BRPI0616199A2

BRPI0616199A2 - mÉtodos para produzir proteÍna a vegetariana, proteÍna a vegetariana, composiÇÕes farmacÊuticas e mÉtodo para ligar anticorpos ou fragmentos de anticorpos a uma resina de cromatografia de proteÍna a vegetariana

Info

Publication number: BRPI0616199A2
Application number: BRPI0616199-5A
Authority: BR
Inventors: Nandu Deorkar; Thomas R Leary; Daniel N Lafoe
Original assignee: Mallinckrodt Baker Inc
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2011-06-14
Also published as: NZ566873A; JP2009508950A; ATE548446T1; IL190092A0; NO20081881L; EP1926811A1; CA2622542A1; BRPI0616201A2; NZ566871A; CA2623176A1; AU2006292583B2; CN101268181A; NO20081882L; CN101268182A; TW200804412A; IL190088A0; WO2007035341A1; IL190088A; AU2006292700A1; KR20080065590A

Abstract

MÉTODOS PARA PRODUZIR PROTEÍNA A VEGETARIANA, PROTEÍNA A VEGETARIANA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODO PARA LIGAR ANTICORPOS OU FRAGMENTOS DE ANTICORPOS A UMA RESINA DE CROMATOGRAFIA DE PROTEÍNA A VEGETARIANA. A presente invenção refere-se a métodos para produzir Proteína A sem contaminação da Proteína A por produtos animais. A invenção também refere-se a um meio de fermentação vegetariana no qual Staphylococcus aureus é cultivada para produzir uma Proteína A vegetariana. A invenção, adicionalmente, refere-se a uma Proteína A vegetariana e o uso de uma Proteína A vegetariana em métodos terapêuticos e profiláticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA PRODUZIR PROTEÍNA A VEGETARIANA, PROTEÍNA A VEGETA-RIANA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODO PARA LIGARANTICORPOS OU FRAGMENTOS DE ANTICORPOS A UMA RESINA DECROMATOGRAFIA DE PROTEÍNA A VEGETARIANA".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A Proteína A é uma proteína da parede celular fabricada porStaphylococcus aureus. A utilidade da Proteína A provém de sua capacidadepara ligar a região Fc da maior parte da imunoglobulina G (IgG) de mamíferoe, em uma menor extensão, à imunoglobulina M (IgM) tendo uma região VH3,sem afetar a afinidade da imunoglobulina por antígeno. A Proteína A é usadacomercialmente para purificar anticorpos monoclonais que são, freqüente-mente, por sua vez usados como terapêuticos em doenças humanas comodoenças inflamatórias e câncer. Além disso, a própria Proteína A pode serusada como um terapêutico. A Proteína A pode ser administrada a um paci-ente, de modo a ligar complexos imunes circulantes em doenças auto-imunes como artrite reumatóide ou a estimular produção de citocina especí-fica em alguém com uma infecção. Além disso, quando acoplada a uma re-sina de cromatografia, a Proteína A pode agir como um absorvedor terapêu-tico para tratar o plasma ou o sangue total removendo complexos de IgG emdistúrbios como doença auto-imune e rejeição de órgão de transplante.

Originalmente, a Proteína A foi derivada da parede de células de S.aureus, mas cepas bacterianas as quais secretam a proteína têm sido isoladase também são usadas para obter Proteína A. No entanto, a preparação de Pro-teína A por métodos convencionais apresenta um problema para seu uso emterapêuticos humanos. A S. aureus é cultivada em meio que contém produtosanimais como uma fonte de aminoácidos para as bactérias. Em particular, hi-drolisados bovinos e extratos são comumente usados como suplementos emmeio de crescimento bacteriano. Deste modo, a obtenção de Proteína A demeio de crescimento contendo produtos derivados de animais leva à possibili-dade de que produtos animais como príons, o agente causador da doença daVaca Louca, Doença Infecciosa no cérebro de gado e doença debilitante, pos-samestar presentes no meio e ser transmitidos a pacientes humanos.As preparações de Proteína A também podem ser expostas econtaminadas com produtos animais durante processos de purificação a ju-sante. Por exemplo, em métodos usados atualmente, a Proteína A é purifi-cada usando uma coluna de cromatografia Sepharose de IgG e a IgG aco-piada à coluna de cromatografia Sepharose é tipicamente de origem animal.No entanto, os produtos animais que chegam a ser associados com umapreparação de Proteína A durante os processos de isolamento e purificaçãonão são facilmente purificados da preparação pelos métodos conhecidosatualmente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método para produzir Prote-ína A livre de contaminação por produto derivado de animal fermentandouma cepa secretora de S. aureus em um meio contendo aminoácidos oupeptídeos vegetarianos ao invés de peptídeos animais, colhendo o meiocontendo Proteína A e purificando a Proteína A aplicando-a a uma resinasintética que carece de peptídeos animais e filtrando o elutriente a partir daresina.

Em uma modalidade do método, cepa secretora de S. aureus éStaph aureus, var Imre (S. Imre). Em outra modalidade da presente inven-ção, a Proteína A é purificada a partir do meio usando uma resina de croma-tografia de permuta de ânions. Em ainda outra modalidade da presente in-venção, a Proteína A eluída a partir da resina de cromatografia é adicional-mente purificada por hidroxiapatita ou cromatografia de permuta catiônicapara remover contaminantes não proteínáceos. Depois de purificação, a Pro-teína A pode ser concentrada e trazida para pH fisiológico.

A presente invenção também refere-se a um meio vegetarianopara fermentação do S. aureus que consiste em extrato de levedura, amino-ácidos ou peptídeos vegetarianos, glicose e sais essenciais. Em uma moda-lidade, os aminoácidos ou peptídeos vegetarianos são peptídeos da soja.Além disso, a presente invenção refere-se a métodos para produzir uma Pro-teína A vegetariana, isto é, uma preparação de Proteína A livre de contami-nação por produtos animais, cultivando as bactérias no meio vegetariano.A presente invenção adicionalmente refere-se a uma preparaçãode Proteína A vegetariana produzida pelos métodos da invenção. A presenteinvenção adicionalmente refere-se a uma composição farmacêutica conten-do uma Proteína A vegetariana e um veículo adequado. Em uma modalida-de, a composição farmacêutica é usada em um método terapêutico para tra-tar um paciente que necessite da mesma. Em particular, a composição far-macêutica é usada em um método para tratar um paciente que necessite deestimulação da produção de citocina ou crioglobulina administrando a com-posição farmacêutica de Proteína A vegetariana ao paciente.

