510 mg de fluorouracil dissolvido em 15 ml de DMF. Toda a mistura é aquecida e a reação é deixada continuar por 1 hora na temperatura de refluxo. O produto recuperado por precipitação é dissolvido em uma mistura anidra de DMSO/piridina 50/50 com 1,00 g de cloreto de p- toluenosulfonil. Após cerca de 15 horas, o produto é recuperado por precipitação e adicionado a uma solução de HATBA dissolvido em DMSO (3,60 g em 180 ml de DMSO). A solução é mantida sob agitação a 38°C por cerca de 3 dias e no final 20 ml de água milliQ e 7 ml de uma solução saturada de NaCl são adicionados. Toda a mistura é deixada sob agitação por 1 hora para permitir a troca do sódio com o íon de TBA. Etanol é subseqüentemente adicionado em gotas e o produto filamentoso obtido é dissolvido em água, diaiisado e liofilizado. Exemplo 5: Preparação de um derivado de éster de ácido hialurônico com um MW de 200 kDa e Ι-β-D-arabino-furanosilcitosina (Ara-C) com um grau de substituição na carboxila de cerca de 18%
100 mg de Ara-C5 80 mg de EDC e 69 mg de ácido 4-bromo- butírico são dissolvidos em 10 ml de água. Toda a mistura é reagida por cerca de 1 hora e no final o solvente é eliminado pela evaporação em pressão reduzida em um rotavapor. O produto é purificado por meio de separação cromatográfica em coluna. O intermediário assim obtido é dissolvido em uma solução a 20 mg/ml de 1,10 g de HATBA em DMSO e reagido por 7 dias à temperatura ambiente. 5 ml de uma solução saturada de NaCl são adicionados de forma a recuperar o produto, permitindo assim a salinificação com sódio das carboxilas de ácido hialurônico. O polímero é precipitado pela adição de etanol em gotas, e após a filtração e redissolução em água, ele é diaiisado para eliminar os resíduos de solvente e sal e finalmente liofilizado. Exemplo 6: Preparação de um derivado de éster de ácido hialurônico com um MW de 120 kDa e 17-P-extradiol com um grau de substituição na carboxila de cerca de 20%
140 mg de 17P-extradiol são dissolvidos em 50 ml de DMSO e 380 mg de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC), 262 mg of ácido 4-bromobutírico são adicionados à solução. O produto é recuperado por meio de precipitação e purificado por cromatografia em uma coluna de sílica. O intermediário assim obtido é seco à temperatura ambiente sob alto vácuo. 0,80 g de sal de tetrabutilamônio de ácido hialurônico (HATBA) são dissolvidos em 40 ml de N-metil-2-pirrolidona (NMP) à temperatura ambiente. O intermediário é adicionado à solução e toda a mistura é deixada reagir à temperatura ambiente. Após 7 dias de reação, a solução é diluída com 5 ml de água e 5 ml de cloreto de sódio saturado. Toda a mistura é deixada sob agitação por 1 hora para permitir a troca do sódio com o íon de TBA. Etanol é subseqüentemente adicionado em gotas e o produto filamentoso obtido é dissolvido em água, dialisado, em no final, liofilizado.
Exemplo 7: Preparação de um derivado do éster parcial entre ácido hialurônico com um MW de 200 kDa e SN38 e auto-reticulacão do derivado de HA
200 mg de SN38 são dissolvidos em 50 ml de DMSO e 375 mg de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC), 330 mg of ácido 4-bromobutírico são adicionados à solução. O desenvolvimento da solução é monitorado por meio de cromatografia TLC (fase estacionária de sílica com indicador de fluorescência e eluente de clorofórmio-acetonitrila 60:40). O produto é recuperado por meio de precipitação e purificado por cromatografia em uma coluna de sílica usando clorofórmio:metanol 99:1 como eluente. O intermediário assim obtido é seco à temperatura ambiente sob alto vácuo. 0,84 g de sal de tetrabutilamônio de ácido hialurônico (HATBA) são dissolvidos em 43 ml de N-metil-2-pirrolidona (NMP) à temperatura ambiente. Após deixar a solução reagir por 7 dias, 34 mg de trietilamina são adicionados à solução de reação e toda a mistura é agitada por 30'.
