BRPI0619606A2 - anticorpos anti-mn e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

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Gerald Ranges
Lila Adnane
Timothy Mccabe
Pamela Trail
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Abstract

ANTICORPOS ANTI-MN E MéTODOS DE USO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a anticorpos que têm um sítio de ligação antigênico especificamente dirigido contra uma proteína MN e métodos para uso de tais anticorpos no tratamento e diagnóstico de um distúrbio MN-relacionado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ANTI-MN E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS".
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. Ns 60/749.716 depositado em 12 de Dezembro de 2005.
O pedido precedente e todos os documentos citados no mesmo e todos os documentos citados ou mencionados no mesmo e todos os do- cumentos citados ou mencionados aqui ("documentos aqui citados") e, todos os documentos citados ou mencionados em documentos citados aqui, junto com quaisquer instruções de fabricante, descrições, especificações de pro- duto e folhas de dados de produto para quaisquer produtos mencionados aqui ou em qualquer documento incorporado por referência aqui, são aqui incorporados por referência e podem ser empregados na prática da inven- ção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
1. Campo da Invenção
A presente invenção se refere a anticorpos e/ou fragmentos dos mesmos tendo especificidade pela proteína MN. A invenção ainda se refere à composições de anticorpo e/ou imunoconjugado e a seu uso no tratamen- to, prevenção e/ou diagnóstico de distúrbios MN-relacionados, por exemplo, câncer.
2. Antecedentes
A ocorrência de câncer está mais comumente associada ao en- velhecimento, pelo que 65% de todos os novos casos de câncer são regis- trados para pacientes com idade de 65 anos e mais. O câncer é a segunda causa que leva à morte nos Estados Unidos, superado apenas pela doença cardíaca. Na verdade, a American Gancer Society estimou que 1 em 4 pes- soas morrerão de câncer nos Estado Unidos, admitindo que as taxas de mortalidade atuais permaneçam estáticas. Nos Estado Unidos apenas, 1.399.790 novos casos e 564.830 mortes por câncer são esperadas em 2006. Espera-se que a maioria desses novos casos sejam cânceres do có- lon (106.680), pulmão (172.570) e mama (214.640). Além disso, a incidência e prevalência de câncer são previstas como aumentando aproximadamente 15% nos próximos 10 anos, refletindo uma taxa média de crescimento de 1,4% (American Câncer Society, 2006).
Descobriu-se que um antígeno associado ao tumor recentemen- te identificado, MN, uma proteína na superfície celular, é expresso em uma série de carcinomas clínicos. Por exemplo, descobriu-se que MN é ectopi- camente expresso em 100% de carcinomas de células renais (Liao, SY, Câncer Res., 1997, 57: 2827-2831), 100% de carcinomas do esôfago (Tur- ner JR, Hum. Pathol., 199, 28: 740-744), mais de 90% de carcinomas cervi- cais (Liao, SY, Câncer Res., 1997, 57: 2827-2831), 76% de carcinomas ma- lignos do cólon (Saarnio, J. e colaboradores, Am. J. Path., 1997, 153: 279- 285), 80% de carcinomas de pulmão de células não-pequenas (Vermylen P. e colaboradores, Eur. Respir. J., 1999, 14: 806-811) e em 48% dos cânceres de mama (Chia SK e colaboradores, J. Clin. Oncol., 2001, 19: 3660-3668).
Assim como outros antígenos associado a tumors, a proteína MN também está presente sobre células de um número limitado de tecidos normais inclu- indo, por exemplo, estômago mucosa do duto biliar e as células normais al- tamente proliferativas localizadas no intestino delgado (Saarnio J. e colabo- radores, J. Histochem. Cytochem., 1998, 46: 497-504).
cDNA de MN humana foi clonado e seqüenciado (Pastorek e colaboradores, Oncogene, 1994, 9: 2877-2888). A proteína prevista consiste em um peptídeo sinalizador, uma seqüência relacionada a proteoglicana, um domínio de anidrase carbônica (anidrase carbônica IX ou CA IX), um seg- mento transmembrana e uma cauda intracelular curta. O domínio de anidra- se carbônica IX catalisa a hidratação reversível de dióxido de carbono em ácido carbônico. Essa atividade pode ter um papel na regulação da acidifica- ção local da porção extracelular dos ambientes do tumor as qual pode, con- seqüentemente, levar à ativação de proteases e, finalmente, metástases.
A regulação de expressão de MN também foi investigada. Em um aspecto, por exemplo, expressão de MN é super-regulada por hipóxia. O complexo transcricional conhecido como fator-1 hipóxia-induzível (HIF-1) é um regulador de expressão de MN. Conseqüentemente, MN é conhecida como um gene responsivo ao. HIF-1 o qual tem implicações na compreensão da resposta do tumor à hipóxia (Wykoff CC e colaboradores, Câncer Res., 2000, 60: 7075-7083). Além disso, expressão de MN se correlaciona com os níveis de hipóxia no tumor e é um indicador prognóstico de sobrevivência global e sobrevivência sem metástase em câncer cervical (Loncaster, JA e colaboradores, Câncer Res., 2000, 60: 7075-7083). Expressão de MN tam- bém se correlaciona com uma alta densidade média de vaso, estágio avan- çado de câncer, grau de necrose em carcinoma de cabeça e pescoço (Beas- Iey NJP e colaboradores, Câncer Res., 2001, 61: 5262-5267), pobre sobrevi- vência em carcinoma nasofaringial (Hui EP e colaboradores, Clin. Câncer Res., 2002, 8: 2595-2604), necrose de tumor, maior grau, estado negativo do receptor de estrogênio, maior taxa de reincidência e pobre sobrevivência para carcinoma de mama invasivo (Chia SK e colaboradores, J. Clin. Oncol., 2001, 19: 3660-3668). Portanto, expressão de antígeno MN se correlaciona com pobre prognóstico de sobrevivência e cânceres de maior grau.
Terapias novas e aperfeiçoadas para esses cânceres agressi- vos, em particular, aquelas que objetivam a expressão de MN, são altamente desejáveis e representariam um avanço na técnica. Como tal, a presente invenção divulga novas composições de anticorpo e imunoconjugados do mesmo que são úteis no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de cânce- res MN-relacionados.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a anticorpos, por exemplo, anti- corpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo que se ligam à proteína na 25 superfície celular MN e os quais podem ser usados no tratamento, preven- ção e/ou diagnóstico de câncer. Os anticorpos da invenção podem ser ainda conjugados a agentes citotóxicos, por exemplo, monometil Iauristatina-E e/ou co-administrados ou formulados com um ou mais agentes anticâncer adicionais. Os anticorpos e imunoconjugados anti-MN da invenção podem ser usados nos métodos da invenção para tratar e/ou diagnosticar e/ou mo- nitorar cânceres, por exemplo, tumores sólidos.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou uma composição que inclui o anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento tem um sítio de ligação antígeno que é especificamente dirigido contra uma proteína MN. O sítio de ligação antigênica pode incluir pelo menos uma CDR1, CDR2 ou CDR3 ou uma CDR1 junto com uma CDR2 ou uma CDR3 ou uma CDR2 junto com uma CDR 1 ou uma CDR3 ou uma CDR3 junto com uma CDRI ou CDR 2 ou qualquer combinação das mesmas. A CDR1 pode ser selecio- nada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 77, 80, 81, 86, 87, 88, 89, 98, 99, 104, 107 e 108. A CDR2 pode ser selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 78, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 100, 101, 105, 109 e 110. A CDR3 pode ser selecionada do gru- po consistindo em SEQ ID NOS: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 79, 84, 85, 94, 95, 96, 97, 102, 103, 106, 111 e 112. As seqüências de CDR desse aspecto da invenção também podem incluir seqüências de aminoácido que têm, de preferência, mais de cerca de 80% de identidade de seqüência, mais preferi- velmente mais de cerca de 85% de identidade de seqüência, ainda mais pre- ferivelmente cerca de 90% de identidade de seqüência, ainda mais preferi- velmente cerca de 95% ou mesmo cerca de 99% identidade de seqüência e mesmo até cerca de 100% identidade de seqüência com qualquer uma das seqüências indicadas acima para cada uma das CDR1, CDR2 ou CDR3.
Em outro aspecto, o sítio de ligação antigênica pode ter uma CDR de região variável de cadeia pesada que é selecionada do grupo con- sistindo em: SEQ ID NOS: 57-85 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% de identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 57-85.
O sítio de ligação antigênica também pode ter uma CDR de re- gião variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOS: 86-112 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% de identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 86-112.
O sítio de ligação antigênica também pode ser selecionado de um conjunto de seqüências de CDR específicas que incluem os seguintes conjuntos de seis CDRs: (a) [3ee9] SEQ ID NOS: 57, 63, 70, 89, 93 e 97;
(b) [3ef2] SEQ ID NOS: 58, 64, 71, 107, 109 e 111;
(c) [1e4] SEQ ID NOS: 59, 65, 72, 107, 109 e 111;
(d) [3a4] SEQ ID NOS: 60, 66, 73, 108, 110 e 112;
(e) [3ab4] SEQ ID NOS: 61, 67, 74, 87, 91 e 95;
(f) [3ah10] SEQ ID NOS: 61, 68, 75, 88, 92 e 96;
(g) [3bb2] SEQ ID NOS: 62, 69, 76, 98, 100 e 102;
(h) [1 aa1 ] SEQ ID NOS: 77, 78, 79, 86, 90 e 94;
(i) [5a6] SEQ ID NOS: 80, 82, 84, 99, 101 e 103; e
(j) [5aa3] SEQ ID NOS: 81, 83, 85, 104, 105 e 106.
O sítio de ligação antigênica também pode incluir um conjunto de seqüências de CDR de cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em:
(a) [3ee9] SEQ ID NOS: 57, 63 e 70;
(b) [3ef2] SEQ ID NOS: 58, 64 e 71;
(c) [1 e4] SEQ ID NOS: 59, 65 e 72;
(d) [3a4] SEQ ID NOS: 60, 66 e 73;
(e) [3ab4] SEQ ID NOS: 61, 67 e 74;
(f) [3ah10] SEQ ID NOS: 61, 68 e 75;
(g) [3bb2] SEQ ID NOS: 62, 69 e 76;
(h) [1aa1] SEQ ID NOS: 77, 78 e 79;
(i) [5a6] SEQ ID NOS: 80, 82 e 84; e
(j) [5aa3] SEQ ID NOS: 81, 83 e 85.
O sítio de ligação antigênica também pode incluir um conjunto de seqüências de CDR de cadeia leve selecionadas do grupo consistindo em:
(a) [3ee9] SEQ ID NOS: 89, 93 e 97;
(b) [3ef2] SEQ ID NOS: 107, 109 e 111;
(c) [1e4] SEQ ID NOS: 107, 109 e 111;
(d) [3a4] SEQ ID NOS: 108, 110 e 112;
(e) [3ab4] SEQ ID NOS: 87, 91 e 95;
(f) [3ah10] SEQ ID NOS: 88, 92 e 96; (g) [3bb2] SEQ ID NOS: 98, 100 e 102;
(h) [1 aa1 ] SEQ ID NOS: 86, 90 e 94;
(i) [5a6] SEQ ID NOS: 99, 101 e 103; e
(j) [5aa3] SEQ ID NOS: 104, 105 e 106.
Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de anticorpo que tem um sítio de ligação antigênica que contém um par de regiões variável de cadeia pesada e variável de ca- deia leve selecionada do grupo consistindo em:
(a) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 133 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 134;
(b) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 135 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 136;
(c) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 137 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 138;
(d) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 139 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 140;
(e) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 141 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 142;
(f) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 143 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 144;
(g) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 145 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 146;
(h) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 147 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 148;
(i) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 149 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 150; e
(j) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 151 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 152.
Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo da invenção podem se ligar à proteína MN com uma constante de dissociação de preferência de cerca de 0,15 nM a cerca de 50 nM.
Em outro aspecto, os anticorpos ou fragmentos da invenção são anticorpos de IgG ou fragmentos de IgG. Os anticorpos ou fragmentos tam- bém pode ser anticorpos de IgGI, lgG2a, lgG2b, lgG3, IgM1 IgD, IgE, IgA ou IgM, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos com cadeia simples, anticorpos multiespecíficos, anticorpos biespecíficos ou anticorpos quiméricos (por e- xemplo, compreendendo uma armação de anticorpo humano enxertada so- bre uma região de ligação de anticorpo humana ou não-humana ou uma ar- mação de anticorpo não-humano enxertada em uma região de ligação de anticorpo humana ou não-humana). Os anticorpos quiméricos podem incluir, por exemplo, regiões de armação de anticorpo de fontes não-humanas tais como, por exemplo, vaca, camundongo, lhama, camelo ou coelho. Informa- ção adicional sobre a manipulação de anticorpos pode ser encontrada na literatura, por exemplo, Holliger e Hudson, Nature Biotechnology, (Set. de 2005) 23: 1126-1136, o qual é incorporado aqui por referência. Os fragmen- tos antes mencionados podem ser obtidos de uma imunoglobulina ou produ- zidos através de um meio adequado, por exemplo, expressão recombinante, em uma forma de fragmento.
Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo da invenção também podem ser humanizados, em que as seqüências ou regiões de CDR (por exemplo, CDR1, CDR2, CDR3) podem ser não-humanas, por exemplo, de murino.
Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo da invenção ou com- posições incluindo os anticorpos ou fragmentos, podem incluir um agente citotóxico que é conjugado ao anticorpo ou fragmento. Em um aspecto, o agente citotóxico é monometil auristatina-E (MMAE), contudo, outros agen- tes citotóxicos também são proporcionados, os quais podem incluir, por e- xemplo, análogos funcionais de MMAE (por exemplo, monometil auristatina- F) e outros agentes citotóxicos, por exemplo, aplidina, azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicina, bortezomib, briostatina-1, bussulfan, calicheamicina, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucil, cisplatina, irinotecan (CPT-1 1), SN-38, carboplatina, cladribina, ciclofosfa- mida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, glucuronida de dau- nomicina, daunorrubicina, dexametasona, dietilestilbestrol, doxorrubicina, glucuronida de doxorrubicina, glucuronida de epirrubicina, etinil estradiol, estramustina, etoposídeo, glucuronida de etoposídeo, fosfato de etoposídeo, floxuridina (FUdR)1 3',5'-O-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, fluorouracila, fluoximesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiuréia, idarrubicina, ifosfamida, L-asparaginase, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de medroprogesterona, acetato de megestrol, mel- phalan, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mi- tramicina, mitomicina, mitotano, butirato de fenila, prednisona, procarbazina, paclitaxel, pentostatina, PSI-341, semustina estreptozocina, tamoxifeno, ta- xanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, te- niposídeo, topotecan, mostarda de uracila, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricina, abrina, ribonuclease, onconase, rapLRI, DNase I, Entero- toxina-A Estafilocócica, proteína antiviral de pokeweed, gelonina,toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas e endotoxina de Pseudomonas ou com- binações dos mesmos. Qualquer um dos agentes citotóxicos também pode incluir análogos funcionais dos mesmos.
As composições da invenção podem incluir, além dos anticorpos e fragmentos (com ou sem os agentes citotóxicos conjugados antes mencio- nados) vários agentes anticâncer, os quais podem incluir, por exemplo, ble- omicina, docetaxel (Taxotere), doxorrubicina, edatrexato, erlotinib (Tarceva), etoposídeo, finasterida (Proscar), flutamida (Eulexin), gemcitabina (Gemzar), genitinib (Irresa), acetato de goserelina (Zoladex), granisetron (Kytril), imati- nib (Gleevec), irinotecan (Campto/Camptosar), ondansetron (Zofran), pacli- taxei (Taxol), pegaspargase (Oncaspar), cloridrato de pilocarpina (Salagen), porfímero sódico (Photofrin), interleucina-2 (Proleukin), rituximab (Rituxan), topotecan (Hycamtin), trastuzumab (Herceptin), Triapina, vincristina e tartrato de vinorelbina (NaveIbine) ou anticorpos terapêuticos ou fragmentos dos mesmos ou agentes antiangiogênicos tais como, por exemplo, angiostatina, bevacizumab (Avastin®), sorafenib (Nexavar®), baculostatina, canstatina, maspina, anticorpos ou peptídeos anti-VEGF, anticorpos ou peptídeos antifa- tor de crescimento placentário, anticorpos anti-Flk-1, anticorpos ou peptídeos anti-Flt-1, peptídeos de laminina, peptídeos de fibronectina, inibidores de ativador de plasminogênio, inibidores de metaloproteinase tecidual, interfe- rons, interleucina 12, IP-10, Gro-β, trombospondina, 2-metóxioestradiol, pro- teína proliferina-relacionada, carboxiamidotriazol, CM101, Marimastat, polis- sulfato de pentosana, angiopoietina 2, interferon-alfa, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina de 16K, Linomida, talidomida, pento- xifilina, genisteína, TNP-470, endostatina, paclitaxel, acutina, cidofovir, vin- cristina, bleomicina, AGM-1470, fator 4 de plaqueta ou minociclina.
A presente invenção ainda proporciona, em outro aspecto, um método para tratamento de um distúrbio MN-relacionado através de adminis- tração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos anticorpos e/ou fragmentos da invenção ou uma composição da invenção a qual inclui os anticorpos e/ou fragmentos da invenção. O distúrbio MN-relacionado podem incluir, por exemplo, câncer, tal como um câncer de tumor sólido. O tumor sólido pode estar em ou ser originário da mama, trato respiratório, pulmão, cérebro, órgão reprodutivo, trato digestivo, cólon, trato urinário, rim, esôfago, cérvix, olho, fígado, pele, cabeça, pescoço, tiróide e paratireóide.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de diagnóstico de um distúrbio MN-relacionado caracterizado por níveis a- normais de MN compreendendo comparação do nível de MN em uma célula ou tecido que se suspeita estar doente com o nível de MN em uma célula ou tecido saudável correspondente, em que um nível anormal de MN na célula ou tecido que se suspeita estar doente é uma indicação de um distúrbio MN- relacionado, a referida etapa de comparação ainda compreendendo detec- ção, através de imunoensaio, do nível de MN no tecido doente e no tecido saudável com os anticorpos ou fragmentos de anticorpo da invenção.
Em um aspecto particular, a invenção proporciona um método de diagnóstico de um distúrbio MN-relacionado onde o imunoensaio inclui as etapas de: (a) detecção do nível de proteína MN no tecido saudável; (b) de- tecção do nível de proteína MN no tecido que se suspeita estar doente; e (c) comparação dos níveis de proteína MN de (a) e (b). Um nível elevado de proteína MN no tecido que se suspeita estar doente, quando comparado com o nível de proteína MN no tecido saudável, é indicativo da presença de um distúrbio MN-relacionado.
Também proporcionado pela presente invenção é um kit com- preendendo os anticorpos ou fragmentos de anticorpo da invenção ou, alter- nativamente, uma composição da invenção e um conjunto de instruções pa- ra uso do kit em um método de tratamento de um distúrbio MN-relacionado ou para diagnóstico de um distúrbio MN-relacionado.
Essas e outras modalidades são descritas ou são óbvias a partir de e abrangidas pela Descrição Detalhada a seguir. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A descrição detalhada a seguir, fornecida à guisa de exemplo, mas não destinada a limitar a invenção unicamente às modalidades especí- ficas descritas, pode ser melhor entendida em conjunto com os desenhos em anexo, nos quais:
a figura 1 representa seqüências de DNA das regiões de deter- minação de complementaridade de anticorpo (CDRs);
a figura 2 representa as seqüências de proteína das regiões de determinação de complementaridade de anticorpo (CDRs);
a figura 3 representa as seqüências de DNA de regiões variáveis de cadeias leve e pesada de anticorpo específicas, cada uma das quais con- tém regiões de CDR e framework-,
a figura 4 representa seqüências de proteína de regiões variá- veis de cadeia leve (VL) e pesada (VH) de anticorpo específicas, cada uma das quais contém as regiões de CDR e frameworlç,
a figura 5 representa as propriedades de ligação-MN para os anticorpos de MN da presente invenção;
a figura 6 representa a prevenção de adesão de células tumorí- genas à lâminas revestidas com MN produzidas através de incubação com um anticorpo anti-MN;
a figura 7 representa a atividade antitumor in vivo em um modelo de xenoenxerto compreendendo o tumor MaTu resultante de tratamento com um imunoconjugado compreendendo o anticorpo monoclonal anti-MN 1e4; a figura 8 representa a medição, através de FACS, da ligação de um anticorpo anti-MN à linhagem de células PC3mm2 a qual expressa a pro- teína MN sobre sua superfície;
a figura 9 representa esquematicamente o conjugado de anticor- po (anticorpo anti-MN conjugado a MMAE);
a figura 10a mostra plotagens por FACS representando a ligação de 3ee9/MMAE à células MN+ (MaTu)1 mas não à células MN-(DLD);
a figura 10b mostra plotagens por FACS representando a ligação do imunoconjugado 1E4 à células MN+ (PC3mm2), mas não à células MN- (DLD);
a figura 10c mostra plotagens por FACS representando a ligação do imunoconjugado 1aa1 à células MN+ (PC3mm2), mas não à células MN- (DLD);
a figura 11a mostra imagens por imunofluorescência represen- tando a internalização de 3ee9/MMAE por células MN+ e a falta de internali- zação por células MN-. 3ee9/MMAE internalizado é mostrado como fluores- cência;
a figura 11b mostra imagens por imunofluorescência represen- tando a internalização do imunoconjugado 1E4 por células MN+ e a falta de internalização por células MN-. O imunoconjugado 1E4 internalizado é mos- trado como fluorescência;
a figura 12 mostra uma imunoblot representando a imunoprecipi- tação específica de proteínas na superfície celular biotiniladas por anticorpos de MN;
a figura 13a representa graficamente a citotoxicidade de 3ee9/MMAE contra MN+, mas não contra células MN-;
figura 13b representa graficamente a citotoxicidade do imuno- conjugado 1E4 contra MN+, mas não contra células MN-;
a figura 13c representa graficamente a citotoxicidade do imuno- conjugado 1aa1 contra MN+, mas não contra células MN-;
a figura 14 mostra imagens por imunofluorescência representan- do a prevenção, por 3ee9/MMAE, da formação de fuso normal através de inibição de tubulina;
a figura 15 representa graficamente a eficácia antitumor de 3ee9/MMAE contra xenoenxertos MaTu;
a figura 16 representa graficamente a eficácia antitumor do imu- 5 noconjugado 1E4 contra tumores de mama MaTu estabelecidos;
a figura 17 representa graficamente a eficácia antitumor do imu- noconjugado 1aa1 contra xenoenxertos MaTu;
a figura 18 representa graficamente o índice terapêutico (TI) de 3ee9/MMAE contra xenoenxertos MaTu;
a figura 19 representa graficamente a eficácia antitumor de 3ee9/MMAE e MMAE livre contra xenoenxertos HT-29;
a figura 20 representa graficamente a eficácia antitumor de 3ee9/MMAE contra xenoenxertos HT-29, seguindo o esquema Q7Dx2;
a figura 21 representa graficamente a eficácia antitumor de 3ee9/MMAE contra xenoenxertos HT-29, seguindo o esquema Q1 Dx1;
a figura 22 representa graficamente a eficácia antitumor de 3ee9/MMAE contra xenoenxertos PC3mm2;
a figura 23 representa graficamente a eficácia antitumor de 3ee9/MMAE contra xenoenxertos Colo-205;
a figura 24 representa graficamente a eficácia antitumor de 3ee9/MMAE contra xenoenxertos HCT-15;
a figura 25 representa graficamente a eficácia antitumor de 3ee9/MMAE contra xenoenxertos MIAPaca2MN- (no gráfico à esquerda) e MN+ (no gráfico à direita);
as figuras 26a e 26b representam graficamente a eficácia anti- tumor de 3ee9/MMAE em combinação com Xeloda® contra xenoenxertos Colo-205 CRC em doses variadas;
a figura 27 mostra imagens por imunofluorescência representan- do a localização in vivo de 3ee9 em tumores huMN- MIAPaca2 e MIAPaca2;
a figura 28 mostra imagens por imunofluorescência (de amostras histológicas) representando a inibição por 3ee9/MMAE de polimerização de tubulina em xenoenxertos HT-29 CRC em duas doses; e a figura 29 mostra a seqüência de nucleotídeo completa da regi- ão de inserção do vetor de expressão de mamífero 3ee9m-i pCMVucoe8 (vide Exemplo 21)_o qual codifica um anticorpo de IgG humana anti-MN compre- endendo as regiões variáveis de CDR kappa e pesada de SEQ ID NOS: 126 e 125, respectivamente, obtido a partir do vetor 3ee9pMORPHx9 (vide E- xemplos 1-3). SEQ ID NO: 153.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Deve ser entendido que a presente invenção, conforme descrito aqui, não está limitada aos detalhes em particular apresentados aqui com relação a qualquer aspecto da presente invenção, incluindo anticorpos anti- MN, imunoconjugados, métodos de tratamento, protocolos, linhagens de cé- lulas, espécies ou gêneros de animal, estruturas e reagentes descritos e, como tal, pode variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é para fins de descrição de modalidades particulares apenas e não se destina a limitar o escopo da presente invenção.
Definições
A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o significado comumente compreendido por a- queles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. As referên- cias a seguir, contudo, podem proporcionar àqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence uma definição geral de muitos dos termos usados na presente invenção e podem ser mencionadas e usadas, na medi- da em que tais definições sejam consistentes com o significado comumente entendido na técnica. Tais referências incluem, mas não estão limitadas a, Singleton e colaboradores, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991); e Lackie e colaboradores, The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3a ed. 1999); e Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman e Pober, 2a Edição, W.B. Saunders Company. Quaisquer recursos técnicos adicionais disponíveis para aqueles versados na técnica que proporcionam definições de termos usados aqui tendo o significado comumente entendido na técnica podem ser consultados. Para fins da presente invenção, os termos a seguir são ainda definidos. Termos adicionais são definidos em alguma parte na descrição.
Conforme usado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um(a)M e "a(o)" incluem a referência no plural, a menos que o contexto oriente claramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a "um gene" é uma referência a um ou mais genes e inclui equivalentes dos mesmos conhecidos por aqueles versados na técnica e assim por diante.
Conforme usado aqui, o termo "anticorpo" inclui moléculas de imunoglobulina (por exemplo, qualquer tipo, incluindo IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY e/ou qualquer classe, incluindo IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e lgA2) isoladas da natureza ou preparadas através de meios recombinantes. Anti- corpos também se destinam a abranger fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno, tais como Fab, F(ab')2, scFv (Fvs de cadeia simples), Fv, anti- corpos com cadeia simples, diacorpos, Fvs dissulfeto-ligados (sdFv) e frag- mentos compreendendo um domínio Vl ou Vh, os quais são preparados a partir de imunoglobulinas intactas ou preparados através de meios recombi- nantes.
Os anticorpos e/ou fragmentos de anticorpo de ligação a antíge- no da presente invenção podem ser monoespecíficos (por exemplo, mono- clonais) biespecíficos, triespecíficos ou de uma maior multiespecificidade. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epitopos de um antígeno ou podem ser específicos para epitopos de mais de um an- tígeno. Veja, por exemplo, publicações PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt e colaboradores, 1991, J. Immunol. 147: 60 69; Patentes U.S. N25 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny e colaboradores, 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553, cada um dos quais é incorporado aqui por referência.
Fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno podem compre- ender a(s) região(ões) variável(eis) sozinha(s) ou em combinação com a to- talidade ou uma porção dos seguintes: região de dobradiça, domínios CH1, CH2, CH3 e CL. Também incluídos na invenção são fragmentos de anticor- po de ligação a antígeno também compreendendo qualquer combinação de região(ões) variável(eis) com uma região de dobradiça, domínios CH1, CH2, CH3 e CL.
De preferência, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno são humanos, humanizados, de murino (por exemplo, camundongo e rato) burro, ovelha, coelho, cabra, porco-da-índia, camelídeo, cavalo ou galinha. Conforme usado aqui, anticorpos "humanos" incluem an- ticorpos tendo a seqüência de aminoácido de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de uma biblioteca de imunoglobulina humana, de células B humanas ou de animais transgênicos para uma ou mais imuno- globulinas humanas, conforme descrito infra e, por exemplo, na Pat. U.S. Ns 5.939.598 para Kucherlapati e colaboradores. O termo anticorpo também se estende à outras armações de proteína que são capazes de orientar insertos de CDR de anticorpo na mesma conformação de ligação ativa conforme a- quela encontrada em anticorpos naturais, de modo que a ligação do antíge- no alvo observada com essas proteínas quiméricas seja mantida com rela- ção à atividade de ligação do anticorpo natural do qual as CDRs foram deri- vadas.
