ES2356330T3 - Método para combatir una infección. - Google Patents

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Abstract

Tretazicar para su uso en la lucha contra una infección por protozoos parásitos de un animal.

Description

Método para combatir una infección.
Esta invención se refiere a la lucha contra la infección y, en particular para el tratamiento de las infecciones por protozoos parásitos.
La lista o la discusión de un documento anterior publicado en esta especificación no debería tomarse necesariamente como un reconocimiento en el que el documento es parte del estado del arte o de conocimiento común general.
La incidencia de los parásitos resistentes a las enfermedades por protozoos ha crecido significativamente en los últimos años como consecuencia de un mayor número de muertes tanto en los países en desarrollo y en el mundo occidental. Las estrategias en curso para abordar el problema de incluir el desarrollo de nuevos fármacos, la adopción de tratamientos estrictos de regímenes y un amplio programa de educación pública.
Un posible medio para la entrega de agentes altamente activos farmacológicos en su sitio de acción con un mínimo de efectos secundarios no deseados en otras células y tejidos es el uso de profármacos. Los profármacos se han conocido durante muchos años y se utilizan en varias indicaciones médicas. Pueden ser definidas como entidades químicas que son modificados por sistemas metabólicas o no-metabólicas dando lugar a la formación o la liberación de especies con la actividad farmacológica deseada. En muchos casos, las formas del profármaco se utilizan para modificar la farmacocinética de la droga por la alternancia de una de las propiedades fisicoquímicas de la droga (como lipofilia). En estos casos, la modificación del profármaco es generalmente no específica, que ocurre por procesos no enzimáticos de degradación o por la acción metabólica de enzimas que están en todas partes. Las formas de los profármacos también se puede utilizar, sin embargo, el objetivo del agente activo farmacológico en sitios específicos, generalmente mediante el aprovechamiento de la distribución diferencial de las enzimas capaces de catalizar la reacción de modificación del profármaco.
En el campo de la activación de la quimioterapia del cáncer de profármacos por el objetivo de enzimas específicas ha sido durante mucho tiempo un objetivo y muchos profármacos potenciales se han sintetizado y probado en la esperanza de que la enzima específica del tumor sea capaz de convertirla específicamente en un agente anti-tumoral.
Muchos investigadores aún están activos en esta área utilizando profármacos diseñados para ser activado por una variedad de enzimas , incluido el \beta-glucuronidasa (Woessner et al (2000) Anticancer Research 20, 2289-2296), DT diaforasa (Loadman et al (2000) Biochemical Pharmacology 59, 831-837) y timidilato sintasa (Collins et al (1999) Clinical Cancer Research 5, 1976-1981).
Como alternativa a esta estrategia de monoterapia del profármaco, algunos investigadores han tratado de entregar la enzima deseada para el tumor, antes de administrar un profármaco. Este enfoque, a menudo denominados terapia de anticuerpos enzimáticas dirigidas profarmacológicas (TAEDP), ha sido divulgada en WO88/07378. En este ejemplo, la enzima está relacionada con un anticuerpo monoclonal anticuerpo que es capaz de unirse a un tumor antígeno asociado. De este modo, la enzima se entrega a los lugares del tumor donde puede actuar sobre un profármaco adecuado. Una estrategia similar ha sido revelada, por ejemplo, en WO 96/03151, en el que el gen codifica una enzima que se entrega al tumor y, una vez presente, expresa la enzima deseada. Esta estrategia es a menudo denominado gen de la terapia de gen dirigida a la enzima profarmacológica (TGDEP).
Es un principio importante de muchas de estas estrategias de focalización que la enzima acercada a la zona del tumor debe no ser endógena para el huésped (Aghi et al (2000) J Med Gen 2, 148-164). La presencia de enzimas endógenas conduciría a la no activación específica de la profármacos y toxicidad para los tejidos normales. En consecuencia, la mayoría de estos estudios terapéuticos de enzimas profarmacológicas se han llevado a cabo utilizando enzimas bacterianas como la carboxipeptidasa G2, \beta-lactamasas y nitroreductasa.