Uma solução de 87 mg de iodeto de 2-cloro-l-metil-piridina em 10 ml de DMSO é vagarosamente adicionada em gotas durante um período de 45' e a mistura é mantida a 30°C por 15 h.
Uma solução que consiste de 15 ml de água e 0,5 g de cloreto de sódio é então adicionada e a mistura resultante é vagarosamente despejada em 300 ml de acetona sob agitação contínua. Um precipitado é formado, o qual é filtrado e lavado 3 vezes com 25 ml de acetona-água 5:1 e 3 vezes com acetona (50 ml). O produto é seco sob um alto vácuo a 38°C. Exemplo 8: Preparação de um derivado de amida do ácido hialurônico com um MW de 220 kDa com doxorubicina com um grau de substituição na carboxila de cerca de 5% (Figura 2)
2,00 g de HATBA são dissolvidos em 100 ml de DMSO com um baixo teor de água. A solução é insuflada com ácido clorídrico gasoso até que, na remoção de uma alíquota da solução e diluição com água 1:10, o pH esteja entre 4,5 e 5. Carbonildiimidazol (55 mg) é subseqüentemente adicionado à solução e toda a mistura é deixada sob agitação à temperatura ambiente por 1 h. No final, 1,4, g de doxorubicina são adicionados à solução e a mistura é deixada reagir por 24 horas à temperatura ambiente. 5 ml de uma solução saturada de NaCl são adicionados para recuperar o produto, permitindo assim a salinificação com sódio das carboxilas de ácido hialurônico. O polímero é precipitado pela adição de etanol em gotas e, após a filtração e redissolução em água, ele é dialisado para eliminar os quais últimos dois grupos são opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de resíduo de solvente e sal e finalmente dialisado. Exemplo 9: Preparação do éster parcial entre ácido hialurônico e doxorubicina e auto-reticulação com condensação de Ugi
500 mg de polímero obtido de acordo com o exemplo 8 são dissolvidos em 5 ml de água destilada. O pH da solução é diminuído para cerca de 4 pela adição de ácido clorídrico concentrado. 15 mg de diidrocloreto de etil éster de lisina, 250 μΐ de solução aquosa de formaldeído a 40% e 250 μΐ de cicloexilisocianeto são adicionados à solução. Após 15' de reação, o gel é colocado em diálise em uma solução básica de carbonato de sódio por cerca de 24 h e no final é dialisado contra água até que a condutividade da solução seja menor que 40 μ8. O polímero é recuperado por liofilização. Exemplo 10: Preparação de um derivado de éster de ácido hialurônico com um MW de 200 kDa e doxorubicina com um grau de substituição na carboxila de cerca de 10%
325 mg de hidrocloreto de doxorubicina são dissolvidos em 50 ml de NMP, após a adição de 0,3 ml de Et3N, 420 mg de l-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) e 280 mg of ácido 4- bromobutírico são adicionados à solução. O desenvolvimento da solução é monitorado por meio de cromatografia TLC (fase estacionária de sílica com indicador de fluorescência e eluente de diclorometano-metanol 80:20). O produto é purificado por cromatografia em uma coluna usando clorofórmio:metanol 99:1 como eluente.
