BRPI0616201A2

BRPI0616201A2 - produÇço e purificaÇço de proteÍna a sem usar componenetes derivados de animais

Info

Publication number: BRPI0616201A2
Application number: BRPI0616201-0A
Authority: BR
Inventors: Nandu Deorkar; Wei Guo; Steve Magee
Original assignee: Mallinckrodt Baker Inc
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2006-09-14
Publication date: 2011-06-14
Also published as: NZ566873A; JP2009508950A; ATE548446T1; BRPI0616199A2; IL190092A0; NO20081881L; EP1926811A1; CA2622542A1; NZ566871A; CA2623176A1; AU2006292583B2; CN101268181A; NO20081882L; CN101268182A; TW200804412A; IL190088A0; WO2007035341A1; IL190088A; AU2006292700A1; KR20080065590A

Abstract

PRODUÇçO E PURIFICAÇçO DE PROTEÍNA A SEM USAR COMPONENTES DERIVADOS DE ANIMAIS. A presente invenção refere-se a uma purificação de Proteína A vegetariana (não derivada de animal) que usa um processo de purificação multidimensional para remover impurezas de componentes não derivados de animal indesejáveis na Proteína A do meio de fermentação não animal usado para produzir a Proteína A de modo a produzir uma Proteína A vegetariana livre de componentes de origem animal e essencialmente livre de componentes derivados de meio de crescimento não derivado de animal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃOE PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA A SEM USAR COMPONENTES DERI-VADOS DE ANIMAIS".

Requerimentos RelacionadosCampo da Invenção

A presente invenção refere-se a métodos para a purificação deProteína A vegetariana (não derivada de animal) usando um processo depurificação multidimensional para remover impurezas de componentes nãoderivados de animal indesejáveis na Proteína A do meio de fermentação nãoanimal usado para produzir a Proteína A de modo a produzir uma Proteína Avegetariana livre de componentes de origem animal e essencialmente livrede componentes derivados de meio de crescimento não derivado de animal.Antecedentes da Invenção

A Proteína A é uma proteína da parede celular fabricada porStaphylococcus aureus. A proteína de ligação de imunoglobulina do Staph-ylococcus aureus Gram positivo, Proteína A, liga fortemente à região Fc deimunoglobulinas de seres humanos, porquinho-da-índia, porco, e coelho.Vide Langone, (1982) Adv. Immunol. 32.157 e Lindmark (1983) J. Immunol.Methods 62:1. A Proteína A liga, em uma menor extensão, a imunoglobulinaM (IgM) tendo uma região VH3, sem afetar a afinidade de imunoglobulina porantígeno. A Proteína A é usada comercialmente para purificar anticorposmonoclonais que são freqüentemente usados por sua vez como terapêuticosem doenças humanas como doenças inflamatórias e câncer. Além disso, aprópria Proteína A pode ser usada como um terapêutico. A Proteína A podeser administrada a um paciente de modo a ligar complexos imunes circulan-tes em doenças autoimunes como artrite reumatóide ou a estimular produ-ção de citocina específica em alguém com uma infecção. Além disso, quan-do acoplada a uma resina de cromatografia, a Proteína A pode agir como umabsorvedor terapêutico para tratar o plasma ou o sangue total pela remoçãode complexos IgG em distúrbios como doença autoimune e rejeição detransplante de órgão.

Em algumas cepas de S. aureus a Proteína A permanece ligadaà parede celular enquanto em algumas outras (secretoras), a Proteína A éliberada como um produto de proteína solúvel de peso molecular de 40-55.000 dentro do meio de crescimento. Vide Lindmark1 (1977) Eur. J. Bio-chem. 74:623. A Proteína A é extensivamente usada na produção comercialde anticorpos monoclonais. Proteína A solúvel e funcional e fragmentos fun-cionais de Proteína A representando vários dos 5 domínios de ligação IgGde Proteína A foram produzidos por clonagem molecular, todos os quaisdemonstraram afinidade por IgG. Tipicamente, os clones são expressadosem bactérias as quais foram cultivadas em meio parcialmente ou totalmentederivado de fontes animais, tais como caseínas do leite bovino, matérias-primas ou caldos de carne de mamífero.

Originalmente, a Proteína A foi derivada da parede de células deS. aureus, mas cepas bacterianas as quais secretam a proteína foram isola-das e também são usadas para obter Proteína A. No entanto, a preparaçãode Proteína A por métodos convencionais apresenta um problema para seuuso em terapêuticos humanos. S aureus é cultivado em meio que contémprodutos animais como uma fonte de aminoácidos para as bactérias. Emparticular, hidrolisados e extratos bovinos são usados comumente como su-plementos em meio de crescimento bacteriano. Deste modo, a obtenção deProteína A de meio de crescimento contendo produtos derivados de animaisleva à possibilidade de que produtos animais como príons, o agente causa-dor da doença da Vaca Louca, Scrapie e doença debilitante, possam estarpresentes no meio e ser transmitidos a pacientes humanos. As preparaçõesde Proteína A também podem ser expostas e contaminadas com produtosanimais durante processos de purificação a jusante. Por exemplo, em méto-dos usados atualmente, a Proteína A é purificada usando uma coluna decromatografia Sepharose IgG e a IgG acoplada à coluna de cromatografiaSepharose é tipicamente de origem animal. No entanto, os produtos animaisque chegam a ser associados com uma preparação de Proteína A duranteos processos de isolamento e purificação não são facilmente purificados dapreparação pelos métodos conhecidos atualmente.

Recentes preocupações de saúde relacionadas com a transmis-são de várias doenças debilitantes, tais como encefalopatia espongiformebovina (BSE), uma de várias doenças classificadas como encefalopatia es-pongiforme transmissível (TSE) e doença de Creutzfeldt-Jacob variante(CJD), doenças relacionadas com príons, sugeriram a remoção de materiaisderivados de animais a partir de meio de crescimento bacteriano onde qual-quer produto obtido a partir de desenvolvimento de bactérias em semelhantemeio pode entrar em contato com seres humanos. Portanto, o meio derivadode vegetais começou a substituir meio derivado de animal para desenvolvermicróbios os quais são designados para produzir um produto que essenci-almente se torna um agente medicinal, tal como vitaminas, aminoácidos, ouproteínas terapêuticas, tais como anticorpos. Deste modo, há a necessidadede um meio comercialmente viável para fabricar e purificar uma Proteína Anão derivada de animal para uso em anticorpos terapêuticos que devem terelevada pureza, propriedades de ligação no mínimo iguais à Proteína A co-mumente usada e certeza de condições de crescimento livres de animais eprocessos de purificação.

Processos de purificação desenvolvidos há muito tempo paraisolar produtos a partir de fermentações microbianas derivadas de animalforam designados para remover componentes indesejados produzidos pelomicróbio no processo de fermentação ou fortuitamente adicionado comouma parte do meio de crescimento e ou alterado pelo micróbio ou deixadoinalterado. Anos de prática na arte de purificação levaram a numerosos pro-cessos para realizar semelhantes purificações. No entanto, em casos taiscomo o isolamento de uma proteína solúvel secretada pelo micróbio dentrodo meio, muito do processo de purificação se repetiu em círculos removendoos componentes do meio os quais foram adicionados em altos níveis parapromover rápido crescimento e produção eficiente do produto de interesse.No caso de uma troca de ingredientes do meio, provavelmente apareceráum novo espectro de contaminantes, deste modo, haverá a necessidade deremover os mesmos do produto de interesse. No entanto, eles podem nãopurificar pelos protocolos desenvolvidos para isolamentos de meios anterio-res. Deste modo, a troca de meio de crescimento derivado de animal paracomponentes de meio não derivado de animal introduz uma variedade dedesafios para o processo de purificação, tais como diferenças em solubilida-des de componentes de meio, teor de carboidrato, teor de lipídeo, teor deproteína, particulados, viscosidade, e etc. Cada um destes se relaciona coma velocidade, a eficiência e a eficácia do processo desenvolvido originall-mente para fermentações de meio de crescimento derivado de animal ecrescimento.

