BRPI0617342A2

BRPI0617342A2 - grÂnulos estÁveis, durÁveis com agentes ativos

Info

Publication number: BRPI0617342A2
Application number: BRPI0617342-0A
Authority: BR
Inventors: Nathaniel T Becker; Kathleen A Clarkson; Douglas Dale; Beth Fryksdale; Mark S Gebert; Michael Partsuf; Troels Gravesen
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2011-07-26
Also published as: EP2497370A3; EP2497374A2; EP2497379A3; CN101287381B; CA2625557C; DK201300009U1; US20100124586A1; US20150030679A1; EP2497370A2; EP2497376A2; RU2415602C2; EG25772A; KR20140033253A; EP2497371A2; MX354218B; EP2497373A3; AU2006299824A1; KR20080059198A; HK1174209A1; DE202006021153U1

Abstract

<B>GRÂNULOS ESTAVEIS, DURÁVEIS COM AGENTES ATIVOS<D>A presente invenção refere-se a um grânulo durável, estável para composições alimentícias que tem um núcleo, pelo menos um agente ativo; e pelo menos um revestimento, O agente ativo do grânulo retém pelo menos 50% da atividade, pelo menos 60% da atividade, pelo menos 70% da atividade, pelo menos 80% da atividade após as condições selecionadas a partir de um ou mais dos a) processos de formação de péletes de alimentação, b) processos de pré-tratamento de alimento aquecido a vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não-peletizada, e e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura de base de alimentação ou uma pré-mistura de alimentação compreendendopelo menos um composto selecionado a partir de minerais traço, ácidos orgânicos, açúcares de redução, vitaminas, cloreto de colina, e composições que resultam em uma mistura de base de alimentação ácida ou básica ou pré-mistura de alimentação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GRÂNULOSESTÁVEIS, DURÁVEIS COM AGENTES ATIVOS".

Nathaniel T. Becker

Kathleen A. Clarkson

Douglas A. Dale

Beth Fryksdale

Mark S. Gebert

Troels Gravesen

Michael Partsuf

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade de acordo com 35 U.S.C. §119para o Pedido Provisório U.S. Ne de Série 60/726.494, depositado em 12 deOutubro de 2005.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos grânulos estáveis, duráveiscom agentes ativos. Especificamente, a invenção refere-se aos grânulostermoestáveis, duráveis com agentes ativos, os grânulos que são particular-mente apropriados para inclusão nos processos de tratamento a vapor, in-cluindo processos de formação de péletes e de comprimidos e processa-mento de alimento a vapor, sem perdas significativas da atividade do agenteativo. Os grânulos estáveis, duráveis têm perfis de dissolução apropriadospara liberar o agente ativo para prover eficácia para seu propósito pretendi-do. A atividade dos agentes ativos é conservada em seguida ao armazena-mento em misturas não-peletadas e tratamento a vapor.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O uso de agentes ativos, tais como enzimas, na alimentação a-nimal é comum. As enzimas são conhecidas para melhorar a digestibilidadedo alimento, reduzir os fatores antinutritivos na alimentação, e melhorar aprodutividade do animal. Sabe-se que a indústria de ingredientes de alimen-tação acídicos e básicos como também ingredientes particulares de alimen-tos de animais, incluindo, mas não limitado a traçar minerais, ácidos ou ba-ses orgânicos ou inorgânicos, reduzir açúcares e substâncias higroscópicas,particularmente cloreto de colina e cloreto de sódio, têm um efeito adversosobre agentes ativos tais como outras vitaminas, proteínas, antimicrobianos,prebióticos, probióicos e enzimas; e, é também sabido que algums proces-sos de produção de alimento são prejudiciais aos agentes ativos.

Existe um problema na indústria para prover formulações prote-toras para fazer os agentes ativos apropriados para armazenamento em mis-turas de alimento animal não-peletizadas, tais como misturas e pré-misturasde base, que podem ser acídicas ou básicas e conter os ingredientes quetêm efeito adverso sobre a estabilidade dos agentes ativos. Um mecanismopara o efeito adverso é dito ser as reações de oxidação-redução (redox) queocorrem entre oxidizar e reduzir compostos em pré-misturas na presença deágua. Um estudo relatado no BASF Technical Bulletin NU0013 reporta queduas enzimas comercialmente disponíveis contendo grânulos retiveram, res-pectivamente, atividade de 86% e 81% depois de ficarem armazenadas du-rante 3 semanas em uma pré-mistura de alimento, e atividade de 55% e33%, respectivamente, depois de armazenadas na pré-mistura de alimentosdurante 6 semanas. Atualmente alguns fabricantes de enzimas para a indús-tria de alimentos recomendam que as enzimas sejam protegidas com emba-lagens de barreira se tiverem que ser armazenados em pré-misturas, ou quetenham de ser aramazenados separadamente das pré-misturas, ou que elastenham que ser aramazenados em pré-misturas apenas por um curto perío-do de tempo.

Adicionalmente, muitos agentes ativos usados em alimentos ealimentação são instáveis ao calor. A estabilidade térmica de enzimas e suacapacidade de sobreviver às etapas de processamento por calor na fabrica-ção de alimentação animal é um problema na indústria, particularmente naprodução de péletes para alimentação animal. Quando comparadas com asmisturas de alimentação seca, os péletes de alimentação têm propriedadesque são favorecidas pela indústria, tais como qualidade de alimentação me-lhorada, diminuição de patógenos, níveis de poeira mais baixos durante afabricação, boa manipulação, e dosagem dos ingredientes mais uniforme.Os processos de formação de pélete preferidos na indústria utilizam injeçãode vapor, em um processo conhecido como condicionador, que adiciona u-midade e eleva a alvo antes da etapa de formação de pélete, o que depoisforça os ingredientes de alimentação aquecidos a vapor, ou massa condicio-nada, através de um corante. As alvos do processo de formação de péletes podem ser a partir de cerca de 70°C a 95°C, ou mais elevadas.

As enzimas são ingredientes de alimentação importantes e de-vem ser capazes de resistir ao aumento de alvos de processamento maisaltas usadas nos processos de formação de péletes, particularmente naque-les processos que empregam dilatadores, enquanto continuam a distribuir eficácia in vivo.

Por causa do vapor, alvos e forças de compressão usadas nosprocessos de formação de péletes, a estabilidade de enzimas e outros agen-tes ativos é um problema que é ilustrado pelo fato de que as enzimas de a-limentação são muitas vezes providas para a indústria como produtos delíquido estabilizado que são adicionados aos péletes de alimentação depoisdo processo de formação de péletes para evitar a inativação da enzima. Adosagem homogênea é um problema quando a enzima é aplicada após aformação dos péletes, por exemplo, através de dispersão da enzima sobreos péletes, e o custo do equipmento para adicionar enzima pós-formação depéletes é alto. Alternativamente, formulações de enzima líquida, ou formula-ções de enzima misturadas a seco são adicionadas ao misturador antes daformação de péletes. Em certas ocasiões, níveis mais altos de enzimas doque o necessário podem ser adicionados a fim de compensar as perdas du-rante a formação dos péletes.

Processos de formação de comprimidos também utilizam forçasde compressão e podem ou não empregar calor. Os comprimidos são usa-dos em indústrias de cuidados domésticos, por exemplo, em lavanderia, a-plicações de limpeza de pratos e superfícies.

Nas indústrias de alimentos, alimentação e cuidados domésticos existe uma necessidade de grânulos estáveis e duráveis com ingredientesativos para servirem como componentes em formulações que estão sujeitasa tratamento a vapor, por exemplo, processos para formação de péletes efabricação de comprimidos, sem perda apreciável da atividade do agenteativo, e com perfis de dissolução apropriados para liberar os ingredientesativos para prover eficácia para seus propósitos pretendidos. Existe tambémuma necessidade de grânulos estáveis, duráveis com agentes ativos queretenham a atividade deles quando usados como ingredientes em formula-ções de alimentação animal, tais como misturas não-peletadas, que contêmingredientes que afetam adversamente os agentes ativos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos grânulos para composiçõesde alimentação que compreendem: um núcleo; um agente ativo; e pelo me-nos um revestimento, o agente ativo do grânulo retendo pelo menos 50% deatividade, pelo menos 60% de atividade, pelo menos 70% de atividade, pelomenos 80% de atividade após condições selecionadas a partir de um oumais de a) um processo de formação de pélete para alimentação, b) um pro-cesso de pré-tratamento de alimentação aquecida a vapor, c) armazenamen-to, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura de não-peletização, e) armazenamento como um ingrediente em um misturador debase de alimentação ou um pré-misturador de alimentação, compreendendopelo menos um composto selecionado a partir de minerais de micronutrien-tes, ácidos orgânicos, açúcares de redução, vitaminas, cloreto de colina, ecompostos que resultam em uma mistura de alimentação básica ou acídicaou pré-mistura de alimentação.

Em uma modalidade da presente invenção um grânulo para ali-mentação animal é provido compreendendo: um núcleo; um agente ativo,um agente ativo do grânulo retendo pelo menos 80% de atividade depois doarmazenamento e depois do processo de formação de pélete aquecida avapor em que o grânulo é um ingrediente; um revestimento de barreira deumidade; e um revestimento de hidratação de umidade que é pelo menos25% em p/p do grânulo, o grânulo tendo uma atividade de água de menosdo que 0,5 antes do processo de formação de pélete aquecido a vapor.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, um ingredien-te de alimentação de animal é provido compreendendo: um grânulo quecompreende um núcleo; um agente ativo envolvendo o núcleo; e pelo menosum revestimento envolvendo o agente ativo, o agente ativo retendo pelo me-nos 50% da atividade, pelo menos 60% da atividade, pelo menos 70% daatividade, pelo menos 80% da atividade após condições selecionadas a par- tir de um ou mais de a) um processo de formação de pélete de alimentação,b) um processo de pré-tratamento de alimentação aquecido a vapor, c) ar-mazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em um mistura denão-peletizada e e) aramazenamento como um ingrediente em uma misturade base de alimentação ou uma pré-mistura de alimentação contendo pelomenos um compsto selecionado de minerais micronutrientes, ácidos orgâni-cos, redução de açúcares, vitaminas, cloreto de colina, e compostos queresultam em uma mistura de base de alimentação acídica ou básica ou pré-mistura de alimentação.

Em um processo da presente invenção para produzir um grânulo compreendendo um agente ativo para alimentação, o processo compreende:preparar grânulos estáveis que têm um núcleo, pelo menos um agente ativo,e pelo menos um revestimento; misturar os grânulos estáveis junto com umou mais de a) um diluente, b) uma mistura de base, c) uma pré-mistura, e d)uma mistura de alimentação para formação de pélete.

Em outra modalidade da presente invenção, é provido um pro-cesso para fazer um grânulo estável compreendendo enzima para armaze-namento em uma pré-mistura de alimentação que compreende cloreto decolina, o processo compreendendo: prover um material e enzima de núcleo,a enzima distribuída por todo ou material de núcleo ou colocada em cama- das sobre o material de núcleo; aplicar para o material de núcleo e a enzimaum material de hidratação de umidade para formar uma camada que é pelomenos 25% em p/p do grânulo estável; revestir a camada com um materialde barreira de umidade para formar um revestimento que é pelo menos 2%em p/p do grânulo, a aplicação e o revestimento sob condições selecionadas de tal modo que uma atividade de água do grânulo estável é inferior a 0,5.

Grânulos estáveis, duráveis das modalidades acima retêm pelomenos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo me-nos 90%, e pelo menos 95% de atividade de agente ativo sob condições deformação de pélete aquecida a vapor ou processos de pré- tratamento queelevam a alvo do material peletizado a uma altura de 85°C até cerca de95°C durante até cerca de diversos minutos. Os grânulos estáveis, duráveisda presente invenção são particularmente apropriados como ingredientesem péletes de alimentação animal, e como ingredientes em comprimidos decuidados domésticos.

Em modalidades da presente invenção, grânulos estáveis durá-veis incluem um material de hidratação dê umidade que constitui pelo menoscerca de 55% em p/p do grânulo.

Em outras modalidades da presente invenção, um grânulo está-vel durável tem um revestimento de hidratação de umidade que compreendepelo menos cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cer-ca de 50%, cerca de 55%, e cerca de 60% em p/p do grânulo e um revesti-mento de barreira de umidade que compreende pelo menos cerca de 2% acerca de 40% em epso/peso, cerca de 2% a cerca de 10%, cerca de 2% acerca de 7%, e cerca de 5% a cerca de 15% do grânulo.

Em modalidades da presente invenção, grânulos estáveis durá-veis incluem três revestimentos protetores em que um revestimento compre-ende cerca de 20% a 25% em p/p do grânulo de um material de hidrataçãode umidade e os dois outros revestimentos compreendem cerca de 5% acerca de 15% em p/p do grânulo de um material de barreira de umidade.Nessa modalidade, uma etapa de processamento de recozimento por calor éusada para o cozimento do material de barreira de umidade.

Nas modalidades da presente invenção, um grânulo estável du-rável compreende um núcleo de silicato ou argila e um agente ativo estávelinerentemente térmico dentro de uma matriz; um revestimento protetor dehidratação de umidade de sal inorgânico opcional; e um revestimento de bar-reira de umidade opcional. Nesta modalidade, as camadas de revestimentoopcional constituem cerca de 0% a cerca de 15% em p/p do grânulo.

