BRPI0617664A2

BRPI0617664A2 - agente para tratar enfarte do miocárdio e para suprimir a remodelagem ventricular esquerda depois do enfarte do miocárdio e uso do inibidor de il-6

Info

Publication number: BRPI0617664A2
Application number: BRPI0617664-0A
Authority: BR
Inventors: Kobara Miyuki
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2005-10-21
Filing date: 2006-10-20
Publication date: 2011-08-02
Also published as: IL190991A; EP1941908A1; AU2006305119B2; EP1941908B1; ZA200804238B; BRPI0617664B1; HK1124534A1; KR101239051B1; CA2626688A1; RU2008120019A; CN101330930B; US20090220500A1; EP1941908A4; KR20080064172A; CA2626688C; NO20082311L; AU2006305119A1; US8945558B2; RU2450830C2; IL190991A0

Abstract

<B>AGENTE PARA TRATAR ENFARTE DO MIOCáRDIO E PARA SUPRIMIR A REMODELAGEM VENTRICULAR ESQUERDA DEPOIS DO ENFARTE DO MIOCáRDIO E USO DO INIBIDOR DE IL-6<D>A presente invenção refere-se a efeitos dos anticorpos do receptor anti-IL-6 na melhoria da condição de áreas enfartadas no enfarte do mio-cárdio, e na supressão da remodelagem ventricular esquerda depois do enfarte do miocárdio. Como resultado, a administração dos anticorpos do receptor anti-IL-6 significativamente suprimiu o aumento da atividade de MPO na área enfartada e suprimiu a expressão de MCP-1 do miocárdio tanto na área enfartada quanto na área não-enfartada. Além disso, os exames eco-cardiográficos e histológicos revelaram que a hipertrofia cardíaca também é suprimida.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGENTE PARATRATAR ENFARTE DO MIOCÁRDIO E PARA SUPRIMIR A REMODELA-GEM VENTRICULAR ESQUERDA DEPOIS DO ENFARTE DO MIOCÁRDIOE USO DO INIBIDOR DE IL-6".

Campo técnico

A presente invenção refere-se aos agentes para tratar enfarte domiocárdio, os quais compreendem um inibidor da IL-6 como um ingredienteativo e seus usos. Além disso, a presente invenção refere-se aos agentes parasuprimir o remodelamento ventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio,o qual compreende um inibidor da IL-6 como um ingrediente ativo e seus usos.

Técnica anterior

Enfarte do miocárdio é uma das doenças cardíacas isquêmicas.Ele é um distúrbio que causa a necrose do miocárdio onde a constrição da arté-ria coronária cardíaca ocorre devido à arteriosclerose e similares, e a circulaçãosangüínea da artéria coronária se torna dramaticamente reduzida ou interrom-pida. A expansão e/ou deterioração da área enfartada causa complicações taiscomo falência cardíaca e/ou arritmia severa induzida por isquemia, e o aumentoda ameaça à morte.

Conforme o enfarte do miocárdio progride, as células do miocárdionas áreas enfartadas morrem e/ou são descartadas, e são deslocadas por teci-dos fibrosos tais como fibra de colágeno. Tal área enfartada não tem contratili-dade, e falha ao resistir à pressão intracardíaca que surge com a contraçãocardíaca, e então as paredes fibrosas se estendem delgadamente. Como resul-tado, para compensar a hipofunção, a hipertrofia da cavidade endocardial naárea não-enfartada e a dilatação do ventrículo esquerdo inteiro são induzidas.Esse fenômeno é chamado de remodelamento ventricular esquerdo e é conhe-cido por reduzir adicionalmente a função cardíaca e aumentar a morbidez e amortalidade conseqüentemente. Dessa forma, para melhorar o prognóstico doenfarte do miocárdio, é considerado importante suprimir a progressão do remo-delamento ventricular esquerdo tão antes quanto possível, e o desenvolvimentode métodos de tratamento eficazes é desejado.

IL-6 é uma citocina chamada de fator estimulador de células B 2(BSF2) ou interferon β2. IL-6 foi descoberta como um fator de diferenciaçãoenvolvido na ativação dos linfócitos das células B (Documento Não-Patente1) e foi depois descrita como sendo uma citocina multifuncional que influen-cia a função de várias células (Documento Não-Patente 2). IL-6 tem sidoreportada como indutora da maturação das células de linfócito T (DocumentoNão-Patente 3).

IL-6 transmite a sua atividade biológica através de dois tipos deproteínas na célula. Uma das proteínas é o receptor da IL-6, o qual é umaproteína de ligação ao Iigante à qual a IL-6 se liga e tem um peso molecularde cerca de 80 KDa (Documentos Não-Patente 4 e 5). Além de uma formaligada à membrana que penetra e é expressa na membrana celular, o recep-tor da IL-6 está presente como um receptor de IL-6 solúvel, o qual principal-mente consiste na região extracelular da forma ligada à membrana.

A outra é a proteína de membrana gp130, a qual tem um pesomolecular de cerca de 130 KDa e está envolvida na transdução de sinal deligação não-ligante. A atividade biológica da IL-6 é transmitida para a célulaatravés da formação do complexo IL6/receptor da IL-6 pela IL-6 e pelo re-ceptor da IL-6 e da ligação do complexo com gp130 depois (DocumentoNão-Patente 6).

Os inibidores da IL-6 são substâncias que inibem a transmissãoda atividade biológica da IL-6. Até agora, anticorpos contra a IL-6 (anticorposanti-IL-6), anticorpos contra os receptores da IL-6 (anticorpos receptores an-ti-IL-6), anticorpos contra a gp130 (anticorpos anti-gp130), variantes da IL-6,peptídeos parciais da IL-6 ou receptores da IL-6 e tais são conhecidos.

Existem vários relatórios considerando os anticorpos receptoresanti-IL-6 (Documentos Não-Patente 7 e 8; e Documentos de Patente 1 a 3).Um anticorpo PM-1 humanizado, o qual tenha sido obtido pelo transplanteem um anticorpo humano, a região determinante de complementaridade (C-DR) do anticorpo PM-1 de camundongo (Documento Não-Patente 9), o qualé um dos anticorpos dos receptores anti-IL-6, é conhecido (Documento dePatente 4).

Até agora, foi sugerido que a IL-6 afeta a função e estrutura docoração em vista dos fatos de que ela influencia negativamente a miocontra-tilidade (Documento Não-Patente 10), que a hipertrofia cardíaca se desen-volve em camundongos, nos quais gp130 é constantemente ativada devido àsuperexpressão da IL-6 e dos receptores de IL-6 (Documento Não-Patente11), e assim por diante. Depois do enfarte do miocárdio, a IL-6 é expressa noventrículo esquerdo, particularmente, na zona da borda do enfarte miocardialreperfusado (Documento Não-Patente 12), e o nível de expressão está rela-cionado com o tamanho do ventricular esquerdo (LV) depois do enfarte domiocárdio (Documento Não-Patente 13). Além disso, foi reportado que as cé-lulas do miocárdio geram a IL-6 sob estresse de baixo oxigênio (DocumentoNão-Patente 14), e que a expressão da citocina nas células não-muscularesdurante o remodelamento pós-enfarte desempenha um papel regulatório nasalterações da matriz extracelular (Documento Não-Patente 15). Além disso,considerando a relação entre o enfarte do miocárdio e a IL-6, o sistemaJAK/STAT ativado através da IL-6 é reportado por agir de maneira protetorano enfarte do miocárdio (Documento Não-Patente 16).

Por outro lado, de acordo com um experimento usando camun-dongos knockout IL-6, é reportado que a deficiência de IL-6 não teve influên-cia no tamanho da área enfartada, no remodelamento ventricular esquerdo,ou de tal maneira (Documento Não-Patente 17). Conforme descrito acima, opapel da IL-6 no enfarte do miocárdio e no remodelamento ventricular es-querdo depois do enfarte do miocárdio foi desconhecido.

As referências à técnica anterior relacionada com a presenteinvenção são mostradas abaixo.

Documento Não-Patente 1 Hirano, T. et al., Natute (1986) 324,73 a 76

Documento Não-Patente 2 Akira, S. et al., Adv. in Immunology(1993)54, 1 a 78

Documento Não-Patente 3 Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988)167, 1253 a 1258

Documento Não-Patente 4 Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987)166, 967 a 981Documento Não-Patente 5 Yamasaki, K. et alM Science (1988)241, 825 a 828

Documento Não-Patente 6 Taga1 T. et al., Cell (1989) 58, 573 a 581

Documento Não-Patente 7 Novick, D. et al, Hybridoma (1991)10, 137 a 146

Documento Não-Patente 8 Huang, Y. W. et al., Hybridoma(1993) 123, 621 a 630

Documento Não-Patente 9 Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989)143, 2900 a 2906

Documento Não-Patente 10 Finkel, M. S. et al., Science (1992)257, 387 a 389

Documento Não-Patente 11 Hirota, H. et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA (1995) 92, 4862 a 4866

Documento Não-Patente 12 Gwechenberger, M. et al., Circulati-on (1999) 99, 546 a 551

Documento Não-Patente 13 Ono, K. et al., Circulation (1998) 98,149 a 156

Documento Não-Patente 14 Yamauchi-Takibara, K. et al., Circu-Iation (1995) 91, 1520 a 1524

Documento Não-Patente 15 Yue, P. et al., Am. J. Physiol. (1998)275, H250 a H258

Documento Não-Patente 16 Negoro, S. et al., Cardiovasc. Res.(2000) 47, 797 a 805

Documento Não-Patente 17 Fuchs M. et al., FASEB J. (2003)17, 2118 a 2120

Documento de Patente 1 WO 95/09873

Documento de Patente 2 Publicação de Pedido de PatenteFrancesa Ns FR 2694767

Documento de Patente 3 Patente U.S. Nq 5216128

Documento de Patente 4 WO 92/19759Descrição da invenção

Problemas a serem solucionados pela invenção

Até agora, a IL-6 tem sido sugerida como estando envolvida noenfarte do miocárdio e no conseqüente remodelamento ventricular esquerdo.

Entretanto, seu papel detalhado não foi ainda esclarecido. Além disso, nãofoi descrito que tipo de efeito a administração do inibidor da IL-6 deve mos-trar no enfarte do miocárdio e no conseqüente remodelamento ventricularesquerdo.

A presente invenção tem sido feita sob tais circunstâncias, e umobjetivo da presente invenção é proporcionar agentes para tratar o enfartedo miocárdio, os quais compreendem um inibidor da IL-6 como um ingredi-ente ativo. Além disso, a presente invenção proporciona agentes para su-primir o remodelamento ventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio,o qual compreende um inibidor da IL-6 como um ingrediente ativo. Além dis-so, outros objetivos da presente invenção são para proporcionar métodospara tratar o enfarte do miocárdio e métodos para suprimir o remodelamentoventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio, ambos os quais com-preendem a etapa de administrar um inibidor da IL-6 a indivíduos os quaistenham desenvolvido o enfarte do miocárdio.

Meios de solucionar os problemas

Para solucionar os problemas acima, os presentes inventoresinvestigaram os efeitos dos anticorpos do receptor anti-IL-6 na melhoria dacondição de uma área enfartada no enfarte do miocárdio, e na supressão doremodelamento ventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio.