Aunque gran parte de la obra hasta la fecha en el campo de la activación profarmacológica del sitio específico se ha concentrado o terapia anticáncer, los esfuerzos de tratamiento, recientemente se han de adaptar a esta tecnología para su uso en aplicaciones de antibacterianas. Por ejemplo, WO 99/32113 describe el uso de profármacos que consiste en una fracción de citotóxico y una fracción de \beta-lactámico. En bacterias Gram-negativas con contenido en enzimas \beta-lactamasas dentro del espacio periplásmico, el profármaco se rompe para liberar la fracción de citotóxico la cual continúa en el desarrollo de las funciones vitales de la célula. Estos profármacos están limitados en su amplitud de aplicación, sin embargo, en que no todas las bacterias que expresan \beta-lactamasas y en que las bacterias Gram-positivas tienden a excretar \beta-lactamasas de tal manera que gran parte del efecto de la toxina beneficiosa localizada del profármaco se perderán.
En Smyth et al ((1998) J. Org Chem. 63, 7600-7618), las S-aminosulfenimina penicilinas son presentadas. Estos compuestos son inhibidores de \beta-lactamasas y plantillas potenciales de profármacos para acercar una variedad de agentes en la \beta-lactamasas de bacterias positivas. Al igual que con los derivados \beta-lactámicos discutidos anteriormente, sin embargo, estos compuestos pueden a ser de utilidad limitada en las bacterias Gram positivas y, debido a su permeabilidad lenta a través de las estructuras exteriores de la membrana de la porina, podría necesitarse que esté presente en concentraciones extracelulares demasiadas altas no deseadas a fin de lograr efectos significativos en bacterias Gramnegativos.
Una salida de las deficiencias potenciales de los profármacos dependientes \beta-lactamasas ha sido presentado por Wei y Pei ((2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 1073-1076). Estos trabajadores demostraron conceptualmente el uso de 5'-dipeptidil derivados de agentes antibacterianos citotóxicos, como profármacos activables por el péptido bacteriano deformilasa. Los resultados preliminares usando estos profármacos sugirió una actividad antibacteriana más bien débil, sin embargo, esto fue una hipótesis que se planteó debido a la escasa captación de los compuestos en las células.
Enfermedades parasitarias humanas son endémicas en muchas partes del mundo. Por ejemplo, la leishmaniasis (una enfermedad parasítica causada por un protozoario intracelular transmitida por la picadura de algunas especies de moscas de arena) se encuentra en aproximadamente 90 países tropicales y subtropicales de todo el mundo y en el sur de Europa. Más del 90% de los casos de leishmaniasis cutánea en el mundo se dan en Afganistán, Argelia, Brasil, Irán, Iraq, Perú, Arabia Saudita, y Siria. Sin embargo, aproximadamente el 75% de los casos que se evalúan en los Estados Unidos fueron adquiridas en América Latina, donde la leishmaniasis se produce desde el norte de México (en ocasiones, en el sur de Texas rural) hasta el norte de Argentina. Más del 90% de los casos de leishmaniasis visceral en el mundo ocurren en Bangladesh, Brasil, India, Nepal y Sudán. Del mismo modo, la distribución geográfica distribución de la enfermedad de Chagas (causada por un parásito protozoo flagelado, Tiypanosoma cruzi, transmitido a los humanos por insectos triatominos) se extiende desde México hasta el sur de Argentina. La enfermedad afecta a 16-18 million de personas y unos 100 millones, es decir, aproximadamente el 25% de la población de América Latina, es un riesgo de contraer la enfermedad de Chagas. Incluso la gente que permanece durante un tiempo corto en las zonas endémicas de parásito puede llegar a ser infectados por enfermedades de parásitos llegando a ser un problema en el mundo desarrollado como resultado del aumento de los viajes mundiales.