A presente invenção também refere-se a a Proteína A vegetaria-na imobilizada a uma resina de cromatografia para formar uma Resina decromatografia de Proteína A vegetariana. Em uma modalidade, a Proteína Avegetariana- resina de cromatografia é usada em um método para ligar anti-corpos ou fragmentos de anticorpos. Em uma modalidade particularmentepreferencial, a Resina de cromatografia de Proteína A vegetariana é usadapara purificar anticorpos. A presente invenção também refere-se a umacomposição farmacêutica compreendendo os anticorpos purificados e umveículo adequado. Em uma modalidade, a composição farmacêutica de anti-corpos purificados é usada para tratar um paciente que necessite da mesmae, em uma modalidade preferencial, os anticorpos são usados para tratar umpaciente tendo câncer.

A invenção adicionalmente refere-se a uma composição farma-cêutica compreendendo a Resina de cromatografia de Proteína A vegetaria-na e um veículo adequado e métodos nos quais a composição farmacêuticaé usada para tratar um paciente que necessite da mesma. Em uma modali-dade do método, a composição farmacêutica é usada para tratar a hemofiliaadquirida. Em outra modalidade, a composição farmacêutica é usada em ummétodo para tratar doenças autoimunes ou problemas imunorrelacionados.Em uma modalidade adicional do método, a composição farmacêutica é u-sada para tratar as doenças autoimunes, artrite reumatóide ou cardiomiopa-tia dilatada. Em ainda outra modalidade do método, a composição farmacêu-tica é usada para tratar o problema imunorrelacionado de doença enxertoversus hospedeiro.

Portanto, a invenção proporciona um método para produzir Pro-teína A em uma maneira para prevenir sua contaminação com proteínas a-nimais. Além disso, vantajosamente proporciona uma preparação de Proteí-na A e composições farmacêuticas de Proteína A que não entraram em con-tato com produtos animais, assegurando que a Proteína A não seja contami-nada pelos mesmos. Isto é especialmente importante para o uso de ProteínaA em terapêuticos humanos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gel SDS-PAGE ilustrando as frações obtidas apartir da Proteína A vegetariana eluída de uma coluna de permuta de ânionsMacroPrep High Q.

A Figura 2 é um perfil cromatográfico linear ilustrando a fração 6de Proteína A vegetariana eluída de uma coluna de permuta de ânions Ma-croPrep High Q.

A Figura 3 é um Western blot ilustrando a atividade de ProteínaA vegetariana purificada por cromatografia de permuta de ânions MacroPrepHigh Q comparada com a de uma preparação de Proteína A de rotina.

A Figura 4 é um gel SDS-PAGE ilustrando as frações de Proteí-na A vegetariana eluída de uma coluna de hidroxiapatita cerâmica.

A Figura 5 é os perfis cromatográficos lineares ilustrando o con-teúdo de cada banda da fração 3 da Proteína A vegetariana eluída de umacoluna de hidroxiapatita cerâmica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Segue-se uma descrição de modalidades preferenciais da in-venção. A Proteína A pode ser obtida a partir de qualquer cepa de S. aureusprodutora de Proteína A incluindo as cepas que ocorrem naturalmente, iso-ladas ou produzidas por engenharia genética. Cepas de S. aureus produto-ras de Proteína A também podem incluir as cepas nas quais a Proteína Apermanece embutida na parede celular e as cepas que secretam Proteína Ano meio de crescimento, preferencialmente S. aureus, var Imre, por exem-plo. Métodos pelos quais a Proteína A pode ser recuperada da parede celu-lar do S. aureus (por exemplo, digestão enzimática) são de conhecimentogeral daqueles versados na técnica. A Proteína A recuperada desta maneirapode ser purificada para eliminar os componentes celulares digeridos. Noentanto, é preferencial obter Proteína A a partir de cepas de Staphylococcusque secretam Proteína A, no meio de tal modo que somente seja necessáriocolher a Proteína A do meio.

FERMENTAÇÃO E COLHEITA

Cepas de S. aureus são fermentadas em meio condicionado quecarece de peptídeos derivados de animais para prevenir contaminação daProteína A por produtos animais. Conforme referido aqui, "produtos animais"são definidos como qualquer material transmitido ou derivado de um animalnão humano, o material incluindo peptídeos, proteínas, aminoácidos, materi-ais similares às proteínas, ácidos nucléicos, vírus e similares. Conforme refe-rido aqui, o termo "Proteína A vegetariana" é definido como uma composiçãode Proteína A não contaminada por produtos animais ou quaisquer peptí-deos derivados de animais que são derivados do meio de fermentação ou domeio de purificação. Similarmente, o termo "meio vegetariano" refere-se ameio de fermentação não contaminado por produtos animais ou quaisquerpeptídeos derivados de animais. Conforme usado aqui, o termo "aminoáci-dos ou peptídeos vegetarianos" refere-se a quaisquer peptídeos, proteínas,aminoácidos ou materiais similares às proteínas que não são derivados deum animal não humano.

Bactérias secretoras podem ser fermentadas em qualquer quan-tidade de meio vegetariano suficiente para cultivar as bactérias e produzir aquantidade desejada de Proteína A. Ainda mais preferencialmente, os S.aureus são cultivados em um lote de fabricação em larga escala em tanquesde fermentador. As condições de fermentação (isto é, fluxo de ar, temperatu-ra, agitação, pri e pressão) podem ser controladas e/ou monitoradas eletro-nicamente, com, por exemplo, um microprocessador, ou por qualquer outromeio eletrônico. Algumas condições particularmente preferenciais incluemfermentação do S. aureus a cerca de 37° e um fluxo de ar de cerca de 1 li-tro/minuto de ar estéril por litro de meio. O meio pode consistir em compo-nentes de meio condicionado para crescimento de S. aureus que são conhe-cidos na técnica, tipicamente, extrato de levedura, glicose e sais essenciais,e, no caso da invenção, inclui aminoácidos e peptídeos vegetarianos (porexemplo, peptídeo de soja, hidrolisado de ervilha ou hidrolisado de sementede algodão) como uma fonte de aminoácidos. Aminoácidos ou peptídeosvegetarianos podem ser derivados, por exemplo, de qualquer fonte não ani-mal (por exemplo, planta ou similar) ou sintética (por exemplo, sintetizadaquimicamente) e em uma modalidade da invenção, os aminoácidos ou pep-tídeos vegetarianos são derivados de soja. Os componentes podem estarem uma concentração de cerca de 50 gramas / litro (g/L) de extrato de leve-dura, 15 g/L de peptídeos da soja e 5 a 10 g/L de glicose dissolvida em águadeionizada purificada com ácido fosfórico diluído e hidróxido de sódio diluídoadicionado conforme necessário durante fermentação para controlar o pHem entre cerca de 7 e 8. O meio pode conter adicionalmente no mínimo 0,67mililitros/litro (mL/L) de polietileno glicol para prevenir espumação na misturade fermentação.