Conforme usado aqui, o termo formas "humanizadas" de anti- corpos não-humanos (por exemplo, de murino) são anticorpos quiméricos os quais contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Em sua maioria, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (an- ticorpo-recipiente) nas quais resíduos de região hipervariável (por exemplo, as regiões de determinação de complementaridade "CDR") do recipiente são substituídos por resíduos de região hipervariável (CDRs) de uma espécie não-humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou pri- mata não-humano, tendo a especificidade, afinidade e capacidade deseja- das. Em alguns casos, resíduos de região de framework (FR) da imunoglo- bulina humana podem ser substituídos por resíduos não-humanos corres- pondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resí- duos os quais não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Tais modificações são feitas para refinar adicionalmente o desem- penho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado pode compreender substancialmente todos de pelo menos um ou, tipicamente, dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões hipervariá- veis correspondem àquelas de imunoglobulina não humana e todas subs- tancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência de imunoglobuli- na humana. O anticorpo humanizado também pode compreender, opcional- mente, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para uma revisão, vide Jones e colaboradores, (Nature 321: 522-525, 1986); Reichmann e co- laboradores, (Nature 332: 323-329, 1988); e Presta (Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992). O preparo de anticorpos humanizados pode ser encontrado nas Patentes U.S. Nes 7.049.135, 6.828.422, 6.753.136, 6.706.484, 6.696.248, 6.692.935, 6.667.150, 6.653.068, 6.300.064, 6.294.353 e
Conforme usado aqui, o termo fragmentos de anticorpo com "Fv de cadeia simples" ou "sFv" compreende domínios Vh e Vlde um anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma cadeia polipeptídica. Ge- ralmente, o polipeptídeo de Fv ainda compreende um Iigante polipeptídico entre os domínios Vh e Vl , o que permite que o sFv forme a estrutura dese- jada para ligação a antígeno. Para uma revisão, vide Pluckthun (The Phar- macoloqy of Monoclonal Antibodies. Vol. 113, Rosenburg e Moore eds. S- pringer-Verlag, New York, páginas 269-315, 1994), o qual é incorporado aqui em sua totalidade por referência.
O termo "diacorpos" se refere a pequenos fragmentos de anti- corpo com dois sítios de ligação a antígeno, fragmentos os quais compreen- dem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia polipeptídica (Vh-Vl). Usando um Iigante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de liga- ção a antígeno. Diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger e colaboradores (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448, 1993), cada um dos quais é incorporado por refe- rência.
A expressão "anticorpos lineares se refere aos anticorpos descri- tos na técnica, por exemplo, em Zapata e colaboradores (Protein Eng. 8(10): 1057-1062, 1995), o qual é incorporado por referência. Resumidamente tais anticorpos compreendem um par de segmentos Fd aleatórios (Vh-Ch1-Vh- CH1) o qual forma um par de regiões de ligação a antígeno. Anticorpos linea- res podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.
O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, se refere a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogê- neos, isto é, anticorpos individuais compreendendo uma população idêntica, exceto quanto à possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades mínimas. Anticorpos monoclonais são alta- mente específicos, isto é, dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste à preparados de anticorpo convencionais (policlonais) os quais, tipicamente, incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante sobre o antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser construído como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método em particular. Por exem- plo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos através do método de hibridoma primeiro descrito por Kohler e colaboradores (Nature 256: 495, 1975) ou podem ser feitos a- través de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente U.S. Ne 4.816.567). Anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibli- otecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson e colaboradores (Nature 352: 624-628, 1991) e Marks e colabora- dores (J. Mol. Biol. 222: 581 -597, 1991).
Os anticorpos monoclonais aqui, também incluem anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica à ou homóloga à seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico à ou homólogo à seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, na medida em que eles exibam a ativi- dade biológica desejada (vide, por exemplo, Patente U.S. N9 4.816.567; e Morrison e colaboradores Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855, 1984, cada um dos quais incorporado por referência.
Conforme usado aqui, os termos "amostra biológica" ou "amos- tra do paciente", conforme usado aqui, se referem a uma amostra obtida de um organismo ou de componentes (por exemplo, células) de um organismo. A amostra pode ser de qualquer tecido ou fluído biológico. A amostra pode ser uma "amostra clínica" a qual é uma amostra derivada de um paciente. Tais amostras incluem, mas não estão limitadas a, escarro, sangue, soro, plasma, células sangüíneas (por exemplo, células brancas), amostras de tecido, amostras de biopsia, urina, fluído peritoneal e fluído pleural, saliva, sêmen, exudato da mama, fluído cérebro-espinhal, lágrimas, muco, linfa, citosóis, ascita, fluído amniótico, lavagens da bexiga e lavagens brônquio- alveolares ou células das mesmas, dentre outras amostras de fluido corpo- ral. As amostras do paciente podem ser frescas ou congeladas e podem ser tratadas com heparina, citrato ou EDTA. Amostras biológicas também po- dem incluir seções de tecidos, tais como seções congeladas tomadas para fins histológicos.
O termo "câncer" inclui, mas não está limitado a, tumores sóli- dos, tais como cânceres da mama, trato respiratório, cérebro, órgãos repro- dutivos, trato digestivo, trato urinário, olho, fígado, pele, cabeça e pescoço, tiróide, paratiróide e suas metástases distantes. O termo também inclui sar- comas, linfomas, Ieucemias e mielomas de células plasmáticas.
Exemplos de câncer de mama incluem, mas não estão limitados a, carcinoma dutal invasivo, carcinoma Iobular invasivo, carcinoma dutal in situ e carcinoma Iobular in situ. Exemplos de cânceres do trato respiratório incluem, mas não estão limitados a, carcinoma de pulmão de célula pequena e célula não pequena, bem como adenoma brônquico e blastoma pleuro- pulmonar. Exemplos de cânceres do cérebro incluem, mas não estão limita- dos a, glioma hipotalâmico e do tronco cerebral, astrocitoma cerebelar e ce- rebral, meduloblastoma, ependimona, bem como tumor da pineal e neuroec- todérmico. Tumores dos órgãos reprodutivos femininos incluem, mas não estão limitados a, câncer endometrial, cervical, ovariano, vaginal e vulvar, bem como sarcoma do útero. Tumores dos órgãos reprodutivos masculinos incluem, mas não estão limitados a, câncer de próstata e testicular. Tumores do trato digestivo incluem, mas não estão limitados a, cânceres anal, de co- lón, corretal, esofageal, da vesícula biliar, gástrico, pancreático, retal, do in- testino delgado e da glândula salivar. Tumores do trato urinário incluem, mas não estão limitados a, cânceres da bexiga, pênis, rim, pélvis, ureter e uretral. Cânceres do olho incluem, mas não estão limitados a, melanoma intraocular e retinoblastoma. Exemplos de cânceres do fígado incluem, mas não estão limitados a, carcinoma hepatocelular (carcinomas de células hepáticas com ou sem variante fibrolamelar), colangiocarcinoma (carcinoma do duto biliar intra-hepático) e colangiocarcinoma hepatocelular misturado. Cânceres de pele incluem, mas não estão limitados a, carcinomas de células escamosas, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, câncer de pele de células de Mer- kell e câncer de pele de não-melanoma. Cânceres de cabeça e pescoço in- cluem, mas não estão limitados a, câncer laringeal/hipofarin- geal/nasofaringeal/orofaringeal e câncer do lábio e da cavidade oral. Linfo- mas incluem, mas não estão limitados a, linfoma AIDS-relacionado, linfoma não-Hodgkin, linfoma cutâneo de células T, doença de Hodgkin e linfoma do sistema nervoso central. Sarcomas incluem, mas não estão limitados a, sar- coma de tecidos moles, osteosarcoma, hitiocitoma fibroso maligno, linfosar- coma e rhabdomiosarcoma. Leucemias incluem, mas não estão limitadas a, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogênea crônica e leucemia de células pilosas.
Conforme usado na presente invenção, o termo "epitopo" signifi- ca qualquer determinante antigênico sobre um antígeno, por exemplo, prote- ína MN, ao qual o anticorpo se liga através de um sítio de ligação antigênica. Determinantes ou determinantes antigênicos usualmente consistem em a- grupamentos na superfície quimicamente ativos de moléculas tais como a- minoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas.
O termo "especificamente" imunorreativo se refere a uma reação de ligação entre um anticorpo e uma proteína composto ou antígeno, tendo um epitopo reconhecido pelo sítio de ligação antigênica do anticorpo. Essa reação de ligação é determinativa da presença de uma proteína antígeno ou epitopo tendo o epitopo reconhecido entre a presença de uma população heterogênea de proteínas e outros produtos biológicos. No contexto de um imunoensaio, anticorpos especificamente imunoreativos podem se ligar a uma proteína tendo o epitopo reconhecido e se ligar, se houver, até um grau detectavelmente menor, à outras proteínas carecendo do epitopo as quais estão presentes na amostra. Em um contexto in vivo, "especificamente imu- norreativo) pode se referir à condições sob as quais, em um animal, formam uma resposta imune contra uma vacina ou antígeno, por exemplo, uma res- posta humoral ao antígeno (a produção de anticorpos, contra uma vacina, proteína, composto ou antígeno apresentado ao mesmo sob as condições imunologicamente reativas) ou uma resposta célula-mediada (também aqui uma "resposta celular imune", isto é, uma resposta mediada por linfócitos T contra a vacina, proteína, composto ou antígeno apresentado aos mesmos.
Conforme usado aqui, o termo "condições imunologicamente reativas" é usado no contexto de um imunoensaio ou uma reação in vitro, em que as condições físicas da reação incluindo, por exemplo, a temperatu- ra, concentração de sal, pH, reagentes e suas concentrações e as concen- trações de antígeno e anticorpo cognato que é especificamente imunorreati- vo ao antígeno, são proporcionadas ou ajustadas para permitir ligação do anticorpo cognato ao antígeno. Condições imunologicamente reativas são dependentes do formato da reação de ligação de anticorpo e, tipicamente, são aquelas utilizadas em protocolos de imunoensaio. Veja, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para uma descrição de formatos e condições de imunoensaio.
O termo "paciente" ou "indivíduo", conforme usado aqui, inclui mamífero (por exemplo, seres humanos e animais). Anticorpos
A presente invenção se refere a anticorpos que se ligam à MN. Esses anticorpos podem ser úteis para uma variedade de fins terapêuticos e diagnósticos.
Geralmente, será apreciado por aqueles versados na técnica que a maioria dos determinantes clínicos de seletividade e atividade de Iiga- ção de anticorpo são as seqüências e conformações resultantes das regiões de determinação de complementaridade (CDRs). A maioria dos anticorpos contém seis CDRs, três dentro da região variável de cadeia pesada (VH) e três dentro da região variável de cadeia leve (VL). As seqüências interveni- entes entre as CDRs dentro de VH e VL são regiões de framework as quais orientam as CDRs. As CDRs juntas formam os sítios de ligação antigênica dentro de anticorpos. O papel crítico dessas CDRs na determinação das propriedades funcionais dos anticorpos foi explicado nos processos de hu- manização de anticorpo e otimização de anticorpo. No primeiro processo, as CDRs de um anticorpo monoclonal, por exemplo, um anticorpo de camun- dongo, são transferidas para um anticorpo humano com design de frame- work similar, desse modo, resultando em um anticorpo com as mesmas pro- priedades funcionais e imunogenicidade reduzida no homem.
O sucesso desse processo é evidente a partir da série de anti- corpos humanizados que têm sido comercializadas com sucesso como pro- dutos terapêuticos humanos e incluem Herceptin® (trastuzumab, Genentech, Inc., South San Francisco, CA), Synagis® (palivizumab, Medimmune, Inc., Gaithersburg, MD), Campath® (alemtuzumab, Genzyme Oncology, Cambrid- ge, MA), Zenapax® (daclizumab, Roche Pharmaceuticlas, Nutley, NJ), Xola- ir® (omalizumab, Genentech, Inc., South San Francisco, CA), Raptiva® (efali- zumab, Genentech, Inc., South San Francisco, CA), Avastin® (bevacizumab, Genentech, Inc., South San Francisco, CA) e Mylotarg® (gemtuzumab ozo- gamicina, Wyeth-Ayerst, Madison, NJ). Outros exemplos foram descritos em Singer e colaboradores (J. Immunol, 150: 2844-2857, 1993); Luo e colabora- dores (J. Immunol Meth., 275: 31-40, 2002); e Kostelny e colaboradores (Int. J. Câncer 93;556-565, 2001).
O processo de otimização de anticorpo se focaliza sobre aper- feiçoamentos na seletividade ou afinidade de ligação do anticorpo através de alteração específica nas seqüências das CDRs. É bem-aceito dentro do campo de desenvolvimento de anticorpo que as CDRs codificam proprieda- des de afinidade e seletividade requeridas para usos terapêuticos e diagnós- ticos e essas seqüências de CDR podem ser usadas para conferir tais pro- priedades funcionais desejadas a uma ampla variedade de frameworks de anticorpo alternativas usando procedimentos padrões conhecidos por aque- les versados na técnica. Também é possível transferir a atividade de ligação a anticorpo através de enxertagem de CDRs de anticorpo sobre outras pro- teínas que possuem duplicações similares à imunoglobulina, tais como ou- tras proteínas dentro da superfamília de imunoglobulina e não- imunoglobulinas com duplicações similares à imunoglobulinas (Nicaise e colaboradores, Protein Science 13: 1882-1891, 2004).
A presente invenção considera qualquer tecnologia conhecida ou adequada para o preparo dos anticorpos e fragmentos de ligação a antí- geno da invenção.
Por exemplo, a tecnologia de phage display é útil para obtenção de anticorpos anti-MN de alta afinidade ou fragmentos de anticorpo de liga- ção a antígeno da invenção para uso em diagnóstico e/ou tratamento de um distúrbio MN-relacionado, tal como um câncer MN-relacionado. A tecnologi- a, referida como maturação por afinidade emprega mutagênese ou walking de CDR e resseleção usando o antígeno MN para identificar anticorpos que se ligam com maior afinidade ao antígeno quando comparado com o anti- corpo inicial ou precursor (vide, por exemplo, Glaser e colaboradores, 1992, J. Immunology 149: 3903). Fazendo mutagênese de códons inteiros ao invés de um único nucleotídeo, resulta em um repertório semi-aleatório de muta- ções de aminoácido. Bibliotecas podem ser construídas consistindo em um reservatório de clones variantes, cada um dos quais difere por uma única alteração de aminoácido em uma única CDR e o qual contém variantes re- presentando cada possível substituição de aminoácido para cada resíduo de CDR. Mutantes com afinidade de ligação aumentada pelo antígeno podem ser selecionados através de contato com os mutantes imobilizados contendo antígeno rotulado. Qualquer método de seleção conhecido na técnica pode ser usado para identificar anticorpos mutantes com avidez aumentada pelo antígeno (por exemplo, ELISA) (vide Wu e colaboradores, 1998, Proc Natl. Acad. Sei. USA 95: 6037; Yelton e colaboradores, 1995, J. Immunology 155: 1994,incorporados por referência). Walking de CDR também pode ser usado para randomizar a cadeia leve (vide Schier e colaboradores, 1996, J. Mol. Βiο. 263: 551, incorporado por referência).
Em um exemplo particular, MorphoSys AG (Alemanha) propor- ciona uma tecnologia de fago - anticorpo que pode ser usada para gerar anticorpos completamente humanos. A biblioteca Morphosys HuCAL GOLD proporciona uma série de avanços com relação às versões anteriores da tecnologia (Knappik e colaboradores, J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000, incorpo- rado por referência), incluindo a biblioteca HuCAL-Fab 1 descrita em Rau- chenberger e colaboradores, (J. Biol. Chem. 278: 38194-38205, 2003, incor- porado por referência). Assim como versões anteriores, HuCAL GOLD in- corpora um design de anticorpo humano que se caracteriza por seqüências de frameworkóe consenso humanas e padrões de variabilidade de CDR que imitam a diversidade de seqüência humana natural. Contudo, a diversidade é aumentada em HuCAL GOLD para incluir todas as seis CDRs de anticor- po. Além disso, a recuperação de anticorpos de alta afinidade é aumentada através da característica CysDisplay® (Kretzschmar e von Ruden, Curr. O- pin. Biotechnol. 13: 598-602, 2002). Anticorpos derivados com essa tecnolo- gia exibem uma probabilidade grandemente reduzida de imunogenicidade.
As tecnologias de phage display, tais como aquelas disponíveis da Morphosys, são conhecidas na técnica e referência pode ainda ser feita a Boehncke WH e colaboradores, Br J Dermatol. (2005), Novembro; 153(5): 1092; Simon Moroney e colaboradores, Modern Biopharmaceuticals; Editado por J. Knaeblein, WiIey-VCH Verlag (2005); Ralf Ostendorp e colaboradores, Antibodies, Volume 2: Novel technologies and therapeutic use, páginas 13- 52, (2004), Kluwer Academic/Plenum Publishers1 New York; R. Rauchenber- ger e colaboradores, J Biol Chem., (2003), 3 de Outubro, 278(40): 38194- 38205; T. Kretzschmar e colaboradores, Curr Opin Biotechnol., (2002), 13 de Dezembro(6): 598-602; Krebs B e colaboradores J Immunol Methods, (2001), 1 de Agosto 254(1-2); M. Marget e colaboradores, Tissue Antigens, (2000), 56: 1-9; A. Knappik e colaboradores, J. Mol Biol., (2000), 11 de Feve- reiro 296 (1): 57-86; e A. Plückthun e colaboradores, Immunotechnology, (1997), 3 de Junho (2): 83-105, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em suas totalidades.
Como um exemplo, anticorpos com atividade de ligação à MN e neutralização de adesão celular podem ser identificados usando a tecnologia MorphoSys. A proteína MN pode ser revestida sobre uma lâmina de microti- tulação ou um conta magnético e incubada com a biblioteca de fago de Fab MorphoSys HuCAL-GOLD. Fabs fago-ligados que não se ligam à MN podem ser lavados da lâmina, deixando apenas fagos que se ligam à MN. O fago ligado pode ser eluído através da adição de um agente de redução de tiol, tal como ditiotreitol (DTT), resultando na clivagem da ligação de dissulfeto que liga o anticorpo ao fago. A população recuperada de fago pode ser enrique- cida com fago expressando fragmentos de anticorpo de ligação à MN e pode ser amplificada através de infecção de hospedeiros E. coli. Esse processo de "panning" pode ser repetido usando a população enriquecida do fago pa- ra enriquecer adicionalmente uma população dos anticorpos fago-ligados que se ligam à MN. A seqüência de gene que codifica os Fabs pode, então, ser excisada usando técnicas padrões de clonagem e transferida para um vetor de expressão, tal como um vetor de expressão bacteriano (por exem- plo, E. coli) ou um vetor de expressão de mamífero, o qual é usado para transformar uma linhagem de célula hospedeira, tal como uma linhagem de célula de expressão CHO ou E. coli. Fabs do reservatório enriquecido po- dem, então, ser expressos e purificados.
Alternativamente, "panning" pode ser realizado usando células que expressam MN como antígeno. Por exemplo, células transfectadas com antígeno MN podem ser rotuladas com biotina. Essas células transfectadas podem, então, ser misturadas com células não transfectadas com proteína MN não rotuladas em uma proporção de rotulada para não rotulada de 1:10. A biblioteca de fago é adicionada às células e as células trazendo MN biotini- ladas são capturadas com contas magnéticos revestidos com estreptavidina que são ligados a um imã. Fagos não específicos são lavados e as células trazendo MN são especificamente eluídas através de remoção do campo magnético. Esses fagos especificamente ligados podem ser amplificados para ciclos adicionais de "panning" de célula ou podem ser alternadas com "panning"de peptídeo e/ou proteína.
Anticorpos podem ser produzidos através de uma variedade de outras técnicas, conforme descrito abaixo. Por exemplo, outra abordagem para obtenção de anticorpos é selecionar uma biblioteca de DNA de células B, conforme descrito por Dower e colaboradores, (WO 91/17271, incorpora- do por referência) e McCafferty e colaboradores, (WO 92/01047) (cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade). Nesses métodos, bibliotecas de fago são produzidas nas quais membros mostram diferentes anticorpos sobre suas superfícies externas. Anticorpos são, usualmente, vi- sualizados como fragmentos Fv ou Fab. Anticorpos de visualização de fago são selecionados através de enriquecimento por afinidade com relação à ligação a uma proteína selecionada.
Em uma variação do método de phage display, anticorpos hu- manos tendo a especificidade de ligação de um anticorpo de murino selecio- nado podem ser produzidos (por exemplo, WO 92/20791, incorporado por referência). Nesse método, a região variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo de murino selecionado (por exemplo, 5C7.29) pode ser usada co- mo um material de iniciação. Se, por exemplo, uma região variável de cadeia leve é selecionada como o material de iniciação, uma biblioteca de fago po- de ser construída, na qual membros mostram a mesma região variável de cadeia leve (isto é, o material de inserção de murino) e uma região variável de cadeia pesada diferente. As regiões variáveis de cadeia pesada podem ser obtidas de uma biblioteca de regiões variáveis de cadeia pesada huma- nas reestruturadas. Um fago mostrando forte ligação específica por uma pro- teína (por exemplo, pelo menos 10 nM ou pelo menos 1 nM) é selecionado. A região variável de cadeia pesada humana desse fago, então serve como um material de iniciação para construção de uma outra biblioteca de fago. Nessa biblioteca, cada fago mostra a mesma região variável de cadeia pe- sada (isto é, a região identificada da primeira biblioteca de visualização) e uma região de variável de cadeia leve diferente. As regiões variáveis de ca- deia leve podem ser obtidas de uma biblioteca de regiões variáveis de ca- deia leve humanas reestruturadas. Novamente, fagos mostrando forte Iiga- ção específica são selecionados.
Como outro exemplo, anticorpos também podem ser produzidos usando a metodologia de trioma. A abordagem básica e um parceiro de fu- são celular exemplificativo SPAZ-4, para uso nessa abordagem foram des- critos por Oestberg e colaboradores, (Hybridoma 2: 361-367, 1983; Patente U.S. N° 4.634.664, cada um dos quais incorporado por referência); e Engle- man e colaboradores, (Patente U.S. N° 4.634.666, incorporado por referên- cia). As linhagens de células que produzem anticorpo são denominadas tri- omas, porque elas descendem de três células - duas humanas uma de ca- mundongo. Inicialmente, uma linhagem de mieloma de camundongo é fundi- da com um linfócito B humano para obter uma célula híbrida xenogenêica que não produz anticorpo, tal com a linhagem de célula SPAZ-4. A célula xenogenêica é, então, fundida com um linfócito B humano imunizado para obter uma linhagem de célula de trioma que produz anticorpo. Descobriu-se que triomas produzem anticorpos mais estavelmente do que hibridomas co- muns feitos de células humanas.
Os linfócitos B são obtidos do sangue, baço, nódulos linfáticos ou medula óssea de um doador humano. Imunização in vivo de um ser hu- mano vivo com proteína é usualmente indesejável em virtude do risco de iniciar uma resposta prejudicial. Assim, linfócitos B são usualmente imuniza- dos in vitro com uma proteína (por exemplo, MN) ou um fragmento antigêni- co da mesma ou uma célula trazendo a referida proteína (por exemplo, MN). Fragmentos epitópicos específicos consistindo essencialmente nos segmen- tos de aminoácido que se ligam a um dos anticorpos de murino exemplifica- dos podem ser usados para imunização in vitro. Linfócitos B são, tipicamen- te, expostos ao antígeno durante um período de 7-14 dias em um meio, tal como RPMI-1640 (vide, por exemplo, Patente U.S. Ns 4.634.666) suplemen- tado com 10% de soro humano.
Os linfócitos B imunizados podem ser fundidos a uma célula hí- brida xenogenêica, tal como SPAZ-4 através de métodos conhecidos na téc- nica. Por exemplo, as células podem ser tratadas com polietileno glicol a 40- 50% com MW de 1.000-4.000 durante cerca de 5-10 minutos e em torno de 37 2C. As células podem ser separadas da mistura de fusão e propagadas em meios seletivos para os híbridos desejados (por exemplo, HAT ou AH). Clones que secretam anticorpo tendo a especificidade de ligação requerida podem ser identificados ensaiando o meio de cultura de trioma com relação à capacidade de se ligar a uma proteína (por exemplo, MN usando os mes- mos métodos conforme discutido acima para anticorpos não-humanos). Tri- omas que produzem anticorpos humanos tendo a especificidade desejada podem ser subclonados, por exemplo, através da técnica de diluição Iimitati- va e crescidos in vitro em meio de cultura.
Embora triomas sejam geneticamente estáveis, eles podem não produzir anticorpos em níveis muito altos. Os níveis de expressão podem ser aumentados através de clonagem de genes de anticorpo a partir do trioma em um ou mais vetores de expressão e transformação do vetor em uma li- nhagem de célula, tais como as linhagens de célula para expressão das i- munoglobulinas recombinantes ou humanizadas.
Anticorpos humanos que reagem cruzadamente com uma prote- ína (por exemplo, MN) podem também ser produzidos a partir de mamífero transgênicos não-humanos tendo transgenes que codificam pelo menos um segmento do Iocus de imunoglobulina humana. Usualmente, o Iocus de imu- noglobulina endógeno de tais mamíferos transgênicos é funcionalmente ina- tivado. O segmento do Iocus de imunoglobulina humana pode incluir se- qüências não reestruturadas de componentes de cadeias pesada e leve. Inativação dos genes de imunoglobulina endógenos e introdução de genes de imunoglobulina exógenos pode ser obtida através de recombinação ho- móloga objetivada ou através da introdução de cromossomas YAC. Os ma- míferos transgênicos resultantes desse processo são capazes de reestrutu- rar funcionalmente as seqüências componentes de imunoglobulinas e ex- pressar um repertório de anticorpos de vários isotipos codificados pelos ge- nes de imunoglobulina humana, sem expressar genes de imunoglobulina endógenos. A produção e propriedades de mamíferos tendo essas proprie- dades são descritas em detalhes, por exemplo, Lonberg e colaboradores, (WO 93/12227); e Kucherlapati, (WO 91/10741) (cada um dos quais é incor- porado por referência em sua totalidade). Reação cruzada de anticorpos humanos à MN pode ser obtida através de imunização de um mamífero não- humano transgênico conforme descrito acima. Anticorpos monoclonais po- dem ser preparados, por exemplo, através de fusão de células B de tais mamíferos com linhagens de células de mieloma adequadas usando a tec- nologia convencional de Kohler-Milstein technology (Kohler e Milstein, Natu- re 256: 495-497, 1975, incorporado por referência).
Anticorpos de camundongo ou outros não-humanos que reagem cruzadamente com uma proteína (por exemplo, MN) podem ser obtidos u- sando uma variedade de estratégias de imunização. Em algumas estraté- gias, animais não-humanos (mamíferos não humanos) tais como camun- dongos (podem ser imunizados com antígenos MN). Imunógenos podem incluir células estavelmente transfectadas com proteína MN e expressando proteína MN sobre sua superfície celular e proteína MN ou fragmentos epi- tópicos contendo os segmentos dessas moléculas que se ligam aos anticor- pos de reação cruzada exemplificados. Células que produzem anticorpo ob- tidas dos animais imunizados podem ser imortalizadas e selecionadas para a produção de um anticorpo o qual se liga especificamente à proteína MN (por exemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, C.S.H.P., N.Y., 1988, incorporado por referência). A ligação pode ser detectada, por exemplo, usando um anticorpo secundário apropriado trazendo um segundo rótulo. Anticorpos de reação cruzada podem, então, ser ainda selecionados com relação à sua capacidade de dirigir a citotoxicidade celular seletiva à células expressando proteína MN .
A presente invenção também se refere a anticorpos humaniza- dos tendo especificidade e afinidade de ligação similares a anticorpos de camundongos selecionados ou outros não-humanos. Anticorpos humaniza- dos podem ser formados através de ligação de regiões de CDR (por exem- plo, CDR1, CDR2 e CDR3) de anticorpos não-humanos à regiões constantes e de framework humanas através de técnicas de DNA recombinante (por exemplo, Queen e colaboradores, Proc, Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029- 10033,1989; WO 90/07861; cada um incorporado por referência em sua tota- lidade), isto é, enxertagem de CDR. Essas imunoglobulinas humanizadas têm resíduos de framework de região variável substancialmente de uma i- munoglobulina humana (referida como imunoglobulina aceitadora) e regiões de determinação de complementaridade (CDRs) substancialmente de uma imunoglobulina de camundongo (referida como uma imunoglobulina doado- ra). A(s) região(ões) constante(s), se presente(s), pode(m) também ser subs- tancialmente de uma imunoglobulina humana.
