ES2428373T3 - Anticuerpos anti-MN y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un sitio de unión a antígeno dirigido específicamentecontra una proteína MN, en el que el sitio de unión a antígeno comprende un conjunto de secuencias de CDRde cadena pesada seleccionadas del grupo constituido por: [3ee9] SEC ID Nº: 57, 63 y 70; y un conjunto de secuencias de CDR de cadena ligera seleccionadas del grupo constituido por: [3ee9] SEC ID Nº: 89, 93 y 97.

Description

Anticuerpos anti-MN y procedimientos de uso de los mismos
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos y/o fragmentos de los mismos que tienen especificidad por la proteína MN. La invención se refiere además a composiciones de anticuerpo y/o inmunoconjugado y a su uso en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de trastornos relacionados con la MN, por ejemplo cáncer.
2. Antecedentes
La aparición de cáncer se asocia con mayor frecuencia al envejecimiento, según lo cual el 65 % de todos los casos nuevos de cáncer se registran para pacientes de 65 años de edad y mayores. El cáncer es la segunda causa principal de muerte en Estados Unidos, superada sólo por las enfermedades cardíacas. De hecho, la Sociedad Americana del Cáncer (American Cancer Society) ha estimado que 1 de cada 4 personas morirán por cáncer en EE.UU., suponiendo que las tasas de mortalidad actuales no se muevan. Solo en EE.UU., en 2006 se esperan
1.399.790 casos y 564.830 muertes por cáncer. Cabe esperar que la mayoría de estos casos nuevos sean cánceres de colon (106.680), pulmón (172.570) y mama (214.640). Además, se ha previsto que tanto la incidencia como la prevalencia del cáncer aumenten aproximadamente un 15% en los próximos diez años, lo que refleja un índice de crecimiento medio de 1,4% (American Cancer Society, 2006).
Se ha descubierto que un antígeno asociado con tumores identificado recientemente, MN, una proteína de superficie celular, se expresa en una serie de carcinomas clínicos. Por ejemplo, se ha hallado que la MN se expresa ectópicamente en el 100% de los carcinomas de células renales (Liao, SY, Cancer Res., 1997, 57:2827 -2831), el 100% de los carcinomas del esófago (Turner JR, Hum. Pathol., 199, 28:740 -744), más del 90% de los carcinomas cervicouterinos (Liao, SY, Cancer Res., 1997, 57:2827 -2831), el 76% de los carcinomas de colon malignos (Saarnio, J. et al., Am. J. Path., 1997, 153:279 -285), el 80% de los carcinomas de pulmón de células no pequeñas (Vermylen P. et al., Eur. Respir. J., 1999, 14:806 -811), y en el 48% de los cánceres de mama (Chia SK et al., J. Clin. Oncol., 2001, 19:3660 -3668). Como otros antígenos asociados a tumores, la proteína MN también está presente en las células de un número limitado de tejidos normales, incluyendo, por ejemplo, estómago, mucosa del conducto biliar y las células normales de alta proliferación en el intestino delgado (Saarnio J. et al., J. Histochem. Cytochem., 1998,46:497 -504).
Se ha clonado y secuenciado el ADNc de la MN humana (Pastorek, et al., Oncogene, 1994; 9:2877 -2888). La proteína predicha está constituida por un péptido señal, una secuencia relacionada con el proteoglicano, un dominio de anhidrasa carbónica, (anhidrasa carbónica IX o CA IX), un segmento transmembrana y una cola intracelular corta. El dominio de la anhidrasa carbónica IX cataliza la hidratación reversible del dióxido de carbono en ácido carbónico. Esta actividad puede desempeñar un papel en la regulación de la acidificación local de la porción extracelular de los entornos tumorales, que, en consecuencia, puede conducir a la activación de proteasas y, por último, a metástasis. El documento WO 03/048328 describe anticuerpos neutralizantes anti-MN humanos.
También se ha investigado la regulación de la expresión de MN. En un aspecto, por ejemplo, la expresión de MN está regulada por aumento por la hipoxia. El complejo transcripcional conocido como factor inducible de hipoxia 1 (HIF-1) es un regulador de la expresión de MN. De acuerdo con esto, la MN se conoce como un gen efector por HIF1 que tiene implicaciones en la comprensión de la respuesta tumoral a la hipoxia (Wykoff CC et al., Cancer Res., 2000, 60:7075 -7083). Además, la expresión de MN se correlaciona con los niveles de hipoxia tumoral y es un indicador pronóstico de la supervivencia global y supervivencia sin metástasis en el cáncer cervicouterino (Loncaster, JA et al., Cancer Res., 2000, 60:7075 -7083). La expresión de MN también se correlaciona con una densidad vascular media alta, un estadio avanzado del cáncer, el grado de necrosis en el carcinoma de cabeza y cuello (Beasley NJP et al., Cancer Res., 2001, 61:5262 -5267), escasa supervivencia en el carcinoma nasofaríngeo (Hui EP et al., Clin. Cancer Res., 2002, 8:2595 -2604), necrosis tumoral, grado más alto, estado negativo al receptor de estrógenos, mayor índice de recaídas y escasa supervivencia para el carcinoma de mama invasivo (Chia SK et al., J. Clin. Oncol., 2001, 19:3660 -3668). Por tanto, la expresión del antígeno MN se correlaciona con un pronóstico de supervivencia malo y con cánceres de mayor grado.
Nuevas y mejores terapias para luchar contra estos cánceres agresivos, en particular los dirigidos a la expresión de MN, son altamente deseables y representarían un avance en la técnica. Como tal, la presente invención divulga nuevas composiciones de anticuerpos e inmunoconjugados de los mismos que son útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los cánceres relacionados con la MN.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, o fragmentos de anticuerpos, que se unen a la proteína de superficie celular MN y que se pueden usar en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico del cáncer. Los anticuerpos de la invención se pueden conjugar además con agentes citotóxicos, por
ejemplo monometillauristatina-E y/o coadministrarse o formularse con uno o más agentes anticancerosos adicionales. Los anticuerpos anti-MN e inmunoconjugados de la invención se pueden usar en los procedimientos de la invención para tratar y/o diagnosticar y/o vigilar cánceres, por ejemplo tumores sólidos.
En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o una composición que incluye el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, teniendo el anticuerpo o fragmento un sitio de unión a antígeno que está específicamente dirigido a una proteína MN.
El sitio de unión a antígeno se selecciona de un conjunto de secuencias de CDR específicas que incluyen los siguientes conjuntos de seis CDR:
(a) [3ee9] SEC ID Nº: 57, 63, 70, 89, 93 y 97;
El sitio de unión a antígeno incluye un conjunto de secuencias de CDR de cadena pesada seleccionadas del grupo constituido por:
(a) [3ee9] SEC ID Nº: 57, 63 y 70;
El sitio de unión a antígeno incluye un conjunto de secuencias de CDR de cadena ligera seleccionadas del grupo constituido por:
(a) [3ee9] SEC ID Nº: 88, 93 y 97.
Los anticuerpos divulgados en el presente documento tienen sitios de unión a antígeno que contienen un par de regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera seleccionadas del grupo constituido por:
(a)
la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 133 y la región variable de cadena ligera SEC ID Nº 134;
(b)
la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 135 y la región variable de cadena ligera SEC ID Nº 36;
(c)
la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 137 y la región variable de cadena ligera SEC ID Nº: 138;
(d)
la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 139 y la región variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 140;
(e)
la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 141 y la región variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 142;
(f)
la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 143 y la región variable de cadena ligera SEC ID Nº 144;
(g)
la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 145 y la región variable de cadena ligera SEC ID Nº 146;
(h)
la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 147 y la región variable de cadena ligera SEC ID Nº: 148;
(i)
la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 149 y la región variable de cadena ligera SEC ID Nº 150; y
(j)
la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 151 y la región variable de cadena ligera SEC ID Nº:
152.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden unir a la proteína MN con una constante de disociación de 0,15 nM a 50 nM.
En otro aspecto, los anticuerpos o fragmentos de la invención son anticuerpos IgG o fragmentos de IgG. Los anticuerpos o fragmentos también pueden ser anticuerpos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA, o IgM, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos bioespecíficos, anticuerpos multiespecíficos o anticuerpos quiméricos (p. ej., que comprenden una estructura de anticuerpo humano injertado con una región de unión de anticuerpo humano o no humano, o una estructura de anticuerpo no humano injertado con una región de unión de anticuerpo no humano, o una estructura de anticuerpo no humano injertado con una región de unión de anticuerpo humano o no humano). Los anticuerpos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, regiones estructurales de anticuerpos de fuentes no humanas, tales como, por ejemplo, de vaca, ratón, llama, camello o conejo. Información adicional sobre la ingeniería de anticuerpos se puede encontrar en la literatura, por ejemplo, Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, (Sep, 2005) 23:1126 -1136. Los fragmentos mencionados en lo que antecede se pueden obtener a partir de una
inmunoglobulina o producirse por un medio adecuado, por ejemplo expresión recombinante, en una forma de fragmento.
El alcance de la invención se define en las reivindicaciones.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención, o composiciones que incluyen los anticuerpos o los fragmentos, pueden incluir un agente citotóxico que está conjugado con el anticuerpo o fragmento. En un aspecto, el agente citotóxico es un monometilauristatina-E (MMAE), sin embargo, también se proporcionan otros agentes citotóxicos, que pueden incluir, por ejemplo, análogos funcionales de la MMAE (p. ej., monometilauristatina-F) y otros agentes citotóxicos, por ejemplo aplidina, azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicina, bortezomib, briostatina1, busulfán, caliqueamicina, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucilo, cisplatino, irinotecán (CPT-I 1), SN-38, carboplatino, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, daunomicina glucurónido, daunorrubicina, dexametasona, dietilestilbestrol, doxorrubicina, doxorrubicina glucurónido, epirrubicina glucurónido, etinilestradiol, estramustina, etopósido, etopósido glucurónido, etopósido fosfato, floxuridina (FUdR), 3',5'-O-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, fluorouracilo, fluoximesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, Lasparaginasa, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalán, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomicina, mitotano, fenil butirato, prednisona, procarbazina, paclitaxel, pentostatina, PSI-341, semustina estreptozocina, tamoxifeno, taxanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, tenipósido, topotecán, mostaza de uracilo, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricina, abrina, ribonucleasa, onconasa, rapLRl, DNasa I, enterotoxina A de Staphylococcus, proteína antivírica de la hierba carmín, gelonina, toxina diftérica, exotoxinas de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas o combinaciones de los mismos. Cualquiera de los agentes citotóxicos puede también incluir análogos funcionales de los mismos.
Las composiciones de la invención pueden incluir, además de los anticuerpos y fragmentos (con o sin los agentes citotóxicos conjugados mencionados en lo que antecede) varios agentes anticancerosos, que pueden incluir, por ejemplo, bleomicina, docetaxel (Taxotere), doxorrubicina, edatrexato, erlotinib (Tarceva), etopósido, finasterida (Proscar), flutamida (Eulexin), gemcitabina (Gemzar), genitinib (Iresa), acetato de goserelina (Zoladex), granisetrón (Kytril), imatinib (Gleevec), irinotecán (Campto/Camptosar), ondansetrón (Zofran), paclitaxel (Taxol), pegaspargasa (Oncaspar), pilocarpina clorhidrato (Salagen), porfímero sódico (Photofrin), interleucina-2 (Proleukin), rituximab (Rituxan), topotecán (Hycamtin), trastuzumab (Herceptin), Triapine, vincristina, tartrato de de vinorelbina (Navelbine),
o anticuerpos terapéuticos o fragmentos de los mismos, o agente antiangiogénico, tal como, por ejemplo, angiostatina, bevacizumab (Avastin®), sorafenib (Nexavar®), baculostatina, canstatina, maspina, anticuerpos o péptidos anti-VEGF, anticuerpos o péptidos anti-factor de crecimiento placentario, anticuerpos anti-Flk-1, anticuerpos
o péptidos anti-Fit-1, péptidos de laminina, péptidos de fibronectina, inhibidores del activador de plasminógeno, inhibidores de la metaloproteinasa tisular, interferones, interleucina 12, IP-IO, Gro-β, trombospondina, 2metoxiestradiol, proteína relacionada con la proliferina, carboxiamidotriazol, CM101 Marimastat, polisulfato de pentosán, angiopoyetina 2, interferón alfa, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina 16K, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteína, TNP-470, endostatina, paclitaxel, acutina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM--1470, factor plaquetario 4 o minociclina.
El trastorno relacionado con la MN puede incluir, por ejemplo, cáncer, tal como, cáncer de tumor sólido. El tumor sólido puede estar, u originarse en, mama, tracto respiratorio, pulmón, cerebro, órganos reproductores, tracto digestivo, colon, tracto urinario, riñón, esófago, cuello uterino, ojo, hígado, piel, cabeza, cuelo, tiroides y paratiroides.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de diagnóstico de un trastorno relacionado con MN que se caracteriza por niveles anormales de MN, que comprende comparar los niveles de MN en un tejido o célula que se sospecha que está enfermo con los niveles de MN en un tejido o célula sano correspondiente, en el que unos niveles anormales de MN en la célula o tejido que se sospecha que está enfermo es una indicación de trastorno relacionado con MN, comprendiendo dicha etapa de comparación detectar además mediante inmunoensayo los niveles de MN en el tejido enfermo y el tejido sano con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención.
En un aspecto concreto, la invención proporciona un procedimiento de diagnóstico de un trastorno relacionado con MN, en el que el inmunoensayo incluye las etapas de: (a) detectar los niveles de proteína MN en el tejido sano; (b) detectar los niveles de proteína MN en el tejido que se sospecha que está enfermo; y (c) comparar los niveles de proteína MN de (a) y (b). Unos niveles elevados de la proteína MN en el tejido que se sospecha que está enfermo en comparación con los niveles de la proteína MN en el tejido sano son indicativos de la presencia de un trastorno relacionado con MN.
La presente invención también proporciona un kit que comprende los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención o, como alternativa, las composiciones de la invención, y un conjunto de instrucciones para usar el kit en un procedimiento de tratamiento de un trastorno relacionado con MN o para diagnosticar un trastorno relacionado con MN.
Estas y otras formas de realización se exponen en o son obvias a partir de la siguiente descripción detallada, y están
incluidas en la misma.
Breve descripción de las figuras
La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo pero con la que no se pretende limitar la invención únicamente a las realizaciones específicas descritas, se puede entender mejor junto con las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1 representa secuencias de ADN de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de anticuerpo.
La Figura 2 representa secuencias de proteína de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de anticuerpo.
La Figura 3 representa las secuencias de ADN de regiones variables de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos, cada una de las cuales contiene las CDR y regiones estructurales.
La Figura 4 representa secuencias proteicas de las regiones variables de cadena ligera (VL) y pesada (VH) de anticuerpo, cada una de las cuales contiene las CDR y regiones estructurales.
La Figura 5 representa las propiedades de unión a MN para los anticuerpos frente a MN de la presente invención.
La Figura 6 representa la prevención de la adhesión de células tumorales a placas revestidas con MN producidas mediante incubación con un anticuerpo anti-MN.
La Figura 7 representa la actividad anti-tumoral in vivo en un modelo de xenoinjerto que comprende el tumor MaTu resultante del tratamiento con un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo monoclonal anti-MN 1e4; (ejemplo comparativo).
La Figura 8 representa la medición mediante FACS de la unión de un anticuerpo anti-MN a la línea celular PC3mm2 que expresa la proteína MN sobre su superficie.
La Figura 9 representa esquemáticamente el conjugado de anticuerpo (anticuerpo anti-MN conjugado con MMAE).
La Figura 10a representa gráficos de FACS que representan la unión de 3ee9/MMAE a células MN+ (MaTu), pero no a células MN-(DLD).
La Figura 10b muestra gráficos de FACS que representan la unión del inmunoconjugado 1E4 a células MN+ (PC3mm2), pero no a células MN-(DLD); (ejemplo comparativo)
La Figura 10c muestra gráficos de FACS que representan la unión del inmunoconjugado 1aa1 a células MN+ (PC3mm2), pero no a células MN-(DLD); (ejemplo comparativo)
La Figura 11a muestra imágenes de inmunofluorescencia que representan la internalización de 3ee9/MMAE por las células MN+ y la falta de internalización por células MN-. La internalización de 3ee9/MMAE se muestra como fluorescencia.
La Figura 11b muestra imágenes de inmunofluorescencia que representan la internalización del inmunoconjugado 1E4por las células MN+ y la falta de internalización por células MN-. El inmunoconjugado 1E4 internalizado se muestra como fluorescencia; (ejemplo comparativo)
La Figura 12 muestra una inmunotransferencia que representa inmunoprecipitación específica de proteínas de superficie celular biotiniladas por los anticuerpos frente a MN.
La Figura 13a representa gráficamente la citotoxicidad de 3ee9/MMAE contra MN+, pero contra células MN.
