BRPI0616224A2

BRPI0616224A2 - composto farmacÊutico

Info

Publication number: BRPI0616224A2
Application number: BRPI0616224-0A
Authority: BR
Inventors: Laura Lazo Vazquez; Lisset Hermida Cruz; Carlos Lopez Abarrategui; La Caridad Sierra Vazquez Beatriz De; Ramudo Susana Vazquez; Prado Iris Valdez; Nieto Gerardo Enrique Guillen; Tirado Maria Guadalupe Guzman; Aida Zulueta Morales
Original assignee: Ct Ingenieria Genetica Biotech
Priority date: 2005-09-16
Filing date: 2006-09-18
Publication date: 2013-02-19
Also published as: US7790173B2; PT1944038E; ZA200802740B; ES2444691T3; BRPI0616224B8; EP1944038B1; JP5657204B2; WO2007031034A1; RU2008114841A; DK1944038T3; US20080311157A1; EP1944038A1; MY149395A; JP2009507864A; CN101304760A; MY161452A; CA2622827A1; AU2006291863A1; KR20080048068A; KR20130100026A

Abstract

COMPOSTO FARMACÊUTICO. Nesta invenção se refere a um método de obter a proteína da cápside dos sostipos do vírus da Dengue, que po induzir uma resposta imune protetora fente ao reto no receptor, sem induzir a imuniamplificação dependente de anticorpo. As proteínas recombinantes obtidas podem ser usadas na indústria farmacêutica de modo a obter preparações da vacina da dengue.

Description

"COMPOSTO FARMACÊUTICO" CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito ao campo da biotecnologia e à indústria farmacêutica, em particular à obtenção de proteínas capazes de induzir uma resposta imune protetora em relação à infecção pelo vírus da Dengue, denominado, daqui por diante, DEN, evitando-se os efeitos da amplificação viral dependente dos Acs descritos nas pessoas re-infectadas por este vírus.

TÉCNICA ANTERIOR

A febre da dengue (FD) e a febre hemorrágica da dengue (FHD) adquirem cada vez maior importância como problemas de saúde que afetam numerosos países das zonas tropicais e subtropicais do nosso planeta. A dengue foi reconhecida em mais de 100 países e estima-se que 2 bilhões e 500 milhões de pessoas vivem nas áreas de risco. A cada ano são relatados entre 50 e 100 milhões de casos de FD e 250.000 a 500.000 de FHD (Guzmán, M. G. e Kouri, G. 2002. Dengue: an update. Lancet infect. Dis. 2: 33-42).

O agente causador desta enfermidade é o vírus da dengue, pertencente à família Flaviviridae9 gênero FIavivirus9 o qual é transmitido pela picada do mosquito Aedes Aegypti (Leyssen, P., De Clerco, E., Neyts, J. 2000. Perspectives for the treatment of infections with Flaviviridae. Clin. Microbiol Rev. 13: 67-82).

Até o momento foram relatados quatro sorotipos virais que podem circular em uma mesma região. É um vírus envolvo em ARN positivo, cujo genoma contém um só sinal de leitura que é traduzido na forma de uma poliproteína que é imediatamente processada em três proteínas estruturais e sete não estruturais (Russell, P. K., Brandt, W. E., Dalrymple, J. M. 1980. Estrutura química e antigênica do flavivírus. Os togavírus: biologia, estrutura, replicação. Schelesingers R. W. (ed.) 503-529). 2 V- Foram realizados múltiplos estudos epidemiológicos com o objetivo de se determinar os fatores de risco que levam à forma mais severa da enfermidade, a qual é caracterizada por febre alta, extravasão de líquidos, hemorragias e, finalmente, ao choque pela dengue (Gubler, D. J. 1998, DengueandDengueHemorrhagicFever. Clin. Microbiol Rev. 11: 480-496). Um dos fatores de risco más definido constitui a infecção secundária por um sorotipo heterólogo, o qual implica não existir proteção cruzada entre as infecções dos diferentes sorotipos (Kouri, G., Guzman, M. G., Bravo, J., Trina, C. 1989. Dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome: lessons from the Cuban epidemic. WHOBulletin OMS. 67: 375-380).

Existem várias hipóteses para explicar referido fenômeno, entre as quais destaca-se a amplificação viral dependente de anticorpos (Halstead, S. B., Scanlon, J. E., Umpaivit, P., Udomsakdi, S. 1969. Dengue and Chikungunya vírus infection in man in Thailand9 1962-1964. IV. Epidemiologic studies in the Bangkok metropolitan area. Am. J. Trop. Med.

Hyg 18:997-1021).

A partir dos primeiros estudos foi proposto que o DEN se replicava de uma forma mais acentuada nas células mononucleares periféricas do sangue de pacientes que haviam sofrido de uma infecção anterior por este vírus (Halstead, S. B., 0'Rourke, E. J., Allison, A. C. 1977. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. II. Identity of blood and tissue leukocytes supporting in vitro infection. J. Exp. Med. 146: 218-229). Posteriormente, mostrou-se que os Acs residuais eram os responsáveis por este efeito (Morens, D. M., Halstead, S. B., Marchettes Ν. I 1987. Profiles of antibody- ' dependent enhaneement of dengue virus type 2 infection,. Microb. Pathog

Oct; 3(4): 231-237).

Nas condições de especificidade ou concentração de Acs em que não ocorre a neutralização, os complexos vírus-anticorpo podem ser internalizados pelas células que expressam receptores Fcy em sua superfície, 3 W como os monócitos e os macrófagos. Este mecanismo, conhecido como amplificação dependente de anticorpos (ADA)s ocorre, conforme se propôs, durante as infecções secundárias (Morens, D. M., Halstead, S. B., Marchette, N. J. 1987. Profiles of antibody-dependent enhancement of dengue virus type 2 infection. Microb. Pathog. Oct9 3(4): 231-237; Kliks5 S. C., Nimmannitya, S., Nisalak, A., Burke, D. S. 1988. Evidence thar maternal dengue antibodies are important in the development of dengue hemorrhagic fever in infants. Am. J. Trop. Med Hyg. 38: 411-419).

Halstead et ai (Halstead, S. B., Scanlon, J. E., Umpaivit, P., Udomsakdi, S. 1969. Dengue and Chikungunya virua infection in man in Thailand, 1962-1964. IV. Epidemiologic studies in the Bangkokmetropolitan area. Am. J. Trop. Med. Hyg. 18: 997-1021), em um estudo de 3 anos em Bancoc, Tailândia, relataram que os índices de hospitalização por infecção com o DEN entre as crianças alcançaram um máximo naquelas com idades entre os 7 e 8 meses de vida. Estes índices foram de quatro a oito vezes maiores do que os observados entre as crianças de 1 a 3 meses, e de duas vezes maiores do que os das crianças de 3 anos. Kliks et ai. (Kliks, S. C., Nimmannitya, S., Nisalak, A., Burke, D. S. 1988. Evidence thar maternal dengue antibodies are important in the development of dengue hemorrhagic fever in infants. Am. J. Trop. Med. Hyg. 38: 411-419) determinaram a relação existente entre os títulos de Acs neutralizantes conta os DEN-2 maternos e as idades de 13 crianças com FHD provocada por infecção com o vírus homólogo. Os resultados mostraram que os casos sérios de infecção com o vírus ocorreram quando os níveis de Acs maternos haviam sido reduzidos consideravelmente até alcançar níveis subneutralizantes. Estes dados são consistentes com a hipótese de que os Acs maternos desempenham um papel duplo de proteger no início e de aumentar posteriormente o risco de desenvolver a FHD.

Apesar da existência deste fenômeno, na atualidade os candidatos vacinais mais avançados no mundo correspondem às cepas dos vírus atenuados dos quatro sorotipos virais que contêm a proteína do envoltório. Estes candidatos são capazes de induzir anticorpos potencialmente imunoamplificadores contra as proteínas expostas (PrM/M e Envoltório), e anticorpos neutralizantes protetores contra os quatro sorotipos virais (Kanesa- thasan, N., Sun, W., Kim-Ahns G., Van Albert, S., Putnaks J. R., King, A., Raengsakulsrachs B.s Christ-Schmidts H., Gilson, K.s Zahradniks J. M., Vaughn, D. W., Innis, B. L.s Saluzzo, J. F. e Hokes C. H. 2001. Safety and immunogenicity of attenuated dengue virus vaccines (.Aventis Pasteur) in human volunteers. Vaccine. 19: 3179-3188). Se se conseguisse induzir altos níveis de Acs neutralizantes após a imunização, estes impediriam a replicação viral diante da infecção, apesar da indução dos Acs imunoamplificadores. O problema pode aparecer quando não se consegue a soro-conversão total para os quatro sorotipos nos vacinados em termos de Acs neutralizantes, os quais, à medida em que passe o tempo, se reduzem a baixos níveis no sangue e os indivíduos se transformariam então em suscetíveis a uma infecção secundária grave com o sorotipo viral, cujos anticorpos protetores não estivessem presentes. Isto feito, vários ensaios em macacos e em seres humanos foram realizados para definir as quantidades virais nas formulações de vacina (Guirakhoo, F., Arroyo, J., Pugachevs Κ. V., Millers C.s Zhangs Z.-X.s Weltzins R., Georgakopoulos, K., Catalans J.s Ocran, S.s Soikes Ks Raterrees M.s Monath, Τ. P. 2001. Constructionf safety, and immunogenicity in nonhuman primates of a chimeric yellow fever-dengue virus tetravalent vaccine. J. ViroL 75: 7290-7304). Em alguns casos não se conseguiu a soro- conversão balanceada contra os quatro sorotipos (Sabchareons A., Lang, J., Chanthavanich, P.s Yoksan, S., Forrat, R., Attanath, P., Sirivichayakul, C., Pengsaa, K., Pojjaroen-Anant, C.,Chokejindachai, W., Jagsudee, A., Saluzzo, J. F., Bhamarapravati, N. 2002. Safety and Immunogenicity of tetravalent Iive- attenuated dengue vaccines in Thai adult volunteers: role of serotype concentration, ratio, and multiple doses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 66(3): 264- 272). Adicionalmente, foi necessário administrar até três doses de vacinas atenuadas em crianças para uma soro-conversão total em termos de neutralizantes de Acsi e ainda ficou sem se saber se estes perdurarão no tempo (Sabchareon, A., Lang, J., Chanthavanich, P., Yoksans S., Forratj R., Attanaths P.s Sirivichayakul, C., Pengsaas K., Pojjaroen-Anant, C.s Chambonneaus L.s Saluzzo, J. F., Bhamarapravati, N. 2003. Safety and Immunogenicity of a three dose regimen of two tetravalent live-attenuated dengue vaccines infive- to twelve-year-old Thai children. Pediatr. Infect Dis. J.; 23(2): 99-109). Este é um dos aspectos mais questionados atualmente nas formulações que incluem a proteína do envoltório do vírus Dengue es por conseguinte, dos candidatos à vacina em desenvolvimento.

Outros dentre os aspectos negativos que apresentam as vacinas atenuadas atualmente na fase I/II é a segurança. Foi demonstrado em vários estudos que existem efeitos adversos em adultos e em crianças (febre, mialgia, petéquias e cefaléia) depois da inoculação da primeira dose (Sabchareon, A., Langs J., Chanthavanich, P., Yoksan, S., Forrat, R., Attanath, P.s Sirivichayakul, C., Pengsaa, K., Pojjaroen-Anant, C., Chambonneau, L., Saluzzo, J. F., Bhamarapravati, N. 2004. Safety and Immunogenicity of a three dose regimen of two tetravalent live-attenuated dengue vaccines infive- to twelve-year-old Thai children. Pediatr. Infect Dis. J.; 23(2): 99-109). Em geral, podem-se apresentar os fenômenos de reversão à virulência potencialmente associados com as vacinas vivas.