Em princípio, uma seqüência de framework de qualquer anticor- po humano pode servir como o template para enxertagem de CDR. Contudo, foi demonstrado que substituição de uma CDR reta sobre tal framework fre- qüentemente leva a uma perda significativa de afinidade de ligação ao antí- geno (Glaser e colaboradores, J. Immunol. 149: 2606, 1992); Tempest e co- laboradores, Biotechnology 9: 266, 1992; Shalaby e colaboradores, J. Exp. Med. 17: 217, 1992). Quanto mais homólogo é um anticorpo humano pelo anticorpo de murino original, menos provável será a combinação das CDRs de murino com a framework humana de introduzir distorções nas CDRs que possam reduzir a afinidade. Portanto, a homologia (isto é, identidade percen- tual de seqüência) entre a framework de região variável de anticorpo huma- nizado e a framework de região variável de anticorpo doador será, de prefe- rência, pelo menos cerca de 65%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% e ainda mais preferivelmente cerca de 95% ou cerca de 99% é sugerido.
Os resíduos de framework de região variável de cadeias pesada e leve podem ser derivados das mesmas ou de diferentes seqüências de anticorpo humano. Contudo, seqüências de framework de cadeia pesada e cadeia leve escolhidas do mesmo anticorpo humano reduzem a possibilida- de de incompatibilidade na montagem das duas cadeias. As seqüências de anticorpo humano podem ser as seqüências de anticorpos humanos que ocorrem naturalmente ou podem ser as seqüências de consenso de vários anticorpos humanos (por exemplo, WO 92/22653, incorporado por referên- cia). Determinados aminoácidos dos resíduos de framework de região variá- vel humana podem ser selecionados para substituição baseado em sua pos- sível influência sobre a conformação de CDR e/ou ligação ao antígeno. Aná- lise de tais possíveis influências pode ser realizada através de modelamento, exame das características dos aminoácidos em locais particulares ou obser- vação empírica dos efeitos de substituição ou mutagênese de aminoácidos em particular.
Por exemplo, quando um aminoácido difere entre um resíduo de framework de região variável de murino e um resíduo de framework de regi- ão variável humana, o aminoácido de framework humana pode ser substituí- do pelo aminoácido de framework equivalente do anticorpo de camundongo quando é razoavelmente esperado que o aminoácido:
(1) contate o antígeno diretamente,
(2) esteja adjacente a uma região de CDR na seqüência ou
(3) ou de outro modo, interaja com uma região de CDR (por e- xemplo, está dentro de 4-6 Á de uma região de CDR).
Outros candidatos para substituição são, por exemplo, aminoá- cidos de framework humana aceitadora que são incomuns para uma imuno- globulina humana nessa posição. Esses aminoácidos podem ser substituí- dos por aminoácidos da posição equivalente do anticorpo doador ou das po- sições equivalentes de imunoglobulinas humanas mais típicas. As frame- works de região variável de imunoglobulinas humanizadas podem mostrar, por exemplo, pelo menos, de preferência, cerca de 85% de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identi- dade de seqüência e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência, a uma seqüência de frameworkàe região variá- vel humana ou consenso de tais seqüências.
A presente invenção também se refere a anticorpos biespecífi- cos ou bifuncionais que têm um sítio de ligação que se liga especificamente a uma proteína (por exemplo, proteína MN) e um segundo sítio de ligação que se liga especificamente a uma segunda porção. Em anticorpos biespecí- ficos, um par de cadeia pesada e leve é usualmente, por exemplo, de um anticorpo de ligação à proteína MN e o outro par de um anticorpo estimulado contra outro epitopo. Isso resulta em valência multifuncional, isto é, uma ca- pacidade de se ligar a pelo menos dois epitopos diferentes simultaneamente.
Ensaios de Ligação
Qualquer meio útil para descrever a resistência de ligação (ou afinidade) entre um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção e um antígeno da invenção (proteína MN) pode ser usado. Por exemplo, a cons- tante de dissociação Kd (Kd = k2/k1 = [anticorpo][antígeno] /[complexo de anticorpo - antígeno]) pode ser determinada através de análises cinéticas padrões que são conhecidas na técnica. Será apreciado por aqueles versa- dos na técnica que a constante de dissociação indica a resistência de Iiga- ção entre um anticorpo e um antígeno em termos de quão fácil é separar o complexo. Se uma alta concentração de anticorpo e antígeno é requerida para formar o complexo, a resistência ou afinidade de ligação é baixa, resul- tando em uma Kd. Segue que quanto menor a Kd (quando expressa em uni- dades de concentração, por exemplo, molar ou nanomolar), mais forte a Ii- gação.
A afinidade pode ser ensaiada e/ou medida através de uma vari- edade de técnicas e imunoensaios conhecidos, incluindo, por exemplo, en- saio imuno-específico enzima-ligado (ELISA), Bimolecular Interaction Analy- sis (BIA) (por exemplo, Sjolander e Urbaniczky, Anal. Chem. 63: 2338-2345, 1991; Szabo e colaboradores, Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705, 1995, ca- da um incorporado aqui por referência) e seleção de células fluorescência- ativada (FACS) para quantificação de ligação de anticorpo à células que ex- pressam MN. BIA é uma tecnologia para análise de interações bio- específicas em tempo real, sem rotulação de quaisquer um dos agentes de interação (por exemplo, BlAcore®). O BIAcore é baseado sobre determina- ção de alterações no fenômeno óptico ressonância de plasmônio em super- fície (SPR) em reações em tempo real entre moléculas biológicas, tal como um anticorpo da invenção e um antígeno proteína MN. Referências relativas à tecnologia BIAcore podem ser ainda encontradas nos Pedidos Publicados U.S. N2s: 2006/0223113, 2006/0134800, 2006/0094060, 2006/0072115, 2006/0019313, 2006/0014232 e 2005/0199076, cada um dos quais é incor- porado aqui em suas totalidades por referência.
Anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno da invenção que se ligam especificamente a uma proteína (por exemplo MN) proporcionam um sinal de detecção, por exemplo, de preferência pelo me- nos cerca de 5 vezes maior, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 vezes maior e, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 20 vezes maior do que um sinal de detecção proporcionado para outras proteínas quando usados em um ensaio imunoquímico. Como tal, esses anticorpos podem ser usados para imunoprecipitar uma proteína (por exemplo, MN) de solução.
Os anticorpos e fragmentos da invenção podem ser ensaiados com relação à ligação imuno-específica (ou ligação que é "especificamente imunoreativa" a qual é aqui definida) através de qualquer método adequado conhecido na técnica. Ensaios envolvendo um anticorpo e um antígeno são conhecidos como "imunoensaios" os quais podem ser empregados na pre- sente invenção para caracterizar os anticorpos e os antígenos da invenção. Os imunoensaios os quais podem ser usados incluem, mas não estão limita- dos a, sistemas de ensaios competitivo e não-competitivo usando técnicas tais como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imuno- absorvente enzima-ligado), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imu- noprecipitação, reações com precipitina, reações de precipitina por difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunoradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios com proteína A, para mencionar uns poucos. Tais ensaios são rotina e bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ausubel e colabora- dores, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, o qual é incorporado por referência aqui em sua to- talidade) e podem ser realizados sem experimentação indevida. Imunoen- saios exemplificativos são descritos resumidamente abaixo (mas não se des- tinam a ser uma limitação).
Protocolos de imunoprecipitação geralmente compreendem lise de uma população de células em um tampão de lise, tal como RIPA (NP-40 a 1% ou Triton X-100, deoxicolato de sódio a 1%, SDS a 0,1%, NaCI a 0,15 M, fosfato de sódio a 0,01 M em um pH 7,2, 1% de Trasylol) suplementado çom fosfatase de proteína e/ou inibidores de protease (por exemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sódio), adição do anticorpo de interesse ao lisato de célula, incubação durante um período de tempo (por exemplo, 1-4 horas a 4 QC, adição de contas de Sepharose de proteína A e/ou proteína G ao lisato de célula, incubação durante cerca de 1 hora ou mais a 4 5C, lava- gem dos contas em tampão de lise e resuspensão dos contas em tampão de amostra/CDS. A capacidade do anticorpo de interesse de imunoprecipitar de um antígeno em particular pode ser avaliada, por exemplo, através de análi- se por Western blot. Aqueles versados na técnica estarão cientes de quais parâmetros podem ser modificados para aumentar a ligação do anticorpo a um antígeno e diminuir a interferência (por exemplo, pré-clarificação do Iisato de célula com contas de Sepharose). Para discussão adicional com relação a protocolos de imunoprecipitação vide, por exemplo, Ausubel e colaborado- res, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10,16.1, o qual é incorporado aqui por referência.
Análise por Western blot geralmente compreende preparo de amostras de proteína, eletroforese das amostras de proteína em um gel de poliacrilamida (por exemplo, SDS-PAGE a 8%, 20%, dependendo do peso molecular do antígeno), transferência da amostra de proteína do gel de poli- acrilamida para uma membrana, tal como nitrocelulose, PVDF ou náilon, bloqueio da membrana em solução de bloqueio (por exemplo, PBS com BSA a 3% ou leite desnatado), lavagem da membrana em tampão de lavagem (por exemplo, PBS - Tween 20), bloqueio da membrana com anticorpo pri- mário (o anticorpo de interesse) diluído em tampão de bloqueio, lavagem da membrana em tampão de lavagem; bloqueio da membrana com um anticor- po secundário (o qual reconhece o anticorpo primário, por exemplo, um anti- corpo anti-humano) conjugado a um substrato enzimático (por exemplo, pe- roxidase de armorácia ou fosfatase alcalina) ou uma molécula radioativa (por exemplo, 32P ou 12õI) diluída em tampão de bloqueio, lavagem da membrana em tampão de lavagem e detecção da presença do antígeno. Aqueles ver- sados na técnica estarão cientes sobre quais parâmetros podem ser modifi- cados para aumentar o sinal detectado e reduzir o ruído de interferência. Para discussão adicional a respeito de protocolos de Western blot vide, por exemplo, Ausubel e colaboradores, eds, 1994, Current Protocols in Molecu- lar Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10,8.1, o qual é in- corporado aqui por referência.
ELISAs compreendem, tipicamente, preparo de antígeno, reves- timento da cavidade de uma lâmina de microtitulação com 96 cavidades com o antígeno, adição do anticorpo de interesse conjugado a um composto de- tectável, tal como um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de ar- morácia ou fosfatase alcalina) à cavidade e incubação durante um período de tempo e detecção da presença do antígeno. Em ELISAs, o anticorpo de interesse não tem de estar conjugado a um composto detectável; antes, um segundo anticorpo (o qual reconhece o anticorpo de interesse) conjugado a um anticorpo detectável pode ser adicionado à cavidade. Ainda, ao invés de revestir a cavidade com o antígeno, o anticorpo pode ser revestido na cavi- dade. Nesse caso, um segundo anticorpo conjugado a um composto detec- tável pode ser adicionado após a adição do antígeno de interesse à cavida- de revestida. Aqueles versados na técnica estarão cientes de quais parâme- tros podem ser modificados para aumentar o sinal detectado, bem como ou- tras variações de ELISAs conhecidos na técnica. Para uma discussão adi- cional com relação a ELISAs vide, por exemplo Ausubel e colaboradores, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1, o qual é incorporado aqui por referência.
Em um aspecto, a presente invenção concretiza uma série de diferentes anticorpos tendo características de ligação à MN identificadas a- través de seleção da biblioteca de Fab MorphoSys HuCAL GOLD. Em um aspecto da invenção, as seqüências de áminoácido de três CDRs da região VH de um anticorpo humano foram identificadas (SEQ ID NOS: 57-85; figura 2). Em outra modalidade da invenção, as seqüências de áminoácido de três CDRs da região VL de um anticorpo à MN humano foram identificadas (SEQ ID NOS: 86-112; figura 2). A presente invenção também se refere à combi- nações de CDRs, frameworks e pares de VH/VL. Exemplos de tais combina- ções são mostrados na figura 3 (SEQ ID NOS: 113-132 para as seqüências de nucleotídeo de codificação) e na figura 4 (SEQ ID NOS 133-152 para as seqüências de proteína). Anticorpos que têm ligação à MN na figura 4. Deta- lhes dos processos de seleção são descritos nos exemplos descritos aqui. Outros métodos de seleção de anticorpos específicos altamente ativos ou fragmentos de anticorpo podem ser considerados para aqueles versados na técnica e usados para identificar anticorpos à MN humanos.
Anticorpos e/ou fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno da invenção também podem ser purificados a partir de qualquer célula que expressa os anticorpos, incluindo células hospedeiras que tenham sido transfectadas com as estruturas de expressão que codificam anticorpo. As células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições pelas quais os an- ticorpos são expressos. Anticorpos purificados e/ou fragmentos de ligação a anticorpo podem ser separados de outros componentes celulares que po- dem se associar com os anticorpos na célula, tais como determinadas prote- ínas, carboidratos ou lipídios usando métodos bem-conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, cromatografia por exclu- são de tamanho, fracionamento com sulfato de amônio, cromatografia por troca de íons, cromatografia por afinidade e eletroforese em gel preparativa. A pureza dos preparados pode ser avaliada através de qualquer meio co- nhecido na técnica, tal como eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS. Um preparado de anticorpos purificados pode conter mais de um tipo de an- ticorpo (por exemplo, anticorpos com as características de neutralização e ligação à MN).
Alternativamente, anticorpos podem ser produzidos usando mé- todos químicos para sintetizar sua seqüência de aminoácido ou porções da seqüência do anticorpo (por exemplo, seqüências de CDR), tal como através de síntese direta de peptídeo usando técnicas em fase sólida (por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soe. 85: 2149-2154, 1963; Roberge e colaborado- res, Science 269: 202-204, 1995, cada um dos quais é incorporado aqui por referência). Síntese de proteína pode ser realizada usando técnicas manuais ou através de automatização. Síntese automática pode ser obtida, por e- xemplo, usando o Sintetizador de Peptídeo Applied Biosystems 431A Pepti- de Synthesizer (Perkin Elmer). Opcionalmente, fragmentos de anticorpo po- dem ser separadamente sintetizados e combinados usando métodos quími- cos para produzir uma molécula de comprimento total.
Uma vez que um anticorpo ou fragmento de acordo com a in- venção é identificado ou obtido, por exemplo, através de qualquer um dos métodos descritos aqui, por exemplo, incluindo através de métodos tradicio- nais de produção de anticorpo (por exemplo, métodos de imunização de a - nimal), produção monoclonal ou meios de DNA recombinante, pode ser pre- ferível realizar outras etapas para caracterizar e/ou purificar e/ou modificar o anticorpo. Por exemplo, pode ser desejável preparar um fragmento de anti- corpo imunorreativo ou preparar uma composição com alta titulação purifica- da do anticorpo identificado desejável e/ou testar a imuno-reatividade do an- ticorpo identificado ou fragmento do mesmo. A presente invenção considera quaisquer métodos conhecidos e adequados para caracterização, purifica- ção ou ensaio dos anticorpos da presente invenção e espera-se que qual- quer pessoa com habilidade comum na técnica à qual a invenção pertence tenha o nível requerido de know how técnico e recursos, por exemplo, ma- nuais ou tratados técnicos, para realizar qualquer caracterização, purificação e ensaios dos anticorpos da invenção sem experimentação indevida.
Em aspectos particulares, os anticorpos e/ou fragmentos de an- ticorpo da invenção podem ser recuperados e purificados de culturas de cé- lula recombinante através de métodos bem-conhecidos incluindo, mas não limitado a, purificação por proteína A, precipitação de etanol ou sulfato de amônio, extração com ácido, cromatografia de toca de ânions ou cátions, cromatografia por afinidade, cromatografia em hidróxiapatita e cromatografia com lecitina. Cromatografia de líquido de alto desempenho ("HPLC") tam- bém pode ser empregada para purificação. Veja, por exemplo, Colligan, Cur- rent Protocols in Immunology ou Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997 2001), por exemplo, Capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada um totalmente incorporado aqui por referência.
O termo "isolamento", no contexto dos anticorpos se refere a qualquer processo conhecido na técnica para purificação de anticorpos. Mé- todos para purificação de anticorpos são bem-conhecidos por aqueles habili- tados e a presente invenção considera qualquer método adequado que será conhecido por aqueles habilitados e o qual não requererá experimentação indevida. Por exemplo, métodos cromatográficos tais como, por exemplo, cromatografia por imunoafinidade (ligante imobilizado para ligação e conten- ção de antígeno de interesse), cromatográfica por afinidade, precipitação de proteína, cromatografia de troca de íons, cromatografia por interação hidro- fóbica, cromatografia por exclusão de tamanho, bem como eletroforese po- dem ser encontrados descritos na literatura técnica, por exemplo, em Me- thods in Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, Eds. J. A- belson, M. Simon, Academic Press, 1- Edição, 1990, o qual é incorporado aqui por referência. Assim, materiais adequados para realização de tais eta- pas de purificação, tais como etapas cromatográficas, são conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais métodos são adequados para purificação de quaisquer um dos anticorpos, antígenos ou quaisquer fragmentos dos mesmos que estão de acordo com a invenção, conforme descrito aqui.
Determinadas modalidades podem requerer a purificação ou isolamento de proteínas expressas ou anticorpos ou fragmentos das mes- mas de uma célula hospedeira ou uma porção da mesma. Procedimentos convencionais para isolamento de proteínas reçombinantes de células hos- pedeiras transformadas são considerados pela presente invenção. Tais mé- todos incluem, por exemplo, isolamento da proteína ou fragmentos de inte- resse através de extração inicial de pelotas de células ou de meio de cultura de célula, seguido por dessalinização e uma ou mais etapas cromatográfi- cas, incluindo cromatografia de troca de íons aquosa, etapas de cromatogra- fia por exclusão de tamanho, cromatografia líquida de alto desempenho (H- PLC) e cromatografia por afinidade podem ser usadas para isolar a proteína recombinante ou fragmento. Orientação quanto a procedimentos para purifi- cação de proteína pode ser encontrada na literatura técnica incluindo, por exemplo, Methods in Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, Eds. J. Abelson, M. Simon, Academic Press, Ii Edição, 1990, o qual já é incorporado por referência.
Moléculas quimicamente sintetizadas podem ser substancial- mente purificadas através de cromatografia líquida de alto desempenho (vi- de, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principies, WH Freeman e Co., New York, N.Y., 1983, incorporada aqui por referência). A composição de um polipeptídeo sintético pode ser confirmada através de análise de aminoácido ou seqüenciamento (por exemplo, usando degrada- ção de Edman).
Polinucleotídeos
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a polinucleotí- deos que codificam os anticorpos (por exemplo, anticorpos contra MN) ou os fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno da invenção. Esses polinu- cleotídeos podem ser usados, por exemplo, para produzir quantidades dos anticorpos para produzir quantidades dos anticorpos para uso terapêutico ou diagnóstico ou produzir amostras de anticorpos ou fragmentos para uso em imunoensaios da invenção.
Polinucleotídeos que podem ser usados para codificar, por e- xemplo, cada uma das três CDRs que podem ser usadas para codificar, por exemplo, cada uma das três CDRs dentro das regiões VH de anticorpo são descritos pelas SEQ ID NOS: 1-29. polinucleotídeos que podem ser usados para codificar, por exemplo, cada uma das CDRs dentro das regiões VL de anticorpo são descritos pelas SEQ ID NOS: 30-56. Polinucleotídeos que co- dificam, por exemplo, as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpos são descritas por SEQ ID NOS: 113-132 (figura 3).
Polinucleotídeos da presente invenção podem também ser iso- lados de células hospedeiras, livres de outros componentes celulares, tais como componentes da membrana, proteínas e lipídios de acordo com qual- quer método conhecido ou adequado na técnica. Polinucleotídeos podem ser isolados usando técnicas padrões de purificação de ácido nucléico ou sintetizados usando uma técnica de amplificação, tal como a reação em ca- deia de polimerase (PCR) ou usando um sintetizador automático. Métodos para isolamento de polinucleotídeos são rotina e são conhecidos na técnica. Qualquer uma de tais técnicas para obtenção de um polinucleotídeo pode ser usada para obter polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos da invenção. Por exemplo, enzimas de restrição e sondas podem ser usadas para isolar os polinucleotídeos os quais codificam os anticorpos.
Moléculas de cDNA que codificam anticorpo podem ser feitas com técnicas padrões de biologia molecular usando mRNA como template. Após o que, moléculas de cDNA podem ser replicadas usando métodos de biologia molecular conhecidos na técnica e descritos em manuais, tal como Sambrook e colaboradores, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Se- gunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989, Vol. 1-3, incorporada aqui por referência). Uma técnica de ampli- ficação, tal como PCR, pode ser usada para obter cópias adicionais dos po- linucleotídeos.
Alternativamente, técnicas de química sintética podem ser usa- das para produzir polinucleotídeos que codificam anticorpos da invenção. A degenerância do código genético permite que seqüências de nucleotídeo alternativas sejam sintetizadas, as quais codificarão um anticorpo tendo, por exemplo, uma das seqüências de aminoácido VH-CDR1, VH-CDR2, VH- CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3, VH completo ou VL completa (por exemplo, SEQ ID NOS: 57-112 e 133-152).
Para expressar um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, o polinucleotídeo pode ser inserido em um vetor de expressão que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da seqüência de codifi- cação inserida. Métodos são bem-conhecidos por aqueles versados na téc- nica e podem ser usados para construir vetores de expressão contendo se- qüências que codificam anticorpos e elementos de controle de tradução e transcrição apropriados. Esses métodos incluem técnicas de DNA recombi- nante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação de gene in vivo. Tais técni- cas são descritas, por exemplo, em Sambrook e colaboradores (1989) e em Ausubel e colaboradores, (Current Protocols in Molecular Biology, John Wi- ley & Sons, New York, N.Y., 1995, incorporados aqui por referência).
Uma variedade de sistemas de vetor de expressão/hospedeiro pode ser utilizada para conter e expressar seqüências que codificam anti- corpos. Esses incluem, mas não estão limitados a, microorganismos, tais como bactérias transformadas com bacteriófago recombinante, vetores de expressão de DNA de plasmídeo ou cosmídeo (por exemplo, baculovírus); sistemas de célula de planta transformados com vetores de expressão virais (por exemplo, vírus mosaico da couve-flor, CaMV; vírus mosaico do tabaco, ®V); ou vetores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmídeos Ti ou pBR322) ou sistemas de células de animais.
Os elementos de controle ou seqüências regulatórias são aque- las regiões não traduzidas dos vetores - intensificadores, regiões não tradu- zidas 5' e 3' - as quais interagem com proteínas celulares do hospedeiro para realizar transcrição e tradução. Tais elementos podem variar quanto à resistência e especificidade. Dependendo do sistema de vetor e do hospe- deiro utilizado, qualquer número de elementos de transcrição e tradução a- dequados, incluindo promotores induzíveis e constitutivos, podem ser usa- dos. Por exemplo, quando de clonagem em sistemas bacterianos, promoto- res induzíveis tal como o promotores híbridos lacZ do fagemídeo BLUES- CRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.), plasmídeo pSPORTI (Life Technologies) ou semelhante podem ser usados. O promotor de polihidrina de baculovírus pode ser usado em células de inseto. Promotores ou intensificadores deriva- do dos genomas de células de planta (por exemplo, genes da proteína de choque térmico, RUBISCO e de armazenamento) ou de vírus de planta (por exemplo, promotores virais ou seqüências líderes) podem ser clonados no vetor. Em sistemas de células de mamífero, promotores de genes de mamí- fero ou de vírus de mamífero podem ser usados, por exemplo, um promotor CMV. Se é necessário gerar uma linhagem de célula que contém múltiplas cópias de uma seqüência de nucleotídeo que codifica um anticorpo, vetores baseados em SV40 ou EBV podem ser usados com um marcador selecioná- vel apropriado.
Conseqüentemente, a presente invenção também se refere a vetores recombinantes que incluem moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção (por exemplo, regiões variáveis de cadeias pesada e leve de SEQ ID NOS: 113-132), células hospedeiras que são geneticamente ma- nipuladas com os vetores recombinantes e a produção e/ou expressão dos anticorpos recombinantes ou fragmentos dos mesmos da invenção.
As estruturas de expressão podem ainda conter sítios para início de transcrição, término e, na região transcrita, um sítio de ligação ribossômi- ca para tradução. A porção de codificação dos transcritos maduros expres- sos pelas estruturas podem ainda incluir um início de tradução no começo e um códon terminal (por exemplo, UAA, UGA ou UAG) apropriadamente po- sicionado no final do mRNA a ser traduzido com UAA e UAG preferidos para expressão de célula eucariota ou de mamífero.
Vetores de expressão também podem incluir pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadoras incluem, mas não estão limitados a, marcadoras de célula de mamífero, tais metotrexato (MTX), reductase de dihidrofolato (DHFR) (vide por exemplo, Patentes U.S. N- 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; e 5.179.017, cada uma das quais é incorporada por referência), ampicilina, neomicina (G418), ácido mi- cofenólico ou sintetase de glutamina (GS) (vide por exemplo, Patentes U.S. N— 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739, cada uma das quais é incorporada por referência) e marcadoras de células bacterianas, tais como os genes de re- sistência à tetraciclina ou ampicilina. Meios de cultura e condições apropria- das para as células hospedeiras descritas acima são conhecidos na técnica. Vetores adequados serão prontamente evidentes para o técnico versado. Qualquer método conhecido adequado para introdução de um DNA da invenção, por exemplo, um vetor de expressão de DNA contendo uma ou mais seqüências de codificação de anticorpo de SEQ ID NOS: 113- 132, em uma célula hospedeira pode ser utilizado. Alguns métodos conheci- dos incluem transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, transfecção mediada por lipídio catiônico, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos conhecidos. Tais métodos são des- critos na técnica, tal como em Sambrook e colaboradores, (Molecular Clo- ninq: A Laboratory Manual. (Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3, Capítulos 14, 16 e 18).
Aqueles versados na técnica estarão cientes quanto aos nume- rosos sistemas de expressão disponíveis para expressão de um ácido nu- cléico que codifica os anticorpos ou porções dos mesmos da presente in- venção.
Ilustrativas de culturas de célula úteis para a produção dos anti- corpos ou fragmentos de anticorpo da invenção são células de mamífero. Sistemas de células de mamífero freqüentemente estarão na forma de mo- nocamadas de células, embora suspensões de célula de mamífero ou bior- reatores também possam ser usados. Uma série de linhagens de célula hospedeira adequadas capazes de expressar proteínas glicosiladas intactas foi desenvolvida na técnica e incluem as linhagens de célula CHO, CHO-S, COS-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL- 1651), HEK293, BHK21 (por exemplo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610) e BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), células Cos-7, células CHO, células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células 293, cé- lulas HeLa e similares, as quais estão prontamente disponíveis, por exem- plo, da American Type Culture Collection.
Vetores de expressão para essas células podem incluir um ou mais das seguintes seqüências de controle de expressão tal como, mas não limitado a, uma origem de replicação, um promotor (por exemplo, promoto- res SV40 precoces ou tardios, o promotor SMV (por exemplo, Patentes U.S. N— 5.168.062; 5.385.839), um promotor HSV tk, um promotor pgk (quínase de fosfoglicerato) um promotor EF-1 alfa (Pat. U.S. N° 5.266.491), um pro- motor de imunoglobulina; um intensificador e/ou sítios de informação de pro- cessamento, tais como sítios de ligação ribossômica, sítios de splicing de RNA, sítios de poliadenilação (por exemplo, um sítio de adição de poliA de T A grande de SV40) e seqüências de término de transcrição. Outras células úteis para a produção de ácidos nucleicos ou proteínas da presente inven- ção são conhecidas e/ou estão disponíveis, por exemplo, do Catálogo de Linhagens de Células e Hibridomas da American Type Culture Collection ou outras fontes comerciais ou conhecidas.
Quando células hospedeiras eucariotas são empregadas, se- qüências de término de transcrição ou de poliadenilação podem ser incorpo- radas no vetor. Um exemplo de uma seqüência terminadora é a seqüência de poliadenilação do gene do hormônio de crescimento bovino. Seqüências para splicing preciso de transcritos também podem ser incluídas. Um exem- pio de uma seqüência de splicing é o íntron VP1 do SV40 (Sprague e cola- boradores, J. Virol. 45: 773 781 (1983)). Adicionalmente, seqüências de ge- ne para controlar a replicação na célula hospedeira podem ser incorporadas no vetor, conforme conhecido na técnica.
