BRPI0617057A2 - anticorpo isolado, toxina especìfica para receptor de fator de necrose tumoral 25 (tnfr25), método para ativar o receptor de fator de necrose tumoral 25 (tnfr25), método para inibir a sinalização do receptor de fator de necrose tumoral 25 (tnfr25) numa célula, vacina antitumoral, método para imunizar um paciente contra tumor, método para tratar cáncer num paciente, método para tratar e/ou prevenir inflamação intestinal, composição terapêutica para a facilitação de um transplante de órgão, método para transplantar um tecido de um doador para um hospedeiro, método para inibir a expressão clonal de uma população de células t cd8 cognatas, método para tratar e/ou prevenir inflamação pulmonar, antagonista de tnfr25 isolado, composição e vetor de expressão - Google Patents

Abstract

ANTICORPO ISOLADO, TOXINA ESPECìFICA PARA RECEPTOR DE FATOR DE NECROSE TUMORAL 25 (TNFR25), MéTODO PARA ATIVAR O RECEPTOR DE FATOR DE NECROSE TUMORAL 25 (TNFR25), MéTODO PARA INIBIR A SINALIZAçAO DO RECEPTOR DE FATOR DE NECROSE TUMORAL 25 (TNFR25) NUMA CéLULA, VACINA ANTITUMORAL, MéTODO PARA IMUNIZAR UM PACIENTE CONTRA TUMOR, MéTODO PARA TRATAR CANCER NUM PACIENTE, MéTODO PARA TRATAR E/OU PREVENIR INFLAMAçAO INTESTINAL, COMPOSIçAO TERAPêUTICA PARA A FACILITAçAO DE UM TRANSPLANTE DE ORGAO, MéTODO PARA TRANSPLANTAR UM TECIDO DE UM DOADOR PARA UM HOSPEDEIRO, MéTODO PARA INIBIR A EXPRESSAO CLONAL DE UMA POPULAçAO DE CéLULAS T CD8 COGNATAS, MéTODO PARA TRATAR E/OU PREVENIR INFLAMAçAO PULMONAR, ANTAGONISTA DE TNFR25 ISOLADO, COMPOSIçAO E VETOR DE EXPRESSAO. O objeto da presente invenção consiste em prover compo- sições e métodos novos utilizando agentes imunomoduladores que podem estimular ou indiretamente aumentar o sistema imune ou, em outros casos, ter um efeito imunossupressor. Os agonistas de TNFR25 aqui descritos possuem um efeito antiinflamatório e curativo. Podem ser usados, entre outras coisas, para tratar doença causada por asma e inflamação crónica, tais como, por exemplo, doenças intestinais inflamatórias, incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn. Os antagonistas de TNFR25 aqui descritos são ca- pazes de inibir as respostas imunes celulares mediadas por célula T CD8 e podem, por exemplo, mitigar a rejeição de órgáo ou tecido, após um transplante de tecido. Os agonis- tas de TNFR25 aqui descritos representam modificadores de resposta biológica que alteram a interação entre as defesas imunes celulares do organismo e as células cancerosas para reforçar, direcionar ou restaurar a capacidade do organismo no combate ao câncer quando administrados com vacinas anti- tumorais. As imunotoxinas TNFR25 específicas aqui descritassão também capazes de aumentar a eficácia de um esquema quimioterápico através da depleção de células imunos- supressoras de ocorrência natural num paciente com câncer.

Description

"ANTICORPO ISOLADO, TOXINA ESPECÍFICA PARA RECEPTOR DE FATOR DE NECROSE TUMORAL 25 (TNFR25), MÉTODO PARA ATIVAR O RECEPTOR DE FATOR DE NECROSE TUMORAL 25 (TNFR2 5), MÉTODO PARA INIBIR A SINALIZAÇÃO DO RECEPTOR DE FATOR DE NECROSE TUMORAL 25 CÍNFR2 5) NUMA CÉLULA, VACINAANTITUMORAL, MÉTODO PARA IMUNIZAR UM PACIENTE CONTRA TUMOR, MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER NUM PACIENTE, MÉTODO PARA TRATAR E/OU -PREVENIR INFLAMAÇÃO INTESTINAL, COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA PARA A FACILITAÇÃO DE UM TRANSPLANTE DE ÓRGÃO, MÉTODO PARA TRANSPLANTAR UM TECIDO DE UM DOADOR PARA UM HOSPEDEIRO, MÉTODO PARA INIBIR A EXPRESSÃO CLONAL DE UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS CD8 COGNATAS, MÉTODO PARA TRATAR E/OU PREVENIR INFLAMAÇÃJD PULMONAR, ANTAGONISTA DE ' TNFR2 5 IÍÍOLAÍJS1,C COMPOSIÇÃO E|VETOR DE EXPRESSÃO".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a agonistas, imunotoxinas, antagonistas da Super Família 25 de Receptor de Fator de Necrose Tumoral (TNFR25) e a seu uso no tratamento do câncer, inflamação e para efetuar imunossupressão, respectivamente.

Histórico da invenção

Muitos distúrbios do sistema imune humano enquadram-se em duas amplas categorias: os que se caracterizam por uma resposta imune atenuada e os que se caracterizam por respostas imunes exageradas. A imunodeficiência é caracterizada por uma resposta atenuada. Há formas congênitas (inatas) e adquiridas de imunodeficiência. A doença granulomatosa crônica, na qual os fagócitos encontram dificuldade em destruir os patógenos, é um exemplo da primeira. A AIDS ("Síndrome da Imunodeficiência Adquirida"), uma doença infecciosa, causada pelo vírus HIV que destrói as células T CD4+, é um exemplo da última. Uma outra doença que pode ser caracterizada por uma resposta imune atenuada é o câncer. Ao contrário dos indivíduos sadios, os sistemas imunes de pacientes com câncer não são capazes de reconhecereficazmente e/ou de destruir as células tumorais. Apesar das grandes expectativas, não existem medicamentos até o momento que aumentem diretamente a atividade do sistema imune. Porém, terapias biológicas têm sido recentemente utilizadas para recrutar o sistema imune, seja direta ou indiretamente, no combate a doenças, tal como o câncer. Os anticorpos monoclonais (MAb) são atualmente utilizados com freqüência como terapia biológica. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem reagir com tipos específicos de células cancerosas, e possuem efeitos antitumorais diretos ou indiretos. As vacinas antitumorais podem ser empregadas terapeuticamente ou para profilaxia após terapia primária. As vacinas antitumorais podem precisar induzir a imunidade celular na forma de células T citotóxicas tumor-específicas do fenótipo CD4 ou CD8. Considera-se que a imunidade antitumoral eficaz requer a geração e a manutenção de tais células citotóxicas por longos períodos de tempo. Além disso, as evidências indicam que o braço inato do sistema imune deve ser ativado paragerar vacinas antitumorais eficazes. As vacinas que aumentam ou que geram respostas humorais produzem anticorpos que podem ser detectados durante um período relativamente longo. Para serem eficazes, esses anticorpos devem ser capazes de direcionar antígenos de superfície celular em ensaios com célula viva. A manutenção de respostas imunes celulares específicas a epítopos antigênicos (imunidade adaptativa) pode requerer imunizações mais freqüentes, emboras as células dememória possam manter a capacidade de responder e de reopor-se ao epítopo de imunização. Como tal, seria substancialmente benéfico ter acesso a terapias que fossem capazes de reforçar as respostas imunes celulares específicas a vacinas antitumorais. Por outro lado, um sistema imune superativo figura em diversos outros distúrbios, especialmente nos distúrbios autoimunes, tais como o lupus eritematoso, diabete tipo I(às vezes denominada "diabete de início juvenil"), esclerose múltipla, psoríase, artrite reumatóide, e doenças intestinais inflamatórias, tais como Doença de Crohn e colite ulcerativa (UC) . Nestes, o sistema imune não distingue adequadamente entre o "próprio" ("self") e o "não-próprio" ("non-self") e ataca uma parte do organismo do próprio paciente. Outros exemplos de respostas imunes exageradas em doenças incluem hipersensibilidades, tais como alergias e asma. A supressão do sistema imune é freqüentemente utilizada para controlar os distúrbios autoimunes ou a inflamação quando isso causa dano excessivo aos tecidos. A medicação imunossupressora induz intencionalmente umaimunodeficiência para impedir a rejeição de órgãos transplantados. Os imunossupressores comumente utilizados incluem glucocorticóides, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, ciclofosfamida e mercaptopurina. Em transplantes de órgãos, a inibição seletiva de célula T previne a rejeição do órgão, sendo utilizados a ciclosporina, tacrolimus, micofenolato mofetil e diversos outros.

Os linfócitos T desempenham um papel central na regulação das respostas imunes. As células T auxiliares expressam o marcador de superfície de CD4 e ajudam as células B na produção de anticorpos e as células T CD8 a desenvolverematividade citotóxica. Outras células T CD4 inibem a produção de anticorpos e a citotoxicidade. As células T regulam o equilíbrio entre o ataque de células infectadas ou tumorigênicas e a tolerância às células corporais. Umataque imune desregulado pode levar à autoimunidade, ao passo que a responsividade imune diminuída resulta em infecção crônica e câncer.

O Receptor de Fator de Necrose Tumoral 25 (TNFR25) aqui também alternadamente designado Receptor de Morte 3 (DR3), conforme aqui discutido, é um regulador de função da célula Τ.O receptor de morte (DR3) (Chinnaiyan et al. , Science 274:990, 1996) é um membro da família dereceptor TNF. É também conhecido como TRAMP (Bodmer et al. , Immunity 6:79, 1997), wsl-1 (Kitson et al.,Nature 384:372, 1996), Apo-3 (Masters et al., Curr.Biol. 6:1669, 1996) e LARD (Screaton et al., Proc. Natl .Acad. Sci USA 94:4615, 1997) e contém um domínio de morte típico. A transfecção de 2 93 células com DR3 humano (hDR3) induziu a apoptose e ativou o NF-κΒ. O ligante cognato para DR3 foi recentemente identificado como TLlA (Migone et al., Immunity 16:479, 2002) e demonstrou ter atividade co-estimulatória para DR3 sobre células T através da indução de NF-κΒ e supressão de apoptose através de expressão de CIAP2 (Wen et al., J.Biol Chem 25:25, 2003). 0 TLlA também se liga ao receptor chamariz 3 (DcR3/TR-6) indicando que a sintonia fina de acessibilidade biológica de TLlA é de importância crítica. Foram observadas formas de ligação múltiplas de mRNA de DR3 humano, indicando regulação a nível pós-transcricional (Screaton et al., Proc. Natl Acad Sci USA 94:4615, 1997).

Muitos membros da família de receptor TNF têm acapacidade de induzir a morte celular através de apoptoseou de induzir sinais co-estimulatórios para a função de célula Τ. A regulação dessas vias opostas foi recentemente esclarecida para TNF-Rl, o receptor contendo domínio de morte prototípico que pode causar apoptose ou proliferação de células T positivas para receptor (Micheau e Tschopp. Cell 114:181, 2003). A ativação de NF-κΒ através de um complexo sinalizador composto de TNF-Rl via TRADD, TRAF2 e RIP induz a associação FLIPL com um segundo complexo sinalizador composto de TNFRl, TRADD e FADD, impedindo a ativação de caspase 8 enquantopersistir a sinalização de NF-κΒ. 0 DR3 demonstrou ser capaz de induzir a apoptose em células transfectadas e de induzir NF-κΒ e todas as três vias de MAP-quinase (Chinnaiyan et al., Science 274:990, 1996; Bodmer et al., Immunity 6:79, 1997; Kitson et al., Nature 384:372, 1996; Marsters et al., Curr.Biol. 6:1669, 1996; Screaton et al.Proc.Natl.Acad Sci USA 94:4615, 1997; Wen et al.J.Biol Chem 25:25, 2003). O bloqueio de NF-κΒ, mas não o de MAP-quinase e a inibição de síntese protéica resultou na morte celular mediada por DR3, indicando que os sinais NF-κΒ mediam os efeitos anti-apoptóticos através da síntese de proteínas anti-apoptóticas.

A expressão de mRNA de DR3 é pronunciada em tecidos linfóides, principalmente no baço, nódulos linfáticos, timo e intestino delgado, indicando um papel importante de DR3 sobre os linfócitos. DR3 murinó foi eliminado através de recombinação homóloga em células tronco embrionárias (Wang et al. , Mol Cell Biol 21:3451, 2001). Camundongos-/-DR3 mostraram seleção negativa reduzida por anti-CD3 no timo, mas seleção negativa normal por superantígenos e seleção positiva não prejudicada de timócitos. As células T periféricas maduras não foram afetadas pela deficiência de DR3. Apesar da considerável quantidade de pesquisa preliminar, a função fisiológica de DR3 permanece precariamente caracterizada. Todas as publicações científicas incluindos os documentos patentários aqui citados são aqui incorporados por referência em sua totalidade, para todos os fins.

Sumário da invenção

Um aspecto da invenção refere-se a um anticorpo que liga-se ao antígeno de Receptor de Fator de Necrose Tumoral 25 (TNFR25) e que pode atuar como um agonista de TNFR25. Numa concretização, o anticorpo é capaz de aumentar a expansão de célula CD8 OT-I quando de uma preparação cruzada ("cross-priming") através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle. Numa outra concretização, o anticorpo é o anticorpo monoclonal 4C12 purificado.

Outro aspecto da invenção refere-se a uma toxina TNFR25-específica compreendendo um agente tóxico ligado a polipeptídeo que se liga ao receptor TNRF2 5. Numa concretização deste aspecto, a porção compreendendo toxina inclui o anticorpo monoclonal 4C12 ou uma porção imunoespecífica de 4C12. Em outra concretização, o agentetóxico é selecionado de um isótopo radioactivo, ricina, abrina, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, ou íon metálico. Numa outra concretização, o polipeptídeo que se liga ao TNRF2 é a proteína de TLlA ou um 5 fragmento ou variante da mesma.

Em outro aspecto da invenção, a toxina TNFR25-específica é usada num método para tratar câncer num paciente. Especificamente, o método inclui a depleção de células T CD4+/CD25+ reguladoras (Tregs) de um paciente, administrando ao mesmo toxina TNFR25-específica e também um agente quimioterápico.

Outro aspecto da presente invenção refere-se ainda a um método para ativar receptor de TNFR2 5 expressado numa célula compreendendo contatar a célula com um agonista de TNFR25. 0 agonista pode ser selecionado de um anticorpo monoclonal 4C12; um anticorpo que se liga a TNFR25 e que pode aumentar a expansão de célula CD8 OT-I quando da preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle; um proteína de TLlA solúvel; um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um anticorpo de agonista de TNFR25; um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um TLlA solúvel; ou um vetor de expressãocom um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um TNFR2 5. Esse método inclui ainda observar um aumento na sinalização de receptor TNFR25. Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a um anticorpo que seja capaz de atuar como um antagonista de 30 TNFR25. Em uma concretização, o anticorpo liga-se a um TLlA e é capaz de reduzir a expansão de célula CD8 OT-I quando da preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle. Numa outra concretização, o anticorpo é o anticorpo monoclonal purificado L4G6.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para inibir a sinalização de receptor TNFR25 numa célula. 0método inclui contatar a célula com um antagonista de TNFR2 5. 0 método inclui ainda observar uma redução na sinalização de receptor TNFR25.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma vacina antitumoral compreendendo um antígeno tumoral e um agonista de TNFR25 como modificador de resposta biológica. Uma outra concretização dessa vacina também inclui um adjuvante.

Em outro aspecto da presente invenção, após isolar um antígeno tumor-específico, uma vacina compreendendo um antígeno tumor-específico e um agonista de TNFR25 é utilizada para imunizar um paciente contra o tumor. Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para tratar e/ou prevenir inflamação intestinal compreendendo prover a um paciente necessitado uma quantidade eficaz de uma composição terapêutica compreendendo um agonista de TNFR25.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição terapêutica para a facilitação de um transplante de órgão compreendendo um antagonista de TNFR2 5 e um imunossupressor. Numa concretização deste aspecto, o imunossupressor é o glucocorticóide, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, ciclofosfamida, mercaptopurina, tacrolimus ou micofenolato mofetil.

Em outro aspecto da invenção, uma composição antagonistade TNFR25 é usada num método para transplante de tecido de um doador para um hospedeiro. Esse método inclui as etapas de obter tecido de um doador; prover um hospedeiro com uma composição antagonista de TNFR2 5; e transplantaro tecido no hospedeiro.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para inibir a expansão clonal de uma população de células T CD8 cognatas. Esse método inclui expor as células T CD8 a seu antígeno cognato e expor as células T CD8 a um antagonista de TNFR25. Em outra concretização, o antígeno cognato está associado com o tecido a ser transplantado de um doador para um hospedeiro.Outro aspecto da presente invenção refere-se a um antagonista de TNFR25 isolado compreendendo um polipeptídeo codificado por uma seqüência compreendendo ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes com SEQ ID NOS: 4, 5, 6 e/ou 16 e sendo que a seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de TL1A. Numa concretização, a seqüência hibridiza sob condições estringentes com SEQ ID NO :4. Numa outra concretização, a seqüência hibridiza sob condições estringentes com SEQ ID NO: 5. Numa outra concretização, a seqüência hibridiza sob condições estringentes com SEQ ID NO:6. Em outra concretização, a seqüência hibridica sob condições estringentes com a SEQ ID NO:16. Em outra concretização, o TLlA é um TLlA humano ou de camundongo.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método para tratar e/ou prevenir inflamação pulmonar compreendendo prover a um paciente necessitado uma quantidade eficaz de uma composição terapêutica compreendendo o antagonista de TNFR25 compreendendo um polipeptídeo codificado por uma seqüência compreendendo ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes com SEQ ID NOs: 4, 5, 6 e/ou 16, e sendo que a seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de TL1A.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método para transplantar um tecido de um doador para um hospedeiro compreendendo obter o tecido do doador, prover o hospedeiro com o antagonista de TNFR2 5 compreendendo um polipeptídeo codificado por uma seqüência compreendendo ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes com SEQ ID NOs: 4, 5, 6 e/ou 16 e sendo que a seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de TL1A; e transplantar o tecido no hospedeiro.

Outro aspecto da invenção refere-se a uma composição compreendendo um polipeptídeo codificado por uma seqüência que hibridiza sob condições estringentes comSEQ ID NOs: 3 e/ou 7, e sendo que a seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se à proteína de receptor TNFR2 5; e um agente tóxico. Numa concretização, o agente tóxico é selecionado do grupo consistindo de um isótopo radioativo, ricina, abrina, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, e íon metálico.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método para tratar câncer num paciente compreendendo a depleção de células T CD4 + /CD25+ reguladoras (Tregs) num paciente, provendo ao paciente uma composição que compreenda a toxina da reivindicação 39; e prover a um paciente um agente quimioterápico.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para tratar e/ou prevenir inflamação intestinal compreendendo prover a um paciente necessitado uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um polipeptideo codificado por uma seqüência que hibridiza sob condições estringentes com SEQ ID NOs: 3 e/ou 7, e sendo que a seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de receptor de TNFR25. Numa concretização, a inflamação é resultado de síndrome do intestino irritável. Em outra concretização, a inflamação intestinal é resultado de doença de Crohn. Um outro aspecto da invenção refere-se a uma vacina antitumoral compreendendo um antígeno tumoral e um polipeptideo codificado por uma seqüência que hibridiza sob condições estringentes com SEQ ID NOs: 3 e/ou 7, e sendo que a seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de receptor de TNFR25, como modificador de resposta biológica. Outro aspecto da invenção refere-se ainda a um vetor de expressão compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes com SEQ ID NOs: 3 e/ou 7, e que codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de receptor de TNFR2 5. Outro aspecto da invenção refere-se ainda a um vetor deexpressão compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes com SEQ ID NOs: 4, 5, 6 e/ou 16, e sendo que a seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de TLlA.

