BRPI0617688A2 - método para expressão recombinante de um polipeptìdeo - Google Patents

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Abstract

MéTODO PARA A EXPRESSãO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTìDEO. A presente invenção refere-se a um descrito um método para a produção recombinante de um polipeptídeo heterólogo em uma célula hospedeira eucariótica. A célula hospedeira compreende um plasmídeo de expressão, em que o plasmídeo de expressão compreende em uma direção 5' para 3' a) um promotor, b) um ácido nucléico codificando um primeiro polipeptídeo, cuja seqúência de aminoácidos é selecionada da Tabela 1 dependendo dos dois primeiros aminoácidos do segundo polipeptídeo, c) um ácido nucléico codificando um segundo polipeptídeo compreendendo um ácido nucléico codificando um polipeptídeo heterólogo, um ácido nucléico codificando um ligante, e um ácido nucléico codificando um fragmento de imunoglobulina, e d) uma região 3 não traduzida compreendendo um sinal de poliadenilação. São descritos adicionalmente um plasmídeo e um kit.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA A EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO".
A presente invenção refere-se a um método para a expressãorecombinante de um polipeptídeo em células eucarióticas.
Antecedentes da Invenção
Sistemas de expressão para a produção de polipeptídeos re-combinantes são de conhecimento geral no estado da técnica e são descri-tos por, por exemplo, Marino, M.H., Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel,D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F., and Bernard, A.,Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159. Polipeptídeos para uso em apli-cações farmacêuticas são preferencialmente produzidos em células mamífe-ras tais como células CHO, células NSO1 células Sp2/0, células COS, célulasHEK, células BHK e semelhantes. Os elementos essenciais de um plasmí-deo de expressão são uma unidade de propagação de plasmídeo procarióti-co, por exemplo, para E.coli compreendendo uma origem de replicação e ummarcador de seleção, um marcador de seleção eucariótico, e um ou maiscassetes de expressão para a expressão do um ou mais genes estruturaisde interesse cada um compreendendo um promotor, um g?ne estrutural, eum terminador de transcrição incluindo um sinal de poliadenilação. Para ex-pressão transitória em células mamíferas pode ser inclusa uma origem dereplicação mamífera, tal como a SV40 Ori ou OriP. Como promotor pode serselecionado um promotor constitutivo ou indutível. Para transcrição otimiza-da pode ser inclusa uma seqüência Kozak na região 5' não traduzida. Paraprocessamento de RNAm, em particular junção de RNAm e terminação detranscrição, sinais de junção de RNAm, dependendo da organização do ge-ne estrutural (organização éxon / íntron), podem ser inclusos bem como umsinal de poliadenilação.
A expressão de um gene é realizada ou como expressão transitó-ria ou como permanente. Um ou mais polipeptídeos de interesse são em geralpolipeptídeos secretados e portanto contêm uma extensão de N-terminal (tam-bém conhecida como a seqüência de sinal) a qual é necessária para o trans-porte / a secreção do polipeptídeo através da célula para dentro do meioextracelular.
Em geral, a seqüência de sinal pode ser derivada de qualquergene codificando um polipeptídeo secretado. Se for usada uma seqüênciade sinal heteróloga, preferencialmente é uma seqüência que é reconhecida eprocessada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedei-ra. Para secreção em levedura, por exemplo, a seqüência de sinal nativa deum gene heterólogo a sér expressado pode ser substituída por uma seqüên-cia de sinal de levedura homóloga derivada de um gene secretado, tal comoseqüência de sinal de invertase de levedura, alfa-fator Iider (incluindo α-fatorlíderes Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, e Hansenulal o segundodescrito na Patente dos Estados Unidos N2 5.010.182), seqüência de sinalde fosfatase ácida, ou a seqüência de sinal de glucoamilase de C. albicans(publicação de patente européia N2 EP 0 362 179). Na expressão em célulasmamíferas a seqüência de sinal nativa da proteína de interesse é satisfató-ria, embora outras seqüências de sinal mamíferas possam ser adequadas,tais como seqüências de sinal de polipeptídeos secretados da mesma espé-cie ou de espécie relacionada, por exemplo, para imunoglobulinas de origemhumana ou murina, bem como seqüências de sinal secretor viral, por exem-plo, a seqüência de sinal da glicoproteína D do herpes simples. O fragmentode DNA codificando para um pré-segmento semelhante é ligado in frame aofragmento de DNA codificando um polipeptídeo de interesse.
Na publicação de patente internacional N2 WO 98/28427 é reportada uma proteína de fusão preparada geneticamente ou quimicamentecompreendendo a regiaõ de imunoglobulina Fc, um derivado ou análogofundido à porção N-terminal da proteína OB. Uma molécula quimerica, isto é,proteína de fusão ou fusão de anticorpo, compreendendo uma seqüência deintrodução de proteína de terminal carbóxi e uma região de carga de terminalamino é apresentada na publicação de patente internacional WO 03/035892.
Na Patente dos Estados Unidos N2 2003/0049227 é reportadoum método para a indução de uma reação imune citocida contra um tumorem um mamífero administrando uma imunocitocina, a qual é uma proteínade fusão compreendendo uma parte imunoglobulina de terminal amino euma parte citocina de terminal carbóxi.
A publicação de Patente Internacional WO 91/16437 reportauma proteína fundida recombinante solúvel a qual é estável no sistema cir-culatório mamífero compreendendo um polipeptídeo o qual contém um sítiode reconhecimento para uma molécula-alvo, tal como um sítio receptor decomplemento, e é ligado à extremidade N-terminal de uma cadeia de imuno-globulina. Uma proteína de fusão composta de um anticorpo e um peptídeotendo uma atividade biológica é reportada na Patente dos Estados UnidosN2 2003/0103984.
São reportados na Patente dos Estados Unidos Ns 2004/0033511uma proteína de fusão de anticorpo-citocina e na Patente dos Estados UnidosN2 2004/0180035 um imunoconjugado de anticorpo-citocina. Uma imunoto-xina compreendendo Gelonina e um anticorpo é reportada na publicação depatente internacional N2WO 94/26910.
Sumário da Invenção
A presente invenção compreende um método para a produçãorecombinante de um polipeptídeo heterólogo em uma célula hospedeira eu-cariótica compreendendo um plasmídeo de expressão, em que o plasmídeode expressão compreende em uma direção 5' para 3' a) um promotor, b) umácido nucléico codificando um primeiro polipeptídeo, cuja seqüência de ami-noácidos é selecionada da Tabela 1 dependendo dos dois primeiros amino-ácidos do segundo polipeptídeo, c) um ácido nucléico codificando um se-gundo polipeptídeo compreendendo um ácido nucléico codificando o poli-peptídeo heterólogo, um ácido nucléico codificando um ligante, e um ácidonucléico codificando urfi fragmento de imunoglobulina, e d) uma regiãO 3!não traduzida compreendendo um sinal de poliadenilação. O método com-preende adicionalmente a introdução do plasmídeo de expressão em umacélula hospedeira eucariótica a qual é cultivada sob condições adequadaspara a expressão do segundo polipeptídeo e o segundo polipeptídeo é recu-perado do meio de cultura.
Em uma modalidade da invenção o ácido nucléico codificando osegundo polipeptídeo contém na posição 5' para o ácido nucléico codifican-do o polipeptídeo heterólogo um ácido nucléico adicional codificando ou umúnico aminoácido ou um dipeptídeo ou o peptídeo da seqüência de aminoá-cidos QIWNN (SEQ ID NO: 472) ou um fragmento do mesmo.
Em outra modalidade o fragmento de imunoglobulina é obtido oude uma IgG ou de uma IgE.
Em uma modalidade adicional a célula eucariótica é uma célulamamífera, especialmente uma célula CHO1 célula N£>0, célula Sp2/0, célulaCOSi célula K562, célula BHK, célula PER.C6 ou célula HEK.
Em ainda outra modalidade o Iigante é um peptídeo ou polipep-tídeo selecionado entre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 06, 07, 08, 09,10, 139, 140, 554, 555, 556, e 557.
Em outra modalidade o fragmento de imunoglobulina compreen-de o domínio constante de carbóxi-terminal de uma cadeia pesada ou levede uma imunoglobulina que ocorre naturalmente ou sintética, isto é, ou odomínio CH1, a região de articulação, o domínio CH2, o domínio CH3 de umacadeia pesada ou o domínio Cl de uma cadeia leve. Adicionalmente o frag-mento de imunoglobulina compreende um fragmento de domínio variável.
Em outra modalidade o fragmento de domínio variável é um do-mínio variável de uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina na qual apartir de um até seis aminoácidos do domínio variável são eliminados.
Em uma modalidade adicional a partir de uma até seis regiões(FR1, FR2, FR3, CDR1, CDR2, CDR3) do domínio variável são eliminadas.
Em uma modalidade adicional o domínio variável é eliminado.
Em outra modalidade o fragmento de imunoglobulina é derivadode uma imunoglobulina que ocorre naturalmente ou umã variante díj.mesma.
Em uma modalidade adicional o fragmento de imunoglobulina éderivado de uma imunoglobulina no mínimo parcialmente sintética.
Em ainda outra modalidade da invenção a seqüência de amino-ácidos do polipeptídeo heterólogo é de a partir de 5 até 500 resíduos amino-ácidos, mais preferencial de a partir de 10 até 350 resíduos aminoácidos, omais preferencial de a partir de 15 até 150 resíduos aminoácidos.
Esta invenção compreende adicionalmente um plasmídeo com-preendendo em uma direção 5' para 3' a) um promotor, b) um ácido nucléicocodificando um primeiro polipeptídeo, cuja seqüência de aminoácidos é se-lecionada da Tabela 1 dependendo dos dois primeiros aminoácidos do se-gundo polipeptídeo, c) um ácido nucléico codificando um segundo polipeptí-deo compreendendo um ácido nucléico codificando um polipeptídeo heteró-logo, um ácido nucléico codificando um ligante, e um ácido nucléico codifi-cando um fragmento de imunoglobulina, e d) uma região não traduzida 3'compreendendo um sinal de poliadenilação.
Esta invenção ainda compreende adicionalmente um kit para apreparação de um plasmídeo para a expressão de um polipeptídeo heterólo-go em uma célula eucariótica compreendendo um plasmídeo o qual compre-ende em uma direção 5' para 3' a) um promotor, b) um ácido nucléico codifi-cando um primeiro polipeptídeo, cuja seqüência de aminoácidos é selecio-nada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 36, 37, 319, 320, 321, 322,323, 324, 325, 326, 327, 328, e 329, c) um ácido nucléico codificando umsegundo polipeptídeo compreendendo i) um ácido nucléico codificando umpeptídeo da seqüência de aminoácidos QIWNN (SEQ ID NO: 472) ou umafração N-terminal do mesmo, ii) um sítio de clonagem compreendendo nomínimo um sítio de clivagem de restrição adequado para a inserção de umácido nucléico codificando um polipeptídeo heterólogo, iii) um ácido nucléicocodificando um ligante selecionado entre o grupo consistindo em SEQ IDNOs 06, 07, 08, 09, 10, 139, 140, 554, 555, 556, e 557, e iv) um ácido nu-cléico codificando um fragmento de imunoglobulina, e d) uma região nãotraduzida 3' compreendendo um sinal de poliadenilação.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção compreende um método para a expressãorecombinante de um polipeptídeo heterólogo de interesse em uma célulahospedeira eucariótica compreendendo um vetor de expressão, o qual con-tém um promotor adequado, um terminador de transcrição, um marcadorselecionável, uma seqüência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo,e uma seqüência de ácido nucléico codificando uma seqüência de sinal, emque a seqüência de ácido nucléico codificando a seqüência de sinal é sele-cionada entre a Tabela 1 dependendo dos dois primeiros aminoácidos doseguinte polipeptídeo. A seqüência de ácido nucléico codificando o polipep-tídeo heterólogo inicia dentro de quinze nucleotídeos depois da extremidadeda seqüência de ácido nucléico codificando a seqüência de sinal. A seqüên-cia de ácido nucléico codificando o polipeptídeo heterólogo pode ser ou inse-rida dentro de uma região FR1 de uma imunoglobulina, dentro de uma regi-ão Vl de uma imunoglobulina ou dentro do primeiro fdomínio constante deuma imunoglobulina ou pode substituir toda ou uma fração de uma regiãoFR1 de uma imunoglobulina, uma região Vl de uma imunoglobulina, ou oprimeiro domínio constante de uma imunoglobulina.
Dentro do escopo da presente invenção alguns dos termos usa-dos são definidos como se segue:
Uma "molécula de ácido nucléico" conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, se refere a um ácido nucléico codificando um poli-peptídeo que ocorre naturalmente, ou parcialmente ou totalmente não natu-ral o qual pode ser produzido de modo recombinante. A molécula de ácidonucléico pode ser composta de fragmentos de DNA os quais são ou isoladosou sintetizados por meios químicos. A molécula de ácido nucléico pode serintegrada em outro ácido nucléico, por exemplo, em um plasmídeo de ex-pressão ou no genoma / cromossoma de uma célula hospedeira eucariótica.Plasmídeo inclui vetores de vai-vém e de expressão. Tipicamente, o plasmí-deo também compreenderá uma unidade de propagação procariótica com-preendendo uma origem de replicação (por exemplo, a origem de replicaçãoColE1) e um marcador selecionável (por exemplo, gene de resistência a am-picilina ou tetraciclirfa) para replicação e seleção, respectivamente, do vetorem bactérias.
Um "cassete de expressão" se refere a uma seqüência de ácidonucléico que contém os elementos necessários para expressão e secreçãode no mínimo o gene estrutural contido em uma célula.
Uma molécula de ácido nucléico é igualmente caracterizada porsua seqüência de ácido nucléico consistindo em nucleotídeos individuaisou/e por uma seqüência de aminoácidos codificados pela molécula de ácidonucléico.
Um "gene" denota um segmento, por exemplo, sobre um cro-mossoma ou sobre um plasmídeo o qual é necessário para a expressão deum peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Além da região codificante o genecompreende outros elementos funcionais incluindo um promotor, íntrons, eterminadores.
Um "gene estrutural" denota a região codificante de um genesem uma seqüência de sinal.
Um "gene de resistência" ou um "marcador selecionável", o qualé usado de modo intercambiável dentro deste requerimento, é um gene quepermite que células carregando o gene sejam especificamente selecionadaspara ou contra, na presença de um agente de seleção correspondente. Ummarcador selecionável útil positivo é um gene de resistência a antibiótico.Este marcador selecionável permite que a célula hospedeira transformadacom o gene seja positivamente selecionada para na presença do antibióticocorrespondente; uma célula hospedeira não transformada não seria capazde crescer ou sobreviver sob as condições de cultura seletivas. Marcadoresselecionáveis podem ser positivos, negativos ou bifuncionais. Marcadoresselecionáveis positivos permitem a seleção para células carregando o mar-cador, ao passo que marcadores selecionáveis negativos permitem que cé-lulas carregando o marcador sejam eliminados seletivamente. Tipicamente,um marcador selecionável conferirá resistência a um fármaco ou compensa-rá um defeito metabólico ou catabólico na célula hospedeira. Genes de resis-tência úteis com células eucarióticas incluem, por exemplo, os genes paraaminoglicosídeo fosfotransferase (ΑΡΗ), tais como a higromicina fosfotrans-ferase (hyg), neomicina e G418 ΑΡΗ, diidrofolato redutase (DHFR), timidinaquinase (tk), glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase, triptofano sinte-tase (indole), histidinol deidrogenase (histidinol D), e genes codificando re-sistência a puromicina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, Zeocin, e ácidomicofenólico. Genes marcadores são descritos na publicação de patenteinternacional N2 WO 92/08796 e na publicação de patente internacional N-WO 94/28143."Elementos reguladores" conforme usado aqui, neste requeri-mento de patente, se referem a seqüências de nucleotídeos presentes emeis, necessários para transcrição e/ou translação do gene compreendendo aseqüência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de interesse. Oselementos reguladores transcricionais normalmente compreendem um pro-motor a montante da seqüência genética estrutural a ser expressada, sítiosde iniciação e terminação transcripcionais, e uma seqüência de sinal de poli-adenilação. O termo "sítio de iniciação transcripcional" se refere à base deácido nucléico no gene correspondente ao primeiro ácido nucléico incorpo-rado no transcripto primário, isto é, o precursor de RNAm; o sítio de iniciaçãotranscripcional pode se sobrepor com a seqüência promotora. O termo "sítiode terminação transcripcional" se refere a uma seqüência de nucleotídeosnormalmente representada na extremidade 3' de um gene de interesse a sertranscrito, que faz com que a RNA polimerase termine a transcrição. A se-qüência de sinal de poliadenilação, ou sinal de adição poly-A proporciona osinal para a clivagem em um sítio específico na extremidade 3' de RNAmeucariótico e a adição pós-transcripcional no núcleo de uma seqüência decerca de 100 a 200 nucleotídeos adenina (polyA tail) à extremidade 3' cliva-da. A seqüência de sinal de poliadenilação pode incluir a seqüência de con-senso AATAAA localizada a cerca de 10 a 30 nucleotídeos a montante dosítio de clivagem.