Textos gerais descrevendo técnicas de biologia molecular adi- cionais úteis aqui, incluindo o preparo dos anticorpos incluem Berger e Kim- mel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzvmoloqy, Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook e colaboradores, (Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. (Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Mole- cular Biology, (F. M. AusUbeI e colaboradores [Eds.], Current Protocols, um lançamento conjunto entre a Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc. (suplementado até 2000)); Harlow e colaboradores, (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed.]); Fundamental Immunoloqy. (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); e Harlow e colaboradores, (Usinq Antibodies: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)), todos os quais são aqui incor- porados por referência. Em outra modalidade, a presente invenção também se refere ao uso de imunoensaios quantitativos para medir os níveis de proteína MN em amostras de pacientes. Muitos formatos podem ser adaptados para uso com os métodos da presente invenção. Por exemplo, a detecção e quantificação de proteína MN em amostras de pacientes podem ser realizadas através de ensaios imunoabsorventes enzima-ligados, radioimunoensaios, ensaios em sanduíche com anticorpo duplo, ensaios de aglutinação, imunoensaios fluo- rescentes, microscopia por exploração e imunoelétrons, dentre outros ensai- os comumente conhecidos na técnica. A quantificação de proteína MN em tais ensaios pode ser adaptada através de métodos convencionais conheci- dos na técnica. Em uma modalidade, alterações seriais nos níveis de proteí- na MN em circulação podem ser detectadas e quantificadas através de um ensaio em sanduíche no qual o anticorpo de captura foi imobilizado usando técnicas convencionais sobre a superfície do suporte.
Suportes adequados incluem, por exemplo, suportes poliméricos sintéticos, tais como polipropileno, poliestireno, poliestireno substituído, poli- acrilamidas (tal como poliamidas e cloreto de polivinila) contas de vidro, aga- rose e nitrocelulose.
Um exemplo de um imunoensaio em sanduíche ELISA que pode ser usado nos métodos da presente invenção usa anticorpo monoclonal anti- MN humana de camundongo como o anticorpo de captura e anticorpo poli- clonal anti-MN humana de bezerro biotinilado como o anticorpo detector. O anticorpo monoclonal de captura é imobilizado sobre cavidades de lâminas de microtitulação. Amostras diluídas de soro/plasma humano ou padrões de MN (proteína MN recombinante do tipo silvestre) são incubados nas cavida- des para permitir a ligação de antígeno MN pelo anticorpo monoclonal de captura. Após lavagem das cavidades, o antígeno MN imobilizado é exposto a um anticorpo detector biotinilado, após o que as cavidades são lavadas novamente. Um conjugado de estreptavidina-peroxidase de armorácia é, então, adicionado. Após uma lavagem final, substrato ®B Blue é adicionado às cavidades para detectar atividade de peroxidase ligada. A reação é ces- sada através da adição de ácido sulfúrico a 2,5 Nea absorbância é medida a 450 nm. Correlação dos valores de absorbância de amostras com os pa- drões de MN permite a determinação de um valor quantitativo de MN em pg/ml de soro ou plasma.
Os anticorpos úteis para identificar proteínas MN podem ser ro- tulados de qualquer maneira convencional. Um exemplo de um rótulo é pe- roxidase de armorácia e um exemplo de um método de rotulação de anticor- pos é usando complexos de biotina - estreptavidina.
Conforme apropriado, anticorpos usados nos imunoensaios da presente invenção que são usados como rastreadores podem ser rotulados de qualquer maneira, direta ou indiretamente, que resulta em um sinal que é visível ou pode ser tornado visível. Substâncias marcadoras detectáveis in- cluem radionuclídeos, tais como 3H1 125I e 131I; agentes de fluorescência, tais como isotiocianato de fluoresceína e outros fluorocromas, ficobiliproteínas, ficoeritina, quelatos de terras raras, Texas red, dansila e rodamina; reagen- tes colorimétricos (cromogênios); materiais elétron-opacos, tal como ouro coloidal; agentes de bioluminescência; agentes de quimioluminescência; co- rantes; enzimas, tais como peroxidase de armorácia, fosfatases alcalinas, oxidase de glicose, dehidrogenase de glicose-6-fosfato, acetilcolinesterase, alfa, beta-galactosidase, dentre outras; co-enzimas; substratos enzimáticos; co-fatores enzimáticos; inibidores enzimáticos; subunidades enzimáticas; íons de metal; radicais livres; ou qualquer outra substância imunologicamen- te ativa ou inerte a qual proporciona um meio de detecção ou medição da presença ou quantidade de imunocomplexo formado. Combinações de subs- trato enzimático exemplificativas são peroxidase de armorácia e tetrametil benzidina (®B) e fosfatases alcalinas e fosfato de paranitrofenila (pNPP).
Outros sistemas de detecção e quantificação de acordo com a presente invenção produzem sinais luminescentes, bioluminescentes (BL) ou quimioluminescentes (CL) em ensaios quimioluminescentes (CL) ou biolumi- nescentes (BL), a intensidade ou emissão de luz total é medida e relaciona- da à concentração do analito desconhecido. Luz pode ser medida quantitati- vamente usando um luminômetro (tubo fotomultiplicadar como o detector) ou um dispositivo carga- acoplado ou qualitativamente por meio de um filme fotográfico ou de raio-x. As principais vantagens de usos de tais ensaios são sua simplicidade e sensibilidade analítica, permitindo a detecção e/ou quanti- ficação de quantidades muito pequenas de analito.
Rótulos luminescentes exemplificativos são ésteres de acridínio, sulfonil carboxamidas de acridínio, luminol, umbeliferona, derivados de iso- luminol, fotoproteínas, tais como aequorina e luciferases de vaga-lumes, bactérias marinhas Vargulla e Renilla. Luminol pode ser usado opcionalmen- te com uma molécula intensificadora, tal como 4-iodofenol ou ácido 4- hidróxi-cinâmico. Tipicamente, um sinal CL é gerado através de tratamento com um oxidante sob condições básicas.
Sistemas de detecção luminescentes adicionais são aqueles em que o sinal (marcador detectável) é produzido através de uma reação enzi- mática sobre um substrato. Esquemas de detecção CL e BL foram desen- volvidos para ensaiar fosfatases alcalinas (AP), oxidase de glicose, dehidro- genase de 6-fosfato de glicose, peroxidase de armorácia (HRP) e rótulos de oxidase-xantina, dentre outros. AP e HRP são dois rótulos enzimáticos os quais podem ser quantificados através de uma faixa de reações CL e DL. Por exemplo, AP pode ser usada com um substrato, tal como um substrato de aril fosfato de adamantil 1,2-dioxetano (por exemplo, AMPPD ou CSPD; Kricka, L.J., "Chemiluminescence and Bioluminescence, Analysis" por "Mo- lecular Biology and Biotechnoloqy: A Comprehensive Desk Reference (ed. R.A. Meyers) (VCH Publishers; N.Y., N.Y.; 1995)); por exemplo, um sal dis- sódico de 4-metóxi-4-(3-fosfatofenil) espiro [1,2-dioxetano-3,2'-adamantano], com ou sem uma molécula intensificadora, tal como dicloreto de 1-(trioctilfosfônio metil)-4- (tributilfosfônio metil) benzeno. HRP pode ser usa- da tal como 2',3',6'-trifluorofenil-metóxi-10-metilacridan-9-carboxilato.
Reações CL e BL podem ser adaptadas não apenas de enzi- mas, mas também de outros substratos, co-fatores, inibidores, íons de metal e similares. Por exemplo, reações com luminol, luciferase de vaga-lume e luciferase de bactérias marinhas são reações indicativas para a produção ou consumo de peroxidase, ATP e NADPH, respectivamente. Elas podem ser acopladas à outras reações envolvendo oxidases, quínases e dehidrogena- ses e podem ser usadas para medir qualquer componente da reação aco- plada (enzima, substrato, co-fator).
O marcador detectável pode ser direta ou indiretamente ligado a um anticorpo usado em um ensaio da presente invenção. Exemplificativo de uma ligação indireta do rótulo detectável é o uso de um par de ligação entre um anticorpo e um marcador ou o uso de um sistema de amplificação de sinal.
Exemplos de pares de ligação que podem ser usados para ligar anticorpos a marcadoras detectáveis são biotina/avidina, estreptavidina ou antibiotina; avidina/antiavidina; tiroxina/globulina de ligação à tiroxina; antí- geno/anticorpo; anticorpo/antianticorpo; carboidrato/lecitinas; hapte- no/anticorpo anti-hapteno; corantes e sítios de ligação de proteína hidrofóbi- ca/moléculas hidrofóbicas; inibidor enzimático, co-enzima ou co- fator/enzima; ácido polinucléico/seqüência de ácido polinucléico homóloga; fluoresceína/anti-fluoresceína; dinitrofenol/antidinitrofenol; vitamina B12/fator intrínseco, cortisona, cortisol/proteína de ligação a cortisol; e Iigantes para proteína/membrana de receptor específico associada à proteínas de receptor específicas.
Vários meios para ligação de rótulos direta ou indiretamente a anticorpos são conhecidos na técnica. Por exemplo, rótulos podem ser liga- dos covalente ou não covalentemente. Métodos exemplificativos de conjuga- ção de anticorpo são descritos em Avarmeas e colaboradores, Scan. J. Im- munol. 8 (Suplemento 7): 7, 1978); Bayer e colaboradores, Meth. Enzymol. 62: 308, 1979; Chandler e colaboradores, J. Immunol. Meth. 53: 187, 1982; Ekeke e Abuknesha, J. Steroid Biochem. 11: 1579, 1979; Engvall e Perl- mann, J. Immunol. 109: 129, 1972; Geoghegan e colaboradores, Immunol. Comm. 7: 1, 1978; e Wilson e Nakane, Immunofluorescence and Related Techniques. Elsevier/North Holland Biomedical Press; Amsterdã (1978), ca- da um dos quais é incorporado aqui por referência.
Dependendo da natureza do rótulo, várias técnicas podem ser empregadas para detecção e quantificação do rótulo. Para agentes de fluo- rescência, um grande número de fluorômetros está disponível. Para agentes de quimioluminescência, luminômetros ou filmes estão disponíveis. Com en- zimas, um produto fluorescente, quimioluminescente ou colorido pode ser determinado ou medido fluorometricamente, luminometricamente, espectro- fotometricamente, ou visualmente.
Vários tipos de compostos quimioluminescentes tendo um tipo de sistema de anel heterocíclico de acridínio, benzacridínio ou acridana são outros exemplos de rótulo. Exemplos de ésteres de acridínio incluem aque- les compostos tendo anéis heterocíclicos ou sistemas de anel que contém um heteroátomo em um estado de oxidação positivo, incluindo sistemas de anel, tais como acridínio, benz[a]acridínio, benz[b]acridínio, benz[c]acridínio, um cátion de benzimidazol, quinolínio, isoquinolínio, quinolizínio, um quinolí- nio cíclico substituído, fenantridínio e quinoxalínio.
O rastreador pode ser preparado através de fixação ao anticorpo selecionado direta ou indiretamente de um grupo reativo presente sobre o éster de acridínio ou benzacridínio, conforme é bem-conhecido por aqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Weeks e colaboradores, Clin. Chem. 29(8): 1474-1479, 1983). Exemplos de compostos são ésteres de acridínio e benzacridínio com um grupo de condução com anel de arila e o grupo fun- cional reativo presente na posição para ou meta do anel de arila (por exem- pio, Patente U.S. N2 4.745.181 e WO 94/21823, incorporados aqui por refe- rência).
Métodos de Uso
O termo "tratamento" inclui qualquer processo, ação, aplicação, terapia ou semelhante, em que é fornecido auxilio médico a um indivíduo (ou paciente), incluindo um ser humano, com o objetivo de melhorar a condição do indivíduo, direta ou indiretamente, ou diminuir a progressão de uma con- dição ou distúrbio no indivíduo ou aliviar pelo menos um sintoma da doença ou distúrbio sob tratamento.
O termo "terapia combinada" ou "co-terapia" significa a adminis- tração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar uma doença, condi- ção e/ou distúrbio. Tal administração abrange co-administração de dois ou mais agentes terapêuticos de uma maneira substancialmente simultânea, tal como em uma única cápsula tendo uma proporção fixa de ingredientes ati- vos ou em múltiplas cápsulas distintas para cada agente inibitório. Além dis- so, tal administração abrange o uso de cada tipo de agente terapêutico de uma maneira seqüencial. A ordem de administração de dois ou mais agentes terapêuticos co-administrados seqüencialmente não estão limitada.
A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quanti- dade de cada agente administrado que obterá o objetivo de melhorar a gra- vidade de uma doença, condição e/ou distúrbio e/ou sintoma do mesmo, ao mesmo tempo em que evita ou minimiza efeitos colaterais adversos associ- ados ao tratamento terapêutico fornecido.
O termo "farmaceuticamente aceitável" significa que o item em questão é apropriado para uso em um produto farmacêutico.
Espera-se que os anticorpos da presente invenção sejam valio- sos como agentes terapêuticos. Conseqüentemente, em uma modalidade da presente invenção inclui um método de tratamento das várias condições em um paciente (incluindo mamíferos) o qual compreende administração, ao referido paciente, de uma composição contendo uma quantidade de um anti- corpo da invenção que é eficaz no tratamento da condição alvo.
Os anticorpos da presente invenção podem ser usados no tra- tamento ou prevenção de doenças e/ou comportamentos que estão associa- dos à proteína MN. Essas doenças e/ou comportamentos incluem, por e- xemplo, câncer, tal como carcinomas do rim, esôfago, mama, cérvix, cólon e pulmão. A presente invenção também se refere a métodos de alívio de sin- tomas de um distúrbio nos quais a MN está elevada ou, de outro modo, a- normalmente expressa. Esses distúrbios incluem, sem limitação, carcinomas do rim, esôfago, mama, cérvix, cólon e pulmão (vide, por exemplo, Liao, Câncer Res. 57: 2827-2831, 1997; Turner, Hum. Pathol. 28: 740-744, 1997; Liao e colaboradores, Am. J. Pathol. 145: 598-609, 1994; Saarnio e colabo- radores, Am. J. Pathol. 153: 279-285, 1998; Vermylen e colaboradores, Eur. Respir. J. 14: 806-811, 1999). Em uma modalidade da invenção, uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção é administrada a um paciente tendo um distúrbio no qual MN está elevada. Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicio- nais. Terapia combinada inclui administração de uma única formulação de dosagem farmacêutica a qual contém um anticorpo da presente invenção e um ou mais agentes terapêuticos adicionais, bem como administração do anticorpo da presente invenção e cada um dos agentes terapêuticos adicio- nais em sua própria formulação de dosagem farmacêutica distinta. Por e- xemplo, um anticorpo da presente invenção e um agente terapêutico podem ser administrados ao paciente juntos em uma única composição de dosagem oral ou cada agente pode ser administrado em formulações de dosagem oral distintas.
Onde formulações de dosagem distintas são usadas, o anticorpo da presente invenção e um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados essencialmente ao mesmo tempo (por exemplo, concor- rentemente) ou em tempos espaçados separadamente (por exemplo, se- qüencialmente). A ordem de administração dos agentes não está limitada.
Por exemplo, em um aspecto, co-administração de um anticorpo ou fragmento de anticorpo anti-MN da invenção junto com um ou mais agen- tes anticâncer para potencializar o efeito do anticorpo/fragmento ou do agen- te(s) anticâncer(es) ou ambos é considerada para uso no tratamento de dis- túrbios MN-relacionados, tal como câncer.
Tais terapias combinadas podem também ser usadas para pre- venir câncer, prevenir a recorrência de câncer, prevenir a disseminação ou metástase de um câncer ou reduzir ou aliviar os sintomas associados ao câncer.
O um ou mais agentes anticâncer podem incluir qualquer com- posto conhecido e adequado na técnica tal como, por exemplo, quimioagen- tes, outros produtos imunoterapêuticos, vacinas contra o câncer, agentes antiangiogênicos, citocinas, terapias hormonais, terapias genéticas e radiote- rapias. Um quimioagente (ou "agente anticâncer" ou "agente antitumor" ou "produto terapêutico para câncer") se refere a qualquer molécula ou compos- to que auxilia no tratamento de um câncer. Exemplos de quimioagentes con- siderados pela presente invenção incluem, mas não estão limitados a, arabi- nosídeo de citosina, taxóides (por exemplo, paclitaxel, docetaxel), agentes anti-tubulina (por exemplo, paclitaxel, docetaxel, epotilona B ou seus análo- gos), macrolídeos (por exemplo, rizoxina) cisplatina, carboplatina, adriamici- na, tenoposídeo, mitozantron, discodermolida, eleuterobina, 2- clorodeoxiadenosina, agentes de alquilação (por exemplo, ciclofosfamida, mecloretamina, tioepa, clorambucila, melphalan, carmustina (BSNU), Iomus- tina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina, tiotepa), anti- bióticos (por exemplo, dactinomicina (formalmente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina), antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, flavopiridol, 5-fluorouracila, fluda- rabina, gemcitabina, dacarbazina, temozolamida), asparaginase, Bacillus Calmette e Guerin, toxina da difteria, hexametilmelamina, hidroxiuréia, LY- SODREN.R®., análogos de nucleosídeo, alcalóides de planta (por exemplo, Taxol, paclitaxel, camptotecina, topotecan, irinotecan (CAMPTOSAR, CPT- 11), vincristina, vinca alcalóides, tal como vinblastina), podofilotoxina (inclu- indo derivados tais como epipodofilotoxina, VP-16 (etoposídeo), VM-26 (te- niposídeo)), citocalasina B, colchina, gramicidina D, brometo de etídio, eme- tina, mitomicina, procarbazina, mecloretamina, antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (formalmente daunomicina), doxorrubicina, doxorrubicina Ii- possômica), dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, procaína tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, agentes antimitó- ticos, abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, fator de crescimento de ner- vo, fator de crescimento derivado de plaqueta, ativador de plasminogênio tecidual, aldesleucina, alutamina, anastrozol, bicalutamida, biaomicina, bus- sulfan, capecitabina, carboplatina, clorambucila, cladribina, citarabina, dacti- nomicina, estramustina, floxurida, gemcitabina, gosereína, idarrubicina, itos- famida, acetato de leuprolida, levamisola, lomustina, mecloretamina, acetato de magistrol, mercaptopurina, mesna, mitolanc, pegaspergase, pentoslatina, picamicina, riuxlmab, campath-1, estraplozocina, tioguanina, tretinoína, vino- relbina ou quaisquer fragmentos, membros da família ou derivados dos mesmos, incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, compo- sições compreendendo um ou mais quimioagentes (por exemplo, FLAG, CHOP) também são consideradas pela presente invenção. FLAG compre- ende fludarabina, arabinosídeo de citosina (Ara-C) e G-CSF. CHOP compre- ende ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina e prednisona.
O quimioagente pode ser uma gente antiangiogênico, tal como, por exemplo, angiostatina, bevacizumab (Avastin®), sorafenib (Nexavar®), baculostatina, canstatina, maspina, anticorpos ou peptídeos anti-VEGF, anti- corpos ou peptídeos antifator de crescimento placentário, anticorpos anti-Flk- 1, anticorpos ou peptídeos anti-Flt-1, peptídeos de laminina, peptídeos de fibronectina, inibidores de ativador de plasminogênio, inibidores de metalo- proteinase tecidual, interferons, interleucina 12, IP-10, Gro-β, trombospondi- na, 2-metoxiestradiol, proteína proliferina-relacionada, carboxiamidotriazol, CM101, Marimastat, polissulfato de pentosana, angiopoietina 2, interferon- alfa, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina de 16K, Linomi- da, talidomida, pentoxifilina, genisteína, TNP-470, endostatina, paclitaxel, acutina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, fator 4 de plaqueta ou minorciclina. Sem estar preso a qualquer teoria, a co-administração de um agente antiangiogênico pode, vantajosamente, levar ao aumento na expres- são de MN em um tumor, desse modo, tornando o tumor mais suscetível aos anticorpos e conjugados de anticorpo da invenção.
Em um aspecto, o referido quimioagente é gemcitabina em uma dosagem oscilando de 10O a 1000 mg/m2/ciclo. Em uma modalidade, o refe- rido quimioagente é dacarbazina em uma dosagem oscilando de 200 a 4000 mg/m2 ciclo. Em outro aspecto, a referida dosa oscila de 700 a 1000 mg/m2/ciclo. Em ainda outro aspecto, o referido quimioagente é fludarabina em uma dosagem oscilando de 25 a 50 mg/m2/ciclo. Em outro aspecto, o referido quimioagente é arabinosídeo de citosina (Ara-C) em uma dosagem oscilando de 200 a 2000 mg/m2/ciclo. Em ainda outro aspecto, o referido quimioagente é docetaxel em uma dosagem oscilando de 1,5 a 7,5 mg/kg/ciclo. Em ainda outro aspecto, o referido quimioagente é paclitaxel em uma dosagem oscilando de 5 a 15 mg/kg/ciclo. Em um outro aspecto, o refe- rido quimioagente é cisplatina em uma dosagem oscilando de 5 a 20 mg/kg/ciclo. Em ainda um outro aspecto, o referido quimioagente é 5- fluorouracila em uma dosagem oscilando de 5 a 20 mg/kg/ciclo. Em outro aspecto, o referido quimioagente é doxorrubicina em uma dosagem oscilan- do de 2 a 8 mg/kg/ciclo. Em ainda um outro aspecto, o referido quimioagente é epipodofilotoxina em uma dosagem oscilando de 40 a 160 mg/kg/ciclo. Em ainda outro aspecto, o referido quimioagente é ciclofosfamida em uma dosa- gem oscilando de 50 a 200 mg/kg/ciclo. Em um outro aspecto, o referido quimioagente é irinotecan em uma dosagem oscilando de 50 a 150 mg/m2/ciclo. Em ainda um outro aspecto, o referido quimioagente é vinblas- tina em uma dosagem oscilando de 3,7 a 18,5 mg/m2/ciclo. Em outro aspec- to, o referido quimioagente é vincristina em uma dosagem oscilando de 0,7 a 2 mg/m2/ciclo. Em um aspecto, o referido quimioagente é metotrexato em uma dosagem oscilando de 3,3 a 1000 mg/m2/ciclo.
Em outro aspecto, os anticorpos anti-MN e/ou fragmentos de anticorpo da presente invenção são administrados em combinação com um ou mais agentes imunoterapêuticos, tais como anticorpos ou imunomodula- dores os quais incluem, mas não estão limitados a, Herceptin®, Retuxan®., OvaRex, Panorex, BEC2, IMC-C225, Vitaxin, Campath l/H, Smart MI95, LymphoCide, Smart I D10 e Oncolym, rituxan, rituximab, gemtuzumab ou trastuzumab.
A invenção também considera a administração dos anticorpos anti-MN e/ou fragmentos de anticorpo da presente invenção com um ou mais agentes antiangiogênico, os quais incluem, mas não estão limitados a, angi- ostatina, talidomida, kringle 5, endostatina, Serpin (Inibidor de Protease de Serina), anti-trombina, fragmentos proteolíticos C-terminais de 40 kDa e N- terminais de 29 kDa de fibronectina, fragmento proteolítico de 16 kDa de pro- lactina, fragmento proteolítico de 7,8 kDa do fator 4 de plaqueta, um peptí- deo de β-aminoácido correspondendo a um fragmento de fator-4 de plaqueta (Maione e colaboradores, 1990, Câncer Res. 51: 2077), um peptídeo de 14- aminoácidos correspondendo a um fragmento de colágeno (Tolma e colabo- radores, 1993, J. Cell Biol. 122: 497), um peptídeo de 19 aminoácidos cor- respondendo a um fragmento de Trombospondina I (Tolsma e colaborado- res, 1993, J. Cell Biol. 122: 497), um peptídeo de 20 aminoácidos corres- pondendo a um fragmento de SPARC (Sage e colaboradores, 1995, J. Cell. Biochem. 57: 1329-) ou quaisquer fragmentos, membros da família ou deri- vados dos mesmos, incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mes- mos.
Outros peptídeos que inibem a angiogênese e correspondem a fragmentos de laminina, fibronectina, pró-colágeno e EGF também foram descritos (vide a revisão por Cao, 1998, Prog. Mol. Subcell. Biol. 20: 161). Foi demonstrado que anticorpos monoclonais e pentapeptídeos cíclicos, os quais bloqueiam determinadas integrinas que se ligam à proteínas RGD (isto é, possuem o motivo de peptídeo Arg-Gly-Asp) têm atividades de antivascu- larização (Brooks e colaboradores, 1994, Science 264: 569; Hammes e co- laboradores, 1996, Nature Medicine 2: 529). Além disso, inibição do receptor de ativador de plasminogênio de uroquínase por antagonistas inibe a angio- gênese, crescimento de tumor e metástase (Min e colaboradores, 1996, Câncer Res. 56: 2428-33; Crowley e colaboradores, 1993, Proc Natl Acad. Sei. USA 90: 5021). Uso de tais agentes antiangiogênicos também é consi- derado pela presente invenção.
Em outro aspecto, os anticorpos e/ou fragmentos de anticorpo anti-MN da presente invenção são administrados em combinação com um regime de radiação.
Os anticorpos e/ou fragmentos de anticorpo anti-MN da presente invenção também podem ser administrados em combinação com uma ou mais citocinás, as quais incluem, mas não estão limitadas a, linfocinas, fato- res de necrose de tumor, citocinás similares a fatores de necrose de tumor, Iinfotoxina-D, linfotoxina-D, interferon-D, proteínas inflamatórias de macrófa- go, fatores de estimulação de colônia de monócito granulócito, interleucinas (incluindo, mas não limitado a, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-6, interleucina-12, interleucina-15, interleucina-18, Iigantes 0X40, CD27, CD30, CD40 ou CD137, Iigantes Fas-Pas, 4-1BBL, proteína de ativação de monóci- to endotelial ou quaisquer fragmentos, membros da família ou derivados dos mesmos, incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
Os anticorpos e/ou fragmentos de anticorpo anti-MN da presente invenção podem também ser administrados em combinação com uma vaci- na contra câncer, exemplos da qual incluem, mas não estão limitados a, cé- lulas ou tecidos autólogos, células ou tecidos não autólogos, antígeno carci- noembriônico, alfa-fetoproteína, gonadotrofina coriônica humana, vacina viva de camundongo, proteína da linhagem de melanócito (por exemplo, gp100, MART-1/MelanA, TRP-1 (gp75), tiroquínase, antígenos associado a tumors altamente compartilhados, incluindo, tumor-específicos, (por exemplo, BA- GE, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-3, N-acetil glicosaminil transferase- V, p15), antígenos com mutação que são associado a tumors (β-catenina, MUM-1, CDK4), antígenos de não melanoma (por exemplo, HER-2/neu (car- cinoma de mama e ovariano), papiloma vírus-E6, E7 humano (carcinoma cervical), MUC-1 (carcinoma de mama ovariano e pancreático). Para antíge- nos de tumor humano reconhecidos por células T vide, de modo geral, Rob- bins e Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 628. Vacinas contra o cân- cer podem ou não ser preparados purificados.
Em ainda outra modalidade, os anticorpos anti-MN e/ou frag- mentos de anticorpo da presente invenção são usados em associação com um tratamento hormonal. Tratamentos terapêuticos hormonais incluem ago- nistas hormonais, antagonistas hormonais (por exemplo, flutamida, tamoxi- fen, acetato de leuprolida (LUPRON), antagonistas de LH-RH), inibidores da biossíntese de hormônio e processamento e esteróides (por exemplo, dexa- metasona, retinóides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, dehidro- testosterona, glicocorticóides, mineralocorticóides, estrogênio, testosterona, progestinas), antigestagênios (por exemplo, mifepristona, onapristona) e an- ti-androgênios (por exemplo, acetato de ciproterona).
Os anticorpos e/ou fragmentos anti-MN da invenção podem ser usados em combinação, por exemplo, co-administrados com, um agente antifenótipo MDR (resistência a múltiplos fármacos).