A presente invenção adicionalmente inclui métodos para fabri-cação de grânulos estáveis, duráveis como também de péletes de alimenta-ção, alimento para animal doméstico, e cuidados domésticos e comprimidosde alimento contendo tais grânulos estáveis, duráveis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção provê grânulos estáveis, duráveis com a -gentes ativos que resistem a alvos elevadas e forças de compressão, quan-do adicionadas às formulações sujeitas a, por exemplo, pré-tratamentos a-quecidos a vapor, processos de formação de pélete e processos de forma-ção de comprimidos, enquanto mantêm perfis de dissolução estáveis paraagentes ativos de liberação que são capazes de prover eficácia para seus propósitos pretendidos.

Um primeiro aspecto da presente invenção surpreendentementeprovê grânulos estáveis duráveis com agentes ativos de alimentação resis-tentes a pré-tratamentos a vapor e alvos de processos por aquecimento avapor para formação de péletes e forças de compressão, enquanto mantêm perfis de dissolução que liberam os agente ativos de alimentação de forne-cem a eficácia pretendida. Nessa modalidade, os componentes do grânulopreferivelmente são aprovados para uso na alimentação.

Um segundo aspecto da presente invenção provê grânulos es-táveis, duráveis com enzimas que resistem a alvos dos processos de forma-ção de péletes de pré-tratamento de alimentação aquecida a vapor e forçasde compressão, enquanto mantêm perfis de dissolução que liberam a enzi-ma para prover eficácia de biodisponibilidade in vivo. Nesta modalidade, oscomponentes do grânulo são comestíveis pelos animais, e preferivelmentesão também digeríveis.

Um terceiro aspecto da presente invenção provê grânulos está-veis, duráveis com agente ativos para misturas não-peletadas de formaçãode alimentação, por exemplo, pré-misturas. Os grânulos estáveis, duráveisretêm eficácia quando a mistura de não-peletada é aquecida e pré-tratada avalor antes de alimentar os animais, ou depois da mistura de não- peletizadas ser peletizada. Neste aspecto da invenção, surpreendentemente,os agentes ativos mantêm a atividade quando armazenados em misturasnão-peletizadas que contêm ingredientes que são prejudiciais à estabilidadeda enzima. Neste aspecto da invenção, sem querer estar preso a qualquerteoria em particular, acredita-se que um material hidratante de umidade nosgrânulos atua em combinação com um material de barreira de umidade nosgrânulos para proteger o ingrediente ativo de ingredientes prejudiciais nasmisturas de não-peletização. O material de hidratação por umidade retardaou reduz a taxa ou extensão da migração de água para dentro da área doagente ativo, e o material de barreira de umidade exclui a água. A combina-ção do material de hidratação por umidade com o material de barreira deumidade provê estabilidade mecânica para adicionalmente proteger o agente ativo, no caso de uma camada de material de barreira de umidade ser dani-ficado. Adicionalmente, em algumas modalidades da presente invenção, ma-teriais de barreira de umidade que são usados oxidam somente sob condi-ções extremas, desse modo em combinação com materiais de hidrataçãopor umidade, os grânulos são quimicamente estáveis porque acredita-se queas reações redox são reduzidas durante o armazenamento dos grânulo semmateriais não-peletizados.

Um quarto aspecto da presente invenção provê grânulos está-veis, duráveis com agentes ativos que resistem a procedimentos de forma-ção de comprimidos enquanto mantêm os perfis de dissolução que liberam oagente ativo para prover eficácia em aplicações de cuidados domésticos,tais como lavagem de roupa, aplicações para limpeza de pratos e superfí-cies. Nessa modalidade, os componentes dos grânulos podem incluir mate-riais que não são diferidos pelos animais, por exemplo, tensoativos, zeólitos,materiais de branquear, e corantes.

Os grânulos estáveis, duráveis da presente invenção são grânu-los esféricos ou quase esféricos, embora outras formas tais como discos,ovais, cilíndricas e formas oblongas podem ser úteis, se desejado. Os grânu-los têm um ou mais revestimentos protetores envolvendo o agente ativo.

Os grânulos podem ser misturados junto com ingredientes se-cos, tais como formulações de alimentação e de cuidados domésticos oumistura de alimentação não-peletizadas, por exemplo, formulações de pré-misturas, antes de usar em um processo de formação de comprimidos ou depéletes, ou usado em misturas de alimentação seca e misturas que não sãopeletizadas. Os grânulos são particularmente apropridos para uso em pro-cessos de fabricação de formação de péletes de alimentação, e são tambémapropriados para alimentos, incluindo alimento para animais domésticos, e processos de fabricação de comprimidos para cuidados domésticos.

A menos que seja de outra maneira definido, todos os termostécnicos e científicos usados aqui a seguir têm o mesmo significado comohabitualmente compreendido pela pessoa de habilidade comum na técnicapara o qual essa invenção diz respeito. Como usado nas especificações ereivindicações, o singular "um", "uma" e "o/a" inclui as referências no plural amenos que o contexto claramente indique o contrário. Por exemplo, o termogrânulo pode incluir uma pluralidade de grânulos.

Para fins desta descrição o "agente ativo" pode ser qualquermaterial que deve ser adicionado a um grânulo estável, durável. O agente ativo pode ser um material biologicamente viável, um ingrediente de alimentoou de alimentação, um agente antimicrobiano, um agente de substituiçãoantibiótica, um prebiótico, um probiótico, um ingrediente agroquímico, talcomo um pesticida, fertilizante ou herbicida; um ingrediente farmacêutico ouum ingrediente ativo para cuidados domésticos, ou combinações dos mes-mos. Em uma modalidade preferida, o ingrediente ativo é uma proteína, en-zima, peptídeo, polipeptídeo, amino ácido; carboidrato, lipídeo ou óleo, vita-mina, co-vitamina, ou hormônio, ou combinações dos mesmos. Em outramodalidade, o ingrediente ativo é uma enzima, um alvejante, ativador de al-vejante, perfume, ou outro ingredientes biologicamente ativo. Agentes ativosinerentemente termoestáveis são abrangidos pela presente invenção e exi-bem termoestabilidade aumentada nos grânulos da presente invenção.-Al-ternativamente, menos material de revestimento pode ser usado quandoprovendo grânulos com agentes ativos inerentemente termoestáveis, e asquantidades de material de revestimento protetor providas aqui a seguir fo-ram selecionadas principalmente para agentes ativos que não eram ineren-temente termoestáveis.

Ingredientes ativos mais preferidos para aplicações em alimen-tos e alimentação são enzimas, peptídeos e polipeptídeos, amino ácidos,antimicrobianos, agentes promotores de saúde intestinal, vitaminas, e com-binações dos mesmos.

Qualquer enzima pode ser usada, e uma lista de enzimas nãolimitante inclui fitases, xilanases, β-glucanases, fosfatases, proteases, amila-ses (alfa ou beta ou glucoamilases) celulases, lipases, cutinases, oxidases,transferases, reductases, hemicelulases, mananases, esterases, isomera-ses, pectinases, lactases, peroxidases, lactases, outras enzimas redox emisturas das mesmas.

As enzimas particularmente preferidas incluem uma xilanase deTrichoderma reesei de uma xilanae variante de Trichoderma reesei, ambasdisponíveis a partir de Danisco A/S, Denmark e/ou Genencor International,Inc., Palo Alto, Califórnia, ou a xilanase inerentemente termoestável descritaem EP1222256B1, como também outras xilanases de Aspergillus niger, As-pergillus kawaehii, Aspergillus tubigensis, Bacillus circulans, Bacillus pumi-lus, Bacillus subtilis, Neocallimastix patrieiarum, Penieillium species, Strep-tomyees lividans, Streptomyees thermoviolaeeus, Thermomonospora fusca,Triehoderma harzianum, Triehoderma reesei, Triehoderma vi ride; exemplosde fitases são Finase L®, uma fitase de Aspergillus sp., disponível de AB En-TMzimas, Darmstadt, Alemanha; Phyzyme XP, uma fitase de E. Coli, disponí-vel de Danisco, Copenhagen, Dinamarca, e outras fitases de, por exemplo,as seguintes espécies: Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Buttiauxella, Ci-trobacter, Enterobacter1 Penicillium, Humicola, Bacillus, e Peniophora.

Um exemplo de celulase é Multifect® BGL, uma celulase (beta glucanase), disponível de Danisco A/S, Dinamarca, e outras celulases deespécies tais como Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Humicola, Bacillus,Cellulomonas, Penicillium, Thermomonospore, Clostridium, e Hypocrea. Ascelulases e endoglucanases descritas em US20060193897A1 também po-dem ser usadas. Amilases podem ser, por exemplo, de espécies tais comoAspergillus, Trichoderma, Penicillium, Bacillus, por exemplo, B. subtilis, B.stearothermophilus, B. lentus, B. lieheniformis, B. eoagulans, e B. amyloli-quefaeiens. Amilases fúngicas apropriadas são derivadas de Aspergillus, taiscomo A. oryzae e A. niger. Proteases podem ser de Bacillus amyloliquefaei-ens, Bacillus lentus, Bacillus subtilis, Bacillus lieheniformis, e Aspergillus eTriehoderma speeies.

Fitases, xilanases, fosfatases, proteases, amilases, esterases,enzimas redox, lipases, transferases, celulases, e β-glucanases são enzimasfreqüentemente usadas para inclusão na alimentação animal. Enzimas apro-priadas para inclusão em comprimidos para aplicações de cuidados domés-ticos são similares, particularmente proteases, amilases, lipases, hemicelu-lases, enzimas de redox, peroxidases, transferases, e celulases.

Em aspectos particularmente preferidos da invenção, as enzi-mas são selecionadas a partir de fitases, xilanases, beta-glucanases, amila-ses, proteases, lipases, esterases, e misturas das mesmas. Em uma modali-dade da presente invenção, duas enzimas são fornecidas no grânulo, umaxilanase e uma beta-glucanase. As enzimas podem ser misturadas juntas ou aplicadas para o grânulo separadamente. Em outra modalidade, três enzi-mas são providas no grânulo, a saber beta-glucanase, xilanase e fitase.

As listas de enzimas acima são apenas exemplos e não signifi-cam que sejam exclusivas. Qualquer enzima pode ser usada nos grânulosduráveis da presente invenção, incluindo enzimas do tipo selvagem, recom- binantes e variantes de fontes bacteriana, fúngica, levêdo, planta, inseto eanimal, e enzimas de ácido, neutras ou alcalinas.

Será reconhecido por aqueles versados na técnica que a quan-tidade de enzima usada vai depender, pelo menos em parte, do tipo e daspropriedades da enzima selecionada e do uso pretendido.

Os grânulos duráveis da invenção incluem entre cerca de0,0005 a cerca de 20% em uma base de peso seco do componente da en-zima do grânulo. Por exemplo, a percentagem de peso da enzima em moda-lidades da invenção compreende pelo menos 0,0005 a cerca de 15%, pelomenos 0,001 a cerca de 15%, pelo menos 0,01 a cerca de 10%, pelo menos 0,1 a cerca de 10%, pelo menos 1,0 a cerca de 10%, pelo menos 1,0 a cercade 8%, pelo menos 1,0 a cerca de 5%, e pelo menos 2,0 a pelo menos 5%no grânulo. Doses típicas de 25 a 400 gramas dos grânulos de enzima está-veis, duráveis por tonelada de alimentação distribuirá cerca de 0,0001 a cer-ca de 80 gramas de proteína de enzima ativa por tonelada de alimentação, eos grânulos de enzima podem ser dosados até uma altura de 5000 gramaspor toneladas de alimento. Dosagens para outros ingredientes ativos tipica- mente são de 0,001 a cerca de 400 gramas/tonelada de alimento ou maiselevada. As dosagens podem ser ainda mais altas quando os grânulos ter-moestáveis da presente invenção são usados como um componente dasmisturadas não-peletizadas de alimentação animal, por exemplo, pré-misturas, que podem conter diversos agentes ativos e são adicionadas às composições de alimentação. Por exemplo, a dosagem dos grânulos de en-zima adicionados à pré-mistura pode ser de cerca de 0,2% a 10% da pré-mistura, ou cerca de 0,1% a cerca de 3% de uma mistura de base. Em umamodalidade exemplar, o nível de atividade de fitase contendo grânulos está-veis, duráveis armazenada em uma pré-mistura é cerca de 500 U/g, ou maisalta. As pré-misturas tipicamente são adicionadas à dieta em cerca de 0,5%a cerca de 2%, e misturas de base são adicionadas em cerca de 2% a cercade 6%.

A porção do grânulo durável, sem o(s) revestimento(s) prote-tores) da invenção, e compreendendo o ingrediente ativo, incluindo quais- quer sólidos de processamento, aglutinantes ou outros ingredientes naquelelugar, podem compreender menos do que cerca de 70%, menos de cerca de60%, menos de cerca de 50%, menos de cerca de 40%, menos de cerca de30%, and menos de cerca de 20% em peso do grânulo, com, geralmente, opercentual de peso sendo cerca de 25% a cerca de 50% em p/p, cerca de 40% a cerca de 60%, ou cerca de 50% a cerca de 60%.

