BRPI0615448A2 - usos de tretazicar, de uma combinação de tretazicar e um ou mais compostos, e de um ou mais compostos, combinação, e, composição farmacêutica - Google Patents

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Abstract

USOS DE TRETAZICAR, DE UMA COMBINAçãO DE TRETAZICAR E UM OU MAIS COMPOSTOS, E DE UM OU MAIS COMPOSTOS, COMBINAçãO, E, COMPOSIçãO FARMACêUTICA. A invenção refere-se a um método de combate de uma infecção parasítica por protozoário de um organismo hospedeiro, que compreende a administração de tretazicar ao organismo hospedeiro. Tretazicar é o composto 5-(aziridin-1-il)-2,4-dinitrobenzamida (CB 1954), e a infecção parasítica é preferivelmente uma infecção por Trypanosoma cruzi, T. b. brucei, Leishmania spp. particularmente L. infantum, Cryptosporidium e Giardia spp.

Description

"USOS DE TRETAZICAR, DE UMA COMBINAÇÃO DE TRETAZICARE UM OU MAIS COMPOSTOS, E DE UM OU MAIS COMPOSTOS,COMBINAÇÃO, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA"
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método para combaterinfecção e, particularmente, ao tratamento de infecções parasíticas porprotozoários.
A listagem ou discussão de um documento publicadoanteriormente neste relatório não deve ser necessariamente tomada como umreconhecimento de que o documento é parte do estado da técnica ou éconhecimento geral comum.
A incidência de doenças de protozoários parasíticas resistentesa droga tem crescido significativamente em anos recentes, resultando em umnúmero aumentado de mortes em ambos os países em desenvolvimento e nomundo ocidental. Estratégias sendo desenvolvidas para resolver o problemaincluem o desenvolvimento de novas drogas, a adoção de regimes detratamento estrito e um programa de educação pública compreensivo.
Um meio possível para liberar agentes farmacológicosaltamente ativos no seu local de ação com efeitos laterais indesejadosmínimos em outras células e tecidos é o uso de pró-drogas. As pró-drogas sãoconhecidas há muitos anos e são usadas em várias indicações médicas. Elaspodem ser definidas como entidades químicas que são modificadas porsistemas metabólicos ou não-metabólicos, resultando na formação ouliberação de uma espécie com a atividade farmacológica desejada. Em muitoscasos, as formas de pró-droga são usadas para modificar farmacocinéticos dedroga pela alternância de uma propriedade físico-química (tal comolipofilicidade). Nestes casos, a modificação da pró-droga é geralmente não-específica, ocorrendo por processos degradantes não-enzimáticos ou pela açãometabólica de enzimas ubíquas. As formas de pró-droga podem também serusadas, contudo, para alvejar o agente farmacológico ativo para locaisespecíficos somente, geralmente pela exploração da distribuição diferencialde enzimas capazes de catalisar a reação de modificação de pró-droga.
No campo de ativação de quimioterapia de câncer de pró-drogas por enzimas específicas para um alvo tem sido há muito tempo umobjetivo e muitas pró-drogas potenciais têm sido sintetizadas e testadas naesperança de que uma enzima específica para tumor seria capaz de osconverter especificamente em um agente anti-tumor potente.
Muitos pesquisadores ainda são ativos nesta área utilizandopró-drogas projetadas para serem ativadas por uma variedade de enzimas queincluem β-glucuronidase (Woessner et al (2000) Anticancer Research 20,2289-2296), DT diaphorase (Loadman et al (2000) Bioehemieal Phamaeology59, 831-837) e thymidylate synthase (Confins et al (1999) Clinica! CâncerResearch 5, 1.976-1981).
Como uma alternativa para esta estratégia de monoterapia depró-droga, alguns pesquisadores têm tentado fornecer a enzima desejada aotumor,antes da administração de uma pró-droga. Tal abordagem,freqüentemente chamada de terapia de pró-droga de enzima direcionada paraum anticorpo (ADEPT), foi descrita na W088/07378. Neste exemplo, aenzima é ligada a um anticorpo monoclonal que é capaz de se ligar a umantígeno associado com o tumor. Desta forma, a enzima é fornecida ao localdo tumor, onde ela pode agir em uma pró-droga apropriada. Uma estratégiasimilar foi descrita, por exemplo, na WO 96/03151, na qual o gene quecodifica uma enzima é fornecido ao tumor e, quando presente, expressa aenzima desejada. Esta estratégia é freqüentemente chamada de terapia de pró-droga de enzima direcionada para um gene (GDEPT).
