BRPI0618833A2 - polinucleotìdeo contendo um fosfato mimético - Google Patents
polinucleotìdeo contendo um fosfato mimético Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0618833A2 BRPI0618833A2 BRPI0618833-8A BRPI0618833A BRPI0618833A2 BR PI0618833 A2 BRPI0618833 A2 BR PI0618833A2 BR PI0618833 A BRPI0618833 A BR PI0618833A BR PI0618833 A2 BRPI0618833 A2 BR PI0618833A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- group
- nucleotide
- acc
- oligonucleotide
- electron acceptor
- Prior art date
Links
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 title description 18
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 title description 16
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 title description 16
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 49
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 47
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 23
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims abstract description 10
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-O pyridinium Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims abstract description 5
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-O hydron;pyrimidine Chemical compound C1=CN=C[NH+]=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 42
- -1 (i) - CN Chemical class 0.000 claims description 36
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims description 23
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 22
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 14
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 11
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 4
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-O hydron;quinoline Chemical compound [NH+]1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 3
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 42
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 40
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 39
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 23
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 20
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 19
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 18
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 18
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 18
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 12
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 12
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 10
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical class [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 9
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 9
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 8
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 8
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 6
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 6
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 3
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- XMRSVLCCIJUKDQ-UHFFFAOYSA-N n-diazobenzenesulfonamide Chemical compound [N-]=[N+]=NS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 XMRSVLCCIJUKDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 3
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 3
- HSVFKFNNMLUVEY-UHFFFAOYSA-N sulfuryl diazide Chemical class [N-]=[N+]=NS(=O)(=O)N=[N+]=[N-] HSVFKFNNMLUVEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N COP(O)=O Chemical class COP(O)=O QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole-4,5-dicarbonitrile Chemical compound N#CC=1N=CNC=1C#N XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- HCGYMSSYSAKGPK-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-1h-indole Chemical compound C1=CC=C2NC([N+](=O)[O-])=CC2=C1 HCGYMSSYSAKGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004080 3-carboxypropanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- VTVWTPGLLAELLI-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzenesulfonyl chloride Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 VTVWTPGLLAELLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPDKTVJZFVWAOC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-1,3,2,4lambda5-dioxathiaphosphetane 4-oxide Chemical class S1OP(O1)(O)=O ZPDKTVJZFVWAOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YERWMQJEYUIJBO-UHFFFAOYSA-N 5-chlorosulfonyl-2-[3-(diethylamino)-6-diethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzenesulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O YERWMQJEYUIJBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 101000864807 Homo sapiens Doublesex- and mab-3-related transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001108330 Homo sapiens Natural resistance-associated macrophage protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100346629 Mus musculus Msr1 gene Proteins 0.000 description 1
- FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N N-phenylacetamide Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC=C1 FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021867 Natural resistance-associated macrophage protein 2 Human genes 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 125000003354 benzotriazolyl group Chemical group N1N=NC2=C1C=CC=C2* 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001369 canonical nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000298 carbocyanine Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- KWEDUNSJJZVRKR-UHFFFAOYSA-N carbononitridic azide Chemical compound [N-]=[N+]=NC#N KWEDUNSJJZVRKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001993 dienes Chemical class 0.000 description 1
- 230000000594 effect on fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003574 free electron Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- RXMBKOPBFXCPDD-UHFFFAOYSA-N methoxyphosphonamidous acid Chemical class COP(N)O RXMBKOPBFXCPDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007040 multi-step synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- BHQIGUWUNPQBJY-UHFFFAOYSA-N n-diazomethanesulfonamide Chemical compound CS(=O)(=O)N=[N+]=[N-] BHQIGUWUNPQBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 125000003431 oxalo group Chemical group 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008039 phosphoramides Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M pinacyanol iodide Chemical class [I-].C1=CC2=CC=CC=C2N(CC)C1=CC=CC1=CC=C(C=CC=C2)C2=[N+]1CC QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 125000002098 pyridazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- MZKUGCOENXBMFR-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O.C1=CC=[NH+]C=C1.C1=CC=[NH+]C=C1.C1=CC=[NH+]C=C1 MZKUGCOENXBMFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical class ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 125000004665 trialkylsilyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C247/00—Compounds containing azido groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B62/00—Reactive dyes, i.e. dyes which form covalent bonds with the substrates or which polymerise with themselves
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
OLINUCLEOTìDEO CONTENDO UM FOSFATO MIMéTICO. A presente invenção refere-se a oligonucleotídeos modificados e a processos para sua produção, em que esses oligonucleotídeos contêm, pelo menos uma vez, a estrutura P=N-Acc, onde Acc é um aceitador de elé- trons ou um aceitador de elétrons substituído por um resíduo R e R é qualquer substituinte orgânico.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLINU- CLEOTÍDEO CONTENDO UM FOSFATO MIMÉTICO".
A presente invenção refere-se a novas substâncias e processos para produção das mesmas no campo da química de nucleotídeo. Essas substâncias são chamadas de fosfatos miméticos, em que um grupo hidroxi- la é substituído por um mimético correspondente.
Em particular, a presente invenção refere-se a uma nova classe de oligonucleotídeos modificados e processos para sua produção. Estado da Técnica
Diversos processos já foram anteriormente descritos para pro- duzir nucleotídeos ou oligonucleotídeos com um resíduo de fosfato modifica- do.
(Desóxi)oligonucleotídeos sintéticos são normalmente prepara- dos em uma fase sólida com a ajuda da química de fosforamidita. Pérolas de vidro com poros de tamanho definido são normalmente usadas como fase sólida (abreviado em seguida como CPG = vidro de poro controlado). O pri- meiro monômero é ligado ao suporte por um grupo de clivagem, de modo que o oligonucleotídeo livre possa ser clivado após completar a síntese de fase sólida. Além disso, o primeiro monômero contém um grupo hidroxila protegido, em cujo caso dimetoxitritila (DMT) é normalmente usado como grupo protetor. O grupo protetor pode ser removido mediante tratamento á- cido. Depois, no terminal 5', derivados de fosforamidita de terminal 3' de (de- sóxi) ribonucleosídeos que são também providos de um grupo protetor DMT, são sucessivamente acoplados ao grupo reativo que é liberado em cada ca- so do grupo protetor de DMT em um processo cíclico. Alternativamente, fos- foramiditas de terminal 5', protegidos por dimetoxitritila de terminal 3' são usados na síntese inversa de oligonucleotídeo. A estratégia de H-fosfonato é também usada para introduzir, em particular, modificações na estrutura prin- cipal do fosfato, por exemplo, para a preparação de fosforotioatos marcados radioativamente. Diversas estratégias já são também conhecidas para a preparação de oligonucleotídeos modificados ou marcados: materiais de su- porte trifuncional são usados, de acordo com o estado da técnica, para pre parar oligonucleotídeos marcados no terminal 3' (Patentes U.S. N5S 5.290.925 e 5.401.837). Fosforamiditas marcadas em que o grupo de mar- cação é ligado à fosforamidita através de um Iigante C3-12 são normalmente usadas para preparar oligonucleotídeos marcados no terminal 5' (Patentes U.S. Ngs 4.997.928 e 5.213.191). Adicionais modificações podem ser intro- duzidas nos oligonucleotídeos em bases individuais (Patentes U.S. N9S 5.241.060, 5.260.433, 5.668.266) ou mediante introdução de Iigantes não- nucleosídeos (Patentes U.S. Nos. 5.656.744 e 6.130.323).
Alternativamente, um fosfato de internucleosídeo pode ser mar- cado por meio de marcação pós-sintética de fosforotioatos (Hodges R.R., et al. Biochemistry 28 (1989) 261-7) ou por meio de pós-marcação de uma fos- foramidita funcionalizada (Agrawal S., Methods in Mol. Biology, 26 (1993), Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Humana Press, Totowa, NJ1 Capí- tulo 3). Entretanto, esses métodos ainda não receberam aceitação devido à instabilidade das fosforamiditas e dos tioésteres de ácido fosfórico.
Também já é conhecido do estado da técnica que as modifica- ções podem ser introduzidas no resíduo de fosfato internucleosídeo dos oli- gonucleotídeos. Nos casos mais importantes, tais resíduos são fosfotioatos (Burgers P.M., e Eckstein F., Biochemistry 18, (1979) 592-6), metilfosfonatos (Miller P.S., et al., Biochemistry 18 (1979) 5134-43) ou boranofosfatos (Pa- tente WO 91/08213). Monômeros especiais têm de ser sintetizados a fim de preparar os oligonucleotídeos de metilfosfonato. Ao contrário, as fosforamidi- tas convencionais ou H-fosfonatos podem ser usados para sintetizar fosforo- tioatos e boranofosfatos, em cujo caso a modificação de borano ou de tio pode ser introduzida diretamente, durante ou após a síntese do oligonucleo- tídeo, mediante uso de reagentes especiais que reagem com o H-fosfonato trivalente ou com o trièster de ácido fosfônico. Embora todos esses métodos levem a oligonucleotídeos modificados, as exigências da química de síntese usada para isso não permitem marcações que possam ser detectadas dessa maneira ou grupos funcionais serem diretamente introduzidos na estrutura principal de fosfato da cadeia do oligonucleotídeo durante a síntese de oli- gonucleotídeo. Baschang G. e Kvita V., Angewandte Chemie 85(1) (1973) 43-44 descrevem a reação de um nucleotídeo de triéster de ácido fosfórico com azidas, tais como, metilsulfonilazida, para preparar trialquil(aril)imidofosfatos que são, entretanto, instáveis e se decompõem.
Nielsen J. e Caruthers M.H., J. Am. Chem. Soe. 110 (1988) 6275-6276, descrevem a reação de fosfitos de desoxinucleosídeos providos com um grupo protetor de 2-ciano-1,1-dimetiletila, na presença de alquilazi- da. Além disso, os autores sugerem que este princípio seja adequado para a preparação de nucleotídeos que são modificados no resíduo de fosfato, sem elucidar quais tipos de modificações preparadas com a ajuda do método descrito podem ter particulares vantagens. Particularmente, os autores suge- rem a introdução de resíduos alquílicos.
O documento de patente WO 89/091221 descreve N-alquil- fosforamiditas ou outros oligonucleotídeos substituídos por N-alquila em pelo menos um resíduo de fosfato, que são preparados mediante oxidação de fosfitos de nucleosídeos (providos com um grupo protetor) com iodo, na pre- sença de alquilaminas adequadas.
O documento de patente WO 03/02587 descreve a preparação de oligonucleotídeos modificados, em que os H-fosfonatos são convertidos por aminação em fosforamidatos.
Assim, todas essas publicações descrevem a preparação de mo- léculas que contêm um fosforamidato ao invés de um resíduo de fosfato. No entanto, as moléculas contendo fosforamidato são suscetíveis de hidrólise, uma vez que o grupo amino é protonado em um ambiente acídico e depois substituído por água.
Além disso, o documento de patente WO 01/14401 propõe blo- cos de construção de nucleotídeos ou oligonucleotídeos, em que um resíduo de fosfato é substituído por N—CIO3, N—NO2 ou N—SO2R. De acordo com o ensinamento do documento WO 01/14401, essas substâncias podem ser preparadas mediante reação do grupo hidroxila de um desoxinucleosídeo com cloreto de amidofosfonila, na presença de piridina. Entretanto, esse tipo de preparação é complicado, dispendioso de tempo e inadequado para as sínteses rotineiras de nucleotídeos e oligonucleotídeos.
O objeto técnico que forma a base da presente invenção é, por- tanto, de preparar oligonucleotídeos marcados aperfeiçoados e proporcionar um processo simples para sua preparação.
