BRPI0616438A2

BRPI0616438A2 - proteÍna, polinucleotÍdeo, anticorpo contra uma proteÍna secretora ou de membrana, ou um fragmento funcional do mesmo, hibridoma, agente terapÊutico para uma doenÇa autoimune, agente para inibir adesço de cÉlulas t, e, mÉtodo para triar uma substÂncia

Info

Publication number: BRPI0616438A2
Application number: BRPI0616438-2A
Authority: BR
Inventors: Hideaki Ogasawara; Keiko Mizuno; Yoshihisa Arita; Miyuki Nishimura; Toshio Imai
Original assignee: Eisai R&D Man Co Ltd
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2012-12-25
Also published as: CA2624135A1; IL190488A0; AU2006295717A1; CA2624135C; CN101316930A; MY150639A; RU2396275C2; DK1939288T3; KR20080068039A; CN101316930B; EP1939288A1; JP5106111B2; IL190488A; AU2006295717B2; EP1939288A4; NZ567043A; NO20081503L; US20090181025A1; KR101026016B1; JPWO2007037430A1

Abstract

PROTEÍNA, POLINUCLEOTÍDEO, ANTICORPO CONTRA UMA PROTEÍNA SECRETORA OU DE MEMBRANA, OU UM FRAGMENTO FUNCIONAL DO MESMO, HIBRIDOMA, AGENTE TERAPÊUTICO PARA UMA DOENÇA AUTOIMUNE, AGENTE PARA INIBIR ADESçO DE CÉLULAS T, E, MÉTODO PARA TRIAR UMA SUBSTÂNCIA. Revela-se uma molécula de adesão de células T que é expressa em uma célula dendrítica. A molécula é uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12.

Description

"PROTEÍNA, POLINÜCLEOTÍDEO, ANTICORPO CONTRA UMA PROTEÍNA SECRETORA OU DE MEMBRANA, OU UM FRAGMENTO FUNCIONAL DO MESMO, HIBRIDOMA, AGENTE TERAPÊUTICO PARA UMA DOENÇA AUTOIMUNE, AGENTE PARA INIBIR ADESÃO DE CÉLULAS Τ, E, MÉTODO PARA TRIAR UMA SUBSTÂNCIA"

Campo técnico

A presente invenção refere-se a uma molécula de adesão a células T que é expressa em células dendríticas derivadas de medula óssea e um gene da mesma, e um ligante para a molécula de adesão (receptor) que é expressa em células T e um gene da mesma. A presente invenção também se refere a um anticorpo contra a molécula de adesão ou o ligante e um uso do mesmo. Além disso, a presente invenção também se refere a um método de seleção usando a molécula de adesão.

Arte anterior

Há poucos anos reportou-se que uma molécula clonada como um ativador de célula dendrítica que é expresso em células T é uma citocina principal para regular a diferenciação de osteoclastos (Yasuda, H., et ai. (1998) Proc NatlAcadSei USA 95: 3597-3602). Assim, esclareceu-se que um sistema imune é estreitamente relacionado com o metabolismo dos ossos.

Estudos da regulação do metabolismo dos ossos por meio de moléculas reguladoras do sistema imunológico progrediram rapidamente, e esclareceu-se também a transdução de sinal associada com regulação de diferenciação de osteoclastos.

Por exemplo, como uma molécula envolvida na diferenciação de osteoclastos conhece-se Oscar (Osteoelast-assoeiated receptor [receptor associado com osteoclasto]). Reportou-se até aqui que Oscar é um receptor similar a imunoglobulina, que está associado com a cadeia FcRy e transmite um sinal para fosfolipase Cy via uma repetição ITAM da cadeia FcRy (Kim, N., et ai (2002) J. Exp Med 195: 201-209). 2

Adicionalmente, reportou-se várias interações, CD80-CD28, CD40-CD40L ou ICAMl-LFAl para moléculas que são expressas em células dendríticas e que aderem a uma célula T envolvendo-se numa interação relativa a uma resposta imune entre células T e células dendríticas.

Sumário da invenção

Os presentes inventores identificaram um gene que é expresso em células dendríticas derivadas de medula óssea por meio de um método de subtração. Os inventores também verificaram que uma proteína codificada pelo gene previamente indicado liga-se à cadeia FcRy constituindo o receptor de IgE, que a expressão da proteína previamente indicada é incrementada por estimulo de LPS5 que células dendríticas são ativadas por estímulo de reticulação de anticorpo para a proteína previamente indicada, que a proteína previamente indicada tem uma função de aderir a uma célula T, e que um anticorpo contra a proteína previamente indicada tem um efeito terapêutico sobre um modelo de artrite induzida com colágeno que é um modelo de doença de artrite reumatóide. Os inventores identificaram adicionalmente um gene de um ligante para a proteína previamente indicada, que é expresso em células Τ. A presente invenção baseia-se nestas verificações.

A presente invenção proporciona uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8, ou uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 que contém uma ou mais substituições conservativas (referido a seguir como uma proteína inédita de uma primeira concretização de acordo com a presente invenção).

A presente invenção proporciona uma proteína secretora ou de membrana selecionada dentre as seguintes (1), (ii), (iii) e (iv) (referida a seguir como uma proteína inédita de uma segunda concretização de acordo com a presente invenção): (i) uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 10;

(ii) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: IO em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais aminoácidos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10;

(iii) uma proteína secretora ou de membrana que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 10; e

(iv) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando 90 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

A presente invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica as proteína inéditas da primeira e segunda concretizações de acordo com a presente invenção.

A presente invenção também proporciona um polinucleotídeo selecionado dentre os seguintes (v), (vi), (vii) e (viii):

(v) um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9;

(vi) um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9 em que um ou mais nucleotídeos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais nucleotídeos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que codifica uma proteína secretora ou de membrana funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 10;

(vii) um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, e que codifica uma proteína secretora ou de membrana funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; e (viii) um polinucleotídeo que apresenta 90 % ou mais de identidade com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, e que codifica uma membrana ou proteína secretora funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 10.

A presente invenção também proporciona um anticorpo contra uma proteína secretora ou de membrana selecionada dentre as seguintes (ix), (x), (xi) e (xii) (referida a seguir ocasionalmente como uma proteína TARM (T cell-interacting Activating Receptor on Myeloid cells) [receptor ativador de interação com células T, em células mielóides], e um fragmento funcional do mesmo (referido a seguir como um anticorpo de uma primeira concretização de acordo com a presente invenção):

(ix) uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; (x) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: ou SEQ ID NO: 12 em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais aminoácidos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQID NO: 10 ou SEQID NO: 12;

(xi) uma proteína secretora ou de membrana que é codificada β f

por um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; e

(xii) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:

6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQID NO: 10 ou SEQID NO: 12.

A presente invenção proporciona uma proteína ligante inédita que é um ligante para a proteína inédita de acordo com a presente invenção, que é selecionada dentre as seguintes (xiii), (xiv), (xv) e (xvi) (referida a seguir ocasionalmente como uma proteína ligante inédita de acordo com a presente invenção ou uma proteína TARM-L (ligante de TARM)):

(xiii) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQID NO: 16;

(xiv) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16 em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais aminoácidos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que é

funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 14 ou SEQID NO: 16;

(xv) uma proteína que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, e que é ψ

funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 14 ou SEQID NO: 16; e

(xvi) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de

aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16.

A presente invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica a proteína ligante de acordo com a presente invenção. A presente invenção também proporciona um polinucleotídeo

selecionado dentre os seguintes (xvii), (xviii), (xix) e (xx):

(xvii) um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQID NO: 13 ou SEQID NO: 15;

(xviii) um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 em que um ou mais

nucleotídeos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais nucleotídeos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que codifica uma proteína funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQID NO: 16; (xix) um polinucleotídeo que hibridiza em condições

estringentes com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, e que codifica uma proteína funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 14 ou SEQID NO: 16; e (xx) um polinucleotídeo que apresenta 70 % ou mais de

identidade com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, e que codifica uma proteína funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. A presente invenção proporciona um anticorpo contra a proteína ligante de acordo com a presente invenção, e um fragmento funcional do mesmo (referido a seguir como um anticorpo de uma segunda concretização de acordo com a presente invenção).

A presente invenção proporciona um agente terapêutico para

doenças autoimunes e um agente para inibir adesão de células T compreendendo, como ingredientes ativos, os anticorpos da primeira e segunda concretizações de acordo com a presente invenção (a seguir, ambos os anticorpos podem ser referidos como "anticorpos de acordo com a presente invenção"), ou fragmentos funcionais dos mesmos.

A presente invenção proporciona os métodos de seleção a

seguir.

De acordo com um método de seleção de uma primeira concretização de acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para triar uma substância que inibe adesão de uma célula T a uma proteína TARM ou um sal da mesma, ou um solvato da mesma, que compreende as etapas de:

(a) contactar uma célular T com uma proteína TARM na presença ou ausência de uma substância de teste; e (b) medir a atividade de ligação de uma célula T com referida

proteína TARM.

De acordo com um método de seleção de uma segunda concretização de acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para triar uma substância que inibe a ativação de uma célula dendrítica ou um sal da mesma, ou um solvato da mesma, que compreende as etapas de:

(d) contactar um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a presente invenção com uma célula dendrítica na presença ou ausência de uma substância de teste; e

(e) medir o nível de ativação de referida célula dendrítica. De acordo com um método de seleção de uma terceira concretização de acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para triar uma substância que inibe uma formação de complexo entre uma proteína TARM e a cadeia FcRy ou um sal da mesma, ou um solvato da mesma, que compreende as etapas de:

(g) contactar um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a presente invenção com uma célula dendrítica na presença ou ausência de uma substância de teste; e

(h) medir o nível de expressão da cadeia FcRy em referida célula dendrítica.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1 mostra as seqüências de aminoácidos de genes de TARM de camundongo (de ml a 4 e sl), sendo que o sublinhado indica uma região de estrutura em alça de imunoglobulina (IG) e o negrito indica uma região de transmembrana.

Figura 2 mostra os resultados obtidos analisando-se a expressão de mRNA de TARM em tecidos de camundongo por meio de PCR em tempo real usando o conjunto de iniciadores 1.

Figura 3 mostra os resultados obtidos analisando-se a expressão de TARM no mRNA em vários tipos de células por meio de PCR em tempo real usando o conjunto de iniciadores 1.

Figura 4A mostra a estrutura e quantidades de aminoácidos de uma região extracelular usada na produção de anticorpos anti-TARM. Figura 4B mostra os resultados obtidos estudando-se as especificidade do anticorpo previamente indicado para a proteína TARM.

Figura 5 mostra os resultados obtidos analisando-se a expressão de proteínas de camundongo em células dendríticas derivadas de medula óssea.

Figura 6 mostra os resultados obtidos analisando-se a

expressão de proteínas de camundongo em células derivadas de tecidos imunes de camundongo normais.

Figura 7 mostra os resultados obtidos analisando-se a expressão da proteína de camundongo em mastócitos peritoneais positivos para kit c.

Figura 8 mostra os resultados obtidos analisando-se a expressão da proteína TAJRM de camundongo em células de nódulos linfáticos de camundongo por meio de estímulo inflamatório de LPS, sendo que as setas indicam a expressão da proteína TARM de camundongo. Figura 9A mostra a indução da produção de IL-6 de células

dendríticas da medula óssea maduras por meio de estímulo de anticorpo anti- TARM. Figura 9B mostra a indução da produção de MCP-I de células dendríticas da medula óssea imaturas por meio de estímulo de anticorpo anti- TARM.

Figura 10 mostra incrementos na cadeia FcRy associados com

incrementos da expressão da proteína TARM de camundongo sobre a superfície da célula.

Figura 11 mostra os resultados obtidos analisando-se uma formação de complexo entre a proteína TARM de camundongo e a cadeia FcRy por meio de um método de imunoprecipitaçao.

Figura 12 mostra os resultados obtidos analisando-se a expressão de moléculas que se ligam à proteína TARM de camundongo em células T ativadas.

Figura 13 mostra a capacidade de células T ativadas aderirem um proteína TARM de camundongo.

Figura 14 mostra a inibição de adesão de células Th2 à proteína TARM de camundongo por meio de anticorpos de TARM anti- camundongo.

Figura 15 mostra as verificações externas e alterações dos pesos corporais, ao longo do tempo, em um modelo de artrite induzida com colágeno, a que se administrou um anticorpo de TARM anti-camundongo.

Figura 16 mostra o efeito da administração do anticorpo de TARM anti-camundongo ao modelo de artrite induzida com colágeno em concentrações séricas de amilóide A no plasma do mesmo.

Figura 17 mostra o efeito da administração do anticorpo de TARM anti-camundongo ao modelo de artrite induzida com colágeno sobre titulações de anticorpos anti-colágeno no plasma do mesmo.

Figura 18 mostra os resultados obtidos analisando-se expressão de mRNA da proteína TARM em tecidos humanos por meio de PCR em tempo real.

Figura 19 mostra as seqüências de aminoácidos da proteína TARMA humana, sendo que o sublinhado indica uma região de estrutura em alça de imunoglobulina (IG), o tipo negritado indica uma região de transmembrana, e a porção encerrada indica seqüências diferentes entre hTARM e LOC441864.

Figura 20 mostra a capacidade de células T ativadas aderirem à proteína TARM humana, e inibição da adesão de células T à proteína TARM humana por anticorpos de TARM anti-humanos.

Figura 21A mostra os resultados obtidos analisando-se a expressão de moléculas que se ligam à proteína TARM de camundongo em linhas de células de camundongo. Figura 2IB mostra os resultados obtidos analisando-se a expressão do mRNA de ENSMUSG00000035095, uma molécula candidata de TARM-L em linhas de células de camundongo por meio de PCR em tempo real.

Figura 22A mostra a ligação específica da proteína quimérica TARM-AP de camundongo a células B300.19 expressando mTARM-L. Figura 22B mostra a adesão celular específica de células B300.19 expressando mTARM-L à proteína quimérica TARM-AP de camundongo. Figura 23 mostra os resultados obtidos analisando-se homologia entre proteínas TARM-L humanas e de camundongo.

Figura 24 mostra os resultados obtidos analisando-se homologia entre a proteína TARM humana e a proteína TARM de camundongo (m3).

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção será descrita mais detalhadamente abaixo. As descrições a seguir são dadas apenas como exemplos para explicar a presente invenção, e assim referidos exemplos não se destinam a limitar a presente invenção apenas às concretizações da presente invenção. Todos os termos tecnológicos, termos científicos e termos técnicos usados na presente descrição têm os mesmos significados que aqueles geralmente compreendidos por pessoas versadas no campo técnico a que se refere a presente invenção. Referidos termos são usados com o objetivo de apenas explicar concretizações específicas, e, assim, não se destinam a limitar a presente invenção. A presente invenção pode ser realizada em várias concretizações, exceto se se desviarem da essência da mesma. Todas as referências do estado da técnica e documentos de patentes, como pedidos de patentes ou publicações de patentes aqui indicadas são incorporadas aqui integralmente por referência, e podem ser usadas para realizar a presente invenção.

Polinucleotídeos e proteínas inéditas

Entre genes que são expressos especificamente em células dendríticas derivadas de medula óssea, que foram identificados na presente invenção, um gene derivado de camundongo tem 5 tipos de isoformas. Referidas isoformas de um gene derivado de camundongo incluem ml, m2, m3 e m4 que são genes de proteína ligada a membrana (proteína de membrana), e sl que é um gene de proteína de tipo secretor (proteína secretora). As seqüências de nucleotídeos e seqüências de aminoácidos de referidas isoformas correspondem aos seguintes números de seqüências. ml SEQID NOS: 11 e 12 m2 SEQID NOS: 1 e 2 m3 SEQ ID NOS: 3 e4 m4 SEQID NOS: 5 e 6 sl SEQ ID NOS: 7 e 8

Entre os genes que são expressos especificamente em células dendríticas derivadas de medula óssea, que foram identificados na presente invenção, um tipo de proteína de membrana pode ser mencionado como um gene derivado de humano. A seqüência de nucleotídeos deste gene e a seqüência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene são como mostradas nas SEQ ID NOS: 9 e 10, respectivamente.

Como a seqüência de nucleotídeos do gene identificado na presente invenção codifica um peptídio-sinal, uma proteína codificada pelo gene previamente indicado forma uma proteína de membrana ou uma proteína secretora. A extremidade C da proteína de membrana de acordo com a presente invenção é modificada (por exemplo, por meio de deleção de uma porção de transmembrana), de modo a se obter uma proteína secretora. A extremidade C da proteína secretora de acordo com a presente invenção é modificada (por exemplo, por meio de adição de uma porção de transmembrana à mesma), de forma a se obter uma proteína de membrana.

Na presente descrição, as expressões "um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou adicionados em uma ou ambas as extremidades" e "um ou mais nucleotídeos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais nucleotídeos são adicionados a uma ou ambas as extremidades" significam que a modificação foi realizada de acordo com métodos técnicos bem conhecidos, como mutagênese sítio direcionada, ou por meio de substituição de um número plural de aminoácidos ou nucleotídeos até serem gerados naturalmente. O número de aminoácidos ou nucleotídeos a serem modificados pode ser, por exemplo, de 1 a 30, de preferência, de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10, ainda mais preferivelmente de 1 a 5, e de forma particularmente preferível 1 ou 2.

A seqüência de aminoácidos modificada pode ser, de preferência, uma seqüência de aminoácidos apresentando uma ou mais (preferivelmente, um ou vários, ou 1, 2, 3 ou 4) substituições conservativas na seqüência de aminoácidos.

A seqüência de nucleotídeos modificada pode ser, de preferência, uma seqüência de nucleotídeos apresentando uma ou mais (por exemplo, de um a vários, ou 1, 2, 3 ou 4) mutações que não afetam as funções de uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

Na presente descrição, o termo "substituição conservativa" significa que um ou mais aminoácidos são substituídos por outros radicais de aminoácidos quimicamente similares, de tal forma que as funções de uma proteína não são modificadas substancialmente. Exemplos de referida substituição conservativa incluem um caso em que um radical hidrofóbico é substituído por outro radical hidrofóbico, e um caso em que um determinado radical polar é substituído por outro radical polar apresentando a mesma carga elétrica. Para cada tipo de aminoácidos, conhece-se no presente campo técnico aminoácidos funcionalmente similares que podem ser substituídos de uma tal maneira. Exemplos de aminoácidos não-polares (hidrofóbicos) incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptofano, fenilalanina, e metionina. Exemplos de aminoácidos polares (neutros) incluem glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina, e cisteína. Exemplos de aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, histidina, e lisina. Exemplos de aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

Na presente descrição, o termo "hibridiza" significa hibridizar com um polinucleotídeo-alvo em condições estringentes. Especificamente, cSO

Φ

pode-se exemplificar um polinucleotídeo apresentando pelo menos 70 % ou mais, de preferência, 80 % ou mais, mais preferivelmente 85 % ou mais, ainda mais preferivelmente 90 % ou mais, ainda mais preferivelmente 95 % ou mais, de forma particularmente preferível 98 % ou mais, e, da forma mais preferível, 99 % ou mais de identidade com a seqüência de nucleotídeos- alvos, quando referida identidade é calculada usando um parâmetro padrão com programa de pesquisa de homologia, como FASTA, BLAST, ou Smith- Waterman [Metk Enzym., 164, 765 (1988)]. Adicionalmente, o termo "em condições estringentes" significa condições em que uma reação é realizada em um tamponador de hibridização que pode ser usado comumente por pessoas versadas na arte, a uma temperatura de 40°C a 70°C, e, de preferência, 60°C a 65°C, e o produto de reação é então lavado com uma solução de lavagem apresentando uma concentração de sal de 15 a 300 mmol/1, e, de preferência, de 15 a 60 mmol/1. Uma tal temperatura e concentração de sal podem ser ajustadas vantajosamente dependendo do comprimento de uma sonda usada. Além disso, condições para lavagem do produto obtido por meio de hibridização pode ser de 0,2 ou 2 χ SSCs 0,1 % de SDS, e uma temperatura de 20°C a 68°C. E possível determinar condições estringentes (alta estringência) ou condições brandas (baixa estringência) efetuando-se uma diferença com uma concentração de sal ou uma temperatura aplicada durante a lavagem. Quando se efetua uma diferença de hibridização do tipo referido com uma concentração de sal, é possível usar 0,2 χ SSC, 0,1 % de DS como um tamponador de lavagem estringente (tamponador de lavagem com alta estringência), e é possível usar 2 χ SSC, 0,1 % de SDS como um tamponador de lavagem brando (tamponador de lavagem de baixa estringência). Por outro lado, quando uma diferença do tipo referido é efetuada com uma temperatura, aplica-se uma temperatura de 68°C no caso de alta estringência, aplica-se uma temperatura de 42°C no caso de estringência moderada, e uma temperatura ambiente (de 20°C a 25°C) no caso de baixa estringência. Em todos os três casos acima, a reação pode ser realizada em 0,2 χ SSC, 0,1 % de SDS.