La Figura 13b representa gráficamente la citotoxicidad del inmunoconjugado 1E4 contra MN+, pero contra células MN-; (ejemplo comparativo)
La Figura 13c representa gráficamente la citotoxicidad del inmunoconjugado 1aa1 contra MN+, pero contra células MN-; (ejemplo comparativo)
La Figura 14 muestra imágenes de inmunofluorescencia que representan la prevenciónde fusiformación normal por la inhibición de tubulina.
La Figura 15 representa gráficamente la eficacia anti-tumoral de 3ee9/MMAE contra xenoinjertos de MaTu.
La Figura 16 representa gráficamente la eficacia anti-tumoral del inmunoconjugado 1E4 contra tumores de mama MaTu establecidos; (ejemplo comparativo)
La Figura 17 representa gráficamente la eficacia anti-tumoral del inmunoconjugado 1aa1 contra xenoinjertos de MaTu; (ejemplo comparativo)
La Figura 18 representa gráficamente el índice terapéutico (IT) de 3ee9/MMAE contra xenoinjertos de MaTu.
La Figura 19 representa gráficamente la eficacia anti-tumoral de 3ee9/MMAE y MMAE libre contra xenoinjertos HT-29.
La Figura 20 representa gráficamente la eficacia anti-tumoral de 3ee9/MMAE contra xenoinjertos HT-29, siguiendo el programa de C7D x 2.
La Figura 21 representa gráficamente la eficacia anti-tumoral de 3ee9/MMAE contra xenoinjertos HT-29, siguiendo el programa de C1D x 1.
La Figura 22 representa gráficamente la eficacia anti-tumoral de 3ee9/MMAE contra xenoinjertos PC3mm2.
La Figura 23 representa gráficamente la eficacia anti-tumoral de 3ee9/MMAE contra xenoinjertos Colo-205.
La Figura 24 representa gráficamente la eficacia anti-tumoral de 3ee9/MMAE contra xenoinjertos HCT-15.
La Figura 25 representa gráficamente la eficacia anti-tumoral de 3ee9/MMAE contra xenoinjertos MIAPaca2 MN-(en el gráfico de la izquierda) y MN+ (en el gráfico de la derecha).
Las Figuras 26a y 26b representan gráficamente la eficacia anti-tumoral de 3ee9/MMAE en combinación con Xeloda® contra xenoinjertos Colo-205 CCR a varias dosis.
La Figura 27 muestra imágenes de inmunofluorescencia que representan la localización in vivo de 3ee9 en tumores huMN-MIAPaca2 y MIAPaca2; y
La Figura 28 muestra imágenes de inmunofluorescencia (de muestras histológicas) que representan la inhibición por 3ee9/MMAE de la polimerización de tubulina en HT-29 CCR a dos dosis.
La Figura 29 muestra la secuencia nucleotídica completa de una región insertada del vector de expresión en mamíferos 3ee9H+LpCMVUCOE8 (véase el Ejemplo 21) que codifica un anticuerpo IgG humano anti-MN que comprende las regiones variables CDR de las cadenas kappa y pesada de las SEC ID Nº: 126 y 125, respectivamente, obtenidas del vector 3ee9pMORPHx9 (véanse los ejemplos 1-3). SEC ID Nº: 153.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria descriptiva tienen el significado que un experto en la técnica a la que esta invención pertenece entiende habitualmente. No obstante, las referencias siguientes pueden proporcionar a un experto en la técnica a la que atañe la presente invención una definición general de muchos de los términos usados en la presente invención y puede hacerse referencia a ellas y usarse siempre que dichas definiciones sean consistentes con el significado habitualmente comprendido en la técnica. Dichas referencias incluyen, entre otras, Singleton y col., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2ª ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991); y Lackie y col., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3ª ed. 1999); y Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman y Pober, 2ª Edición,
W.B. Saunders Company. Se puede consultar cualquier recurso técnico adicional disponible para el experto en la técnica que proporcione definiciones de términos usados en la presente memoria descriptiva que tengan el significado habitualmente entendido en la técnica. Para los fines de la presente invención, los términos siguientes se definen con más profundidad. Términos adicionales se definen en otra parte de la descripción.
En general, el anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente todo de al menos uno, o normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado puede también comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana. Para una recapitulación, véase Jones, y col., (Nature 321:522525, 1986); Reichmann, y col., (Nature 332:323329, 1988); y Presta, (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593596, 1992). La preparación de anticuerpos humanizados se puede encontrar en las patentes de EE.UU. nº 7.049.135, 6.828.422, 6.753.136, 6.706.484, 6.696.248, 6.692.935, 6.667.150, 6.653.068, 6.300.064, 6.294.353 y 5.514.548, cada una de las cuales se incorporan en la presente memoria descriptiva en su totalidad.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “Fv de cadena sencilla” o fragmentos de anticuerpos “sFv” comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica sencilla. Generalmente, el polipéptido Fv además comprende un ligador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que la sFV forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión, véase Pluckthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994), que se incorpora en la presente memoria descriptiva en su totalidad por referencia.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos “muestra biológica”, o “muestra de un paciente” como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una muestra obtenida de un organismo o de componentes
(p. ej., células) de un organismo. La muestra puede ser de cualquier tejido o fluido biológico. La muestra puede ser una “muestra clínica”, que es una muestra derivada de un paciente. Dichas muestras incluyen, entre otras, esputo, sangre, suero, plasma, células sanguíneas (p. ej., glóbulos blancos), muestras de tejido, muestras de biopsia, orina, fluido peritoneal y fluido pleural, saliva, semen, exudado de mama, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, moco, linfa, citosoles, ascitis, líquido amniótico, lavados vesicales y lavados bronquioalveolares o células de los mismos, entre otras muestras de fluidos corporales. Las muestras de pacientes pueden ser frescas o congeladas, y pueden tratarse con heparina, citrato o EDTA. Las muestras biológicas pueden también incluir secciones de tejidos, tales como secciones congeladas tomadas con fines histológicos.
El término “cáncer” incluye, entre otros, tumores sólidos, tales como cáncer de mama, del tracto respiratorio, cerebral, de órganos reproductores, del tracto digestivo, del tracto urinario, ocular, de hígado, de piel, de cabeza y cuello, de tiroides, de paratiroides, y sus metástasis distantes. El término también incluye sarcomas, linfomas, leucemias y mielomas de células plasmáticas.
Ejemplos de cáncer de mama incluyen, pero no se limitan a carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma ductal in situ y carcinoma lobular in situ. Los ejemplos de cánceres del tracto respiratorio incluyen, pero no están limitados a, carcinoma de pulmón de células pequeñas y carcinoma de pulmón no de células pequeñas, así como a adenoma bronquial y a blastoma pleuropulmonar. Ejemplos de cánceres de cerebro incluyen, pero no se limitan a glioma del bulbo raquídeo y glioma hipotalámico, astrocitoma cerebelar y cerebral, meduloblastoma, ependimoma, así como a tumor neuroectodérmico y a tumor pineal. Los tumores de los órganos reproductores masculinos incluyen, entre otros, cáncer de próstata y testicular. Los tumores de los órganos reproductores femeninos incluyen, entre otros, cáncer de endometrio, cervicouterino, de ovarios, vaginal y vulvar, así como el sarcoma del útero. Los tumores del tracto digestivo incluyen, entre otros, cáncer anal, de colon, colorrectal, esofágico, de vesícula biliar, gástrico, pancreático, rectal, de intestino delgado y de glándulas salivares. Los tumores del tracto urinario incluyen, entre otros, cáncer de vejiga urinaria, de pene, renal, de pelvis renal, de uréter y de uretra. Cánceres oculares incluye, entre otros, melanoma intraocular y retinoblastoma. Ejemplos de cánceres de hígado incluyen, pero no se limitan a, carcinoma hepatocelular (carcinomas de hepatocitos con y sin variante fibrolamelar), colangiocarcinoma (carcinoma del conducto biliar intrahepático) y colangiocarcinoma hepatocelular mixto. Los cánceres de piel incluyen, entre otros, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, cáncer de piel de células de Merkel y cáncer de piel distinto al melanoma. Los cánceres de cabeza y cuello incluyen, entre otros, el cáncer de laringe / hipofaringe / nasofaringe / orofaringe, y el cáncer de cavidad oral y labios. Los linfomas incluyen, entre otros, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma no Hodgkin, linfoma cutáneo de linfocitosT, enfermedad de Hodgkin y linfoma del sistema nervioso central. Los sarcomas incluyen, entre otros, el sarcoma de tejidos blandos, osteosarcoma, el histiciocitoma fibroso maligno, el linfosarcoma y el rabdomiosarcoma. Las leucemias incluyen, entre otras, la leucemia mieloide aguda, la leucemia linfoblástica aguda, la leucemia linfocítica crónica, la leucemia mielógena crónica y la tricoleucemia.
Como se usa en la presente invención, el término “epítopo” significa cualquier determinante antigénico localizado sobre un antígeno, por ejemplo la proteína MN, al que el anticuerpo se une a través de un sitio de unión a antígeno. Los determinantes o determinantes antigénicos normalmente constan de grupos de superficie químicamente de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales, así como características de carga específicas.
El término “específicamente inmunorreactivo” se refiere a una reacción de unión entre un anticuerpo y una proteína, compuesto o antígeno, que tiene un epítopo reconocido por el sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Esta reacción de unión es determinante de la presencia de una proteína, antígeno o epítopo que tiene el epítopo reconocido entre la presencia 10 de una población heterogénea de proteínas y otras sustancias biológicas. En el contexto de un inmunoensayo, los anticuerpos específicamente inmunorreactivos se pueden unir a una proteína que tenga el epítopo reconocido y unirse, si lo hacen, en un grado detectablemente menor, a otras proteínas que carezcan del epítopo que estén presentes en la muestra. En un contexto in vivo, "específicamente inmunorreactivo" se puede referir a las condiciones en las que un animal forma una respuesta inmunitaria contra una vacuna o antígeno, por ejemplo una respuesta humoral al antígeno (la producción de anticuerpos contra una vacuna, proteína o compuesto
o antígeno presentado a los mismos en condiciones inmunológicamente reactivas) o una respuesta mediada por células (también denominada en la presente memoria descriptiva “respuesta inmunitaria celular”, es decir una respuesta mediada por los linfocitos T contra la vacuna, proteína, compuesto o antígeno presentado a los mismos).
Como se usa en la presente memoria descriptiva "condiciones inmunológicamente reactivas” se usa en el contexto de un inmunoensayo o una reacción in vitro en el que las condiciones físicas de la reacción, incluidas, por ejemplo,
la temperatura, la concentración de sales, el pH, los reactivos y sus concentraciones, y las concentraciones del antígeno y del anticuerpo conocido que es específicamente inmunorreactivo frente al antígeno, se proporcionan o ajustan para permitir la unión del anticuerpo conocido al antígeno. Las condiciones inmunológicamente reactivas dependen del formato de la reacción de unión al anticuerpo y, normalmente, son éstas las utilizadas en los protocolos de inmunoensayo. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para una descripción de los formatos y condiciones de inmunoensayo.
El término “paciente” o “sujeto”, como se usa en la presente memoria descriptiva, incluye mamíferos (p. ej., seres humanos y animales).
Anticuerpos
La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a la MN. Este anticuerpo puede ser útil para varios fines diagnósticos y terapéuticos.
En general, los expertos en la técnica apreciarán que los determinantes más cruciales de la selectividad de los anticuerpos y de la afinidad de unión son las secuencias y las conformaciones resultantes de las regiones de complementariedad (CDR). La mayoría de los anticuerpos contienen seis CDR, tres dentro de la región variable de cadena pesada (VH) y tres dentro de la región variable de cadena ligera (VL). Las secuencias intermedias entre las CDR dentro de las VH y VL son las regiones estructurales que orientan las CDR. Las CDR juntas forman los sitios de unión antigénica dentro de los anticuerpos. El papel crucial de estas CDR en la determinación de las propiedades funcionales de los anticuerpos lleva explotándose mucho tiempo en los procedimientos de humanización de anticuerpos y optimización de anticuerpos. En el procedimiento anterior, las CDR de un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, un anticuerpo de ratón se transfiere a un anticuerpo humano de diseño estructural similar de modo que tiene como resultado un anticuerpo con las mismas propiedades funcionales y menor inmunogenicidad en el ser humano.
El éxito de este procedimiento es evidente por el número de anticuerpos humanizados que se han comercializado con éxito como terapéuticas humanas e incluyen Herceptin® (trastuzumab, Genentech, Inc., South San Francisco, CA), Synagis® (palivizumab, Medimmune, Inc., Gaithersburg, MD), Campath® (alemtuzumab, Genzyme Oncology, Cambridge, MA), Zenapax® (daclizumab, Roche Pharmaceuticlas, Nutley, NJ), Xolair® (omalizumab, Genentech, Inc., South San Francisco, CA), Raptiva® (efalizumab, Genentech, Inc., South San Francisco, CA), Avastin® (bevacizumab, Genentech, Inc., South San Francisco, CA) y Mylotarg® (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth-Ayerst, Madison, NJ). Otros ejemplos se han descrito en Singer, et al., (J. Immunol, 150:2844 -2857, 1993); Luo, et al., (J. Immunol Meth., 275:31 -40, 2002); y Kostelny, et al., (Int. J. Cancer 93;556 -565, 2001).
El procedimiento de optimización de anticuerpos se centra en mejoras en la selectividad de anticuerpos o la afinidad de unión a través de la alteración específica en la secuencia de las CDR. Está bien aceptado dentro del campo de desarrollo de anticuerpos que las CDR codifican las propiedades de afinidad de unión y de selectividad requeridas para usos terapéuticos y diagnósticos, y estas secuencias de CDR se pueden usar para conferir dichas propiedades funcionales deseables a una amplia variedad de estructuras de anticuerpos alternativas usando procedimientos estándar conocidos para los expertos en la técnica. También es posible transferir la actividad de unión a anticuerpo mediante el injerto de CDR del anticuerpo sobre otras proteínas que poseen pliegues de tipo inmunoglobulina tales como otras proteínas dentro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y no inmunoglobulinas con pliegues similares a las inmunoglobulinas (Nicaise, et al., Protein Science 13:1882 -1891, 2004).
La presente invención contempla cualquier tecnología conocida o adecuada para la preparación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de la invención.
Por ejemplo, la tecnología de expresión en fagos es útil para obtener anticuerpos anti-MN de alta afinidad o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de la invención para el uso en el diagnóstico y/o tratamiento de un trastorno relacionado con MN, tal como un cáncer relacionado con MN. La tecnología, denominada maduración de afinidad, usa mutagénesis o camino y reselección de CDR usando el antígeno de la MN para identificar anticuerpos que se unen con mayor afinidad al antígeno cuando se compara con el anticuerpo inicial o parental (véase, por ejemplo, Glaser et al., 1992, J. Immunology 149:3903). La mutageneización de codones completos en lugar de nucleótidos únicos tiene como resultado un repertorio semi-aleatorizado de mutaciones de aminoácidos. Se pueden construir bibliotecas que consisten en un conjunto de clones variantes cada uno de los cuales difiere en una única alteración de aminoácido en una única CDR y que contienen variantes que representan cada posible sustitución de aminoácidos para cada residuo de CDR. Los mutantes con mayor afinidad de unión por el antígeno se pueden seleccionar por contacto con los mutantes inmovilizados que contienen antígeno marcado. Se puede usar cualquier procedimiento de selección conocido en la técnica para identificar anticuerpos mutantes con mayor avidez por el antígeno (p. ej., ELISA) (véase Wu et al., 1998, Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994). El camino de CDR también se puede usar para aleatorizar la cadena ligera (véase, Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551, incorporado por referencia).
En un ejemplo concreto, MorphoSys AG (Alemania) proporciona una tecnología de fago-anticuerpo que se puede usar para generar anticuerpos completamente humanos. La biblioteca Morphosys HuCAL GOLD proporciona una
serie de avances sobre las versiones anteriores de la tecnología (Knappik, et al., J. Mol. Biol. 296:57 -86, 2000) incluyendo la biblioteca HuCAL-Fab 1 descrita en Rauchenberger, et al., (J. Biol. Chem. 278:38194 -38205, 2003). Como las versiones anteriores, HuCAL GOLD incorpora un diseño de anticuerpos humanos que portan las secuencias estructurales consenso humanas y patrones de la variabilidad de la CDR que simulan la diversidad de las secuencias humanas naturales. No obstante, la diversidad se extiende en HuCAL GOLD para incluir las seis CDR de anticuerpos. Además, la recuperación de anticuerpos de alta afinidad aumenta mediante la característica CysDisplay™ -(Kretzschmar y von Ruden, Curr. Opin. Biotechnol. 13:598 -602, 2002). Los anticuerpos derivados con esta tecnología exhiben una probabilidad muy reducida de inmunogenicidad.