Primeiro, os presentes inventores produziram modelos de enfar-te do miocárdio pela ligação da ramificação descendente anterior esquerdaem camundongos machos Balb/C. A seguir, 500 μg de um anticorpo do re-ceptor anti-IL-6 (MR16-1) foram intraperitonealmente administrados no ca-mundongo modelo de enfarte do miocárdio.

Como resultado, o aumento da atividade da mieloperoxidase(MPO) na área enfartada do miocárdio foi significativamente suprimida. Alémdisso, a expressão da proteína 1 quimioatratora de monócito miocardial(MCP-1) foi suprimida tanto na área enfartada quanto na área não-enfartadados camundongos administrados com anticorpo do receptor anti-IL-6. Alémdisso, tanto a ecocardiografia quanto os exames histológicos revelaram quea hipertrofia cardíaca foi suprimida em um camundongo administrado comanticorpo do receptor anti-IL-6.

Dessa forma, os presentes inventores descobriram, pela primei-ra vez, que é possível melhorar a condição de uma área enfartada no enfartedo miocárdio e suprimir o remodelamento ventricular esquerdo depois doenfarte do miocárdio pela administração de um anticorpo receptor anti-IL-6, efinalmente completaram a presente invenção.

Especificamente, a presente invenção proporciona:

[1] um agente para tratar enfarte do miocárdio, o qual compre-ende um inibidor da IL-6 como um ingrediente ativo;

[2] o agente, de [1], em que o inibidor da IL-6 é um anticorpo quereconhece a IL-6;

[3] o agente de [1], em que o inibidor da IL-6 é um anticorpo quereconhece o receptor da IL-6;

[4] o agente de [2] ou [3], em que o anticorpo é um anticorpomonoclonal;

[5] o agente de [2] ou [3], em que o anticorpo é um anticorpocontra a IL-6 humana ou um receptor da IL-6 humana;

[6] o agente de [2] ou [3], em que o anticorpo é um anticorpo re-combinante;

[7] o agente de [6], em que o anticorpo é um anticorpo quiméri-co, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano;

[8] um agente para suprimir a remodelagem ventricular esquerdadepois do enfarte do miocárdio, o qual compreende um inibidor da IL-6 comoum ingrediente ativo;

[9] agente de [8], em que o inibidor da IL-6 é um anticorpo quereconhece a IL-6;

[10] o agente de [8], em que o inibidor da IL-6 é um anticorpoque reconhece o receptor da IL-6;[11] o agente de [9] ou [10], em que o anticorpo é um anticorpomonoclonal;

[12] o agente de [9] ou [10], em que o anticorpo é um anticorpocontra a IL-6 humana ou um receptor da IL-6 humana;

[13] o agente de [9] ou [10], em que o anticorpo é um anticorporecombinante;[14] o agente de [13], em que o anticorpo é um anticorpo quimé-rico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano;

[15] o agente de qualquer uma de [8] a [14], o qual é usado paratratar o enfarte do miocárdio;

[16] um método para tratar enfarte do miocárdio em um indiví-duo, o qual compreende a etapa de administrar um inibidor da IL-6 a um in-divíduo o qual tenha desenvolvido enfarte do miocárdio;

[17] um método para suprimir o remodelamento ventricular es-querdo depois do enfarte do miocárdio em um indivíduo, o qual compreendea etapa de administrar um inibidor da IL-6 a um indivíduo o qual tenha de-senvolvido enfarte do miocárdio;

[18] o método de [16] ou [17], em que o inibidor da IL-6 é um an-ticorpo que reconhece a IL-6.;

[19] o método de [16] ou [17], em que o inibidor da IL-6 é um an-

ticorpo que reconhece um receptor da IL-6;

[20] o método de [18] ou [19], em que o anticorpo é um anticorpomonoclonal;

[21] o método de [18] ou [19], em que o anticorpo é um anticorpocontra a IL-6 humana ou um anticorpo contra um receptor da IL-6 humana;

[22] o método de [18] ou [19], em que o anticorpo é um anticorporecombinante;

[23] o método de [22], em que o anticorpo é um anticorpo quimé-rico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano;

[24] uso do inibidor da IL-6 para a produção de um agente paratratar o enfarte do miocárdio;

[25] uso do inibidor da IL-6 para a produção de um agente parasuprimir o remodelamento ventricular esquerdo depois do enfarte do miocár-dio;

[26] o uso de [24] ou [25], em que o inibidor da IL-6 é um anti-corpo que reconhece a IL-6;

[27] o uso de [24] ou [25], em que o inibidor da IL-6 é um anti-

corpo que reconhece um receptor da IL-6;

[28] o uso de [26] ou [27], em que o anticorpo é um anticorpo

monoclonal;

[29] o uso de [26] ou [27], em que o anticorpo é um anticorpocontra a IL-6 humana ou um anticorpo contra um receptor da IL-6 humana;

[30] o uso de [26] ou [27], em que o anticorpo é um anticorpo re-combinante; e

[31] 0 uso de [30], em que o anticorpo é um anticorpo quimérico,um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.Melhor forma de executar a invenção

Os presentes inventores descobriram que a melhoria da condi-ção da área enfartada no enfarte do miocárdio e a supressão no remodela-mento ventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio pode ser alcan-çada pela administração de u, anticorpo receptor anti-IL-6. A presente inven-ção é baseada nessas descobertas.

A presente invenção se refere a agentes para tratar enfarte domiocárdio e agentes para suprimir o remodelamento ventricular esquerdodepois do enfarte do miocárdio, ambos os quais compreendem um inibidorda IL-6 como um ingrediente ativo.

Aqui, um "inibidor da IL-6" é uma substância que bloqueia atransdução de sinal mediada pela IL-6 e inibe a atividade biológica da IL-6.Preferivelmente, o inibidor da IL-6 é uma substância que tem uma funçãoinibitória contra a ligação da IL-6, do receptor da IL-6 ou de gp130.

Os inibidores da IL-6 da presente invenção incluem, porém nãoestão limitados, por exemplo, a anticorpos anti-IL-6, a anticorpos do receptoranti-IL-6, a anticorpos anti-gp130, a variantes da IL-6, a variantes do recep-tor da IL-6 solúveis e a peptídeos parciais da IL-6 ou dos receptores da IL-6e a compostos de baixo peso molecular que apresentam atividades seme-lhantes. Preferivelmente, inibidores da IL-6 da presente invenção incluemanticorpos que reconhecem receptores da IL-6.

A fonte do anticorpo não está particularmente restrita na presen-te invenção; entretanto o anticorpo é preferivelmente derivado de mamíferos,e mais preferivelmente derivado de seres humanos.

O anticorpo anti-IL-6 usado na presente invenção pode ser obti-do como um anticorpo policlonal ou monoclonal através de meios conheci-dos. Particularmente, anticorpos monoclonais derivados de mamíferos sãopreferidos como o anticorpo anti-IL-6 usado na presente invenção. Os anti-corpos monoclonais derivados de mamíferos incluem aqueles produzidos apartir de hibridomas e aqueles produzidos a partir de hospedeiros transfor-mados com um vetor de expressão que compreenda um gene de anticorpopor métodos de engenharia genética. Pela ligação a IL-6, o anticorpo inibe aligação da IL-6 a um receptor de IL-6 e bloqueia a transmissão da atividadebiológica da IL-6 na célula.

Tais anticorpos incluem MH166 (MAtsuda, T. et al., Eur. J. Im-munol. (1988) 18, 951 a 956), anticorpo SK2 (Sato, K. et al., transaction ofthe 21st Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology (1991) 21,166) e assim por diante.

Basicamente, hibridomas produtores de anticorpo anti-IL-6 po-dem ser preparados usando técnicas conhecidas como se segue. Especifi-camente, tais hibridomas podem ser preparados pelo uso da IL-6 como umantígeno sensibilizador para efetuar a imunização por um método de imuni-zação convencional, fundindo as células imunes obtidas com células de ori-gem conhecidas por um método de fusão de células convencional, e varren-do por células produtoras de anticorpos monoclonais por um método de var-redura convencional.

Mais especificamente, anticorpos anti-IL6 podem ser produzidoscomo se segue. Por exemplo, a IL-6 humana usada como o antígeno sensi-bilizador para obter anticorpos pode ser obtida usando o gene da IL-6 e/ouseqüências de aminoácidos descritas na Eur. J. Biochem. (1987) 168, 543 a550; J. Immunol. (1988) 140, 1534 a 1541; e/ou Agr. Biol. Chem. (1990) 54,2685 a 2688.

Depois de transformar uma célula hospedeira apropriada comum sistema de vetor de expressão conhecido inserido com uma seqüênciade gene da IL-6, a proteína IL-6 desejada é purificada por um método co-nhecido de dentro da célula hospedeira ou a partir do sobrenadante da cultu-ra. Essa proteína IL-6 purificada pode ser usada como o antígeno sensibili-zante. Alternativamente, uma proteína de fusão da proteína IL-6 e outra pro-teína podem ser usadas como o agente sensibilizante.

Anticorpos receptores anti-IL-6 usados para a presente invençãopodem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais por métodosconhecidos. Particularmente, os anticorpos do receptor anti-IL-6 usados napresente invenção são preferivelmente anticorpos monoclonais derivados demamíferos. Os anticorpos monoclonais derivados de mamíferos incluem a-queles produzidos a partir de hibridomas e aqueles produzidos a partir dehospedeiros transformados com um vetor de expressão que compreende umgene de anticorpo por métodos de engenharia genética. Pela ligação a umreceptor da IL-6, o anticorpo inibe a IL-6 de se ligar ao receptor da IL-6 ebloqueia a transmissão da atividade biológica da IL-6 na célula.

Tais anticorpos incluem o anticorpo MR16-1 (Tamura, T. et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90, 11924 a 11928); o anticorpo PM-1 (Hi-rata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900 a 2906); o anticorpo AUK12-20,o anticorpo AUK64-7 e o anticorpo AUK146-15 (WO 92/19759); e assim pordiante. Dentre esses, o anticorpo PM-1 pode ser exemplificado como umanticorpo monoclonal preferido contra o receptor da IL-6 humana, e o anti-corpo da MR16-1 como um anticorpo monoclonal preferido contra o receptorda IL-6 de camundongo.

Basicamente, hibridomas produtores de um anticorpo monoclo-nal do receptor anti-IL-6 podem ser preparados usando técnicas conhecidascomo se segue. Especificamente, tais hibridomas podem ser preparadospelo uso de um receptor de IL-6 como o antígeno sensibilizador para execu-tar a imunização por um método de imunização convencional, fundindo ascélulas imunes obtidas com uma célula de origem conhecida por um métodode fusão de células convencional, e varrendo por células produtoras de anti-corpo monoclonal por um método de varredura convencional.

Mais especificamente, anticorpos de receptores anti-IL-6 podemser produzidos como se segue. Por exemplo, um receptor da IL-6 humanaou um receptor da IL-6 de camundongo como o antígeno sensibilizante paraobter o anticorpo pode ser obtido usando os genes do receptor de IL-6 e/ouas seqüências de aminoácidos descritas na Publicação de Pedido de Paten-te Européia Ns EP 325474, e na Publicação Kokai do Pedido de Patente Ja-ponesa N9 (JP-A) Hei 3-155795, respectivamente.