Em geral, a pré-hibridização é realizada nas mesmas condições que aquelas para hibridização. No entanto, hibridização e pré-lavagem não são sempre realizadas nas mesmas condições.

Hibridização pode ser realizada de acordo com um método conhecido. No caso de se usar uma biblioteca comercialmente obtenível, hibridização pode ser realizada de acordo com o método descrito nas instruções incluídas com a mesma.

Na presente descrição, o termo "identidade" (ocasionalmente referido como "homologia") com relação às seqüências de aminoácidos e seqüências de nucleotídeos significa o grau de coincidência entre as seqüências comparadas em termos de radicais de aminoácidos ou radicais de nucleotídeos que constituem referidas seqüências. Naquele momento considera-se a presença de um espaço [gap] e a propriedade de aminoácidos (Wilbur, Natl Acad Sci U.S.A. 80: 726-730 (1983)). Para cálculo de homologia, é possível usar produtos de programas de busca por homologia comercialmente obteníveis, como BLAST (Altschul: 3. Mol Biol 21.5: 403- 410 (1990)), FASTA (Peasron: Methods in Enzymology 183: 63-69 (1990)), ou Smith-Waterman [Metk Enzym., 164, 765 (1.988)].

O valor numérico de referida "identidade" pode ser calculado usando-se um programa de busca de homologia conhecido por pessoas versadas na arte. Por exemplo, um tal valor numérico como identidade pode ser calculado usando-se um parâmetro default (initialização) no algoritmo de homologia BLAST ((Basic local alignment search tool) [ferramenta básicas de pesquisa de alinhamento local] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (NCBI, National Center for Biotechnology Information).

Na proteína inédita da segunda concretização de acordo com a presente invenção, uma seqüência de aminoácidos apresentando 90 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 pode ser uma seqüência de aminoácidos apresentando, de preferência, 95 % ou mais, de forma particularmente preferível 98 % ou mais, e da forma mais preferível 99 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos previamente indicada.

No polinucleotídeo que codifica a proteína inédita da segunda concretização de acordo com a presente invenção, uma seqüência de nucleotídeos apresentando 90 % ou mais de identidade com a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9 pode ser uma seqüência de nucleotídeos apresentando, de preferência, 95 % ou mais, de forma particularmente preferível 98 % ou mais, e da forma mais preferível 99 % ou mais de identidade com a seqüência de nucleotídeos previamente indicada.

No anticorpo da primeira concretização de acordo com a presente invenção, uma seqüência de aminoácidos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 pode ser uma seqüência de aminoácidos apresentando, de preferência, 80 % ou mais, mais preferivelmente, 85 % ou mais, ainda mais preferivelmente 90 % ou mais, ainda mais preferivelmente 95 % ou mais, de forma particularmente preferível 98 % ou mais, e da forma mais preferível 99 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos previamente indicada.

Na presente invenção, se a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 for dada, é possível determinar facilmente uma seqüência de nucleotídeos que codifica a mesma. Assim, é possível selecionar várias seqüências de nucleotídeos que codificam a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: ou SEQ ID NO: 12. â?

Assim, um polinucleotídeo que codifica uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 inclui não só uma parte de, ou toda a seqüência de DNA da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11, mas também uma seqüência de DNA que codifica os mesmos aminoácidos, que possui um códon apresentando uma relação de degeneração com o mesmo, como uma seqüência de DNA. A presente invenção inclui adicionalmente uma seqüência de RNA correspondentes a uma seqüência de DNA do tipo referido.

Um exemplo preferido do polinucleotídeo que codifica uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 é um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 ou SEQID NO: 11.

Na presente descrição, se uma determinada proteína é ou não funcionalmente equivalente à proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, pode ser determinado avaliando-se um fenômeno biológico ou funções associadas com a expressão da proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12. Por exemplo, isto pode ser determinado permitindo-se que determinada proteína expresse, por meio de técnica de recombinação genética, e então avaliando se a proteína previamente indicada funciona ou não como um receptor ativador de célula dendrítica. A proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 interage com células T e tem a função de ativar células âfl

dendríticas. Assim, para a avaliação previamente indicada, é possível usar as funções a seguir como índice:

- função de mediar adesão de células T (Exemplos 5, 6, IOe

ii);

- função de ativar células dendríticas por meio de estímulo de

reticulação de anticorpos (Exemplo 3):

- função de formar complexo com cadeia FcRy (Exemplo 4);

ou

- uso combinado de várias ou de todas as funções previamente

indicadas.

Polinucleotídeo e proteína de ligante inéditos

Entre genes que são expressos especificamente em células T ativadas como ligantes para proteínas TARM, que foram identificadas na presente invenção, um tipo de gene de proteína de membrana pode ser indicado com um gene derivado de camundongo. A seqüência de nucleotídeos deste gene e a seqüência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene são como mostrado nas SEQ ID NOS: 13 e 14, respectivamente. Adicionalmente, entre genes que são expressos especificamente em células T ativadas como ligantes para proteínas TARM, um tipo de gene de proteína de membrana pode ser indicado como um gene derivado de humano. A seqüência de nucleotídeos deste gene e a seqüência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene são como mostradas nas SEQ ID NOS: 15 e 16, respectivamente.

Na proteína ligante de acordo com a presente invenção, uma seqüência de aminoácidos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16 pode ser uma seqüência de aminoácidos apresentando, de preferência, 80 % ou mais, mais preferivelmente, 85 % ou mais, ainda mais preferivelmente 90 % ou mais, ainda mais preferivelmente 95 % ou mais, de forma particularmente preferível 98 % ou mais, e, da forma mais preferível, 99 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos previamente indicada.

Em um polinucleotídeo que codifica a proteína ligante de acordo com a presente invenção, a seqüência de nucleotídeos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 pode ser uma seqüência de nucleotídeos apresentando, de preferência, 80 % ou mais, mais preferivelmente, 85 % ou mais, ainda mais preferivelmente 90 % ou mais, ainda mais preferivelmente 95 % ou mais, de forma particularmente preferível 98 % ou mais, e, da forma mais preferível, 99 % ou mais de identidade com a seqüência de nucleotídeos previamente indicada.

Na presente invenção, se a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQID NO: 16 for dada, é possível determinar facilmente uma seqüência de nucleotídeos codificando a mesma. Assim, é possível selecionar várias seqüências de nucleotídeos que codificam a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 14 ou SEQID NO: 16.

Assim, um polinucleotídeo que codifica uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16 inclui não só uma parte ou toda a seqüência de DNA da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, mas também uma seqüência de DNA que codifica os mesmos aminoácidos, que possui um códon que apresenta uma relação de degeneração com o mesmo, como uma seqüência de DNA. A presente invenção inclui adicionalmente uma seqüência de RNA correspondente a uma tal seqüência de DNA.

Um exemplo preferido do polinucleotídeo que codifica uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16 é um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15.

Na presente descrição, se uma determinada proteína é ou não funcionalmente equivalente à proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, pode ser determinado avaliando-se um fenômeno biológico ou funções associadas com a expressão da proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. Por exemplo, isto pode ser determinado deixando-se a determinada proteína expressar por meio de técnica de recombinação genética e, depois, avaliar se a proteína previamente indicada funciona ou não como um ligante em uma célula T para um receptor ativador de célula dendrítica. A proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16 liga-se a uma proteína TARM. Assim, para a avaliação previamente indicada, a função de ligação a uma referida proteína TARM (Exemplo 12) pode ser usada como um índice:

A proteína ligante de acordo com a presente invenção tem uma região de transmembrana simples, e é expressa na superfície da célula em uma direção em que o seu lado N-terminal pode ser localizado no espaço extracelular. Assim, usando-se a proteína previamente indicada, é possível produzir anticorpos contra a proteína previamente indicada.

A presente invenção proporciona uma proteína compreendendo um polipeptídio que consiste de pelo menos 6 radicais de aminoácidos ou de toda a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 159 da SEQ ID NO: 14 ou aminoácidos de 1 a 158 da SEQ ID NO: 16. A proteína previamente indicada contém uma porção correspondente à região extracelular da seqüência de aminoácidos de uma proteína TARM-L, e, assim, pode ser usada como um antígeno para a produção de anticorpos contra a proteína previamente indicada.

A presente invenção proporciona o uso da proteína ligante da presente invenção para a produção de anticorpos contra a proteína ligante previamente indicada da presente invenção.

Anticorpo

O anticorpo de acordo com a presente invenção pode reconhecer especificamente uma proteína TARM ou uma proteína TARM-L. Assim, é preferível que uma proteína TARM ou uma proteína TARM-L usada para se obter o anticorpo de acordo com a presente invenção deveria apresentar a antigenicidade de TARM ou TARM-L. Uma proteína TARM ou uma proteína TARM-L do tipo referido inclui uma proteína apresentando uma seqüência de aminoácidos de uma proteína TARM ou uma proteína TARM-L em que um ou mais radicais de aminoácidos são deletados, inseridos, substituídos, ou adicionados. E de conhecimento geral que uma proteína do tipo referido conserva a mesma atividade biológica que aquela da proteína original (Mark et al. (1984) Proc. Natl Acad Sei. USA 81: 5662-6; Zoller e Smith (1982) Nucleie Aeids Res. 10: 6487-500; Wang et ai (1.984) Science 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland et al (1982) Proe. Natl Acad ScL USA 79: 6409-13). Já se conhece um método de produzir uma determinada proteína por meio de deleção, inserção, substituição ou adição de um ou mais aminoácidos com relação à proteína original, enquanto se conserva a antigenicidade da proteína original. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma proteína mutante é preparado por meio de mutagênese sítio direcionada, e uma proteína é então deixada expressar, conforme apropriado (Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1989); Current Protoeols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1987- 1997), seção 8,1-8,5; Hashimoto-Goto et al (1995) Gene 152: 271-5; Kinkel (1985) Proe. Natl Acad Sei USA 82: 488-92; Kramer e Fritz (1987) Method Enzymol 154: 350-67; Kunkel (1988) MethodEnzymol 85: 2763-6). O anticorpo de acordo com a presente invenção também inclui

anticorpos específicos para uma parte da proteína TARM ou proteína TARM- L.

Isto quer dizer que uma proteína TARM do tipo referido ou uma proteína TARM-L usada para obter o anticorpo de acordo com a presente invenção inclui não só um polipeptídio apresentando o comprimento pleno da seqüência de aminoácidos da proteína TARM ou a proteína TARM-L, mas também um fragmento de polipeptídio apresentando pelo menos 6 radicais de aminoácidos (por exemplo, 6, 8, 10, 12, 15 ou mais radicais de aminoácidos) da proteína TARM ou da proteína TARM-L. Na presente descrição, o tipo do fragmento de polipeptídio da proteína TARM ou da proteína TARM-L não é particularmente limitado, desde que possua a antigenicidade da proteína TARM ou da proteína TARM-L.

Um fragmento de polipeptídeo preferido pode ser um fragmento de polipeptídio, como a extremidade amino ou a extremidade carboxila da proteína TARM ou da proteína TARM-L. O sítio determinante de antígeno de um polipeptídio é estimado por meio um método de análise da hidrofobicidade/hidrofilicidade na seqüência de aminoácidos de uma proteína (Kyte-Doolittle (1982) 3. Mol Biol 157: 105-22) ou de um método de análise de uma estrutura secundária (Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 41: 251-76). Em seguida, é possível confirmar um referido sítio determinante de antígeno usando-se um programa de computador (Anal Biochem. 151: 540-6 (1985)), ou aplicando-se meios, como um método PEPSCAN de síntese de um peptídeo curto, e confirmando a antigenicidade do mesmo (Publicação Divulgada de Patente Japonese n° 500684/1985).

O anticorpo de acordo com a presente invenção consiste, de preferência, de anticorpos que apresentam uma influência sobre as funções da proteína TARM ou da proteína TARM-L. Por exemplo, os significados da expressão "apresentando uma influência sobre as funções da proteína TARM" incluem: ativação de células dendríticas por meio do estímulo de reticulação da proteína TARM por meio do anticorpo de acordo com a primeira concretização da presente invenção (Exemplo 3); inibição de adesão de células T à proteína TARM por meio de ligação do anticorpo previamente indicado à proteína TARM (Exemplos 6 e 11); e inibição da formação de

complexo entre a proteína TARM e a cadeia FcRy por meio de ligação do anticorpo previamente indicado à proteína TARM (Exemplo 4). Por exemplo, os significados da expressão "apresentando uma influência sobre as funções da proteína TARM-L" incluem inibição da ligação da proteína TARM-L à proteína TARM por meio de ligação do anticorpo da segunda concretização de acordo com a presente invenção à proteína TARM-L.

O anticorpo de acordo com a presente invenção inclui: um anticorpo monoclonal obtido por meio do uso da proteína TARM ou da proteína TARM-L como um antígeno e imunizando-se um mamífero, como um camundongo, com o antígeno previamente indicado; um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado produzido por meio de recombinação genética; e um anticorpo humano produzido usando-se um animal transgênico produtor de anticorpo humano, ou análogo. Quando o anticorpo de acordo com a presente invenção é administrado como uma droga a um humano, usa- se, de preferência, um anticorpo humano no que se refere a efeitos secundários.

O "anticorpo humano" significa um anticorpo em que todas as regiões são derivadas de humanos. Um anticorpo humano do tipo referido pode ser produzido introduzindo-se um gene de anticorpo humano em um camundongo. Um anticorpo humano do tipo referido pode ser produzido com referência aos métodos descritos, por exemplo, em Nature Genetics, vol. 7, pp. 13-21, 1994; Nature Genetics, vol. 15, pp. 146-156, 1997; Publicação Divulgada de Patente Japonese n° 504365/1992; Publicação Divulgada de Patente Japonese n° 509137/1995; Publicação Internacional W094/25585; Naturei Vol. 368, pp. 856-859, 1994; e Publicação Divulgada de Patente Japonese n° 500233/1994. Adicionalmente, um anticorpo humano do tipo referido também pode ser produzido por meio de um método de apresentação de fago. Este pode ser obtido com referência ao método descrito em Marks, J. D. et ai: 3. Mol Biol, Vol. 222, pp. 581-597, 1991, por exemplo. O "anticorpo humanizado" é um anticorpo produzido por meio de transplante (enxerto de CDR: [região determinadora de complementaridade (CDR, complementarity determining region)]) apenas da seqüência gênica do sítio de ligação de antígeno (CDR; região determinadora de complementaridade) de um anticorpo de camundongo em um gene de anticorpo humano. Um anticorpo humanizado do tipo referido pode ser produzido com referência aos métodos descritos na Publicação Divulgada de Patente Japonese n° 506458/1992 e Divulgação de Patente Japonesa n° 296890/1987, por exemplo.

O "anticorpo quimérico" é um anticorpo produzido ligando-se a região variável de um anticorpo de camundongo à região constante de um anticorpo humano. Especificamente, um camundongo é imunizado com um antígeno, e uma região variável de anticorpo (região V) que se liga ao antígeno é recortada do gene do anticorpo monoclonal de camundongo. A região V assim obtida é então deixada ligar-se a um gene de região constante de anticorpo (região C) derivado de medula óssea humana, de forma a produzir um anticorpo quimérico. Um anticorpo quimérico do tipo referido pode ser produzido com referência ao método descrito na Publicação de Patente Japonesa n° 73280/1991, por exemplo.

O anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção pode ser obtido usando-se um método bem conhecido por pessoas versadas na arte (p. ex. "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons (1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).

Como um imunógeno, é possível usar um fragmento da proteína TARM ou da proteína TARM-L. De outra forma, também é possível usar um antígeno sintetizado com base na seqüência de aminoácidos previamente indicada. Um antígeno do tipo referido pode ser usado em forma de um complexo com uma proteína-veículo. Para preparar um complexo de um antígeno com uma proteína-veículo, é possível usar vários tipos de agentes de acoplamento. E possível usar glutaraldeído, carbodiimida, um éster ativo de maleimida, e análogos. A proteína-veículo pode consistir de produtos comumente usados, como albumina de soro bovino, tiroglobulina, ou hemocianina e é realizada geralmente usando-se um acoplamento numa relação de 1 a 5.

Exemplos de um animal a ser imunizado incluem um camundongo, um rato, um coelho, um porquinho-da-índia, e um hâmster. Um método de inoculação inclui administração subcutânea, administração intramuscular, e uma administração intraperitoneal. Para administração, um antígeno pode ser misturado com adjuvante de Freund completo ou adjuvante de Freund incompleto. A administração é geralmente realizada uma vez a cada 2 a 5 semanas.

Células produtoras de anticorpos obtidas do baço ou nódulo linfático do animal imunizado são submetidas a fusão de células com células de mieloma, e elas são isoladas como hibridomas. Como referidas células de mieloma, é possível usar células derivadas de um camundongo, um rato, um humano ou análogos, e são derivadas, de preferência, da mesma espécie que as células produtoras de anticorpo. No entanto, também há casos em que é possível realizar uma referida fusão de células, mesmo entre as células de espécies diferentes.

A fusão de células pode ser realizada por meio de um método conhecido, como o método descrito Nature, 256, 495, 1975.

Exemplos de um promotor de fusão incluem polietileno glicol e vírus Sendai. Em geral, a fusão de células pode ser realizada deixando-se células produtoras de anticorpos reagirem com células de mieloma usando-se polietileno glicol (peso molecular médio: de 1.000 a 4.000) apresentando uma concentração de aproximadamente 20 % a 50 % a uma temperatura entre 20°C e 40°C, e, de preferência, entre 30°C e 37°C, a uma taxa entre o número Ά Φ

das células produtoras de anticorpo para o número das células de mieloma que é geralmente de aproximadamente 1:1 a 10:1, durante aproximadamente de 1 a 10 minutos.

F

E possível usar vários tipos de métodos imunoquímicos para seleção de hibridomas produtores de anticorpos. Exemplos de um método imunoquímico do tipo referido incluem: um método ELISA usando uma microplaca revestida com a proteína TARM ou a proteína TARM-L; um método ETA usando uma microplaca revestida com um anticorpo anti- imunoglobulina; e um método de imuno-manchamento envolvendo submeter uma amostra contendo a proteína TARM a eletroforese e, depois, usar uma membrana de nitrocelulose.