Breve Descrição da Invenção
Portanto, a presente invenção concerne um composto químico, o qual é preferivelmente um oligonucleotídeo contendo, pelo menos uma vez, a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 5</formula>
na qual:
-A representa o terminal 5' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeos ou representa um Iigante ligado a uma fase sólida; e
- B representa o terminal 3' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeos ou representa um ligante;
- D é OH ou CH3; e
- Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elétrons substituído por um resíduo R, e R é qualquer substituinte orgânico.
O aceitador de elétrons Acc é preferivelmente selecionado do grupo que consiste em:
-CN;
-SO2-R', em que R1 contém pelo menos um grupo alquila substi- tuído por amino, um grupo arila opcionalmente substituído ou um heterociclo opcionalmente substituído;
e N+-heterociclos de seis membros deficientes de elétrons, em que pelo menos um átomo de nitrogênio é alquilado e localizado na posição orto ou para e onde esses heterociclos podem ser opcionalmente substituí- dos por R.
São particularmente preferidos os oligonucleotídeos em que R ou R1 individualmente ou em combinação com o aceitador de elétrons con- tém uma unidade detectável ou um grupo funcional. Esses oligonucleotídeos são preparados conforme a invenção por meio de processos que são caracterizados pelo fato de um derivado de fósforo trivalente, de estrutura química:
<formula>formula see original document page 6</formula>
- em que E representa um grupo metila ou um grupo hidroxila protegido,
- em que A representa o terminal 5' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeos ou representa um Iigante ligado a uma fase só- lida, e
- em que B representa o terminal 3' de um nucleotídeo ou de 10 uma cadeia de nucleotídeos ou representa um ligante,
é reagido com uma azida da seguinte estrutura:
N=N=N-Acc,
- em que Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elé- trons substituído por um resíduo R e R é qualquer substituinte orgânico.
O aceitador de elétrons Acc é preferivelmente selecionado do grupo que consiste em:
-CN, -SO2-R e N+-heterociclos de seis membros deficientes de elétrons, em que pelo menos um átomo de nitrogênio é alquilado e localiza- do na posição orto ou para e onde esses heterociclos podem ser opcional- mente substituídos por R.
Em uma especial modalidade para produção de um oligonucleo- tídeo de acordo com a invenção:
a) uma 3'-fosforamidita é primeiro reagida com o terminal 5'-OH de uma cadeia nascente de oligonucleotídeos; e, em seguida,
b) reação de uma azida da seguinte estrutura:
N=N=N-Acc1
em que Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elétrons substitu- ído por um resíduo R e R é qualquer substituinte orgânico.
São particularmente preferidos os processos em que R contém uma unidade detectável ou um grupo funcional.
Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção que são produ- zidos dessa maneira podem ser usados para todas as aplicações em que parceiros de hibridização em qualquer forma e, em particular, parceiros de hibridização derivatizados ou marcados são requeridos.
Em particular, esses oligonucleotídeos podem ser usados como sondas de hibridização para detectar certas seqüências-alvo.
Outro uso potencial concerne o uso de oligonucleotídeos modifi- cados conforme a invenção, para inativação de expressão de gene na forma de oligonucleotídeos de anti-sentido ou siRNAs. Descrição Detalhada da Invenção
O objetivo da presente invenção é produzir nucleotídeos e oligo- nucleotídeos de uma maneira simples, os quais contêm resíduos de fosfato modificados e, assim, podem também preferivelmente conter marcadores detectáveis.
A idéia central da presente invenção é no sentido de se começar com um átomo de fósforo trivalente e reagir o mesmo com um reagente, de tal modo que seja formado um fosfato mimético estável. De acordo com a invenção, um átomo de fósforo contendo pelo menos um resíduo hidroxila que é provido de um grupo protetor, é para esta finalidade reagido com uma azida tendo a estrutura N=N=N-Acc, em que Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elétrons substituído por um resíduo R e R é qualquer substituinte orgânico. Isso resulta na formação de um átomo de fósforo pen- tavalente ao qual um grupo aceitador de elétrons de forte atração de elétrons é covalentemente ligado através de um átomo de N. Esse grupo garante que os compostos produzidos dessa maneira são, ao contrário dos compostos de fosforamidato conhecidos do estado da técnica, estabilizados por resso- nância e não suscetíveis à hidrólise.
A idéia que fundamenta a invenção pode ser aplicada a todos os processos em que é formado fósforo trivalente como intermediário.
Durante a síntese convencional de oligonucleotídeo usando fos- foramiditas, são formados triésteres de ácido fosfônico com um átomo de fósforo trivalente como produtos intermediários. As primeira e segunda liga- ções de éster representam a ligação de internucleosídeo. O átomo de fósfo- ro é ligado a um grupo hidroxila protegido, tal como, por exemplo, um grupo beta-cianoetilóxi, através da terceira ligação de éster. Ao invés de uma oxi- dação com iodo, o oligonucleotídeo nascente pode ser depois reagido con- forme a invenção com uma apropriada azida no processo pelo qual o átomo de fósforo trivalente é oxidado a um átomo pentavalente mediante ligação covalente -N-Acc ao átomo de fósforo, durante a clivagem com nitrogênio.
A síntese de oligonucleotídeo pode depois ser subseqüentemen- te continuada conforme conhecido do estado da técnica. Oligonucleotídeos estáveis são obtidos como um produto final, sendo modificados de quase todas as maneiras em um ou mais resíduos de fosfato de internucleotídeo.
Definições
Dentro do escopo da presente invenção, alguns dos termos usa- dos são definidos como segue.
O termo "grupo reativo" refere-se a grupos de uma molécula que são capazes de reagir sob condições adequadas com outra molécula, for- mando ao mesmo tempo uma ligação covalente. Exemplos de grupos reati- vos incluem grupos hidroxila, grupos amino, tiol, hidrazino, hidroxilamino, dieno, alcino e grupos de ácido carboxílico.
O termo "grupo protetor" indica moléculas que reagem com um ou mais grupos reativos de uma molécula, de modo que como parte de uma reação de síntese de múltiplas etapas, somente um grupo reativo particular não-protegido pode reagir com o desejado parceiro de reação. Exemplos de grupos protetores freqüentemente usados para proteger grupos hidroxila incluem beta-cianoetila, trialquilsilila e alila. Grupos protetores para proteção de grupos amino incluem trifluoroacetila e Fmoc. Outros possíveis grupos protetores se encontram resumidos em livros de texto padrões (Greene T.W., "Protective groups in organic synthesis"; Wiley Interscience Publicati- ons, John Wiley&Sons (1981) New York, Chichester, Brisbane, Toronto; Souveaux E., "Methods in Mol. Biology", Vol. 26, Protocols for Oligonucleoti- de Conjugates, Humana Press, Totowa1 NJ, 1994, Capítulo 1, editor S. A- grawal).
O termo "ligantes" indica cadeias de carbono tendo uma exten- são de 1 -30 átomos de carbono. Essas cadeias ligantes podem também adi- cionalmente apresentar um ou mais átomos internos de nitrogênio, oxigênio, enxofre e/ou fósforo. Os ligantes podem também ser ramificados, por exem- plo, também serem dendríticos. A interconexão de um Iigante com um nu- cleotídeo ou uma cadeia de nucleotídeos é feita com uma unidade detectá- vel ou um grupo reativo, que é opcionalmente protegido por um grupo protetor.
Uma unidade detectável é entendida para indicar substâncias que podem ser detectadas com a ajuda de métodos analíticos. Essa unida- de, por exemplo, pode consistir em unidades que podem ser detectadas por espectroscopia de massa, imunologicamente ou com a ajuda de RMN. As unidades detectáveis são, em particular, substâncias que também podem ser detectadas por métodos ópticos, tais como, fluorescência e espectrosco- pia de UV/VIS, tais como, fluoresceínas, rodaminas e partículas de ouro. Elas também incluem intercaladores e ligantes de fendas menores, os quais podem também causar efeito no comportamento de fusão e cuja fluorescên- cia é modificada por hibridização.
O termo "fosforamiditas" indica moléculas contendo um átomo de fósforo trivalente que pode ser acoplado ao terminal 5' de um nucleosídeo ou derivado de nucleosídeo. Assim, as fosforamiditas podem ser usadas na síntese de oligonucleotídeo. Além das fosforamiditas de desoxirribonucleotí- deo que são usadas para extensão de cadeia, existem também as fosfora- miditas derivatizadas com um marcador que podem ser usadas em proces- sos similares durante ou ao final de uma síntese de oligonucleotídeo, para marcar o oligonucleotídeo (Beaucage S.L., "Methods in Molecular Biology", 20 (1993) 33-61, ed. S. Agrawal; Wojczewski C., et al., Synlett, 10 (1999) 1667-1678).
Em conexão com a presente invenção, o termo "oligonucleotí- deos" abrange não apenas (desóxi)oligorribonucleotídeos, mas, também, oligonucleotídeos que contêm um ou mais análogos de nucleotídeo com modificações na estrutura principal do fosfato (tal como, por exemplo, metil- fosfonatos, fosfotioatos), no açúcar (tal como, derivados de 2'-0-alquila, 3' e/ou 5'-aminorribose, LNA, HNA, TCA) ou bases modificadas, tais como, 7- deazapurina. Em tal contexto, a invenção também abrange conjugados e quimeras contendo análogos não-nucleosídicos, tais como, PNAs ou outros biopolímeros, por exemplo, peptídeos. Além disso, os oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem também conter uma ou mais unidades não- nucleosídicas, tais como, espaçadores em cada posição, por exemplo, he- xaetilenoglicol ou Cn (n=3,6) espaçadores.
O termo "aceitador de elétrons" abrange estruturas atômicas que possuem a tendência de se ligar a pares de elétrons livres. Uma medida pa- ra isso é a constante de Hammett. A presente invenção concerne, em parti- cular, modalidades em que a constante de Hammett σρ excede um determi- nado valor de 0,30, preferivelmente, 0,45 e, particularmente e preferivelmen- te, de 0,60.
O aceitador de elétrons deve, além disso, ser compatível com todas as reações químicas na síntese de oligonucleotídeo, isto é:
- não deve ser oxidado por iodo;
- deve ser inerte para o ácido dicloroacético e ácido tricloroacéti- co, e
- deve ser inerte para bases e, em particular, para amônia, e
- não deve reagir com fosforamidatos trivalentes.
Exemplos de aceitadores de elétrons que atendem a essas con- dições são: -NO2, SO2-R, -CN, -CO-R, pirinidinila, piridinila, piridazinila, he- xafluorofenila, benzotriazolila (Hansch C., et al., "Chem. Reviews", 91 (1991), 165-195). Além disso, esses aceitadores podem também ser ligados ao átomo de nitrogênio em um modo de ligação de vinila ou fenila.
O termo "substituído" significa que a estrutura que é referida como sendo substituída, contém outro resíduo em qualquer posição, desde que essa posição não seja definida em maiores detalhes. O termo "opcio- nalmente substituído" indica que a estrutura referida dessa maneira compre- ende modalidades com e sem adicional resíduo. O termo "alquila substituído por amino" abrange CrC3O alquila linear ou ramificada, contendo pelo menos um grupo amino, em que o grupo amino é protegido ou é ligado a uma unidade detectável através de um Iigan- te.
O termo "N+-heterociclo de seis membros" abrange N-hetrociclos que são alquilados em um nitrogênio sp2, de modo que a carga global do heterociclo é positiva. Exemplos destes incluem piridínio, pirimidínio e quino- línio. Esses heterociclos são conhecidos na técnica como sendo deficientes de elétrons.