Em uma modalidade preferencial, o caldo de fermentação é ino-culado com aproximadamente 5 χ 109 S. aureus da cepa de Staph Imre parafabricação de grande lote. Para assegurar que a preparação de Proteína Aesteja completamente livre de contaminação por produtos animais, a semen-te de S. aureus usada para inocular o caldo de fermentação também é man-tida no meio vegetariano. Os S. aureus são preferencialmente fermentadospor 13 a 14 horas a 37°C para obter uma alta densidade de bactérias emuma concentração medindo mais de 50 em um comprimento de onda de 560nanômetros (nm) (ou mais de 5,2 χ 108 S. aureus/mL), mas podem ser fer-mentados em qualquer lugar de 10 a 24 horas para obter uma concentraçãobacteriana desejada, o tempo de crescimento apropriado é determinado poralguém versado na técnica. Pode ser experimentação adicional para confir-mar a pureza da cultura cultivando-se uma amostra coletada orientadamentedo caldo de fermentação sobre Agar Mueller Hinton (o qual favorece o cres-cimento de bactérias Gram negativas) e, sobre simples metabólitos tais co-mo glutamina, galactose, melobiose ou similares, identificar um padrão decrescimento ou não crescimento consistente dependendo do metabólito. Kitspara realizar uma análise de identificação e pureza similar estão disponíveiscomercialmente, por exemplo, na BioMerieux.

O caldo de fermentação pode ser avaliado visualmente sob ummicroscópio para assegurar que o caldo não esteja contaminado com outrosmicroorganismos. Similarmente, os S. aureus na cultura podem ser inspe-cionados usando um microscópio para a morfologia apropriada a qual incluiter: a forma de cocos Gram positivos, pleiomorfismo (isto é, colônias únicas,cadeias ou rosáceas) e uma medida de aproximadamente 0,6 micra. Os S.aureus cultivados também podem ser avaliados para qualidade e saúde de-terminando se eles apresentam uma morfologia redonda, elevada, acinzen-tada sobre lâminas de ágar de sangue, têm a capacidade de causar a β-hemólise de sangue de carneiro depois de 48 horas e teste positivo para asenzimas coagulase e catalase.

A fermentação do caldo sob as condições desejadas preferenci-almente resultarão na produção de Proteína A vegetariana para uma con-centração de 0,68 miligramas / mililitro (mg/mL) de meio. A Proteína A vege-tariana no meio de fermentação pode ser então colhida passando o caldoatravés de um sistema de filtração (por exemplo, sistema de filtração Millipo-re Prostak) usando filtros de 0,1 mícron. Outros métodos de filtração ade-quados também podem ser empregados para remover células bacterianas,por exemplo, qualquer método para profunda filtração com auxiliares demeio, tais como terra diatomácea. As células de Staphylococcus tambémpodem ser eliminadas por centrifugação contínua de alta velocidade do meiode fermentação de S. aureus, a centrifugação peletizando as células bacteri-anas e enriquecendo o meio com a Proteína A secretada. O caldo livre decélula pode ser então passado através de um filtro estéril de 0,22 mícron ousimilar antes de purificação adicional.

PURIFICAÇÃO

A Proteína A vegetariana é submetida a várias etapas de pro-cessamento a jusante para produzir uma preparação de Proteína A vegetari-ana purificada. Portanto, os métodos da invenção também refere-sem à puri-ficação da Proteína A vegetariana. Em uma modalidade, o meio contendoProteína A vegetariana pode ser submetido à dialfiltração para reduzir acondutividade da solução e remover material não proteináceo que co-existecom Proteína A vegetariana. A condutividade da solução de Proteína A ve-getariana é preferencialmente reduzida, de tal modo que é de não mais de 2miliSiemens / centímetro (mS/cm). Pode ser realizada diafiltração da soluçãousando um filtro e o tampão desejado e, em uma modalidade da invenção, éfeita usando uma membrana de corte de peso molecular (MWCO) de 10.000em 10 milimolar (mM) de tampão TrisHCI a pH 7,8. Métodos de diafiltraçãosão conhecidos na técnica e podem incluir tanto membranas de MWCO (porexemplo, Millipore PROCON), um filtro de diálise de fibra oca (por exemplo,Fresenius OptiFIux) ou qualquer outro sistema de filtração com um corte depeso molecular apropriado para obter a produção máxima e/ou desejada deProteína A vegetariana.

O meio contendo Proteína A vegetariana pode ser então purifi-cado usando um método de cromatografia no qual os materiais cromatográ-ficos são livres de produtos derivados de animais. Em uma modalidade dainvenção, a Proteína A é purificada aplicando a solução contendo Proteína Avegetariana a uma resina de cromatografia de permuta de ânions. Uma vari-edade de resinas de permuta de ânions podem ser empregadas e matrizesadequadas incluem celulose, acrilamida e sílica gel. Muitos sistemas decromatografia de permuta de ânions estão disponíveis comercialmente e, namodalidade mais preferencial da invenção, a solução contendo Proteína Avegetariana é purificada usando a resina de permuta de ânions MacroPrepHigh Q. A Proteína A pode ser aplicada à matriz de cromatografia de permu-ta de ânions por métodos bem conhecido na técnica. Tipicamente, a colunade cromatografia é equilibrada para o pH e condutividade da solução con-tendo Proteína A vegetariana (isto é, pH 7.5 a 8.5) e o meio contendo Prote-ína A vegetariana é passado sobre a coluna a qual liga a Proteína A vegeta-riana devido a interações intermoleculares. Em uma modalidade, a ProteínaA vegetariana ligada à coluna é lavada com tampão de equilibração e podeser lavada com qualquer tampão no pH e na condutividade apropriados. Acromatografia é preferencialmente realizada em cerca de um índice de fluxode 5,7 a 7,9 cm/minuto sobre uma coluna tendo uma altura de cerca de 24centímetros. A Proteína A vegetariana pode ser então eluída da coluna u-sando o tampão apropriadamente carregado e, em uma modalidade particu-lar da invenção, usando 20 mM de TrisHCI e cloreto de sódio (NaCI) tendouma condutividade de cerca de 18 mS/cm. Em uma modalidade da inven-ção, a cromatografia de permuta de ânions do meio de Proteína A vegetaria-na produz um eluente de Proteína A vegetariana que contém uma ProteínaA no mínimo 95% pura. Em uma modalidade preferencial, o eluente de Pro-teína A contém Proteína A em uma pureza de mais de 95% e o mais prefe-rencialmente, em uma pureza de 97 a 99%.