Na procura de novas alternativas, desenvolveram-se variantes diferentes de candidatos à vacina com base na proteína do envoltório ou dos fragmentos desta obtidos de maneira recombinante. Se bem que estas estratégias evitem os problemas de segurança relacionados com a inoculação dos vírus vivos, elas apresentam a mesma desvantagem de sensibilizar potencialmente o indivíduo quando se perda na formulação tetravalente ou V não se introduza, uma resposta equivalente de Acs neutralizantes contra os quatro sorotipos (Velzings J., Groen5 J., Drouetj M. T., van Amerongen5 G., Copra, C., Osterhaus, A. D., Deubel, V. 1999. Induction of protective immunity against Dengue virus type 2: comparison of candidate Hve attenuated and recombinant vaccines. Vaccine. 17 de Março; 17(11-12): 1312-1320). Por outro lado, com aqueles candidatos em que se obtém uma resposta soro-tipo-esecífica, necessita-se adjuvantes potentes para se obter uma resposta imune protetora adequada, os quais não se acham aprovados para uso em seres humanos (Hermida, L., Rodriguez, R., Lazo, L., Silva, R., Zulueta, A. Chinea, G., Lopez, C., Guzman, M. G., Guillen, G. 2004. A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice. J. Virol Methods. Janeiro de 2004; 115(1): 41-49).

Não obstante a resposta humoral, em termos de Acs neutralizantes, tenha sido extensamente estudada em animais, e tenha sido demonstrado seu efeito protetor, a resposta imune citotóxica celular como mecanismo de proteção na dengue não foi profundamente explorada. Ao contrário, existem vários relatos em que se correlaciona a indução de uma resposta celular com a forma mais grave da enfermidade (Rothman, A. L. e Ennis, F. A. 1999. Immunopathogenesis of Dengue Hemorragic Fever. Virology. 257: 1 a 6). Estes estudos se baseiam na presença de altos níveis de células T ativadas naqueles indivíduos que apresentam febre hemorrágica da dengue (Green, S., Pichyangkul, S., Vaughn, D. W., Kalayanarooj, S., Nimmannitya, S., Nisalak, A., Kurane, I., Rothman, A. L., Ennis, F. A. 1999. Early CD69 expression on peripheral blood lymphoeytes from children with dengue hemorrhagiefever. J. Infect Dis. 180(5): 1429-1435).

Foram relatados epítopos de células T principalmente nas proteínas não estruturais, ressaltando-se a proteína NS3 (Kuranei I., Zeng, L., Brinton, Μ. A., Ennis, F. A. 1998. Definition of an epitope on NS3 reeognized t by human CD4+ cytotoxic T Lymphocyte clones cross-reactive for dengue virus types 2, 3, and 4. Virology. 20 de janeiro de 1998; 240(2): 169-174).

Também foram relatados epítopos de células T, principalmente nas proteínas não estruturais, salientando-se a proteína NS3 (Kuranej I., Zengs L., Brintonj Μ. A., Ennisj F. A. 1998. Definition of an epitope on NS3 recognized by human CD4+ cytotoxic TLymphocyte clones cross-reactive for dengue virus types 2, 3, and 4. Virology. 20 de janeiro de 1998; 240(2): 169- 174).

Também foram relatados epítopos de células T nas proteínas estruturais do envoltório e da cápside viral (Bukowski, J. F., I. Kuranej C.-J. Lai, M. Bray, Bj Falgout e F. A. Ennis. 1989. Dengue virus-specific cross- reactive CD8 human cytotoxic T lymphocytes. J. Virol 63: 5086-5091; Gagnonj S. J., Zeng, W., Kuranej I., Ennisj F. A. 1996. Identification oftwo epitopes on the dengue 4 virus capside protein recognized by a serotype- specific and a panei of serotype-cross-reactive human CD4+ cytotoxic T- lymphocyte clones. J. Virol 70: 141-147). Não obstante, não se demonstrou o caráter protetor de algumas destas proteínas através da indução de uma só resposta imune celular.

Na procura de candidatos da vacina que citem o fenômeno da imunoamplifícação, foram realizados procedimentos com as proteínas não estruturais NSl e NS3. No caso da proteína NSl, foram alcançados níveis de proteção em ratos pela imunização com a proteína obtida por via recombinante e com formulações de DNA desnudo contendo o gene de NSl através do mecanismo de ADCC (Wu, S. F., Liao, C. L., Linj Y. L., Yehs C. T.s Chen, L. K.s Huangs Y. F.s Chous H. Y.s Huangj J. L., Shaios M. F., Sytwu, Η. K. 2003. Evaluation of protective efficacy and immune mechanisms of using a non-structural protein NSl in DNA vacine against dengue 2 virus in mice. Vaccine. 8 de setembro; 21(25-26): 3919-3929). Entretanto, existem relatos de sua possível relação em fenômenos de autoimunidade por causa da indução de Acs que reconhecem células endoteliais humanas (Chiou-Feng Lin, Huan-Yao Lei, Ai-Li Shiaus Hsiao-Sheng Liuj Trai-Ming Yehs Shun-Hua Chen, Ching-Chuan Lius Shu-Chen Chiu e Yee-Shin Lin. 2002. Endothelial Cell Apoptosis Induced by Antibodies Against Dengue Virus nonstructural Protein 1 Via Production of Nitric Oxide. J. Immunol 657-664).

Adicionalmente, existe um relato de proteção com uma formulação de DNA desnudo contendo o gene da proteína NS3s não obstante tenha sido evidenciado que esta proteção era mediada pelos Acs gerados, já que se pretendeu a mesma proteção com imunização passiva (Tan, C. H., Yap, E. H., Singh, M., Deubel, V.s Chan5 Y. C.1990. Passive protection studies in mice with monoclonal antibodies directed against the non- structural protein NS3 of dengue 1 vírus. J. Gen. Virol Março de 1990; 71 (Pt 3): 745-749). Deve-se ressaltar, além disso, que a hipótese de que a resposta celular possa ser potencialmente nociva frente a uma infecção com vírus heterólogo, baseia-se nos estudos dos epítopos contidos na proteína NS3 (Zivny, J., DeFronzo, M., Jarrys W., Jameson, J.s Cruz, J.s Ennis, F. As Rothman, A. L. 1999. Parcial agonist effect influences the CTL response to a heterologous dengue virusserotype. J. Immunol 1 de setembro; 163(5): 2754- 2760).

Quanto à proteína da cápside do vírus da dengue, não foi relatada nenhuma evidência de proteção frente a provocação com o vírus letal da dengue. Quanto aos flavivírus relacionados, foi publicado um relato onde ratos foram inoculados com uma formulação de DNA desnudo contendo o gene da proteína da cápside do vírus da Encefalite Japonesa (JE). Referida construção não foi capaz de induzir uma resposta protetora diante da provocação com o vírus de JE letal em ratos, apesar da demonstração da indução de uma resposta citotóxica (Konishi, E., Ajiros N.s Nukuzumas C.s Masons P. W., Kuranes I. 2003. Comparison of protective efficacies of plasmid DNAs encoding Japanese encephalitis vírus proteins that induce Ή W

neutralizing antibody or citotoxic T lymphocytes in mice. Vaccine. 8 de setembro; 21(25-26): 3675-3683).

A proteção com cápsides recombinantes foi demonstrada unicamente no caso do vírus do papiloma humano, embora se tenha sugerido seu possível papel protetor com outros vírus como o vírus da Hepatite C. Não obstante, em todos os casos, existe a correspondência com infecções crônicas ou tumores nos quais a resposta celular citotóxica é a única arma do sistema imune capaz de dissipar a infecção viral (Duenas-Carrera, S., Alvarez- Lajoncheres L., Alvarez-Obregons L C., Herrerai A., Lorenzo5 L. J.s Pichardo, D., Morales, L 2000. A truncated variant of the hepatitis C vírus core induces a slow but potent immune response in mice following DNA immunization. Vaccine. 22 de novembro; 19(7-8); 992-997; Suzich, J. A., Ghin, S. J., Palmer-Hillj F. J., et ai. 1995. Systemic immunization with papillomavírus Ll protein completely prevents the development of viral mucosal papillomas. Proe. Natl Acad Sei. USA; 92: 11553-11557).

Estes tipos de enfermidades não correspondem com o perfil agudo que se apresenta na infecção por dengue em seres humanos (Vaughn, D. W., Greens S., Kalayanarooj, S., Innis, B. L., Nimmannitya, S., Suntayakoms S., Endy, T. P., Raengsakulrach, B., Rothmans A. L., Ennis, F. A. e Nisalaks A, 2000. Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. J. Infect Dis. 181: 2-9).

A proteína da cápside do vírus da dengue tem um peso molecular de 9 a 12 kDa (112-127 aminoácidos) e um caráter básico marcante, já que os 25% de seus aminoácidos são arginina e lisina. A presença destes Aas poderia favorecer as apresentações antigênicas ao sistema imune, tendo em vista ter sido relatada a capacidade dos peptídeos policatiônicos de exercerem referida função (Lingnau, K., Egyed, A., Schellack, C., Mattners F., Buschles M., Schmidts W. 2002. Poly-I -arginine synergizes with oligodeoxynucleotides containing CpG-motifs (CpG-ODN) Ή 10

-W

for enhanced and prolonged immune responses and prevents the CpG-ODN- induced systemic release of pro-inflamatory cytokines. Vaccine. 20: 3498- 3508. A proteína encontra-se totalmente no interior da estrutura do vírion, sem nenhuma região exposta (Kuhn, R. J., Zhangj W., Rossmann, M. G., Pletnevs S. V., Corvers J., Lenches, E., Jones, C. T., Mukhopadhyay5 S., Chipman, P. R., Strauss, E. G., Baker, T. S., Strauss5 J. H. 2002. Structure of dengue virus:implications for flavivirus organization, maturation, andfusion. Cell Mar 8; 108(5): 717-725).

Jones e colegas (Christopher T. Jones, Lixin Ma, John W. Burgner, Teresa D. Groesch, Carol B. Post e Richard J. Kuhn. 2003. Flavivirus Capsid is a Dimeric Alpha-Helical Protein. Journal of Virologyy pp. 7143-7149, Volume 77, ns 12) purificaram a proteína da cápside de VD2 obtida por via recombinante em Escherichia eoli (E. eoli) e demonstraram que esta proteína se comporta como um dímero em solução na ausências de ácidos nucléicos. Sua estrutura secundária é na maioria na forma de alfa-hélices e é composta de quatro delas, encontrando-se a de maior comprimento na extremidade C-terminal. A extremidade N-terminal não apresenta estrutura definida e sua supressão não afeta a integridade estrutural da proteína.