Proteína A derivada de origem animal é normalmente purificadapor qualquer um de dois métodos, um método "clássico" usando algumacombinação de colunas de permutação iônica e/ou colunas de exclusão detamanho ou colunas de afinidade, empregando uma imunoglobulina purifica-da (derivada de animal) fixada de modo covalente a uma matriz insolúvel talcomo Agarose ou sílica. De modo a produzir um produto de Proteína A que élivre de contaminantes derivados de animais, é necessário remover qualquerproduto derivado de animais de sua história recente e do processo de fer-mentação e também do processo de purificação. Portanto, torna-se necessá-rio isolar uma cultura de matéria-prima do organismo de crescimento emmeio de cultura não derivado de animal unicamente, desenvolver o micróbioem meio não derivado de animal e purificar o produto de Proteína A usandomeio não derivado de animal em uma tal extensão que seja livre de proteí-nas bacterianas contaminantes e componentes derivados do meio.

Tentativas para purificar Proteína A por métodos clássicos a par-tir de S. aureus cultivado sobre meio derivado de animal convenional deramum produto de proteína típico com alta pureza conforme determinado poreletroforese de gel SDS e cromatografia analítica com um espectro UV típicopara Proteína A (Vide Sjoquist, (1972) Eur. J. Biochem. 29:572). Em concen-trações de 1 a 10 mg/mL, a solução foi quase incolor. No entanto, em nos-sos testes iniciais usando S. aureus cultivados sobre meio não derivado deanimal e purificados pelo mesmo processo, o produto de Proteína A teveuma cor amarela e deu uma absorvência substancial no alto UV e no alto UVe na região visível (300-450 nm), mas deu o mesmo padrão sobre eletrofo-rese de gel SDS, indicando alta pureza. Isto sugeriu que houve contaminan-tes não protéicos presentes. Na verdade, soluções a 1 a 5 mg/mL de umaProteína A semelhante foram de um marrom amarelo distinto, uma cor seassemelhando a uma versão diluída do meio de crescimento. Portanto pare-ceu que os procedimentos de purificação existentes não estavam removen-do todo o meio de crescimento não derivado de componentes animais. Por-tanto desenvolveram a necessidade de proporcionar um processo novo eaprimorado de purificação para purificar Proteína A derivada de vegetaria-nos.

Sumário da Invenção

Esta invenção proporciona um processo de purificação de Prote-ína A não derivada de animal que compreende:

(a) proporcionar uma solução de Proteína A não derivada de a-nimal que tenha sido produzida fermentando uma cepa secretora de Staph-ylococcus aureus em um meio contendo aminoácidos ou peptídeos vegetari-anos, o referido meio estando livre de produtos animais;

(b) carregar a solução de Proteína A filtrada sobre uma primeiracoluna;

(c) lavar a coluna com uma mistura de sal e tampão para enxa-guar a cor indesejável e proteínas contaminantes da coluna;

(d) eluir a Proteína A da primeira coluna para produzir um con-junto da solução de Proteína A;

(e) ajuste do pH e da condutividade do conjunto da solução deProteína A;

(f) carregar a Proteína A do conjunto da solução de Proteína Asobre uma segunda coluna;

(g) lavar a segunda coluna com uma mistura de sal e tampãopara enxaguar a cor indesejável e proteínas contaminantes da coluna; e

(h) eluir a Proteína A da segunda coluna para produzir uma so-lução de Proteína A purificada; em que a primeira coluna é selecionada entre

(1)o grupo consistindo em uma coluna de permutação de ânions, uma colu-na de HIC e uma coluna de hidroxiapatita cerâmica, ou (2) uma coluna depermutação de cátions; e a segunda coluna é uma coluna de permutação decátions quando a primeira coluna é uma coluna selecionada entre o grupoconsistindo em uma coluna de permutação de ânions, uma coluna de HIC euma coluna de hidroxiapatita cerâmica, e a segunda coluna é uma colunaselecionada entre o grupo consistindo em uma coluna de permutação deânions, uma coluna de HIC e uma coluna de hidroxiapatita cerâmica quandoa primeira coluna é uma coluna de permutação de cátions.

A invenção também compreende uma Proteína A vegetariana• purificada imobilizada sobre uma resina cromatográfica para formar umaProteína A vegetariana purificada resina cromatográfica. A invenção adicio-nalmente compreende um método para ligar anticorpos ou fragmentos deanticorpos a uma resina cromatográfica contactando os anticorpos ou frag-mentos de anticorpos com a Proteína A vegetariana purificada resina croma-tográfica. A invenção adicionalmente compreende o anticorpo ou fragmentosde anticorpos ligados à Proteína A purificada resina cromatográfica.

Esta invenção proporciona uma fermentação bacteriana emmeio de crescimento não derivado de animal para dar uma elevada concen-tração de Proteína A nos exsudatos a qual é purificada usando diafiltração ecolunas para produzir um produto que é >95% puro por eletroforese por gelSDS e por testes químicos e físicos é substancialmente idêntica com Proteí-na A purificada de meio de cultura esgotado de origem derivada de animal.Além disso, contaminantes deixados de parte do meio de crescimento nãoanimal foram virtualmente eliminados. Em uma modalidade desta invençãouma cultura de sementes de S. aureus var. IMRE conhecida por secretarProteína A foi cultivada serialmente através de 2 culturas para eliminar resí-duo de meio derivado de animal na cultura de sementes. Estoques de cultu-ra de sementes foram transferidos para aproximadamente 400 frascos decultura estéril e mantidos a -70° C até necessário. As culturas de sementesforam usadas para inocular 2 litros de meio não derivado de animal compos-to de 1,8% de Soy Peptone (Sigma), 5% de extrato de levedura (Sigma),0,5% de cloreto de sódio (Mallinckrodt Baker), 0,25% de dextrose, 0,25% defosfato de potássio, dibásico (Fisher), em água e NaOH para tornar o pH 7,5.O crescimento a 37° C foi estimulado com aeração e manutenção do pH poradições de 1 M de ácido fosfórico ou hidróxido de sódio por 16 horas, entãoeste inóculo foi transferido para uma câmara de crescimento de 16 litros con-tendo a mesma composição de meio e o crescimento foi continuado a 37° Ccom aeração a 16 l/minuto por no mínimo 10 horas ou até as unidades deabsorvência a 560 nm atingirem 52. Em seguida, uma rodada maior podeser feita usando esta cultura de 16 litros como inóculo para um fermentadormaior, é dito de 375 litros, contendo o mesmo meio previamente esterilizadoe novamente permitir crescimento a 1 Litro de ar por minuto por litro de meiopor tempo suficiente para atingir aproximadamente 50 unidades de absor-vência a 560 nm. As células foram removidas por centrifugação ou por filtra-ção através de filtros de 0,1 mícron e o caldo / meio de cultura foi em segui-da filtrado através de uma membrana Millipore PROCON 10.000 MWCOTFF para reter a Proteína A, reduzir a concentração de sal e a concentraçãode componentes de menor peso molecular e para permutar o tampão. A so-lução concentrada de proteína / caldo resultante foi em seguida aplicada auma coluna apropriada a qual foi então lavada com uma solução tamponadaentão a Proteína A foi eluída em ou um gradiente ou etapa de eluição commaiores concentrações de sal. Foi preparado um conjunto de frações ativasde pureza apropriada e ou simplesmente diluído com água para uma con-centração de sal apropriada ou tratado por diaflow para concentrar e permu-tar tampões. Esta solução de proteína foi em seguida aplicada a uma se-gunda coluna a qual foi lavada, então a Proteína A foi eluída com uma maiorconcentração de sal tamponada e as frações reunidas para obter Proteína Aem uma recuperação de 80 a 100%, pureza > 95% por HIC, pureza >95%por eletroforese de gel SDS e de tal modo que a proporção de absorvênciado conjunto a 275 nm:340 nm foi de mais de 7,0. Colunas apropriadas po-dem ser ou uma matriz de permutação de ânions, uma matriz de hidroxiapa-tita cerâmica, matriz hidrofóbica ou uma matriz de permutação de cátions. Amatriz de permutação de ânions pode ser qualquer uma das resinas de per-mutação de ânions úteis embora a modalidade preferencial da invenção sejaXWP 500 PolyQuat-35 (Mallinckrodt Baker ne 7603) pré-equilibrada com 20mM de Tris-CI, pH 7,8. A matriz de hidroxiapatita cerâmica preferencial (Bio-Rad) foi pré-equilibrada com 20 mM de Tris-CI, pH 7,8. A matriz de permuta-ção de cátions pode ser qualquer uma das resinas de permutação de cátionsúteis embora a modalidade preferencial da invenção seja WP carbóxi-sulfona (permutador de cátion fraco-forte) (Mallinckrodt Baker n9 7587) pré-5 equilibrada com 137 mM de ácido acético-trietanolamina-30 mM de NaCI1 pH4,5-6,0. Tipicamente, depois da segunda coluna de permutação iônica, asolução de Proteína A pode ser dialisada ou diafiltrada para remover a mas-sa do sal e componentes tampão em seguida congelados e liofilizados.