O termo "cadeia de nucleotídeos" é entendido como uma molé- cula ou parte de uma molécula contendo pelo menos dois resíduos de nu- cleosídeo que são interligados nos terminais 5'-3' por uma porção de fosfato. Compostos Químicos de acordo com a Invenção
A presente invenção compreende qualquer composto químico contendo, pelo menos uma vez, a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 11</formula>
em que:
- A representa o terminal 5' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeos ou representa um Iigante ligado a uma fase sólida; e
- B representa o terminal 3' de um nucleotídeo ou uma cadeia de nucleotídeos ou representa um ligante, e
- Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elétrons substituído por um resíduo R e R é qualquer substituinte orgânico. O resíduo deve ser ainda compatível com todas as reações químicas que ocorrem na síntese de oligonucleotídeo, isto é:
- não deve ser oxidado por iodo;
- deve ser inerte para o ácido dicloroacético e ácido tricloroacéti- co, e
- deve ser inerte para bases e, em particular, para amônia, e
- não deve reagir com fosforamidatos trivalentes. Os resíduos que são inicialmente per si incompatíveis, podem, entretanto, ser convertidos em derivados que se comportam de modo inerte sob condições químicas de síntese de oligonucleotídeo, mediante uso de grupos protetores conhecidos para alguém versado na técnica.
Deve ser também entendido por um versado na técnica que os grupos -OH do oligonucleotídeo estão normalmente presentes em uma con- dição desprotonada.
Além disso, a presente invenção também compreende fosfona- tos de metila da seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 12</formula>
com as definições fornecidas acima.
Em uma primeira modalidade preferida, o composto químico da presente invenção é um oligonucleotídeo. Nesse oligonucleotídeo, A repre- senta o terminal 5' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeos e/ou B representa o terminal 3' de um nucleotídeo ou uma cadeia de nucleo- tídeos. Assim, AeB juntos compreendem pelo menos dois resíduos de nu- cleotídeo.
Dependendo do uso pretendido do oligonucleotídeo, as estrutu- ras descritas acima podem ocorrer uma vez, duas vezes ou diversas vezes ou mesmo em todos os resíduos de fosfato presentes no oligonucleotídeo. Os resíduos de fosfato dentro do oligonucleotídeo são chamados de fosfatos de internucleosídeo, de modo que:
- A representa o terminal 5' de um primeiro nucleosídeo, e
- B representa o terminal 3' de um segundo nucleosídeo dentro da cadeia de nucleotídeo.
Além disso, as estruturas de acordo com a invenção podem ser localizadas no terminal 3' ou terminal 5' de um oligonucleotídeo. Caso elas estejam presentes no terminal 5' do oligonucleotídeo, então:
- A representa o terminal 5' da cadeia do nucleotídeo, e
- B representa um grupo hidroxila opcionalmente protegido ou um Iigante que pode opcionalmente conter um grupo detectável ou outro grupo reativo e pode ser usado para introduzir um grupo detectável no oligo- nucleotídeo.
Se o aceitador de elétrons contiver um substituinte que também representa uma unidade detectável, um oligonucleotídeo estando presente, conforme a invenção, poderá realizar uma dupla marcação no terminal 5'.
Se a estrutura de acordo com a invenção ocorrer no terminal 3' de uma cadeia de nucleotídeos, então:
- B representará o terminal 3' do dito oligonucleotídeo, e
-A será hidroxila ou um Iigante ligado a uma fase sólida, em que
a fase sólida será preferivelmente controlada por partículas de poros de vi- dro, tais como, aquelas que são usadas como material de partida para a sín- tese rotineira de oligonucleotídeo.
Os nucleosídeos individuais dentro dos oligonucleotídeos de a- cordo com a invenção, podem conter qualquer tipo de nucleosídeos ou nu- cleosídeos modificados ou derivados de nucleosídeos. As unidades de açú- car são normalmente desoxirribose para oligonucleotídeos de DNA ou ribose para oligonucleotídeos de RNA. As nucleobases contidas nos oligonucleotí- deos de acordo com a invenção podem ser bases de ocorrência natural, tais como, adenina, guanina, timidina, citidina, uridina, derivados das mesmas ou as chamadas bases universais, como nitroindol. Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem conter quaisquer grupos aceitadores de elé- trons que sejam ligados através de uma ligação de amida ao respectivo fos- fato. Em particular, os seguintes grupos aceitadores de elétrons podem ser usados:
a) -CN,
b) -SO2-R', em que R1 contém pelo menos um grupo alquila substituído por amino, um grupo arila opcionalmente substituído ou um hete- rociclo opcionalmente substituído;
c) N+-heterociclos de seis membros deficientes de elétrons, em que pelo menos um átomo de nitrogênio é alquilado e localizado na posição orto ou para e onde esses heterociclos podem ser opcionalmente substituí- dos por R.
A invenção também compreende ainda modalidades de SCVR', em que R1, tal como, alquila substituída por amino, é uma arila opcionalmen- te substituída ou um heterociclo opcionalmente substituído.
A presença dos ditos aceitadores de elétrons dentro dos oligo- nucleotídeos de acordo com a invenção resulta em oligonucleotídeos modifi- cados que podem ser usados para uma ampla variedade de aplicações. En- tretanto, todos os aceitadores de elétrons que podem conter qualquer resí- duo orgânico R são de particular interesse pelo fato de permitirem aos oligo- nucleotídeos modificados contendo quaisquer resíduos orgânicos serem preparados de uma maneira simples dentro do escopo dos processos de síntese descritos no presente pedido de patente.
Conseqüentemente, a presente invenção concerne, em particu- lar, também os oligonucleotídeos em que um aceitador de elétrons substituí- do por um resíduo R contém uma unidade detectável como R ou, alternati- vamente, contém um grupo funcional como R, ao qual uma unidade detectá- vel pode ser acoplada após a síntese do oligonucleotídeo mediante pós- marcação. Alternativamente, a presente invenção também compreende mo- dalidades em que o aceitador de elétrons é um componente da unidade de- tectável. Alternativamente, o resíduo R pode ser a própria unidade detectá- vel ou um grupo funcional.
Esses oligonucleotídeos marcados podem ser usados, de forma vantajosa, em numerosas e diferentes aplicações na biologia molecular, tal como, em PCR de tempo real. A marcação detectável, preferivelmente, é um corante fluorescente ou uma molécula de rápida fluorescência. Corantes cor- respondentes e moléculas que podem sen/ir como uma unidade detectável para oligonucleotídeos são bem-conhecidos para aqueles versados na técni- ca. Exemplos dos mesmos não-limitativos do escopo de proteção da presen- te invenção são: fluoresceínas, rodaminas, cianinas, merocianinas, carboci- aninas e compostos azo e poliazo.
A presente invenção também concerne sondas de PCR em tem- po real tendo a estrutura descrita acima, em que pelo menos uma marcação fluorescente é ligada ao átomo de fosfato da cadeia de oligonucleotídeos por meio de um grupo amida aceitador de elétrons. Exemplos de tais sondas são as sondas de hibridização FRET (documento de patente WO 97/46707) ou as chamadas sondas de marcação única (documento de patente WO 02/14555). Em tal contexto, as sondas de oligonucleotídeos em que existe uma modificação interna de acordo com a invenção em um resíduo de fosfa- to de intemucleosídeo são particularmente preferidas.
Nesse contexto, a presente invenção também particularmente concerne oligonucleotídeos de dupla marcação que apresentam duas unida- des detectáveis. Exemplos de tais sondas são os sinais moleculares (Paten- te U.S. No. 5.118.801) das sondas TaqMan (Patente U.S. No. 5.804.375). Nesse contexto, a presente invenção concerne oligonucleotídeos de dupla marcação em que uma primeira marcação fluorescente é ligada a um átomo de fosfato de intemucleosídeo da cadeia de oligonucleotídeos por meio de um grupo amida aceitador de elétrons e uma segunda unidade detectável se faz presente terminantemente no terminal 5' ou terminal 3' do oligonucleotídeo.
As moléculas que apresentam essas marcações e métodos para sua preparação são bem-conhecidas dos especialistas versados na técnica.
Em um adicional aspecto, a presente invenção é dirigida para um composto químico que apresenta a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 15</formula>
em que:
- A representa um ligante ligado a uma fase sólida;
- B representa um ligante que, preferivelmente, é veículo de um grupo reativo protegido ou uma unidade detectável;
- E é um grupo metila ou um grupo hidroxila protegido;
- Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elétrons substituído por um resíduo R e R é qualquer substituinte orgânico.
Com relação a Β, o grupo reativo protegido preferido é um grupo hidroxila protegido por dimetoxitritila (DMT). Com relação a Ε, o grupo prote- tor preferido é um grupo beta-cianoetila.
Tal composto pode ser usado como material de partida para sín- tese de oligonucleotídeo, em que o fosforamidato seguinte reage com o res- tante grupo hidroxila do dito composto. Além disso, no caso de A representar um Iigante trifuncional com uma ligação extra, é possível se produzir um oli- gonucleotídeo com dupla marcação no seu terminal 3', caracterizado pelo fato de que uma marcação é introduzida através do substituinte de Acc e a segunda marcação é introduzida através de uma adicional porção conectada ao ligante.
Produção de Oligonucleotídeos de acordo com a Invenção
A presente invenção também concerne processos para produ- ção de oligonucleotídeos modificados e, em particular, processos para pro- dução dos oligonucleotídeos que foram descritos aicima.
Em geral, a presente invenção concerne processos para produ- ção de oligonucleotídeos modificados, que são caracterizados pelo fato de que um derivado de fósforo trivalente de estrutura química:
<formula>formula see original document page 16</formula>
em que:
- E representa um grupo metila ou um grupo hidroxila protegido, que, preferivelmente, é protegido por um grupo beta-cianoetila;
- A representa o terminal 5' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeos ou representa um Iigante ligado a uma fase sólida; e
- B representa o terminal 3' de um nucleotídeo ou uma cadeia de nucleotídeos ou representa um ligante;
é reagido com uma azida da seguinte estrutura:
N=N=N-Acc,
em que Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elétrons substitu- ído por um resíduo R e R é qualquer substituinte orgânico.
Grupos protetores particularmente preferidos incluem beta- cianoetila, metila, alila ou silila. Alternativamente, os compostos de metil- fosfonato podem ser produzidos, de acordo com a invenção, em que E re- presenta CH3.
De acordo com a invenção, as azidas podem conter quaisquer grupos aceitadores de elétrons. Esses grupos são depois ligados ao respec- tivo átomo de fósforo. Em particular, os seguintes grupos aceitadores de elé- trons podem ser usados:
a)-CN,
b) -SO2-R,
c) N+-heterociclos de seis membros deficientes de elétrons, em que pelo menos um átomo de nitrogênio é alquilado e localizado na posição orto ou para e onde esses heterociclos podem ser opcionalmente substituí- dos por R.
O processo de acordo com a invenção pode ser também rotinei- ramente usado, em particular, em uma síntese convencional de oligonucleo- tídeo. Assim, a presente invenção também concerne um processo que com- preende as seguintes etapas:
a) reação de 3'-fosforamidita com o terminal 5'-0H de uma ca- deia nascente de oligonucleotídeo;
b) reação com uma azida da seguinte estrutura:
N=N=N-Acc
onde Acc representa um aceitador de elétrons ou um aceitador de elétrons substituído por um resíduo R e R é qualquer substituinte orgânico.
Nesse caso, o terminal 5'-OH da cadeia nascente de oligonucle- otídeos pode ser o terminal 5' de um nucleotídeo de terminal 5' ou o grupo OH livre de um Iigante fixado a um CPG.
A química convencional de oligonucleotídeo começa em um ma- terial suporte reativo de fase sólida. O material reativo de fase sólida se refe- re a substâncias poliméricas que formam uma fase sólida contendo um gru- po reativo sobre o qual outras moléculas podem ser imobilizadas. No caso de síntese de oligonucleotídeos, o material suporte consiste normalmente em pérolas de vidro poroso com um tamanho de poro definido, chamadas de partículas de vidro de poro controlado (CPG). Alternativamente, é também possível se utilizar resíduos de poliestireno e de outros polímeros e copolí- meros orgânicos (Ghosh P. K., et al., J. Indian. Chem. Soe. 75 (1998) 206- 218). Caso os oligonucleotídeos devam permanecer imobilizados após a síntese no substrato, podem ser usados vidro e também chips semiconduto- res como material suporte de fase sólida. Os materiais suporte de fase sólida são comercialmente disponíveis.