La resistencia a los medicamentos que se utilizan actualmente ha sido informada. Los problemas de resistencia requieren el uso de más drogas tóxicas, y que los medicamentos son cada vez menos y menos efectivos a los nuevos medicamentos descubrimientos que se necesitan.
Los inventores han encontrado que, sorprendentemente, las enzimas nitroreductasa también parecen ser expresadas en determinados organismos parásitos protozoarios y los inventores sugieren que tretazicar puede ser muy eficaz contra la infestación parasitaria en los animales (como los humanos), porque los animales (humanos) de acogida no es sensible a este agente, mientras que el parásito podrá estar tóxicamente afectado. Los inventores han demostrado que tretazicar es muy eficaz contra ciertos parásitos protozoarios y por lo que es un objeto de la invención para proporcionar tretazicar un agente antiparasítico altamente efectivo.
Un aspecto de la invención proporciona un uso de tretazicar en la fabricación de un medicamento para combatir una infección por protozoos parásitos de un animal.
El compuesto tretazicar es (5-(aziridin-1-il)-2,4-dinitrobenzamida (CB1954)), cuya estructura se muestra a continuación. Tretazicar ha sido utilizado anteriormente como agente contra el cáncer.
1
Tretazicar tiene el número de registro C.A.S. N º 21919-05-1 y su síntesis se ha descrito en Khan & Ross (1969/70) "Inhibidores nitrofenilaziridinas del crecimiento tumoral y compuestos relacionados: relaciones estructura-actividad" Chem-Biol. Interacciones 1, 27-47 y en Cobb et al (1969) Biochem. Pharmacol. 18, 1519-1527.
Este compuesto es capaz de erradicar un tumor de rata específica ("tumor Walker"), aunque tiene poco o ningún efecto de una variedad de otros tumores (Cobb et al (1969) Biochem. Pharmacol. 18, 159-1527) y no muestra ningún beneficio terapéutico en los estudios de oncología clínica (Knox et al (1993) Cáncer y Metástasis Rev. 12, 195-212). Se ha demostrado que una enzima nitroreductasa presente en el tumor de Walker es capaz de activar CB1954 reduciendo su 4-grupo nitro a la forma del compuesto 5-aziridino-4-hidroxilamino-2- nitrobenzamina, un potente agente electrofílico de crosslinking de ADN en presencia de tioésteres intracelulares (Knox et al (1988) Biochem. Pharmacol. 37, 4661-4669; Knox et al (1991) Biochem. Pharmacol. 42, 1691-1697). La enzima correspondiente en las células humanas tiene una cinética relativamente lenta de reducción, presentando a las células humanas insensibles a los efectos de la CB1954 (Boland et al (1991) Biochem. Pharmacol. 41, 867-875).
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En estudios mecanísticos en las bacterias, se ha demostrado que la CB 1954, ha atenuado la toxicidad en cepas de nitroreductasenegativa (Venitt y Crofton-Sleigh (1987) Mutagénesis 2, 375-381.
El Tretazicar se activa para formar un agente antiparasitario por el protozoo parásito asociado de las enzimas. El término "parásito protozoario asociado de enzima", significa que una enzima o isoforma de las mismas es específica a la protozoos parásitos que constituyen la infección, o se expresa en una forma funcional a un grado tan bajo por el organismo de acogida como para hacer que cualquier activación de tretazicar por la insuficiencia de este último causa una inaceptable toxicidad en el huésped, pero dicha enzima es expresada pro el parásito protozoario.
Normalmente, el parásito de la enzima asociada es al menos 10 - o 20 veces - o 50 veces - o 100 - veces o 500 - o 1000 - veces más activo en el compuesto de activación que en la enzima presente en el organismo huésped.
Se puede apreciar que tretazicar es substancialmente el mismo por las enzimas endógenas del organismo hospedador y se activa sustancialmente por una o más enzimas en el protozoo parásito.
Por la "activada para formar un agente antiparasitario" se incluye el sentido de que tretazicar se convierte en una forma que se es citotóxica, en particular para el parásito protozoario.