Existem dois tipos de proteínas receptoras da IL-6, isto é, a pro-teína expressa na membrana celular e a proteína separada da membranacelular (receptor de IL-6 solúvel) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990)108, 673 a 676). O receptor da IL-6 solúvel consiste essencialmente da regi-ão extracelular do receptor da IL-6 ligado à membrana celular, e difere doreceptor de IL-6 ligado à membrana pelo fato de que lhe falta a regiãotransmembranar ou tanto a região transmembranar quanto a intracelular.Qualquer receptor de IL-6 pode ser empregado como a proteína receptorada IL-6 contanto que ele possa ser usado como um antígeno sensibilizantepara produzir o anticorpo receptor anti-IL-6 utilizado na presente invenção.

Depois de transformar uma célula hospedeira apropriada comum sistema de vetor de expressão conhecido inserido com uma seqüênciade genes receptores da IL-6, a proteína receptora IL-6 desejada é purificadapor um método conhecido do interior da célula hospedeira ou do sobrena-dante da cultura. Essa proteína do receptor da IL-6 purificada pode ser usa-da como um agente sensibilizante. Alternativamente, uma célula expressan-do o receptor da IL-6 ou uma proteína de fusão da proteína receptora da IL-6e outra proteína pode ser utilizada como um antígeno sensibilizante.

Anticorpos anti-gp130 usados na presente invenção podem serobtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais por métodos conheci-dos. Particularmente, os anticorpos anti-gp130 usados na presente invençãosão preferivelmente anticorpos monoclonais derivados de mamíferos. Osanticorpos monoclonais derivados de mamíferos incluem aqueles produzidosa partir de hibridomas e aqueles produzidos a partir de hospedeiros trans-formados com um vetor de expressão que compreende um gene de anticor-po por métodos de engenharia genética. Pela ligação ao gp130, o anticorpoinibe a gp130 da ligação ao complexo IL-6/receptor de IL-6 e bloqueia atransmissão da atividade biológica da IL-6 na célula.

Tais anticorpos incluem o anticorpo AM64 (JP-A Hei 3-219894);o anticorpo 4B11 e o anticorpo 2H4 (US 5571513); o anticorpo B-S12 e oanticorpo B-P8 (JP-A Hei 8-291199); e assim por diante.

Basicamente, hibridomas produtores do anticorpo monoclonalAnti-gp130 podem ser preparados usando técnicas conhecidas como se se-gue. Especificamente, tais hibridomas podem ser preparados pelo uso degp130 como um antígeno sensibilizante para efetuar a imunização por ummétodo de imunização convencional, fundindo as células imunes obtidascom uma célula de origem conhecida por um método de fusão celular con-vencional, e varrendo por células produto das de anticorpos monoclonais porum método de varredura convencional.

Mais especificamente, o anticorpo monoclonal pode ser produzi-do como se segue. Por exemplo, gp130 usado como um antígeno sensibili-zante para obter anticorpo pode ser obtido usando o gene gp130 e/ou a se-qüência de aminoácidos descrita na Publicação do Pedido de Patente Euro-péia Ne EP 411946.

Depois de transformar uma célula hospedeira apropriada comum sistema de vetor de expressão conhecido inserido com uma seqüênciade gene gp130, a proteína gp130 desejada é purificada por um método co-nhecido de dentro da célula hospedeira ou do sobrenadante de cultivo. Essaproteína gp130 purificada pode ser usada como um antígeno sensibilizante.Alternativamente, uma célula expressando gp130 ou uma proteína de fusãoda proteína gp130 e outra proteína podem ser usados como um antígenosensibilizante.

Mamíferos a serem imunizados com um agente sensibilizantenão são particularmente limitados, porém são preferivelmente selecionadosem consideração da compatibilidade com a célula de origem usada para fu-são celular. Geralmente, roedores tais como camundongos, ratos e hamsterssão usados.

A imunização de animais com um agente sensibilizante é efetu-ada de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, como um métodogeral, ela é efetuada pela injeção do antígeno sensibilizante intraperitonealou subcutaneamente em mamíferos. Especificamente, o antígeno sensibili-zante é preferivelmente diluído ou suspenso em uma quantidade apropriadade salina tamponada com fosfato (PBS), salina fisiológica ou parecido, mis-turado com uma quantidade apropriada de um adjuvante geral (por exemplo,adjuvante completo de Freund), emulsificado e, a seguir, administrado porvárias vezes a cada 4 a 21 dias a um mamífero. Além disso, um veículo a -propriado pode ser usado para a imunização com um agente sensibilizante.

Após tal imunização, um nível aumentado do anticorpo desejado no soro é confirmado e, a seguir, as células imunes são obtidas a partir domamífero para a fusão celular. Células imunes preferidas para a fusão celu-lar incluem, particularmente, células do baço.

Para as células do mieloma de mamífero serem usadas comouma célula de origem, isto é, uma célula parceira para ser fundida com ascélulas imunes acima, várias cepas de células conhecidas, por exemplo,P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol (1979) 123, 1548 a 155),P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1a 7), NS-1 (Kohler, G e Milstein, C. Eur., J. Immunol. (1976) 6, 511 a 519,MPC-11 (Marguiles, D. H. et al., Cell (1976) 8, 405 a 415), SP2/0 (Shulman,M. et al., Nature (1978) 276, 269 a 270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Im-munol. Methods (1980) 35, 1 a 21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978) 148, 313 a 323), R210 (Galfre, G et al., Nature (1979) 277, 131 a 133)e tais são apropriadamente usados.

Basicamente, a fusão celular da célula imune e da célula de mie-Loma anteriormente mencionadas pode ser efetuada usando métodos co-nhecidos, por exemplo, o método de Milstein et al. (Kohler, G. e Milstein, C.,Methods Enzymol. (1981), 3 a 46) e tais.Mais especificamente, a fusão celular anteriormente mencionadaé alcançada em meio de cultivo nutriente geral sob a presença de um agenteintensificador de fusão celular. Por exemplo, polietilenoglicol (PEG), vírusSendai (HVJ) e tais são usados como um agente intensificador de fusão.

Além disso, para aumentar a eficiência de fusão, agentes adjuvantes taiscomo dimetilsulfóxido podem ser adicionados para uso de acordo com asnecessidades.

A proporção de células imunes e de células de mieloma usadasé preferivelmente, por exemplo, de 1 a 10 células imunes para cada célulade mieloma. O meio de cultura usado para a fusão anteriormente menciona-da é, por exemplo, o meio de cultura RPMI1640 ou MEM, os quais são ade-quados para a proliferação das células de mieloma anteriormente menciona-das. Um meio de cultivo geral usado para cultivar esse tipo de célula tam-bém pode ser usado. Além disso, os suplementos do soro, tal como soro debezerro fetal (FCS) podem ser usados em combinação.

Para a fusão celular, as células de fusão (hibridomas) de inte-resse são formadas pela mistura de quantidades predeterminadas da célulaimune e da célula de mieloma anteriormente mencionadas bem no meio decultura anteriormente mencionado, e a seguir pela adição e mistura de umaconcentração de 30 a 60% (p/v) de solução PEG (por exemplo, uma soluçãoPEG com um peso molecular médio de cerca de 1.000 até 6.000) pré-aquecida até cerca de 37°C. A seguir, os agentes de fusão celular e tais; quenão são adequados para o crescimento do hibridoma podem ser removidospela repetição das etapas de adição sucessiva de um meio de cultura apro-priado e pela remoção do sobrenadante por centrifugação.

Os hibridomas acima são selecionados pelo cultivo de célulasem um meio de cultura de seleção geral, por exemplo, o meio de culturaHAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). Ocultivo no meio de cultura HAT é continuado por um período de tempo sufici-ente, geralmente por vários dias até várias semanas, para matar células dife-rentes dos hibridomas de interesse (células não-fundidas). A seguir, o méto-do de diluição limitado padrão é efetuado para varrer e clonar hibridomasque produzem o anticorpo de interesse.

Além do método de imunizar um animal não-humano com umantígeno para obter os hibridomas anteriormente mencionados, um anticorpohumano desejado que tenha a atividade de ligação em um antígeno deseja-do ou em uma célula expressando antígeno pode ser obtido pela síntese deum linfócito humano com uma proteína de antígeno desejada ou de uma cé-lula expressando antígeno in vitro, e fundindo o linfócito B sensibilizado comuma célula de mieloma humana (por exemplo, U266) (vide a Publicação Ko-koku do Pedido de Patente Japonesa Ne (JP-B) Hei 1-59878 (pedido de pa-tente japonesa aprovado e examinado publicado para oposição)). Além dis-so, um anticorpo humano desejado pode ser obtido pela administração doantígeno ou da célula que expressa o antígeno para um animal transgênicoque tenha um repertório de genes de anticorpo humano e, a seguir, seguin-do o método anteriormente mencionado (vide as Publicações de Pedido dePatente Internacional Nss WO 93/1227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO94/25585, WO 96/34096 e WO 96/33735).

Os hibridomas preparados dessa forma, os quais produzem an-ticorpos monoclonais, podem ser subcultivados em meio de cultura conven-cional e estocados em nitrogênio líquido por um longo período.

Para obter anticorpos monoclonais a partir dos hibridomas ante-riormente mencionados, os seguintes métodos podem ser empregados: (1)método onde os hibridomas são cultivados de acordo com métodos conven-cionais e os anticorpos são obtidos como um sobrenadante de cultura; (2)método onde os hibridomas se proliferam pela administração deles a ummamífero compatível e os anticorpos são obtidos como ascites; e assim pordiante. O primeiro método é preferido para obter anticorpo com alta pureza,e o último é preferido para a produção em larga escala de anticorpos.

Por exemplo, a preparação de hibridomas produtores de anticor-po de receptor anti-IL-6 pode ser efetuada pelo método descrito em JP-A Hei3-139293. A preparação pode ser efetuada pelo método de injeção de umhibridoma produtor de anticorpo PM-1 na cavidade abdominal de um ca-mundongo BALB/c, obtendo a ascite, e a seguir purificando o anticorpo PM-1da ascite, ou o método de cultivo do hibridoma em um meio apropriado (porexemplo, meio RPMI1640 contendo 10% de soro bovino fetal, e 5% de BM-Condimed H1 (Boehringer Mannheim); hibridoma de "meio SFM (GIBCO-BRL); meio PFHM-II (GIBCO-BRL), etc.) e a seguir obtendo o anticorpo PM-1 do sobrenadante cultivado.

Um anticorpo recombinante pode ser usado como um anticorpomonoclonal da presente invenção, em que o anticorpo é produzido atravésde técnicas de recombinação genética pela clonagem de um gene de anti-corpo de um hibridoma, inserindo o gene em um vetor apropriado e, a se-guir, introduzindo o vetor em um hospedeiro (vide, por exemplo, Borrebaeck,C. A. K., e Larrick, J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990).