Descrição Detalhada da Invenção

(b) carregar a solução de Proteína A filtrada sobre uma primeira coluna;

(e) ajuste do pH e da condutividade do conjunto da solução deProteína A;

Em um aspecto a invenção compreende:

1. desenvolvimento de uma cultura de sementes de S. aureusem um meio de cultura não derivado de animal

2. crescimento de S. aureus de uma cultura de sementes emmeio de crescimento não derivado de animal

3. filtração para remover células inteiras e partículas insolúveis

4. diafiltração

5. duas colunas de purificação consecutivas

6. reunir as frações mais puras

7. diálise ou diafiltração

8. liofilização

A Proteína A pode ser obtida a partir de qualquer cepa de S. au-reus produtora de Proteína A incluindo as cepas que ocorrem naturalmente,isoladas ou produzidas por engenharia genética. Cepas de S. aureus produ-toras de Proteína A também podem incluir as cepas nas quais a Proteína Apermanece embutida na parede celular e as cepas que secretam Proteína Adentro do meio de crescimento, preferencialmente S. aureus, var Imre, porexemplo. Os métodos pelos quais a Proteína A pode ser recuperada da pa-rece celular do S. aureus (por exemplo, digestão enzimática) são de conhe-cimento geral daqueles versados na técnica. A Proteína A recuperada destamaneira pode ser purificada para eliminar os componentes celulares digeri-dos. No entanto, é preferencial, obter Proteína A a partir de cepas de Staph-ylococcus que secretam Proteína A dentro do meio de tal modo que somenteseja necessário colher a Proteína A do meio.

Culturas de sementes designadas para serem livres de nutrien-tes e componentes de origem animal foram obtidas a partir de estoques deS. aureus por laminação serial sobre meio de componentes e nutrientes de-rivados de microbiológicos e derivados de vegetais. Várias composições demeios deram bom crescimento com quantidades variáveis de Proteína A nosexsudatos, especialmente dependentes do teor de extrato de levedura domeio. Uma desvantagem do meio não derivado de animal é a maior intensi-dade de cor produzida na solução de Proteína A inicial. Esforços iniciais parapurificar a Proteína A usando meios adotados previamente resultaram emum produto com uma quantidade substancial de cor comparado com Proteí-na A purificada na mesma maneira a partir de meio derivado de animal me-nos colorido. Empregando o processo de coluna de permutação multidimen-sional desta invenção reduziu significativamente ou eliminou substancial-mente esta coloração de impureza. Proteína A eluída a partir de uma segun-da coluna de cromatografia de acordo com o processo desta invenção redu-ziu substancialmente o teor de cor dando uma Proteína A de pureza elevada(>98% por géis SDS) que foi essencialmente idêntica fisicamente e quimi-camente a Proteína A isolada de fontes de meios derivados de animais.

Conforme referido aqui, neste requerimento de patente, "produ-tos animais" são definidos como qualquer material transmitido ou derivadode um animal não humano, o material incluindo peptídeos, proteínas, amino-ácidos, materiais semelhantes a proteínas, ácidos nucléicos, vírus e seme-lhantes. Conforme referido aqui, neste requerimento de patente, o termo"Proteína A vegetariana" é definido como uma composição de Proteína Anão contaminada por produtos animais ou quaisquer peptídeos derivados deanimais que são derivados do meio de fermentação ou do meio de purifica-ção. Similarmente, o termo "meio vegetariano" se refere a meio de fermenta-ção não contaminado por produtos animais ou quaisquer peptídeos deriva-dos de animais. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, otermo "aminoácidos ou peptídeos vegetarianos" se refere a quaisquer peptí-deos, proteínas, aminoácidos ou materiais semelhantes a proteínas que nãosão derivados de um animal não humano.

O seguinte é uma breve descrição dos materiais e métodos em-pregados nesta invenção. Os materiais e métodos são ilustrativos de, masnão limitados a, os materiais e métodos que podem ser empregados no pro-cesso desta invenção.

Estoque de culturas de sementes derivadas de S. aureus var.IMRE. Bactérias secretoras podem ser fermentadas em qualquer quantidadede meio vegetariano suficiente para desenvolver as bactérias e produzir aquantidade desejada de Proteína A. Mais preferencialmente, os S. aureussão desenvolvidos em um lote de fabricação em grande escala em tanquesde fermentador. As condições de fermentação (isto é, circulação de ar, tem-peratura, agitação, pH e pressão) podem ser controladas e/ou monitoradaseletronicamente, com, por exemplo, um microprocessador, ou por qualqueroutro meio eletrônico. Algumas condições particularmente preferenciais in-cluem fermentação do S. aureus em cerca de 37° e uma circulação de ar decerca de um litro/minuto de ar estéril por litro de meio. O meio pode consistirdos componentes de meio condicionado para crescimento de S. aureus quesão conhecidos na técnica, tipicamente, extrato de levedura, glicose e saisessenciais, e, no caso da invenção, inclui aminoácidos e peptídeos vegetari-anos (por exemplo, peptídeo de soja, hidrolisado de ervilha ou hidrolisado desemente de algodão) como uma fonte de aminoácidos. Aminoácidos ou pep-tídeos vegetarianos podem ser derivados, por exemplo, de qualquer fontenão animal (por exemplo planta ou semelhante a planta) ou sintética (porexemplo, sintetizados quimicamente) e em uma modalidade da invenção, osaminoácidos ou peptídeos vegetarianos são derivados de soja. Os compo-nentes podem estar em uma concentração de cerca de 50 gramas / litro(g/L) de extrato de levedura, 15 g/L de peptídeos da soja e 5 a 10 g/L de gli-cose dissolvida em água deionizada purificada com ácido fosfórico diluído ehidróxido de sódio diluído adicionado conforme necessário durante fermen-tação para controlar o pH em entre cerca de 7 e 8. O meio pode conter adi-cionalmente no mínimo 0,67 müilitros / litro (mL/L) de polietileno glicol paraprevenir espumação na mistura de fermentação. Preferencialmente, umacultura pequena de S. aureus var. IMRE foi riscada sobre meio de agar es-téril composto de componentes não derivados de animais: 1,8% de Soy Pep-tone (Sigma), 5% de extrato de levedura (Sigma), 0,5% de cloreto de sódio(Mallinckrodt Baker), 0,25% de dextrose, 0,25% de fosfato de potássio, dibá-sico (Fisher), 3% de agar (Difco) em água e NaOH para tornar o pH 7,5. Alâmina foi incubada a 37° C de um dia para o outro. Usando uma única colô-nia desta lâmina, foi feita uma transferência para outra lâmina da mesmacomposição riscando e foi deixada para desenvolver sob as mesmas condi-ções de um dia para o outro. Uma única colônia desta segunda riscagem foitransferida para 100 mL de meio líquido não derivado de animal estéril este-rilizado autoclavando a 121 0C por 25 minutos: 1,8% de Soy Peptone (Sig-ma), 5% de extrato de levedura (Sigma), 0,5% de cloreto de sódio (Mallinc-krodt Baker), 0,25% de dextrose e 0,25% de fosfato de potássio, dibásico(Fisher) em água e NaOH para tornar o pH 7,5. Esta cultura líquida foi agita-da a 300 RPM de um dia para o outro a 37°C. Dez mL desta cultura líquidafoi em seguida usada para inocular um fermentador de 16 litros contendo 12litros de meio não derivado de animal esterilizado autoclavando: 3% de Se-Iect APS® TSB (Becton-Dickinson and Co.) e 0,08% de polietileno glicol. Acultura foi cultivada a 37°C com aeração em cerca de 12 U minuto ao mes-mo tempo que agitando a 400 RPM por no mínimo 10 horas ou a uma den-sidade celular de 52 unidades de absorvência a 560 nm. O pH foi mantido a7,0 +/- 0,5 com NaOH diluído e ácido fosfórico diluído. Porções do caldo cul-tivado foram centrifugadas a 2000 χ g por 30 minutos para concentrar ascélulas. A massa celular concentrada foi suspendida com aproximadamente4 volumes de meio esterilizado autoclavando: 3% Select APS® TSB (Becton-Dickinson and Co.) e 0,08% de polietileno glicol. Aproximadamente porçõesde 4 a 5 mL da suspensão celular foram transferidas para dentro de cerca de400 a 500 frascos estéreis e armazenadas a -70°C até necessário. Aproxi-madamente 5% dos frascos foram testados para verificar a pureza bacteria-na. Adicionalmente, o caldo de fermentação pode ser avaliado visualmentesob um microscópio para assegurar que o caldo não seja contaminado comoutros microorganismos. Similarmente, o S. aureus na cultura pode ser ins-pecionado usando um microscópio para a morfologia apropriada que incluiter: a forma de cocci Gram positivos, pleiomorfismo (isto é, únicas colônias,cadeias ou rosáceas) e uma medida de aproximadamente 0,6 mícron. O S.aureus cultivado também pode ser avaliado para qualidade e saúde determi-nando se eles apresentam uma morfologia redonda, elevada, acinzentadasobre lâminas de agar de sangue, têm uma habilidade que causa a β-hemólise de sangue de carneiro depois de 48 horas e teste positivo para asenzimas coagulase e catalase.