O suporte pode ser ligado por meio do chamado grupo Iigante contendo uma ligação que pode ser clivada ao terminal do resíduo hidroxila reativo protegido por um grupo protetor, tal como, DMT (dimetoxitritila). Um grupo Iigante com uma ligação que pode ser clivada indica aqueles grupos que se encontram entre o espaçador trifuncional e o material suporte de fase sólida e podem ser clivados por uma simples reação química. Exemplos de tais grupos incluem succinila ou oxalila ou outros grupos Iigantes contendo uma ligação de éster que pode ser clivada. Outros grupos Iigantes são co- nhecidos para aqueles versados na técnica (Ghosh P. K., et al., J. Indian. Chem. Soe. 75 (1998) 206-218).
Esses grupos Iigantes são essenciais para o uso do material su- porte para sintetizar os oligonucleotídeos que são pretendidos de estarem presentes na solução aquosa após a concretização da síntese. Se, ao con- trário, o oligonucleotídeo deve permanecer sobre a superfície do material suporte após a síntese, como no caso da produção de sistemas de ácido nucléico (Patente U.S. No. 5,624,711, Shchepinov M.S., et al., Nucl. Acids. Res., 25 (1997) 1155-1161), grupos Iigantes cliváveis são desnecessários, sendo preferidos grupo Iigantes não-cliváveis.
Os detalhes de uma síntese de oligonucleotídeo para a incorpo- ração de estruturas de acordo com a invenção são como segue.
Um grupo reativo hidroxila, no qual uma extensão de cadeia na direção dos terminais 3'-5' pode ocorrer, é formado após a remoção do gru- po protetor DMT por tratamento ácido. Em seguida, derivados de 3'- fosforamidita de (desoxi)ribonucleosídeos que são também providos com um grupo protetor DMT e adicionais grupos protetores de base bem-conhecidòs na técnica, são sucessivamente acoplados ao terminal 5' em cada grupo reativo liberado do grupo protetor DMT1 na presença de tetrazol. Um inter- mediário contendo um átomo de fósforo trivalente é formado nesse processo como um produto intermediário que forma uma ligação de éster com cada um dos nucleosídeos que são ligados pela reação e uma terceira ligação de éster com um grupo hidroxila protegido que já está presente na fosforamidita que é usada. Esse grupo protetor que, por exemplo, pode ser formado por beta-cianoetila, metila, alila ou silila, é subseqüentemente clivado com amô- nia, após concretização da síntese do oligonucleotídeo no processo, a partir do qual os grupos protetores de base e o Iigante ao GPC são também cliva- dos.
Ao invés de oxidação com a ajuda de iodo, o oligonucleotídeo nascente é reagido, de acordo com a invenção, com uma azida da seguinte estrutura:
N=N=N-Acc,
nas posições em que os compostos miméticos do fosfato devem ser introdu- zidos na cadeia de nucleotídeo, onde Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elétrons substituído por um resíduo R e R é qualquer resíduo orgânico. A química de síntese descrita permite a incorporação basicamente de quaisquer resíduos R e, em particular, a incorporação de qualquer tipo de corante fluorescente.
A preparação das azidas de Acc, tais como, azidas de acila e azidas de sulfonila é simples e conhecida há longo tempo (Consultar a análi- se de: Brãse S., et al., Angewandte Chemie 117, (2205), 5320-5374, 3.4 e 3.5.2). Tais azidas são referivelmente preparadas a partir de cloretos de aci- la ou cloretos de sulfonila, usando azidas de sódio ou a partir de hidrazidas usando ácido nitroso.
Corantes à base de azida de sulfonila são, por exemplo, também usados em processos de fingimento (por exemplo, documento de patente DE 19650252). A azida de cianogênio pode ser simplesmente produzida mediante reação de azida de sódio com bromocianogênio em acetonitrila (McMurry J.E., et al., J. Organie Chemistry 38(16) (1973) 2821-7). As azidas heteroarílicas podem ser preparadas mediante substituição nucleofílica de um halogênio por azida ou a partir de hidrazinas heteroarílicas. Um pré- requisito é que o nitrogênio atrativo de elétron se encontre na posição para ou orto em relação ao grupo azido, uma vez que somente assim é formado um fosfato mimético estabilizado por ressonância. As azidas orto e para N- alquil-piridínio são particularmente adequadas em tal contexto. Algumas azi- das de acila, sulfonila e piridila são também comercialmente disponíveis.
A presente invenção adicionalmente concerne processos con- forme descrito acima, em que o resíduo R é uma unidade detectável. R é preferivelmente um corante fluorescente ou uma molécula de rápida fluores- cência.
Certas modalidades da presente invenção concernem a prepa- ração de sondas de oligonucleotídeo de dupla marcação, em que uma mar- cação é preferivelmente introduzida internamente no oligonucleotídeo, de acordo com o processo da invenção, e outra marcação é introduzida no oli- gonucleotídeo, preferivelmente, nos terminais 5' ou 3', de acordo com um método conhecido do estado da técnica.
No caso de uma marcação 5' na posição 5' da ribose do nucleo- tídeo de terminal 5', a incorporação é executada por meio de métodos con- vencionais, usando uma fosforamidita marcada por corante ao final da sínte- se do oligonucleotídeo (Beaucage, S.L., Methods in Molecular Biology 20 (1993) 33-61, S. Agrawal Publishers).
A marcação no terminal 3' é realizada mediante uso de CPG comercialmente disponível como suporte de fase sólida reativo, já contendo uma marcação detectável além do grupo hidroxila tritilado. Após a clivagem do grupo protetor DMT, a síntese-padrão de oligonucleotídeo pode ser inici- ada no grupo hidroxila que está agora livre.
Alternativamente, podem ser usados métodos conhecidos do estado da técnica para pós-marcação de uma adicional marcação 5' ou 3' (Patentes U.S. NsS 5.002.885 e 5.401.837).
A presente invenção também concerne intermediários de sínte- se, os quais podem ser preparados antes da síntese-padrão de oligonucleo- tídeo. Nesse caso, os intermediários que ainda estão ligados à fase sólida e não estão ainda desprotegidos, podendo conter grupos espaçadores bási- cos, são os preferidos. Os CPGs que são familiares para aqueles versados na técnica , como o CPG de fosfato, são preferivelmente usados para a pre- paração, uma vez que se forma um oligonucleotídeo fosforilado em 3' após a síntese do oligonucleotídeo. Após a detritilação, esses CPGs de fosfato são reagidos com uma fosforamidita espaçadora, na presença de um ativador. O intermediário de fósforo trivalente que se forma é depois reagido com uma azida de Acc contendo uma unidade detectável. Esses intermediários de síntese podem ser armazenados e usados como CPGs trifuncionais para marcação 3' de caráter universal.
A presente invenção também concerne a síntese de fosforamidi- tas contendo um grupo N-Acc protegido, ao invés, por exemplo, de oxigênio protegido por beta-cianoetila, a fim de possibilitar a formação de fosforotioa- tos de N-Acc ou de miméticos de fosfato de bis-N-Acc a serem sintetizados. Tal estratégia de síntese é adequada em casos individuais, por exemplo, para preparação de oligonucleotídeos contendo P=N-CN.
Um intermediário de fósforo trivalente é também formado duran- te a síntese de metil-fosfonatos, o qual pode ser reagido com as azidas. Os compostos de metil-fosforamiditas são também comercialmente disponíveis.
Em uma estratégia de síntese inversa, (documento de patente EP 1 155 027), a qual é usada para oligonucleotídeos-padrão, assim como, em particular, para análogos, por exemplo, para síntese de oligonucleotídeos N3'- > P5', um intermediário contendo um fósforo trivalente é também forma- do, o qual pode ser reagido, conforme a invenção, com as azidas. As fosfo- ramiditas correspondentes são comercialmente disponíveis.
Espectro de Aplicações
A estratégia de síntese de acordo com a invenção permite a preparação de uma ampla variedade de oligonucleotídeos modificados na estrutura principal de fosfato. O grau de modificação, a diversidade e a carga das modificações são determinadas pelo uso pretendido.
Por exemplo, os oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem ser usados para hibridizar com DNA e RNA naturais, por exemplo, para captura ou detecção. Os oligonucleotídeos contendo miméticos de fos- fato de P-N=Acc, individualmente ou como quimeras com fosfatos normais, podem também ser usados com sucesso como iniciadores em reações de amplificação.
Essas sondas de oligonucleotídeos constituem a base para di- versas aplicações, por exemplo, PCR em tempo real, FISH, técnicas de Blot, seqüenciamento (Jung P.M., et al., "Nucleic Acid Amplification Technologies BioTechniques Books", Div. Eaton Publishing (1997), Editors H.H. Lee, S.A. Morse, O. Olsvik; Bustin Stephen A. e Nolan Tania. "Chemistries IUL Biote- chnology Series" (2004), 5(A-Z of Quantitative PCR, 215-278).
Os oligonucleotídeos marcados de acordo com a invenção são particularmente adequados como sondas marcadas de modo fluorescente em diversos formatos de PCR em tempo real.
Duas sondas marcadas são normalmente usadas para o formato de sinal molecular (Patentes U.S. Nos. 5.118.801) e para o formato de sonda de TaqMan (Patentes U.S. Nos. 5.210.015, 5.538.848 e Patentes U.S. Nos. 5.487.972, 5.804.375), em que uma marcação é preferivelmente introduzida internamente e uma segunda marcação se encontra localizada nos terminais 5' ou 3' da sonda. É especialmente vantajoso marcar internamente as son- das usando um processo de acordo com a invenção como parte de uma sín- tese de oligonucleotídeo, baseado na química de fosforamidita. A segunda unidade detectável nos terminais 5' ou 3' da sonda pode também ser intro- duzida na sonda correspondente por meio de um dos processos descritos na invenção ou com a ajuda de processos conhecidos do estado da técnica.
Uma sonda marcada no terminal 5' e uma sonda marcada no terminal 3' são normalmente usadas para o formato de sonda de hibridiza- ção de FRET (Matthews J.A., e Kricka L.J., "Analytical Biochemistry", 169, (1988), 1-25), (Bernard P.S., et al., "Analytical Biochemistry", 255, (1998), 101-107). Nesse caso, é particularmente vantajoso se realizar a marcação no terminal 5' da sonda usando um processo de acordo com a invenção, como parte de uma síntese de oligonucleotídeo baseada na química de fos- foramidita.
A presente invenção permite a oligonucleotídeos funcionalizados serem preparados de uma maneira simples, em que o aceitador de elétrons Acc é modificado por um resíduo R1 o qual contém um grupo funcional que é adequadamente protegido para a síntese do oligonucleotídeo. Se este resí- duo for um grupo amino ou hidroxilamino, então, ele pode ser usado para preparar, por exemplo, sistemas de oligonucleotídeos mediante marcação de superfícies modificadas por epóxi (Seliger H., et al., "Current Pharmaceutical Biotechnology", 4, (2003), 379-395). Ao contrário, grupos tiol podem ser u- sados para imobilização em superfícies de ouro ou partículas de ouro. Nesse caso, é particularmente vantajoso, de acordo com a invenção, quando diver- sos grupos tiol são introduzidos de uma maneira simples, a fim de se obter uma ligação estável de uma sonda de captura na superfície de ouro. Se um grupo OH protegido for incorporado como grupo funcional, então, oligonu- cleotídeos ramificados ou dendríticos podem também ser preparados.
Tais grupos funcionais e, em particular, grupos amino, podem também ser usados para preparar oligonucleotídeos marcados, mediante reação dos mesmos com um éster ativo de um corante, após a síntese do oligonucleotídeo. Entretanto, é mais vantajoso se introduzir a unidade detec- tável diretamente durante a síntese de oligonucleotídeo, de acordo com o processo da invenção.