Adicionalmente, para seleção de referidos hibridomas produtores de anticorpos, é possível aplicar um método de seleção dos hibridomas baseado em se o anticorpo previamente indicado tem ou não uma influência sobre as funções da proteína TARM ou da proteína TARM-L, em lugar do método imunoquímico previamente indicado. Hibridomas produtores de anticorpos podem ser selecionados com base na influencia do anticorpo da primeira concretização de acordo com a presente invenção sobre as funções da proteína TARM, por exemplo, com base em se células dendríticas são ou não ativadas pelo estimulo de reticulação da proteína TARM pelo anticorpo da primeira concretização de acordo com a presente invenção (Exemplo 3), ou se a função da proteína TARM de mediar a adesão de células T pode ou não ser inibida pela ligação do anticorpo previamente indicado à proteína TARM (Exemplos 6 e 11), ou se uma formação de complexo entre a proteína TARM e a cadeia FcRy pode ou não ser inibida por meio de ligação do anticorpo previamente indicado à proteína TARM (Exemplo 4). Hibridomas produtores de anticorpos também podem ser usados com base na influência do anticorpo da segunda concretização de acordo com a presente invenção sobre as funções da proteína TARM-L, por exemplo, com base em se a função da proteína TARM de ligar-se à proteína TARM-L pode ou não ser inibida por meio de ligação do anticorpo da segunda concretização de acordo com a presente invenção à proteína TARM-L. Por meio deste método de seleção é possível selecionar um anticorpo que tem uma influência sobre as funções da proteína TARM ou da proteína TARM-L, que é uma concretização preferida do anticorpo da presente invenção. Além disso, este método de seleção também pode ser realizado como um secundário de seleção, que é realizado após o previamente indicado método imunoquímico de seleção em que um hibridoma produtor de anticorpo é selecionado com base em se ele produz ou não um anticorpo que se liga à proteína TARM ou à proteína TARM-L.

Adicionalmente, a clonagem é realizada em um poço do tipo referido, por exemplo, um método de diluição de limitação, de modo a se obter clones. Seleção e cultura de referidos hibridomas são geralmente realizadas em um meio para células animais (p. ex. RPMI1640) contendo de % a 20 % de soro bovino fetal, a que se adicionou HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina). Os clones assim obtidos são transplantados para a cavidade peritoneal de camundongos SCID, a que se administrou previamente pristano. De 10 a 14 dias mais tarde, coleta-se áscites contendo uma alta concentração de anticorpos monoclonais alta concentração de anticorpos monoclonais, e isto pode ser usado como uma matéria-prima na purificação de anticorpos. De outra forma, os clones previamente indicados são cultivados, e a cultura obtida também pode ser usada como uma matéria- prima na purificação de anticorpos.

Um anticorpo monoclonal pode ser purificado por meio de um método conhecido de purificação de imunoglobulina. Por exemplo, referida purificação de um anticorpo monoclonal pode ser facilmente obtida por meios, como um método de fracionamento com sulfato de amônio, um método de fracionamento com PEG, um método de fracionamento com etanol, o uso de um trocador de ânion, ou cromatografia de afinidade usando- se uma coluna de proteína A, uma coluna de proteína G, e uma proteína TARM.

O "fragmento funcional" da presente invenção significa uma parte de um anticorpo (um fragmento parcial), que reconhece especificamente a proteína da presente invenção. Exemplos específicos de um fragmento funcional do tipo referido incluem Fab, Fab', F(ab')2, um fragmento de região variável (Fv), um Fv ligado com dissulfeto, um anticorpo de cadeia simples (scFv), e um polímero do mesmo.

Exemplos preferidos do anticorpo da primeira concretização de acordo com a presente invenção incluem um anticorpo contra a proteína inédita da primeira concretização de acordo com a presente invenção, e um fragmento funcional do mesmo.

Tais exemplos preferidos do anticorpo da primeira concretização de acordo com a presente invenção também incluem anticorpos contra a proteína inédita da segunda concretização de acordo com a presente invenção, e um fragmento funcional dos mesmos.

Tais exemplos preferidos do anticorpo da primeira concretização de acordo com a presente invenção incluem adicionalmente anticorpos contra as seguintes proteínas:

(ix') uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12;

(x') uma proteína secretora ou de membrana_que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais aminoácidos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 12;

(xi') uma proteína secretora ou de membrana que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; e

(xii') uma proteína secretora ou de membrana_que compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.

Um exemplo mais preferido do anticorpo da primeira concretização de acordo com a presente invenção compreende anticorpos contra uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, ou uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 que contém uma ou mais substituições conservativas, ou um fragmento funcional dos mesmos.

Um exemplo específico é um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma depositado sob o número de acesso n0 FERM BP-10376.

Assim, a presente invenção proporciona um hibridoma (@TARM.ll) depositado no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japão), sob o número de acesso FERM BP-10376 em 15 de julho de 2005.

Outro exemplo mais preferido do anticorpo da primeira concretização de acordo com a presente invenção compreende anticorpos contra uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 que contém uma ou mais substituições conservativas, ou um fragmento funcional dos mesmos.

Um exemplo preferido do anticorpo da segunda concretização de acordo com a presente invenção compreende anticorpos contra uma 36

proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 que contém uma ou mais substituições conservativas, ou um fragmento funcional dos mesmos.

Outro exemplo preferido do anticorpo da segunda

concretização de acordo com a presente invenção compreende anticorpos contra uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 16 ou uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 que contém uma ou mais substituições conservativas, ou um fragmento funcional dos mesmos.

Um exemplo mais preferido do anticorpo da segunda concretização de acordo com a presente invenção compreende anticorpos que reconhecem uma região de polipeptídio que é expressa no espaço extracelular da proteína TARM-Ls ou um fragmento funcional dos mesmos. Um exemplo de um anticorpo do tipo referido compreende anticorpos contra uma proteína compreendendo um polipeptídio que consiste de pelo menos 6 radicais de aminoácidos ou de toda uma seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 159 da SEQ ID NO: 14 ou aminoácidos de 1 a 158 da SEQ ID NO: 16, ou um fragmento funcional do mesmo. Uso de anticorpos e composição farmacêutica

Doenças autoimunes

Como células T, que são linfócitos associados com respostas imunes, atuam sinergicamente com células dendríticas apresentando uma função apresentadora de antígeno para referidas células T, as células T desempenham um papel em várias respostas imunes (Kroczek, RA., et aí. (2004) Current Opinion in Immunology 16: 321-327). Como descrito mais tarde nos exemplos, revelou-se que a expressão de uma proteína TARM em células dendríticas foi incrementada por meio de estímulo inflamatório (Exemplo 2), e que células dendríticas aderiram a células T via a proteína TARM (Exemplos 5 e 10). Adicionalmente, confirmou-se que células dendríticas foram ativadas pela proteína TARM submetida a estímulo de reticulação, e que a produção de IL-6 foi induzida (Exemplo 3). Reportou-se que a produção excessiva de IL-6 está associada com doenças autoimunes (Ishihara, K., et ai. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13: 357-368). Além disso, a adesão das células T a células dendríticas foi suprimida significantemente por anticorpos contra a proteína TARM (Exemplos 6 e 11).

Adicionalmente, nos exemplos indicados mais adiante, confirmou-se que o anticorpo de acordo com a presente invenção exerceu efetivamente um efeito terapêutico sobre um modelo de artrite induzida com colágeno (Exemplo 7). O modelo de artrite induzida com colágeno é um modelo de artrite reumatóide que é uma doença autoimune.

Assim, o anticorpo da primeira concretização de acordo com a presente invenção é útil para o tratamento de doenças autoimunes.

Um exemplo de referidas doenças autoimunes é artrite

reumatóide.

Da mesma forma, considera-se que a adesão de células T a células dendríticas é suprimida por anticorpos contra uma proteína TARM-L. Assim, o anticorpo da segunda concretização de acordo com a presente invenção é útil para o tratamento de doenças autoimunes.

A presente invenção proporciona uso do anticorpo de acordo com a presente invenção para produzir um agente terapêutico para tratar doenças autoimunes.

A presente invenção proporciona um método para tratar doenças autoimunes compreendendo a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo de acordo com a presente invenção a mamíferos incluindo um humano.

Agente para inibir adesão de células T

Como descrito mais adiante nos exemplos, a adesão de células

T a células dendríticas foi significativamente suprimida por anticorpos contra uma proteína TARM (Exemplos 6 e 11). Assim, o anticorpo da primeira concretização de acordo com a presente invenção pode ser usado como um agente para inibir adesão de células T.

Da mesma forma considera-se que a adesão de células T a

células dendríticas é suprimida por anticorpos contra uma proteína TARM-L. Assim, o anticorpo da segunda concretização de acordo com a presente invenção pode ser usado como um agente para inibir adesão de células T.

Na presente descrição, o termo "adesão de células T" meio adesão de células T a células dendríticas, ou seja, a ligação de uma proteína TAJRM expressa em células dendríticas a uma proteína TARM-L expressa em células T. Mediante a inibir da ligação de uma proteína TARM expressa em células dendríticas a uma proteína TARM-L expressa em células T usando-se o agente para inibir adesão de células T de acordo com a presente invenção, é possível suprimir uma resposta imune gerada como um resultado da interação entre células dendríticas e células T, como ativação, crescimento e diferenciação das células dendríticas e células T, e produção de citocina/ quimiocina.

Composição farmacêutica A via de administração do anticorpo de acordo com a presente

invenção não é particularmente limitada. O anticorpo previamente indicado pode ser administrado a mamíferos, incluindo um humano, por meio de administração oral ou administração parenteral (p. ex. injeção intravenosa, injeção intramuscular, administração subcutânea, administração retal, administração percutânea, e administração local). Entre estes, é preferível uma administração parenteral, e em particular, injeção intravenosa.

A forma de dosagem para administração oral e para administração parenteral e o método de produção da mesma são bem conhecidos pelas pessoas versadas na arte. A forma de dosagem para administração oral e administração parenteral pode ser produzida por meio de um processo convencional, por exemplo, por meio de misturação do anticorpo de acordo com a presente invenção, por exemplo, com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Como um veículo farmaceuticamente aceitável do tipo referido, usa-se uma substância que é usada comumente no campo da formulação de drogas e que não reage com o anticorpo de acordo com a presente invenção. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, um excipiente, ligante, desintegrador, lubrificante, agente corante, e agente aromatizante comumente usados; e, conforme necessário, um estabilizante, um emulsificante, um promotor de absorção, um tensoativo, um ajustador de pH, um antisséptico, um antioxidante, um extensor, um agente umidificante, um ativador de superfície, um dispersante, um tamponador, um conservante, um solubilizador, e um agente acalmador, e podem ser formulados de acordo com um método convencional por meio de misturação dos ingredientes comumente usados como matérias-primas para preparações farmacêuticas.

Exemplos de uma forma de dosagem para administração parenteral incluem preparações injetáveis (p. ex. um produto de injeção por gotejamento, um produto de injeção intravenosa, um produto de injeção intramuscular, um produto de injeção subcutânea, e um produto de injeção percutânea), preparações externas (p. ex., um ungüento, um cataplasma, uma loção), um supositório, um inalante, gotas oftálmicas, um ungüento para olhos, gotas nasais, gotas auriculares, e um agente lipossômico.

Uma preparação injetável é preparada dissolvendo-se o anticorpo de acordo com a presente invenção em água destilada usada para

r

injeções, por exemplo. E possível adicionar um solubilizador, um

tamponador, um ajustador de pH, um agente isotonizador, um agente acalmador, um conservante, um estabilizante, etc., em uma preparação injetável do tipo referido, conforme necessário. Adicionalmente, é possível produzir uma preparação injetável em forma de um produto secado por congelamento, que será preparados quando usado.

Exemplos de uma forma de dosagem para administração oral incluem formas de dosagem sólidas e líquidas, como um tablete, um tablete revestido, uma pílula, um párvulo, um grânulo, um pó, uma cápsula, um xarope, uma emulsão, uma suspensão, uma injeção, ou um losango.

A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode conter outros agentes terapeuticamente efetivos. Além disso, também EPO adicionar componentes, como um promotor de fluxo sangüíneo, um germicida, um antiflogístico, um ativador de células, vitaminas, aminoácido, um umidificador, ou uma droga queratolítica, conforme necessário. Ao mesmo tempo, a relação do ingrediente ativo para o veículo pode ser alterada dentro da uma faixa de 1 a 90 % em peso.

Uma dose do anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser determinada por um clínico com base em vários fatores, como via de administração, o tipo de doença, o grau de sintomas, a idade, sexo e peso corporal de um paciente, a gravidade da doença, verificações farmacêuticas, como farmacocinéticos, e características toxicológicas, a presença ou ausência de uso de um sistema de fornecimento de droga, e a possibilidade de ser administrada como uma porção da combinação com outros agentes, e pode ser geralmente de 1 a 5000 mg/dia, de preferência, de 10 a 2000 mg/dia, e mais preferivelmente, de 50 a 2000 mg/dia, para administração oral, e de 1 a 5000 mg/dia, de preferência, de 5 a 2000 mg/dia, e mais preferivelmente, de 50 a 2000 mg/dia, para administração por injeção, cada uma para adulto (peso de 60 kg), que são administradas uma vez ou várias vezes por dia. Quando administrada a uma criança, a dose pode ser menor do que aquela administrada a um adulto. Um método de administração que é aplicado efetivamente pode ser modificado por decisão de um clínico, e assim, a dose aplicada pode ser separada da faixa previamente indicada.

Método de seleção

Método para selecionar para uma substância que inibe adesão de uma célula T a uma proteína TARM

De acordo com o método de seleção da primeira concretização da presente invenção, proporciona-se um método de seleção para triar uma substância que inibe adesão de uma célula T a uma proteína TARM.

A proteína TARM é expressa em células dendríticas e é associada com uma interação que está envolvida na resposta imune entre células dendríticas e células T. Adicionalmente, como um resultado do estímulo de reticulação que é adicionado à proteína TARM, a produção de IL- 6 que pode causar a doença autoimune pode ser induzida. Assim, o método de seleção da primeira concretização da presente invenção pode ser usado para seleção de uma substância que inibe adesão de uma célula T à proteína TARM, e pode ser usado, de preferência, para seleção de uma substância útil para o tratamento da doença autoimune, e mais preferivelmente, artrite reumatóide.

O método de seleção da primeira concretização de acordo com a presente invenção pode compreender adicionalmente a etapa de (c) comparar a atividade de ligação na presença de uma substância de teste com aquela na ausência de uma substância de teste, após a etapa (b).

Na etapa (c), quando a atividade de ligação na presença de uma substância de teste é inferior àquela na ausência de uma substância de teste, e, de preferência, quando é inferior a 50 %, pode-se determinar que a substância de teste inibe a ligação das células T à proteína de acordo com a presente invenção.

O termo "contactar" na etapa (a) não é particularmente limitado, desde que uma proteína TARM seja deixada entrar em contato diretamente com células T. Por exemplo, isto pode ser realizado por meio de um método de adicionar as células T marcadas a uma placa sobre a qual a proteína TARM foi imobilizada, ou por meio de um método de adicionar a proteína TARM marcada a uma placa contendo células T.

As células T são, de preferência, células T ativadas, e mais preferivelmente, células Th2 ativadas.

Na etapa (b), a atividade de ligação pode ser medida por meio de um método conhecido. Por exemplo, as células T marcadas são adicionadas a uma placa sobre a qual uma proteína TARM foi imobilizada, e elas são então cultivadas durante um determinado tempo. Em seguida, células não-aderidas são eliminadas por meio de lavagem ou análogo, e o nível das células aderidas é então medido, obtendo-se com isso a medição da atividade de ligação.

Para a marcação previamente indicada, é possível usar, por exemplo, um radioisótopo, uma enzima, uma substância fluorescente (incluindo uma proteína fluorescente), uma substância luminescente. Exemplos de um radioisótopo usado aqui incluem [3H], [14C], [125I], e [35S]. Exemplos de uma enzima usada aqui incluem β-galactosidase, fosfatase alcalina, peroxidase, e luciferase. Exemplos de uma substância fluorescente usada aqui incluem isotiocianato de fluoresceína, BODIPY, e Calceína-AM (Dojindo Laboratories). Também é possível usar como uma proteína fluorescente, GFP e análogos. Com relação a referidas enzimas e proteínas fluorescentes, o seu gene pode ser introduzido em uma célula e pode, então, ser expresso na mesma. Exemplos de uma substância luminescente usada aqui incluem luciferina e lucigenina. Em alguns casos, é possível usar um sistema de biotina-avidina para permitir que o ligante previamente indicado se ligue a uma substância de marcação.

Além disso, adiciona-se células T não-marcadas, e as células T aderidas podem então ser detectadas por um anticorpo que é específico para as células T, como um anticorpo anti-CD3, ou por um anticorpo que é w

específica para uma célula T auxiliar, como um anticorpo anti-CD4.

Com relação à atividade de ligação, as células adicionadas foram medidas previamente, e podem ser expressas em forma da relação das células aderidas, e isto pode ser expresso em forma da relação das células aderidas para as células adicionadas.

Método para triar uma substância que inibe ativação de uma célula dendrítica

De acordo com o método de seleção da segunda concretização da presente invenção, proporciona-se um método de seleção para triar uma substância que inibe a ativação de uma célula dendrítica.

Células dendríticas podem ser ativadas por uma proteína TARM submetida

a estímulo de reticulação (Exemplos 3 e 4). Assim, um sistema de célula dendrítica que foi submetido a estímulo de reticulação com um anticorpo TARM pode ser usado para triar uma substância que inibe a ativação das células dendríticas.

Como indicado acima, demonstrou-se que a doença autoimune é causado por ativação de células dendríticas. Assim, o método de acordo com a presente invenção para triar uma substância que inibe a ativação de células dendríticas pode ser usado para triar uma substância útil para o tratamento de, de preferência, a doença autoimune, e mais preferivelmente, artrite reumatóide.

Quando estímulo de reticulação é dado a uma proteína TARM que é expressa em células dendríticas, as células dendríticas tornam-se ativadas. Nesse momento, a proteína TARM forma um complexo com o cadeia FcRy conhecido como uma molécula transdutora de sinal, e induz-se a produção de IL-6 que causes doenças autoimunes ou MCP-I que atua como um fator quimiotáctico para monócitos. Assim, na etapa (e) do método de seleção da segunda concretização de acordo com a presente invenção, o nível de ativação de células dendríticas pode ser medido usando-se, como um índice, a quantidade de IL-6 e/ou MCP-I produzida das células dendríticas. De outra forma, o nível de ativação de células dendríticas pode ser medido usando-se, como um índice, o nível de expressão da cadeia FcRy nas células dendríticas.

No método de seleção da segunda concretização de acordo

com a presente invenção, quando o nível de ativação de células dendríticas é medido usando-se, como um índice, a quantidade de IL-6 e/ou MCP-I produzida das células dendríticas, o método de seleção pode compreender adicionalmente a etapa de (f-1) comparar a quantidade de IL-6 e/ou MCP-I produzida na presença de uma substância de teste com aquela de IL-6 e/ou MCP-I produzida na ausência de uma substância de teste, após a etapa (e). Na etapa (f-1), quando a quantidade de IL-6 e/ou MCP-I produzida na presença de uma substância de teste é menor do que aquela de IL-6 e/ou MCP-I produzida na ausência de uma substância de teste, e, de preferência, quando é inferior a 50 %, pode-se determinar que a substância de teste substância de teste inibe a ativação das células dendríticas.

No método de seleção da segunda concretização de acordo com a presente invenção, quando o nível de ativação de células dendríticas é medido usando-se, como um índice, o nível de expressão da cadeia FcRy nas células dendríticas, o método de seleção pode compreender adicionalmente a etapa de (f-2) comparado-se o nível de expressão da cadeia FcRy na presença de uma substância de teste com aquela da cadeia FcRy na ausência de uma substância de teste, após a etapa (e).

Na etapa (f-2), quando o nível de expressão da cadeia FcRy na presença de uma substância de teste é inferior àquele da cadeia FcRy na ausência de uma substância de teste, e, de preferência, quando é inferior a 50 %, pode-se determinar que a substância de teste inibe a ativação das células dendríticas.

Na etapa (d), o termo "contactar" não é particularmente limitado, desde que uma proteína TARM em células dendríticas seja submetida a estímulo de reticulação com o anticorpo de acordo com a presente invenção. Por exemplo, isto pode ser realizado cultivando-se as células dendríticas em um meio que contém o anticorpo de acordo com a presente invenção.

Na etapa (e), a quantidade de uma proteína produzida ou o nível de expressão pode ser medido de acordo com um método conhecido. Também é possível usar um kit comercialmente obtenível.

Método para triar uma substância que inibe formação de complexo entre uma proteína TARM e a cadeia FcRy.