Muitos cânceres humanos expressam intrinsecamente ou de- senvolvem espontaneamente resistência à várias classes de fármacos anti- câncer ao mesmo tempo, não obstante cada uma das classes de fármaco tenha diferentes estruturas e mecanismos de ação. Esse fenômeno, o qual pode ser imitado em células de mamífero cultivadas, é geralmente referido como resistência a múltiplos fármacos ("MDR") ou o fenótipo de resistência a múltiplos fármacos. O fenótipo MDR apresenta obstáculos significativos aos tratamentos quimioterapêuticos com sucesso para cânceres em pacientes humanos. A resistência de tumores malignos a múltiplos agentes quimiote- rapêuticos é a principal causa de falha de tratamento (Wittes e colaborado- res, Câncer Treat. Rep. 70: 105 (1986); Bradley, G. e colaboradores, Bio- chim. Biophys. Acta 948: 87 (1988); Griswald, D. P. e colaboradores, Câncer Treat. Rep. 65(S2): 51 (1981); Osteen, R. T. (ed.), Câncer Manual, (1990)). Tumores inicialmente sensíveis a agentes citotóxicos, freqüentemente reo- correm ou se tornam resistentes a múltiplos fármacos quimioterapêuticos (Riordan e colaboradores, Pharmacol. Ther. 28: 51 (1985); Gottesman e co- laboradores, Trends Pharmacol. Sei. 9: 54 (1988); Moscow e colaboradores, J. Natl. Câncer Inst. 80: 14 (1988); Croop, J. M. e colaboradores, J. Clin. In- vest. 81: 1303 (1988)). Células ou tecidos obtidos de tumores e crescidos na presença de um fármaco citotóxico de seleção podem resultar em resistên- cia cruzada a outros fármacos nessa classe, bem como outras classes de fármaco incluindo, mas não limitado a, antraciclinas, Vinca alcalóides e epi- podofilotoxinas (Riordan e colaboradores, Pharmacol. Ther. 28: 51 (1985); Gottesman e colaboradores, J. Biol. Chem. 263: 12163 (1988)). Assim, resis- tência adquirida a um único fármaco resulta em resistência simultânea a um grupo diverso de fármacos que são estrutural e funcionalmente não relacio- nados. Tal resistência pode ser um problema para tumores na forma sólida e na forma líquida (por exemplo, cânceres baseados na Iinfa ou no sangue).
Um mecanismo principal de resistência a múltiplos fármacos em células de mamífero envolve a expressão aumentada do sistema de bomba de glicoproteína da membrana plasmática de 170 kDa (Juranka e colabora- dores, FASEB J 3: 2583 (1989); Bradley, G. e colaboradores, Blochem. Bio- phys. Acta 948: 87 (1988)). O gene que codifica esse sistema de bomba, algumas vezes referido como um transportador de múltiplos fármacos, foi clonado de células humanas cultivadas e é geralmente referido como mdrl. Esse gene é expresso em várias classes de tecidos normais, mas substratos fisiológicos transportados para o produto do gene mdrl nesses tecidos não foram identificados. O produto MDR1 é um membro da superfamília da Pro- teína Transportador ABC, um grupo de proteínas tendo função de exporta- ção energia - dependente.
O produto de proteína do gene mdrl, geralmente conhecido co- mo P-glicoproteína ("P-170", "P-gp"), é uma proteína na membrana trans- plasmática de 170 kDa que constitui a bomba de efluxo energia-dependente antes mencionada. Expressão de P-gp sobre a superfície celular é suficiente para tornar as células resistentes a múltiplos fármacos citotóxicos, incluindo múltiplos agentes anticâncer. MDR P-gp- mediada parece ser um compo- nente clínico importante da resistência do tumor em tumores de diferentes tipos e expressão do gene mdrl se correlaciona com a resistência à quimio- terapia em diferentes tipos de câncer.
A seqüência de nucleotídeo do gene mdrl (Gros, P. e colabora- dores, Cell 47: 371 (1986); Chen, C. e colaboradores, Cell 47: 381 (1986)) indica que ele codifica um polipeptídeo similar ou idêntico à planta glicopro- teína e que esses são membros da classe altamente conservada de proteí- nas da membrana similares a transportadores bacterianos e estão envolvi- dos em processos normais de transporte fisiológico. Análise de seqüência do gene mdrl indica que Pgp consiste em 1280 aminoácidos distribuídos entre duas metades homólogas (identidade de 43%). Cada metade da molécula tem seis domínios transmembrana hidrofóbicos e cada um tem um sítio de ligação de ATP dentro dos grandes Ioops citoplásmicos. Apenas cerca de 8% da molécula são extracelulares e a porção de carboidrato (aproximada- mente 30 kDa) está ligada a sítios nessa região.
Assim, será apreciado que células de mamífero tendo uma "re- sistência a múltiplos fármacos" ou fenótipo de "resistência a múltiplos fárma- cos" são caracterizadas pela capacidade de capturar, exportar ou expelir uma pluralidade de substâncias citotóxicas (por exemplo, fármacos quimiote- rapêuticos) do milieu intracelular. Células podem adquirir esse fenótipo como um resultado da pressão de seleção imposta através de exposição a um úni- co fármaco quimioterapêutico (a toxina de seleção). Alternativamente, as células podem exibir o fenótipo antes de exposição à toxina, uma vez que a exportação de substâncias citotóxicas pode envolver um mecanismo em comum com a exportação normal de produtos de secreção celular, metabóli- tos e similares. Resistência a múltiplos fármacos difere da resistência adqui- rida simples à toxina de seleção pelo fato de que a célula adquire competên- cia para exportar citoxinas adicionais (outros fármacos quimioterapêuticos) às quais a célula não foi previamente exposta. Por exemplo, Mirski e colabo- radores (1987), 47 Câncer Res. 2594-2598, descrevem o isolamento de uma população de células resistente a múltiplos fármacos através de cultura da linhagem de células H69, derivada de um carcinoma de pulmão de células pequenas humano, na presença de adriamicina (doxorrubicina) como uma toxina de seleção. Descobriu-se que as células que sobrevivem são resisten- tes aos efeitos citotóxicos de análogos de antraciclina (por exemplo, dauno- micina, epirrubicina, menogaril e mitoxantrona), acivicina etoposídeo grami- cidina D, colchicina e alcalóides Vinca- derivados (vincristina e vinblastina), bem como adriamicina. Técnicas similares de cultura de seleção podem ser aplicadas para gerar populações de células resistentes a múltiplos fármacos adicionais.
Conseqüentemente, as composições farmacêuticas da invenção podem, adicionalmente, incluir compostos os quais atuam para inibir o fenó- tipo de MDR e/ou condições associadas ao fenótipo de MDR. Tais compos- tos podem incluir quaisquer compostos inibidores de MDR conhecidos na técnica, tais como anticorpos específicos para componentes de MDR (por exemplo, anticorpos anti-transportadores de MDR) ou inibidores de pequena molécula de transportadores de MDR, incluindo especificamente, tamoxifen, verapamil e ciclosporina A, os quais são agentes conhecidos por reverter ou inibir a resistência a múltiplos fármacos. (Lavie e colaboradores J. Biol. Chem. 271: 19530-10536, 1996, incorporado aqui por referência. Tais com- postos podem ser encontrados nas Patentes U.S. N- 5.773.280, 6.225.325 e 5.403.574, cada uma das quais é incorporada aqui por referência. Tais compostos inibidores de MDR podem ser co-administrados com os anticor- pos e/ou fragmentos anti-MN da invenção para várias finalidades, incluindo reversão do fenótipo de MDR para auxiliar ou intensificar um tratamento quimioterapêutico. O inibidor de MDR, tal como, por exemplo, tamoxifen, verapamil ou ciclosporina A, pode ser usado em conjunto com os compostos da invenção para auxiliar na detecção do fenótipo de MDR. De acordo com esses aspecto, um inibidor de MDR pode intensificar a captação e acúmulo de um composto da invenção em uma célula cancerígena MDR, uma vez que a capacidade do sistema de transporte de MDR no transporte ou "bom- beamento" do composto cuja imagem foi formada vis-a-vis o domínio de substrato será diminuído na presença de um inibidor de MDR.
Em ainda outra modalidade, os anticorpos e/ou fragmento de anticorpo anti-MN da presente invenção são usados em associação com um programa de terapia genética no tratamento de câncer. Terapia genética com células recombinantes que secretam interleucina-2 pode ser adminis- trada em combinação com os anticorpos da invenção para prevenir ou tratar câncer, particularmente câncer de mama (vide, por exemplo, Deshmukh e colaboradores, 2001, J. Neurosurg. 94: 287).
Para avaliar a capacidade de um anticorpo em particular de ser terapeuticamente útil para tratar câncer, como um exemplo, o anticorpo pode ser testado em um modelo de tumor de xenoenxerto de camundongo in vivo. Essa conversão é descrita no Exemplo 5 e um exemplo de um modelo tera- pêutico é detalhado no Exemplo 9. A atividade do anticorpo pode também ser testada usando um ensaio de citotoxicidade célula-mediada anticorpo- dependente conforme descrito no Exemplo 12.
A presente invenção também proporciona métodos diagnósticos com os quais MN pode ser detectada em uma amostra do paciente ou amos- tra biológica. Tais métodos diagnósticos podem ser usados para diagnosticar distúrbios nos quais MN estão elevada. Tais distúrbios incluem, mas não estão limitados a, carcinomas do rim, esôfago, mama, cérvix, cólon e pul- mão. Quando usado para diagnóstico, detecção de uma quantidade do com- plexo anticorpo-MN em uma amostra de um paciente a qual é maior do que uma quantidade do complexo em uma amostra normal identifica o paciente como provável de ter o distúrbio. Um método imunohistoquímico para a de- tecção de MN em tecidos cancerígenos é descrito no Exemplo 11.
Em outro aspecto da invenção, um método é proporcionado para detecção e/ou visualização de um câncer MN-relacionado tendo uma quanti- dade anormal de proteína MN expressa. Tais métodos podem compreender contato da célula cancerígena MN relacionada com um anticorpo anti-MN ou fragmento da invenção e fazer uma imagem usando uma modalidade de formação de imagem médica, em que o anticorpo anti-MN ou fragmento compreende um domínio de rótulo capaz de ser detectado pela modalidade de formação de imagem médica.
Os métodos de detecção da invenção podem ser realizados in vitro. A célula ou tecido cancerígeno pode ser de qualquer fonte adequada, tal como, por exemplo, uma biópsia ou uma cultura de célula ou tecido. Mé- todos para obtenção de biópsias e manutenção e/ou propagação dos tecidos e/ou células removidas serão bem-conhecidos por aqueles habilitados. De- tecção in vitro de resistência a múltiplos fármacos pode ter várias aplicações tais como, por exemplo, determinar se um câncer de um indivíduo em parti- cular, quer antes, durante ou após tratamento, desenvolveu um fenótipo de resistência a múltiplos fármacos.
O tipo de modalidade de formação de imagem usada para detec- tar os compostos da invenção dependerá do domínio de rótulo usado em particular nos compostos da invenção. Por exemplo, se o domínio de rótulo compreende um quelato de gadolínio, então, tipicamente MRI poderia ser usada para detectar o agente de formação de imagem da invenção. Se um quelato de radionuclídeo é usado como domínio de rótulo, um método de formação de imagem nuclear poderia ser usado (por exemplo, PET). Se um domínio de rótulo baseado em fluorescência é usado, um sistema de forma- ção de imagem óptica poderia ser usado, tal como, por exemplo, um sistema FACS ou microscopia por microfluorescência ou um leitor para lâmina auto- mático por fluorescência. A escolha de uma modalidade de formação de i- magem apropriada para uso nos métodos de detecção in vitro da invenção está completamente dentro do conhecimento do técnico versado.
Além disso, a quantidade de agente de formação de imagem usado nos métodos de detecção in vitro da invenção será determinada por aqueles versados na técnica e pode depender do grau até o qual o fenótipo de MDR está presente, por exemplo, o nível de expressão do sistema de transporte de MDR (por exemplo, a P-glicoproteína). O técnico versado pode determinar qual quantidade dos novos compostos de formação de imagem que é suficiente para detecção de um fenótipo de MDR sem experimentação indevida isto é, uma quantidade detectavelmente suficiente.
O tipo de modalidade de formação de imagem usado não está limitado a qualquer tipo em particular e pode incluir (por exemplo, MRI, for- mação de imagem nuclear, por exemplo, PET ou SPECT), formação de ima- gem óptica, formação de imagem por sonoluminescência ou formação de imagem fotoacústica (ultra-som). O técnico versado apreciará que o domínio de rótulo em particular dos compostos de formação de imagem da invenção deverá ser compatível com a modalidade de formação de imagem que está sendo usada em particular.
Em uma modalidade preferida, os métodos de detecção utilizam anticorpos anti-MN e/ou fragmentos dos mesmos e rótulos apropriados que são capazes de ser detectados através de MRI. Por exemplo, os anticorpos ou fragmentos da invenção podem compreender um domínio de rótulo que é um agente de contraste para MR, tal como, por exemplo, um quelato de me- tal paramagnético ou quelatos ou qualquer um daqueles descritos aqui. O agente de formação de imagem também pode compreender um domínio de rótulo de radionuclídeo para formação de imagem ou detecção através de uma modalidade de formação de imagem nuclear, tal como tomografia por emissão de positron (PET) ou tomografia computadorizada por emissão de um único fóton (SPECT) por exemplo, um radionuclídeo, tal como, por e- xemplo, 199Au, 72As, 141Ce, 67Cu, 60Cu, 52Fe, 67Ga, 68Ga, 51Gr, 111In, 177Lu, 51Mn, 203Pb, 188Re, 97Ru, 47Sc, 177mSn, 94mTc, 167Tm e 90Y. O radionuclídeo pode ser quelado através de um quelador ou através de múltiplos quelado- res adequados, tais como, por exemplo, HYNIC, DRPA, EDTA, DOTA, TE- TA1 DTPA e ΒΑΤ. Condições sob as quais um quelador coordenará um me- tal são descritas, por exemplo, por Gansow e colaboradores, Patentes U.S. N— 4.831.175, 4.454.106 e 4.472.509, cada uma das quais é incorporada aqui por referência. 99mTc (Tecnécio-99m) é um rádio isótopo particularmen- te atraente para aplicações terapêuticas e diagnosticas, uma vez que ele está geralmente disponível para departamentos de medicina nuclear, é bara- to, proporciona doses mínimas de radiação para o paciente e tem proprieda- des ideais de formação de imagem nuclear.
A amostra do paciente pode ser contatada com um anticorpo da invenção e a amostra do paciente pode, então, ser ensaiada com relação à presença de um complexo de anticorpo-MN. Conforme descrito acima, o an- ticorpo pode compreender uma rótulo detectável, tal como um rótulo fluores- cente, radioisotópico, quimioluminescente ou enzimático, tal como peroxida- se de armorácia, fosfatase alcalina ou luciferase.
Opcionalmente, o anticorpo pode ser ligado a um suporte sólido, o qual pode acomodar automatização do ensaio. Suportes sólidos adequa- dos incluem, mas não estão limitados a, lâminas de vidro ou plástico, lâmi- nas de cultura tecidual, cavidades de microtitulação tubos, chips de silício ou partículas tais como contas (incluindo, mas não limitado a, contas de látex, poliestireno ou vidro). Qualquer métodos conhecido na técnica pode ser u- sado para fixar o anticorpo ao suporte sólido, incluindo o uso de ligações covalentes e não covalentes, absorção passiva ou pares de porções de liga- ção presos ao anticorpo e o suporte sólido. A ligação de MN e do anticorpo pode ser realizada em qualquer vaso adequado para contenção dos reagen- tes. Exemplos de tais vasos incluem lâminas de microtitulação, tubos de en- saio e tubos para microcentrífuga.
Composições Farmacêuticas e Dosaqens
Os anticorpos descritos aqui podem ser proporcionados em uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser não pirogênico. As composições podem ser administradas sozinhas ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como um composto de estabilização, o qual pode ser administrado em qualquer veículo farmacêutico biocompatível esté- ril incluindo, mas não limitado a, solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. Uma variedade de veículos aquosos podem ser emprega- dos, incluindo, mas não limitado a, solução salina, glicina ou semelhante.
Essas soluções são estéreis e geralmente isentas de matéria em partícula. Essas soluções podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem-conhecidas (por exemplo, filtração).
Em geral, a frase "veículo farmaceuticamente aceitável" é reco- nhecido na técnica e inclui um material farmaceuticamente aceitável, com- posição ou veículo, adequado para administração dos compostos da presen- te invenção a mamíferos. OS veículos incluem um material enchedor sólido ou líquido, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulação, envol- vido no transporte do agente em questão de um órgão ou porção do corpo para outro órgão ou porção do corpo. Cada veículo deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o paciente. Alguns exemplos de materiais os quais podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carbóxi metil celulose de sódio e, etil celulose e acetato de celulose; tragacanta em pó; malte; gelati- na; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositório; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como propileno glicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno gli- col; ésteres, tais como oleato de etila e Iaurato de etila; ágar; agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções tampões de fosfato; e outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.
Agentes de umedecimento, emulsificantes e lubrificantes tais como Iauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes de coloração, agentes de liberação, agentes de revestimento, adoçantes, agen- tes flavorizantes e aromáticos, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes nas composições de anticorpo da invenção.
Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis inclu- em: antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e simila- res; antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidró- xianisola butilada (BHA, hidroxitolueno butilado (BHT)1 lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol e similares; agentes de quelação de metal, tais como ácido cítrico, ácido etileno diamina, tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartá- rico, ácido fosfórico e similares.
As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceu- ticamente aceitáveis conforme requerido para se aproximar das condições fisiológicas, tais como agentes para ajuste de pH e tamponamento e simila- res. A concentração de anticorpo da invenção em tal formulação farmacêuti- ca pode variar amplamente e pode ser selecionada primariamente baseado em volume de fluídos, viscosidade etc., de acordo com o modo de adminis- tração selecionado em particular. Se desejado, mais de um tipo de anticorpo pode ser incluído em uma composição farmacêutica (por exemplo, um anti- corpo com uma Kd diferente para ligação à MN).
As composições podem ser administradas a um paciente sozi- nhas ou em combinação com outros agentes, fármacos ou hormônios. Além dos ingredientes ativos, essas composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipien- tes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparados os quais podem ser usados farmaceuticamente. Composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas através de qualquer número de vias incluindo, mas não limitado a, os meios oral, intravenoso, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, trans- dérmico, subcutâneo, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópico, sublin- gual ou retal.
As composições da invenção consideram, adicionalmente, imu- noveículos adequados tais como proteínas, polipeptídeos ou peptídeos, tais como albumina, hemocianina, tiroglobulina e derivados dos mesmos, particu- larmente albumina de soro bovino (BSA) e hemocianina do caramujo mega- thura crenulata (KLH), polissacarídeos, carboidratos, polímeros e fases sóli- das. Outras substâncias derivadas de proteína ou não derivadas de proteína são conhecidas por aqueles versados na técnica.
Em aspectos envolvendo vacinas, por exemplo, vacinas contra o câncer junto com os anticorpos da invenção, as composições da invenção podem ser administradas com ou sem um adjuvante. A administração pode ser realizada na ausência de um adjuvante de forma a evitar qualquer toxici- dade adjuvante - induzida. Aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence, por exemplo, um médico especializado em câncer, apre- ciarão e compreenderão como determinar se um adjuvante deverá ou não ser usado e pode depender da história médica de um indivíduo, dados fami- liares, dados de toxicidade, resultados de testes alérgicos, etc.. Em uma modalidade onde um adjuvante é usado, é vantajoso que o adjuvante pro- mova a formação de anticorpos protetores, tais como anticorpos de IgG pro- tetores. Qualquer adjuvante adequado conhecido por aqueles versados na técnica é considerado pela presente invenção e são prontamente adaptados à presente invenção. Adjuvantes adequados para uso em vacinação de ani- mais podem incluir, mas não estão limitados a, hidróxido de alumínio, sapo- nina e seu componente Quit A purificado, adjuvante completo de Freund (CFA) e adjuvante incompleto de Freund (IFA). Foi mostrado que sulfato de dextrana é um estimulador potente de anticorpo lgG2 contra antígenos na superfície celular estafilocócica e é também adequado como um adjuvante. Será apreciado por aqueles habilitados que alguns adjuvantes podem ser mais preferíveis para aplicação veterinária, enquanto que outros adjuvantes serão preferíveis para usos em seres humanos e que toxicidades por adju- vante são uma consideração que deverá ser feita por aqueles habilitados antes de administração do composto a um ser humano.
Formulações adequadas para administração parenteral, subcu- tânea, intravenosa, intramuscular e similares; veículos farmacêuticos ade- quados; e técnicas para formulação e administração podem ser preparadas através de qualquer um dos métodos bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Remington1S Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Eas- ton, Pa., 2 O8 edição, 2000). Formas de dosagem líquida para administração oral dos compostos da invenção incluem emulsões farmaceuticamente acei- táveis, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Além do ingrediente ativo, as formas de dosagem líquida podem conter um diluente inerte comumente usado na técnica, tal como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, ben- zoato de benzila, propileno glicol, 1,3 butileno glicol, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germe, oliva, mamona e gergelim, glicerol, álcool, tetrahidrofurfurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitan e misturas dos mesmos.
As frases "administração parenteral" e " parenteral administra- da", conforme usado aqui, significam outros modos de administração que não administração interal e tópica, usualmente através de injeção e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperito- neal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinhal e intra-esternal.
A determinação da dose terapeuticamente eficaz está bem den- tro da capacidade daqueles versados na técnica. Uma dose terapeuticamen- te eficaz se refere à quantidade de um anticorpo que pode ser usada para tratar eficazmente uma doença (por exemplo, câncer) comparado com a efi- cácia que é evidente na ausência da dose terapeuticamente eficaz.
A dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em modelos com animais (por exemplo, ratos, camundongos, coelhos, cães ou porcos). O modelo com animais pode também ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e via de administração. Tal informação pode, então, ser usada para determinar doses úteis e vias para administra- ção em seres humanos.
A eficácia terapêutica e toxicidade (por exemplo, ED50 - a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população e LD50 - a dose letal para 50% da população) de um anticorpo podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padrões em culturas de célula ou animais ex- perimentais. A proporção de dose de efeitos tóxicos para terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a proporção, LD50ZED50. Os dados obtidos de estudos com animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso humano. A dosagem contida em tais com- posições pode estar dentro de uma faixa de concentrações em circulação que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro dessa faixa, dependendo da forma de dosagem empregada, sensibi- lidade do paciente e a via de administração.
A dosagem exata pode ser determinada pelo praticamente, à luz de fatores relacionados ao paciente que requer tratamento. A dosagem e administração podem ser ajustadas para proporcionar níveis suficientes do anticorpo ou manter o efeito desejado. Fatores que podem ser levados em conta incluem a gravidade do estado doentio, saúde geral do indivíduo, ida- de, peso e sexo do indivíduo, dieta, tempo e freqüência de administração, combinação(ões) de fármaco, sensibilidades de reação e tolerância/resposta à terapia.
Polinucleotídeos que codificam os anticorpos da invenção po- dem ser construídos e introduzidos em uma célula, quer ex vivo ou in vivo usando técnicas bem estabelecidas, incluindo, mas não limitado a, transfe- rência de DNA mediada por transferrina-policátions, transfecção com ácidos nucleicos não revestidos ou encapsulados, fusão celular lipossoma-mediada, transporte intracelular de contas de látex revestidos com DNA, fusão de pro- toplasta, infecção viral, eletroporação, "pistola de gene" e transfecção medi- ada por fosfato de cálcio ou DEAE.
Dosagens eficazes in vivo de um anticorpo estão na faixa de cerca de 5 μg a cerca de 500 μg/kg de peso corporal do paciente. Para ad- ministração de polinucleotídeos que codificam os anticorpos, dosagens efi- cazes in vivo estão na faixa de cerca de 100 ng a cerca de 500 μg de DNA.
O modo de administração de composições farmacêuticas con- tendo anticorpo da presente invenção pode ser qualquer via adequada a qual distribui o anticorpo ao hospedeiro. Como um exemplo, composições farmacêuticas da invenção podem ser úteis para administração parenteral (por exemplo, administração subcutânea, intramuscular, intravenosa ou in- tranasal).
Todas as patentes e pedidos de patente citados na presente descrição são expressamente incorporados aqui por referência. A descrição acima descreve de modo geral a presente invenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida através de referência aos exemplos específi- cos a seguir, os quais são proporcionados para fins de ilustração apenas e não se destinam a limitar o escopo da invenção.
EXEMPLOS
As estruturas, materiais, composições e métodos descritos aqui se destinam a ser exemplos representativos da invenção e deve ser enten- dido que o escopo da invenção não está limitado pelo escopo dos exemplos. Aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção pode ser pratica- da com variações nas estruturas, materiais, composições e métodos descri- tos e tais variações são consideradas como dentro do âmbito da invenção. Exemplo 1: Construção da biblioteca de Fab combinatorial humana (HuCAL Gold)
HuCAL® GOLD é uma biblioteca de anticorpo baseada na tecno- logia HuCAL® (Human Combinatorial Antibody Library; MorphoSys AG, Mar- tinsried/Planegg, Alemanha). A biblioteca combina uma biblioteca de anti- corpo totalmente humano sintética no formato Fab se caracterizando por seis regiões de CDR diversificadas, com uma tecnologia de visualização pa- ra seleção de anticorpos de alta afinidade, CysDisplay® (MorphoSys AG, Martinsried/Planegg, Alemanha). CysDisplay® é uma tecnologia de phage display monovalente baseada em uma ligação de fenótipo-genótipo via liga- ções de dissulfeto, o que permite a recuperação de anticorpos específicos com altas afinidades.
O vetor de phage display pMORPH®23 é um vetor de fagemídeo que permite CysDisplay® monovalente de fragmentos Fab. Ele codifica a glllp de comprimento total, a cadeia Fd (Vh-ChI) e a cadeia leve (Vl-Cl), todas as quais são equipadas com diferentes seqüências sinalizadoras se- cretárias as quais dirigem a cadeia de proteína correspondente ao periplas- ma de E. coli. Seqüências sinalizadoras ompA e phoA são utilizadas para transportar as cadeias pesada e leve para o periplasma, onde a montagem de cadeia via interações não covalentes ocorre. Esse vetor de visualização traz um promotor Iac induzível/região operadora. O produto do gene Iaqlq para repressão de expressão é fornecido pela cepa hospedeira de E. coli TG1. Indução de expressão de Cys-glllp e Fab é obtida através da adição de IPTG (isopropil-p-D-tio-galacto-piranosídeo). Os reservatórios de Fab enri- quecidos foram subclonados do pMORPH®23 ao vetor de expressão de Fab pMORPH®x9 usando as enzimas de restrição Xbal e EcoRI. Através dessa etapa, a cisteína e a parte Iigante-His6 no C-término da cadeia Fd foram re- movidos e a glllp é excisada. O vetor de expressão pMORPH®x9_Fab_FH proporciona duas tags C-terminais, uma FLAG e uma 6xHis, assim, facilitan- do a detecção e purificação das proteínas Fab.
Resgate de Fagemídeo e Amplificação de Fago
O fagemídeo de Fab HuCAL GOLD em células TG1 foi amplifi- cado em meio 2xTY suplementado com 34 μg/ml de cloranfenicol e 1% de glicose. Após infecção com fago auxiliar (VCSM13 -2-6 χ 1011 pfu/ml) a 37°C durante 30 minutos, células TG1 foram concentradas através de centrifuga- ção. Os fagos foram amplificados através de incubação das células TG1 in- fectadas a 22 eC durante a noite em meio 2xTY contendo 34 μg/ml de clo- ranfenicol, 50 μg/ml de canamicina e IPTG a 0,25 mM. O fago contendo so- brenadante foi usado para a fase de "panning".
Exemplo 2: "panning" em Fase Sólida
"panning" em fase sólida foi realizado através de revestimento de lâminas MaxiSorp® (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) ou Dy- nabeads® (Invitrogen, Carlsbad, CA) com proteína MN humana em PBS (1 μg/cavidade ou 1 μg/1 mg de contas). A proteína MN representa todo o do- mínio extracelular da proteína com uma histag C-terminal para purificação. A proteína MN foi expressa em uma linhagem de célula de mamífero HKB-11 e purificada através de cromatografia em Ni-NTA usando métodos padrões que são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Cavidades con- tendo proteína MN ligada foram bloqueadas com 5% de leite em PBS, lava- das em PBS, seguido por uma incubação de 2 horas em temperatura ambi- ente, com uma alíquota de biblioteca de fago HuCAL GOLD pré-bloqueada contendo 1 x 1012 fagos de Fab HuCAL GOLD. Os fagos ligados foram lava- dos e, então, eluídos com DTT a 20 mM em tampão de Tris a 10 mM em um pH de 8,0. Três ciclos de "panning" foram realizados, com amplificação de fago conduzida entre cada ciclo, conforme descrito acima. A estringência de lavagem foi aumentada entre cada ciclo de "panning" para diminuir a ligação não específica.