Dessalinização da solução de Proteína A eluída da coluna. Umavez que seja obtido o conjunto da segunda coluna na série, dialisar ou diafil-trar contra água deionizada ou destilada até essencialmente livre de sal(condutividade de menos de 2 mS/cm). As membranas de diálise podemincluir membranas ou cassetes de tubagem contendo paredes feitas demembranas de celulose com MWCO <10.000 tratadas de acordo com asrecomendações do fabricante. Soluções de proteína dialisadas ou diafiltra-das podem ser congeladas dentro de garrafas em um dispositivo giratórioque estimula o congelamento da solução sobre as paredes da garrafa emuma concha ou podem ser colocadas em panelas de vidro rasas sobre umaplaca ou prateleira em temperaturas abaixo do congelamento. Nesta modali-dade, é feito congelamento em placas de Petri de vidro grandes sobre umaprateleira ajustada a -55°C até a temperatura da solução congelada ter atin-gido -15°C ou menos ocasião na qual a evacuação é iniciada com um vácuopré-ajustado a 200-250 mTorr e a prateleira é ajustada a -15°C. Secagempor congelamento é continuada por 2 a 24 horas, ocasião na qual a tempera-tura de prateleira é aumentada para O0C até o produto estar visivelmenteseco, ocasião na qual a temperatura de prateleira é aumentada para 23°C emantida por no mínimo 2 horas para secagem final ocasião na qual o produ-to fofo branco a castanho claro seco é removido e pode ser mantido refrige-rado ou em um freezer.

Coluna de C4 Analítica (HIC). Uma coluna de Fase Reversa WPButil (C4) de 4,6 X 250 mm (Mallinckrodt Baker Nq 7116-00) foi completa-mente pré-equilibrado com água : acetonitrilo : ácido trifluoroacético(80:20:0,1) (volumes) a 1,0 mL/ minuto usando uma Bomba de HPLC Waters515. Amostras ou padrões foram dissolvidas ou diluídas com água para 0,1a 1,5 mg/mL e 0,025 mL injetada e o efluente monitorado a 214, 275 e 340nm (Waters 996 Photodiode Array Detector). Imediatamente depois de inje-ção, um gradiente linear foi iniciado começando com tampão de equilibraçãoe terminando em 30 minutos com uma mistura a 50:50 de tampão de equili-bração e tampão de eluição (tampão de eluição é composto de água : ace-tonitrilo : ácido trifluoroacético a 25:75:0.1). A coluna foi enxaguada por 1minuto com tampão de eluição (100%) e em seguida re-equilibrada comtampão de equilibração por 35 minutos antes da amostra seguinte ser injeta-da. Áreas sob picos de absorvência a 214 nm foram determinadas pelo ins-trumento. Amostras de Proteína A de rotina foram preparadas dissolvendo 5a 25 mg de Proteína A purificada seca em água a uma concentração de 1,5mg de Proteína A/mL e armazenando 0,35 a 0,85 ml. Em tubos de microcen-trífuga a -10 a -15° C até necessário. Um tubo de matéria-prima de 1,5 mgde Proteína A/mL de solução congelada foi degelado e diluído a 1:1 , 1:3, 1:7e 1:15 com água para gerar uma série de padrões de concentração. A Prote-ína A tipicamente eluiu em 15-17 minutos. Áreas sob os picos de Proteína Apadrão a 214 nm foram plotadas contra a concentração de Proteína A dopadrão aplicado para gerar uma curva padrão. Áreas obtidas a partir dasamostras de teste foram comparadas com a curva padrão para obter a con-centração da amostra. Se a área da amostra excedeu a área obtida para opadrão de 1,5 mg/ml_, a amostra foi diluída com água apropriadamente enovamente rodada.

Coluna de Exclusão de Tamanho Analítica. Uma coluna de ex-clusão de tamanho padrão (7,8 χ 300 mm de TSK-GeI G3000 SW (Tosoh))foi equilibrada com 0,1 M de fosfato de sódio, pH 7,0, contendo 0,5 M deNaCI. Tipicamente, amostras de 0,10 mL foram aplicadas e rodadas a 0,5mL/minuto (Bomba 515 HPLC waters) ao mesmo tempo que monitorando oefluente a 214, 280 e 340 nm (Waters 996 Photodiode Array Detector). Á-reas sob picos de absorvência a 214 nm foram determinadas pelo instru-mento. Para quantificação de concentração, amostras de Proteína A de roti-na foram preparadas dissolvendo 5 a 25 mg de Proteína A purificada secaem água a uma concentração de 1,5 mg de Proteína A/mL e armazenandoalíquotas de 0,35 a 0,85 mL em tubos de microcentrífuga a -10 a -15° C aténecessário. Um tubo de matéria-prima de 1,5 mg de Proteína A/mL de solu-ção congelada foi degelado e diluído a 1:1, 1:3, e 1:7 com água para geraruma série de padrões de concentração. A Proteína A eluiu em 15 a 16 minu-tos. Áreas sob os picos de Proteína A de rotina em 214 nm foram plotadascontra a concentração de Proteína A do padrão aplicado para gerar umacurva padrão. Áreas obtidas de amostras de teste foram comparadas com acurva padrão para obter a concentração da amostra. Se a área da amostraexcedeu a área obtida para o padrão de 1,5 mg/mL, a amostra foi diluídacom água apropriadamente e novamente passada. Para estimativa do pesomolecular, proteínas de teste de rotina foram dissolvidas em 20 mM de Tris-Cl, pH 8 para dar 1,0 mg/mL e 0,1 ml_ injetado e passado conforme acimapara os padrões de concentração. Para estimativa do peso molecular, umacurva padrão foi obtida plotando o Iogi0 do padrão de peso molecular conhe-cido contra o tempo de retenção do padrão. Tempos de retenção de picos deproteína monitorados a 214 nm ou 280 nm nas amostras foram comparadoscom a curva padrão para obter a estimativa de peso molecular das proteínasda amostra. A Proteína A elui em uma posição dando um peso molecularestimado de 85.000, consideravelmente maior do que o valor esperado de40-50.000 da estrutura conhecida e dados obtidos por eletroforese de gelSDS. Isto provavelmente está relacionado com a natureza não esférica daproteína nativa (Bjork, (1972) Eur. J. Biochem. 29:579).