E um importante princípio de muitas destas estratégias dealvejamento que a enzima liberada no local do tumor não deve ser endógenapara o hospedeiro (Aghi et ai (2000) J Gene Med 2, 148-1.64). A presença deenzimas endógenas levaria à ativação não-específica das pró-drogas etoxicidade aos tecidos normais. Com isso, a maioria destes estudos de terapiade pró-droga de enzima têm sido realizados usando enzimas, tais comocarboxipeptidase G2, β-lactamase e nitroredutase.
Embora muito do trabalho até hoje no campo de ativação depró-droga específico para um local tenha sido concentrado na terapia anti-câncer, têm sido feitos esforços para se adaptar esta tecnologia para uso emaplicações antibacterianas. Por exemplo, WO 99/32113 descreve o uso depró-drogas consistindo de uma parte citotóxica e uma parte β-lactamo. Embactérias gram-negativas contendo enzimas de β-lactamase dentro do espaçoperiplásmico, a pró-droga é clivada para liberar a parte citotóxica que entãovai romper as funções de células vitais. Estas pró-drogas são limitadas em seucampo de aplicação, contudo, pelo fato de que nem todas as bactériasexpressam β-lactamases e de que as bactérias Gram-positivas tendem aexcretar β-lactamases de tal forma que a maior parte do efeito de localizaçãode toxinas benéficas da pró-droga seja perdido.
Em Smyth et al ((1995) J. Org Chem. 63, 7600-7618), as S-aminosulfenimino-penicilinas são introduzidas. Estes compostos sãoinibidores de β-lactamase e padrões de pró-droga potenciais para ofornecimento de uma variedade de agentes nas bactérias positivas em β-lactamase. Como com os derivados de β-lactamo discutidos acima, contudo,estes compostos são provavelmente de utilidade limitada em bactérias Grampositivas e, devido à sua permeação lenta através das estruturas de porina damembrana externa, podem precisar estar presentes em concentraçõesextracelulares indesejavelmente altas de forma a alcançar efeitossignificativos em bactérias Gram-negativas.
Um afastamento das desvantagens potenciais de pró-drogasdependentes de β-lactamase tem sido apresentado por Wei and Pez ((2000)Bioorg. Med Chem. Lett. 10, 1073-1076). Estes trabalhadoresconceitualmente demonstraram o uso de derivados de 5'-dipeptidil de agentesantibacterianos citotóxicos como pró-drogas ativáveis por deformilase depeptídeo bacteriano. Os resultados preliminares usando estas pró-drogassugeriram uma atividade antibacteriano fraca, contudo, e foi levantada ahipótese de que isto pode ter sido devido à pobre captação dos compostospelas células.
As doenças parasíticas humanas são endêmicas em muitaspartes do mundo. Por exemplo, leishmaniose (uma doença parasítica causadapor um protozoário intracelular obrigatório pela mordida de algumas espéciesde moscas de areia) é verificada em cerca de 90 países tropicais e subtropicaisem todo o mundo e no sul da Europa. Mais que 90% dos casos mundiais deleishmaniose cutânea ocorrem nos seguintes países: Afeganistão, Argélia,Brasil, Irã, Iraque, Peru, Arábia Saudita e Síria. Contudo, cerca de 75% doscasos que são avaliados nos Estados Unidos foram adquiridos na AméricaLatina, enquanto que a leishmaniose ocorre desde o norte do México(ocasionalmente no sul rural do Texas) até o sul da Argentina. Mais que 90%dos casos mundiais de leishmaniose visceral ocorrem em Bangladesh, Brasil,índia, Nepal e Sudão. Similarmente, a distribuição geográfica de Doença deChagas (causada por um parasita protozoário flagelado, Trypanosoma cruzi,transmitido aos humanos por insetos de triatomina) se estende desde oMéxico até o sul da Argentina. A doença afeta 16-18 milhões de pessoas ealguns 100 milhões, i.e., cerca de 25% da população da América Latina, estãoem risco de adquirir o Mal de Chagas. Mesmo as pessoas que ficam porpouco tempo em áreas endêmicas com o parasita podem se tornar infectadas edoenças parasíticas estão se tornando um problema no mundo desenvolvidocomo resultado do aumento na viagem global.