Uma vez que os oligonucleotídeos de acordo com a invenção são resistentes a nucleases, eles também são adequados para uso em di- versos experimentos de cultura celular, conhecidos dos especialistas para inativação de expressão de genes, isto é, os oligonucleotídeos de acordo com a invenção são usados como oligonucleotídeos de anti-sentido ou como um componente de ingredientes ativos de siRNA. Nesse caso, as modifica- ções podem ser selecionadas de modo a facilitar a absorção celular e/ou melhorar a ligação ao ácido nucléico-alvo. A inativação da expressão de um respectivo gene alvo pode ser subseqüentemente monitorada por meio de análise de Northern blot, um procedimento de PCR-RT (em uma etapa ou duas etapas de tempo real (RT)), mediante hibridização em apropriados mi- crossistemas.
Além disso, os oligonucleotídeos de acordo com a invenção po- dem ser usados como Iigantes hidrofílicos entre uma unidade detectável e uma proteína ou como uma marcação de uma massa definida. Além disso, bibliotecas de substâncias aptâmeras podem ser estabelecidas, em cujo ca- so é possível se introduzir diversos resíduos R no fosfato durante a síntese, mediante uso de diferentes azidas de sulfonila e azidas de acila ou azidas de heteroarila. Essas bibliotecas podem, então, ser testadas quanto a sua liga- ção a proteínas ou outras biomoléculas. Uma vantagem sobre os aptâmeros conhecidos do estado da técnica é que o processo de acordo com a inven- ção permite um grande número de diferentes e adicionais modificações se- rem produzidas e testadas de uma maneira simples.
A invenção é esclarecida em maiores detalhes mediante os e- xemplos seguintes, publicações e protocolos de seqüências, cujo escopo de proteção é derivado das reivindicações de patente. Os métodos descritos devem ser entendidos como exemplos, que ainda descrevem o objetivo da invenção, mesmo após algumas modificações.
Os exemplos seguintes e a listagem de seqüências são forneci- dos para ajudar no entendimento da presente invenção, cujo verdadeiro es- copo é estabelecido nas reivindicações anexas. Deve ser entendido que po- dem ser feitas modificações nos procedimentos estabelecidos, sem que seja afastado o espírito da invenção.
Exemplo 1
Síntese de um dT(P(=NS02PhNHAc)dT Modificado
A síntese de dímero foi realizada em uma escala de 10 μmol, em um sintetizador ABI 394. Um suporte dT CPG comercialmente disponível foi usado como fase sólida. Todos os produtos químicos para a síntese-padrão foram obtidos da Glen Research.
A solução oxidante convencional contendo iodo foi substituída por uma solução 0,1 M de azida de fenilsulfonila (p-NAc) (Sigma Aldrich) em acetonitrila anidra. O tempo de oxidação foi prolongado para 16 minutos.
O produto foi clivado do suporte por 2 horas à temperatura am- biente com amônia a 33% e separado por cromatografia de fase reversa em uma coluna Poros Oligo R3, de 4,6 χ 50 mm. Cromatografia: tampão A: ace- tato de trietilamônio a 0,1 M em água, pH de 6,8; tampão B: acetato de trieti- lamônio a 0,1 M em água/acetonitrila 1:1, gradiente de 2 minutos, 0% de B a 100% de B em 45 minutos. A absorção de UV do eluente foi medida em 260 nm. Ocorreu uma fração principal que continha o produto desejado. O sol- vente foi removido em uma centrífuga a vácuo. O resíduo foi tomado em á- gua redestilada e foi novamente separado a vácuo. Esse procedimento foi repetido três vezes. O resíduo foi então, dissolvido em água redestilada e liofilizado.
1H RMN: (Bruker DPX 300) em D2O: 7,82 d[2H, aríla], 7,56 d[2H arila], 7,47 s[1H, C6-H], 7,40[1H, C6-H], 6,21 m [1 Η, H1'], 6,21 m [1H, H1'], 6,07 m[1H, H1'3, 4,38 m [1H, H3'], 4,10 [m, 4H, H4', H5'], 2,38-2,24 m [4H, H2'], 2,22 [3H, CH3], 2,16 [3H, CH3], 2,14 [3H, CH3];
31P RMN: (Bruker DPX 300) em D2O: 2,14
Espectroscopia de Massa (ESI-MS): calculado: 742,66; encon- trado: [M-H] 741,73.
Exemplo 2
Síntese de um Oligonucleotídeo T(P(=NSQ2PhNHAc)T9 A síntese de oligonucleotídeo foi realizada em uma escala de 1 μmol, em um sintetizador ABI 394. Um suporte de dT CPG comercialmente disponível foi usado como fase sólida. Todos os produtos químicos para a síntese-padrão foram obtidos da Glen Research.
No primeiro ciclo de síntese, o oxidante contendo iodo foi substi- tuído por uma solução a 0,1 M de azida de fenilsulfonila (p-NAc) (Sigma Al- drich) em acetonitrila anidra. O tempo de oxidação foi prolongado para 16 minutos. A ligação das restantes dT-fosforamiditas foi realizada de acordo com protocolos-padrão.
O produto foi clivado do suporte por 2 horas à temperatura am- biente com amônia a 33% e separado por cromatografia de fase reversa em uma coluna Poros Oligo R3, de 4,6 χ 50 mm. Cromatografia: tampão A: ace- tato de trietilamônio a 0,1 M em água, pH de 6,8; tampão B: acetato de trieti- lamônio a 0,1 M em água/acetonitrila 1:1, gradiente de 2 minutos, 0% de B a 100% de B em 45 minutos. A absorção de UV do eluente foi medida em 260 nm. Ocorreu uma fração principal que continha o produto desejado. O sol- vente foi removido em uma centrífuga a vácuo. O resíduo foi tomado em á- gua redestilada e foi novamente separado a vácuo. Esse procedimento foi repetido três vezes. O resíduo foi, então, dissolvido em água redestilada e liofilizado.
Espectroscopia de Massa (ESI-MS): calculado: 3176,25; encon- trado: [M-H] 3176,0. Exemplo 3
Síntese de um Oliqonucleotídeo marcado com Fluoresceína
AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC fluoresceína-3', em que cada P=O é substituído por P=N-pPh-NAc (SEQ ID NO:4).
A síntese de oligonucleotídeo foi realizada em uma escala de 1 μmol, em um sintetizador ABI 394. Um CPG de fluoresceína LightCycIer co- mercialmente disponível foi usado como fase sólida. Todos os produtos quí- micos para a síntese-padrão foram obtidos da Glen Research. Foram usa- das fosforamiditas com grupos protetores terc-butilfenóxi-acetila (conhecidos como monômeros "tac" ou "Expedite") da Proligo.
O protocolo-padrão foi usado para a síntese, em que o oxidante contendo iodo foi substituído por uma solução a 0,1 M de azida de fenilsulfo- nila (p-NAc) (Sigma Aldrich) em acetonitrila anidra e o tempo de oxidação foi prolongado para 16 minutos.
O produto foi clivado do suporte por 2 horas à temperatura am- biente com amônia a 33% e separado por cromatografia de fase reversa em uma coluna Poros Oligo R3, de 4,6 x 50 mm. Cromatografia: tampão A: ace- tato de trietilamônio a 0,1 M em água, pH de 6,8; tampão B: acetato de trieti- lamônio 0,1 M em água/acetonitrila a 1:1, gradiente de 2 minutos, 0% de B a 100% de B em 45 minutos. A absorção de UV do eluente foi medida em 260 nm. Ocorreu uma fração principal que continha o produto desejado. O sol- vente foi removido em uma centrífuga a vácuo. O resíduo foi tomado em á- gua redestilada e foi novamente separado a vácuo. Esse procedimento foi repetido três vezes. O resíduo foi então, dissolvido em água redestilada e iiofilizado.
Espectroscopia de Massa (ESI-MS): calculado: 11839; encon- trado: [M-H] 11839,9.
Exemplo 4
Síntese de Oliqonucleotídeos Quiméricos em que P=O foi substituído por P=N-Acc em Posições Específicas
A síntese foi realizada em escala de 1 μmοl em um sintetizador ABI 394. A fim de não ter modificação do oxidante durante a síntese, o pro- grama de síntese foi modificado, de modo que a solução N3-Acc possa ser fixada em uma posição básica extra. Devido às limitações da programação, a azida foi reagida juntamente com o atívador. Isto não afetou a modificação. O tempo de reação de N3-Acc com o intermediário de fósforo trivalente foi de 5 minutos.
Todos os produtos químicos para a síntese-padrão foram obti- dos da Glen Research. As fosforamiditas, com grupos de proteção de terc- butilfenóxi-acetila (conhecido como monômeros "tac" ou "Expedite") da Pro- ligo foram usadas. A purificação foi realizada conforme descrito acima.
Suporte: CPG de fluoresceína: N3-Acc; azida de p-Nac- fenilsulfonila (Sigma Aldrich).
As seguintes sondas, cada qual com uma idêntica SEQ ID NO: 4 foram sintetizadas e subseqüentemente analisadas por espectroscopia de massa.
Modificação (SEQ:ID.N0:4) Massa Massa calcula- encon- da trada 5'-AAT ACCTGT ATTCCTÇGCCTGTpl Cfluoresceína-3' 7718 7718,6 5'-Ap1 AT ACCTGT ATTCCTCGCCTGTC fluoresceína-3' 7718 7718,9 5'-AATACCTGp1TATTCCTCp1GCCTGTC-fluoresceína-3' 7915 7914,9 5'-Ap1 Ap1Tp1 Ap1 Cp1 Cp1 Tp1 Gp1Tp1 Ap1 Tp1 TCCTCGCCTGTC- 9681 9681.9 fluoresceína-3' 5'-AATACCTGTATTp1 Cp1 Cp1 Tp1 Cp1 Gp1 Cp1 Cp1 Tp1 Gp1 Tp1 C- 9681 9681,8 fluoresceína-3' 5'-Ap1 Ap1Tp1 ACCTGTATpl Tp1 Cp1 CTCGCCTpl Gp1 Tp1 C- 9288 9289.8 fluoresceína-3'
p1 é um P=N-pPh-NAc mimético Exemplo 5
Marcação de Terminal-3' de acordo com a Invenção a) Preparação de dabsil-azida
0,71 g (2,19 mmols) de cloreto de dabsila foi dissolvido em 10 mL de acetona. Uma solução de 142 mg (2,19 mmols) de azida de sódio em 2 mL de água foi lentamente adicionada em gotas, sob resfriamento em gelo e agitação. A agitação ocorreu durante 2 horas à temperatura de OsC é de- pois durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, uma solução de 32 mg de azida de sódio (0,5 mmol) em 500 μΙ_ de água foi adicionada e agi- tada por 1 hora à temperatura ambiente (TLC, sílica gel, CH2CI2). 200 mL de cloreto de metileno foram depois adicionados à suspensão e esta foi, então, filtrada. O filtrado foi agitado duas vezes com água e uma vez com uma so- lução de carbonato ácido de sódio a 5% e depois duas vezes com água. A fase orgânica separada foi seca sobre sulfato de sódio. O solvente foi remo- vido mediante destilação em um evaporador rotativo a uma temperatura de banho inferior a 20SC. O resíduo foi suspenso em 2 mL de acetonitrila e fil- trado. O resíduo foi lavado com éter.