Em outra modalidade da invenção o eluente de Proteína A vege-tariana da coluna de cromatografia de permuta de ânions é diafiltrada paraajustar o pH e a condutividade da solução. A diafiltração é o mais preferen-cialmente realizada usando uma membrana de 10.000 MWCO para produzirum filtrado de Proteína A vegetariana tendo um pH de cerca de 6.5 a 7.1 euma condutividade de cerca de 1 a 2 mS/cm. Em ainda outra modalidade dainvenção, o filtrado de Proteína A vegetariana pode ser então opcionalmentee adicionalmente purificado por hidroxiapatita cromatografia para removercontaminantes não protéicos. Hidroxiapatita é uma resina de cromatografiade permuta iônica de modo misto que faz com que as proteínas (por exem-plo, Proteína A) eluírem mais cedo e compostos contendo carboidrato eluí-rem subseqüentes às proteínas. É preferencial que a resina de hidroxiapatitatenha uma altura do leito de resina de cerca de 20 cm em uma coluna decromatografia. Uma vez que o filtrado da Proteína A vegetariana é aplicado àresina de hidroxiapatita, é lavado com um tampão e, em uma modalidade dainvenção, o tampão é 14 mM de fosfato de sódio em pH 6,8. Em uma moda-lidade preferenciai, a Proteína A vegetariana é então eluída da coluna dehidroxiapatita usando 370 mM de fosfato de sódio em pH 6,8.

Depois da purificação a Proteína A vegetariana pode ser con-centrada um volume e/ou concentração apropriados desejados para arma-zenamento ou uso. Mecanismos para concentrar proteínas são bem conhe-cidos na técnica e tipicamente envolvem filtros ou centrifugação. Em umamodalidade da invenção, a solução de Proteína A vegetariana é concentradadepois da cromatografia de permuta de ânions, enquanto em outra modali-dade a solução de Proteína A vegetariana é concentrada depois da croma-tografia de hidroxiapatita. O eluente de Proteína A vegetariana pode serconcentrado usando um filtro de 10.000 MWCO para obter 5 a 20 mg/mL deuma preparação de Proteína A vegetariana em uma modalidade preferencialda invenção. De modo a usar a Proteína A vegetariana em aplicações nasquais é requerido pH fisiológico, o pH da Proteína A vegetariana concentra-da pode ser ajustado para pH neutro, preferencialmente usando tampão defosfato.

COMPOSITCÕES E MÉTODOS DE TRATAMENTO

A presente invenção adicionalmente refere-se a uma Proteína Avegetariana produzida pelos métodos da invenção. A Proteína A vegetarianapode ser administrada diretamente aos pacientes ou, mais preferencialmen-te, combinada com um veículo adequado. Deste modo, a invenção tambémrefere-se a uma composição farmacêutica compreendendo a Proteína A ve-getariana e um veículo adequado. Veículos farmacêuticos adequados (porexemplo, contas de agarose Glyoxal ou Eupergit) são conhecidos na técnicae variam de acordo com a via de administração.

A presente invenção adicionalmente refere-se a métodos paratratar um paciente com composições farmacêuticas de Proteína A vegetaria-na. Em uma modalidade, a um paciente que necessite da mesma é adminis-trada uma composição farmacêutica de Proteína A vegetariana. Em outramodalidade, ao paciente é administrada uma composição farmacêutica deProteína A vegetariana de modo a estimular a produção de citocina ou crio-globulina. Mais preferencialmente, o paciente é tratado desta maneira paracombater uma infecção ou reforçar um sistema imune comprometido. Acomposição farmacêutica de Proteína A vegetariana é administrada confor-me apropriado e conforme determinado por uma pessoa versada na técnica,mas um método mais adequado para administração é por injeção na corren-te sangüínea do paciente.A presente invenção também refere-se a Proteína A vegetarianaimobilizada a uma resina de cromatografia.

A resina à qual a Proteína A vegetariana é imobilizada pode sertão pequena quanto 40 micra ou tão grande quanto 300 micra. Em uma mo-dalidade da invenção, a resina é um polímero sintético (por exemplo, polime-tacrilato), um polímero semissintético (por exemplo, poligalactose) ou ummaterial amorfo (por exemplo, terra diatomácea ou sílica). Em uma modali-dade adicional da invenção, a Proteína A vegetariana-resina pode ser pro-duzida reagindo um grupamento carboxila ou amino sobre a Proteína A ve-getariana com um grupamento quimicamente funcional sobre a resina decromatografia. Em uma modalidade preferencial da invenção, grupamentoscarboxila da Proteína A vegetariana são reagidos com grupamentos aminosobre a resina para produzir a Proteína A vegetariana-resina. Em outra mo-dalidade, a resina pode ser ativada com triazina e a Proteína A reagida coma triazina ligada à resina. Em ainda outra modalidade, podem ser obtidostítulos muito elevados de ligação de Proteína A com meio ativado por aldeí-do ou meio de carboidrato primeiro oxidando a resina com periodato de só-dio, seguido por redução da Proteína A sobre o meio usando ascorbato ouboridrato de sódio. Na modalidade mais preferencial, a Proteína A vegetaria-na é fixada à resina em múltiplos locais na proteína para minimizar a Iixivia-ção da Proteína A da resina.

A presente invenção também refere-se a um método para ligaranticorpos ou fragmentos de anticorpos à Proteína A vegetariana-resina. Ostermos "anticorpo" e "fragmentos de anticorpo" pretendem englobar tantoanticorpos policlonais quanto monoclonais. Além disso, o termo anticorpoconforme usado aqui, neste requerimento de patente, também engloba vá-rios tipos de anticorpos, inclusive anticorpos humanos, quiméricos, humani-zados, primatizados, folheados ou de cadeia única. Os anticorpos ou frag-mentos de anticorpos podem ser ligados a uma Proteína A vegetariana-resina aplicando os anticorpos ou fragmentos de anticorpos à Proteína Avegetariana-resina por meio de métodos conhecidos na técnica. Por exem-plo, anticorpos são tipicamente ligados à resina aplicando uma solução deanticorpos à resina sob condições tais que os anticorpos ligam a resina elavando a resina ligada a anticorpo com o tampão apropriado para removermaterial não ligado. Em uma modalidade, os anticorpos ou fragmentos deanticorpos são ligados à Proteína A vegetariana-resina de modo a purificaros anticorpos.