A resistência às drogas hoje usadas tem sido relatada. Osproblemas de resistência requerem o uso de drogas mais tóxicas e como asdrogas estão se tornando menos e menos efetivas, a descoberta de uma novadroga é necessária.
Os inventores verificaram agora, surpreendentemente, queenzimas de nitroredutase também parecem ser expressadas em certosorganismos parasíticas e os presentes inventores sugerem que tretazicar podeser altamente efetiva contra infestação parasítica em animais (tais comohumanos) porque o hospedeiro de animal (e.g., humano) é insensível a esteagente, enquanto que o parasita vai ser toxicamente afetado. Os presentesinventores têm mostrado agora que tretazicar é extremamente efetivo contracertos parasitas e, assim, é um objeto da presente invenção fornecer tretazicarcomo um agente anti-parasítica altamente efetivo.
Um primeiro aspecto da presente invenção fornece um métodode combate de uma infecção parasítica por protozoário de um organismohospedeiro, com o método compreendendo a administração de tretazicar aoorganismo.
O organismo hospedeiro preferivelmente é um animal, maispreferivelmente um mamífero e mais preferivelmente um humano. Osmamíferos não-humanos para tratamento pelo método da presente invençãoincluem cavalos, vacas, porcos, cabras, ovelhas, cães, gatos e semelhantes.
Por "combate" a uma dada infecção entende-se que a infecçãoseja substancialmente erradicada ou que a infecção seja substancialmenteinibida. Será apreciado que pode não ser necessário que todos os parasitas noorganismo hospedeiro sejam mortos de forma a tratara efetivamente oorganismo hospedeiro.
Um segundo aspecto da presente invenção fornece o uso deum tretazicar na fabricação de um medicamento para combater uma infecçãopor parasita parasítica de um animal.
O composto tretazicar é (5-(aziridin-l-il)-2,4-dinitrobenzamida(CB 1954)), cuja estrutura é mostrada abaixo. Tretazicar tem sido usadopreviamente como um agente anticâncer.
<formula>formula see original document page 7</formula>
Tretazicar tem o número de registro C.A.S. No 21919-05-1 esua síntese foi descrita em Khan & Ross (1969170) "Tumour growthinhíbitory nitrophenylaziridines and related compounds; stracture-activityrelationships" Chem-Biol Inteiactions 1, 27-47 e em Cobb et al (1969)Biochern. Pharnzacal. 18,151.9-1.527.
Este composto é capaz de erradicar um tumor de ratoespecífico ("tumor de Walker"), embora tenha pouco ou nenhum efeito emuma variedade de outros tumores (Cobb et al (1969) Biochem. Phamacol. 18,1519-1527) e não mostra nenhum benefício terapêutico em estudosoncológicos clínicos (Knox et al (1993) Câncer and Metastasis Rev. 12, 195-212). Tem sido mostrado que uma enzima de nitroredutase presente no tumorde Walker é capaz de ativar CB1954 pela redução de seu grupo 4-nitro paraformar o composto 5-aziridino-4 hidroxilamino-2 nitrobenzamina, um agentede reticulação de DNA eletrofílico potente na presença de tio-ésteresintracelulares (Knox et al (1958) Biochem. pharmacol. 37, 4661-4669; Knoxet al (1991) Biochem. Pharmacol. 42, 1691-1697). A enzima correspondenteem células humanas tem cinética de redução relativamente vagarosa,tornando, assim, as células humanas insensíveis aos efeitos de CB1954(Boland et al (1991) Biochem. Pharmacol. 41, 867-875).