De acordo com o método de seleção da terceira concretização de acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para triar uma substância que inibe uma formação de complexo entre uma proteína TARM e a cadeia FcRy.

A proteína TARM é expressa em células dendríticas e formas um complexo com a cadeia FcRy que tem sido bem conhecida como uma molécula transdutora de sinal. Além disso, sugeriu-se que a cadeia FcRy forma um complexo com a proteína TARM, de modo que a sua expressão é incrementada sobre a superfície da célula. Assim, o método de seleção de acordo com a presente invenção pode ser usado para triar uma substância que inibe a formação de complexo entre a proteína TARM e a cadeia FcRy, e pode ser usado, de preferência, para triar uma substância útil para o tratamento de, de preferência, doenças autoimunes, e mais preferivelmente, artrite reumatóide.

O método de seleção de acordo com a presente invenção pode compreender adicionalmente a etapa de (i) comparar o nível de expressão da cadeia FcRy na presença de uma substância de teste com aquele da cadeia FcRy na ausência de uma substância de teste, após a etapa (h).

Na etapa (i), quando o nível de expressão da cadeia FcRy na presença de uma substância de teste é inferior àquele da cadeia FcRy na ausência de uma substância de teste, e, de preferência, quando é inferior a 50 %, pode-se determinar que a substância de teste inibe a formação de complexo entre a proteína de acordo com a presente invenção e a cadeia FcRy.

Na etapa (g), o termo "contactar" não é particularmente limitado, desde que células dendríticas sobre as quais uma proteína TARM e a cadeia FcRy tenham sido expressas sejam deixadas entrar em contato diretamente com o anticorpo de acordo com a presente invenção. Por exemplo, isto pode ser realizado cultivando-se a células dendríticas em um meio que contém o anticorpo de acordo com a presente invenção.

Na etapa (h), o nível de expressão pode ser medido de acordo com um método conhecido. Por exemplo, o nível de expressão pode ser medido usando-se citometria de fluxo.

Na presente descrição, exemplos da "substância de teste" incluem um composto sintético com baixo peso molecular, uma proteína, um peptídeo sintético, um polipeptídeo purificado ou parcialmente purificado, um anticorpo, uma substância liberadora de bactéria (incluindo um metabólito bacteriano), e um ácido nucleico (anti-sentido, ribozima, RNAi, etc.). Exemplos preferidos incluem um composto ou um sal do mesmo, ou um solvato do mesmo (p. ex. um hidrato), mas exemplos não se limitam aos mesmos. A "substância de teste" pode ser, ou uma substância inédita ou uma substância conhecida.

Exemplos

A presente invenção será descrita em detalhe nos exemplos a seguir. No entanto, os exemplos descritos abaixo não se destinam a limitar o escopo da presente invenção. Nos exemplos, a "proteína TARM" e "proteína TARM-L" podem ser referidas por vezes simplesmente como "TARM" e "TARM-L", respectivamente. Além disso, a proteína TARM derivada de camundongo e a proteína TARM derivada de humano pode ser referida por vezes simplesmente como "mTARM" e "hTARM", respectivamente.

Exemplo 1 - Isolamento do gene de TARM e análise de

expressão

(1) Isolamento do gene mTARM

Células T CD4 separadas de baço de camundongo foram diferenciadas em Thl ou Th2 por meio de cultura in vitro. Um fragmento de cDNA a ser usado como um impelidor ou um testador foi preparado a partir de Thl ou Th2. Em seguida, realizou-se busca com Blast empregando a seqüência de fragmentos de cDNA obtidos durante uma etapa de conduzir um método de subtração de alta sensibilidade (N-RDA). Como um resultado, obteve-se um gene que codifica uma proteína de membrana celular apresentando funções desconhecidas (número de acesso GenBank™ n° NM_177363).

Os iniciadores a seguir foram projetados com base na seqüência de GenBank™ (NM__177363), e analisou-se a expressão do gene mTARM em vários órgãos de um camundongo.

mTARM Fl: GTGACTTTGCAGTGCCAGAA (SEQ ID NO.: 17) mTARM RI: TGCACAGGAGTTGAGTGTCC (SEQ ID NO.: 18)

cDNA de filamento simples foi sintetizado de RNA total de cada órgão (Promega) usando-se kit de PCR de RNA (TAKARA). Empregando referido cDNA de filamento simples como um modelo, realizou- se PCR em tempo real usando AB17700 (Applied Biosystems). A PCR foi realizada usando-se uma solução de reação com a composição a seguir (12,5 μΐ da QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN), 0,25 μΐ de uracila DNA glicosilase (Invitrogen), 0,125 μΐ de iniciador de mTARM 100 μΜ, 0,125 μΐ de iniciador R de mTARM 100 μΜ, 2,5 μΐ de cDNA modelo (diluído 10 vezes), e 7,25 μΐ de água destilada). Para referida PCR, após o tratamento a 94°C durante 10 minutos, repetiu-se um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos e 60°C-1 minuto por 35 vezes. Como um resultado, verificou-se que mTARM foi expressa no rim.

Assim, usando o RNA total do rim, realizou-se 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) e 3-RACE para tentar determinar a seqüência do gene de comprimento pleno de mTARM.

Primeiramente sintetizou-se cDNA de filamento duplo a partir de RNA total do rim de camundongo usando o kit de síntese de cDNA (TAKARA), e cDNA foi então purificado usando-se kit de purificação de PCR Qiaquick (QIAGEN). Subseqüentemente, adicionou-se a isto uma adaptador ad29 (um produto obtido por meio de recombinação de ad29S (acatcactccgt; SEQ ID NO: 19) e ad29A (acggagtgatgtccgtcgacgtatctctgcgttgatacttcagcgtagct; SEQ ID NO: 20)), de forma a produzir um modelo de RACE.

Realizou-se Ia PCR usando uma solução de reação com a seguinte composição (5 μΐ de 10 χ tamponador ExTaq, 4 μΐ de 2,5 mM de dNTP, 0,25 μΐ de ExTaq, 0,5 μΐ de iniciador 100 μΜ (5'PCR4), 0,5 μΐ de iniciador específico para Gene 100 μΜ, 1 μΐ de cDNA adicionado a adaptador ad29 (diluído 25 vezes), e 38,75 μΐ de água destilada).

As seqüências a seguir foram usadas como iniciadores. 5TCR4: AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO.: 21) mTARM_RACE_5'_4: CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT (SEQ ID NO.: 22), ou

mTARMJlACEJM: G GAG AGTACACCTGTGAATACTAC (SEQ ID NO.: 23)

Para referida PCR, após o tratamento a 94°C durante 5 minutos, um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos, 65°C-1 minuto, e Il0C-S minutos foi repetido 30 vezes. Finalmente, realizou-se uma reação a 72°C durante 5 minutos.

Realizou-se 2a PCR usando uma solução de reação com a

seguinte composição (5 μΐ de 10 χ tamponador ExTaq, 4 μΐ de dNTP 2,5 mM, 0,25 μΐ de ExTaqj 0,5 μΐ de iniciador 100 M (5'PCRl), 0,5 μΐ de iniciador específico para Gene 100 μΜ, 1 μΐ do I0produto de PCR (diluído 100 vezes), e 38,75 μΐ de água destilada).

As seqüências a seguir foram usadas como iniciadores.

5'PCRl: GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG (SEQ ID NO.: 24) mTARM_RACE_5'_3: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO.: 25), ou

mTARM RACE_3'_3: CTACAGAAAAGCATCCCCCCACATCCT TTC (SEQ ID NO.: 26)

Para referida PCR, após o tratamento a 94°C durante 5 minutos, um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos, e 72°C-5 minutos foi repetido 25 vezes. Finalmente, uma reação foi realizada a 72°C durante 5 minutos. O fragmento de cDNA amplificado foi clonado em pCR2.1 (Invitrogen), e a seqüência de nucleotídeos do mesmo foi determinada usando-se o analisador de seqüências ABI3100 (Applied Biosystems).

Como um resultado, obteve-se 2 tipos de cDNAs em 5 'RACE, e obteve-se 3 tipos de cDNAs em 3'RACE, e, assim, clarificou-se a presença de isoformas de recomposição.

Usando informação de seqüência de nucleotídeos obtida por meio de RACE, projetou-se iniciadores para amplificar isoformas de recomposição. CDNA de filamento duplo foi sintetizado do RNA total de medula óssea de camundongo usando-se o kit de síntese de cDNA (TAKARA), e cDNA foi então purificado usando-se o kit de purificação de PCR Qiaquick (QIAGEN). PCR foi realizada usando-se uma solução de reação com a seguinte composição (5 μΐ de IOx tamponador ExTaq, 4 μΐ de dNTP 2,5 mM, 0,25 μΐ de ExTaq, 0,5 μΐ de iniciador 100 μΜ a 5', 0,5 μΐ de iniciador 100 μΜ a 3', 1 μΐ de cDNA (diluídos 25 vezes), e 38,75 μΐ de água destilada).

As seqüências a seguir foram usadas como iniciadores.

InTARMJ1UTR: GCTGATAGTAGACCTGCTGAAGAC (SEQ ID NO.: 27)

mT ARM3 'UTR-1: GTCCAGATATGTCCAGGCCTCTG (SEQ ID NO.: 28), ou

mTARM-3'UTR-2: TTCAGTTATTTTACCAGGGTTTA (SEQ ID NO.:

29)

Para a PCR, após o tratamento a 94°C durante 5 minutos, um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos, e 72°C- minutos foi repetido 35 vezes. Finalmente, uma reação foi realizada a 72°C durante 5 minutos. Com 2 tipos de iniciadores, foi possível confirmar 6 tipos de isoformas de recomposição. Como um resultado, obteve-se produtos de amplificação em 5 tipos de 6 combinações de isoformas de recomposição putativas. O fragmento de cDNA amplificado foi clonado em pCR2.1 (Invitrogen), e a seqüência de nucleotídeos do mesmo foi determinada usando o analisador de seqüências ABI3100.

Como um resultado, revelou-se que estavam presentes isoformas de recomposição que codificam 4 tipos de genes de TARM ligado a membrana (ml, m2, m3 e m4) e um tipo de gene de TARM de tipo secretora (sl) (Figura 1).

(2) Análise de expressão de genes de mTARM

Analisou-se a expressão de genes de mTARM em tecidos normais de camundongo. Como descrito acima, como estavam presentes as isoformas de recomposição, projetou-se 3 tipos de conjuntos de iniciadores.

Conjunto 1 (iniciadores foram projetados de tal forma que pudessem amplificar especificamente as isoformas ml e m2.)

mTARM_gF2: TCTGTGATAGACAACCATCT (SEQ ID NO.: 30) mTARM_gR2: GTCATTGTACCCGGGGTCTT (SEQ ID NO.: 31) Conjunto 2 (Iniciadores foram projetados de tal forma que pudessem amplificar especificamente as isoformas m3 e m4).

mTARM_gF4: ATGACAGAAGGCTACACTGTGGATAA (SEQ ID NO.: 32)

mTARM_gR3: TCATTTTTCTCCTGGGGCAC (SEQ ID NO.: 33)

Conjunto 3 (Iniciadores foram projetados para que pudessem amplificar especificamente a isoforma sl);

mTARM_gF3: GATCTCTGTGATAGATGCAAG (SEQ ID NO.: 34) mTARM_gR2: GTCATTGTACCCGGGGTCTT (SEQ ID NO.: 35)

Usando o kit de PCR de RNA (TAKARA), sintetizou-se cDNA de filamento simples a partir de RNA total preparado de cada órgão de mouse usando o kit RNeasy mini kit (QIAGEN) ou do RNA total adquirido de cada órgão (Promega). Usando o cDNA de filamento simples assim sintetizado como um modelo, realizou-se PCR em tempo real usando AB17700. A PCR foi realizada usando-se uma solução de solução de reação com a seguinte composição (12,5 μΐ de mix Master de PCR verde QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN), 0,25 μΐ de uracila DNA glicosilase (Invitrogen), 0,125 μΐ de iniciador F 100 μΜ, 0,125 μΐ de iniciador R 100 μΜ, 2,5 μΐ de cDNA de modelo (diluído 10 vezes), e 7,25 μΐ de água destilada).

Para referida PCR, após o tratamento a 94°C durante 10 minutos, um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos e 60°C-1 minuto foi repetido 35 vezes.

Como um resultado, verificou-se que mTARM foi intensamente expressa em medula óssea (Figura 2).

Subseqüentemente, analisou-se a expressão de mTARM em vários tipos de células.

Usando mini kit RNeasy (QIAGEN), RNA total foi preparado de cada uma das células separadas e purificadas de baço de camundongo, φ

células cultivadas in vitro, e vários tipos de linhas de células. Em seguida, sintetizou-se cDNA de filamento simples a partir de RNA total usando o kit de PCR de RNA (TAKARA). Usando o cDNA de filamento simples como um modelo, realizou-se PCR em tempo real usando AB17700 da mesma maneira que para análise de expressão em tecidos de camundongo normais.

Como um resultado, verificou-se que mTARM foi intensamente expressa em células dendríticas derivadas de medula óssea (Figura 3).

Exemplo 2 - Preparação de anticorpo contra TARM de camundongo e análise de expressão

(1) Preparação de células que expressam mTARM

Um vetor de expressão de gene de mTARM foi preparado

como a seguir.

Iniciadores foram projetados com base na seqüência de nucleotídeos da isoforma ml.

mTARM F2: cgcgtcgacgccaccATGATCTCTAGGCTCCTTTCCCTT (SEQID NO.: 36)

mTARM R2: gcgggcggccgcTTACCAGGGTTTATTTGGAGACAG (SEQ ID NO.: 37)

Usando kit de PCR de RNA (TAKARA), sintetizou-se cDNA de filamento simples a pártir de RNA total de medula óssea. O cDNA de filamento simples assim sintetizado foi usado como um modelo. PCR foi realizada usando-se uma solução de reação com a seguinte composição (5 μΐ de 10 χ tamponador, 4 μΐ de 2,5 mM de dNTP, 0,5 μΐ de Pyrobest polimerase (TAKARA), 0,5 μΐ de cada um de iniciadores 100 μΜ, 1 μΐ de cDNA, 2,5 μΐ de DMSO, e 36 μΐ de água destilada). Para referida PCR, após o tratamento at 94°C durante 5 minutos, um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos, e Il0C-S minutos foi repetido 35 vezes. Finalmente, realizou-se uma reação a 72°C durante 2 minutos. O cDNA 53

r

amplificado foi clonado em pBlueScriptII SK(+) (Stratagene), e a sua seqüência de nucleotídeos foi então confirmada usando-se o analisador de seqüência ABI3100. O fragmento de cDNA obtido foi inserido em um vetor de expressão pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050-3058), de forma a preparar um vetor de expressão de gene de mTARM.

Retrovírus recombinante foi preparado como a seguir.

3 χ IO6 células 293/EBNA-l (Invitrogen) foram suspensas em um meio (D-MEM/10 % de FBS), foram colocadas em um disco de 10 cm, e foram então cultivadas em um incubador com CO2 durante 24 horas. No dia seguinte, o meio foi trocado por outro fresco, e preparou-se uma solução de transfecção como descrito abaixo que lhe foi então adicionada, de forma a realizar a transfecção. A solução de transfecção foi preparadas adicionando-se 600 μΐ de OPTI-MEM (GIBCO BRL) e 24 μΐ de TransIT LTl (TaKaRa) em um tubo de 5 ml para misturar os mesmos, depois incubar a mistura à temperatura ambiente durante 5 minutos, e depois adicionando 9 μg de um vetor de expressão e 9 μg de pCL-Eco (Imgenex) usado como um vetor de empacotamento para a mistura de reação, seguido de incubação da mistura à temperatura ambiente durante 5 minutos. 48 horas mais tarde, o sobrenadante de cultura foi recuperado, e realizou-se então filtração com um filtro de 0,45 μηι, de forma a se obter uma solução de vírus recombinante.

Células B300.19 (EMBO J. (1984) 3: 1209-1219) foram infectadas com este vírus recombinante como descrito abaixo, de forma a preparar células que expressam mTARM. As 1 χ IO6 células B300.19 foram adicionadas em um tubo de 15 ml, e foram então centrifugadas a 1200 rpm a 25°C durante 5 minutos. Em seguida, o sobrenadante de cultura foi descartado por meio de aspiração. Obteve-se uma solução por meio de adição da mistura de 2 μΐ de polibreno (10 mg/ml) e adicionou-se às células 2 μΐ de 2- mercaptoetanol 55 μΜ para 2 ml da solução de vírus recombinante solução de vírus recombinante. A mistura obtida foi então centrifugada a 2500 rpm a r

3 O0C durante 2 horas, de forma que as células foram infectadas com o vírus recombinante. Após completar a infecção, a solução de vírus recombinante foi descartada, e adicionou-se a isto um meio (RPMI-1640/10 % FBS/55 μΜ 2- mercaptoetanol), seguido de cultura. Células positivas para EGFP foram separadas por meio de triagem de células, de forma a se obter células que expressam mTARM.

(2) Preparação de proteína quimérica região extracelular de mTARM fundida a SEAP ou Fc

Primeiramente, preparou-se um vetor pcDNA3.1(+)- SEAP(His)i0-Neo como a seguir.

O sítio Sall endógeno de um vetor pcDNA3.1(+)-Neo (Invitrogen) foi digerido com SaR9 seguido de dessensibilização e re-ligação, de forma a ser deletado.

O fragmento de cDNA de SEAP(His)i0 foi amplificado por meio de PCR usando pDREF-SEAP His6-Hyg (J. Biol Chem., 1996, 271, 21514-21521) como um modelo e também usando um iniciador adicionado HindIII a 5' e um iniciador adicionado XhoI a 3'. O fragmento de cDNA obtido foi digerido com HindIII e XhoIj e foi então inserido no vetor pcDNA3.1(+)-Neo em que o sítio SaR fora deletado. Subseqüentemente, a região extracelular de mTARM foi

amplificada por meio de PCR usando-se cDNA de comprimento pleno de mTARM como um modelo e também usando-se um iniciador Sa/I-adicionado a 5' (mTARM_F2: (SEQ ID NO: 36)) e um iniciador NotI-adicionado 3' (mTARM_R3: cgcggcggccgcattatccacagtgtagccttctgtcat (SEQ ID NO: 38)). A PCR foi realizada em uma solução de reação com a seguinte

composição (5 μΐ de IOx tamponador, 4 μΐ de 2,5 mM de dNTP, 0,5 μΐ de Pyrobest polimerase (TAKARA), 0,5 μΐ de cada um de iniciadores 100 μΜ, 1 μΐ de cDNA, 2,5 μΐ de DMSO, e 36 μΐ de água destilada). Para referida PCR, após o tratamento a 94°C durante 5 minutos, um ciclo de reação consistindo ξό

de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos, e 72°C-5 minutos foi repetido 35 vezes. Finalmente, uma reação foi realizada a 72°C durante 2 minutos. O cDNA amplificado foi clonado em pBlueScriptII SK(+) (Stratagene), e a sua seqüência de nucleotídeos foi então determinada usando-se analisador de seqüência ABI3100. O fragmento de cDNA obtido foi digerido com Sall e NotI, e então inserido no vetor de expressão previamente indicado vetor pcDNA3.1(+)-SEAP(His)i0-Neo, de forma a se preparar um vetor de expressão de mTARM-AP.

Com isto, a região extracelular de mTARM é fundida através de ligante de 3 aminoácidos (Ala-Ala-Ala) a fosfatase alcalina placentar humana de tipo secretora apresentando um marcador 10-histidina (His)io na sua extremidade C-terminal a ser expressa como uma proteína quimérica secretora (referida a seguir como proteína quimérica AP). O vetor de expressão de proteína quimérica AP obtido foi introduzido em células 293/EBNA-l usando TransIT LTl (TAXARA), e foram então cultivados durante 4 ou 5 dias. Em seguida, o sobrenadante de cultura foi recuperado por meio de centrifugação, e a proteína quimérica AP secretada no sobrenadante foi então filtrada com um filtro de 0,22 μπι. Em seguida, adicionou-se a isto Hepes (pH 7,4) e azida de sódio a concentrações finais de 20 mM e 0,02 %, respectivamente, e o produto obtido foi armazenado a 4°C. A concentração da proteína quimérica AP foi calculada medindo-se a atividade de fosfatase alcalina usando ensaio de genes repórter quimioluminescentes Aurora AP (ICN).