Eletroforese de Gel Desnaturante. Soluções contendo proteínaforam diluídas ou dissolvidas com 1 % de dodecil sulfato de sódio-0,1 M deditiotreitol-6 M de uréia-0,125 M de Tris-HCI, pH 6,8, para uma concentraçãofinal de proteína de 0,1 a 1,0 mg/mL e em seguida aquecidas a 65°C por 5 a10 minutos e resfriadas até a temperatura ambiente. Padrões de proteínasão obtidos em uma forma de kit da Sigma Chemical Co. ou da Bio-Rad.Entre 1 e 25 microlitros de solução de proteína pode ser aplicado a um gelde poliacrilamida preparado comercialmente para o fim de determinação detamanho de subunidade de proteína (monômero) tal como 4 a 20% de Re-ady Gels (Bio-Rad), 4-20% de iGels (Gradigels), 4-20% de Novex Pre-castGels (Invitrogen) ou géis podem ser preparados como 12% ou mais em acri-lamida/bis-acrilamida (proporção de 37,5/1) de acordo com Laemmli (Laem-mli, (1970) Nature 227:680). Seguindo as instruções do fabricante ou o pro-cedimento de Laemmli e ao final da eletroforese, o gel é fixado, corado edescorado por quaisquer dos vários métodos usados comumente empre-5 gando 40% de metanol-7% de ácido acético-água e ou 0,1% de azul coo-massie R250 ou técnica de tingimento com prata, dependendo da sensibili-dade necessária. Kits estão disponíveis comercialmente para tingimento comprata (Sigma ou Bio-Rad).

Propriedades Espectrais Ultravioleta de Proteína A Isolada de10 Meio Derivado de Animal e Não Derivado de Animal. As absorvências defundo foram tomadas sobre água em uma cuvette de quartzo de extensão detrajetória de 1 cm sobre um Perkin- Elmer A800 de 200 a 400 nm. Similar-mente, as absorvências foram tomadas em 200 a 400 nm sobre amostras deproteína com o fundo subtraído. Se a absorvência em qualquer comprimento15 de onda na região de 400 a 250 nm exceder unidades de 2,0 de absorvên-cia, a amostra foi diluída com 2 partes iguais de água e testadas novamente.

Proporções de Absorvência a 275 e 340 nm. Um espectrofotô-metro foi zerado com água ou tampão no qual a Proteína A pode ser dissol-vida em uma cuvette de quartzo de 1 cm de extensão de trajetória para zerar20 o instrumento a 275 nm. A absorvência de qualquer solução de proteína emquestão é lida e registrada no mesmo comprimento de onda na mesma cu-vette de quartzo. Se for reconhecido que o tampão no qual a proteína é dis-solvida absorve luz em ou 275 nm ou 340 nm, então o tampão em questãodeve ser usado para zerar o instrumento ao invés de água. Este processo é25 repetido a 340 nm. A proporção da absorvência a 275 nm para a absorvên-cia a 340 nm é registrada como A275/A340 e para qualquer Proteína A eluí-da de uma segunda coluna deve exceder 7,0.

Liofilização de Proteína A Purificada. Proteína A eluída da se-gunda coluna de purificação é diafiltrada contra água ou dialisada contra á-30 gua para remover o volume de sais e componentes de baixo peso molecular.Esta solução é então eongelada sobre os lados de frascos giratórios de mo-do a formar uma concha de líquido congelado ou rapidamente congeladodentro de panelas de vidro frio grandes. As soluções congeladas são resfria-das sobre uma prateleira ajustada a -55° C até a temperatura da soluçãocongelada ter atingido -15° C ou menos ocasião na qual a evacuação é ini-ciada com um vácuo pré-ajustado para 200 a 250 mTorr e a prateleira é a-justada para -15° C. A secagem por congelamento é continuada por 2 a 24horas ocasião na qual a temperatura da prateleira é é aumentada para 0°Caté o produto estar visivelmente seco, ocasião na qual a temperatura da pra-teleira é é aumentada para 23°C e mantida por no mínimo 2 horas para se-cagem final, ocasião na qual o produto fofo branco a castanho claro seco éremovido e pode ser mantido refrigerado ou em um freezer.

Exemplos

(1) Crescimento de S. aureus em larga escala. Um frasco dacultura de sementes foi desenvolvido em meio de crescimento não derivadode animal em um fermentador de 16 litros contendo meio estéril compostode 50 g/L de extrato de levedura (Difco), 15 a 20 g/L de peptona de soja(Sigma), 5 g/L de NaCI (Integra), 2,5 a 25 g/L de Glicose (Fluka), 2,5 g/L defosfato de potássio, dibásico (Mallinckrodt Baker), 1 mL de Anti-Espuma(Dow) / litro de meio e água com pH ajustado para 7.5-7.8. Crescimento a37°C foi estimulado com aeração a 1 Litro / litro de meio e manutenção dopH a 7,5-7,8 foi afetado por adições de 1 M de ácido fosfórico ou hidróxidode sódio diluído por aproximadamente 16 a 22 horas, em seguida este inó-culo foi transferido para uma câmara de crescimento de 400 litros contendoa mesma composição de meio estéril e o crescimento foi continuado a 37° Ccom aeração a 1 U minuto/ Litro de meio e agitação a 800 RPM por no mí-nimo 10 horas em uma densidade celular de no mínimo 50 unidades de ab-sorvência a 560 nm. Neste ponto, a produção de Proteína A livre no meio emuma forma secretada é de aproximadamente 0,2 a 1,0 mg de Proteína A/mL.As células foram removidas por centrifugação ou por filtração através de fil-tros de 0,1 ou 0,2 mícron e o caldo / filtrado do meio de cultura foi em segui-da diafiltrado através de uma membrana Millipore PROCON 10.000 MWCOTFF para reter a Proteína A, reduzir a concentração de sal e a concentraçãode componentes de menor peso molecular, para reduzir o volume da solu-ção e permutar o tampão para um apropriado para a coluna na qual deve seraplicado. Colunas apropriadas podem ser ou uma matriz de permutação deânions, uma matriz de hidroxiapatita cerâmica, uma matriz hidrofóbica ouuma matriz de permutação de cátions. A matriz de permutação de ânions5 pode ser qualquer uma de várias resinas de permutação de ânions tais comoWP DEAM (fraca) ou WP PEI (Mallinckrodt Baker) embora a modalidadepreferencial da invenção seja XWP 500 PolyQuat-35 pré-equilibrada com 20mM de Tris-Cl1 pH 7,8 usando uma bomba 515 HPLC waters. A matriz dehidroxiapatita cerâmica (Bio-Rad) foi pré-equilibrada com 20 mM de Tris-CI,10 pH 7,8. A matriz hidrofóbica pode ser qualquer uma dos vários materiais ali-fáticos de cadeia curta fixado de modo covalente a sílica, tais como etila,propila, isopropila, butila, isobutila ou pentil-sílica equilibrada com 20 mM deTris-HCI, pH 7,8, e contendo 0,5 M de sulfato de amônio. A matriz de permu-tação de cátions pode ser qualquer uma de várias resinas de permutação de15 cátions, embora a modalidade preferencial da invenção seja WP carbóxi-sulfona (permutador de cátions fraco-forte) (Mallinckrodt Baker n9 7587) e éequilibrada com 137 mM de ácido acético- trietanolamina-30 mM de NaCI1pH 4,5-6,0.