Las tecnologías de expresión en fagos, tales como las disponibles en Morphosys, se conocen en la técnica y se pueden hacer referencias también a Boehncke WH et al., Br J Dermatol. (2005), Nov;153(5): 1092; Simon Moroney et al., Modern Biopharmaceuticals; Edited by J. Knaeblein, Wiley-VCH Verlag (2005); Ralf Ostendorp et al., Antibodies, Volumen 2: Novel technologies and therapeutic use, p.13 -52, (2004), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York; R. Rauchenberger et al., J Biol Chem., (2003), Oct 3, 278(40): 38194 -38205; T. Kretzschmar et al., Curr Opin Biotechnol., (2002), Dec, 13(6):598 -602; Krebs B et al, J Immunol Methods, (2001), Aug 1, 254(1 2); M. Marget et al., Tissue Antigens, (2000), 56: 1 -9; A. Knappik et al., J. Mol Biol., (2000), Feb 11, 296 (1): 57 -86; y A. Pluckthun et al., Immunotechnology, (1997), Jun; 3(2): 83 -105.
Como ejemplo, los anticuerpos con unión a MN y actividad neutralizante de la adhesión celular se pueden identificar usando la tecnología MorphoSys. La proteína MN puede revestir una placa de microtitulación o una perla magnética e incubar con la biblioteca de fagos MorphoSys HuCAL-GOLD Fab. Los Fab unidos a fagos que no se unen a MN se pueden lavar de la placa, dejando solo el fago que se une a MN. El fago unido se puede eluir mediante adición de un agente reductor tiol tal como ditiotreitol (DTT) que tiene como resultado la escisión del puente disulfuro que une el anticuerpo al fago. La población recuperada del fago se puede enriquecer con fagos que expresan fragmentos de anticuerpos de unión a MN y se pueden amplificar mediante infección de huéspedes de E. coli. Este proceso de panning se puede repetir usando la población enriquecida de fagos para enriquecer adicionalmente una población de anticuerpos unidos a fago que se unen a MN. La secuencia génica que codifica los Fab se pueden escindir después usando técnicas de clonación estándar y transferir a un vector de expresión, tal como un vector de expresión bacteriana (p. ej., E. coli) o un vector de expresión en mamíferos, que se usa para transformar una línea celular huésped, tal como CHO o la línea celular de expresión E. coli. Los Fab del conjunto enriquecido se pueden expresar y purificar.
Como alternativa, se puede realizar el panning usando células que expresan MN como antígeno. Por ejemplo, las células transfectadas con el antígeno MN se pueden marcar con biotina. Estas células transfectadas se pueden mezclar después con células no transfectadas con MN no marcadas en una proporción marcado:sin marcar de 1:10. La biblioteca de fagos se añade a as células y las células portadoras de MN biotiniladas se capturan con perlas magnéticas unidas a estreptavidina que están unidas a un imán. Los fagos inespecíficos se eliminan mediante lavado y las células portadoras de MN se eluyen específicamente eliminando el campo magnético. Estos fagos unidos específicamente se pueden amplificar para otras rondas de panning celular o se pueden alternar con panning de péptidos y/o proteínas.
Los anticuerpos pueden producirse mediante otras técnicas, tal como se describe a continuación. Por ejemplo, otro enfoque para obtener anticuerpos es seleccionar una biblioteca de ADN de linfocitos B como se describe en Dower, et al., (documento WO 91/17271) y McCafferty, et al., (documento WO 92/01047). En estos procedimientos, se producen bibliotecas de fagos en las que los miembros muestran diferentes anticuerpos sobre sus superficies externas. Normalmente, los anticuerpos se expresan como fragmentos Fv o Fab. Los anticuerpos que se expresan en fagos se seleccionan mediante enriquecimiento por afinidad de la unión a una proteína seleccionada.
En una variación del procedimiento de expresión en fagos se pueden producir anticuerpos humanos que tienen especificidad de unión de un anticuerpo murino seleccionado (documento WO 92120791). En este procedimiento, la región variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo murino seleccionado (p. ej., 5C7.29) se puede usar como material de partida. Si, por ejemplo, se selecciona una región variable de cadena ligera como material de partida, se puede construir una biblioteca de fagos en la que los miembros muestran la misma región variable de cadena ligera (es decir, el material de partida murino) y una región variable de cadena pesada diferente. Las regiones variables de cadena pesada pueden obtenerse de una biblioteca de regiones variables de cadena pesada humanas reorganizadas. Se selecciona un fago que muestra una fuerte unión específica por una proteína (p. ej., al menos 10 nM o al menos 1 nM). La región variable de cadena pesada humana de este fago sirve como material de partida para construir una biblioteca de fagos adicional. En esta biblioteca, cada fago expresa la misma región variable de cadena pesada (es decir, la región identificada a partir de la primera biblioteca de expresión) y una región variable de cadena ligera diferente. Las regiones variables de cadena ligera pueden obtenerse de una biblioteca de regiones variables de cadena ligera humanas reorganizadas. De nuevo, se seleccionan fagos que muestran una fuerte unión específica.
Como otro ejemplo, se pueden producir anticuerpos usando la metodología del trioma. El enfoque básico y un ejemplo de pareja de fusión celular, SPAZ-4 para usar en este enfoque, han sido descritos por Oestberg, et al., (Hybridoma 2:361 -367, 1983; patente de EE.UU. Nº 4.634.664); y Engleman, et al., (patente de EE.UU. Nº 4.634.666). Las líneas celulares productoras de anticuerpo obtenidas mediante este procedimiento se denominan
triomas porque descienden de tres células, dos humanas y una de ratón. Inicialmente, una línea de mieloma de ratón se condensa con un linfocito B humano para obtener una célula híbrida xenogeneica no productora de anticuerpos, tal como la línea celular SPAZ-4. La célula xenogeneica se condensa después con un linfocito B humano inmunizado para obtener una línea celular trioma productora de anticuerpos. Se ha descubierto que los triomas producen anticuerpos de un modo más estable que los hibridomas normales fabricados de células humanas.
Los linfocitos B se obtienen de sangre, bazo, ganglios linfáticos o médula ósea de un donante humano. Normalmente no es deseable la inmunización In vivo de un humano vivo con la proteína debido al riesgo de iniciar una respuesta dañina. Por tanto, normalmente los linfocitos B se inmunizan in vitro con una proteína (p. ej., MN) o un fragmento antigénico de la misma o una célula portadora de dicha proteína (p. ej., MN) Fragmentos epitópicos específicos que consisten esencialmente en los segmentos de aminoácidos que se unen a uno de los anticuerpos murinos de ejemplo se pueden usar para inmunización in vitro. Normalmente, los linfocitos B se exponen a un antígeno durante un periodo de 7-14 días en un medio tal como RPMI-1640 (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 4.634.666) suplementado con 10% de suero humano:
Los linfocitos B inmunizados se pueden condensar a una célula híbrida xenogeneica tal como SPAZ-4 mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden tratar con 40 -50 % de polietilenglicol de PM 1.000 – 4.000 durante aproximadamente 5-10 minutos a aproximadamente 30ºC. Las células se pueden separar de la mezcla de fusión y propagar en medio selectivo para los híbridos deseados (p. ej., HAT o AH). Los clones que secretan anticuerpos que tienen la especificidad de unión requerida se pueden identificar analizando en el medio de cultivo del trioma su capacidad para unirse a una proteína (p. ej., MN) usando los mismos procedimientos que se han tratado anteriormente para anticuerpos no humanos. Los triomas productores de anticuerpos humanos que tienen la especificidad deseada se pueden subclonar, por ejemplo, mediante la técnica de dilución límite, y cultivar in vitro en medio de cultivo.
Aunque los triomas son genéticamente estables, pueden no producir anticuerpos a niveles muy altos. Los niveles de expresión se pueden incrementar clonado genes de anticuerpos del trioma en uno o más vectores de expresión y transformar el vector en una línea celular tal como las líneas celulares para la expresión de inmunoglobulinas recombinantes o humanizadas.
Los anticuerpos humanos con reacción cruzada con una proteína (p. ej., MN) también se pueden producir de mamíferos transgénicos no humanos que tienen transgenes que codifican al menos un segmento del locus de la inmunoglobulina humana. Normalmente, el locus de la inmunoglobulina endógena de dichos mamíferos transgénicos está funcionalmente inactivado. El segmento del locus de la inmunoglobulina humana puede incluir secuencias no reorganizadas de componentes de las cadenas pesada y ligera. Tanto la inactivación de los genes de inmunoglobulina endógena como la introducción de genes de inmunoglobulina exógena se pueden conseguir mediante recombinación homóloga dirigida o mediante introducción de cromosomas YAC. Los mamíferos transgénicos resultantes de este procedimiento pueden reorganizar funcionalmente las secuencias del componente inmunoglobulina y expresar un repertorio de anticuerpos de varios isotipos codificados por genes de inmunoglobulina humana, sin expresar genes de inmunoglobulina endógena. La producción y las propiedades de los mamíferos que tienen estas proteínas se describen con detalle en, por ejemplo, Lonberg, et al., (documento WO 93/12227); y Kucherlapati, (documento WO 91/10741). La reacción cruzada de anticuerpos anti-MN humanos se puede obtener inmunizando un mamífero no humano transgénico como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar, por ejemplo, condensado linfocitos B de dichos mamíferos con líneas celulares de mieloma adecuadas usando tecnología de Kohler-Milstein convencional (Kohler y Milstein, Nature
256:495 -497, 1975.
Los anticuerpos de ratón o de otros no humanos que reaccionan de forma cruzada con una proteína (p. ej., MN) se pueden obtener usando varias estrategias de inmunización. En algunas estrategias, los animales no humanos (normalmente mamíferos no humanos tales como ratones) se pueden inmunizar con antígenos MN. Los inmunógenos pueden incluir células transfectadas de forma estable con MN y expresan MN en su superficie celular, y proteína MN o fragmentos epitópicos que contienen los segmentos de estas moléculas que se unen a los anticuerpos de ejemplo que reaccionan de forma cruzada. Las células productoras de anticuerpos obtenidas de animales inmunizados se pueden inmortalizar y seleccionar para la producción de un anticuerpo que se une específicamente a MN (p. ej., Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, C.S.H.P., N.Y., 1988). La unión se puede detectar usando, por ejemplo, un anticuerpo secundario adecuado portador de un segundo marcador. Después, los anticuerpos de reacción cruzada se pueden someter a selección para determinar su capacidad para dirigir la citotoxicidad celular selectiva a las células que expresan MN.
Ensayos de unión
Se puede usar cualquier medio para describir la fuerza de la unión (o la afinidad) entre un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención y un antígeno de la invención (proteína MN). Por ejemplo, la constante de disociación, Kd (Kd = k2/k1 = [anticuerpo][antígeno] / [completo anticuerpo-antígeno]) se puede determinar mediante análisis cinéticos estándar que se conocen en la técnica. Los expertos en la técnica apreciarán que la constante de disociación indica la fuerza de la unión entre un anticuerpo y un antígeno en términos de lo fácil que es separar el complejo. Si se requiere una concentración elevada del anticuerpo y del antígeno para formar el complejo, la fuerza
o afinidad de la unión es baja, lo que tiene como resultado una Kd más alta. Se deduce que cuanto menor es la Kd (expresada en unidades de concentración, por ejemplo molar o nanomolar), más fuerte es la unión.
La afinidad se puede evaluar y/o medir mediante varias técnicas e inmunoensayos conocidos, incluyendo, por ejemplo, ensayo inmunoespecífico ligado a enzima (ELISA), análisis de interacción biomolecular (BIA) (p. ej., Sjolander y Urbaniczky, Anal. Chem. 63:2338 -2345, 1991; Szabo, et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699 -705, 1995), y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para cuantificar la unión del anticuerpo a las células que expresan MN. El BIA es una tecnología para analizar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcaje de ninguno de los interactuantes (p. ej., BIAcore™). BIAcore se basa en la determinación de cambios en la resonancia de plasmón superficial de fenómeno óptico (SPR) en reacciones a tiempo real entre moléculas biológicas, tales como un anticuerpo de la invención y un antígeno proteico MN. Las referencias en relación con la tecnología BIAcore se puede encontrar también en las solicitudes publicadas de EE.UU. Nº 2006/0223113, 2006/0134800, 2006/0094060, 2006/0072115, 2006/0019313, 2006/0014232 y 2005/0199076.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de la invención que se unen específicamente a una proteína (p. ej., MN) proporcionan una señal de detección, por ejemplo, preferentemente, al menos aproximadamente 5 veces más alta, más preferentemente, al menos aproximadamente 10 veces más alta y todavía más preferentemente, al menos aproximadamente 20 veces más alta que una señal de detección proporcionada para otras proteínas cuando se usa en un ensayo inmunoquímico. Como tales, estos anticuerpos se pueden usar para inmunoprecipitar una proteína (p. ej., MN) en la solución.
Los anticuerpos y fragmentos de la invención se pueden analizar para determinar la unión inmunoespecífica (o la unión que es “específicamente inmunorreactiva”, que se define en el presente documento) mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los ensayos que implican un anticuerpo y un antígeno se conocen como “inmunoensayos”, que se pueden usar en la presente invención para caracterizar los anticuerpos y los antígenos de la invención. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, entre otros, sistemas de ensayo competitivo y no competitivo usando técnicas tales como transferencias de tipo western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzima), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A, por citar algunas. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York) y se pueden realizar sin experimentación indebida. Ejemplos de inmunoensayos se describen brevemente más adelante (pero no se pretende que sean limitantes).
Generalmente, los protocolos de inmunoprecipitación comprenden lisar una población de células en un tampón de lisis, tal como tampón RIPA (1% de NP-40 o Triton X-100, 1% de desoxicolato sódico, 0,1% de SDS, NaCl 0,15 M, fosfato sódico 0,01 M a pH 7,2, 1% de Trasylol) suplementado con fosfatasa proteica y/o inhibidores de la proteasa
(p. ej., EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato sódico), añadir el anticuerpo de interés al lisado celular, incubar durante un periodo de tiempo (p. ej., 14 horas) a 4° C, añadir perlas de sefarosa con proteína A y/o proteína G al lisado celular, incubar durante aproximadamente una hora o más a 4 ºC, lavar las perlas en tampón de lisis y resuspender las perlas en tampón de SDS/muestra. La capacidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipitar un antígeno concreto se puede evaluar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia de tipo western. Un experto en la técnica conocerá los parámetros que se pueden modificar para aumentar la unión del anticuerpo a un antígeno y disminuir el fondo (p. ej., aclarar previamente el lisado celular con perlas de sefarosa). Para una discusión adicional sobre los protocolos de inmunoprecipitación, véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1.
Generalmente, el análisis de transferencia de tipo western comprende preparar muestras de proteínas, electroforesis de las muestras de proteínas en un gel de poliacrilamida (p. ej., 8 % 20 % SDS-PAGE dependiendo del peso molecular del antígeno), transferir la muestra proteica del gel de poliacrilamida a una membrana, tal como nitrocelulosa, PVDF o nailon, bloquear la membrana en solución de bloqueo (p. ej., PBS con 3 % de BSA o leche desgrasada), lavar la membrana en tampón de lavado (p. ej., PBS-Tween 20), bloquear la membrana con anticuerpo primario (el anticuerpo de interés) diluido en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado; bloquear la membrana con un anticuerpo secundario (que reconoce el anticuerpo primario, por ejemplo un anticuerpo antihumano) conjugado con un sustrato enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) o molécula radioactiva (p. ej., 32P o 125I) diluida en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado y detectar la presencia del antígeno. Un experto en la técnica conocerá los parámetros que se pueden modificar para aumentar la señal detectada y para reducir el ruido de fondo. Para una discusión adicional sobre los protocolos de transferencia de tipo western, véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York en 10.8.1.
Los ELISA normalmente comprenden preparar el antígeno, revestir el pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con el antígeno, añadir el anticuerpo de interés conjugado con un compuesto detectable, tal como un sustrato enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) al pocillo e incubar durante un periodo de tiempo, y detectar la presencia del antígeno. En los ELISA, el anticuerpo de interés no tiene que estar conjugado con un compuesto detectable; en su lugar, se puede añadir al pocillo un segundo anticuerpo (que reconoce el anticuerpo
de interés) conjugado a un compuesto detectable. Además, en lugar de revestir el pocillo con el antígeno, el anticuerpo puede recubrir el pocillo. En este caso, un segundo anticuerpo conjugado a un compuesto detectable se puede añadir tras la adición del antígeno de interés al pocillo revestido. Un experto en la técnica conocerá los parámetros que se pueden modificar para aumentar la señal detectada, así como otras variaciones de ELISA conocidas en la técnica. Para una discusión adicional sobre los ELISA, véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1.
Los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de la invención también se pueden purificar en cualquier célula que exprese los anticuerpos, incluidas las células huésped que se han transfectado con constructos de expresión que codifican anticuerpo. Las células huésped se pueden cultivar en condiciones en las que se expresan los anticuerpos. Los anticuerpos purificados y/o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno se pueden separar de otros componentes celulares que se pueden asociar con los anticuerpos en la célula, tal como ciertas proteínas, hidratos de carbono o lípidos, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, entre otros, cromatografía por exclusión de tamaño, fraccionamiento con sulfato amónico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y electroforesis en gel preparativa. La pureza de las preparaciones se puede evaluar por medios conocidos en la técnica, tal como electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Una preparación de anticuerpos purificados pueden contener más de un tipo de anticuerpo (p. ej., anticuerpos con las características de unión a MN y neutralizantes).