Na presente invenção se descreve pela primeira vez que a cápside do vírus DEN-2, obtida de forma recombinante na bactéria E. eoli e com somente uns 40% de pureza, é capaz de induzir uma reposta imune protetora diante da provocação com o vírus DEN-2 letal em ratos. Foi demonstrado que referida proteína altamente purificada conservou sua capacidade protetora, a qual foi superada com a imunização dos ratos com a forma particulada da molécula. Por outro lado, foi demonstrado que a proteção obtida foi mediada pelas células CD8+, elemento novo se levarmos em conta que os epítopos das células T relatados até o momento para a cápside são reconhecidos pelas células T CD4+ (Gagnon, S. J., Zeng, W., Kurane, I., Ennis, F. A. 1996. Identification of two epitopes on the dengue 4 to

virus capside protein recognized by a serotype-specific and a panei of serotype-cross-reactive human CD4+ cytotoxic T-Iymphocyte clones. J. Virol 70(1): 141-147; Simmons, C. P., Dong, T., Chau, Ν. V., Dung, Ν. T, Chau, T. N., Thao Ie T. T., Dungj N. T., Hien, T. T., Rowland-Jones, S., Farrar5 J. 2005. Early T-eell responses to dengue virus epitopes in Vietnamese adults with secondary dengue virus infections. J. Virol 79(9): 5665-5675). Adicionalmente, esta molécula recombinante misturou-se com a proteína PD5, a qual é formada pela proteína P64k de Neisseria meningitidis e o domínio III da proteína do envoltório do vírus da dengue 2. Esta proteína de íusão é capaz de gerar uma resposta imune protetora e neutralizadora altamente soro-tipo-esecífica, por meio do que a união com a proteína da cápside geraria uma formulação capaz de induzir uma resposta imune celular e humoral com uma baixa probabilidade de gerar o fenômeno de amplificação dependente de anticorpos (Hermidaj L., Rodriguezj R., Lazoi L., Silva, R., Zulueta, A., Chinea, G., Lopez, C., Guzman, M. G.,Guillen, G. 2004. A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice. J. Virol Methods. Janeiro de 2004; 115(1): 41-49). Igualmente é descrita a obtenção de uma construção genética formada pela fusão do domínio III e a cápside para se obter o mesmo objetivo. Como resultado, foi obtido o fato de que as duas formulações, em que se combinam a cápside e o domínio III da, DEN-2, geraram nos ratos uma resposta linfoproliferativa superior à gerada pela cápside apenas e, além disso, uma resposta de Acs soro-tipo-esecífica superior à gerada unicamente por PD5. Este último resultado torna evidente a capacidade imunopotenciadora da cápside do vírus da dengue na geração de Acs por um antígeno heterólogo, fenômeno descrito para outras cápsides recombinantes provenientes de outros vírus como o da hepatite B (Alvarez, J. C., Guillén, G. Formulações contendo partículas semelhantes ao vírus como imunopotenciadores através da mucosa. Escritório Cubano da propriedade industrial. CU 1998/183). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O objeto desta invenção é a obtenção de uma proteína recombinante correspondente à cápside do vírus da dengue, a qual, ao ser inoculada em ratos, gera uma resposta protetora contra a infecção com o vírus letal.

O gene codificante para a proteína da cápside do vírus da dengue foi introduzido em um plasmídeo contendo o promotor do fago T5. As células XL-I blue, ao serem transformadas com o plasmídeo recombinante, expressaram altos níveis da proteína resultante.

Esta proteína foi semi-purificada até aproximadamente uns 40% de pureza e foi auxiliada com hidróxido de alumínio para sua inoculação em ratos Balb/C. Um mês após a última dose, foi determinada a resposta de Acs antivirais e a resposta linfoproliferativa nos linfócitos de inferiores estimulados in vitro com o vírus da dengue. Como resultado, pôde-se determinar que não foram induzidos anticorpos antivirais e sim uma resposta linfoproliferativa significativa. Paralelamente, nos ratos não analisados, foi realizado o ensaio de proteção. Para isso, inoculou-se uma dose letal correspondente a 100 LD50 do vírus da Dengue e observou-se o aparecimento de sintomas e a morte durante 21 dias. Como resultado, foi obtido uns 44,4% de sobrevida nos ratos imunizados com a cápside recombinante enquanto no grupo de controle negativo todos os ratos morreram. Esta foi a primeira evidência de uma resposta protetora diante do vírus da dengue, por causa unicamente da inoculação com a proteína da cápside.

Em seguida, foi realizado um processo de purificação, com o emprego de procedimentos cromatográficos de alta resolução, obtendo-se um

percentual de pureza > 95%.

Ambas as preparações, a variante semi-puriflcada e a variante purificada foram analisadas por cromatografia em gel em HPLC com o objetivo de se conhecer o estado de agregação da proteína em cada amostra. No caso da preparação semi-purificada, foi detectada uma fração com baixos tempos de retenção, enquanto na amostra da preparação purificada foi detectado um tempo de retenção correspondente à forma dimérica da molécula.

Com o objetivo de se obter um estado de agregação na variante pura, foi realizado um processo de particulação in vitro empregando-se pequenas quantidades de oligonucleotídeos. Como resultado, conseguiu-se obter partículas de aproximadamente 21 nm de diâmetro.

As variantes dimérica e particulada, ambas com mais de uns 95% de pureza, foram inoculadas em ratos. No caso da variante dimérica, foi inoculada com o adjuvante de Freund e hidróxido de alumínio (Alumina), enquanto a variante particulada foi inoculada unicamente em alumina. De forma semelhante ao obtido para a variante impura, foram obtidos altos níveis de linfoproliferação nos linfócitos inferiores estimulados in vitro com o vírus da dengue. Quando da realização do ensaio de proteção, foi determinado que, na variante pura dimérica, foram obtidos níveis de proteção de uns 40% e 20% auxiliada em Adjuvante de Freund e alumina, respectivamente, não obstante a proteína particulada pura e adjuvada em alumina tenha apresentado um percentual de proteção maior.

Estes resultados, combinados com os obtidos com a proteína semi-purificada, demonstram a potencialidade da proteína da cápside em induzir uma resposta protetora em ratos Balb/c, e, por sua vez, que a forma particulada é superior, permitindo, além disso, seu futuro emprego em seres humanos por causa do emprego da alumina como adjuvante. Adicionalmente, o fato de não induzir uma resposta de Acs antivirais eliminaria o fenômeno de amplificação viral dependente de Acs relatado como fator de risco quanto à ocorrência da forma mais severa da enfermidade: a febre hemorrágica da dengue. Com o objetivo de determinar o possível mecanismo de proteção, o qual não esteja relacionado com a indução de Acs por causa da sua ausência demonstrada, foi realizado um estudo de depleção de células CD8+, marcador presente nas células T citotóxicas. Como resultado, foi obtido o fato de que a proteção alcançada com as proteínas puras de cada variante era dependente da presença das células que apresentam referido marcador, já que, ao serem eliminadas, foi eliminado o efeito protetor induzido.

Adicionalmente, foi realizado um estudo para se conhecer se a combinação da cápside recombinante particulada com antígenos indutores da resposta humoral não afetaria a geração da resposta linfoproliferativa e contaria com uma mistura de imunogenes capazes de proporcionar ambos os ramos da resposta imune. Para isso, inocularam-se a variante purificada particulada e uma proteína de fusão contendo o domínio III da proteína do envoltório do vírus da dengue-2, a qual é capaz de gerar uma resposta imune sorotipo específica minimizando também o fenômeno do ADE (Hermida, L., Rodriguez, R., Lazo5 L., Zulueta, A. Chinea, G., Lopez, C., Guzman, M. G., Guillen, G. 2004. A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice. J. Virol Methods. Janeiro de 2004; 115(1): 41-49). Ao se administrar três doses e analisar os Acs gerados, demonstrou-se que foi potencíada a indução de Acs antivirais soro-tipo-esecíficos, produto da inoculação da proteína de fusão. Por sua vez, foi detectada uma resposta linfoproliferativa superior à induzida pela cápside isoladamente, e significativamente maior do que a induzida pela inoculação unicamente da proteína de fusão.

Paralelamente, para se saber se é possível obter-se o efeito da combinação por fusão genética de ambos os antígenos, construiu-se um plasmídeo contendo o Domínio III da proteína do envoltório do vírus DEN-2 15 W fundido ao N-terminal do gene codificador para a proteína da cápside. A proteína resultante, com uns 40% de pureza, também gerou nos ratos Balb/C uma resposta linfoproliferativa superior à obtida com a cápside unidamente, e uma resposta de Acs soro-tipo-esecífica superior à induzida por PD5. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Estratégia de clonagem da cápside do vírus DEN2 para a obtenção de PDC-2 DEN2 C: Fragmento da proteína da cápside do DEN-2.

Figura 2. Análise por SDS-PAGE aos 15% do processo de semi-purificação da proteína PDC-2.

1. Sobrenadante de ruptura. 2 e 3. Fração não adsorvida à matriz Q Sepharose FF. 4. Eluato da matriz com IM de NaCl.

Figura 3. Análise por SDS-PAGE aos 15% do processo de semi-purificação da proteína PDC-2. 1. Sobrenadante de ruptura. 2. Fração não adsorvida à matriz,

3. Lavagem (350 mM de NaCl), 4. Fração eluída (750 mM de NaCl), 5. Fração em Tris 10 mM, EDTA 1 mM.

Figura 4. Perfil cromatográfico da preparação semi-purificada (A) e pura (B) de PDC-2 em superdex 200. Figura 5. Fotografias de microscopia eletrônica da preparação

pura de PDC-2 antes (A) e depois (B) do tratamento com os oligonucleotídeos.

Figura 6. Estratégia de clonagem da cápside do vírus DEN-I para a obtenção de PDC-I DENl C: Fragmento da proteína da cápside do DEN-1.

Figura 7. Análise por SDS-PAGE aos 15% do processo de semi-purificação da proteína PDC-I.

1. Padrão de peso molecular. 2. Sobrenadante de ruptura. 3. Fração não adsorvida à matriz Q Sepharose FF. W EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO Exemplo 1 - Clonagem e expressão de PDC-2.

A seqüência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 1 a 99 da proteína da cápside do vírus DEN-I (Seqüência n- 3) foi amplificada com os oligonucleotídeos identificados na lista de seqüências como Seqüência η- 1 e Seqüência ne2a partir da cepa viral de Den-2 genótipo Jamaica (Deubel, V., Kinney, R. M., Trent5 D. W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 vírus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome. Virology 1988,165:234-244).

O vetor foi gerado por digestão BamHI/HindIII do plasmídeo pQE-30, que contém o promotor do Fago T5 e uma lista de 6 histidinas na extremidade N-terminal (Seqüência n- 6). Depois do processo de ligação, os recombinantes possíveis foram analisados por restrição e os positivos foram seqüenciados para confrontar as uniões.

As células competentes XL-I Blue (Hanahanj D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J.Mol Biol 166: 557- 580) transformaram-se com o clone selecionado denominado pDC-2 (Figura 1 e Seqüência nfí 4). As cepas de E. coli transformadas cresceram em meio Luria Bertani (LB) suplementado com Ampicilina a 50 μ^/ναί durante 10 horas a 37°C. A indução do promotor foi realizada com isopropil-5-D- tiogalactopiranosídeo (EPTG) a uma concentração final de 1 mM. A partir da biomassa obtida foi realizado um SDS-PAGE do cultivo celular e foi obtida uma banda correspondente a uma proteína de aproximadamente 15 kDa, que foi reconhecida por um líquido ascítico hiperimune (LAHI) anti-DEN2 e foi denominado PDC-2 (Seqüência nfi 5). Exemplo 2. Semi-purificacão e caracterização de PDC-2

A biomassa obtida da cepa transformada com PDC-2 e crescida a 37°C9 foi rompida em prensa francesa. A proteína recombinante foi obtida distribuída igualmente entre as frações solúveis e as insolúveis. A partir da fração solúvel realizou-se uma cromatografia de intercâmbio aniônico, com a utilização da matriz Q. Sepharose FF e o tampão Tris 10 mM, pH 8. A proteína, presente na fração não adsorvida na matriz, foi obtida com uns 40% de pureza e foi empregada para realizar os estudos imunológicos (Figura 2).