Para produzir um polipeptídeo secretado, o gene estrutural deinteresse inclui um segmento de DNA que codifica uma seqüência de sinal /peptídeo lider. A seqüência de sinal dirige o polipeptídeo recém-sintetizadopara e através da membrana do ER onde o polipeptídeo pode sór enviadopara secreção. A seqüência de sinal é clivada por algumas peptidases desinal enquanto a proteína cruza a membrana do ER. Como para a função daseqüência de sinal o reconhecimento pelo mecanismo de secreção da célu-las hospedeiras é essencial. Portanto a seqüência de sinal usada deve serreconhecida pelas proteínas e enzimas das célula hospedeira do mecanismode secreção.
Elementos reguladores translacionais incluem um códon de ini-ciação translaxional initiation (AUG) e códon de interrupção (TAA, TAG1 ouTGA). Um sítio de ingresso de ribossoma interno (IRES) pode ser incluso emalguns constructos.
Um "promotor" se refere a uma seqüência de polinucleotídeoque controla a transcrição de um gene / gene estrutural ou seqüência de á-cido nucléico ao qual é encadeado operavelmente. Um promotor inclui sinaispara ligação de RNA polimerase e iniciação de transcrição. Os promotoresusados serão funcionais no tipo celular da célula hospedeira na qual é con-templada a expressão da seqüência selecionada. Um grande número deselecionado incluindo selecionado constitutivos, indutíveis e repressíveis deuma variedade de fontes diferentes, são de conhecimento geral na técnica (eidentificados em bandos de dados tais como GenBank) e estão disponíveiscomo ou dentro de polinucleotídeos clonados (de, por exemplo, depositáriostais como ATCC bem como outras fontes comerciais ou individuais). Um"promotor" compreende uma seqüência de nucleotídeos que dirige a trans-crição de um gene estrutural. Tipicamente, um promotor está localizado naregião não codificante 5' ou não traduzida de um gene, proximal ao sítio de. iniciação transcripcional de um gene estrutural. Elementos de seqüênciadentro de promotores que funcionam na iniciação de transcrição são fre-qüentemente caracterizados por seqüências de nucleotídeos de consenso.Estes elementos promotores incluem sítios de ligação de RNA polimerase,seqüências TATA, seqüências CAAT, elementos específicos de diferencia-ção (DSEs; McGehee, R.E., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551), elementosde reação de AMP cíclico (CREs), elementos de reação sérica (SREs;Treisman, R., Seminars in Câncer Biol. 1 (19§0) 47), elementos de reaçãode glucocorticóides (GREs), e sítios de ligação para outros fatores de trans-crição, tais como CRÉ/ATF (0'Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992)19938), AP2 (Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728), SP1, proteínade ligação de elementos de reação de cAMP (CREB; Loeken, M.R., GeneExpr. 3 (1993) 253) e fatores de octâmeros (vide, em geral, Watson et al.,eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Pu-blishing Company, Inc. 1987), e Lemaigre, F.P. e Rousseau, G.G., Biochem.J. 303 (1994) 1-14). Se um promotor for um promotor indutível, então o índi-ce de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Em contraste,o índice de transcrição não é regulado por um agente indutor se o promotorfor um promotor constitutivo. Também são conhecidos promotores repressí-veis. Por exemplo, o promotor c-fos é especificamente ativado na ligação dohormônio do crescimento a seu receptor sobre a superfície celular. Expres-são regulada por tetraciclina (tet) pode ser obtida por promotores híbridosartificiais que consistem, por exemplo, em um promotor de CMV seguido pordois sítios Tet-operadores. O Tet-repressor liga aos dois sítios Tet-operadores e bloqueia a transcrição. Na adição do indutor tetraciclina, Tet-repressor é liberado dos sítios Tet-operadores e a transcrição prossegue(Gossen, M. and Bujard, H., PNAS 89 (1992) 5547-5551). Para outros pro-motores indutíveis incluindo metalotioneína e promotores de choque térmico,vide, por exemplo, Sambrook et al. (supra) e Gossen et al., Curr. Opin. Bio-tech. 5 (1994) 516-520. Entre os promotores eucarióticos que foram identifi-cados como fortes promotores para alto nível de expressão são o promotorprecoce SV40, promotor tardio principal de adenovírus, promotor de metalo-tioneína-l de camundongo, longa repetição de terminal do s&rcoma vírusRous, fator 1 alfa de alongamento de hamster chinês (CHEF-1, vide por e-xemplo, a Patente dos Estados Unidos N2 5.888.809), EF-1 alfa humana,ubiquitina, e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (CMVIE).
O "promotor" pode ser constitutivo ou indutível. Um reforçador(isto é, um elemento de DNA de ação eis que age sobre um promotor au-mentando a transcrição) pode ^ser necessário funcionar em combinação como promotor para aumentar o nível de expressão obtido com um promotorsomente, e pode ser incluso como um elemento regulador transcripcional.Freqüentemente, o segmento de polinucleotídeo contendo o promotor inclui-rá seqüências reforçadoras também (por exemplo, CMV ou SV40).
Um "reforçador", conforme usado aqui, neste requerimento depatente, se refere a uma seqüência de polinucleotídeo que reforça atranscrição de um gene ou seqüência codificante à qual é encadeado opera-velmente. Diferentemente de promotores, reforçadores são relativamenteindependentes da orientação e da posição e foram encontrados 5' ou 3'(Lusky, M., et al., Mol. Cell Bio. 3 (1983) 1108) para a unidade detranscrição, dentro de um íntron (Banerji, J., et al., Cell 33 (1983) 729) bemcomo dentro da própria seqüência codificante (Osborne, T.F., et al., Mol. CellBio. 4 (1984) 1293). Portanto, reforçadores podem ser dispostos a montanteou a jusante do sítio de iniciação de transcrição ou em distâncias considerá-veis do promotor, embora na prática reforçadores possam sobrepor fisica-mente e funcionalmente com promotores. Um grande número de reforçado-res, de uma variedade de diferentes fontes são de conhecimento geral natécnica (e identificados em bandos de dados tais como GenBank) e estãodisponíveis como ou dentro de seqüências de polinucleotídeos clonados (de,por exemplo, depositários tais como a ATCC bem como outras fontes co-merciais ou individuais). Uma série de polinucleotídeos compreendendo se-qüências promotoras (tais como o promotor de CMV comumente usado)também compreendem seqüências reforçadoras. Por exemplo, todos os for-tes promotores listados acima também podem conter fortes reforçadores(vide, por exemplo, Bendig, M.M., Genetic Eqgineering 7 (1988) 91-127).
Um "sítio de ingresso de ribossoma interno" ou "IRES" descreveuma seqüência a qual promove funcionalmente iniciação de translação inde-pendente do gene 5' do IRES e permite que dois cistrons (frames de leituraaberta) sejam traduzidos de um único transcripto em uma célula animal. OIRES proporciona um sítio de ingresso de ribossoma independente paratranslação do frame de leitura aberta imediatamente a jusante (a jusante éusado de modo intercambiável aqui, neste requerimento de patente, com 3')deste. Diferentemente de RNAm bacteriano o qual pode ser policistrônico,isto é, codificar vários polipeptídeos diferentes que são traduzidos seqüenci-almente a partir dos RNAms, a maioria dos RNAms de células animais sãomonocistrônicos e codificam para a síntese de somente uma proteína. Comum transcripto policistrônico em uma célula eucariótica, a translação iniciariaa partir do sítio de iniciação de translação mais 5', terminaia no primeiro có-don de parada, e o transcripto seria liberado do ribossoma, resultando natranslação de somente o primeiro polipeptídeo codificado no RNAm. Em umacélula eucariótica, um transcripto policistrônico tendo um IRES encadeadooperavelmente ao segundo frame de leitura aberta ou subseqüente no trans-cripto permite a translação seqüencial deste frame de leitura aberta a jusantepara produzir os dois ou mais polipeptídeos codificados pelo mesmo trans-cripto. O uso de elementos de IRES na construção vetorial foi previamentedescrito, vide, por exemplo, Pelletier, J., et al., Nature 334 (1988) 320-325;Jang, S.K., et al., J. Virol. 63 (1989) 1651- 1660; Davies, M.V., et al., J. Virol.66 (1992) 1924-1932; Adam, M.A., et al., J. Virol. 65 (1991) 4985-4990; Mor-gan, R.A., et al., Nucl. Acids Res. 20 (1992) 1293-1299; Sugimoto, Y., et al.,Biotechnology 12 (1994) 694-698; Ramesh, N., et al., Nucl. Acids Res. 24(1996) 2697-2700; e Mosser, D.D., et al., Biotechniques 22 (1997) 150-152).
"Encadeado operavelmente" se refere a uma justaposição dedois ou mais componentes, em que os componentes descritos deste modoestão em uma relação permitindo que os mesmos funcionem em sua manei-ra pretendida. Por exemplo, um promotor e/ou reforçador são encadeadosoperavelmente a uma seqüência codificante, se agir em eis para controlar oumodular a transcrição da saqüência encadeada. Geralmente, mas não ne-cessariamente, as seqüências de DNA que são "encadeadas operavelmen-te" são contíguas e, onde necessário unam duas regiões codificando proteí-na tais como uma seqüência secretora líder / de sinal e um polipeptídeo,contíguos e no frame de leitura. No entanto, embora um promotor encadea-do operavelmente esteja geralmente localizado a montante da seqüênciacodificante, não é necessariamente contíguo com este. Reforçadores nãodevem, ser contíguos. Um feforçador é encadeado operavelmente a uma 'seqüência codificante se o reforçador aumenta a transcrição da seqüênciacodificante. Reforçadores encadeados operavelmente podem estar localiza-dos a montante, dentro, ou a jusante de seqüências codificantes e em consi-derável distância do promotor. Um sítio de poliadenilação é encadeado ope-ravelmente a uma seqüência codificante se estiver localizado na extremida-de a jusante da seqüência codificante de tal modo que a transcrição prossigaatravés da seqüência codificante para a seqüência de poliadenilação. A en-cadeação é realizada por métodos recombinantes conhecidos na técnica,por exemplo, usando metodologia de PCR e/ou por ligação em sítios de res-trição convenientes. Se não existirem sítios de restrição convenientes, entãosão usados adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou Iigantes de acor-do com a prática convencional.
O termo "expressão" conforme usado aqui, neste requerimentode patente, se refere a transcrição e/ou translação ocorrendo dentro de umacélula hospedeira. O nível de transcrição de um produto desejado em umacélula hospedeira pode ser determinado com base na quantidade de RNAmcorrespondente que está presente na célula. Por exemplo, RNAm transcritode uma seqüência selecionada pode ser quantificado por PCR ou por hibri-dização Northern (vide Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Proteína codificadapor uma seqüência selecionada pode ser quantificada por vários métodos,por exemplo, por ELISA, testando a atividade biológica da proteína, ou em-pregando testes que são independentes de semelhante ativitade, tais comoWestern blotting ou radioimunoensaio, usando anticorpos que reconhecem eligam à proteína (vide Sambrook et al., 1989, supra).
Uma "célula hospedeira" se refere a uma célula na qual o genecodificando o polipeptídeo da invenção é introduzido. Células hospedeirasinclui tanto células procarióticas usadas para propagação dos plasmídeos /vetores, quanto células eucarióticas para expressão do gene estrutural. Tipi-camente, as células eucarióticas são células mamíferas.
Um "polipeptídeo" é um polímero de resíduos aminoácidos uni-dos por ligações peptídicas, quer produzidas naturalmente; óu sinteticçmen-te. Polipeptídeos de menos de cerca de 20 resíduos aminoácidos podem serreferidos como "peptídeos." Polipeptídeos compreendendo uma ou mais ca-deias de polipeptídeos ou compreendendo uma cadeia de aminoácido deuma extensão de 100 aminoácidos ou mais podem ser referidos como "pro-teínas".
Uma "proteína" é uma macromolécula compreendendo uma oumais cadeias de polipeptídeo em que no mínimo uma cadeia tem uma ex-tensão de aminoácido de 100 aminoácidos ou mais. Uma proteína tambémpode compreender componentes não peptídicos, tais como grupamentoscarboidrato. Carboidratos e outros substituintes não peptídicos podem seradicionados a uma proteína pela célula na qual a proteína é produzida, epodem variar com o tipo de célula. Proteínas são definidas aqui, neste re-querimento de patente, em termos de suas estruturas de espinha dorsal deaminoácido; adições tais como grupamentos carboidrato são geralmente nãoespecificadas, mas não obstante podem estar presentes.
"DNA heterólogo" ou "polipeptídeo heterólogo" se refere a umamolécula de DNA ou um polipeptídeo, ou uma população de moléculas deDNA ou uma população de polipeptídeos, que não existem naturalmentedentro de uma dada célula hospedeira. Moléculas de DNA heterólogas auma célula hospedeira particular podem conter DNA derivado da espécie decélula hospedeira (isto é, DNA endógeno) na medida que o DNA hospedeiroseja combinado com DNA não hospedeiro (isto é, DNA exógeno). Por exem-plo, uma molécula de DNA contendo um segmento de DNA não hospedeirocodificando um polipeptídeo encadeado operavelmente a um segmento deDNA hospedeiro compreendendo um promotor é considerado uma moléculade DNA heteróloga. Em vez, uma molécula de DNA heteróloga pode com-preender um gene estrutural endógeno encadeado operavelmente com umpromotor exógeno.
Um peptídeo ou polipeptídeo codificado por uma molécula deDNA não hospedeira é um peptídeo ou polipeptídeo "heterólogo".
Um "vetor de clonagem" é uma molécula de ácido nucléico, talcomo um plasmídeo, cosmídeo, fagomídeo ou cromossoma artificial bacteri-ano (BAC), o qual tem a capacidade de replicar autonomamente em umacélula hospedeira. Vetores de clonagem tipicamente contêm um ou um nú-mero pequeno de sítios de reconhecimento de endonuclease de restriçãoque permitem inserção de uma molécula de ácido nucléico em um modo de-terminável sem perda de uma função biológica essencial do vetor, bem co-mo seqüências de nucleotídeo codificando um gene de resistência que éadequado para uso na identificação e seleção de células transformadas como vetor de clonagem. Genes de resistência tipicamente incluem genes queproporcionam resistência a tetraciclina ou resistência a ampicilina.
Um "plasmídeo de expressão" é uma molécula de ácido nucléicocodificando uma proteína a ser expressada em uma célula hospedeira. Tipi-camente, um plasmídeo de expressão compreende uma unidade de propa-gação de plasmídeo procariótico, por exemplo, para E.coli, compreendendouma origem de replicação, e um marcador de seleção, um marcador de se-leção eucariótico, e um ou mais cassetes de expressão para a expressão doum ou mais genes estruturais de interesse compreendendo um promotor, umgene estrutural, e um terminador de transcrição incluindo um sinal de polia-denilação. A expressão genética é geralmente disposta sob o controle de umpromotor, e diz-se que um gene estrutural semelhante é "encadeado opera-velmente a" o promotor. Similarmente, um elemento regulador e um promo-tor de núcleo são encadeados operavelmente se o elemento regulador mo-dula a atividade do promotor de núcleo.
Uma "unidade de transcrição policistrônica" é uma unidade detranscrição na qual mais de um gene estrutural está sob o controle do mes-mo promotor. · ■ -
Um "polipeptídeo isolado" é um polipeptídeo que é essencial-mente livre de componentes celulares contaminantes, tais como carboidrato,lipídeo, ou outras impurezas proteináceas associadas com o polipeptídeo nanatureza. Tipicamente, uma preparação de um polipeptídeo isolado contémo polipeptídeo em uma forma altamente purificada, isto é, no mínimo cercade 80% pura, no mínimo cerca de 90% pura, no mínimo cerca de 95% pura,mais de 95% pura, oa mais de 99% pura. Um modo tle mostrar que umapreparação de proteína em particular contém um polipeptídeo isolado é peloaparecimento de uma única banda depois de eletroforese por dodecil sulfatode sódio (SDS)-gel de poliacrilamida da preparação protéica e tintura Coo-massie Brilliant Blue do gel. No entanto, o termo "isolado" não exclui a pre-sença do mesmo polipeptídeo em formas físicas alternativas, tais como dí-meros ou alternativamente formas glicosiladas ou derivadas.