Del mismo modo, se aprecia que los métodos y medicamentos de la invención son especialmente adecuados para luchar contra la infección por el parásito protozoario en el que el parásito protozoario es uno que contiene un sistema enzimático el cual es capaz de activar el tretazicar en una forma sustancialmente citotóxica. Un método para determinar si un parásito protozoario es sensible al tretazicar se describe en el ejemplo. Estos parásitos protozoos pueden ser destruidos por tretazicar. Adecuadamente, infecciones por protozoos parásitos que pueden ser tratados con tretazicar son aquellas para las que tretazicar tiene una CI_{50} de menos de 10 micromolar preferiblemente menos de 5 micromolar y más preferentemente inferior a 1 micromolar.
Otros métodos de determinación de si un parásito protozoario contiene una enzima capaz de activar un tretazicar a una forma citotóxica se dará a conocer a los expertos en la materia. Estos incluyen, pero no limitado a, el uso de los programas informáticos adecuados, por ejemplo, el programa de GAP de la Universidad de Wisconsin Genetic Computing Group, para comparar la secuencia genética de los protozoos con la de nitroreductasa conocida que contienen las especies o el uso de los técnicas clásicas mediante la cual la enzima relevante es detectada, aislada y purificada antes de la prueba con tretazicar.
El Tretazicar se cree que es capaz de covalentemente entrecruzar el ácido nucleico del parásito protozoario, una vez que se ha activado por un sistema de enzima presente en el parásito de en la forma citotóxica. Desde que el tretazicar sólo llega a ser capaz en la activación por una enzima parásita-asociada, la presencia de tretazicar en las células del huésped se cree que no representa un peligro ya que no poseen actividad compatible con la actividad de la enzima. La unión de tretazicar para albergar componentes de la célula a través de la aziridina (o de), grupo mostaza, presentará sólo un menor riesgo de perturbación de la célula, ya que cualquier unión mono funcional de compuestos se cree que están extirpados por los procesos enzimáticos de reparación del huésped (Knox et al (2003) Current Pharmaceutical Design 9, 2091-2104).
El parásito asociado a la enzima responsable de activar el compuesto tiene, creemos, actividad nitroreductasa, por ejemplo, en tanto aeróbicas y las condiciones de hipoxicas.
En una fabricación, el tretazicar puede utilizarse para inhibir selectivamente esos parásitos que han desarrollado resistencia a uno o más antibióticos se utilizan actualmente.
En una realización de la invención, al animal es también se le administra uno o más compuestos conocidos para ser de utilidad en la lucha contra una infección parasitaria.
El Tretazicar y uno o más compuestos como se indica puede ser administrados de igual forma o secuencialmente.
Compuestos conocidos que son de uso en la lucha contra una infección parasitaria incluyen Misonidazol, nitroheterociclicos tales como Nifurtimox y RSU 1069, antimoniales Benznidazol como estibogluconato, y derivados de acetilcolina, tales como la Miltefosina.
Por lo tanto, otros aspectos de la invención proporciona el uso de una combinación de tretazicar y uno o más de otros compuestos conocidos para el uso en la lucha contra una infección parasitaria de un animal en la fabricación de un medicamento para la lucha contra una infección parasitaria de un animal; y el uso de tretazicar en la fabricación de un medicamento para la lucha contra una infección parasitaria de un animal, en el que en el animal se administra uno o más de otros compuestos para el uso en la lucha contra una infección parasitaria de un animal; y el uso de uno o más de otros compuestos conocidos para su utilización contra una infección parasitaria de un animal en la fabricación de un medicamento para combatir una infección parasitaria de un animal, en el que al animal se ha administrado tretazicar.
Los métodos y medicamentos de la invención encuentran una especial utilidad en la lucha contra las infecciones con una o más de Trypanasoma cruzci, T. brucei, Leishmania spp. en particular, infaritum L., Cryptosporidium spp. y Giardia spp.
Otro aspecto de la invención proporciona la combinación de tretazicar con uno o más de otros compuestos conocidos para su uso en la lucha contra una infección por protozooarios parásitos de un organismo de acogida.