O intermediário assim obtido é seco à temperatura ambiente sob alto vácuo. 0,75 g de sal de tetrabutilamônio de ácido hialurônico (HATBA) são dissolvidos em 40 ml de N-metil-2-pirrolidona (NMP) à temperatura ambiente. O intermediário é adicionado à solução e toda a mistura é deixada reagir à temperatura ambiente. Após 7 dias de reação, a solução é diluída com 5 ml de água e 5 ml de cloreto de sódio saturado. Toda a mistura é deixada sob agitação por 1 hora para permitir a troca do sódio pelo íon TBA. Etanol é subseqüentemente adicionado em gotas e o produto filamentoso obtido é dissolvido em água, dialisado e, no final, liofilizado. Experimentação in vitro:
Avaliação da atividade antiproliferativa do conjugado de éster HA/SN38 tendo um grau de substituição igual a 10% e 15%. na linhagem celular de adenocarcinoma cólico HT29
As alíquotas dos derivados obtidos dos exemplos 1 e 2 são caracterizados por meio de um teste de citotoxicidade in vitro em uma linhagem de células tumorais cólicas chamadas HT29. A comparação foi realizada com SN38 dissolvido em DMSO. Os derivados de HA são solubilizados em uma solução glicosada a 5% em uma concentração de 5 mg/ml. O teste é efetuado pela deposição em uma placa com 96 cavidades, 3000 células por cavidade; após 24 horas de incubação a 37°C, as células são colocadas em contato com as soluções e após outras 48 horas a vitalidade das células é determinada por meio de um ensaio colorimétrico MTT (Dezinot F. et al-, Immunol Methods, 1986, 22(89):271-277).
As curvas de proliferação referentes aos 2 conjugados de éster de HA são mostrados nos gráficos (na esquerda, a atividade citotóxica do derivado em 15%, na direita em 10%)s ver a figura 4.
Pela comparação dos dados de EC50 com SN38 em sulfóxido de dimetil (DMSO), os seguintes resultados são obtidos: _
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Os resultados in vitro confirmam que os novos derivados de HA/SN38 mostram a mesma atividade citotóxica do metabólito ativo SN38 que, como descrito acima, tem de 100 a 1.000 vezes a atividade de sua pró- droga comercial, Irinotecan. A experimentação efetuada, portanto, afirma uma eficácia muito maior do novo derivado com relação à droga de referência hoje usada na prática clínica.
Para se demonstrar o que é estabelecido acima com relação à eficácia dos novos conjugados (objeto da presente invenção) como drogas antineoplásticas capazes de superar a resistência farmacológica adquirida pelas células neoplásticas não mais sensíveis à droga, as seguintes experimentações in vitro foram realizadas:
Teste de citotoxicidade em células DHD/Kl 2 da droga quimioterápica doxorubicina comparada com seu conjugado de amida com HA
A linhagem celular usada deriva de ratos da cepa BDIX tratada com 1,2-dimetil-hidrazina. Estas células de fato expressam os mesmos antígenos tumorais que o adenocarcinoma cólon-retal humano e, por esta razão, elas são usadas como um modelo de estudo pré-clínico in vitro para o mesmo tipo de tumor.
A linhagem celular acima também adquiriu resistência ao tratamento de quimioterapia (esta é chamada de "Resistência a Várias Drogas": MDR).
Para se avaliar o grau de vitalidade celular, o ensaio de vitalidade de células vivas/mortas (Sondas Moleculares) foi usado, que permite que as células metabolicamente ativas sejam distinguidas das células mortas; as últimas emitem fluorescência verde em um nível nuclear, enquanto que as células vivas emitem uma fluorescência vermelha localizada na membrana celular e no citoplasma. Após a coloração, as células foram analisadas usando-se um microscópio confocal e a percentagem de células vivas/mortas foi avaliada pela contagem de um mínimo de 500 células vivas ou mortas por amostra.
O conjugado de amida de doxorubicina com HA (Hidrox) foi usado para a experimentação, tendo um grau de substituição de 5% obtido de acordo com o exemplo 8, comparado com a droga, em concentrações diferentes.