Mais especificamente, mRNA codificando para a região variável(V) de um anticorpo é isolado de uma célula que produza o anticorpo de inte-resse, tal como um hibridoma. O isolamento do mRNA pode ser efetuadopelo preparo de RNA total de acordo com métodos conhecidos, tais como ométodo de ultracentrifugação de guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemis-try (1979) 18, 5294 a 5299) e o método AGPC (Chomezynski, P. et al., Anal.Biochem. (1987) 162, 156 a 159) e preparando mRNA usando o kit de purifi-cação de mRNA (Pharmacia) e tais. Alternativamente, mRNA pode ser dire-tamente preparado usando o kit de purificação mRNA QuickPrep. (Pharma-cia).

cDNA da região V do anticorpo é sintetizado a partir do mRNAobtido usando a transcriptase reversa. A síntese de cDNA pode ser alcança-da pelo uso do Kit de Sintese de cDNA de primeiro filamento da Transcripta-se Reversa AMV, e assim por diante. Além disso, para sintetizar e amplificaro cDNA, o método 5'-RACE (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA (1988) 85, 8998 a 9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids REs. (1989)17, 2919 a 2932) usando o kit 5'-Ampli FINDER RACE (CIontech) e PCRpodem ser empregados. O fragmento de DNA de interesse é purificado apartir dos produtos de PCR obtidos e, a seguir, ligado com um DNA vetor. Aseguir, um vetor recombinante é preparado usando o DNA acima e introdu-zindo em Escherichia coli ou tal, e suas colônias são selecionadas para pre-parar o vetor recombinante desejado. A seqüência de nucleotídeos do DNAde interesse é confirmada, por exemplo, pelo método de dideóxi.

Quando um DNA codificando a região V de um anticorpo de inte-resse é obtido, o DNA é ligado com um DNA que codifica uma região cons-tante do anticorpo desejada (região C) e inserido em um vetor de expressão.Alternativamente, o DNA codificando a região V do anticorpo pode ser inse-rido em um vetor de expressão compreendendo o DNA de uma região C doanticorpo.

Para produzir um anticorpo para ser usado na presente inven-ção, conforme descrito abaixo, o gene do anticorpo é inserido em um vetorde expressão de fora que ele é expresso sob o controle da região reguladorade expressão, por exemplo, intensificador e promotor. A seguir, o anticorpopode ser expresso pela transformação de uma célula hospedeira com o seuvetor de expressão.

Na presente invenção, para reduzir a heteroantigenicidade con-tra seres humanos e tais, anticorpos recombinantes genéticos artificialmentemodificados, por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizadosou anticorpos humanos podem ser usados. Esses anticorpos modificadospodem ser preparados usando métodos conhecidos.

Um anticorpo quimérico pode ser obtido pela ligação do DNAcodificando a região V do anticorpo obtido conforme acima com um DNAcodificando a região C do anticorpo humano inserindo o DNA em um vetorde expressão e introduzindo este em um hospedeiro para produção (vide aPublicação do Pedido de Patente Européia Ne EP 125023; A Publicação doPedido de Patente Internacional Nq WO 92/19759). Esse método conhecidopode ser usado para obter anticorpos quiméricos úteis para a presente in-venção.

Anticorpos humanizados são também referidos como anticorposhumanos remodelados, e são anticorpos em que as regiões determinantesde complementaridade (CDRs) de um anticorpo de um mamífero diferentedo humano (por exemplo, um anticorpo de camundongo) são transferidaspara os CDRs de um anticorpo humano. Métodos gerais para essa recombi-nação gênica são também conhecidos (vide a Publicação do Pedido de Pa-tente Européia Ne EP 125023, a Publicação do Pedido de Patente Interna-cional No. WO 92/19759).

Mais especificamente, uma seqüência de DNA designada demodo que os CDRs de um anticorpo de camundongo são ligados com asregiões de estrutura (FRs) de um anticorpo humano é sintetizada por PCR apartir de vários oligonucleotídeos que foram produzidos para conter porçõessobreponíveis nos seus terminais. O DNA obtido é ligado com um DNA codi-ficante da região C do anticorpo humano e, a seguir, inserido em um vetorde expressão. O vetor de expressão é introduzido em um hospedeiro paraproduzir o anticorpo humanizado (vide a Publicação do Pedido de PatenteEuropéia No. EP 239400, a Publicação do Pedido de Patente Internacional NeWO 92/19759).

As FRs do anticorpo humano a serem ligadas através dos CDRssão selecionadas de modo que as CDRs de um sítio de ligação de antígenoadequado. O(s) aminoácido(s) nas FRs das regiões variáveis do anticorpopodem ser substituídos conforme necessário de modo que os CDRs do anti-corpo humano remodelado formem um sítio de ligação de antígeno apropri-ado (Sato, K. et al., Câncer REs. (1993) 53, 851 a 856).

Regiões C de anticorpos humanos são usadas para os anticor-pos quiméricos e humanizados, e incluem Cy. Por exemplo, Cy1, Cy2, Cy3 eCy4 podem ser usados. Além disso, para melhorar a estabilidade do anticor-po ou de sua produção, as regiões C do anticorpo humano podem ser modi-ficadas.

Anticorpos quiméricos consistem da região variável de um anti-corpo derivado de mamíferos não-humanos e de uma região C derivada deanticorpo humano; e anticorpos humanizados consistem dos CDRs de umanticorpo derivado de mamíferos não-humanos e as regiões de estrutura eas regiões C derivadas de um anticorpo humano. Ambas têm antigenicidadereduzida no corpo humano e, dessa forma, são úteis como anticorpos paraserem usados na presente invenção.Exemplos específicos preferidos de anticorpos humanizados u-sados na presente invenção incluem um anticorpo PM-1 humanizado (vide aPublicação do Pedido de Patente Internacional Ne WO 92/19759).

Além disso, além do método anteriormente mencionado para ob-ter um anticorpo humano, técnicas para obter anticorpos humanos por penei-ração usando uma biblioteca de anticorpo humano também são conhecidas.Por exemplo, é possível expressar as regiões variáveis de anticorpos huma-nos na superfície dos fagos como anticorpos de cadeia individual (scFv) pelométodo de apresentação de fagos, e a seguir selecionar os fagos de ligaçãoa antígeno. Pela análise dos genes dos fagos selecionados, as seqüênciasde DNA que codificam as regiões variáveis do anticorpo humano que se li-gam ao antígeno podem ser determinadas. Uma vez que a seqüência doDNA de um scFV que se liga ao antígeno é descrita, um vetor de expressãoapropriado compreendendo a seqüência pode ser construído para obter umanticorpo humano. Esses métodos já são conhecidos, e as publicações deWO 92/01047, WO 92/20791, W093/06213, WO 93/11236, WO 93/19172,WO 95/01438 e WO 95/15388 podem ser usadas como referência.

O gene do anticorpo construído acima pode ser expresso de a-cordo com os métodos convencionais. Quando uma célula de mamífero éusada, o gene do anticorpo pode ser expresso usando um DNA no qual ogene do anticorpo a ser expresso está funcionalmente ligado a um promotorcomumente usado útil e um sinal poli A a montante do gene do anticorpo, ouum vetor compreendendo o DNA. Exemplos de um promotor/intensificadorincluem o promotor/intensificador inicial imediato do citomegalovírus huma-no.

Além disso, outros promotores/intensificadores que podem serutilizados para expressar o anticorpo a ser usado na presente invenção in-cluem promotores/intensificadores virais de retrovírus, polioma vírus, adeno-vírus, vírus símio 40 (SV40) e tais; e promotores/intensificadores derivadosde células de mamíferos, tal como o fator de alongamento humano 1a(HEF1a).

Por exemplo, quando o promotor/intensificador SV40 é usado, aexpressão pode ser facilmente efetuada seguindo o método por Mulligan etal. (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108 a 114). Alternativamente,no caso do promotor/intensificador HEFIoc, o método por Mizushima et al.(Mizushima, S. e Nagata S., Nucleic Acids res. (1990) 18, 5322) pode ser usado.

Quando E. coli é usada, o gene do anticorpo pode ser expressopela ligação de forma funcional de um promotor útil convencional, uma se-qüência de sinal para a secreção do anticorpo e o gene do anticorpo paraser expresso. Exemplos de um promotor incluem o promotor IacZ, o promo-tor araB e tais. quando o promotor IacZ é usado, a expressão pode ser efe-tuada de acordo com o método de Ward et al. (Ward, E. S. et al., Nature(1989) 341, 544 a 546; Ward., E. S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422 a 2427);e o promotor araB pode ser usado de acordo com o método de Better et al.(Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041 a 1043).

Quando o anticorpo é produzido no periplasma de E. coli, a se-qüência de sinal pel B (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 a 4383)pode ser usada como a seqüência sinal para a secreção de anticorpo. O an-ticorpo produzido no periplasma é isolado e, a seguir, usado depois do redo-bramento apropriado da estrutura do anticorpo (vide, por exemplo, WO96/30394).

Como a origem de replicação, aqueles derivados de SV40, poli-oma vírus, adenovírus papiloma vírus bovino (BPV) e tais podem ser usa-dos. Além disso, para aumentar a quantidade de cópias de gene em um sis-tema de células hospedeiras, o vetor de expressão pode compreender o ge-ne da aminoglicosideofosfotransferase (ΑΡΗ), o gene da timidina quinase(TK), o gene da fosforibosiltransferase (Ecogpt), o gene da diidrofolato redu-tase (dhfr) ou tal como um marcador de seleção.

Qualquer sistema de produção pode ser usado para preparar osanticorpos a serem usados na presente invenção. Os sistemas de produçãopara a preparação dos anticorpos incluem aqueles que usam células eucari-óticas ou células procarióticas.

Os sistemas de produção que usam células procarióticas inclu-em aqueles que utilizam células animais, células vegetais ou células fúngi-cas. Tais células animais incluem (1) células de mamíferos, por exemplo,CHO1 COS, mieloma, rim de hamster jovem (BHK), HeLa, VEro e tal; (2) cé-lulas anfíbias, por exemplo, Xenpus oocyte; e (3) células de inseto, por e-xemplo, sf9, sf21, Tn5 e tais. Células vegetais conhecidas incluem célulasderivadas de Nicotiana tabacum, as quais podem ser cultivadas como calos.Células fúngicas conhecidas incluem leveduras tais como Saccharomyces(por exemplo, S. cerevisiae), fungos de mofo tais como Aspergilius (por e-xemplo, Α. niger) e tais.

Sistemas de produção usando células procarióticas incluem a-queles usando células bacterianas, Células bacterianas conhecidas incluemE. eoii e Bacilius subtilis.

Anticorpos podem ser obtidos pela introdução de um gene deanticorpo de interesse nessas células por transformação, e cultivando ascélulas transformadas in vivo. O cultivo é efetuado de acordo com métodosconhecidos. Por exemplo, DMEM, MEM, RPM11640, IMDM, podem ser usa-dos como o meio de cultura, e suplementos de soro, tais como FCS, podemser usados juntamente. Além disso uma célula introduzida com um gene deanticorpo pode ser introduzida na cavidade abdominal ou tal de um animalpara produzir um anticorpo in vivo.

Por outro lado, sistemas de produção in vivo incluem aquelesque utilizam animais ou plantas. Sistemas de produção usando animais in-cluem aqueles que utilizam mamíferos ou insetos.

Mamíferos que podem ser usados incluem cabras, porcos, ove-lhas, camundongos, bovinos e tais (Vicki Glaser, SPECTRUM BiotechnologyApplications, 1993). Além disso, os insetos que podem ser usadas incluembichos da seda. Ao usar plantas, por exemplo, tabaco pode ser usado.