A presente invenção adicionalmente refere-se a uma composi-ção farmacêutica compreendendo anticorpos ou fragmentos de anticorpospurificada usando a Proteína A vegetariana-resina e um veículo adequado(por exemplo, contas de silícia Dohkai Microsphere). Anticorpos podem serpurificados por métodos bem conhecidos de uma pessoa versada na técni-ca. De fato, a purificação de anticorpos usando uma Proteína Α-resina decromatografia é um dos métodos mais amplamente usados para fazer isto eos métodos são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Harlow, E.,and Lane, D.P., Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory1 Cold SpringHarbor, New York (1988)). A invenção adicionalmente refere-se a tratar umpaciente que necessite da mesma com uma composição farmacêutica dosanticorpos purificados ou fragmentos de anticorpos em um veículo adequa-do. Há muitas doenças nas quais os anticorpos purificados podem ser usa-dos como um tratamento inclusive doença inflamatória (por exemplo, doençade Crohn, doença de Behcet e colite), doença reumática, esclerose múltipla,doença de Alzheimer, Lúpus, câncer, distúrbios da pele e alergia. Em umamodalidade particular da invenção, o paciente é tratado para câncer.

A presente invenção também refere-se a uma composição far-macêutica compreendendo a Proteína A vegetariana-resina e um veículoadequado e métodos para tratar um paciente que necessite da mesma ad-ministrando a composição farmacêutica de Proteína A vegetariana-resina.Em uma modalidade do método, o paciente é tratado para hemofilia adquiri-da. Em outra modalidade da invenção o paciente é tratado para doença au-toimune ou problemas imunorrelacionados. Em uma modalidade adicional dainvenção, a doença autoimune é artrite reumatóide ou cardiomiopatia dilata-da. Em ainda outra modalidade da invenção, o problema imunorrelacionadoé doença de enxerto versus hospedeiro ou rejeição de órgãos transplanta-dos.

VEÍCULOS ADEQUADOS E MODOS DE ADMINISTRAÇÃO

De acordo com os métodos, composições farmacêuticas de Pro-teína A vegetariana ou anticorpos purificados ou fragmentos de anticorpospodem ser administrados a um paciente por uma via apropriada, quer sozi-nhas ou em combinação com outro fármaco. Uma quantidade eficaz de umacomposição farmacêutica (por exemplo, Proteína A vegetariana, Proteína Avegetariana imobilizada a uma resina de cromatografia ou anticorpos purifi-cados usando uma Proteína A vegetariana-resina) é administrada a um pa-ciente. Uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para obter o efei-to terapêutico ou profilático desejado, sob as condições de administração, talcomo uma quantidade suficiente para estimular células imunes ou ligar pro-teínas relacionadas com doença. As composições farmacêuticas podem seradministradas em uma única dose ou em múltiplas doses para assegurarque o paciente mantenha altos níveis plasmáticos das composições farma-cêuticas de Proteína A vegetariana ou de anticorpos purificados por ProteínaA vegetariana durante a terapia. A dosagem pode ser determinada por meiode métodos conhecidos na técnica e depende, por exemplo, do agente emparticular escolhido, da idade do sujeito, do peso corporal, da sensibilidade eda tolerância a fármacos, e do bem-estar geral. Dosagens adequadas paracomposições farmacêuticas compreendendo Proteína A vegetariana podemser de cerca de 0,001 miligramas / quilograma (mg/kg) até cerca de 10mg/kg de peso corporal por tratamento e para anticorpos purificados usandoProteína A vegetariana de cerca de 0,01 mg/kg aé cerca de 100 mg/kg depeso corporal por tratamento.

São possíveis uma variedade de vias de administração inclusive,por exemplo, vias de administração oral, dietética, tópica, transdérmica, re-tal, parenteral (por exemplo, intravenosa, intraaterial, intramuscular, injeçãosubcutânea, injeção intradérmica), e inalação (por exemplo, inalação intra-bronquial, intranasal ou oral, gotas intranasais), dependendo do agente e dadoença ou condição a ser tratada. A administração pode ser local ou sistê-mica conforme indicado. O modo de administração preferencial pode variardependendo do agente em particular escolhido, e da doença em particularsendo tratada; no entanto, geralmente é preferencial a administração oral ouparenteral.

Formulações de composições farmacêuticas de Proteína A ve-getariana e anticorpos purificados variarão de acordo com a via de adminis-tração selecionada (por exemplo, solução, emulsão ou cápsula). Veículosfarmacêuticos adequados podem conter ingredientes inertes os quais nãointeragem com as composições farmacêuticas de Proteína A vegetariana ouos anticorpos purificados por Proteína A vegetariana. Podem ser emprega-das técnicas de formulação farmacêutica de rotina, tais como as descritasem Remington1S Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eas-ton, PA. Veículos farmacêuticos adequados para administração parenteralincluem, por exemplo, água esterilizada, salina fisiológica, salina bacteriostá-tica (salina contendo cerca de 0,9% mg/ml de álcool benzílico), salina tam-ponada com fosfato, solução de Hank, Iactato de Ringer e similares. Méto-dos de composições de encapsulação (tais como em um revestimento degelatina dura ou ciclodextrano) são conhecidos na técnica. Para inalação, oagente pode ser solubilizado e carregado para dentro de um dispensadoradequado para administração (por exemplo, um atomizador ou nebulizadorou dispensador de aerossol pressurizado.

Os exemplos seguintes são oferecidos a título de ilustração dainvenção e não pretendem limitar a invenção de nenhum modo.EXEM PLIFICACÃOEXEMPLO 1

Os componentes do caldo de fermentação no quais os S. aureusforam cultivados para produzir Proteína A vegetariana estavam em cerca deuma concentração de 50 gramas / litro de extrato de levedura, 15 gramas /litro de peptídeos da soja e 5 a 10 gramas / litro de glicose. Em particular,para fermentação de lote de fabricação, o meio vegetariano continha os ma-teriais nas concentrações identificadas na Tabela 1.TABELA 1. MATERIAIS PARA O CALDO DE FERMENTAÇÃO

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EXEMPLO 2

As condições para a fermentação de S. aureus produtor de Pro-teína A vegetariana em fermentação de lote de fabricação são listadas na

Tabela 2.