Figura 3: Após 48 horas de tratamento, os resultados do teste vivas/mortas mostrado na figura 3 indicam claramente como o conjugado Hidrox pe capaz de exercer, em uma forma dependente da dose, um efeito citotóxico em células que tenham adquirido uma certa resistência à quimioterapia, muito maior que a doxorubicina não-conjugada correspondente, usada sob as mesmas concentrações. Hidrox, de fato, também prova ser efetivo em concentrações baixas, tais como 0,25 μΜ, enquanto que a droga de referência nesta dosagem não tem qualquer efeito citotóxico. Quando se dobra a concentração, o conjugado em questão tem 35% mais de citotoxicidade, portanto, permitindo o uso de menores dosagens de droga com menos efeitos colaterais em células que não mais respondam a terapias quimioterápicas clássicas devido à resistência adquirida às drogas antineoplásticas acima.
A descrição da presente invenção sendo tal que é evidente que estes métodos podem ser modificados de várias formas. As ditas modificações não devem ser consideradas como divergentes do espírito e das perspectivas da presente invenção e todas as modificações que aparecem evidentes para os versados na técnica são incluídas no escopo das seguintes reivindicações.
Claims (30)
1. Conjugados químico-farmacêuticos de ácido hialurônico e/ou seus derivados, caracterizados pelo fato de serem obtidos através de uma ligação indireta entre o polissacarídeo e uma droga com uma ação antitumoral, através de um espaçador molecular que forma uma ligação de éster ou amida com o grupo carboxílico de HA e/ou seu derivado, com a condição de que o dito espaçador não seja uma hidrazida ou um polipeptídeo.
2. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que a droga é selecionada dos seguintes grupos: nitrosuréias, antimetabólitos, alcalóides, antibióticos e produtos análogos, modificadores de resposta biológica, diterpenóides, hormônios sintéticos e anti-hormônios.
3. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 2, caracterizados pelo fato de que a droga é um antimetabólito que consiste de um produto análogo de pirimidina, tal como fluorouracil e Ara-C.
4. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 2, caracterizados pelo fato de que a droga é um alcalóide tal como vincristina, vinblastina e o metabólito ativo de irinotecan SN38.
5. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 2, caracterizados pelo fato de que a droga é um antibiótico, tal como doxorubicina.
6. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 2, caracterizados pelo fato de que a droga é um hormônio, tal como estradiol.
7. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que o grau de substituição na carboxila do ácido hialurônico e/ou um de seus derivados varia de 1 a 100%.
8. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 7, caracterizados pelo fato de que a droga é doxorubicina e o grau de substituição na carboxila de ácido hialurônico do espaçador ligado à doxorubicina varia de 1 a 20%.
9. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 7, caracterizados pelo fato de que a droga é SN38 e o grau de substituição na carboxila de ácido hialurônico do espaçador ligado a SN38 varia de 3 a 15%.
10. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que o ácido hialurônico e/ou um de seus derivados tem um peso molecular que varia de 400 a 3 χ IO6 Da.
11. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 10, caracterizados pelo fato de que o ácido hialurônico preferivelmente tem um peso molecular que varia de 5.000 a 1 χ IO6 Da.
12. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 11, caracterizados pelo fato de que o ácido hialurônico preferivelmente tem um peso molecular que varia de 30.000 a 0,5 χ IO6 Da.
13. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico é um sal com bases orgânicas e/ou inorgânicas.
14. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação I5 caracterizados pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico é um éster de ácido hialurônico com álcoois da série alifático, aralifático, cicloalifático, aromático, cíclico e heterocíclico, com uma percentagem de esterificação não maior que 75%.
15. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico é uma amida de ácido hialurônico com aminas da série alifático, aralifático, cicloalifático, aromático, cíclico e heterocíclico, com uma percentagem de amidação de 1 a 10%.
16. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico é um derivado O-sulfatado de ácido hialurônico até o 4o grau de sulfatação.
17. Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico é um éster interno com uma percentagem de esterificação que varia de 0,5 a 10%.
18.Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação I5 caracterizados pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico é obtido pela desacetilação da fração de N-acetilglucosamina, com uma percentagem de desacetilação de 0,1 a 30%.