La combinación puede ser envasados y presentados para su uso en la medicina.
En una realización futura, la combinación puede ser mayor con un portador farmacéuticamente aceptable a fin de formar una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica que puede incluir, por ejemplo, tretazicar y estériles, pirógenos libre de agua. Normalmente, la composición farmacéutica está en forma líquida en polietilenglicol/N-metil pirrolidona (PEG/NMP) diluido con solución salina (Chung-Faye et al (2001) Clinical Cancer Research 7, 2662-2668).
Una realización preferida es una composición farmacéutica para administración oral. Convenientemente, la composición farmacéutica es una cápsula de gelatina que contiene el tretazicar. Normalmente, la composición farmacéutica es una cápsula o comprimido que permite la liberación entérica, por ejemplo, en virtud de un recubrimiento que se disuelve en el intestino. Métodos de toma de cápsulas y tabletas son bien conocidos en el arte.
Uno o más compuestos tal como se definen pueden ser administrados al organismo hospedador en forma adecuada y en cualquier cantidad efectiva para combatir la infección. Adecuadamente, el veterinario (en el caso de los animales no humanos) o médicos (en el caso de los seres humanos) pueden seleccionar la ruta adecuada de administración y la dosis adecuada o el régimen de administración. Una cantidad de tretazicar es administrada, ya sea como dosis únicas o múltiples, en una cantidad efectiva para combatir la infección parasitaria.
Para la administración a un animal (incluidos los humanos), vías de administración apropiadas incluyen, pero no limitado a intravenosa, transdérmica y por inhalación. Por lo general, a la administración a un ser humano por la infusión, la tretazicar sería administrada en una dosis de hasta 30 mg/m^{2}. La administración oral es también adecuada, como el uso de una cápsula de gelatina como se indicó anteriormente.
El tretazicar puede darse por una variedad de rutas en función de la naturaleza y la localización del agente infeccioso. En consecuencia, una variedad de composiciones de diferente forma farmacéutica son proporcionadas, como quedaría claro para un experto en el arte.
La invención será ahora descrita con más detalle en relación con las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.
La figura 1 muestra la actividad de la tretazicar contra L. donovani HU3 en ratones BALB/c (administración de la PI al día).
La figura 2 muestra la actividad de tretazicar contra L. donovani HU3 en ratones BALLB/c (la administración IV al día).
La figura 3 muestra la actividad de tretazicar contra L. donovani HU3 en ratones SCID (administración intravenosa al día).
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Ejemplo 1 Actividad antiparasitaria de tretazicar Actividad in vitro
El Tretazicar se proyectó contra una serie de organismos parásitos utilizando un enfoque integrado en el sistema de selección in vitro y se comparó con el tratamiento de elección en contra de ese organismo (Tabla 1).
Como se muestra en la Tabla 1, el tretazicar es muy activo frente a Leishmania infantum y tripanosoma cruzi y es mucho más activos que los agentes establecidos. Los ensayos de citotoxicidad contra una serie de líneas celulares humanas siempre dan un valor de IC_{50}> 50 \muM y las relaciones terapéuticas contra de estos dos organismos es, pues, dramática (> 16.000 para T. cruzi y > 625 para L. infantum). Aunque no es tan potente como suramina, el tretazicar era activo contra T. brucei con una relación terapéutica > 10. Ninguna actividad se vio contra las cepas probadas de T. colubriformis o Plasmodium falciparum, presumiblemente porque no expresan un sistema de enzima que es capaz de activar tretazicar en una forma citotóxica.
Dada la aceptación clínica probada de tretazicar, este agente representa un enfoque novedoso para el profármaco tratamiento de la infestación parasitaria, en particular, la leishmaniasis y la enfermedad de Chagas.