Como alternativa, los anticuerpos se pueden producir usando procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos o porciones de la secuencia de anticuerpos (p. ej., Secuencias de CDR), tal como mediante síntesis peptídica directa usando técnicas de fase sólida (p. ej., Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 -2154, 1963; Roberge, et al., Science 269:202 -204, 1995). La síntesis de proteínas puede realizarse usando técnicas manuales
o mediante automatización. La síntesis automática se puede conseguir, por ejemplo, usando el Sintetizador Peptídico 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer). Opcionalmente se pueden sintetizar por separado fragmentos de anticuerpos y combinarse usando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.
Una vez que un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invención se identifica u obtiene mediante, por ejemplo, cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, por ejemplo incluyendo procedimientos tradicionales de producción de anticuerpos (p. ej., procedimientos de inmunización animal), producción monoclonal o por medios de ADN recombinante, puede ser preferible llevar a cabo otras etapas para caracterizar y/o purificar y/o modificar el anticuerpo. Por ejemplo, puede ser deseable preparar un fragmento de anticuerpo inmunorreactivo o preparar una composición purificada de alta titulación del anticuerpo identificado deseable o analizar la inmunorreactividad del anticuerpo identificado o fragmento del mismo. La presente invención contempla cualquier procedimiento conocido y adecuado para caracterizar, purificar o analizar los anticuerpos de la presente invención y cabe esperar que cualquier experto en la técnica a la que la invención pertenece tendrá el nivel requerido de conocimientos técnicos y recursos, por ejemplo manuales o tratados técnicos, para conseguir cualquier caracterización, purificación y/o ensayo de los anticuerpos de la invención sin experimentación indebida.
En aspectos concretos, los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos, que incluyen, entre otros, purificación de la proteína A, precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de interacción de carga hidrófoba y cromatografía con lectina. La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (“HPLC”) también se puede emplear para purificación. Véase, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (19972001),por ejemplo los Capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10.
El término “aislar” en el contexto de los anticuerpos hace referencia a cualquier procedimiento conocido en la técnica mediante el cual se purifican anticuerpos. En la técnica se conocen bien procedimientos para purificar anticuerpos y la presente invención contempla cualquier procedimiento adecuado que conozca un experto en la técnica y que no requiera experimentación indebida. Por ejemplo, procedimientos cromatográficos, tales como, por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad (ligando inmovilizado para unir y atrapar el anticuerpo de interés), cromatografía de afinidad, precipitación de proteínas, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de exclusión por tamaño, así como electroforesis, se pueden encontrar descritos en la literatura técnica, por ejemplo en Methods in Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, Eds. J. Abelson, M. Simon, Academic Press, 1ª Edición, 1990. Por tanto, los expertos en la técnica conocen los materiales adecuados para realizar dichas etapas de purificación, tales como etapas cromatográficas. Dichos procedimientos son adecuados para purificación de cualquiera de los anticuerpos, antígenos o cualquier fragmento de los mismos de acuerdo con la invención como se ha descrito en el presente documento.
Ciertas realizaciones pueden requerir la purificación o aislamiento de proteínas expresadas o anticuerpos o fragmentos de los mismos de una célula huésped o una porción de la misma. En la presente invención se contemplan procedimientos convencionales para aislar proteínas recombinantes de células huésped transformadas. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, aislamiento de la proteína o fragmentos de interés mediante extracción inicial de sedimentos celulares o de medio de cultivo celular, seguido de desalación, y se pueden usar una o más etapas de cromatografía, incluyendo etapas cromatografía de intercambio iónico acuosa, cromatografía de exclusión
por tamaño, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) y cromatografía de afinidad, para aislar la proteína
o fragmento recombinante. Guías en los procedimientos para purificar proteínas se pueden encontrar en la literatura técnica, incluyendo, por ejemplo, Methods in Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, Eds. J. Abelson, M. Simon, Academic Press, 1ª Edición, 1990.
Las moléculas sintetizadas químicamente se pueden purificar sustancialmente mediante cromatografía preparativa líquida de alto rendimiento (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983). La composición de un polipéptido sintético se puede confirmar mediante análisis o secuenciación de los aminoácidos (p. ej., usando la degradación de Edman).
Polinucleótidos
En otro aspecto, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican los anticuerpos contra MN o los fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de la invención. Estos polinucleótidos se pueden usar para, por ejemplo, producir cantidades de los anticuerpos para uso terapéutico o diagnóstico o para producir muestras de anticuerpos o fragmentos para usar en inmunoensayos de la invención.
Los polinucleótidos que se pueden usar para codificar, por ejemplo, cada una de las tres CDR dentro de las regiones VH de anticuerpo se describen en las SEC ID Nº: :57, 63, 70. Los polinucleótidos que se puede usar para codificar, por ejemplo, cada una de tres CDR dentro de las regiones VL de anticuerpos se describen en las SEC ID Nº: 89, 93,
97.
Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden aislar de células huésped, liberar de otros componentes celulares tales como componentes de membrana, proteínas y lípidos de acuerdo con cualquier procedimiento conocido o adecuado en la técnica. Los polinucleótidos pueden aislarse usando técnicas de purificación de ácido nucleico estándar o sintetizarse usando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o mediante el uso de un sintetizador automático. Los procedimientos para aislar polinucleótidos son rutinarios y se conocen en la técnica. Se puede usar cualquiera de dichas técnicas para obtener un polinucleótido para obtener polinucleótidos aislados que codifican anticuerpos de la invención. Por ejemplo se pueden usar enzimas de restricción y sondas para aislar polinucleótidos que codifican anticuerpos.
Se pueden preparar moléculas de ADNc que codifican anticuerpos con técnicas estándar de biología molecular, usando ARNm como molde. Después, las moléculas de ADNc se pueden replicar usando técnicas de biología molecular conocidas en la técnica y divulgadas en manuales tales como Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989, Vol. 1
3. Se puede usar una técnica de amplificación, como la PCR, para obtener copias adicionales de los polinucleótidos.
Para expresar un polinucleótido que codifica un anticuerpo, el polinucleótido se puede insertar en un vector de expresión que contenga los elementos necesarios para las transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Se pueden usar procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifican anticuerpos y los elementos adecuados de control de la transcripción y la traducción. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en, por ejemplo, Sambrook, et al. (1989) and in Ausubel, et al., (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1995).
Se pueden utilizar varios sistemas de expresión en vector/huésped para contener y expresar secuencias que codifiquen anticuerpos. Estos incluyen, ente otros, microorganismos, tales como bacterias transformadas con vectores de expresión con ADN recombinante de bacteriófago, plásmido o cósmico, levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión en virus
(p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacteriana (p. ej., plásmidos Ti o pBR322) sistemas de células animales.
Los elementos control o secuencias reguladoras son las regiones no traducidas del vector, potenciadores, promotores, regiones no traducidas en 5' y 3', que interaccionan con las proteínas de las células huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Tales elementos pueden variar de fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y del huésped utilizados, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y de traducción adecuados, incluidos los promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, al clonar en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles como el promotor híbrido LacZ del fagemido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) o el plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares. En células de insectos se puede usar el promotor de la polihidrina del baculovirus. En el vector se pueden clonar promotores o potenciadores derivados de los genomas de células vegetales (p. ej., genes de las proteínas del shock térmico, RUBISCO y de almacenamiento) o de virus vegetales (p. ej., promotores víricos o secuencias líder). En los sistemas de células de mamíferos se pueden usar promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos, por ejemplo un promotor del CMV. Es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que codifique un anticuerpo, los vectores basados en los virus SV40 o EBV se pueden usar con un marcador seleccionable adecuado.
Las construcciones de expresión contendrán además sitios para el inicio y la terminación de la transcripción, y, en la
región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción de codificación de los transcritos maduros expresados por las construcciones pueden incluir, además, un codón de iniciación de la traducción al comienzo y un codón de terminación (p. ej., UAA, UGA o UAG) colocado adecuadamente al final del ARNm que se va a traducir, siendo UAA y UAG preferidos para expresión en células de mamífero o eucariotas.
Los vectores de expresión también pueden incluir al menos un marcador seleccionable. Dichos marcadores incluyen, entre otros, marcadores de células de mamífero, tales como metotrexato (MTX), dihidrofolato reductasa (DHFR) (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; y 5,179,017), ampicilina, neomicina (G418), ácido micofenólico o glutamina sintetasa (GS) (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739), y marcadores de células bacterianas, tales como genes de resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina. Medios de cultivo adecuados y las condiciones para las células huésped descritas anteriormente se conocen en la técnica. Los vectores adecuados serán evidentes para el experto en la técnica,
Se puede usar cualquier procedimiento conocido adecuado para introducir un ADN de la invención, por ejemplo un vector de expresión de ADN que contiene una o más secuencias que codifican anticuerpos en una célula huésped. Algunos procedimientos incluyen transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros procedimientos conocidos. En la técnica se describen dichos procedimientos, tal como en Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1 3, Capítulos 14, 16 y 18).
Los expertos en la técnica conocen numerosos sistemas de expresión disponibles para expresión de un ácido nucleico que codifica anticuerpos o porciones de los mismos de la presente invención.
Ilustrativos de cultivos celulares útiles para la producción de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención son células de mamífero. Los sistemas de células de mamífero a menudo estarán en forma de monocapas de células, aunque también se pueden usar suspensiones de células de mamífero o biorreactores. En la técnica se han desarrollado numerosas líneas celulares huésped adecuadas de expresión de proteínas glicosiladas intactas e incluyen las líneas celulares CHO, CHO-S, COS-1 (p. ej., ATCC CRL 1650), COS-7 (p. ej., ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (p. ej., ATCC CRL-10), CHO (p. ej., ATCC CRL 1610) y BSC-1 (p. ej.,ATCC CRL-26), células Cos7, células CHO, células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, células 293, células HeLa y similares, que están fácilmente disponibles en, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo.
Vectores de expresión para estas células pueden incluir una o más de las siguientes secuencias de control de la expresión, tales como, entre otros, un origen de replicación, un promotor (p. ej., promotores tardíos o tempranos de SV40, el promotor de CMV (p. ej., patentes de EE.UU. Nº 5,168,062; 5,385,839), un promotor de HSV tk (fosfoglicerato quinasa), un promotor alfa de EF-1 (patente de EE.UU. nº 5.266.49 1), un promotor de inmunoglobulina; un potenciador y/o sitios de información de progresión, tales como los sitios de unión al ribosoma, los puntos de corte en el ARN, sitios de poliadenilación (p. ej.,. un sitio de adición de poli A de T Ag grande de SV40) y secuencias terminadoras de la transcripción, Otras células útiles para la producción de ácidos nucleicos o proteínas de la presente invención se conocen o están disponibles en, por ejemplo, el catálogo de la Colección Americana de Cultivos Tipo de líneas celulares e hibridomas u otros conocidos o fuentes comerciales.
Cuando se usan células huésped eucariotas se pueden incorporar en el vector secuencias de poliadenilación o de terminación de la transcripción. Un ejemplo de una secuencia de terminación es la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovina. También se pueden incluir secuencias para corte y empalme preciso de transcritos. Un ejemplo de secuencia de corte y empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773 781 (1983)). Adicionalmente, se pueden incorporar en el vector secuencias génicas para controlar la replicación en la célula huésped, como se sabe en la técnica.
Textos generales que describen técnicas de biología molecular adicionales útiles en el presente documento, incluyendo la preparación de anticuerpos, incluyen Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1 -3); Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, a joint venture between Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (suplementado hasta 2000)); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); y Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
En otra realización, la presente divulgación también se refiere al uso de inmunoensayos cuantitativos para medir los niveles de la proteína MN en muestras de pacientes. Se adaptar muchos formatos para usar con los procedimientos de la presente invención. Por ejemplo, la detección y cuantificación de la proteína MN en muestras de pacientes se pueden realizar mediante ensayos de inmunosorción ligados a enzimas, radioinmunoensayos, ensayos de tipo sándwich de anticuerpo dual, ensayos de aglutinación, inmunoensayos fluorescentes, microscopia de inmunoelectrones y de barrido, entre otros ensayos conocidos habitualmente en la técnica. En una realización, se
pueden detectar y cuantificar varios cambios en los niveles de proteína MN circulante y mediante un ensayo de tipo sándwich en el que el anticuerpo de captura se ha inmovilizado usando técnicas convencionales sobre la superficie del soporte.
Soportes adecuados incluyen, por ejemplo, soportes de polímero sintético, tales como polipropileno, poliestireno, poliestireno sustituido, poliacrilamidas (tales como poliamidas y poli(cloruro de vinilo)), perlas de vidrio, agarosa y nitrocelulosa.
Un ejemplo de un inmunoensayo de tipo sándwich ELISA que se puede usar en los procedimientos de la presente invención usa anticuerpo monoclonal contra MNN anti-humano de ratón como anticuerpo de captura y anticuerpo policlonal contra MN anti-humano de cabra biotinilado como anticuerpo detector. El anticuerpo monoclonal de captura se inmoviliza sobre pocillos de placas de microtitulación. Muestras de suero/plasma humano diluido o patrones de MN (proteína MN silvestre recombinante) se incuban en pocillos para permitir la unión del antígeno de MN mediante el anticuerpo monoclonal de captura. Después de lavar los pocillos, el antígeno de MN inmovilizado se expone a un anticuerpo detector biotinilado tras lo cual se vuelven a lavar los pocillos. Después se añade un conjugado de peroxidada de rábano-estreptavidina. Después de un lavado final se añade a los pocillos sustrato TMB Blue para detectar la actividad peroxidada unida. La reacción se detiene mediante la adición de ácido sulfúrico 2,5N y la absorbancia se mide a 450 nm. La correlación de los valores de absorbancia de las muestras con los patrones de MN permite la determinación de un valor cuantitativo de MN en pg/ml de suero o plasma.
Los anticuerpos útiles para identificar proteínas de MN se pueden marcar mediante cualquier forma convencional. Un ejemplo de un marcador es la peroxidasa de rábano y un ejemplo de un procedimiento de marcaje de anticuerpos es usando complejos de estreptavidina-biotina.
Según sea adecuado, los anticuerpos usados en los inmunoensayos de la presente invenció que se usan como marcadores se pueden marcar de cualquier modo, directa o indirectamente, que tenga como resultado una señal que sea visible o se pueda hacer visible. Las sustancias marcadores detectables incluyen radionúclidos tales como
125I
3H, and 131I; agentes de fluorescencia tales como isotiocianato de fluoresceína y otros flurocromos, ficobiliproteínas, ficoeritrina, quelatos de tierras raras, rojo texas, dansilo y rodamina; reactivos colorimétricos (cromógenos); materiales opacos a electrones, tales como oro coloidal; agentes de bioluminiscencia; agentes de quimioluminiscencia; pigmentos; enzimas tales como peroxidasa de rábano, fosfatasas alcalinas, glucosa oxidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, acetilcolinesterasa, alfa-, beta-galactosidasa, entre otros; coenzimas; sustratos enzimáticos; cofactores enzimáticos; inhibidores de enzimas; subunidades de enzimas; iones metálicos; radicales libres; o cualquier otra sustancia inmunológicamente activa o inerte que proporcione un medio para detectar o medir la presencia o cantidad de inmunocomplejo formado. Ejemplos de combinaciones de sustratos enzimáticos son peroxidasa de rábano y tetrametilbencidina (TMB) y fosfatasas alcalinas y paranitrofenilfosfato (pNPP).
Otros sistemas de detección y cuantificación según la presente invención producen señales luminiscentes, bioluminiscentes (BL) o quimioluminiscentes (CL). En ensayos quimioluminiscentes (CL) o bioluminiscentes (BL), la intensidad o la emisión lumínica total se mide y relaciona con la concentración del analito desconocido. La luz se puede medir cuantitativamente usando un luminómetro (tubo fotomultiplicador como detector) o dispositivo acoplado a carga, o cualitativamente por medio de fotografía o películas de rayos X. Las principales ventajas del uso de estos ensayos es su simplicidad y sensibilidad analítica, lo que permite la detección y/o cuantificación de cantidades muy pequeñas de analito.
Ejemplos de marcadores luminiscentes son ésteres de acridinio, sulfonil carboxamidas de acridinio, luminol, umbeliferona, derivados de isoluminol, fotoproteínas tales como aecuorina, y luciferasas de luciérnagas, bacterias marinas Vargulla y Renilla. El luminol se puede usar opcionalmente con una molécula potenciadora tal como 4yodofenol o ácido 4-hidroxicinámico. Normalmente se general una señal CL mediante tratamiento con un oxidante en condiciones básicas.