Nos estudos mecanísticos em bactérias, tem sido mostrado queCB1954 tem atenuado a toxidade em cepas negativas em nitroredutase (Venittand Croflon-Sleigh (1987) Mutagenesis 2, 375-381).Tretazicar é ativada para formar um agente antiparasítica porenzimas associadas com parasita protozoário. O termo "enzima associada comparasita protozoário" significa uma enzima ou sua isoforma que é específicapara o parasita protozoário constituindo a infecção, ou é expressada em umaforma funcional até uma pouca extensão pelo organismo hospedeiro paratornar qualquer ativação de tretazicar pelo último insuficiente de provocartoxicidade de hospedeiro inaceitável, mas a qual enzima é expressada peloparasita protozoário.
Tipicamente, a enzima associada com o parasita é pelo menos10 vezes ou 20 vezes ou 50 vezes ou 100 vezes ou 500 vezes ou 1000 vezesmais ativa na ativação do composto do que a enzima presente no organismohospedeiro.
Será apreciado que tretazicar é substancialmente inalteradopelas enzimas endógenas ao organismo hospedeiro e é ativadosubstancialmente por uma ou mais enzimas no parasita protozoário.
Por "ativado para formar um agente antiparasítica" entende-seque tretazicar é convertido em uma forma que é citotóxica, particularmente aoparasita protozoário.
Similarmente, será apreciado que os métodos e medicamentosda presente invenção são particularmente adequados para combater umainfecção por parasita protozoário, em que o parasita protozoário é aquele quecontém um sistema de enzima que é capaz de ativar tretazicar em uma formasubstancialmente citotóxica. Um método para determinar se um parasitaprotozoário é responsivo a tretazicar é descrito no Exemplo. Tais parasitas deprotozoários podem ser mortos por tretazicar. Adequadamente, as infecçõesparasíticas de protozoários que podem ser tratadas com tretazicar são aquelaspara as quais tretazicar tem uma IC50 menor que 10 micromolar,preferivelmente menor que 5 micromolar e, mais preferivelmente, menor que1 micromolar.Outros métodos de determinação se um parasita protozoáriocontém uma enzima capaz de ativar tretazicar a uma forma substancialmentecitotóxica serão conhecidos por aqueles versados na técnica. Estes incluem,mas não estão limitados a, o uso de programas de computador adequados, porexemplo, o programa GAP da University of Wisconsin Genetic ComputingGroup, para comparar a seqüência de genes do protozoário com aquela daespécie contendo nitroredutase conhecida ou o uso de técnicas clássicas pormeio das quais a enzima relevante é detectada, isolada e purificada antes doteste com tretazicar.
Acredita-se que tretazicar seja capaz de reticularcovalentemente o ácido nucleico de parasita protozoário, pois ele é ativadopor um sistema de enzima presente no parasita na forma citotóxica. Comotretazicar somente se torna capaz de ativação por uma enzima associada comparasita, acredita-se que a presença de tretazicar em células hospedeiras nãorepresente um perigo, pois ele não possui atividade de enzima compatível. Aligação de tretazicar a componentes de células hospedeiras através do grupoaziridina (ou mostarda), vai apresentar somente um menor risco derompimento celular, pois acredita-se que qualquer composto mono-funcionalmente ligado seja excisável por processos enzimáticos de reparo dehospedeiro (Knox et al (2003) Current Pharmaceutical Design 9, 2091-2104).
A enzima associada com parasita responsável pela ativação docomposto tem, acredita-se, atividade de nitroredutase, por exemplo, sobcondições óxica e hipóxicas.
Em uma forma de realização, tretazicar pode ser usado parainibir seletivamente aqueles parasitas que tenham desenvolvido resistência aum ou mais antibióticos hoje usados.
Em uma forma de realização da presente invenção, ao animalsão também administrados um ou mais outros compostos conhecidos porserem de uso no combate de uma infecção parasítica.Tretazicar e um ou mais compostos estabelecidos aqui podemser administrados juntos ou seqüencialmente.
Os compostos conhecidos por terem uso no combate de umainfecção parasítica incluem Misonidazol, nitro-heterocíclicos, tais comoNifurtimox e RSU 1069, antimoniais de Benznidazol tais comostibogluconato, e derivados de acetilcolina tais como Miltefosina.