(2) Aplicação de Solução da Coluna de Permutação de Ânions20 Primeiro. Para aplicação da solução de Proteína A à coluna de permutaçãode ânions, a solução de 375 litros de caldo de fermentação foi diafiltrada a-través de uma membrana Millipore PROCON 10.000 MWCO TFF para retera Proteína A, reduzir a concentração de sal, reduzir a concentração de com-ponentes de menor peso molecular, para permutar o tampão para 20 mM de25 Tris-CI, pH 7,8 e para reduzir o volume da solução. Esta solução de proteínafoi aplicada a uma XWP 500 PolyQuat-35 de 10 X 75 cm (Mallinckrodt BakernQ 7603) com uma bomba 515 HPLC waters em um índice de fluxo de 5,5 a8,0 cm/minuto. Componentes não ligados foram lavados da coluna com 3 a10 volumes de coluna de tampão de equilibração fresco, em seguida a Pro-30 teína A foi eluída da coluna com 20 mM de Tris-CI, pH 7,8 ajustado parauma condutividade de 18 mS/cm com NaCI. A concentração e a pureza daProteína A foram determinadas sobre frações usando uma coluna analíticade fase reversa C4 (HIC) e monitorando a absorvência a 214, 275 e 340 nmem um Detector de Arranjo Fotodiodo Waters. Frações de Proteína A sãoreunidas de tal modo que a recuperação é de 85 a 100% e a proporção doconjunto A275/A340 é 7 ou maior. Neste ponto, a solução de proteína é en-5 tão aplicada a uma coluna de permutação de cátions. Para a permutação decátions, o conjunto de Proteína A foi titulado para pH 4,5-6,0 com HCI diluídoe em seguida diluído com água em uma condutividade de 4,0 a 7,3 mS/cm eaplicado a uma coluna de 16 χ 72 cm de WP carbóxi-sulfona (permutador decátions fraco-forte) pré-equilibrada com 137 mM de ácido acético-10 trietanolamina-30 mM de NaCIl pH 4,5-6,0 com pH 4.7, sendo a modalidadepreferencial, em um índice de fluxo de 100 a 300 cm/hora. A coluna foi emseguida lavada no mesmo índice de fluxo com 2 a 10 volumes de coluna detampão de equilibração seguida por eluição da Proteína A com uma etapade 137 mM de ácido acético-trietanolamina-200 mM de NaCI, pH 4.5-6.0 ou15 gradiente de 0 a 1,0 M de NaCI no tampão de equilibração em uma faixa de10 volumes de coluna. A concentração e pureza da Proteína A foram deter-minadas sobre frações usando uma coluna analítica de fase reversa C4(HIC) e monitorando a absorvência a 214, 275 e 340 nm em um Detector deArranjo Fotodiodo Waters. A A275 e A340 foram examinadas em frações20 contendo Proteína A e em seguida foram reunidas como as frações tendoproporções de A275/A340 excedendo 7,0.

(3) Aplicação de Solução de Proteína a Coluna de Permutaçãode Cátions Primeiro. Para aplicação da solução de Proteína A à coluna depermutação de cátions, a solução de 375 litros de caldo de fermentação foi25 diafiltrada através de uma membrana Millipore PROCON de 10.000 MWCOTFF para reter a Proteína A, reduzir a concentração de sal e a concentraçãode componentes de menor peso molecular, reduzir o volume da solução epara permutar o tampão para 137 mM de ácido acético-trietanolamina-30mM de NaCI, pH 4,5-6,0, o pH preferencial sendo 4,7. Alternativamente, a30 solução de proteína pode ser simplesmente filtrada através de um filtro de0,2 mícron, o pH ajustado para 4,7-6,0 com 1 N de HCI ou 1 N de NaOH, ediluída com água para uma condutividade de 4,0 a 7,0 mS/cm. Esta soluçãode proteína foi aplicada a uma coluna de 16 χ 72 cm WP carbóxi-sulfona emum índice de fluxo de 100 a 300 cm/minuto. Componentes não ligados foramlavados da coluna com 3 a 10 volumes de coluna de tampão de equilibraçãoseguido por eluição da Proteína A com uma etapa de 137 mM de ácido acé-5 tico-trietanolamina- 200 mM de NaCI, pH 4,5-6,0 ou gradiente de 0-1,0 M deNaCI no tampão de equilibração em uma faixa de 10 volumes de coluna. Aconcentração e pureza da Proteína A foram determinadas sobre frações u-sando uma coluna analítica de fase reversa C4 (HIC) e monitorando a absor-vência a 214, 275 e 340 nm em um Detector de Arranjo Fotodiodo Waters. A10 A275 e A340 foram examinadas sobre frações contendo Proteína A e estasforam reunidas tendo proporções de A275/A340 excedendo 7,0. Neste pon-to, pode ser feita uma escolha para aplicar a solução de proteína a uma co-luna de permutação de ânions, de interação hidrofóbica ou de hidroxiapatitacerâmica, a modalidade preferencial foi uma coluna de permutação de â-15 nions, por meio da qual o conjunto de Proteína A foi diafiltrado através deuma membrana Millipore PROCON 10.000 MWCO TFF para reter a ProteínaA, reduzir a concentração de sal, reduzir a concentração de quaisquer com-ponentes remanescentes de menor peso molecular, para permutar o tampãopara 20 mM de Tris-CI, pH 7,8 e para reduzir o volume da solução. Esta so-20 lução de proteína foi em seguida aplicada a uma coluna de 10,5 X 72 cm deresina de permutação de ânions XWP 500 PolyQuat-35 (Mallinckrodt Bakerng 7603) pré- equilibrada com 20 mM de Tris-CI, pH 7,8 usando uma Bomba515 HPLC waters em um índice de fluxo de 100 a 250 cm/hora. Componen-tes não ligados foram lavados da coluna com 3 a 10 volumes de coluna de25 tampão de equilibração fresco, em seguida a Proteína A foi eluída da colunacom 20 mM de Tris-CI, o pH 7,8 foi ajustado para uma condutividade de 18mS/cm com NaCI. A concentração e pureza da Proteína A foram determina-das sobre frações usando uma coluna analítica de fase reversa C4 (HIC) emonitorando a absorvência a 214, 275 e 340 nm em um Detector de Arranjo30 Fotodiodo Waters. Frações de Proteína A foram reunidas de tal modo que arecuperação é de 85 a 100% e a proporção de A275/A340 é de 7,0 ou maior.Alternativamente, se a coluna de HIC for a segunda escolha de coluna, oconjunto é misturado com suficiente sulfato de amônio granular ou em pópara tornar uma concentração final de 0,5 M de sulfato de amônio e o pH foiajustado para 7,5 a 8,2 com hidróxido de amônio diluído. Esta solução é a-plicada a uma coluna de 16 χ 72 cm de resina polimérica WP Hl-Propila (C3)5 pré- equilibrada com 0,5 M de sulfato de amônio em 20 mM de fosfato desódio, pH 8,0. A coluna é lavada com 2 a 5 volumes de coluna de 0,5 M desulfato de amônio em 20 mM de fosfato de sódio, pH 8,0, em seguida iniciarum gradiente de 5 volumes de 0,5 M de sulfato de amônio em 20 mM de fos-fato de sódio, pH 8,0 para 5 volumes de 20 mM de sódio fosfato, pH 8,0. A10 concentração e a pureza da Proteína A são determinadas sobre frações u-sando uma coluna de fase reversa de C4 analítica (HIC) e monitorando aabsorvência a 214, 275 e 340 nm em um Detector de Arranjo Fotodiodo Wa-ters. A275 e A340 são examinadas sobre frações contendo Proteína A e re-unidas como as com proporções de 275/340 excedendo 7,0. Se a escolha15 para a segunda coluna for uma hidroxiapatita cerâmica, a solução de proteí-na é diafiltrada para permutar o tampão para 20 mM de Tris-HCI, pH 7,5.Uma coluna de 16 χ 72 cm de hidroxiapatita cerâmica (Bio-Rad) é equilibra-da com 20 mM de Tris-HCI, pH 7,5 e a solução de proteína é carregada so-bre a coluna a 100 a 150 cm/hora. O fluxo é continuado com uma lavagem20 do mesmo tampão para 3 a 5 volumes de coluna em seguida a Proteína A éeluída com 3 volumes de coluna de 20 mM de Tris-HCI, pH 7,5, contendo0,2 M de sulfato de amônio. A concentração e pureza da Proteína A são de-terminadas sobre frações usando uma coluna de fase reversa de C4 analítica(HIC) e monitorando a absorvência a 214, 275 e 340 nm em um Detector de25 Arranjo Fotodiodo Waters. Examinar A275 e A340 sobre as frações e reuniras frações contendo Proteína A com proporções de A275/A340 de mais de7,0.