Rendimento bruto : 280 mg. A azida é usada diretamente no sin- tetizador de DNA ou para preparar um suporte sem posterior purificação. b) Preparação de um Suporte de dabsila para Síntese de Oliqonucleotídeos CPG-1caa-NHC(=O)-CH2-CH2-C(=O)-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-O-P(O-CH2- CH2-CN) (=N-SO2-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe2)-O CH2-CH2-CH2-ODMTr
Uma carga de 1,2 g de CPG ligada a fósforo (49 pmol/g) foi in- troduzida em uma frita de Schlenk e lavada com acetonitrila anidra sob at- mosfera de argônio. Depois, foi lavada com ácido dicloroacético a 0,1 M em cloreto de metileno até o filtrado se tornar incolor. Em seguida, foi intensa- mente lavado com acetonitrila anidra. Após isso, foi lavada com 2 mL de di- cianoimidazol em acetonitrila a 0,25 M (ativador) e 2 mL de ativador e, ime- diatamente, foram usados 2 mL de uma solução a 0,1 M de espaçador C3 fosforamidita. A suspensão foi depois deixada repousar por 3 minutos e foi filtrada sob pressão de argônio. Depois, foi lavada com 2 mL de ativador e, novamente, com 2 mL de ativador e, imediatamente, foram adicionados 2 mL de uma solução a 0,1 M de espaçador C3 fosforamidita. Depois, a prepa- ração foi deixada repousar por 12 minutos. O solvente foi removido mediante filtração sob pressão de argônio, foram adicionados 2 mL de uma solução a 0,1 M de dabsil-azida em cloreto de metileno e a mistura foi deixada repou- sar por 15 minutos. O CPG modificado foi finalmente lavado com 100 mL de cloreto de metileno e depois com 100 mL de acetonitrila anidra e seco a vá- cuo.
c) Síntese de Oligonucleotídeo usando Suporte de dabsila: 5' fluorescein-GCA CCA GAT CCA CGC CCT TGA TGA GC-O-CH2-CH2- CH2-O(O2)Pi=N-SO2-Ph-P-N=N-Ph-P-NMe2)
A síntese de oligonucleotídeo foi realizada em escala de 1 μιηοΙ em um sintetizador ABI 394. O dabsil-CPG do exemplo 5ã foi usado como material de suporte. O produto de 6-carboxifluorescein-fosforamidita (Glen Research, Report No. 10 (GR10-1), (1997), 1-12) foi usado para a marcação do terminal 5'.
Todos os produtos químicos para a síntese-padrão foram obti- dos da Glen Research. Conforme descrito no Exemplo 4, foram usadas as fosforamiditas com grupos de proteção de terc-butilfenóxi-acetila (conhecido como monômeros "tac" ou "Expedite") da Proligo. A síntese foi realizada de acordo com o protocolo-padrão. A clivagem e purificação foi também reali- zada conforme descrito no Exemplo 4.
Espectroscopia de Massa (ESI-MS): calculado 8973; encontrado [M-H]: 8973,1
Exemplo 6
PCR em Tempo Real e Análise de Curva de Fusão
Um procedimento de PCR quantitativo em tempo real de DNA de fator V subseqüente à análise de curva de fusão foi realizado em um instru- mento LightCycIer 1.2® (Roche Diagnostics GmbH), a fim de analisar o efeito de miméticos de fosfato sobre a hibridização. Os iniciadores foram usados em combinação com um par de sondas de hibridização de fluoresceína (Li- ghtCycler Red 640 FRET). Os iniciadores e a sonda de 5' (LightCycIer Red 640) foram mantidas constantes. As diversas sondas de 3'-fIuoresceína mo- dificadas no fosfato do Exemplo 4 e a sonda não-modificada de fluoresceína tomada como referência, foram usadas como sondas doadoras FRET. O efeito com relação ao ponto de cruzamento, que é uma medida para amplia- ção de eficiência, e o efeito com relação ao ponto de fusão foram avaliados.
20 μl de uma mistura reacional de PCR foram preparados como segue, para a amplificação de um fragmento de DNA de fator V.
-106 cópias de um plasmídeo que contém o gene tipo selvagem de fator V e mutantes (Gene Bank Accession No. M_014335);
-13 mM de MgCl2;
- 500 nM de iniciadores tendo as seqüências SEQ ID NO: 1 e 2;
- 200 nM de sondas de hibridização FRET tendo as seqüências SEQ ID NO: 3 e 4
O kit de sondas de DNA LightCycIer Master Hyb (Roche Applied Science, Cat. No. 2158825) foi usado para todos os outros componentes de PCR, de acordo com as instruções do fabricante.
As seguintes seqüências foram usadas como iniciadores e son- das:
SEQ ID NO:1
iniciador dianteiro:
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A
SEQ ID NO:2
iniciador inverso:
5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
SEQ ID NO:3
sonda aceitadora FRET:
5' LC-Red 640 AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT
SEQ ID NO:4
sonda doadora FRET:
5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-fluoresceína
O seguinte programa de temperatura foi usado para a amplifica- ção no LightCycler 1.2 (Roche Applied Science). <table>table see original document page 31</column></row><table>
O monitoramento em tempo real foi realizado durante 45 ciclos usando o segundo método limite derivado, em que o sinal de fluorescência foi medido em um canal de detecção que é específico para a emissão do LigthCycIer Red 640 (em 640 nm) e o modo de correção aritmético de se- gundo plano foi usado para normalizar o sinal inicial.
Após a amplificação, foi realizada uma análise de curva de fusão de acordo com as instruções do manual do instrumento LightCycIer (Roche Applied Sciences).
O seguinte programa de temperatura foi usado:
<table>table see original document page 31</column></row><table>
Os sinais de fluorescência absolutos são medidos conforme a- cima no canal 640 nm e, subseqüentemente, o primeiro derivado foi calcula- do a partir disso.
Os pontos de cruzamento (CP) são mostrados na Tabela seguin- te como uma medida para eficiência de amplificação quando do uso de dife- rentes sondas doadoras modificadas. A tabela também mostra as temperatu- ras de fusão (Tm) medidas de diversas sondas doadoras para a seqüência tipo selvagem (WT) de fator Vea seqüência mutante (mT) de fator V.
Modificação (SEQ ID NO:4) Cp
5' AATACCTGTATTCCTÇGCCTGTC-fluoresceína-3' (ref) 22,11
5' AATACCTGTATTCCTÇGCCTGTpl C fIuoresceína-3' 22.61
5' Ap1 ATACCTGTATTCCTCGCCTGTC fluoresceína-3' 22.51
5' AATACCTGp1TATTCCTCp1GCCTGTC-fluoresceína-3' 22,26
5' Ap1 Ap1Tp1AplCplCp1Tp1Gp1Tp1Ap1 Tp1 TCCTCGCCT 21,40
Tm Tm
wt mt
64,92 56,98
64.32 56.26
64.80 56.80
64,28 55,89
60,69 52,19 <table>table see original document page 32</column></row><table>
p1 é um mimético de P=N-pPh-Nac.
Conforme mostrado na Tabela, o ponto de cruzamento não é significativamente afetado pela introdução de modificações conforme a in- venção, isto é, a eficiência de PCR não é modificada.
Além disso, nenhum efeito é encontrado na temperatura de fu- são medida em caso de sondas modificadas uma ou duas vezes. Além dis- so, sondas multiplamente modificadas apenas exibem uma mudança mode- rada no ponto de fusão, não superior a 4SC, enquanto que a capacidade de discriminação malcombinada é retida.
Exemplo 7
Análise de PCR em tempo real + curva de fusão
a) Preparação de lissamina-azida (= rodamina B)
Uma solução de 195 mg (3,0 mmols) de azida de sódio em 5 mL de água foi adicionada em gotas à temperatura de 0°C a uma solução de 577 mg (1 mmol) de cloreto ácido de sulforrodamina B em 20 mL de aceto- na. A mistura foi agitada por 2 horas à temperatura de 0°C e depois por 6 horas à temperatura ambiente. A mistura foi transferida para um funil de se- paração e foram adicionados 300 mL de água e 300 mL de cloreto de meti- leno. A fase orgânica foi separada e lavada duas vezes com 100 mL de á- gua. A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio. O solvente foi removido mediante destilação em um evaporador rotativo. O resíduo (140 mg) foi usa- do sem qualquer purificação posterior para a síntese de oligonucleotídeos.
b) Síntese de uma sonda aceitadora de FRET de SEQ ID NO:3 Ap*GG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-p p* = P=NS(O)2-rodamina-B
A síntese de oligonucleotídeo foi realizada em uma escala de 1 μmol, em um sintetizador ABI 394. Um CPG (vidro de poro controlado) liga- do a fósforo comercialmente disponível (Glen Research) foi usado como ma- terial de suporte. Todos os produtos químicos para a síntese-padrão foram obtidos da Glen Research. Foram usadas fosforamiditas com grupos proteto- res terc-butilfenóxi-acetila (conhecidos como monômeros "tac" ou "Expedi- te") da Proligo.
O protocolo-padrão (sem tritila) foi usado para a síntese, em que o oxidante no último ciclo foi substituído por uma solução a 0,1 M de azida de lissamina em acetonitrila anidra e o tempo de oxidação foi prolongado para 16 minutos.
O produto foi clivado do suporte por 2 horas à temperatura am- biente com amônia a 33% e separado por cromatografia de fase reversa em uma coluna Poros Oligo R3, de 4,6 χ 50 mm. Cromatografia: tampão A: ace- tato de trietilamônio a 0,1 M em água, pH de 6,8; tampão B: acetato de trieti- lamônio a 0,1 M em água/acetonitrila 1:1, gradiente de 2 minutos, 0% de B a 100% de B em 45 minutos. A absorção de UV do eluente foi medida em 260 nm. Ocorreu uma fração principal que continha o produto desejado. O sol- vente foi removido em uma centrífuga a vácuo. O resíduo foi tomado em á- gua redestilada e foi novamente separado a vácuo. Esse procedimento foi repetido três vezes. O resíduo foi, então, dissolvido em água redestilada e liofilizado.
Espectroscopia de Massa (ESI-MS): calculado: 11710; encon- trado: [M-H] 11710,5.
c) PCR em Tempo Real
A fim de demonstrar a adequabilidade em PCR de tempo real, um procedimento de PCR em tempo real de DNA de fator V foi realizado em um instrumento LightCycIer 2.0. Os iniciadores foram usados em combina- ção com um par de sondas de hibridização FRET fluoresceína/lissamina, em que a lissamina (rodamina B) atuou como um aceitador de FRET. Curvas de quantificação foram registradas e o valor de cp foi determinado como função da concentração do ácido nucléico-alvo.
Uma análise de PCR em tempo real e de curva de fusão foi rea- lizada, de acordo com o Exemplo 6, para a amplificação de 104 e 106 cópias de um fragmento de DNA de fator V. Para isso, foram usadas uma sonda doadora de fluoresceína, de acordo com o Exemplo 6 (SEQ ID No: 4) que não foi posteriormente modificada e uma sonda aceitadora de FRET, de a- cordo com o Exemplo 7b (SEQ ID NO: 3).
<table>table see original document page 34</column></row><table>
O sinal de fluorescência foi medido em um canal de detecção de 610 nm. O modo de correção de segundo plano 610/530 foi usado para , normalizar o sinal bruto. Um valor de cp de 22 foi determinado para 106 có- pias e um valor de cp de 26 foi determinado para 104 cópias.
O ponto de fusão para o tipo selvagem foi determinado nos valo- res de 64,69 0C e 56,24 0C foi determinado como ponto de fusão para o mu- tante (106 cópias).
Exemplo 8
PCR em Tempo Real com Iniciadores Modificados
Um procedimento de PCR quantitativo em tempo real de um DNA humano de fator V foi realizado em um instrumento LightCycIer 1.2® (Roche Diagnostics GmbH), a fim de analisar o efeito dos miméticos de fos- fato com relação ao alongamento do iniciador. O mimético P=N-pPh-NAc foi introduzido em diferentes posições de um par de iniciadores usado para a amplificação de DNA humano de fator V. Os iniciadores modificados foram sintetizados de acordo com o Exemplo 4. A purificação foi feita através de cromatografia de fase reversa, conforme o Exemplo 3, no modo de realiza- ção de Tritila. A destritilação foi executada mediante tratamento com ácido acético a 80%, durante 20 minutos.