Los sistemas de detección luminiscente adicionales son aquéllos en los que la señal (marcador detectable) se producen mediante reacción enzimática sobre un sustrato. Se han desarrollado esquemas de detección CL y BL para analizar los marcadores de fosfatasas alcalinas (AP), glucosa oxidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, peroxidasa de rábano (HRP) y xantina oxidasa, entre otros. AP y HRP son dos marcadores enzimáticos que se pueden cuantificar mediante una serie de reacciones CL y BL. Por ejemplo, las AP se pueden usar con un sustrato, tal como un sustrato 1,2-dioxetano arilfosfato de adamantilo (p. ej., AMPPD o CSPD; Kricka, L.J., "Chemiluminescence and Bioluminescence, Analysis by," Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (ed. R.A. Meyers) (VCH Publishers; N.Y., N.Y.; 1995)); por ejemplo, una sal disódica de 4-metoxi-4(3-fosfatofenil) espiro [1,2-dioxetano-3,2'-adamantano], con o sin una molécula potenciadora tal como dicloruro de 1(trioctilfosfonio metil)-4-(tributilfosfonio metil) benceno. La HRP se puede usar con sustratos tales como 2',3',6'trifluorofenil-metoxi-10-metilacridan-9-carboxilato.
Las reacciones CL y BL se pueden adaptar para análisis, no solo de enzimas sino también de otros sustratos, cofactores, inhibidores, iones metálicos y similares. Por ejemplo, las reacciones de luminol, luciferasa de luciérnaga y luciferasa de bacterias marinas son reacciones indicadoras de la producción o consumo de peróxido, ATP y NADPH, respectivamente. Se pueden acoplar a otras reacciones con oxidasas, quinasas y deshidrogenasas, y se
pueden usar para medir cualquier componente de la reacción acoplada (enzima, sustrato, cofactor).
El marcador detectable puede estar unido directa o indirectamente a un anticuerpo usado en un ensayo de la presente invención. Ejemplos de unión indirecta del marcador detectable es el uso de un par de unión entre un anticuerpo y un marcador o el uso de un sistema de amplificación de señal.
Ejemplos de pares de unión que se pueden usar para unir anticuerpos a marcadores detectables son biotina/avidina, estreptavidina o antibiotina, avidina/anti-avidina; tiroxina/globulina de unión a tiroxina; antígeno/anticuerpo; anticuerpo/anti-anticuerpo; hidratos de carbono/lectinas; hapteno/anticuerpo anti-hapteno; pigmentos y moléculas hidrófobas/sitios de unión a proteínas hidrófobas; inhibidor enzimático, coenzima o cofactor/enzima; ácido polinucleico/secuencia de ácido polinucleico homóloga; fluoresceína/anti-fluoresceína; dinitrofenol/anti-dinitrofenol; vitamina B12/factor intrínseco; cortisona; cortisol/proteína de unión a cortisol; y ligandos para proteínas receptoras específicas/proteínas receptoras específicas asociadas a la membrana.
En la técnica se conocen varios medios para unir marcadores directa o indirectamente a anticuerpos. Por ejemplo, los marcadores se pueden unir de forma covalente o no covalente. Ejemplos de procedimientos de conjugación de anticuerpos se describen en Avarmeas, et al., Scan. J. Immunol. 8(Suppl. 7): 7, 1978); Bayer, et al., Meth. Enzymol. 62:308, 1979; Chandler, et al., J. Immunol. Meth. 53:187, 1982; Ekeke and Abuknesha, J. Steroid Biochem. 11:1579, 1979; Engvall and Perlmann, J. Immunol. 109:129, 1972; Geoghegan, et al., Immunol. Comm. 7:1, 1978; and Wilson and Nakane, Immunofluorescence and Related Technique Elsevier/North Holland Biomedical Press; Amsterdam (1978).
Dependiendo de la naturaleza del marcador se pueden usar varias técnicas para detectar y cuantificar el marcador. Para los agentes de fluorescencia se dispone de un gran número de fluorímetros. Para los agentes de quimioluminiscencia se dispone de luminómetros o películas. Con enzimas, un agente fluorescente, agente quimioluminiscente o producto coloreado se puede determinar o medir fluorimétricamente, luminométricamente, espectrofotométricamente o visualmente.
Varios tipos de compuestos quimioluminiscentes que tienen un tipo acridinio, benzacridinio o acridano de sistemas anulares heterocíclicos son otros ejemplos de marcadores. Ejemplos de ésteres de acridinio incluyen los compuestos que tienen anillos heterocíclicos o sistemas anulares que contienen el heteroátomo en un estado de oxidación positiva que incluye sistemas anulares como acridinio, benz[a]cridinio, benz[b]acridinio, benz[c]acridinio, un catión de bencimidazol, quinolinio, isoquinolinio, quilolizinio, un quinolinio sustituido cíclico, fenantridinio y quinoxalinio.
El marcador se puede preparar uniendo al anticuerpo seleccionado directa o indirectamente un grupo funcional reactivo presente en el éster de acridinio o benzacridinio, como es bien conocido para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Weeks, et al., Clin. Chem. 29(8): 1474 -1479, 1983). Ejemplos de compuestos son ésteres de acridinio o benzacridinio con un grupo saliente de anillo arilo y el grupo funcional reactivo presente en la posición para o meta del sistema de arilo. (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 4.745.181 y el documento WO 94/21823.)
Procedimientos de uso
El término “tratamiento” incluye cualquier procedimiento, acción, aplicación, terapia o similar, en el que a un sujeto (o paciente), incluido un ser humano, se le proporciona ayuda médica con el objeto de mejorar la afección del sujeto, directa o indirectamente, o ralentizar la progresión de una afección, o trastorno, en el sujeto, o aliviar al menos un síntoma de la enfermedad o trastorno en tratamiento.
El término “terapia de combinación” o “co-terapia” quiere decir la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una enfermedad, afección y/o trastorno. Dicha administración abarca la coadministración de dos o más agentes terapéuticos de un modo sustancialmente simultáneo, tal como en una única cápsula que tiene una proporción fija de ingredientes activos, o en múltiples cápsulas distintas para cada agente inhibidor. Además, dicha administración abarca el uso de cada tipo de agente terapéutico de forma secuencial. El orden de administración de dos o más agentes terapéuticos co-administrados de forma secuencia no está limitado.
La expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” quiere decir la cantidad de cada agente administrado que alcanzará el objetivo de mejora de la gravedad de una enfermedad, afección y/o trastorno, y/o sus síntomas, mientras que evita o minimiza los efectos secundarios adversos asociados con el tratamiento terapéutico administrado.
El término “farmacéuticamente aceptable” significa que el artículo sujeto es adecuado para usar en un producto farmacéutico.
Cabe esperar que los anticuerpos de la presente invención sean valiosos como agentes terapéuticos. De acuerdo con esto, una forma de realización de la presente invención incluye un procedimiento de tratamiento de varias afecciones en un paciente (incluidos mamíferos), que comprende administrar a dicho paciente una composición que contiene una cantidad de un anticuerpo de la invención que es efectiva en el tratamiento de la afección diana.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar en el tratamiento o prevención de enfermedades y/o comportamientos que están asociados con la proteína MN. Estas enfermedades y/o comportamientos incluyen, por ejemplo, cáncer, tal como carcinomas de riñón, esófago, mama, cuello uterino, colon y pulmones. La presente invención también se refiere a procedimientos de alivio de síntomas de un trastorno en el que la MN está elevada o, de otro modo, se expresa de forma anormal. Estos trastornos incluyen, sin limitación, carcinomas de riñón, esófago, mama, cuello uterino, colon y pulmones (véase, por ejemplo, (Liao, Cancer Res. 57:28272831, 1997; Turner, Hum. Pathol. 28:740744, 1997; Liao, y col., Am. J. Pathol. 145:598609, 1994; Saarnio, y col., Am. J. Pathol. 153:279285, 1998; Vermylen, y col., Eur. Respir. J. 14:806811, 1999). En una forma de realización de la invención, una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención se administra a un paciente que tenga un trastorno en el que la MN está elevada.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar solos o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. La terapia de combinación incluye la administración de una única formulación de dosificación farmacéutica que contiene un anticuerpo de la presente invención y uno o más agentes terapéuticos, así como la administración del anticuerpo de la presente invención y cada agente terapéutico en su propia formulación de dosificación farmacéutica aparte. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención y un agente terapéutico se pueden administrar al paciente juntos en una única composición de dosificación oral o cada agente puede administrarse en formulaciones de dosificación oral separadas.
Cuando se usan formulaciones de dosificación distintas, el anticuerpo de la presente invención y uno o más agentes terapéuticos pueden administrarse esencialmente al mismo tiempo (p. ej., de forma concurrente) o a tiempos separados escalonados (p. ej., secuencialmente). El orden de administración del agente no está limitado.
Por ejemplo, en un aspecto, la co-administración de un anticuerpo anti-MN o fragmento de anticuerpo de la invención junto con uno o más agentes anticancerosos para potenciar el efecto del anticuerpo/fragmento o el(los) agente(s) anticanceroso(s) o ambos se contempla para usar en el tratamiento de trastornos relacionados con la MN, tales como cáncer.
Dichas terapias de combinación también pueden usarse para prevenir el cáncer, la recurrencia del cáncer, prevenir la diseminación o metástasis de un cáncer o reducir o aliviar los síntomas asociados con el cáncer.
El o los agentes anti-cancerosos pueden incluir cualquier compuesto conocido y adecuado en la técnica, tal como, por ejemplo, agentes químicos, otros inmunoterapéuticos, vacunas contra cáncer, agentes anti-angiogénicos, citocinas, terapias hormonales, terapias génicas y radioterapias. Un agente químico (o "agente anti-canceroso" o "agente anti-tumoral o agente terapéutico contra el cáncer") se refiere a cualquier molécula o compuesto que ayuda en el tratamiento de un cáncer. Ejemplos de agentes químicos contemplados por la presente invención incluyen, entre otros, citosina arabinósido, taxoides (e.g., paclitaxel, docetaxel), agentes anti-tubulina (e.g., paclitaxel, docetaxel, epotilona B, o sus análogos), macrólidos (p. ej., rizoxina) cisplatino, carboplatino, adriamicina, tenopósido, mitozantron, discodermolida, eleuterobina, 2-clorodesoxiadenosina, agentes alquilantes (p. ej., ciclofosfamida, mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino, tiotepa), antibióticos (p. ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina), antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, flavopiridol, 5-fluorouracilo, fludarabina, gemcitabina, dacarbazina, temozolamida), asparaginasa, bacilos de Calmette y de Guerin, toxina diftérica, hexametilmelamina, hidroxiurea, LYSODREN.RTM., análogos nucleosídicos, alcaloides vegetales (p. ej., Taxol, paclitaxel, camptotecina, topotecán, irinotecán (CAMPTOSAR, CPT-I l), vincristina, alcaloides de la vinca (tales como vinblastina), podofilotoxina (incluidos los derivados, tales como epipodofilotoxina, VP-16 (etopósido), VM-26 (tenipósido)), citocalasina B, colchicina, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, procarbazina, mecloretamina, antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (antes daunomicina), doxorrubicina, doxorrubicina liposómica), dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, agentes antimitóticos, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, factor de crecimiento neural, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, activador del plasminógeno tisular, aldesleukina, alutamina, anastrozol, bicalutamida, biaomicina, busulfano, capecitabina, carboplatino, clorambucilo, cladribina, citarabina, dactinomicina, estramustina, floxuridina, gemcitabina, goserelina, idarrubicina, ifosfamidai, leuprolida acetato, levamisol, lomustina, mecloretamina, megestroll, acetato, mercaptopurina, mesna, mitolanc, pegaspergasa, pentostatina, picamieína, rituximab, campath-1, estraptozocina, tioguanina, tretinoína, vinorelbina, o cualquier fragmento, miembros de la familia o sus derivados, incluidas sus sales farmacéuticamente aceptables. Las composiciones que comprenden uno
o más agentes quimioterapéuticos (p. ej., FLAG, CHOP) también se contemplan en la presente invención. FLAG comprende fludarabina, citosina arabinósido (Ara-C) y G-CSF. CHOP comprende ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina y prednisona.
o péptidos anti-factor de crecimiento placentario, anticuerpos anti-Flk--1, anticuerpos o péptidos anti-Fit--1, péptidos de laminina, péptidos de fibronectina, inhibidores del activador de plasminógeno, inhibidores de la metaloproteinasa tisular, interferones, interleucina 12, IP-10, Gro-β, trombospondina, 2-metoxiestradiol, proteína relacionada con la proliferina, carboxiamidotriazol, CMlOl, Marimastat, pentosán polisulfato, angiopoyetina 2, interferón-alfa, herbimicina
El agente quimioterapéutico puede ser un agente antiangiogénico, tal como, por ejemplo, angiostatina, bevacizumab (Avastin®), sorafenib (Nexavar®), baculostatina, canstatina, maspina, anticuerpos o péptidos anti-VEGF, anticuerpos
A, PNU145156E, fragmento 16K de prolactina, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteína, TNP-470, endostatina, paclitaxel, acutina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM--1470, factor plaquetario 4 o minociclina. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, la coadministración de un agente antiangiogénico puede conducir, de forma ventajosa, al incremento de la expresión de MN en un tumor, de modo que hace que el tumor sea más sensible a los anticuerpos y conjugados de anticuerpos de la invención.
En un aspecto, dicho agente quimioterapéutico es gemcitabina a una dosis que varía de 100 a 1000 mg/m2/ciclo. En una forma de realización, dicho agente quimioterapéutico es dacarbazina a una dosis que varía de 200 a 4.000 mg/m2/ciclo. En otro aspecto, dicha dosis varía de 700 a 1000 mg/m2/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es fludarabina a una dosis que varía de 25 a 50 mg/m2/ciclo En un aspecto, dicho agente quimioterapéutico es citosina arabinósido (Ara-C) a una dosis que varía de 200 a 2.000 mg/m2/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es docetaxel a una dosis que varía de 1,5 a 7,5 mg/kg/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es paclitaxel a una dosis que varía de 5 a 15 mg/kg/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es cisplatino a una dosis que varía de 5 a 20 mg/kg/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es 5-fluorouracilo a una dosis que varía de 5 a 20 mg/kg/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es doxorrubicina a una dosis que varía de 2 a 8 mg/kg/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es epipodofilotoxina a una dosis que varía de 40 a 160 mg/kg/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es ciclofosfamida a una dosis que varía de 50 a 200 mg/kg/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es irinotecán a una dosis que varía de 50 a 150 mg/m2/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es vinblastina a una dosis que varía de 3,7 a 18,5 mg/m2/ciclo. En otro aspecto más, dicho agente quimioterapéutico es vincristina a una dosis que varía de 0,7 a 2 mg/m2/ciclo. En un aspecto, dicho agente quimioterapéutico es metotrexato a una dosis que varía de 3,3 a 1000 mg/m2/ciclo
En otro aspecto, los anticuerpos anti-MN y/o fragmentos de anticuerpo de la presente invención se administran en combinación con uno o más agentes inmunoterapéuticos, tales como anticuerpos o inmunomoduladores, que incluyen, entre otros, Herceptin®, Retuxan®, OvaRex, Panorex, BEC2, IMC-C225, Vitaxin, Campath I/H, Smart MI95, LymphoCide, Smart I D 10 y Oncolym, rituxán, rituximab, gemtuzumab o trastuzumab.
La invención también contempla administrar los anticuerpos anti-MN y/o fragmentos de anticuerpos de la presente invención con uno o más agentes anti-angiogénicos, que incluyen, entre otros, angiostatina, talidomida, kringle 5, endostatina, Serpin (inhibidor de la serínproteasa) anti-trombina, fragmentos proteolíticos de 29 kDa en N-terminal y de 40 kDa en C-terminal de fϊbronectina, fragmento proteolítico de 16 kDa de prolactina, fragmento proteolítico de 7,8 kDa del factor-4 plaquetario, un péptido β-aminoácido correspondiente a un fragmento del factor-4 plaquetario (Maione y col., 1990, Cancer Res. 51:2077), un péptido de 14 aminoácidos correspondiente a un fragmento del colágeno I (Tolma y col., 1993, J. Cell Biol. 122:497), un péptido de 19 aminoácidos correspondiente a un fragmento de la trombospondina I (Tolsma y col., 1993, J. Cell Biol. 122:497), un péptido de 20 aminoácidos correspondiente a un fragmento de la SPARC (Sage y col., 1995, J. Cell. Biochem. 57:1329) o cualquier fragmento, miembros de la familia o derivados del mismo, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
También se han descrito otros péptidos que inhiben la angiogénesis y corresponden a fragmentos de laminina, fibronectina, procolágeno y EGF (Véase la revisión de Cao, 1998, Prog. MoI. Subcell. Biol. 20:161). Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales y los pentapéptidos cíclicos, que bloquean ciertas integrinas que se unen a proteínas RGD (es decir, que poseen el motivo peptídico Arg-Gly-Asp) tienen actividades antivascularización (Brooks y col., 1994, Science 264:569; Hammes y col., 1996, Nature Medicine 2:529). Además, la inhibición del receptor del activador de plasminógeno tipo urocinasa por antagonistas inhibe la angiogénesis, el crecimiento tumoral y la metástasis (Min y col., 1996, Cancer Res. 56:242833; Crowley y col, 1993, Proc Natl Acad. Sci. USA 90:5021). En la presente invención también se contempla el uso de dichos agentes anti-angiogénicos.