(4) Aplicação de Solução de Proteína a Coluna de Permutaçãode Ânions Seguida por uma Coluna de Permutação de Cátions. Em uma30 modalidade preferencial, a solução de Proteína A é aplicada primeiro à colu-na de permutação de ânions. A solução de 375 litros de caldo de fermenta-ção foi diafiltrada através de uma membrana Millipore PROCON 10.000MWCO TFF para reter a Proteína A, reduzir a concentração de sal, reduzir aconcentração de componentes de menor peso molecular, para permutar otampão para 20 mM de Tris-CI, pH 7,8 e para reduzir o volume da solução.Esta solução de proteína foi aplicada a uma coluna de 10,5 X 72 cm de XWP5 500 PoIyQuat- 35 com uma bomba de HPLC Waters 515 em um índice defluxo de 5,5 a 8,0 cm/minuto. Componentes não ligados foram lavados dacoluna com 3 a 10 volumes de coluna de tampão de equilibração fresco, emseguida a Proteína A foi eluída da coluna com 20 mM de Tris-CI, pH 7,8 a-justado para uma condutividade de 18 mS/cm com NaCI. A concentração e a10 pureza da Proteína A foram determinadas sobre frações usando uma colunaanalítica de fase reversa C4 (HIC) e monitorando a absorvência a 214, 275 e340 nm em um Detector de Arranjo Fotodiodo Waters. As frações de Proteí-na A foram reunidas de tal modo que a recuperação é de 85 a 100% e de talmodo que o conjunto apresentou uma proporção de A275/A340 de 7,0 ou15 maior. O conjunto de Proteína A foi titulado para pH 4,5 a 6,0 com HCI diluí-do e em seguida diluído com água para uma condutividade de 4,0 a 7,3mS/cm e aplicado a uma coluna de 16 χ 72 cm de WP carbóxi-sulfona (per-mutador de cátions fraco-forte) pré-equilibrada com 137 mM de ácido acéti-cotrietanolamina-30 mM de NaCI, pH 4,5-6,0 com pH 4,7 sendo a modalida-20 de preferencial, em um índice de fluxo de 100 a 300 cm/hora. A coluna foiem seguida lavada no mesmo índice de fluxo com 2 a 10 volumes de colunade tampão de equilibração seguido por eluição da Proteína A com uma eta-pa de 137 mM de ácido acético-trietanolamina- 200 mM de NaCI, pH 4,5-6,0ou gradiente de 0 a 1,0 M de NaCI no tampão de equilibração por uma faixa25 de 10 volumes de coluna. A concentração e a pureza da Proteína A foramdeterminadas sobre frações usando uma coluna analítica de fase reversa C4(HIC) e monitorando a absorvência a 214, 275 e 340 nm em um Detector deArranjo Fotodiodo Waters. A275 e A340 das frações foi examinada em todasas frações contendo Proteína A e as com proporções de A275/A340 exce-30 dendo 7,0 foram reunidas.

(5) Aplicação de Solução de Proteína a Coluna de Permutaçãode Cátions Seguida por uma Coluna de Permutação de Ânions. Em outramodalidade preferencial, a solução de Proteína A foi aplicada a uma colunade permutação de cátions WP carbóxi-sulfona (permutador de cátions fraco-forte) (Mallinckrodt Baker n9 7587). A solução de 375 litros de caldo de fer-mentação foi diafiltrada através de uma membrana Millipore PROCON5 10.000 MWCO TFF para reter a Proteína A, reduzir a concentração de sal ea concentração de componentes de menor peso molecular, reduzir o volumede solução e para permutar o tampão para 137 mM de ácido acéticotrietano-lamina-30 mM de NaCI1 pH 4,5 a 6,0, o pH preferencial sendo 4,7. Alternati-vamente, a solução de proteína pode ser simplesmente filtrada através de10 um filtro de 0,2 mícron, o pH foi ajustado para 4,7 a 6,0 com 1 N de HCI ou 1N de NaOH, e diluído com água para uma condutividade de 4,0 a 7,0mS/cm. Esta solução de proteína foi clarificada (caso necessário) por filtra-ção através de um filtro de 0,2 mícron e em seguida aplicada a uma WP car-bóxi-sulfona de 16 χ 72 cm (permutador de cátions fraco-forte) (Mallinckrodt15 Baker nõ 7587) equilibrada com 137 mM de ácido acético-trietanolamina-30mM de NaCI, pH 4.5 a 6.0, o pH preferencial sendo de 4,7 em um índice defluxo de 100 a 300 cm/minuto. Componentes não ligados foram lavados dacoluna com 3 a 10 volumes de coluna de tampão de equilibração seguidopor eluição da Proteína A com uma etapa de 137 mM de ácido acético-20 trietanolamina-200 mM de NaCI, pH 4,5 a 6,0 ou gradiente de 0 a 1,0 M deNaCI no tampão de equilibração por uma faixa de 10 volumes de coluna. Aconcentração e a pureza da Proteína A foram determinadas sobre fraçõesusando uma coluna analítica de fase reversa C4 (HIC) e monitorando a ab-sorvência a 214, 275 e 340 nm em um Detector de Arranjo Fotodiodo Wa-25 ters. As frações de Proteína A foram reunidas de tal modo que a recupera-ção foi de 85 a 100% e de tal modo que o conjunto apresentou uma propor-ção de A275/A340 de 7,0 ou maior. Usando diaflow ou diálise, o conjunto dasolução de proteína foi permutado para dar 20 mM de Tris-CI, pH 7,8 e parareduzir o volume da solução. Esta solução de proteína foi aplicada a uma30 coluna de 10,5 X 72 cm de XWP 500 PolyQuat-35 com uma bomba de H-PLC Waters 515 em um índice de fluxo de 5,5 a 8,0 cm/minuto. Componen-tes não ligados foram lavados da coluna com 3 a 10 volumes de coluna detampão de equilibração fresco, em seguida a Proteína A foi eluída da colunacom 20 mM de Tris-CI, pH 7,8 ajustado para uma condutividade de 18mS/cm com NaCI. A concentração e a pureza da Proteína A foram determi-nadas sobre frações usando uma coluna analítica de fase reversa C4 (HIC) emonitorando a absorvência a 214, 275 e 340 nm em um Detector de ArranjoFotodiodo Waters. As Frações de Proteína A foram reunidas de tal modoque a recuperação é de 85 a 100% e de tal modo que o conjunto apresentauma proporção de A275/A340 de 7,0 ou maior.

(6) Identidade Entre Proteína A Isolada de Meio Derivado de A-nimal e Não Derivado de Animal. A Proteína A foi purificada separadamentea partir de células de S. aureus desenvolvidas em meio derivado de animalou meio não derivado de animal usando, em seqüência, permutação de â-nions em seguida permutação de cátions em alguns casos e permutação decátions seguida por permutação de ânions em outros casos. Cada proteínapurificada foi em seguida testada para co-migração sobre géis SDS e géisnão desnaturantes (géis de Laemmli sem SDS nem na amostra nem no pró-prio gel). As duas proteínas separadas migraram no mesmo índice em am-bos os sistemas, respectivamemte. As Proteínas A separadas foram subme-tidas a um laboratório comercial para análise de aminoácidos usando HCI6N, análise de seqüência de N-terminal e para mapeamento de peptídeos.Para ambas as proteínas, a análise de aminoácidos foi comparável. A análi-se de N-terminal dos seis primeiros aminoácidos combinou embora uma pe-quena quantidade de valina tenha aparecido na Proteína A não derivado deanimal que não estava no primeiro aminoácido removido na Proteína A deri- vada de animal. O mapeamento de peptídeos foi realizado sobre as duasproteínas digerindo com tripsina e separando os peptídeos resultantes porHPLC. O perfil de eluição das duas foram virtualmente idênticos, a exceçãosendo que dois picos eluídos da fragmentação da Proteína A não derivadade animal elutriando em 61,5 e em 87 minutos não estavam presentes na fragmentação da Proteína A derivada de animal e o pico que eluiu em 92minutos sobre a derivada de animal foi muito maior na não derivada de ani-mal. Esta combinação de eventos pode ter resultado de incompleta decom-posição de um peptídeo maior nos fragmentos de Proteína A não animal. Demodo diverso, houve similaridade quase perfeita entre os dois padrões. Ca-da uma das duas Proteínas A foram passadas sobre géis de focalização iso-elétrica também dando padrões similares, as bandas protéicas predominan-5 tes tendo pontos isoelétricos de pH 5,1, 4,9 e 4,7 quando comparadas comproteínas padrão de mioglobina de coração de cavalo, anidrase carbônica eβ-lactoglobulina.

Enquanto esta invenção foi descrita aqui, neste requerimento depatente, com referência às modalidades específicas da mesma, será reco-10 nhecido que podem ser feitas várias alterações, modificação e variaçõessem se afastar do espírito e do âmbito do conceito da invenção revelado a-qui, neste requerimento de patente. Por conseguinte, pretende-se que en-globe todas as referidas alterações, modificação e variações que estejamdentro do do espírito e do âmbito das reivindicações anexadas.