Vantagens adicionais da presente invenção tornar-se-ão evidentes aos habilitados na técnica a partir da descrição detalhada a seguir, sendo que apenas a concretização preferida da invenção é mostrada e descrita, simplesmente com a finalidade de ilustrar o melhor modo previsto para executar a invenção. Conforme será realizado, a invenção é capaz de outras e diferentes concretizações, e seus diversos detalhes são capazes de modificações em diversos aspectos óbvios, desde que não fujam do escopo da invenção. A presente invenção pode ser praticada sem alguns ou todos esses detalhes específicos. Em outros casos, operações de processo conhecidas não foram descritas com detalhes, de forma a não confundir desnecessariamente a presente invenção. Conseqüentemente,os desenhos e descrições devem ser considerados comoilustrativos por natureza e não restritivos. Breve descrição dos desenhos

A Figura IA mostra a expressão de TNFR2 5 murino em células de nódulos linfáticos. MFI é indicado por números em preto para o anticorpo de controle de isótipo como anticorpo primário e em tracejado para anti-TNFR25. A detecção de TNFR2 5 necessitou de um sanduíche triplo de anticorpo monoclonal anti-TNFR25 primário de hamster, seguido de biotina anti-hamster de cabra e estreptavidina(Strept-Avidin) marcada com PE. IB ilustra a expressão deTNFR25 sobre os linfócitos ativados. A ativação de esplenócitos foi realizada com anti-CD3 imobilizado (5 //g/ml) e anti-CD28 {lμg/ml) ou LPS (lμg/ml) por 24 horas. As células foram assistidas pelas células CD4 ou CD8 ou células positivas B220 e células negativas 7-AAD (a subscrição a significa células CD4, CD8 ou B ativadas). Nos histogramas, é mostrado o MFI para expressão deTNFR25 nos esplenócitos em repouso e nos esplenócitos ativados. IC ilustra a expressão de TNFR25 sobre os timócitos. Os timócitos foram assistidos pelas células CD4/CD8 duplas negativas, duplas positivas ou positivas simples e avaliados quanto à fluorescência anti-TNFR25. A Figura 2A ilustra as formas de ligação de TNFR25 murino. As formas de ligação foram obtidas através de RT-PCR de mRNA obtido de esplenócitos murinos e linhagens celulares murinas em repouso. CRD: domínio rico em cisteína; TM: domínio transmembrânico; DD: domínio de morte. Asteriscos: códon de parada na estrutura. Nas formas de ligação 1-4 o íntron entre o éxon 2 e 3 não é ligado e contém um códon de parada prematuro. As formas de ligação 1-4 provavelmente são proteínas não funcionais. Δ5 e Δ6 murino (correspondendo a Δ5 e Δ6,7 humano) são desprovidos de domínio transmembrânico completo, sendo provavelmente formas secretadas que poderiam atuar como receptor chamariz solúvel para TLlA. Δ5,6 (potencialmente correspondendo a A3 humano) e formas de ligação FL são estudadas como transgenes neste relatório. Δ5,6, 8 e Δ5, 6, 9 (sem homólogos humanos) são provavelmente ancorados em membrana, sendo, porém, desprovidos de domínio de morte, podendo ter propriedades de sinalização alteradas ou atuar como formas de ligação negativas dominantes. 0 DN TNFR25 preferido aqui descrito foi truncado após o domínio ΤΜ. 2B ilustra a ligação alternativa de TNFR25 induzida por ativação. 0 TNFR25 tanto humano como de camundongo são ligados após ativação. A ligação humana é aqui mostrada já que as formas de ligação de TNFR2 5 são melhor separadas quanto ao tamanho após eletroforese em gel do que as formas murinas. As formas de ligação foram confirmadas por seqüenciamento. PBL foram isolados por centrifugação de gradiente de Ficoll-Hypaque. Cinco milhões de células foram usadas em cada amostra e mRNAs foram extraídos e convertidos em cDNA utilizando o kit de síntese de cDNA Invitrogen. Ativação de PBL através de PHA (5/zg/ml),anti-CD3 imobilizado (5 μ9/ιη1) e anti-CD28 solúvel (lμg/ml) ou PMA (10 ng/ml) e ionomicina (400 ng/ml) conforme indicado. As células foram coletadas nos pontos de tempo indicados e as análises RT-PCRs conduzidas; β- actina foi usada como controle interno. 2C ilustra que a ligação induzida por ativação é dependente de PKC e independente de síntese de proteína. As células PBL recentemente isoladas foram estimuladas com PMA (10 ng/ml) isoladamente, ou ionomicina (400 ng/ml) isoladamente ou em combinação. PBL foram pré-tratados com H7 (50 μΜ), ou cicloheximida (10 μg/ml) por meia-hora, então PMA e ionomicina foram adicionados à cultura de células. As células foram coletadas após 12 horas para análise de RT-PCR. A Figura 3 ilustra a expressão e função de transgenes-TNFR25 sob o promotor e intensificador de CD2. 3A ilustra a expressão de TNFR2 5 em camundongos transgênicos em comparação com camundongos B6 tipo selvagem e controle de isótipo. Células de nódulo linfático inguinal foram assistidas pelas células positivas CD4, CD8, B220, CDllc, ou células positivas NKl.1 e negativas CD3 ou células positivas duplas NK1.1/CD3. É indicado o MFI correspondente. 0 perfil de expressão para FL TNFR2 5, Δ5, 6 TNFR25 e DN TNFR25 eram idênticos. 3B ilustra um Western blot de células tumorais transfectadas com TNFR25 alternativamente ligadas. 50 μg de proteína de lisados de P815 transfectados com três formas de ligação de TNFR25 foram carregados e borrados ("blotted") com o anticorpo anti-TNFR2 5 IODl. Pista 1: DN TNFR25; pista 2: Δ5, 6 TNFR2 5; pista 3: FL TNFR2 5. 0 anticorpo não detecta Δ5,6 TNFR25 em western blots. 3C ilustra a celularidade reduzida das células positivas CD4 e CD8 em células de nódulo linfático FL TNFR25-tg e timócitos em comparação com as ninhadas tipo selvagem(n=5)*p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001. 3D ilustra a proliferação de FL induzida por ativação danificada e as células transgênicas Δ5,6 TNFR25. A proliferação de células CD4 ou CD8 purificadasfoi medida após 3 dias de estímulo através de captação de timidina durante as últimas 6 horas. As células foram ativadas em placas de microtitulação com anti-CD3 imobilizado (2^g/ml) com ou sem anti-CD28 solúvel (1 μg/ml) ou PMA (lOng/ml) e ionomicina (400 ng/ml). IL-2 de camundongo recombinante foi usado a 1000 U/ml. 3E ilustra que FL TNFR25 e Δ5, 6 TNFR25 ativam NF-κΒ. A ativação de NF-kB foi medida em células EL4 transf ectadas com FL TNFR25 (painel superior) ou com Δ5, 6 TNFR25 (painel inferior) em resposta à ativação de TNFR25. As células foram tratadas com o anticorpo 4C12 TNFR2 5 agonista (5 μg/ml) durante 50 minutos; TLlA solúvel foi provido por 25, 50 ou 75 min conforme indicado, na forma de 25% de sobrenadantes de células EL4 transfectadas com TL1A; o TLlA ligado à membrana (MTLlA) foi provido durante 50 minutos mediante adição de células EL4 transfectadas com TLlA diretamente a TNFR25 expressando EL4. Os controles receberam sobrenadantes de EL4 (não transfectados) durante 50 minutos.

Os extratos nucleares foram preparados e analisados através de EMSA; a seta indica NF-κΒ ativado. 3F ilustra produção de citocina polarizada para Th2 por células T CD4 padrão, FL TNFR2 5 e Δ5, 6 TNFR25-transgênicas. As células T CD4 de baços foram purificadas através de seleção negativa e ativadas com anti-CD3 imobilizado (2 μ9/πι1) e anti-CD28 solúvel (l/xg/ml) durante 3 dias. Os sobrenadantes foram coletados para ensaios ELISA de citocina. A figura representa três experimentos independentes. n.s.: não significativo; *p< 0,05; ** p<0,01; ***p<0,001. 3G ilustra que TNFR25 pode co-estimular a produção de citocina Thl ou Th2. A produção de citocina de células T CD4 FL TNFR25-tg reestimuladas foi determinada sob condições não-polarizantes (Th neutro), Thl, ou Th2. As células CD4 foram ativadas com anti-CD3 imobilizado (2 μg/ml) e anti-CD2 8 solúvel (1 μg/ml) isoladamente (Th neutro) ou combinadas com IL-12 (5 ng/ml) e anti-IL-4 (20 μ9/πι1) para polarização de Thl, ou combinadas com IL-4 (10ng/ml), anti-IFN-γ (10 ^g/ml) e anti-IL-12 (10 μg/ml) para polarização de Th2 durante 4 dias. As células foram coletadas, lavadas e replaqueadas sobre anti-CD3 durante 24 horas e os sobrenadantes coletados para análise por ELISA de citocina.

A Figura 4 ilustra que a proliferação diminuída de células transgênicas-TNFR2 5 não se deve à apoptose, falta de IL-2 ou de expressão do receptor IL-2. 4A ilustra a regulação para cima ("upregulation") normal de IL-2-Ra (CD25) em células CD4 e CD8 transgênicas mediante ativação. Após ativação de 72 horas com anti-CD3 imobilizado e anti-CD28 solúvel, os esplenócitos foram coletados, lavados e corados com anti-CD25-FITC, anti-CD8-PE, e anti-CD4-CY. Células tipo padrão nos painéis superiores, células Δ5,6 TNFR25-tg nos painéis inferiores. 4D demonstra que as células transgênicas não sofrem apoptose aumentada quando da ativação. As células CD4 foram ativadas com CD3 anti-camundongo imobilizado (2 μg/ml) com anti-mCD2 8 solúvel (lμg/ml) durante três dias e coradas com Annexin-V-PE e 7-AAD. Células positivas coradas com Anexina-V e negativas coradas com 7-AAD representam as células apoptóticas. 4C ilustra a produção reduzida de IL-2 pelas células T transgênicas Δ5,6 TNFR25. As células T foram purificadas através de seleção negativa e ativadas com anti-CD3 imobilizado e anti-CD28 solúvel durante 3 dias. Os sobrenadantes foram analisados quanto à produção de IL-2 através de ensaio ELISA; **p=0,0078. 4D ilustra que as células TNFR25-transgênicas dominantes negativas não são polarizadas para Th2 em resposta primária. As células T CD4 do baço foram purificadas através de seleção negativa e ativadas com anti-CD3 imobilizado (2^g/ml) e anti-CD28 solúvel (lμg/ml) durante 3 dias. Os sobrenadantes foram coletados para os ensaios ELISA de citocina. A figura representa três experimentos independentes. 4E ilustra a mesma resposta anticorpo-isótipo de camundongos transgênicos-DN TNFR2 5 e do tipo selvagem. Os camundongos foramimunizados intraperitonealmente com 100 ug de DNP-KLH em PBS estéril e anticorpos IgGl e IgG2a DNP-específicos em soro foram avaliados por ELISA três semanas após imunização. Placas contendo 96 cavidades de alta ligação foram revestidas com DNP-BSA a 0,8/ig/ml para detectar anticorpos anti-DNP específicos. A Figura representa um dos três experimentos independentes.

A figura 5 ilustra que os camundongos transgênicos TNFR25 desenvolvem uma resposta polarizada para Th-2 após desafio in vivo. 5A demonstra que um anticorpo-isótipo é polarizado para Th2 em camundongos TNFR25-tg imunizados. Os camundongos foram imunizados intraperitonealmente com 100 μg DNP-KLH em PBS estéril sem adjuvante. Anticorpos IgGl e IgG2a DNP-específicos em soro foram avaliados através de ELISA uma semana após imunização. Placas com 96 cavidades de alta ligação foram revestidas com DNP-BSA a 0,8/xg/ml para detectar anticorpos anti-DNP específicos. Os dados representam um dos três experimentos independentes. **p<0,01; n.s.: não significativo. 5B ilustra que os sinais TNFR25 regulam a eosinofilia no líquido brônquio-alveolar (BALF). A imunização e o desafio das vias aéreas de camundongos tipo selvagem e Á5,6 TNFR25-tg foram realizados conforme descrito nos Exemplos 10-15. As vias aéreas foram lavadas e a contagem diferencial de células obtida de preparações em "cytospins" coradas com Wright-Giemsa. *:p<0,05; n.s.: não significativo. 5C ilustra o aumento na inflamação pulmonar dos camundongos TNFR25-tg. Histologia pulmonar de camundongos sensibilizados i.p. e submetidos a desafio de vias aéreas com ovalbumina. Após lavagem brônquica, os pulmões foram removidos e fixados em formalina neutra tamponada a 10%. Os pulmões foram então embebidos em parafina, cortados a uma espessura de 5μπι e corados com H&E (painéis esquerdos) ou corante periódico ácido de Schiff (PAS, painéis direitos) para detectar produção de muco. Camundongos B6 tipo selvagem dos dois painéis superiores; camundongos Δ5,6 TNFR25-tg de painéisinferiores. 5D ilustra que os sinais TNFR25 controlam os níveis séricos de IgE. Os camundongos foram sangrados no dia 0 e três dias após o desafio por aerossol (dia 15) . 0 soro foi separado e analisado através de ELISA para determinação de IgE ovalbumina-específica através de sanduíche ELISA. Uma vez que não há proteína padrão disponível para IgE OVA-específica, os resultados são apresentados em unidades O.D. A figura representa um dos três experimentos independentes. **:p<0,01. 5E ilustra a produção aumentada de Th2 citocina por células de nódulos linfáticos brônquicos em camundongos TNFR25-tg. Os nódulos linfáticos brônquicos foram coletados um dia após o desafio por aerossol (dia 13) e as células foram reestimuladas in vitro com 10C^g/ml ovalbumina durante 4 dias. Os sobrenadantes foram então analisados quanto à produção de citocina através de ELISA. Essa figura é representativa de dois experimentos independentes. *p<0,05; * *p< 0,01; ***p<0,001.

A Figura 6 ilustra que TNFR2 5 dominante negativo interfere com a polarização para Th2 e com a inflamação pulmonar. 6A ilustra que o transgene DN TNFR2 5 bloqueia a co-estimulação de citocina através de TNFR25 endógeno. As células tipo padrão e CD4 DN TNFR25-tg foram estimuladas durante três dias com anti-CD3 ou com o anticorpo 4C12 anti-TNFR25 agonista e anti-CD3 combinado e os sobrenadantes analisados quanto às citocinas através de ELISA. 6B ilustra que DN TNFR25 bloqueia a co-estimulação de proliferação através de TNFR25 endógeno. Nos ensaios de proliferação, as células tipo padrão e CD4 DN TNFR25- tg foram ativadas com anti-CD3, com 4C12 ou com a combinação de anti-CD3 e 4C12 durante 3 dias e a incorporação de timidina medida durante as 8 horas finais. 6C ilustra que as células T CD4 DN TNFR25-tg produzem citocinas Th2 reduzidas na ativação secundária. As células T CD4 tipo padrão e transgênicas foram purificadas por seleção negativa e ativadas com anti-CD3 imobilizado (2^g/ml) e anti-CD28 solúvel (lμg/ml) durante3 dias. As células foram então coletadas, lavadas, replaqueadas e reestimuladas com anti-CD3 imobilizado (lμg/ml) durante 2 dias. Os sobrenadantes foram coletados para ensaio de citocina por ELISA. n.s.-não significativo.; ***p<0,001. 6D ilustra que as células T CD4 DN TNFR25-tg resistem à polarização para Th2 in vitro. As células tipo padrão e CD4 DN TNFR25-tg foram purificadas e ativadas durante quatro dias com anti-CD3 e anti-CD28 sob condições neutras (ThN) ou polarizadas para Th2 (adicionando-se IL-4 e bloqueando-se IFN-γ com anticorpo). As células foram coletadas, lavadas e replaqueadas em anti-CD3 durante 24h, os sobrenadantes coletados e as citocinas analisadas por ELISA. 6E ilustra a exudação celular reduzida em BALF em camundongos DN TNFR25-tg em comparação com camundongos tipo selvagem. Os camundongos foram preparados e então submetidos à desafio por aerossol com ovalbumina de acordo com o protocolo padrão; n=5; *:p<0,05. 6F ilustra a supressão de inflamação pulmonar en camundongos DN TNFR2 5 após imunização e desafio das vias aéreas. Painel superior: Ausência de infiltrados perivasculares em camundongos DN TNFR-25-tg após exposição a antígeno por aerossol. Painel inferior: Ausência de muco durante a produção e hiperplasia de células calciformes em camundongos DN TNFR2 5-tg. A inflamação pulmonar foi induzida como na Fig. 5 através de imunização com ovalbumina e posterior exposição ao aerossol. Os camundongos de controle tipo selvagem apresentaram inflamação típica conforme mostra a Fig. 5. 6G ilustra a supressão de produção de IgE ovalbumina-específica em camundongos DN TNFR25-tg. A IgE ovalbumina-específica no soro foi determinada por ELISA. **p<0,01. 6H ilustra a supressão da produção de citocina Th2, mas não de Thl através de DN TNFR2 5 nos nódulos linfáticos brônquicos. Os nódulos linfáticos brônquicos foram coletados um dia após desafio por aerossol e as células reestimuladas com lOOl.tg/ml ovalbumina durante 4 dias. Os sobrenadantes foram então analisados quanto àprodução de citocina através de ELISA. Essa figura representa dois experimentos independentes, n.d.: não detectado; n.s.: não significativo; *:p<0,05. A Figura 7 ilustra que os anticorpos que bloqueiam TLlA debelam a inflamação pulmonar e diminuem a produção de Th2 citocina no pulmão. 7A-D ilustra que o anticorpo L4G6 anti-TLIA é um antagonista funcional de TL1A. a. transfectantes P815 com FL TNFR25, b. com Δ5,6 TNFR25 e c. com TLlA corado através de citometria de fluxo com os anticorpos apropriados, d. L4G6 bloqueia a citotoxicidade mediada por TLlA de células transfectadas com TNFR25. TLlA solúvel diluído coletado serialmente de sobrenadantes de células transfectadas com P815-TLlA foram misturadas com células alvo P815-TNFR25 marcadas com 51Cr. Anticorpos monoclonais TLlA anti-murinos diferentes foram adicionados ao ensaio e a liberação de 51Cr foi analisada cinco horas mais tarde. 7E ilustra que o anticorpo L4G6 bloqueador de TLlA suprime a produção de muco e a inflamação pulmonar in vivo em camundongos C57B16 tipo selvagem. Esquema: Programa de preparação de ovalbumina, desafio por aerossol, e administração de anticorpo de bloqueio (L4G6) ou anticorpo de controle. A histologia pulmonar após coloração com PAS com IgG de controle (à esquerda) e L4G6-IgC (à direita). Observou-seausência de produção de muco em animais tratados com L4G6(as setas apontam para muco em camundongos tratados com IgG de controle). 7F demonstra exudação celular reduzida em BALF em camundongos tratados com L4G6 em comparação com animais tratados com IgG de controle. *:p<0,05; **: p<0,01; n.s. não significativo. 7G ilustra a produção reduzida de 11-5 e 11-13 através de células de nódulo linfático brônquico reestimuladas com ovalbumina após bloqueio de TLlA com L4G6. **p<0,01; ***p<0,001. Detalhes experimentais como na Fig. 5. 7H ilustra a expressão de TLlA após desafio por aerossol numa subpopulação decélulas CDllc positivas (seta) no pulmão. Os nódulos linfáticos brônquicos foram coletados antes e após odesafio por aerossol de ovalbumina, e as células CDllc analisadas quanto à expressão de TLlA. Todas as outras células de nódulo linfático brônquico foram TLlA negativas. 71 ilustra falta de expressão de TLlA em linfócitos de células de nódulo linfático brônquico de camundongos imunizados com ovalbumina após desafio das vias aéreas. As suspensões de uma célula foram coradas num sanduíche triplo com anti-TLlA como anticorpo monoclonal primário. As células foram assistidas utilizando o respectivo anticorpo marcado como marcador de população e o histograma de TLlA exibido. Anti-TL1A; controle de isótipo. 7J ilustra que TLlA é expressada em linfócitos T ativados in vitro. Os esplenócitos foram ativados durante 24h com anti-CD3 ligado à placa ou com LPS e então corados com o sanduíche triplo de anti-TLIA como ilustra a Fig. 1 e com o marcador de população conforme indicado. As células B são negativas para TLlA mesmo após ativação com LPS. É mostrada assistência ("gating") no marcador de população e a expressão de TLlA nas células ativadas.

A Figura 8 ilustra que os sinais de TNFR25 são necessários nas células NKT para indução de inflamação pulmonar. Camundongos nocauteados para Jal8 desprovidos de NKT (Cui, J.et al. Science 278, 1623-6 (1997)) foram preparados com ovalbumina e alum como no protocolo padrão de material e métodos. No dia 11 os camundongos receberam por transferência adotiva i.v.3,1 milhões de células NKT tipo padrão parcialmente purificadas ou de células NKT DN TNFR2 5-tg ou PBS conforme indicado. Os camundongos foram aerosolizados no dia 12 com ovalbumina e no dia 14 analisados. Os camundongos tipo selvagem serviram como controles positivos para indução de inflamação pulmonar, camundongos Jal8 k.o. foram imunizados e ovalbumina aplicada por aerossol sem transferência celular adotiva como controles negativos. Os dados referem-se a quatro camundongos de cada grupo em dois experimentos independentes. Ja são camundongos desprovidos de NKT(Cui, J.et al. Science 278, 1623-6(1997).

A Figura 9 ilustra um modelo para ativação de células NKT mediada por TL1A/TNFR25 e de células CD4 polarizadas para Th2 no pulmão. O modelo ilustra a interação potencial entre TLlA e TNFR2 5 que pode contribuir para a produção de IL-13 e indução de AHR. A evidência da necessidade de produção de IL-13 pelas células NKT já foi relatada anteriormente (Akbari, O.et al. Nat Med 9, 582-8(2003)). A presente comunicação mostra a necessidade de sinais de TNFR2 5 em células NKT para inflamação pulmonar, de expressão de TLlA por células CDllc+ e a co-estimulação de efetores CD4 Th2 através de TNFR25. Uma vez que os efetores CD4 podem expressar TL1A, é possível que a interação TLIA/TNFR2 5 entre células CD4 e NKT possam prover a ligação molecular para sua sinergia na asma. Além disso, outras células associadas com pulmão podem expressar TLlA e ajudar a induzir inflamação pulmonar. As Figuras 10 a a 10c ilustram os resultados de um experimento no qual os camundongos receberam 1 milhão-OT- I-gfp i.v. Dois dias depois, eles foram imunizados i.p. com a dose indicada de ovalbumina em PBS(curva azul); com EG7-gp96-Ig de 3T3-ova-gp96-Ig - a quantidade de gp96-Ig (em ng) secretada no prazo de 24h pelo número de células injetadas está indicada na abcissa; com 3T3-ova - a quantidade de ovalbumina secretada no prazo de 24 horas pelo número de células injetadas está indicada na abscissa. Após 5 dias a expansão de OT-I foi determinada através de citometria de fluxo na cavidade peritoneal (PEC) e no baço. A freqüência de OT-I entre células CD8 foi de até 50% na PEC e até 8% no baço com imunização com 3T3-ova-gp96-Ig.

A Figura 11 ilustra os resultados de um experimento no qual mAb 4C12 anti-TNFR25 atuou agonisticamente e matou as células EL4 transfectadas com TNFR25, mas não EL4 tipo padrão. Em 11B, 50 μg de 4C12 agonista ou L4G6 anti-TLIA antagonista ou IgG de controle foram administrados i.p. 24h e 72h após imunização com EG7-gp96-Ig. 4C12 causou umaumento de 8-10 vezes na expansão de OT-I e duplicação de células de exudato peritoneal (n= 4 camundongos por grupo). Anti-TLlA inibe a expansão de CD8.

A Figura 12 ilustra a preparação cruzada ("cross priming") de células CD8 através de proteína gp96 de choque térmico. As células de vacina (alogeneicas ou singeneicas) foram transfectadas com gp96-Ig e ovalbumina, quando então secretaram peptídeos de ovalbumina gp96-Ig chaperonados. Gp96 foi detectado por CD91 e TLR2/4 em DC resultando em sua ativação e absorção de gp96-Ig com seus peptídeos ligados. 0 DC ativado regulou B7 para cima (independente de CD4 0-L) e os peptídeos ligados a gp-96 reenviados de forma cruzada via Kb (em camundongos B6). OT-I expressa gfp, as células CD8 TCR transgênicas adotivamente transferidas para camundongos B6 específicas para Kb-ova. Sua expansão podem ser facilmente medida por proteína fluorescente verde.

A Figura 13 ilustra Tregs CD4+CD25+ positivas FoxP3 expressando TNFR25. As células CD4 foram purificadas através de depleção de células B, células CD8 e monócitos e então positivamente selecionadas por classificação magnética para CD25 e então ativadas.

A Figura 14 ilustra a não recuperação de camundongos DN-TNFR2 5-tg de colite induzida por DSS. 5 camundongos decada grupo receberam DSS a 2% em água potável durante 8 dias e então retornaram à água normal.