Exemplo 3. Avaliação imunológica. em ratos, de PDC-2 semi-purificada

Foram utilizados três grupos de 30 ratos Balb/c. Dois deles foram imunizados com 10 ug da proteína recombinante pela via intraperitoneal, com a utilização, como adjuvante em um deles, do adjuvante de Freund e, no outro, do hidróxido de alumínio (Alumina). Como controle negativo, imunizou-se a fração solúvel da ruptura de células XL-I Blue transformadas com o plasmídeo pQE-30 e adjuvadas em adjuvante de Freund. Uma parte dos animais (10 ratos) foi sangrada 15 dias após a terceira dose e foram determinados por ELISA os anticorpos anti-DEN-2. Como se pode observar na Tabela 1, não foram obtidos anticorpos antivirais após a imunização com a proteína recombinante formulada em ambos os adjuvantes. Tabela 1

Títulos de anticorpos contra o vírus DEN-2 dos soros obtidos após a imunização com PDC-2 semi-purifícada._

Rato Títulos ELISÁ contra D£N-2 PDC-2 PDC-2 XL-IBlue Freund A. Hidróxido de alumínio Freund (Controle neg.) 1 <1:100 <1:100 <1: 100 2 < 1:100 <1: 100 <1: 100 3 <1: 100 < 1: 100 <1: 100 4 <1: 100 <1: 100 <1: 100 <1: 100 < 1: 100 <1: 100 6 < 1: 100 <1: 100 < 1: 100 7 <1: 100 < 1: 100 <1: 100 δ <1: 100 < 1: 100 <1: 100 9 < 1: 100 <1: 100 <1: 100 <1: 100 <1: 100 <1: 100

Exemplo 4. Ensaio de Proteção

Para a avaliação da proteção conferida aos ratos ante a %Ύ W

10

15

20

provocação com DEN letal homólogo pela imunização com as variantes descritas, foram utilizados 10 dos ratos dos grupos imunizados com a proteína recombinante adsorvida em alumina e com a preparação de controle. Cada um dos animais recebeu uma dose de 100 LD50 de DEN-2 letal por inoculação intracraniana e foram observados durante 21 dias para se obter os percentuais de letalidade em termos de morte por encefalite viral. Foi utilizado como controle positivo um grupo de 10 ratos imunizados com o vírus DEN-2 infeccioso (IO4 ufp). Todos os ratos do grupo de controle (+) sobreviveram, enquanto os ratos do grupo de controle (-) adoeceram nos 7 a 11 dias posteriores à provocação, obtendo-se uns 100% de mortalidade no 212 dia. Finalmente, o grupo imunizado com a proteína recombinante PDC-2 apresentou uns 44,4% de proteção (Tabela 2). Tabela 2

Percentuais de sobrevida em ratos imunizados com PDC-2 frente à

Imunogene Percentual de sobrevida* XL-I blue 0 DEN-2 100 PDC-2 alum. 44,4

foram tomados 21 depois da provocação. Exemplo 5. Resposta linfoproliferativa

Os animais restantes do grupo imunizado com a proteína da cápside reforçada em alumina foram sacrificados 30 dias após a última dose. Posteriormente, foram extraídos seus baços e estudou-se a resposta linfoproliferativa frente ao vírus da Dengue 2. Os resultados da Tabela 3 refletem os índices de estímulo obtidos. Tabela 3

índices de estímulos frente ao sorotipo homólogo dos linfócitos dos ratos imunizados.

25 W

PDC-2 alumina DEN-2** 8* Antígeno 1,5 Controle*** PHA 7

* índice de estímulo: quociente médio dos conteúdos por minuto das amostras entre os

conteúdos por minuto do controle de síntese espontânea de DNA.

** Preparação do cérebro dos ratos infectados com DEN-2.

*** Preparação do cérebro de ratos não infectados.

**** Mitógeno fitoemaglutinina (Controle positivo).

Exemplo 6. Purificação de PDC-2

A biomassa obtida da cepa transformada com PDC-2 e desenvolvida a 37°C, foi rompida em prensa francesa. A proteína recombinante foi obtida distribuída igualmente entre as frações solúveis e as insolúveis. A partir da fração solúvel realizou-se uma cromatografia de intercâmbio catiônico, com a utilização da matriz SP-Sepharose FF e o tampão Tris 10 mM, Tween 0,5%, uréia 7M, pH 8. A lavagem da coluna foi realizada com o tampão de dietanolamina 30 mM, NaCl 350 mM, pH 10,3- A eluição da proteína de interesse foi realizada com tampão de dietanolamina 30 mM, NaCl 750 mM, pH 10,3. Uma vez eluída a proteína, procedeu-se a uma troca do tampão, utilizando-se colunas de G-25. Finalmente, a proteína foi obtida em uns 96% de pureza no tampão Tris 10 mM, EDTA 1 mM (Figura 3).

Exemplo 7. Caracterização da variante semi-purificada e da purificada.

Com o objetivo de se caracterizar o estado de agregação da preparação semi-purificada e da purificada, foram realizadas cromatografias de filtragem em gel utilizando-se a coluna TSK-5000 (Tosoh bioscience, Japão). Imediatamente após a aplicação da amostra semi-purificada, foi obtido um pico homogêneo e superior, cujo tempo de retenção oscilou entre e 20 minutos, o qual evidenciou a presença de espécies de alto peso molecular (Figura 4A). Contrariamente, na amostra proveniente da fração altamente purificada da proteína da cápside, foram detectados tempos de retenção de 30 minutos correspondentes à forma dimérica da molécula 20 ^5 W

(Figura 4B).

Exemplo 8. Estudos de re-particulação "in vitro

Para a re-particulação da proteína pura da cápside na forma dimérica, foi realizada uma troca de tempão por Hepes 25 mM, KAc 100 raM, MgAc2 1,7 mM, pH 7,4. Depois de aquecer por 1 minuto a 37°C a proteína e a mistura de oligonucleotídeos, estas foram incubadas em igual volume por 30 minutos a 30°C. Como controle negativo da experiência, realizou-se uma incubação de proteína sem oligonucleotídeos. Ambas as preparações foram observadas no microscópio eletrônico, onde foi detectada uma grande quantidade de partículas de aproximadamente 21 nm de diâmetro na amostra de proteína previamente incubada com a mistura de oligonucleotídeos, ao passo que na amostra de controle não foram observadas partículas (Figura 5). Exemplo 9. Avaliação imunológica. em ratos, da cápside purificada.

Foram utilizados cinco grupos de 20 ratos Balb/c. Doius deles foram imunizados com 10 ug da proteína recombinante purificada dimérica pela via intraperitoneal, com a utilização, como adjuvante, da alumina e do Freund. Outro grupo foi imunizado com 10 ug da proteína da cápside purificada e particulada reforçada em alumina. Como controle negativo, imunizou-se a fração solúvel da ruptura de células XL-I Blue transformadas com o plasmídeo pQE-30 submetida aos mesmos procedimentos de purificação que a PDC-2, em adjuvante de Freund. O quinto grupo foi imunizado com vírus DEN-2 como controle positivo. Um mês depois da última dose, 10 animais de cada grupo receberam uma dose de 100 LD50 de DEN-2 letal por inoculação intracraniana e observou-se durante 21 dias para se obter os percentuais de sobrevida. Todos os ratos do grupo de controle (+) sobreviveram, enquanto os ratos do grupo de controle (-) adoeceram nos 7 a 11 dias posteriores à provocação, obtendo-se 0% de sobrevida. Finalmente, dos grupos imunizados com a proteína recombinante, o grupo imunizado com PDC-2 pura dimérica apresentou uns 20% de proteção ao ser imunizada com So alumina, e uns 40% de proteção com o emprego de Freund como adjuvante. Adicionalmente, no grupo que recebeu a proteína pura re-particulada e reforçada em alumina, foram protegidos 90% dos ratos (Tabela 4). Tabela 4

Percentuais de sobrevida em ratos imunizados com as variantes de proteínas

ensaiadas diante da provocação com o vírus den homólogo letal,_

Imunogene

(adjuvante)_

XL-I Blue (Freund) PDC-2 pura dimérica (Alumina) PDC-2 pura dimérica (Freund) PDC-2 pura e re-particulada (Alumina)_

DEN-2__

* Calculou-se: (n2 de ratos sobreviventes) / (n2 total de ratos). Os dados de sobreviventes foram tomados no 2 Ifi dia após a provocação.

Exemplo 10. Resposta linfoproliferativa

Os animais restantes dos grupos imunizados com a proteína da cápside (10 animais), tanto dimérica quanto re-particulada, reforçadas em alumina, foram sacrificados 15 dias após a última dose. Posteriormente, foram extraídas as células do baço e estudou-se a resposta linfoproliferativa quanto ao vírus da Dengue 2 infeccioso. Os resultados da Tabela 5 refletem os índices de estímulo obtidos. Tabela 5

índices de estímulo quanto ao sorotipo homólogo dos linfócitos dos ratos imunizados ___

Percentual de sobrevida*

0_

20

5_

40

90 10

TÕÕ

PDC-2 pura e PDC-2 re-particulada pura DEN-2** 10* 4 Antígeno*** 1,5 1,2 Controle PHA**** 7 8

por minuto do controle de síntese espontânea de DNA. ** Preparação de cérebro de ratos infectados com DEN-2. *** Preparação de cérebro de ratos não infectados. W **** Mitógeno Fitoemaglutinina (Controle positivo).

Exemplo 11, Avaliação imunológica da mistura formada por PD5 E PDC-2

Foram inoculados 20 animais com a mistura de 10 ug da proteína do núcleo, pura particulada, e 20 ug da proteína PD5 (Seqüência 23) em um regime de três doses a cada quinze dias. Foram empregados como controles grupos imunizados com 10 ug da proteína da cápside pura, com 20 ug da proteína PD5 misturada com o volume equivalente de PDC-2, porém proveniente de um conjunto de controle (-) e outro grupo com a proteína P64k, a proteína portadora presente na construção de PD5. Em todos os casos, foi empregada a alumina como adjuvante.

Quinze dias após a última dose, os animais foram sangrados e os soros foram analisados por ELISA para se determinar os anticorpos antivirais. Como se observa nas Tabelas 6 e 7, no grupo imunizado com a mistura foram gerados anticorpos soro-tipo-esecíflcos de títulos superiores aos gerados no grupo imunizado unicamente com a proteína PD5 e, por sua vez, ambos superiores aos gerados com o grupo imunizado com a proteína PDC-2, onde não foram detectados Acs contra o vírus DEN-2.