O termo "imunoglobulina" se refere a uma proteína consistindoem um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes deimunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genesde domínios constantes (região) diferentes bem como miríade de genes deregiões variáveis de imunoglobulina. Imunoglobulinas podem existir em umavariedade de formatos, incluindo, por exemplo, Fv1 Fab, e F(ab)2 bem comocadeias únicas (scFv) (por exemplo, Huston, J.S., et al., PNAS USA 85(1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; em geral,Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984); e Hunkapiller, T.and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16).
Uma imunoglobulina em geral compreende no mínimo dois poli-peptídeos de cadeia leve e dois polipeptídeos de cadeia pesada. Cada umacadeias dos polipeptídeo pesadas e leves contém um domínio variável (regi-ão) (geralmente a porção terminal amino da cadeia do polipeptídeo) o qualcontém uma região de ligação (domínio) que é capaz de interagir com umantígeno. Cada uma cadeias dos polipeptídeo pesadas e leves compreendeuma região constante (geralmente a porção terminal carboxila). A regiãoconstante da cadeia pesada media a ligação do anticorpo i) a células carre-gando um gama receptor de Fc (FcryR), tal como células fagocitárias, ou ii) acélulas carregando o receptor de Fc neonatal (FcRn) também conhecido comoreceptor de Brambell. Também media a ligação a alguns fatores incluindo fato-res do sistema de complemento clássico tais como componente (C1 q).
O domínio variável de uma cadeia leve ou pesada de imunoglo-bulina por sua vez compreende diferentes segmentos, isto é, quatro regiõesde framework (FR) e três regiões hipervariáveis (CDR).
Um ,"fragmento de imunoglobulina" denota um polipeptídeocompreendendo no mínimo os domínios constantes de uma cadeia de umaimunoglobulina, isto é, CH1, região de articulação, CH2, e Ch3 e opcional-mente Ch4 de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina ou Cl de uma ca-deia leve de uma imunoglobulina. Também são compreendidos derivados evariantes dos mesmos. Adicionalmente um domínio variável, no qual um oumais aminoácidos ou regiões de aminoácidos são eliminados, pode estarpresente. Em uma modalidade preferencial o domínio variável é eliminadono fragmento de imunoglobulina.
"Terminador de transcrição" conforme denotado dentro desterequerimento é uma seqüência de DNA de 50 a 750 pares de base de ex-tensão a qual dá à RNA polimerase o sinal para terminação da síntese deRNAm. Terminadores muito eficientes (fortes) na extremidade 3' de um cas-sete de expressão são aconselháveis para evitar que a RNA polimerase sejalida apressadamente particularmente ao usar promotores fortes. Terminado-res de transcrição ineficazes podem levar à formação de um RNAm seme-lhante a operon o qual pode ser a razão para uma expressão genética inde-sejada, por exemplo, codificada por plasmídeo.
O termo "ligante" conforme usado dentro deste requerimentodenota Iigantes de peptídeos de origem natural ou sintética. Eles estão cons-truindo uma cadeia linear de aminoácidos. A cadeia tem uma extensão de apartir de 1 até 50 aminoácidos, preferencial entre 3 e 25 aminoácidos. O li-gante pode conter seqüências de aminoácidos repetitivas ou partes de poli-peptídeos que ocorrem naturalmente, tais como polipeptídeos com uma fun-ção de articulação.
"Ligant^s sintéticos" são designados para serem ricos em resí-duos glicina, glutamina, e serina. Estes resíduos são dispostos em uma pe-quena unidade peptídica de até cinco aminoácidos, tal como GGGGS,QQQQG, ou SSSSG. A pequena unidade peptídica é repetida por duas acinco vezes para formar uma unidade multimérica. Em cada uma das extre-midades de terminal amino e/ou carbóxi da unidade multimérica até seis a-minoácidos adicionais podem ser adicionados.
O termõ "molécula biologicamente ativa" conforme usado aqui,neste requerimento de patente, se refere a uma molécula orgânica, por e-xemplo, uma macromolécula biológica tal como um peptídeo, proteína, gli-coproteína, nucleoprotein, mucoproteína, lipoproteína, polipeptídeo ou prote-ína sintéticos, que causa um efeito biológico quando administrada em ou asistemas biológicos artificiais, tais como bioensaios usando linhagens celula-res e vírus, ou in vivo a um animal, incluindo mas não limitado a aves e ma-míferos, incluindo seres humanos. Este efeito biológico pode ser mas nãoestá limitado a inibição ou ativação enzimática, ligação a um receptor ou umligante, quer no sítio de ligação ou circunferencial, no disparo de sinal ou namodulação de sinal.
Moléculas biologicamente ativas são sem limitação, por exem-plo, hormônios, citocinas, fatores de crescimento, Iigantes de receptores,agonistas ou antagonistas, agentes citotóxicos, agentes antivirais, agentesde estudo por imagens, inibidores enzimáticos, ativ^idores enzimáticos oumoduladores da atividade enzimática tais como substâncias alostéricas.
O termo "aminoácido" conforme usado dentro deste requerimen-to compreende alanina (código de três letras: ala, código de uma letra: A),arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys,C), glutamina (gln, Q), ácido glutâmico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his,H), isoleucina (ile, I), Ieucina (leu, L), Iisina (lys, K), metionina (met, M), feni-Ialanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptofano(trp, W), tirosina (tyr, Y), e valina (vai, V).
Métodos e técnicas de conhecimento de uma pessoa versadana técnica, os quais são úteis para realizar a presente invenção, são descri-to^, por exemplo,, em Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Bio-logy, Volumes I to Ill (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Labora-tory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
Esta invenção compreende um método para a produção recom-binante de um polipeptídeo heterólogo em uma célula hospedeira eucarióti-ca. A célula hospedeira compreende um plasmídeo de expressão, o qualcompreende na direção 5' para 3' a) um promotor, tí) um ácido nucléico codi-ficando um primeiro polipeptídeo cuja seqüência de aminoácidos é selecio-nada da Tabela 1 dependendo dos dois primeiros aminoácidos do segundopolipeptídeo, c) um ácido nucléico codificando um segundo polipeptídeocompreendendo um ácido nucléico codificando um polipeptídeo heterólogotendo uma atividade biológica, um ácido nucléico codificando um peptídeoou polipeptídeo selecionado entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 06-10, 139, 140, e 554-557, um ácido nucléico codificando um fragmento deimunoglobulina, e d) uma região não traduzida 3'. Este plasmídeo de ex-pressão é introduzido em uma célula hospedeira o qual é cultivado sob con-dições adequadas para a expressão do segundo polipeptídeo. O segundopolipeptídeo secretado é recuperado do meio de cultura.
O primeiro polipeptídeo é uma chamada seqüência de sinal. Aseqüência de sinal é responsável pela secreção do polipeptídeo fixado /subseqüente / operavelmente encadeado. Para ser eficaz a seqüência desinal tem de ser reconhecida e processada pelas proteínas e enzimas dentroda célula expressando o polipeptídeo. No caso de uma célula hospedeiraeucariótica, a seqüência de sinal é preferencialmente uma seqüência eucari-ótica. Para assegurar que o segundo polipeptídeo de acordo com a presenteinvenção seja secretado corretamente, a seqüência de sinal é selecionadaentre seqüências de sinal de imunoglobulina humana e murina. Uma compi-lação de seqüências de sinal é mostrada na tabela 1.
Qual seqüência de sinal é selecionada depende dos aminoáci-dos subseqüentes. Deve ser assegurado que a peptidase de sinal, a qualcliva a seqüência de sinal depois do processo de secreção, reconheça a se-qüência de sinal do polipeptídeo secretado e a remova. Para proporecionaruma transição "natural" da seqüência de sinal para o polipeptídeo heterólogoa seqüência de sinal deve ser escolhida deste modo, de modo que os doisprimeiros aminoácidos do polipeptídeo heterólogo sejam idênticos aos doisprimeiros aminoácidos das seqüências de aminoácidos da região -FR1 daimunoglobulina natural seguinte.
Tabela 1: Série dos dois primeiros aminoácidos (dados em código de umaletra) do segundo polipeptídeo aíribuído a pçptídeos de sinal (primeiro poli-peptídeo dado em código de uma letra).
<formula>formula see original document page 20</formula><table>table see original document page 21</column></row><table><table>table see original document page 22</column></row><table><table>table see original document page 23</column></row><table><table>table see original document page 24</column></row><table><table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table><table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table>
Se o dipeptídçvD dos dois primeiros aminoácidos do segundopolipeptídeo não for explicitamente listado na Tabela 1, e não se pretenderusar nenhuma seqüência conforme listado na última linha da Tabela 1, évantajoso não enfileirar o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeodiretamente juntos. Em um caso semelhante é favorável inserir uma seqüên-cia curta de até cinco aminoácidos para se assemelhar ao início da seqüên-cia da região FR1 da imunoglobulina a qual iria / poderia naturalmente seguiro primeiro polipeptídeo. Esta seqüência pode ser um único aminoácido ouum dipeptídeo, o peptídeo QIWNN (SEQ ID NO: 472) ou um fragmento domesmo para se assemelhar aos dois primeiros aminoácidos da região FR1da imunoglobulina natural seguinte. Em uma modalidade, esta seqüência é opeptídeo QIWNN (SEQ ID NO:472), ou uma fração N-terminal do mesmocompreendendo no mínimo o dipeptídeo Ql.
Depois do primeiro polipeptídeo ou opcionalmente depois daseqüência curta inserida o segundo polipeptídeo compreende um polipeptí-deo heterólogo. Este polipeptídeo heterólogo tem uma seqüência de amino-ácidos de a partir de 5 até 500 resíduos aminoácidos. Em uma modalidadepreferencial da invenção a seqüência de aminoácidos é de a partir de 10 até350 resíduos aminoácidos e em uma modalidade mais preferencial de a par-tir de 15 até 150 resíduos aminoácidos. O polipeptídeo heterólogo conjugadoà imunoglobulina é selecionada entre o grupo compreendendo moléculasbiologicamente ativas. Estas moléculas apresentam um efeito biológicoquando administradas a um sistema biológico artificial ou uma célula viva, talcomo em sistemas de teste, ou a um organismo vivo, tal como aves ou ma-míferos, incluindo seres humanos. Estes compostos biologicamente ativoscompreendem, mas não estão,limitados a, agonistas bem como antagonis-tas de receptores, inibidores bem como ativadores de enzimas, e semelhan-tes, e também peptídeos, polipeptídeos, e proteínas apresentando atividadecitotóxica, antiviral, antibacteriana, ou anti-cancerígena, bem como antíge-nos. O efeito biológico pode ser, mas não está limitado, a inibição enzimáti-ca, ligação a um receptor, quer no sítio de ligação ou circunferencial, e dis-paro de sinal. Estes compostos biologicamente ativos são, por exemplo, Ci-teis para aplicações farmacêuticas, terapêuticas, ou de diagnóstico.
O segundo polipeptídeo compreende adicionalmente depois dopolipeptídeo heterólogo um ligante. Ligantes que podem ser usados prefe-rencialmente com a presente invenção são listados na Tabela 2.<table>table see original document page 46</column></row><table>Ch2, Ch3 e a região de articulação de uma cadeia pesada de imunoglobuli-na e opcionalmente um domínio Ch4, ou o domínio Cl de uma cadeia levede imunoglobulina. A imunoglobulina da qual o fragmento é derivado podeser uma imunoglobulina que ocorre naturalmente ou uma imunoglobulinasintética. Em uma modalidade da invenção o fragmento de imunoglobulinaadicionalmente contém um fragmento de um domínio variável de cadeia pe-sada ou leve ou de uma variante do mesmo. No fragmento de domínio variá-vel um ou mais aminoácidos ou uma ou mais regiões são eliminados. Emuma modalidade a partir de um a seis aminoácidos do domínio variável sãoeliminados. Em outra modalidade a partir de um a seis regiões do domíniovariável são eliminadas. Em uma modalidade adicional o domínio variável éeliminado. A presença de um domínio variável funcional, isto é, de reconhe-cimento antigênico, no fragmento de imunoglobulina não é essencial para apresente invenção. Uma imunoglobulina não funcionável de acordo com ainvenção é uma imunoglobulina não possuindo um domínio variável de reco-nhecimento antigênico. Em uma modalidade, o fragmento de imunoglobulinaé uma imunoglobulina não funcionável. Em uma modalidade, os domíniosvariável e constantes compreendidos no fragmento de imunoglobulina são-do/derivados do mesmo anticorpo, isto é, pertencem ao mesmo anticorpo.
As diferentes seqüências de ácidos nucléicos são encadeadasoperavelmente sobre um plasmídeo de expressão. Para expressão o plas-mídeo é introduzido em uma célula hospedeira. Proteínas são preferencial-mente produzidas em células mamíferas tais como células CHO, célulasNSO, células Sp2/0, células COS, células HEK, células K562, células BHK,células PER.C6, e semelhantes.
Os exemplos, listagem de seqüência e figuras seguintes sãoproporcionados para auxiliar no entendimento da presente invenção, cujoverdadeiro escopo é determinado nas reivindicações anexadas. Entende-seque podem ser feitas modificações nos procedimentos determinados sem seafastar do espírito da invenção.Descrição das Figuras:
Estrutura comum de imunoglobulinas da classe das IgG.Mapa de plasmídeo do vetor de expressão de cadeia pesada-γΐanti-IGF-1R 4818.
Mapa de plasmídeo do vetor de expressão de cadeia leve-κ anti-IGF-1R 4802.
Mapa de plasmídeo do vetor genético da região constante de ca-deia pesada-y1 4962.
Mapa de plasmídeo do vetor de expressão de cadeia leve κ anti-IG F-1R modificado 4964.
Mapa de plasmídeo do vetor de expressão de cadeia leve anti-IGF-1R modificado 4963.
Géis SDS-PAGE corados com Coomassie Blue de conjugados deimunoglobulina purificados por afinidade; disposição de amostrasde acordo com a Tabela 6.
Imunodetecção da cadeia leve em sobrenadantes da cultura celulardepois de expressão transitória em células HEK293 EBNA; disposi-ção de amostras de acordo com a Tabela 6. rFigura 9 Imunodetecção da cadeia pesada em sobrenadantes da culturacelular depois de expressão transitória em células HEK293 EBNA;disposição de amostras de acordo com a Tabela 6.
Exemplos
Material e Métodos
Informação geral referente às seqüências de nucleotídeos decadeias leve e pesada de Imunoglobulinas humanas é dada em: Kabat, E.A.,et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological lnterest, fifth ed., NIHPublication No 91-3242.
Aminoácidos de cadeias de anticorpos são numeradas de acor-do com a numeração EU (Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Ka-bat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological lnterest, Fif-th Ed., NIH Publieation No 91 -3242).
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8Técnicas de DNA Recombinante
Métodos de rotina foram usados para manipular DNA conformedescrito em Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A Iaboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 New York, 1989.Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instru-ções do fabricante.
Determinação de Proteína
A concentração de proteína foi determinada determinando adensidade ótica (OD) a 280 nm, usando o coeficiente de extinção molar cal-culado com base na seqüência de aminoácidos.Determinação da seqüência de DNA
Seqüências de DNA foram determinadas por seqüenciamento defilamento duplo realizado na MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemanha).Análise de seqüências de DNA e de proteína e tratamento dos dados dasseqüências
O pacote do software do GCG (Genetics Computer Group, Ma-dison, Wisconsin) versão 10.2 e Infomax1S Vector NTI Advance suite versão8.0 foi usado para criação, mapeamento,, análise, anotação, e ilustração deseqüências.
Síntese de gene
Segmentos genéticos desejados foram preparados pela Medi-genomix GmbH (Martinsried, Alemanha) a partir de oligonucleotídeos fabri-cados por síntese química. Os segmentos genéticos de 100 a 600 bp de ex-tensão os quais foram flanqueados por sítios de clivagem de endonucleasede restrição singulares foram reunidos por recozimento e ligação de oligonu-cleotídeos incluindo amplificação por PCR e subseqüentemente clonados novetor de clonagem pCR2.1-TOPO-TA (Invitrogen Corp., EUA) através deprotuberâncias em A. A seqüência de DNA dos fragmentos genéticos sub-clonados foram confirmadas por seqüenciamento de DNA.
Purificação por afinidade de conjugados de imunoqlobulina
Os conjugados de imunoglobulina expressados e secretadosforam purificados por cromatografia de afinidade usando Protein A-Sepharose® CL-4B (GE Healthcare former Amersham Bioscience, Suécia)de acordo com métodos conhecidos. Em resumo, depois de centrifugação(10.000 g por 10 minutos) e filtração através de um filtro de 0,45 pm o conju-gado de imunoglobulina contendo sobrenadantes de cultura clarificados foiaplicado sobre uma coluna Protein A-Sepharose® CL-4B equilibrada comtampão de PBS (10 mM de Na2HPO4, 1 mM de KH2PO4, 137 mM de NaCI e2,7 mM de KCI, pH 7.4). Proteínas não ligadas foram lavadas com tampãode equilibração de PBS e 0,1 M de tampão de citrato, pH 5.5. Os conjugadosde imunoglobulina foram elutriados com 0,1 M de tampão de citrato, pH 3.0,e as frações contendo o conjugado de imunoglobulina foram neutralizadascom 1 M de Tris-Base. Em seguida, os conjugados de imunoglobulina foramextensivamente dialisados contra tampão de PBS a 4°C, concentrados comum dispositivo de filtro centrífugo ultrafree equipado com uma membranaBiomax-SK (Millipore Corp., EUA) e armazenado em um banho gelado a0°C.