Estes iniciadores foram usados em combinação com um par de sondas de hibridização, fluoresceína/LightCycler Red 640 FRET, de acordo com o Exemplo 6. A sonda de fluoresceína e a sonda de 5' LightCycIer Red 640 (Seq. ID. No: 3 e 4) foram mantidas constantes. Diversas combinações de iniciadores modificados e não-modificados foram testadas. Como refe- rência, foram usados iniciadores não-modificados. O efeito com relação ao ponto de cruzamento, que é uma medida para a eficiência de amplificação, foi avaliado.
O monitoramento em tempo real foi realizado durante 45 ciclos usando o segundo método limite derivado, em que o sinal de fluorescência foi medido em um canal de detecção que é específico para a emissão do LigthCycler Red 640 (em 640 nm) e o modo de correção aritmético de se- gundo plano foi usado para normalizar o sinal inicial.
Os sinais absolutos de fluorescência são medidos como acima no canal de 640 nm e, subseqüentemente, o primeiro derivado foi calculado a partir disso. Os pontos de cruzamento são mostrados na Tabela seguinte como uma medida de eficiência de amplificação, quando do uso de diferen- tes iniciadores modificados.
Combinações de Iniciador Cp
SEQIDNO:1
SEQ ID NO:2
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A 20,36
5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCTA 22,08
5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT Ap1 A
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A 22,50
5' TGT TAT CAC ACT GGT Gp1 CT AA
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A 21,36
5' TGT TAT CAC ACT p1 GGT GCT AA
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT p1 A 20,80
5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG p1 GCT A 20,85
5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
5' GAG AGA CAT CGC CTpI C TGG GCT A 20,61
5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT p1 A 21,76
5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT Ap1 A
5' GAG AGA CAT CGC CTpI C TGG p1 GCT A 22,75
5' TGT TAT CAC ACT GGT Gp1 CT AA
5' GAG AGA CAT CGC CTpI C TGG GCT A 21,36
5' TGT TAT CAC ACT p1 GGT GCT AA p1 é um mimético de P=N-pPh-NAc.
Conforme mostrado na Tabela, o ponto de cruzamento não é significativamente afetado pela introdução de modificações de acordo com a invenção, nos iniciadores que mostram que a eficiência do procedimento de PCR é praticamente não-modificada.
Exemplo 9
Síntese de um oligonucleotídeo marcado de fluoresceína compreendendo um mimético de piridínio-fosfato
A síntese de um oligonucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO: 4 foi realizada em uma escala de 1 μιτιοΙ, em um sintetizador ABI 394. Um CPG contendo fluoresceína, LightCycIer, comercialmente disponível (Roche Applied Science) foi usado como material de suporte. Todos os produtos químicos para a síntese-padrão foram obtidos da Glen Research. Foram u- sadas fosforamiditas com grupos protetores terc-butilfenoxi-acetila (conheci- dos como monômeros "tac" ou "Expedite") da Proligo.
O protocolo do Exemplo 4 foi usado para a síntese, enquanto durante o segundo ciclo, foi usado como oxidante uma solução a 0,1 M de 1,2,6-trimetil-piridínio-4-azida (RareChem AQ N6 1054) em acetonitrila ani- dra e o tempo de oxidação foi prolongado para 16 minutos. Isto resultou em um composto intermediário compreendendo a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 36</formula>
O produto foi clivado do suporte por 2 horas à temperatura am- biente com amônia a 33% e separado por cromatografia de fase reversa em uma coluna Poros Oligo R3, de 4,6 χ 50 mm. Cromatografia: tampão A: ace- tato de trietilamônio a 0,1 M em água, pH de 6,8; tampão B: acetato de trieti- lamônio 0,1 M em água/acetonitrila 1:1, gradiente de 2 minutos, 0% de B a 100% de B em 45 minutos. A absorção de UV do eluente foi medida em 260 nm. Ocorreu uma fração principal que continha o produto desejado. O sol- vente foi removido em uma centrífuga a vácuo. O resíduo foi tomado em á- gua redestilada e foi novamente separado a vácuo. Esse procedimento foi repetido três vezes. O resíduo foi então dissolvido em água redestilada e liofilizado.
Espectroscopia de Massa (Maldi-MS, Applied Biosystems Voya- ger System 6327): calculado: 7641,32; encontrado: [M-H] 7639,59 . Exemplo 10
Estabilidade de um dinucleotídeo dA(P(=NS02PhNHAc)dT. em comparação com um dAdT não-modificado em diferentes temperaturas e pH
O dA(P(=NSO2PhNHAc)dT foi sintetizado e purificado de acordo com o Exemplo 1. O dAdT foi também sintetizado de acordo com o Exemplo 1, porém, foram usados agentes oxidantes padrões (iodo a 0,02 M em THF).
Os dímeros foram expostos em diferentes tempos e temperatu- ras em um tampão de Tris a 10 mM, em diferentes valores de pH, 7,0, 8,0 e 9,0. As amostras foram deixadas à temperatura ambiente (aproximadamente 24°C) por 24 horas ou sob a temperatura de 95°C por 60 minutos, respecti- vamente. Frações de 150 μL foram removidas antes e depois do experimen- to e volumes de 100 pL foram injetados no procedimento de HPLC.
A decomposição foi monitorada por cromatografia de HPLC de fase reversa em uma coluna analítica X-Bridge (2,5pm, diâmetro interno de 4,6 χ 50 mm) com um módulo de separação Waters 2690. A detecção foi realizada em um detector Waters 2996 PAD (260 nm). Uma fase móvel de acetato de trietilamômio a 0,1 M (pH 6,8), bombeada com um gradiente de acetonitrila a 95%, a uma vazão de 1,0 mL/min, foi usada. A velocidade de destruição dos dímeros foi julgada por monitoramento do tempo de retenção (tr) do sinal de dímero (Software Millenium, Waters) e determinação da ocor- rência de picos adicionais com diferentes tempos de retenção daquele do dímero de nucleotídeo. Os resultados são mostrados na Tabela seguinte: <table>table see original document page 38</column></row><table>
O dímero não-modificado foi estável em um pH 7,0, 8,0 e 9,0 durante 24 horas à temperatura ambiente, por 1 hora à temperatura de 95°C e iniciou a decomposição após 16 horas em um pH 7,0 e pH 8,0. O dímero modificado foi estável em um pH 7,0, 8,0 e 9,0 durante 24 horas à tempera- tura ambiente, por 1 hora à temperatura de 95°C e iniciou a decomposição após 16 horas em um pH 7,0. Listagem de Seqüências
<110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Polinucleotídeo contendo um fosfato mimético
<130> WO 23428
<150> EP 05025499
<151> 2005-11-23
<160> 4
<170> Patentln versão 3.2
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> iniciador
<400> 1
gagagacatc gcctctgggc ta 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> iniciador
<400> 2
tgttatcaca ctggtgctaa 20
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> sonda
<400> 3 agggatctgc tcttacagat tagaagtagt cctatt 36 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> sonda <400> 4
aatacctgta ttcctcgcct gtc 23
Claims (9)
1. Composto químico, o qual contém, pelo menos uma vez, a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 41</formula> na qual: - A representa o terminal 5' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeos ou representa um Iigante ligado a uma fase sólida; e - B representa o terminal 3' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeos; - D é OH OU CH3; e - Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elétrons substituído por um resíduo R e R é qualquer substituinte orgânico, e Acc é selecionado do grupo que consiste em: (i) - CN; (ii) - SO2-R1, em que R1 contém pelo menos um grupo alquila substituído por amino, um grupo arila opcionalmente substituído ou um hete- rociclo opcionalmente substituído; (iii) N+-heterociclo de seis membros, em que pelo menos um á- tomo de nitrogênio é alquilado e localizado na posição orto ou para, dito he- terociclo sendo selecionado de um grupo que consiste em piridínio, pirimidínio e quinolínio.
2. Composto químico de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que R ou R1 individualmente ou em combinação com o aceitador de elétrons contém uma unidade detectável ou um grupo funcional.
3. Oligonucleotídeo de acordo com as reivindicações 1 e 2, ca- racterizado pelo fato de que AeB juntos compreendem pelo menos dois resíduos de nucleotídeo.
4. Processo para produzir um oligonucleotídeo modificado, ca- racterizado pelo fato de que um derivado de fósforo trivalente, de estrutura química: <formula>formula see original document page 42</formula> - em que E representa um grupo metila ou um grupo hidroxila protegido, - em que A representa o terminal 5' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeos ou representa um Iigante ligado a uma fase só- lida, e - em que B representa o terminal 3' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeos ou representa um ligante, é reagido com uma azida da seguinte estrutura: N=N=N-Acc1 - em que Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elé- trons substituído por um resíduo R, e R é qualquer substituinte orgânico, e Acc é preferivelmente selecionado do grupo que consiste em: (i) -CN; 1 (ii) -SO2-R', em que R1 contém pelo menos um grupo alquila substituído por amino, um grupo arila opcionalmente substituído ou um hete- rociclo opcionalmente substituído; (iii) N+-heterociclo de seis membros, em que pelo menos um á- tomo de nitrogênio é alquilado e localizado na posição orto ou para, dito he- terociclo sendo selecionado de um grupo que consiste em piridínio, pirimidí- nio e quinolínio.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, compreendendo as seguintes etapas: a) reagir uma 3'-fosforamidita com o terminal 5'-OH de uma ca- deia nascente de oligonucleotídeos; e, em seguida, b) reação com uma azida da seguinte estrutura: N=N=N-Acc, em que Acc é um aceitador de elétrons ou um aceitador de elétrons substitu- ído por um resíduo R, e R é qualquer substituinte orgânico, e Acc é selecio- nado do grupo que consiste em: (i) -CN; (ii) -SO2-R', em que R1 contém pelo menos um grupo alquila substituído por amino, um grupo arila opcionalmente substituído ou um hete- rociclo opcionalmente substituído; (iii) N+-heterociclo de seis membros, em que pelo menos um á- tomo de nitrogênio é alquilado e localizado na posição orto ou para, dito he- terociclo sendo selecionado de um grupo que consiste em piridínio, pirimidí- nio e quinolínio.
6. Processo de acordo com as reivindicações 4 e 5, em que R ou R' é uma unidade detectável.
7. Uso de um oligonucleotídeo como definido nas reivindicações 1 a 3, como um parceiro de hibridização.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, como uma sonda de hibridização.