A Figura 15 mostra que os sinais de TNFR25 anulam a inibição de Treg.

A Figura 16 mostra a localização de Gfp-OT-I na mucosaapós imunização com gp96-Ig i.p. Os camundongos receberam 1 milhão de gfp-0T-I i.v. através de transferência adotiva.

Após 2 dias, os camundongos receberam 4 milhões de EG7-gp96-Ig (à esquerda) ou 4 milhões EG7 (painéis à direita) i.p. como estímulo. Quatro dias depois, a freqüência de gfp-0T-I foi analisada em IEL, placas de Peyer e LPL, além da análise usual de células na PEC, nobaço e nos nódulos Iinfáticos.

As Figuras 17a a 17d mostram as SEQ ID NOs: 1-7 e SEQ ID No:16 e os números de acesso ao banco de dados público selecionado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Ê objeto da invenção prover composições e métodos novos utilizando agentes imunomoduladores que possam estimular ou indiretamente incrementar o sistema imune ou, em outros casos, que tenham um efeito imunossupressor. Os agonistas de TNFR2 aqui descritos representam os modificadores de resposta biológica que alteram a interação entre as defesas imunes celulares do organismo e as células cancerosas para reforçar, direcionar ou restaurar a capacidade do organismo no combate ao câncer quando administrados com vacinas antitumorais. Os agentes tóxicos TNFR25-espec£ficos aqui descritos são capazes de aumentar a eficácia de um regime quimioterápico através da depleção de células imunossupressoras de ocorrência natural num paciente com câncer. Os agonistas de TNFR25 aqui descritos podem também ter um efeito curativo. Podem ser usados, entre outras coisas, para tratar doença causada por inflamação crônica tal como a doença intestinal inflamatória. Os antagonistas de TNFR25 aqui descritos são capazes de inibir as respostas imunes celulares mediadas por célula T CD8 e podem, por exemplo, tratar asma e abrandar a rejeição de órgão ou tecido após um transplante de tecido.

1. Definições

Ao descrever a presente invenção, são empregados os termos a seguir descritos, que devem ser definidos conforme indicado abaixo.

Um "antígeno" inclui qualquer substância que pode ser especificamente ligada por uma molécula de anticorpo. Assim, o termo "antígeno" abrange moléculas biológicas inclusive, porém não limitado a metabólitos intermediários simples, açúcares, lipidios, autoácidos, e hormônios, bem como macromoléculas, tais comocarbohidratos complexos, fosfolipídios, ácidos nucleicos e proteínas.

Uma "composição antigênica" pode compreender um antígeno (ex: um peptídio ou polipeptidio), um ácido nucleico codificando um antígeno (ex: um vetor de expressão de antígeno) ou uma célula expressando ou apresentando um antígeno. Vide Pub.USA No.2003/0185840, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Um "imunógeno" é um antígeno macromolecular que é capaz de iniciar a ativação linfocitária resultando numa resposta imune antígeno-específica. Um imunógeno, portanto, inclui qualquer molécula que contenha um ou mais epítopos que estimularão o sistema imune de um hospedeiro para induzir uma resposta antígeno-específica secretória, humoral e/ou celular.

0 termo "anticorpo" abrange preparações de anticorpo policlonal e monoclonal. Os anticorpos da invenção podem ser preparados em qualquer mamífero, inclusive camundongos, ratos, coelhos, cabras e humanos. 0anticorpo pode ser um membro de uma das seguintes classesde imunoglobulina: IgG7 IgM, IgA, IgD ou IgE e suas subclasses, e preferivelmente é um anticorpo IgGl. 0 termo anticorpo também refere-se a equivalentes funcionais dos anticorpos descritos neste relatório. Equivalentes funcionais possuem características de ligação comparáveis às dos anticorpos, e incluem, por exemplo, anticorpos quiméricos, híbridos, humanizados e de cadeia simples, bem como fragmentos dos mesmos. Métodos para produzir tais equivalentes funcionais são descritos no Pedido PCT WO 93/21319, Pedido de Patente Européia No. 239.400; Pedido PCT WO 89/09622; Pedido de Patente Européia 338.745; e Pedido de Patente Européia EP 332.424. Equivalentes funcionais incluem polipeptídeos com seqüências de aminoácido substancialmente iguais à seqüência de aminoácido das regiões variáveis ouhipervariáveis dos anticorpos da invenção. Seqüência de aminoácido "substancialmente igual" é aqui definida comouma seqüência com pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos cerca de 80%, e mais pref erivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia em relação a outra seqüência de aminoácido, conforme determinado pelo método de busca FASTA, de acordo com Pearson and Lipman, Proc. Natl.Acad.Sci. USA 85, 2444-2448 (1998).

Conforme aqui utilizado, O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a uma composição de anticorpo que tenha uma população homogênea de anticorpos. O termo não se restringe à espécie ou fonte do anticorpo, e nem pretende ser limitado pela forma como é criado. O termo abrange imunoglobulinas completas.

Métodos para preparar anticorpos policlonais e monoclonais são bastante conhecidos no estado da técnica. Os anticorpos policlonais são gerados imunizando-se um animal apropriado, tal como um camundongo, rato, coelho, ovelha ou cabra, com um antígeno de interesse. Para aumentar a imunogenicidade, o antígeno pode ser ligado a um portador antes da imunização.

Portadores apropriados são tipicamente macromoléculas grandes, metabolizadaslentamente, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas de vírus inativo. Tais portadores são bem conhecidos no estado da técnica. Além disso, o antígeno pode ser conjugado a um toxóide bacteriano, tal como um toxóide de difteria, tétano, cólera, etc., para aumentar a imunogenicidade do mesmo.Coelhos, ovelhas e cabras são preferidos na preparação desoros policlonais quando forem desejados grandes volumes de soro. Esses animais são boas escolhas, devido à disponibilidade de anticorpos marcados anti-coelho, anti-ovelha e anti-cabra. A imunização é geralmente realizada misturando-se ou emulsificando-se o antígeno em solução salina, preferivelmente num adjuvante tal como adjuvante completo de Freund ("FCA") e injetando-se a mistura ouemulsão parenteralmente (geralmente subcutaneamente ou intramuscularmente). 0 animal é geralmente reforçado 2-6 semanas mais tarde com uma ou mais injeções do antígeno em solução salina, preferivelmente utilizando adjuvante incompleto de Freund ("FIA"). Os anticorpos podem também ser gerados por imunização in vitro, utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Antisoros policlonais são então obtidos do animal imunizado.

Os anticorpos monoclonais são geralmente preparados utilizando o método de Kohler e Milstein, Nature (1975) 256:495-497, ou uma modificação do mesmo, ou Campbell em "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" em Burdon et al., Eds. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985); bem como através do método de DNA recombinante descrito por Huse et al. em Science 246, 1275-1281 (1989).

Tipicamente, um camundongo ou rato é imunizado conforme descrito acima. Porém, em vez de sangrar o animal para extrair soro, o baço (e opcionalmente diversos nódulos linfáticos grandes) é removido e dissociado em células simples. Se desejado, as células esplênicas podem ser identificadas (após remoção de células não especificamente aderentes) aplicando-se uma suspensão de células a uma placa ou cavidade revestida com o antígeno. Células B, expressando imunoglobulina ligada à membrana específica para o antígeno, ligar-se-ão à placa e não serão removidas com o restante da suspensão quando da lavagem. As células B resultantes, ou todas as células esplênicas dissociadas, são então induzidas a fundirem-se com células de mieloma para formar hibridomas, e são cultivadas num meio seletivo (ex: meio de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Os hibridomas resultantes são plaqueadas limitando-se a diluição, e testados quanto à produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antígeno imunizador (e que não se ligam a antígenos nãorelacionados). Os hibridomas secretores de anticorpo monoclonal selecionado são então cultivados ou in vitro (ex: em frascos para cultura de tecidos ou reatores de fibra oca) ou in vivo (ex: como ascite em camundongos).

0 "sítio de ligação ao antígeno" ou "porção ligante" refere-se à parte da molécula de imunoglobulina que participa na ligação ao antígeno. 0 sítio de ligação ao antígeno é formado por resíduos aminoácido das regiões variáveis "V" de terminal N das cadeias pesadas ("H") e leves ("L"). Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias leve e pesada são designados como "regiões hipervariáveis" que são interpostas entre trechos flanqueadores mais conservados conhecidos como "regiões estruturais" ou "FRs". Assim, o termo "FR" refere-se a seqüências de aminoácido que são naturalmente encontradas entre e adjacentes a regiões hipervariáveis em imunoglobulinas. Numa molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada são dispostas relativamente entre si num espaço tridimensional para formar a superfície de ligação ao antígeno. A superfície de ligação ao antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado, e as três regiões hipervariáveis das cadeias leve e pesada são designadas "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs".

Conforme aqui utilizados, os termos "imunoespecífico", "ligação imunológica" e "propriedades de ligação imunológica" referem-se a interações não-covalentes do tipo que ocorre entre uma molécula de imunoglobulina e um antígeno para o qual a imunoglobulina é específica. A força ou afinidade de interações de ligação imunológica pode ser expressada em termos da constante de dissociação (Kd) da interação, sendo que um Kd menor representa maior afinidade. As propriedades de ligação imunológica de polipeptídeos selecionados podem ser quantificadas utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Um desses métodos consiste em medir as taxas de sítio deligação ao antígeno/formação e dissociação de complexo antigênico, sendo que tais taxas dependem das concentrações dos pares complexos, da afinidade da interação, e dos parâmetros geométricos que igualmente influenciam a taxa em ambas as direções. Assim, tanto a "constante na taxa" (Kon) como a "constante fora da taxa" (Koff) podem ser determinadas calculando-se as concentrações e as taxas reais de associação e dissociação. A relação de KoffZKon permite o cancelamento de todos os parâmetros não relacionados com a afinidade, sendo assim igual à constante de dissociação Kd. Vide, geralmente, Davies et al.(1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473.

Diversas moléculas terapeuticamente úteis são conhecidas no estado da técnica e compreendem sítios de ligação ao antígeno que são capazes de exibir propriedades de ligação imunológica de uma molécula de anticorpo. A enzima proteolítica papaína preferencialmente cliva moléculas de IgG para produzir diversos fragmentos, dois dos quais (os fragmentos "F(ab)") compreendem cada um um heterodímero covalente que inclui um sítio de ligação a antígeno intacto. A enzima pepsina é capaz de clivar moléculas de IgG para prover diversos fragmentos, inclusive o fragmento "F(ab')2" que compreende ambos sítios de ligação ao antígeno. Um fragmento "Fv" pode ser produzido através de clivagem proteolítica preferencial de uma IgM, e em raras ocasiões moléculas de imunoglobulina IgG ou IgA. Os fragmentos Fv são, porém, mais comumente derivados utilizando técnicas recombinantes conhecidas no estado da técnica. 0 fragmento Fv inclui um heterodímero VH::VL não-covalente, inclusive um sítio de ligação a antígeno que retém muito do reconhecimento do antígeno e capacidades de ligação da molécula de anticorpo nativa. Inbar et al.(1972) Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706-2710; e Ehrlich et al.(1980) Biochem. 19:4091-4096.Um polipeptídeo de cadeia simples Fv ("sFv") é um heterodímero VH::VL covalentemente ligado que é expressado a partir de uma fusão de genes incluindo os genes codificadores de VH e VL ligados por um ligante codificador de peptídeo. Huston et al. (1988) Proc.Nat.Acad.Sci. USA 85 (16) :5879-5883 . Diversos métodos foram descritos para discernir as estruturas químicas para converter as cadeias polipeptídicas leves e pesadas naturalmente agregadas mas quimicamente separadas de uma região de anticorpo V numa molécula sFv que irá se moldar numa estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de um sítio de ligação a antígeno. Vide, por exemplo, as patentes americanas Nos. 5.091.513 e 5.132.405, de Huston et al. , e patente americana No. 4.946.778 de Ladner et al.

"Antígeno cognato" conforme aqui utilizado refere-se a um antígeno para o qual um receptor de célula T CD8 (TCR) é imunoespecífico. Tais antígenos, geralmente derivados por exemplo, de patógeno, tecidos transplantados(aloantígeno) e célülas tumorais, são reconhecidos pelo sistema imune como "não-próprio" ("non-self"). A ligação do antígeno cognato a seu receptor de célula T CD8 resulta na expansão clonal daquela célula T. Uma população crescente de células T CD8 cognatas está então 25 em posição de montar uma resposta imunológica celular contra a fonte do antígeno cognato agressor. Os anticorpos da invenção podem também ser usados para preparar "imunotoxinas". A molécula híbrida combina a especificidade de um anticorpo ou antígeno com a toxicidade da toxina. Como tal, as moléculas de imunotoxina possuem uma porção de ligação a antígeno e uma porção de agente tóxico. As imunotoxinas são preferivelmente específicas para uma molécula de superfície celular, por exemplo, TNFR25 e facilitam a liberação de um agente tóxico para uma célula expressando a molécula de superfície celular anteriormente mencionada.Preferivelmente, os "agentes tóxicos" possuem um efeito citostático e/ou citotóxico sobre a célula à qual são liberados. Agentes tóxicos preferidos são, por exemplo, isótopos radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes, enzimas, substratos enzimáticas, cofatores enzimáticos, inibidores enzimáticos, corantes e íons metálicos. Agentes tóxicos incluem, porém não se restringem a Iodo-131, índio-111, e Tecnécio-99m, Tecnécio-99m, índio-111, ítrio-90, doxorubicina (Yang et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:1189-1193), daunorubicina (Diener et al.(1985) Science 231:148-150; Dillman et al. (1988) Câncer Res.48:6097-6102), metotrexato (Uadia et al. (1985) J Natl. Câncer Inst.74:29-35; Deguchi et al. (1986) Câncer Res.46:3751-3755), e clorambucil (Symth et al.(1986) J.Immunol.137:3361-3366). Outros agentes tóxicos incluem ricina, abrina, toxina de difteria e exotoxina de Pseudomonas, ou uma porção enzimaticamente ativa (cadeias A) dos mesmos. Vide, por exemplo, a patente americana No. 4.753.894 de Frankel et al.; Nevelle et al.(1982) Immunol Rev 62:75-91; Ross et al. (1980) European J. Biochem. 104; Vitteta et al. (1982) Immunol Rev 62:158-183; Raso et al.(1982) Câncer Res 42:457-464, e Trowbridge et al.(1981) Nature 294:171-173. São também incluídas as toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos, tais como modecina, alfa-sarcina,proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII E PAP-S), inibidor momordica charantia, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina,restrictocina, fenomicina e enomicina.

"Agentes tóxicos" podem também ser agentes quimioterápicos. 0 termo "agente quimioterápico" conforme aqui utilizado geralmente refere-se a compostos administrados para interromper, desacelerar ou reverter a proliferação indesejada de células. Preferivelmente, tais agentes possuem um efeito anti-proliferativo. Agentes quimioterápicos podem ser anti-metabólitos taiscomo 5-FU, por exemplo. A quimioterapia à base de 5-FU compreende administração de 5-FU, seus derivados, isoladamente ou com outros quimioterápicos, tais como leucovorina ou com um inibidor de DPD tal como uracil, 5-5 etiniluracil,bromoviniluracil, timina,benziloxibenziluracil (BBU) ou 5-cloro-2,4-dihidroxipiridina. Além disso, constatou-se que a co-administração de um derivado de 5"-desoxicitidina da fórmula (I) com 5-FU ou um derivado do mesmo melhora 10 significativamente a liberação de um agente quimioterápico seletivamente para tecidos tumorais em comparação com a combinação de 5-FU ou um derivado do mesmo com um inibidor DPD 5-etiniluracil.

Alternativamente, os agentes genotóxicos são os que formam lesões genômicas persistentes e são preferidos para uso como agentes quimioterápicos no manejo clínico de proliferação celular indesejada. A taxa de reparo celular de danos ao DNA induzidos por genotoxina, bem como a taxa de crescimento celular através do ciclo de divisão celular, afeta o resultado da terapia com genotoxina. Uma classe geral de compostos genotóxicos que são usados para tratar muitos cânceres são os agentes alquilantes de DNA e os agentes intercalantes de DNA. Psoralenos são compostos genotóxicos conhecidos como úteis no tratamento fotoquimioterápico de doenças cutâneas tais como psoríase, vitiligo, infecções fúngicas e linfoma cutâneo de células T. Harrison's Principies of Internai Medicina, Part 2 Cardinal Manifestation of Disease, Ch.60(12th ed 1991). Outra classe geral de compostos genotóxicos, cujos membros podem alquilar ou intercalarem-se no DNA inclui os antibióticos de fontes sintéticas ou naturais. São de especial interesse os antibióticos antineoplásicos, que incluem, porém não se restringem às seguintes classes de compostos representados por: amsacrina; actinomicina A, C, D (alternativamente conhecida como dactinomicina) ou F (alternativamente KS4); azaserina; bleomicina;carminomicina (carubicina); daunomicina (daunorubicina) ou 14-hidroxidaunomicina (adriamicina ou doxorubicina); mitomicina A, B ou C; mitoxantrona; plicamicina (mitramicina); e similares. Outra classe geral de agentes genotóxicos que são comumente utilizados e que alquilam o DNA, são os que incluem as haloetilnitrosouréias, especialmente as cloroetilnitrosouréias. Membros representativos desta ampla classe incluem carmustina, clorozotocina, fotemustina, Iomustinaf nimustina, ranimustina e estreptozotocina. Os primeiros agentes de haloetilnitrosouréia podem ser análogos ou derivados de qualquer um dos compostos representativos anteriormente citados.

Tumores atualmente manejáveis com compostos de coordenação de platina, tais como cisplatina ou oxaliplatina incluem carcinomas testiculares, endometriais, cervicais, gástricos, de células escamosas, adrenocorticais e pulmonares de pequenas células, juntamente com os meduloblastomas e neuroblastomas. Outros agentes terapêuticos citotóxicos anti-câncer incluem, por exemplo, BEP (bleomicina, etoposídeo, cisplatina) para tratamento de câncer testicular, MVAC (metotrexato, vinblastina, doxorubicina, cisplatina) para câncer de bexiga, MVP (mitomicina C, vinblastina, cisplatina) para câncer pulmonar não de pequenas células. Outra classe geral de agentes genotóxicos, cujos membros alquilam o DNA, inclui as mostardas de enxofre e nitrogênio. Esses compostos danificam o DNA principalmente pela formação de adutos covalentes no átomo N7 de guanina. Membros representativos desta ampla classe incluem clorambucil, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan, mecloroetamina, novembicina, trofosfamida e similares. Oligonucleotídeos ou seus análogos que interagem covalentemente ou não-covalentemente com seqüências específicas no genoma de células selecionadas podem também ser usados como agentes genotóxicos, caso se deseje selecionar um ou mais alvos genômicos predefinidoscomo locus de uma lesão genômica.

Outra classe de agentes, cujos membros alquilam o DNA, incluem as etileniminas e metilmelaminas. Essas classes incluemaltretamina (hexametiImelamina), trietilenofosforamida (TEPA), trietilenotiofosforamida (TioTEPA) e trietilenomelamina, por exemplo. Classes adicionais de agentes alquilantes de DNA incluem os sulfonatos de alquila, representados por busulfan; azinidinas, representadas por benzodepa; e outros, representados por exemplo por mitoguazona, mitoxantrona e procarbazina. Cada uma dessas classes inclui análogos e derivados dos respectivos compostos representativos. Em uma concretização, agentes quimioterápicos são inibidores de receptor tirosina-cinase tais como EGFR e HER-2-neu e são empregados como inibidores seletivos do crescimento de células proliferativas. Por exemplo, erbstatina, um inibidor de receptor tirosina cinase EGF, reduz o crescimento de células de carcinoma humano expressando EGFR. Também se afirma que diversos derivados de estireno possuem propriedades inibidoras de tirosina cinase e encontram utilidade como agentes antitumorais. Dois desses derivados de estireno são os inibidores RTK classe I cuja eficácia foi demonstrada por atenuar o crescimento de carcinoma humano de células escamosas quando injetados em camundongos desnudos. Certos derivados de 4-anilinoquinazolina são úteis como inibidores de receptor tirosina cinase. As relações estrutura-atividade mostradas por esses compostos indicam um modo de ligação claramente definido, onde o anel de quinazolina liga-se na bolsa de adenina e o anel anilino liga-se na bolsa lipofílica específica Três análogos de 4-anilinoquinazolina (dois inibidores reversíveis e um irreversível) foram avaliados clinicamente como fármacos anticâncer. Adicionalmente, o anticorpo monoclonal trastazumab (Herceptin™) para o tratamento de cânceres de mama metastáticos superexpressando HER2-neu. Scheurle, et al., Anticâncer Res 20:2091-1096, 2000.Um "vetor de expressão" é qualquer elemento genético, como por exemplo, um plasmídeo, cromossomo, vírus, comportando-se como uma unidade autônoma de replicação de polinucleotídeo dentro de uma célula (ou seja, capaz de replicação sob seu próprio controle) ou tornado capaz de replicação mediante inserção num cromossomo de célula hospedeira, tendo a ele ligado outro segmento de polinucleotídeo, de forma a realizar a replicação e/ou expressão do segmento ligado. Vetores apropriados incluem, porém não se restringem a vírus, plasmídeos e cosmídeos.

Vetores de expressão contém um "cassete de expressão" que inclui uma seqüência de polinucleotídeo a ser transcrita operavelmente ligada às seqüências de polinucleotídeo necessárias para efetuar a ligação ou inserção do vetor numa célula hospedeira desejada e para efetuar a transcrição do polinucleotídeo a ser expressado. Tais seqüências incluem seqüências promotoras para efetuar a transcrição, seqüências intensificadoras para aumentar a transcrição, seqüências de sítio de ligação ribossômico, e seqüências de terminação de transcrição e translação. Alternativamente, os vetores de expressão podem ser capazes de expressar diretamente os produtos da seqüência de ácido nucleico ali codificados sem ligação ou integração do vetor nas seqüências de DNA de célula

hospedeira.