(3) Preparação de anticorpo monoclonal contra mTARM Para uso como um antígeno na imunização, primeiramente

purifica-se a proteína quimérica de mTARM-AP.

Referida purificação foi realizada utilizando-se o marcador de histidina existente na extremidade C da proteína quimérica AP e usando o kit His Trap (Amersham Biosciences). Um sobrenadante de cultura contendo a proteína quimérica de mTARM-AP foi adicionado em uma coluna de HP queladora de 1 ml HiTrap (Amersham Biosciences), seguido de lavagem com uma solução de imidazol 10 mM. Em seguida, a proteína quimérica de mTARM-AP foi eluída da coluna usando-se uma solução de imidazol 500 mM. A concentração da proteína quimérica de mTARM-AP foi calculada pela medição da atividade de enzima usando-se ensaio de gene repórter quimioluminescente Aurora AP (ICN) e pela quantificação de proteína usando-se o kit de ensaio de proteína II (BIO-RAD).

A proteína quimérica de mTARM-AP obtida foi misturada com TiterMax, e foi então imunizada em ratos WKY (Japan SLC, Inc.). Linfócitos foram isolados dos ratos assim imunizados. Os linfócitos foram misturados com células de mieloma P3 (ATCC), de tal forma que a relação das células de mieloma P3 para os linfócitos se tornou 1:5. Em seguida, realizou-se fusão de células empregando uma solução de PEG15 00 (Boehringer). Hibridomas foram selecionados em um meio HAT (Invitrogen), e um sobrenadante de cultura dos hibridomas obtidos foi submetido a seleção por meio de ELISA de sanduíche usando-se uma proteína quimérica de mTARM-Fc. Clonagem foi realizada, e obteve-se 3 tipos de clones (#6, #21 e #37) de células positivas. Células B300.19, em que se introduziu mTARM- IRES-EGFP, foram deixadas reagir com os anticorpos anti-mTARM, seguido de análise de FACS. Como um resultado, os anticorpos gerados reagiram apenas com células B300.19 em que EGFP foi expresso (Figura 4B), e assim confirmou-se a especificidade dos anticorpos anti-mTARM.

Hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais anti- mTARM #6, #21 e #37 foram inoculados na cavidade peritoneal de camundongos nus, e obteve-se então áscites. Em seguida, anticorpos foram purificados usando-se uma coluna de proteína G. O hibridoma produzindo o anticorpo monoclonal anti-mTARM #6 foi depositado no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism

Depositary^ sob o número de acesso FERM BP-10376.

(4) Expressão de proteína TARM em células dendríticas cultivadas derivadas de medula óssea

Usando-se o anticorpo monoclonal (mAb) obtido, analisou-se a expressão de uma proteína TARM sobre as superfícies celulares das células dendríticas cultivadas derivadas de medula óssea.

Referidas células dendríticas cultivadas derivadas de medula óssea foram preparadas por meio do método a seguir. As células de medula óssea de camundongos C57BL/6 machos (Japan SLC, Inc.) foram suspensas em um meio (RPMI1640/10 % FBS/1 mM de piruvato de sódio/55 μΜ 2- mercaptoetanol) que continha GM-CSF de camundongo (20 ng/ml) (R & D system) a uma concentração de 2 χ IO6 células/10 ml. As células foram colocadas em discos não revestidos de 10 cm, e foram então cultivados. 3 dias mais tarde adicionou-se 10 ml de meio que continha GM-CSF de mouse (20 ng/ml), e a cultura foi prosseguida. Adicionalmente, 3 dias mais tarde, recuperou-se 10 ml da solução de cultura e, então, isto foi centrifugado. Em seguida, agregados de células foram suspensos em 10 ml de meio fresco que continha GM-CSF de camundongo (20 ng/ml), e a suspensão obtida foi então devolvida aos discos de 10 cm não revestidos originais, seguido de cultura durante 2 dias. As células dendríticas imaturas assim obtidas foram suspensas em um meio que continha LPS (100 ng/ml) (Sigma) a uma concentração de 1 χ 10 células/10 ml. As células foram colocadas em discos de 10 cm, e foram então cultivadas durante 1 dia, de forma a se obter células dendríticas maduras.

Células dendríticas imaturas derivadas de medula óssea foram

suspensas em um tamponador FACS (PBS/1 % FBS/1 mM de EDTA) que continha 5 % de soro de camundongo, e foram reagidas com anticorpo #6 ou anticorpo #21 (10 μg/ml). Em seguida, as células foram incubadas com anticorpo secundário de IgG anti-rato de burro marcado com PE (Jackson), seguido de medição com FACSCalibur (Becton Dickinson). Como um resultado, ambos, o anticorpo #6 e anticorpo #21, mostraram reações positivas que foram mais fortes do que aquelas obtidas com IgG de rato usadas como um controle negativo.

Assim, para analisar de maneira detalhada células expressando mTARM, anticorpo foi marcado fluorescentemente com o kit de marcação de anticorpo monoclonal Alexa 647 (Molecular Probe). Subseqüentemente, células dendríticas imaturas ou células dendríticas maduras obtidas por meio de estímulo com LPS foram suspensas em um tamponador de FACS (PBS/1 % FB S/1 mM de EDTA) que continha 5 % de soro de camundongo e 5 % de soro de rato. Adicionou-se solução de bloqueio de FcR (BD Pharmingen) à suspensão e isto foi incubado sobre gelo durante 10 minutos. Em seguida, a mistura de reação foi reagida sobre gelo durante 30 minutos com um anticorpo anti-mTARM marcado fluorescentemente, um anticorpo de marcador de célula dendrítica anti-CDllc, e um anticorpo de marcador de ativação anti-CD40, e mediu-se depois o nível de expressão da proteína mTARM usando FACSCalibur.

Como um resultado, revelou-se que a proteína mTARM foi expressada tanto em células dendríticas imaturas como em maduras, que a expressão da proteína mTARM foi incrementada em células dendríticas da medula óssea maduras ao invés de em células dendríticas imaturas, e que a proteína mTARM foi intensamente expressa em células em que o marcador de ativação CD40 foi expresso (Figura 5).

(5) Expressão de proteína TARM em camundongo normal

Como a expressão de mTARM foi confirmada em células dendríticas derivadas de medula óssea, analisou-se a expressão de uma proteína mTARM nos tecidos imunes de camundongos normais.

Células foram preparadas a partir de medula óssea, sangue periférico, baço, nódulo linfático mesentérico e remendo de Peyer de camundongos C57BL/6 machos. As células assim preparada foram suspensas em um tamponador FACS (PBS/1 % FBS/1 mM de EDTA) que continha 5 % de soro de camundongo e 5 % de soro de rato. Adicionou-se solução de bloqueio de FcR à suspensão e isto foi incubado sobre gelo durante 10 minutos.

Em seguida, a mistura de reação foi reagida sobre gelo durante minutos com um anticorpo anti-mTARM marcado fluorescentemente e vários tipos de anticorpos marcadores de linhagem de células marcadas fluorescentemente, e o nível de expressão da proteína mTARM foi então medido usando-se FACSCalibur.

Como um resultado, nos tecidos imunes de camundongos normais, não se observou a expressão da proteína mTARM em todas as células T CD3+, células NK DX5+, células mielóides CDllb+ e células dendríticas CDl Ic+ no baço (SP), e células B B220+, macrógados/monócitos F4/80+, neutrófilos SSC high/Grl+ e SSC eosinófilos high/F4/80+ no sangue periférico (PBL) (Figura 6).

Assim, a expressão da proteína mTARM em tecidos periféricos de camundongos normais foi analisada usando-se células preparadas da cavidade peritoneal dos mesmos.

Como um resultado, não se observou expressão da proteína mTARM em células T CD3+, células NK DX5+, células dendríticas CDl Ic+, células B B220+, F4/80+ monócitos/macrófagos, e SSC neutrófilos high/Grl+ da cavidade peritoneal. No entanto, referida expressão foi observada em uma parte das células mielóides CDllb+. Assim, realizou-se análise adicional. Como um resultado, revelou-se que a proteína mTARM foi expressa em mastócitos c-kit+ (Figura 7).

(6) Indução de expressão de proteína TARM em células dendríticas por meio de estímulo inflamatório de LPS

A proteína mTARM foi expressa nas células dendríticas cultivadas, mas tal expressão da proteína mTARM não foi observada em células dendríticas preparadas de tecidos periféricos e linfóides de camundongo. Assim, considerou-se que a expressão da proteína mTARM foi induzida por meio de estímulo inflamatório in vivo. Assim, administrou-se 100 μg de LPS intraperitonealmente a camundongos C57BL/6 machos. De 14 a 18 horas mais tarde, células foram recuperadas de nódulo linfático mesentérico, e analisou-se então a expressão de proteína mTARM.

Como um resultado, expressou-se a expressão da proteína mTARM em células dendríticas mielóides CDl lc+/CDl Ib+ que se moveram para o nódulo linfático mesentérico por meio de estímulo inflamatório com LPS (Figura 8). Assim, revelou-se que a proteína mTARM não foi expressa sobre toda a superfície celular de células dendríticas in vivo em condição normal, mas foi expressa seletivamente em células dendríticas, e em particular, em células dendríticas mielóides durante inflamação. Assim, sugeriu-se que a proteína mTARM funcionou em células dendríticas durante a inflamação.

Exemplo 3 - Ativação de células dendríticas derivadas de medula óssea cultivadas por anticorpo anti-TARM

O mTARM foi expresso seletivamente em células dendríticas. Assim, analisou-se a ativação de referidas células dendríticas pelo estímulo de reticulação da mTARM.

Células dendríticas imaturas ou maduras derivadas de medula

o

óssea foram suspensas a uma concentração de 1 χ 10 células em 350 μΐ de um tamponador MACS (PBS/l % de FBS/2 mM de EDTA). Adicionou-se 50 μΐ de solução de bloqueio de FcR (Miltenyi) à suspensão e isto foi incubado a 4°C durante 10 minutos. Em seguida, adicionou-se 100 μΐ de micropérolas CDllc (Miltenyi) à mistura de reação e isto foi incubado a 4°C durante 30 minutos. Em seguida células CDllc+ foram separadas e purificadas usando Auto MACS (Miltenyi). Um anticorpo de IgG anti-rato F(ab)'2 (10 μ§/πι1) (Jackson) foi imobilizado em uma placa de 96 poços a 37°C durante 2 horas, e a placa foi então lavada com PBS. Em seguida, usou-se anticorpo anti- mTARM #6, #21, ou IgG de rato (10 μ^ηιΐ) como um controle negativo foi imobilizada na placa a 37°C durante 1 hora. Em seguida, a placa foi lavada com PBS, e as células dendríticas CDllc+ purificadas foram cultivadas em um meio, ou em um meio que continha um anticorpo anti-CD40 agonista (BD Pharmingen) a uma concentração final de 2 μ§/πι1. 24 ou 48 horas mais tarde, o sobrenadante de cultura foi recuperado, e citocinas foram então detectadas usando o kit de desenvolvimento DuoSet ELISA (R & D). Como um resultado, revelou-se que o anticorpo anti-mTARM

induziu produção de IL-6 de células dendríticas maduras derivadas de medula óssea em um nível similar àquele com que o anticorpo anti-CD40, e apresentou um efeito aditivo com o anticorpo anti-CD40 (Figura 9A). De forma similar, o anticorpo previamente indicado tendeu a induzir produção de IL-6 também de células dendríticas imaturas. Além disso, a produção induzida com anticorpo anti-mTARM de MCP-I de células dendríticas da medula óssea imaturas, mas o anticorpo anti-CD40 não induziu referida produção de MCP-I (Figura 9B). Não se observou indução de produção de MCP-I pelo anticorpo anti-mTARM em células dendríticas da medula óssea maduras. Adicionalmente, analisou-se também a indução de produção de IL- 12, TNFa, IL-I β, IL-10, e KC, mas o anticorpo anti-mTARM não exerceu efeitos significativos em ambas as células dendríticas imaturas e maduras.

Dos resultados acima, confirmou-se que mTARM em células dendríticas está associada com a produção de citocinas específicas e quimiocinas (p. ex. IL-6 e MCP-1).

Exemplo 4 - Formação de complexo entre TARM e cadeia

FcRy

Revelou-se que mTARM funcionou como um receptor de ativação de célula dendrítica. Em seguida, examinou-se uma molécula de

transdução de sinal. A mTARM tem uma região de transmembrana similar àquela de Oscar que está envolvida na diferenciação de osteoclastos. Sabe-se que Oscar forma um complexo com a cadeia FcRy, uma molécula de transdução de sinal bem conhecida como um componente do receptor de IgE.

Considerou-se que a interação entre um aminoácido básico na região de transmembrana celular de Oscar e um aminoácido ácido da cadeia FcRy está envolvida na associação previamente indicada. A mTARM também tem um aminoácido básico em sua região de transmembrana. Por outro lado, DAPlO e DAP12 são conhecidas como moléculas de transdução de sinal de ativação apresentando um aminoácido ácido em sua região de transmembrana, como com a cadeia FcRy. Assim, analisou-se a possibilidade de uma formação de complexo entre a cadeia FcRy, DAPlO ou DAP12, e a mTARM.

Cada um dos vetores de expressão da cadeia FcRy, DAPlO e DAP12 foi produzido inserindo-se um fragmento de cDNA amplificado usando-se os iniciadores a seguir que foram projetados com base nas seqüências de nucleotídeos como mostrado em NM_010185, AF072846 e NM_011662 do GenBank™ em um vetor de expressão pMXII IRES-Puro proj etado de tal forma que uma seqüência marcadora Flag ligada à extremidade N pode ser expressa sobre a superfície celular.

FcRy F: cgcctcgagCTGGGAGAGCCGCAGCTCTGCTAT (SEQ ID NO.: 39)

FcRy R: gcgggcggccgcCTACTGGGGTGGTTTCTCATGCTT (SEQ ID NO.: 40)

DAPlO F: cgcgtcgacCAGACATCGGCAGGTTCCTGCTCC (SEQ ID NO.: 41)

DAPlO R: gcgggcggccgcTCAGCCTCTGCCAGGCATGTTGAT (SEQ ID NO.: 42)

DAP12 F: cgcgtcgacTTAAGTCCCGTACAGGCCCAGAGT (SEQ ID NO.: 43) DAP12 R: gcgggcggccgcTCATCTGTAATATTGCCTCTGTGT (SEQ ID NO.: 44)

Em seguida, preparou-se retrovírus recombinante por meio do método similar àquele aplicado para preparar células que expressam mTARM, e células B300.19 expressando mTARM foram então infectadas com o retrovírus recombinante. Em seguida, as células foram cultivadas na presença de puromicina, e as células infectadas foram então selecionadas. Os transfectantes B300.19 obtidos foram suspenso em um tamponador FACS (PBS/1 % de FBS/1 mM de EDTA) e reagidas com anticorpo #6 e um anticorpo anti-Flag de camundongo (Sigma) a uma concentração final de 10 μ§/ιη1. Em seguida, isto foi reagido com um anticorpo secundário de IgG anti- rato de burro marcado com PE (Jackson) e um anticorpo secundário de IgG anti-camundongo de burro marcado com Cy5 (Jackson), seguido da medição do nível de expressão usando FACSCalibur (Becton Dickinson).

Como um resultado, revelou-se que quando a mTARM e a cadeia FcRy foram expressas simultaneamente, o nível de expressão da cadeia FcRy na superfície da célula foi incrementado, como o nível de expressão da mTARM na superfície celular foi incrementado. Os níveis de expressão de DAPlO e DAP12 na superfície da célula não dependem do nível de expressão da mTARM. Assim, sugeriu-se que o nível de expressão da cadeia FcRy na superfície celular foi incrementado por sua formação de um complexo com a mTARM (Figura 10).

Subseqüentemente, proteínas de ligação de mTARM foram analisadas bioquimicamente.

Transfectantes de B300.19 foram solubilizados em um tamponador de Iise celular contendo 1 % de digitonina (1 % de digtonina/50 mM de Tris-HCl (pH 7,5)/150 mM de NaCl/5 mM de NaF/1 mM de ortovanadato/Complete™(Roche)). Imunoprecipitação foi realizada usando-se um anticorpo anti-Flag, e análise de imuno-manchamento realizada usando r

5

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20

Exemplo 5 - Adesão de linfócitos ativados a TARM

imobilizada

(1) Expressão de moléculas de ligação de mTARM em células T ativadas

Mostrou-se que células dendríticas atuam como célula apresentadoras de antígeno e que interagem com células T. Assim, é tentador especular que moléculas que se ligam a mTARM são expressas em células T e que a ativação de células dendríticas é regulada via referidas moléculas. Assim, analisou-se a presença ou ausência das moléculas de ligação de mTARM nas células T.

4 χ IO7 células esplênicas de camundongo C57BL/6 macho foram suspensas em 70 μΐ de um tamponador MACS (PBS/1 % de FBS/2 mM de EDTA), e adicionou-se 10 μΐ de solução de bloqueio de FcR (Miltenyi) à suspensão. Em seguida, a mistura foi incubada a 4°C durante 10 minutos. 100 μΐ de micropérolas CD4 (Miltenyi) foram adicionadas à mistura de reação e incubadas a 4°C durante 15 minutos. Em seguida, usou-se auto MACS para obter células T CD4+ em descanso. As células CD4+, que haviam sido purificadas com MACS, foram suspensas em um meio (RPMI1640/10 % de FBS/1 mM de piruvato de sódio/55 μΜ de 2-mercaptoetanol) a uma concentração de 1 χ IO6 células/ml. Em seguida, a suspensão foi adicionada em uma placa, sobre a qual se havia imobilizado anticorpo anti-CD3 (eBioscience) com uma solução a 1 μg/m\ a 37°C durante 2 horas, e estimulada na presença de um anticorpo anti-CD28 a 2 μ^ιηΐ (Pharmingen). Quando células T CD4+ foram diferenciadas em Th 1, realizou-se referido estímulo de anticorpo anti-CD3 na presença de IL-12 de camundongo (10 ng/ml) (Peprotech) e um anticorpo de 11-4 anti-camundongo (10 μ§/πι1) (MP4-25D2; Pharmingen). Quando células T CD4+ foram diferenciadas em Th2, referido estímulo de anticorpo anti-CD3 foi realizado na presença de IL- 4 de camundongo (15 ng/ml) (Genzima) e um anticorpo de IL12 anti- camundongo (15 μ g/ml) (24910,1 Pharmingen). Dois dias após o estímulo, no caso de Thl, adicionou-se IL-2 de camundongo (20 ng/ml) (Genzima) e IL-12 de camundongo (10 ng/ml), seguido de cultura. No caso de Th2, adicionou-se IL-2 de camundongo (20 ng/ml) e IL-4 de camundongo (15 ng/ml), seguido de cultura. Diferenciação em Thl e Th2 foi confirmada por meio de produção de IFN-y e IL-4, respectivamente.

Células T CD4+ em descanso imediatamente após a purificação com MACS e células T CD4+ ativadas 2 e 8 dias após estímulo com CD3 foram usadas para analisar a atividade de ligação de uma proteína quimérica mTARM-AP sobre uma superfície de célula. Estas células foram suspensas em um tamponador FACS (PBS/1 % de FBS) e reagidas sobre gelo durante 30 minutos com proteína quimérica'mTARM-AP ou proteína AP usada como um controle negativo a uma concentração final de 30 μ^πιΐ. Em seguida, adicionou-se um anticorpo anti-PLAP de coelho (diluição de 6000 vezes) (COSMO BIO Co., Ltd.), e então isto foi reagido sobre gelo durante 30 minutos. Adicionalmente, adicionou-se um anticorpo de IgG (H + L) anti- coelho de burro marcado com PE (diluição de 50 vezes) (Jackson), e então isto foi reagido sobre gelo durante 30 minutos. A atividade de ligação da proteína quimérica mTARM-AP foi medida usando FACSCalibur.