Por outro lado, foram empregados outros 10 animais de cada grupo para se realizar os ensaios de linfoproliferação. Para isso, foram extraídas as células do baço de cada animal que foram estimuladas com o vírus DEN-2 infeccioso. Como se pode observar na Tabela 8, no grupo imunizado com a mistura foram obtidos índices de estímulo superiores aos detectados no grupo imunizado unicamente com a proteína da cápside. Por sua vez, no grupo imunizado com a proteína PD5, os índices de estímulo foram os mais baixos. Tabela 6

Títulos de anticorpos contra o vírus DEN-2 dos soros obtidos após a imunização W Rato Grupos inoculados com: PDC-2 PDC-2/PD5 PD5 P64k 1 <1:100 <1:128000 <1:64000 <1:100 2 < 1:100 <1:320000 <1:32000 <1:100 3 < 1:100 <1:320000 <1:64000 <1:100 4 <1:100 <1:320000 <1:16000 <1:100 <1:100 <1:64000 <1:64000 <1:100 6 < 1:100 <1:128000 <1:128000 <1:100 7 <1:100 <1:64000 <1:64000 <1:100 8 <1:100 <1:128000 <1:32000 <1:100 9 <1:100 <1:320000 <1:64000 <1:100 < 1:100 <1:320000 <1:32000 <1:100

Tabela 7

Determinação da especificidade do sorotipo dos Acs CONTIDOS NAS

misturas dos soros obtidos de cada grupo

Grupos inoculados com: Antígeno viral PDC-2 PDC-2/PD5 PD5 P64k DEN-I <1: 100 <1:200 <1:200 < 1: 100 DEN-2 <1: 100 1:320 000 1:64000 < 1: 100 DEN-3 <1: 100 <1:200 <1:200 <1: 100 DEN-4 <1:100 <1:200 <1:200 < 1: 100

Tabela 8

índices de estímulo quanto ao sorotipo homólogo dos linfócitos dos ratos imunizados

PDC-2 PDC- 2/PD5 PD5 P64k DEN-2** 9* 11 2,1 1,1 Antígeno*** Controle (-) 1,3 1,6 1,5 1,2 PHA**** 7,5 7,3 7,9 8

por minuto do controle de síntese espontânea de DNA. ** Preparação de cérebro de ratos infectados com DEN-2. *** Preparação de cérebro de ratos não infectados. **** Mitógeno Fitoemaglutinina (Controle positivo).

Exemplo 12. Estudos de deplecão de CDS

As proteínas da cápside re-particulada e dimérica foram

inoculadas em ratos Balb/c com o objetivo de se obter alguma evidência da

indução de resposta celular. Como controle negativo foi empregada uma

preparação obtida das células transformadas com o vetor utilizado para a

geração de pDC-2 e por um processo de purificação semelhante ao realizado 10

15

20

53

para a proteína PDC-2.

Foram administradas em grupos de 20 animais, 3 doses da proteína (20 ug), empregando-se o hidróxido de alumínio como adjuvante. Um mês após a última dose, foi administrado à metade dos animais de cada grupo 1 mg de um AcM de rato fêmea anti-CD8 capaz de depletar as células do sistema imune do rato que contivessem referido marcador. No dia seguinte, todos os animais foram provocados com 100 DL5O (dose letal média) de vírus da dengue-2, foi observado o aparecimento de sinais da enfermidade e foram quantificadas as mortes.

No caso dos grupos imunizados e não tratados, foram obtidos e 80% de proteção nos grupos imunizados com a cápside dimérica e re- particulada, respectivamente. Paralelamente, nos grupos tratados, o percentual de proteção foi menor do que nos não tratados: 0% de proteção para PDC-2 dimérica e 10% de proteção para a proteína re-particulada. No caso do grupo de controle negativo não se obteve proteção alguma, tanto nos animais tratados quanto nos não tratados. Tabela 9

Ensaio de provocação com o vírus DEN-2 letal nos animais imunizados com

Grupo *% de sobrevida em ratos tratados com o AcM anti-CD8 % de sobrevida em ratos não tratados com o AcM anti-CD8 PCD.12 ré-partieulada 10 80 PGDl 2 não paiticulada 0 20 Controle (-) 0 0

25

foram tomados no 2 Ifi dia depois da provocação.

Exemplo 13. Obtenção e semi-purificação da proteína de DEN-I

A seqüência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 1 a 100 da proteína da cápside do vírus DEN-I (Seqüência ne 7) foi amplificada com os oligonucleotídeos identificados na lista de seqüências como Seqüência n~ 8 e Seqüência ns 10 a partir da cepa viral de Den-1. O vetor foi gerado por digestão BamHlfHindlll do plasmídeo PQE-30, que contém o promotor do 3Μ W

Fago Τ5 e uma lista de 6 histidinas na extremidade N-terminal (Seqüência n- 6). Depois do processo de ligação, os recombinantes possíveis foram analisados por restrição e os positivos foram seqüenciados para confrontar as uniões.

As células competentes XL-I Blue (Hanahani D. 1983. Studies

on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol Biol 166: 557- 580) transformaram-se com o clone selecionado denominado pDC-1 (Figura 6 e Seqüência n° 10). As cepas de E. coli transformadas cresceram em meio Luria Bertani (LB) suplementado com Ampicilina a 50 μ/ml durante 10 horas

L

a 37°C. A indução do promotor foi realizada com isopropil-5-D- tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma concentração final de 1 mM. A partir da biomassa obtida foi realizado um SDS-PAGE do cultivo celular e foi obtida uma banda correspondente a uma proteína de aproximadamente 15 kDa, que foi reconhecida por um líquido ascítico hiperimune (LAHI) anti-DENl e foi

denominado PDC-1 (Seqüência ne 11).

Exemplo 14. Semi-purificação e caracterização de PDC-1.

A biomassa obtida da cepa transformada com PDC-1 e crescida a 37°C, foi rompida em prensa francesa. A proteína recombinante foi obtida distribuída igualmente entre as frações solúveis e as insolúveis. A

partir da fração solúvel realizou-se uma cromatografia de intercâmbio aniônico, com a utilização da matriz Q. Sepharose FF e o tampão Tris 10 mM, pH 8. A proteína, presente na fração não adsorvida na matriz, foi obtida com uns 45% de pureza e foi empregada para realizar os estudos imunológicos.

Exemplo 15. Avaliação imunológica da proteína PDC-1 semi-purifícada.

Foram utilizados dois grupos de 30 ratos Balb/c. Um deles foi imunizado com 10 ug da proteína recombinante pela via intraperitoneal, com a utilização da alumina como adjuvante. Como controle negativo, imunizou- se a fração solúvel da ruptura de células XL-I Blue transformadas com o plasmídeo pQE-30, também adjuvadas em alumina. Uma parte dos animais (10 ratos) foi sangrada 15 dias após a terceira dose e foram determinados os anticorpos anti-DEN-1 por ELISA. Como se pode observar na Tabela 10, não foram obtidos anticorpos antivirais após a imunização com a proteína recombinante. Tabela 10

Títulos de anticorpos contra o vírus DEN-I DOS SOROS obtidos após a

imunização com PDC-I purificada.

Rato Títulos ELISA Anti- DEN-I XL-I blue Controle (·) PDC-I 1 <1: 100 <1: 100 2 <1: 100 <1: 100 3 <1: 100 < 1: 100 4 <1: 100 <1: 100 <1: 100 <1: 100 6 <1: 100 <1: 100 7 <1: 100 < 1: 100 B <1: 100 <1: 100 9 <1: 100 <1: 100 <1: 100 <1: 100

Exemplo 16. Ensaio de proteção

Para a avaliação da proteção conferida aos ratos ante a

provocação com DEN letal homólogo pela imunização com as variantes descritas, foram utilizados outros 10 dos ratos dos grupos imunizados com a proteína recombinante adsorvida em alumina e com a preparação de controle. Cada um dos animais recebeu uma dose de 100 LD50 de DEN-I letal por inoculação intracraniana, e observou-se durante 21 dias para se obter os percentuais de letalidade em termos de morte por encefalite viral. Foi utilizado como controle positivo um grupo de 10 ratos imunizados com o vírus DEN-I infeccioso (IO4 ufp). Todos os ratos do grupo de controle (+) sobreviveram, ao passo que os ratos do grupo de controle (-) adoeceram nos 7 a 11 dias posteriores à provocação, obtendo-se 100% de mortalidade no 21° dia. Finalmente, o grupo imunizado com a proteína recombinante PDC-I apresentou 50% de proteção (Tabela 11). Tabela 11.

%

Imunogene Percentual de sobrevida* XL-I Blue O (Controle -) DEN-I 100 (Controle +) PDC-I 50

foram tomados no 2 Ifi dia depois da provocação. Exemplo 17. Resposta linfoproliferativa

Os animais restantes do grupo imunizado com a proteína PDC- 1 foram sacrificados 15 dias após a última dose. Posteriormente5 foram extraídos seus baços e estudou-se a resposta linfoproliferativa frente ao vírus da Dengue 1. Os resultados da Tabela 12 refletem os índices de estímulo obtidos. Tabela 12

índices de estímulo frente ao sorotipo homólogo dos linfócitos dos ratos imunizados

PDC alumina DENl** 8* Antígeno 1,5 Controle*** PHA**** 7

conteúdos por minuto do controle de síntese espontânea de DNA. * * Preparação do cérebro dos ratos infectados com DEN-1. *** Preparação do cérebro de ratos não infectados. *#** Mitógéno fitoèmaglutinina (Controle positivo).

Exemplo 18. Clonagem e expressão de PDC-2 DomIII.

A seqüência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína do envoltório do vírus DEN-2 (Seqüência n- 12), correspondente à região do domínio III da proteína, foi amplificada com os oligonucleotídeos identificados na lista de seqüências como Seqüência ne 13 e Seqüência n- 14 a partir da cepa viral de DEN-2 genótipo Jamaica (Deubel, V., Kinney, R. M., Trent, D. W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 vírus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome. Virology 1988, 165: 234-244).

O vetor foi gerado por digestão BamHVBamHl do plasmídeo pQE-30, que contém o promotor do Fago T5 e uma lista de 6 histidinas na extremidade N-terminal (Seqüência nfi 6) e a região correspondente aos 100 aminoácidos da proteína da cápside do vírus da Dengue 2. Depois do processo de ligação, os recombinantes possíveis foram analisados por restrição e os positivos foram seqüenciados para confrontar as uniões. Finalmente, foi selecionado um clone, o qual foi denominado pDC-2 DomIII (seqüência na 15).

As células competentes XL-I Blue (Hanahan, D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol Biol 166: 557- 580) transformaram-se com o clone selecionado denominado pDC-2 DomIII. As cepas de E. coli transformadas cresceram em meio Luria Bertani (LB) suplementado com Ampicilina a 50 μg/ml durante 10 horas a 37°C. A indução do promotor foi realizada com isopropil-5-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma concentração final de 1 mM. A partir da biomassa obtida foi realizado um SDS-PAGE do cultivo celular e foi obtida uma banda correspondente a uma proteína de aproximadamente 30 kDa, que foi reconhecida por um líquido ascítico hiperimune (LAHI) anti-DEN2 e foi denominado PDC-2 DomIII (Seqüência na 16). Exemplo 19. Semi-purifícacão e caracterização de PDC-2 DomIII.

A biomassa obtida da cepa transformada com PDC-2 e crescida a 37°C, foi rompida em prensa francesa. A proteína recombinante foi obtida distribuída de igual forma entre as frações solúveis e as insolúveis. A partir da fração solúvel realizou-se uma cromatografia de intercâmbio aniônico, com a utilização da matriz Q Sepharose FFq o tampão Tris 10 mM, pH 8. A proteína, presente na fração não adsorvida na matriz, foi obtida com uns 40% de pureza e foi empregada para realizar os estudos imunológicos. Exemplo 20. Avaliação imunológica em ratos de PDC-2 DomIII semi- puri ficada.