A(s) camada(s) de revestimento pode(m) compreender mais doque cerca de 30%, mais do que cerca de 40%, mais do que cerca de 50%,mais do que cerca de 60%, mais do que cerca de 70%, e mais do que cercade 80% em peso do grânulo, com, geralmente, a percentagem de peso sen-do cerca de 50% a cerca de 75% em p/p, 40% a cerca de 60%, ou cerca de40% a cerca de 50%, dependendo do tipo e número de camadas de reves-timento.Para modalidades que utilizam um agente ativo inerentementetermoestável, o núcleo pode constituir cerca de 85 a cerca de 100% em p/pdo grânulo e o revestimento pode constituir cerca de 0% a cerca de 15% emp/p do grânulo.

Os grânulos duráveis da presente invenção podem ser dimensi-onados como desejado e estão entre cerca de 300 um a cerca de 1000 umem diâmetro, cerca de 300 um a cerca de 900 um, cerca de 400 um a cercade 800 um, e cerca de 400 um a cerca de 600 um.

"Forças de compressão" para fins desta descrição referem-se àsforças aplicadas em geral axialmente que fazem os átomos de um materialse compactarem. Forças de compressão, como usado aqui a seguir, ocor-rem em processos de formação de pélete e formação de comprimido e po-dem incluir um elemento de tensão flexural em que as forças aplicadas nãosão completamente simétricas com respeito ao eixo longitudinal do material.

Uma "enzima ou proteína inerentemente termoestável" refere-sea enzimas e proteínas que têm um ponto de fusão acima de cerca de 60°C acerca de 65°C, por exemplo, a enzima inerentemente termoestável utilizadana Tabela 2, para os grânulos 28, 29 e 30, tem um ponto de fusão de 69°Cem um pH de 5,5 e um ponto de fusão de 72°C em um pH de 8,0. Um núme-ro de enzimas termoinstáveis referidas em toda a especificação tinha, porexemplo, um ponto de fusão de menos de 60°C em valores de pH de 5,5 e8,0.

"Materiais de barreira contra umidade" referem-se aos materiaisque excluem, previnem ou substancialmente retardam a absorção da água.Esses materiais tipicamente são hidrofóbicos ou amfifílicos, provêm isola-mento contra a água e não absorvem inerentemente e/ou ligam a água éincluem, mas não estão limitados a materiais de formação de película. E-xemplos de materiais de barreira contra umidade incluem polímeros, proteí-nas, lipídeos, gorduras e óleos, ácidos graxos e gomas. Exemplos de mate-riais de barreira contra umidade para formação de película são polímerosnaturais e modificados, tais como goma arábica, soro, concentrado de prote-ína do soro, PVA, incluindo PVA modificado e polímeros sintéticos tais como,látex, HPMC, e amido de hidroxipropila de ácido adelgaçado, por exemplo,PureCote®, amido oxidizado, e amido modificado. Materiais de barreira con-tra umidade não formadores de película incluem, por exemplo, ceras, gordu-ras, óleos e lipídeos, e lecitina. Materiais de barreira contra umidade selecio-nados que não oxidam prontamente são, por exemplo, polímero de látex epolímeros tais como goma arábica.

"Materiais de hidratação de umidade" referem-se aos materiaisque absorvem líquidos aquosos, tais como água, por um dos diversos me-canismos. Em um primeiro mecanismo, os materiais absorvem água livre.Em um segundo mecanismo, os materiais absorvem água de fronteira quegeralmente está presente como águas cristalinas de hidratação. Por conse-guinte, os materiais podem ser providos como materiais parcialmente ou to-talmente hidratados ou como materiais não hidratados que absorverão ouligação líquidos aquosos e retardam ou reduzem a taxa ou extensão da mi-gração de tais líquidos para o agente ativo. Em um terceito mecanismo, osmateriais de hidratação de umidade isolam termicamente o agente ativo re-tardando a transferência de calor para o agente ativo dentro do grânulo emantendo o agente ativo em uma alvo mais baixa que a alvo na superfícieexterior do grânulo. Materiais de hidratação de umidade incluem carboidra-tos e sais inorgânicos, incluindo sais hidratados, tais como sulfato de mag-nésio, sulfato de sódio e sulfato de amônio; maltodextrina; açúcares, por e-xemplo, sacarose; e amido de milho.

Em modalidades exemplares da presente invenção, os matériasde hidratação de umidade são sais inorgânicos que, quando adicionados ao grânulo em mais do que cerca de 25% em p/p, são anidros ou contêmquantidades relativamente baixas de água limite ou livre de modo que a ati-vidade da água do grânulo completado é menos de 0,5. Sem querer ficarpreso a nenhuma teoria em particular, quando o grânulo é sujeito aos pro-cessos de aquecimento a vapor, o material de hidratação de umidade desal inorgânico começará a absorver a água do tratamento aquecido a vapor,a água se movendo para dentro do material de hidratação de umidade emum processo cinético, durante um período de tempo curto do tratamento avapor para evitar que a água penetre numa área do grânulo que possui oagente ativo. Nessas modalidades com uma atividade de água do grânulo demenos de 0,5 o material de hidratação da umidade pode constituir tão poucoquanto 25% em p/p do grânulo. Em modalidades com material de hidratação da umidade constituindo cerca de 40-70% em p/p do grânulo, a camadamais espessa do material de hidratação da umidade leva em conta o uso demateriais hidratados ou parcialmente hidratados, particularmente sais inor-gânicos. Para as finalidades desta descrição, "hidratado", "parcialmente hi-dratado", e "não-hidratado" referem-se ao potencial de hidratação de um ma· terial quando o grânulo está em equilíbrio antes de ser submetido ao aque-cimento a vapor. Um material "hidratado" refere-se a um material que con-tém água em uma forma livre ou ligada, ou uma combinação das mesmas. Aágua pode ser adicionada tanto durante como depois dos processos de re-vestiento e o grau de hidratação do grânulo é uma função dos materiais doe grânulo e das condições de alvo, humidade e secagem sob as quais ele áaplicado.

"Péletes" e "Formação de péletes" referem-se a comprimidos oupéletes sólidas redondas, esféricas e cilíndricas e aos processos dar taisconformações sólidas, particularmente péletes e sólidos de alimentação e alimentação animal extrudada. Processos de fabricação peletizada de ali-mentação conhecidos geralmente incluem misturar em conjunto os ingredi-entes de alimentação durante cerca de 1 a cerca de 5 minutos, transferindoa mistura para uma coluna amortecedora, transportando a mistura para umcondicionador a vapor, opcionalmente transferindo a mistura condicionada a vapor para um ampliador, transferindo a mistura para um extrusor ou Iami-nador de pélete, e finalmente transferindo os péletes para dentro de um re-frigerador de pélete. Fairfield, D. 1994. Chapter 10, Pelleting Cost Center. InFeed Manufacturing Technology IV. (McEIlhiney, editor), American Feed In-dustry Association, Arlington, VA, pp. 110-139.

O condicionador a vapor trata a mistura durante cerca de 20 acerca de 90 segundos e até diversos minutos, em cerca de 85°C a cerca de95°C. A quantidade de vapor pode variar de acordo com a quantidade deumidade e a alvo inicial para a mistura de alimentação. Cerca de 4% a cercade 6% de vapor adicionado foi relatado em processos de peletização, e aquantidade é selecionada para produzir menos de cerca de 18% de umidadena mistura antes da peletização, ou até cerca de 28% de umidade na mistu- ra pretendida para extrusão.

Um processo de prolongador opcional ocorre durante cerca de 4a cerca de 10 segundos em uma faixa de alvo de cerca de 100°C a cerca de140°C. A porção de Iaminador de pélete do processo de fabricação tipica-mente opera durante cerca de 3 a cerca de 5 segundos em uma alvo de cer- ca de 85°C a cerca de 95°C.

Um grânulo "estável" refere-se a um grânulo em que a atividadedo(s) agente(s) ativo(s) é substancialmente mantida após a inclusão de umingrediente na formulação submetida aos processos de pré-tratamento a-quecido a vapor, processos de peletização aquecida a vapor, processos deformação de comprimidos aquecidos a vapor, após aramzenamento sozi-nhos e armazenamento como um ingrediente em misturas não-peletizadas enão formadoras de comprimidos. Estabilidade inclui termoestabilidade, prazode validade ou estabilidade de armazenamento, estabilidade mecânica, e/ouestabilidade química, quando o agente ativo contém grânulos, são armaze- nados em misturas não-peletizadas e não formadoras de comprimidos e/ousubmetidas a aquecimento a vapor e processos de peletização pressuriza-dos e processos de formação de comprimidos. Estabilidade mecânica refere-se à robustez física ou integridade estrutural de grânulos, em que a integri-dade estrutural inclui resistência à microbios, resistência à produção de poei-ra, e resistência para liberar ingredientes que podem resultar na produção deodores. A estabilidade química refere-se à manutenção substancial da ativi-dade quando os grânulos são armazenados em misturas não-peletizadase/ou não formadoras de comprimidos com ingrediente(s) prejudicial(ais)ao(s) agente(s) ativo(s). Termoestabilidade é definido ainda aqui a seguir, e geralmente refere-se à manutenção da atividade que segue a exposição aalvos até cerca de 85°C a 95°C quando os grânulos estáveis, duráveis sãoum ingrediente de péletes, comprimidos e misturas não-peletizadas e nãoformadoras de comprimidos.

"Formação de comprimidos" refere-se aos processos para for-mar balas ou comprimidos sólidos comprimindo uma mistura de ingredientesem uma prensa de comprimidos como descrito em EP 1 257 631B1, que épelo presente incorporado por referência.

Os comprimidos podem ser feitos pela formação de comprimi-dos por compressão direta de misturas de agentes ativos, agentes de en-chimento/aglutinantes, lubrificantes, e quaisquer outros ingredientes opcio-nais. O componente do agente ativo é misturado completamente com os ou-tros ingredientes de formação de comprimidos antes de entrar na máquinade comprimidos. Os ingredientes são combinados em qualquer dispositivode mixagem apropriado, tais como um misturador de invólucros gêmeos ouaparelho similar, ou usando qualquer método de mixagem que resulte namistura dos ingredientes do comprimido.

As misturas são depois comprimidas em comprimidos, usandoqualquer aparelho de formação de comprimidos, tais como uma prensa decomprimido (Stokes Model R-4, Warminster, PA). As prensas de comprimi-dos geralmente têm furadores correspondentes às formas superior e inferior,que se encaixam em um pequeno cubo de cima e abaixo do cubo. O materi-al de formação do comprimido misturado é inserido na cavidade do cubo epelo menos um dos furadores, tipicamente o furador superior, entra na cavi-dade do cubo. É aplicada uma pressão em ambos, furador superior e inferi-or. A ação dos furadores superior e inferior se movimenta um em direção aooutro, aplicam pressão ao material entre os furadores, dessa maneira for-mando um comprimido.

Uma grande variedade de formatos de comprimidos pode serfeita. A forma do comprimido é determinada pela maneira de trabalhar comas ferramentas dos furadores. As forças de compactação variam, dependen-do da geometria do furo, tipo de instrumento e formulação usada. Alternati-vãmente, os comprimidos podem ser feitos usando procedimentos de granu-lação seca ou úmida como descrito na Patente US Ne 6.852.336, que estáincorporada ao presente por referência aqui a seguir em sua totalidade. Apatente '336 estabelece que os procedimentos de granulação a seco podemser utilizados quando um dos componentes tem propriedades coesivas sufi-cientes para ser comprimido. O método mistura os ingredientes com um lu-brificante, se necessário. O procedimento de granulação úmida descrito mis-tura o ingrediente seco usando um misturdor de invólucro gêmeo ou mistu-rador de cone duplo sob condições de mixagem por cisalhamento e depoisadiciona soluções de um agente de ligação aos pós misturados para obteruma granulação.

Um grânulo "termoestável" refere-se a um grânulo que tem umagente ativo que retém pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%,pelo menos 80%, pelo menos 90%, e pelo menos 95% de sua atividade,mensurada por um ensaio convencional específico para o agente ativo sele-cionado, seguido da inclusão em uma formulação, e exposição a calor e va-por, de tal forma que a formulação atinge alvos de até cerca de 85°C a cercade 95°C durante diversos minutos. Aqueles versados na técnica reconhece-rão que os grânulos termoestáveis em formulações expostas a alvos de me-nos de 85°C são estáveis, e os resultados do teste conduzido a 80°C esta-beleceu que este é na verdade o caso. Por conseguinte, ficará entendidoque até 85°C a 95°C significa que abrange alvos inferiores a 85°C, que es-tão incluídas no escopo desta invenção.

Em uma modalidade, "termoestável" refere-se a um agente ativoque retém pelo menos 80% de sua atividade mensurada por um ensaio con-vencional específico para o ingrediente ativo selecionado em seguida à in-clusão e uma formulação, exposto ao vapor, de tal maneira que a formula-ção atinge alvos de cerca de 85°C-95°C durante cerca de 30 segundos. Emainda outra modalidade, termoestável refere-se a um agente ativo que retémpelo menos 50% de sua atividade mensurada por um método convencionalque é específico para o ingrediente ativo selecionado seguido pela inclusãoem uma formulação, exposto ao vapor, de tal modo que a formulação atingealvos de cerca de 85°C-95°C durante cerca de 30 segundos.