Um gene de anticorpo é introduzido nesses animais ou plantas,e um anticorpo é produzido no corpo dos animais ou plantas e, a seguir, sãorecuperados. Por exemplo, o gene do anticorpo é preparado como um genede fusão pela inserção do gene no meio de um gene codificando uma prote-ína, tal como uma β caseína de cabra, a qual é unicamente produzida noleite. Um fragmento de DNA compreendendo um gene de fusão inserido emum gene de anticorpo é injetado em um embrião de cabra, e o embrião éintroduzido em uma cabra fêmea. O anticorpo desejado é obtido a partir doleite produzido a partir do animal transgênico nascido da cabra que recebeuo embrião, ou produzido a partir de progênias do animal. Para aumentar aquantidade de leite que contém o anticorpo desejado produzido a partir dacabra transgênica, hormônios podem ser apropriadamente usados na cabratransgênica (Ebert, K. M., et al., Bio/Technology (1994) 12, 699 a 702).

Além disso quando um bicho da seda é usado, ele é infectadocom baculovírus inserido com o gene do anticorpo desejado, e o anticorpodesejado é obtido a partir do fluido corporal desse bicho da seda (Maeda, S.et al., Nature (1985) 315, 592 a 594). Além disso, quando tabaco é usado, ogene do anticorpo desejado é inserido em um vetor de expressão vegetal(por exemplo, pMON530) e o vetor é introduzido em uma bactéria tal comoAgrobacterium tumefaciens. Essa bactéria é usada para infectar o tabaco(por exemplo, Nicotiana tabacum) para obter o anticorpo desejado das folhasdesse tabaco (Julian, K. - C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131 a138).

Ao produzir um anticorpo em sistemas de produção in vitro ou invivo conforme descrito acima, DNAs codificando a cadeia pesada do anti-corpo (cadeia H) e a cadeia leve (cadeia L) podem ser inseridos nos vetoresde expressão separados e um hospedeiro é, a seguir, co-transformado comos vetores. Alternativamente, os DNAs podem ser inseridos em um únicovetor de expressão para transformar um hospedeiro (vide a Publicação doPedido de Patente Internacional Ne WO 94/11523).

Os anticorpos usados na presente invenção podem ser fragmen-tos de anticorpo ou seus produtos modificados contanto que eles possamser adequadamente usados na presente invenção. Por exemplo, fragmentosde anticorpo incluem Fab, F(ab')2, Fv e Fv de cadeia única (scFv) nos quaisos Fvsdas cadeias HeL serem ligadas através de um Iigante apropriado.

Especificamente, os fragmentos de anticorpo são produzidos portratar um anticorpo com uma enzima, por exemplo, papaína ou pepsina ou,alternativamente genes que codificam esses fragmentos são construídos,introduzidos em vetores de expressão, e expressos em uma célula hospe-deira apropriada (vide, por exemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152,2968 - 2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989)178, 476 a 496; Plueckthum, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989)178, 497 a 515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652 a 663;Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663 a 666; Bird, R.E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132 a 137).

Um scFv pode ser obtido pela ligação da região V da cadeia H epela região V da cadeia L de um anticorpo. No scFv, a região V da cadeia He pela região V da cadeia L são ligadas através de um ligante, preferivel-mente através de um ligante de peptídeo (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. A-cad. Sei. USA (1988) 85, 5879 a 5883). As regiões V das cadeias H e L emuma scFv podem ser derivadas de qualquer um dos anticorpos descritosacima. Ligantes peptídicos para ligação das regiões V incluem, por exemplo,um peptídeo de cadeia individual arbitrário consistindo de 12 a 19 resíduosde aminoácidos.

Um DNA codificando scFv pode ser obtido pelo uso de DNA co-dificando a cadeia H ou sua região Veo DNA codificando a cadeia L de suaregião V dos anticorpos anteriormente mencionados como moldes, PCRamplificando a porção de DNA que codifica a seqüência de aminoácidos de-sejada na seqüência molde usando iniciadores que definem o terminal daporção, e a seguir amplificando adicionalmente a porção de DNA amplificadacom um DNA codificando a porção do ligante de peptídeo e partes de inicia-dores que ligam ambas as extremidades do ligante à cadeia H e à cadeia L.

Além disso, uma vez que um DNA codificando scFv tenha sidoobtido, um vetor de expressão compreendendo o DNA e um hospedeirotransformado com o vetor pode ser obtido de acordo com métodos conven-cionais. Além disso, o scFv pode ser obtido de acordo com métodos conven-cionais usando o hospedeiro.

Semelhantemente conforme acima, esses fragmentos de anti-corpo podem ser produzidos a partir do hospedeiro pela obtenção e expres-são de seus genes. Aqui, "anticorpo" engloba esses fragmentos de anticor-po.

Como um anticorpo modificado, um anticorpo ligado a várias mo-léculas, tal como polietilenoglicol (PEG) pode ser usado. Aqui, "anticorpo"engloba esses anticorpos modificados. Esses anticorpos modificados podemser obtidos pela modificação química dos anticorpos obtidos. Tais métodossão já estabelecidos na técnica.

Os anticorpos produzidos e expressados como acima podem serisolados de dentro ou de fora da célula ou do hospedeiro, e purificados até ahomogeneidade. O isolamento e/ou a purificação dos anticorpos usados pa-ra a presente invenção pode ser efetuado por cromatografia de afinidade.Coluna a serem usadas para a cromatografia de afinidade incluem, por e-xemplo, a coluna de proteína Aea coluna de proteína G. Veículos usadospara a coluna de proteína A incluem, por exemplo, HyperD, POROS, Sepha-rose F. F. e tais. Além dos acima, outros métodos usados para o isolamentoe/ou purificação de proteínas comuns podem ser usados, e não são limita-dos de qualquer forma.

Por exemplo, os anticorpos usados para a presente invençãopodem ser isolados e/ou purificados pela seleção apropriada e pela combi-nação das cromatografias além da cromatografia por afinidade, filtros, ultra-filtração, "salting-out", diálise e tais. Cromatografias incluem, por exemplo,cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel etais. Essas cromatografias podem ser aplicadas em cromatografia líquida dealta eficiência (HPLC). Alternativamente, HPLC de fase reversa pode serusado.

A concentração dos anticorpos conforme obtidos acima pode serdeterminada pela medição da absorvância, de ELISA ou tal. Especificamen-te, a absorvância é determinada pela diluição apropriada da solução de anti-corpo com PBS(-), medindo a absorvância a 280 nm, e calculando a concen-tração (1,35 OD = 1 mg/mL). Alternativamente, ao usar ELISA, a mediçãopode ser efetuada como se segue. Especificamente, 100 μL de IgG anti-humana de cabra (TAG) diluída para 1 μg/mL, com tampão de bicarbonato0,1 M (pH 9,6) são adicionados em uma placa de 96 cavidades (Nunc) e in-cubados de um dia para o outro a 4°C para imobilizar o anticorpo. Depois dobloqueio, 100 μL de um anticorpo apropriadamente diluído da presente in-venção ou uma amostra apropriadamente diluída compreendendo o anticor-po, e a IgG humana (CAPPEL) são adicionadas como um padrão, e incuba-das por uma hora em temperatura ambiente.

Depois da lavagem, 100 μΙ_ de IgG anti-humana marcada comfosfatase alcalina diluída 5.000 χ (ΒΙΟ SOURCE) são adicionados e incuba-dos por uma hora em temperatura ambiente. Depois de outra lavagem, asolução do substrato é adicionada e incubada, e a absorvância a 405 nm émedida usando MICROPLATE READER Modelo 3550 (Bio-Rad) para calcu-lar a concentração do anticorpo de interesse.

As variantes IL-6 usadas na presente invenção são substânciasque têm a atividade de se ligar a um receptor de IL-6 e as quais não transmi-tem a atividade biológica da IL-6. Isto é, as variantes da IL-6 competem coma IL-6 para se ligar aos receptores IL-6, porém falham ao transmitir a ativida-de biológica da IL-6, bloqueando dessa forma a transdução de sinal mediadapela IL-6.

As variantes da IL-6 são produzidas pela introdução de muta-ções através da substituição dos resíduos de aminoácidos na seqüência deaminoácidos da IL-6. A origem da IL-6 usada como a base das variantes daIL-6 não é limitada; entretanto, ela é preferivelmente a IL-6 humana ao con-siderar a sua antigenicidade a tais.

Mais especificamente, a substituição de aminoácidos é efetuadapela predição da estrutura secundária da seqüência de aminoácidos da IL-6usando programas de modelagem molecular conhecidos (por exemplo,WHATIF; Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52 a 56) e avaliando adi-cionalmente a influência do(s) resíduo(s) de aminoácido(s) substituído(s) namolécula inteira. Depois de determinar o resíduo de aminoácido apropriadopara ser substituído, métodos de PCR comumente pré-formados são execu-tados usando a seqüência de nucleotídeos codificando do gene da IL-6 hu-mana como um molde para introduzir mutações de forma que os aminoáci-dos são substituídos, e dessa forma um gene codificando uma variante daIL-6 é obtida. Caso necessário, esse gene é inserido em um vetor de ex-pressão apropriado, e a variante da IL-6 pode ser obtida pela aplicação dosmétodos anteriormente mencionados para a expressão, produção e purifica-ção dos anticorpos recombinantes.

Exemplos específicos das variantes da IL-6 são descritos emBrakenhoff et al., J. Biol. Chem., (1994) 269, de 86 a 93, Savino et al., EM-BO J. (1994) 13, 1357 a 1367, WO 96/18648, e WO 96/17869.

Peptídeos parciais da IL-6 e peptídeos parciais dos receptoresda IL-6 a serem usados na presente invenção são substâncias que têm aatividade de se ligar aos receptores da IL-6 e IL-6, respectivamente, e osquais não transmitem a atividade biológica da IL-6. a saber, pela ligação ecaptura de um receptor IL-6 ou IL-6, o peptídeo parcial da IL-6 ou o peptídeoparcial do receptor da IL-6 inibe especificamente a IL-6 da ligação ao recep-tor da IL-6. Como resultado, a atividade biológica da IL-6 não é transmitida, edessa forma a transdução do sinal mediada pela IL-6 é bloqueada.

Os peptídeos parciais da IL-6 e do receptor da IL-6 são peptí-deos que compreendem parte ou toda da seqüência de aminoácidos da re-gião da seqüência de aminoácidos da IL-6 ou do receptor da IL-6 que estáenvolvida na ligação da IL-6 ou do receptor da IL-6. Tais peptídeos geral-mente compreendem de 10 a 80, preferivelmente de 20 a 50, mais preferi-velmente de 20 a 40 resíduos de aminoácidos.

Os peptídeos parciais da IL-6 ou os peptídeos parciais do recep-tor de IL-6 podem ser produzidos de acordo com métodos conhecidos ge-rais, por exemplo, técnicas de engenharia genética ou método de síntese depeptídeos, pela especificação da região da seqüência de aminoácidos da IL-6 ou do receptor da IL-6 que está envolvida na ligação da IL-6 ou do receptorda IL-6, e usando uma porção ou toda uma seqüência de aminoácidos daregião especificada.

Ao preparar um peptídeo parcial da IL-6 ou um peptídeo parcialdo receptor da IL-6 por um método de engenharia genética, uma seqüênciade DNA codificando o peptídeo desejado é inserida em um veto de expres-são, e então o peptídeo pode ser obtido pela aplicação dos métodos anteri-ormente mencionados para expressar, produzir e purificar anticorpos recom-binantes.

Para produzir um peptídeo parcial da IL-6 ou um peptídeo parcialdo receptor da IL-6 por métodos de síntese de peptídeos, os métodos desíntese de peptídeos geralmente usados, por exemplo, métodos de sínteseem fase sólida ou métodos de síntese em fase líquida podem ser usados.