O termo "operavelmente ligado" refere-se à ligação de um segmento de DNA a outro segmento de DNA de forma a permitir que os segmentos funcionem nas formas pretendidas. Uma seqüência de DNA codificando um produto gênico é operavelmente ligada à seqüência reguladora quando está ligada à seqüência reguladora, tal como por exemplo promotores, intensificadores, e/ou silenciadores, de forma a permitir a modulação de transcrição daseqüência de DNA, seja direta ou indiretamente. Porexemplo, uma seqüência de DNA é operavelmente ligada a um promotor quando está ligada ao promotor a jusante emrelação ao sítio de iniciação de transcrição do promotor, na região de leitura correta em relação ao sítio de iniciação de transcrição e permite o alongamento da transcrição para proceder através da seqüência de DNA. Um intensificador ou silenciador é operavelmente ligado à seqüência de DNA codificando um produto gênico quando está ligado à seqüência reguladora de forma a aumentar ou reduzir, respectivamente, a transcrição da seqüência de DNA. Intensificadores ou silenciadores podem estar localizados a montante, a jusante ou embutidos nas regiões codificadoras da seqüência de DNA. Um DNA para uma seqüência sinal é operavelmente ligado ao DNA codificando um polipeptídeo se a seqüência sinal for expressada como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo. A ligação de seqüências de DNA a seqüências reguladoras é tipicamente realizada através de ligação em sítios de restrição apropriados ou através de adaptadores ou ligantes inseridos na seqüência utilizando endonucleases de restrição conhecidas no estado da técnica.

"Molécula pequena" conforme aqui utilizado, refere-se a compostos sintéticos de peso molecular, criados para interagir com uma proteína específica conhecida por estar envolvida numa dada condição patológica. Bancos de taiscompostos podem ser prontamente sintetizados através dequímica combinatorial, por exemplo, e identificados quanto à atividade de agonista/antagonista de TNFR25 utilizando técnicas convencionais.

Os termos "TNFR-SF5", "TNFR25" ou "DR3" são todos utilizados na presente invenção, de forma alternativa, para um membro da família de receptor TNF cuja função biológica completa não era anteriormente conhecida. Vide patente americana No. 6.713.061 e Borysenko, et al. Biochem. Biophys Res Commun.2005, Mar 18; 328 (3) ;794-9;Sheikh et al. , Curr.Câncer Drug Targets.2 004 Feb;4(1):97-104, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Porém, os inventores fizeram diversasdescobertas importantes. A seqüência cDNA codificando TNFR2 5 de camundongos é mostrada na SEQ ID NO: 1. 0 cDNA codificando TNFR25 humano é mostrado na SEQ ID NO:2. Ao contrário de qualquer outro membro da família TNF-R, a expressão de DR3 demonstrou ser controlada por anelamento alternativo de mRNA. As células T em repouso expressaram pouca ou nenhuma proteína de DR3, mas continham altos níveis de mRNA de DR3 aleatoriamente anelado. Mediante ativação da célula T através do receptor de célula T, a proteína cinase C (PKC) é ativada. A ativação de PKC, por sua vez, media a ligação correta de DR3 de extensão completa e a expressão superficial da proteína. Essa regulação específica de expressão de DR3 permite a rápida expressão de proteína de DR3 nas células Tea regulação ambiental de expressão de DR3 por influência dos níveis PKC responsáveis pela ligação e expressão de DR3. 0 DR3 está também envolvido na co-estimulação de polarização de célula T e na estimulação da produção de IL-13 e IL-IO em células polarizadas para Th2. Essa é uma importante observação, pois, entre outras coisas, a produção de IL-IO desempenha um papel crítico na supressão de doença intestinal inflamatória. A expressão transgênica de TNFR25 em células T media a polarização para Th2 de citocina e a produção de anticorpos mediante ativação de célula T e exposição ao antígeno. Além disso, o TNFR25 transgênico inibe parcialmente a proliferação de células CD4 e CD8 ativada por TCR e reduz o número total de células T em órgãos linfóides sem induzir a apoptose. As células CD8 foram mais afetadas pelo TNFR25 do que as células CD4. Como tal, os sinais de TNFR25 são importantes nas respostas do efetor a patógenos ao delinear a polarização subseqüente para TH2 ou para uma resposta mista de TH1/TH2. Os camundongos transgênicos TNFR2 5 são altamente suscetíveis â inflamação das vias aéreas induzidas por antígeno num modelo de asma em camundongos e produziram quantidades aumentadas de IL-13 e eosinófilos no pulmãoquando da exposição ao antígeno por inalação. Os camundongos transgênicos expressando uma forma negativa dominante de TNFR2 mostraram resistência aumentada à hiperreatividade das vias áereas quando comparados com 5 camundongos do tipo selvagem.

" TLlA" é aqui designado como um fator do tipo TNF que atua como um coestimulador de secreção IFN-gama através da ligação ao receptor contendo o domínio de morte, DR3. Também se supõe que o TL1A, tal como o TNF, circule como uma forma homotrimérica solúvel. Como tal "TLlA solúvel", conforme aqui utilizado, refere-se a TLlA homotrimérico. O termo não se restringe a qualquer forma específica de espécies. Porém, a seqüência de cDNA para o monômero de TLlA humano é provida como SEQ ID NO:7, e a do camundongo como SEQ ID NO:3.

Foi sugerido que o TLlA desempenha um papel na doença intestinal inflamatória (IBD) funcionando como uma citocina polarizadora para Thl. Demonstrou-se que a quantidade de proteína de TLlA e o número de células TLIA-positivas correlacionam-se com a severidade da inflamação, de forma mais significativa na Doença de Chrohn (CD). Também foi demonstrado que a adição de TLlA humano recombinante a culturas de células mononucleares de lâmina própria estimuladas com PHA de pacientes com doença de Crohn aumentaram significativamente a produção de IFN-gama em 4 vezes, enquanto um efeito mínimo foi observado nos pacientes de controle. Adicionalmente, um anticorpo bloqueador anti-TLlA foi capaz de melhorar a asma em camundongos tipo selvagem, indicando que o TNFR25 e TLlA estão envolvidos na patogênese da asma.

Os receptores do corpo humano funcionam ao serem estimulados ou inibidos por agonistas naturais (tais como hormônios, citocinas e neurotransmissores) ou sintéticos (tais como fármacos, como por exemplo, anticorpos ou pequenas moléculas).

O agonista TNFR25 é aqui designado como uma substância que se liga ao receptor TNFR2 5 e que induz uma respostana célula na qual o receptor TNFR2 5 é expressado de forma similar à resposta que seria observada expondo-se a célula a um ligante TNFR25 natural, como por exemplo, TLlA. Um agonista é o oposto de um antagonista, pois embora um antagonista possa também ligar-se ao receptor, ele não ativa o receptor, bloqueando-o completa ou parcialmente da ativação por agonistas endógenos ou exógenos. Um agonista parcial ativa um receptor, porém não causa uma alteração fisiológica como o faz um agonista completo.

TLlA solúvel pode ser administrado na forma terapêutica a um paciente para aumentar a ativação do receptor TNFR25 numa dada população celular como um agonista de TNFR25. Alternativamente, outro exemplo de um agonista de TNFR25 é um anticorpo capaz de ligar-se a e ativar TNFR25. Por exemplo, o anticorpo monoclonal 4C12 liga-se a e ativa a sinalização de TNFR25. Em outra concretização e no contexto da presente invenção, um agonista de TNFR25 pode ser derivado de um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ectopicamente ativar a expressão transgênica de um anticorpo de agonista de TNFR25 e/ou proteína de TLlA num local selecionado ou num momento selecionado. Em outra concretização ainda, um agonista de TNFR2 5 que leva a um aumento na sinalização de TNFR25 num tecido é provido por um vetor de expressão com um cassetede expressão capaz de ativar a expressão transgênica do próprio TNFR25. Isso seria útil numa situação em que se deseja sinalização aumentada de TNFR25 num tecido no qual exista um excesso de agonista(s) de TNFR25 exógenos ouendógenos em relação ao receptor.

"Antagonista de TNFR2 5" é aqui designado como uma substância que inibe a função fisiológica normal de um receptor TNFR25. Tais agentes funcionam interferindo na ligação de agonistas/ligantes de receptor endógenos tais como TL1A, com o receptor TNFR25. Um exemplo de antagonista TNFR25 é um receptor TNFR25 negativo dominante. Preferivelmente, o antagonista de TNFR2 5 aquiutilizado é um anticorpo específico para TLlA que interfere com a capacidade de TLlA ativar o receptor TNFR25. 0 mais preferivelmente, esse anticorpo é o anticorpo monoclonal L4G6. Em outra concretização, o antagonista de TNFR2 5 é uma proteína de fusão da porção extracelular de TNFR2 5 ou uma forma de ligação alternativa de TNFR2 5 com a porção Fc de imunoglobulina ou de qualquer outro par de fusão apropriado. Em outra concretização, o antagonista de TNFR25 é uma forma solúvel de TNFR25 preparada através do truncamento acima do domínio de ligação transmembrânico, seja como uma forma de ligação alternativa ou como um construto artificial. Em outra concretização, o antagonista de TNFR25 é um anticorpo que liga-se especificamente a TNFR25 e que interfere com sua ligação ao seu ligante(s) natural(ais). Em outra concretização, o antagonista de TNFR2 5 pode ser um vetor de expressão com uma cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um mRNA, RNai não-orientados ou ribozima que é capaz de nocautear a transcrição e/ou translação de TNFR25 e/ou TLlA mRNA endógeno num dado local ou num dado momento. Em outra concretização ainda, pode-se reduzir a sinalização de TNFR2 5 num tecido provendo-se um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressãotransgênica de um TNFR25 dominante negativo.

Os antagonistas ou agonistas de TNFR2 5 podem estar na forma de aptâmeros. "Aptâmeros" são moléculas de DNA ou RNA que foram selecionadas de grupos aleatórios baseados em sua capacidade de ligar-se a outras moléculas. Numa concretização, os aptâmeros ligam-se especificamente a TNFR25 para bloquear a ligação de seu ligante natural, como por exemplo, TL1A, ou que ligam-se ao próprio TLlA e o impede de ligar-se a TNFR25. Em outra concretização, os aptâmeros ligam-se especificamente ao receptor TNFR25, ativando-o.

"Negativo dominante" ou "DN" conforme aqui utilizado, refere-se a uma variante estrutural de TNFR25exogenamente provida que atua para bloquear TNFR25 endógeno. Por exemplo, um excesso molar de um DN competirá com o TNFR2 5 endógeno para ligação do ligante de TNFR2 5, como por exemplo, TLlA. Preferivelmente, o DN é igual ao TNFR2 5 do tipo padrão, exceto que nele está ausente o domínio intracelular. Alternativamente, o DN é igual ao TNFR2 5 do tipo padrão, exceto que nele estão ausentes os domínios transmembrânico e intracelular. A seqüência de codificação para o DN TNFR2 5 de camundongo é provida na SEQ ID NO:4. A seqüência de codificação para o DN TNFR2 5 humano é provida na SEQ ID NO:5. A seqüência de codificação para o DN TNFR2 5 humano contendo apenas o domínio extracelular é provida na SEQ ID NO: 6. A invenção também envolve as seqüências de codificação que são substancialmente idênticas às SEQ ID NOs: 3-7. O habilitado na técnica apreciará que as seqüências de oligonucleotídeo substancialmente idênticas às SEQ ID NOs: 3-7 podem diferir das SEQ ID NOs: 3-7, respectivamente, com respeito à identidade de pelo menos uma base de nucleotídeo. Porém, todos as seqüências de oligonucleotídeos substancialmente idênticas às SEQ ID NOs: 3-7 hibridizarão sob condições estringentes (conforme aqui definido) com todos ou com uma porção dos complementos de SEQ ID NOs: 3-6 (i.e. seqüências-alvo), respectivamente. Os termos "hibridizar especificamente" ou "especificamente hibridizar" refere-se à hibridização complementar entre um oligonucleotídeo (ex: um preparador ("primer") ou sonda marcada) e uma seqüência alvo. O termo abrange especificamente pareamentos incompatíveis secundários que podem ser acomodados reduzindo-se aestringência dos meios de hibridização para obter a preparação ("priming") desejada para as PCR polimerases ou detecção de sinal de hibridização.

Sob condições estringentes de hibridização, somente as seqüências de aminoácido altamente complementares, ou seja,substancialmente idênticas, hibridizam.

Preferivelmente, tais condições impedem a hibridização deácidos nucleicos tendo 3 ou mais pareamentos incompatíveis ("mismatches") de 20 nucleotídeos contíguos, mais preferivelmente, 2 ou mais pareamentos incompatíveis de 2 0 nucleotídeos contíguos, o mais preferivelmente um ou mais pareamentos incompatíveis de 20 nucleotídeos contíguos. A porção hibridizante do ácido nucleico hibridizador é de cereca de pelo menos 90%, pref erivelmente cerca de pelo menos 95%, ou o mais preferivelmente cerca de pelo menos 98% idêntica à seqüência de uma seqüência alvo, ou seu complemento.

A hibridização de um ácido nucleico com uma amostra de ácido nucleico sob condições estringentes é definida abaixo. 0 dúplex ou a estabilidade híbrida de ácido nucleico é expressado(a) como uma temperatura de fusão (Tm) que é a temperatura na qual a sonda se dissocia do DNA alvo. Essa temperatura de fusão é usada para definir as condições de estringência necessárias. Se as seqüências a serem identificadas forem substancialmente idênticas à sonda, em vez de idênticas, será útil entãoprimeiramente estabelecer a temperatura mais baixa naqual apenas a hibridização homóloga ocorre com uma concentração específica de sal (ex: SSC ou SSPE). Então, supondo que 1% de pareamento incompatível resulte numa redução de Io C na Tm, a temperatura de lavagem final na reação de hibridização é consequentemente reduzida (por exemplo, caso se procure obter seqüências que possuam > 95% identidade com a sonda, a temperatura de lavagem final é reduzida em 5°C) . Na prática, a alteração da Tm pode ser entre 0,5°C e 1,5°C, por 1% pareamento 30 incompatível.

As condições estringentes envolvem hibridização a 68°C em solução 5xSSC/5x Denhart/1,0% SDS, e lavagem em 0,2xSSC/0,l% SDS à temperatura ambiente. Condições moderamente estringentes incluem lavagem em 3xSSC a 42°C.

Os parâmetros de concentração salina e de temperatura podem ser alterados para se obter nível ótimo de identidade entre o preparador ("primer") e o ácidonucleico alvo. A orientação adicional relacionada com tais condições está disponível no estado da técnica, por exemplo em Sambrook, Fischer and Maniatis, Molecular Cloning, um manual laboratorial, (2a.edição), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) e F.M.Ausubel et al. eds.Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1994).

"Imunossupressores" conforme o termo aqui utilizado, refere-se a fármacos importantes, necessários para o tratamento de doenças inflamatórias e na facilitação de transplantes de órgãos. Por exemplo, a ciclosporina A (CsA) possui atividade imunossupressora considerável. Ela revolucionou o transplante de órgãos e é comumente utilizada no tratamento de doenças autoimunes. Para uma revisão recente do uso de CsA e de seus mecanismos de ação, vide Wenger et al; Cyclosporine Chemistry, Structure-activity relationships and Mode of Action, Progress in Clinicai Biochemistry and Medicine, Vol.2, 176 (1986). Porém, a CsA é uma medicação potente que pode apresentar efeitos colaterais severos, tais como insuficiência renal, supressão de medula óssea, e infertilidade.

Os corticosteróides são também utilizados em condições inflamatórias por seus efeitos antiinflamatórios. Possuemum rápido início de ação, e afetam profundamente muitaspartes do sistema imune, bem como a maioria de outros sistemas corporais. Os corticosteróides são fundamentais no tratamento da maioria dos tipos de vasculite e freqüentemente usados em combinação com outrosmedicamentos imunossupressores. Porém, o uso a longoprazo de corticosteróide pode também apresentar diversos efeitos colaterais incluindo hipertensão, ganho de peso, acne e inchaço no rosto. Outros imunossupressores incluem a azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida,mercaptopurina, tacrolimus e micofenolato mofetil.

Geralmente, os agonistas e os antagonistas podem ser administrados a um paciente em quaisquer composições quepossam ser deglutidas, injetadas, inaladas ou através de supositórios. Alternativamente, as composições podem ser formuladas na forma de colírios ou soluções otológicas. 0 termo "asma" conforme aqui utilizado, inclui qualquer condição asmática causada por ataques recorrentes de dispnéia paroxismal (ou seja, doença obstrutiva reversível das vias aéreas) com chiado devido à contração espasmódica dos brônquios (denominado broncoespasmo). As condições asmáticas que podem ser tratadas ou até mesmo prevenidas de acordo com a presente invenção incluem asma alérgica e alergia brônquica caracterizada por manifestações em pessoas sensíveis provocadas por uma variedade de fatores, inclusive exercício, especialmente exercício vigoroso ("broncoespasmo induzido por exercício"), partículas irritantes (pólen, pó, algodão, pelo de gato) bem como asma de discreta a moderada, asma crônica, asma crônica severa, asma severa e instável, asma noturna, e estresse psicológico. Os métodos da presente invenção podem ser especialmente úteis na prevenção de manifestação de asma em mamíferos, como por exemplo, humanos acometidos de doença obstrutiva reversível das vias aéreas inferiores e pulmões, bem como o broncoespasmo induzido por exercícios. Nos métodos aqui descritos para tratar asma, o método preferido para liberar os antagonistas da invenção é através deinalação.

Existem vários tipos diferentes de dispositivos que utilizam mecanismos e metodologias geralmente diferentes para produzir aerossóis para inalação. 0 dispositivo mais comumente utilizado é um inalador dosimetrado (MD I que compreende um recipiente de formulação farmacológica, com a formulação incluindo um propelente com baixo ponto de ebulição. A formulação é mantida no recipiente sob pressão e uma dose medida de formulação é liberada na forma de aerossol quando a válvula do recipiente é aberta. 0 propelente com baixo ponto de ebulição evapora rapidamente ou "salpica" quando a formulação é exposta àpressão atmosférica fora do recipiente. As partículas da formulação contendo o fármaco sem o propelente são inaladas pelos pulmões do paciente e em seguida migram para o sistema circulatório do mesmo. Há diversos tipos diferentes de dispositivos MDI. Os dispositivos deste tipo são descritos na patente americana No. 5.404.871 emitida em 11 de abril de 1995 e na patente americana No. 5.364.838 emitida em de novembro de 1994. Outro tipo de dispositivo é o dispositivo inalador de pó 10 seco (DPI). Conforme o nome indica, tais dispositivos utilizam formulações de pó seco em que o pó é soprado numa nuvem aerosolizada através de dispersão de gás. Os dispositivos DPI típicos são mostrados na patente americana No.5.775.320 emitida em 07 de julho de 1998 e patente americana No. 5.740.794 emitida em 21 de abril de 1998 .

Outro tipo de dispositivo de liberação em aerossol força a formulação através de uma membrana porosa. A formulação que se movimenta através dos poros, rompe-se formando pequenas partículas que são inaladas pelo paciente.

Dispositivos desse tipo são mostrados na patente americana No. 5.554.646 emitida em 13 de agosto de 1996 e patente americana No. 5.522.385 emitida em 04 de junho de 1996.

Com respeito às composições inaláveis, os materiais portadores apropriados podem estar na forma de um pó amorfo, um pó cristalino ou uma combinação de pós amorfos e cristalinos. Materiais apropriados incluem carboidratos, como por exemplo, os monossacarídeos, tais como frutose, galactose, glicose, D-manose, sorbose esimilares; dissacarídeos, tais como lactose, trehalose, celobiose, e similares; ciclodextrinas, tais como 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina; e polissacarídeos tais como rafinose, maltodextrinas, dextranos e similares; (b) aminoácidos, tais como glicina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, lisina, e similares; (c) sais orgânicos preparados de ácidos ebases orgânicas, tais como citrato de sódio, ascorbato de sódio, gluconato de magnésio, gluconato de sódio; cloridrato de trometamina, e similares; (d) peptídeos e proteínas, tais como aspartame, albumina de soro humano, gelatina, e similares; (e) alditóis, tais como manitol, xilitol e similares. Um grupo preferido de portadores incluem lactose, trehalose, rafinose, maltodextrinas, glicina, citrato de sódio, cloridrato de trometamina, albumina de soro humano e manitol. Tais materiais portadores podem ser combinados com os agonistas e antagonistas da invenção, antes da secagem por pulverização, ou seja, adicionando-se o material portador â solução tampão preparada para secagem por pulverização. Assim, o material portador será formado simultaneamente com e como parte das partículas de agonista e antagonista da invenção. Tipicamente, quando o portador é formado através de secagem por pulverização com os agonistas ou antagonistas da invenção, os agonistas ou antagonistas da invenção estarão presentes em cada partícula individual a uma porcentagem em peso na faixa de 5% a 95%, preferivelmente de 20% a 80%. 0 restante da partícula será principalmente material portador (tipicamente de 5% a 95%, geralmente de 20% a 80% em peso) mas também incluirá tampão(ões), podendoincluir outros componentes conforme acima descrito. Apresença de material portador nas partículas que são liberadas para a região alveolar do pulmão (ou seja, aquelas que estão na faixa de tamanho exigida abaixo de 10 μm) demonstrou não interferir de forma significativacom a absorção sistêmica de agonistas ou antagonistas da invenção.

Alternativamente, os portadores podem ser preparados separadamente na forma de um pó seco e combinados com os agonistas ou antagonistas em pó seco da invenção através de mistura. Os portadores em pó preparados separadamente geralmente são cristalinos (para evitar absorção de água) podendo, em alguns casos, ser amorfos ou misturas decristalino e amorfo. 0 tamanho das partículas do portador pode ser selecionado para melhorar a escoabilidade do pó dos agonistas ou antagonistas, tipicamente na faixa de 25 μm a 100 μm. As partículas de portador nesta faixa de tamanho geralmente não penetrarão na região alveolar do pulmão, e com freqüência se separarão dos agonistas ou antagonistas da invenção no dispositivo de liberação antes da inalação. Assim, as partículas que penetram na região alveolar do pulmão consistirão essencialmente de agonistas ou antagonistas da invenção e de tampão. Um material portador preferido é o manitol cristalino com um tamanho na faixa acima citada.

As composições em pó seco da presente invenção são preferivelmente aerosolizadas através de dispersão numa corrente de ar circulante ou outra corrente de gás fisiologicamente aceitável de forma convencional. Um sistema apropriado para tal dispersão é descrito no pedido copendente No.série 07/910.048, publicado como WO 93/00951, cujas descrições completas são aqui incorporadas por referência.

Soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando-se as composições e formulações da invenção na quantidade requerida no solvente apropriado, tal como solução salina tamponada com fosfato sódico, seguido de esterilização em filtro. Conforme aqui utilizado, o termo "portador fisiologicamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, agentes antibacterianos e antifúngicos que sejam atóxicos para seres humanos, e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bastante conhecido no estado da técnica. Os meios ou agente devem ser compatíveis com a manutenção de conformação apropriada das cadeias de proteína da invenção, e seu uso nas composições terapêuticas. Ingredientes ativos complementares podem também ser incorporados às composições. Uma descrição de portadores e diluentes farmaceuticamente aceitáveis representativos, bem como de formulações farmacêuticas,pode ser encontrada em Remingyon's Pharmaceutical Sciences, um texto padrão nesse campo e em USP/NF. A dosagem e modo de administração das composições reivindicadas devem ser ajustados de acordo com a identidade, formulação, via de administração e outras características relevantes pertinentes ou prontamente discerníveis no estado da técnica.

2. Agonistas de TNFR25 como Potenciadores Diretos de Polarização de Célula T e Inflamação Pulmonar 1TNFR25 e seu ligante TLlA foram descobertos como potenciadores diretos de polarização de célula T e inflamação pulmonar. 0 importante papel de TLlA e TNFR25 na doença pulmonar é reforçado pela inflamação pulmonar exagerada observada em camundongos transgênicos-TNFR25 agonista. A superexpressão de TNFR25 resulta numa forte polarização para Th2 de células CD4 mediante ativação. A polarização, por sua vez, é provavelmente responsável pela inflamação pulmonar aumentada no modelo de ovalbumina.

Os inventores observaram que num modelo murino de asma, obloqueio da sinalização de TNFR25 resulta em produção reduzida de Th2 citocina o que inibe a inflamação pulmonar. 0 TNFR25 sobre as células CD4 ativa a secreção de IL-13 tanto nas células polarizadas para Thl como para Th2, sendo necessários os sinais de TNFR25 nas células NKT que iniciam e promovem a inflamação pulmonar. A produção crônica de IL-13, ativada por TNFR25, também é responsável pelas seqüelas da inflamação pulmonar crônica, inclusive, porém não restrito a asma crônica,remodelamento de vias aéreas e fibrose. 0 bloqueio dasinalização de TNFR25 nas células NKT através de um mutante de TNFR25 negativo dominante em experimentos de transferência adotiva debela a inflamação pulmonar. O bloqueio de sinais TNFR25 tal como este seria útil no tratamento de asma aguda e crônica e outros distúrbios pulmonares.

Na cadeia de eventos que levam à inflamação pulmonar, aprodução de IL-13 por células NKT é uma etapa inicial (Akbari, O.et al, Nat Med 9, 582-8(2003)). 0 papel crítico das células NKT na asma é reforçado pelo presente estudo, já que os experimentos de transferência adotiva indicaram que uma das principais chaves moleculares utilizadas pelas células NKT para induzir inflamação pulmonar é o TNFR25. O TNFR25 possui a capacidade adicional para modular respostas efetoras incipientes através de células de memória CD4 antígeno-específicas através de ligação de TNFR2 5 mediada por PKC em células ativadas por TCR. 0 TNFR2 5 atua, desta forma, na fase bem precoce de iniciação da resposta de memória no pulmão. Portanto, o bloqueio de sinalização de TNFR25 por anti-TLlA ou por outros procedimentos interrompe a cascata de eventos que levam à inflamação aguda do pulmão, supostamente responsável pelos ataques de asma. O bloqueio de TNFR2 5 foi obtido em camundongos do tipo selvagem geneticamente, bem como através de bloqueio de anticorpo com os dois métodos independentes, dando resultados similares. A interferência com sinais TNFR25 in vivo resultou na produção reduzida de IL-13, IL-5 e IL-4 através de nódulos linfáticos brônquicos drenantes reestimulados com antígeno e na supressão da inflamação pulmonar. Essencialmente, o bloqueio do anticorpo anti-TLlA durante a fase de desafio por antígeno de vias aéreas de camundongos preparados e polarizados para Th2 mostrou-se eficaz ao inibir a inflamação pulmonar, indicando o papel direto de TNFR2 5 na fase efetora no pulmão.

3. Expressão Constitutiva de TNFR25 em Células NKT e expressão induzível em células T ativadasPara estudar as funções biológicas de TNFR2 5 e de seu ligante cognato TL1A, anticorpos monoclonais anti-camundongo de hamster foram gerados através de protocolos padrão. Para detectar de forma confiável o baixo nível de expressão de TNFR2 5 através de citometria de fluxo em células primárias, foi necessário desenvolver um ensaiosanduíche de tripla camada. Sem ativação TNFR25 foi detectado a baixos níveis em células T CD4 virgens e a níveis ainda mais baixos também em células T CD8, porém não em células B (Fig.la) . Além disso, uma subpopulação de células CDllc+ expressaram TNFR25. As células NKT expressaram constitutivamente níveis relativamente altos de TNFR2 5, ao passo que apenas uma pequena fração de células NKll+ CD3 negativas mostraram expressão de TNFR25 (Fig. Ia) . No timo, células CD4 e CD8 simples positivas expressaram TNFR25 de forma similar à das células T periféricas. Timócitos CD4, CD8 duplos positivos e duplos negativos não expressaram TNFR2 5 (Fig.Ic). Quando da ativação de células T periféricas com anti-CD3 e anti-CD2 8, a expressão de TNFR25 foi regulada para cima tanto nas células CD4+ como nas células CD8+ (Fig. lb). A ativação de LPS de células B, por outro lado, não resultou na expressão de TNFR25. mRNA TNFR25 murino é constitutivamente expressado em células T, mas aleatoriamente ligado de forma similar ao TNFR25 humano (Screaton, G.R. et al.Proc Natl. Acad Sci USA 94, 4615-9. (1997)) (Fig. 2). A expressão protéica aumentada de TNFR25 nas células T ativadas estava associada com a ligação induzida por ativação de TNFR25 de extensão completa de mRNA TNFR25 aleatoriamente ligado. A ligação induzida por ativação de TNFR25 em células T foi bloqueada pelo inibidor químico H7, indicando um papel para PKC na ligação (Fig. 2) .

A expressão preferencial de TNFR2 5 nas células NKT e T ativadas e sua ligação induzida por ativação de TNFR25 de extensão completa e o rápido aumento na expressão de superfície levantou a questão da função biológica de TNFR25 no sistema imune. A ablação do gene de TNFR25 em camundongos não revelou um fenótipo definitivo para a deficiência de TNFR25, exceto por um discreto defeito na seleção negativa no timo. Assim, foram analisados os efeitos biológicos de transgenes-TNFR2 5 expressados em célula T ativados pelo promotor e intensificador de CD2.O TNFR2 5 de extensão completa (FL TNFR2 5, na Fig. 2) e um produto de ligação alternativa de TNFR25 desprovido dos éxons 5 e 6 (Δ5,6 TNFR25, Fig. 2) foram utilizados na expressão transgênica. Δ5,6 TNFR25 é desprovido na parte codificadora dos éxons 5 e 6 do quarto domínio extracelular rico em cisteína. Porém, ele está ancorado na membrana e possui um domínio de sinalização intracelular completo como o FL TNFR25 e liga-se a TLlA e a um anticorpo anti-TNFR2 5 agonista (4C12). Além disso, um mutante negativo dominante, DN TNFR2 5, truncado imediatamente após o domínio transmembrânico, foi expressado como transgene e será descrito abaixo. 4. Superexpressão Transgênica de TNFR2 5 promove a polarização para Th2 de células CD4 e media a inflamação pulmonar aumentada no modelo de ovalbumina de AHR.

Quatro fundadores independentes para cada transgene de TNFR2 5 foram obtidos e analisados. 0 promotor e intensificador de CD2 suportou a expressão transgênica independente de posição em todos os fundadores Δ5,6 TNFR2 5, FL TNFR25 e DN TNFR2 5, revelando expressão de alto nível nas células T, NKT e NK em repouso e numa subpopulação de células CDllc+. As células B não expressaram o transgene (Fig.3a). A autenticidade de detecção de anticorpo através de citometria de fluxo foi verificada por Western Blot de células tumorais transfectadas (Fig. 3b) e bandas de Western blot idênticas foram detectadas em esplenócitos transgênicos, ao passo que a molécula endógena estava abaixo do nível de detecção através de Western blot. A forma de ligação-Δ5,6 não foi detectada pelo anticorpo IODl em Westernblots (Fig. 3b) indicando sua ligação ao éxon 4 ou 5. A superexpressão transgênica de FL TNFR2 5 estava associada a números reduzidos de células T em órgãos linfóides primários e secundários em comparação com ninhadas não transgênicas (Fig. 3c); o efeito do transgene Δ5,6 sobre a celularidade foi modesto no timo e não significativo nos órgãos linfóides secundários. 0 número reduzido decélulas T em camundongos transgênicos foi acompanhado de proliferação reduzida em resposta ao estímulo com anti-CD3 e CD2 8 ao se comparar números iguais de células CD4 e CD8 de ninhada transgênica purificada com não-transgênica (Fig. 3d). A proliferação reduzida foi observada em todos os pontos de tempo de 24 a 72 horas. Porém, o estímulo de células CD4 ou CD8 TNFR25-tg com forboléster PMA e ionomicina Ca-ionófora restabeleceu a proliferação normal, indicando que as células transgênicas não tinham um defeito intrínseco em sua capacidade de proliferar. As células T TNFR2 5-tg ativadas por CD3/CD28 regularam para cima o CD2 5 normalmente, mas produziram apenas cerca de metade da quantidade de IL-2 (Fig. 4) em comparação com controles de ninhada. A adição exógena de IL-2 excedente 1 não restabeleceu a proliferação (Fig. 3d) . As células T TNFR25 -tg não sofreram apoptose aumentada quando medidas através de coloração com anexina V (Fig. 4) indicando que o déficit proliferativo não se deve aos sinais TNFR25 para morte celular. Células EL4 transf ectadas com FL e Δ5,6 TNFR25 foram usadas para comparar as propriedades de sinalização das variantes de ligação ativadas com TLlA solúvel, TLlA ligado â membrana (EL4-TL1A) ou um anticorpo anti-TNFR25 agonista (4C12). Todos os três ligantes induziram 25 rapidamente a ativação de NF-kB no prazo de minutos, conforme detectado por EMSA (Fig. 3e).

Após ativação primária com anti-CD3 ligado à placa e anti-CD2 8 FL solúvel e Δ5,6 TNFR2 5, as células transgênicas produziram quantidades significativamente 30 aumentadas de citocinas Th2, incluindo IL-4, 11-5, IL-13 e 11-10, quando comparadas com ninhadas não-transgênicas (Fig. 3f) . 0 IFN-γ foi reduzido quando as células CD4 FL TNFR25-tg foram ativadas, mas não com transgenes Δ5,6 TNFR25, indicando uma diferença sutil na função de 35 variantes de ligação. Embora a proliferação de células CD4 TNFR-transgênicas tenha diminuído, a produção aumentada de Th2 citocina foi detectável já dentro de umperíodo de 24 horas de ativação e continuou a aumentar nos dias seguintes, indicando que existia polarização para Th2 antes da ativação.

Em seguida, determinou-se se a polarização para Th2 de células CD4 TNFR-transgênicas poderia ou não ser anulada sob condições de polarização para Thl. Sob condições neutras de Th as células CD4 TNFR25-tg produziram tanto IL-4 quanto as células CD4 tipo padrão, sob condições de polarização para Th2 (Fig. 3g). A incubação de células FL TNFR25-tg sob condições de polarização para Th2 não teve nenhum efeito adicional sobre a produção de 11-4 ou 11-3, indicando que as células já estavam polarizadas ao máximo para Th2 durante a ativação primária sob condições Th-neutras. Porém, as células CD4 FL TNFR25-tg poderiam ser polarizadas para Thl incluindo-se na cultura anticorpos a IL-4 e adicionando-se IL-12 exógeno. Sob essas condições, as células FL TNFR25-tg produziram IFN-γ em níveis mais elevados do que as células tipo padrão polarizadas para Thll (fig. 3g) indicando que o transgene TNFR25 pode também coestimular as citocinas Thl. As células CD4 FL TNFR-25 polarizadas para Thl, ao contrário das células Thl tipo padrão, também produziram 11-13, mas somente quantidades mínimas de 11-4. A superexpressão transgênica de TNFR25, embora espontaneamente polarizada para Th2,pode contudo co-stimular a produção de citocina tipo Thl ou Th2 sob condições apropriadas de polarização. Além disso, os sinais de TNFR25 coestimulam a produção de IL-13 sob condições de polarização para Thl ou Th2. A polarização espontânea para Th2 de camundongos TNFR2 5- tg in vivo através de imunização e análise de produção de isótipo de anticorpo foi avaliada. Estudos in vivo foram conduzidos com camundongos Δ5,6-TNFR2 5-transgênicos. A5,6-TNFR25 mostra as mesmas propriedades de sinalização de FL TNFR25 em relação à indução de NF-kB (Fig. 3e) e àindução de apoptose, e gera um perfil similar de citocina polarizada para Th2. Porém, ao contrário de camundongos FL-transgênicos, os camundongos Δ5,6-transgênicos possuemcelularidade normal de célula T CD4 nos nódulos linfáticos (Fig. 3c) e no baço e, portanto, podem representar de forma mais precisa a função de TNFR25 para experimentos in vivo.

Camundongos TNFR25-tg imunizados com DNP-KLH geraram relações aumentadas de anticorpo IgGl/lgG2a antígeno-específico em comparação com ninhadas não-transgênicas, indicativas de uma relação aumentada de anticorpo tipo Th2 in vivo (Fig. 5a) . Sem imunização, os níveis de IgGl e IgG2a de camundongos tipo selvagem e transgênicos foram idênticos, comprovando que a ativação é necessária para revelar a polarização para Th2.

A polarização para Th2 de células CD4 TNFR-2 5-tg e sua produção aumentada de IL-13 sugeriram que a 15 superexpressão de TNFR25 pode predispor à inflamação pulmonar alérgica aumentada, característica da asma, já que IL-13 é a citocina característica dessa condição (Elias, J.A. et al. Am J Respir Cell Mol Biol 28, 401-4 (2003). Essa hipótese foi testada utilizando-se o modelo clássico de ovalbumina para inflamação pulmonarexperimental em camundongos. Camundongos B6 TNFR25-tg e controles do tipo selvagem foram preparados i.p. com ovalbumina e alum no dia 0 e 5. No dia 12 eles foram submetidos a desafio nas vias aéreas com ovalbumina em 25 aerossol e analisados de um a três dias depois. Os camundongos TNFR25-tg tinham números dramaticamente aumentados de eosinófilos no líquido brônquio-alveolar (BALF, Fig.5b), associadoscom níveis de IgE ovalbumina-específicos aumentados no soro (Fig. 5d) e produção elevada de citocina Th2 através de reestímulo comovalbumina de células de nódulos linfáticos brônquicos (Fig. 5e) . A produção de IFN-γ foi reduzida em células de nódulos linfáticos brônquicos transgênicas em comparação com células tipo padrão. A análise histopatológica dos pulmões de camundongos TNFR25-tg mostraram infiltração pulmonar perivascular maciçamente aumentada por eosinófilos, produção aumentada de muco brônquico, ehiperplasia de células calciformes coradas com PAS (Fig. 5c) compatível com exacerbação de inflamação pulmonar por superexpressão de TNFR2 5 nas células T.

5. 0 bloqueio genético ou por anticorpo de TNFR25 durante o desafio de vias aéreas de camundongos preparados bloqueia a inflamação pulmonar

Um mutante negativo dominante de TNFR25, DN TNFR25 foi preparado para bloquear a sinalização de TNFR2 5 durante o desafio das vias aéreas, e o construto expressado como transgene sob o promotor e intensificador de CD2. O transgene DN TNFR2 5 é desprovido de todo domínio de sinalização intracelular, mas é idêntico ao TNFR25 de extensão completa em seu domínio transmembrânico e extracelular.

O DN TNFR2 5 transgênico foi expressado em níveis idênticos como os transgenes TNFR25 agonistas (Fig. 3a) conforme determinado por citometria de fluxo. Utilizando intensidade de fluorescência superficial como medida para o número de moléculas expressadas, determinou-se um excesso molar triplo ou quádruplo de expressão de TNFR2 5transgênico sobre TNFR2 5 endógeno. Esse nível de superexpressão de DN TNFR2 5 silenciou a atividade de TNFR25 endógeno. A ativação anti-CD3 primária tanto de células tipo padrão como de células CD4 DN-transgênicas 25 estimula a secreção tanto de citocina Thl como de citocina Th2 (Figura 4, painel D) . A ativação de TNFR25 com um anticorpo agonista (4C12) durante a ativação de anti-CD3 primária de células tipo padrão coestimula a produção tanto de citocina Thl como de citocina Th2, mas 30 esse efeito coestimulatório de TNFR25 é bloqueado pelo transgene DN TNFR25 (Fig. 6a), indicando que o transgene bloqueia a função do gene endógeno. De forma similar, o efeito agonista de 4C12 coestimula a proliferação de células T4 tipo padrão que foi bloqueada nas células CD4

DN TNFR2 5-tg (Fig. 6b) indicando que o TNFR2 5 endógenofoi silenciado. De forma importante, a expressão de DN TNFR2 5 em células CD4 diminuiu muito a produçãonormalmente observada de citocina Th2 regulada para cima, mediante ativação secundária de células que tinham sido preparadas sob condições tH-neutras (Fig.6c), indicando que os sinais de TNFR2 promovem fortemente ou são necessários para a polarização para Th2 e que esses sinais são bloqueados pelo transgene Dn. Mais importante ainda, as células DN TNFR25-tg não poderiam ser polarizadas para Th2 mesmo sob condições de polarização para Th2, providas pela adição de IL-4 e bloqueio de anticorpos para IFN-γ e IL-12 (Fig. 6d) . A polarização para Thl de células CD4 DNTNFR25-tg, por outro lado, não foi afetada mesmo sob condições não polarizantes (Th-neutras, ThN) . Assim, embora o TNFR25 estimule a produção tanto de citocinas Thl como de citocinas Th2 na ativação primária de células CD4, os sinais de TNFR25 parecem ser necessários para promover a polarização para Th2 in vitro. A polarização para Th2 é independente de TNFR2 5, mas os sinais de TNFR25 nas células Thl promovem a produção de 11-13 (Fig. 3g) . A ausência de sinais de TNFR2 5 em camundongos DN TNFR2 5-tg in vivo não afeta a relação normal de IgGl para IgG2a encontrada em camundongos tipo selvagem após imunização de camundongos DN TNFR25-tg com DNP-KLH (Fig. 4) .

Em seguida, foi determinado se camundongos DN TNFR25-tgtinham uma resposta alterada no modelo de inflamação

pulmonar. Em comparação com camundongos tipo selvagem, camundongos DN TNFR2 5-tg submetidos a desafio de vias aéreasexibiram infiltração eosinofílica significativamente diminuída no BALF, inflamação pulmonarausente e produção reduzida de IgE no soro quando examinados através de histopatologia e coloração com PAS (Fig. 6e-g). A reestimulação de nódulos linfáticos brônquicos drenantes de camundongos DN TNFR2 5 tg submetidos à desafio nas vias áereas com ovalbumina mostrou produção reduzida de' citocina Th2, porém produção normal de IFN-γ (Fig.6h). Os dados sugerem que TNFR25 desempenha um papel crítico nas respostas imunespulmonares.

Para validar os dados genéticos de bloqueio de TNFR25 em camundongos tipo selvagem, foram desenvolvidos os anticorpos monoclonais contra TLlA murino. Utilizando 5 células transfectadas com TNFR25 e TLlA (Fig. 7 a,b) os anticorpos bloqueadores de TLlA que anularam a sinalização de TNFR25 foram identificados. As células transfectadas com TLlA expressam TLlA em sua superfície (Fig. 7c) e secretam TLlA no sobrenadante similar a outros membros da superfamília TNF. Os sobrenadantes contendo TLlA causaram a rápida liberação de ICr de células tumorais transfectadas com FL TNFR25 ou Δ5,6 TNFR2 5 através de apoptose, conforme anteriormente citado (Chinnaiyan, A.M. et al.Science 274, 990-2(1996); Kitson, J.et al. Nature 384, 372-5 (1996); Screaton, G.R.et al.Proc Natl. Acad Sci USA 94, 4615-9 (1997); Bodmer, J.L.et al. Immunity 6, 79-88 (1997); Masters, S.A. et al.Curr. Biol 6, 1669-76 (1996); Tan, K.B.et al.Gene 204, 35-46 (1997)). (Fig. 7d) . Um dos anticorpos anti-TLIA, L4G6, bloqueou completamente a Iise mediada por TLlA de células transfectadas com TNFR25, ao passo que diversos outros anticorpos anti-TLIA não tiveram nenhum efeito ou apenas mediaram a inibição incompleta de Iise (Fig. 7d) . 0 anticorpo L4G6, portanto, foi selecionado para uso no bloqueio in vivo de TLlA para bloquear a sinalização de TNFR25 em camundongos tipo selvagem não modificados geneticamente. Os camundongos foram imunizados duas vezes com ovalbumina em alum conforme usual. Um dia antes do desafio das vias aéreas e nos três dias seguintes 50 μg de L4G6 foram injetados i.p. e então os camundongos foram analisados (Fig. 7e) . Os controles receberam a mesma quantidade e esquema de IgG de hamster. L4G6 administrado desta forma durante e após o período da fase de desafio por aerossol inibiu a exudação de eosinófilos em BALF, bloqueou a excessiva produção de muco e diminuiu a produção de citocina Th2 de células de nódulos linfáticos brônquicos mediante novo desafio com ovalbumina in vitro(Fig. 7e-g).

O bloqueio de inflamação pulmonar através de anti-TLlA durante o desafio por aerossol é prova da expressão de TLlA nas vias aéreas. Descobriu-se que níveis modestos de TLlA são expressados numa subpopulação de células CDllc+ em nódulos linfáticos drenantes brônquicos após desafio de vias aéreas, porém não antes do desafio das vias aéreas (Fig. 7h). Todas as outras populações celulares em nódulos linfáticos brônquicos foram negativas para TLlA antes e após o desafio por aerossol (Fig. 7i). Os nódulos linfáticos inguinais não expressaram TLlA em células CDllc+ ou qualquer outro tipo de célula em nenhum momento antes ou após preparação com ovalbumina ou desafio de vias aéreas. A expressão de TL1A, porém, pode ser induzida in vitro no prazo de 24 horas em células CD4+ e CD8+ esplênicas ou de nódulo linfático através de ativação com anti-CD3 e anti-CD28 (Fig. 7j). As células B proliferativas ativadas com LPS não expressam TLlA (Fig. 7j).