Como um resultado, revelou-se que moléculas de ligação de mTARM não foram expressas em uma célula T CD4+ em descanso, mas que referida expressão foi induzida em células T CD4+ ativadas (Figura 12). As moléculas de ligação de mTARM já haviam expressado 2 dias após o estímulo e a sua expressão também foi mantida 8 dias após o estímulo. Referidas moléculas de ligação de mTARM foram expressas em ambas as condições de diferenciação Thl e Th2. 8 dias mais tarde, a expressão da molécula de ligação de mTARM em células Th2 tendeu a ser mais forte do que em células Thl (Figura 12).

(2) Adesão de células T ativadas a proteína mTARM

recombinante

Em seguida, analisou-se a possibilidade da função da mTARM como uma molécula de adesão a células T ativadas. Primeiramente adicionou-se, 50 μΐ de anticorpo anti-fosfatase alcalina (10 μ^ηιΐ) (Seradyn) em cada poço de uma placa ELISA de 96 poços (Nunc) e isto foi incubado a 37°C durante 30 minutos para imobilização. Após lavagem com PBS, um sítio de ligação não-específica foi bloqueado com Block Ace (Dainippon Pharma Co., Ltd.). Uma proteína quimérica AP (10 nM) foi adicionada em cada poço e incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos para imobilização. De 6 a 9 dias após o estímulo, células T ativadas foram suspensas em um tamponador de adesão de células (RPMI 1640/0,5 % BSA/20 raM de HEPES (pH 7,4)), seguido de marcação fluorescente com Calceína-AM (Dojindo Laboratories). Em seguida, as 1 χ IO5 células foram adicionadas em cada poço e incubada a 37°C durante 1 hora. Células não-aderidas foram eliminadas por meio de lavagem, e adicionou-se então a isto um tamponador de Iise de células (10 mM de Tris- HCl (pH 8,0)/l % TritonX-100). Em seguida, medição foi realizada a um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de detecção de 535 nm usando contador Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer), e as células aderidas foram então quantificadas. Com relação ao nível de adesão celular, a relação das células aderidas às células adicionadas foi expressa como um percentual. Como um resultado, revelou-se que a mTARM funcionou

como uma molécula de adesão para células T ativadas (Figura 13). Ambas as células, Thl e Th2, apresentaram atividade de adesão à mTARM. A atividade de adesão das células Th2 à mTARM tendeu a ser maior do que aquela das células Thl à mTARM. Exemplo 6 - Atividade inibidora de adesão celular do

anticorpo anti-TARM

Analisou-se o efeito de anticorpos anti-TARM sobre a adesão celular de células Th2 à mTARM.

Adicionou-se 10 μg/ml de anticorpo anti-mTARM às células Th2 e isto foi pré-tratado à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, as células resultantes foram adicionadas a uma placa sobre a qual uma proteína quimérica mTARM-AP havia sido imobilizada, e analisou-se a atividade de adesão celular na presença do anticorpo.

Como um resultado, a adesão das células Th2 à proteína quimérica mTARM-AP foi suprimida significativamente em todos os anticorpos anti-mTARM #6, #21 e #37 (Figura 14).

Exemplo 7 - Efeito terapêutico de anticorpo anti-TARM no modelo de artrite induzida com colágeno

Um modelo de artrite induzida com colágeno (CIA, Collagen- Induced Arthritis) é um modelo de doença de artrite reumatóide autoimune. Como células T CD4+ e anticorpos que reagem com colágeno de tipo II são detectadas, considera-se que ambos cooperam provocando artrite. Adicionalmente, reporta-se que a suscetibilidade ao modelo de CIA está ligada a moléculas do MHC de classe II. A TARM é uma molécula ativadora que é expressa em células dendríticas, e isto induz adesão celular de células T ativadas via moléculas de ligação de TARM. Assim, considera-se que a interação entre referidas células dendríticas e células T ativadas é inibida por um anticorpo anti-TARM, de modo a suprimir possivelmente uma resposta imune associada com células dendríticas ou as células T ativadas. Assim, analisou-se o efeito terapêutico do anticorpo anti-TARM no modelo de CIA.

Uma solução a 3 % de colágeno tipo II derivada de junta bovina (Collagen Gijutsu Kenshukai) e adjuvante de Freund completo (Difco) foram misturados em quantidades iguais para produzir uma emulsão. Em seguida, 100 μΐ da emulsão (150 μg/camundongo) foram administrados intracutaneamente na base da cauda de um camundongo DBA/IJ com 5 semanas de vida (Charles River Laboratories Japan, Inc.), de modo que o camundongo foi imunizado no dia -21 (imunização inicial) e no dia 0 (reforço). Do reforço, o anticorpo anti-mTARM #6 foi administrado intravenosamente a uma dose de 500 μg duas vezes por semana. Três dias após o reforço realizou-se a medição do peso corporal e a avaliação externa. No dia 13, o camundongo foi sacrificado. Determinações externas foram avaliadas usando o escore a seguir. Ou seja, 0: normal; 1: eritema e inchaço brando confinado à parte mediana do pé (tarso) ou junta do calcanhar; 3: eritema e inchaço moderado estendendo-se do calcanhar até a junta metatársica; 4: eritema e inchaço grave em toda a porção compreendendo o calcanhar, pé e dedos.

Conseqüentemente, como um resultado da administração do anticorpo anti-mTARM, observou-se claro alívio dos sintomas e supressão da redução do peso corporal (Figura 15).

Além disso, sangue heparinizado foi recolhido da veia cava inferior dos camundongos sacrificados, e mediu-se a concentração de amilóide A sérico (SAA) no plasma e titulação de anticorpos no colágeno. SAA é uma proteína do plasma produzida em células do fígado pela ação de citocinas produzidas por estímulo inflamatório. A concentração de SAA no plasma é usada como um índice de inflamação. A titulação de anticorpo para colágeno é usada como um índice de uma resposta imune específica para antígeno.

A concentração de SAA no plasma foi medida com um kit ELISA (BioSource) usando-se o plasma diluído 8.000 vezes.

Além disso, a titulação de anticorpo para colágeno no plasma foi medida como a seguir.

Primeiramente, 50 μΐ de uma solução de colágeno tipo II derivado de junta bovina a 5 μg/ml foram adicionados em cada poço de uma placa ELISA de 96 poços (Nunc) e isto foi incubado a 4°C de um dia para o outro para imobilização. Em seguida, o poço foi lavado com T-PBS (0,02 % de Tween20/PBS), e um sítio de ligação não-específica foi então bloqueado com 1 % de BSA/PBS. O poço foi lavado com T-PBS 3 vezes, e 50 μΐ do ãf 64

plasma que havia sido diluído 100.000 vezes com T-PBS foram então adicionados em cada poço, seguido de incubação à temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida, o poço foi lavado com T-PBS 3 vezes, e 50 μΐ de cada um de IgGl anti-camundongo biotinilado (BD) e IgG2a anti- camundongo biotinilado (BD) que havia sido diluído 1.000 vezes com T-PBS foram adicionados então em cada poço, seguido de incubação à temperatura ambiente durante 2 horas. O poço foi lavado com T-PBS 3 vezes, e 50 μΐ de cada um de estreptavidina marcada com HRP (Pierce) que havia sido diluída 5.000 vezes com T-PBS foram então adicionados em cada poço, seguido de temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, adicionou-se substrato cromogênico e este foi revelado.

Como um resultado, a concentração de SAA no plasma foi diminuída por meio de administração do anticorpo anti-mTARM (Figura 16). No entanto, a titulação de anticorpo anti-colágeno no plasma não foi alterada por administração do anticorpo anti-mTARM (Figura 17).

Exemplo 8 - Determinação de seqüência gênica de comprimento pleno de TARM humana

Para identificar um gene de TARM humana, realizou-se busca BLAST usando a seqüência gênica de TARM de camundongo. Como um resultado, descobriu-se uma seqüência mostrando alta homologia com a seqüência de cDNA de TARM de camundongo (número de acesso GenBank XM_497642). No entanto, não existiram seqüências-sinal em uma seqüência de aminoácidos (LOC441864) codificada por referida XM_497642, e, assim, não se considerou que a seqüência previamente indicada funciona como uma proteína de membrana celular. Considerou-se que XM_497642 é uma seqüência putativa e que a estimativa de uma seqüência de cDNA da seqüência genômica está incorreta. Assim, tentou-se determinar a seqüência gênica de comprimento pleno de TARM humana. Identificou-se tecidos de expressão de TARM, e estimou-se a seqüência de comprimento pleno de cDNA de TARM conduzindo-se 5 - e 3'-RACE. Em seguida, com base na seqüência de uma região que codifica a proteína TARM, projetou-se iniciadores, e isolou-se então cDNA de comprimento pleno.

(1) Análise de expressão de gene de TARM humana

Primeiramente, analisou-se a expressão de hTARM em tecidos

humanos. Projetou-se iniciadores com base no acesso GenBank: XM_497642.

hTARM Fl: TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (SEQ ID NO.: 45) hTARM RI: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO.: 46)

CDNA de filamento simples foi sintetizado de RNA total de cada órgão humano (Clontech) usando-se kit de PCR de RNA (TAXARA). Usando referido cDNA de filamento simples como um modelo, realizou-se PCR em tempo real usando ABI7700. A PCR foi realizada usando-se uma solução de reação com a composição a seguir (12,5 μΐ de QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN), 0,25 μΐ de uracila DNA glicosilase (Invitrogen), 0,125 μΐ de iniciador F 100 μΜ, 0,125 μΐ de iniciador R 100 μΜ, 2,5 μΐ de cDNA modelo (diluído 10 vezes), e 7,25 μΐ de água destilada). Para referida PCR, após o tratamento a 94°C durante 10 minutos, um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos e 60°C-1 minuto foi repetido 35 vezes.

Como um resultado, verificou-se que o gene de hTARM, como com o gene de mTARM, foi fortemente expresso na medula óssea (Figura 18).

(2) Isolamento de gene de TARM humana

Como o gene de hTARM foi expresso na medula óssea, usou- se o RNA total da medula óssea para realizar 5'-RACE e 3'-RACE, de forma a tentar determinar a seqüência de um gene de comprimento pleno da hTARM. Primeiramente, cDNA de filamento duplo foi sintetizado do

RNA total da medula óssea usando o kit de síntese de cDNA (TAKARA), e cDNA foi então purificado usando o kit de purificação Qiaquick PCR (Qiagen). Subseqüentemente, adicionou-se a isto um adaptador ad29, e o produto assim obtido foi usado como um modelo em RACE. Ia PCR foi realizada usando-se uma solução de reação com a composição a seguir (5 μΐ de 10 χ tamponador ExTaq, 4 μΐ de dNTP 2,5 mM, 0,25 μΐ de ExTaq, 0,5 μΐ de iniciador 100 M (5'PCR4), 0,5 μΐ de iniciador específico para Gene 100 μΜ, 1 μΐ de cDNA adicionado a adaptador ad29 (diluído 25 vezes), e 38,75 μΐ de água destilada).

Usou-se as seguintes seqüências como iniciadores.

5*PCR4: AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO.: 21)

hTARM RACE 5' 4: CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT (SEQ ID NO.: 47), ou

hTARM_RACE_3' 4: GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC (SEQ ID NO.: 48)

Para referida PCR, após o tratamento a 94°C durante 5 minutos, um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos, 65°C-1 minuto, e 72°C-5 minutos foi repetido 30 vezes. Finalmente, realizou-se uma reação a 72°C durante 5 minutos.

2a PCR foi realizada usando-se uma solução de reação com a composição a seguir (5 μΐ de 10 χ tamponador ExTaq, 4 μΐ de dNTP 2,5 mM, 0,25 μΐ de ExTaq, 0,5 μΐ de iniciador 100 M (5'PCRl), 0,5 μΐ de iniciador específico para Gene 100 μΜ, 1 μΐ do produto de IaPCR (diluído 100 vezes), e 38,75 μΐ de água destilada).

As seqüências a seguir foram usadas como iniciadores.

5'PCRl: (SEQIDNO.: 24),

h29B140 171" TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (SEQ ID NO.: 49), ou

h29B140 Rl: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO.: 50)

Para referida PCR, após o tratamento a 94°C durante 5 minutos, um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos, e 72°C-5 minutos foi repetido 25 vezes. Finalmente, realizou-se uma reação a 72°C durante 5 minutos. O fragmento de cDNA amplificado foi clonado em pCR2.1 (Invitrogen), e a sua seqüência de nucleotídeos foi determinada usando o analisador de seqüência ABI3100.

Como um resultado, seqüências de nucleotídeos a 5' e 3', que foram completamente diferentes da seqüência como mostrado em XM497642, foram obtidas (SEQ ID NO: 9).

Os iniciadores a seguir foram projetados usando informação de seqüência de nucleotídeos obtida por meio de RACE: h29BL40_Sall-Kozac_F:

cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC (SEQ ID NO.: 51)

h29B 140_NotI-R: cgcgcggccgcCTAGCGCATGCTACCCTTGGCAGC (SEQ ID NO.: 52)

Com estes iniciadores, PCR foi realizada usando cDNA de filamento simples sintetizado do RNA total de medula óssea usando kit de PCR de RNA (TAKARA) como um modelo. A PCR foi realizada em uma solução de reação com a composição a seguir (5 μΐ de 10 χ tamponador, 4 μΐ de dNTP 2,5 mM, 0,5 μΐ de Pyrobest polimerase (TAKARA), 0,5 μΐ cada de iniciadores 100 μΜ, 1 μΐ de cDNA, 2,5 μΐ de DMSOs e 36 μΐ de água destilada). Para referida PCR, após o tratamento a 94°C durante 5 minutos, um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos, e 72°C-5 minutos foi repetido 35 vezes. Finalmente, uma reação foi realizada a 72°C durante 2 minutos. O cDNA amplificado foi clonado em pBlueScriptll SK(+) (Stratagene), e a sua seqüência de nucleotídeos foi então determinada usando o analisador de seqüência AB13100. A seqüência de nucleotídeos obtida do cDNA de hTARM foi idêntica à seqüência determinada por meio de RACE (SEQ ID NO. 9). A seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) codificada pelo cDNA de hTARM apresentou uma seqüência-sinal necessária r

para funcionar como uma proteína de membrana celular em sua extremidade Ν. A hTARC e a seqüência de aminoácidos codificada por XM_497642 (LOC441864) apresentou extremidades NeC diferentes. Assim, revelou-se que uma seqüência de cDNA putativa do tipo referido, XM 497642, estimada a partir da seqüência genômica não existe efetivamente, e que o cDNA de hTARM era um gene real que codifica a proteína de membrana celular hTARM (Figura 19).

Exemplo 9 - Preparação de anticorpo contra TARM humana (1) Preparação de células que expressam TARM humana Um vetor de expressão de gene de TARM humana foi

preparada por meio de inserção do cDNA de hTARM obtido no Exemplo 8 em um vetor de expressão pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050-3058).

Retrovírus recombinante foi preparado como a seguir. Células 293/EBNA-l (Invitrogen) de 3 χ IO6 células foram

suspensas em um meio (D-MEM/10 % de FBS), e colocadas em discos de cultura de 10 cm, e cultivadas em um incubador de CO2 durante 24 horas. No dia seguinte, o meio foi trocado por outro meio fresco e adicionou-se a isto uma solução de transfecção preparada como descrito abaixo, para realizar a transfecção. A solução de transfecção foi preparada por meio de adição de 600 μΐ de OPTI-MEM (GIBCO BRL) e 24 μΐ de TransIT LTl (TaKaRa) em um tubo de 5 ml para misturar os mesmos, depois incubação da mistura à temperatura ambiente durante 5 minutos, e, depois, adição de 9 ug de um vetor de expressão e 9 ug de pCL-Eco (Imgenex) usado como um vetor de empacotamento para a mistura de reação, seguido de incubação da mistura à temperatura ambiente durante 5 minutos. 48 horas mais tarde recuperou-se o sobrenadante de cultura, e a filtração foi então realizada com um filtro de 0,45 μηι para se obter uma solução de vírus recombinante

Células B300.19 foram infectadas com este vírus recombinante como descrito abaixo, de forma a preparar células que expressam hTARM.

As 1 χ IO6 células B300.19 foram adicionadas em um tubo de ml, e elas foram então centrifugadas a 1200 rpm a 25°C durante 5 minutos. Em seguida, o sobrenadante de cultura foi descartado por meio de aspiração.

Uma solução obtida por meio de adição de 2 μΐ de polibreno (10 mg/ml) e 2 μΐ de 55 μΜ de 2-mercaptoetanol a 2 ml da solução de vírus recombinante foi adicionada às células. A mistura obtida foi então centrifugada a 2500 rpm a 30°C durante 2 horas, de forma que as células foram infectadas com o vírus recombinante. Após completamento da infecção, a solução de vírus recombinante foi descartada, e adicionou-se a isto um meio (RPMI-1640/10 % de FBS/55 μΜ de 2-mercaptoetanol), seguido de cultura. Células positivas para EGFP foram separadas por meio de seleção de células, de modo a se obter células que expressam hTARM.

(2) Preparação de região extracelular de hTARM fundida a proteína quimérica a SEAP ou Fc

A região extracelular de hTARM foi amplificada por meio de PCR usando-se cDNA de comprimento pleno de hTARM como um modelo e também usando um iniciador adicionado a SalI a 5' (h29B140_SalI- Kozac_F:cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC (SEQ ID NO: 51)) e um iniciador adicionado a NotI a 3' (h29B140_NotI_SEAP_R: gcgggcggccgcACCCAGGGAGTAGTTGCTCGATGT (SEQ ID NO: 53)). A PCR foi realizada em uma solução de reação com a seguinte composição (5 μΐ de 10 χ tamponador, 4 μΐ de dNTP 2,5 mM, 0,5 μΐ de Pyrobest polimerase (TAKARA), 0,5 μΐ cada um de iniciadores 100 μΜ, 1 μΐ de cDNA, 2,5 μΐ de DMSO, e 36 μΐ de água destilada). Para referida PCR, após o tratamento a 94°C durante 5 minutos, um ciclo de reação consistindo de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos, e 72°C-5 minutos foi repetido 35 vezes. Finalmente, uma reação foi realizada a Il0C durante 2 minutos. O cDNA amplificado foi clonado em pBlueScriptII SK(+) (Stratagene), e a sua seqüência de nucleotídeos foi então confirmada usando analisador de seqüência AB13100. O fragmento de cDNA obtido foi digerido com Sall e NotIj e então inserido em vetor pcDNA3.1(+)-SEAP(His)i0-Neo descrito no Exemplo 2, de forma a preparar um vetor de expressão de hTAJRM-AP.

Com isto, a região extracelular de hTARM é fundida através de ligante de três aminoácidos (Ala-Ala-Ala) para fosfatase alcalina placentar humana de tipo secretora apresentando um marcador de 10-histidina (His)i0 em sua extremidade C a ser expresso como uma proteína quimérica secretora (referida a seguir como proteína quimérica AP). O vetor de expressão de proteína quimérica AP obtido foi introduzido em células 293/EBNA-l usando TranslT LTl (TAKARA) e elas foram então cultivadas durante 4 ou 5 dias. Em seguida, o sobrenadante de cultura foi recuperado por meio de centrifugação, e a proteína quimérica AP secretada no sobrenadante foi então filtrada com um filtro de 0,22 μηι. Em seguida, adicionou-se Hepes (pH 7,4) e azida de sódio a isto a concentrações finais de 20 mM e 0,02 %, respectivamente, e o produto obtido foi armazenado a 4°C. A concentração da proteína quimérica AP foi calculada medindo-se a atividade de fosfatase alcalina usando-se ensaio de gene repórter quimioluminescente Aurora AP (ICN).

(3) Preparação de anticorpo monoclonal contra hTARM

Para uso como um antígeno na imunização, primeiramente purificou-se a proteína quimérica AP-hTARM.