Assim, outros aspectos da presente invenção fornecem uso deuma combinação de tretazicar e um ou mais outros compostos conhecidos porterem uso no combate de uma infecção de um animal na fabricação de ummedicamento para combater uma infecção parasítica de um animal; e uso detretazicar na fabricação de um medicamento para combate de uma infecçãoparasítica de um animal, em que ao animal são administrados um ou maisoutros compostos conhecidos por terem uso no combate de uma infecçãoparasítica de um animal; e uso de um ou mais outros compostos conhecidospor terem uso no combate de uma infecção parasítica de um animal nafabricação de um medicamento para combater uma infecção parasítica de umanimal, em que ao animal é administrado tretazicar.
Os métodos e medicamentos da presente invenção encontramutilidade particular no combate de infecções com um ou mais dentreTrypanosoma cruzi, T: brucei, Leishimania spp. particularmente, L. infaritum,Cryptosporidium spp. e Giardia spp.
Um outro aspecto da presente invenção fornece a combinaçãode tretazicar com um ou mais outros compostos conhecidos por terem uso nocombate de uma infecção parasítica por protozoário de um organismohospedeiro.
A combinação pode ser acondicionada e apresentada para usona medicina.
Em uma outra forma de realização, a combinação pode sertambém combinada com um carreador farmaceuticamente aceitável paraformar uma composição farmacêutica. Uma composição farmacêutica podeincluir, por exemplo, tretazicar e água estéril livre de pirogênio. Tipicamente,a composição farmacêutica está em uma forma líquida em polietilenoglicol /N-metil pirrolidona (PEG/NMP) diluído com solução salina (Chung-Faye etal (2001) Clinicai Câncer Research 7, 2662-2668).
Uma forma de realização preferida é uma composiçãofarmacêutica para administração oral. Convenientemente, a composiçãofarmacêutica é uma cápsula de gelatina contendo o tretazicar. Tipicamente, acomposição farmacêutica é uma cápsula ou tablete que permite a liberaçãoentérica, por exemplo, em virtude de um revestimento que se dissolve nointestino. Os métodos de fabricação de tais cápsulas e tabletes são bemconhecidos na técnica.
Os um ou mais compostos definidos aqui podem seradministrados ao organismo hospedeiro em qualquer forma adequada e emqualquer quantidade efetiva para combater a infecção. Adequadamente, oveterinário (no caso de animais não-humanos) ou médico (no caso dehumanos), o praticante pode selecionar a via de administração apropriada e adose ou o regime de dosagem apropriada(o). Uma quantidade de tretazicar éadministrada, como doses únicas ou múltiplas, em uma quantidade efetivapara combater a infecção parasítica.
Para administração a um animal (incluindo humano), as viasapropriadas de administração incluem, mas não estão limitadas a, intravenosa,transdérmica e por inalação. Tipicamente, para administração a um humanopor infusão, o tretazicar seria administrado em uma dose de até 30 mg/m2. Aadministração oral é também adequada, tal como usando uma cápsula degelatina, como discutido acima.
O tretazicar pode ser dado por uma variedade de viasdependendo da natureza e da localização do agente infectivo. Com isso, umavariedade de composições de uma diferente forma farmacêutica fornecida,como seria claro para alguém versado na técnica.
A presente invenção vai agora ser descrita em mais detalhespor referência às seguintes Figuras e exemplo não-limitante.
A Figura 1 mostra a atividade de tretazicar contra L.dononvani HU3 em ratos BALB/c (diariamente, administração IP).
A Figura 2 mostra a atividade de tretazicar contra L.dononvani HU3 em ratos BALLB/c (diariamente, administração IV).
A Figura 3 mostra a atividade de tretazicar contra L.dononvani HU3 em ratos SCID (diariamente, administração IV).
Exemplo 1: Atividade antiparasítica de tretazicarAtividade in vitro
Tretazicar foi triado contra vários organismos parasíticasusando um sistema de triagem in vitro integrado e comparado com otratamento da escolha contra aquele organismo (Tabela 1).