Exemplo 1
Fabricação dos plasmídeos de expressão
Os segmentos genéticos codificando um domínio variável decadeia leve de anticorpo (região) (Vl) anti-receptor de fator I de crescimentosemelhante a insulina (IGF-1R) e o domínio constante de cadeia leve kappahumana (região) (Cl) foram unidos como segmentos genéticos ao domíniovariável de cadeia pesada anti-IGF-1R (região) (Vh) e a região constante decadeia pesada gamai humana (CH1-Hinge-CH2-CH3).a) Vetor 4818
O vetor 4818 é o plasmídeo de expressão para a expreásãotransitória de um anticorpo anti-IGF-1 R (também denotado como anti-IGF-1Ra seguir) cadeia pesada (cassete de expressão organizado genomicamente;organização éxon-íntron) em células HEK293 EBNA (para seqüências vide aPatente dos Estados Unidos N- 2005/0008642). Compreende os seguinteselementos funcionais:
Além do cassete de expressão de cadeia pesada-γΐ anti-IGF-1Reste vetor contém:- um gene de resistência a higromicina como um marcador se-lecionável,
- uma origem de replicação, oriP, do vírus Epstein-Barr (EBV),
- uma origem de replicação do vetor pUC18 a qual possibilitareplicação deste plasmídeo em E. coli, e
- um gene de beta-lactamase o qual confere resistência a am-picilina em E. coli. s
A unidade de transcrição do gene de cadeia pesada-gamal anti-IGF-1R é composta dos seguintes elementos:
- o reforçador precoce imediato e promotor do citomegalovírushumano (HCMV),
- uma região não traduzida 5' sintética (UT)1
- uma seqüência de sinal de cadeia pesada de imunoglobulinamurina incluindo um íntron da seqüência de sinal (seqüência de sinal 1, ín-tron, seqüência de sinal 2 [L1-íntron-L2]),
- o segmento codificando cadeia pesada variável anti-IGF-1Rclonada arranjado com um único sítio de restrição Bsml na extremidade 5'(12 seqüência de sinal) e um sítio doador de junção e um único sítio de res-trição Notl na extremidade 3',
- um íntron 2 híbrido de cadeia pesada de camundongo / hu-mana incluindo o elemento reforçador de cadeia pesada de camundongo(parte JH3, JH4) (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378),
- a região constante do gene de cadeia γ1-pesada humanagenômica,
- a seqüência de sinal de poliadenilação'de γ1 -imunoglobulinahumana ("poly A"), e
- os únicos sítios de restrição Ascl e SgrAI na extremidade 5' e3', respectivamente.
O mapa de plasmídeo do vetor de expressão de cadeia pesada-γ1 anti-IGF-1R 4818 é mostrado na Figura 2.
b) Vetor 4802
O vetor 4802 é o plasmídeo de expressão para a expressãotransitória de uma cadeia leve de anticorpo anti-IGF-1R (cDNA) em célulasHEK293 EBNA. Compreende os seguintes elementos funcionais.
Além do cassete de expressão de cadeia leve-kappa anti-IGF-1R este vetor contém:
- um gene de resistência a higromicina como um marcador se-
lecionável,
- uma origem de replicação, oriP, do vírus Epstein-Barr (EBV),
- uma origem de replicação do vetor pUC18 a qual possibilitareplicação deste plasmídeo em E. coli, e
- um gene de β-lactamase o qual confere resistência a ampici-lina em E. coli.
A unidade de transcrição do gene de cadeia leve κ anti-IGF-1Ré composta dos seguintes elementos:
- o reforçador precoce imediato e promotor do citomegalovírushumano (HCMV),
- o cDNA de cadeia leve variável anti-IGF-1R clonado incluin-do
- a 5'-UT nativa e
- a seqüência de sinal de cadeia leve nativa do gene da linha-gem germinativa de imunoglobulina humana disposta com um único sítio derestrição Bglll na extremidade 5',
- a região constante do gene de cadeia leve-κ humana,
- a seqüência de sinal de κ-poliadenilação de imunoglobulinahumana ("poly A"), e
- os únicos sítios de restrição Ascl e Fsel na extremidade 5' e3', respectivamente.
O mapa de plasmídeo do vetor de expressão de cadeia leve-κanti-IGF-1R 4802 é mostrado na Figura 3.
c) Plasmídeo 4962
O vetor 4962 serviu como estrutura básica para a reunião dosplasmídeos de expressão 4965, 4966, e 4967. Estes plasmídeos possibilita-ram a expressão transitória de cadeias pesadas de anticorpo modificado(conjugação de N-terminal sem domínio variável, organização de cDNA) emcélulas HEK 293 EBNA. O plasmídeo 4962 compreende os seguintes ele-mentos funcionais.
Além do cassete de expressão para a região constante de ca-deia pesada-gamal este vetor contém:
- um gene de resistência a higromicina como um marcador se-lecionável, }
- uma origem de replicação, oriP, do vírus Epstein-Barr (EBV),
- uma origem de replicação do vetor pUC18 a qual possibilitareplicação deste plasmídeo em E. coli, e
- um gene de beta-lactamase o qual confere resistência a am-picilina em E. coli.
A unidade de transcrição do gene da região constante de cadeiapesada-γΐ (CH1-Hinge-CH2-CH3) é composta dos seguintes elementos:
- o reforçador precoce imediato e promotor do citomegalovírushumano (HCMV),
- um Iigante sintético (SEQ ID NO: 01) compreendendo um Cí-nico sítio de restrição Bglll na extremidade 5' e urr>- único sítio de restriçãoNhel na extremidade 3' (sítio Nhel dentro do N-término de ChO
HCMV-promotor AIaSer(CHI)
.. .aaatcttttqccaccactaqc...
Bglll Nhel
- os domínios constantes de gene de cadeia pesada-γΐ huma-na (região) (CH1-Hinge-CH2-CH3, organização de cDNA),
- a seqüência díPsinal de poliadenilação de γΐ-imunoglobulinahumana ("poly A"), e
- os únicos sítios de restrição Ascl e Fsel na extremidade 5' e3', respectivamente.
O mapa de plasmídeo do vetor genético dos domínios constan-tes de cadeia pesada-γΐ /região 4962 é mostrado na Figura 4.d) Plasmídeo 4964
O vetor 4964 serviu como estrutura básica para a reunião dosplasmídeos de expressão 4976 e 4977. Estes plasmídeos possibiltaram aexpressão transitória das cadeias leves de anticorpo anti-IGF-1R modificado(conjugação de N-terminal) em células HEK 293 EBNA.
O plasmídeo 4964 é uma variante do plasmídeo de expressão4802.
A unidade de transcrição do gene de cadeia leve-κ anti-IGF-1Rfoi modificada conforme indicado abaixo:
A seqüência de sinal de cadeia leve nativa é substituída por umligante sintético disposto com um único sítio de restrição Bglll na extremida-de 5'- e um único sítio de restrição Nhel na extremidade 3' unido diretamenteao domínio variável Vl-IGF-I R (região) (SEQ ID NO: 03)... .agatctatatatatatatgctaacgaaattatattaaca...
AlaSerGIuIleValLeuThr...Bglll Nhel
O mapa de plasmídeo do vetor de expressão de cadeia leve-κanti-IGF-1 R modificada 4964 é mostrado na Figura 5.
e) Plasmídeo 4969
O plasmídeo de expressão 4969 é derivado do plasmídeo 4802o qual é um plasmídeo de expressão para a cadeia leve do anticorpo anti-IGF-1R. O plasmídeo codifica um fragmento de cadeia leve de anticorpomodificado (conjugação de N-terminal sem domínio variável; polipeptídeo-ligante-região constante de cadeia kappa).
Para a construção do plasmídeo 4969 um único sítio de restri-ção Bglll foi introduzido na. extremidade 3' do CMV-promotor e um único sítioâe restrição,^BbsI foi introduzido clentro da região constante da cadeia levedo anticorpo anti-IGF-1R (SEQ ID NO: 04).
I- C-kappa Bbsl
cgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttc...
ArgThrValAlaAIaProSerValPhellePhe...
f) Plasmídeo 4963
Este plasmídeo enabled the transient expressão of anti-IGF-1Rantibody cadeias leves in HEK 293 EBNA cells.O plasmídeo 4963 é uma variante do plasmídeo de expressão4802.
A unidade de transcrição do gene de cadeia leve-κ anti-IGF-1Rfoi modificada conforme indicado abaixo:
- a região genética constante de cadeia Ieve-Khumana foi ligei-ramente modificada na região de ligação C-kappa-lg-kappa pA (inserção deum único sítio de restrição Hindlll e Kasl, SEQ ID NO:j558)....C-kappa Ig-kappa-pA
... AaaagcttcaacaggggagagtgtTG Aaqaaaaàaacaccccca...LysSerPheAsnArgGlyGluCys
Hindlll Kasl
O mapa de plasmídeo do vetor de expressão de cadeia leve an-ti-IGF-1 R modificado 4963 é mostrado na Figura 6.
Exemplo 2
Fabricação dos plasmídeos de expressão finais
Os genes de fusão de imunoglobulina (cadeia pesada e leve)compreendendo o segmento genético de imunoglobulina, segmento genéticoligante, e segmanto genético de polipeptídeo foram reunidos com técnicas emétodos recombinantes conhecidos por conesão dos segmentos genéticosconcordantes (ácidos nucléicos).
As seqüências de ácido nucléico codificando os Iigantes de pep-tídeos e polipeptídeos foram cada uma sintetizadas por síntese química eem seguida ligadas em um plasmídeo de E. coli. As seqüências de ácidonucléico subclonadas foram verificadas por seqüenciamento de DNA.
As sadeias de polipeptídeo de imunoglobulina empfegadas, ó,fragmento de imunoglobulina, a localização da conjugação do polipeptídeo(N-terminal), o ligante empregado e o polipeptídeo empregado são listadosna Tabela 2 (página\ 45), Tabela 3, e Tabela 3a.
Tabela 3: Proteínas e polipeptídeos empregados; a seqüência de aminoáci-dos e a numeração das posições é como na cepa de referência BH8 (LocusHIVH3BH8; HIV-1 isolado LAI/IIIB clone BH8 da França; Ratrier1 L., et al.,Nature 313 (1985) 277-384).<table>table see original document page 56</column></row><table>
Tabela 3a: Segmentos genéticos preparados quimicamente usados paraconstrução genética de conjugado de imunoglobulina.
<table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table>
Os componentes usados para a construção dos plasmídeos deexpressão finais para expressão transitória das cadeias leves e pesadas dospolipeptídeos de imunoglobulinas modificadas (os cassetes de expressão)são listados na Tabela 4 com respeito ao plasmídeo de base usado, ao sítiode clonagem, e à seqüência de ácido nucléico inserida codificando os poli-peptídeos de imunoglobulina conjugados.
Tabela 4: Componentes empregados na construção dos plasmídeos de ex-pressão usados.
<table>table see original document page 57</column></row><table>
Na Tabela 5 são listado: os polipeptídeos usados com proprie-dades inibitórias do HIV-1 (variantes do ectodomínio T-651 e HIV-1 gp41), osIigantes usados para ligar a cadeia leve ou pesada de imunoglobulina com opolipeptídeo e o peso molecular deduzido das cadeias de anticorpos modifi-cadas conforme deduzido a partir das seqüências de aminoácidos codifica-das.
Tabela 5: Sumário dos polipeptídeos empregados e o peso molecular dedu-zido das cadeias de polipeptídeos da imunoglobulina modificada.
<table>table see original document page 58</column></row><table>
Exemplo 3
Expressão transitória de variantes de imunoglobulina em células HEK293EBNA
Variantes de imunoglobulina recombinante foram geradas portransfecção transitória de células HEK293-EBNA em crescimento aderentes(linhagem de células de rim embrionário humano 293 expressando antígenonuclear do Vírus Epstein-Barr; Número de depósito ATCC (American typeculture collection) n2 CRL-10852) cultivadas em DMEM (meio de Eagle modi-ficado por Dulbecco, Gibco1 Invitrogen Corp., EUA) suplementado com 10%de ultrabaixo IgG FCS (soro de feto de vitelo, Gibco, Invitrogen Corp., EUA),2 mM de Glutamina (Gibco, Invitrogen Corp., EUA), 1°/o de volume por volu-me (v/v) de aminoácidos não essenciais (Gibco, Invitrogen Corp., EUA) e250 pg/ml de G418 (Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics Gm-bH, Alemanha). Para transfecção, foi usado reagente de transfecção Fuge-ne® 6 Transfection Reagent (Roche Molecular Biochemicals, Roche Diag-nostics GmbH, Alemanha) em uma proporção de reagente (μΙ) para DNA(pg) variando de 3:1 a 6:1. Cadeias leve e pesada de polipeptídeo de imu-noglobulina foram expressadas a partir de dois plasmídeos diferentes usan-do uma proporção molar de cadeia leve para cadeia pesada codificandoplasmídeo from 1:2 to 2:1. Variantes de imunoglobulina contendo sobrena-dantes de cultura celular foram colhidos no dia 4 a 11 depois de transfecção.Os sobrenadantes foram armazenados a 0° C em um banho de água geladaaté a purificação.
Informação geral referente a expressão recombinante de imuno-globulinas humanas em, por exemplo, células HEK293 é dada em: Meissner,P., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.Exemplo 4
Análise da expressão usando SDS PAGE. Western blotting transferência edetecção com conjugados de anticorpos imunoglobulina específicos
Os polipeptídeos expressados e secretados foram processadospor dodecil sulfato sódio (SDS) eletroforese por gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), e os polipeptídeos separados foram transferidos para uma membra-na a partir do gel e subseqüentemente foram detectados por um método i-munológico.SDS-PAGE
Tampão da amostra de LDS, concentrado quatro vezes (4x): 4 gde glicerol, 0,682 g de Tris-Base, 0,666 g de Tris-cloridrato, 0,8 g de LDS(dodecil sulfato de lítio), 0,006 g de EDTA (etileno diamina tetra ácido), 0,75ml de uma 1% em peso (em peso / vol) de solução de Serva Blue G250 emágua, 0,75 ml de uma 1% em peso (em peso/ vol) de solução de vermelhofenol, adicionar água para preparar um volume total de 10 ml.
O caldo de cultura contendo o polipeptídeo secretado foi centri-fugado para remover células e debris celulares. Uma alíquota do sobrena-dante clarificado foi misturado com 1/4 volumes (em vol/ vol) de 4xLDS tam-pão de amostra e 1/10 volume (v/v) de 0,5 M de 1,4-ditiotreitol (DTT). Emseguida as amostras foram incubadas por 10 min a 70°C e a proteína foi se-parada por SDS-PAGE. O sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (InvitrogenCorp., EUA) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Em parti-cular, foi usado 10% de géis NuPAGE® Novex® Bis-Tris Pre-Cast (pH 6.4) eum tampão de operação NuPAGE® MOPS.
Western blot
Tampão de transferência: 39 mM de glicina, 48 mM de Tris-cloridrato, 0,04% em peso (em peso/ vol) SDS, e 20% por volume de meta-nol (v/v.)
Depois do SDS-PAGE as cadeias polipeptídicas de conjugadode imunoglobulina separadas foram transferidas eletroforeticamente parauma membrana de filtro de nitrocelulose (medida do poro: 0,45 pm) de acor-do com o método "Semidry-Blotting-Method" de Burnette (Burnette, W.N.,Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203).
Detecção imunolóqica
Tampão TBS: 50 mM de Tris-cloridrato, 150 mM de NaCl ajustado para pH 7.5
Solução de bloqueio: 1% (em peso/ vol) de Western BlockingReagent (Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Alemanha) em tampão TBS
Tampão TBST: 1x tampão TBS com 0,05% por volume (v/v) de Tween-20
Para detecção imunológica as membranas de Western blottingforam incubadas com agitação em temperatura ambiente duas vezes por 5minuto e em tampão TBS e uma vez por 90 minutos em solução de bloqueio.Detecção das cadeias de polipeptídeo de conjugado de imunoqlobulina
Cadeia pesada: Para detecção dos polipeptídeos contendo ca-deia pesada ou fragmento de cadeia pesada foi usado um anticorpo de IgGanti-humana de coelho purificado conjugado a uma peroxidase (Código NsP0214, DAKO1 Dinamarca). ,
Cadeia leve: Polipeptídeos contendo cadeia leve ou fragmentosde cadeia leve foram detectados com um anticorpo de cadeia leve kappaanti-humano de coelho conjugado a peroxidase purificado (DAKO, Dinamar-ca, Código N2 P 0129).