Foram utilizados cinco grupos de 30 ratos Balb/c. Um deles foi imunizado com 10 ug da proteína recombinante pela via intraperitoneal, com a utilização da Alumina como adjuvante. Como controle negativo, imunizou- se a fração solúvel da ruptura de células XL-I Blue transformadas com o plasmídeo pQE-30 empregando-se o mesmo adjuvante. Além disso, foram incluídos como controles dois grupos, um dos quais foi imunizado com a proteína PDC-2 e o outro grupo com a proteína PD5 (contém a região do domínio III da proteína do envoltório de DEN-2). Uma parte dos animais (10 ratos) foi sangrada 15 dias após a terceira dose e foram determinados por ELISA os anticorpos anti-DEN-2. Como se pode observar nas Tabelas 13 e 14, no grupo imunizado com PDC-2 DomIII foram gerados altos títulos de Acs anti-DEN-2 soro-tipo-esecíficos, os quais eram superiores aos gerados pela proteína PD5. Estes resultados evidenciam que também a combinação genética com a cápside, imunopotência a resposta contra o vírus proporcionada pelo Domínio III da proteína do envoltório. Tabela 13

Títulos de anticorpos contra o vírus DEN-2 dos soros obtidos após a imunização com a proteína DomIII-CÁPSIDE.

Rato Grupos imunizados com: PDC-2 PDC-2 Dom III PD5 P64k 1 < 1:100 < 1: 320000 < 1: 32000 <1: 100 2 <1: 100 < 1: 640000 < 1:32000 <1: 100 3 <1: 100 < 1:640000 <1:64000 <1: 100 4 <1: 100 <1:640000 <1:64000 <1: 100 < 1: 100 < 1: 128000 < 1: 64000 <1: 100 6 <1: 100 < 1: 320000 < 1: 32000 <1: 100 7 <1: 100 <1: 128000 < 1:64000 <1: 100 8 < 1: 100 <1:64000 < 1: 128000 <1: 100 9 < 1: 100 < 1:64000 < 1:32000 <1: 100 <1: 100 <1: 128000 <1:64000 <1: 100 Tabela 14 Determinação da especificidade do sorotipo dos Acs contidos nas misturas dos soros obtidos de cada grupo._

Grupos inoculados com:: Antígeno viral PDC-2 PDC-2 Dom ΙΠ PD5 P64k DEN-I <1: 100 <1:200 <1:200 < 1: 100 DEN-2 <1: 100 1:320 000 1:64 000 < 1: 100 DEN-3 <1: 100 <1:200 <1:200 < 1: 100 DEN-4 <1: 100 <1:200 <1:200 <1: 100

Por outro lado, pegaram-se outros 10 animais de cada grupo para realizar os ensaios de linfoproliferação. Para isso, extraíram-se as células do baço de cada animal e estimularam-se com o vírus DEN-2 infeccioso. Como se pode observar na tabela no grupo imunizado com a mistura, foram obtidos índices de estímulo superiores aos detectados no grupo imunizado com a proteína da cápside unicamente. Por sua vez, no grupo imunizado com a proteína PD5, os índices de estímulo foram os mais baixos. Tabela 15

índices de estímulo diante do sorotipo homólogo dos linfócitos dos ratos imunizados

PDC-2 PDC-2 Domm PDS P64k DEN-2** 9,5* 11,6 2,2 1,2 Antígeno*** Controlei-) μ 1,1 1,2 1,6 PHA**** 7,6 7,4 7,5 7,9

* índice de estímulo: quocien

e dos conteúdos por minuto das amos

tras entre os conteúdos

por minuto do controle de síntese espontânea de DNA. ** Preparação do cérebro dos ratos infectados com DEN-2. *** Preparação do cérebro de ratos não infectados. **** Mitógeno fitoemaglutinina (Controle positivo). ι Ioj- LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Center for Genetic Engineering and Biotecnology

<120> Proteina da cápside do virus da Dengue indutora de resposta

protetora, e composição farmacêutica.

<130> Dengue <160> 24

<170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 24 <212> DNA

<213> Virus da dengue

<220>

<221> primer_bind <222> (1) . . (24)

<223> Seqüência do oligonucleotideo BamH-I para a amplificação da

proteina da cápside do virus da dengue 2 <400> 1

cgggatccaa taaccaacga aaaa 24

<210> 2 <211> 23 <212> DNA

<213> Virus da dengue

<220>

<221> primer_bind <222> (1).. (23)

<223> Seqüência do oligonucleotideo Hind-III para a amplificação da proteina da cápside do virus DEN-2

<400> 2

acaagctttt acctgcgtct cct 23

<210> 3 <211> 339 <212> DNA

<213> Virus da dengue

<220>

<221> gene <222> (1).. (339)

<223> Seqüência nucleotidica que codifica para os aminoácidos de 1 a 113

da proteina da cápside do virus da Dengue 2 <400> 3

aataaccaac gaaaaaaggc gagaagtacg cctttcaata tgctgaaacg cgagagaaac 60 cgcgtgtcaa ctgtgcaaca gctgacaaag agattctcac ttggaatgct gcaaggacga 120 ggaccattaa aactgttcat ggcccttgtg gcgttccttc gtttcctaac aatcccacca 180 acagcaggga tactgaaaag atggggaacg atcaaaaaat caaaagctat caatgttttg 240 agagggttca ggaaagagat tggaaggatg ctgaàcatct tgaacaggag acgcaggaca 300 gcaggcgtga ttattatgtt gattccaaca gcgatggcg 339

<210> 4 <211> 339 <212> DNA

<213> Virus da dengue <220>

<221> gene <222> (1)..(339)

<223> Seqüência nucleotidica que codifica para a proteina quimérica PDC-2 no plasmideo pQE-30

<400> 4

atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccaata accaacgaaa aaaggcgaga 60

agtacgcctt tcaatatgct gaaacgcgag agaaaccgcg tgtcaactgt gcaacagctg 120 acaaagagat tctcacttgg aatgctgcaa ggacgaggac cattaaaact gttcatggcc 180 1θ3 cttgtggcgt tccttcgttt cctaacaatc ccaccaacag cagggatact gaaaagatgg

ggaacgatca aaaaatcaaa agctatcaat gttttgagag ggttcaggaa agagattgga

aggatgctga acatcttgaa caggagacgc taaaagctt

<210> 5

<211> 111

<212> PRT

<213> Vírus da dengue <220>

<221> CADEIA <222> {1)..(111)

<223> Seqüência de aminoácidos correspondente à proteína PDC-2. <400> 5

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asn Asn Gln Arg 10 15

Lys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Phe Asn Met Leu Lys Arg Glu Arg Asn

25 30

Arg Val Ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg Phe Ser Leu Gly Met

40 45

Leu Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met Ala Leu Val Ala Phe

50 55 60

Leu Arg Phe Leu Thr Ile Pro Pro Thr Ala Gly Ile Leu Lys Arg Trp 65 70 75 80

Gly Thr Ile Lys Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val Leu Arg Gly Phe Arg

85 90 95

Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn Arg Arg Arg Arg 100 105 110

<210> 6 <211> 3461 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> plasmídeo pQE-30 <220>

<221> misc__feature

<223> Seqüência nucleotídica do plasmídeo pQE-30. Resumidamente

salientam-se os sítios de restrição BamHI/Hind III. <400> 6

ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga ggatcgcatc accatcacca tcacggatcc gcatgcgagc tcggtacccc gggtcgacct gcagccaagc ttaattagct gagcttggac tcctgttgat agatccagta atgacctcag aactccatct ggatttgttc agaacgctcg gttgccgccg ggcgtttttt attggtgaga atccaagcta gcttggcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgga atttcgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgtct gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt attggtgccc ttaaacgcct ggggtaatga ctctctagct tgaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gctctagagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtctgtcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg

240 300 339

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 Ioh ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagctg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca c <210> 7 <211> 300 <212> DNA

<213> Vírus da dengue <220>

<221> gene

(1)..(300)

Seqüência nucleotídica que codifica para os aminoácidos

<222> <223> 100

1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3461

de 1 a

da proteína da cápside do vírus da Dengue 1

<400> 7

atgaacaacc aacggaaaaa gacggctcga ccgtctt.tca atatgctgaa acgcgcgaga aaccgcgtgt caactgtttc acagttggcg aagagattct caaaaggatt gctctcaggc caaggaccca tgaaattggt gatggccttc atagcattcc taagatttct agccataccc ccaacagcag gaattttggc tagatggggc tcattcaaga agaatggagc gatcaaagtg ctacggggtt tcaagaaaga aatctcaaac atgttgaata taatgaatag aaggaaaaga <210> 8 <211> 26 <212> DNA

<213> Vírus da dengue

<220>

<221> primer_bind <222> (1)..(26)

<223> Seqüência do oligonucleotídeo BamH-I para a amplificação da proteína da cápside do vírus DEN-I

<400> 8

ggatccatga acaaccaacg gaaaaa <210> 9 <211> 24 <212> DNA

<213> Vírus da dengue

60 120 180 240 300

26 k>6 24

60 120 180 240 300 345

<220>

<221> primer_bind <222> (1)..(24)

<223> Seqüência do oligonucleotídeo Hind-III para a amplificação da

proteina da cápside do vírus DEN-I <400> 9

aagctttctt ttccttctat tcat <210> 10 <211> 345 <212> DNA

<213> Vírus da dengue

<220>

<221> gene <222> (1)..(345)

<223> Seqüência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica PDC-I no plasmídeo pQE-30

<400> 10

atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccatga acaaccaacg gaaaaagacg gctcgaccgt ctttcaatat gctgaaacgc gcgagaaacc gcgtgtcaac tgtttcacag ttggcgaaga gattctcaaa aggattgctc tcaggccaag gacccatgaa attggtgatg gccttcatag cattcctaag atttctagcc atacccccaa cagcaggaat tttggctaga tggggctcat tcaagaagaa tggagcgatc aaagtgctac ggggtttcaa gaaagaaatc tcaaacatgt tgaatataat gaatagaagg aaaagataaa agctt <210> 11 <211> 112 <212> PRT

<213> Vírus da dengue

<220>

<221> CADEIA <222> (1).. (112)

<223> Seqüência de aminoácidos correspondendo à proteína PDC-I. <4 00> 11

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Met Asn Asn Gln 10 15

Arg Lys Lys Thr Ala Arg Pro Ser Phe Asn Met Leu Lys Arg Ala Arg

25 . 30

Asn Arg Val Ser Thr Val Ser Gln Leu Ala Lys Arg Phe Ser Lys Gly

40 45

Leu Leu Ser Gly Gln Gly Pro Met Lys Leu Val Met Ala Phe Ile Ala

50 55 60

Phe Leu Arg Phe Leu Ala Ile Pro Pro Thr Ala Gly Ile Leu Ala Arg 65 70 75 80

Trp Gly Ser Phe Lys Lys Asn Gly Ala Ile Lys Val Leu Arg Gly Phe ·

85 ...... 90 ...... .95

Lys ;Lys Glu Ile Ser Asn Met Leu Asn Ile Met Asn Arg ArgLys Arg

' ' ■ 100 ' 105 - ■ . 110

<210> 12 <211> 426 <212> DNA

<213> Vírus da dengue <220>

<221> gene <222> (1) . . (426)