Como mostrado na Tabela 1, tretazicar é extremamente ativocontra Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi e é muito mais ativo do queos agentes estabelecidos. Os ensaios de citotoxicidade contra uma faixa delinhagens celulares humanas sempre dão um valor de IC50 >50 μΜ e asrelações terapêuticas contra estes dois organismos são assim dramáticas(>16,000 para T. cruzi e >625 para L. infantum). Embora não tão potentequanto suramina, tretazicar era ativo contra T. brucei com uma relaçãoterapêutica >10. Nenhuma atividade foi vista contra as cepas testadas de T.colubriforrmis ou Plasmodium falciparum presumidamente porque elas nãoexpressam um sistema de enzima que seja capaz de ativar tretazicar em umaforma citotóxica.
Dada a aceitabilidade clínica provada de tretazicar, este agenterepresenta uma nova abordagem de pró-droga para o tratamento de infestaçãoparasítica, particularmente leishmaniose e Doença de Chagas.Tabela 1: Dados in vitro para tretazicar contra certos parasitas
<table>table see original document page 13</column></row><table>
Atividade in vivo
A atividade in vivo de tretazicar contra L. dononvani foitestada em ambos os ratos BALB/c e SCID. A infecção e o tratamento dosanimais foram realizados como descrito por Croft e Yardley e referência aí(Croft & Yardley (1999) Animal models of visceral leishmaniasis. InHandboo 1: of Animal Models of Infection, Zak, O. (ed) pp 753-787,Academic Press, Londres). No final do tratamento, os ratos foram pesadospara dar uma estimação da toxicidade da droga. O fígado foi removido dosanimais recém sacrificados e pesado. Nódoas foram então preparadas a partirdos fígados nas lâminas dos microscópios e fixadas com metanol emanchadas com mancha de Giemsa. O número de parasitas por 500 células defígado foi determinado microscopicamente para cada animal experimental.Esta figura é multiplicada pelo peso total do fígado (mg) e esta figura (aunidade Leishman-Donovan (LDU)) é usada como a base para calcular adiferença na carga de parasitas entre animais tratados e não tratados (Croft &Yardley, 1999 supra).
Como mostrado nas Figuras 1 a 3, há uma resposta de doselog/linear dramática de inibição do número de parasitas com concentração detretazicar. Nenhuma toxicidade relacionada com droga, como medida porperda de peso corporal, foi observada nestes experimentos e uma toxicidadesignificativa não foi observada até que uma dose de 10 mg/kg χ 5 fosseempregada. Os valores de ED50 obtidos são mostrados na Tabela 2. Aatividade equivalente de tretazicar em ambos os ratos BALB/c e SCIDimunodeficiente mostra que a terapia não é imunodependente. Isto seriaprevisto a partir do mecanismo de ação proposto. Stibogluconato em seuMTD (15 mg/kg χ 5 SC) foi usado como o composto de controle para estesexperimentos. Esta dose somente alcançou uma inibição de 52 ± 15,2% nacontagem de parasitas em ratos BALB/c e pouco efeito no modelo de ratoSCID. A eficácia in vivo de stibogluconato é conhecida como sendodependente de células T (Murray et al (1993) Antimicrob. Agents Chemother.37, 1504-1505). A atividade de tretazicar é notadamente maior que a dasdrogas anti-leishmaniose em modelos de ratos (comparar os dados na Tabela1 com aqueles em Croft & Yardley, 1999 supra).
Tretazicar é também efetivo contra T. cruzi in vivo. Comomostrado na Tabela 3, ratos BALB/c infectados mas não tratados somentesobreviveram por uma média de 13,8 dias. Em uma dose de 0,3 mg/kg (IP χ5, diariamente), todos os ratos sobreviveram pelos 50 dias antes doexperimento ser terminado. Contudo, nesta dose, os parasitas podem ainda serdetectados no sangue em 13 dias. Uma dose de 3,0 mg/kg (IP χ 5,diariamente) eliminou todos os parasitas do sangue. Uma dose de 45 mg/kg(p.o. χ 5, diariamente) de benznidazol foi requerida para produzir um efeitoequivalente.