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EXEMPLO 3

TESTE DA ATIVIDADE DE PROTEÍNA A VEGETARIANA

A atividade e a produção de Proteína A em cada estágio foramdeterminadas usando um teste simples. Uma pequena coluna de IgG-Sefarose foi verificada para atividade de ligação e capacidade de ligaçãousando Proteína A produzida por métodos de rotina. Uma amostra contendouma quantidade de Proteína A subsaturante foi aplicada, a coluna foi lavada,a Proteína A foi eluída com tampão de glicina pH 2.2 e a concentração deProteína A foi determinada por OD275· Este teste foi usado do início ao fimpara determinar a atividade e a produção de Proteína A vegetariana. Alterna-tivamente, tudo menos extratos brutos pode ser quantificado mais conveni-entemente usando HPLC e cromatografia de coluna de fase reversa, depermuta iônica ou de exclusão de tamanho.

CROMATOGRAFIA DE PERMUTA DE ÂNIONS MACROPREP HIGH Q

Depois de avaliar uma variedade de resinas de cromatografiadisponíveis comercialmente (Mallinckrodt, EMD, BioRad, Millipore), foi sele-cionada a resina de cromatografia de permuta de ânions BioRad MacroPrepHigh Q (quarternária). Caldo diafiltrado foi aplicado a uma pequena colunade 67 ml_ usando um sistema de cromatografia automatizado PharmaciaBiotech BioPiIot usando Software Unicorn para gerenciamento da configura-ção (coluna de 1,5 cm X 38 cm; 12 mL/min) e compilação de dados. Depoisde aplicar o caldo diafiltrado, a coluna foi lavada com 6 volumes de colunade TrisHCI a 10 mM pH 7.8. A Proteína A vegetariana ativa foi eluída usando6 volumes de coluna com TrisHCI a 20 mM pH 7.8 + NaCI para 8 mS/cm(gradiente de etapas). A coluna foi subseqüentemente lavada com TrisHCI a20 mM pH 7.8 + NaCI a 0,5 M para remover material marrom que aderiu àmetade superior da coluna. Periodicamente, a coluna pode ser totalmenteextraída usando vários volumes de coluna de NaOH a 0,1 M seguido porlavagem com vários volumes de coluna de TrisHCI a 0,2 M pH 7.8 para ajus-tar o pH e TrisHCI a 10 mM para ajustar a condutividade.

Aproximamente 0,5 gramas (gm) de proteína em 150 mL de cal-do diafiltrado / concentrado foi aplicado a uma coluna de 67 mL contendo106 mg de Proteína A vegetariana. Nas frações selecionadas (corte), 58 mgde Proteína A vegetariana foram recuperados (55%). Aproximamente 28 mgde Proteína A vegetariana estavam contidos em outras frações disponíveis(26%). Apesar de somente o primeiro corte ter sido explorado extensivamen-te, a análise SDS-PAGE sugeriu que frações posteriores também podem seradequadas. Se fosse possível corte de elutriação total, a recuperação entãoseria de 81% para a etapa de cromatografia de permuta de ânions.

A Figura 1 mostra a análise SDS-PAGE realizada sobre caldosem células, caldo diafiltrado, o escoamento principal de MacroPrep Q, evárias frações obtidas da rodada de cromatografia MacroPrep High Q. Nãofoi feita tentativa de ajustar as quantidades de carga portanto várias das a-Iamedas estavam subrecarregadas para uma ou mais bandas. Apesar dasaturação de várias bandas, ainda podem ser feitas algumas observaçõesinteressantes. A análise do perfil sugeriu que a Proteína A vegetariana pode-ria ser responsável por tanto quanto 20% da proteína presente no caldo.

(Não foi feita tentativa de determinar a quantidade de lipídeo ou carboidratopresente muito embora houvesse evidência química indireta de ambos.) Se-gundo, algumas das proteínas evidentes no caldo não se ligam à MacroPrepQ e passaram através da coluna (vide o escoamento principal da coluna).

As frações 5 a 11 foram diluídas e aplicadas a SDS-PAGE No-vex 4 para 12% de gradiente de gel. Estudos anteriores demonstraram umaresposta linear a partir de amostras de 0,05 micrograma (pg) a 2,0 pg usan-do este sistema. Várias bandas menores foram evidentes sob a banda prin-cipal. Isto é típico de Proteína A e representa isoformas que outros estudosdemonstraram estarem presentes em produtos de fermentação. A presençadas isoformas não é devido à degradação que ocorre no processo de purifi-cação a jusante mas, ao invés, provavelmente é devido à degradação duran-te o processo de fermentação uma vez que se sabe que próteses são secre-tadas por S. aureus. Uma varredura de bandas (mais precisa) em oposição auma varredura de linhas da Fração 6 é apresentada na Figura 2. O picoprincipal é responsável por 90,2% da proteína com isoformas sendo respon-sáveis por um adicional de 8,4%. A Fração 7 (perfil não apresentado) teveum pico principal de 96,5% e isoformas de 1,9%. A Fração 8 (perfil não a-presentado) teve um pico principal de 97,4% e isoformas de 1,0%.

A evidência de que as bandas designadas como isoformas ti-nham atividade de Proteína A foi determinada por realização de um Westernblot para atividade de Proteína A o qual é apresentado na Figura 3. Cemnanogramas (ng) e 10 ng de uma amostra reunida de Proteína A vegetarianapreparada por MacroPrep Q em duplicata foi passada sobre um Novex SDS-PAGE 4 para 12% de gel. Padrões de peso molecular pré-manchados fora-om incluídos sobre o gel. Quando a eletroforese do gel estava completa, asamostras de proteína foram transferidas eletroforeticamente (60 V/300mAmp/1 hr) para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 mícron (BioRad)em tampão de transferência de Towbin. A membrana manchada foi lavadaem salina tamponada com TrisHCI e em seguida bloqueada por 1 hora u-sando SuperBIock. Depois de uma lavagem com 0,05% de Tween-20 emsalina tamponada com TrisHCI (TTBS)1 a membrana foi incubada com umconjugado de IgG-Fosfatase Alcalina anticamundongo de coelho por 30 mi-nutos. Depois de duas lavagens de 5 minutos em TTBS, a membrana foiimersa em coloração Vector Black da Vector Labs (BCIP/NBT Substrate Kit.5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato / tetrazólio nitroblue). O subproduto das rea-ções dos substratos com fosfatase alcalina se forma como um precipitadopreto na membrana à medida que uma reação química prossegue e a posi-ção da fosfatase alcalina pode ser identificada. Como a fosfatase alcalinaestava conjugada a IgG de coelho, sua posição identificou a posição da ati-vidade de Proteína A sobre a membrana.