En otro aspecto, los anticuerpos anti-MN y/o fragmentos de anticuerpos de la presente invención se administran en combinación con un régimen de radiación.
Los anticuerpos anti-MN y/o fragmentos de anticuerpos de la presente invención también se pueden administrar en combinación con una o más citocinas, que incluyen, entre otras, linfocinas, factor de necrosis tumoral, citocinas similares al factor de necrosis tumoral, linfotoxina-α, linfotoxina-β, interferón-β, macrófago, proteínas inflamatorias, factor estimulador de las colonias de granulocitos monocitos, interleucinas (incluidas, entre otras, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-6, interleucina-12, interleucina-15, interleucina--18), ligandos OX40, CD27, CD30, CD40
o CD 137, ligando Fas-Pas, 4-IBBL, proteína activadora de monocitos endoteliales o cualquier fragmento, miembros de la familia o sus derivados, incluidas sus sales farmacéuticamente aceptables.
Los anticuerpos anti-MN y/o fragmentos de anticuerpos de la presente invención también se pueden administrar en combinación con una vacuna contra el cáncer, ejemplos de las cuales incluyen, entre otras, células o tejidos antólogos, células o tejidos no antólogos, antígeno carcinoembrionario, alfa-fetoproteína, gonadotropina coriónica humana, vacuna con microorganismos vivos contra BCG, proteínas de linaje melanocítico (p. ej., gplOO, MART-1/MelanA, TRP-I (gp75), tirosinasa, antígenos ampliamente compartidos asociados con tumores, incluidos los específicos de tumores (p. ej., BAGE, GAGE-I, GAGE-2, MAGE-I, MAGE-3, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, pl5), antígenos mutados que están asociados con tumores (β-catenina, MUM-I, CDK4), antígenos no melanoma (p. ej., HER-2/neu (carcinoma de mama o de ovario), papilomavirus humano 5 E6, E7 (carcinoma cervical), MUC--1
(carcinoma de mama, de ovario y de páncreas). Para los antígenos tumorales humanos reconocidos por los linfocitos T, véase, generalmente, Robbins y Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:628. Las vacunas contra el cáncer pueden o no ser preparaciones purificadas.
En otra forma de realización más, los anticuerpos anti-MN y/o fragmentos de anticuerpos de la presente invención se usan junto con un tratamiento hormonal. Los tratamientos terapéuticos hormonales comprenden agonistas hormonales, antagonistas hormonales (p. ej., flutamida, tamoxifeno, acetato de leuprolida (LUPRON), antagonistas de la LH-RH), inhibidores de la biosíntesis y procesamiento de hormonas, y esteroides (p-ej., dexametasona, retinoides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, dehidrotestosterona, glucocorticoides, mineralocorticoides, estrógeno, testosterona, progestinas), antigestágenos (p. ej., mifepristona, onapristona) y antiandrógenos (p. ej., acetato de ciproterona).
Los anticuerpos anti-MN y/o fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden usar en combinación con, por ejemplo coadministrarse con, un agente fenotípico anti-MDR (resistencia a múltiples fármacos).
Muchos cánceres humanos expresan de forma intrínseca o desarrollan espontáneamente resistencia a varias clases de fármacos anticancerosos al mismo tiempo, a pesar de que cada una de las clases farmacológicas tienen diferentes estructuras y mecanismos de acción. Este fenómeno, que se puede imitar en células de mamífero cultivadas, se denomina generalmente multirresistencia (“MDR”, del inglés Multidrug Resistance) o el fenotipo de multirresistencia. El fenotipo MDR presenta obstáculos significativos a los tratamientos quimioterapéuticos con éxito para cáncer en pacientes humanos. La multirresistencia de los tumores malignos a agentes quimioterapéuticos es una causa mayoritaria del fallo del tratamiento (Wittes y col., Cancer Treat. Rep. 70:105 (1986); Bradley, G. y col., Biochim. Biophys. Acta 948:87 (1988); Griswald, D. P. y col., Cancer Treat. Rep. 65(S2):51 (1981); Osteen, R. T. (ed.), Cancer Manual, (1990)). Los tumores que inicialmente son sensibles a los agentes citotóxicos a menudo recurren o se convierten en refractarios a múltiples fármacos quimioterapéuticos (Riordan y col., Pharmacol. Ther.
28:51 (1985); Gottesman y col., Trends Pharmacol. Sci. 9:54 (1988); Moscow y col., J. Natl. Cancer Inst. 80:14 (1988); Croop, J. M. y col., J. Clin. Invest. 81:1303 (1988)). Las células o tejidos obtenidos de tumores y cultivados en presencia de un fármaco citotóxico seleccionado puede tener como resultado la resistencia cruzada a otros fármacos en dicha clase además de en otras clases de fármacos, incluidas, entre otros, las antraciclinas, alcaloides de vinca y epipodofilotoxinas (Riordan y col., Pharmacol. Ther. 28:51 (1985); Gottesman y col., J. Biol. Chem. 263:12163 (1988)). Por tanto, la resistencia adquirida a un único fármaco tiene como resultado una resistencia simultánea a un grupo diverso de fármacos que no están ni estructural ni funcionalmente relacionados. Dicha resistencia puede ser un problema para los tumores en forma sólida y en forma líquida (p. ej., cánceres de la sangre
o de la linfa).
Un mecanismo mayoritario de multirresistencia en células de mamífero implica el incremento de la expresión del sistema de bomba de glicoproteínas de membrana plasmática de 170 kDa (Juranka y col., FASEB J 3:2583 (1989); Bradley, G. y col., Blochem. Biophys. Acta 948:87 (1988)). El gen que codifica este sistema de bomba, en ocasiones denominado un transportador de múltiples fármacos, se ha clonado en células humanas cultivadas y generalmente se denomina mdrl. Este gen se expresa en varias clases de tejidos normales, pero los sustratos fisiológicos transportados para el producto del gen mdrl en estos tejidos no se han descrito. El producto MDR1 es un miembro de la superfamilia de las proteínas transportadoras ABC, un grupo de proteínas que tiene función de exportación dependiente de energía.
El producto proteico del gen mdrl, generalmente conocido como glicoproteína P ("P-170", "P-gp"), es una proteína transmembrana plasmática de170 kDa que constituye la bomba de eflujo dependiente de energía mencionada en lo que antecede. La expresión de P-gp sobre la superficie de la célula es suficiente para hacer que las células sean multirresistentes a fármacos citotóxicos, incluidos muchos agentes anticancerosos. La MDR mediada por la P-gp parece ser un componente clínico importante de la resistencia tumoral en tumores de diferentes tipos y la expresión del gen mdrl se correlaciona con la resistencia a la quimioterapia en diferentes tipos de cáncer.
La secuencia nucleotídica del gen mdrl (Gros, P. y col., Cell 47:371 (1986); Chen, C. y col., Cell 47:381 (1986)) indica que codifica un polipéptido similar o idéntico a la glicoproteína P y que estos son miembros de la clase altamente conservada de proteínas de membrana similares a los transportadores bacterianos e implicados en los procesos de transportes fisiológicos normales. El análisis de la secuencia del gen mdrl indica que la Pgp consta de 1280 aminoácidos distribuidos entre dos mitades homólogas (identidad del 43 %). Cada mitad de la molécula tiene seis dominios transmembrana hidrófobos y cada una tiene un sitio de unión a ATP dentro de los grandes bucles citoplasmáticos. Sólo aproximadamente el 8 % de la molécula es extracelular y el resto de carbohidrato (aproximadamente 30 kDa) está unido a los sitios en esta región.
Por tanto, se apreciará que las células de mamífero que tienen una “multirresistencia” o fenotipo de “.multirresistencia por la capacidad para secuestrar, exportar o expeler una pluralidad de sustancias citotóxicas (p. ej., fármacos quimioterapéuticos) del medio intracelular. Las células pueden adquirir este fenotipo como resultado de la presión de selección impuesta por la exposición a un único fármaco quimioterapéutico (la toxina de selección). Como alternativa, las células pueden exhibir el fenotipo antes de la exposición a la toxina, ya que la exportación de sustancias citotóxicas puede implicar un mecanismo en común con la exportación normal de los productos de secreción celular, metabolitos y similares. La resistencia a múltiples fármacos difiere de la resistencia simple
adquirida a la toxina de selección en que la célula adquiere competencia para exportar citotoxinas adicionales (otros fármacos quimioterapéuticos) a las que la célula no ha sido expuesta anteriormente. Por ejemplo, Mirski y col. (1987), 47 Cancer Res. 25942598, describen el aislamiento de una población celular resistente a múltiples fármacos cultivando la línea celular H69, derivada de un carcinoma humano de pulmón de células pequeñas, en presencia de adriamicina (doxorrubicina) como toxina de selección. Se encontró que las células supervivientes resistían a los efectos citotóxicos de los análogos de antraciclina (p. ej., daunomicina, epirrubicina, menogarilo y mitoxantrona), acivicina, etopósido, gramicidina D, colquicina y alcaloides derivados de Vinca (vincristina y vinblastina) así como adriamicina. Se pueden aplicar técnicas de cultivo de selección similares para generar poblaciones celulares adicionales resistentes a múltiples fármacos.
De acuerdo con esto, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir adicionalmente compuestos que actúan para inhibir el fenotipo MDR y/o las condiciones asociadas con el fenotipo MDR. Dichos compuestos pueden incluir cualquier compuesto inhibidor de MDR conocido en la técnica, tales como anticuerpos específicos de componentes de MDR (p. ej., anticuerpos transportadores anti-MDR) o inhibidores de moléculas pequeñas de transportadores de MDR, incluidos, específicamente, tamoxifeno, verapamilo y ciclosporina A, que son agentes de los que se conoce que invierten o inhiben la multirresistencia. (Lavie y col. J. Biol. Chem. 271: 19530 -10536, 1996). Dichos compuestos se pueden encontrar en las patentes de EE.UU. nº 5.773.280, 6.225.325 y 5.403.574. Dichos compuestos inhibidores de MDR se pueden co-administrar con los anticuerpos anti-MN y/o fragmentos de la invención con varios fines, incluidos, invertir el fenotipo de MDR tras la detección del fenotipo de MDR para ayudar o potenciar un tratamiento quimioterapéutico. El inhibidor de MDR, tal como, por ejemplo, tamoxifeno, verapamilo o ciclosporina A, puede usarse junto con los compuestos de la invención para ayudar en la detección del fenotipo de MDR. De acuerdo con este aspecto, un inhibidor de MDR puede potenciar la captación y la acumulación de un compuesto de la invención en una célula de cáncer MDR, ya que la capacidad del sistema de transporte de MDR en el transporte o “bombeo hacia fuera” del compuesto de contraste respecto al dominio del sustrato disminuiría en presencia de un inhibidor de CDR.
En otra forma de realización más, los anticuerpos anti-MN y/o fragmentos de anticuerpos de la presente invención se usan junto con un programa de terapia génica en el tratamiento del cáncer. La terapia génica con células recombinantes que secretan interleucina 2 se puede administrar en combinación con los anticuerpos de la invención para prevenir o tratar el cáncer, particularmente el cáncer de mama (véase, por ejemplo, Deshmukh y col., 2001, J. Neurosurg. 94:287).
Para evaluar la capacidad de un anticuerpo concreto para ser terapéuticamente útil para tratar el cáncer, como ejemplo, el anticuerpo puede analizarse in vivo en un modelo de tumor xenoinjertado de ratón. Si se desea, los anticuerpos frente a MN se pueden convertir en anticuerpos IgG1 antes de la evaluación terapéutica. Esta conversión se describe en el Ejemplos 5 y un ejemplo de un modelo terapéutico se detalla en el ejemplo 9. La actividad del anticuerpo puede también analizarse usando un ensayo de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos tal como se describe en el ejemplo 12.
La presente invención también proporciona procedimientos diagnósticos con los que se puede detectar MN en una muestra de pacientes o una muestra biológica. Dichos procedimientos diagnósticos se pueden usar para, por ejemplo, diagnosticar trastornos en los que la MN está elevada. Dichos trastornos incluyen, entre otros, carcinomas de riñón, esófago, mama, cuello uterino, colon y pulmones. Cuando se usa para diagnóstico, la detección de una cantidad del complejo anticuerpo-MN en una muestra de un paciente que es superior a una cantidad del complejo en una muestra normal identifica al paciente como que probablemente presente el trastorno. En el ejemplo 11 se describe un procedimiento inmunohistoquímico para la detección de MN en tejidos de cáncer.
En otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para detectar y/o visualizar un cáncer relacionado con MN que tiene una cantidad anormal de proteína MN expresada. Dichos procedimientos pueden comprender poner en contacto la célula cancerosa relacionada con la MN con un anticuerpo anti-MN o fragmento de la invención y realizar una imagen usando una modalidad de imagen médica, en la que el anticuerpo anti-MN o fragmento comprende un dominio capaz de ser detectado mediante la modalidad de imagen médica.
Los procedimientos de detección de la presente invención también se pueden realizar in vitro. La célula o tejido canceroso puede proceder de cualquier fuente adecuada, tal como, por ejemplo, una biopsia o un cultivo celular o tisular. Procedimientos para obtener biopsias y mantener y/o propagar los tejidos y/o células extirpados serán bien conocidos para los expertos en la técnica. La detección in vitro de multirresistencia puede tener varias aplicaciones, tales como, por ejemplo, determinar si el cáncer de un sujeto concreto, antes, durante o después del tratamiento, ha desarrollado un fenotipo multifármaco.
El tipo de modalidad de imagen usada para detectar los compuestos de la invención dependerá del dominio marcador concreto usado en los compuestos de la invención. Por ejemplo, si el dominio marcador comprende un quilato de gadolinio, normalmente se podría usar RMN para detectar el agente de contraste de la invención. Si se usa un quelato de radionúclido como dominio marcador, se podría usar un procedimiento de imagen nuclear (p. ej., PET). Si se usa un dominio marcador basado en fluorescencia se podría usar un sistema de imagen óptica, tal como, por ejemplo, un sistema FACS o microscopia de fluorescencia o un lector de placas automático de fluorescencia. Elegir una modalidad de imagen adecuada para usar en los procedimientos de detección in vitro de la
invención están completamente dentro de los conocimientos del experto en la técnica.
Además, un experto en la técnica determinará la cantidad de agente de contraste usado en los procedimientos de detección in vitro de la invención y puede depender del grado hasta el cual está presente el fenotipo MDR, por ejemplo el nivel de expresión del sistema de transporte de MDR (p. ej., la P-glucoproteína). El experto en la técnica puede determinar qué cantidad de los nuevos compuestos de imagen es suficiente para detectar un fenotipo de MDR sin experimentación indebida, es decir una cantidad detectablemente suficiente.
El tipo de modalidad de imagen usada no se limita a ningún tipo concreto y puede incluir, por ejemplo, RMN, imagen nuclear (p. ej., PET o SPECT), imagen óptica, imagen por sonoluminiscencia o imagen fotoacústica (ultrasonidos). El experto en la técnica apreciarán que el dominio marcador concreto de los compuestos de imagen de la invención deberían ser compatibles con la modalidad de imagen concreta usada.
En una realización preferida, los procedimientos de detección usan anticuerpos anti-MN o fragmentos de los mismos y marcadores adecuados que se pueden detectar mediante RM. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de la invención pueden comprender un dominio marcador que es un agente de contraste para RM, tal como, por ejemplo, un quelato o quelatos metálicos paramagnéticos o cualquiera de los descritos en el presente documento: El agente de contraste también puede comprender un dominio marcador de radionúclido para obtener imágenes o detectar mediante una modalidad de imagen nuclear, tal como tomografía de emisión de positrones (PET) o tomografía computarizada de emisión monofotónica (SPECT), por ejemplo un radionúclido tal como, por ejemplo, 19Au, 72As,141Ce, 67Cu, 60Cu, 52Fe, 67Ga, 68 Ga, 51Gr, IIIIn, 177Lu, 51Mn, 203Pb, 188Re, 97Ru, 47Sc, 177mSn, 94mTc, 167Tm, y 90Y. El radionúclido se puede quelar mediante un quelante adecuado o mediante varios quelantes, tales como, por ejemplo, HYNIC, DRPA, EDTA, DOTA, TETA, DTPA y BAT. Las condiciones en las que un quelante coordinará un metal están descritas por, por ejemplo, Gansow et al., patentes de EE.UU. Nº 4.831.175, 4.454. 06 y 4.472.509. El 99mTC (Tecnecio-99m) es un radioisótopo particularmente atractivo para aplicaciones terapéuticas y diagnósticas, ya que generalmente está disponible en varios departamentos de medicina nuclear, no es caro, da dosis mínimas de radiación al paciente y posee propiedades de imagen nuclear ideales.