6. Células NKT DN-TNFR25-transgênicas não suportam inflamação pulmonar em camundongos desprovidos de NKT, desafiados por aerossol e preparados com antígeno Foi demonstrado que a transferência adotiva de células NKT tipo padrão para camundongos desprovidos de NKT cura a inflamação pulmonar e a hiperreatividade das vias aéreas no modelo de ovalbumina e que a produção de 11-13 pelas células NKT é necessária (Akbari, O. et al.Nat Med 9, 582-8(2003); Lisbonne, M.et al. J.Immunol 171, 1637-41 (2003); Meyer, E. H. et al. Proc Natl.Acad Sci USA 103, 2782-7 (2006). As células NKT também estão implicadas na fisiopatologia de pacientes asmáticos (Se, Y.et al. J Immunol 175, 4914-26 (2005). Akbari, 0. et al. N Engl.J.Med 354, 1117-29(2006)). Para determinar se o TNFR25, que é constitutivamente expressado nas células 35 NKT (Fig. Ia), está envolvido na indução de inflamação pulmonar, células do tipo padrão transferidas e células NKT DN TNFR-tg foram adotivamente transferidas paracamundongos desprovidos de NKT preparados com ovalbumina (Cui, J. et al.Science 278, 1623-6 (1997)) (Jocl 8 k.o.) (Fig. 8) . Embora as células NKT tipo padrão adotivamente transferidas tenham restabelecido a inflamação pulmonar mediante desafio com antígeno nas vias aéreas, o mesmo número de células NKT DN TNFR2 5-tg não foi capaz disso. Os dados demonstram que os sinais TNFR25 em células NKT são críticos para induzir inflamação pulmonar durante exposição das vias aéreas de camundongos sensibilizados ao antígeno.

7. Agonistas de TNFR25 como Potenciadores Diretos de Respostas Imunes Anti-TumoraisAs células dendríticas maduras executam um processo importante designado "apresentação cruzada" que lhes permite eficazmente preparar células T-citotóxicas que são específicas para peptídeos tumor-específicos. Os antígenos tumorais são degradados e apresentados nas proteínas MHC classe I a células T CD8 circulantes. Para demonstrar que os agonistas de TNFR25 são BRMs (modificadores de resposta biológica)eficazes em vacina antitumorais, camundongos foram injetados com células tumorais EG7 e células OT-I. As células OT-I foram então observadas quanto à expansão clonal. EG7 são células EL4 Iinfoblásticas de linfoma de ascite em camundongo, que foram geneticamente modificadas para expressar ovalbumina, o principal componente protéico da clara de ovo. Os camundongos foram inoculados com células EG7 e receberam uma transferência adotiva de células transgênicas de receptor de célula T ovalbumina- específica (OT-I). As células OT-I atual como células indicadoras in vivo, respondendo ao antígeno de ovalbumina tumor-específico. Teoricamente, as células dendríticas de camundongo apresentam a ovalbumina tumor-específica a e ativa as células T ovalbumina-específicas (OT-I). Porém, sob essas circunstâncias e como é freqüentemente observado nos testes com vacina contra tumor em humanos, as células OT-I reagem com anergia àscélulas tumorais EG7.

Ao contrário, a co-transfecção de células EG7 com um construto que codifica uma versão secretada da proteína de choque térmico gp96 (gp-96-Ig) proveu um tumor secretando gp96I e contendo ovalbumina como antígeno substituto. A exposição das células CD8 OT-I às chaperonas secretadas pelas proteínas de choque térmico em combinação com a ovalbumina tumor-específica resultou numa expansão de OT-I de uma freqüência inicial de 0,5% a mais de 50% de todas as células CD8 após injeção primária e um reforço com secreção de gp96Ig. Portanto, a preparação cruzada de células CD8 através de gp96-Ig-ovalbumina em comparação com a preparação cruzada através de proteína de ovalbumina intacta é aumentada de 10.000 para 1.000.000 vezes. Vide Exemplo 19 e Figuras 10 e 12. Vide também Am J Reprod Immunol. 2002 Oct.; 48(4) :220-5.

Quando as células CD8 OT-I foram submetidas à preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina, na presença do anticorpo 4C12 de agonista TNFR25, a expansão de CD8 OT-I aumentou mais 10 vezes em relação a um anticorpo de controle. Porém, quando as células CD8 OT-I submetidas à preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina, na presença do anticorpo L4G6 bloqueador de TL1A, a expansão de CD8 OT-I foi reduzida em 10 vezes em relação a um anticorpo de controle. Vide figura 11.

Como tal, os agonistas de TNFR25 são modif icadores de resposta biológica para vacinas contra tumor, pois eles estimulam a ativação de célula Tea resposta imune celular a um antígeno tumor-específico, ao passo que os antagonistas de TNFR25 bloquearam ou inibiram a ativação de célula T. Portanto, outro aspecto da invenção refere-se a métodos e a agentes terapêuticos que aumentam a eficácia de uma vacina antitumoral. As vacinas contra tumor procuram utilizar os elementos do sistema imune natural do organismo para combater o câncer. As vacinas contra tumor contém um ou maisantígenos tumor-específicos e podem conter um adjuvante e modificadores de resposta biológica. Um antígeno tumor-especifico é um polipeptídeo substancialmente limitado à expressão em ou sobre células tumorais e que podem ser usados para estimular uma resposta imune destinada a atingir aquelas células tumorais. Tipos diferentes de vacinas são utilizados para tratar diferentes tipos de câncer. Para que uma composição antigênica seja útil como vacina, uma composição antigênica deve induzir uma resposta imune ao antígeno numa célula ou tecido. Conforme aqui utilizado, o termo "composição antigênica" pode compreender um antígeno (ex: um peptídeo ou polipeptídeo), um ácido nucleico codificando um antígeno (ex: um vetor de expressão de antígeno) ou uma célula expressando ou apresentando um antígeno. Vide Publicação Americana No. 2003/0185840, aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Os modificadores de resposta biológica (VRM), que demonstraram regular para cima a imunidade de célula T ou de regular para baixo a atividade celular supressora. Tais BRMs incluem, porém não se restringem a, Cimetidina (CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); Ciclofosfamida de baixa dose (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead, NJ), citocinas tais como g-interf eron, IL-2 ou 11-12 ou genes codificando proteínas envolvidas nas funções imunes auxiliares, tal como B-7.

Em uma concretização deste aspecto da invenção, a composição de vacina antitumoral inclui uma composição antigênica tumoral e um agonista de TNFR25. Em outra concretização, o agonista de TNFR25 é o anticorpo 4C12. Na concretização preferida, um agonista de TNFR25 é adicionado a vacina antitumoral como um modificador de resposta biológica. Ainda mais preferivelmente, o agonista de TNFR25 é o anticorpo 4C12. Em outra 35 concretização, a vacina antitumoral inclui um adjuvante. Os adjuvantes de vacina antitumoral podem incluir IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, 11-12, gama-interferon, GMCSP, BCG,hidróxido de alumínio, compostos de MDP1 tais como thur-MDP, e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipídio A, e monofosforil lipídio A. RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, MPL, dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto de parede celular (CWS) numa emulsão a 2% de esqualeno/Tween 80 é também previsto. Os antígenos MHC podem também ser usados. Os adjuvantes representativos freqüentemente preferidos incluem adjuvante completo de Freund (um estimulante não-específico da resposta imune contendo células mortas de Mycobaterium tuberculosis), adjuvantes incompletos de Freund e adjuvante de hidróxido de alumínio.

A preparação de vacinas que contenham seqüências peptídicas como ingredientes ativos é geralmente bastante conhecida no estado da técnica, conforme exemplificado pelas patentes americanas Nos. 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792 e 4.578.770, todas aqui incorporadas por referência.

Tipicamente, tais vacinas são preparadas na formainjetável. Como soluções ou suspensões líquidas: formassólidas apropriadas para solução e, ou suspensão em, líquido antes da injeção podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsifiçada. O ingrediente imunogênico ativo é freqüentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Excipientes apropriados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou similares e suas combinações. Além disso, se desejado, a vacina podeconter pequenas quantidades de substâncias auxiliarestais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, ou adjuvantes que aumentem a eficácia das vacinas.

8. Imunotoxinas de TNFR25 como Potenciadores Indiretos de Respostas Imunes Inatas Antitumorais

Muitos cientistas e empresas trabalham em células T CD4+/CD25+ reguladoras (Tregs) devido ao seu imensoimpacto potencial sobre o tratamento de muitas doenças. Embora muitas pessoas sejam expostas aos mesmos alérgenos ambientais e a sensibilização aos alérgenos seja comum, somente uma fração de pessoam desenvolvem doenças alérgicas, tais como asma. A razão para isso é incerta no momento, mas pode estar relacionada com a presença de Tregs reguladoras eficientes que suprimem a inflamação das vias aéreas em indivíduos sadios expostos a alérgenos. Como tal, as Tregs são conhecidas por contribuírem com a manutenção de tolerância periférica contra "próprio" ("self") e "não-próprio" ("non-self). Porém, também foi documentado que as Tregs impedem a capacidade do organismo de lutar contra o câncer. Nesses casos, as Tregs interferem com as células do sistema imune exterminadoras de tumor. Como tal, as Tregs funcionam como células supressoras dedicadas e podem desempenhar um papel importante na prevenção de tumores, como por exemplo, no carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, ao serem reconhecidas pelo sistema imune. Vide Br J Câncer, 2005 Mar 14; 92 (5) :913-20.

Os inventores observaram que as Tregs possuem propriedades sugerindo serem elas ativadas. Foi reportado que outros receptores TNF são expressados nas Tregs. GITR é expressado pelas Tregs ativadas. Constatou-se que sua ligação anula a atividade inibidora das Tregs (Nocentini et al., Eur J Immunol.2005 Apr; 35 (4) : 1016-22). TNFR25 possui muitas propriedades que poderiam torná-lo um regulador versátil de células Tregs. a). a expressão de proteína de TNFR25 é rapidamente regulada para cima pelo anelamento de mRNA induzido por PKC; b). diversas versões funcionais de ligação, incluindo um receptor chamariz e uma forma negativa dominante, permitem a sintonia fina da regulação; c). a expressão de TLlA parece ser altamente regulada para cima na Doença de Crohn; além disso, a expressão de TLlA sobre linfócitos ativados permite perceber a densidade do linfócito. Finalmente, eles exercem sua ação reguladora pelo menos em partesecretando IL-IO e IL-13, uma citocina ativada por sinais de TNFR2 5. Os inventores são os primeiros a observarem que as Tregs CD4+/CD25+ cultivadas expressando FoxP3 expressam desordenadamente altos níveis de TNFR25.Como 5 tal, os inventores concluem que o TNFR2 5 modula a função da Treg e que o TNFR2 pode ser usado como marcador molecular na depleção de Tregs in vivo. Vide Exemplo 20. Além disso, os agonistas de TNFR25 anulam a inibição de Treg. Vide Figura 15. Outro aspecto da invenção refere-se, portanto, a métodos e agentes terapêuticos que são úteis para aumentar a potência de terapias anti-câncer, através de depleção de células T CD4+/CD25+ reguladoras num paciente. Numa concretização deste aspecto da invenção, uma imunotoxina é usada na depleção de Tregs. Nesta concretização, a imunotoxina possui uma porção ligante ao antígeno que é específica para TNFR25; e é conjugada a um agente tóxico. Numa concretização alternativa, o paciente recebe TLlA solúvel conjugado a um agente tóxico. Outra concretização ainda refere-se a uma composição quimioterápica que possui um agente quimioterápico e uma imunotoxina TNFR2 5-específica. Outra concretização ainda refere-se a uma composição quimioterápica tendo um agente quimioterápico e um TLlA conjugado a um agente tóxico. Outro aspecto da invenção refere-se a métodos e agentes terapêuticos que são úteis para aumentar a potência de terapias anti-câncer provendo ao paciente agonistas de TNFR2 5 para reduzir a inibição mediada por células T CD4+/CD25+ reguladoras (Tregs).

9. Agonistas de TNFR25 como Agentes Antiinflamatórios

Utilizando uma forma negativa dominante de TNFR25 (DN-TNFR2 5) desprovida de domínio de morte intracelular e uma forma alternativamente ligada de TNFR25 (delta 5,6-TNFR25) desprovida dos éxons 5 e 6 codificantes do quarto domínio extracelular rico em cisteína, os inventores descobriram que a função do TNFR2 5 é necessária para restaurar o balanço homeostático após um trauma à mucosa.Especificamente, os inventores expressaramtransgenicamente uma forma negativa dominante de TNFR25 (DN-TNFR25) sob o promotor CD2 em camundongos. Os camundongos receberam dextran sulfato de sódio (DSS) para 5 induzir colite como modelo para doença de Crohn humana. Camundongos C5 7B1/6 tipo selvagem desenvolveram colite e diarréia e perderam peso após dias recebendo água potável com DSS a 2%. Porém, quando passaram a receber água normal, os camundongos do tipo selvagem se recuperaram no prazo de uma semana e recuperaram o peso novamente, ao passo que os camundongos expressando DN-TNFR2 5-tg adquiriram a doença de forma similar à dos camundongos do tipo selvagem, embora a diarréia parecesse mais severa. Adicionalmente, o retorno à água normal não resultou em sua recuperação. Pelo contrário, todos os camundongos expressando DN-TNFR25-tg continuaram a perder peso e morreram na segunda semana. Os camundongos expressando transgenes funcionais de TNFR25 (TNFR25 de extensão completa ou uma versão ligada de A5,6-TNFR25)recuperaram-se de forma similar à dos camundongos do tiposelvagem. Vide Exemplos 21 e 22 e Fig. 14.

O tratamento atual da doença de Crohn utiliza agentes antiinflamatórios, imuno ssupressores, e inibidores de TNF. Todos são sintomáticos. A estimulação da sinalização 25 de TNFR25 dá um passo além na cadeia patogenética de eventos. 0 TNFR25 ativado estimula a produção de Il-IO e 11-13 que, por sua vez, estimula a produção de TGF-beta, resultando no restabelecimento da homeostase. Tal tratamento é curativo ou se aproxima da cura.

Portanto, outro aspecto da invenção refere-se a ummétodo para tratar doença intestinal inflamatória num paciente, administrando ao paciente uma quantidade terapêutica de um agonista TNFR25. Outra concretização refere-se a um método para tratar doença intestinal inflamatória num paciente, elevando os níveis de IL-IO nas áreas mucosais do intestino. Em outra concretização, o agonista de TNFR25 é o anticorpo 4C12. Numa outraconcretização, o agonista de TNFR25 é a forma solúvel de TLlA. Na concretização preferida, a doença intestinal inflamatória é doença de Crohn.

Considerando essa atividade antiinflamatória dos agonistas de TNFR2 5, outro aspecto da invenção consiste em prover métodos e agentes terapêuticos a um paciente que necessite de redução na inflamação. Em uma concretização, um paciente recebe uma composição contendo um agonista de TNFR25 para reduzir a inflamação e promover a cura. Em uma concretização, um paciente recebe uma composição contendo o agonista de TNFR25 4C12. Tais concretizações são úteis para aliviar os sintomas de distúrbios mediados por respostas inflamatórias crônicas a nível celular, incluindo doenças cardiovasculares (ex: aterosclerose), doenças autoimunes incluindo lúpus eritematoso sistêmico (SLE), esclerose múltipla (MS) diabete (especialmente diabete tipo I) , espondilite anquilosante, artrite (especialmente artrite reumatóide), asma e alergia, distúrbios de reabsorção óssea, distúrbios oftalmológicos incluindo retinopatias e doenças fibróticas.

10. Antagonistas de TNFR25 como Imunossupressores Muitos órgãos e tecidos são atualmente transplantados rotineiramente de um ser humano para outro. Exceto em casos raros, quando o doador e o receptor são gêmeos

monozigóticos "idênticos", tais enxertos são denominados aloenxertos. A combinação dos tecidos para transplante de tecidos de um indivíduo para o outro é crítica, pois o receptor de tecido manifestará uma forte reação imunehumoral e celular contra as proteínas "não próprias" ("non-self"). A tipagem de tecidos envolve a identificação de antígenos MHC tanto nas células do doador como nas do receptor e o uso de células do doador com tantos alelos MHC idênticos aos do receptor quanto possível. A combinação de alelos MHC Classe I (especialmente HLA-B) e alelos HLA-DR Classe II é muito importante para um transplante bem sucedido, do que acombinação de outros antígenos MHC; e a combinação de MHC é mais importante do que a combinação de antígenos de histocompatibilidade secundária.

A combinação de HLA melhora a sobrevivência do transplante, não impedindo porém a rejeição, mesmo em irmãos MHC-idênticos (exceto gêmeos idênticos) . O MHC alogênico é reconhecido por células T CD8 (Classe I) ou células T CD4 (Classe II) ; até 10% de células T podem reconhecer um dado MHC alogênico, já que ele lembra MHC próprio + peptídeo estranho.

O aumento do sucesso na área de transplantes deve-se à crescente especialização técnica, ao aumento da disponibilidade de centros de transplante para realizar a combinação HLA e minimizar o tempo de entrega do órgão, ao aumento na disponibilidade de fármacos imunossupressores (ciclosporina e tacrolimus) que bloqueiam a ativação da célula T aos aloantígenos. Ainda problemáticas são a deficiência de órgãos, bem como a capacidade de a doença existente destruir o órgão transplantado (diabete e infecção por HBV são dois exemplos), os efeitos colaterais dos fármacos imunossupressores e o alto custo.

Considerando os principais efeitos colaterais associados aos atuais imunossupressores que bloqueiam a ativação de 2 5 célula Tea observação de que os antagonistas de TNFR25, tal como o anticorpo L4G6 bloqueador de TLlA tornam eficazes os inibidores da expansão clonal de célula T CD8 cognata (vide, Fig. 11, Exemplo 19) , outro aspecto da invenção envolve o uso de antagonistas de TNFR25 para facilitar o transplante de tecidos e prevenir a rejeição de tecidos. Numa concretização, os antagonistas de TNFR25 são providos para um receptor de transplante para suprimir a expansão clonal de células T CD8 que carregam receptores de célula T aloantígeno-específicos (TCRs) e 35 para abrandar a supressão de T-regs pelo TNFR25. Em outra concretização,, os antagonistas de TNFR25 são providos para um receptor de transplante em combinação com umagente imunossupressor. EXEMPLOS

Exemplo 1: Meios e Reagentes

As células foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo de Dulbecco modificado por Iscove (Invitrogen) suplementado com FBS inativado por calor a 10% (Invitrogen), 10g/ml de gentamicina (Invitrogen) e 50 μΜ β-mercapto-etanol (Bio-Rad). CD3 anti-camundongo e CD3 anti-humano monoclonais foram purificados de sobrenadantes de cultura das linhagens celulares 2C11 e 0KT3, respectivamente (ATCC, Manassas, VA). CD28 anti-camundongo e CD28 anti-humano monoclonais foram adquiridos da eBioscience (San Diego, CA). ConAf PHA e LPS foram adquiridos da Sigma (St.Louis, MO). IL-2 murino recombinante foi adquirido da BioSource International (Camarillo, CA). PMA, ionomicina, H7 e cicloheximida foram adquiridos de Calbiochem (San Diego, CA).

Anticorpos monoclonais diretamente conjugados, incluindo o FITC-CD4. Cychrome-CD4, PE-CD8a, Cychrome-CD8a, FITC- B220, PE-B22 O, FITC-CD25, PE-CDllc, PEDX5, FITC-CD3, PE-NKl.1, PE-Anexina V e 7-AAD foram adquiridos de BD/PharMingen (San Diego, CA). O controle IgG de hamster foi adquirido da eBioscience.

Exemplo 2 : Geração de anticorpos monoclonais contra mTNFR2 5 e mTLIA

Hamsters armênios foram imunizados intraperitonealmente três vezes a cada quinze dias com 50μg de mTNFR25-Ig ou mTLIA-MBP (proteína ligante de maltose) em adjuvante de Freund. Três dias antes da fusão, os hamsters receberam um reforço de 50μg das respectivas proteínas, intravenosamente. Os esplenócitos de hamster foram fundidos com o mieloma SP2 0 murino com PEG e então plaqueados em meio à base de metilcelulose durante duas semanas utilizando kit ClonaCell-HY (StemCell Technologies Inc.BC, Canadá). Mil colônias foram selecionadas e analisadas através de ELISA em placas revestidas com a proteína de fusão imunizante ou aproteína de controle-proteína de fusão Ig. Os sobrenadantes de clones positivos foram testados quanto à capacidade de detectar isoformas de mTNFR25 em células transfectadas através de citometria de fluxo e western blot. Os anticorpos foram purificados de um sobrenadante Nutridoma-SP (Roche, Indianapolis, IN) sobre uma coluna de proteína-G, dialisada em PBS e esterilizada em filtro. Exemplo 3: Análise citométrica de fluxo para a expressão de mTNFR2 5 e mTLIA Suspensões de uma célula foram preparadas a partir de órgãos linfóides indicados no experimento individual. Antes da coloração, as células foram tratadas com CD16/CD32 anti-camundongo purificado (receptor Fc-γΐΐΐ/ll; BD) e IgG humana purificada (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) para bloquear a ligação não-específica a FcRs. As células foram coradas com TNFR2 5 anti-camundongo de hamster armênio ou TLlA anti-camundongo durante 30 minutos a 4°C. As células foram lavadas em tampão FACS (PBS contendo BSA 0,5% e 2nM EDTA) e então coradas com IgG de anti-hamster armênio de cabra marcada com biotina (Jackson ImmunoResearch) durante 30 minutos a 4°C. As células foram lavadas e então coradas com Estreptavidina-PE ou Estreptavidina-Cychrome (BD) durante 30 minutos a 4°C. As células foram lavadas eentão coradas com marcadores de superfície celulardiretamente conjugados para populações celulares distintas. As amostras foram analisadas utilizando um instrumento FACS LSR da Becton Dickinson e software CELLQuestTM.

Exemplo 4 : RT-PCR

Identificação de formas de ligação de mTNFR2 5: RNA Mensageiro foi extraído de linhagens celulares murinas ou tecidos com o kit Micro Fast-Track (Invitrogen, Carlsbad, CA) , e o cDNA foi submetido à transcrição reversa utilizando o kit Superscript II (Invitrogen). Os produtos de RT-PCR foram subclonados no vetor PCR II utilizando o kit de clonagem TOPO (Invitrogen) e foram confirmadoscomo formas de ligação de mTNFR2 através de seqüenciamente de DNA. Para análise da ligação de TNFR25 raurino, foram utilizados os seguintes preparadores ("primers"). Primer a montante, éxon 2: CAG TGA GTC CCA 5 GAA GAG GT (SEQ ID NO: 8); primer a jusante, éxon 7: GGA TAG CCC CAA AAA GGA AC (SEQ ID NO: 9) ; primer a montante, éxon 7 : TCC TTT TTG GGG CTA TCC TG (SEQ ID NO: 10), primer a jusante, éxon 10: GGT ATT TCT CCA TGA CGC TT (SEQ ID NO:11).