Não somente foi a banda principal de Proteína A vegetariana eProteína A preparada por métodos de rotina (vide Fresenius SpA1 Figura 3)prontamente manchada usando esta técnica, várias bandas menores foramprontamente evidentes logo abaixo da banda principal. Além disso, a bandaprincipal de Proteína A vegetariana passou entre os marcadores de pesomolecular de 50.000 kilodalton (KD) e os de 38.000 KD. A Proteína A prepa-rada por métodos de rotina tem um peso molecular de 47.000 KD conformedeterminado por espectrometria de massa MALDI TOF. Portanto, o Westernblot confirmou que a Proteína A vegetariana era do tamanho esperado.

EXEMPLO 4

HIDROXIAPATITA CERÂMICA TIPO 1

Frações reunidas de MacroPrep Q foram diafiltradas para menosde 2 mS/cm com 14 mM de Fosfato de Sódio (Fosfato de Na) em pH 6.8. Aamostra foi aplicada a uma coluna de cromatografia de HidroxiApatita Cerâ-mica BioRad de 8 mL equilibrada com 14 mM de Fosfato de Na. Um picoraso apareceu durante o escoamento principal. (A BioPiIot usa uma filtro delargura de banda UV de cerca de 260 a 290 nanômetros.) Como o pico eraraso, representou provavelmente um artefato de resíduo de tampão ou al-guma outra condição de tampão, embora pudesse representar um materialreal. A coluna foi então lavada com 5 volumes de coluna de 14 mM de Fos-fato de Na pH 6.8 (1,7 mS/cm). Então a Proteína A vegetariana foi eluídacom 5 volumes de coluna de 370 mM de Fosfato de Na pH 6.8 (25 mS/cm).

Primeiro, a coluna foi carregada com 26 mg de Proteína A vege-tariana, conforme determinado pela prova de atividade, e 27 mg de ProteínaA vegetariana ativa foram recuperados, isto é, houve completa recuperaçãodentro do erro da prova. Amostras do pico principal foram rodadas diluídasou não diluídas, conforme apropriado para carga apropriada, em um NOVEX4 para 12% de SDS-PAGE (vide a Figura 4). Mais uma vez houve uma ban-da principal com várias bandas menores logo abaixo da banda de Proteína Avegetariana principal. Uma banda menor também foi evidente próxima aofundo do gel perto do começo da tintura.

Uma amostra da Fração 2 foi testada para atividade de ProteínaA por Western blot. A bánda principal e isoformas foram prontamente evi-dentes conforme visto na Figura 3. Não foi evidente outra atividade de Prote-ína A no Western blot. Na Figura 5, foi realizada uma análise do perfil sobrecada uma das bandas da Fração 3 sobre o SDS-PAGΕ. A banda principal decada perfil representou 94,9% e 94,6% da proteína presente. As isoformasrepresentaram 2,8% e 2,6%, respectivamente. Portanto, a Proteína A vege-tariana representou cerca de 97% a 98% da proteína presente.

Enquanto esta invenção for particularmente mostrada e descritacom referências às modalidades preferenciais da mesma, será entendido poraqueles versados na técnica que podem ser feitas várias alterações na for-ma e detalhes na mesma sem se afastar do âmbito da invenção englobadopelas reivindicações anexadas.

Claims

1. Método para produzir proteína A vegetariana, caracterizadopelo fato de que compreende fermentar uma cepa secretora de Staphylo-coccus aureus (S. aureus) em um meio contendo aminoácidos ou peptídeosvegetarianos, o referido meio estando livre de produtos animais, para produ-zir proteína A; cultivar o meio contendo proteína A; e purificar a proteína Aaplicando o meio contendo proteína A a uma resina de cromatografia sintéti-ca desprovida de produtos animais e eluindo a proteína A da resina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a S. aureus é a cepa secretora Staph Imre.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a semente de S. aureus usada para inocular o fermentador émantida em meio vegetariano.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que as S. aureus são fermentadas por 10 a 24 horas.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que as S. aureus são fermentadas por 13 a 14 horas.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o pH do meio contendo proteína A é ajustado para cerca de 7,5a 8,5 e a condutividade é ajustada para menos de 2 miliSiemens/centímetropor diafiltração usando 10 milimolares de Hidroximetilamino metano e NaCI.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que o meio contendo proteína A é aplicado a uma resina de croma-tografia de permuta de ânions para purificação.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que a cromatografia é realizada em um índice de fluxo linear de cer-ca de 5,7 a 7,9 centímetros/minuto sobre uma coluna de cerca de 24 centí-metros de altura.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a proteína A é eluída da coluna de cromatografia usando no mí-nimo 20 milimolares de TrisHCI e NaCI em uma condutividade de cerca de 8miliSiemens/centímetro.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que o pH do eluente da proteína A é ajustado para cerca de pH 6,5 a7,1 e uma condutividade de cerca de 1 a 2 milli-Siemens/centímetro por dia-filtração, com 14 milimolares de fosfato de sódio em pH 6,8.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe-lo fato de que a proteína A é diafiltrada usando uma membrana tendo pontode corte de peso molecular de 10.000.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que compreende, adicionalmente, concentrar o filtrado de proteínaA para cerca de 5 a 20 miligramas/mililitro usando um filtro de peso molecu-lar de 10.000 e ajustando a solução de proteína A para um pH neutro.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe-lo fato de que o pH da solução de proteína A é ajustado para pH neutro u-sando um tampão de fosfato.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que compreende, adicionalmente, aplicar o filtrado de proteína A auma coluna de hidroxiapatita de cromatografia para remover contaminantesnão protéicos e eluir a proteína A da coluna.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe-Io fato de que a proteína A aplicada à coluna é lavada com 14 milimolares defosfato de sódio em pH 6,8 e eluída com cerca de 370 mM de fosfato de só-dio em pH 6,8.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe-lo fato de que a altura do leito da resina na coluna é cerca de 20 centíme-tros.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pe-lo fato de que compreende, adicionalmente, concentrar o eluente da proteínaA da coluna de cromatografia de hidroxiapatita para cerca de 5 a 20 miligra-mas/mililitro usando um filtro de peso molecular de 10.000 e ajustando a so-lução de proteína A para um pH neutro.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe-lo fato de que o pH da solução de proteína A é ajustado para pH neutro u-sando um tampão de fosfato.