<223> Seqüência do nucleotídica que codifica para o DomB da proteína do

envoltório do vírus DEN-2

<400> 12

aggctgagaa tggacaaact acagctcaaa ggaatgtcat actctatgtg tacaggaaag tttaaaattg tgaaggaaat agcagaaaca caacatggaa caatagttat cagagtacaa tatgaagggg acggctctcc atgtaagatc ccttttgaga taatggattt ggaaaaaaga cacgtcttag gtcgcctgat tacagttaac ccgatcgtaa cagaaaaaga tagcccagtc aacatagaag cagaacctcc attcggagac agctacatca tcataggagt agagccggga caattgaaac tcaactggtt taagaaagga agttccatcg gccaaatgtt tgagacaaca

60 120 180 240 300 360 ÍOG W

atgagaggag cgaagagaat ggccatttta ggtgacacag cctgggattt tggaagcctg 420 ggaggg 426

<210> 13 <211> 21 <212> DNA

<213> Virus da dengue

<220>

<221> primer_bind <222> (1) . . (21)

<223> Seqüência do oligonucleotideo 5' para a amplificação da região

codificadora para os aminoácidos 286 a 426 da proteína

do envoltório do vírus DEN-2 <4Q0> 13

cttggatcca ttctgagaat g 21

<210> 14 <211> 33 <212> DNA

<213> Vírus da dengue <220>

<221> primer_bind <222> (1)..(33)

<223> Seqüência do oligonucleotideo 3' para a amplificação da região codificadora para os aminoácidos 286 a 426 da proteína do envoltório do vírus DEN-2 <400> 14

tgtggatcct cctcctaggc ttccaaaatc cca 33

<210> 15 <211> 753 <212> DNA

<213> Vírus da dengue

<220>

<221> gene <222> (1)..(753)

<223> Seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína quimérica pDC-2

DomIII. <400> 15

catcaccatc accatcacgg atccaggctg agaatggaca aactacagct caaaggaatg 60 tcatactcta tgtgtacagg aaagtttaaa attgtgaagg aaatagcaga aacacaacat 120 ggaacaatag ttatcagagt acaatatgaa ggggacggct ctccatgtaa gatccctttt 180 gagataatgg atttggaaaa aagacacgtc ttaggtcgcc tgattacagt taacccgatc 240 gtaacagaaa aagatagccc agtcaacata gaagcagaac ctccattcgg agacagctac 300 atcatcatag gagtagagcc gggacaattg aaactcaact ggtttaagaa aggaagttcc 360 atcggccaaa tgtttgagac aacaâtgaga.ggagcgaaga gaatggccat tttaggtgac 420 acagcctggg" attttggatc cctgggagga ggatccaàta accaacgaaa aaaggcgaga 48.0 agtacgcctt tcaatatgct gaaacgcgag agaaaccgcg tgtcaactgt gcaacagctg 540 acaaagagat tctcacttgg aatgctgcaa ggacgaggac cattaaaact gttcatggcc 600 cttgtggcgt tccttcgttt cctaacaatc ccaccaacag cagggatact gaaaagatgg 660 ggaacgatca aaaaatcaaa agctatcaat gttttgagag ggttcaggaa agagattgga 720 aggatgctga acatcttgaa caggagacgc taa 753

<210> 16 <211> 250 <212> PRT

<213> Vírus da dengue <220>

<221> CADEIA <222> (1)..(250)

<223> Seqüência de aminoácidos de PDC-2 Dom III <400> 16

His His His His His His Gly Ser Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln 10 15

Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln 35 40 45 Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp 50 55 60 Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile 65 70 75 80 Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe 85 90 95 Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu 100 105 110 Asn Trp Phe 115 Lys Lys Gly Ser Ser 120 Ile Gly Gln Met Phe 125 Glu Thr Thr Met Arg 130 Gly Ala Lys Arg Met 135 Ala Ile Leu Gly Asp 140 Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Asn Asn Gln Arg Lys Lys Ala Arg 145 150 155 160 Ser Thr Pro Phe Asn 165 Met Leu Lys Arg Glu 170 Arg Asn Arg Val Ser 175 Thr Val Gln Gln Leu 180 Thr Lys Arg Phe Ser 185 Leu Gly Met Leu Gln 190 Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu 195 200 205 Thr Ile 210 Pro Pro Thr Ala Gly 215 Ile Leu Lys Arg Trp 220 Gly Thr Ile Lys Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly 225 230 235 240 Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn Arg Arg Arg 245 250

<210> 17 <211> 142 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 1 <220>

<221> CADEIA <222> (1)..(142)

<223> Seqüência aminoacidica correspondente ao DomB da proteina

envoltório do vírus DEN-I. <400> 17

Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Val Ser Tyr Val Met 1 5 10 15 Cys Thr Gly Ser Phe. Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His 20 25 30 Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys 35 40 45 Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly 50 55 60 Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Ile Asp Lys Glu Lys Pro Val 65 70 75 80 Asn Ile Glu Ala Glu 85 Pro Pro Phe Gly Glu 90 Ser Tyr Ile Val Val 95 Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser 100 105 110 Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala 115 120 125 Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly 130 135 140

<210> 18 <211> 142 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 3 <220> <221> CADEIA <222> (1)..(142)

<223> Seqüência aminoacídica correspondente ao DomB da proteína

envoltório do vírus DEN- -3. <400> 18 Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met 1 5 10 15 Cys Thr Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His 20 25 30 Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Val Pro Cys 35 40 45 Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly 50 55 60 Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val 65 70 75 80 Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly 85 90 95 Ile Gly Asp Asn 100 Ala Leu Lys Ile Asn 105 Trp Tyr Lys Lys Gly 110 Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala 115 120 125 Ile Leu 130 Gly Asp Thr Ala Trp 135 Asp Phe Gly Ser Val 140 Gly Gly

<210> 19 <211> 142 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 4

<220>

<221> CADEIA <222> (1)..(142)

<223> Seqüência aminoacídica correspondente ao Dom B da proteína

do envoltório do vírus DEN-4. <400> 19

Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met 1 5 10 15 Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His 20 25 30 Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys 35 40 45 Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly 50 55 60 Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr 65 70 75 80 Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly.Asp Ser Tyr lie. Val Ile Gly 85 90 95 Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser 100 105 110 Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala 115 120 125 Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly

130 135 140

<210> 20 <211> 749 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 1

<220>

<221> CADEIA

<222> (1)..(749)

<223> Seqüência de aminoácidos correspondente à proteína PLH3.

<400> 20

Met Gly His His His His His His Ala Met Val Asp Lys Arg Met Ala 10 15 Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp 20 25 30 Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp 35 40 45 Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala 50 55 60 Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu 65 70 75 80 Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro 85 90 95 Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala 100 105 110 Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala ASp Ala Glu 115 120 125 Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala 130 135 140 Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys 165 170 175 Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala 180 185 190 Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu 195 200 205 Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala 210 215 220 Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln 225 230 235 240 Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala 245 250 255 Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys 260 265 270 Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile 275 280 285 Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys 290 295 300 Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu 305 310 315 320 Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val 325 330 335 Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys 340 345 350 Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn 355 360 365 Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr 370 375 380 Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val 385 390 395 400 Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu 405 410 415 Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys 420 425 430 Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val 435 440 445 Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala 450 455 460 Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile 465 470 475 480 Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr 485 490 495 Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe 500 505 510 Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro 515 520 525 Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly 530 535 540 Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu 545 550 555 560 Ala Ile Glu Met Gly 565 Cys Asp Ala Ala Asp 570 Ile Gly Lys Thr Ile 575 His Pro His Pro Thr 580 Leu Gly Glu Ser Ile 585 Gly Met Ala Ala Glu 590 Val Ala Leu Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Arg 595 600 605 Leu Lys 610 Met Asp Lys Leu Thr 615 Leu Lys Gly Val Ser 620 Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly 625 630 635 640 Thr Val Leu Val Gln 645 Val Lys Tyr Glu Gly 650 Thr Asp Ala Pro Cys 655 Lys Ile Pro Phe Ser 660 Ser Gln Asp Glu Lys 665 Gly Val Thr Gln Asn 670 Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Ile Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn 675 680 685 Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala 690 695 700 Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile 705 710 715 720 Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile 725 730 735 Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly 740 745

<210> 21 <211> 749 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 3 <220>

<221> CADEIA <222> (1)..(749)

<223> Seqüência de aminoácidos correspondente à proteína PAZ3. <400> 21

Met Gly His His His His His His Ala Met Val Asp Lys Arg Met Ala 1 5 10 15 Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp 20 25 30 Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp 35 40 45 Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala 50 55 60 Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser GIu 65 70 75 80 Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro 85 90 95 Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala 100 105 110 Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu 115 120 125 Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala 130 135 140 Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys 165 170 175 Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala 180 185 190 Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu 195