Exemplo 3: Subclonagem de Fragmentos Fab Selecionados para Expressão em E. coli
Os Fabs selecionados foram clonados do vetor de visualização pMORPH®23 para o vetor de expressão pMORPH®x9_Fab_FH para facilitar expressão rápida do Fab solúvel para seleção por ELISA. A preparação de DNA do vetor pMORPH®23 foi digerido com EcoRI e Xbal, assim, cortando todo o fragmento de codificação de Fab (ompA-VL-VL e phoA-Fd). Após subseqüente purificação, o fragmento foi ligado ao vetor pMOR- PHx9_Fab_FH preparado (também digerido com EcoRI/Xbal e purificado). O vetor contendo o inserto Fab foi transfectado em células TG1 F- de E. coli competentes através de eletroporação. As células de E. coli transformadas foram crescidas sobre lâminas LB contendo 34 μg/ml de cloranfenicol e 1% de glicose o/n a 37°C. As colônias foram selecionadas e colocadas em meio de cultura contendo 34 μg/ml de cloranfenicol e 1% de glicose. Glicerol foi adicionado a 20% e essas culturas iniciadoras de estoque foram armazena- das a -80°C até necessárias para ELISA. Para obter Fabs purificados, trans- formantes de E.coli trazendo esse vetor foram crescidos, tipicamente, em múltiplos de culturas em frasco de agitação de 1L, coletados e purificados usando cromatografia por afinidade Ni-NTA usando métodos bem- conhecidos por aqueles versados na técnica.
Exemplo 4: Identificação de Fragmentos Fab de Ligação à MN através de ELISA
Lâminas para ELISA Maxisorp com 96 cavidades foram revesti- das com 100 μΙ/cavidade de uma solução da proteína MN humana purificada em uma concentração de 5 μς/ιτιΙ em PBS. Os Fabs foram expressos usan- do transformantes de E.coli crescidos em meio 2xTY contendo 34 μς/ml de cloranfenicol a partir das culturas de estoque iniciadoras. Doze (12) horas antes de coleta, expressão de Fab foi induzida através da adição de IPTG (concentração final de 0,5 mM). As células foram submetidas à Iise e 100 μΙ de lisato foram incubados dentro da cavidade de uma lâmina Maxisorp pré- revestida com MN e bloqueada com leite durante 2 horas em temperatura ambiente. As lâminas foram, então, lavadas em TBS e TBS contendo Tween para remover a ligação não específica. Os Fabs ligados foram detectados com anticorpo anti-(Fab')2 humano de cabra conjugado à fosfatase alcalina (Pierce Chemical, Rockford, IL). O substrato AttoPhos (Roche Diagnostics, 15 Alameda, CA) foi usado conforme orientado nas instruções do fabricante; excitação foi a 430 nm e emissão foi lida a 535 nm.
Um grande número de transformantes de E. coli expressaram Fabs que exibiram uma proporção de sinal para ruído no ELISA > 10. Se- qüenciamento de DNA das regiões VH e VL identificou mais de 50 Fabs de ligação à MN únicos. As seqüências de DNA e proteína das VH e VL inteiras de dez anticorpos, baseado em suas propriedades funcionais, são mostra- das nas figuras 3 e 4, respectivamente. Cada um desses dez anticorpos descritos se ligou, através de ELISA, à proteína MN purificada isolada de uma linhagem de célula de expressão de mamífero, HKB-11 (figura 5). Os anticorpos examinados também reagiram com MN isolada de células de in- seto sf9 que tinham sido infectadas com um baculovírus que codifica o do- mínio extracelular da MN (figura 5) demonstrando que as interações por E- LISA foram específicas para a proteína MN e não quaisquer contaminantes vestigiais nos preparados de proteína. Em um ensaio BlAcore®, os anticor- pos da presente invenção se ligam especificamente à MN humana com uma Kd na faixa de 1 nM (1 χ 10"9 Μ) a cerca de 50 nM (5,0 χ 10"8 nM) (figura 5). Exemplo 5: Identificação de Fabs de Ligação à MN e IgGs As interações de ligação entre proteína MN e os anticorpos da presente invenção foram analisadas usando a tecnologia de ressonância em plasmônio sobre um instrumento BIAcore 3000 (BIAcore1 Uppsala, Suécia). Para a ligação de IgGs de comprimento total (1e4, 1aa1 e 3ee9), Fc de IgG anti-humana de bezerro foi covalentemente acoplada ao chip biossensor CM5 em alta densidade, usando um kit de acoplamento de amina padrão (BlAcore, Uppsala, Suécia). Um ensaio de captura foi, então, usado para ligar essa IgG à superfície Fc de IgG anti-humana-imobilizada, objetivando uma resposta de sinal no BIAcore de 300 unidades. O BIAcore foi operado a 25°C e uma taxa de fluxo de 10 μΙ/min de tampão de operação contendo PBSyTween 20 a 0,05% ou contendo Na-HEPES a 10 mM, pH de 7,5/NaCI a 150 mM/EDTA a 3 mM/Tween 20 a 0,005%. Após ligação do ligante, a taxa de fluxo foi, então, aumentada para 25 μΙ/min e várias concentrações de analito de MN (por exemplo, faixa de 50 nM a 1 nM) foram deixadas fluir so- bre a superfície durante 10 minutos, de modo que a fase de associação pu- desse ser monitorada. Dissociação, então, se processou durante 35 minutos, seguido por regeneração da Fc de IgG anti-humana superfície-imobilizada a 100 μΙ/min com 100 μΙ de ácido fosfórico a 10 mM. Sensorgramas foram a- daptados usando um modelo de ligação de Langmuir a 1:1 para calcular as constantes de taxa. A ligação de Fabs à MN foi similarmente examinada, exceto que uma IgG anti-Fab humano foi imobilizada sobre o chip e usada para capturar os Fabs antes de avaliação da ligação à MN. A figura 5 mostra as constantes de ligação resultantes para a ligação dos anticorpos descritos à proteína MN purificada. Cada um dos anticorpos se ligou à MN1 exibindo valores de Kd que oscilavam entre 0,15 e 50 nM.
Exemplo 6: Construção de Vetores de Expressão de Imunoglobulina HuCAL para Expressão Transitória de Anticorpo em Células 293 F Vetor de Expressão de Cadeia Pesada
O sítio de clonagem múltipla do pcDNA3.1+ (Invitrogen, Carls- bad, CA) foi removido (Nhel/Apal) e um sítio compatível com os sítios de restrição usados para HuCAL foi inserido para a ligação das seqüências líde- res (Nhel/EcoRI), domínios VH (EcoRI/BIpl) e as regiões constantes de imu- noglobulina (Blpl/Apal). A seqüência líder (EMBL M83133) foi equipada com uma seqüência de Kozak (Kozak, Nucleic Acid Res. 15: 8125-8148,1987). As regiões constantes de IgGI humana (PIR J00228), lgG4 (EMBL K01316) e IgA1 no soro (EMBL J00220) foram dissecadas em oligonucleotídeos de sobreposição com comprimentos de cerca de 70 bases. Mutações silencio- sas foram introduzidas para remover sítios de restrição não compatíveis com o design HuCAL. Os oligonucleotídeos foram submetidos à splicing através de PCR por extensão de sobreposição. Vetores de Expressão de Cadeia Leve
O sítio de clonagem múltipla do pcDNA3.1/Zeo+ (Invitrogen, Car- Isbad1 CA) foi substituído por dois sítios diferentes. O sítio-□ proporcionou sítios de restrição para inserção de um □-lider (Nhel/EcoRV), Vk-domínios de HuCAL-scFv (EcoRV/BsiWI) e a região constante de cadeia-□ (Bsi- Wl/Apal). Os sítios de restrição correspondentes no sítio-λ eram Nhel/EcoRV (l-líder), EcoRV/Hpal (VI-domínios) e Hpal/Apal (região cons- tante de λ-cadeia). O D-Iider (EMBL Z00022), bem como o λ-líder (EMBL L27692) eram ambos equipados com seqüências de Kozak. As regiões constantes da D-cadeia humana (EMBL J00241) e λ-cadeia (EMBL M18645) foram montadas através de PCR de extensão por sobreposição conforme descrito acima.
Geração de IgG de Comprimento Total a partir de Fabs
A seqüência de cadeia pesada de Fab contida dentro do vetor de expressão de E. coli pMORPHx9_Fab_FH foi excisada cortando com Mfel/BIpl e ligada no vetor de expressão de cadeia pesada descrito acima que tinha sido cortado com EcoRI/BIpl. A seqüência de cadeia leve kappa do Fab contida dentro do pMORPHx9_Fab_FH foi excisada com EcoRV/BsiWI e ligada no vetor de expressão de cadeia leve Kappa descrito acima que tinha também sido cortado com EcoRV/BsiWI. A seqüência de cadeia leve lambda do Fab contida dentro do pMORPHx9_Fab_FH foi excisada com E- coRV/Hpaí e ligada no vetor de expressão Iambda descrito acima.
Expressão Transitória em Larga Escala de IgGs de Comprimento Total
Cellbag 20L/0 (Wave Biotech LLC, Somerset, NJ) foi cultivado com 0,25 χ 106 células 293F/ml (Invitrogen) em 9,3 L de meio de expressão Freestyle 293 (Invitrogen). As células foram crescidas para uma densidade de 1 χ 106/ml e transfectadas através da adição de 5 mg cada do vetor de expressão de cadeia leve e do vetor de expressão de cadeia pesada que codificam o anticorpo de comprimento total em 350 ml de Optimem (Invitro- gen) contendo reagente 293fectin (Invitrogen). Após fermentação durante 96 horas a 37°C, o sobrenadante de cultura de célula foi coletado através de centrifugação, filtrado estéril, concentrado através de filtração em fluxo tan- gencial, ajustado para um pH de 7,6 e, então, submetido à cromatografia em coluna de proteína A (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Exemplo 7: Ensaio de Adesão Celular
Cinqüenta (50) μ!_ de uma solução a 1 μg/mL de MN purificada em PBS foram adsorvidos sobre uma lâmina com 96 cavidades não tratada durante a noite a 4°C. A solução foi removida e as cavidades enxaguadas 3x com PBS. As cavidades foram bloqueadas durante 1 hora com 200 μΙ_ de FBS a 50% em meio RPM11640. As cavidades foram, então, tratadas com 100 μg de anticorpo anti-MN 1e4 em BSA a 1% em PBS, IgG de controle em BSA a 1% em PBS ou BSA a 1% em PBS. Após lavagem com PBS, 5000 células MaTu (células MN+) foram adicionadas às cavidades e a lâmina in- cubada durante a noite a 37°C a 5% de CO2. A capacidade dos anticorpos anti-MN de bloquear a adesão de células MaTu à cavidades revestidas com MN foi avaliada após lavagem com PBS. Um exemplo desse experimento é mostrado na figura 6, onde 100 μg de anticorpo anti-MN 1e4 inibe a adesão celular, enquanto que IgG de controle ou o veículo tampão não.
Exemplo 8: Modelo de Câncer de Xenoenxerto Subcutâneo com Imunocon- jugado
Anticorpos anti-MN foram conjugados à pequenas moléculas citotóxicas usando protocolos que são conhecidos na técnica (por exemplo, Liu e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 8618-8623, 1996). Xenoen- xerto mamário humano, células MaTu, foram mantidas como culturas ade- rentes em RPMI suplementado com FBS a 10%. Camundongos nus Ncr (8- 12 semanas de idade) foram inoculadas subeutaneamente no flanco direito com 5 χ 106 células em 0,1 mL de matrigel a 80%/HBSS a 20%. Quando os tumores atingiram um tamanho médio de -180 mg (6 dias), tratamento foi iniciado. Anticorpos monoclonais conjugados à pequenas moléculas citotóxi- cas foram administrados i.v. uma vez a cada quatro dias (Q4Dx3) em uma dose de 10 mg/kg. Camundongos de controle foram tratados com PBS ou um anticorpo monoclonal não conjugado. Exames diários no estado de saú- de de cada animal foram conduzidos. Cada grupo experimental consistia em 10 camundongos e o volume de dosagem foi de 0,1 mL/10 g de peso corpo- ral. O comprimento e largura de cada tumor forma medidos usando um cali- brador eletrônico 2-3 vezes por semana e os pesos do tumor (mg) foram cal- culados baseado na fórmula de [comprimento (mm) χ largura (mm)2]/2. To- dos os dados, incluindo observações diárias, obtidas no decorrer do curso do estudo, foram documentados em um Sistema de Aquisição de Dados An- ti-Tumor (ADAS). A dose máxima tolerada (MTD) é definida como a maior dose que não produz mais de 20% de letalidade e/ou uma perda de peso corporal líquida de 20%. Inibição de crescimento de tumor (TGI) foi calculada como (1-T/C)x100, onde T = pesos finais do tumor de um grupo tratado após a última dose e C = pesos finais do tumor do grupo de controle após a última dose. A figura 7 mostra que a IgGI monoclonal 1e4, quando conjugada a um fármaco citotóxico, produziu um efeito antitumor significativo a 30 mg/kg de imunoconjugado, enquanto que o anticorpo não conjugado não teve efeito. Esses dados demonstram a utilidade terapêutica dos anticorpos dirigidos contra proteína MN como veículos para distribuição de fármacos citotóxicos a tumores.
Exemplo 9: Ensaio de Seleção de Células Fluorescência-Ativado (ensaio FACS)
Células podem ser ensaiadas com relação à expressão de MN como ferramenta diagnostica. Células PC-3 mm2 expressando MN aderen- tes e células DLD1 não expressando MN foram soltas de seus frascos com tripsina/Versene a 1:10 em solução de PBS durante 5 a 10 minutos. As célu- las foram centrifugadas (1000 rpm, 5 minutos), lavadas uma vez com RP- MI/FBS a 10% gelado e ressuspensas em tampão de coloração gelado (PBS sem Ca+ Mg+, BSA a 2% e azida de sódio a 0,05%) a 6 χ "IO6 células/ml. An- ticorpo primário, IgGI anti-MN humana ou anticorpo IgGI humana de contro- le a 25 μg/mL foram incubados com 6 χ "IO5 células sobre gelo durante 1 ho- ra. O anticorpo não ligado foi lavado das células com tampão de coloração gelado. As células foram fixadas com formaldeído a 2% em PBS durante 10 minutos, então, lavadas duas vezes com tampão de coloração. O pélete de células foi ressuspensa em 100 μΙ de tampão de coloração gelado contendo anticorpo secundário anti-humano Alexa flúor 488 (conc. final de 1:200, Mo- lecular Probes/lnvitrogen, Carlsbad, CA) e incubado sobre gelo durante 1 hora. O anticorpo não ligado foi lavado das células duas vezes com tampão de fluxo (PBS contendo BSA a 2%) e as células foram ressuspensas em 1 mL de tampão de fluxo. Análise por FACS das células ressuspensas foi rea- lizada sobre um instrumento Beckman FACS Caliber. A figura 8 mostra que células de câncer de próstata humano PC-3 mm2 expressam MN, conforme ensaiado através de FACS, enquanto que células DLD-1 não.
Exemplo 10: Ensaios de Citotoxicidade Célula-mediada Anticorpo- dependente (ensaios de ADCC)
A atividade antitumor de IgGs anti-MN pode ser mediada através de atividade de ADCC. Células PC-3 mm2 expressando MN e células HCT- 116 não expressando MN são incubadas com 250 ng/mL, 1000ng/mL ou 2000 ng/mL de IgGI anti-MN humana ou anticorpo antidigoxina de IgGI hu- mana de controle. PBMCs humanas são adicionadas a essas células em proporções de efetuador:alvo de 50: 1, 25: 1 e 5: 1. Um ensaio de liberação de cromo-51 é realizado para determinar o nível de Iise de célula alvo. Uma pequena quantidade de Iise é observada quando de incubação de anticorpo de controle ou nenhum anticorpo na presença de células DLD e PC-3 mm2. Esse nível espontâneo de Iise é de 10-15%, 5-10% ou 2-3% para proporções de alvo:efetuador de 50:1, 25:1 e 5:1, respectivamente. Similarmente, Iise de células DLD não expressando MN estava na faixa de 0-10% quando incuba- das com os anticorpos anti-MN. Contudo, Iise de células PC-3 mm2 quando incubadas com as IgGs anti-MN humana era significativamente maior do que os controles. Lise de 40, 50 e 60% foi observada quando usando 250 ng/mL, 1000 ng/mL e 2000 ng/mL em proporções de alvo:efetuador de 50:1. Simi- larmente, lise de 30, 33 e 38% foi observada em proporções de 25:1 e, fi- nalmente, lise de 8, 10 e 15% foi observada em proporções de al- vo:efetuador de 5:1. Esses experimentos mostram que anticorpos anti-MN humana mediam a atividade de ADCC antitumor e podem ser usados para o tratamento terapêutico de câncer.
Exemplo 11: Imunoconjugado
Preparação
Um anticorpo humano dirigido ao antígeno na superfície celular MN foi gerado usando uma biblioteca de phage dispiay que codifica uma diversidade de Fabs humanos (Morphosys). Esse anticorpo foi conjugado à Monometil auristatina E (MMAE) (Fransisco e colaboradores, Blood, 2003, 102: 1458-1465) (figura 9).
Atividade e Seietividade in vitro
A porção de anticorpo do 3ee9/MMAE (3ee9) foi identificada a- través de ""panning"" in vitro de um domínio extracelular purificado de MN humana contra a biblioteca de fago MorphoSys composta de 1010 fragmen- tos Fab humanos (Fabs são as porções de ligação a antígeno dos anticor- pos). Os Fabs ativos foram ainda examinados com relação à sua capacidade de se ligar seletivamente sofrer internalização quando de adição de células MN-positivas. Os Fabs ativos resultantes foram, então, convertidos a anti- corpos de IgG1 de comprimento total, expressos em células CHO e, então, conjugados ao toxoforo MMAE (Liu e colaboradores, Proc Natl Acad Sei, 1996, 93: 8618-8623). Os anticorpos conjugados foram, então, testados com relação à sua capacidade de matar células expressando MN. De um painel de sete anticorpos de comprimento total testados, o 3ee9/MMAE foi selecio- nado baseado em suas propriedades de ligação, seletividade e potência em ensaios in vitro e in vivo.
Ressonância de Piasmônio em Superfície (Biacore)
Materiais e Métodos
Interações de ligação entre proteína MN humana HKB11- expressa e MAbs anti-MN de comprimento total usando a tecnologia de res- sonância de plasmônio em superfície sobre um instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Uppsala, Suécia). Para preparação do chip, Fc anti-lgG humana de bezerro foi covalentemente acoplada ao chip biossensor CM5 usando o kit de acoplamento de amina padrão (BIAcore, Uppsala, Suécia). Um ensaio de captura foi, então, usado para ligar os anticorpos de interesse à superfície Fc anti-lgG humana imobilizada, objetivando um sinal no BIAcore de 300 unidades de resposta. O BIAcore foi operado a 25C com uma taxa de fluxo de 10 μΙ/min de tampão de operação contendo PBS/Tween 20 a 0,05% ou contendo Na-HEPES a 10 mM, pH de 7,5/NaCI a 150 mM/EDTA a 3 mM/Tween 20 a 0,005%. Após ligação do ligante, a taxa de fluxo foi aumen- tada para 25 μΙ/min e analito de MN (50 nM a 1 nM) foram deixado fluir sobre a superfície durante 10 minutos, de modo que a fase de associação pudesse ser monitorada. Dissociação, então, se processou durante 35 minutos, se- guido por regeneração da Fc de IgG anti-humana superfície-imobilizada a 100 μΙ/min com 100 μΙ de ácido fosfórico a 10 mM. Sensorgramas foram a- daptados usando um modelo de ligação de Langmuir a 1:1 para calcular as constantes de taxa (Tabela 1, abaixo). Tabela 1
Afinidade de anticorpos "panning"-der\vaóos à MN solúvel determinada atra- vés de ressonância de plasmônio em superfície (Biacore)
<table>table see original document page 79</column></row><table>
Ligação de Anticorpo
Foi mostrado que 3ee9/MMAE tem uma kD de 3,6 nM para pro-
teína MN purificada usando a tecnologia Biacore, o qual tem a mesma afini- dade do anticorpo 3ee9 não conjugado. A ligação à MN (CA IX) parecia es- pecífica, uma vez que não houve ligação detectável a 13 outras anidrases carbônicas. Ligação a CA5 mitocôndria-associado foi observada, mas essa isozima seria inacessível ao anticorpo in vivo.
Através de análise por FACS1 foi mostrado que 3ee9/MMAE se liga à células MaTu expressando MN, mas não à células DLD MN-negativas (figura 10a). O anticorpo à MN G250, um anticorpo de IgGI humanizado (Wi- lex) foi usado como uma referência por todos os estudos in vitro. Ele se liga à MN com uma Kd de 5,3 nM e exibiu um perfil de ligação similar, em linha- gens de células MN+ e MN-, àquele do 3ee9/MMAE.
Resultados similares foram obtidos para o anticorpo 1E4 e imu- noconjugados 1aa1 (figuras 10b e 10c, respectivamente), os quais exibiram ligação à células MN+, mas não à células MN-.
Internalização de Anticorpo
3ee9/MMAE foi seletivamente internalizado por células expres- sando MN (PC3mm2), mas não por células MN-negativas (DLD1), conforme medido pela Cellomics (figura 11a). Similarmente, descobriu-se que o imu- noconjugado 1E4 foi internalizado por células MN+ (PC3mm2), mas não por células MN- (DLD1) (figura 11b).
Imunoprecipitacão
Para explorar adicionalmente a especificidade, vários anticorpos candidatos, incluindo a porção de anticorpo de 3ee9/MMAE (3ee9) e o anti- corpo de referência G250, foram incubados com Iisatos de célula de linha- gens de células MN+ (Pc3mm2) e MN- (DLD-1) que tinham sido seletiva- mente rotuladas com biotina. Complexos entre os anticorpos e proteínas ce- lulares foram imunoprecipitados e os antígenos co-precipitados visualizados usando imunoblots desenvolvidas com estreptavidina enzima-ligada. Ambos os anticorpos G250 e 3ee9 do 3ee9/MMAE se ligaram seletivamente e co- imunoprecipitaram com uma única banda do mesmo tamanho como MN de células MN+ (figura 12). Anticorpos menos específicos, tais como 3ef2, 5aa3 e 5A6, co-imunoprecipitaram várias outras proteínas, além de MN.
Citotoxicidade
Ensaios de citotoxicidade in vitro foram realizados. Descobriu-se que 3ee9/MMAE era altamente tóxicos para células PC3mm2 expressando MN (EC50 = 50 nM), mas não para células MIAPaca2 MN-negativas (figura 13a). Menos de 10% de morte das células MN-negativas foi observado em doses tão altas quanto 1 uM. Também descobriu-se que o imunoconjugado 1A4 era seletivamente citotóxico para células MN+ (PC3mm2 e MaTu), mas não para células MN- (MIAPaca2 e DLD1) nos ensaios de citotoxicidade in vitro (figura 13b). Adicionalmente, descobriu-se que o imunoconjugado 1aa1 era seletivamente citotóxico para células MN+ (PC3mm2), mas não para células MN- (MIAPaca2) nos ensaios de citotoxicidade in vitro (figura 13c).
O fármaco citotóxico MMAE distribuído pelo 3ee9/MMAE é um inibidor de tubulina que previne a formação de fuso durante mitose celular, resultando em interrupção G2/M. O efeito de tratamento de células expres- sando MN (Pc3mm2) e células que não expressam MN (H460) com 3ee9/MMAE é mostrado na figura 14. A tubulina é corada com anticorpo ro- tulado por fluorescencia. Células não tratadas mostraram formação de fuso normal, enquanto que as células tratadas expressando MN mostraram fibras fragmentadas resultantes de ligação de tubulina com MMAE e prevenção de formação de fusão normal. Nenhuma atividade foi observada em células não expressando MN. Esses estudos confirmaram que o conjugado de anticor- po/fármaco 3ee9/MMAE mata células através de ruptura tubulina-objetivada.
Exemplo 12: Atividade do imunoconjugado in vivo Farmacologia in vivo de 3ee9/MMAE contra modelos de câncer de xenoen- xerto humano implantados subcutaneamente
3ee9/MMAE exibe efeitos antitumor significativos e consistentes sobre o crescimento de múltiplos modelos de tumor de xenoenxerto humano em camundongos atímicos quando administrado através da via intravenosa em um esquema intermitente. O efeito antitumor in vivo de 3ee9/MMAE foi examinado em 6 diferentes modelos de tumor de xenoenxerto humano. Es- ses modelos foram estabelecidos através de implante subcutâneo de células de tumor humano em camundongos fêmeas atímicos NCr (nu/nu) (Taconic, NY). Os modelos de xenoenxerto de tumor humano avaliados incluíam o modelo de carcinoma mamário humano MaTu, os modelos de carcinoma cólon-retal humano HT-29 e Colo-205 (CRC), o modelo de carcinoma de próstata PC3MM2, o modelo CRC resistente a múltiplos fármacos HCT-15 (P-gp) e o modelo pancreático humano MiaPaCa2. PBS foi usado como um veículo e soluções de dosagem foram preparadas frescas diariamente. O volume de dosagem foi de 0,1 mL/10 g (10 mL/kg). O comprimento e largura de cada tumor foram medidos usando um calibrador eletrônico 2-3 vezes por semana e os pesos do tumor (mg) foram calculados baseado na fórmula de [comprimento (mm) χ largura (mm)2]/2. Todos os dados, incluindo observações diárias, obtidas no decor- rer do curso do estudo, foram documentados em um Sistema de Aquisição de Dados Anti-Tumor (ADAS). A dose máxima tolerada (MTD) é definida como a maior dose que não produz mais de 20% de Ietalidade e/ou uma perda de peso corporal líquida de 20%. Inibição de crescimento de tumor (TGI) foi calculada como (1-T/C)x100, onde T = pesos finais do tumor de um grupo tratado após a última dose e C = pesos finais do tumor do grupo de controle após a última dose. Além disso, a eficácia antitumor foi medida co- mo a incidência de respostas (ou respondedores ou regressões) definida como tumores com < 50% de seu tamanho inicial. Uma duração mínima de 7 dias é requerida para que uma resposta seja considerada durável. Elicácia de 3ee9/MMAE no modelo de xenoenxerto MaTu
Xenoenxerto mamário humano, células MaTu, foram mantidos como culturas aderentes em RPMI suplementado com FBS a 10%. Camun- dongos nus NCr (8-12 semanas de idade) foram inoculados subcutaneamen- te no flanco direito com 5x 106 células em 0,1 ml_ de matrigel a 80%/HBSS a 20%. Quando os tumores atingiram um tamanho médio de -180 mg (7 dias), o tratamento foi iniciado. BAY 79-4620 (3ee9-IC) foi administrado i.v. uma vez a cada quatro dias (Q4Dx3) em uma dose de 1, 3 e 10 mg/kg. Camun- dongos de controle foram tratados com PBS ou um anticorpo monoclonal não conjugado em uma dose de 10 mg/kg.
Exames diários no estado de saúde de cada animal foram con- duzidos. Cada grupo experimental consistia em 10 camundongos e o volume de dosagem foi de 0,1 ηιΙ_ΛΙ0 g de peso corporal. O comprimento e largura de cada tumor foram medidos usando um calibrados eletrônico 2-3 vezes por semana e os pesos do tumor (mg) foram calculados baseado na fórmula de [comprimento (mm) χ largura (mm)2]/2. Todos os dados, incluindo obser- vações diárias, obtidos por todo o curso do estudo foram documentados. Inibição de crescimento de tumor (TGI) foi calculada como 1-T/Cx100, onde T = pesos finais do tumor de um grupo tratado e C = pesos finais do tumor do grupo de controle.
3ee9/MMAE foi bem-tolerado em todas as doses examinadas, com todos os animais tratados não exibindo perda de peso significativa. A eficácia representativa de 3ee9/MMAE no modelo de tumor MaTu é ilustrada na figura 15. Tumores de grupos de controle tratados com veículo e não tra- tados cresceram progressivamente em todos os animais. O tempo médio de duplicação para os animais nos grupos de controle e com veículo foi de 11,2 dias. Ao final da dosagem, 3ee9/MMAE mostrou eficácia antitumor robusta em todas as doses examinadas. Mais especificamente, BAY 79-4620 (3ee9- IC) proporcionou uma TGI de 67, 72 e 78% a 1, 3 e 10 mg/kg, respectiva- mente. Em comparação, o mAb 3ee9 não conjugado não teve efeito signifi- cativo na inibição de crescimento desse tumor de xenoenxerto mamário.
Após o término do regime de dosagem predeterminado (Q4Dx3), o efeito de 3ee9/MMAE sobre o retardo de crescimento de tumor foi deter- minado. Conforme mostrado na figura 15, o tratamento com 3ee9/MMAE resultou em retardo de crescimento e regressão significativos do tumor. Na menor dose examinada (1 mg/kg), após terminar o tratamento, os tumores permaneceram estáveis durante ~2 semanas e começaram a crescer nova- mente depois. Em geral, 30% dos tumores foram responsivos a esse trata- mento de 1 mg/kg. Em comparação, 100% dos animais responderam quan- do estimulados com 3 e 10 mg/kg. De nota, mesmo após ~3 meses após o término de tratamento, apenas 3 e 1 tumores mostraram sinais de recresci- mento nos grupos com 3 e 10 mg/kg, respectivamente, mostrando que 70 e 90% dos animais permaneceram sem tumor mesmo após -90 dias após o término de tratamento.