TABLA 1 Datos in vitro para tretazicar contra ciertos parásitos
2
Actividad in vitro
En la actividad in vivo de tretazicar contra L. donovani fue probada tanto en ratones BALB/c y SCID. La infección y tratamiento de los animales se realizó según lo descrito por Croft y Yardley y las referencias allí (Croft y Yardley (1999) Los modelos animales de leishmaniasis visceral. En el Manual de modelos animales de infección, Zak, O. (ed), pp 783-787, Academic Press, London). Al final del tratamiento, los ratones fueron pesados para dar una estimación de la toxicidad de los medicamentos. El hígado fue retirado de animales recién sacrificados y se pesó. Los frotis fueron preparados a partir de los hígados en el portaobjetos de microscopio y se fijó con metanol y se tiñeron con Giemsa. El número de parásitos por cada 500 células del hígado se determinó microscópicamente para cada animal de experimentación. Esta cifra se multiplica por el peso total del hígado (mg) y de esta cifra (unidad de Leishman Donovan (ULD)) se utiliza como base para el cálculo de la diferencia en la carga de parásitos, entre tratados y los animales no tratados (Croft y Yardley, 1999 supra).
Como se muestra en las figuras 1 a 3, hay un registro dramático log/lineal dosis respuesta de la inhibición de los números de parásitos con concentración tretazicar. No hay toxicidad relacionada con el medicamento, según lo medido por la pérdida de peso corporal, se observó en estos experimentos, y la toxicidad significativa no se observó hasta una dosis de 10 mg/kg x 5 fue empleado. Los valores obtenidos ED50 se muestran en la Tabla 2. La actividad equivalente de tretazicar tanto en BALB/c e ratones inmunodeficientes SCID muestra que la terapia no es familiarmente inmune. Esto podría predecirse desde el mecanismo de acción propuesto. El estibogluconato en su MTD (15 mg/kg x 5 SC) se utilizó como compuesto de control para estos experimentos. Esta dosis sólo se consigue a 52\pm 15,2% la inhibición en el recuento de parásitos en ratones BALB/c y poco efecto en el modelo de ratón SCID. La eficacia in vivo de estibogluconato es conocida en que las células T dependientes (Murray et al (1993) Antimicrob. Agents Chemother. 37, 1504-1505). La actividad de tretazicar es notablemente superior al medicamento anti-leishmanial contra en modelos de ratón (comparación de los datos en la Tabla 1 con la de los Croft y Yardley, 1999 supra).
El Tretazicar es también eficaz contra T. cruzi en vivo. Como se muestra en el cuadro 3, infectadas pero no tratadas, los ratones BALB/c sólo sobrevivieron un promedio de 13,8 días. A una dosis de 0,3 mg/kg (IP x 5, al día) todos los ratones sobrevivieron durante los 50 días antes de que termine el experimento. Sin embargo, en este parásitos dosis podría ser detectado en la sangre en 13 días. La dosis de 3,0 mg/kg (IP x 5, al día) aclaró que todos los parásitos venían de la sangre. Una dosis de 45 mg/kg (PO x 5 al día) ofbenznidazola era requerida para producir un efecto equivalente.
TABLA 2 Actividad de Tetrazicar contra L. donovani HU3
3
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TABLA 3 Actividad de Tetrazicar contra T cruzi
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Dada la aceptación clínica probada de tretazicar, este agente representa un enfoque novedoso para el profármaco en el tratamiento de la infestación parasitaria, en particular, la leishmaniasis y la enfermedad de Chagas.
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Métodos de escáner in vitro
Enfermedad de Chagas: Modelo de escáner in vitro T. cruzi (MHOM/CL/00/Tulahuen); T. cruzi (MHOM/BR/00/Y).
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Parásito y en cultivos celulares
El Trypanosoma cruzi (MHOM/CL/00/Tulahuen) transfectadas con gen \beta-galactosidasa (Lac Z), se utilizó (Buckner et al (1996) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 40 (11), 2592-2597. La cepa se mantuvo en un L-6 (rata de mioblastos esquelética línea celular obtenida de European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC, Salisbury, Reino Unido)) capa de células en RPMI 1640 w/o fenol rojo medio suplementado con 10% de calor inactivo fetal de suero bovino. Todos los cultivos y los ensayos se realizaron en el 37ºC en una atmósfera de 5% de CO2 en el aire.