9. Uso de acordo com a reivindicação 7, para inativar a expres- são de gene em um experimento de cultura celular.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP05025499.4 | 2005-11-23 | ||
| EP05025499A EP1801114B8 (de) | 2005-11-23 | 2005-11-23 | Polynukleotid mit Phosphatmimetikum |
| PCT/EP2006/008842 WO2007059816A1 (en) | 2005-11-23 | 2006-09-12 | Polynucleotide containing a phosphate mimetic |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0618833A2 true BRPI0618833A2 (pt) | 2011-09-13 |
| BRPI0618833B1 BRPI0618833B1 (pt) | 2015-06-16 |
Family
ID=36128618
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0618833-8A BRPI0618833B1 (pt) | 2005-11-23 | 2006-09-12 | Polinucleotídeo contendo um fosfato mimético, oligonucleotídeo, seu uso e processo de produção |
| BRPI0618855-9A BRPI0618855A2 (pt) | 2005-11-23 | 2006-11-21 | reagente de marcação de polinucleotìdeo |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0618855-9A BRPI0618855A2 (pt) | 2005-11-23 | 2006-11-21 | reagente de marcação de polinucleotìdeo |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7741472B2 (pt) |
| EP (3) | EP1801114B8 (pt) |
| JP (2) | JP5155177B2 (pt) |
| KR (2) | KR101028980B1 (pt) |
| CN (2) | CN101312985B (pt) |
| AT (2) | ATE443072T1 (pt) |
| AU (1) | AU2006317195B2 (pt) |
| BR (2) | BRPI0618833B1 (pt) |
| CA (2) | CA2627208C (pt) |
| DE (2) | DE502005008153D1 (pt) |
| ES (2) | ES2332139T3 (pt) |
| WO (1) | WO2007059816A1 (pt) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003064621A2 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Ambion, Inc. | HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES |
| WO2003064626A2 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Sequitur, Inc. | Double-stranded oligonucleotides |
| US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
| DE502005008153D1 (de) | 2005-11-23 | 2009-10-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Polynukleotid mit Phosphatmimetikum |
| CA2676115C (en) | 2007-04-18 | 2011-09-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleotide with an alpha-phosphate mimetic |
| US8906306B2 (en) | 2009-04-09 | 2014-12-09 | Roche Molecular Systems, Inc. | Fluid transfer control for real-time PCR |
| US8674080B2 (en) | 2009-04-09 | 2014-03-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Dye composition for liquid transfer control |
| ES2645754T3 (es) | 2009-07-30 | 2017-12-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjunto de sondas de oligonucleótidos así como métodos y usos relacionados con el mismo |
| SG10201408401RA (en) | 2009-09-16 | 2015-01-29 | Genentech Inc | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
| AR080793A1 (es) | 2010-03-26 | 2012-05-09 | Roche Glycart Ag | Anticuerpos biespecificos |
| JP5845270B2 (ja) | 2010-10-22 | 2016-01-20 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | チオフィリック固相およびチオオキソヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの間のコンジュゲート |
| EP2655413B1 (en) | 2010-12-23 | 2019-01-16 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery |
| CN103384825B (zh) | 2010-12-23 | 2017-05-24 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 通过二价结合剂检测经翻译后修饰的多肽 |
| CA2817448C (en) | 2010-12-23 | 2019-01-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Binding agent |
| JP5913363B2 (ja) | 2010-12-23 | 2016-04-27 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 二価結合剤によるポリペプチド二量体の検出 |
| ES2472965T3 (es) | 2011-03-04 | 2014-07-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nuevo tipo de sondas universales para la detección de variantes gen�micas |
| KR101411013B1 (ko) * | 2011-12-01 | 2014-06-23 | 제일모직주식회사 | (메타)아크릴로일 이미노포스파젠계 화합물, 그 제조방법 및 이를 포함한 공중합체 |
| CN104105711B (zh) | 2012-02-10 | 2018-11-30 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 单链抗体及其他异多聚体 |
| MX2014014065A (es) | 2012-06-27 | 2015-02-04 | Hoffmann La Roche | Metodo para la seleccion y produccion de moleculas terapeuticas hechas a la medida, selectivas y multiespecificas que comprenden al menos dos diferentes entidades de direccionamiento y usos de las mismas. |
| MX2014014804A (es) | 2012-06-27 | 2015-02-12 | Hoffmann La Roche | Metodo para la elaboracion de conjugados de la region fc de anticuerpos que comprenden por lo menos una entidad de union que se une especificamente a un objetivo y usos del mismo. |
| HK1207864A1 (zh) | 2012-06-27 | 2016-02-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | 用於选择并产生含有至少两种不同结合实体的定制高度选择性和多特异性靶向实体的方法及其用途 |
| US9382581B2 (en) * | 2012-12-13 | 2016-07-05 | Roche Molecular Systems, Inc. | Primers with modified phosphate and base in allele-specific PCR |
| RU2708237C2 (ru) | 2014-08-22 | 2019-12-05 | Общество с ограниченной ответственностью "НооГен" | Модифицированные олигонуклеотиды и способ их получения |
| ES2764111T3 (es) | 2014-12-03 | 2020-06-02 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos multiespecíficos |
| JPWO2017111137A1 (ja) * | 2015-12-22 | 2018-10-18 | 味の素株式会社 | オリゴヌクレオチドの製造方法 |
| RU2740501C2 (ru) * | 2017-02-21 | 2021-01-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, АКТИВИРУЮЩИЕ РНКазу Н |
| EP3630199A4 (en) | 2017-06-02 | 2021-11-10 | Wave Life Sciences Ltd. | OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS FOR THEIR USE |
| CA3065523A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods of use thereof |
| AU2019252680B2 (en) | 2018-04-12 | 2025-11-06 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods of use thereof |
| SG11202010910QA (en) | 2018-05-07 | 2020-12-30 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Extrahepatic delivery |
| JP7427608B2 (ja) | 2018-05-11 | 2024-02-05 | ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッド | オリゴヌクレオチド組成物及びその使用方法 |
| US11384376B2 (en) | 2018-05-31 | 2022-07-12 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reagents and methods for post-synthetic modification of nucleic acids |
| CN114555621B (zh) * | 2019-08-15 | 2025-10-28 | Ionis制药公司 | 键修饰的寡聚化合物及其用途 |
| US20260085087A1 (en) * | 2020-10-12 | 2026-03-26 | Maxim Sergeevich Kupryushkin | Chemical compound comprising a triazine group and method for producing same |
| WO2025070241A1 (ja) * | 2023-09-25 | 2025-04-03 | 藤本化学製品株式会社 | 化合物又はその塩、並びにその製造方法 |
| AU2024369609A1 (en) * | 2023-10-31 | 2025-12-11 | Korro Bio, Inc. | Oligonucleotides comprising phosphoramidate internucleotide linkages |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3792025A (en) * | 1972-12-15 | 1974-02-12 | Upjohn Co | Novel compounds and process |
| US4031068A (en) * | 1976-07-26 | 1977-06-21 | Uniroyal Inc. | Non-migratory sulfonyl azide antioxidants |
| US5260433A (en) | 1982-06-23 | 1993-11-09 | Enzo Diagnostics, Inc. | Saccharide specific binding system labeled nucleotides |
| US5241060A (en) | 1982-06-23 | 1993-08-31 | Enzo Diagnostics, Inc. | Base moiety-labeled detectable nucleatide |
| US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
| US5002885A (en) | 1984-01-30 | 1991-03-26 | Enzo Biochem, Inc. | Detectable molecules, method preparation and use |
| US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
| US5231191A (en) | 1987-12-24 | 1993-07-27 | Applied Biosystems, Inc. | Rhodamine phosphoramidite compounds |
| WO1989009221A1 (en) | 1988-03-25 | 1989-10-05 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates |
| US4997928A (en) | 1988-09-15 | 1991-03-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
| US5118801A (en) | 1988-09-30 | 1992-06-02 | The Public Health Research Institute | Nucleic acid process containing improved molecular switch |
| US5141813A (en) | 1989-08-28 | 1992-08-25 | Clontech Laboratories, Inc. | Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis |
| US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5290925A (en) | 1990-12-20 | 1994-03-01 | Abbott Laboratories | Methods, kits, and reactive supports for 3' labeling of oligonucleotides |
| JPH06102267A (ja) * | 1992-09-18 | 1994-04-15 | Japan Organo Co Ltd | 非イオン界面活性剤の分析方法 |
| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| US5624711A (en) | 1995-04-27 | 1997-04-29 | Affymax Technologies, N.V. | Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis |
| DE69725611T2 (de) | 1996-05-15 | 2004-07-29 | Biogenex Laboratories, San Ramon | Nicht-Nukleotid verknüpfende Reagentien |
| JP4281877B2 (ja) | 1996-06-04 | 2009-06-17 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | 生物学的プロセスを実行し且つモニタリングするためのシステムと方法 |
| DE19650252C2 (de) | 1996-12-04 | 2002-01-17 | Univ Dresden Tech | Verfahren zum Färben von Filamenten, Fasern und Garnen, natürlicher oder synthetischer Herkunft und von Kunststoffen in Folienform |
| JPH11140488A (ja) * | 1997-11-05 | 1999-05-25 | Nippon Shokubai Co Ltd | 洗剤ビルダーおよび洗剤組成物 |
| US6255476B1 (en) | 1999-02-22 | 2001-07-03 | Pe Corporation (Ny) | Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports |
| US6303774B1 (en) | 1999-08-20 | 2001-10-16 | Sri International | Nucleoside pyrophosphate and triphosphate analogs and related compounds |
| TWI287536B (en) * | 2000-04-18 | 2007-10-01 | Ind Tech Res Inst | Method for preparing azide photo-initiators |
| ATE332398T1 (de) | 2000-08-11 | 2006-07-15 | Univ Utah Res Found | Einfach markierte oligonukleotidsonden |
| WO2003002587A2 (en) | 2001-06-29 | 2003-01-09 | Micrologix Biotech Inc. | Phosphoramide containing nucleic acid-based compounds and libraries as antivirals |
| KR101092043B1 (ko) * | 2002-04-22 | 2011-12-12 | 바이오니취 라이프 사이언시즈 인코포레이티드 | 올리고뉴클레오티드 조성물 및 면역 반응 조절시 이의 용도 |
| DE502005008153D1 (de) | 2005-11-23 | 2009-10-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Polynukleotid mit Phosphatmimetikum |
-
2005
- 2005-11-23 DE DE502005008153T patent/DE502005008153D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2005-11-23 AT AT05025499T patent/ATE443072T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-11-23 ES ES05025499T patent/ES2332139T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2005-11-23 EP EP05025499A patent/EP1801114B8/de not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-09-12 WO PCT/EP2006/008842 patent/WO2007059816A1/en not_active Ceased
- 2006-09-12 KR KR1020087012000A patent/KR101028980B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-12 AT AT06791985T patent/ATE478087T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-09-12 CA CA2627208A patent/CA2627208C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-12 ES ES06791985T patent/ES2349129T3/es active Active
- 2006-09-12 EP EP06791985A patent/EP1954707B1/en active Active
- 2006-09-12 AU AU2006317195A patent/AU2006317195B2/en not_active Ceased
- 2006-09-12 BR BRPI0618833-8A patent/BRPI0618833B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-09-12 CN CN200680043667.3A patent/CN101312985B/zh active Active
- 2006-09-12 JP JP2008541599A patent/JP5155177B2/ja active Active
- 2006-09-12 DE DE602006016325T patent/DE602006016325D1/de active Active
- 2006-11-21 CA CA2627216A patent/CA2627216C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-21 KR KR1020087012296A patent/KR101032008B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-21 CN CN2006800434199A patent/CN101312941B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-21 JP JP2008541627A patent/JP5364380B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-21 EP EP06818687A patent/EP1954671B1/en not_active Not-in-force
- 2006-11-21 BR BRPI0618855-9A patent/BRPI0618855A2/pt not_active Application Discontinuation
-
2008
- 2008-05-16 US US12/121,842 patent/US7741472B2/en active Active
- 2008-05-20 US US12/123,656 patent/US7795423B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101028980B1 (ko) | 포스페이트 모방체를 함유하는 폴리뉴클레오티드 | |
| AU2017317568B2 (en) | Tagged nucleotides useful for nanopore detection | |
| JP2818650B2 (ja) | トリスヒドロキシメチルエタン化合物 | |
| CN101547928B (zh) | 合成和纯化寡核苷酸的化合物和方法 | |
| BRPI0706586A2 (pt) | sìntese de oligonnucleotìdeos usando ligantes fotocliváveis | |
| JP2006501250A (ja) | オリゴヌクレオチドの分離及び脱保護方法 | |
| AU2006316903B8 (en) | Polynucleotide labelling reagent | |
| HK1126224B (en) | Polynucleotide containing a phosphate mimetic | |
| HK1126183B (en) | Polynucleotide labelling reagent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 12/09/2006, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
|
| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 13A ANUIDADE. |
|
| B24J | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12) |
Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2531 DE 09-07-2019 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |