BRPI0615541A2

BRPI0615541A2 - formulaÇÕes nasais de eritropoietina recombinante humana (rhuepo) com baixo conteédo de Ácido siÁlico para o tratamento de doenÇas do sistema nervoso central

Info

Publication number: BRPI0615541A2
Application number: BRPI0615541-3A
Authority: BR
Inventors: Adriana Munoz Cernada; Julio Cesar Garcia Rodrigues; Yanier Nunez Figueredo; Zenia Pardo Ruiz; Jorge Daniel Garcia Selman; Iliana Sosa Teste; David Curbelo Rodriguez; Janette Cruz Rodriguez; Nelvys Subiros Martinez
Original assignee: Ct De Investigacion Y Desarrollo De Medicamentos Cidem
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-27
Publication date: 2013-02-13
Also published as: CA2616156C; EP1997483B1; HK1216993A1; AU2006272217A1; EP1997483A1; WO2007009404A1; CU23317A1; TR201815428T4; CN101296692A; EP1997483A4; CA2616156A1; MX2008000997A; CN105435212A

Abstract

Formulações nasais de eritropoietina recombinante humana (rHuEPO) com baixo conteúdo de ácido siálico para o tratamento de doenças do sistema nervoso central. A presente invenção refere-se à indústria biofarmacêutica e em específico ao desenvolvimento de uma medicação para o tratamento de doenças cerebrovasculares, neurodegenerativas e psiquiátricas. Seu princípio ativo é a eritoproteina humana recombinante (rHuEPO) com baixo conteúdo de ácido siálico. Durante a produção de rHuEPO, esta glicoproteína é obtida com diferentes conteúdos de ácido siálico; se menor do que 40% da molécula for protegida com ácido siálico (básico), náo é biologicamente ativo no modo sistêmico como é então tornado inativo pelas enzimas hepáticas. De forma surpreendente, percebemos que a administração intranasal da rHuEPO básica intensificou a atividade terapêutica em comparação com rHuEPO ácida. As formulações nasais da rHuEPO básica aqui apresentadas incorporam polímeros bioadesivos que aumentam o tempo de residência na cavidade nasal, assim aumentando seu efetivo terapêutico. Eles também incluem outras substâncias auxiliares como conservantes, agentes tenso ativos, reguladores de pH, agentes isotônicos e estabilizantes de proteína.

Description

Formulações nasais de eritropoietina recombinante humana (rHuEPO) com baixo conteúdo de ácido siálico para o tratamento de doenças do sistema nervoso central.

Esta invenção refere-se à indústria biofarmacêutica e em específico à produção de uma medicação intranasal de rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico (básico) a partir de células do ovário de hamsters chineses através de uma engenharia genética para o tratamento de doenças cerebrovasculares, neurodegenerativas e psiquiátricas

Eritropoietina (EPO) é um hormônio da glicoproteína cujo peso molecular está dentro da variação de 34 kDa; a fração de proteína consiste de aproximadamente 166 aminoácidos; é produzido nas células dos rins, do fígado e do sistema nervoso central e é envolvido na proliferação, diferenciação e maturação dos eritrócitos e de outras células hematopoiéticas.

Em 1998, Sakanaka e colaboradores relataram as propriedades neuro-protetoras da rHuEPO contra danos de isquemia in vivo após a oclusão da artéria carótida comum, um modelo de isquemia global seguido pela infusão de rHuEPO nos ventrículos laterais de jerbos. Estes autores observaram uma redução do dano da isquemia nos neurônios hipocampos CA1.

Os efeitos neuroprotetores de rHuEPO podem ser devido a diferentes fatores, incluindo: antagonismo da citotoxicidade induzida por glutamato, aumento na expressão das enzimas antioxidantes, redução na formação de óxido nítrico (NO) mediado por radicais livres, normalização do fluxo sangüíneo cerebral, influenciam na liberação dos neurotransmissores, promoção de neoangiogenese, inibição da apoptose induzida pela excitotoxina ou óxido nítrico, aumento da expressão dos genes anti- apoptótica, efeitos neurotrópicos, redução na excitabilidade neural, efeitos anti- inflamatórios cerebrais, inibição da apoptose induzida por cainato e a produção de citocinas pró-inflamatórias, efeitos angiogênico e neurogênico. Ainda, rHuEPO contribuem para o condicionamento isquêmico. Como um todo, essas considerações podem justificar o uso de rHuEPO no tratamento doenças cerebrovasculares, neurodegenerativas e psiquiátricas.

As propriedades neuroprotetoras da rHuEPO pode prevenir ou reverter a morte dos neurônios, um evento caracterizando muitas doenças do sistema nervoso central, como isquemia, trauma neural e doenças neurodegenerativas e neuro- inflamatórias.

Também foi descrito que os processos neurodegenerativos contribuem para provocar a fisiopatologia da esquizofrenia. É por isso que as drogas neuroprotetoras podem ser uma alternativa terapêutica eficaz para o tratamento desta doença.

Uma vez que o organismo tenha sido exposto a certas condições patológicas, como hipoglicemia ou forte despolarização neural, ou devido à geração de espécies reagentes a oxigênio pela mitocôndria, a expressão da rHuEPO aumenta de forma notável.

Em outro aspecto, os processos de inflamação aumentam o dano cerebral por diferentes mecanismos, e eles até mesmo inibem diretamente a produção local da EPO. De fato, apesar da rHuEPO ser produzida de forma endógena no cérebro após a isquemia, sua expressão é inibida de forma notável por citocinas inflamatórias. Esta inibição reduz a capacidade neuroprotetora da rHuEPO e justifica a administração exógena da rHuEPO como especialmente benéfico para o tratamento de doenças cerebrovasculares, neurodegenerativas e psiquiátricas. Ainda, é bem sabido que a afinidade da molécula rHuEPO

para seu receptor (e, então, a eficácia da resposta fisiológica a esta molécula) está inversamente relacionado ao percentual do ácido siálico associado a ela.

O efeito neuroprotetor da rHuEPO administrada por meio intravenoso aos modelos de murine de isquemia cerebral [LM Brines e cols, PNAS97 (19):10526-10531, 2000] reduz o dano causado por isquemia entre 50 e 75%, e um efeito similar ocorre em humanos (WO 0354475). Entretanto, os resultados clínicos e experimentais de uso da eritropoietina humana recombinante ácida (rHuEPO) não avaliaram ainda o impacto de médio período potencialmente negativo do uso desta molécula na indução da eritropoiese, já que, dado a baixa permeabilidade da barreira hematencefálica (BHE) e a baixa afinidade dos receptores da rHuEPO na SNC, quantidades relativamente grandes de rHuEPO são necessárias para um período relativamente longo para alcançar um efeito farmacológico eficaz. Sob estas condições, corre-se o risco de mais viscosidade do sangue e de maior possibilidade de eventos trombolíticos levando à isquemia cerebral. Estas conseqüência negativas da aplicação da rHuEPO ácida foram relatada como complicações em pacientes nefríticos tratados com esta molécula.

Estudos foram conduzidos a fim de desenvolver métodos que aumentem a permeabilidade da BHE, que é considerado uma etapa crítica na incorporação de substâncias aos tecidos cerebrais (US 5260308; WO 8901343; US 4801575; US 5442043; JP 57146710 e JP 01149718). Muitos destes métodos envolvem os tão chamados portadores (US 5442043) formando um conjugado peptídico ou eles usam peptídeos quiméricos (US 48015575) para a incorporação das substâncias ao cérebro. A preparação dos Iipossomas contendo eritropoietina foi relatada (JP 08231417).

O uso do meio intranasal faz com que as moléculas alcancem SNC foi relatado para gangliosídeos (US 4639437), assim como agentes terapêuticos neuronais atingindo o cérebro através de sua absorção pela membrana mucosal do nariz e seu subseqüente transporte através do meio neural olfatório (EP 504263).

Há várias patentes relacionadas à proteção de formulações líquidas da rHuEPO, a maioria dos representantes estão listados a seguir:

Preparações nas quais o princípio ativo usado é a rHuEPO, e na qual as proteínas em todos os casos apresentados na forma injetável (e.g.: CIPO- 2041989; CIPO-2353553). Este meio de administração indica que a rHuEPO usada foi do tipo ácido, ou seja, mais de 40 % da molécula seria coberta com ácido siálico, do contrário teria sido tornada inativa pelas enzimas hepáticas e não seria clinicamente eficaz.

A patente CIPO-2074820 usa o meio intranasal para a administração da proteína. Neste caso, as ciclodextrinas são usadas como um componente da formulação e, similarmente, uma absorção sistêmica da rHuEPO é buscada, de modo que a proteína também seja ácida.

Há publicações cientificas com referência ao uso de agentes bioadesivos para aumentar o tempo de residência das proteínas na cavidade nasal Polireddy D e cols, International Journal of Pharmaceutics (127):115 - 133, 1996]; entretanto, não há relatórios sobre o uso de agentes bioadesivos nas formulações contendo rHuEPO.

A patente CIPO-2353553 justifica a administração exógena da rHuEPO para o tratamento de isquemia cerebral, mas, como nos casos anteriores, a busca é que a proteína passe diretamente ou indiretamente à corrente sangüínea a fim de ser eficaz, de modo que estamos igualmente na presença da rHuEPO com alto conteúdo de ácido siálico.

A patente CIPO-2408685 cobre diferentes formulações da rHuEPO, mas, neste caso, elas são para fins de tratamento da anemia, de modo que a rHuEPO ácida, já que a rHuEPO básica não pode promover a proliferação, diferenciação e maturação dos eritrócitos. A patente CIPO-2437333 especifica que as formulações

protegidas iniciam da eritropoietina alfa, i.e., da rHuEPO ácida.

Em todos os casos expostos anteriormente e revistos na literatura, a referência é feita à rHuEPO ácida, ao passo que a patente que estamos solicitando é para fins de proteção de formulações líquidas iniciando da rHuEPO básica. Durante a produção da rHuEPO, a glicoproteína é obtida com

diferentes conteúdos de ácido siálico. A proteína tendo menos de 40% de sua molécula protegida com ácido siálico (básico) é normalmente eliminada, já que não é biologicamente ativa pelo meio sistêmico. Esta rHuEPO básica, com um baixo conteúdo de ácido siálico, representa 70% da produção total da rHuEPO. De maneira surpreendente, descobrimos que a administração intranasal da rHuEPO básica pode ter valores terapêuticos mais altos do que a rHuEPO ácida; os resultados desta invenção permite tomar vantagem das isoformas básicas da rHuEPO, que, no momento, não são recuperados e são de fácil aquisição. Isto representa uma grande vantagem econômica porque permite recuperar o que, naquele momento, constitui um desperdício da produção da rHuEPO.

Esta formulação pode ser usada para o tratamento e/ou prevenção de doenças do sistema nervoso central, incluindo desordens cerebrovasculares, neurodegenerativas e psiquiátricas, a nível ambulatorial a nível do sistema de saúde primário. As vantagens da solução proposta inclui o emprego da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico para fins terapêuticos permitindo maiores efeitos protetores com doses menores. Uma chegada rápida do agente terapêutico ao local de ação é alcançada, e isto é crítico para alcançar efeitos terapêuticos satisfatórios na presença de hipoxia cerebral. No caso específico das doenças cerebrovasculares, na fase aguda, é necessário começar com a intervenção terapêutica antes de determinados processos da cascata isquêmica acontecer. Este processo é chamado de período da janela terapêutica.

Administração intranasal da rHuEPO básica elimina o risco de induzir a eritropoiese. Um incremento na concentração de eritrócitos aumentaria a viscosidade sangüínea, assim, ameaçando a reperfusão após um episódio de oclusão ou hemorragia, de modo que o fluxo sangüíneo cerebral diminuiria e, portanto, a chegada do oxigênio e nutrientes aos tecidos cerebrais seria impedida.

O meio intranasal tem maiores vantagens do que outras formas de administração, permitindo rápido acesso ao cérebro; é menos invasivo do que os meios endovenosos ou intracerebroventricular, e um percentual da rHuEPO pode alcançar o fluido cérebro-espinhal sem ter que antes passar à corrente sangüínea; isto evita o metabolismo da primeira etapa hepática, assim, prevenindo sua conseqüente inativação. A aplicação intranasal não é traumática e elimina os riscos cirúrgicos e outras possíveis implicações dadas por meios traumáticos. Constitui um meio alternativo de acesso ao cérebro sem danificar a BHE. O uso de um meio de administração alternativo ao meio vascular assegura a chegada da molécula às áreas do sistema nervoso central com pouca ou nenhuma irrigação sangüínea, por difusão através do fluido intersticial.

Mantendo em mente que uma das principais limitações da administração intranasai é a rápida purificação do muco induzido por cílio, esta invenção utiliza-se da estratégia de usar polímeros bioadesivos que aumentem o tempo de residência da rHuEPO na cavidade nasal. Durante o desenvolvimento da formulação, ouras substâncias auxiliares ou recipientes foram também incorporadas, como os conservantes, agentes tensoativos, reguladores de pH, agentes isotônicos e estabilizadores de proteína a fim de obter uma formulação com estabilidade física, química e microbiológica que mantém suas propriedades terapêuticas por todo o tempo. Figuras

Fig. 1. Ação de ácido e eritropoietina básica na atividade enzimática da GST em culturas de células PC12.

Fig. 2. Efeito na mortalidade, ambos os sexos, no modelo de isquemia cerebral no jerbo da Mongólia.

Fig. 3. Atividade motora funcional do jerbo da Mongólia no cilindro. Fig. 4. Status neurológico dos animais, 24 horas após a lesão.

Fig. 5. Efeito da administração intranasal da rHuEPO no peso corpóreo em animais tratados durante 5 semanas após isquemia cerebral unilateral. Fig. 6 a e b. Efeito da rHuEPO no edema cerebral.

Fig. 7, Pontuação hístopatológica dos danos no setor CA1 do hipocampo do jerbo. Fig. 8. Microfotografia do hipocampo do jerbo após a lesão isquêmica sem tratamento (A) e tratada por administração da rHuEPO (B). Observe a integridade Fig. 9. Efeito protetor da eritropoietina básica e ácido em peroxidação !ipódica nos tecidos do sistema nervoso.

Fig. 10. Comportamento dos valores médios das variáveis hematológicas analisadas nas três amostras para o grupo tratado com rHuEPO em relação à variação normal range X ± 2SD da primeira amostragem. Fig. 11. Passagem da eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico da cavidade nasal ao bulbo olfatório e cerebelo. Descrição da invenção

A rHuEPO usada continha em sua molécula menos de 40% de ácido siálico (ou seja, rHuEPO básica) com concentração variando de 0,5 a 2 mg/rrtL. As formulações aqui apresentadas são preparações líquidas, incolores, transparentes, livres de impurezas mecânicas, com viscosidade aparente variando de 10 a 250 mPas. Como polímeros bioadesivos, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) em concentrações de 0,4 a 0,9%, hidroxipropilcelulose (HPC) de 0,2 a 0,8% e metil celulose (MC) de 0,25 a 0,5% foram empregados.

O pH foi ajustado a uma variação de 6,0 a 7,5 com o uso,

principalmente de tampões de fosfato e citrato em concentrações de 20 a 100 mM/L.

A pressão osmótica pode ser regulada com diferentes agentes isotônicos, por exemplo: Cloreto de sódio, manitol, sorbitol, glucose, entre outros, dentro de uma variação de 0,05 para 10 g/L.

Os agentes conservantes usados foram: Cloreto de benzalcônio concentração de 0,01 para 0,02% em combinação com dissódio-EDTA em concentrações dentro da variação de 0,01%, clorobutanol de 0,3 para 0,5%, metilparabeno de 0,02 para 0,035 % e propilparabeno de 0,01 para 0,02 %.

A fim de evitar aderência da proteína nas paredes do recipiente, foram usados surfactantes não iônicos não iônicos [sic], como Iaurato de polietilenosorbitano (Tween 20 a 80), cremofor RH 40, trioleato de sorbitano (spam 35 a 80), com variações nas concentrações de 0,01 para 1 g/L.

Como estabilizantes de proteínas, foram usados diferentes aminoácidos, entre outros: L-triptofano, L-Ieucina1 L-arginina hidrocloreto e L-hidrocloreto de histidina com variações nas concentrações entre 0,1 e 10 mg/mL. O solvente usado em todos estes casos foi água para injeção.

Testes da irritabilidade da membrana da mucosa nasal foram conduzidos em ratos, e nenhuma indicação de irritação foi descoberta neste nível. Isto, junto com a excelente tolerância do produto, apresenta validação toxicológica para o emprego da rHuEPO básica em humanos.

Estudos de estabilidade mostraram um comportamento apropriado de concentrações de proteína em tempo. Sob a aplicação do método de Lowry (± 10%), o pH ficou dentro dos limites estabelecidos. EXEMPLOS DE TRABALHOS Exemplo 1:

Purificação da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico:

Para obter eritropoietina básica com conteúdo de ácido siálico menor do que 40%, três etapas cromatográficas foram executadas, iniciando de um material de grande complexidade e com uma grande quantidade de proteínas contaminantesjá que este material contém 5% do soro bovino fetal. Uma etapa adicional é, então, realizada para obter os isoformes de interesse.

Para a diafiltração e concentração da rHuEPO básica um sistema de ultrafiltração em escala Iaboratoral (SARTOFLOW SLICE 200) foi usado, acoplado a uma bomba peristáltica (IP55 Watson-Marlow). Foi usada uma membrana Hydrosart de 10 kDa. O trabalho foi realizado a um fluxo de 1,9 ± 0,25 mL/min, uma pressão de alimentação (P1) de 2,9 ± 0,25 bar, uma pressão de fração retida (P2) de 0,65 ± 0,1 bar e uma pressão de transmembrana (TM) de 1,8 ± 0,2 bar. Para a determinação da concentração de proteína, um espectrofotômetro UItrospec TM 3100 foi usado a λ = 280 nm. Para o processo diafiltração, uma solução de tampão intranasal NaH2PO4 e Na2HPO4 a um pH de 6,0 e uma condutividade de 3,25 ms/cm foi usada. O pH foi controlado pelo uso de um metro Sartorius pH e um conductímetro Omega. A produção do processo é revelada na variação de 75 - 95 %. A Tabela 1 mostra os resultados do processo:

Tempo (h) PH Condutividade (ms/cm) Concentração (mg/mL) Volume da solução intranasal incorporada (mL) Volume real (mL) 0 7,12 14,29 1,72 - 290,0 6,0 6,5 4,5 1,3 800 _ 12 6,0 3,5 2,1 1100,0 210,0

Exemplo 2: Formulação Nasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico que usa HPMC como polímero bioadesivo, histidina hidrocloreto como estabilizador, Tween 80 como surfactantes não ionicos e cloreto de benzalcônio como conservante. Método de Preparação:

A preparação da solução inicia de um volume de água para

injeção representando 30% do volume total da formulação. Este volume é usado para dissolver o conservante, o tampão e agente isotônico. Além disso, em um recipiente da capacidade apropriada, um volume de água para injeção igual a 15 % do volume total da formulação é colocada e aquecida a uma temperatura variando de 85 a 95°C, e o polímero é disperso com força, agitação constante. Uma vez que o polímero é umedecido, a solução preparada anteriormente é incorporada ao mesmo enquanto agitando vigorosamente até a homogeneização total. A agitação é então reduzida a fim de incorporar o volume correspondente da rHuEPO básica, o surfactante não iônico e o estabilizador de proteína. Finalmente, o volume é completado com a água para injeção até o 100% do volume finai da formulação. A formulação é filtrado de maneira subseqüente através de uma membrana de acetato de celulose de 0,2 μηι e o pH é testado para verificar que se mantenha dentro da variação estabelecida.

A composição da preparação finalizada é como segue: Componente Proporção

rHuEPO básico 0,8 mg/mL

Hidroxipropilmetilcelulose 5,0 mg/mL

Hidrocloreto de histidina 1,0 mg/mL

Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL

Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL

Tween 80 0,25 mg/mL

Cloreto de Sódio 7,4 mg/mL

Ácido etilenodiamino tetracético 0,1 mg/mL dissódico

Cloreto de Benzalcônio 0,2 mg/mL

Água para injeção q.s. 1 ml

Exemplo 3:

Formulação Nasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo anterior, mas com uso de metilcelulose como polímero bioadesivo. Método de Preparação: similar ao exemplo 2.

A composição da preparação finalizada é como segue: Componente Proporção

rHuEPO básico 0,8 mg/mL

Metilcelulose 3,0 mg/mL

20 Hidrocloreto de histidina 1,0 mg/mL

Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL

Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL

Tween 80 0,25 mg/mL

Cloreto de sódio 7,4 mg/mL

Ácido etilenodiamino tetrácetico 0,1 mg/mL dissódico

Cloreto de benzalcônio 0,2 mg/mL

Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 4:

Formulação Nasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo 2, mas com uso de Tween 20 como surfactante não iônico. Método de Preparação: similar ao exemplo 2.

A composição da preparação finalizada é como segue: Componente Proporção

rHuEPO básico 0,8 mg/mL

Hidroxipropilmetilcelulose 5,0 mg/mL

Hidrocloreto de histidina 1,0 mg/mL

Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL

Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL

Tween 20 0,20 mg/mL

Cloreto de sódio 7,4 mg/mL

Ácido etilenodiamino tetrácetico 0,1 mg/mL dissódico

Cloreto de benzalcônio 0,2 mg/mL

Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 5:

Formulação Nasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo anterior, mas com 1,2 mg/ml do princípio ativo e sem hidrocloreto de histadina como estabilizador de proteína.

Método de preparação: similar ao exemplo 2, mas sem utilizar Hidrocloreto de histidina.

A composição da preparação finalizada é como segue: Componente Proporção

rHuEPO básico 1,2 mg/mL

Hidroxipropilmetilcelulose 5,0 mg/mL

Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL

Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL Tween 20 0,20 mg/mL

Cloreto de sódio 7,7 mg/mL

Ácido etilenodiamino tetrácetico 0,1 mg/mL dissódico

Cloreto de benzalcônio 0,2 mg/mL

Injeção para água csp 1 ml

Exemplo 6:

Formulação Nasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo 2, mas com 1,2 mg/ml de princípio ativo e sem hidrocloreto de histadina como estabilizador de proteína. Método de preparação: similar ao exemplo 2, mas sem utilizar Hidrocloreto de histidina.

A composição da preparação finalizada é como segue: Componente Proporção

rHuEPO básico 1.2 mg/mL

HidroxipropilmetilceIuIose 5.0 mg/mL

Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL

Hidrogênio fosfato dissódico 0.7 mg/mL

Tween 80 0.25 mg/mL

Cloreto de sódio 7.7 mg/mL

Ácido etilenodiamino tetrácetico 0.1 mg/mL dissódico

Cloreto de benzalcônio 0.2 mg/mL

Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 7:

Formulação com base na rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico para administração intranasal, similar ao exemplo 2 mas com metilparabeno e propilparabeno como agentes conservante antimicrobianos. Método de Preparação:

A preparação da solução inicia de um volume de água para injeção representando 30% do volume total da formulação. Este volume é usado para dissolver o tampão e o agente isotônico. Além disso, em um recipiente de capacidade apropriado a água para injeção igual a 15% do volume total da formulação é colocada e aquecida a uma temperatura variando de 90 a 95°C. Os parabenos são dissolvidos e o polímero é então incorporado com força e agitação constante. Uma vez que o polímero é umedecido, a solução anteriormente preparada é incorporada ao mesmo enquanto agitando vigorosamente até a homogeneização total. A agitação é, então, reduzida a fim de incorporar o volume correspondente da rHuEPO, o surfactante não iônico e o hidrocloreto 10

de histadina. Finalmente, o volume completado com água para injeção até 100% do volume final da formulação. A formulação é, de modo subseqüente, filtrado através de uma membrana de acetato de celulose de 0,2 μηι e o pH é testado para verificar que seja mantido dentro da variação estabelecida.

A composição da preparação finalizada é como segue:

Componente Proporção rHuEPO básico 0,8 mg/mL Hidroxipropilmetilcelulose 5,0 mg/mL Hidrocloreto de histidina 1,0 mg/mL Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL Tween 80 0,25 mg/mL Cloreto de sódio 7,5 mg/mL Metilparabeno 0,33 mg/mL PropiIparabeno 0,17 mg/mL Injeção para água q.s. 1 ml

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Exemplo 8:

Formulação Nasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo anterior, mas com uso de metilcelulose como polímero bioadesivo. Método de Preparação: similar ao exemplo 6.

A composição da preparação finalizada é como segue: Componente Proporção

rHuEPO básico 0,8 mg/mL

Metilcelulose 3,0 mg/mL

Hidrocloreto de histidina 1,0 mg/mL

Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL

Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL

Tween 80 0,25 mg/mL

Cloreto de sódio 7,5 mg/mL

Metilparabeno 0,33 mg/mL

Propilparabeno 0,17 mg/mL

Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 9:

Formulação Nasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo 7, mas com uso de Tween 20 como surfactante não iônico. Método de Preparação: similar ao exemplo 7.

A composição da preparação finalizada é como segue: Componente Proporção rHuEPO básico 0,8 mg/mL Hidroxipropilmetilcelulose 5,0 mg/mL Hidrocloreto de histidina 1,0 mg/mL Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL Tween 20 0,20 mg/mL Cloreto de sódio 7,5 mg/mL Metilparabeno 0,33 mg/mL Propilparabeno 0,17 mg/mL Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 10:

Formulação com base na rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo anterior, mas sem hidrocloreto de histadina como estabilizador e com o uso de glicose como agente isotônico. Método de Preparação: similar ao exemplo 7.

A composição da preparação finalizada é como segue:

Componente Proporção rHuEPO básico 1,2 mg/mL Hidroxipropilmetilcelulose 5,0 mg/mL Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL Tween 20 0,20 mg/mL Glucose 48,0 mg/mL Methilparabeno 0,33 mg/mL Propilparabeno 0,17 mg/mL Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 11:

Formulação com base na rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo anterior, mas com Tween 80 como surfactante não iônico. Método de Preparação: similar ao exemplo 7.

A composição da preparação finalizada é como segue: Componente Proporção

rHuEPO básico 1,2 mg/mL

Hidroxipropilmetilcelulose 5,0 mg/mL

Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL

Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL

Tween 80 0,25 mg/mL

Glucose 48,0 mg/mL Metilparabeno 0,33 mg/mL

Propilparabeno 0,17 mg/mL

Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 12:

Formulação Nasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo 7, mas com o uso de clorobutanol como agente conservante antimicrobiano.

Método de Preparação: similar ao exemplo 7.

A composição da preparação finalizada é como segue:

Componente Proporção rHuEPO básico 0,8 mg/mL Hidroxipropilmetilcelulose 5,0 mg/mL Hidrocloreto de histidina 1,0 mg/mL Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL Tween 80 0,25 mg/mL Cloreto de sódio 6,2 mg/mL Clorobutanol 5,0 mg/mL Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 13:

Formulação com base na rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo anterior, mas com metilcelulose como polímero bioadesivo. Método de Preparação: similar ao exemplo 2.

A composição da preparação finalizada é como segue: Componente Proporção

rHuEPO básico 0,8 mg/mL

Metilcelulose 3,0 mg/mL

Hidrocloreto de histidina 1,0 mg/mL

Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL

Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL

Tween 80 0,25 mg/mL

Cloreto de sódio 6,2 mg/mL

Clorobutanol 5,0 mg/mL

Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 14:

Formulação Nasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo 12, mas com Tween 20 como surfactante não iônico Método de Preparação: similar ao exemplo 2. A composição da preparação finalizada é como segue:

Componente Proporção rHuEPO básico 0,8 mg/mL Hidroxipropilmetilcelulose 5,0 mg/mL Hidrocloreto de histidina 1,0 mg/mL Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL Hidrogênio fosfato dissódíco 0,7 mg/mL Tween 20 0,20 mg/mL Cloreto de sódio 6,2 mg/mL Clorobutanol 5,0 mg/mL Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 15;

Formulação Nasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico similar ao exemplo 5, mas com clorobutanol como agente conservante antimicrobiano. Método de Preparação: similar ao exemplo 2.

A composição da preparação finalizada é como segue:

Componente Proporção rHuEPO básico 1,2 mg/mL Hidroxipropilmetilcelulose 5 mg/mL Dihidrogênio fosfato de sódio 2 mg/mL Hidrogênio fosfato dissódico 0,7 mg/mL Tween 20 0,20 mg/mL Cloreto de sódio 6,5 mg/mL Clorobutanol 5,0 mg/mL Injeção para água q.s. 1 ml

Exemplo 16:

Avaliação "in vitro" da ação estimulante nas células de origem nervosa da formulação nasal da eritropoietina humana recombinante com um baixo conteúdo de ácido siálico.

A fim de demonstrar o feito indutivo na atividade específica da enzima Glutation-S-Transferase (GST) da rHuEPO nas células de origem nervosa, assim como demonstrar que a eritropoietina humana recombinante ácida e básica possuem efeitos similares nas células de origem nervosa, um estudo in vitro foi conduzido em células PC12. As células foram mantidas de maneira uniforme no meio DMEM suplementado com 2 mM de L-Glutamine1 100 Unidades/ml penicilina G1 100 microgramas/ml estreptomicina (GIBCO), 10 % (v/v) contendo 10 mM de tampão de Hepes. O meio de cultura foi preparado com soro total de cavalo a 10 %. As células foram adicionadas 0,6 e 15 eritropoietina humana recombinante nanomolar, com baixo conteúdo de ácido siálico (exemplos 5 e 6) ou eritropoietina ácido (totalmente glicolisada). Como controle foram adicionadas células às quantidades similares da rHuEPO, anteriormente tornadas inativas por calor. Os valores da atividade específica da GST obtidos nestas culturas foram considerados como 100%. Para a determinação da atividade específica da GST1 o homogenato das células cultivadas com rHuEPO básica ou ácida foi usado; este foi executado em um sistema de homogeneização totalmente feitas com vidro a 4 0C, com 0,1 M tampão fosfato, pH = 6,95. O homogenato livre das células foi obtido por centrifugação a 16 000 X g, a 4 graus Celsius, em uma centrífuga refrigerada de alta velocidade. O homogenato, assim obtido, foi mantido em um banho de água gelada e foi usado para a determinação da atividade específica da GST de acordo com o método de Habig. (Habig, W.H., Pabst1 J.J., e Jakoby, W.B. 1974; Biol. Chem. 249 (22): 7130-7139). A determinação da proteína foi executada pelo método de Bradford (Bradford Anal MM. Biochem, 72, (176) 158). O principal resultado obtido foi que as células nervosas responderam à presença da rHuEPO pela modificação da atividade da enzima GST. Os valores no gráfico (Fig. 1) representam o valor médio das três culturas independentes. A resposta à eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico foi similar à resposta à rHuEPO ácida.

Fig. 1. Ação de ácido e eritropoietina básica na atividade enzimática da GST em culturas de células PC12. O gráfico mostra como as células nervosas respondem à presença da rHuEPO pela modificação da atividade da enzima GST. Os valores no gráfico representam os valores médios das três culturas respectivas independentes. Exemplo 17:

Eficácia terapêutica da administração intranasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico.

Jerbos da Mongólia de ambos os sexos com peso corpóreo entre 60 e 70 gramas foram usados. Eles estavam recebendo água e alimento ad Iibitum e foram mantidos em ciclos de 12 horas na luz, alternando com 12 horas na escuridão durante o todo o período experimental. Os animais foram submetidos à oclusão unilateral

permanente da carótida direita sob anestesia profunda pelo meio intraperitoneal, com diazepam (5,0 mg/kg) como pré-anestésico. A quetamina (47 mg/kg) e atropina (0,02 mg/kg) foram usadas como agente anestésico. A carótida direita foi exposta sob estereoscópio, duplamente ligado e cortado. Os animais foram preparados com as mesmas manipulações mas sem ligação ou corte da carótida.

Para a avaliação clinica e histopatológica os grupos

experimentais foram:

Grupo de Controle: carótida isolada, sem qualquer outro procedimento (sham) (n = 10). Grupo de animais com danos sem tratamento: Os animais com danos sem submeterem-se a qualquer outro procedimento (n = 20).

Grupo de animais com danos com tratamento: carótida isolada, duplamente ligada e cortada, com administração intranasal da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico (exemplo 10) (n = 20).

O tratamento consistia na aplicação na cavidade nasal de 10 μ! da rHuEPO ou seu veículo a cada 8 horas diariamente, de uma hora após a operação até o 4o subseqüente à operação.

Cada animal foi examinado para determinar seu status neurológico de acordo com a escala de 2 a 5 que incluiu tom corporal, força tenaz e alterações na postura e caminhar. Um animal sobrevivente sem sinais patológicos possui um valor de 5 nesta escala.

A avaliação funcional foi realizada pela observação da atividade exploradora espontânea dos animais, ou seja, contando o número de ações de reação corpórea traseira (i.e., os casos de ficar na ponta dos pés nas patas traseiras) feita por roedores quando explorando um novo recipiente. O recipiente usado foi uma caixa cilíndrica vertical de 30 cm de diâmetro e 25 cm altura. Cada jerbo foi colocado no centro desta caixa e foram contadas as ações traseiras realizadas durante um intervalo de 3 minutos.

Sete dias após a operação, os animais foram aspergidos

através do ventrículo esquerdo com 4 % de solução de formaldehídeo em solução de tampão de fosfato (PBS) a pH = 7,0. Os cérebros foram extraídos e mantidos nesta solução por alguns dias. Depois, os cérebros foram incluídos em parafina, cortados em fatias de 4 μΓπ de espessura e coloridos com hematoxilina e eosina. As seções foram avaliadas a 10 χ e 40 χ sem conhecimento prévio de sua identidade.

Para a avaliação do edema cerebral, foram utilizadas 90 fêmeas entre 60 e 70 g de peso corpóreo, incluídas nos 3 grupos experimentais:

Animais Sham (n = 20).

Animais com danos sem tratamento (n = 35). Animais com danos com tratamento (n = 35)

Três, 12 ou 24 horas após a lesão, os animais foram anestesiados e aspergidos com solução salina. O cérebro foi extraído da cavidade craniana e os hemisférios separados um do outro. A determinação do conteúdo foi executada de acordo com o método gravimétrico descrito por Calapai e cols. 2000 de acordo com a equação: Água % = [(Peso Úmido do Hemisfério - Peso Seco do Hemisfério) X 100 X Peso Úmido "1]. Para análise dos dados, foram estabelecidas diferenças entre grupos e amostras para cada variável por meio do teste do Estudante, o ANOVA (teste de uma via) e teste de Dunnett para Comparação Múltipla. Para a avaliação do peso corpóreo dos animais, os machos foram classificados de forma aleatória em três grupos experimentais (10 animais em cada grupo) seguindo a mesma linha de tratamento usada em experimentos anteriores. Os animais foram pesados com o uso de uma balança Sartorius no dia da operação e posteriormente por uma série de 5 semanas (1 vez por semana).

Durante as experiências descritas com administração nasal da rHuEPO, uma taxa de mortalidade mais baixa foi observada entre os animais tratados durante os dias subseqüentes à cirurgia em ambos os sexos, como evidenciado pela análise das proporções (Fig. 2).

Vinte e quatro horas após a ligação unilateral, uma parte dos animais mostrou comportamento no status neurológico, revelado através do exame descrito e expresso pela pontuação (Fig. 3). Como pode ser observado, apareceu uma lesão funcional significante nos animais sem tratamento. A atividade exploratória funcional motora pareceu deprimida em animais isquêmicos não tratados (Fig. 4), enquanto que esta atividade nos animais tratados com rHuEPO permaneceu similar aos dos controles.