"Misturas não-peletizadas" refere-se a pré-misturadoras ou pre-cursoras, misturadoras de base, misturas e diluentes. As pré-misturas tipi-camente contêm vitaminas e minerais traço. As misturas de base tipicamen-te contêm ingredientes de alimento e alimentação tais como fosfato dicálcio,calcário, sal e uma vitamina e pré-mistura mineral, mas não contém grãosnem ingredientes de proteínas. Os diluentes incluem, mas não são limitados aos grãos (por exemplo artigos de trigo de segunda e farelo de arroz) e argi-las, tais como filossilicatos (silicato de magnésio sepiólito, bentonita, caolin,montmorilonita, hectorita, saponita, beidelita, atapulgita, e estevensita). Asargilas funcionam também como carreadores e agentes fluidizantes, ou dilu-entes para pré-misturas de alimentação. A mistura tipicamente compreende uma dieta animal completa.

Os grânulos etáveis da presente invenção podem ser adiciona-dos à essas misturas não-peletizadas, e para misturas de ração de fareloensopado, que podem ser subseqüentemente tratadas com vapor e/ou vaporpeletizado ou secado.

"Atividade de água", simbolizada como aw refere-se a uma umi-dade relativa fracional de uma atmosfera em equilíbrio com um material defase sólida ou líquida, isto é, a proporção da pressão parcial do vapor deágua para aquela água pura acima presente na mesma alvo. Em todas asfases entre as quais a distribuição de água atingiu equilíbrio, é por definição igual. O termo "umidade relativa" é geralmente usado para descrever a águana atmosfera ou fase de gás em equilíbrio com o sólido, e é expresso comouma percentagem, com 100% como a umidade relativa de água pura em umsistema fechado. Dessa forma, por qualquer valor da atividade da água, e-xiste uma umidade relativa correspondente dada por %RH=100*aw. A ativi-dade da água pode ser prontamente medida por métodos conhecidos natécnica, tipicamente colocando uma amostra do material dentro da câmarade alvo controlada de um metro de atividade de água, tal como o Modelo deSistema de Atividade da água (Activity System Model D2100) disponível daRotronic Instrument Corp. (Huntington, N.Y.), e permitindo a mensuraçãopara atingir o equilíbrio como indicado na exibição. A atividade da água refe-rida aqui a seguir é aquela do próprio grânulo depois da aplicação de todosos revestimentos.A atividade de água preferida para os grânulos da presente in-venção é, particularmente, quando os revestimentos externos do polímerodevem ser usados, menos de 0,5.

O grânulo estável, durável da presente invenção é um grânuloque pode ser preparado por qualquer processo que resulte na aplicação deum ou mais revestimentos protetores para o núcleo. O agente ativo pode serum componente de núcleo do grânulo, ou pode estar revestido sobre ummaterial do núcleo, e para as finalidades desta descrição, um núcleo refere-se a todos os componentes do grânulo durável exceto qualquer (quaisquer)revestimento(s) protetor(es) aplicado(s) ao núcleo do grânulo.

O núcleo pode ser feito por qualquer processo conhecido natécnica, tal como granulação, extrusão, revestimento de badeja, esferoniza-ção, granulação de membrana timpânica, aglomeração de cisalhamento alto,revestiento por spray de base de fluido, cristalização, precipitação, e proces-sos de "prill". Tais processos são conhecidos na técnica e estão descritos naPatente US N9 4.689.297 e na Patente US Nq 5.324,649 (processamento debase de fluido); EP656058B1 e Patente US N9 454332 (processo por extru-são); Patente US N9 6.248.706 (granulação, alto cisalhamento); eEP804532B1 e Patente US N9 6.534466 (processo de combinação utilizandoum núcleo de base de fluido e um revestimento de misturador), todas asdescrições dos quais estão incorporadas por referência em sua inteireza.

Os revestimentos protetores da presente invenção podem seraplicados como descrito nos processos de granulação, extrusão, base defluido e liPriII" mencionados acima. Adicionalmente, os revestimentos proteto-res podem ser aplicados por métodos de arremesso, incluindo métodos dearremesso de disco giratório, como descrito em WO 03/000625, que é aqui aseguir incorporado por referência em sua inteireza.

Adicionalmente, em uma modalidade, o processo pode incluiruma etapa de recozimento por calor, que aquece o grânulo acima da tem-pertura de transição do vidro (Tg) de um componente de barreira de umida-de e depois gradualmente reduz a alvo para fazer o material da barreira en-durecer, ou se tornar vítreo.NÚCLEOS

O núcleo é o núcleo interno do grânulo, e como estabelcido aci-ma, pode incluir o ingrediente ativo ou o ingrediente ativo pode ser revestidoao redor do material do núcleo. Núcleos apropriados para uso na presenteinvenção são preferivelmente um material hidratável ou poroso (isto é, ummaterial que é dispersável ou solúvel na água) que é um material de grau dealimentação. O material do núcleo deve tanto dispersar-se na água (desinte-grar quando hidratado) ou solubilizar em água indo para dentro de uma solu-ção verdadeiramente aquosa. Argilas (por exemplo, os filossilicatos de ben- tonita, caolin, montmorilonita, hectorita, saponita, beidelita, atapulgita, e es-tevensita, silicatos, tais como areia (silicato de sódio), farinha ou amido debatata aglomerada e de partículas adocicadas, ou outras fontes de grânulode amido tais como trigo e espigas de milho são considerados dispersíveis.As partículas adocicadas são partículas esféricas que consistem em um cris- tal de semente que foi criado e arredondado em uma forma esférica ligandocamadas de pó e soluto para o cristal de semente em um recipiente de esfé-rico rotativo. Partículas adocicadas são tipicamente feitas da combinação deum açúcar tal como sacarose, em pó tal como espiga de milho. Em uma mo-dalidade da presente invenção o núcleo é um cloreto de sódio ou cristal desulfato de sódio, às vezes referido como uma semente, ou outro cristal desal inorgânico. Em outra modalidade da presente invenção, o núcleo é umcristal de sacarose.

Partículas compostas de sais inorgânicos e/ou açúcares e/oumoléculas orgânicas pequenas podem ser usadas como os núcleos da pre- sente invenção. Ingredientes solúveis em água apropriados para incorpora-ção dentro de núcleos incluem: sais inorgânicos tais como cloreto de sódio,sulfato de amônio, sulfato de sódio, sulfato de magnésio, sulfato de zinco; ouuréia, ácido cítrico, açúcares tais como sacarose, Iactose e os similares.

Núcleos da presente invenção podem adicionalmente compre- ender um ou mais dos seguintes: agentes ativos, polímeros de grau de ali-mento ou alimentação, agentes de enchimento, plastificantes, materiais fi-brosos, prolongadores e outros compostos conhecidos para serem usadosnos núcleos. Polímeros apropriados incluem álcool de polivinila (PVA), polie-tileno glicol, oxido de polietileno, polivinil pirrolidina, e polímeros de carboi-drato (tais como amido, amilose, amilopectina, alfa e beta-glucanos, pectina,glicogênio), incluindo misturas e derivados dos mesmos.

Os núcleos usados nos exemplos incluem cristais de açúcar,cristais de sal inorgânico, núcleos de sabugo de milho, argilas e silicato.

Agentes de enchimento úteis em núcleos incluem materiais iner-tes usados para adicionar massa e reduzir o custo, ou usadas para fins deadjustar a atividade da enzima pretendida no grânulo terminado. Exemplosde tais agentes de enchimento incluem, mas não estão limitados a, agentessolúveis na água tais como sais, açúcares e agentes de dispersão na águatais como argilas, talco, silicatos, celulose e amidos, e celulose e derivadosde amido.

Plastificantes apropriados úteis nos núcleos da presente inven-ção são compostos orgânicos de peso molecular baixo e são altamente es-pecíficos para o polímero que está sendo plastificado. Exemplos incluem,mas não estão limitados a, açúcares (tais como, glicose, frutose e sacarose),alcoóis de açúcar (tais como, sorbitol, xilitol e maltitol e outros glicois), com-postos orgânicos de peso molecular polar baixo, tais como uréia, ou outrosplastificantes conhecidos tais como plastificantes de grau de alimentação oude água.

Materiais fibrosos apropriados úteis nos núcleos da presente in-venção incluem, mas não são limitados a: celulose, e derivados de celulosetais como HPMC (hidróxi-propil-metil celulose), CMC (carbóxi-metil celulose),HEC (hidróxi-etil celulose).

Em uma modalidade, particularmente para aplicações em ali-mentação, da presente invenção, o núcleo é um material de sabugo de milhodispersível solúvel em água ou cristal de sal ou açúcar. Em outra modalida-de particularmente apropriada para aplicações em limpeza doméstica, o nú-cleo é um cristal de sal ou açúcar dispersível ou solúvel em água ou um par-tícula esférica.

As pessoas versadas na técnica reconhecerão que, para aplica-ções em alimento e alimentação, os núcleos (e quaisquer polímeros, agen-tes de enchimento, plastificantes, materiais fibrosos e prolongadores), sãoaceitáveis para apicações em alimento e/ou alimentação. Para aplicaçõesem limpeza doméstica, não é necessário aplicar tal restrição.

O núcleo dos grânulos da presente invenção, incluindo qualquerrevestimento que têm ingredientes ativos nele, e excluindo os revestimentosprotetores descritos abaixo, preferivelmente compreendem menos de cercade 70%, menos de cerca de 60%, menos de cerca de 50%, menos de cercade 40%, menos de cerca de 30%, e menos de cerca de 20% em p/p do grâ- nulo durável.

AGENTE ATIVO

O agente ou agentes ativos, particularmente as enzimas discuti-das acima, é obtida a partir de um caldo de fermentação e pode ser um cal-do total, caldo Iisado ou caldo de fermentação clarificada recuperado a partir do processo de fermentação. A enzima pode estar em forma líquida, de pas-ta fluida, seca, Iiofilizada ou cristalina como obtida usando processos de re-cuperação a partir dos caldos de fermentação. A(s) enzima(s) opcionalmenteé(são) misturadas junto com plastificantes, tais como carboidratos e políme-ros, tais como amido modificado ou nativo para formar uma matriz. Uma listanão Iimitante de plastificantes inclui glicose de açúcares, frutose e sacarose,dextrinas, PVA, e alcoóis de açúcar, tais como, sorbitol, xilitol e maltitol, ouqualquer um dos plastificantes listas acima. Amidos modificados incluem,mas não são limitados a espiga de milho e amido de ácido hidróxi propil a-delgaçado, por exemplo, PureCote®, e amidos oxidizados. Alternativamente,o agente ativo pode ser adicionado ao núcleo, ou adicionado a ambos, o nú-celo e a uma camada que envolve o núcleo.

REVESTIMENTOS PROTETORES

Os revestimentos protetores da presente invenção são geral-mente aplicados como uma ou mais camadas que envolvem o núcleo quan- do o agente ativo não é basicamente termoestável. Modalidades incluemuma, duas, três ou quatro camadas de revestimento protetor.

Materiais de revestimento protetor adequados são polímeros,carboidratos, proteínas, lipídios, gorduras e óleos, ácidos graxos, sais inor-gânicos, e gomas e misturas das mesmas.

Os revestimentos protetores incluem revestimentos de barreirade umidade e revestimentos de hidratação de umidade. Os revestimentos de barreira de umidade funcional através da exclusão da umidade, por exemplo,formando uma camada revestida que tipicamente não absorve a umidade eprevine ou retarda a taxa de migração da umidade dentro do grânulo. Reves-timentos de hidratação de umidade no grânulo absorvem ou ligam a umida-de sem água ou água de hidratação, com isso agindo para impedir ou retar- dar o nível ou taxa de transporte de umidade externa no grânulo. Os reves-timentos de hidratação de umidade tipicamente constituem pelo menos cer-ca de 35% em p/p do grânulo. Os materiais de hidratação de umidade nosrevestimentos isolam termicamente os agentes ativos e irão absorver umacerta quantidade de umidade e reter dentro do material de hidratação sempermitir a passagem da umidade para a porção do grânulo que contém oagente ativo. Para os revestimentos de hidratação de umidade nos grânuloestáveis, duráveis que não contêm quantidades notáveis de água antes dotratamento com vapor, tais revestimentos podem constituir cerca de 25% emp/p do grânulo.

Revestimentos de barreira de umidade compreendem tipicamen-te materiais hidrofóbicos, tais como polímeros hidrofóbicos, por exemplo,PVA1 HPMC, amidos de hidroxipropila reduzidos com ácido e amidos oxida-dos; proteínas, por exemplo, soro de leite e concentrados de proteína desoro de leite; lipídios, por exemplo, lecitina; gorduras e óleos, ácidos graxos,látex e gomas, por exemplo, goma arábica. Certos revestimentos de barreirade umidade, tais como PVA e goma arábica, não são facilmente oxidados eencontram especial aplicabilidade em prover estabilidade química quando osgrânulos da invenção são armazenados em misturas não-peletizadas ounão-comprimidas, por exemplo, em pré-misturas que contêm cloreto de coli-na. Materiais de revestimentos de hidratação de umidade são materiais hi-drofílicos, tais como carboidratos e sais inorgânicos, incluindo sais hidrata-dos. Exemplos de materiais de hidratação de umidade são sulfato de mag-nésio, sulfato de sódio, maltodextrina, sulfato de amônio, açúcares, por e-xemplo, sacarose e amido de milho natural.

Polímeros usados para os revestimentos protetores são álcoolpolivinílico (PVA), polietileno glicol, polivinil pirrolidona, poliacrilatos, óxidosde polietileno (PEO)1 ácido poliláctico, cloreto de polivinila, acetato de polivi-nila, polivinil pirrolidonas (PVP), éteres de celulose, alginatos, gelatina, ami-dos modificados e derivados substituídos, hidrolisados e copolímeros dosmesmos, tais como amido de hidroxipropila reduzido com ácido, tais como,Pure Cote®, hídroxipropil metil celulose (HPMC), metil celulose (MC), carbo-ximetil celulose (CMC), e etil celulose. Polímeros mais preferidos para osrevestimentos protetores são PVA, PVA modificado, como descrito na Paten-te U.S. nQ 6.872.696, e celulose modificada, tal como metil celulose e hidro-xilpropilmetil celulose, como descrito na Publicação PCT N2 WO 99/51210,ambos os quais são incorporados aqui por referência.

Carboidratos usados para os revestimentos protetores são hi-droxilmetil celulose de maltodextrina, amidos naturais ou modificados feitosde milho, sorgo, araruta, arroz, trigo, centeio, cevada, aveia, batata, inhame,tapioca, mandioca, sagu, e açúcares incluindo sacarose, sólidos de xaropede milho, melado, glicose, frutose e lactose.

Proteínas usadas para os revestimentos protetores são soro deleite em pó, concentrado de proteína de soro de leite, caseínatos, concen-trado e isolado de soja, zeína, albumina e gelatina.

Lipídios derivados e compostos, simples que podem ser usadosnos revestimentos protetores são ceras (por exemplo, legumes, mineral esintético, tais como carnaúba, rácimo (cãndelilla), cera de abelha, cerúmèn,carnaúba, goma-laca, parafina, e ceras microcristalinas); Iecitina (por exem-plo, mono- e diglicerídeos); ácidos graxos (por exemplo, ácidos graxos este-áricos, palmíticos, linoléicos, oléicos, butíricos e araquidônicos e seus saisde sódio, potássio, cálcio e zinco); e gorduras e óleos (por exemplo, gordu-ras e óleos hidrogenados ou parcialmente hidrogenados, tais como soja, mi-lho, semente de algodão, sebo, canola, e óleo de semente de linhaça). Umlipídio preferido para os revestimentos protetores é lecitina.Sais inorgânicos usados para os revestimentos protetores inclu-em sais de sulfato, citrato, cloreto, carbonato, sulfeto, fosfato, fosfonato esais de bicarbonato de sódio, amônio, potássio, cálcio, magnésio e zinco.Sais preferidos são sulfato de magnésio, sódio e amônio.

Gomas que podem ser usadas nos revestimentos protetores in-cluem goma arábica, goma guar, ágar, goma tragacanto, goma karaia, gomade alfarroba, carrageniná, goma xantana e alginatos.

Os revestimentos protetores da presente invenção também po-dem incluir plasticizantes, lubrificantes, pigmentos e pós, tais como talco,bentonita, caulim, amido de milho, silicato de magnésio, carbonato de cálcioe quitosana.

Certas modalidades da presente invenção tipicamente têm umacamada simples de um material de hidratação de umidade que é aproxima-damente pelo menos 55% em p/p do grânulo. Uma vez que a capacidade derevestimentos de hidratação de umidade para absorver e isolar tem um limi-te, níveis relativamente altos de revestimentos de camadas simples são apli-cados. Alternativamente, material(is) de hidratação de umidade pode(m) seraplicado(s) em duas camadas. Outras modalidades da presente invençãotêm revestimentos protetores que utilizam tanto materiais de hidratação deumidade quanto materiais de barreira de umidade. Nestas modalidades, aquantidade de material de hidratação de umidade pode ser inferior, pelo me-nos cerca de 25% em p/p do grânulo, e o material de barreira de umidade écerca de 2% a 25% em p/p do grânulo. Usar tanto materiais de hidratação deumidade quanto materiais de barreira de umidade combinam mecanismosprotetores e tipicamente reduzem custo, especialmente dos materiais dé bar-reira de umidade. Materiais de barreira de umidade, especialmente materiaisde formação de filme, podem estar sujeitos à falha mecânica a qual, se estesmateriais forem usados sozinhos como um revestimento fino, pode levar àperda de proteção do agente ativo. A combinação permite o uso de menosde ambos os materiais do que seria requerido se os materiais fossem usa-dos sozinhos. A combinação permite alguma falha da camada de barreira deumidade devido à presença do material de hidratação de umidade. Comotratado acima, a combinação dos materiais é especialmente adequada paraprover estabilidade química através da manutenção da atividade quando osgrânulos estão armazenados em misturas não-peletizadas.

Para grânulos que têm uma etapa de processamento de enrije-cimento quente, a quantidade de material de hidratação de umidade podeser diminuída a cerca de pelo menos 20% em p/p do grânulo porque a ca-mada de barreira fundida melhorou a continuidade e é menos sujeita à falhamecânica.

Processos da presente invenção, além dos processos descritospara fabricação dos grânulos duráveis, estáveis, incluem misturar os grânu-los com misturas de alimentação não-peletizada e armazenagem das mistu-ras resultantes. Processos adicionais incluem tratar com vapor as misturasresultantes e/ou peletizar as misturas resultantes. É claro que os grânulosduráveis, estáveis da presente invenção também podem ser armazenadossozinhos e misturados com alimento, ou peletizados, quando desejado.

Os exemplos seguintes não pretendem ser limitantes.

EXEMPLOS

Tabela 1 abaixo é uma lista de ingredientes e abreviações nosexemplos seguintes.<table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>Tabela 2 ilustra a composição de muitos grânulos duráveis, es-táveis exemplares da presente invenção e vários grânulos que não demons-tram pelo menos 50% da atividade do agente ativo recuperada sob condi-ções de peletização especial.

Tabela 2

Formulação nQ 1 *

<table>table see original document page 31</column></row><table>

*Etapa de enrijecimento a quente

Formulação ne 2

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Formulação n9 3

<table>table see original document page 31</column></row><table>Formulação η9 4

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Formulação n9 5

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Formulação n9 6

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Formulação ne 7

<table>table see original document page 32</column></row><table>Formulação nQ 8

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Formulação n9 9

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Formulação n9 10 (Termoinstável)

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Formulação ns 11

<table>table see original document page 33</column></row><table>Formulação η-12 (Grânulo de teste sem revestimento protetor)

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Formulação nQ 13 (Termoinstável)

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Formulação n9 14 (Termoinstável)

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Formulação n9 15 (Termoinstável)

<table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table>

Formulação n9 17

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Formulação n9 18

<table>table see original document page 35</column></row><table>Formulação η-19

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Formulação η9 20

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Formulação η9 21 (Termoinstável)

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Formulação ne 22

<table>table see original document page 36</column></row><table>Formulação η9 23

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Formulação η9 24 (Termoinstável)

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Formulação n9 25 (Termoinstável)

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Formulação n9 26

<table>table see original document page 37</column></row><table>Formulação η9 27

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Formulação ne 28**

<table>table see original document page 38</column></row><table>

**Enzima basicamente termoestável

Formulação n9 29**

<table>table see original document page 38</column></row><table>

**Enzima basicamente termoestávelFormulação η9 30"

<table>table see original document page 39</column></row><table>

**Enzima basicamente termoestável

Formulação n9 31

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Formulação n9 32

<table>table see original document page 39</column></row><table>Formulação ns 33

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Formulação n- 34

<table>table see original document page 40</column></row><table>

EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DE GRÁNULOS NA TABELA 2.

Todos os grânulos na Tabela 2, exceto o grânulo número 1, são grânüíõs que foram preparados usando um processo de leito fluido comodescrito na Patente US Ng 5.324.649. O processo de leito fluido fluidizou osmateriais de núcleo em um processador de Vetor FL-1 (fabricado por VectorCorp, Marion, IA, USA), um processador Glatt 3, ou um Uniglatt (ambos fa-bricados por Glatt Air Techniques, Binzen, Alemanha). Uma mistura de en- zima/açúcar/amido foi revestido por pulverização no material de núcleo. En-tão, quaisquer revestimentos protetores foram pulverizados seqüencialmentena camada da enzima e permitidos secar.

Por exemplo, o grânulo da Formulação nQ 3 foi preparado comosegue:

Em um revestidor de leito fluido de spray superior Glatt 3, cris-tais de sulfato de sódio peneirados a malha -45/+140 foram carregados efluidizados usando uma alvo de leito aquecido. Um concentrado de ultrafil-tração de xilanase Trichoderma reesei foi misturado com amido de milho esacarose e pulverizado nos cristais. A solução foi cerca de 33% de sólidossecos. O peso da batelada final foi de 4000 gramas.

Em um revestidor de spray superior de vetor FL-1, material dehidratação de umidade, uma solução de sulfato de magnésio, foi pulverizadoem 833 gramas do material descrito acima. A alvo do leito era de 50°C. Abatelada final pesava 2500 gramas.

Preparação do Grânulo número 1 também incluiu uma etapa deenrijecimento a quente suficiente para exceder a alvo de transição de vidro(Tg) do material de cera de carnaúba seguido por resfriamento lento queproduziu uma camada de cera vítrea, endurecida.

EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS DE MISTURA COM GRÂNU-LOS E FORMAÇÃO DE PÉLETES

Três formulações de alimentação diferentes e processos de for-mação de péletes foram usados para preparar péletes com os grânulos lis-tados na tabela 2. Dosagens relativamente altas de grânulos foram adicio-nadas às formulações de alimentação para otimizar os ensaios de atividadedo agente ativo restante.

Laminador N 1:

Os grânulos selecionados da tabela 2 foram misturados juntoscom uma formulação de alimentação. A composição das formulações dealimentação foi como a seguir:

75% (p/p) de fubá (fubá desgerminado amarelo enriquecido, nQ50956, General Mills Operations, Minneapolis, MN); e

25% (p/p) de farinha de soja (Pro Soibean meai, Cargill OilseedCo., Cedar Rapids, IA).

12 kg da mistura de alimentação acima foram combinados comcada grânulo de amostra (dosado a 5 g/kg de formulação de alimentação), emisturados em um misturador grande Hobart (modelo D-300T, Troi OH), por8 minutos. Aproximadamente 150 g de cada amostra foram retidos como aamostra de mistura, ou mistura de alimentação não-peletizada. Cada batela-da foi a seguir dividida em três subbateladas de 4 kg, e peletizadas em pro-cessos de laminação de pélete em triplicata.

O Iaminador de péletes usado foi o CPM modelo CL5 (CalifórniaPellet Mill Co., Crawfordsville, IN). A alvo no condicionador de fluxo foi con-trolada pela quantidade de fluxo injetado, a 1,36 atm. A alvo de condiciona-mento da mistura, medida imediatamente antes da entrada do molde do Ia-minador de péletes, foi direcionada a 89- 90°C. A medição da alvo foi feitausando um termômetro e um termoacoplador do tipo "J" (OMEGA Enginee-ring, Inc. Stamford, CT). O tempo de residência no condicionador foi de a-proximadamente 5 segundos. As dimensões do molde foram de 12,7 cm dediâmetro interno, 17,8 cm de diâmetro externo, 4,7 mm de diâmetro do orifí-cio. O Iaminador de péletes foi processado continuamente, e as amostrasforam processadas através do Iaminador seqüencialmente, separadas aoprocessar aproximadamente 2 kg de uma mistura de fubá/soja entre as a-mostras. Aproximadamente 1 minuto após a mistura de teste ser adicionadaao condicionador, e a alvo do condicionador ter estabilizado na alvo alvo, ospéletes foram coletados durante um intervalo de 30 segundos, permitindoque aproximadamente 1 kg de péletes fosse coletado para cada amostra. Ospéletes coletados foram mantidos sob condições ambiente, por 30 segun-dos, e a seguir resfriados com um resfriador de ar por 2 a 3 minutos até aalvo ambiente.

Laminador N- 2:

Grânulos duráveis preparados a partir da Tabela 2 foram peleti-zados com uma formulação de alimentação de milho e soja. A composiçãoexata das formulações de alimentação foi como a seguir: 61,2% (p/p) de fu-bá, 31,6% (p/p) de farinha de soja, 3,0% de carne e farinha de ossos, 2,5%de óleo de soja, 1,3% de calcário, 0,28 % de sal, e 0,08% de metionina. Paracada grânulo testado, 370 a 2000 gramas dos grânulos, dependendo do tipoe da atividade da enzima, foram combinados com 450 kg do alimento semóleo, e misturados em misturador de arado por 2 minutos. A seguir, o óleode soja foi adicionado e a amostra foi misturada por um período adicional de3 minutos. O Iaminador de péletes foi o modelo Master1 fabricado por Cali-fornia Pellet Mill. O diâmetro do orifício do pélete molde foi de 4,5 mm. A ta-xa de alimentação típica foi de 780 kg por hora. A alvo no condicionador avapor foi controleada manualmente, e foi medida na saída de alimentação apartir do condicionador. As duas alvos de condicionamento foram usadas;85°C e 95°C. O tempo de residência no condicionador foi de aproximada-mente 30 segundos. Quando a alvo alvo foi alcançada, o sistema foi proces-sado por aproximadamente 5 minutos antes da amostragem ocorrer. As a-mostras de aproximadamente 5 kg de alimento peletizado foram tomadas, eforam resfriadas por espalhamento sobre as bandejas de triagem.