Especificamente, a síntese pode ser efetuada seguindo o méto-do descrito em "Continuation of Development of Pharmaceuticals, Vol. 14,Peptide Synthesis (em Japonês) (ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Sho-ten)". Como um método de síntese em fase sólida, por exemplo, o seguintemétodo pode ser empregado: o aminoácido correspondendo ao C terminaldo peptídeo a ser sintetizado é ligado a um suporte que é insolúvel em sol-ventes orgânicos, a seguir alongando o filamento peptídico pela repetição demodo alternado (1) da reação de condensação dos aminoácidos cujos gru-pos α-amino e grupos funcionais da cadeia ramificada são protegidos comgrupos protetores apropriados um de cada vez na direção C- ou N-terminal;e (2) a reação de remoção dos grupos protetores dos grupos α-amino doaminoácido ou peptídeo ligado à resina. A síntese do peptídeo em fase sóli-da é amplamente classificada no método Boc e o método Fmoc baseando-se no tipo de grupo protetor usado.

Depois da proteína de interesse ser sintetizada conforme acima,a reação de desproteção e a reação para clivar o filamento peptídico do su-porte são executados. Para a reação de clivagem do filamento peptídico, emgeral, fluoreto de hidrogênio ou ácido trifluormetanossulfônico é usado parao método Boc, e TFA para o método Fmoc. De acordo com o método Boc,por exemplo, a resina peptídica protegida mencionada acima é tratada emfluoreto de hidrogênio sob a presença de anisol. A seguir, o peptídeo é recu-perado pela remoção do grupo protetor e pela clivagem do peptídeo do su-porte. Por liofilização do peptídeo recuperado, um peptídeo bruto pode serobtido. Por outro lado, no método de Fmoc, por exemplo, a reação de des-proteção e a reação para clivar o filamento peptídico do suporte podem serefetuadas em TFA por um método similar ao descrito acima.

O peptídeo bruto obtido pode ser separado e/ou purificado poraplicação de HPLC. A eluição pode ser efetuada sob condições ótimas u-sando um sistema de solvente água-acetonitrila, o qual é geralmente usadopara a purificação de proteína. As frações correspondendo aos picos do per-fil cromatográfico obtido são coletadas e liofilizadas. Dessa forma, as fraçõespeptídicas purificadas são identificadas por análise de peso molecular atra-vés da análise do espectro de massas, da análise da composição de amino-ácidos, da análise da seqüência de aminoácidos ou tal.

Exemplos específicos de peptídeos parciais de IL-6 e de peptí-deos parciais do receptor da IL-6 são descritos na JP-A Hei 2-188600, naJP-A Hei 7-324097, na JP-A Hei 8-311098, e na Publicação de Patente U.S.Ne US 5210075.

Os anticorpos usados na presente invenção também podem seranticorpos conjugados os quais são ligados a várias moléculas, tais comopolietilenoglicol (PEG), substâncias radioativas e toxinas. Tais anticorposconjugados podem ser obtidos pela modificação química dos anticorpos mo-dificados. Métodos para modificar anticorpos são já estabelecidos na técni-ca. Os "anticorpos" da presente invenção englobam esses anticorpos conju-gados.

Os agentes para tratar enfarte do miocárdio e agentes para su-primir o remodelamento ventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdiona presente invenção podem ser usados para tratamentos de enfarte do mi-ocárdio.

Aqui, "tratado enfarte do miocárdio" significa suprimir ou preveniros sintomas do enfarte do miocárdio, e a falência cardíaca e a arritmia seve-ra induzida por isquemia, as quais ocorrem como complicações do enfartedo miocárdio.

Sintomas de complicação do enfarte do miocárdio incluem arrit-mia (extra-sistólica, fibrilação ventricular e bloqueio atrioventricular), falênciacardíaca, ruptura muscular papilar, ruptura cardíaca, aneurisma ventricular(o qual é formado no ápice cardíaco como resultado do enfarte na ramifica-ção descendente anterior da artéria coronária esquerda) e a síndrome doenfarte pós-miocardial. Os "agentes para tratar enfarte do miocárdio" da pre-sente invenção podem suprimir e prevenir os sintomas descritos acima.

Entretanto, aqui, o termo "supressão do remodelamento ventri-cular esquerdo depois do enfarte do miocárdio" significa suprimir ou prevenira hipertrofia miocardial (dilatação do ventrículo esquerdo inteiro) que ocorrepara compensar o dano funcional da área enfartada.

A hipertrofia do miocárdio ocorre quando células do músculocardíaco em áreas enfartadas são deslocadas com um tecido fibroso, talcomo fibras de colágeno, como resultado da necrose e/ou esfoliação dascélulas e o tecido fibroso é finamente estendido. Dessa forma, a supressão eprevenção do "deslocamento da área enfartada com fibras de colágeno" e "aextensão do tecido fibroso", isto é, a melhoria da condição da área enfarta-da, também são incluídos no sentido de "suprimir o remodelamento ventricu-lar esquerdo depois do enfarte do miocárdio" descrito acima.

Se os sintomas do enfarte do miocárdio e do remodelamentoventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio são suprimidos ou nãopode ser determinado usando a atividade da mieloperoxidase (MPO) emáreas enfartadas e não-enfartadas do músculo cardíaco como um indicador.MPO é uma enzima presente nos grânulos intracelulares de neutrófilos e suaatividade é conhecida como sendo significativamente elevada devido às do-enças da artéria coronária. Isto é, quando a atividade do MPO é suprimidapela administração de um agente da presente invenção, os sintomas do en-farte do miocárdio e do remodelamento ventricular esquerdo depois do en-farte do miocárdio podem ser considerados como estando suprimidos. A ati-vidade da MPO pode ser determinada por métodos conhecidos, os quaisincluem, por exemplo, os métodos de medição descritos nos Exemplos.

Alternativamente, se os sintomas do enfarte do miocárdio e oremodelamento ventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio são su-primidos ou não também pode ser determinado usando a expressão daMCP-1 (proteína quimioatratora de monócito) em áreas enfartadas e não-enfartadas do músculo cardíaco como um indicador. MCP-1 é uma quimioci-na que pode causar a falência cardíaca pelo recrutamento de macrófagospara o músculo cardíaco e aumentando a expressão de citocinas inflamató-rias. MCP-1 é conhecido por ativar a inflamação e induzir a fibrose do mús-culo cardíaco e dos tecidos perivasculares. O espalhamento ou o agravo(necrose e tal) da área enfartada aumentam a expressão da MPC-1. Especi-ficamente, quando a expressão da MCP-1 é suprimida, os sintomas do en-farte do miocárdio e o remodelamento ventricular esquerdo depois do enfartedo miocárdio podem ser considerados como estando suprimidos. A expres-são da MCP-1 pode ser medida por métodos conhecidos para medir a ex-pressão da proteína, os quais incluem, por exemplo, Western blotting e ELI-SA.

As frases "suprimindo a atividade da MPO" e "suprimindo a ex-pressão da MCP-1" também significam "melhorando a condição da área en-fartada" mencionada acima.

Além disso, a supressão dos sintomas do enfarte do miocárdio eo remodelamento ventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio po-dem também ser determinados pela medição da dimensão diastólica finalventricular esquerda e a fração de ejeção por ecocardiografia, ou a avaliaçãoquantitativa do grau de fibrose do miocárdio e de hipertrofia dos cardiomióci-tos por exame histológico dos tecidos cardíacos. Tais medições podem seralcançadas usando métodos conhecidos. Tais métodos incluem, por exem-plo, os métodos descritos nos Exemplos.

Na presente invenção, a atividade dos inibidores da IL-6 na inibi-ção da transdução do sinal da IL-6 pode ser avaliada por métodos conven-cionais. Especificamente, a IL-6 é adicionada em culturas de linhagens celu-lares de mieloma humano dependentes de IL-6 (S6B45 e KPMM2), na linha-gem celular de Iinfoma T de Lennert humana ou na linhagem celular depen-dente de IL-6 MH60.BSF2; e a captação de timidina-3H pelas células depen-dentes de IL-6 é medida na presença de um inibidor da IL-6. Alternativamen-te, células U266 expressando receptor da IL-6 são cultivadas, e o inibidor daIL-6 e a IL-6 marcada com 125I são adicionados a cultura ao mesmo tempo;e, a seguir, a IL-6 marcada com 125I ligada às células expressando o receptorda IL-6 é quantificada. Além do grupo inibidor da IL-6, um grupo de controlenegativo que não contém o inibidor da IL-6 é incluído no sistema de ensaiodescrito acima. A atividade dõ inibidor da IL-6 em relação ao inibidor da IL-6pode ser avaliada pela comparação dos resultados de ambos os grupos.

Conforme mostrado abaixo nos Exemplos, a administração deum anticorpo receptor anti-IL-6 foi descoberta como supressora dos sinto-mas do enfarte do miocárdio e do remodelamento ventricular esquerdo de-pois do enfarte do miocárdio. Essa descoberta sugere que os inibidores daIL-6, tais como os anticorpos receptores anti-IL-6, são úteis como agentespara tratar enfarte do miocárdio e agentes para suprimir o remodelamentoventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio.

Indivíduos a serem administrados com os agentes da presenteinvenção para tratar enfarte do miocárdio e agentes da presente invençãopara suprimir o remodelamento ventricular esquerdo depois do enfarte domiocárdio são mamíferos. Os mamíferos são preferivelmente seres huma-nos.

Os agentes da presente invenção para tratar enfarte do miocár-dio e agentes da presente invenção para suprimir o remodelamento ventricu-lar esquerdo depois do enfarte do miocárdio podem ser administrados comomedicamentos, e podem ser administrados sistemicamente ou localmenteatravés da administração oral ou parenteral. Por exemplo, a injeção intrave-nosa como a infusão por gotejamento, a injeção intramuscular, a injeção in-traperitoneal, a injeção subcutânea, supositório, enema, comprimidos entéri-cos orais ou semelhantes podem ser selecionados. Um método de adminis-tração apropriado pode ser selecionado dependendo da idade do paciente edos sintomas. A dose eficaz por administração é selecionada da faixa de0,01 até 100 mg/Kg de peso corporal. Alternativamente, a dose pode serselecionada da faixa de 1 até 1000 mg/paciente, preferivelmente da faixa de5 a 50 mg/paciente. Uma dose e um método de administração preferidos sãocomo se segue: por exemplo, quando um anticorpo receptor anti-IL-6 é usa-do, a dose eficaz é uma quantidade tal que o anticorpo livre está presente nosangue. Especificamente, uma dose de 0,5 a 40 mg/Kg de peso corpo-ral/mês (quatro semanas), preferivelmente de 1 a 20 mg/Kg de peso corpo-ral/mês é administrada através de injeção intravenosa tal como por infusãopor gotejamento, por injeção subcutânea ou tal, de uma a várias vezes pormês, por exemplo, duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez acada duas semanas ou uma vez a cada quatro semanas. O cronograma deadministração pode ser ajustado, por exemplo, pela extensão do intervalo deadministração de duas vezes por semana ou de uma vez por semana atéuma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas ou uma vez acada quatro semanas, durante o monitoramento da condição depois dotransplante e das alterações nos valores de teste sangüíneo.