La muestra del paciente se puede poner en contacto con un anticuerpo de la invención y, después, se puede analizar la muestra del paciente para detectar la presencia de un complejo anticuerpo-MN. Como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo puede comprender un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente, radioisotópico, qumioluminiscente o enzimático, tal como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina o luciferasa.
Opcionalmente, el anticuerpo se puede unir a un soporte sólido, que puede acomodar la automatización del ensayo. Los soportes sólidos adecuados incluyen, entre otros, portaobjetos de vidrio o de plástico, placas de cultivo tisular, pocillos de microtitulación, placas de silicio o partículas tales como perlas (incluidas, entre otras, perlas de látex, poliestireno o vidrio). Cualquier procedimiento conocido en la técnica se puede usar para fijar el anticuerpo al soporte sólido, incluido el uso de enlaces covalentes y no covalentes, absorción pasiva, o pares de restos de unión unidos al anticuerpo y al soporte sólido. La unión de MN y el anticuerpo se puede conseguir en cualquier vaso adecuado para poner en contacto los reactantes. Ejemplos de tales recipientes incluyes placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga.
Composiciones y dosificaciones farmacéuticas
Los anticuerpos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden proporcionar en una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser no pirogénico. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que puede administrarse en cualquier vehículo farmacéutico estéril, biocompatible, incluidos, entre otros, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Se pueden emplear una variedad de vehículos acuosos, incluidos, entre otros, solución salina, glicina o similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de material particulada. Éstas soluciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (p. ej., filtración).
Generalmente, la frase “vehículo farmacéuticamente aceptable” está reconocida en la técnica e incluye un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para administrar a mamíferos compuestos de la presente invención. Los vehículos incluyen cargas líquidas o sólidas, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, implicados en el transporte del agente sujeto de un órgano, una porción del cuerpo, a otro órgano o porción del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no dañinos para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa, y sus derivados, tales como carboximeticelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; goma tragacanto en polvo; malta, gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes de tamponamiento, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones de tampón fosfato; y otras sustancias
compatibles no tóxicas empleadas en las formulaciones farmacéuticas.
Agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato sódico y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones de anticuerpo de la invención.
Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: Antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metasulfito sódico, sulfito sódico y similares; antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, y similares. La concentración del anticuerpo de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar considerablemente y puede seleccionarse principalmente sobre la base de volúmenes de fluido, viscosidades etc., de acuerdo con el modo de administración concreto seleccionado. Si se desea, más de un tipo de anticuerpo puede incluirse en una composición farmacéutica (p. ej., un anticuerpo con diferentes Kd para la unión a la MN).
Las composiciones pueden administrarse a un paciente solas o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y sustancias auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por cualquier serie de vías, incluidas, entre otras, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópica, sublingual o rectal.
Las composiciones de la invención adicionalmente contemplan inmunovehículos adecuados, tales como proteínas, polipéptidos o péptidos tales como albúmina, hemocianina, tiroglobulina y sus derivados, particularmente seroalbúmina bovina (BSA) y hemocianina de lapa californiana (KLH), polisacáridos, hidratos de carbono, polímeros y fase sólidas. Otras sustancias derivadas de proteínas o no derivadas de proteínas son conocidas para los expertos en la técnica.
En aspectos que implican vacunas, por ejemplo vacunas contra el cáncer junto con los anticuerpos de la invención, las composiciones de la invención se pueden administra con o sin un adyuvante. La administración se puede llevar a cabo en ausencia de un adyuvante con el fin de evitar cualquier toxicidad inducida por adyuvante. El experto en la técnica a la que atañe la presencia invención, por ejemplo un médico especializado en cáncer, apreciará y entenderá cómo determinar si se debe usar o no un adyuvante y puede depender de la historia médica del un sujeto, los datos familiares, los datos de toxicidad, los resultados de las pruebas relacionadas con alergia etc. En formas de realización en los que se usa un adyuvante, es ventajoso que el adyuvante estimule la formación de anticuerpos protectores, tales como anticuerpos IgG protectores. Cualquier adyuvante adecuado conocido para un experto en la técnica se contempla en la presente invención y se adapta fácilmente a la presente invención. Adyuvantes adecuados para usar en la vacunación de animales pueden incluir, entre otros, hidróxido de aluminio, saponina y su componente purificado Quit A, adyuvante completo de Freund (ACF) y adyuvante incompleto de Freund (AIF). Se ha mostrado que el sulfato de dextrano es un potente estimulador de anticuerpos IgG2 contra los antígenos de superficie celular estafilocócicos y también es adecuado como adyuvante. El experto en la técnica apreciará que algunos adyuvantes pueden ser más preferibles para aplicación veterinaria, mientras que otros adyuvantes serán preferibles para usar en seres humanos y que las toxicidades del adyuvante son una consideración que el experto en la técnica debe tener en cuenta antes de la administración del compuesto a un ser humano.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular y similares; vehículos farmacéuticos adecuados; y técnicas para la formulación y la administración se pueden preparar mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., Vigésima edición, 2000). La formas farmacéuticas líquidas para administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del ingrediente activo, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyente inerte de uso habitual en la técnica, tal como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular aceites de algodón, aceite de cacahuete, de maíz, de germen de trigo, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos.
Las expresiones “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral”, como se usan en la presente memoria descriptiva, significan modos de administración distintos a la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitaciones, la inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal y la infusión.
La determinación de una dosis terapéuticamente efectiva está bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de un anticuerpo que puede usarse para tratar de forma efectiva una enfermedad (p. ej., cáncer) en comparación con la eficacia que es evidente en ausencia de la dosis terapéuticamente efectiva.
La dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente en modelos de animales (p. j., ratas, ratones, conejos, perros o cerdos). El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentraciones adecuado y la vía de administración. Tal información se puede usar después para determinar dosis útiles y vías de administración en seres humanos.
La eficacia terapéutica y la toxicidad (p. ej., DE50, la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población y la DL50, la dosis letal para el 50 % de la población) de un anticuerpo se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales. El cociente entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse en forma del cociente DL50/DE50. Los datos obtenidos de los estudios animales se usan en la formulación de in intervalo de dosificación para uso humano. La dosificación contenida en dichas composiciones puede estar dentro de in intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.
El médico puede determinar la dosificación exacta a la luz de los factores relacionados con el paciente que requiere el tratamiento. La dosificación y la administración pueden ajustarse para proporcionar niveles suficientes del anticuerpo o para mantener el efecto deseado. Entre los factores que se pueden tener en cuenta se incluyen la gravedad de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, la hora y la frecuencia de administración, la(s) combinaciones de fármacos, las sensibilidades de la reacción y la tolerancia/respuesta al tratamiento.
Los polinucleótidos que codifican anticuerpos de la invención se pueden construir e introducir en una célula, bien ex vivo o in vivo, usando técnicas bien establecidas incluidas, entre otras, transferencia de ADN mediada por transferrina-policationes, fusión celular, transporte intracelular de perlas de látex recubiertas con ADN, fusión de protoplastos, infección vírica, electroporación, “disparo génico” y DEAE, o transfección mediada por fosfato cálcico.
Dosificaciones efectivas in vivo de un anticuerpo están en el intervalo de aproximadamente 5 μg a aproximadamente 500 μg/kg del peso corporal del paciente. Para administración de polinucleótidos que codifican los anticuerpos, dosis in vivo eficaces están en el intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 500 μg de ADN.
El modo de administración de las composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpo de la presente invención puede ser cualquier vía adecuada que libere el anticuerpo en el huésped. Como ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser útiles para administración parenteral (p. ej., administración subcutánea, intramuscular, intravenosa o intranasal).
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de biblioteca de Fab combinatoria humana (HuCAL Gold)
La HuCAL® GOLD es una biblioteca de anticuerpos basada en tecnología HuCAL® (Human Combinatorial Antibody Library; MorphoSys AG, Martinsried/Planegg, Alemania). La biblioteca combina una biblioteca de anticuerpos sintéticos completamente humanos en el formato de Fab con seis regiones CDR diversificadas con una tecnología de expresión para la selección de anticuerpos de alta afinidad, CysDisplay™ (MorphoSys AG, Martinsried/Planegg, Alemania). CysDisplay™ es una tecnología de expresión en fagos monovalente basada en una unión fenotipogenotipo mediante enlaces disulfuro que permite la recuperación de anticuerpos específicos con afinidades altas.
El vector de expresión en fagos pMORPH®23 es un vector fagémido que permite CysDisplay™ monovalente de fragmentos Fab. Codifica el gIIIp de longitud total, la cadena Fd ((VH-CH1), y la cadena ligera (VL-CL), todo lo cual está equipado con diferentes secuencias señal secretoras que dirigen la correspondiente cadena proteica al periplasma de E. coli. Las secuencias señal ompA y phoA se usan para transportar las cadenas pesada y ligera al periplasma, donde las cadenas se unen mediante interacciones no covalentes. Este vector de expresión porta una región promotor/operador de lac inducible. El producto del gen laqIq para la represión de la expresión se suministra mediante la cepa huésped de E. coli TG1. La inducción de expresión de Cys-gIIIp y Fab se consigue mediante la adición de IPTG (isopropil-β-D-tio-galacto-piranósido). Los conjuntos de Fab enriquecidos se subclonaron de pMORPH®23 en el vector de expresión de Fab pMORPH®x9 usando las enzimas de restricción XbaI y EcoRI. Mediante esta etapa, la cisteína y la parte ligador-His6 en el extremo C de la cadena Fd se retiraron y se escinde gIIIp. El vector de expresión pMORPH®x9_Fab_FH proporciona dos marcas en C-terminal, FLAG y 6xHis, de modo que se facilita la detección y purificación de las proteínas Fab.
Rescate de fagémidos y amplificación de fagos
Los fagémidos de Fab HuCAL GOLD en células TG1 se amplificaron en medio 2xTY suplementado con 34 μg/ml de cloranfenicol y 1% de glucosa. Después de la infección en fagos colaboradores (VCSM13 ~2 -6x1011 ufp/ml) a 37 ºC
durante 30 minutos, las células TG se concentraron mediante centrifugación. El fago se amplificó mediante incubación de las células TG1 infectadas a 22 ºC durante la noche en medio 2xTY que contiene 34 μg/ml de cloranfenicol, 50 μg/ml de kanamicina e IPTG 0,25 Mm. El sobrenadante que contiene fago se usó para el panning por fases.
Ejemplo 2: Panning en fase sólida
El panning en fase sólida se llevó a cabo revistiendo placas MaxiSorpTM (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) o Dynabeads™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) con proteína MN humana en PBS (1 μg/pocillo o 1 μg/1 mg de perlas). La proteína MN representa todo el dominio extracelular de la proteína con una cola de his en C-terminal para purificar. La proteína MN se expresó en una línea celular de mamíferos HKB-11 y se purificó mediante cromatografía Ni-NTA usando procedimientos estándar que son bien conocidos en la técnica. Los pocillos que contienen proteína MN unida se bloquearon con 5% de leche en PBS, se lavaron en PBS seguido de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente con un alícuota de la biblioteca de fagos HuCAL GOLD prebloqueada que contiene 1x1012 de fagos Fab HuCAL GOLD. El fago unido se lavó y después se eluyó con DTT 20 mM en tampón Tris 10 mM a pH 8,0. Se realizaron tres rondas de panning con amplificación en fagos entre cada ronda como se ha descrito anteriormente. La rigurosidad del lavado se aumentó entre cada ronda de panning para disminuir la unión inespecífica.
Ejemplo 3: Subclonación de fragmentos Fab seleccionados para expresión en E.coli
Los Fab seleccionados se clonaron del vector de expresión pMORPH®23 al vector de expresión pMORPH®x9_Fab_FH para facilitar la expresión rápida de Fab soluble para detección selectiva con ELISA. La preparación de ADN del vector pMORPH®23 se digirió con EcoRI y Xbal, de modo que se cortó todo el fragmento que codifica el Fab (ompA-VL-VL y phoA-Fd). Después de la purificación posterior, el fragmento se ligó en el vector pMORPHx9_Fab_FH preparado (también digerido con EcoRI/XbaI y purificado). El vector que contiene el inserto Fab se transfectó en células E.coli TG1 F competentes mediante electroporación. Las células E.coli transformadas se cultivaron en placas LB que contienen 34 μg/ml de cloranfenicol y 1% de glucosa o/n a 37 ºC. Se escogieron las colonias y se colocaron en medios de cultivo que contenían 34 μg/ml de cloranfenicol y 1% de glucosa. Se añadió glicerol hasta un 20% y estos cultivos iniciadores de reserva se almacenaron a -80 ºC hasta que se necesitaron para el ELISA. Para obtener FAb purificados, los transformantes de E.coli portadores de este vector se cultivaron habitualmente en múltiples matraces de agitación de 1 l, se recogieron y se purificaron usando cromatografía de afinidad de Ni-NTA usando procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica.
Ejemplo 4: Identificación de fragmentos Fab de unión a MN mediante ELISA
Placas de ELISA de 96 pocillos Maxisorp se revistieron con 100 μl/pocillo de una solución de proteína MN humana purificada a una concentración de 5 μg/ml en PBS. Los Fab se expresaron usando transformantes de E.coli cultivados en medio 2xTY que contiene 34 μg/ml de cloranfenicol de cultivos de reserva iniciados. Doce (12) horas antes de la recolección, la expresión de Fab se indujo mediante la adición de IPTG (concentración final 0,5 mM) Las células se lisaron y 100 μl de lisado se incubaron dentro del pocillo de una placa Maxisorp bloqueada con leche y prerrecubierta con MN durante 2 horas a temperatura ambiente. Después, las placas se lavaron en TBS y TBS que contenía Tween para eliminar la unión inespecífica. Los Fab unidos se detectaron con un anticuerpo (Fab')2 antihumano de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Pierce Chemical, Rockford, IL). El sustrato AttoPhos (Roche Diagnostics, Alameda, CA) se usó como se indica en las instrucciones de los fabricantes, la excitación a 430 nm y la emisión se leyó a 535 nm.
Un gran número de transformantes de E.coli expresaron Fab que exhibieron una proporción señal-ruido en el ELISA de > 10. La secuenciación de ADN de las regiones VH y VL identificaron más de 50 Fab de unión a MN únicos. Las secuencias de ADN y de proteína de todas las VH y VL de diez anticuerpos en base a sus propiedades funcionales se muestran en las Figuras 3 y 4, respectivamente. Cada uno de estos anticuerpos divulgados unidos mediante ELISA a la proteína MN purificada aislada de una línea celular de expresión en mamífero, HKB-11 (Figura 5). Los anticuerpos estudiados también reaccionaron con MN purificada aislada de células de insecto sf9 que se habían infectado con un baculovirus que codifica el dominio extracelular de MN (Figura 5), que demuestra que las interacciones del ELISA eran específicas de la proteína MN y no cualquier contaminante marcador en las preparaciones proteicas. En un ensayo BIAcore™, los anticuerpos de la presente invención se unen específicamente a MN humana con una Kd en el intervalo de 1 nM (1 x 10-9 M) a aproximadamente 50 nM (5,0 x 10-8 nM) (Figura 5).
Ejemplo 5: Identificación de Fab e IgG de unión a MN
Las interacciones de unión entre la proteína MN y los anticuerpos de la presente invención se analizaron usando tecnología de resonancia en plasmón superficial en un instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Uppsala, Suecia). Para la unión de IgG de longitud completa (1e4, 1aa1, and 3ee9), el Fc de IgG anti-humana de cabra se acopló covalentemente el chip biosensor CM5 a una densidad alta usando un kit de acoplamiento de aminas estándar (BIAcore, Uppsala, Suecia). Después se usó un ensayo de captura usado para unir estas IgG a la superficie inmovilizada-Fc de IgG, dirigido a 300 unidades de respuesta de señal BIAcore. El BIAcore se realizó a 25 ºC y a un caudal de 10 μl/min con un tampón de carrera que contiene PBS/0,05% de Tween 20, o que contiene Na-HEPES 10
mM, a pH 7,5/NaCl 150mM/EDTA 3mM /0,05% de Tween 20. Después de la unión del ligando, el caudal se aumentó a 25 μl/min y se pasaron varias concentraciones del analito de MN (p. ej., un intervalo de 50 nM a 1 nM) sobre la superficie durante 10 minutos de un modo tal que se pudo monitorizar la fase de asociación. Después, procedió la disociación durante 35 minutos, seguida de regeneración de la superficie inmovilizada-Fc de IgG anti-humana a 100 μl/min con100 μl de ácido fosfórico 10 mM. Los sensogramas se adaptaron usando un modelo de unión Langmuir a
1:1 para calcular las constantes de velocidad. La unión de Fab a MN se determinó de un modo similar a excepción de que una IgG Fab-antihumana se inmovilizó sobre el chip y se usó para capturar los Fab antes de la evaluación de la unión a MN. La Figura 5 muestra las constantes de unión resultantes para la unión de los anticuerpos divulgados a la proteína MN purificada. Cada uno de los anticuerpos se unieron a MN exhibiendo valores de Kd comprendidos entre 0,15 y 50 nM.