Claims

1. Processo de purificação de Proteína A não derivada de animalque compreende:(a) proporcionar uma solução de Proteína A não derivada de a-nimal que tenha sido produzida fermentando uma cepa secretora de Staph-ylococcus aureus em um meio contendo aminoácidos ou peptídeos vegetari-anos, o referido meio estando livre de produtos animais;(b) carregar a solução de Proteína A filtrada sobre uma primeiracoluna;(c) lavar a coluna com uma mistura de sal e tampão para enxa-guar a cor indesejável e proteínas contaminantes da coluna;(d) eluir a Proteína A da primeira coluna para produzir um con-junto da solução de Proteína A ;(e) ajuste do pH e da condutividade do conjunto da solução deProteína A;(f) carregar a Proteína A do conjunto da solução de Proteína Asobre uma segunda coluna;(g) lavar a segunda coluna com uma mistura de sal e tampãopara enxaguar a cor indesejável e proteínas contaminantes da coluna; e(h) eluir a Proteína A da segunda coluna para produzir uma so-lução de Proteína A purificada; em que a primeira coluna é selecionada entre(1) o grupo consistindo em uma coluna de permutação de ânions, uma colu-na de HIC e uma coluna de hidroxiapatita cerâmica, ou (2) uma coluna depermutação de cátions; e a segunda coluna é uma coluna de permutação decátions quando a primeira coluna é uma coluna selecionada entre o grupoconsistindo em uma coluna de permutação de ânions, uma coluna de HIC euma coluna de hidroxiapatita cerâmica, e a segunda coluna é uma colunaselecionada entre o grupo consistindo em uma coluna de permutação deânions, uma coluna de HIC e uma coluna de hidroxiapatita cerâmica quandoa primeira coluna é uma coluna de permutação de cátions.

2. Processo de purificação de Proteína A não derivada de animalde acordo com a reivindicação 1, em que a primeira coluna é selecionadoentre o grupo consistindo em uma coluna de permutação de ânions, umacoluna de HIC e uma coluna de hidroxiapatita cerâmica; e a segunda colunaé uma coluna de permutação de cátions.

3. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1,compreendendo a etapa adicional:(i) monitorar a absorvência de cada fração de Proteína A purifi-cada da primeira coluna e da segunda coluna a 275 nm e a 340nm para ob-ter uma proporção de A275/A340 de modo a escolher frações apropriadaspara "pooling".

4. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 2, emque a primeira coluna é uma coluna de permutação de ânions.

5. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 2, emque a primeira coluna é uma coluna de HIC.

6. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 2, emque a primeira coluna é uma coluna de hidroxiapatita cerâmica.

7. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1,compreendendo a etapa adicional:(k) secar a solução de Proteína A purificada para um produto seco.

8. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 7, emque a secagem ocorre por liofilização.

9. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1,compreendendo a etapa adicional de filtrar a referida solução de Proteína Apara remover células bacterianas, particulados e moléculas de baixo pesomolecular (< 10.000 dáltons) antes de carregar a solução de Proteína A so-bre a primeira coluna.

10. Processo de purificação de Proteína A não derivada de ani-mal de acordo com a reivindicação 1 , em que a primeira coluna é uma colu-na de permutação de cátions e a segunda coluna é uma coluna selecionadaentre o grupo consistindo em uma coluna de permutação de ânions, umacoluna de HIC e uma coluna de hidroxiapatita cerâmica.

11. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 10compreendendo a etapa adicional:(i) monitorar a absorvência de cada fração de Proteína A purifi-cada da primeira e da segunda coluna a 275 nm e a 340 nm para obter umaproporção de A275/A340 de modo a escolher frações apropriadas para reu-nir.

12. Processo de purificação, de acordo com a reivindicação 10,em que a segunda coluna é uma coluna de permutação de ânions.

13. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 10,em que a segunda coluna é uma coluna de HIC.

14. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 10,em que a segunda coluna é uma coluna de hidroxiapatita cerâmica.

15. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 10,compreendendo a etapa adicional de:(j) secar a solução de Proteína A purificada para um produto se-co.

16. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 15,em que a secagem ocorre por liofilização.

17. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 10,compreendendo a etapa adicional de filtrar a referida solução de Proteína Apara remover células bacterianas, particulados e moléculas de baixo pesomolecular (< 10.000 dáltons) antes de carregar a solução de Proteína A so-bre a coluna de permutação de cátions.

18. Proteína A vegetariana purificada produzida como definidona reivindicação 1, imobilizada sobre uma resina cromatográfica para formaruma Proteína A vegetariana-resina cromatográfica.

19. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 18, em que a resina cromatográfica é um material amorfo oupolímero sintético.

20. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 19, em que a resina cromatográfica é um polímero sintéticoselecionado entre o grupo consistindo em polimetacrilato ou poligalactose.

21. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 19, em que a resina cromatográfica é um material amorfoselecionado entre o grupo consistindo em sílica ou terra diatomácea.

22. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 18, produzida reagindo um grupamento carboxila ou aminosobre a Proteína A vegetariana com um grupamento quimicamente funcionalsobre a resina cromatográfica.

23. Proteína A vegetariana purificada vegetariana como definidana reivindicação 2, imobilizada sobre uma resina cromatográfica para formaruma Proteína Α-resina cromatográfica.

24. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 23, em que a resina cromatográfica é um polímero sintéticoou material amorfo.

25. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 24, em que a resina cromatográfica é um polímero sintéticoselecionado entre o grupo consistindo em polimetacrilato ou poligalactose.

26. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 24, em que a resina cromatográfica é um material amorfoselecionado entre o grupo consistindo em sílica ou terra diatomácea.

27. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 23, produzida reagindo um grupamento carboxila ou aminosobre a Proteína A vegetariana com um grupamento quimicamente funcionalsobre a resina cromatográfica.

28. Método para ligar anticorpos ou fragmentos de anticorpos auma resina cromatográfica compreendendo contactar os anticorpos ou frag-mentos de anticorpos com a Proteína A vegetariana coluna cromatográficacomo definido na reivindicação 23.

29. Método para ligar anticorpos ou fragmentos de anticorpos auma resina cromatográfica compreendendo contactar os anticorpos ou frag-mentos de anticorpos com a Proteína A vegetariana coluna cromatográfica,como definido na reivindicação 25.

30. Proteína A vegetariana purificada vegetariana como definidana reivindicação 10, imobilizada sobre uma resina cromatográfica para for-mar uma Proteína Α-resina cromatográfica.

31. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 30, em que a resina cromatográfica é um polímero sintéticoou material amorfo.

32. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 31, em que a resina cromatográfica é um polímero sintéticoselecionado entre o grupo consistindo em polimetacrilato ou poligalactose.

33. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 31, em que a resina cromatográfica é um material amorfoselecionado entre o grupo consistindo em sílica ou terra diatomácea.

34. Proteína A vegetariana resina cromatográfica de acordo coma reivindicação 30, produzida reagindo um grupamento carboxila ou aminosobre a Proteína A vegetariana com um grupamento quimicamente funcionalsobre a resina cromatográfica.

35. Método para ligar anticorpos ou fragmentos de anticorpos auma resina cromatográfica compreendendo contactar os anticorpos ou frag-mentos de anticorpos com a Proteína A vegetariana resina cromatográficacomo definido na reivindicação 18.

36. Anticorpo ou fragmentos de anticorpos ligados à Proteína Avegetariana de acordo com a reivindicação 35.

37. Método para ligar anticorpos ou fragmentos de anticorpos auma resina cromatográfica compreendendo contactar os anticorpos ou frag-mentos de anticorpos com a Proteína A vegetariana coluna cromatográficacomo definido na reivindicação 23.

38. Anticorpo ou fragmentos de anticorpos ligados à Proteína Avegetariana de acordo com a reivindicação 37.

39. Método para ligar anticorpos ou fragmentos de anticorpos auma resina cromatográfica compreendendo contactar os anticorpos ou frag-mentos de anticorpos com a Proteína A vegetariana coluna cromatográficacomo definido na reivindicação 30.

40. Anticorpo ou fragmentos de anticorpos ligados à Proteína Avegetariana como definido na reivindicação 39.