Laminador N2 3:

Os grânulos duráveis preparados foram peletizados com umaformulação de alimentação de trigo e soja ou uma formulação de trigo e ce-vada. A composição da formulação de alimentação foi de 60% de trigo,31,5% de farinha de soja, 4% de óleo de soja, 1,5% de fosfato de dicálcio,1,23% de pré-mistura mineral vitaminada, 1,2% de calcário, 0,4% de sal, e0,2% de DL metionina; ou 60% de trigo, 30% de cevada, com duas alvos decondicionamento, 90°C e 95°C usadas. Para cada grânulo testado, 200 a500 gramas de grânulos, dependendo do tipo de e da atividade da enzima,foram combinados com 160 kg da alimentação, e misturados em um mistu-rador de faixa horizontal por aproximadamente 15 minutos. O Iaminador depéletes foi um Simon Heesen, do tipo que tem um rolo, encaixado em moldede 17,3 cm de diâmetro interno, com um diâmetro de orifício do pélete de 3mm. A velocidade do molde foi de 500 rpm e foi acionado por um motor de7,5 kW. A taxa de alimentação típica foi de 300 kg por hora. A alvo no condi-cionador a vapor foi mantida em +/- 0,1 grau Celsius, medida na saída daalimentação a partir do condicionador. O condicionador tinha um sistemamisturador do tipo cascata. Três alvos de condicionamento foram usadas;85°C, 90°C, e 95°C. A pressão da entrada a vapor foi de 2 atm, e a alvo nocondicionador foi controlada por ajuste manual das três válvulas que regu-Iam a distribuição do vapor. O tempo de residência no condicionador foi deaproximadamente 30 segundos. Quando a alvo alvo foi alcançada, o sistemafoi processado por aproximadamente 5 a 10 minutos antes da amostragemocorrer. As amostras foram tomadas por períodos de 1-1,5 minuto, corres-pondendo a 5-7,5 kg de alimento peletizado, e foram imediatamente coloca-das em uma caixa de resfriamento com um fundo perfurado e fluxo de ar de1500 metros cúbicos por hora. Após o resfriamento por 15 minutos, as a-mostras foram dimensionadas duas vezes usando um divisor de amostras, e1 kg foi tomado para testes laboratoriais.

EXEMPLO 3: MEDIÇÕES DA ATIVIDADE DA ENZIMA

Determinação da atividade da enzima

Para determinar a atividade da enzima após a formação de péle-tes, a mistura e as amostras peletizadas foram a seguir moídas por 30 se-gundos em moedor de café de cozinha (modelo 203-42, Krups North Ameri-ca Inc., Medford MA), e avaliadas quanto à atividade da enzima como descri-to acima. Alternativamente, as amostras foram moídas em um Iaminadorcentrífugo ZM-200, encaixado com uma peneira de 1 mm (Retsch GmbH,Germany).

Cálculo da Atividade Percentual Recuperada:

Para cada amostra de teste, ambas a mistura e as amostras pe-letizadas correspondentes foram avaliadas quanto à atividade. A atividadepercentual recuperada foi calculada como a seguir:

atividade no pélete% de atividade recuperada = -χ 100 atividade na mistura

O ensaio de enzima de fitase foi conduzido de acordo com ométodo oficial 2000.12 AOAC (Association of Analitical Chemists), comodescrito em "Determination of phitase activity in feed by a colorimetric enzy-matic method: collaborative interlaboratory study". Engelen AJ, van der HeeftFC, Randsdorp PH, Somers WA, Schaefer J, van der Vat BJ. J AOAC Int.2001 Mai-Jun; 84(3):629-33. De forma resumida, as amostras moídas extra-ídas em trihidrato de acetato de sódio a 220 rnM, dihidrato de cloreto de só-dio a 68,4 mM, Tween 20 a 0,01%, pH 5,5. O ensaio mede a liberação dofosfato inorgânico a partir de fitato de arroz, a pH 5,5, por 60 minutos a 37°C.O ensaio é paralisado com reagente de molibdato ácido/vanadato, e fosfatoé quantificado por intensidade de complexo colorido amarelo do vanadato-molibdofósforo.

O ensaio de enzima xilanase foi realizado usando o Kit de En-saio de Xilanase (Xilazime AX Format), Cat NQ: K-XYLS Megazyme Interna-tional Ireland Ltd., Wicklow, lreland. Os materiais para o ensaio incluem ostubos de cultura de vidro descartáveis; tampão de extração: tampão de salde sódio MES a 100 mM, pH 6,0; tampão de ensaio: tampão de fosfato desódio a 25 mM, pH 6,0; solução de interrupção: 20 g de NaP0412H20 emum litro de água MilliQ; Frascos de Cultura de Tecido de Poliestireno, 225 ml(Corning Incorporated - Life Sciences Big Flats, New York). 6 - 12 g de ali-mento moído são extraídos em 120 ml de tampão de extração, em um frascode cultura, por 1 hora a 20 - 25°C, enquanto agitando em um agitador de gelorbital ajustado a 100 rpm. As amostras são a seguir centrifugadas a 2000 gpor 1 min, e o sobrenadante é avaliado. Para o ensaio, 20 a 100 ul do so-brenadante alimentar são diluídos em 5000ul usando tampão de ensaio, emtubos de cultura, e equilibrados em um banho de água a 40°C por 10 min. Aseguir, um comprimido de substrato é colocado em cada tubo de cultura, eas amostras são incubadas por um adicional de 10 minutos a 40°C. 10 ml desolução de interrupção são a seguir adicionados a cada tubo. As amostrassão submetidas a vórtice de forma breve, e a seguir filtradas através de pa-pel filtro Whatman Ne 1. A absorbância do filtrado é lida com um espectrofo-tômetro em um comprimento de onda de 590 nm. O espectrofotômetro éprimeiro zerado com espaço vazio, feito pela combinação de 20 a 100 ul dosobrenadante alimentar, 500 ul do tampão de ensaio, e 10 ml de solução deinterrupção. Um comprimido de substrato é a seguir adicionado, após sersubmetido a vórtice e filtração da mesma maneira que as amostras. A inter-ferência a partir de alguns componentes de alimentação pode afetar a res-posta do ensaio. A fim de corrigir qualquer interferência, curvas com antece-dente alimentar foram preparadas. Os grânulos de xilanase não revestidosforam adicionados à mistura em branco, e aos péletes em branco, em váriosníveis. As amostras de péletes e mistura cortadas foram a seguir moídas, eextraídas exatamente como descrito acima. A partir desta série de extratos,curvas para ambos a mistura e os péletes foram geradas.

O ensaio de enzima beta-glucanase foi realizado usando umKit de Ensaio Beta-glucanase (Beta-Glucazime Tablet format), Cat N9:T-BGZ200, Megazime International Ireland Ltd., Wicklow, lreland. Os materi- ais para o ensaio incluem os tubos de cultura de vidro descartáveis de 16 χ125 mm; o tampão de extração e o tampão de ensaio: tampão de acetato desódio a 25 mM; solução de interrupção: NaP0412H20 a 2% em 1 litro deágua MilliQ; 140 ml de béqueres de vidro. 10 g de alimento moído foram ex-traídos em 100 ml de tampão de extração, ao misturar em béquer por 1 hora a 20-25°C. As amostras são a seguir centrifugadas a 2000 g por 1 min, e osobrenadante é avaliado. Para o ensaio, 20 a 100 ul do sobrenadante ali-mentar são diluídos em 500 ul usando o tampão de ensaio, em tubos de cul-tura, e equilibrados em um banho de água a 40°C por 10 min. A seguir, umcomprimido de substrato é colocado em cada tubo de cultura, e as amostras são incubadas por um adicional de 10 minutos a 40°C. 10 ml de solução deinterrupção são a seguir adicionados a cada tubo. As amostras são submeti-das a vórtice brevemente, e a seguir filtradas através de um papel de filtroWhatman N9 1. A absorbância do filtrado é lida com um espectrofotômetroem um comprimento de onda de 590 nm. O espectrofotômetro é primeiro zerado com um branco, feito por combinação de 20 a 100 ul do sobrenadan-te alimentar, 500 ul do tampão de ensaio, e 10 ml de solução de interrupção.Um comprimido de substrato é a seguir adicionado, em seguida submetido avórtice e filtração da mesma maneira que as amostras. Uma curva é prepa-rada avaliando uma série de enzimas diluídas em níveis apropriados emtampão de ensaio.RESULTADOS DA ATIVIDADE DE ENZIMA RETIDA

Tabela 3: Resultados da formação de péletes - Atividade Percentual Recu-perada após a formação de péletes.

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Os laminadores de péletes usados podem ser quebrados emdois grupos. O Iaminador N9 1 é um Iaminador de escala laboratorial, o qualé muito mais áspero do que aquele que é tipicamente encontrado na práticacomercial. A aspereza é atribuída à grande quantidade de vapor que é distri-buída a uma porção relativamente pequena da mistura, acoplada ao fato deque a mistura de alimentação não contém óleo, o qual tipicamente Iubrifica oalimento enquanto ele viaja através do molde. Os Iaminadores N9 2 a Ne 4são considerados ser mais representativos de condições comerciais.

As atividades retidas dos grânulos são mostradas na Tabela 3.

Os grânulos da presente invenção que não são considerados grânulos durá-veis, estáveis foram os números 10, 12, 13, 14, 15, 16, 21 e 25, dos quaistodos demonstraram menos do que 30% de atividade recuperada. Estesgrânulos têm um núcleo revestido com uma camada de matriz de enzima emque o núcleo revestido é maior do que cerca de 50% em p/p do grânulo intei-ro. A maioria destes grânulos não estáveis tinha apenas uma camada derevestimento de proteção de um material de barreira contra a umidade, talcomo cera de carnaúba, ou etilcelulose, ou HPMC, ou óleo de canola. Semdesejar estar limitado por qualquer teoria particular, e reconhecendo queestes grânulos podem mostrar mais do que 50% da atividade do agente ati-vo retido em 70-85°C, a pobre termoestabilidade destes grânulos sob estascondições de teste, em relação aos grânulos duráveis, estáveis, pode serdevido à provisão de materiais de revestimento como camadas relativamen-te finas, compreendendo em cinco exemplos cerca de 2,0 a cerca de 17,0%em p/p do grânulo, e/ou o agente de revestimento particular empregado. Porexemplo, grânulo número 10 tem uma camada única de material de revesti-mento que é 50% em p/p do material de barreira contra a umidade (cera decarnaúba); e o grânulo ne 25 tem duas camadas de revestimento de prote-ção de barreira contra a umidade que juntas constituem 32 % em p/p dogrânulo.

Os grânulos duráveis, estáveis da presente invenção foram osnúmeros 4, 8, 17, 18, 19, 20, 26, 28, 29, 31 e 32, dos quais todos têm maisdo que 70% da atividade de xilanase recuperada quando peletizada em cer-ca de 90°C por cerca de 5 segundos. Adicionalmente, os grânulos 26, 31 e32 demonstraram mais do que 90% da atividade de fitase recuperada quan-do peletizada entre 85°C e 95°C por cerca de 30 segundos. Os grânulos 28 e 29 demonstraram mais do que 90% da atividade retida de uma xilanaseinerentemente termoestável na mistura de enzima e 70% a 90% da atividaderetida de uma beta-glucanase termoinstável quando peletizada entre 85 C e95 C por 30 segundos. Aqueles grânulos duráveis, estáveis tendo um agenteativo que não é inerentemente termoestável são ou :1) revestidos com uma camada de proteção espessa, única de um material de hidratação da umida-de, ou 2) revestidos com dois ou três camadas de proteção, onde pelo me-nos uma das camadas é um material de hidratação da umidade e uma ca-mada é um material de barreira contra a umidade.

Em geral, quando os materiais de hidratação da umidade são aplicados como camadas individuais, o revestimento deve compreender decerca de pelo menos cerca de 55% do grânulo, para prover adequada prote-ção térmica; e quando a quantidade de material de hidratação da umidadefor reduzida a menos do que 55% usando uma camada individual, a ativida-de percentual retida caiu a menos do que 50%. No entanto, quando os mate- riais de hidratação da umidade forem usados em combinação com os mate-riais de barreira contra a umidade, a camada de proteção da hidratação comágua pode ser reduzida a pelo menos cerca de 25% p/p do grânulo, enquan-to o material de barreira contra a umidade pode ser cerca de 2% a 40% p/pdo grânulo.