Arg Ala Tyr 210 Gly Met Ala

225

Phe Leu Asp

Tyr Glu Gln

Asn Cys Ile 275

Pro Glu Asp

290 Glu Val Pro

305

Glu Met Gly

Glu Met Met

Val Trp Gln 355

Thr Lys Thr

370 Phe Glu Gly

385

Leu Val Ala

Lys Ala Gly

Gln Met Arg 435

Gly Gln Pro

450 Ala Glu Asn 4 65

Pro Gly Val

Glu Leu Ser

Pro Trp Ala 515

Phe Thr Lys

530 Gly Ile Val

545 ■

Ala Ile Glu

Pro His Pro

Leu Gly Thr 595

Leu Lys Met

610

Leu Asn Thr

625

Thr Ile Leu

Ile Pro Phe

Leu Ile Thr 675

Ile Glu Ala 690

Lys Asp

Lys Ser

Pro His 245 Ala Ala 260

Ile Ala

Pro Arg

Gly Lys

Thr Val 325 Asp Gly 340

Lys Gln

Val Ala

Ala Asn

Ala Gly 405 Val Ala 420

Thr Asn Met Leu Cys Ala

Ala Tyr

485 Ala Lys

500

Ala Ser

Leu Ile

Gly Pro

Met Gly 565

Thr Leu

580

Cys Thr Asp Lys

Phe Val

Ile Lys 645 Ser Thr 660

Ala Asn Glu Pro

Gly Val 215 Arg Lys 230

His Leu Pro Thr

Ala Gly

Ile Ile 295 Leu Leu 310

Tyr Ser

Leu Met

Asn Glu

Val Glu 375 Ala Pro

390

Arg Ala

Val Thr

Val Pro

Ala His 455 Gly His 470

Thr Ser

Ala Ser

Gly Arg

Phe Asp 535 Asn Gly 550

Cys Asp

Gly Glu

Asp Leu

Leu Lys 615 Leu Lys 630

Val Glu

Glu Asp

Pro Val

Pro Phe 695

200

Val Ser

Val Asp

Glu Val

Gly Glu 265 Ser Arg

280

Asp Ser

Ile Ile

Thr Leu

Gln Gly 345 Tyr Arg

360

Pro Lys

Lys Glu

Pro Asn

Asp Arg 425 His Ile 440

Lys Ala

Pro Glu

Gly Arg 505 Ala Ile 520

Ala Glu

Gly Asp

Ala Ala

Ser Ile 585

Pro Pro 600

Leu Lys

Lys Glu

Tyr Lys

Gly Gln 665 Val Thr 680

Gly Glu

Arg Leu

Val Ile 235 Ser Leu

250

Lys Lys

Val Thr

Ser Gly

Gly Gly 315 Gly Ser 330

Ala Asp Phe Asp Glu Asp

Pro Gln

395 Gly Lys 410

Gly Phe Tyr Ala

Val His

Tyr Phe 475 Val Ala 490

Lys Ile

Ala Asn

Thr Gly

Met Ile 555 Asp Ile 570

Gly Met

Gln Lys

Gly Met

Val Ser 635 Gly Glu

650

Gly Lys

Lys Lys Ser Asn

205 Thr Gly Gly 220

Gln Gly Asp

Thr Ala Gly

Ile Val Ala 270

Lys Leu Pro

285 Ala Leu Ala

300

Gly Ile Ile

Arg Leu Asp

Arg Asp Leu 350

Asn Ile Met

365 Gly Val Tyr

380

Arg Tyr Asp

Leu Ile Ser

Ile Glu Val 430

Ile Gly Asp

445 Glu Gly His

460

Asp Ala Arg

Trp Val Gly

Thr Lys Ala 510

Gly Cys Asp

525 Arg Ile Ile 540

Gly Glu Val

Gly Lys Thr

Ala Ala Glu 590

Lys Lys Gly

605 Ser Tyr Ala

620

Glu Thr Gln

Asp Ala Pro

Ala His Asn 670

Glu Glu Pro

685 Ile Val Ile 700

Leu Ala

Gly Gln 240 Asp Ala 255

Phe Lys

Phe Ile

Leu Lys

Gly Leu 320 Val Val

335

Val Lys Val Asn

Val Thr

Ala Val 400 Ala Glu 415

Asp Lys

Ile Val

Val Ala

Val Ile 480 Glu Thr 495

Asn Phe

Lys Pro

Gly Gly

Cys Leu 560, Ile His 575

Val Ala

Ser Arg

Met Cys

His Gly 640 Cys Lys 655

Gly Arg Val Asn Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Gly Ser Ser Ile 705 710 715 720

Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile

725 730 735

Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly 740 745

<210> 22 <211> 749 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 4

<220>

<221> CADEIA <222> (1)..(749)

<223> Seqüência de aminiácidos correspondente a PID3. <400> 22

Met Gly His His His His His His Ala Met Val Asp Lys Arg Met Ala 10 15

Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp

25 30

Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp

40 45

Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala

50 55 60

Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu 65 70 75 80

Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro

85 90 95

Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala

100 105 110

Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu

115 120 125

Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala

130 135 140

Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr 145 150 155 160

Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys

165 170 175

Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala

180 185 190

Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu

195 200 205

Arg Ala Tyr Lys Asp.Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala

210 215 220

Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln 225 230 235 240

Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala

245 250 255

Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys

260 265 270

Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile

275 280 285

Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys

290 295 300

Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu 305 310 315 320

Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val

325 330 335

Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys

340 345 350

Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn

355 360 365

Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr 370 375 380 Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val 385 390 395 400 Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu 405 410 415 Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys 420 425 430 Gln Met Arg 435 Thr Asn Val Pro His 440 Ile Tyr Ala Ile Gly 445 Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala 450 455 460 Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile 465 470 475 480 Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr 485 490 495 Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe 500 505 510 Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro 515 520 525 Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly 530 535 540 Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu 545 550 555 560 Ala Ile Glu Met. Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His 565 570 575 Pro His Pro Thr Leu Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala 580 585 590 Leu Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Lys 595 600 605 Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys 610 615 620 Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly 625 630 635 640 Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys 645 650 655 Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg 660 665 670 Ile Ile Ser 675 Ser Thr Pro Leu Ala 680 Glu Asn Thr Asn Ser 685 Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val 690 695 700 Glv Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile 705 710 715 720 Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile 725 730 735 Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly

740 745

<210> 23 <211> 750 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 2 <220>

<221> CADEIA

<222> (1)..(750)

<223> Seqüência de aminoácidos correspondente a PLL3. <400> 23

Met Gly His His His His His His Ala Met Val Asp Lys Arg Met Ala 10 15

Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp

25 30

Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp

40 45

Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala 50 55 60 Gly Val 5

Gly Gly

Lys Ala

Ala Pro

Tyr Asp 130 Phe Ala

145

Lys Thr

Ala Leu

Ala Asn

Arg Ala 210 Gly Met

225

Phe Leu

Tyr Glu

Asn Cys

Pro Glu 290 Glu Val

305

Glu Met

Val Trp

Thr Lys 370 Phe Glu 385

Leu Val Lys Ala

Gln Met

Gly Gln 450 Ala Glu 465

Pro Gly Glu Leu Pro Trp

Phe Thr 530 Gly Ile 545

Ala Ile

Val Lys

Leu Ile

Glu Ala 100 Ala Pro 115

Val Val

Ala Ala

Leu Gly

Leu His 180 Gly Ile 195

Tyr Lys

Ala Lys

Asp Pro

Gln Ala 260 Ile Ile 275

Asp Pro

Pro Gly

Gly Thr

Met Asp 340 Gln Lys 355

Thr Val

Gly Ala

Ala Ala

Gly Val 420 Arg Thr 435

Pro Met Asn Cys

Val Ala

Ser Ala 500 Ala Ala

515

Lys Leu

Glu Val

70 Val Val 85

Ala Ala

Gln Ala

Val Leu

Asp Glu 150 Gly Val

165

Asn Ala Lys Tyr

Asp Gly

Ser Arg 230 His His 245

Ala Pro

Ala Ala

Arg Ile

Lys Leu 310 Val Tyr 325

Gly Leu

Gln Asn

Ala Val

Asn Ala 390 Gly Arg 405

Ala Val

Asn Val

Leu Ala

Ala Gly 470 Tyr Thr

485

Lys Ala Ser Gly Ile Phe

Val Gly Glu Met

Pro Asn 550 Gly Cys

Lys Val Lys

Val Glu Ala

Ala Pro Ala 105

Ala Gln Phe 120 Gly Gly Gly

135

Gly Leu Lys

Cys Leu Asn

Ala Val Ile 185

Pro Glu Pro 200 Val Val Ser

215

Lys Val Asp

Leu Glu Val

Thr Gly Glu 265

Gly Ser Arg 280 Ile Asp Ser

295

Leu Ile Ile

Ser Thr Leu

Met Gln Gly 345

Glu Tyr Arg

360 Glu Pro Lys

375

Pro Lys Glu

Ala Pro Asn

Thr Asp Arg 425

Pro His Ile

440 His Lys Ala 455

His Lys Ala

Ser Pro Glu

Ser Gly Arg 505

Arg Ala Ile

520 Asp Ala Glu 535

Gly Gly Asp Asp Ala Ala

Val Gly Asp 75

Glu Gly Thr 90

Gln Glu Ala

Gly Gly Ser

Pro Gly Gly 140

Val Ala Ile

155 Val Gly Cys 170

Asp Glu Val Glu Leu Asp

Arg Leu Thr

220

Val Ile Gln

235 Ser Leu Thr

250

Lys Lys Ile

Val Thr Lys

Ser Gly Ala 300

Gly Gly Gly

315 Gly Ser Arg

330

Ala Asp Arg

Phe Asp Asn

Glu Asp Gly 380

Pro Gln Arg

395 Gly Lys Leu 410

Gly Phe Ile

Tyr Ala Ile

Val His Glu 460

Tyr Phe Asp

475 Val Ala Trp

490

Lys Ile Thr

Ala Asn Gly

Thr Gly Arg 540

Met Ile Gly

555 Asp Ile Gly

Lys Ile

Ala Ala

Pro Lys 110 Ala Asp

125

Tyr Ser

Val Glu

Ile Pro

Arg His 190 Ile Asp 205

Gly Gly

Gly Asp

Ala Gly

Val Ala 270 Leu Pro 285

Leu Ala

Ile Ile

Leu Asp

Asp Leu 350 Ile Met

365

Val Tyr

Tyr Asp

Ile Ser

Glu Val 430 Gly Asp 445

Gly His Ala Arg

Val Gly

Lys Ala 510 Cys Asp 525

Ile Ile Glu Val Lys Thr

Ser Glu 80 Ala Pro 95

Ala Ala

Ala Glu

Ala Ala

Arg Tyr 160 Ser Lys

175

Leu Ala

Met Leu

Leu Ala

Gly Gln 240 Asp Ala 255

Phe Lys

Phe Ile

Leu Lys

Gly Leu 320 Val Val 335

Val Lys Val Asn

Val Thr

Ala Val 400 Ala Glu 415

Asp Lys

Ile Val

Val Ala

Val Ile 480 Glu Thr

495

Asn Phe

Lys Pro

Gly Gly

Cys Leu 560 Ile His 565 570 575 Pro His Pro Thr 580 Leu Gly Glu Ser Ile 585 Gly Met Ala Ala Glu 590 Val Ala Leu Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Asp 595 600 605 Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met 610 615 620 Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His 625 630 635 640 Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys 645 650 655 Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly 660 665 670 Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val 675 680 685 Asn Ile 690 Glu Ala Glu Pro Pro 695 Phe Gly Asp Ser Tyr 700 Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser 705 710 715 720 Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala 725 730 735 Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly 740 745 750

<210> 24 <211> 142 <212> PRT

<213> Vírus da dengue tipo 2 <220>

<221> CADEIA <222> (1)..(142)

<223> Seqüência arainoacídica correspondente ao DomB da

proteína do envoltório do vírus DEN-2. <400> 24

Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met 1 5 10 15 Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His 20 25 30 Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys 35 40 45 Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly 50 55 60 Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val 65 70 75 80 Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly 85 90 95 Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser 100 105 110 Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala 115 120 125 Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Giy Ser Leu Gly Gly

130 135 140

Claims

1. Composto farmacêutico, caracterizado pelo fato de que é uma vacina capaz de induzir no organismo receptor uma resposta imune protetora contra os vírus da Dengue e conter a proteína da cápside de um ou de vários sorotipos do vírus da dengue só ou combinada com outros antígenos.

2. Composto farmacêutico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que contém a proteína da cápside do vírus da Dengue 1, 2, 3 ou 4, sós, mescladas ou combinadas entre elas.

3. Composto farmacêutico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que contém a proteína da cápside mesclada ou combinada com antígenos capazes de induzir uma resposta humoral e/ou celular.

4. Composto farmacêutico de acordo com as reivindicações 1 e3, caracterizado pelo fato de que contém a proteína da cápside mesclada com uma ou várias das proteínas identificadas na listagem de seqüência como: Seqüência 20, Seqüência 21 , Seqüência 22 e Seqüência 23.

5. Composto farmacêutico de acordo com as reivindicações 1 e 3, caracterizado pelo fato de que contém a proteína da cápside fundida por via química ou genética com uma ou várias das seqüências identificadas na listagem de seqüência como: Seqüência 17, Seqüência 18, Seqüência 19 e Seqüência 24.

6. Composto farmacêutico de acordo com as reivindicações 1,2, 3, 4 e 5, caracterizado pelo fato de que contém a proteína da cápside em forma particulada ou agregada.

7. Composto farmacêutico de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 e 6, caracterizado pelo fato de que contém um veículo farmacologicamente aceitável e um adjuvante oleoso, ou não oleoso.

8. Composto farmacêutico de acordo com as reivindicações 1, -2, 3, 4, 5, 6 e 7, caracterizado pelo fato de que é um composto preventivo ou terapêutico contra os vírus da Dengue, para uso oral, intramuscular, subcutâneo, mucosal ou intravenoso.