Para visualização das cadeias leve e pesada de anticorpo oufragmentos das mesmas membranas de Western blot lavadas e bloqueadasforam primeiro incubadas em caso de uma cadeia pesada com um anticorpode IgG anti-humana de coelho purificado conjugado a uma peroxidase ou emcaso de uma cadeia leve com um anticorpo de cadeia leve kappa anti-humano de coelho conjugado a peroxidase purificado em uma diluição a1:10.000 em 10 ml de solução de bloqueio a 4°C com agitação de um .diapara o outro. Depois de lavar as membranas três vezes com tampão deTBTS e uma vez com tampão de TBS por 10 min. em temperatura ambiente,as membranas de Western blot foram dsenvolvidas com uma solução deLuminol / peróxido gerando quimiluminescência (Substrato de Western Blot-ting Lumi-Lightpujs, Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics Gm-bH, Alemanha). Portanto as membranas foram incubadas em 10 ml de solu-ção de Luminol / peróxido por 10 segundos a 5 minutos e a luz emitida^foidetectada depois disso com um analisador Lumi-Imager F1 Analysator (Ro-che Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Alemanha) e/ou foiregistrada com um filme de raios-X.
A intensidade das manchas foi quantificada com o Software Lu-miAnalyst (Versão 3.1).Múltipla coloração de immunoblots
O conjugado de anticorpo marcado com peroxidase secundáriausado para a detecção pode ser removido da mancha corada incubando amembrana por uma hora a 70°C em tampão de Tris-cloridrato a 1 M (pH 6.7)contendo beta-mercaptoetanol a 100 mM e 20% (em peso / vol) de SDS.Depois deste tratamento a mancha pode ser corada com um anticorpo se-cundário diferente uma segunda vez. Antes da segunda detecção a manchaé lavada três vezes em temperatura ambiente com agitação em tampão TBSpor 10 minutos cada.
A disposição das amostras é listada na Tabela 6.Tabela 6: Disposição de amostras de géis SDS PAGE / Western blots
<table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table>
Exemplo 5
Detecção de polipeptídeos de imunoglobulina reunidosPurificação e concentração de polipeptídeos de imunoglobulinapor ligação por afinidade a Proteína A Sepharose™ CL-4B
Células HEK 293 EBNA contendo um ou mais plasmídeos foramcultivadas sob condições adequadas para a expressão transitória do um oumais genes de polipeptídeos localizados sobre o um ou mais plasmídeos por6 a 10 dias. A 1 ml de sobrenadante de cultura clarificada em um copo Ep-pendorf de 1,8 ml foi adicionado 0,f*ml de uma suspensão de ProteinaASepharose™ CL-4B (GE Healthcare former Amersham Biosciences, Suécia)(suspensão a 1:1 (v/v) de Proteína A Sepharose em tampão PBS (10 mM deNa2HPO4, 1 mM de KH2PO4, 137 mM de NaCI e 2,7 mM de KCI, pH 7.4)). Asuspensão foi incubada por um tempo de entre uma e dezesseis horas emtemperatura ambiente com agitação. Depois disso as contas Sepharose fo-ram sedimentadas por centrifugação (30 s, 5000 rpm) e o sobrenadante foidescartado. O pélete Sepharose foi lavado subseqüentemente cada com 1,6ml de tampão PBS, 1,6 ml de tampão de citrato a 0,1 M pH 5.0, e 1,6 ml deágua destillada. A imunoglobulina ligada a proteína A foi extraída das contasSepharose com 0,1 ml de tampão de amostra IxLDS-PAGE a 70°C por 5 a10 min. A análise foi feita por separação SDS-PAGE e coloração com azulbrilhante Coomassie conforme descrito no exemplo 4.Resultados:
Expressão / Secreção Análise de fragmento de cadeia pesadae/ou leve contendo polipeptídeos depois de expressão transitória:
Figura 7a-c: Géis SDS-PAGE corados com Coomassie Blue depolipeptídeos purificados por afinidade; disposição de amostras de acordocom a Tabela 6.
Imunodetecção de polipeptídeos contendo imunoglobulina:
Figura 8a-c: Imunodetecção de polipeptídeos contendo fragmen-to de cadeia leve em sobrenadantes de cultura celular depois de expressãotransitória em células HEK293 EBNA.
Figura 9a-c: Imunodetecção do polipeptídeos contendo fragmen-to de cadeia pesada em sobrenadantes de cultura celular depois de expres-são transitória em células HEK293 EBNA.
A partir da Figura 7 a-c, 8 a-c e 9 a-c pode ser deduzido que ospolipeptídeos são expressados transitoriamente e secretados no meio decultura. No caso em que o polipeptídeo contendo imunoglobulina possui umou vários sítios de glicosilação os polipeptídeos finais não têm peso molecu-lar definido exatamente mas uma distribuição de peso molecular dependen-do da extensão da glicosilação. Isto faz com que no SDS-PAGE as espéciestodas representando um polipeptídeo não migrem homogeneamentê e por-tanto as bandas são alargadas.
Exemplo 6
Quantificação dos polipeptídeos contendo cadeia pesada expressados com
ELISA de IaG humana
A concentração de polipeptídeo contendo fragmento de cadeiapesada de imunoglobulina nos sobrenadantes da cultura celular foi determi-nada por um ELISA'sanduíche o qual usou um fragmento F(ab')2 de fgG anti-humana biotinilado como o reagente de captura e para detecção um frag-mento de anticorpo F(ab')2 de IgG anti-humana conjugado a peroxidase.
Lâminas de 96 cavidades revestidas com estreptavidina (PierceReacti-Bind® Streptavidin Coated Polystyrene Strip Plates, Código N2 15121,Pierce Chemical Company, EUA) foram revestidas com 0,5 pg/ml de frag-mento de anticorpo F(ab')2 de IgG anti-humana policlonal de cabra biotinila-do ((F(ab')2<h-Fcy>Bi; Dianova, Alemanha, Código Ns 109-066-098) anticor-po de captura (0,1 ml/cavidade) em tampão de diluente (tampão de diluente:tampão de PBS contendo 0,5% em peso por volume (peso/ vol) de albuminasérica bovina) por incubação por uma hora em temperatura ambiente (RT)sob agitação. Depois disso, as lâminas foram lavadas três vezes com maisde 0,3 ml de tampão de lavagem (tampão de lavagem: PBS contendo 1%em peso por volume (peso/ vol) de Tween 20). Conjugado de imunoglobulinaIgG contendo sobrenadantes da cultura celular (amostras) foram diluídasserialmente (duas vezes) até uma concentração de 0,5 a 20 ng/ml em tam-pão de diluente, adicionado a lâminas e incubado por uma hora em tempera-tura ambiente com agitação. Anticorpo padrão anti-IGF-1 R purificado (0,5 a20 ng/ml) em tampão de diluente foi usado Para A Geração de uma curvapadrão de proteína de IgG. Depois de lavar as lâminas três vezes com0,3 ml/cavidade de tampão de lavagem, complexos ligados a Fcgama humanaforam detectados com um fragmento F(ab')2 anti-humano policlonal de cabraconjugado a peroxidase F(ab')2-specific IgG [F(ab')2<h-Fc7>POD; Dianova, Co-de N2 109-036-098]. Depois de lavar as lâminas três vezes com 0,3 ml/cavi-dade de tampão de lavagem, as lâminas foram desenvolvidas com soluçãode substrato de peroxidase ABTSd (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-sulfônico) (Roche Molecular Biochemicals, Code N- 1684302, Roche Diag-nostics GmbH, Alemanha). Depois de 10 a 30 minutos a absorvência foi me-dida a 405 nm e 490 nm contra um reagente em branco (tampão de incuba-ção + solução ABTS®) sobre uma leitora de lâminas Tecan Spectrafluorplus(Tecan Deutschland GmbH, Alemanha). Para correção do fundo a absorvên-cia a 490 nm foi subtraída da absorvência a 405 nm de acordo com a fórmu-la' I. Todas as amostras foram avaliadas no mínimo como duplicatas, e foifeita a média dos valores de medições da absorvência dupla ou tripla. O teorde IgG das amostras foi calculado a partir de uma curva padrão.
Fórmula I: AA = (AZstra ~ AZslJ- tóL - KlJLISTAGEM DE SEQUENCIA
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> MÉTODO PARA A EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE UM POLIPEPTÍDEO
<130> 23215 FT
<150> EP 05023003<151> 2005-10-21
<150> EP 06010665<151> 2006-05-24
<160> 558
<170> Versão de patente 3.2
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ligante sintético compreendendo um sítio de restrição BglII na extre-midade 5' e um sítio de restrição NheI na extremidade 3' (sítio Nheicom terminação-N com CHI)
<400> 1
agatcttttg ccaccgctag c 21
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys1 5 10 15
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Ligante sintético arranjado com o sítio de restrição ÊçlII na "t-armina-ção 5' e o sítio de restrição NheI ná terminação 3' diretainente com-binado à região variável VL-IR. '.f
<400> 3
agatctatat atatatatgc tagc 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> sítio de restrição BglII na terminação 3' do promotor-CMV e sítio derestrição BbsI no interior da região constante da cadeia leve do an-ticorpo <IGF-IR.HuMab.<400> 4
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttc
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ile Leu Val Ala Ala Ala Thr15 10 15
1
<210> 6 - ·<211> 15<212> PRT<213> Artificial
<220>
<223> Iigante 1<400> 6
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly15 10 15
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Iigante 2
<400> 7
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly20 25
<210> 8<211> 15<212> PRT
<213> Artificial. ' , '
f '
<220>
<223> Iigante 3<400> 8
Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln1 5 10 15
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220><223> ligante 4<400> 9
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser15 10 15
Gly
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Iigante 5
<400> 10
Gly Ser Thr1
<210> 11<211> 345<212> PRT
<213> Vírus da imunodeficiência humana
<220>
<221> propriedade de mistura
<223> Seqüência natural de aminoácidos derivados da glicoproteína HIV-Igp41 do clone LAI/IIIB isolado HN-I (locus HIVH3BH8) BH8 (posição bp:507-851).
<400> 11
Ala Val Gly Xle Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly15 10 15
Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln20 25 30
Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile35 , 40 , 45
/
Glu Gly GcIn Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln50 55 60
Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln65 70 75 80
Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala85 90 95
Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp100 105 110Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr115 120 125
Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys130 135 . 140
Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn145 150 155 160
Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met165 170 f 175
Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser180 185 190
Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr195 200 205
His Leu Pro Asn Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu210 215 220
Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Ile Arg Leu Val Asn Gly225 230 235 240
Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser245 250 255
Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg Ile Val Glu260 265 270
Leu Leu Gly Arg Arg Glv Trp Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Leu275 280 285
Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys Asn Ser Ala Val Asn Leu Leu290 295 300
Asn Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu305 , ' 310. 315 3.>0
Leu Val Gln Ala Ala Tyr Arg Ala Ile Arg His Ile Pro Arg Arg Ile325 330 335
Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu340 345
<210> 12
<211> 36
<212> PRT
<213> Vírus da imunodeficiência humana<220>
<221> propriedade de mistura
<223> Seqüência de aminoácios natural derivada do ectodomínio de HIV-I gp41(posição bp: 621-656)
<400> 12
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu1 5 10 15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu20 25 30
Gln Glu Leu Leu35
<210> 13
<211> 123
<212> PRT
<213> Vírus da imunodeficiência humana<220>
<221> propriedade de mistura
<223> Ectodomínio HIV-I gp41 variante I568P (mutante simples), posição pb:534-656
<400> 13
Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn15 10 15
Leu Leu Arg Ala Ile Glu Gly Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val20 25 30
Trp Gly Pro Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr35 40 45
Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu50 55 60
Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser
65 70 75 80 -
/■· ' ·
Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp" Arg Glu85 90 95
Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln100 105 110
Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu115 120
<210> 14<211> 135<212> PRT<213> Vírus da imunodeficiência humana
<220>
<221> propriedade de mistura
<223> Ectodominio HIV-I gp41 variante I568p, L550E, L566E, I580E (mutantequádruplo), posição bp: 522-656
<400> 14
Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg1 5 10 15
Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Glu Lèu Arg Ala20 25 30
Ile Glu Gly Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Thr Val Trp Gly Pro Lys35 40 45
Gln Leu Gln Ala Arg Glu Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln50 55 60
Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr65 70 75 80
Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile85 90 95
Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr100 105 110
Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu115 120 125
Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu130 135
<210> 15
<211> 133
<212> DNA
<213> Vírus da imunodeficiência humana
<220>
<221> propriedade de mistura<223> Inserir 4964
<400> 15
agatctatat atatatatgc tagcgaaattttgtctccag gggaaagagc caccctctccttagcctggt acc
<210> 16<211> 249
gtgttgacac agtctccagc caccctgtct 60tgcagggcca gtcagagtgt tagtagctac 120
133<212> DNA
<213> Vírus da imunodeficiência humana
<220>
<221> propriedade de mistura<223> Inserir 4965
<400> 16
agatcttttg ccaccatgga caccctgtgc agcaccctgc tcctgctgac catccccagc 60
tgggtgctct cccaaatctg gaacaacatg acctggatgg agtgggaccg cgagatcaat 120
aactacacaa gcttgatcca ctctctgatc gaggaaagcc agaaccagca ggagaagaac 180
gagcaggagc tcctgggcgg gggtggatcc ggcggcgggg gcagcggcgg gggaggctcc 240
ggcgctagc 249
<210> 17
<211> 279
<212> DNA
<213> Vírus da imunodeficiência humana
<220>
<221> propriedade de mistura<223> Inserir 4966
<400> 17
agatcttttg ccaccatgga caccctgtgc agcaccctgc tcctgctgac catccccagc 60
tgggtgctct cccaaatctg gaacaacatg acctggatgg agtgggaccg cgagatcaat 120
aactacacaa gcttgatcca ctctctgatc gaggaaagcc agaaccagca ggagaagaac 180
n- -
gagcaggagc tcctgggcgg gggtggctcc ggcggcgggg gcagcggcgg gggaggctcc 240ggcgggggcg gatccggggg cggtggcagc ggcgctagc 279
<210> 18
<211> 252
<212> DNA
<213> Vírus da imunodeficiência humana
<220>
<221> propriedade de mistura<223> ^Inserir 4967.
f^
<400> 18
agatcttttg ccaccatgga caccctgtgc agcaccctgc tcctgctgac catccccagc 60tgggtgctct cccaaatctg gaacaacatg acctggatgg agtgggaccg cgagatcaat 120aactacacaa gcttgatcca ctccctgatc gaggaaagcc agaaccagca ggagaagaac 180gagcaggagc tcctgggatc cagctccagc tccagctcca gctccagcag tagctccagc 240
tctggcgcta gc 252
<210> 19<211> 589<212> DNA
<213> Vírus da imunodeficiência humana
<220>
<221> propriedade de mistura<223> Inserir 4969
<400> 19
agatctagct ctgggagagg agcccagcac tagaagtcgg cggtgtttcc attcggtgat 60cagcactgaa cacagaggac tcaccatgga gtttgggctg agctgggtgt tcctcgtggc 120
actgctcagg ggtgtacagt gtcaggtgca ggcccgccag ctgctctccg gcatcgtcca 180
tf
gcagcaaaac aatctgctgc gggcgatcga ggggcagcag cacctcctgc agctgacggt 240
gtggggtccc aagcagctgc aggcccgcat tctggccgtg gaacggtacc tgaaggacca 300
gcagctgctc ggcatctggg gatgctctgg caagcttatc tgcaccacag ccgtcccctg 360
gaãcgctagc tggagtaaca aaagcctgga gcaaatttgg aacaacatga cctggatgga 420
gtgggatcgc gagatcaata attacacaag cctgatccac tccctgatcg aggaaagcca 480
gaaccagcag gagaagaacg agcaggagct cctgggcggg ggcggatccg gcggcggggg 540
cagcggtggg ggcggctccg gccgaactgt ggctgcacca tctgtcttc 589
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys15 10 15
<210> 21<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 21
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys1 5 10 15
<2 Í0> 22<211> 13<212> PRT<213> Mus<400> 22
Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 23 Met Arg Val Leu Ala 1 5<210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus<400> 24
10 15
Met Arg Val Leu Pro Glu Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15
<210> 25<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 25
Met Arg Cys Ser Leu Gln Phe Leu Gly Val Leu Met Phe Trp Ile Ser1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 26
Arg ^Glu Trp Ser Trp Asn Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Thr1 ** 5 10 15
<210> 27<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 27
Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala15 10 15
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 29<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 30<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 30
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Ser1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Pro Thr Gly1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
S- '
Met Asp Cys Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ϊ'Ά& Ala Thr Gly1 5 10 15
Thr His Ala
<210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr AspAla Tyr Ser
<210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens<400> 34 Met Asp Trp Thr Trp
10 15
Ala His Ser
<210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens<400> 35 Met Asp Trp Ile Trp1 5Ala His Ser
10 15
<210> 36<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 36
Met Asp Thr Leu Cys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Trp1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 37<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 37
Met Asp Thr Leu Cys Tyr Thr Leu Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ser Trp1 5 10 15
Val Leu Ser<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 39
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly15 10 15
Val Gln Cys
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly15 10 15
Val Gln Cys
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<,400> 41
'ê
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Ala Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 43
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly15 10 15
Val Gln Cys
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly15 10 15
Val Gln Cys
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly15 10 15
Val Gln Cys
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly15 10 15
Val Gln Cys<210> 47<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 47
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 48<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 48
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 49<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 49
Met Glu Leu Gly Leu Cys Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 50
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50 'g
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 51
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 52
<211> 20
<212> PRT
<213> seqüência germinativa humana
<400> 52
Met Thr Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Phe Lys1 5 10 15
Gly Val Gln Cys20
<210> 53
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 54<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 54
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Val Ile Leu Gln Gly15 10 15
Val Gln Cys .