A IgGI monoclonal 1E4, quando conjugada a um fármaco citotó- xico, produziu um efeito antitumor significativo contra o xenoenxerto mamá- rio humano, MaTu, quando dosada a 30 mg/kg de imunoconjugado, enquan- to que o anticorpo não conjugado não teve efeito (figura 16). Outros experi- mentos usando o mesmo protocolo, mas substituindo formas conjugados do anticorpo 1aa1 (figura 17), 3ee9 e 5aa3, proporcionaram resultados simila- res. Adicionalmente, quando usando a forma conjugada de 3ee9, efeitos an- titumor foram observados em outros modelos de xenoenxerto humano deri- vados de vários tipos histológicos, incluindo, modelos de xenoenxerto de câncer cólon-retal humano HT-29 e Colo-205 e PC3-mm2, um modelo de xenoenxerto de próstata humana. Esses dados indicam a utilidade terapêuti- ca dos anticorpos dirigidos contra a proteína MN como veículos para distri- buição de fármacos citotóxicos a tumores.
Exemplo 13: Determinação do índice terapêutico de 3ee9/MMAE no modelo de xenoenxerto MaTu
A dose máxima tolerada (MTD)1 dose mínima eficaz (MED) e índice terapêutico (TI) de 3ee9/MMAE foram determinados usando camun- dongos trazendo tumor de xenoenxerto MaTu. O Tl é definido como a pro- porção da MTD dividido pela MED. 3ee9/MMAE foi administrado intraveno- samente uma vez a cada 4 dias durante um total de 3 injeções (Q4Dx3). 3ee9/MMAE foi administrado em níveis de dose de 0,625, 1,25, 2,5, 5,0, 10, 30 e 60 mg/kg. Camundongos de controle foram tratados com PBS ou um anticorpo monoclonal não conjugado em uma dose de 60 mg/kg. 3ee9/MMAE dosado a 60 mg/kg parecia ser a MTD, uma vez que houve Ie- talidade de 10% e -20% de perda de peso corporal em resposta a esse tra- tamento. Todos os outros grupos de tratamento foram bem-tolerados.
A atividade antitumor de 3ee9/MMAE é apresentada na figura 18. Ao final da dosagem, 3ee9/MMAE em uma dose de 0,625 e 1,25 mg/kg resultou em inibição de 62 e 81%, respectivamente. Doses de 2,5, 5, 10, 30 e 60 mg/kg resultaram em uma maior inibição de crescimento de tumor (-90%) com a maioria dos tumores começando a mostrar regressões. Base- ado nos dados observados, a MED de 3ee9/MMAE foi de 0,625 mg/kg. Após o término do regime de dosagem predeterminado (Q4Dx3), o efeito de 3ee9/MMAE sobre o retardo de crescimento de tumor e regressão foi deter- minado. Nenhuma regressão de tumor foi observada para a dose de 0,625 mg/kg. Em contraste, 80% dos animais exibiram regressões do tumor em resposta a 1,25 mg/kg. Além disso, em doses de 2,5 mg/kg e maior, 100% dos animais responderam ao tratamento. O índice terapêutico de 3ee9/MMAE foi determinado como sendo de -96.
Exemplo 14: Eficácia de 3ee9/MMAE no modelo de xenoenxerto HT-29
Xenoenxerto CRC humano, células HT-29 foram inoculadas subcutaneamente no fIanco direito com 5 χ "IO6 células em 0,1 mL de HBSS.
Quando os tumores atingiram um tamanho médio de -120 mg (5 dias), o tratamento foi iniciado. 3ee9/MMAE foi administrado i.v. uma vez a cada quatro dias (Q4Dx3) em uma dose de 0,625, 1,25, 2,5, 5,0, 10 mg/kg. Ca- mundongos de controle foram tratados com PBS ou um anticorpo monoclo- nal não conjugado em uma dose de 10 mg/kg. Além disso, MMAE foi avalia- do como um fármaco livre em uma dose de 0,1, 0,2 e 1 mg/kg. As doses de 0,1 e 0,2 mg/Kg de MMAE representam quantidades equivalentes desse fármaco àquelas presentes em 5 e 10 mg/Kg de 3ee9/MMAE, respectiva- mente.
3ee9/MMAE foi bem-tolerado em todas as doses examinadas, com todos os animais tratados não exibindo perda de peso significativa. Si- milarmente, doses menores de MMAE, isto é, 0,1 e 0,2 mg/kg, também fo- ram bem-toleradas com perda de peso mínima não significativa. Contudo, na maior dose de 1 mg/kg, Ietalidade de 50% foi observada com os animais res- tantes exibindo perda grave de peso e, assim, foi considerada tóxica.
A eficácia representativa de 3ee9/MMAE e MMAE livre no mode- lo de tumor HT-29 é ilustrada na figura 19. Tumores dos grupos de controle tratado com veículo e não tratado cresceram progressivamente em todos os animais. O tempo médio de duplicação para animais nos grupos de controle e veículo foi de 6,4 dias. Ao final da dosagem, 3ee9/MMAE mostrou eficácia antitumor robusta em todas as doses examinadas. Mais especificamente, 3ee9/MMAE em doses de 0,625, 1,25, 2,5, 5 e 10 mg/kg proporcionou uma TGI de 54, 72, 97, 100 e 100%, respectivamente. Em comparação, MMAE livre de 0,2mg/kg resultou em uma TGI significativa de 60%, enquanto que 0,1 mg/kg não teve efeito significativo na inibição do crescimento desse mo- delo de xenoenxerto. Em termos de respostas do tumor, 3ee9/MMAE dosa- do a 1,25 mg/kg resultou em 20% dos animais mostrando regressões. Nas maiores doses, as respostas do tumor foram muito maiores, com 2,5 mg/kg mostrando regressões de 90% e 5 e 10 mg/kg induzindo à respostas de 100%. Em contraste, MMAE livre não induziu à quaisquer respostas do tu- mor, conforme definido acima.
O efeito antitumor de 3ee9/MMAE também foi avaliado em es- quemas variados, isto é, dosagem uma vez por semana durante um total de duas doses (Q7Dx2, figura 20) e uma única dose no momento inicial (Q1Dx1, figura 21). Em ambos os esquemas, 3ee9/MMAE foi dosado a 0,625, 1,25, 2,5, 5 e 10 mg/kg. A despeito do esquema, 3ee9/MMAE foi al- tamente eficaz na inibição de crescimento nesse modelo de xenoenxerto CRC.
A Tabela 2 abaixo resume a eficácia antitumor de 3ee9/MMAE. A eficácia antitumor era muito similar àquela a qual foi observada para 3ee9/MMAE no esquema Q4Dx3 indicando que, nos esquemas examinados, a eficácia antitumor de 3ee9/MMAE parece ser esquema-independente.
Tabela 2
Eficácia antitumor de 3ee9/MMAE
<table>table see original document page 86</column></row><table> <table>table see original document page 87</column></row><table>
Exemplo 15: Eficácia de 3ee9/MMAE em modelos de xenoenxerto PC3mm2 e Colo-205
A atividade antitumor de 3ee9/MMAE foi, em seguida, avaliada contra xenoenxertos de tumor de próstata (PC-3mm2) e CRC (Colo-205).
Camundongos fêmeas NCr nu/nu foram implantados subcutaneamente (s.c.) com 5 χ 106 células PC3mm2 ou Colo-205. O tratamento foi iniciado quando os tumores estavam de um tamanho médio de aproximadamente 125-150 mg. A saúde geral dos camundongos foi monitorada e registrada diariamen- te. As dimensões do tumor e pesos corporais foram registrados duas vezes por semana, começando com o primeiro dia de tratamento.
Nos estudos com PC3mm2 e Colo-205, 3ee9/MMAE foi adminis- trado intravenosamente (i.v.) uma vez a cada 4 dias, durante um total de 3 injeções (Q4Dx3) em doses de 1, 3, 10 e 30 mg/kg e 1,25, 2,5, 5 e 10 mg/kg, respectivamente. Conforme em outros estudos, 3ee9/MMAE foi bem- tolerado em todas as doses avaliadas. 3ee9/MMAE inibiu o crescimento de tumores de próstata PC3MM2 estabelecidos quando administrado em níveis de dose de 10 e 30 mg/kg, com 100% dos animais mostrando respostas (fi- gura 22). Nas doses menores de 1 e 3 mg/kg, efeitos apenas moderados foram observados, uma vez que uma TGI de 45 a 50% foi observada ao final de dosagem. 20% dos animais, contudo, mostraram respostas no grupo com 3 mg/kg.
Similarmente, no modelo de xenoenxerto Colo-205 CRC, 3ee9/MMAE foi altamente eficaz na inibição de crescimento de tumor (figura 23). Ao final da dosagem, TGI >90% foi observado para doses de 5 e 10 mg/kg e TGI >70% foi observado em resposta à dose de 2,5 mg/kg. A menor dose, 1 mg/kg, de 3ee9/MMAE, foi relativamente ineficaz contra esse mode- lo CRC. Em termos de regressões, 3ee9/MMAE dosado a 5 e 10 mg/kg re- sultou em respostas de 40 e 80%, respectivamente.
Exemplo 16: Eficácia de 3ee9/MMAE em modelo de xenoenxerto HCT-15
Para examinar o efeito de 3ee9/MMAE em um modelo de resis- tência a múltiplos fármacos, camundongos fêmeas NCr nu/nu foram implan- tados subcutaneamente (s.c.) com 5 x 106 células HCT-15. HCT-15 é uma linhagem resistente a múltiplos fármacos (MDR) que superexpressa P- glicoproteína (P-gp). Como tal, essa linhagem de células exibe um fenótipo de resistência a múltiplos fármacos e é resistente ao Taxol®, doxorrubicina e etoposídeo. 3ee9/MMAE, Taxol e Gemcitabina foram administrados quando os camundongos tinham estabelecido tumores com um peso médio -150 mg. Gemcitabina, um análogo de pirimidina que não é um substrato para P- gp foi usada como um controle positivo. Conforme esperado, Gemcitabina (120 mg/kg, i.p., QDx10) foi altamente ativa nesse modelo MDR (figura 24). Em contraste, 3ee9/MMAE (MMAE sendo um substrato conhecido de P-gp) e Taxol® falharam em produzir qualquer efeito antitumor significativo. Exemplo 17: Eficácia de 3ee9/MMAE em modelos de xenoenxerto huMN- MIAPaca2 e MIAPaca2
Para entender melhor a relação entre expressão de MN e eficá- cia antitumor, estudos de eficácia de xenoenxerto foram conduzidos usando um modelo pancreático de baixa expressão de MN, MIAPaCa2 e um modelo de alta expressão de MN. Essa última linhagem foi derivada através de ma- nipulação da linhagem MIAPaCa2 para expressar estavelmente MN. 3ee9/MMAE tinha um efeito mínimo na inibição de crescimento dessa linha- gem MIAPaCa2 de baixa expressão de MN (figura 25). 3ee9/MMAE dosado a 10 mg/kg apenas produziu TGI de 50%. Em contraste, atividade antitumor significativa foi observada para 3ee9/MMAE contra o modelo huMN- MIAPaCa2 onde, no final da dosagem, doses de 2,5, 5 e 10 mg/kg propor- cionaram uma TGI de 63, 82 e 94%, respectivamente. Além disso, a dose de 10 mg/kg induziu à respostas de 100%, indicando que há um grande desvio na sensibilidade através de super-expressão dos níveis de MN em tumores. Exemplo 18: Combinação com Xeloda® no Modelo de xenoenxerto Colo-205
A possibilidade de uso de 3ee9/MMAE em conjunto com outros agentes quimioterapêuticos contra câncer foi investigada. Xeloda® é usado como tratamento de primeira linha de pacientes com carcinoma cólon-retal metastático. A atividade e tolerabilidade de terapia combinada usando 3ee9/MMAE e Xeloda® foram avaliadas. 3ee9/MMAE foi administrado i.v. em um esquema Q4Dx3 e em níveis de dose de 1,25, 2,5 e 10 mg/kg. Xeloda® foi administrado oralmente uma vez ao dia durante 9 dias em níveis de dose de 250 e 500 mg/kg. 3ee9/MMAE administrado sozinho a 2,5 e 10 mg/kg resultou em inibição robusta de crescimento de tumor (TGI de 73 e 96%, respectivamente) (figura 26a). O grupo com 1,25 mg/kg de 3ee9/MMAE, contudo, foi relativamente ineficaz, resultando em uma TGI de apenas 31%. Xeloda® administrado sozinho em níveis de dose de 250 e 500 mg/kg tam- bém produziu TGI robusto de 78 e 86%, respectivamente.
Em termos de respostas, o grupo com 10 mg/kg de 3ee9/MMAE induziu a uma taxa de resposta de 80%, enquanto que zero por cento dos animais em ambos os grupos com dose de Xeloda mostrou quaisquer re- gressões. Todos os grupos com tratamento combinado foram bem-tolerados e resultaram em inibição significativa de crescimento de tumor, bem como taxas de resposta. Dados quantitativos detalhando a TGI e respostas de tu- mor através de combinação desses dois agentes são mostrados nas figuras 26a e 26b, bem como na Tabela 3, abaixo. Nas doses examinadas, a ativi- dade antitumor de 3ee9/MMAE em combinação com Xeloda® foi mais supe- rior àquela de 3ee9/MMAE ou Xeloda® administrado como agentes únicos. Finalmente, com relação à tolerabilidade, a administração desses produtos terapêuticos foi bem-tolerada, sem reações adversas.
Tabela 3
Atividade antitumor de BAY 79-4620 (3ee9-IC) em combinação com Xeloda® <table>table see original document page 90</column></row><table>
Exemplo 19: Distribuição/localização de tumor in vivo de mAb 3ee9 contra o modelo de câncer por xenoenxerto humano bilateralmente implantado
Para determinar a distribuição e localização de tumor in vivo do componente mAb de 3ee9/MMAE, estudos de formação de imagem in vivo não invasivos foram conduzidos usando o CRI Maestro® em camundongos os quais receberam implanta bilateral de tumores exibindo alta e baixa ex- pressão de MN. O sistema de formação de imagem in vivo Maestro® (CRI, Woburn, MA) com aquisição multiespectral e análise é projetado para elimi- nar a interferência de autofluorescência. Mabs 3ee9 de BAY 79-4620, M75 (monoclonal de camundongo que reconhece MN) e IgG de controle humana, foram conjugados com Alexa Fluor 750 (Invitrogen Cat ng A20011) de acordo com as instruções do fabricante. A proporção de Proteína/AF750 (mol/mol) foi de 1/5,9 para 3ee9, 8,9 para IgG humana e 6,0 para M75.
Doze dias antes da injeção de cada anticorpo fluorescentemente rotulado, camundongos nus Harlan Balb/C foram implantados com MIAPa- Ca-2 (baixa expressão de MN; 7,5 χ 106 células em 50% de Matrigel) subcu- taneamente no flanco direito e huMN-MIAPaCa2 (linhagem de célula estável transfectada com MN; 5 χ 106 células em 50% de Matrigel) subcutaneamen- te no flanco esquerdo. 4 μς de anticorpo conjugado foram injetados no Dia 0 (12 dias pós-implante) em cada animal. Formação de imagem foi feita no Dia 4, Dia 5 e Dia 10. Os dados foram coletados usando animais que foram a- nestesiados (100 mg/kg de cetamina /10 mg/kg de xilazina, i.p.) e colocados dentro do sistema de formação de imagem. Cubos de imagem multiespectral (série de imagens) foram adquiridos com imagens espaçadas a cada 10 nm por toda a faixa espectral de 680 a 950 nm, a qual cobria a faixa próxima do Infravermelho (NIV).
Cada imagem foi exposta durante 5 segundos. Imagens falsa- mente coloridas foram sintetizadas a partir do cubo de espectro usando o software Maestro e escalonado para brilho visível usando ImagePro Plus 6.0. Escalonamento foi idêntico em todas as imagens, com a imagem mais brilhante ligeiramente abaixo do nível de saturação. A maioria dos anticorpos fluorescentemente rotulados tendem a se localizar no fígado e bexiga. Após 4 a 5 dias, a maioria do sinal, então, diminui do fígado e bexiga e estabiliza no tumor. Imagens tomadas no Dia 5 proporcionaram a maior proporção de sinal para interferência (figura 27). Após cinco dias, havia muito pouco sinal gerado dos animais injetados com hlgG, indicando que hlgG falhou em se localizar no tecido tumorígeno. Em contraste, M75 e 3ee9 se localizaram especificamente em tumores com alta expressão de MN (huMN-MIAPaCa2). Nenhuma localização foi observada em tumores MIAPaCa2 com baixa ex- pressão de MN nos mesmos animais.
Exemplo 20: Mecanismo de ação in vivo
Para explorar o mecanismo de ação in vivo de 3ee9/MMAE, tu- mores forma implantados subcutaneamente no flanco direito dos camundon- gos com 5 χ 106 células HT-29. Oito dias depois, camundongos atímicos tra- zendo tumores HT-29 foram tratados com veículo ou com 3ee9/MMAE a 1,25 e 5 mg/kg (Q1 Dx1). Os tumores foram coletados e fixados em formalina 4 horas e 1, 3 e 5 horas após administração de 3ee9/MMAE. As amostras foram, então, incrustadas em parafina, divididas em 5 μm, desparafinizadas e coradas usando um protocolo padrão para imunohistoquímica fluorescente de tecidos humanos utilizando anticorpos de camundongo: Anti-D/D- tubulina, Antifosfohistona H3 e DNA. As seções foram, então, observadas sob um microscópio fluorescente e imagens representativas foram tomadas através de três canais de cor distintos.
3ee9/MMAE tinha pouco efeito ao afetar o mecanismo celular nas amostras de 4 horas. Contudo, no dia 1, números aumentados de célu- las estavam em interrupção de G2/M e fuso multipolar foi observado clara- mente. Além disso, um nível diminuído de coloração de tubulina pôde ser observado. Esses efeitos foram, então, altamente amplificados nas amostras
do dia 3 e do dia 5. Na verdade, todas as células no grupo com dose de 5 mg/kg de 3ee9/MMAE no dia 5 foram gravemente afetadas pelo tratamento (figura 28). Esses dados indicam claramente que o 3ee9/MMAE afetou o crescimento de células cancerígenas através de inibição de tubulina, levan- do à interrupção de G2/M e apoptose.
A Tabela 4 abaixo resume o perfil de comportamento do 3ee9/MMAE.
Tabela 4
Perfil para 3ee9/MMAE
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Exemplo 21: Construção de vetor de expressão, transfecção, expressão e purificação de IgGs anti-MN baseado em regiões variáveis de CDR leve e pesada de 3ee9 usando um sistema de expressão de células CHO estável Construção do vetor de expressão 3ee9H+LpCMVUCOE8 As regiões variáveis de CDR kappa e pesada (SEQ ID NOS: 126 e 125, respectivamente) do vetor 3ee9pMORPHx9 (obtido de acordo com os Exemplos 1-3) foram inseridas no vetor H+LpattB (ML Laboratories) como segue. Um fragmento de enzima de restrição EcoRV - BsiWI de aproxima- damente 350 pares de base do 3ee9pMORPHx9 (preparado de acordo com os Exemplos anteriores, por exemplo, Exemplos 1-3) foi inserido nos sítios de enzima de restrição EcoRV - BsiWI do H+LpattB para gerar o vetor 3ee9kappapAttB. Em seguida, o fragmento de enzima de restrição Mfel-Bllpl de aproximadamente 350 pares de base do 3ee9pMORPHx9 foi inserido nos sítios de enzima de restrição EcoRI - Blpl do 3ee9kappapAttB para gerar o 3ee9H+LpattB. As seqüências de codificação pesada e leve de 3ee9 (SEQ ID NOS: 126 e 125, respectivamente) foram, então, recombinadas com pDONR221 (Invitrogen Cat. n- 12536-017) usando a mistura de enzima Ga- teway BP Clonase Il (Invitrogen Cat. ns 11789-100) para gerar o vetor 3ee9H+LpENTR. O vetor 3ee9H+L.pCMVucoE8 foi gerado através de recom- binação entre 3ee9H+LpENTR e pCMV_UCOE8_DEST usando a mistura de enzima Gateway LR Clonase II (Invitrogen Cat. nQ 11791-100).
A construção de pCMV_UCOE8_DEST foi como segue. O cas- sete de conversão de vetor Gateway (Invitrogen; cat ne 11828-029) foi inse- rido no sítio Smal do pCET906 para gerar o vetor pCET906_gw. O vetor pCET906 foi obtida da ML Laboratories e descrito totalmente em Williams e colaboradores, BMC Biotechnology, (2005), 5: 17, o qual é incorporado aqui por referência. O fragmento de enzima de restrição Agel de aproximadamen- te 2900 pares de base do pCET906_gw foi, então, clonado no sítio Agel do pCET1015 para gerar o pCMV_UCOE8_DEST. O vetor pCET1015 também foi obtido da ML Laboratories e o qual é descrito em Williams e colaborado- res, supra. O vetor pCMV_UCOE8_DEST foi propagado em uma cepa de E. coli resistente ao gene de toxina ccdB (por exemplo, tal como aquele comer- cializado como "One Shot ccdB Survival T1 Cells" da Invitrogen (cat ne: C7510-03)). A seqüência de nucleotídeo completa do inserto de 3ee9hui pCMVurnF8 é mostrada na figura 29, isto é, a seqüência de nucleotí- deo completa que codifica um anticorpo de IgG humana anti-MN compreen- dendo as regiões variáveis de CDR kappa e pesada de SEQ ID NOS: 126 e 125, respectivamente, obtido a partir do vetor 3ee9pMORPHx9.
Isolamento do clone de célula 3ee9.25
Para transfectar células CHO-S com vetor 3ee9H+L.pCMVucoE8, 60 μg de DNA foram diluídos em 2 mL dé CD CHO (invitrogen n910743-029) completo com L-glutamina a 8 mM e HT (Invitrogen) e carecendo de PenS- trep. Em seguida, 2 ml de meio CD CHO completo foram adicionados a um frasco de Erlenmeyer de 250 ml. Então, 150 μL de DMRIE-C (Invitrogen cat n°10459-014) foram adicionados ao frasco e incubados em TAdurante 10 min. O DNA diluído foi, então, misturado com DMRIE-C diluído, submetido a fluxo com 5% de CO2 e incubado em TAdurante 30 min. Durante a incuba- ção, 4 ml de células CHO-S a 5 χ 10"6 células/mL (2 χ 10"7 células no total) foram preparados em CD CHO completo (sem P/S). Após a incubação, as células foram adicionadas ao frasco com complexo de DNA-DMRIE-C e, en- tão, gentilmente agitadas para misturar. O frasco foi, então, submetido a flu- xo com 5% de CO2 e agitado a 125 rpm a 37 eC durante 4 horas. Em segui- da, 32 ml de meio CD CHO completo sem Pen Strep foram adicionados ao frasco, submetidos a fluxo com 5% de CO2 e, então, retornados para o agi- tador (37 °C) durante a noite. Após 24 horas, as células foram contadas, centrifugadas e ressuspensas em CD CHO completo mais 5,5 mL/L de PenStrep com 20% de meio condicionado e antibiótico (12,5 pg/ml de puro- micina) em uma densidade de célula apropriada para colocação em lâmina. As células foram colocadas a 100, 300, 900 e 2700 células/cavidade em lâ- minas com 96 cavidades. As lâminas foram, então, incubadas em uma incu- badora com 5% de CO2 durante aproximadamente 3 semanas. Cuidado foi tomado para não perturbar as lâminas.
Clones individuais foram expandidos das lâminas tendo cavida- des contendo colônias únicas em menos de 20% das cavidades sobre a lâ- mina. As células foram expandidas para lâminas com 24 cavidades com te- cido não tratado com 1 ml de meio seletivo por cavidade. As células foram incubadas durante cerca de 1 semana, durante a qual 500 μL de meio fresco foram adicionados, conforme necessário. Expressão de anticorpo foi testada em uma única diluição para eliminar clones que não expressam. Os clones foram testados através de ELISA em duplicada usando uma diluição de 1:5 (5 uL de sobrenadante em 95 uL de TBS/tween). Foram eliminados clones que proporcionaram uma OD (densidade óptica) abaixo de 0,1. Clones posi- tivos foram expandidos em lâminas com 6 cavidades com tecido não tratado. Em seguida, 5 mL de células foram cultivados a 4 χ 104 células/mL. Após 4 dias de incubação, a expressão de proteína foi determinada através de ELI- SA. Os clones foram testados usando diluições de 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400. O clone 3ee9.25 exibiu a maior concentração de anticorpo secretado. As células 3ee9.25 foram transferidas para um frasco agitador de Erlenme- yer de 125 mL, cultivando a 2 χ 105 células/mL, para adaptar as células a crescimento em suspensão.
Expressão de IgGs anti-MN
Células CHO-S transfectadas foram cultivadas em um Bio-reator Wave de 10 Litros (Wave Biotech, 300 Franklin Square Drive, Somerset1 New Jersey, 08873, EUA) a 500.000 células/ml. As células foram cultivadas durante sete dias em Meio CD-CHO a 50% (Invitrogen 10743), Meio Sigma CHO a 50% Número 5 (Sigma 0363), FCS a 1%, 1x HT suplemento (Invitro- gen 11067-030), Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen 15140-122), L- Glutamina a 8 mM (Invitrogen 25030-081) e 12,5 pg/ml de Puromicina (BD 631305) com o biorreator girando a 25 rpm sob uma atmosfera de 5% de CO2 a 37°C. Ao final do período de fermentação, meio de cultura consumido foi coletado através de centrifugação e filtrado estéril (0,2 μΜ) antes de puri- ficação de IgG.
Purificação das IgGs anti-MN
Tipicamente, 10 a 20 L de meio de cultura de células contendo IgG foram concentrados 2 a 5 vezes usando Prep-Scale TFF-2 30 kD Car- tridge (Millipore). Tampão de Tris-Cl a 1M, pH de 7,5, foi adicionado ao meio concentrado até a concentração final de 50 mM. NaCI a 5,0 M foi, então, a- dicionado até uma concentração final de 150 mM. O meio concentrado foi, tipicamente, carregado sobre uma coluna Protein Sepharose de 30 mL equi- librada com PBS, pH de 7,4. A coluna foi lavada com PBS, pH de 7,4, con- tendo Tween 20 a 0,1% e EDTA a 1 mM. A coluna foi, então, lavada com PBS e eluída com tampão de glicina a 100 mM, pH de 3,0. Quando de cole- ta, as frações foram neutralizadas para um pH de 7,5 com Tris-HCI a 1M, pH de 7,8. As IgGs purificadas foram transferidas para PBS através de diálise e esterilizadas através de filtração (0,2 μΜ). Os preparados finais de anticorpo purificado foram ajustados para entre 1 e 5 mg/mL, exibindo uma pureza > 95%, conforme determinado através de géis de SDS PAGE corados com azul comassie, quando do que a proteína migrou como duas bandas corres- pondendo às cadeias pesadas de Mr = 50 kDa e as cadeias leves de Mr = 25 kDa, tinham níveis de endotoxina de menos de 1 EU/mg de proteína e menos de 10% de agregado de proteína, conforme determinado através de SEC HPLC. Os preparados também foram submetidos à Q.C. funcional com relação à ligação de antígeno à MN através de ressonância de plasmônio em superfície, ligação à células expressando MN através de FACS e interna- lização em células expressando MN, conforme determinado através de for- mação de imagem automática (Cellomics). Uma fermentação combinada de 20L proporcionou, tipicamente, 1 grama de proteína purificada, com uma recuperação global de 50 a 75%. Seqüenciamento N-terminal de 255 pmols do preparado final de anticorpo 3ee9 de comprimento total purificado usando um seqüenciador ABI Procise 494 HT, proporcionou 368 pmols da seguinte seqüência esperada e para a cadeia leve kappa madura de: DIQMTQSPSS- LSASVGDRVTIT-RASQDINNYLSWYQQKP-. Essa é a mesma que a se- qüência N-terminal da cadeia leve Vkappal madura correspondente do mAb 3ee9 (SEQ ID NO: 146). A cadeia pesada não foi detectada através de se- qüenciamento de Edman, mostrando que sua seqüência foi bloqueada.
Tendo assim descrito em detalhes modalidades preferidas da presente invenção, deve ser entendido que a invenção definida pelos pará- grafos acima não está limitada aos detalhes particulares apresentados na descrição acima, uma vez que muitas variações evidentes da mesma são possível sem se desviar do espírito ou escopo da presente invenção.