A ligação alternativa induzida por ativação de TNFR25 humano foi analisada, já que nos camundongos os produtos de PCR com diferentes formas de ligação eram mais difíceis de distinguir em gel de agarose, embora parecessem similares às formas de ligação humana. Foram utilizados os primers de PCR a seguir descritos. Éxon 4 a montante: TTC ACC CTT CTA CTG CCA AC (SEQ ID NO: 12); éxon 7, a jusante: TAA CCA GGG GCT TGT GAG GC (SEQ ID NO: 13). As células mononucleares sangüíneas periféricas humanas foram isoladas de doadores sadios através de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll Hypaque. Cinco milhões de células por amostra foram ativadas com PHA (5^g/ml), ou anti-CD3 imobilizado (0KT3, 5^g/ml), e anti-CD2 8 {1μ$/νη1) ou PMA (10 ng/ml) e ionomicina (400 ng/ml). As células foram coletadas nos pontos de tempo indicados e o mRNA extraído e convertido em cDNAutilizando o kit Invitrogen. /3-actina humana foi utilizada como controle interno. A quantificação de produtos de PCR foi realizada com auxílio de software Molecular Analyst (BioRad).

Exemplo 5 : Geração de Camundongos Transgênicos

Os construtos de TNFR25 murino foram clonados sob o promotor CD2 humano e região de controle local (doação do Dr. A.Singer, NIH) utilizando os sítios de endonuclease de restrição EcoR I e Sal I. Três construtos mTNFR2 5 foram gerados por PCR utilizando uma enzima com mecanismo de revisão ("proofreading"). Os construtos eram a molécula de extensão completa de TNFR2 5 murino (FLTNFR2 5), a variante de ligação de TNFR2 5 desprovida do 5o e 6o éxon (Δ5,6 TNFR25) e a versão negativa dominante de TNFR25 (DN TNFR25, como 1-234) terminando na extremidade do domínio transmembrânico e desprovido do domínio intracelular completo. A seqüência dos produtos de PCR foi confirmada por seqüenciamento. Microinjeções de DNA nos ovos fertilizados foram conduzidas pela unidade transgênica na University of Miami, School of Medicine. Fundadores potenciais foram identificados através de PCR de DNA de biópsias da cauda. O par preparador (primer) foi localizado a montante e a jusante dos sítios de clonagem; portanto, o mesmo par preparador foi utilizado para todos os transgenes mTNFR2 5. O primer a montante é 5'CGC TCT TGC TCT CTG TGT ATG 3' (SEQ ID NO: 14) e O primer a jusante é o 5'CTG CCA GCC CTC TTC CAT C 3'(SEQ ID NO:15). Os camundongos transgênicos foram criados no "background" C57BL/L6 através de combinação serial de animais transgênicos hemizigotos com C57BL/6J tipo selvagem (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Todos os camundongos foram usados na 6a.-12a.semana de vida, e mantidos em dependências livres de patógenos. 0 "University of Miami Animal Care and Use Committee" aprovou todos os procedimentos para utilização dos animais.

Exemplo 6 : Preparação de extrato nuclear e ensaios dedesvio de mobilidade eletroforética para ativação de NFIkB

Cento e sete células Ε14-Δ5,6 TNFR25 ou EL4-FL TNFR25 foram tratadas com TLlA solúvel ou ligado a membrana oucom anticorpo 4C12 agonista de TNFR2 5 conforme indicadonas legendas das figuras, e então coletadas por centrifugação a 800g durante 5 min. Extratos nucleares foram isolados utilizando um protocolo de minipreparação e submetidos a EMSA conforme descrito (Harhaj, E.W. et al. Virology 333, 145-58 (2005). Os extratos nucleares (6μg) foram incubados à temperatura ambiente durante 20 minutos com uma sonda κΒ de alta afinidade marcada com32Ρ seguido de separação dos complexos de DNA-proteína em géis de poliacrilamida nativa a 5%. Exemplo 7 : Ensaio de Proliferação de Célula T Os esplenócitos foram plaqueados em triplicata a 1 χ 10^5 células/cavidade em placas de fundo plano de 96 cavidades. As células foram ativadas com anti-CD3 imobilizado (2/xg/ml) com ou sem anti-CD28 solúvel (l^g/ml) ou com ConA (5 μg/ml) ou com PMA (1 μg/ml) e ionomicina (400 ng/ml). Para proliferação de célula T, células T CD4 purificadas a 1 χ 10^5 células/cavidade ou células T CD8 a 5 χ 10^4 células/cavidade foram estimuladas com anti-CD3 revestido (2 μg/ml) e anti-CD28 solúvel (1 μg/ml). mIL-2 recombinante foi adicionado à cultura a 1000 U/ml em experimentos indicados. As células foram cultivadas durante 72 horas e pulsadas durante as últimas seis horas de incubação com ^Ci/cavidade de 3H-timidina (Perki η Elmer, Boston, MA), e a incorporação de timidina foi quantificada utilizando um contador de cintilação.

Células CD4 ou CD8 ou T murinas foram purificadas de esplenócitos e/ou nódulos linfáticos através de seleção negativa utilizando o kit SpinSep (StemCell Technology Inc.) de acordo com o protocolo do fabricante. A pureza estava rotineiramente em torno de 90%/96% ao ser examinada por análise FACS.

Exemplo 8 : Imunização de camundongos com DNP-KLH, determinação de isótipo de anticorpo, e ELISA de citocina.

Camundongos transgênicos e do tipo selvagem adultos (6-10 semanas de vida) foram imunizados intraperitonealmentecom 100μg de hemocianina de lapa ("keyhole limpet") conjugada a DNP (DNP-KLH) (CalBiochem). Uma semana e três semanas após imunização, os camundongos foram sangrados e o soro separado para análise de anticorpos IgGl, IgE e Ig2a anti-DNP específicos através de ELISA de acordo com o protocolo do fabricante (BD). Os soros de animais individuis foram absorvidos em placas de 96 cavidadesrevestidas com 0,8^g/ml DNP-albumina (DNP-BSA) (CalBiochem) e o isótipo de anticorpo ligado determinado através de ELISA.

Para analisar a produção de citocina nos sobrenadantes de culturas celulares, testes ELISA "sanduíche" foram conduzidos de acordo com as instruções do fabricante. Pares de anticorpo de BD foram usados para análise de IL-2, IFN-γ e IL-4. Reagentes para ELISA de IL-13 foram adquiridos da R&D Systems (Minneapolis, MN) e os reagentes para o teste ELISA de IL-5 e IL-IO foram adquiridos da eBioscience.

Exemplo 9: Polarização in vitro de células T CD4 em células Thl ou Th2

As células T CD4 foram purificadas através de seleção negativa conforme acima mencionado. As células T CD4 foram ativadas com anti-mCD3 imobilizado (2/xg/ml) e anti-mCD2 8 solúvel (1 μg/ml) isoladamente, ou na presença de IL-12 (10 ng/ml) e anti-mIL-4 (20 Mg/ml) para diferenciação de Thl, ou com IL-4 (10 ng/ml), anti-mIFN-γ (10^g/ml) e anti-mIL-12 (10 μg/ml) durante 7 dias. As células foram coletadas, lavadas e replaqueadas a 1 χ IO5 células por cavidade e reestimuladas com anti-CD3 imobilizado. Após 24 horas, os sobrenadantes foram coletados e avaliados quanto à produção de citocina através de ELISA.

Exemplo 10 : Protocolos de imunização para o modelo murino de asma alérgica

Camundongos DN TNFR2 5-tg (codificado pela SEQ ID NO: 16) , Camundongos Δ5 ,6 TNFR2 5-tg, e FL TNFR2 5 -tg gerados conforme anteriormente descrito e retro-cruzados em pelo menos sete gerações no "background" C57BL/6J, foram comparados com os camundongos C57BL/6J do tipo selvagem adquiridos de National Câncer Institution (Frederick, MD). Os camundongos foram sensibilizados através de injeção intraperitoneal de 66μg de ovalbumina (albumina cristalizada de ovo de galinha, grau V, Sigma)absorvida em 6,6 mg sulfato de alumínio potássio (alum; Sigma) em200 μl PBS no dia 0. No dia 5, os camundongos receberam reforço intraperitonealmente com a mesma dose de ovalbumina em alum. No dia 12, os camundongos foram desafiados por aerossol com 0,5% ovalbumina em PBS por uma hora utilizando um Nebulizador Ultrasônico (MABIS Healthcare Inc., Lake Forest, IL). Os camundongos foram avaliados quanto â inflamação alérgica dos pulmões três dias após a exposição única ao aerossol. Os camundongos foram sacrificados através de inalação de C02. Após canulação da traquéia, o pulmão foi lavado 4 vezes com 1 ml de PBS. As células recuperadas do líquido BAL foram contadas e usadas para preparações em "cytospins" (50.000 células ou menos/lâmina). > 200 células foram contadas para cada lâmina de "cytospin" corada com corante Wright-Giemsa (Sigma) para determinar as contagens diferenciais de células para macrófagos, eosinófilos, linfócitos e neutrófilos.

Exemplo 11 : Histologia Pulmonar

Os pulmões foram removidos dos camundongos após o procedimento de lavagem brônquica e fixados em formalina tamponada neutra a 10%. As amostras foram entregues aos cuidados do "Histopathology Core of the Sylvester Câncer Center University of Miami, School of Medicine" onde as amostras foram embebidas, cortadas e coradas com hematoxilina e eosina. Os cortes foram também corados com ácido de Schiff periódico (PAS) para determinar a produção de muco.

Exemplo 12 : ELISA para IgE total sérica e Ig ovalbumina-específica

Os camundongos foram sangrados antes da sensibilização (dia 0), 3 dias após o desafio por aerossol (dia 15) e em alguns experimentos um dia antes do desafio por aerossol (dia 11). O nível de IgE total foi quantificado através de ELISA de acordo com o protocolo do fabricante (BD). IgE ovalbumina-específica foi determinada em ELISA Sanduíche, primeiramente revestindo-se a placa com OVA 0,01% em PBS, seguido de carregamento das amostras desoro diluída e então do anticorpo anti-IgE secundário marcado com biotina (BD).

Exemplo 13 : Reestimulação in vitro de células de nódulos linfáticos e produção de citocina 5 Um dia ou três dias após o desafio por aerossol, os nódulos linfáticos brônquicos foram coletados e as suspensões de uma célula preparadas. As células foram inoculadas em placas de 96 cavidades de fundo redondo a 1 χ 10 6 células/cavidade e cultivadas com 100 g/ml ovalbumina durante 4 dias. Então, os sobrenadantes foram coletados para os ensaios ELISA de citocina conforme descrito.

Exemplo 14 : Ensaio de Citotoxicidade

Os sobrenadantes de mTLIA diluídos serialmente e coletados de células transfectadas com P815-TL1A foram adicionados às células alvo transfectadas com P815-TNFR25 marcadas com 51Cr. Para testar a atividade de bloqueio de TL1A, foram adicionados anticorpos monoclonais anti-TLlA diferentes à cultura e a liberação de Cr determinada após 4 horas em amostras em triplicata. A liberação espontânea foi calculada a partir de cavidades que continham apenas células alvo marcadas com 51Cr. 100% liberação (controle positivo) foi calculada das cavidades que continham células alvo marcadas com 51Cr e 1% SDS. A porcentagem de atividade de citotoxicidade foi calculada conforme a seguir descrito: (leitura média de amostra - leitura média de liberação espontânea)/leitura média de controle positivo. Dados similares foram também obtidos com transfectantes EL4. Exemplo 15: Bloqueio de Inflamação Pulmonar por anticorpo anti-mTLIA antagonista

Os camundongos foram sensibilizados intraperitonealmente com ovalbumina em alum no dia 0 e no dia 5 seguido de desafio por aerossol com 0,5% ovalbumina em PBS durante 3 5 uma hora no dia 12. Os camundongos receberam L4G6 ou uma quantidade equivalente da IgG de hamster de controle (Jackson Immuno Research) através de injeçãointraperitoneal de 5 0^g/camundongo a cada dia do dia 11 ao dia 14. A inflamação pulmonar alérgica foi avaliada no dia 15.

Exemplo 16: Transferência adotiva de células NKT

Os camundongos Jal8 k.o. (Cui, J.et al. Science 278, 1623-6(1997)) foram doados por Michael Lotze (U.Pittsburgh) com a gentil permissão de M.Taniguchi (Ciba University, Japão). Células NKT de camundongos tipo selvagem e DN TNFR25-tg foram isoladas de células esplênicas agrupadas de camundongos através de seleção positiva utilizando o Kit de Seleção Positiva Pan NK de camundongo "EasySep" (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) de acordo com instruções do fabricante.

Exemplo 17: Análises Estatísticas

As análises estatísticas utilizando um teste t de Student foram conduzidas com o software GraphPad Prism (San Diego, CA); p<0,05 é considerado significativo. Os dados no texto são apresentados como a média ± SEM.

Exemplo 18 : Geração de anticorpos DR3 e TLlA

Uma proteína de fusão DR-3 foi gerada, purificada e usada para imunizar hamsters. Os sobrenandantes de hibridoma foram obtidos e verificados através de ELISA utilizando a proteína de fusão DR3-Ig como agente de verificação. A natureza dos hibridomas foi verificada através de citometria de fluxo de células tumorais transfectadas com DR3, através de Western blots, e através de estudos funcionais. Todos os anticorpos detectaram DR3 de extensão completa e alternativamente ligada em células transfectadas por FACS, um dos anticorpos detectou DR3 em Western blots, e o anticorpo (4C12) exibiu atividade agonista, mediando a sinalização de DR3 na ausência de TLlA.

Os anticorpos monoclonais de TLlA foram obtidos imunizando-se hamsters com uma fusão de proteína de ligação a maltose-TLIA. Os anticorpos de TLlA detectaram TLlA transfectado através de citometria de fluxo. 0 anticorpo (L4G6) exibiu atividade antagonista, bloqueandoa ligação de TLlA a DR3.

Exemplo 19 : A Sinalização através de TNFR25 Aumenta a Preparação Cruzada de CD8

Um sistema novo baseado em proteína gp96 de choque térmico que media forte expansão de CD8-CTL antígeno-específica in vivo foi recentemente descrito em Strbo et al. , Am J Reprod Immunol.2002 Oct;48 (4) :22O-5 . Neste sistema modelo a gp96-Ig liberada (construída para ser secretada) ativa as células dendríticas e prove peptídeos chaperonados para a apresentação cruzada e preparação cruzada de células CD8 (Fig. 12). 0 sistema é muito útil, pois independe do auxílio de CD4. A gp96 secretada provê o sinal de ativação para DC através de CD91 e TLR2/4 que é de outra forma provido por CD409-L nas células CD4. Conseqüentemente, a expansão de CD8 (OT-I) neste sistema funciona bem em camundongos deficientes em CD4 0-L e foi empregada no estudo de imunidade mucosal e para determinar o papel de TNFR2 5 na expansão de CD8. EG7-gp96 é uma linhagem celular derivada do Linfoma EL4

através de transfecção com ovalbumina e gp96-Ig. As

células secretam gp96-Ig associada com peptídeos de ovalbumina. Os peptídeos de ovalbumina chaperonados através de gp96-Ig aumentam a preparação cruzada de células CD8 (Fig. 10) em cerca de 10.000 vezes quando 25 comparados com a ovalbumina isoladamente. IOOng ova-gp96-Ig expandem OT-I em camundongos B6 de uma freqüência de 0,5% entre células CD8 pós-transferência a 20% no baço após imunização com EG7-gp96-Ig.

Para determinar o efeito dos sinais TNFR25 sobre a expansão de CD8, modelo OT-I transgênico de TCR conformedescrito acima, foi utilizado juntamente com estimulação mediada por EG7-gp96-Ig. Para determinar o efeito dos sinais de TNFR25, os camundongos receberam um anticorpo anti-TNFR25 agonista (4C12), um anticorpos de ligação a TNFR2 5 mas não agonista (L4G6) ou uma IgG de controle, 24h e 72h após imunização com EG7-gp96-Ig. A expansão de OT-I foi monitorada na cavidade peritoneal no dia 5 apósimunização. 4C12 causou um recrutamento aumentado de células para a cavidade peritoneal através de EG7-gp96-I, resultando na duplicação do número de células. Além disso, 4C12 causou especificamente um aumento em mais de oito vezes na expansão de OT-I.O anticorpo L4G6 anti-TNFR2 5 não induziu aumento no recrutamento de células para a cavidade peritoneal e inibiu a expansão de OT-I. Esses dados mostram que os anticorpos anti-TNFR2 5 agonistas coestimulam as células CD8 e/ou inibem os efeitos supressores de Tregs via TNFR25. A coestimulação de células T virgens por TNFR25 resulta na proliferação aumentada e na polarização para Th2 mediante ativação secundária. Além disso, a sinalização de TNFR25 sobre as células T reguladoras resulta em sua inibição temporária de supressão. O efeito combinado é então responsável pela expansão aumentada de CD8 e pelo recrutamento de células observado na Fig. 11.

Exemplo 20 : As Células T CD4+CD25+ reguladoras expressam altos níveis em TNFR25

Para determinar a expressão de TNFR25 as Tregs CD4+CD25+ foram purificadas dos baços através de seleção negativa de células CD4 seguido de classificação magnética com anti-CD25. As células foram cultivadas com grânulos de anti-CD3, anti-CD28 a uma relação de grânulo para célula de 3:1, sendo utilizados 2000u/ml de IL-2 humano. Sob essas condições, as células começam a proliferar após 3-4 dias e continuam expandindo-se por cerca de 3 semanas. As células cultivadas foram analisadas através de análise FACS para CD4 e CD2 5, através de citofluorimetria intracelular para expressão de FoxP3 e para análise de superfície de TNFR25. A Fig. 13 mostra que as Tregs obtidas desta forma são essencialmente puras e expressam tanto FoxP3 como TNFR2 5.

Exemplo 21 : O Bloqueio de TNFR2 5 causa letalidade de colite induzida por dextran sulfato de sódio

O modelo de dextran sulfato de sódio (DSS) tem sido amplamente utilizado como modelo de colite, lembrando, emalguns aspectos, a doença de Crohn. O trauma inicial é o efeito danoso do DSS sobre a barreira de permeabilidade normalmente provida pelo epitélio intestinal. Esse efeito do DSS permite acesso da flora intestinal normal aos locais do sistema imune mucosal que deflagram uma resposta imunológica inflamatória lembrando a colite de Crohn. Camudongos do tipo selvagem (w.t.), durante um período de 8 dias de exposição à água potável contendo DSS a 2% desenvolveram diarréia e perda de peso. Quando do retorno à água normal, os camundongos B6 se recuperaram e voltaram seu peso normal. O TNFR25 também influi sobre o curso da doença na Colite. No presente experimento, camundongos tipo selvagem e transgênicos foram expostos foram expostos à água contendo DSS a 2% por sete dias. Conforme mostra a Fig. 14, os camundongos DN-TNFR2 5-tg desenvolveram uma doença semelhante à dos camundongos tipo selvagem, porém quando retornaram à água normal, os camundongos DN-TNFR25-tg não se recuperaram como os camundongos tipo selvagem. Em vez disso, os camundongos DN-TNFR25-tg continuaram a perder peso e morreram entre o dia 12 e 16. Os camundongos A5,6-TNFR25-tg assemelharam-se aos camundongos tipo selvagem embora a morte de um camundongo poderia também sugerir distúrbio no sistema imune. Chegou-se a duas conclusões: em camundongos DNTNFR2 5-tg, a resposta imune resultante é muito mais forte do que a dos camundongos tipo selvagem, levando à letalidade, e o restabelecimento da saúde normal e da homeostase em camundongos tipo selvagem são dependentes do funcionamento normal das células T reguladoras (Treg) . A função da Treg é afetada nos camundongos DNTNFR25-tg. A última hipótese é a mais provável, pois se sabe que a função da Treg é extraordinariamente importante para manter a homeostase no sistema imune mucosal, mantendo o balanço correto entre a tolerância aos nutrientes e a flora intestinal normal e a resposta imune a patógenos intestinais. Exemplo 22 : A Imunização com EG7-gp96-Ig induziu ascélulas OT-I a migrarem para os sítios mucosais de placas de Peyer, linfócitos da lâmina própria (LPL) e linfócitos intraepiteliais (IEL)

Conforme mostra a Fig. 16 (coluna à direita), as células 5 EG7 são incapazes de causar expansão clonal de OT-I ou migração aos sítios mucosais. As células EG7 secretoras de gp96-Ig, por outro lado, causam a expansão clonal de OT-I no baço, nódulos linfáticos e cavidade peritoneal (não mostrada) e sua migração aos sítios mucosais (Fig. 16) . Nas placas de Peyer, 8% das células são CD8+ e 6,7% das células CD-8 são OT-I; em IEL 61% das células são CD8+ e 9% das células CD8 são OT-I . Em LPL, 29% das células CD8 são OT-I . As células OT-I migrando para IEL após imunização são aEb7+ e a4/37+, mas permanecem CD8a/3 e TCRajS, ao contrário de CD8 IEL residente, cuja maioria são CD8aoc e 50% TCRyô.