Os efeitos de danos e administração intranasal da rHuEPO no peso corpóreo dos animais no modelo de isquemia unilateral permanente são mostrados na Fig. 5. Uma comparação entre o grupo de animais com danos com o grupo Iesionado e tratado e com o grupo sham mostrou diferentes comportamentos das curvas de peso. O grupo de controle e o grupo Iesionado tratado tiveram curvas similares, contrastando com a perda de peso nos animais com danos não tratados. No curso de várias semanas, este grupo não pode ultrapassar o peso médio com o qual a experiência começou.

Os resultados na redução do edema cerebral foram devido ao fato de que a administração intranasal da rHuEPO apresentou uma proteção significante da formação do edema cerebral em todos os animais tratados (Fig. 6, a e b). Na verdade, nenhuma diferença no conteúdo da água for descoberta entre os animais tratados com rHuEPO e os controles. Uma situação diametricamente oposta foi descoberta no grupo de animais com danos não tratados, em que o conteúdo da água no hemisfério (direito) Iesionado aumentou por todos os períodos estudados (3, 12 e 24 horas), e uma alta significância por 24 horas após a lesão foi descoberta (p < 0,001).

Com relação aos resultados histopatológicos, a freqüência dos animais com o cérebro intacto foi maior entre os animais de controle do que entre os animais não tratados (p = 0,002), e foi também maior entre os animais tratados com rHuEPO do que entre os animais não tratados (p = 0,03), (Fig. 7).

Os animais não tratados foram afetados por edema generalizado e picnose de todo o hemisfério direito, assim como por hemorragia na fimbria do hipocampo direito no córtex parietal do hemisfério direito, áreas densas e edematosas, cromatina difusa no hemisfério direito, neurônios picnóticos no hipocampo (Fig. 8). Fig. 2. Efeito na mortalidade, ambos os sexos, no modelo de isquemia cerebral no jerbo da Mongólia.

Fig. 3. Atividade motora funcional do jerbo da Mongólia no

cilindro.

Fig. 4. Status neurológico dos animais, 24 horas após a lesão.

Fig. 5. Efeito da administração intranasal da rHuEPO no peso corpóreo em animais tratados durante 5 semanas após isquemia cerebral unilateral.

Fig. 6 a e b. Efeito da rHuEPO no edema cerebral.

Fig. 7. Pontuação histopatotógica dos danos no setor CA1 do

hipocampo do jerbo.

Fig. 8. Microfotografia do hipocampo do jerbo após a lesão isquêmica sem tratamento (A) e tratada por administração da rHuEPO (B). Observe a integridade do setor CA1 no animal tratado. Exemplo 18:

Avaliação in vitro da capacidade antioxidante da eritropoietina humana recombinante básica com baixo conteúdo de ácido siálico (exemplo 10) em regiões anatômicas homogêneas das regiões anatômicas do hipocampo, córtex cerebral e cerebelo do rato.

A fim de demonstrar que tanto a rHuEPO básica quanto a ácida são capazes de cancelar a produção de malondialdeídeo (MDA) e 4-hidroxialcenais (4HDA) em homogenato do cérebro do rato, um experimento in vivo foi conduzido. Para este fim, foram usados ratos machos Wistar (n= 15) com peso corpóreo entre 180 e 200 gramas. Os animais receberam água e alimento ad Iibitum e ficaram sob regime de 12 horas de luz alternando com 12 horas de escuridão durante todo o período experimental. A metodologia aplicada para obter as regiões anatômicas foi como segue:

Os animais foram sacrificados pelo deslocamento cervical e decapitação, o cérebro foi rapidamente removido da cavidade craniana e o tecido foi imediatamente congelado a - 70 graus Celsius. O hipocampo, o córtex cerebral e o cerebelo de cada animal foram dissecados com ajuda de um atlas estereotático (Paxinos, G., e Watson, C., 1986. Academic Press, New York. pp 230-259). Uma união de cada uma das seguintes regiões foi formada e o um homogenato de cada região foi preparada, o qual continha 1:8 partes de tecido por parte de tampão de fosfato 0.1 M a pH = 7.0. O líquido livre das células foi obtido por centrifugação a 4 graus Celsius a 10 000 g por 30 minutos. Os homogenatos foram mantidos em um banho com água gelada até a determinação da atividade enzimática, pela qual um espectrofotômetro digital Spectro UV-VlS RS do Labo Med, Inc. foi usado. O resultado principal obtido foi que a eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico reduziu em 13 % (0 - 23 %) a produção de MDA + 4 HDA nos homogenatos das três regiões estudadas do cérebro do rato. A redução foi dependente da dose usada. Os níveis mais altos em proteção foram observados no hipocampo e no cerebelo, onde níveis consideráveis de receptores da rHuEPO foram detectados. As respostas do ácido e a rHuEPO básica foram similares (Fig.9).

Fig. 9. Efeito protetor da eritropoietina básica e ácido em

peroxidação lipódica nos tecidos do sistema nervoso. A figura mostra como a eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico reduziu em 13 % (O - 23 %) a produção de MDA + 4 HDA nos homogenatos das três regiões estudadas do cérebro do rato. A redução foi dependente da dose usada. Os níveis mais altos na proteção foram observados no hipocampo e o cerebelo, onde os níveis consideráveis dos receptores da rHuEPO foram detectados. Exemplo 19:

A aplicação de 90 000 Ul da eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico (de acordo com formulação no exemplo 6) não induz uma resposta eritropoiética significante.

A fim de demonstrar que a eritropoietina humana recombinante básica com baixo conteúdo de ácido siálico usada em testes não possuem nenhuma atividade eritropoietina significante in vivo, seus efeitos na eritropoiese do jerbo da Mongólia foi avaliado com o uso de uma dose de 90 000 Ul em um estudo comparativo com 10 animais (5 com administração de rHuEPO e 5 controles). Todos os animais foram monitorados (antes da administração, 7 dias após a administração e 14 dias após a administração) para executar um hemograma compieto no sangue total (10 μί EDTA a 10 %/mL de sangue) usando um contador Micros ABX automático para processar as amostras. O pacote estatístico SPSS com base no Windows, tomando ρ = 0,05 como nível confidencial, foi usado para processamento das variáveis. Os seguintes resultados foram obtidos (Tabela 1).

Tabela 1. Parâmetros hematológicos obtidos para os diferentes grupos.

AMOSTRAGENS 1 2 3 X SD X SD X SD GRUPO 1 HB (g/dL) 13,3 1,1 13,2 0,7 12,8 0,9 ETO (106/μΙ_) 7,82 0,95 8,04 0,54 7,63 0,59 HTC (%) 41,9 4,5 43,2 2,8 41,4 3,6 PLT(IO3VL) 612 214 670 101 761 75 VCM (fL) 53 1 54 1 54 1 HCM (pg) 17,0 0,7 16,4 0,3 16,8 0,2 CHCM (g/dL) 31,7 0,9 30,5 0,5 31,0 0,6 LEUC (103/μΙ_) 9,7 4,9 8,8 3,6 6,0 2,8 RETIC (%) 1,6 0,7 1,9 0,8 3,0 1,3 RETIC(106^L) 0,12 0,05 0,16 0,07 0,22 0,09 HB (g/dL) 13,4 0,5 14,3 0,3 13,3 0,3 ETO (106W 8,21 0,55 8,82 0,41 8,13 0,45 HTC (%) 43,4 2,4 48,1 1,1 43,9 1,7 PLT (IO3W 503 213 673 197 714 134 GRUPO 2 ^^^ ^ HCM (pg) 53 16,4 2 0,9 55 16,2 2 0,6 54 16,4 2 0,8 CHCM (g/dL) 31,0 0,9 29,7 0,5 30,4 0,7 LEUC (103W 5,4 1,2 4,9 0,9 5,1 0,9 RETIC (%) 1,3 0,6 1,6 0,5 2,1 1,3 RETIC (106/μί) 0,11 0,05 0,14 0,04 0,17 0,10