Outros grânulos duráveis, estáveis da presente invenção foramos números 1,2,3, 5, 6, 7, 9, 11, 22, 23, 27, 30 e 33 dos quais todos de-monstraram mais do que 50% da atividade da xilanase ou fitase recuperadaquando peletizada a 90°C por 5 segundos ou a 85°C a 95°C por 30 segun-dos. Como pode ser visto a partir destes resultados, os revestimentos inter-nos ou externos de sal inorgânico sozinhos provêem boa proteção para en-zima e proteção intensificada quando combinados com os revestimentos debarreira contra a umidade. Como notado anteriormente, o grânulo número 1foi feito usando uma etapa de processamento de recozimento por calor eacredita-se que a adição de uma etapa de recozimento por calor intensifiqueas propriedades de barreira dos materiais de barreira contra a umidade, taiscomo os polímeros, as proteínas, e os lipídeos dessa forma reduzindo aquantidade de material de hidratação da umidade necessário para provertermoestabilidade. Quando um grânulo de outra forma idêntico ao grânulo N51 for feito sem o recozimento por calor, a atividade recuperada foi de 35%.Os grânulos 2, 3, e 22 mostram que os materiais de núcleo diferentes podemser usados sem comprometer a estabilidade do grânulo.

O grânulo 3 demonstrou mais do que 70% da atividade da enzi-ma recuperada em ambos períodos de tempo de 5 segundos e 30 segundos.O grânulo 11 demonstrou mais do que 50% da atividade da xilanase recupe-rada quando peletizada a 85 C a 95°C por cerca de 30 segundos, e mais doque 70% da atividade da fitase recuperada quando peletizada a 85°C a 95°Cpor cerca de 30 segundos. O grânulo Nq 23 demonstrou mais do que 60% daatividade recuperada de fitase quando peletizada por 5 segundos a 90°C;mais do que 50% da atividade recuperada de xilanase quando peletizada a85°C a 95°C por 30 segundos; e mais do que 80% da atividade recuperadade fitase quando peletizada a 85°C a 95°C por 30 segundos.

EXEMPLO 4: TESTE DE SUBMETER A VAPOR DIRETO

Porções de 100 gramas de mistura compreendidas de 75% defubá e 25% de soja foram dosadas com grânulos, contendo E. coli fitase, emuma taxa de inclusão de 1,25 g dos grânulos por 1 quilograma de mistura.

As amostras de mistura foram a seguir embaladas em um saco de pano dequeijo, e submetidos a vapor por 20 segundos colocando os sacos em umtubo de exaustor com vapor a 206,84 KPa (30 psi) aplicado ao fundo do tubode exaustor. Após submeter a vapor, as amostras foram resfriadas até a alvoambiente, deixadas secar durante a noite, e a seguir avaliadas quanto à ati-vidade de fitase. A atividade percentual recuperada das amostras submeti-das a vapor, em relação à mistura não aquecida, foi relatada.

Um grânulo que não foi considerado adequadamente resistenteao vapor sob estas condições de teste foi o ne 25, que tinha menos do que35% de atividade recuperada após ser submetido a vapor. Os grânulos du-ráveis, estáveis da presente invenção foram os n9s 5 e 23, os quais tinhammais do que 50% da atividade recuperada após serem submetidos a vapor.

EXEMPLO 5: TESTE DE BIODISPONIBILIDADE DOS GRÂNULOS PELE-TIZADOS

Os grânulos duráveis, estáveis da presente invenção podem sertestados quanto à biodisponibilidade da enzima do agente ativo usando ostestes de biodisponibilidade conhecidos, tais como o estudo de biodisponibi-lidade da fitase descrito em WO 00/47060; os testes de biodisponibilidadedescritos em Enzymes in Animal Nutrition, Proceedings of the 1st Symposi-um, Kartause Ittingen, Switzerland, October 13016, 1993; os testes de bio-disponibilidade descritos nas patentes de Chemgen.

Os grânulos da presente invenção foram avaliados após a for-mação de péletes para determinar a biodisponibilidade em frangos para as-sar que receberam como alimento uma dieta comercial.

Materiais e Métodos

As enzimas e os grânulos testados e os tratamentos de dieta in-cluíram a enzima Phyzyme® XP sozinha (6-fitase; E.C. 3.1.3.26), e ambos osgrânulos estáveis revestidos de goma arábica (GA) quanto os revestidos dePVA da presente invenção contendo a enzima Phyzyme XP. (Veja a Tabela4). As enzimas e os grânulos testados foram servidos como alimento aosfrangos para assar tanto em uma dieta de mistura como em uma dieta depéletes (preparada a 90°C). As dietas experimentais foram: controle positivo(dieta comercial), controle negativo, controle negativo + 500 U/kg de Phyzy-me® XP, controle negativo + 500 U/kg de fitase revestida com PVA1 controlenegativo + 500 U/kg de fitase revestida com GA, controle negativo + 500 U/kg de fitase revestida com PVA peletizada a 90°C, e controle negativo +500 U/kg de fitase revestida com GA peletizada a 90°C. Exceto pelo cálcio efósforo, todas as dietas foram isocalóricas e isonitrogenosas. (veja a tabela6). O cálcio e o fósforo disponíveis nas dietas de controle positivas e negati-vas foram de 0,90% e 0,78%, e 0,37% e 0,26%, respectivamente. O dióxido de titânio (0,10%) foi adicionado às dietas como um marcador indigestívelpara ajudar a estimar a digestibilidade do nutriente. As dietas experimentaisforam preparadas por ADAS Gleadthorpe para uma especificação comerciale retidas em ADAS Gleadthorpe e armazenadas sob refrigeração. As amos-tras das misturas de aditivo de enzima (25g), cereal (250g), farinha de soja (250g) e uma amostra de todas as dietas (250 g) foram enviadas a DaniscoAnimal Nutrition Enzymes Feed Services, Edwin Rahrs Vej 38, DK-8220Brabrand, Denmark. Todas as amostras foram avaliadas quanto à fitase an-tes da alimentação.

Animais Experimentais e Desenho:

Os frangos eram machos Ross 308 para assar com idade entre0 e 21 dias usando oito cercados para animais replicados por tratamentocom 30 aves por galinheiro. Os frangos foram colocados aleatoriamente emcaixas antes de serem pesados e aleatoriamente alocados para o cercadopara animais de tratamento. Cada cercado continha um tubo alimentador eas aves tinham livre acesso à água por meio de bebedouros de bico (4 porcercado) e alimento a todo momento. A altura dos bebedouros foi ajustadaregularmente para manter o nível com o topo das costas das aves. Palhapara a cama dos animais foi provida na forma de aparas de madeira de ma-deira limpa até uma profundidade de 5 cm. A casa foi aquecida por um sis-tema de chocadeira a ar quente e o regime de alvo alvo da chocadeira foi de310C no dia do nascimento, reduzindo em 1°C dia sim dia não até 210C seralcançado no dia 21. A taxa de ventilação mínima foi automaticamente cal-culada para suprir 1,9 χ IO4 m3 de ar por segundo por kg0,75 de peso do corpoe esta taxa foi suprida por um ventilador de 610 mm controlado por um pai-nel de controle Farm-Ex Diacam. O programa de iluminação foi de 23 horasde luz e 1 hora de escuro. A intensidade da luz foi reduzida do máximo obte-5nível no dia do nascimento (40 - 60 lux) até uma intensidade de aproxima-damente 10 Iux por 10 dias de idade. A umidade relativa foi monitorada emuma base diária usando um diário de dados Tinytalk©. Os frangos foram va-cinados com IB H120 & 50% de Avinue (ND) em Hatchery.

Ingestão de Alimento/Peso Corporal

O uso do alimento foi medido entre 0 e 21 dias. O alimento emcada cercado foi medido pesando novamente a quantidade de alimento res-tante no final do período e deduzindo-a da quantidade oferecida. As avesforam pesadas em seus grupos de cercado no dia do seu nascimento. Em21 dias, todos os cercados foram pesados em lotes. O peso total de todas asaves em cada cercado foi determinado e a média calculada. Todas as avesque morreram foram pesadas e os detalhes gravados, e quaisquer avesmancas ou aves incapazes de alcançar o alimento e a água foram rejeitadasdo estudo e a razão para a rejeição foi listada.

Pó da Tíbia

Em 21 dias de idade, 2 aves de cada cercado foram rejeitadasusando o deslocamento cervical e a perna esquerda removida. A tíbia foidissecada e o osso enviado para Eurofins laboratories, Woodthorne, Wolve-rhampton para a formação de pó em uma base de lote. Todos os dados fo-ram analisados usando o procedimento de modelos lineares gerais de SAS(SAS Inst. Inc., Gari, NC). Onde diferenças significativas foram encontradas,o teste de Duncan foi usado para comparar os meios de tratamento individuais.

Resultados e Discussão

A atividade de fitase analisada nas dietas experimentais foi <50,<50, 563, 467, 558 FTU/kg (fitase revestida por PVA), e 554 e 440 (fitaserevestida por GA),quanto ao controle positivo, controle negativo, controlenegativo + 500 U/kg de Phyzyme® XP, controle negativo + 500 U/kg de fitaserevestida por PVA e fitase revestida por GA1 e controle negativo + 500 U/kgde fitase revestida por PVA e fitase revestida por GA a 90°C, respectivamen-te (Tabela 5), indicando que a atividade de ambos a fitase revestida de PVAe a fitase revestida de GA não foi destruída após a peletização a 90°C.

As aves que receberam como alimento dietas de alimentaçãosuplementadas com 500 U/kg de fitase revestida por e fitase revestida porGA. peletizada a 90°C, eram mais pesados no dia 21 do que as aves alimen-tadas do controle positivo, controle negativo e controle negativo + 500 U/kgde dieta Phyzyme® XP (Tabela 7). As aves alimentadas com dieta de contro-le negativa consumiram menos do que as aves alimentadas com dieta su-plementar com 500 U/kg de fitase revestida por PVA e a fitase revestida porGA, peletizada a 90°C (Tabela 8). As aves alimentadas com dietas de mistu-ra suplementadas com 500 U/kg de Phyzyme® e fitase revestida por PVA efitase revestida por GA mostraram nenhuma diferença estatística com o con-trole positivo. Aqueles alimentados com dietas suplementadas com 500 U/kgde fitase revestida por PVA e fitase revestida por GA, peletizadas a 90°C,tinham melhor taxa de conversão alimentar no dia 21 do que nas aves ali-mentadas. O pó da tíbia foi o mais baixo para as aves alimentadas de dietade controle negativa em comparação a todos os outros tratamentos. As avesalimentadas de controle positivo e dietas suplementadas por fitase tinham póde tíbia similar A fitase testada, seja como Phyzyme® XP ou revestida comPVA ou GA, realizada assim como a dieta de controle positivo quando ali-mentada mistura. Quando fitase revestida por PVA ou GA foi adicionada àsdietas comerciais peletizadas a 90°C, recuperação do produto foi mantidaem níveis não-peletizados e o desempenho foi pelo menos tão bom quanto adieta de controle positiva. Os resultados indicam que a enzima de revesti-mento com PVA ou GA melhorou sua termoestabilidade em alvo de forma-ção de péletes de 90°C sem perder a bioeficácia de perda em dietas comer-ciais de alimentação para assados.Tabela 4 - Tratamentos de Dieta

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Tabela 5 - Atividade da Fitase em Dietas Experimentais

<table>table see original document page 55</column></row><table>Tabela 6 - Dietas Experimentais

<table>table see original document page 56</column></row><table>Tabela 7 - Peso do Corpo Inicial e Final de assados alimentados em dietasexperimentais

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Sobrescritos diferentes na mesma coluna indicam a diferença significativa

Tabela 8 - Ingestão de alimento total de assados alimentados em dietas ex-perimentais

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Sobrescritos diferentes na mesma coluna indicam a diferença significativaTabela 9 - Taxa de conversão do alimento de assados alimentados em die-tas experimentais

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Sobrescritos diferentes na mesma coluna indicam a diferença significativaTabela 10 - Teor do Pó da Tíbia de assados alimentados em dietas experi-mentais

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Sobrescritos diferentes na mesma coluna indicam a diferença significativaEXEMPLO 6: Pré-mistura da Enzima & estabilidade na formação de péletes

Os grânulos que contêm fitase, feitos de acordo com as formu-lações na Tabela 2 tendo um PVA ou um revestimento de goma arábica eum revestimento de hidratação por umidade, foram misturados com a argilasepiolita, ou uma pré-mistura mineral de vitamina de assados padrão com esem cloreto de colina. As razões de mistura foram 100 gramas de grânulosadicionados a 900 gramas de argila (sepiolita), ou 100 gramas de grânulosadicionados a 500 gramas de pré-mistura mineral de vitamina. As amostrasforam armazenadas em recipientrs vedados a 35°C por 3 semanas, e a se-guir submetidos à formação de péletes como descrito acima no LaminadorNq 3. O controle experimental foram os grânulos que não foram armazena-dos em uma pré-mistura, foram mantidos em condições ambiente por 3 se-manas.

As Tabelas 11 e 12 mostram a atividade percentual de fitase re-cuperada destas misturas após a formação de péletes a 90°C e 95°C. Verifi-cou-se que os grânulos misturados com sepiolita ou as pré-misturas mine-rais de vitamina têm atividade recuperada significativamente aumentada a-pós a formação de péletes.

Tabela 11

Grânulos da formulação de PVA

<table>table see original document page 59</column></row><table>Tabela 12

Grânulos de formulação de GA

<table>table see original document page 60</column></row><table>

Sem desejar estar preso por qualquer teoria particular, acredita-se que a argila e a pré-mistura mineral de vitamina tenham uma capacidadede absorver água e, durante a armazenagem com os grânulos estáveis, elasabsorvem a umidade residual dos grânulos. Para ilustrar este efeito, a Tabe-la 13 mostra os resultados de um experimento no qual os grânulos e a sepio-lita são armazenados em recipientes abertos, posicionados lado a lado, den-tro de uma câmara fechada. A atividade de água dos grânulos, e da sepioli-ta, foi medida antes e após 7 dias de armazenagem a 25°C. Durante a ar-mazenagem, a sepiolita absorvia água dos grânulos até que o sistema al-cançasse um equilíbrio. Após a armazenagem, os grânulos mostram umadiminuição na atividade da água, enquanto a sepiolita mostra um aumentona atividade de água.Tabela 13

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EXEMPLO 7: ESTABILIDADE EM ARMAZENAMENTO COM CLORETO DECOLINA

O cloreto de colina, ou cloreto de N-(2-Hidroxietil) trimetilamônio,é um aditivo alimentar importante, um nutriente de vitamina, em alimentos deaves domésticas, porco e outros animais. O cloreto de colina é uma molécu-la reativa e tem um efeito destrutivo bem-conhecido sobre as outras vitami-nas, e enzimas. O cloreto de colina é freqüentemente incluído nas pré-misturas e misturas de base. Os níveis máximos usados nas pré-misturas74.800 mg/kg para suíno, e 150.000 mg/kg para aves domésticas. E níveistípicos para misturas à base de suíno são de cerca de 966 a 1282,9 mg/kg.

Os grânulos duráveis, estáveis da presente invenção forammostrados preservar a atividade enzimáticã quando armazenados na pre-sença de cloreto de colina. Os grânulos que contêm fitase, feitos de formula-ções com PVA ou goma arábica e um material de hidratação por umidadeforam misturados com uma pré-mistura mineral de vitamina da assados pa-drão, com e sem cloreto de colina. A razão de mistura foi de 100 gramas degrânulos adicionados a 500 gramas de pré-mistura mineral de vitamina. Asamostras foram armazenadas em recipientes vedados, a 35°C, por 3 sema-nas, e a seguir avaliadas quanto à atividade, usando o protocolo de ensaiode fitase descrito acima. O controle de experimento foram os grânulos quenão foram armazenados em uma pré-mistura, e foram mantidos a 35°C por 3semanas. As tabelas 14 e 15 mostram a atividade medida das misturas an-tes e após a armazenagem, e a presente mudança na atividade. Nenhumadas amostras mostra uma perda apreciável de atividade após a armazena-gem. O erro deste ensaio, incluindo erro de amostragem, extração, e etivi-dade é de aproximadamente 15%.

Tabela 14

Grânulo da formulação de PVA

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Tabela 15

Grânulo da formulação de GA

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EXEMPLO 8: EFEITO DA ATIVIDADE DA ÁGUA SOBRE A ESTABILIDADEDA FORMAÇÃO DE PÉLETES

Os grânulos de fitase foram preparados de acordo com umaformulação tendo um revestimento de PVA e/ ou um revestimento de cama-da de sal inorgânica, em um processo de leito fluido, como descrito acima.Uma etapa de secagem adicional pode ser usada se a atividade da água dogrânulo for maior do que 0,5 após o processamento, de forma que em umrevestidor de leito fluido, ou outro processo adequado, os grânulos podemser secos até que uma atividade de água de <0,5 seja alcançada. Os resul-tados são mostrados na tabela 16 e demonstram que a atividade retida apósa formação de péletes é aumentada quando a atividade da água é menor doque 0,5.

Tabela 16

Grânulo da formulação de PVA

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Claims

1. Grânulo para composições de alimentação compreendendo:um núcleo;um agente ativo; epelo menos um revestimento, o agente ativo do grânulo retendopelo menos 50% da atividade, pelo menos 60% da atividade, pelo menos-70% da atividade, pelo menos 80% da atividade após condições seleciona-das a partir de um ou mais de a) um processo de formação de péletes, b) umprocesso de pré-tratamento de alimentação aquecido a vapor, c) armazena-mento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não-peletizada, e e) armazenamento de um ingrediente em uma mistura de basede alimentação ou uma pré-mistura de alimentação compreendendo pelomenos um composto selecionado a partir de minerais micronutrientes, áci-dos orgânicos, açúcares de redução, vitaminas, cloreto de colina e compos-tos que resultam em uma pré-mistura de alimentação ou mistura de base dealimentação acídica ou básica.

2. Grânulo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menosum revestimento compreende um material de hidratação de umidade quecostitui menos 55% em p/p do grânulo.

3. Grânulo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menosum revestimento compreende dois revestimentos.

4. Grânulo de acordo com a reivindicação 3, em que os dois re-vestimentos são um revestimento de hidratação de umidade e um revesti-mento de barreira de umidade.

5. Grânulo de acordo com a reivindicação 4, em que o revesti-mento de hidratação de umidade está entre 25% e 60% em p/p do grânulo erevestimento de barreira de umidade está entre 2% e 15% em p/p do grânulo.

6. Grânulo de acordo com a reivindicação 5, em que o revesti-mento de hidratção da umidade é selecionado a partir de sais inorgânicos,sacarose, amido e maltodextrina e o revestimento de barreira de umidade éselecionado a partir de polímeros, gomas, soro e amido.

7. Grânulo de acordo com a reivindicação 1, em que o agente a-tivo é uma ou mais enzimas.

8. Grânulo de acordo com a reivindicação 1, em que o processode formação de péletes de alimentação e o processo de pré-tratamento dealimentação são conduzidos entre 709 C e 95e C durante até diversos minutos.

9. Grânulo de acordo com a reivindicação 1, em que o processode formação de péletes de alimentação e o processo de ptré-tratamento dealimentação são conduzidos entre 85°C e 95°C.

10. Grânulo de acordo com a reivindicação 1, em que a misturanão-peletizada é um diluente selecionado a partir de uma ou mais argamas-sas, artigos de tigo ou farelo de arroz.

11. Grânulo de acordo com a reivindicação 1, em que a pré-mistura de alimentação ou mistura de base de alimentação compreendemcloreto de colina e o agente ativo é pelo menos uma enzima que retém pelomenos 80% da atividade quando armazanda em uma pré-mistura de alimen-tação ou mistura de base de alimentação.

12. Composição de alimentação animal compreendendo o grâ-nulo como definido na reivindicação 1.

13. Composição animal de acordo com a reivindicação 12, sele-cionada a partir de um diluente de alimentação animal, uma mistura de basede alimentação animal, uma pré-mistura de alimentação animal, mistura, euma pélete de alimentação animal.

14. Grânulo para alimentação animal compreendendo:um núcleo;um agente ativo, o agente ativo do grânulo retendo pelo menos 80% da atividade depois do armazenamento e depois do processo de for-mação de péletes, em que o grânulo é um ingrediente;um revestimento de barreira de umidade; eum revestimento de hidratação por umidade que é pelo menos 25% em p/p do grânulo, o grânulo tendo uma atividade de água de menosde 0,5 antes do processo de formação de péletes por aquecimento a vapor.

15. Grânulo de acordo com a reivindicação 14, em que o reves-timento da barreira de umidade é selecionado a partir de polímeros e gomase o material de hidratção de umidade é um sal inorgânico.

16. Grânulo de acordo com a reivindicação 14, em que o reves-timento de hidratação da umidade é 25% e 45% em p/p de grânulo e o re-vestimento de barreira de umindde é entre 2% e 10% em p/p do grânulo.

17. Grânulo de acordo com a reivindicação 14, em que o agenteativo é uma ou mais enzimes.

18. Grânulo de acordo com a reivindicação 14, em que o pro- cesso de formação de péletes aquecido a vapor é conduzido entre 85°C e-95°C durante até vários minutos.

19. Grânulo de acordo com a reivindicação 14, em que a ativi-dade de pelo menos 80% é retida após armazenamento do grânulo em ummistura não-peletizada compreendendo pelo menos um composto selecio- nado a partir de minerais de micronutrientes, ácidos orgânicos, açúcares deredução, vitaminas, cloreto de colina e compostos que resultam em umamistura não-peletizada acídica ou básica.

20. Composição de alimentação animal compreendendo o grâ-nulo como definido na reivindicação 14.

21. Composição de alimentação animal de acordo com a reivin-dicação 20, selecionada a partir de um diluente de alimentação animal, umamistura de base de alimentação, uma pré-mistura de alimentação animal,uma mistura de alimentação animal, e uma pélete de alimentação animal.

22. Ingrediente de alimentação animal compreendendo:um grânulo que compreende um núcleo;um agente ativo envolvendo o núcleo; epelo menos um revestimento envolvendo o agente ativo, o agen-te ativo retendo pelo menos uma atividade de 50%, pelo menos atividade de-60%, pelo menos atividade de 70%, pelo menos atividade de 80% após as condições selecionadas a partir de um ou mais de a) um processo de forma-ção de péletes de alimentação, b) um processo de pré-tratamento de alimen-tação aquecida a vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como umingrediente em um mistura não-peletizada, e e) armazenamento como umingrediente em uma mistura de base de alimentação ou uma pró-mistura dealimentação compreendendo pelo menos um composto selecionado a partirde minerais micronutrientes, ácidos orgânicos, açúcares de redução, vitami-nas, cloreto de colina, e compostos que resultam em uma pré-mistura dealimentação ou mistura de base de alimentação acídica ou básica.

23. Ingrediente de alimentação animal de acordo com a reivindi-cação 22, em que pelo menos um revestimento compreende dois revesti-mentos.

24. Ingrediente de alimentação animal de acordo com a reivindi-cação 23, em que os dois revestimentos são um revestimento de hidrataçãode umidade e um revestimento de barreira de umidade.

25. Ingrediente de alimentação animal de acordo com a reivindi-cação 24, em que o revestimento de hidratação de umidade compreende ummaterial selecionado a partir de sais inorgânicos, carboidratos, maltodextrinae amido e o revestimento de barreira de umidade compreende um materialselecionado a partir de polímeros, proteínas, lipídeos, gorduras, óleos, áci-dos graxos, gomas, amidos, Iecitina e cera.

26. Ingrediente de alimentação animal de acordo com a reivindi-cação 22, em que o núcleo e o agente ativo juntos compreendem pelo me-nos 50% em p/p do grânulo.

27. Ingrediente de alimentação animal de acordo com a reivindi-cação 22, em que o núcleo e o agente ativo juntos compreendem cerca de-50% a cerca de 60% em p/p do grânulo.

28. Ingrediente de alimentação animal de acordo com a reivindi-cação 22, em que o núcleo e o agente ativo compreende cerca de 90% acerca de 100% em p/p do grânulo e o agente ativo é uma enzima inerente-mente termoestável.

29. Ingrediente de alimentação animal de acordo com a reivindi-cação 22, em que o agente ativo é termoinstável.

30. Ingrediente de alimentação animal de acordo com a reivindi-cação 22 compreendendo adicionalmente uma composição de alimentação,o grânulo sendo dispersado na composição de alimentação.

31. Ingrediente de alimentação animal de acordo com a reivindi-cação 30, em que a composição é uma pélete de alimentação, o agente ati-vo disperso na pélete de alimentação que tem uma atividade retida que épelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, epelo menos 90% de uma atividade de pré-formação de péletes.

32. Ingrediente de alimentação animal de acordo com a reivindi-cação 30, em que a composição de alimentação é selecionada a partir deargila, nutrientes essenciais, grãos, trigo, esporão de centeio, arroz e mistu-ras dos mesmos.

33. Processo para produzir um grânulo compreendendo um a-gente ativo para alimentação, o processo compreendendo: preparar grânulosestáveis tendo um núcleo, pelo menos um agente ativo, e pelo menos umrevestimento; misturar grânulos estáveis junto com um ou mais de a) umdiluente, b) uma mistura de base, c) uma pré-mistura, e d) uma mistura dealimentação para formação de péletes.

34. Processo de acordo com a reivindicação 33, compreenden-do adicionalmente a etapa de formação de péletes a mistura de alimentaçãoa uma alvo de 70°C to 95°C por até vários minutos.

35. Processo de acordo com a reivindicação 33, em que os grâ-nulos estáveis são misturados junto com uma argila.

36. Processo de acordo com a reivindicação 33, em que os grâ-nulos estáveis são misturados junto com uma pré-mistura compreendendocloreto de colina.

37. Composição de alimentação animal feita pelo processo co-mo definido na reivindicação 33.

38. Processo para fazer um grânulo estável compreendendo en-zima para armazenamento em uma pré-mistura de alimentação compreen-dendo cloreto de colina, o processo compreendendo:prover um material e enzima de núcleo, a enzima distribuída portodo o material do núcleo ou em camadas sobre o material do núcleo;aplicar ao material do núcleo e enzima um material de hidrata-ção de umidade para formar uma camada que é pelo menos 25% em p/p dogrânulo estável;revestir a camada com um material de barreira de umidade paraformar um revestimento que é pelo menos 5% em p/p do grânulo, a aplica-ção e o revestimento sob condições selecionadas de tal forma que uma ati-vidade de água do grânulo estável seja menos do que 0,5.

39. Processo de acordo com a reivindicação 38, em que o mate-rial de hidratação de umidade é um sal inorgânico e a camada é cerca de-35% a cerca de 45% em p/p do grânulo estável.

40. Processo de acordo com a reivindicação 38, em que o re-vestimento é selecionado a partir de polímeros e gomas.