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15
Val Gln Cys<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 57
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sápiens
<400> 57
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 58
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp15 10 15
Val Leu Pro
<210> 59 ·
<211> 19 ν
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 60<211> 19<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu1 5
Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp10 15
Val Leu Ser
<210> 61<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 61
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 62<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 62
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp15 10 15
Val Leu Ser
<210> 63<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 63
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly15 10 15Val Cys Ser
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> seqüência germinativa humana
<400> 65
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly1 5 10 15
Val Cys Ala
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Met Ser Val Ser Phe Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp1 5 10 15
Gly Val Leu Ser20
<210> 67<211> 19 .<212> PRT<213> Homo<400> 67
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly15 10 15
Ala His Ser
<210> 68
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys20
<210> 69<211> 22<212> PRT
<213> seqüência germinativa humana<400> 69
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
<210> 70<211> 22<212> PRT<213> Homo<400> 70Met Asp Met
10 15
Leu Ser Gly Ala Arg Cys20
<210> 71<211> 22<212> PRT<213> Homo<400> 71
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Leu Ser Gly Ala Arg Cys20
<210> 72
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Leu Pro Asp Thr Arg Cys20
<210> 73
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu TrpPhe Pro Gly Ala Arg Cys20
<210> 74<211> 22<212> PRT<213> Homo<400> 74
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp15 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys20
<210> 75<211> 22<212> PRT<213> Homo<400> 75
Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys15 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys20
<210> 76
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys20
<210> 77
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp15 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys20<210> 78
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys20
<210> 79
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys20
<210> 80
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp15 10 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys20
<210> 81<211> 22<212> PRT<213> Homo<400> 81Met Asp Met
10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys20
<210> 82
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Arg Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys20
<210> 83<211> 20<212> PRT<213> Homo<400> 83
Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 15
Gly Ala Arg Cys20
<210> 84
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys20
<210> 85<211> 22<212> PRT
<213> seqüência germinativa humana<400> 85
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp15 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys20
<210> 86<211> 22<212> PRT<213> Homo<400> 86
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp15 10 15
Leu Pro Gly Ala Lys Cys20<210> 87
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro1 5 10 15
Gly Ser Ser Glu20
<210> 88<211> 20<212> PRT<213> Homo<400> 88
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro15 10 15
Gly Ser Ser Glu20
<210> 89<211> 20<212> PRT<213> Homo<400> 89
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly20
<210> 90<211> 20<212> PRT<213> Homo<400> 90
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro15 10 15
Gly Ser Ser Gly20
<210> 91
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 91
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Ile Pro1 5 10 15
Gly Ser Ser Ala20
<210> 92
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Ile Pro1 5 10 15
Gly Ser Ser Ala20
<210> 93<211> 20<212> PRT<213> Homo<400> 93
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly20
<210> 94<211> 20<212> PRT<213> Homo<400> 94
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser15 10 15
Gly Ser Ser Gly20
<210> 95<211> 20<212> PRT<213> Homo<400> 95
Met Arg Leu Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro15 10 15
Gly Ser Ser Gly<210> 96
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 15
Asp Thr Thr Gly20
<210> 97
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly20
<210> 98<211> 20<212> PRT<213> Homo<400> 98
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 15
Asp Thr Thr Gly20
<210> 99
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 15
Asp Thr Thr Gly20
<210> 100
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 100
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly20
<210> 101
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr15 10 15
Asp Thr Thr Gly20
<210> 102
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Met Glu Pro Trp Lys Pro Gln His Ser Phe Phe Phe Leu Leu Leu Leu15 10 15
Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly20
<210> 103<211> 20<212> PRT<213> Homo<400> 103
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly20
<210> 104
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Met Gly Ser Gln Val His Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Trp Ile Ser15 10 15Asp Thr Arg Ala20
<210> 105<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 105
Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala15 10 15
Ser Arg Gly
<210> 106
- <211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala15 10 15
Ser Arg Gly
<210> 107<211> 20<212> PRT<213> Homo<400> 107
Met Val Ser Pro Leu Gln Phe Leu Arg Leu Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15
Ala Ser Arg Gly20
<210> 108
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Met Ala Trp Ser Pro Leu Phe Leu Thr Leu Ile Thr His Cys Ala Gly15 10 15
Ser Trp Ala
<210><211><212>
109
19
PRT<213> Homo sapiens<400> 109
Met Ala Trp Ser Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala His Cys Thr Gly1 5 10 15
Ser Trp Ala
<210> 110
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly15 10 15
Ser Trp Ala
<210> 111
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Met Ala Gly Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly1 5 10 15
Ser Trp Ala
<210> 112<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 112Met Thr Cys
10 15
Ser Trp Ala
<210> 113
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly15 10 15Ser Trp Ala
<210> 114
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly1 5 10 15
Ser Trp Ala
<210> 115
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly1 5 10 15
Ser Trp Ala
<210> 116<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 116
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly15 10 15
Ser Trp Ala
<210> 117<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 117
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Asp Thr Gly15 10 15
Ser Trp Ala
<210> 118<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Met Ala Trp Ile Pro Leu Phe Leu Gly Val Leu Ala Tyr Cys Thr Gly1 5 10 15
Ser Val Ala
<210> 119
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
Met Ala Trp Thr Ala Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ala His Phe Thr Gly1 5 10 15
Ser Val Ala
<210> 120
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Met Ala Trp Thr Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu Thr Phe Cys Thr Val15 10 15
Ser Glu Ala
<210> 121<211> 19<212> PRT<213> Homo<400> 121
Met Ala Trp Ile Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu Thr Leu Cys Thr Gly1 5 . 10 15
Ser Glu Ala
<210> 122
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
Met Ala Trp Thr Pro Leu Trp Leu Thr Leu Leu Thr Leu Cys Ile Gly15 10 15
Ser Val Val
<210> 123<211> 19<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 123
Met Ala Tjrp Thr Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser His Cys Thr Gly1 5 10 15
Ser Val Thr
<210> 124
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Met Ala Trp Ala Thr Leu Leu Leu Pro Leu Leu Asn Leu Tyr Thr Gly1 5 10 15
Ser Ile Ala
<210> 125
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Met Ala Trp Ile Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu Thr Leu Cys Thr Gly1 5 10 15
Ser Glu Ala
<210> 126
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
Met Ala Trp Ile Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ile Leu Cys Thr Val1 5 10 15
Ser Val Ala<210> 127
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
Met Ala Trp Val Ser Phe Tyr Leu Leu Pro Phe Ile Phe Ser Thr Gly1 5 10 15
Leu Cys Ala
<210> 128
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Met Ala Trp Thr Gln Leu Leu Leu Leu Phe Pro Leu Leu Leu His Trp1 5 10 15
Thr Gly Ser Leu Ser20
<210> 129<211> 20<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 129
Met Ala Trp Thr Pro Leu Leu Phe1 5
Leu Thr Leu Leu Leu His Cys Thr10 15
Gly Ser Leu Ser20
<210> 130
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Met Ala Trp Thr Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser His Cys Thr Gly1 5 10 15
Ser Leu Ser
<210> 131
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 131
Met Ala Trp Thr Pro Leu Leu Leu Leu Phe Leu Ser His Cys Thr Gly1 5 10 15
Ser Leu Ser
<210> 132
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Met Ala Trp Thr Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Ser His Cys Thr Gly1 5 10 15
Ser Leu Ser
<210> 133
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<40Ú> 133
Met Ala Trp Ala Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala His Cys Thr Gly15 10 15
Ser Trp Ala
<210> 134
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Leu Phe Leu Leu Thr Cys Cys Pro Gly15 10 15
Ser Asn Ser
<210> 135
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 135
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Leu Phe Leu Leu Thr Cys Cys Pro Gly1 5 10 15
Ser Asn Ser<210> 136
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 136
Met Ala Trp Met Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ala Tyr Gly Ser Gly1 5 10 15
Val Asp Ser
13719PRT
Homo sapiens<400> 137
Met Ala Trp Ala Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ser Leu Leu Thr Gly15 10 15
<210><211><212><213>
Ser Leu Ser
<210> 138
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138
Met Pro Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Ser Ala Val1 5 10 15
Ser Val Val
<210> 139<211> 18<212> PRT<213> Artificial<220> <223> Iigante 6<400> 139
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly15 10 15
Ala Ser
<210> 140<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Iigante 7
<400> 140
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser1 5 10 15
Gly Ala Ser
<210> 141
<211> 14
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 141
Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys15 10
<210> 142<211> 10<212> PRT<213> Mus musculus<400> 142
Glu Leu Trp Val Leu Met Val Trp Val Pro1 5 10
<210> 143
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 143
Glu Leu Trp Val Leu Met Val Trp Val Pro Ser Thr Ser1 5 10
<210> 144<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 144
His Asp His Ala Leu Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Ser Ser Pro Leu15 10 15
Cys Leu
<210> 145<211> 16<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 145
Leu Ala Val Ile Thr Ser Asn Ile Trp Phe Pro Met Val Cys Met Ser1 5 10 15
<210> 146
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 146
Met Asp Met Trp Thr Ser Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Leu Ala Arg Cys20
<210> 147<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 147
Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Val1 5 10 15
Leu Ser
<210> 148
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 148
Met Leu Arg Ala Ile Lys Ala Ala Pro Phe Ser Arg Phe Gly Cys Ser1 5 10 15
<210> 149
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 149
Met Arg Ala Pro Ala Pro Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Cys Phe Leu1 5 10 15
Ala Arg Cys
<210> 150<211> 16<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 150
Met Arg Cys Ser Pro His Phe Leu Glu Leu Leu Val Phe Trp Ile Leu1 5 10 15
<210> 151
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 151
Met Arg Pro Thr Leu Ser Phe Leu Gly Ser Cys Cys Ser Ser Leu Ile1 5 10 15
Leu Arg Cys
<210> 152<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 152
Met Arg Thr Pro Ala His Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Leu1 5 10 15
Gly Arg Cys
<210> 153<211> 19<212> PRT<213> MUS<400> 153
Met Arg Thr Pro Ala Pro Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Cys Phe Ser1 5 10 15
Ala Arg Cys
<210> 154
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 154
Met Ser Leu Leu Thr Gln Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr15 10 15
Asp Arg Cys<210> 155<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 155
Met Ser Leu Pro Thr Gln Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10 15
Ala Arg Cys
<210> 156<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 156
Met Thr Met Leu Ser Leu Ala Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Cys1 5 10 15
Val Ser
<210> 157<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 157
Met Thr Ser Leu Ser Gln Leu Leu Gly Met Leu Met Leu Gln Ser Leu1 5 10 15
<210> 158
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 158
Met Val Phe Ala Pro Gln Ile Leu Gly Phe Leu Leu Leu Trp Ile Ser15 10 15
<210> 159<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 159
Met Val Phe Thr Pro His Ile Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Ile Ser15 10 15
<210> 160<211> 19<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 160
Gln His Gly His Glu Gly Leu Cys Ser Val Ser Trp Val Pro Val Ala1 5 10 15
Thr Asn Ser
<210> 161<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 161
Arg Glu Trp Ser Trp Asn Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Thr Val1 5 10 15
Ser Ser
<210> 162<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 162
Thr Asp Phe His Met Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Phe Thr1 5 10 15
Ala Arg Cys
<210> 163<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 163
Met Glu Phe Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Leu Cys Met Ser1 5 10 15
<210> 164<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 164
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15
<210> 165<211> 16<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 165
Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro15 10 15
<210> 166
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 166
Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro15 10 15
<210> 167
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 167
Met Ser Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Txrp Leu Thr1 5 10 15
<210> 168
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 168
Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Ile Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser15 10 15
<210> 169
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 169
Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser15 10 15
<210> 170
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 170
Met Ala Trp Ile Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser15 10 15
<210> 171<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 171Met Ala Trp Thr Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 172 16 PRT Mus musculus<400> 172
10 15
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15
<210> 173<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 173Met Gly Trp Asn Trp 1 5<210> 174<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus
<400> 174
Met Arg Phe Gln Val Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15
<210> 175
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 175
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His1 5 10 15
<210> 176<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 176
Met Asp Ile Arg Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro<210> 177<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 177
Met Asp Met Met Val Leu Ala Gln Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro
<210> 178
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 178
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp15 10 15
Phe Pro
<210> 179<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 179
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro
<210> 180
<211>. 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 180
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Val Phe Gly Phe Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro
<210> 181
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 181
Met Asp Met Arg Ala Ser Ala Gln Phe His Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro
<210> 182
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 182
Met Asp Met Arg Ala Ser Ala Gln Phe His Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro
<210> 183
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 183
Met Asp Met Trp Thr Ser Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu. Leu Leu Trp15 10 15
Phe Leu
<210> 184<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 184
Met Asn Thr Arg Ala Pro Ala Glu Phe Leu Gly Phe Leu Leu Leu Trp15 10 15
Phe Leu
<210> 185<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 185
Met Arg Ala Pro Ala Pro Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Cys Phe Leu1 5 10 15<210> 186
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 186
Met Arg Thr Pro Ala Pro Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Cys Phe Ser1 5 10 15
<210> 187
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 187
Met Ser Ile Ser Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10 15
<210> 188
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 188
Met Ser Leu Pro Thr Gln Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10 15
<210> 189<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 189
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr15 10 15
<210> 190
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400>. 190
Met Ser Val Pro Thr Gln Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr15 10 15
<210> 191
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 191
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10 15
<210> 192<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 192
Thr Asp Phe His Met Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Phe Thr1 5 10 15
<210> 193
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 193
Met Ala Trp Thr Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Cys Ser15 10 15
<210> 194
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 194
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Arg Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15
<210> 195
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 195
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ser1 5 10 15
Ser Ser
<210> 196
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 196
Met Asp Ile Arg Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp15 10 15
Phe Pro Ala Arg Cys20
<210> 197
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 197
Met Asp Met Met Val Leu Ala Gln Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro Ala Arg Cys20
<210> 198<211> 21<212> PRT<213> Mus musculus<400> 198
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro Ile Arg Cys20
<210> 199
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 199
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro Ala Arg Cys20
<210> 200
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 200
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Ile Phe Gly Phe Leu Leu Leu Leu15 10 15
Phe Gln Thr Arg Cys20
<210> 201
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 201
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Val Phe Gly Phe Leu Leu Leu Trp15 10 15
Phe Pro Ala Arg Cys<210> 202<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 202
Met Asp Met Arg Ala Ser Ala Gln Phe Leu Gly Phe Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro
<210> 203
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 203
Met Asp Met Arg Asp Pro Pro Gln Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Ile Pro
<210> 204
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 204
Met Asp Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro Ile Lys Cys20
<210> 205
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 205
Met Asp Met Arg Val Pro Ala His Val Phe Gly Phe Leu Leu Leu Trp15 10 15
Phe Pro Thr Arg Cys20
<210> 206
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 206
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15
Thr Cys Gly
20719PRT
Mus musculus<400> 207
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser15 10 15
Thr Cys Gly
<210><211><212><213>
<210> 208
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 208
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser15 10 15
Thr Cys Gly
<210> 209
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 209
Met Asp Ser Gln Ala Arg Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser15 10 15
Thr Cys Gly
<210> 210
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 210
Met Glu Phe Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Val Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15Val Asp Gly
<210> 211
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 211
Met Glu Phe Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Leu Cys Met Ser1 5 10 15
Ala Cys Ala
<210> 212
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 212
Met Glu Lys Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15
Ser Thr Gly
<210> 213
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 213
Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15
Ser Thr Gly
<210> 214
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 214
Met Glu Ser Gln Ile Gln Ala Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser15 10 15
Val Asp Gly
<210> 215<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 215
Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser15 10 15
Val Asp Gly
<210> 216
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 216
Met Ser Leu Leu Thr Gln Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr15 10 15
<210> 217
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 217
Leu Ile Leu Lys Val Gln Cys1 5
<210> 218
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 218
Leu Val Leu.Lys Val Leu Cys1 5
<210> 219
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 219
Met Asp Met Arg Ala Ser Ala Gln Phe His Gly Ile Leu Leu Leu Trp15 10 15
Phe Pro Ala Arg Cys20
<210> 220
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 220Met Lys Leu Pro Val Leu Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Thr Ser Pro1 5 10 15
Ser Ser Ser
<210> 221<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 221
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ser1 5 10 15
Ser Ser
<210> 222
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 222
Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Gln1 5 10 15
Thr Asn Gly
<210> 223
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 223
Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg1 5 10 15
Thr Asn Gly
<210> 224
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 224
Met Met Ser Pro Val His Ser Ile Phe Ile Leu Leu Leu Trp Ile Val1 5 10 15
Ile Ser Gly<210> 225
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 225
Met Met Ser Pro Val Gln Phe Leu Phe Leu Leu Met Leu Trp Ile Gln15 10 15
Thr Asn Gly
<210> 226
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 226
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Val15 10 15
Gln Cys
<210> 227<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 227
Met Asn Leu Pro Val His Leu Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp Ile Pro1 5 10 15
Ser Arg Gly
<210> 228
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 228
Met Asn Thr Arg Ala Pro Ala Glu Phe Leu Gly Phe Leu Leu Leu Trp15 10 15
Phe Leu Ala Arg Cys20
<210> 229
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 229Met Arg Phe Gln Val Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15
Ala Gln Cys
<210> 230<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 230
Met Arg Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile1 5 10 15
Leu Ser
<210> 231
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 231
Met Asp Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15
Ile Leu Ser Ser Gly20
<210> 232
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 232
Met Asp Phe Gln Met Gln Ile Ile Ser Leu Leu Leu Ile Ser Val Thr15 10 15
Ile Val Ser Asn Gly 20<210> 233<211> 21<212> PRT<213> Mus musculus<400> 233
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15
Ile Leu Thr Asn Gly20118
<210> 234
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 234
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro Ala Arg Cys20
<210> 235
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 235
Met Asn Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15
Ile Gly Ser Ser Gly20
<210> 236<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 236
Met Thr Met Leu Ser Leu Val Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Cys1 5 10 15
Ser Arg Ala
<210> 237
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 237
Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro1 5 10 15
Ala Cys Gly
<210> 238
<211> 20
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 238
Thr Glu Leu Ile Cys Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Ile1 5 10 15
Leu Ser Ser Gly20
<210> 239<211> 17<212> PRT<213> Mus<400> 239
Met Asp Cys Gly Ile Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Val1 5 10 15
Cys
<210> 240
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 240
Met Asp Met Trp Val Gln Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ile Cys Val Thr1 5 10 15
Ser Lys Gly
<210> 241
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 241
Leu Leu Ile Ser Val Thr Ile Met Ser Arg Gly15 10
<210> 242
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 242
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser15 10 15
Ile Met Ser Arg Gly20
<210> 243<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 243
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ile Ser1 5 10 15
Val Met Ser Arg Gly20
<210> 244
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 244
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Ser1 5 10 15
Ile Met Ser Arg Gly20
<210> 245<211> 21<212> PRT<213> Mus musculus<400> 245
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ile Val Thr1 5 10 15
Ile Met Ser Arg Gly20
<210> 246
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 246
Met Gly Glu Gln Arg Ile Arg Ser Cys His Ala Thr Ser Gly Ala Glu15 10 15
Ser Ala Arg
<210> 247
<211> 20
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 247
Met Gly Ser Gln Val His Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Trp Ile Ser1
5
10
15
Asp Thr Arg Ala20
<210> 248<211> 21<212> PRT<213> Mus<400> 248
Met Thr Met Phe Ser Leu Ala Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Cys1 5 10 15
Val Ser Ser Arg Ala20
24918PRT
Mus musculus<400> 249
Met Thr Met Leu Ser Leu Ala Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ser1 5 10 15
Arg Ala
<210><211><212><213>
<210> 250
<211> 22
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> propriedade de mistura
<222> (2).. (2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente
<400> 250
Met Xaa Thr Met Asp Glu His Glu Ser Gly Ala Val Thr Pro His Gln
1 5 10 15
Val Leu Lys Ser Arg 20<210> 251<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 251
Ile Lys Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Val15 10 15Kis Ser
<210> 252<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 252
Ile Lys Trp Ser Trp Ile Ser Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
His Ser
<210> 253
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 253
Leu Ile Leu Lys Val Gln Cys1 5
<210> 254
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 254
Leu Val Leu Lys Val Gln Cys1 5
<210> 255
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 255
Met Ala Val Val Thr Gly Lys Gly Leu Pro Ser Pro Lys Leu Glu Val1 5 10 15
Asn Ser
<210> 256
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 256
Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Val Gln1 5 10 15
Cys
<210> 257
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 257
Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Val
1 5 10 15
Gln Cys
<210> 258
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 258
Met Asp Met Arg Ala Ser Ala Gln Phe His Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro Ala Arg Cys20
<210> 259
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 259
Met Glu Trp Glu Leu Ser Leu Ile Phe Ile Phe Ala Leu Leu Lys Asp1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 260<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 260
Met Glu Trp Ser Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Val1 5 10 15
His Ser<210> 261<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 261
Met Glu Trp Ser Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Ile1 5 10 15
His Ser
<210> 262
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 262
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
Leu Ser
<210> 263<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 263
Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Ala1 5 10 15
Leu Ser
<210> 264
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 264
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 265
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 265Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 266<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 266
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Val15 10 15
His Ser
26718PRT
Mus musculus<400> 267
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Phe Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
Leu Ser
<210><211><212><213>
<210> 268
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 268
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
Leu Ser
<210> 269
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 269
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ser Ala Val15 10 15
Leu Ser<210> 270<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 270
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ser Ala Val1 5 10 15
His Ser
<210> 271
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 271
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Val15 10 15
His Ser
<210> 272
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 272
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr15 10 15
<210> 273<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 273
Ile Asp Ile Asn Val Gln Ile Phe Arg Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr15 10 15
Ser Ser Gly
<210> 274
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 274
Met Asn Met Leu Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Phe Ala15 10 15<210> 275<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 275
Met Arg Thr Pro Ala His Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Leu1 5 10 15
<210> 276<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 276
Met Arg Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Val15 10 15
His Ser
<210> 277
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 277
Met Asn Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr15 10 15
<210> 278
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 278
Met Glu Trp Ser Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu,Ser Val Thr Ala1 5 10-15
<210> 279<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 279
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Gln Ile Pro Val Lys Gln Cys Leu15 10 15
<210> 280
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400>
280Met Asp Phe Gln Val 1 5<210> 281<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 281
10 15
Met Lys Phe Pro Ser Gln Leu Leu Leu Phe Leu Leu Phe Arg Ile Thr1 5 10 15
<210> 282<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 282
Met Asp Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro
<210> 283<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 283Met Ala Val Leu Ala 1 5<210> 284<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 284
10 15
Met Asp Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15
<210> 285<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 285
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15
<210><211><212>
286
15
PRT<213> Mus musculus
<400> 286
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Xle Ser Arg1 5 10 15
<210> 287
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 287
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr15 10 15
<210> 288<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 288
Thr Glu Leu Ile Cys Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala15 10 15
<210> 289
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 289
Leu Leu Ile Ser Val Thr1 5
<210> 290
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 290
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser15 10 15
<210> 291<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 291
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Ser15 10 15
<210> 292
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 292
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Ser1 5 10 15
<210> 293
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 293
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Met Ser Ala Ser15 10 15
<210> 294
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 294
Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ile Val Thr15 10 15
<210> 295
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 295
Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser15 10 15
<210> 296
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 296
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Ile15 10 15
<210> 297
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 297
Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Leu Leu Val Ala Leu Leu Asn1 5 10 15
<210> 298
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 298
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Phe Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro
<210> 299<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 299
Met Ile Tyr Ser Leu Gln Leu Leu Arg Met Leu Val Leu Trp Ile Pro15 10 15
<210> 300<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 300
Met Met Ser Pro Val His Ser Ile Phe Ile Leu Leu Leu Trp Ile Val15 10 15
<210> 301<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 301
Met Ser Tyr Ser Leu Gln Leu Leu Arg Met Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15
<210> 302<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 302
Met Ser Tyr Ser Leu Gln Leu Leu Arg Met Leu Val Leu Trp Ile Pro15 10 15
<210> 303
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 303
Met Asp Phe Gln Met Gln Ile Ile Ser Leu Leu Leu Ile Ser Val Thr15 10 15
<210> 304<211> 21<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 304
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Gln Ile Pro Val Lys Gln Cys Leu1 5 10 15
Ile Ile Ser Arg Gly20
<210> 305
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 305
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser15 10 15
<210> 306
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 306
Met Arg Pro Thr Leu Ser Phe Leu Gly Ser Cys Cys Ser Ser Leu Ile15 10 15
<210> 307<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 307
Met Lys Phe Pro Ser Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Gly Ile Pro15 10 15
<210> 308
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 308
Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15
Ser Thr Ser
<210> 309
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400>
309Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr1 5 10 15
Ala Asp Gly
<210> 310
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 310
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15
Thr Cys Gly
<210> 311<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 311
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15
Ser Thr Gly
<210> 312
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 312
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 313
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 313
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15
Val His Ser<210> 314
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 314
Met Ala Trp Ile Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ala1 5 10 15
Ile Ser
<210> 315<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 315Ile Gly Trp Ser Tyr 1 5
10 15
His Ser
<210> 316
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 316
Met Ala Trp Thr Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Cys Ser Ala1 5 10 15
Ser Ser
<210> 317
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 317
Met Ala Trp Thr Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Cys Ser Ala1 5 10 15
Ile Ser
<210> 318
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 318
Met Gly Trp Ser Cys Val Leu Leu Phe Leu Val Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
Leu Cys
<210> 319
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 319
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15
Ile Ile Ser Arg Gly20
<210> 320
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 320
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15
Ile Leu Phe Arg Gly20
<210> 321
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 321
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15
Ile Leu Ser Arg Gly20
<210> 322
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 322
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15
Ile Met Ser Arg Gly20
<210> 323
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 323
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser15 10 15
Leu Met Ser Arg Gly20
<210> 324
<211> 20
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 324
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Arg Ile15 10 15
Leu Ser Arg Gly20
<210> 325
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 325
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Ser1 5 10 15
Ile Met Ser Arg Gly20
<210> 326
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 326
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Met Ser Ala Ser15 10 15
Ile Met Ser Arg Gly20
<210> 327
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 327
Met Asp Thr Leu Cys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Trp1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 328<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 328
Met Gly Txrp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
His Cys
<210> 329
<211> 21
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 329
Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser15 10 15
Ile Met Ser Arg Gly20
<210> 330 ..<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 330
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser Ser1 5 10 15
Phe Ser
<210> 331
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 331
Met Arg Val Leu Gly Phe Leu Cys Leu Val Thr Val Leu Pro Gly Ser1 5 10 15Leu Ser
<210> 332
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 332
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Leu Leu His Cys Ser Ser1 5 10 15
Phe Ser
<210> 333
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 333
Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Val His Cys1 5 10
<210> 334
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 334
Lys Gly Gly Ser Cys Val Ser Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Asn Val1 5 10 15
His Phe
<210> 335
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 335
Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Ile1 5 10 15
Leu Ser
<210> 336
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 336Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Val15 10 15
Leu Ser
<210> 337<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 337
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Val15 10 15
Leu Ser
<210> 338<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 338
Met Ala Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Val15 10 15
His Ser
<210> 339<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 339
Met Asp Trp Ile Trp Ile Met Leu His Leu Leu Ala Ala Thr Gly Ile15 10 15
Gln Ser
<210> 340<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 340
Met Glu Cys Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Leu Thr Ala Val1 5 10 15
His Cys<210> 341<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 341
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly15 10 15
Val Gln Cys
<210> 342
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> propriedade de mistura
<222> (5).. (6)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente
<400> 342
Met Glu Trp Leu Xaa Xaa Phe Leu Leu Phe Leu Ser Leu Thr Ala Val1 5 10 15
His Cys
<210> 343
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 343
Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Val15 10 15
His Ser
<210> 344
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 344
Met Glu Thr Pro Ala Ser Phe Leu Cys Leu Leu Leu Leu Trp Thr Thr15 10 15
<210><211><212>
345
15
PRT<213> Mus musculus<400> 345
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Leu Leu His Cys Ser1 5 10 15
<210> 346<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 346
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser15 10 15
<210> 347
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 347
Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Ile Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser1 5 10 15
Ala His Gly
<210> 348
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 348
Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser15 10 15
Ala His Gly
<210> 349
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 349
Met Asp Met Trp Val Gln Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ile Cys Val Thr15 10 15
<210> 350
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus<220>
<221> propriedade de mistura
<222> (2).. (2)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente
<400> 350
Met Xaa Thr Met Asp Glu His Glu Ser Gly Ala Val Thr Pro His Gln1 5 10 15
Val Leu Lys
<210> 351<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 351
Met Gly Glu Gln Arg Ile Arg Ser Cys His Ala Thr Ser Gly Ala Glu15 10 15
<210> 352<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 352Met Asn Leu Pro Val 1 5<210> 353<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 353
10 15
Met Thr Met Phe Ser Leu Ala Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Cys15 10 15
Val Ser
<210> 354<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 354
Met Thr Met Leu Ser Leu Ala Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu15 10 15
<210><211><212>
35516PRT<213> Mus musculus<400> 355
Met Thr Met Leu Ser Leu Val Leu1 5
Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Cys10 15
<210> 356<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 356
Met Val Phe Thr Pro Gln Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser15 10 15
<210> 357<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 357
Met Val Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln15 10 15
358!6PRT
Mus musculus<400> 358
Met Val Ser Thr Ser Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Thr Ser1 5 10 15
<210><211><212><213>
<210> 359<211> 13<212> PRT<213> Mus musculus<400> 359
Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Gln15 10
<210> 360<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 360
Ile Asp Ile Asn Val Gln Ile Phe Arg Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr15 10 15
<210> 361
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 361
Met Lys Leu Pro Val Leu Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Thr Ser Pro15 10 15
<210> 362
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 362
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro1 5 10 15
<210> 363<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 363
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro15 10 15
<210> 364<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 364
Met Glu Lys Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15
<210> 365<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 365
Met Glu Ser Asp Thx Leu Leu Leu Tirp Va 1 Leu Leu Leu Trp Va 1 Pr*o15 10 15
<210> 366
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 366
Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15
<210> 367
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 367
Met Glu Thr Asp Pro Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15
<210> 368<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 368
Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15
<210> 369<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 369
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15
<210> 370<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 370
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15
<210> 371<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 371
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15
<210> 372<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 372
Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro15 10 15
<210> 373
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400>
373Met Val Phe Thr Pro Gln Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser15 10 15
<210> 374<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 374
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15
<210> 375
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 375
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser1 5 10 15
<210> 376
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 376
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15
<210> 377<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 377
Met Asp Ser Gln Ala Arg Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15
<210> 378
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 378
Met Glu Ser Gln Asn His Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser15 10 15
<210> 379
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 379Met Glu Ser Gln Thr His Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Vai. Ser1 5 10 15
<210> 380
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 380
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser15 10 15
<210> 381
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 381
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser1 5 10 15
<210> 382
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 382
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser1 5 10 15
<210> 383<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 383
Met Glu Thr Pro Ala Ser Phe Leu Cys Leu Leu Leu Leu Trp Thr Thr1 5 10 15
Ser Ala Val
<210> 384
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 384
Gln His Gly His Glu Gly Leu Cys Ser Val Ser Trp Val Pro Val Ala15 10 15
38516PRT
<210><211><212><213> Mus musculus<400> 385
Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Gln15 10 15
<210> 386
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 386
Met Met Ser Pro Ala 1 5<210> 387<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 387
10 15
Met Met Ser Pro Val Gln Phe Leu Phe Leu Leu Met Leu Trp Ile Gln1 5 10 15
<210> 388
<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 388Met Ile Ala Ser Ala 1 5<210> 389<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 389
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln15 10 15
<210> 390
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 390
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln15 10 15
<210> 391
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 391
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Ile Phe Gly Phe Leu Leu Leu Leu1 5 10 15
Phe Gln
<210> 392<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 392
Met Asp Met Arg Val Pro Ala His Val Phe Gly Phe Leu Leu Leu Trp1 5 10 15
Phe Pro
<210> 393<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 393
Met Asp Cys Gly Ile Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys15 10 15
<210> 394
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 394
Met Glu Phe Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Val Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15
<210> 395<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 395
Met Glu Ser Gln Ile Gln Ala Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser15 10 15
<210> 396
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 396
Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser<210> 397<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 397
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15
<210> 398
<211> 20
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 398
Met Gly Phe Lys Met Glu Ser His Thr Gln Ala Phe Val Phe Ala Phe1 5 10 15
Leu Trp Leu Ser20
<210> 399<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 399
Met Glu Thr His Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15
<210> 400
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> propriedade de mistura
<222> (5)..(6)
<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente
<400> 400
Met Glu Trp Leu Xaa Xaa Phe Leu Leu Phe Leu Ser Leu Thr Ala
1 5 10 15
<210> 401
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 401
Met Glu Trp Ser Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala1 5 10 15<210> 402<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 402
Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala1 5 10 15
<210> 403
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 403
Met Glu Trp Ser Arg Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala15 10 15
<210> 404
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 404
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr1 5 10 15
<210> 405
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 405
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Leu Thr Ser1 5 10 15
<210> 406<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 406
Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr1 5 10 15
<210> 407
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 407
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr1 5 10 15<210> 408<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 408
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Asn1 5 10 15
<210> 409
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 409
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr1 5 10 15
<210> 410
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 410
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr15 10 15
<210> 411<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 411