A distribuição das populações para cada parâmetro

hematológico por amostragem com ρ = 0,05 e η = 10 mostrou uma distribuição normal. Na análise da homogeneidade de variação, foi observado que, de modo geral, as variações tiveram um comportamento homogêneo, com exceção HB e HTC na amostragem I, ou seja, LEUC. Ao comparar as variações da variável hematológica dos grupos nas diferentes amostragens, foram observadas diferenças em HB1 ETO, HTC e CHCM da amostragem II, onde as diferenças são evidenciadas entre o grupo de controle e grupo tratado. Ao comparar as variações entre as amostragens para cada grupo, foram observadas diferenças em CHCM do grupo de controle (amostragem I vs. amostragem II), ao passo que o grupo tratado apresentou diferenças em HB e HTC (amostragem Il vs. amostragens I e III) e a CHCM (amostragem Il vs. amostragem I). Para a avaliação das diferenças das variáveis anteriormente mencionadas entre os grupos de amostragens, a amostragem I foi tomada como amostragem de referência para as comparações. Analisando que algumas diferenças estatísticas ρ = 0,05 são mostradas entre os grupos e entre as amostragens, foi decidido executar uma maior avaliação integral dos dados obtidos, para este fim, os valores da amostragem l foram agrupados, um momento em que os animais não haviam sido ainda tratados η = 10, e a variação desta população X ± 2 SD foi calculada, então, o comportamento dos valores médios para cada variável foi representado em gráfico (Fig. 10). Os valores médios das variáveis foram também comparados com aqueles relatados por outros autores para estas espécies, e então, foi verificado que, em todos os grupos e amostragens, os valores obtidos foram similares àqueles relatados na literatura (Tabela 2).

Apesar das comparações estatísticas mostrarem que as variáveis HB1 ETO e HTC aumentaram de forma significante na amostragem II, na análise deste comportamento de acordo com a variação normal X i 2 SD e os valores médios relatados na literatura (Handbook of Care e Use of Experimental Animais, Canadian Council for Animal Protection. Volume 1, 2o edição, 1998), pode-se observar que este comportamento carece de significância biológica, de modo que se pode concluir que a eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico não induz qualquer resposta significante de eritropoietina nas espécies estudadas.

Tabela 2. Valores hematológicos normais para jerbos.

Parâmetro Valores hematológicos normais para jerbos ERIT (106ZpL) 8,5(7,0-10,0) Hb (g/dL) 15,0(12,1-16,9) PCV (L/L) 0,48 (0,41-0,52) PLT (103/μί) 638 LEUC. T(103/pL) 4,3-21,6 Neutrófilos (103ZpL) 0,3-4,1 Linfócitos (103/pL) 3,2-9,7 Sangue (mg/kg) 60-85

Fig. 10. Comportamento dos valores médios das variáveis hematológicas analisadas nas três amostras para o grupo tratado com rHuEPO em relação à variação normal range X ± 2SD da primeira amostragem.

Exemplo 20:

Rotular com I125 de eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico.

A fim de determinar a passagem da eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico (exemplos 3 e 5) às regiões do sistema nervoso central por administração intranasal, a rHuEPO foi marcada com iodo 125 de acordo com o método comercial (YODOGEN) de Pierce1 Rockford1 Illinois 61105, USA [EUA]. Iniciando desta marcação radioativa, as formulações intranasais foram preparadas. Foram usados um total de 18 ratos Wistar machos do peso sangüíneo entre 180 e 200g. Os animais foram tratados pela administração intranasal desta formulação da eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico rotulado com I125. Cada animal recebeu administração intranasal de 5 a 100 microlitros da formulação. Em intervalos de 5, ou 60 minutos, os animais foram sacrificados por decapitação sob anestesia. O cérebro foi rapidamente removido (em menos de 70 segundos). As áreas do bulbo olfatório e o cerebelo foram extraídos. A conta radioativa foi executada com um contador gama. Os seguintes resultados foram obtidos: Uma aplicação da eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico alcança regiões do cérebro em que no mínimo 5 minutos e diminui com o tempo de modo gradual da região frontal à caudal do cérebro. Sob 60 minutos da aplicação, há ainda alguma rHuEPO nas regiões dos bulbos olfatórios e o cerebelo. Estes resultados indicam que aproximadamente entre 1 e 5% da rHuEPO aplicada de forma nasal alcança o cérebro. Entre 80 e 85 % da rHuEPO alcançando o cérebro foi detectado nos bulbos olfatórios, enquanto em torno de 20% foi detectado no cerebelo sob 5 minutos da apiiçação. Após em torno de 30 minutos, estas concentrações foram quase iguais e após 60 minutos, o cerebelo tinha 30% e somente 10% da radioatividade dos bulbos olfatórios. A presença da molécula marcada nas regiões do cerebelo indica a passagem de BHE; por outro lado, a detecção da molécula em um nível não relacionado com o meio olfatório (cerebelo) indica que não somente faz o meio olfatório participar das passagens das moléculas ao cérebro, mas também faz um mecanismo geral mais rápido, talvez a difusão através do muco e subseqüente penetração através de descontinuidade existente, particularmente, em regiões do epitélio olfatório na área da macula cribosa, que permite a chegada da eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico às regiões longe do meio olfatório. Cada barra na Fig. 11 representa o valor médio de seis animais. Fig. 11. Passagem da eritropoietina humana recombinante

com baixo conteúdo de ácido siálico da cavidade nasal ao bulbo olfatório e cerebelo. Cada barra na figura apresenta o valor médio de seis animais. A figura mostra como a eritropoietina humana recombinante com baixo conteúdo de ácido siálico alcança regiões do cérebro em no mínimo 5 minutos e diminui com o tempo de modo gradual da região frontal à caudal do cérebro. Sob 60 minutos da aplicação, há ainda alguma rHuEPO nas regiões dos bulbos olfatórios e o cerebelo. Foi detectado nos bulbos olfatórios entre 80 e 85% da rHuEPO alcançando o cérebro, enquanto em torno de 20% foi detectado no cerebelo sob 5 minutos da aplicação. Após em torno de 30 minutos, estas concentrações foram quase iguais e após 60 minutos, o cerebelo tinha 30% e somente 10% da radioatividade dos bulbos olfatórios. Exemplo 21:

Efeito da rHuEPO básica na hemorragia sub-aracnóide em coelhos.

O teste foi executado em coelhos machos da Nova Zelândia pesando entre 3 e 4 kg, que foram anestesiados com injeção intramuscular de cetamina 40 mg/kg. Depois, 5 ml de sangue foram extraídos da artéria central do ouvido e foi injetado por meio percutâneo na grande cisterna. Os animais foram monitorados por 72 horas.

Os coelhos foram divididos em 3 grupos experimentais com 8

animais cada:

Grupo I: Animais de Controle. Grupo II: Animais com danos.