Referida purificação foi realizada utilizando-se o marcador histidina existente na extremidade C da proteína quimérica AP e usando o kit His Trap Kit (Amersham Biosciences). Adicionou-se um sobrenadante de cultura contendo a proteína quimérica AP-hTARM em uma coluna HP de quelação HiTrap de 1 ml (Amersham Biosciences), seguido de lavagem com uma solução de imidazol 10 mM. Em seguida, a proteína hTARM-AP foi eluída da coluna usando-se uma solução de imidazol 500 mM. A concentração da proteína quimérica AP-hTARM foi calculada por meio da medição da atividade de enzima usando o ensaio de gene repórter quimioluminescente Aurora AP (ICN) e por meio de quantificação de proteína usando-se o kit de ensaio de proteína II (1310-RAD).

Subseqüentemente, usou-se a proteína quimérica AP-hTARM obtida como um antígeno, e camundongos Balb/c foram imunizados com a proteína previamente indicada por Kohjin Bio Co. Ltd. Linfócitos foram isolados dos camundongos imunizados, e os linfócitos isolados foram então misturados com células de mieloma P3U1. Em seguida, realizou-se fusão de células com um método de PEG. Usando um sobrenadante de cultura dos hibridomas obtidos, realizou-se seleção com ELISA com uma proteína quimérica hTARM-Fc. Clonagem foi realizada de poços positivos, e obteve- se 6 tipos de clones (#11, #18 , #19 , #22, #26, e #40). Como um resultado da análise de especificidade por meio de FACS, verificou-se que todos os clones reagiram com células B300.19 expressando hTARM, e que eles não reagiram com células B300.19 parentais. Hibridomas que produziram os anticorpos monoclonais anti-hTARM #11, #18 , #19 , #22, #26, e #40 foram inoculados na cavidade peritoneal de um camundongo nu, e obteve-se seus áscites. Em seguida, anticorpos foram purificados usando-se uma coluna de proteína A.

Exemplo 10 - Adesão de células T humanas ativadas a proteína hTARM recombinante

Sangue periférico humano foi recolhido com uso de heparina, e adicionou-se a isto Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences) numa quantidade igual do sangue periférico humano, e células mononucleares foram isoladas por meio de centrifugação por gradiente de densidade a 400 χ g durante 30 minutos. As células isoladas foram suspensas em um tamponador MACS (PBS/1 % de FBS/2 mM de EDTA), e solução de bloqueio FcR (Miltenyi) foi adicionada a 5 μΐ/l χ IO7 células à mesma suspensão. A mistura obtida foi reagida a 4°C durante 15 minutos. Usou-se kit de isolamento CD25+CD4+ Treg humano (Miltenyi) e Auto MACS para obter células T CD4+ em descanso. Adicionou-se um anticorpo CD25 anti- humano de camundongo marcado com PE (Miltenyi) e um anticorpo CD4 anti-humano de camundongo marcado com FITC (Miltenyi), cada um numa quantidade de 1/11 da solução, às células CD4+ que haviam sido purificadas com MACS. Elas foram então reagidas a 4°C durante 20 minutos. Em seguida, usou-se FACS Aria (BD Biosciences) para obter células T CD4+ CD25-. As células T CD4+ CD25- foram ativadas usando o kit de expansão/ativação de células T humano (Miltenyi). De 3 dias até o estímulo, adicionou-se IL-2 humana (2 ng/ml) às células. Usando células T CD4 positivas ativadas obtidas no 6o e 8o dia após o estímulo, analisou-se a possibilidade da função da proteína quimérica AP-hTARM como uma molécula de adesão a células T ativadas.

Primeiramente, adicionou-se 50 μΐ de anticorpo anti-fosfatase alcalina (10 μg/ml) (Seradyn) em cada poço de uma placa ELISA de 96 poços (Nunc) e isto foi incubado a 7°C durante 30 minutos para imobilização. Após lavagem com PBS, um sítio de ligação não-específica foi bloqueado com Block Ace (Dainippon Pharma Co., Ltd.). Adicionou-se uma proteína quimérica AP (1 nM) em cada poço e isto foi incubado à temperatura ambiente durante 30 minutos para imobilização. Células T ativadas foram suspensas em um tamponador de adesão de célula (RPMI 1640/0,5 % de BSA/20 mM de HEPES/55 nM 2ME (pH 7,4)), seguido de marcação fluorescente com Calceína-AM (Dojindo Laboratories). Em seguida, as 5 χ IO4 células foram adicionadas em cada poço e depois incubadas a 37°C durante 1 hora. Células não-aderidas foram eliminadas por meio de lavagem, e adicionou-se a isto um tamponador de Iise celular (10 mM de Tris-HCl (pH 8,0)/l % de TritonX-100). Em seguida, realizou-se a medição a um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de detecção de 535 nm usando contador Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer), e as células aderidas foram quantificadas. Com relação ao nível de adesão celular, a relação das células aderidas para as células adicionadas foi expressa como um percentual.

Como um resultado, revelou-se que a hTARM funcionou

como uma molécula de adesão para células T humanas ativadas (Figura 20).

Exemplo 11 - Atividade inibidora de adesão celular de anticorpo anti-TARM

Analisou-se o efeito de anticorpos anti-TARM de células T humanas ativadas à hTARM.

Adicionou-se uma proteína quimérica AP em cada poço e, depois, isto foi incubado à temperatura ambiente durante 30 minutos para imobilização. Em seguida, cada um dos 10 μg/ml de anticorpos anti-hTARM (#11, #18 , #19 , #22, #26, e #40) foi adicionado em cada poço e pré-tratado à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, adicionou-se a isto células T ativadas marcadas fluorescentemente, e analisou-se a atividade de adesão celular na presença de cada anticorpo. Deve-se observar também que um anticorpo anti-IgG2a foi usado como um controle para #11, #18, #19, #22, #26, e #40 que um anticorpo anti-IgG2b foi usado como um controle para #18 e #22.

Como um resultado, verificou-se que a adesão das células T ativadas à proteína quimérica AP-hTARM foi suprimida significativamente na presença de anticorpos anti-hTARM #18 , #19 , #22, e #26 que a supressão parcial de referida adesão foi observada na presença de anticorpos anti- hTARM #11 e #40 (Figura 20).

Exemplo 12 - Identificação de ligante inédito mTARM-L para

mTARM

Mareio

(1) Seleção de moléculas candidatadas mTARM-L (ligante de mTARM)

As moléculas de ligação de mTARM estão presentes em células T ativadas (Exemplo 5). Assim, analisou-se a presença ou ausência das moléculas de ligação de mTARM em linhas de células derivadas de células imunes de camundongo (L5178Y-R, BW5147, e Raw264.7) por meio do método descrito no Exemplo 5.

Como um resultado, revelou-se que as moléculas de ligação de mTARM foram fortemente expressas nas células L5178Y-R, mas que dificilmente foram expressas nas células BW5147 e células Raw264.7 (Figura 2 IA).

Subseqüentemente, presumindo-se que um ligante desconhecido para a mTARM pertenceu à superfamília de imunoglobulina (IgSF), pesquisou-se no banco de dados de Mouse Ensemble. Enfocando a atenção sobre candidatos de 47 IgSF, examinou-se a expressão em células imunes por meio de PCR em tempo real. RNA total foi isolado das células L5178Y-R, células BW5147, e células Raw264.7 usando-se o kit RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). A PCR em tempo real foi realizada na presença de SYBR-verde usando-se o sistema de detecção de seqüência AB17700 (PE Applied-Biosystems). Como um resultado, a expressão de mRNA de

ENSMUSG00000035095 (A530065I17Rik, NM176953) (usando iniciador #2558: CAGCTGGCAAGAGGAACAGT (SEQ ID NO: 54) e iniciador #2559: GAGCATCGGCACTTATCTCC (SEQ ID NO: 55)) mostrou uma correlação com a atividade de ligação da proteína quimérica mTARM-AP às células (Figura 22B). No entanto, não existiu região de transmembrana em uma seqüência de aminoácidos codificada por ENSMUSG00000035095, e, assim, isto não foi considerado como funcionando como uma proteína de membrana celular. Esta seqüência de aminoácidos foi uma seqüência putativa, e, portanto, considerou-se que a estimativa de uma seqüência de cDNA da seqüência genômica estava incorreta. Assim, tentou-se primeiro identificar um produto gênico homólogo humano. Usando uma seqüência de aminoácidos codificada por ENSMUSG00000035095, realizou-se busca em banco de dados. Como um resultado, verificou-se uma seqüência de aminoácidos LOC196264 apresentando alta homologia com a seqüência de aminoácidos codificada por ENSMUSG00000035095. Esta seqüência de aminoácidos relacionada com uma proteína de membrana celular contendo uma região de estrutura de alça de imunoglobulina. Assim, considerou-se que LOC196264 era a seqüência de aminoácidos humana de comprimento pleno de uma TARM-L candidata. Subseqüentemente, usando a seqüência de aminoácidos de LOC196264, realizou-se busca tblastn por meio de banco de dados. Como um resultado, verificou-se uma região que codifica uma seqüência apresentando homologia com a seqüência de aminoácidos de LOC196264 na seqüência genômica de nucleotídeos de clone BAC de camundongo AC122305. A seqüência de cDNA e a seqüência de aminoácidos de uma TARM-L candidata de camundongo foram estimadas a partir desta seqüência, de modo que os iniciadores a seguir foram projetados e que cDNA codificando uma proteína de comprimento pleno foi isolada.

#2693: CGCGTCGACGCCACCATGCAGCTGGCAAGAGGAACAG TA (SEQID NO.: 56)

#2694: GCGGGCGGCCGCTCAGTACGCCTCTTCTTCGTAGTC (SEQ ID NO.: 57)

O RNA total de Thl dia 2 foi usado como um modelo, e o cDNA foi amplificado por meio do método descrito no Exemplo 1. O cDNA amplificado foi inserido em um vetor de expressão pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050-3058), e preparou-se então um vetor de expressão de gene candidato de mTARM-L. Usou-se o analisador de seqüência AB13100 para determinar a sua seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 13). <2Q>

(2) Identificação de mTARM-L

Em seguida, para examinar se mTARM-L candidato era ou não um ligante desconhecido para TARM, preparou-se células em que esta molécula deveria ser expressa, por meio do método descrito no Exemplo 2. A atividade de ligação da proteína quimérica mTARM-AP sobre a superfície celular de células expressando mTARM-L candidato e a atividade de adesão de células que expressam mTARM-L candidato à mTARM imobilizada foram medidas por meio do método descrito no Exemplo 5.

Como um resultado, a mTARM-AP liga-se especificamente a células B300.19 expressando EGFP+ mTARM-L, mas não ligou-se a células B300.19, em que um vetor de controle de EGFP+ foi introduzido (Figura 22A). AP usada como um controle negativo não se ligou a referidas células B300.19 expressando mTARM-L EGFP+ (Figura 22A).

Além disso, examinou-se a atividade de adesão de células B300.19 expressando o mTARM-L a AP e a proteína quimérica mTARM-AP. Como um resultado, verificou-se que a célula previamente indicada só aderiu à proteína quimérica AP-mTARM (Figura 22B).

Assim, os resultados acima demonstraram que a molécula de mTARM-L candidata foi efetivamente um ligante inédito para TARM. Este ligante foi denominado mTARM-L (ligante de TARM).

Com relação a hTARM-L, os iniciadores a seguir foram projetados com base na seqüência de nucleotídeos de NM198275 codificando a seqüência de aminoácidos de LOC196264, e cDNA que codifica a proteína de comprimento pleno foi isolada.

#2721: CGCGTCGACGCCACCATGCAGCAGAGAGGAGCAGCTG GA (SEQ ID NO.: 58)

#2722: GCGGGCGGCCGCTCAATATGTCTCTTCATAGTCTGA (SEQ IDNO.: 59)

Usando o RNA total de medula óssea como um modelo, o © φ

cDNA foi amplificado por meio do método descrito no Exemplo 1. O cDNA amplificado foi inserido em um vetor de expressão pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050-3058) para preparar um vetor de expressão de gene de TARM-L, e a sua seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 15) foi então determinada usando analisador de seqüência ABI3100.

O TARM-L humano e de camundongo foram submetidos a análise de homologia com ClustalW. Os resultados são mostrados na Figura 23. O hTARM-L consistiu de 235 aminoácidos, e o mTARM-L consistiu de 237 aminoácidos. Eles apresentam 86 % de homologia. Por outro lado, mTARM m3 (293 aminoácidos) apresentou a maior homologia com a hTARM (271 aminoácidos) em um percentual de 50 % (Figura 24). LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Eisai R&D Management Co., Ltd.

<120> MOLÉCULA DE ADESÃO DE CÉLULAS T E ANTICORPO PARA A MESMA

<130> 162119PX

<160> 59

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1

<211> 889

<212> DNA

<213> Mus rausculus

<220>

<221> CDS

<222> (49)..(879)

<223>

<4 00> 1

gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atgatctct 57

Met Ile Ser 1

agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg tct cct ccc aag ccc age ctc 105

Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu

10 15

agt gcc tgg ccc age aca gtg ctt ccc acc aag age cac gtg aca atg 153

Ser Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met

25 30 35

caa tgt aag age ccc acc ccg agt aaa tac ttc ate ctc aaa aag gaa 201

Gln Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu 40 45 50

ggt ttc gct ttg aat tct gtg aag cca tat aat ttg aca gag gag acg 24 9

Gly Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr 55 60 65

gct gat ttt cat ttc acc gac cta cga cag aat gat ggc gga cac tac 297

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acc tgt gaa tac tat age aaa tgg ccc cat gac aca ccg tca cac ccc 345

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age aat gcc ctt ttc ttg ttg gtc aca ggg tac tta cct cag ccc tcc 393

Ser Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser

100 105 110 115

ttt caa gcc cac cac cgg ggt aca gtg act gea gga age aag gtg act 441

Phe Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr 120 125 130

ttg cag tgc cag aaa gea ggc agt gtc ctc gga ccc gta aag ttt gcg 489

Leu Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala 135 140 145

tta ctg aag gtg gga cac tca act cct gtg cag aca agg age tca aca 537

Leu Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr

150 155 160

gga atg gta tca gac ttc tet ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg 585

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165 170 175

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180 185 190 195

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200 205 210

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215 220 225

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230 235 240

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245 250 255

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260 265 270 275

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<210> 2

<211> 276

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<213> Mus musculus

<400> 2

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Lys Lys Glu Gly Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr 50 55 60

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70

75

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Ser His Pro Ser Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro 100 105 110

Gln Pro Ser Phe Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser 115 120 125

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Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg 145 150 155 160

Ser Ser Thr Gly Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala 165 170 175

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Val Gly Gly Phe Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro 260 265 270

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<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

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<222> (49)..(930) <223>

<4 00> 3

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1

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Tyr

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Leu

115

cac 441

His

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Gln

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age 633

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195

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Ser

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<4 00> 4

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180 185 190

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Leu Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly 245 250 255

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185

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<220>

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<223>

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Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser Asn Ala Leu 100 105 110 115

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Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe Gln Ala His 120 125 130

cac cgg ggt aca gtg act gea gga age aag gtg act ttg cag tgc cag 489

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Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val 150 155 160

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Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly Met Val Ser

165 170 175

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Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu 130 135 140

Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu 145 150 155 160

Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly 165 170 175

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Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser 195 200 205

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Ser Ala Ser Arg Ser Cys Cys Leu Asp Phe Pro Thr Ala Thr Asp Ser 225 230 235 240

Asn Leu Thr Gln Asp Pro Gly Tyr Asn Asp Arg Arg Leu His Cys Gly 245 250 255

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tgt tgg act cct gcc aga ggt gtg age ttt gtt ctc agg aag gga gga 192

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50' 55 60

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gaa ttt cac ctc aat aat cta aaa gtc aga aat gct gga gag tac acc 288

Glu Phe His Leu Asn Asn Leu Lys Val Arg Asn Ala Gly Glu Tyr Thr

85 90 95

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gac gtc ctt cta ctg ttg gtg aca gga cat tta tet aaa cct ttc ctc 384

Asp Val Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly His Leu Ser Lys Pro Phe Leu 115 120 125

cga acc tac caa agg ggt aca gtg acc gea ggt gga agg gtg act ctg 432

Arg Thr Tyr Gln Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Gly Arg Val Thr Leu 130 135 140

cag tgc cag aag cga gac caa ttg ttt gtg cct ate atg ttc gct cta 480

Gln Cys Gln Lys- Arg Asp Gln Leu Phe Val Pro Ile Met Phe Ala Leu

145 150 155 160

ctg aag gea ggg acg cca tca ccc ate cag ctg cag agt cca gcg ggg 528

Leu Lys Ala Gly Thr Pro Ser Pro Ile Gln Leu Gln Ser Pro Ala Gly

165 170 175

aag gag ata gac ttc tet ctg gtg gac gtg aca gcc ggc gat gct ggg 576

Lys Glu Ile Asp Phe Ser Leu Val Asp Val Thr Ala Gly Asp Ala Gly 180 185 190

aac tac age tgc atg tac tac cag aca aag tet ccc ttc tgg gcc tca 624

Asn Tyr Ser Cys Met Tyr Tyr Gln Thr Lys Ser Pro Phe Trp Ala Ser 195 200 205

gaa ccc agt gat cag ctt gag ata ttg gtg aca gtt ccc cca ggt acc 672

Glu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Ile Leu Val Thr Val Pro Pro Gly Thr 210 215 220

aca tcg age aac tac tcc ctg ggt aac ttc gta cga ctg ggt ctg gct Thr Ser Ser Asn Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Arg Leu Gly Leu Ala 225 230 235 240

720 gcc gta att gtg gtt ate atg gga gct ttc ctg gtg gag gcc tgg tac 768

Ala Val Ile Val Val Ile Met Gly Ala Phe Leu Val Glu Ala Trp Tyr 245 250 255

age cgg aat gtg tet cca ggt gaa tca gag gcc ttc aaa cca gag tga 816

Ser Arg Asn Val Ser Pro Gly Glu Ser Glu Ala Phe Lys Pro Glu 260 265 270

<210> 10

<211> 271

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 10

Met Ile Pro Lys Leu Leu Ser Leu Leu Cys P-he Arg Leu Cys Val Gly 10 15

Gln Gly Asp Thr Arg Gly Asp Gly Ser Leu Pro Lys Pro Ser Leu Ser 25 30

Ala Trp Pro Ser Ser Val Val Pro Ala Asn Ser Asn Val Thr Leu Arg 40 45

Cys Trp Thr Pro Ala Arg Gly Val Ser Phe Val Leu Arg Lys Gly Gly 50 55 60

Ile Ile Leu Glu Ser Pro Lys Pro Leu Asp Ser Thr Glu Gly Ala Ala 65 70 75 80

Glu Phe His Leu Asn Asn Leu Lys Val Arg Asn Ala Gly Glu Tyr Thr 85 90 95

Cys Glu Tyr Tyr Arg Lys Ala Ser Pro His Ile Leu Ser Gln Arg Ser 100 105 110

Asp Val Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly His Leu Ser Lys Pro Phe Leu 115 120 125

Arg Thr Tyr Gln Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Gly Arg Val Thr Leu 130 135 140

Gln Cys Gln Lys Arg Asp Gln Leu Phe Val Pro Ile Met Phe Ala Leu 145 150 155 160

Leu Lys Ala Gly Thr Pro Ser Pro Ile Gln Leu Gln Ser Pro Ala Gly 165 170 175

Lys Glu Ile Asp Phe Ser Leu Val Asp Val Thr Ala Gly Asp Ala Gly 180 185 190 Asn Tyr Ser Cys Met Tyr Tyr Gln Thr Lys Ser Pro Phe Trp Ala Ser 195 200 205

Glu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Ile Leu Val Thr Val Pro Pro Gly Thr 210 215 220

Thr Ser Ser Asn Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Arg Leu Gly Leu Ala 225 230 235 240