19.Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico é um derivado percarboxilado obtido pela oxidação da hidroxila primária da fração de N-acetilglucosamina, com um grau de percarboxilação que varia de 0,1 a 100%.
20.Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que o espaçador consiste de uma cadeia alifática, aralifática, alicíclica, heterocíclica, linear ou ramificada, opcionalmente contendo heteroátomos, tendo grupos hidroxila, carboxila, carbonila, amina, epoxi, cloretos de ácidos, tióis, nitrilas, halogênios, anidridos, isocianatos, e isotiocianatos.
21.Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 20, caracterizados pelo fato de que o espaçador é representado por ácidos carboxílicos com um número de átomos de carbono que variam de .2 a 10.
22.Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 21, caracterizados pelo fato de que o espaçador é ácido bromopropiônico.
23.Conjugados químico-farmacêuticos de acordo com a reivindicação 21, caracterizados pelo fato de que o espaçador é ácido bromobutírico.
24.Composições farmacêuticas, caracterizadas pelo fato de que têm um ou mais dos conjugados químico-farmacêuticos como definidos nas reivindicações prévias, como princípio ativo.
25.Composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação .24, caracterizadas pelo fato de serem para administração oral, intravenosa, intra-arterial, intratecal, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intra- articular, tópica, transdérmica ou para administração direta no local da neoplasia.
26.Biomateriais tridimensionais de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que são processados na forma de hidrogéis, nano- e microesferas, fibras fiadas tecidas e não-tecidas.
27.Uso dos conjugados químico-farmacêuticos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de composições farmacêuticas a serem usadas no campo oncológico.
28.Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento sistêmico ou local de câncer do pâncreas, da mama, cólon-retal, de pulmão e do sistema respiratório in toto, cabeça- pescoço, fígado, estômago, testículos, ovário, endométrio, próstata, bexiga, cérebro, leucemia, linfomas, melanoma, sarcoma de Kaposi, osteosarcoma, neuroblastoma e câncer de pele.
29.Processo para a preparação dos conjugados químico- farmacêuticos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de ser pela conjugação indireta de ácido hialurônico ou de um de seus derivados e uma droga tendo uma atividade antitumoral por meio de um espaçador que forma uma ligação éster com o grupo carboxila de ácido hialurônico de acordo com os seguintes procedimentos alternativos a), b) ou c): Ia) um grupo funcional do espaçador adequadamente selecionado também contendo um segundo grupo de partida capaz de reagir com a função carboxila de HA, reage com um grupo funcional que pertence à molécula antitumoral selecionada; IIa) a reação pode possivelmente requerer a ativação de uma das funções envolvidas por meio de um agente de ativação, tal como carbodiimidas; IIIa) em uma segunda fase, por contato direto com um sal de tetraalquilamônio (preferivelmente tetrabutilamônio) de HA em um ambiente anidro com o composto consistindo da droga modificada, dando origem a uma substituição nucleofílica do grupo de partida na carboxila do HA, provocando a formação de uma ligação éster entre HA e o espaçador; Ib) o grupo carboxila de ácido hialurônico é ligado por ligação nucleofílica a um espaçador adequado que é subseqüentemente ligado a uma função da molécula antitumoral; Ic) o grupo carboxila de HA é ativado com um agente de ativação e é reagido com uma função do espaçador adequadamente selecionado, previamente ou subseqüentemente ligado à droga.
30. Processo para a preparação dos conjugados químico- farmacêuticos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de ser pela conjugação indireta de ácido hialurônico ou um de seus derivados e uma droga tendo uma atividade antitumoral por meio de um espaçador que forma uma ligação amida com o grupo carboxila de ácido hialurônico de acordo com o seguinte procedimento: - o grupo carboxila do ácido hialurônico é ativado com um agente de ativação e reagido com uma função amina do espaçador adequadamente selecionado, previamente ou subseqüentemente ligado à droga.
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