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Ensayos de sensibilidad del medicamento
Las soluciones stock Tretazicar se prepararon en el 100% de DMSO (dimetilsulfóxido) en 20 mg/ml. Las existencias se mantienen a temperatura ambiente en la oscuridad antes de su uso. Para los ensayos, el compuesto se diluye aún más a las pertinentes concentraciones utilizando un medio completo.
Los ensayos se realizaron en 96 placas estériles de microtitulación, cada una en un medio con 100 \mul con 2x103 L-6 celdas. Después de 24 horas 50 \mul. de una suspensión de tripanosomas con 5 x 103 formas de tripomastigotes torrente sanguíneo a partir del cultivo ha sido añadido a los pozos. 48 horas más tarde el medio fue eliminado de los pozos y sustituidos por 100 \mul de medio fresco, con o sin la disolución del medicamento en serie. Después de 72 horas de incubación de las placas fueron inspeccionados bajo un microscopio invertido para asegurar el crecimiento de los controles y la esterilidad, y para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM): esta es la menor concentración de medicamento en la que los no tripanosomas con morfología normal, en comparación con el control de los pozos pueden ser vistos. Nifurtimox fue utilizado como fármaco de referencia.
El sustrato CPRG/Nonidet (50 \mul.) fue añadido a todos los pocillos. Una reacción de color se hizo visible en las 2-6 horas y fue leído por fotometría a 540 nm. Los resultados, expresados como % de reducción de la carga parasitaria en comparación con el control de los pozos, fueron transferidos a un programa de gráficos (Excel), curvas de inhibición sigmoideal determinadas y los valores de CI_{50} calculado.
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Escáner principal
Los compuestos se analizaron por triplicado en 4 concentraciones (30-10-3-1 \mug/ml). Nifurtimox fue incluido como el medicamento de referencia.
El compuesto está clasificada como inactivo cuando el IC_{50} es superior a 15 \mug/ml. Cuando el IC_{50} se encuentra entre los 15 y 5 \mug/ml, el compuesto es considerado como moderadamente activo. Cuando el IC_{50} es inferior a 5 \mug/ml, el compuesto se clasifica como muy activa, y también se evaluó en un examen secundario.
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Escáner secundario
El mismo protocolo fue utilizado y el IC_{50}s se determinó utilizando un rango de dosis extendida ajustable según proceda.
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Leishmaniasis: escáner in vitro Cultivo de células y parásitos
Una cepa de Leishmania spp. (Leishmania donovani MHOM/ET/67/L82, también conocido como LV9, HU3) fue utilizado. La cepa se mantiene en el hámster sirio (Mesocricetus auratus). Amastigotes se recogieron desde el bazo del hámster infectado y carga parasitaria del bazo se evaluó mediante la técnica de Stauber.
Los macrófagos peritoneales primarios del ratón (CD1) se recogieron 1 o 2 días después de que la producción de los macrófagos con la estimulación con la inyección de 2 ml 2% de almidón soluble. Todos los cultivos y los ensayos se realizaron a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5%.
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Ensayos de sensibilidad de medicamento
20 mg/ml de solución stock tretazicar fue preparado en el 100% DMSO y se mantuvo a temperatura ambiente en la oscuridad. El stock fue pre-diluido a 60 \mug/ml en RPMI 1640 + 10% de calor inactivado en el suero bovino fetal. Los ensayos se realizaron en 16 pozos estériles de muestras de cultivo de tejidos, cada uno con 50 \mul de las diluciones de compuesto junto con 100 \mul de macrófagos/inóculo del parásito (4x10^{5} macrófagos/ml y 4x10^{6} parásitos/ml). El inóculo se preparó en medio RPMI-1640, suplementado con 10% de calor inactivo de suero fetal bovino. El crecimiento del parásito se comparó con el control de pozos (100% el crecimiento del parásito). Después de 5 días de incubación, el crecimiento del parásito fue microscópicamente evaluado después de la tinción de las células con una solución de Giemsa al 10%. El nivel de infección/pozo fue evaluado por la cuantificación del número de macrófagos infectados por 100 macrófagos. El resultado se expresó como % de reducción de la carga parasitaria en comparación con el control de los pozos, fueron transferidos en un programa de gráficos (Excel), curvas de inhibición sigmoidales y valores de CI_{50} determinados.