Na presente invenção, os agentes para tratar enfarte do miocár-dio e agentes para suprimir o remodelamento ventricular esquerdo depois doenfarte do miocárdio podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis,tais como conservantes e estabilizantes. Os "veículos farmaceuticamenteaceitáveis" se referem aos materiais que podem ser co-administrados comum agente descrito acima; e podem ou não produzir por si só o efeito acimadescrito de supressão dos sintomas do enfarte do miocárdio e do remodela-mento ventricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio. Alternativamen-te, os veículos podem ser materiais que não têm o efeito de suprimir os sin-tomas do enfarte do miocárdio e do remodelamento ventricular esquerdodepois do enfarte do miocárdio, porém produzem um efeito estabilizante adi-tivo ou sinergístico quando usados em combinação com um inibidor da IL-6.

Tais materiais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exem-plo, água estéril, salina fisiológica, estabilizantes, excipientes, tampões, con-servantes, detergentes, agentes quelantes (EDTA e tais) e ligantes.

Na presente invenção, detergentes incluem detergentes não-iônicos, e exemplos típicos de tais incluem ésteres de ácido graxo de sorbi-tano tais como monocaprilato de sorbitano, monolaurato de sorbitano e mo-nopalmitato de sorbitano; ésteres de ácido graxo de glicerina, tais como mo-nocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina e monoestearato de gli-cerina; ésteres de ácido graxo de poliglicerina tais como monoestearato dedecaglicerila, diestearato de decaglicerila e monolinoleato de decaglicerila;ésteres de ácido graxo de polioxietilenossorbitano tais como monolaurato depolioxietilenossorbitano, monoleato de polioxietilenossorbitano, monoestea-rato de polioxietilenossorbitano, monopalmitato de polioxietilenossorbitano,trioleato de polioxietilenossorbitano e triestearato de polioxietilenossorbitano;ésteres de ácido graxo de polioxietilenossorbit, tais como tetraestearato depolioxietilenossorbit e tetraoleato de polioxietilenossorbit; ésteres de ácidograxo de polioxietilenoglicerina, tais como monoestearato de polioxietileno-glicerila, ésteres de ácido graxo de polietilenoglicol, tais como diestearato depolietilenoglicol; alquil éteres de polioxietileno tais como de Iauril éter polioxi-etileno; alquil ésteres de polioxietilenopolioxipropileno, tais como polioxietile-nopolioxipropilenoglicol, éter de polioxietilenopolioxipropilenopropil e éterpolioxietilenopolioxipropilenocetílico; alquilfeniléteres de polioxietileno taiscomo nonilfeniléter de polioxietileno; óleos de castóreo endurecidos de poli-oxietileno, tais como óleo de castóreo de polioxietileno e óleo de castóreoendurecido de polioxietileno (óleo de castóreo hidrogenado de polioxietile-no); derivados de cera de abelha de polioxietileno tais como cera de abelhade polioxietilenossorbit; derivados de polioxietilenolanolina, tal como polioxie-tilenolanolina; e amidas de ácidos graxos de polioxietileno, e tais como umHLB de 6 a 18, tal como a amida do ácido polioxietilenoesteárico.

Detergentes também incluem detergentes aniônicos, e exemplostípicos de tais incluem, por exemplo, alquilsulfatos com um grupo alquila com10 a 18 átomos de carbono, tais como cetilsulfato de sódio, Iaurilsulfato desódio e oleilsulfato de sódio; alquil éter sulfatos de polioxietileno, nos quais ogrupo alquil tem de 10 a 18 átomos de carbono e o número molar médio deóxido de etileno adicionado é de 2 a 4, tal como polioxietileno Iaurilsulfato desódio; sais do éster de alquilsulfossuccinato com um grupo alquila com 8 a18 átomos de carbono, tais como éster de Iaurilsulfossuccinato de sódio;detergentes naturais, por exemplo, lecitina; glicerofosfolipídeos; esfingofosfo-lipídeos, tal como esfingomielina; e ésteres de ácido graxo de sacarose, nosquais os ácidos graxos têm de 12 a 18 átomos de carbono.

Um, dois ou mais dos detergentes descritos acima podem sercombinados e adicionados aos agentes da presente invenção. Detergentesque são preferivelmente usados nas preparações da presente invenção in-cluem ésteres do ácido graxo de polioxietilenossorbitano, tais como polissor-batos 20, 40, 60 e 80. Polissorbatos 20 e 80 são particularmente preferidos.Polioxietilenopolioxipropilenoglicóis, tais como poloxâmero (Pluronic F-68® etais) também são preferidos.

A quantidade de detergente adicionada varia dependendo do ti-po de detergente usado. Quando polissorbato 20 ou 80 é usado, a quantida-de está, em geral, na faixa de 0,001 até 100 mg/mL, preferivelmente na faixade 0,03 até 50 mg/mL, mais preferivelmente na faixa de 0,005 até 2 mg/mL.

Na presente invenção, tampões incluem fosfato, tampão citrato,ácido acético, ácido málico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido lático, fos-fato de potássio, ácido glucônico, ácido cáprico, ácido desoxicólico, ácidosalicílico, trietanolamina, ácido fumárico e outros ácidos orgânicos; e tampãode ácido carbônico, tampão Tris, tampão de histidina e tampão de imidazol.

Preparações líquidas podem ser formuladas pela dissolução dosagentes em tampões aquosos conhecidos no campo das preparações líqui-das. A concentração de tampão está, em geral, na faixa de 1 a 500 mM, pre-ferivelmente na faixa de 5 a 100 mm, mais preferivelmente na faixa de 10 a20 mM.

Os agentes da presente invenção também podem compreenderoutros polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, tais como albuminado soro, gelatina e imunoglobulina; aminoácidos; açúcares e carboidratos,tais como polissacarídeos e monossacarídeos, alcoóis de açúcar, e tais.

Aqui, aminoácidos incluem aminoácidos básicos, por exemplo,arginina, lisina, histidina e ornitina, e sais inorgânicos desses aminoácidos(preferivelmente sais de cloridrato, e sais de fosfato, a saber, aminoácidosde fosfato). Quando aminoácidos livres são usados, o pH é ajustado até umvalor preferido pela adição de substâncias tamponantes fisiologicamenteaceitáveis apropriadas, por exemplo, ácidos inorgânicos, particularmenteácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido acético e ácido fórmi-co, e seus sais. Nesse caso, o uso de fosfato é particularmente benéficoporque ele proporciona produtos Iiofilizados muito estáveis. Fosfato é parti-cularmente vantajoso quando preparações não contêm substancialmenteácidos orgânicos, tais como ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácidosuccínico e ácido fumárico, ou não contêm os ânions correspondentes (íonmalato, íon tartarato, íon citrato, íon succinato, íon fumarato e tais). Aminoá-cidos preferidos são a arginina, a lisina, a histidina e a ornitina. Além disso, épossível usar aminoácidos ácidos, por exemplo, ácido glutâmico e ácidoaspártico, e seus sais (preferivelmente sais de sódio); aminoácidos neutros,por exemplo, isoleucina, leucina, glicina, serina, treonina, valina, metionina,cisteína e alanina; e aminoácidos aromáticos, por exemplo, fenilalanina, tiro-sina, triptofano e seu derivado, N-acetiltriptofano.

Aqui, açúcares e carboidratos, tais como polissacarídeos e mo-nossacarídeos incluem, por exemplo, dextrana, glicose, frutose, lactose, xi-lose, manose, màltose, sacarose, trealose e rafinose.

Aqui, alcoóis de açúcar incluem, por exemplo, manitol, sorbitol einositol.

Quando os agentes da presente invenção são preparados comosoluções aquosas para injeção, os agentes podem ser misturados com, porexemplo, salina fisiológica e/ou solução isotônica contendo glicose ou outrosagentes adjuvantes (tais como D-sorbitol, S-manose, D-manitol e cloreto desódio). As soluções aquosas podem ser usadas juntamente com agentes-solubilizantes apropriados tais como alcoóis (etanol e similares), polialcoóis(propilenoglicol, PEG e semelhantes) ou detergentes não-iônicos (polissor-bato 80 e HCO-50).

Os agentes podem ainda compreender, caso desejado, diluen-tes, solubilizantes, ajustadores de pH, agentes aliviantes, agentes redutorescontendo enxofre, antioxidantes e semelhantes.

Aqui, os agentes redutores contendo enxofre incluem, por e-xemplo, compostos compreendendo grupos sulfidrila, tais como N-acetilcisteína, N-acetilmonocisteína, ácido tióctico, tiodiglicol, tioetanolamina,tioglicerol, tiossorbitol, ácido tioglicólico e seus sais, tiossulfato de sódio, glu-tationa e ácidos tioalcanóicos com de 1 a 7 átomos de carbono.

Além disso, os antioxidantes na presente invenção incluem, porexemplo, ácido eritórbico, dibutilidroxitolueno, butilidroxianisol, a-tocoferol,acetato de tocoferol, Ácido L-ascórbico e seus sais, palmitato do ácido L-ascórbico, estearato do ácido L-ascórbico, hidrogenossulfito de sódio, sulfitode sódio, gaiato de triamila, gaiato de propila e agentes quelantes tais comoetilenodiaminotetracetato dissódico (EDTA), pirofosfato de sódio e metafos-fato de sódio.

Caso requerido, os agentes podem ser encapsulados em micro-cápsulas (microcápsulas de hidroximetilcelulose, gelatina, ácido (po-li)metilmetacrílico ou tal) ou preparados como sistemas de distribuição defármacos coloidais (lipossoma, microesferas de albumina, microemulsão,nanopartículas, nanocápsulas e similares) (vide "Remington's Pharmaceuti-cal Science 16â edição", Oslo Ed., 1980 e semelhantes). Além disso, méto-dos para preparar agentes como agentes de liberação sustentada tambémsão conhecidos, e são aplicáveis para a presente invenção (Lauger et al., J.Biomed. Mater. Res. 1981, 15:167 a 277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98a 105; Patente U.S. N9 3.773.919; Pedido de Patente Européia Ns (EP)58.481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547 a 556; e EP 133.988).

Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados são apropriada-mente selecionados daqueles descritos acima ou combinados dependendodo tipo da forma de dosagem, porém não são limitados a elas.

A presente invenção se refere aos métodos para tratar enfartedo miocárdio em indivíduos e métodos para suprimir o remodelamento ven-tricular esquerdo depois do enfarte do miocárdio, ambos os quais compre-endem a etapa de administrar um inibidor da IL-6 a indivíduos os quais te-nham desenvolvido enfarte do miocárdio.

Aqui, o "indivíduo" se refere a organismos e a partes corporaisdos organismos a serem administradas com um agente da presente inven-ção para tratar enfarte do miocárdio ou um agente da presente invenção pa-ra suprimir o remodelamento ventricular esquerdo depois do enfarte do mio-cárdio. Os organismos incluem animais (por exemplo, seres humanos, espé-cies de animais domésticos e animais selvagens, porém não são particular-mente limitados.As "partes corporais dos organismos" não são particularmentelimitadas, porém preferivelmente incluem coração, músculo cardíaco e áreasenfartadas e não-enfartadas em enfartes miocardiais.

Aqui, "administração" inclui administrações oral e parenteral.

Administração oral inclui, por exemplo, a administração de agentes orais.Tais agentes orais incluem, por exemplo, grânulos, pós, comprimidos, cáp-sulas, soluções, emulsões e suspensões.