Ala Val Ile Val Val Ile Met Gly Ala Phe Leu Val Glu Ala Trp Tyr 245 250 255

Ser Arg Asn Val Ser Pro Gly Glu Ser Glu Ala Phe Lys Pro Glu 260 265 270

<210> 11

<211> 925

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220> <221> CDS <222> (49)..(915) <223>

<400> 11

gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg ate tet 57

Met Ile Ser

1

agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc etc cgg ctg tgt gtt ggg caa aca gac 105

Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly Gln Thr Asp 10 15

att cct gaa aat ggg tet cct ccc aag ccc age ctc agt gcc tgg ccc 153

Ile Pro Glu Asn Gly Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro 25 30 35

age aca gtg ctt ccc acc aag age cac gtg aca atg caa tgt aag age 201

Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His 'Val Thr Met Gln Cys Lys Ser 40 45 50

ccc acc ccg agt aaa tac ttc ate ctc aaa aag gaa ggt ttc gct ttg 249

Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu Gly Phe Ala Leu

55 60 65

aat tet gtg aag cca tat aat ttg aca gag gag acg gct gat ttt cat 297

Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr Ala Asp Phe His

70 75 80

ttc acc gac cta cga cag aat gat ggc gga cac tac acc tgt gaa tac 345

Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr Thr Cys Glu Tyr 85 90 95

tat age aaa tgg ccc cat gac aca ccg tca cac ccc age aat gcc ctt 393

Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser Asn Ala Leu 100 105 110 115

ttc ttg ttg gtc aca ggg tac tta cct cag ccc tcc ttt caa gcc cac 441

Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe Gln Ala His

120 125 130

cac cgg ggt aca gtg act gca gga age aag gtg act ttg cag tgc cag 489

His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu Gln Cys Gln 135 140 145

aaa gca ggc agt gtc ctc gga ccc gta aag ttt gcg tta ctg aag gtg 537

Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val 150 155 160

gga cac tca act cct gtg cag aca agg age tca aca gga atg gta tca 585

Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly Met Val Ser

165 170 175

gac ttc tet ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg ggg gaa tac age 633

Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly Glu Tyr Ser

180 185 190 195

tgt gtt tac tat cag gca aag gct ccc tat cgg gcc tca ggg ccc age 681

Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser Gly Pro Ser 200 205 210

aat ctc ctt gag ate tet gtg ata gac aac cat ctg cct caa gat ctt 729

Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu Pro Gln Asp Leu 215 220 225

gct gcc tcg act ttc cca ccg caa ctg aca gca acc tca ccc aag acc 777

Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ser Pro Lys Thr 230 235 240

ccg ggt aca atg aca gaa ggc tac act gtg gat aat ctc ate cgg gtc 825

Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn Leu Ile Arg Val 245 250 255

ggt gtg gct gct gca ate ctg cta ata gtg gga ggc ttc ctg gtt gaa 873

Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Phe Leu Val Glu

260 265 270 275

gcc tgg cac agt gag cgg ctg tet cca aat aaa ccc tgg taa 915

Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro Trp

280 285

aataactgaa 925

<210> 12

<211> 288

<212> PRT

<213> Mus musculus

<4 00> 12

Met Ile Ser Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly 10 15

Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu Gly 50 55 60

Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr Ala 65 70 75 80

Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr Thr 85 90 95

Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser 100 105 110

Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe 115 120 125

Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu 130 135 140

Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu 145 150 155 160

Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly 165 170 175

Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly 180 185 190

Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser 195 200 205

Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu Pro 210 215 220

Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ser 225 230 235 240

Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn Leu 245 250 255

Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Phe 260 265 270

Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro Trp 275 280 285 XlO 17 ô

<210> 13

<211> 714

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 13 atgcagctgg caagaggaac agtaggaggc cgtggctgcg ctctctttcc actgctgagc 60 atcctagtcg tccagggtgc gcgtatcgtc ctctccttgg agataagtgc cgatgctcac 120 gtccgaggct atgtgggaga gaagatcaag ttgaaatgca ccttcaagtc atcttcagat 180 gtcactgaca agctgaccat agactggaca taccgccctc ccagcagcag ccgcacagag 240 tctatttttc actatcagtc tttccagtac ccgaccacag cgggcacatt ccgagaccgg 300 atctcctggg ccggaaatgt ctacaaaggg gatgcgtcca tcagtatcag caaccccact 360 ctaaaggaca atgggacgtt cagctgtgct gtgaagaacc ctccagacgt gtaccacaat 420 atccccctaa cagagctcac ggtcacagaa agggggttcg gcaccatgct gtcttctgtg 480 gcccttctct ccatcctcgt cttcgtcccc tcagcagtgg tggtcattct gctgctggtg 540 cgaatgggga ggaaggcaac aggggtgcag aagaggagca ggtctggcta taagaagtct 600 tccattgaag tttccgatga cactgaccag gaggacagca atgactgcat gacgaggctt 660 tgtgtccgct gtgcagagtg tctggattca gactacgaag aagaggcgta ctga 714

<210> 14

<211> 237

<212> PRT

<213> Mus musculus

<4 0 0> 14

Met Gln Leu Ala Arg Gly Thr Val Gly Gly Arg Gly Cys Ala Leu Phe 10 15

Pro Leu Leu Ser Ile Leu Val Val Gln Gly Ala Arg Ile Val Leu Ser 25 30

Leu Glu Ile Ser Ala Asp Ala His Val Arg Gly Tyr Val Gly Glu Lys 40 45

Ile Lys Leu Lys Cys Thr Phe Lys Ser Ser Ser Asp Val Thr Asp Lys 50 55 60

Leu Thr Ile Asp Trp Thr Tyr Arg Pro Pro Ser Ser Ser Arg Thr Glu 65 70 75 80

Ser Ile Phe His Tyr Gln Ser Phe Gln Tyr Pro Thr Thr Ala Gly Thr 85 90 95 Phe Arg Asp Arg Ile Ser Trp Ala Gly Asn Val Tyr Lys Gly Asp Ala

Ser Ile Ser Ile Ser Asn Pro Thr Leu Lys Asp Asn Gly Thr Phe Ser

Cys Ala Val Lys Asn Pro Pro Asp Val Tyr His Asn Ile Pro Leu Thr

Glu Leu Thr Val Thr Glu Arg Gly Phe Gly Thr Met Leu Ser Ser Val

Ala Leu Leu Ser Ile Leu Val Phe Val Pro Ser Ala Val Val Val Ile

Leu Leu Leu Val Arg Met Gly Arg Lys Ala Thr Gly Val Gln Lys Arg

Ser Arg Ser Gly Tyr Lys Lys Ser Ser Ile Glu Val Ser Asp Asp Thr

Asp Gln Glu Asp Ser Asn Asp Cys Met Thr Arg Leu Cys Val Arg Cys

Ala Glu Cys Leu Asp Ser Asp Tyr Glu Glu Glu Ala Tyr

<210> 15

<211> 708

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 15

atgcagcaga gaggagcagc tggaagccgt ggctgcgctc tcttccctct gctgggcgtc 60

ctgttcttcc agggtgttta tatcgtcttt tccttggaga ttcgtgcaga tgcccatgtc 120

cgaggttatg ttggagaaaa gatcaagttg aaatgcactt tcaagtcaac ttcagatgtc 180

actgacaagc ttactataga ctggacatat cgccctccca gcagcagcca cacagtatca 240

atatttcatt atcagtcttt ccagtaccca accacagcag gcacatttcg ggatcggatt 300

tcctgggttg gaaatgtata caaaggggat gcatctataa gtataagcaa ccctaccata 360

aaggacaatg ggacattcag ctgtgctgtg aagaatcccc cagatgtgca ccataatatt 420

cccatgacag agctaacagt cacagaaagg ggttttggca ccatgctttc ctctgtggcc 480

cttctttcca tccttgtctt tgtgccctca gccgtggtgg ttgctctgct gctggtgaga 54 0

atggggagga aggctgctgg gctgaagaag aggagcaggt ctggctataa gaagtcatct 600 attgaggttt ccgatgacac tgatcaggag gaggaagagg cgtgtatggc gaggctttgt 660 gtccgttgcg ctgagtgcct ggattcagac tatgaagaga catattga 708

<210> 16 <211> 235 <212> PRT <213> Homo <4 00> 16

Met Gln Gln Arg Gly Ala Ala Gly Ser Arg Gly Cys Ala Leu Phe Pro 10 15

Leu Leu Gly Val Leu Phe Phe Gln Gly Val Tyr Ile Val Phe Ser Leu 25 30

Glu Ile Arg Ala Asp Ala His Val Arg Gly Tyr Val Gly Glu Lys Ile 40 45

Lys Leu Lys Cys Thr Phe Lys Ser Thr Ser Asp Val Thr Asp Lys Leu 50 55 60

Thr Ile Asp Trp Thr Tyr Arg Pro Pro Ser Ser Ser His Thr Val Ser 65 70 75 80

Ile Phe His Tyr Gln Ser Phe Gln Tyr Pro Thr Thr Ala Gly Thr Phe 85 90 95

Arg Asp Arg Ile Ser Trp Val Gly Asn Val Tyr Lys Gly Asp Ala Ser 100 105 110

Ile Ser Ile Ser Asn Pro Thr Ile Lys Asp Asn Gly Thr Phe Ser Cys 115 120 125

Ala Val Lys Asn Pro Pro Asp Val His His Asn Ile Pro Met Thr Glu 130 135 140

Leu Thr Val Thr Glu Arg Gly Phe Gly Thr Met Leu Ser Ser Val Ala 145 150 155 160

Leu Leu Ser Ile Leu Val Phe Val Pro Ser Ala Val Val Val Ala Leu 165 170 175

Leu Leu Val Arg Met Gly Arg Lys Ala Ala Gly Leu Lys Lys Arg Ser 180 185 190

Arg Ser Gly Tyr Lys Lys Ser Ser Ile Glu Val Ser Asp Asp Thr Asp 195 200 205 Gln Glu Glu Glu Glu Ala Cys Met Ala Arg Leu Cys Val Arg Cys Ala

210

215

220

Glu Cys Leu Asp Ser Asp Tyr Glu Glu Thr Tyr

225

230

235

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 17

gtgactttgc agtgccagaa 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<210> 19

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 19

acatcactcc gt 12

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 18

tgcacaggag ttgagtgtcc

20

<400> 20

acggagtgat gtccgtcgac gtatctctgc gttgatactt cagcgtagct

50

<210> 21 <211> 26 <212> DNA

<213> Artificial

<220> <223> iniciador

<4 00> 21

agctacgctg aagtatcaac gcagag

26

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 22

cttctggcac tgcagagtca ccct

24

<210> <211>

<212>

23

24 DNA

<213> Artificial <220>

<223> iniciador

<4 00> 23

ggagagtaca cctgtgaata ctac

24

<210> <211> <212>

24 26 DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 24

gtatcaacgc agagatacgt cgacgg

26

<210> <211> <212>

25 24 DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 0 0> 25

tccacctgcg gtcactgtac ccct

24

<210> <211> <212> <213>

26

30 DNA

Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 0 0> 26 ctacagaaaa gcatcccccc acatcctttc <210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 27

gctgatagta gacctgctga agac

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 28

gtccagatat gtccaggcct ctg

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 29

ttcagttatt ttaccagggt tta

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 30

tctgtgatag acaaccatct

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 31

gtcattgtac ccggggtctt <210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 32

atgacagaag gctacactgt ggataa

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 0 0> 33

tcatttttct cctggggcac

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 34

gatctctgtg atagatgcaa g

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 35

gtcattgtac ccggggtctt

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 0 0> 36

cgcgtcgacg ccaccatgat ctctaggctc ctttccctt

<210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> iniciador <4 0 0> 37

gcgggcggcc gcttaccagg gtttatttgg agacag

<210> 38

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 38

cgcggcggcc gcattatcca cagtgtagcc ttctgtcat

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 39

cgcctcgagc tgggagagcc gcagctctgc tat

<210> 40

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 40

gcgggcggcc gcctactggg gtggtttctc atgctt

<210> 41

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 41

cgcgtcgacc agacatcggc aggttcctgc tcc

<210> 42

<211> 36

<212> DNA

<213> Artiticiai

<220> <223> iniciador <4 00> 42

gcgggcggcc gctcagcctc tgccaggcat gttgat

<210> 43

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 43

cgcgtcgact taagtcccgt acaggcccag agt

<210> 44

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 44

gcgggcggcc gctcatctgt aatattgcct ctgtgt

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 45

tgtgaatact acagaaaagc atcc

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 46

tccacctgcg gtcactgtac ccct

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 47 cttctggcac tgcagagtca ccct

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 48

ggagagtaca cctgtgaata ctac

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 49

tgtgaatact acagaaaagc atcc

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 0 0> 50

tccacctgcg gtcactgtac ccct

<210> 51

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 51

cgcgtcgacg ccaccatgat ccctaagctg ctttccctc

<210> 52

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 52

cgcgcggccg cctagcgcat gctacccttg gcagc <210> 53

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 53

gcgggcggcc gcacccaggg agtagttgct cgatgt

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 54

cagctggcaa gaggaacagt

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 55

gagcatcggc acttatctcc

<210> 56

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 56

cgcgtcgacg ccaccatgca gctggcaaga ggaacagta

<210> 57

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<400> 57

gcgggcggcc gctcagtacg cctcttcttc gtagtc

<210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> iniciador <400> 58

cgcgtcgacg ccaccatgca gcagagagga gcagctgga 39

<210> 59

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador

<4 00> 59

gcgggcggcc gctcaatatg tctcttcata gtctga

36

Claims

1. Proteína secretora ou de membrana, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8, ou uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 que contém uma ou mais substituições conservativas.

2. Proteína secretora ou de membrana, caracterizada pelo fato de que é selecionada dentre os seguintes (i), (ii), (iii) e (iv): (i) uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 10; (ii) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais aminoácidos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 10; (iii) uma proteína secretora ou de membrana que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 10; e (iv) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando 90 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

3. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína secretora ou de membrana como definido na reivindicação 1.

4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de nucleotídeos da SEQID NO: 1, SEQID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7.

5. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína secretora ou de membrana como definida na reivindicação 2.

6. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre os seguintes (v), (vi), (vii) e (viii): (v) um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9; (vi) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9 em que um ou mais nucleotídeos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais nucleotídeos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que codifica uma proteína secretora ou de membrana funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; (vii) um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, e que codifica uma proteína secretora ou de membrana funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; e (viii) um polinucleotídeo que apresenta 90 % ou mais de identidade com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, e que codifica a proteína secretora ou de membrana funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

7. Anticorpo contra uma proteína secretora ou de membrana, ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre os seguintes (ix), (x), (xi) e (xii): (ix) uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQID NO: 12; (x) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais aminoácidos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; (xi) uma proteína secretora ou de membrana que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQID NO: 10 ou SEQID NO: 12; e (xii) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12.

8. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo contra uma proteína de membrana ou uma proteína secretora como definida na reivindicação 1 ou 2, ou um fragmento funcional do mesmo.

9. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo contra uma proteína secretora ou de membrana compreendendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, ou uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 que contém uma ou mais substituições conservativas, ou um fragmento funcional do mesmo.

10. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo contra uma proteína secretora ou de membrana selecionada dentre as seguintes (ix')> (x'), (xi') e (xii1), ou um fragmento funcional do mesmo: (ix') uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; (x') uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais aminoácidos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 12; (xi') uma proteína secretora ou de membrana que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; e (xii1) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.

11. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo contra uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, ou uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 que contém uma ou mais substituições conservativas, ou um fragmento funcional do mesmo.

12. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é produzido por um hibridoma depositado sob o número de acesso n0 FERM BP-10376.

13. Hibridoma, caracterizado pelo fato de que é depositado sob o número de acesso n0 FERM BP-10376.

14. Proteína, caracterizada pelo fato de que é selecionada dentre as seguintes (xiii), (xiv), (xv) e (xvi): (xiii) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16; (xiv) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16 em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais aminoácidos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 14 ou SEQID NO: 16; (xv) uma proteína que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 14 ou SEQID NO: 16; e (xvi) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16.

15. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína como definida na reivindicação 14.

16. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre os seguintes (xvii), (xviii), (xix) e (xx): (xvii) um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou SEQID NO: 15; (xviii) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 em que um ou mais nucleotídeos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais nucleotídeos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que codifica uma proteína funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQID NO: 16; (xix) um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, e que codifica uma proteína funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 14 ou SEQID NO: 16; e (xx) um polinucleotídeo que apresenta 70 % ou mais de identidade com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, e que codifica uma proteína funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16.

17. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é contra uma proteína como definida na reivindicação 14, ou um fragmento funcional do mesmo.

18. Agente terapêutico para uma doença autoimune, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 12 e 17 como um ingrediente ativo.

19. Agente terapêutico para uma doença autoimune de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de artrite reumatóide.

20. Agente para inibir adesão de células T, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 12 e 17 como um ingrediente ativo.

21. Método para triar uma substância que inibe adesão de uma célula T a uma proteína TARM ou um sal da mesma, ou um solvato da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) contactar uma célular T com uma proteína TARM na presença ou ausência de uma substância de teste; e (b) medir a atividade de ligação de uma célula T com referida proteína TARM, sendo que referida proteína TARM é uma proteína secretora ou de membrana selecionada dentre as seguintes (ix), (x), (xi) e (xii): (ix) uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; (x) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais aminoácidos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQID NO: IOou SEQID NO: 12; (xi) uma proteína secretora ou de membrana que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQID NO: 12; e (xii) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQID NO: IOou SEQID NO: 12.

22. Método de seleção de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de (c) comparar a atividade de ligação na presença de uma substância de teste com a atividade de ligação na ausência de uma substância de teste, após a etapa (b).

23. Método de seleção de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que a célula T é uma célula T ativada.

24. Método de seleção de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 23, caracterizado pelo fato de que a célula T ativada é uma célula Th2 ativada.

25. Método para seleção de uma substância que inibe ativação de uma célula dendrítica ou um sal da mesma, ou um solvato da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (d) contactar um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 12 com uma célula dendrítica na presença ou ausência de uma substância de teste; e (e) medir o nível de ativação de referida célula dendrítica.

26. Método de seleção de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que, na etapa (e), o nível de ativação de referida célula dendrítica é medido usando-se a quantidade de IL-6 e/ou MCP-I produzida da célula dendrítica como um índice.

27. Método de seleção de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de (f-1) comparar a quantidade de IL-6 e/ou MCP-Il produzida na presença de uma substância de teste com a quantidade de IL-6 e/ou MCP-I produzida na ausência de uma substância de teste, após a etapa (e).

28. Método de seleção de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que, na etapa (e), o nível de ativação de uma célula dendrítica é medido usando-se o nível de expressão da cadeia FcRy na célula dendrítica como um índice.

29. Método de seleção de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de (f-2) comparar o nível de expressão da cadeia FcRy na presença de uma substância de teste com o nível de expressão da cadeia FcRy na ausência de uma substância de teste, após a etapa (e).

30. Método para triar uma substância que inibe uma formação de complexo entre uma proteína TARM e a cadeia FcRy ou um sal da mesma, ou um solvato da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (g) contactar um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 12 com uma célula dendrítica na presença ou ausência de uma substância de teste; e (h) medir o nível de expressão da cadeia FcRy em referida célula dendrítica, sendo que referida proteína TARM é uma proteína secretora ou de membrana selecionada dentre as seguintes (ix), (x), (xi) e (xii): (ix) uma proteína secretora ou de membrana compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQID NO: 12; (x) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 em que um ou mais aminoácidos são inseridos, substituídos ou deletados, ou um ou mais aminoácidos são adicionados a uma ou ambas as extremidades, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10 ou SEQID NO: 12; (xi) uma proteína secretora ou de membrana que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQID NO: 12; e (xii) uma proteína secretora ou de membrana que compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando 70 % ou mais de identidade com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, e que é funcionalmente equivalente a uma proteína que consiste da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQID NO: 12.

31. Método de seleção de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de (i) comparar o nível de expressão da cadeia FcRy na presença de uma substância de teste com o nível de expressão da cadeia FcRy a ausência de uma substância de teste, após a etapa (h).