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Tbr. Ala Thr15 10 15
<210> 412<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 412Met Gly Trp Ser Cys
10 15
<210> 413<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 413
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr1 5 10 15<210> 414
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 414
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ile Leu Val Ala Ala Ala Thr1 5 10 15
<210> 415<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 415
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ile Leu Val Ala Ala Ala Thr1 5 10 15
<210> 416<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 416
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Arg Ala Thr1 5 10 15
<210> 417<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 417
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 418
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 418
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 419
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 419
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr1 5 10 15<210> 420
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 420
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 421
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 421
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 422
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 422
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 423
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 423
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr1 10 15
<210> 424
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 424
Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala15 10 15
<210> 425
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 425
Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr
15 ίο 15
<210> 426<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 426
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ser Ala1 5 10 15
<210> 427<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 427
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala1 5 10 15
<210> 428
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 428
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala15 10 15
<210> 429
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 429
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Phe Leu Ser Gly Thr Ala15 10 15
<210> 430
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 430
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Pro Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala15 10 15
<210> 431<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 431
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Pro Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala15 10 15
<210> 432<211> 15<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 432
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 433
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 433Met Gly Trp Ser Tyr 1 5<210> 434<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 434
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 435
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 435
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 436<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 436
Met Leu Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln15 10 15
<210> 437<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 437
Met Arg Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr15 10 15
<210> 438<211> 15<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 438
Met Arg Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 439
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 439
Met Val Ser Glu Thr His Val Leu Ile Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser15 10 15
<210> 440
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 440
Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala15 10
<210> 441
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 441
Ile Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 442
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 442
Ile Lys Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala15 10 15
<210> 443
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 443
Ile Lys Trp Ser Trp Ile Ser Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala15 10 15
<210><211><212>
444
15
PRT<213> Mus musculus<400> 444
Lys Gly Gly Ser Cys Val Ser Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Asn1 5 10 15
<210> 445
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 445
Met Ala Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr1 5 10 15
<210> 446
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 446
Met Glu Cys Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Leu Thr Ala1 5 10 15
<210> 447
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 447
Met Ile Tyr Ser Leu Gln Leu Leu Arg Met Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15
Ile Ser Lys
<210> 448<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 448
Met Ser Tyr Ser Leu Gln Leu Leu Arg Met Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15
Ile Ser Lys
<210> 449
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 449Met Ser Tyr Ser Leu Gln Leu Leu Arg Met Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15
Ile Thr Lys
<210> 450
<211> 4
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 450
Leu Val Leu Lys1
<210> 451<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 451
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser15 10 15
<210> 452
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 452
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser15 10 15
<210> Λ.53
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 453
Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser1 5
Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala10 15
<210> 454<211> 15<212> PRT<213> Mus<400> 454
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala15 10 15
<210> 455
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 455
Met Gly Arg Leu Thr Phe Ser Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Pro Ala1 5 10 15
<210> 456
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 456
Met Gly Trp Ser Cys Val Leu Leu Phe Leu Val Ser Gly Thr Ala15 10 15
<210> 457<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 457
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Phe Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala
10 15
1 5<210> <211> <212> <213> 458 15 PRT Mus musculus<400> 458Met Gly Trp Ser Trp 1 5 <210> <211> <212> <213> 459 15 PRT Mus musculus<400> 459Met Gly Trp Ser Trp 1 5 <210> <211> <212> <213> 460 15 PRT Mus musculus<400> 460
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala15 10 15
<210> 461
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 461
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala1 5 10 15
<210> 462
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 462
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Phe Leu Ser Gly Thr Ala15 10 15
<210> 463
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 463
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Phe Leu Ser Gly Thr Ala1 5 10 15
<210> 464
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 464
Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Ser Phe Leu Ser Gly Thr Ala1 5 10 15
<210> 465
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 465
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ile1 5 10 15
<210> 466
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 466
Met Ala Val Val Thr Gly Lys Gly Leu Pro Ser Pro Lys Leu Glu1 5 10 15
<210> 467
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 467Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr1 5 10 15
<210> 468<211> 11<212> PRT<213> Mus musculus<400> 468
Met Gln Leu Gly His Leu Leu Pro Asp Gly Ser1 5 10
<210> 469<211> 16<212> PRT<213> Mus<400> 469
Arg Ser Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10 15
<210> 470
<211> 4
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 470
Leu Ile Leu Lys1
<210> 471
<211> 4-
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 471
Leu Val Leu Lys1
<210> 472
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptídeo de junção
<400> 472
Gln Ile Trp Asn Asn1 5
<210> 473
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 473
Met Glu Ser Gln Asn His Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15
Thr Cys Gly
<210> 474
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 474
Met Glu Ser Gln Thr His Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser15 10 15
Thr Cys Gly
<210> 475
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 475
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15
Val Asp Gly
<210> 476
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 476
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser15 10 15
Thr Cys Gly
<210> 477
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 477
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15Ala Cys Ala
<210> 478
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 478
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser1 5 10 15
Thr Cys Gly
<210> 479<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 479
Met Glu Thr Asp Pro Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15
Ser Thr Gly
<210> 480<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 480
Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15
Ser Thr Gly
<210> 481<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 481
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15
Ser Thr Gly
<210> 482<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 482
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15
Ser Thr Gly
<210> 483
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 483
Met Glu Thr His Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser1 5 10 15
Val Glu Gly
<210> 484
<211> 23
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 484
Met Gly Phe Lys Met Glu Ser His Thr Gln Ala Phe Val Phe Ala Phe1 5 10 15
Leu Trp Leu Ser Val Asp Gly20
<210> 485
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400>. 485
Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Val Arg Cys15 10 15
<210> 486
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 486
Met Ile Ala Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln1 5 10 15
Thr Arg Cys<210> 487<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 487
Met Lys Phe Pro Ser Gln Leu Leu Leu Phe Leu Leu Phe Arg Ile Thr1 5 10 15
Ile Ile Cys
<210> 488<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 488
Met Lys Phe Pro Ser Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Gly Ile Pro1 5 10 15
Met Ile Cys
<210> 489
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 489
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln1 5 10 15
Thr Arg Cys
<210> 490<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 490
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln1 5 10 15
Thr Arg Tyr
<210> 491
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 491
Met Asn Met Leu Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Phe Ala1 5 10 15
Gly Lys Cys
<210> 492<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 492
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15
Ala Ile Gly
<210> 493
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 493
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Arg Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15
Ala Thr Gly
<210> 494<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 494
Met Arg Cys Ser Leu Gln Phe Leu Gly Val Leu Met Phe Trp Ile Ser1 5 10 15
Val Ser Gly
<210> 495
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 495
Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15Ser Thr Ala
<210> 496<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 496
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His1 5 10 15
Ala Gln Cys
<210> 497<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 497
Met Arg Val Leu Ala Glu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Phe Cys Phe Leu1 5 10 15
Val Arg Cys
<210> 498<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 498
Met Arg Val Leu Pro Glu Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15
Val Arg Cys
<210> 499<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 499
Met Ser Ile Ser Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr15 10 15
Ala Arg Cys
<210> 500<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 500
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10 15
Ala Arg Cys
<210> 501<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 501
Met Ser Val Pro Thr Gln Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10 15
Ala Arg Cys
<210> 502<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 502
Met Ser Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10 15
Ala Gly Cys
<210> 503<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400>. 503
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr15 10 15
Ala Arg Cys
<210> 504<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 504
Met Val Phe Thr Pro Gln Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser10 15
Ser Thr Gly
<210> 505
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 505
Met Val Phe Thr Pro Gln Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser1 5 10 15
Ser Arg Gly
<210> 506
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 506
Met Val Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln Ser1 5 10 15
Arg Gly
<210> 507
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 507
Met Val Ser Thr Ser Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Thr Ser1 5 10 15
Ser Arg Gly
<210> 508<211> 16<212> PRT<213> Mus musculus<400> 508
Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Gln Ser Arg Cys1 5 10 15
<210> 509
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 509
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
Leu Ser
<210> 510<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 510
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
Leu Ser
<210> 511<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 511
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Phe Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
Leu Ser
<210> 512<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 512
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Phe Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
His Ser
<210> 513<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 513
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Phe Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15Leu Ser
<210> 514<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 514Met Gly Trp Ser Trp 1 5
10 15
Leu Ser
<210> 515<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 515
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Ile Ile1 5 10 15
Asn Ser
<210> 516<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 516
Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Leu Leu Val Ala Leu Leu Asn Ile1 5 10 15
Gln Cys
<210> 517
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 517
Met Leu Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln Val1 5 10 15
His Cys
<210> 518<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 518
Met Leu Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln Gly1 5 10 15
Val His Cys
<210> 519<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 519
Met Met Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Leu Pro Gly Ile1 5 10 15
Leu Ser
<210> 520<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 520
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Val15 10 15
Cln Cys
<210> 521
<211> 14
<212> PRT
<213>. Mus musculus
<400> 521
Met Gln Leu Gly His Leu Leu Pro Asp Gly Ser Val Asn Ser15 10
<210> 522
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 522
Met Val Ser Glu Thr His Val Leu Ile Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15Val His Cys
<210> 523<211> 19<212> PRT<213> Mus<400> 523
Arg Ser Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10 15
Val Asn Ser
<210> 524<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 524
Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Val1 5 10 15
Tyr Ser
<210> 525<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 525
Met Glu Trp Ser Arg Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Val1 5 10 15
His Ser
<210> 526<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 526
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 527<211> 18<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 527
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Leu Thr Ser Val1 5 10 15
His Ser
<210> 528
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 528
Met Gly Arg Leu Thr Phe Ser Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Pro Ala15 10 15
Val Leu Ser
<210> 529
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 529
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Val1 .5 10 15
His Phe
<210> 530
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> . 530
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Asn Val15 10 15
His Ser
<210> 531
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400>
531Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 532
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 532
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 533
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 533
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 534
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 534
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 535<211> 18<212> PRT<213> MUS<400> 535
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ile Leu Val Ala Ala Ala Thr Val15 10 15
His Ser<210> 536
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 536
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ile Leu Val Ala Ala Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 537
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 537
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ile Leu Val Ala Ala Ala Thr Val15 10 15
Gln Phe
<210> 538
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 538
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Arg Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 539
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 539
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Phe
<210> 540
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 540
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Phe
<210> 541<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 541
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 542<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 542
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Val15 10 15
His Ser
<210> 543
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 543
Met Gly Trp Ser Cys Ile Met Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Val15 10 15
His Ser
<210> 544
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 544
Met Gly Trp Ser Phe Leu Pro Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser
<210> 545
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 545
Met Gly Trp Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Val1 5 10 15
His Cys
<210> 546<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 546
Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 547
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 547
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Pro Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Val1 5 10 15
His Cys
<210> 548
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 548
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Phe
<210> 549<211> 18<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 549
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 550<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 550
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15
His Ser
<210> 551<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 551
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15
His Ser
<210> 552<211> 18<212> PRT<213> Mus musculus<400> 552Met Gly Trp Ser Tyr 1 5
10 15
Asn Ser
<210> 553<211> 18<212> PRT<213> Mus<400> 553
Met Arg Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Val1 5 10 15His Ser
<210> 554<211> 16<212> PRT<213> Artificial<220> <223> ligante 8<400> 554
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
10
15
<210> 555
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ligante 9<400> 555
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly15 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly20 . 25
<210> 556<211> 17<212> PRT<213> Artificial<220> <223> ligante 10<400> 556
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15
Gly
<210> 557
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ligante 11
<400>
557Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly20 25
<210> 558
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Inserção de um único sítio de restrição HindIII e KasI.
<400> 558
aagcttcaac aggggagagt gttgaaggga gaggcgcc

Claims (11)

1. Método para a produção recombinante de um polipeptídeoheterólogo em uma célula hospedeira eucariótica compreendendo um plas-mídeo de expressão, caracterizado pelo fato de quea) o plasmídeo de expressão compreende em uma direção 5'para 3'aa) um promotor,ab) um ácido nucléico codificando um primeiro polipeptídeo, cujaseqüência de aminoácidos é selecionada da Tabela 1 dependendo dos doisprimeiros aminoácidos do segundo polipeptídeo,ac) um ácido nucléico codificando um segundo polipeptídeocompreendendoi) um ácido nucléico codificando o referido polipeptídeo hete-rólogo,ii) um ácido nucléico codificando um ligante,iii) um ácido nucléico codificando um fragmento de imuno-globulina,ad) uma região 3' não traduzida compreendendo um sinal depoliadenilação,b) o plasmídeo de expressão é introduzido em uma célula hos-pedeira eucariótica,c) a célula hospedeira é cultivada sob condições adequadas pa-ra a expressão do segundo polipeptídeo,d) o segundo polipeptídeo é recuperado do meio de cultura.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o referido segundo polipeptídeo compreende depois do polipep-tídeo heterólogo um ligante e depois do ligante segue um fragmento de imu-noglobulina como a parte carbóxi-terminal do segundo polipeptídeo.
3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou-2, caracterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo contém na posição-5' para o ácido nucléico codificando o referido polipeptídeo heterólogo umácido nucléico adicional codificando ou um único aminoácido ou um dipeptídeoou o peptídeo QIWNN (SEQ ID NO: 472) ou um fragmento do mesmo.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo fato de que o fragmento de imunoglobulina é obtido oude uma IgG ou de uma IgE.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que a célula eucariótica é uma célula mamífera.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que a célula mamífera é uma célula CHO, célula NSO, célula Sp2/0,célula COS, célula K562, célula BHK, célula PER.C6 ou célula HEK.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6, caracterizado pelo fato de que o Iigante é um peptídeo ou polipeptídeoselecionado entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 06, 07, 08, 09, 10,-139, 140, 554, 555, 556, e 557.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,caracterizado pelo fato de que o fragmento de imunoglobulina compreendea) ou o domínio CH1, CH2, CH3 e a região de articulação de umacadeia pesada de imunoglobulina ou o domínio Cl de uma cadeia leve deimunoglobulina, eb) um fragmento de um domínio variável de imunoglobulina decadeia pesada ou leve.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, caracterizado pelo fato de que o fragmento de imunoglobulina compreen-de somente domínios constantes.
10. Plasmídeo compreendendo em uma direção 5' para 3'a) um promotor,b) um ácido nucléico codificando um primeiro polipeptídeo, cujaseqüência de aminoácidos é selecionada da Tabela 1 dependendo dos doisprimeiros aminoácidos do segundo polipeptídeo;c) um ácido nucléico codificando um segundo polipeptídeo com- preendendoi) um ácido nucléico codificando um polipeptídeo heterólogo,ii) um ácido nucléico codificando um ligante,iii) um ácido nucléico codificando um fragmento de imuno-globulina;d) uma região 3' não traduzida compreendendo um sinal de po-liadenilação.
11. Kit para a preparação de um plasmídeo para a expressão deum polipeptídeo heterólogo em uma célula eucariótica compreendendo umplasmídeo o qual compreende em uma direção 5' para 3'a) um promotor,b) um ácido nucléico codificando um primeiro polipeptídeo, cujaseqüência de aminoácidos é selecionada entre o grupo consistindo em SEQID NO: 36, 37, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, e 329c) um ácido nucléico codificando um segundo polipeptídeo com-preendendoi) um ácido nucléico codificando um peptídeo QIWNN (SEQID NO: 472) ou uma fração N-terminal do mesmo,ii) um sítio de clonagem compreendendo no mínimo um sítiode clivagem de restrição,iii) um ácido nucléico codificando um Iigante selecionado en-tre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 06, 07, 08, 09, 10, 139, 140, 554, - 555, 556, e 557,iv) um ácido nucléico codificando um fragmento de imuno-globulina;d) uma região 3' não traduzida compreendendo um sinal de po-liadenilação.
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