Tabela 2: Atividade de tretazicar contra L. donovani HU3
<table>table see original document page 14</column></row><table>Tabela 3: Atividade de tretazicar contra T. cruzi
<table>table see original document page 15</column></row><table>
Dada a aceitabilidade clínica provada de tretazicar, este agenterepresenta uma nova abordagem de pró-droga para o tratamento de infestaçãoparasítica, particularmente, leishmaniose e Doença de Chagas.
Métodos de triagem in vitro
Doença de Chagas: Modelo de triagem in vitro T. cruzi(MHOM/CL/OO/Tulahuen); T. cruzi (MHOM/BR/OO/Y)Culturas de células e parasitas
O T. cruzi (MBOWCL/OO/Tulahuen) transfectado com β-genegalactosidase (Lac Z) foi usado (Buckner et al (1996) Antimicrobial Agentsand ChemotherapyAO(U), 2592-2597. A cepa foi mantida em uma camadade célula L-6 (linhagem de célula de mioblasto de esqueleto de rato obtida daEuropean Collection of Animal Gell Cultures (ECACC, Salisbury, UK)) emmeio de vermelho de fenol RPMI 1640 w/o suplementado com 10% de sorode bezerro fetal desativado por calor. Todas as culturas e ensaios foramconduzidos a 37°C sob uma atmosfera de 5% de CO2 em ar.
Ensaios de sensibilidade de droga
As soluções de tretazicar de carga foram preparadas em 100%de DMSO (sulfóxido de dimetila) em 20 mg/ml. As cargas foram mantidas àtemperatura ambiente no escuro antes do uso. Para os ensaios, o composto foitambém diluído até a concentração apropriada usando meio completo.
Os ensaios foram realizados em placas de microtitulação com96 poços estéreis, com cada poço contendo 100 μl de meio com 1x103 célulasL-6. Após 24 horas, 50 μl de uma suspensão de tripanossoma contendoformas de corrente sangüínea com 5x10 tripomastigotes da cultura foramadicionados aos poços. 48 horas após, o meio foi removido dos poços e15 substituído por 100 μl de meio fresco com ou sem uma diluição de droga emsérie. Após 72 horas de incubação, as placas foram inspecionadas sob ummicroscópio invertido para assegurar o crescimento dos controles e aesterilidade, e para determinar a concentração inibitória mínima (MIC): esta éa menor concentração de droga na qual nenhum tripanossoma com morfologianormal, comparado com os poços de controle, pode ser visto. Nifurtimox foiusado como a droga de referência.
O substrato CPRG/Nonidet (50 μl) foi adicionado a todos ospoços. Uma reação de cor se tornou visível dentro de 2-6 horas e foi lidafotometricamente em 540 nm. Os resultados, expressados como % de reduçãoem danos de parasita quando comparado com os poços de controle, foramtransferidos para um programa gráfico (EXCEL), curvas de inibição sigmóidedeterminadas e valores de IC50 calculados.
Triagem Primária
Os compostos foram testados em triplicata em 4 concentrações(30-10-3-1 μg/ml). Nifurtimox foi incluído como a droga de referência.
O composto é classificado como inativo quando a IC50 formaior que 15 μg/ml. Quando a IC50 ficar entre 15 e 5 μg/ml, o composto éconsiderado como sendo moderadamente ativo. Quando a IC50 for menor que5 μg/ml, o composto é classificado como altamente ativo e é também avaliadoem uma triagem secundária.
Triagem Secundária
O mesmo protocolo foi usado e a IC50 determinada usandouma faixa de doses estendida quando apropriado.
Leishmaniasis: Triagem in vitro
Culturas de células e parasitas
Uma cepa de Leishmania spp. (Leishmania donovaniMHOMIET/67/L82, também conhecida como LV9,HU3) foi usada. A cepa émantida na Syrian Hamster (Mesocricetus auratus). Amastigotes foramcoletados do baço de um hamster infectado e o dano por parasita no balo foiavaliado usando a técnica de Stauber.
Os macrófagos de ratos peritoneais primários (CDl) foramcoletados 1 ou 2 dias após uma estimulação da produção de macrófagos comuma injeção i.p. de 2 ml de amido solúvel a 2%. Todas as culturas e ensaiosforam conduzidos a 37°C sob uma atmosfera de 5% de CO2.