Claims (91)

1. Anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um sítio de ligação antigênico especificamente dirigido contra uma proteína MN, em que o sítio de ligação antigênico inclui pelo menos uma CDR1, CDR2 ou CDR3: (a) a referida CDR1 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 77, 80, 81, 86, 87, 88, 89, 98, 99, 104, -107, 108 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% iden- tidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 57, 58, 59, 60, 61, 62, -77, 80, 81, 86, 87, 88, 89, 98, 99, 104, 107 ou 108; (b) a referida CDR2 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 78, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 100, 101, -105, 109, 110 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, -68,69, 78, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 100, 101, 105, 109 ou 110; e (c) a referida CDR3 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 79, 84, 85, 94, 95, 96, 97, 102, 103, -106, 111, 112 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 70, 71, 72, 73, 74, -75, 76, 79, 84, 85, 94, 95, 96, 97, 102, 103, 106, 111 ou 112.
2. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que o sítio de ligação antigênico compreende uma CDR de região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOS: 57-85 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 57-85.
3. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que o sítio de ligação antigênico compreende uma CDR de região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOS: 86-112 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 86-112.
4. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR selecionadas do grupo consistindo em: (a) [3ee9] SEQ ID NOS: 57, 63, 70, 89, 93 e 97; (b) [3ef2] SEQ ID NOS: 58, 64, 71, 107, 109 e 111; (c) [1e4] SEQ ID NOS: 59, 65, 72, 107, 109 e 111; (d) [3a4] SEQ ID NOS: 60, 66, 73, 108, 110 e 112; (e) 5 [3ab4] SEQ ID NOS: 61, 67, 74, 87, 91 e 95; (f) [3ah10] SEQ ID NOS: 61, 68, 75, 88, 92 e 96; (g) [3bb2] SEQ ID NOS: 62, 69, 76, 98, 100 e 102; (h) [1 aa1 ] SEQ ID NOS: 77, 78, 79, 86, 90 e 94; (i) [5a6] SEQ ID NOS: 80, 82, 84, 99, 101 e 103; e G) 10 [5aa3] SEQ ID NOS: 81, 83, 85, 104, 105 e 106.
5. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: (a) [3ee9] SEQ ID NOS: 57, 63 e 70; (b 15 [3ef2] SEQ ID NOS: 58, 64 e 71; (c) [1 e4] SEQ ID NOS: 59, 65 e 72; (d) [3a4] SEQ ID NOS: 60, 66 e 73; (e) [3ab4] SEQ ID NOS: 61, 67 e 74; (f) [3ah10] SEQ ID NOS: 61, 68 e 75; (g20 [3bb2] SEQ ID NOS: 62, 69 e 76; (h) [1 aa1 ] SEQ ID NOS: 77, 78 e 79; (i) [5a6] SEQ ID NOS: 80, 82 e 84; e (j) [5aa3] SEQ ID NOS: 81, 83 e 85.
6. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR de cadeia leve selecionadas do grupo consistindo em: (a) [3ee9] SEQ ID NOS: 89, 93 e 97; (b) [3ef2] SEQ ID NOS: 107, 109 e 111; (c) [1e4] SEQ ID NOS: 107, 109 e 111; (30 [3a4] SEQ ID NOS: 108, 110 e 112; (e) [3ab4] SEQ ID NOS: 87, 91 e 95; (f) [3ah10] SEQ ID NOS: 88, 92 e 96; (g) [3bb2] SEQ ID NOS: 98, 100 e 102; (h) [1 aa1 ] SEQ ID NOS: 86, 90 e 94; (i) [5a6] SEQ ID NOS: 99, 101 e 103; e j) [5aa3] SEQ ID NOS: 104, 105 e 106.
7. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga à proteína MN com uma constante de dissociação de cerca de 0,15 nM a cerca de 50 nM.
8. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que o anticorpo é uma IgG.
9. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que o anticorpo é uma IgGI, lgG2a, lgG2b, lgG3, IgM, IgD, IgE, IgA, IgM, fragmento Fab, fragmento F(ab')2, fragmento scFv, fragmento Fv, um diacorpo, anticorpo linear, anticorpo com cadeia simples, anticorpo biespecífico, anticorpo quimérico ou anticorpo multiespecífico.
10. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é humanizado.
11. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que a CDR1, CDR2 e CDR3 são não-humanas.
12. Composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo como definido na reivindicação 1 e uma ou mais subs- tâncias farmacêuticas auxiliares.
13. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 85%.
14. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 90%.
15. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 95%.
16. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 99%.
17. Composição reativa contra proteína MN compreendendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um sítio de ligação antigênico especificamente dirigido contra uma proteína MN conjugada a um agente citotóxico, em que o sítio de ligação antigênico inclui pelo menos uma CDR1, CDR2 ou CDR3: (a) a referida CDR1 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 77, 80, 81, 86, 87, 88, 89, 98, 99, 104, -107, 108 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% iden- tidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 57, 58, 59, 60, 61, 62, -77, 80, 81, 86, 87, 88, 89, 98, 99, 104, 107 ou 108; (b) a referida CDR2 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 78, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 100, 101, -105, 109, 110 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, -68, 69, 78, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 100, 101, 105, 109 ou 110; e (c) a referida CDR3 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 79, 84, 85, 94, 95, 96, 97, 102, 103, -106, 111, 112 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 70, 71, 72, 73, 74, -75, 76, 79, 84, 85, 94, 95, 96, 97, 102, 103, 106, 111 ou 112.
18. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o sítio de ligação antigênico compreende uma CDR de região variável de ca- deia pesada selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOS: 57-85 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 57-85.
19. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o sítio de ligação antigênico compreende uma CDR de região variável de ca- deia leve selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOS: 86-112 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de se- qüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 86-112.
20. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR selecionada do grupo consistindo em: (a) [3ee9] SEQ ID NOS: 57, 63, 70, 89, 93 e 97; (b) [3ef2] SEQ ID NOS: 58, 64, 71, 107, 109 e 111; (c) [1 e4] SEQ ID NOS: 59, 65, 72, 107, 109 e 111; (d) [3a4] SEQ ID NOS: 60, 66, 73, 108, 110 e 112; (e) [3ab4] SEQ ID NOS: 61, 67, 74, 87, 91 e 95; (f) [3ah10] SEQ ID NOS: 61, 68, 75, 88, 92 e 96; (g) [3bb2] SEQ ID NOS: 62, 69, 76, 98, 100 e 102; (h) [1 aa1 ] SEQ ID NOS: 77, 78, 79, 86, 90 e 94; (i) [5a6] SEQ ID NOS: 80, 82, 84, 99, 101 e 103; e (j) [5aa3] SEQ ID NOS: 81, 83, 85, 104, 105 e 106.
21. Anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido na a rei- vindicação 17 em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR de cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em: a) [3ee9] SEQ ID NOS: 57, 63 e 70; b) [3ef2] SEQ ID NOS: 58, 64e71; c) [1e4] SEQ ID NOS: 59, 65 e 72; d) [3a4] SEQ ID NOS: 60, 66 e 73; e) [3ab4] SEQ ID NOS: 61, 67 e 74; f) [3ah10] SEQ ID NOS: 61, 68 e 75; g) [3bb2] SEQ ID NOS: 62, 69 e 76; h) [1aa1] SEQ ID NOS: 77, 78 e 79; i) [5a6] SEQ ID NOS: 80, 82 e 84; e j) [5aa3] SEQ ID NOS: 81, 83 e 85.
22. Anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido na rei- vindicação 17, em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: a) [3ee9] SEQ ID NOS: 89, 93 e 97; b) [3ef2] SEQ ID NOS: 107, 109 e 111; c) [1e4] SEQ ID NOS: 107, 109 e 111; d) [3a4] SEQ ID NOS: 108, 110 e 112; e) [3ab4] SEQ ID NOS: 87, 91 e 95; f) [3ah10] SEQ ID NOS: 88, 92 e 96; g) [3bb2] SEQ ID NOS: 98, 100 e 102; h) [1aa1] SEQ ID NOS: 86, 90 e 94; i) [5a6] SEQ ID NOS: 99, 101 e 103; e j) [5aa3] SEQ ID NOS: 104, 105 e 106.
23. Composição de acordo com a reivindicação 17 em que o agente citotóxico é selecionado do grupo consistindo em: monometilaurista- tina-E ou análogos funcionais da mesma, monometilauristatina-F ou análo- gos funcionais da mesma, aplidina, azaribina, anastrozol, azacitidina, bleo- micina, bortezomib, bryostatin-1, bussulfan, calicheamicina, camptotecina, -10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucil, cisplatina, irinote- can (CPT-1 1), SN-38, carboplatina, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, glucuronida de daunomicina, daunor- rubicina, dexametasona, dietilestilbestrol, doxorrubicina, glucuronida de do- xorrubicina, glucuronida de epirrubicina, etinil estradiol, estramustina, etopo- sídeo, glucuronida de etoposídeo, fosfato de etoposídeo, floxuridina (FUdR), -3',5'-O-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, fluorouracila, fluoxi- mesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiuréia, idar- rubicina, ifosfamida, L-asparaginase, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de medroprogesterona, acetato de megestrol, melphalan, mercapto- purina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomici- na, mitotano, butirato de fenila, prednisona, procarbazina, paclitaxel, pentos- tatina, PSI-341, semustina estreptozocina, tamoxifeno, taxanos, taxol, propi- onato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, teniposídeo, topote- can, mostarda de uracila, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricina, abrina, ribonuclease, onconase, rapLRI, DNase I, Enterotoxina-A Estafilocó- cica, proteína antiviral de pokeweed, gelonina,toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudomonas e combinações dos mesmos.
24. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o agente citotóxico é monometilauristatina-E ou análogos funcionais da mes- ma.
25. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga à proteína MN com uma cons- tante de dissociação de cerca de 0,15 nM a cerca de 50 nM.
26. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo é uma IgG.
27. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um isotipo de lgG1, lgG2a, lgG2b, lgG3, IgM, IgD, IgE, IgA ou IgM, um fragmento Fab, fragmento F(ab')2. frag- mento scFv, fragmento Fv, um diacorpo, anticorpo linear, anticorpo com ca- deia simples, anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico ou anticorpo multiespecífico.
28. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é humanizado.
29. Anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido na rei- vindicação 17 em que as CDR1, CDR2 e CDR3 são não-humanas.
30. Composição para tratamento de um indivíduo tendo um cân- cer MN-relacionado, compreendendo um agente anticâncer e um anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo tendo um sítio de ligação antigênico especificamente dirigido contra uma proteína MN conjugada a um agente citotóxico, em que o sítio de ligação antigênico inclui pelo menos uma CDR1, CDR2 ou CDR3: a) a referida CDR1 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 77, 80, 81, 86, 87, 88, 89, 98, 99, 104, -107, 108 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% iden- tidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 57, 58, 59, 60, 61, 62, -77, 80, 81, 86, 87, 88, 89, 98, 99, 104, 107 ou 108; b) a referida CDR2 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 78, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 100, 101, -105, 109, 110 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, -68, 69, 78, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 100, 101, 105, 109 ou 110; e c) a referida CDR3 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 79, 84, 85, 94, 95, 96, 97, 102, 103, -106, 111, 112 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 70, 71, 72, 73, 74, -75, 76, 79, 84, 85, 94, 95, 96, 97, 102, 103, 106, 111 ou 112.
31. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o sítio de ligação antigênico compreende uma CDR de região variável de ca- deia pesada selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOS: 57-85 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 57-85.
32. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o sítio de ligação antigênico compreende uma CDR de região variável de ca- deia leve selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOS: 86-112 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de se- qüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 86-112.
33. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR selecionada do grupo consistindo em: a) [3ee9] SEQ ID NOS: 57, 63, 70, 89, 93 e 97; b) [3ef2] SEQ ID NOS: 58, 64, 71, 107, 109 e 111; c) [1e4] SEQ ID NOS: 59, 65, 72, 107, 109 e 111; d) [3a4] SEQ ID NOS: 60, 66, 73, 108, 110 e 112; e) [3ab4] SEQ ID NOS: 61, 67, 74, 87, 91 e 95; f) [3ah10] SEQ ID NOS: 61, 68, 75, 88, 92 e 96; g) [3bb2] SEQ ID NOS: 62, 69, 76, 98, 100 e 102; h) [1 aa1 ] SEQ ID NOS: 77, 78, 79, 86, 90 e 94; i) [5a6] SEQ ID NOS: 80, 82, 84, 99, 101 e 103; e j) [5aa3] SEQ ID NOS: 81, 83, 85, 104, 105 e 106.
34. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: a) [3ee9] SEQ ID NOS: 57, 63 e 70; b) [3ef2] SEQ ID NOS: 58, 64 e 71; c) [1 e4] SEQ ID NOS: 59, 65 e 72; d) [3a4] SEQ ID NOS: 60, 66 e 73; e) [3ab4] SEQ ID NOS: 61, 67 e 74; f) [3ah10] SEQ ID NOS: 61, 68 e 75; g) [3bb2] SEQ ID NOS: 62, 69 e 76; h) [1aa1] SEQ ID NOS: 77, 78e79; i) [5a6] SEQ ID NOS: 80, 82 e 84; e j) [5aa3] SEQ ID NOS: 81, 83 e 85.
35. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: a) [3ee9] SEQ ID NOS: 89, 93 e 97; b) [3ef2] SEQ ID NOS: 107, 109 e 111; c) [1e4] SEQ ID NOS: 107, 109e 111; d) [3a4] SEQ ID NOS: 108, 110 e 112; e) [3ab4] SEQ ID NOS: 87, 91 e 95; f) [3ah10] SEQ ID NOS: 88, 92 e 96; g) [3bb2] SEQ ID NOS: 98, 100 e 102; h) [1 aa1 ] SEQ ID NOS: 86, 90 e 94; i) [5a6] SEQ ID NOS: 99, 101 e 103; e j) [5aa3] SEQ ID NOS: 104, 105 e 106.
36. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o agente anticâncer é selecionado do grupo consistindo em bleomicina, doce- taxel (Taxotere), doxorrubicina, edatrexato, erlotinib (Tarceva), etoposídeo, finasterida (Proscar), flutamida (Eulexin), gemcitabina (Gemzar), genitinib (Irresa), acetato de goserelina (Zoladex), granisetron (Kytril), imatinib (Glee- vec), irinotecan (Campto/Camptosar), ondansetron (Zofran), paclitaxel (Ta- xol), pegaspargase (Oncaspar), cloridrato de pilocarpina (Salagen), porfíme- ro sódico (Photofrin), interleucina-2 (Proleukin), rituximab (Rituxan), topote- can (Hycamtin), trastuzumab (Herceptin), Triapina, vincristina, tartrato de vinorelbina (NaveIbine) e anticorpos terapêuticos ou fragmentos dos mes- mos.
37. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o agente anticâncer é um agente antiangiogênico selecionado do grupo con- sistindo em angiostatina, bevacizumab (Avastin®), sorafenib (Nexavar®), ba- culostatina, canstatina, maspina, anticorpos ou peptídeos anti-VEGF, anti- corpos ou peptídeos antifator de crescimento placentário, anticorpos anti-Flk-1, anticorpos ou peptídeos anti-Flt-1, peptídeos de laminina, peptídeos de fibronectina, inibidores de ativador de plasminogênio, inibidores de metalo- proteinase tecidual, interferons, interleucina 12, IP-10, Gro-β, trombospondi- na, 2-metóxioestradiol, proteína proliferina-relacionada, carboxiamidotriazol, CM101, Marimastat, polissuifato de pentosana, angiopoietina 2, interferon- alfa, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina de 16K, Linomi- da, talidomida, pentoxifilina, genisteína, TNP-470, endostatina, paclitaxel, acutina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, fator plaquetário 4 e minociclina.
38. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o agente anticâncer é um agente que bloqueia ou inibe um fenótipo de resis- tência a múltiplos fármacos selecionado do grupo consistindo em tamoxife- no, verapamil e ciclosporina A.
39. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o agente citotóxico é monometilauristatina-E ou análogos funcionais da mes- ma.
40. Composição de acordo com a reivindicação 31, em que o agente citotóxico é monometilauristatina-E ou análogos funcionais da mes- ma.
41. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga à proteína MN com uma cons- tante de dissociação de cerca de 0,15 nM a cerca de 50 nM.
42. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o anticorpo é uma IgG.
43. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um isotipo de IgGI, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA ou IgM, um fragmento Fab, fragmento F(ab')2, frag- mento scFv, fragmento Fv, um diaçorpo, anticorpo linear, anticorpo com ca- deia simples, anticorpo biespecífico, anticorpo quimérico ou anticorpo multi- específico.
44. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é humanizado.
45. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que as CDR1, CDR2 e CDR3 são não-humanas.
46. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 85%.
47. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 90%.
48. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 95%.
49. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 99%.
50. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que o câncer está na forma de um tumor sólido.
51. Composição de acordo com a reivindicação 50, em que o tumor sólido está em ou é originário da mama, trato respiratório, pulmão, cérebro, órgão reprodutivo, trato digestivo, cólon, trato urinário, rim, esôfago, cérvix, olho, fígado, pele, cabeça, pescoço, tiróide e paratireóide.
52. Método de diagnóstico de um distúrbio MN-relacionado ca- racterizado por níveis anormais de MN compreendendo comparação do nível de MN em uma célula ou tecido que se suspeita estar doente com o nível de MN em uma célula ou tecido saudável correspondente, em que um nível a- normal de MN na célula ou tecido que se suspeita estar doente é uma indi- cação de um distúrbio MN-relacionado, a referida etapa de comparação ain- da compreendendo detecção do nível de MN no tecido doente e no tecido saudável com o anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido na rei- vindicação 1.
53. Método de acordo com a reivindicação 52, em que o distúr- bio MN-relacionado é um câncer.
54. Método de acordo com a reivindicação 52, em que o câncer está na forma de um tumor sólido.
55. Método de acordo com a reivindicação 52, em que o tumor sólido está em ou é originário da mama, trato respiratório, pulmão, cérebro, órgão reprodutivo, trato digestivo, cólon, trato urinário, rim, esôfago, cérvix, olho, fígado, pele, cabeça, pescoço, tiróide e paratireóide.
56. Método de acordo com ã reivindicação 52, em que a etapa de comparação ainda compreende as etapas de: a) detecção do nível de proteína MN no tecido saudável; b) detecção do nível de proteína MN no tecido que se suspeita es- tar doente; e c) comparação dos níveis de proteína MN de (a) e (b), em que um nível elevado de proteína MN no tecido que se suspeita estar doente, quando comparado com o nível de proteína MN no tecido saudável, é indicativo da presença de um distúrbio MN-relacionado.
57. Método de acordo com a reivindicação 52, em que a etapa de detecção é obtida através de uma modalidade de formação de imagem nuclear.
58. Método de acordo com a reivindicação 57, em que a modali- dade de formação de imagem nuclear é SPECT ou PET.
59. Kit compreendendo o anticorpo ou fragmento de anticorpo de como definido na reivindicação 1 e um conjunto de instruções para uso do kit em um método de tratamento de um distúrbio MN-relacionado.
60. Kit compreendendo a composição como definido na reivindi- cação 17 e um conjunto de instruções para uso do kit em um método de tra- tamento de um distúrbio MN-relacionado.
61. Kit compreendendo a composição como definido na reivindi- cação 30 e um conjunto de instruções para uso do kit in um método de tra- tamento de um distúrbio MN-relacionado.
62. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 85%.
63. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 90%.
64. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 95%.
65. Composição de acordo com a reivindicação 15, em que a identidade de seqüência é mais de cerca de 99%.
66. Método de tratamento de um distúrbio MN-relacionado ca- racterizado por um nível anormal de MN em um indivíduo compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um sítio de ligação antigênico especifica- mente dirigido contra uma proteína MN1 em que o sítio de ligação antigênico inclui pelo menos uma CDR1, CDR2 ou CDR3: a) a referida CDR1 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 77, 80, 81, 86, 87, 88, 89, 98, 99, 104, -107, 108 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% iden- tidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 57, 58, 59, 60, 61, 62, -77, 80, 81, 86, 87, 88, 89, 98, 99, 104, 107 ou 108; b) a referida CDR2 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 78, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 100, 101, -105, 109, 110 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, -68, 69, 78, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 100, 101, 105, 109 ou 110; e c) a referida CDR3 é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 79, 84, 85, 94, 95, 96, 97, 102, 103, -106, 111, 112 e uma seqüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 70, 71, 72, 73, 74, -75, 76, 79, 84, 85, 94, 95, 96, 97, 102, 103, 106, 111 ou 112.
67. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o sítio de ligação antigênico compreende uma CDR de região variável de cadeia pe- sada selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOS: 57-85 e uma se- qüência de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüên- cia a qualquer uma de SEQ ID NOS: 57-85.
68. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o sítio de ligação antigênico compreende uma CDR de região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOS: 86-112 e uma seqüên- cia de aminoácido tendo mais de cerca de 80% identidade de seqüência a qualquer uma de SEQ ID NOS: 86-112.
69. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR selecio- nada do grupo consistindo em: a) [3ee9] SEQ ID NOS: 57, 63, 70, 89, 93 e 97; b) [3ef2] SEQ ID NOS: 58, 64, 71, 107, 109 e 111; c) [1e4] SEQ ID NOS: 59, 65, 72, 107, 109 e 111; d) [3a4] SEQ ID NOS: 60, 66, 73, 108, 110 e 112; e) [3ab4] SEQ ID NOS: 61, 67, 74, 87, 91 e 95; f) [3ah10] SEQ ID NOS: 61, 68, 75, 88, 92 e 96; g) [3bb2] SEQ ID NOS: 62, 69, 76, 98, 100 e 102; h) [1aa1] SEQ ID NOS: 77, 78, 79, 86, 90 e 94; i) [5a6] SEQ ID NOS: 80, 82, 84, 99, 101 e 103; e j) [5aa3] SEQ ID NOS: 81, 83, 85, 104, 105 e 106.
70. Anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido na rei- vindicação 66 em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: a) [3ee9] SEQ ID NOS: 57, 63 e 70; b) [3ef2] SEQ ID NOS: 58, 64 e 71; c) [1e4] SEQ ID NOS: 59, 65 e 72; d) [3a4] SEQ ID NOS: 60, 66 e 73; e) [3ab4] SEQ ID NOS: 61, 67 e 74; f) [3ah10] SEQ ID NOS: 61, 68 e 75; g) [3bb2] SEQ ID NOS: 62, 69 e 76; h) [1aa1] SEQ ID NOS: 77, 78 e 79; i) [5a6] SEQ ID NOS: 80, 82 e 84; e j) [5aa3] SEQ ID NOS: 81, 83 e 85.
71. Anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido na rei- vindicação 66, em que o sítio de ligação antigênico compreende um conjunto de seqüências de CDR de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: a)[3ee9] SEQ ID NOS: 89, 93 e 97; b)[3ef2] SEQ ID NOS: 107, 109 e 111; c)[1e4] SEQ ID NOS: 107, 109 e 111; d)[3a4] SEQ ID NOS: 108, 110 e 112; e)[3ab4] SEQ ID NOS: 87, 91 e 95; f)[3ah10] SEQ ID NOS: 88, 92 e 96; g)[3bb2] SEQ ID NOS: 98, 100 e 102; h)[1aa1] SEQ ID NOS: 86, 90 e 94; i)[5a6] SEQ ID NOS: 99, 101 e 103; e j)[5aa3] SEQ ID NOS: 104, 105 e 106.
72. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o anticor- po ou fragmento de anticorpo se liga à proteína MN com uma constante de dissociação de cerca de 0,15 nM a cerca de 50 nM.
73. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o anticor- po é uma IgG.
74. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o anticor- po ou fragmento de anticorpo é um isotipo de IgGI, lgG2a, lgG2b, lgG3, IgM, IgD, IgE, IgA ou IgM, um fragmento Fab, fragmento F(ab')2, fragmento scFv, fragmento Fv, um diacorpo, anticorpo linear, anticorpo com cadeia simples, anticorpo biespecífico, anticorpo quimérico ou anticorpo multiespe- cífico.
75. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o anticor- po ou fragmento de anticorpo é humanizado.
76. Método de acordo com a reivindicação 66, em que as GDR1, CDR2 e CDR3 são não-humanas.
77. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a identi- dade de seqüência é mais de cerca de 85%.
78. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a identi- dade de seqüência é mais de cerca de 90%.
79. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a identi- dade de seqüência é mais de cerca de 95%.
80. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a identi- dade de seqüência é mais de cerca de 99%.
81. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o anticor- po ou fragmento de anticorpo é conjugado a um agente citotóxico.
82. Método de acordo com a reivindicação 81, em que o agente citotóxico é selecionado do grupo consistindo em: monometilauristatina-E ou análogos funcionais da mesma, é selecionada do grupo consistindo em: mo- nometilauristatina-E ou análogos funcionais da mesma, monometilauristati- na-F ou análogos funcionais da mesma, aplidina, azaribina, anastrozol, aza- citidina, bleomicina, bortezomib, bryostatin-1, bussulfan, calicheamicina, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucil, cisplatina, irinotecan (CPT-1 1), SN-38, carboplatina, cladribina, ciclofosfa- mida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, glucuronida de dau- nomicina, daunorrubicina, dexametasona, dietilestilbestrol, doxorrubicina, glucuronida de doxorrubicina, glucuronida de epirrubicina, etinil estradiol, estramustina, etoposídeo, glucuronida de etoposídeo, fosfato de etoposídeo, floxuridina (FUdR), 3',5'-0-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, fluorouracila, fluoximesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiuréia, idarrubicina, ifosfamida, L-asparaginase, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de medroprogesterona, acetato de megestrol, mel- phalan, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mi- tramicina, mitomicina, mitotano, butirato de fenila, prednisona, procarbazina, paclitaxel, pentostatina, PSI-341, semustina estreptozocina, tamoxifeno, ta- xanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, te- niposídeo, topotecan, mostarda de uracila, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricina, abrina, ribonuclease, onconase, rapLRI, DNase I, Entero- toxina-A Estafilocócica, proteína antiviral de pokeweed, gelonina,toxina de difteria, Exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudomonas e combi- nações dos mesmos.
83. Método de acordo com a reivindicação 82, em que o agente citotóxico é monometilauristatina-E ou análogos funcionais da mesma.
84. Método de acordo com a reivindicação 66, ainda compreen- dendo co-administração de um agente anticâncer.
85. Método de acordo com a reivindicação 84, em que o agente anticâncer é selecionado do grupo consistindo em bleomicina, docetaxel (Taxotere), doxorrubicina, edatrexato, erlotinib (Tarceva), etoposídeo, finas- terida (Proscar)1 flutamida (EuIexin)1 gemcitabina (Gemzar), genitinib (Irresa)1 acetato de goserelina (ZoIadex)1 granisetron (KytriI)1 imatinib (GIeevec)1 irino- tecan (Campto/Camptosar), ondansetron (Zofran)1 paclitaxel (TaxoI)1 pegas- pargase (Oncaspar)1 cloridrato de pilocarpina (SaIagen)1 porfímero sódico (Photofrin)1 interleucina-2 (ProIeukin)1 rituximab (Rituxan)1 topotecan (Hy- camtin), trastuzumab (Herceptin)1 Triapina1 vincristina, tartrato de vinorelbina (NaveIbine) e anticorpos terapêuticos ou fragmentos dos mesmos.
86. Método de acordo com a reivindicação 84, em que o agente anticâncer é um agente que bloqueia ou inibe um fenótipo de resistência a múltiplos fármacos selecionado do grupo consistindo em tamoxifeno, vera- pamil e ciclosporina A.
87. Método de acordo com a reivindicação 66, em que o distúr- bio MN-relacionado é um câncer.
88. Método de acordo com a reivindicação 87, em que o câncer é um tumor sólido.
89. Método de acordo com a reivindicação 88, em que o tumor sólido está em ou é originário da mama, trato respiratório, pulmão, cérebro, órgão reprodutivo, trato digestivo, cólon, trato urinário, rim, esôfago, cérvix, olho, fígado, pele, cabeça, pescoço, tiróide e paratireóide.
90. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivin- dicação 1, em que o sítio de ligação antigênico compreende um par de regi- ões variável de cadeia pesada e variável de cadeia leve selecionada do gru- po consistindo em: (a) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:133 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO:134; (b) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 135 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO:136; (c) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:137 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 138; (d) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:139 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 140; (e) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 141 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO:142; (f) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:143 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO:144; (g) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 145 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO:146; (h) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 147 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO:148; (i) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:149 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 150; e (j) a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:151 e a regi- ão variável de cadeia leve de SEQ ID NO:152.
91. Anticorpo de IgG anti-MN codificado pela seqüência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO: 153.
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