Administração parenteral inclui, por exemplo, a administração deinjeções. Tais injeções incluem, por exemplo, injeção subcutânea, injeçãointramuscular e injeção intraperitoneal. Entretanto, os efeitos dos métodosda presente invenção podem ser alcançados pela introdução de genes com-preendendo oligonucleotídeos a serem administrados em corpos vivos u-sando técnicas de terapia genética. Alternativamente, os agentes da presen-te invenção podem ser administrados localmente em áreas tencionadas detratamento. Por exemplo, os agentes podem ser administrados por injeçãolocal durante cirurgia, o uso de catéteres ou de distribuição de gele alvejadade DNA codificando um peptídeo da presente invenção. Os agentes da pre-sente invenção podem ser administrados juntamente com o tratamento paraocorrência de enfartes de miocárdio, por exemplo, cirurgia por catéter (angi-oplastia coronariana transluminal percutânea (PTCA) e intervenção coroná-ria percutânea (PCI)), recanalização coronariana transluminal percutânea(PTCR), enxerto de atalho da artéria coronária (CABG) e semelhantes.

Quando os métodos da presente invenção são efetuados, osagentes da presente invenção podem ser administrados como parte de umacomposição farmacêutica juntamente com pelo menos um quimioterapêuticoconhecido. Alternativamente, os agentes da presente invenção podem seradministrados juntamente com pelo menos um imunossupressor conhecido.Em uma modalidade, os agentes da presente invenção e os quimioterapêuti-cos conhecidos podem ser praticamente administrados ao mesmo tempo.

Todas as referências da técnica anterior citadas aqui são incor-poradas aqui por referência.Exemplos

Aqui abaixo, a presente invenção será especificamente descritacom referência aos Exemplos, mas não é para ser construída como estandolimitada a eles.

Exemplo 1 - Preparação de um modelo de camundongo de enfarte do mio-cárdio

Camundongos Balb/c machos (25 a 30 g) foram traquealmenteentubados. Os camundongos estavam em um respirador artificial e foramanestesiados por inalação de 0,5 a 1,0% de isoflurano. O peito esquerdo foiaberto. Depois da ligação da artéria coronária descendente anterior esquer-da, o peito foi fechado. Os camundongos foram agrupados em grupo admi-nistrado com MR16-1 (grupo MR16-1) e grupo não-tratado (grupo controle).O grupo administrado com MR16-1 foi submetido à administração intraperi-toneal de MR16-1 em uma dose de 500 μg/corpo.

Exemplo 2 - Medição da atividade da MPO

Os corações foram extraídos dos camundongos dois dias depoisdos enfartes do miocárdio serem criados (ou ligação coronariana). Os cora-ções foram divididos na área enfartada e na área não-enfartada, e picados.A seguir, o músculo cardíaco picado foi combinado com 10 volumes de tam-pão KPO4 50 mM (pH 6,0), contendo brometo de hexadeciltrimetilamônio. Omúsculo picado foi homogeneizado (POLYTRON, KINEMATICAAG, Luzern,Suíça) e a seguir submetido ao ultra-som.

O extrato resultante foi centrifugado a 13.000 rpm por 10 minu-tos a 4°C. Depois de 50 μL do sobrenadante resultante, foi misturado com1,45 mL de solução de substrato (KPO4 50 mM (pH 6,0), 0,167 mg/mL dedicloridrato de o-dianisidina, e H2O2 0,005%), as alterações na cor da solu-ção do substrato foram monitoradas por absorvância a 460 nm (coeficientede extinção = 2,655).

Como resultado, a atividade da MPO do músculo cardíaco nãoapresentou diferença entre o músculo cardíaco não-enfartado e o músculocardíaco do grupo operado de modo simulado, porém aumentou significati-vamente em cerca de quatro vezes na área enfartada (risco não-controle de0,037 ± 0,006; risco de controle de 0,122 ± 0,035: ρ < 0,01). Entretanto esseaumento da atividade da MPO na área enfartada foi significativamente su-primido no grupo administrado com MR16 (risco de MR16-1 de 0,034 ±0,008; ρ < 0,05 contra risco de controle).

Exemplo 3 - Ensaio de expressão da MCP-1

Os corações foram extraídos dos camundongos dois dias depoisda criação do enfarte do miocárdio. Os corações foram divididos em áreaenfartada e em área não-enfartada, e foram picados. O músculo cardíacopicado foi combinado foi com tampão de Iise (2 χ PBS, NP-40 1%, desoxico- lato de sódio 0,5%, dodecilsulfato de sódio 0,1%, PMSF 1 mM, de coquetelinibidor da protease 1% (NacaIai Tesque), e a seguir homogeneizado. O ex-trato foi centrifugado a 13.000 rpm por 10 minutos a 4°C. O sobrenadanteresultante foi usado como um Iisato celular total para quantificar a concen-tração de proteína pelo método Lowry. Volumes iguais da solução de proteí- na foram separados em um gel de poliacrilamida de 12%, e as proteínasforma transferidas em uma membrana PVDF Immun-Blot®. A membrana foi,a seguir, incubada com anticorpo anti-MCP-1 (1:30, IBL Co.) como o anticor-po primário a 4°C de um dia para o outro, e a seguir incubada com IgG anti-coelho de cabra (1:400; Sinalização celular) como o anticorpo secundário em temperatura ambiente por duas horas. A expressão da MCP-1 foi detectadapor quimiluminescência usando ECL (Amersham Bioscience, Buchingham-shire, R.U.). A análise de imagem da fotografia foi executada usando umprograma de computador (Scion Image Frame Grabber Status).

O resultado mostrou que a expressão da MCP-1 do músculo cardíaco foi aumentada tanto nas áreas enfartadas quanto não-enfartadasno grupo de controle, porém muito mais na área enfartada. Por outro lado, oaumento da expressão da MCP-1 foi suprimido em ambas as áreas no grupoadministrado com MR16-1.

Exemplo 4 - Ecocardiografia Quatro semanas depois do enfarte do miocárdio ser criado, oscorações foram examinados por ecocardiografia sob anestesia para deter-minar o diâmetro da extremidade diastólica ventricular esquerda, e o encur-tamento fracional (FS).

O resultado da ecocardiografia quatro semanas depois da cria-ção do enfarte do miocárdio mostrou que o diâmetro da extremidade diástó-lica ventricular esquerda no grupo de controle foi significativamente aumen-tada em comparação com o grupo simulado. Esse aumento (no diâmetroventricular esquerdo) foi significativamente suprimido pela administração deMR16-1. Além disso, enquanto o FS foi reduzido depois do enfarte do mio-cárdio (foi criado), ele foi significativamente melhorado pela administração deMR16-1 (grupo de controle 18,5 ± 2,9% vs. o grupo MR16-1 28,5 ± 1,8%; ρ <0,05).

Exemplo 5 - Avaliação histolóqica

Os corações foram extraídos dos camundongos quatro semanasdepois da criação do enfarte do miocárdio, fixados com tampão de parafor-maldeído-fosfato 4% e, a seguir, embebidos em parafina. Os corações foramdivididos e, a seguir, manchados com tricroma de Masson para avaliar quan-titativamente o grau de fibrose cardíaca e hipertrofia dos miócitos cardíacosna seção do eixo curto do músculo cardíaco na área não-enfartada.

Como resultado, a hipertrofia dos miócitos cardíacos e da fibroseestromal foi descoberta na área não-enfartada no grupo de controle. Ao con-trário, esses sintomas foram suprimidos no grupo administrado com MR16-1.Aplicabilidade industrial

A expansão do enfarte do miocárdio e/ou o agravo podem indu-zir a complicações de falência cardíaca e/ou arritmia severa induzida porisquemia, os quais aumentam a ameaça à vida. Os agentes da presente in-venção para tratar enfarte do miocárdio, agentes para suprimir a remodela-gem ventriocular esquerda depois do enfarte do miocárdio e métodos paratratar ou prevenir o enfarte do miocárdio podem suprimir os sintomas decomplicação em enfarte do miocárdio e alcançar um tratamento eficaz.

A taxa de ocorrência na remodelagem ventricular esquerdadepois do enfarte do miocárdio também é sugerida como estando relaciona-da ao tamanho da área enfartada, e é considerada como sendo importantepara melhorar a condição e prevenir que a área enfartada aumente em umestágio inicial do início do enfarte do miocárdio. Além dos sintomas compli-cadores do enfarte do miocárdio, o remodelamento ventricular esquerdo po-de ser suprimido pela administração de um agente da presente invenção quecompreende um inibidor da IL-6 como um ingrediente ativo ao paciente deum estágio inicial do enfarte do miocárdio.

Claims

1. Agente para tratar enfarte do miocárdio, caracterizado pelofato de que compreende um inibidor da IL-6 como um ingrediente ativo.

2. Agente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o inibidor da IL-6 é um anticorpo que reconhece a IL-6.

3. Agente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o inibidor da IL-6 é um anticorpo que reconhece o receptor daIL-6.

4. Agente, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

5. Agente, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um anticorpo contra a IL-6 humana ou um re-ceptor da IL-6 humana.

6. Agente, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um anticorpo recombinante.

7. Agente, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizadoou um anticorpo humano.

8. Agente para suprimir a remodelagem ventricular esquerdadepois do enfarte do miocárdio, caracterizado pelo fato de que compreendeum inibidor da IL-6 como um ingrediente ativo.

9. Agente, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o inibidor da IL-6 é um anticorpo que reconhece a IL-6.

10. Agente, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o inibidor da IL-6 é um anticorpo que reconhece o receptor da IL-6.

11. Agente, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteriza-do pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

12. Agente, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteriza-do pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo contra a IL-6 humana ou umreceptor da IL-6 humana.

13. Agente, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteriza-do pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo recombinante.

14. Agente, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe-lo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humani-zado ou um anticorpo humano.

15. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que é usado para tratar o enfarte do miocárdio.

16. Método para tratar enfarte do miocárdio em um indivíduo,caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar um inibi-dor da IL-6 a um indivíduo o qual tenha desenvolvido enfarte do miocárdio.

17. Método para suprimir a remodelagem ventricular esquerdadepois do enfarte do miocárdio em um indivíduo, caracterizado pelo fato deque compreende a etapa de administrar um inibidor da IL-6 a um indivíduo oqual tenha desenvolvido enfarte do miocárdio.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracteri-zado pelo fato de que o inibidor da IL-6 é um anticorpo que reconhece a IL-6.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracteri-zado pelo fato de que o inibidor da IL-6 é um anticorpo que reconhece umreceptor da IL-6.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracteri-zado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracteri-zado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo contra a IL-6 humana ouum anticorpo contra um receptor da IL-6 humana.

22. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracteri-zado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo recombinante.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo huma-nizado ou um anticorpo humano.

24. Uso do inibidor da IL-6, caracterizado pelo fato de que é paraa produção de um agente para tratar o enfarte do miocárdio.

25. Uso do inibidor da IL-6, caracterizado pelo fato de que é paraa produção de um agente para suprimir a remodelagem ventricular esquerdadepois do enfarte do miocárdio.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizadopelo fato de que o inibidor da IL-6 é um anticorpo que reconhece a IL-6.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizadopelo fato de que o inibidor da IL-6 é um anticorpo que reconhece um recep-tor da IL-6.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um anticorpo contra a IL-6 humana ou um an-ticorpo contra um receptor da IL-6 humana.

30. Uso, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um anticorpo recombinante.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelofato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizadoou um anticorpo humano.