Ensaios de sensibilidade a droga
20 mg/kg de solução de carga de tretazicar foram preparadosem 100% de DMSO e foram mantidos à temperatura ambiente no escuro. Acarga foi pré-diluída até 60 μg/ml em RPMI 1640 +10% de soro de bezerrofetal desativado. Os ensaios foram realizados em lâminas de cultura de tecidocom 16 poços estéreis, com cada poço contendo 50 μl das diluições docomposto juntamente com 100 μl de inóculo de macrófagos/parasitas (4x105macrófagos/ml e 4x106 parasitas/ml). O inóculo foi preparado em meioRPMI-1640, suplementado com 10% de soro de bezerro fetal desativado porcalor. O crescimento de parasitas foi comparado com os poços de controle(100% de crescimento de parasitas). Após 5 dias de incubação, o crescimentode parasitas foi microscopicamente avaliado após o manchamento das célulascom uma solução de 10% de Giemsa. O nível de infecção/poço foi avaliadopela contagem do número de macrófagos infectados por 100 macrófagos. Osresultados expressados como % de redução no dano por parasitas comparadocom os poços de controle, foram transferidos em um programa gráfico(EXCEL), curvas de inibições sigmóides determinadas e os valores de IC50calculados.
Triagem Primária
Os compostos foram testados em quadruplicata em 4concentrações (30-10-3-1 μg/ml). Pentostam® (stibogluconato de sódio)foi incluído como a droga de referência.
O composto é classificado como inativo quando a IC50 formaior que 15 μg/ml. Quando a IC50 ficar entre 15 e 5 μg/ml, o composto éconsiderado como sendo moderadamente ativo. Quando a IC50 for menor que5 μg/ml, o composto é classificado como altamente ativo e é classificadocomo altamente ativo e é também avaliado em uma triagem secundária.
Triagem Secundária
O mesmo protocolo foi usado e a IC50 determinada usandouma faixa de doses estendida quando apropriado. Pentostam® foi incluídocomo a droga de referência.

Claims (15)

1. Uso de tretazicar, caracterizado pelo fato de ser nafabricação de um medicamento para combater uma infecção parasítica porprotozoário de um animal.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o animal é um mamífero.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o mamífero é um humano.
4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que o parasita que causa a infecção está associadocom um sistema de enzima capaz de ativar tretazicar em uma formacitotóxica.
5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que a enzima é uma nitroredutase.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que o animal é aquele que não contém,endogenamente, um sistema de enzima que ativa tretazicar em uma extensãotal que provoque toxicidade inaceitável ao animal.
7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que o parasita que provoca a infecção é resistente aantibiótico.
8. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a infecção parasítica do animal é causada por qualquer um oumais dos seguintes parasitas: Trypanosoma cruzi, T brucei, Leishmanía spp.particularmente L. infantum, Cryptosporidium e Giardia spp.
9. Uso de uma combinação de tretazicar e um ou maiscompostos conhecidos por terem uso no combate a uma infecção parasíticapor protozoário de um animal, caracterizado pelo fato de ser na fabricação deum medicamento para combater uma infecção parasítica de um animal.
10. Uso de tretazicar, caracterizado pelo fato de ser nafabricação de um medicamento para combater uma infecção parasítica por protozoáriode um animal, em que o animal é administrado com um ou mais outros compostosconhecidos por terem uso no combate a uma infecção parasítica de um animal.
11. Uso de um ou mais compostos conhecidos por terem usono combate a uma infecção parasítica por protozoário de um animal,caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento paracombater uma infecção parasítica de um animal, em que ao animal éadministrado tretazicar.
12. Combinação, caracterizada pelo fato de ser de tretazicar eum ou mais compostos conhecidos por terem uso no combate a uma infecçãoparasítica por protozoário de um organismo hospedeiro.
13. Combinação de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que o organismo hospedeiro é um animal.
14. Combinação de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de ser para uso na medicina.
15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender a combinação como definida na reivindicação 13 e um carreadorfarmaceuticamente aceitável.
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