Grupo III: Animais com danos + rHuEPO básica 20 pg (exemplo 5).

A administração da rHuEPO básica foi executada 5 minutos após a indução da hemorragia sub-aracnóide e foi repetida a cada 8 horas durante 72 horas.

Para avaliação neurológica, o comportamento motor funcional dos animais foi seguido de acordo com Grasso G, 2002 durante o período do teste.

Os resultados são mostrados na Tabela I. Um melhor

comportamento motor funcional foi observado entre os animais de controle (sem danos) e os animais tratados com rHuEPO básica do que entre os animais com danos, não tratados.

Avaliação neurológica observada 72 horas após a hemorragia induzida Grupos Escala de avaliação neurológica 1 2 3 4 Animais de Controle 8 0 0 0 Animais com danos * 0 0 2 6 Animais com danos + rHuEPO básica 6 2 0 0

0 grau do dano neurológico foi classificado como: 1: Sem indicações de danos.

2: Dano mínimo.

3: Dano moderado sem movimentos anormais.

4: Dano severo com a presença de movimentos anormais.

*: Houve diferença significante entre os animais com danos e tratados com rHuEPO básica e aqueles com danos por ρ < 0,05. Exemplo 22:

Efeito da rHuEPO básica para o tratamento de demência

Em 36 jerbos da Mongólia a carótida direita foi amarrada sob anestesia. Os animais receberam a administração intranasal de 40 Ul da rHuEPO (exemplos 10 e 11) diariamente durante 7 dias, começando dentro do espaço de tempo de

1 hora subseqüente à cirurgia. Outros 24 animais submetendo-se a um processo similar receberam uma quantidade equivalente do veículo. Nove jerbos submetendo-se ao isolamento da carótida sem ligadura, constituíram o grupo de controle.

Oito dias após a operação, 27 e 13 animais haviam sobrevivido entre os grupos sujeitados à isquemia unilateral e tratados com rHuEPO e aqueles tratados somente com o veículo, respectivamente. Não houve mortalidade para o grupo de controle.

Os animais foram sujeitados a um teste de habituação um dia antes e uma semana após a ligadura unilateral da carótida. Este teste baseia-se na contagem das ações traseiras em uma caixa cilíndrica durante um intervalo de 9 minutos divididos em três terços. As proporções das ações traseiras em cada terço, determinam uma linha direta de melhor adequação entre os três pontos. A inclinação foi usada para estabelecer comparações entre grupos por meio dos testes U de Mann e Whitney's. As comparações antes-depois foram realizadas por melo do teste de comparação da variação de Wilcoxon dos animais sobreviventes. Os resultados foram como segue:_

Grupo Antes Depois Valor de ρ Controles -14,2 -12,3 0,2 Veículo -16,6 -7,9 a b 0,01 rHuEPO -15,3 -14,0 0,1

a - Diferente do controle; b - Diferente da rHuEPO; ρ < 0,05.

Os resultados mostram uma inclinação menor (perto de 0) para os animais sujeitados à isquemia, uma semana após a isquemia e em comparação com aqueles tratados com rHuEPO e os controles. Uma inclinação menor demonstra uma persistência do animal em explorar seus arredores nos dois últimos terços do intervalo de 9 minutos, mostrando uma perda da habituação que pode ser caracterizado como uma disfunção cognitiva induzida pela isquemia. O tratamento com a rHuEPO básica previne a aparição desta disfunção.

O comportamento dos animais revelou uma deterioração cerebral, induzida pela isquemia, que poderia ser expressa como uma perda da capacidade para nidificação, que é típico nos machos destas espécies; também como um incremento da agressividade e perda do comportamento de auto-aparência durante o tempo que eles foram mantidos no cilindro circular. Os resultados foram comparados por meio de teste de independência chi-quadrado e são expressos na Tabela por percentual:

Grupo Nidificação Agressividade Auto-aparência Controle 88 11 88 Veículo 23 a b 92 a'b 30 a rHuEPO 77 44 a 66

a - Diferente do controle; b - Diferente da rHuEPO; ρ < 0,05.

Os animais foram sacrificados por perfusão sob anestesia com formalina neutra tamponada a 10 %. Os cérebros foram extraídos e processados para obtenção das seções coronárias de 8 μηι de espessura colorida com hematoxilina e eosina. As seções foram examinadas em um microscópio de campo claro para sinais histopatológicas. As comparações foram executadas por meio do teste de independência chi-quadrado. Os resultados na Tabela são expressos em percentual:_

Grupo Picnose Gliose Edema Perda neural Controle 22 0 0 0 Veículo 100 a 92 a'b 23 a,b 69a,b rHuEPO Básica 55 44 a 0 33 a

a - Diferente do controle; b - Diferente da rHuEPO; ρ < 0,05.

É notável que o tratamento previna o edema de forma total e reduz a incidência da picnose, gliose e perda neural pela metade.

A deterioração comportamenta! pode ser qualificada como um reflexo da perda neural e de outros resultados histopatoiógicos observados no grupo não tratado. O tratamento com rHuEPO preveniu a deterioração comportamental induzida pela redução do fluxo sangüíneo cerebral no jerbo da Mongólia, no mínimo parcialmente. Os resultados são excelentes no sentido de sugerir uma ação neuroprotetora da rHuEPO que seja capaz de cancelar a deterioração funcional na demência de origem vascular em humanos.

Claims

1. Formulações nasais a partir da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico caracterizadas pelo fato de que a forma finalizada é administrada por meio nasal.

2. Formulações nasais a partir da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico, de acordo com a reivindicação 1 caracterizadas pelo fato de que a forma finalizada são gotas nasais.

3. Formulações nasais a partir da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico, de acordo com a reivindicação 1 caracterizadas pelo fato de que a forma finalizada é um spray nasal.

4. Formulações nasais a partir da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico, de acordo com reivindicações 1, 2 e 3 caracterizadas pelo uso de polímeros bioadesivos como hidroxipropilmetilcelulose (HPMC)1 hidroxipropilcelulose (HPC) e metilcelulose (MC).

5. Formulações nasais a partir da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico, de acordo com reivindicações 1, 2 e 3 caracterizadas pelo uso de conservantes antimicrobiais como cloreto de benzalconio, clorobutanol, metilparabeno e propilparabeno.

6. Formulações nasais a partir da rHuEPO com baixo conteúdo de ácido siálico, de acordo com reivindicações 3, 4 e 5 caracterizadas pelo uso dos estabilizadores da proteína como L- triptofano, L- leucina, L- hidroclorto de arginina e/ou hidrocloreto de L-histidina e/ou seus sais.

7. Formulações nasais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por serem empregadas para o tratamento de doenças cerebrovasculares, psiquiátricas ou neurodegenerativas agudas ou crônicas, hipoxia do recém-nascido, hipoxia de uma causa cardiovascular, acidentes, traumas, intoxicação, demência, perda de memória, redução da capacidade mental, deterioração mental, manifestações neurológicas resultantes de doenças, danos ou alterações do sistema fisiológico, manifestações psiquiátricas resultantes de doenças, danos ou alterações do sistema fisiológico, manifestações neurológicas produzidas por doenças periféricas, manifestações psiquiátricas produzidas por doenças periféricas, manifestações neurológicas produzidas por epilepsia.