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Escáner Primario
Los compuestos fueron probados en cuatro ejemplares en 4 concentraciones (30-10-3-1 \mug/ml). Pentostam® (sodio estibogluconato) fue incluido como el fármaco de referencia.
El compuesto está clasificado como inactivo cuando el IC_{50} es superior a 15 \mug/ml. Cuando el IC_{50} se encuentra entre los 15 y 5 \mug/ml, el compuesto es considerado como moderadamente activo. Cuando el IC_{50} es inferior a 5 \mug/ml, el compuesto se clasifica como muy activo, y también se evaluó en un examen secundario.
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Escáner Secundario
El mismo protocolo se utilizó y el IC_{50} se determinó utilizando un rango de dosis extendida ajustable según proceda. Pentostam® fue incluido como el fármaco de referencia.
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Referencias citadas en la descripción
Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido.
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Claims (17)

1. Tretazicar para su uso en la lucha contra una infección por protozoos parásitos de un animal.
2. El uso de tretazicar en la fabricación de un medicamento para combatir una infección por protozoos parásitos de un animal.
3. Uso según la reivindicación 2, o tretazicar para su uso según la reivindicación 1, donde el animal es un mamífero.
4. Uso o tretazicar para su uso según la reivindicación 3, donde el mamífero es un ser humano.
5. Uso o tretazicar para uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el parásito que causa la infección está asociado con un sistema de enzimas capaces de activar el tretazicar en una forma citotóxica.
6. Uso o tretazicar para su uso según la reivindicación 5, donde la enzima es una nitroreductasa.
7. Uso o tretazicar para uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el animal es uno de los cuales no contienen endógenamente un sistema enzimático que activa el tretazicar a tal grado como para causar una inaceptable toxicidad para el animal.
8. Uso o tretazicar para uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el parásito que causa la infección es resistente al antibiótico.
9. Un uso según la reivindicación 2 o tretazicar para su uso según la reivindicación 1, donde la infección parasitaria del animal, es causada por uno o más de los siguientes parásitos: Trypanosoma cruzi, T. brucei, Leishmania spp. en particular, L. infantum, Cryptosporidium y Giardia spp.
10. Tretazicar para su uso según la reivindicación 1 en donde al animal también se le administra uno o más de otros compuestos conocidos por su utilidad en la lucha contra una infección parasitaria.
11. Uso de una combinación de tretazicar y uno o más de otros compuestos conocidos por su utilidad en la lucha contra una infección parasitaria protozoaria de un animal en la fabricación de un medicamento para combatir una infección parasitaria de un animal.
12. Uso de tretazicar en la fabricación de un medicamento para combatir una infección por parásitos protozoarios de un animal, en el que al animal se administra uno o más de otros compuestos conocidos por su utilidad en la lucha contra una infección parasitaria de un animal.
13. Uso de una o más de otros compuestos conocidos por ser de utilidad en la lucha contra una infección de parásitos protozoarios de un animal en la fabricación de un medicamento para combatir una infección parasitaria de un animal, en la que se administra tretazicar al animal.
14. Una combinación de tretazicar y uno o más de otros compuestos conocidos por su utilidad en la lucha contra una infección de parásitos protozoarios en un organismo huésped.
15. Una combinación según la reivindicación 14 en el que el organismo huésped es un animal.
16. Una combinación según la reivindicación 15 para uso en la medicina.
17. Una composición farmacéutica que comprende la combinación como se define en la reivindicación 15 y un portador farmacéuticamente aceptable.
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