19. Método para produzir proteína A vegetariana, caracterizadopelo fato de que compreende fermentar Staph Imre em um meio consistindoessencialmente em extrato de levedura, peptídeos de soja, glicose, e saisessenciais para produzir proteína A;cultivar o meio contendo proteína A;purificar a proteína A aplicando o meio contendo proteína A auma forte resina de permuta de ânions desprovida de produtos animais eeluir a proteína A da resina.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe-lo fato de que a semente de S. aureus usada para inocular o fermentador émantida em um meio vegetariano.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pe-lo fato de que as S. aureus são fermentadas por 10 a 24 horas.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe-lo fato de que as S. aureus são fermentadas por 13 a 14 horas.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que o pH do meio contendo proteína A é ajustado para cerca de-7,5 a 8,5 e a condutividade é ajustada para cerca de menos de 2,0 miliSie-mens/centímetro usando 10 milimolares de TrisHidroximetil-amino metano eNaCI.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pe-lo fato de que a cromatografia é realizada em um índice de fluxo linear decerca de 5,7 a 7,9 centímetros/minuto sobre uma coluna de cerca de 24 cen-tímetros de altura.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pe-lo fato de que a proteína A é eluída da coluna de cromatografia usando nomínimo 20 milimolares de TrisHCi e NaCI em uma condutividade de cercade 18 miliSiemens/centímetro.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pe-lo fato de que o pH do eluente da proteína A é ajustado para um pH de cercade 6,5 a 7,1 e uma condutividade de cerca de 1,0 a 2,0 milli-Siemens/ centí-metro por diafiltração com 14 milimolares de fosfato de sódio em pH 6,8.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pe-lo fato de que o eluente da proteína A é diafiltrado usando uma membranatendo um ponto de corte de peso molecular de 10.000.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pe-lo fato de que compreende, adicionalmente, concentrar o filtrado de proteínaA para cerca de 5 a 20 miligramas/mililitro usando um filtro de peso molecu-lar de 10.000 e ajustando a solução de proteína A para um pH neutro.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pe-Io fato de que o pH da solução de proteína A é ajustado para pH neutro u-sando um tampão de fosfato.

30. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pe-lo fato de que compreende, adicionalmente, aplicar o filtrado de proteína A auma coluna de hidroxiapatita de cromatografia para remover contaminantesnão protéicos e eluir a proteína A da coluna.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pe-lo fato de que o filtrado de proteína A aplicado à coluna é lavado com 14 mi-limolares de fosfato de sódio em pH 6,8 e eluído com cerca de 370 mM defosfato de sódio em pH 6,8.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pe-lo fato de que a altura do leito da resina na coluna é cerca de 20 centíme-tros.

33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pe-lo fato de que compreende, adicionalmente, concentrar o eluente da proteínaA da coluna de hidroxiapatita de cromatografia para cerca de 5 a 20 miligra-mas/mililitro usando um filtro de corte de peso molecular de 10.000 e ajus-tando a solução de proteína A para um pH neutro.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pe-lo fato de que o pH da solução de proteína A é ajustado para pH neutro u-sando um tampão de fosfato.

35. Proteína A vegetariana, caracterizada pelo fato de que éproduzida pelo método como definido na reivindicação 1.

36. Proteína, caracterizada pelo fato de que é uma proteína Avegetariana.

37. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende a proteína A vegetariana como definida na reivindicação 35 eum veículo adequado.

38. Método para tratar um paciente que necessite do mesmo,caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição far-macêutica como definida na reivindicação 37.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pe-lo fato de que o paciente é tratado de modo a estimular a produção de cito-cina ou crioglobulina.

40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pe-lo fato de que o paciente é tratado por causa de uma infecção ou um sistemaimune comprometido.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pe-lo fato de que a composição farmacêutica é administrada por injeção na cor-rente sangüínea do paciente.

42. Proteína A vegetariana de acordo com a reivindicação 35,caracterizada pelo fato de que é imobilizada a uma resina de cromatografiapara formar uma resina de cromatografia de proteína A vegetariana.

43. Resina de cromatografia de proteína A vegetariana comodefinida na reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a resina de cro-matografia é um polímero sintético ou material amorfo.

44. Resina de cromatografia de proteína A vegetariana de acor-do com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o polímero sintéti-co é polimetacrilato ou poligalactose.

45. Resina de cromatografia de proteína A vegetariana de acor-do com reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o material amorfo ésílica ou terra diatomácea.

46. Resina de cromatografia de proteína A vegetariana de acor-do com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que é produzida rea-gindo um grupamento carboxila ou amina sobre a proteína A vegetarianacom um grupamento quimicamente funcional sobre a resina de cromatogra-fia.

47. Método para ligar anticorpos ou fragmentos de anticorpos auma resina de cromatografia, caracterizado pelo fato de que compreendeaplicar os anticorpos ou fragmentos de anticorpos à resina de cromatografiade proteína A vegetariana como definida na reivindicação 43.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pe-lo fato de que os anticorpos ou fragmentos de anticorpos são aplicados àresina de cromatografia de proteína A vegetariana de modo a purificar osmesmos.

49. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende os anticorpos purificados ou fragmentos de anticorpos produzi-dos pelo método como definido na reivindicação 48, e um veículo adequado.

50. Método para tratar um paciente que necessite do mesmo,caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição far-macêutica como definida na reivindicação 49.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pe-lo fato de que o paciente é tratado por causa de câncer.

52. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende a resina de cromatografia de proteína A vegetariana como defi-nida na reivindicação 43 e um veículo adequado.

53. Método para tratar um paciente que necessite do mesmo,caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição far-macêutica como definida na reivindicação 52.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pe-lo fato de que o paciente é tratado por causa de hemofilia adquirida.

55. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pe-lo fato de que o paciente é tratado por causa de doença auto-imune ou pro-blemas imunorrelacionados.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pe-lo fato de que a doença auto-imune é artrite reumatóide ou cardiomiopatiadilatada.

57. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pe-lo fato de que o problema imunorrelacionado é a doença enxerto versushospedeiro.