No presente relatório, foram descritas apenas as concretizações preferidas da invenção, e alguns exemplos de sua versatilidade. Deve ficar entendido que a invenção pode ser utilizada em diversas outras combinações e ambientes, sendo capaz de mudanças ou modificações sempre dentro do escopo do conceito inventivo aqui expressado. Assim, por exemplo, os habilitados na técnica reconhecerão, ou poderão verificar, utilizando nada além da experimentação de rotina, numerosos equivalentes às substâncias e procedimentos específicos aqui descritos. Tais equivalentes são considerados como enquadrados no escopo da presente invenção.LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110> University of Miami School of Medicine Podack, Eckhard Levy, Robert Deyev, Vadim

<12O > "ANTICORPO ISOLADO, TOXINA ESPECÍFICA PARA RECEPTOR DE FATOR DE NECROSE TUMORAL 2 5 (TNFR2 5) , MÉTODO PARA ATIVAR O RECEPTOR DE FATOR DE NECROSE TUMORAL 2 5 (TNFR2 5) , MÉTODO PARA INIBIR A SINALIZAÇÃO DO RECEPTOR DE FATOR DE NECROSE TUMORAL 25 (TNFR2 5) NUMA CÉLULA, VACINA ANTITUMORAL, MÉTODO PARA IMUNIZAR UM PACIENTE CONTRA TUMOR, MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER NUM PACIENTE, MÉTODO PARA TRATAR E/OU PREVENIR INFLAMAÇÃO INTESTINAL, COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA PARA A FACILITAÇÃO DE UM TRANSPLANTE DE ÓRGÃO, MÉTODO PARA TRANSPLANTAR UM TECIDO DE UM DOADOR PARA UM HOSPEDEIRO, MÉTODO PARA INIBIR A EXPRESSÃO CLONAL DE UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS T CD8 COGNATAS, MÉTODO PARA TRATAR E/OU PREVENIR INFLAMAÇÃO PULMONAR, ANTAGONISTA DE TNFR25 ISOLADO, COMPOSIÇÃO E VETOR DE EXPRESSÃO".

<13 O > 071342-0041

<140> 11/512,412 <141> 2006-08-30

<150> 60/712,084 <151> 2005-08-30

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210 > 1

<211> 1665

<212 > DNA

<213> Camundongo

<400> 1

gggagttgtt ctggatggcg cgggggcggg cgggcagcag ctactctagt a99g9ctgag Ctggttgggg aagccccggg ttacgcgacc gaccagagcc gggcccaggc ggtacacacc gcaatggagg cacggctgct gcggggctgc ctctgttcct accactgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgcttggt

ctaggaacat 60 gcactcacaa 120 gtggtggagc 180 ggccagggcc 24 0

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<210> 2

<211> 1665

<212 > DNA

<213> Homo sapiens

acatgaaggc cccctgcgca gaaccctgtg 360 acaccttctt gaccagagac aaccacttta 420 atgaagaggc ccttcaagtg acccttgaga 480 gctgccagtc aggctggtgt gttgactgct 540 tctcttgtgt cccatgcggg gctacgacac 600 gcctgcctgg cttctatata cgtggcaatg 660 gcgtttgccc taaggcttgc actgctgtct 720 tgcttctagg agtcgcgttc ctttttgggg 780 agccttgtaa ggccgtggtc actgcagaca 840 agactgccca tctctcagcc tcagacagcg 900 ctgggaaaat ctgtaccact gtccagttgg 960 agactcagga ggtggtctgc ggacaggcct 1020 ctcttggaac tcctctggca tctccgctct 1080 ctgtgctcca gcctggcccg cagctctacg 1140 ggaaggagtt cgtgcgcacg ctggggctgc 12 0 0 aaatctgccg cttccgagac cagcagtatg 1260 ctgcaggcct cggtgccatc tatgcggctc 1320 aggacctgcg cagccgcctg cagcgtggcc 13 8 0 accctagtga cccttgaagg agccttaagt 1440 tcaattacta accccctgcc gtggtcctgc 1500 atctgcagca cggagctcct gctaagggaa 1560 gtgattggtt gctcagctgt taattagccc 1620 aaaagcagct gcttg 1665<4 0 0 > 2 cgggccctgc gggcgcgggg ctgaaggcgg aaccacgacg ggcagagagc acggagccgg 60gaagcccctg ggcgcccgtc ggagggctat ggagcagcgg ccgcggggct gcgcggcggt 120ggcggcggcg ctcctcctgg tgctgctggg ggcccgggcc cagggcggca ctcgtagccc 180caggtgtgac tgtgccggtg acttccacaa gaagattggt ctgttttgtt gcagaggctg 240cccagcgggg cactacctga aggccccttg cacggagccc tgcggcaact ccacctgcct 300tgtgtgtccc caagacacct tcttggcctg ggagaaccac cataattctg aatgtgcccg 360ctgccaggcc tgtgatgagc aggcctccca ggtggcgctg gagaactgtt cagcagtggc 420cgacacccgc tgtggctgta agccaggctg gtttgtggag tgccaggtca gccaatgtgt 480cagcagttca cccttctact gccaaccatg cctagactgc ggggccctgc accgccacac 540

acggctactc tgttcccgca gagatactga ctgtgggacc tgcctgcctg gcttctatga 600

acatggcgat ggctgcgtgt cctgccccac gccacccccg tcccttgcag gagcaccctg 660

gggagctgtc cagagcgctg tgccgctgtc tgtggctgga ggcagagtag gtgtgttctg 72 0

ggtccaggtg ctcctggctg gccttgtggt ccccctcctg cttggggcca ccctgaccta 780

cacataccgc cactgctggc ctcacaagcc cctggttact gcagatgaag ctgggatgga 840

ggctctgacc ccaccaccgg ccacccatct gtcacccttg gacagcgccc acacccttct 900

agcacctcct gacagcagtg agaagatctg caccgtccag ttggtgggta acagctggac 960

ccctggctac cccgagaccc aggaggcgct ctgcccgcag gtgacatggt cctgggacca 1020

gttgcccagc agagctcttg gccccgctgc tgcgcccaca ctctcgccag agtccccagc 1080

cggctcgcca gccatgatgc tgcagccggg cccgcagctc tacgacgtga tggacgcggt 1140

cccagcgcgg cgctggaagg agttcgtgcg cacgctgggg ctgcgcgagg cagagatcga 12 0 0

agccgtggag gtggagatcg gccgcttccg agaccagcag tacgagatgc tcaagcgctg 1260

gcgccagcag cagc'ccgcgg gcctcggagc cgtttacgcg gccctggagc gcatggggct 1320

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<210 > 6 <211> 633<212 > DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6 atggagcagc ggccgcgggg ctgcgcggcg gtggcggcgg cgctcctcct ggtgctgctg 60ggggcccggg cccagggcgg cactcgtagc cccaggtgtg actgtgccgg tgacttccac 120aagaagattg gtctgttttg ttgcagaggc tgcccagcgg ggcactacct gaaggcccct 180tgcacggagc cctgcggcaa ctccacctgc cttgtgtgtc cccaagacac cttcttggcc 240tgggagaacc accataattc tgaatgtgcc cgctgccagg cctgtgatga gcaggcctcc 300caggtggcgc tggagaactg ttcagcagtg gccgacaccc gctgtggctg taagccaggc 360tggtttgtgg agtgccaggt cagccaatgt gtcagcagtt cacccttcta ctgccaacca 420tgcctagact gcggggccct gcaccgccac acacggctac tctgttcccg cagagatact 480gactgtggga cctgcctgcc tggcttctat gaacatggcg atggctgcgt gtcctgcccc 540acgccacccc cgtcccttgc aggagcaccc tggggagctg tccagagcgc tgtgccgctg 600tctgtggctg gaggcagagt aggtgtgttc tgg 633<210 > 7 <211> 2016 <212 > DNA <213> Homo sapiens <4 0 0 > 7 gagagggaaa agggaaggag gagactgagt gattaagtca cccactgtga agagctggtc 60ttctatttaa tgggggctct ctctgcccag gagtcagagg tgcctccagg agcagcagga 120gcatggccga ggatctggga ctgagctttg gggaaacagc cagtgtggaa atgctgccag 180agcacggcag ctgcaggccc aaggccagga gcagcagcgc acgctgggct ctcacctgct 240gcctggtgtt gctccccttc cttgcaggac tcaccacata cctgcttgtc agccagctcc 300gggcccaggg agaggcctgt gtgcagttcc aggctctaaa aggacaggag tttgcacctt 360cacatcagca agtttatgca cctcttagag cagacggaga taagccaagg gcacacctga 420cagttgtgag acaaactccc acacagcact ttaaaaatca gttcccagct ctgcactggg 480aacatgaact aggcctggcc ttcaccaaga accgaatgaa ctataccaac aaattcctgc 540tgatcccaga gtcgggagac tacttcattt actcccaggt cacattccgt gggatgacct 600 ctgagtgcag tgaaatcaga caagcaggcc gaccaaacaa gccagactcc atcactgtgg 660 tcatcaccaa ggtaacagac agctaccctg agccaaccca gctcctcatg gggaccaagt 720 ctgtatgcga agtaggtagc aactggttcc agcccatcta cctcggagcc atgttctcct 780 tgcaagaagg ggacaagcta atggtgaacg tcagtgacat ctctttggtg gattacacaa 840 aagaagataa aaccttcttt ggagccttct tactatagga ggagagcaaa tatcattata 900 tgaaagtcct ctgccaccga gttcctaatt ttctttgttc aaatgtaatt ataaccaggg 960 gttttcttgg ggccgggagt agggggcatt ccacagggac aacggtttag ctatgaaatt 1020 tggggcccaa aatttcacac ttcatgtgcc ttactgatga gagtactaac tggaaaaggc 1080 tgaagagagc aaatatatta ttaagatggg ttggaggatt ggcgagtttc taaatattaa 1140 gacactgatc actaaatgaa tggatgatct actcgggtca ggattgaaag agaaatattt 1200 caacacctcc ctgctataca atggtcacca gtggtccagt tattgttcaa tttgatcata 1260 aatttgcttc aattcaggag ctttgaagga agtccaagga aagctctaga aaacagtata 1320 aactttcaga ggcaaaatcc ttcaccaatt tttccacata ctttcatgcc ttgcctaaaa 1380 aaaatgaaaa gagagttggt atgtctcatg aatgttcaca cagaaggagt tggttttcat 1440 gtcatctaca gcatatgaga aaagctacct ttcttttgat tatgtacaca gatatctaaa 1500 taaggaagta tgagtttcac atgtatatca aaaatacaac agttgcttgt attcagtaga 1560 gttttcttgc ccacctattt tgtgctgggt tctaccttaa cccagaagac actatgaaaa 1620 acaagacaga ctccactcaa aatttatatg aacaccacta gatacttcct gatcaaacat 1680 cagtcaacat actctaaaga ataactccaa gtcttggcca ggcgcagtgg ctcacacctg 1740 taatcccaac actttgggag gccaaggtgg gtggatcatc taaggccggg agttcaagac 1800 cagcctgacc aacgtggaga aaccccatct ctactaaaaa tacaaaatta gccgggcgtg 1860 gtagcgcatg gctgtaatcc tggctactca ggaggccgag gcagaagaat tgcttgaact 1920 ggggaggcag aggttgcggt gagcccagat cgcgccattg cactccagcc tgggtaacaa 1980 gagcaaaact ctgtccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2016

<210 > 8<211> 20

<212 > DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 8

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<210> 9

<211> 20

<212 > DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 9

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<210 > 10

<211> 20

<212 > DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 10

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<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 11

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<210> 12<211> 20

<212 > DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 12

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<210> 13<211 > 20<212 > DNA<213 > Seqüência Artificial

<220 >

<223> Sintetizado quimicamente <4 0 0 > 13taaccagggg cttgtgaggc 2 0

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<220 >

<223> Sintetizado quimicamente <4 0 0 > 14

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<210> 15<211> 19<212 > DNA<213 > Seqüência Artificial

<22 0 >

<223> Sintetizado quimicamente <4 0 0 > 15

ctgccagccc tcttccatc 19

<210 >

16<211> 702 <212 > DNA <213> Camundongo

<400 > 16

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Claims (47)

1. Anticorpo isolado, que se liga a um antígeno de Receptor de Fator de Necrose Tumoral 2 5 (TNFR2 5), caracterizado pelo fato de ser capaz de atuar como um agonista de TNFR25.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser capaz de aumentar a expansão de célula CD8 OT-I quando da preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o antígeno de Receptor de Fatorde Necrose Tumoral 2 5 (TNFR2 5) ser humano ou de camundongo.

4. Toxina específica para Receptor de Fator de Necrose Tumoral 25 (TNFR2 5), caracterizada pelo fato de compreender um agente tóxico ligado a um polipeptídeo que se liga ao receptor TNFR2 5.

5. Toxina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de dito polipeptídeo compreender o anticorpo monoclonal 4C12 ou uma porção imunoespecífica do mesmo.

6. Toxina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de dito agente tóxico ser selecionado do grupoconsistindo de um isótopo radioativo, ricina, abrina, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, e íon metálico.

7. Toxina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de dito polipeptídeo compreender uma proteínaTLlA de uma porção ligante a TNFR2 5 da mesma.

8. Método para ativar o Receptor de Fator de Necrose Tumoral (TNFR2 5), expressado numa célula, caracterizado pelo fato de compreender:a). contatar a célula com um agonista de TNFR2 5, sendo que dito agonista é selecionado do grupo consistindo de:i. um anticorpo monoclonal 4C12;ii. um anticorpo que se liga a um Receptor de Fator de Necrose Tumoral 25 (TNFR25), sendo que dito anticorpo écapaz de aumentar a expansão de células OT-I CD8 quando da preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle;iii. um TLlA solúvel;iv. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um anticorpo de agonista de TNFR25;v. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um TLlA solúvel; e vi. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um TNFR2 5; b. observar um aumento na sinalização do receptor TNFR25.

9. Anticorpo isolado, que se liga a um antígeno de Receptor de Fator de Necrose Tumoral 25 (TNFR25), caracterizado pelo fato de ser capaz de atuar como um antagonista de TNFR25.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ligar-se a um antígeno de TL1A,sendo que dito anticorpo é capaz de reduzir a expansão de célula CD8 OT-I quando da preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de dito antígeno de Receptor deFator de Necrose Tumoral 25 (TNFR2 5)ser humano ou de camundongo.

12. Método para inibir a sinalização do Receptor de Fator de Necrose Tumoral 25 (TNFR2 5) numa célula, caracterizado pelo fato de compreender:a. contatar a célula com um antagonista de TNFR2 5, sendo que dito agonista é selecionado do grupo consistindo de:i. um anticorpo monoclonal L4G6ii. um anticorpo que se liga ao Receptor de Fator de Necrose Tumoral 25 (TNFR25), sendo que dito anticorpo écapaz de reduzir a expansão de célula CD8 OT-I quando da preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle;iii. um anticorpo específico para TLlA solúvel;iv. uma proteína de fusão compreendendo uma porção extracelular de TNFR25;v. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica da porção extracelular deTNFR25;v. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um anticorpo específico para TLlA solúvel; e vi. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de L4G6;b. observar uma redução na sinalização de receptor TNFR25.

13. Vacina antitumoral, caracterizada pelo fato de compreender um antígeno tumoral e um agonista de TNFR2 5como modificador de resposta biológica.

14. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de dito agonista de TNFR25 ser selecionado do grupo consistindo de:a. um anticorpo monoclonal 4C12; b. um anticorpo que se liga a um Receptor de Fator de Necrose Tumoral 25 (TNFR25), sendo que dito anticorpo é capaz de aumentar a expansão de célula CD8 OT-I quando da preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle; c. um TLlA solúvel;d. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um anticorpo de agonista de TNFR25;e. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um TLlA solúvel; ef. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de TNFR25.

15. Vacina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de compreender ainda um adjuvante.

16. Método para imunizar um paciente contra tumor, caracterizado pelo fato de compreender isolar um antígeno tumor-específico de dito tumor, e administrar ao paciente uma vacina antitumoral, conforme definida na reivindicação 14.

17. Método para tratar câncer num paciente, caracterizado pelo fato de compreender a depleção de células T CD4+/CD25+ reguladoras (Tregs) num paciente, provendo ao paciente umacomposição que compreende a toxina, conforme definida na reivindicação 4; e prover um agente quimioterápico ao paciente.

18. Método para tratar e/ou prevenir inflamação intestinal, 5 caracterizado pelo fato de compreender prover a um pacientenecessitado uma quantidade eficaz de uma composição terapêutica compreendendo um agonista de TNFR25.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de a condição de inflamação intestinal serselecionada do grupo consistindo de doença intestinal inflamatória, doença de Crohn e colite ulcerativa.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de dito agonista de TNFR25 ser selecionado do grupo consistindo dea. TLlA solúvelb. um anticorpo monoclonal 4C12c. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um anticorpo de agonista de TNFR25;d. um vetor de expressão com um cassete de expressão capazde ativar a expressão transgênica de um TLlA solúvel; e e. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um TNFR25.

21. Composição terapêutica para a facilitação de um 25 transplante de órgão, caracterizada pelo fato decompreender um antagonista de TNFR2 5 e um imunossupressor.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de o imunossupressor ser selecionado do grupo consistindo de glucocorticóide,azatioprina, metotrexato, ciclosporina, ciclofosfamida, mercaptopurina, tacrolimus e micofenolato mofetil.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de dito antagonista de TNFR25 ser selecionado do grupo consistindo de:a. um anticorpo monoclonal L4G6b. um anticorpo que se liga a um Receptor de Fator de Necrose Tumoral 2 5 (TNFR2 5) e que é capaz de reduzir aexpansão de célula CD8 OT-I quando da preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle;c. um anticorpo específico para TLlA solúvel;d. uma proteína de fusão compreendendo uma porção extracelular de TNFR2 5;e. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica da porção extracelular de TNFR2 5;f. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de um anticorpo específico para TLlA solúvel; eg. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de L4G6.

24. Método para transplantar um tecido de um doador para um hospedeiro, caracterizado pelo fato de compreender:a. obter o tecido do doador;b. prover ao hospedeiro a composição, conforme definida na reivindicação 21;c. transplantar o tecido no hospedeiro.

25. Método para inibir a expressão clonal de uma população de células T CD8 cognatas, caracterizado pelo fato de compreender:a. expor as células T CD8 a seu antígeno cognato; e b. expor as células T CD8 a um antagonista de TNFR25.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de dito antagonista de TNFR25 ser selecionado do grupo consistindo de:a. um anticorpo monoclonal L4G6b. um anticorpo que se liga a um Receptor de Fator de Necrose Tumoral (TNFR25), sendo que dito anticorpo é capaz de reduzir a expansão de célula CD8 OT-I quando da preparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle; c. um anticorpo específico para TLlA solúvel;d. uma proteína de fusão compreendendo uma porção extracelular de TNFR25;e. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica da porção extracelular de TNFR25;f. um vetor de expressão com um cassete de expressão, capaz de ativar a expressão transgênica de um anticorpoespecífico para TLlA solúvel; eg. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica de L4G6.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de o antígeno cognato estar associado com otecido a ser transplantado de um doador para um hospedeiro.

28. Método para tratar e/ou prevenir inflamação pulmonar, caracterizado pelo fato de prover a um paciente necessitado uma quantidade eficaz de uma composição terapêutica compreendendo o antagonista de TNFR25.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de dita condição inflamatória ser resultado de asma.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de o antagonista de TNFR25 ser selecionado dogrupo consistindo de:a. um anticorpo monoclonal L4G6b. um anticorpo que se liga a um Receptor de Fator de Necrose Tumoral 25 (TNFR25), sendo que dito anticorpo é capaz de reduzir a expansão de célula CD8 OT-I quando dapreparação cruzada através de gp96-Ig-ovalbumina em relação a um anticorpo de controle;c. um anticorpo específico para TLlA solúvel;d. uma proteína de fusão compreendendo uma porção extracelular de TNFR2 5;e. um vetor de expressão com um cassete de expressão capaz de ativar a expressão transgênica da porção extracelular de TNFR25;f. um vetor de expressão com um cassete de expressão, capaz de ativar a expressão transgênica de um anticorpoespecífico para TLlA solúvel; eg. um vetor de expressão com um cassete de expressão capazde ativar a expressão transgênica de L4G6.

31. Antagonista de TNFR25 isolado, caracterizado pelo fato de compreender um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico compreendendo uma seqüência que hibridiza sob condições estringentes com as SEQ ID NOS: 4, 5, 6 e/ou 16, e sendo que dita seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína TLlA.

32. Antagonista, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de dita seqüência hibridizar sobcondições estringentes com a SEQ ID NO: 4.

33. Antagonista, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de dita seqüência hibridizar sob condições estringentes com a SEQ ID NO: 5.

34. Antagonista, de acordo com a reivindicação 31, 15 caracterizado pelo fato de dita seqüência hibridizar sobcondições estringentes com a SEQ ID NO: 6.

35. Antagonista, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de dito TLlA ser TLlA humano.

36. Antagonista, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de dito TLlA ser TLlA decamundongo.

37. Método para tratar e/ou prevenir inflamação pulmonar, caracterizado pelo fato de prover a um paciente necessitado uma quantidade eficaz de uma composição terapêutica compreendendo o antagonista de TNFR25, conforme definido na reivindicação 31.

38. Método para transplantar um tecido de um doador para um hospedeiro, caracterizado pelo fato de compreender:a. obter o tecido do doador;b. prover ao hospedeiro o antagonista de TNFR2 5, conformedefinido na reivindicação 31; c. transplantar o tecido para o hospedeiro.

39. Composição, caracterizada pelo fato de compreender um polipeptídeo codificado por uma seqüência que hibridiza sobcondições estringentes com as SEQ ID NOs: 3 e/ou 7, e sendo que dita seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de receptor TNFR25; e umagente tóxico.

40. Composição, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de dito agente tóxico ser selecionado do grupo consistindo de isótopo radioativo, ricina, abrina, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, e íon metálico.

41. Método para tratar câncer num paciente, caracterizado pelo fato de compreender a depleção de células T CD4+/CD25+ reguladoras (Treg) de um paciente, provendo ao paciente uma composição compreendendo a toxina, conforme definina na reivindicação 39; e prover um agente quimioterápico a um paciente.

42. Método para tratar e/ou prevenir inflamação intestinal, caracterizado pelo fato de compreender prover a um paciente necessitado uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um polipeptídeo codificado por uma seqüência que hibridiza sob condições estringentes com as SEQ ID NOs: 3 e/ou 7, e sendo que dita seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de receptor TNFR25.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de dita inflamação intestinal estar associada com a síndrome do intestino irritável.

44. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de dita inflamação intestinal ser doença deCrohn.

45. Vacina antitumoral, caracterizada pelo fato de compreender um antígeno tumoral e um polipeptídeo codificado por uma seqüência que hibridiza sob condições estringentes com as SEQ ID NOS: 3 e/ou 7, e sendo que ditaseqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de receptor TNFR2 5, como modificador de resposta biológica.

46. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de ácido nucleico que hibridizasob condições estringentes com as SEQ ID NOs: 3 e/ou 7, e sendo que dita seqüência codifica uma seqüência deaminoácido capaz de ligar-se a uma proteína de receptor TNFR25.

47. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes com as SEQ ID NOs: 4, 5 e/ou 16, e sendo que dita seqüência codifica uma seqüência de aminoácido capaz de ligar-se a uma proteína TL1A.