Ejemplo 6: Construcción de vectores de expresión de inmunoglobulina HuCAL para la expresión transitoria de anticuerpos en células 293F.
Vector de expresión de cadena pesada. Se eliminó el sitio de clonación múltiple de pcDNA3.1+ (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se insertó un sitio compatible con los sitios de restricción lisados para HuCAL para la unión de las secuencias líder (NheI/EcoRI, dominios en VH) (EcoRI/B1pI), y las regiones constantes de la inmunoglobulina (BlpI/ApaI). La secuencia líder (EMBL M83133) estaba equipada con una secuencia Kozal (Kozak, Nucleic Acid Res. 15:8125 -8148,1987). Las regiones constantes de IgG1 humana (PIR J00228), IgG4 (EMBL K01316) y Gal sérica (EMBL J00220) se diseccionaron en oligonucleótidos solapantes con longitudes de aproximadamente 70 bases. Se introdujeron mutaciones silenciosas para eliminar los sitios de restricción no compatibles con el diseño HuCAL. Los oligonucleótidos se sometieron a corte y empalme mediante PCR de extensión de solapamiento.
Vectores de expresión de cadena ligera. El sitio de clonación múltiple de pcDNA3.1/Zeo+ (Invitrogen, Carlsbad, CA) se sustituyó por dos sitios diferentes. El sitio κ proporcionó sitios de restricción para la inserción de una κ-líder (NheI/EcoRV), HuCAL-scFv dominios de Vk (EcoRV/BsiWI,) y la región constante de la cadena κ (BsiWI/ApaI). Los correspondientes sitios de restricción en el sitio λ fueron NheI/EcoRV (I-líder), EcoRV/HpaI dominios de VI) y HpaI/ApaI (región constante de la cadena λ). La líder κ (EMBL Z00022) así como la líder λ (EMBL L27692) estaban ambas equipadas con secuencias Kozak. Las regiones constantes de la cadena κ humana (EMBL J00241) y la cadena λ (EMBL M18645) se montaron mediante PCR de extensión con solapamiento como se ha descrito anteriormente.
Generación de IgG de longitud completa a partir de Fab. La secuencia de cadena pesada del Fab contenida dentro del vector de expresión de E.coli pMORPHx9_Fab_FH se escindió cortando con MfeI/BlpI y ligando en el vector de expresión de cadena pesada descrito anteriormente que se había cortado con EcoRI/B1pI. La secuencia de cadena ligera kappa del Fab contenida dentro de pMORPHx9_Fab_FH se escindió cortando con EcoRV/BsiWI y ligando en el vector de expresión de la cadena ligera kappa descrito anteriormente que también se había cortado con EcoRV/BsiWI. La secuencia de la cadena ligera lambda del Fab contenida dentro de pMORPHx9_Fab_FH se escindió cortando con EcoRV/HpaI y ligando en el vector de expresión de la cadena ligera lambda descrito anteriormente.
Expresión transitoria de IgG de longitud completa a gran escala. Se sembraron Cellbag 20L/0 (Wave Biotech LLC, Somerset, NJ) con 0,25 x106 de células 293F/ml (Invitrogen) en el medio de expresión 9.3 L Freestyle 293 (Invitrogen). Las células se cultivaron hasta una densidad de 1 x106/ml y se transfectaron mediante la adición de 5 mg de cada uno de el vector de expresión de cadena ligera y el vector de expresión de cadena pesada que codifica el anticuerpo de longitud completa en 350 ml de Optimem (Invitrogen) que contiene el reactivo 293fectina (Invitrogen). Tras la fermentación durante 96 horas a 37 ºC, se recogió el sobrenadante del cultivo celular mediante centrifugación, se filtró en esterilidad, se concentró mediante filtración en flujo tangencial ajustada hasta un pH de 7,6 y después se sometió a cromatografía en columna estándar con proteína A (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Ejemplo 7: Ensayo de adhesión celular
Cincuenta (50) ul de una solución 1 μg/ml de MN purificada en PBS se adsorbieron en una placa de 96 pocillos no tratada durante la noche a 4 ºC. La solución se eliminó y las células se aclararon 3 veces con PBS Los pocillos se bloquearon durante 1 hora con 200 μl de FBS al 50% en medio RPMI1640. Después, se trataron los pocillos con 100 μg del anticuerpo anti-MN 1e4 en BSA al 1% en PBS, IgG control en BSA al 1% en PBS o BSA al 1% en PBS. Después de lavar con PBS, a los pocillos se añadieron 5.000 células MaTu (células MN+) y la placa se incubó durante la noche a 37 ºC a 5% de CO2. La capacidad de los anticuerpos anti-MN para bloquear la adhesión de las células MaTu a los pocillos revestidos con MN se evaluó después de lavar con PBS. Un ejemplo de este experimento se muestra en la Figura 6, en la que 100 μg del anticuerpo anti-MN 1e4 inhiben la adhesión celular, mientras que la IgG control o el vehículo tampón no.
Ejemplo 8: Modelo de cáncer de xenoinjerto subcutáneo con inmunoconjugado
Los anticuerpos anti-MN se conjugaron con pequeñas moléculas citotóxicas usando protocolos conocidos en la técnica (p.ej., Liu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618 -8623,1996.). Las células MaTu de xenoinjerto de mama
humano se mantuvieron como cultivos adherentes en medio RPMI suplementado con 10% de FBS. En ratones Ncr atímicos (de 8-12 semanas de edad) se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho51x 106 células en 0,1 ml de matrigel al 80%/HBSS al 20%. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de ! 180 mg (6 días) se inició el tratamiento. Anticuerpos monoclonales conjugados con moléculas pequeñas citotóxicas se administraron i.v. una vez cada cuatro días (C4Dx3) a una dosis de 10 mg/kg. Los ratones control se trataron con PBS o con un anticuerpo monoclonal sin conjugar. Se realizaron exploraciones diarias del estado de salud de cada animal. Cada grupo experimental estaba compuesto por 10 ratones y el volumen de dosis fue 0,1 ml/10 g de peso corporal. La longitud y la anchura de cada tumor se midió usando un compás electrónico 2-3 veces a la semana y se calcularon los pesos de los tumores (mg) en base a la fórmula de [longitud (mm) x anchura ((mm)2)/2. Se documentaron todos los datos, incluidas las observaciones diarias, obtenidos durante el curso del estudio. La inhibición del crecimiento tumoral (ICT) se calculó como I-T/Cx100, donde T= pesos finales de los tumores de un grupo tratado y C= pesos finales de los tumores del grupo control. La Figura 7 muestra que la IgG1 monoclonal 1e4 conjugada con un fármaco citotóxico producía un efecto antitumoral significativo a 30 mg/kg del inmunoconjugado, mientras que el anticuerpo sin conjugar no tenía ningún efecto. Estos datos demuestran la utilidad terapéutica de los anticuerpos dirigida contra la proteína MN como vehículos para la liberación de fármaco en los tumores.
Ejemplo 9: Clasificación de células activadas por fluorescencia (ensayo FACS)
Se analizó la expresión de MN en las células como herramienta diagnóstica. Las células PC-3 mm2 que expresan MN y las células DLD1 que no expresan MN adheridas se desprendieron de sus matraces con 1:10 tripsina/Versene en solución de PBS durante de 5 a 10 minutos. Las células se centrifugaron (1.000 rpm, 5 minutos), se lavaron una vez con RPMI helado suplementado con 10% de FBS y se resuspendieron en tampón de tinción helado (PBS sin Ca+ Mg+, 2% de BSA y 0,05% de azida sódica) a 6 x 106 células/ml. El anticuerpo primario, la IgG1 anti-MN humana
o la IgG1 humana control a 25 μg/ml se incubaron con 6 x 106 células en hielo durante 1 hora. El anticuerpo no unido se eliminó de las células mediante lavado con tampón de tinción helado. Las células se fijaron durante 10 minutos con formaldehído al 2 % en PBS, después se lavaron dos veces con tampón de tinción El sedimento celular se resuspendió en 100 μl de tampón de tinción helado que contenía anticuerpo secundario Alexa fluor 488 anti-humano (concentración final 1:200, Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA) y se incubaron en hielo durante 1 hora. El anticuerpo no unido se eliminó de las células mediante lavado dos veces con tampón de flujo (PBS que contiene 2% de BSA) y las células se resuspendieron en 1 ml de tampón de flujo. El análisis FACS de las células resuspendidas se realizó en un instrumento Beckman FACS Caliber. La Figura 8 muestra que las células de cáncer de próstata humano PC-3 mm2 expresaban MN según el análisis FACS, mientras que las células DLD-1 no lo hacían.
Ejemplo 10: Ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ensayos CCDA)
La actividad antitumoral de las IgG anti-MN puede estar mediada por actividad CCDA. Las células PC-3 mm2 que expresan MN y las células HCT-116 que no expresan MN se incuban con 250 ng/ml, 1.000 ng/ml o 2.000 ng/ml de anticuerpo IgG1 anti-MN humano o anticuerpo IgG1 humana control anti-digoxina. A estas células se añaden PBMC humanos a proporciones efector: diana de 50:1, 25:1, y 5:1. Se realiza un ensayo de liberación de cromo 51 para determinar el nivel de lisis celular diana. Se observa una cantidad pequeña de lisis tras la incubación del anticuerpo control o sin anticuerpo en presencia de células DLD y PC-3 mm2. Este nivel espontáneo de lisis es 10 -15 %, 5 10 %, o 2 -3 % para las proporciones efector:diana de 50:1, 25:1 y 5:1 respectivamente. De un modo similar, la lisis de células DLD que no expresan MN estaba en el intervalo de 0-10% cuando se incubaron con los anticuerpos anti-MN. No obstante, la lisis de células PC-3 mm2 cuando se incubaron con las IgG anti-MN humanas fue significativamente mayor que la de los controles. Se observó una lisis de 40, 50, and 60 % cuando se usan 250 ng/ml, 1.000 ng/ml y 2.000 ng/ml a proporciones efector:diana de 50:1. De un modo similar, se observó una lisis de 30, 33 y 38 % a proporciones de 25:1 y, por último, se observó una lisis de 8, 10 y 15 % a proporciones efector:diana de 5:1. Estos experimentos muestran que los anticuerpos anti-MN humanos median en la actividad de CCDA antitumoral y se pueden usar para el tratamiento terapéutico del cáncer.
Ejemplo 11. Inmunoconjugado
Preparación
Se generó un anticuerpo humano dirigido al antígeno de superficie celular de MN usando una biblioteca de expresión en fagos que codifica una diversidad de Fab humanos (Morphosys). Este anticuerpo se conjugó con monometilauristatina E (MMAE) (Fransisco et al., Blood, 2003, 102:1458 -1465) (Figura 9).
Actividad y selectividad in vitro
La porción de anticuerpo de 3ee9/MMAE (3ee9) se identificó mediante "panning" in vitro de un dominio extracelular de la MN humana contra la biblioteca de fagos MorphoSys compuesta por 1010 fragmentos Fab humanos (los Fab son las porciones de unión a antígeno de los anticuerpos). Los Fab activos se examinaron después para determinar su capacidad para unirse de forma selectiva y sufrir internalización tras la adición a células positivas para MN. Los Fab activos resultante se convirtieron en anticuerpos IgG1 humanos de longitud completa, se expresaron en células CHO, se purificaron y después se conjugaron con el toxóforo, MMAE (Liu et al, Proc Natl Acad Sci, 1996, 93:8618 8623). Los anticuerpos conjugados se analizaron después para determinar su capacidad para matar células que
expresan MN. De un panel de siete anticuerpos de longitud completa analizados, se seleccionó 3ee9/MMAE en base a sus propiedades de unión, selectividad y potencia en ensayos tanto in vitro como in vivo.
Materiales y procedimientos de resonancia en plasmón superficial (Biacore)
Las interacciones de unión entre la proteína MN humana expresada en HKN11 y los AcMo anti-MN humanos de longitud completa se analizaron usando tecnología de resonancia en plasmón superficial en un instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Uppsala, Suecia). Para la preparación del chip, el Fc de IgG anti-humana de cabra se acopló covalentemente el chip biosensor CM5 usando el kit de acoplamiento de aminas estándar (BIAcore, Uppsala, Suecia). Después se usó un ensayo de captura para unir estas IgG a la superficie inmovilizada-Fc de IgG, dirigido a 300 unidades de respuesta de señal BIAcore. El BIAcore se realizó a 25 ºC y a un caudal de 10 μl/min con un tampón de carrera que contiene Na-HEPES 10 mM, a pH 7,5/NaCl 150mM/EDTA 3mM /0,05% de Tween 20. Después de la unión del ligando, el caudal se aumentó a 25 μl/min y se pasó el analito de MN (de 50 nM a 1 nM) sobre la superficie durante 10 minutos de un modo tal que se pudo monitorizar la fase de asociación. Después, procedió la disociación durante 35 minutos, seguida de regeneración de la superficie inmovilizada-Fc de IgG antihumana a 100 μl/min con ácido fosfórico 10 mM. Los sensogramas se adaptaron usando un modelo de unión Langmuir a 1:1 para calcular las constantes de velocidad (Tabla 1, a continuación).
Tabla 1
Afinidad de anticuerpos derivados de panning por la MN soluble determinada medianteresonancia de plasmón superficial (Biacore)
1 E4 3EE9 1AA1 3A4 5AA3 3EF2
Afinidad (Kd, nM
5 4 27 1 1 6
Unión del anticuerpo
Se demostró que 3ee9/MMAE tenía una kD de 3,6 nM para la proteína MN purificada usando tecnología Biacore, que era la misma que la afinidad del anticuerpo sin conjugar 3ee9. La unión a MN (CA IX) parecía específica, ya que no había unión detectable a 13 otras anhidrasas carbónicas. Se observó unión a CA5 asociada a mitocondrias, pero esta isozima sería inaccesible al anticuerpo in vivo.
Mediante análisis FACS se demostró que 3ee9/MMAE se unía a células MaTu que expresan MN, pero no a células DLD negativas para MN (Figura 10a). El anticuerpo contra MN G250 se usó un anticuerpo IgG1 humanizado (Wilex) como referencia en los estudios in vitro. Se unió a MN con una Kd de 5.3nM y exhibió un perfil de unión similar a las líneas celulares MN+ y MN-como 3ee9/MMAE.
Se obtuvieron resultados similares para el anticuerpo 1E4 y los inmunoconjugados 1aa1 (Figuras 10b y 10c, respectivamente), que exhibieron unión a células MN+, pero no a células MN-.
Internalización de anticuerpos
3ee9/MMAE se internalizó de forma selectiva mediante células que expresan MN (PC3mm2), pero no mediante células negativas para MN (DLD1), medido por Cellomics (Figura 11a). De un modo similar, se encontró que el inmunoconjugado 1E4 era internalizado por las células MN+ (PC3mm2), pero no por las células MN-(DLD1) (Figura 11b).
Inmunoprecipitación
Para explorar adicionalmente la especificidad se incubaron varios anticuerpos candidatos que incluyen la porción de anticuerpo de 3ee9/MMAE-(3ee9) y el anticuerpo de referencia G250 se incubaron con lisados celulares de líneas celulares MN+ (Pc3mm2) y MN-(DLD-1) que se habían marcado selectivamente con biotina. Los complejos entre los anticuerpos y las proteínas celulares se inmunoprecipitaron y los antígenos co-precipitados se visualizaron usando inmunotransferencias desarrolladas con estreptavidina unida a enzimas. Los anticuerpos G250 y 3ee9 de 3ee9/MMAE se unieron de forma selectiva y co-inmunoprecipitaron con una sola banda del mismo tamaño como MN de células MN+ (Figura 12). Anticuerpos menos específicos como 3ef2, 5aa3 y 5A6 co-inmunoprecipitaron otras varias proteínas demás de MN.
Citotoxicidad
13a). Se observó menos del 10% de muertes de células negativas para MN, incluso a dosis tan altas como de 1 uM. El inmunoconjugado 1A4 también se encontró que era citotóxico de forma selectiva para células MN+ (PC3mm2 y MaTu), pero no para células MN-(MIAPaca2 y DLD1) en los ensayos de citotoxicidad in vitro (Figura 13b). Adicionalmente, se encontró que el inmunoconjugado 1aa1 era citotóxico de forma selectiva para las células MN+ (PC3mm2), pero no por las células MN-(MIAPaca2) en los ensayos de citotoxicidad in vitro (Figura 13c).
El fármaco citotóxico MMAE liberado por 3ee9/MMAE es un inhibidor de tubulinas que impide la formación del huso durante la mitosis celular y tiene como resultado la parada en G2/M. El efecto del tratamiento de las células que expresan MN (Pc3mm2) y las células que no expresan MN (H460) con 3ee9/MMAE se muestra en la Figura 14. La tubulina se tiñe con anticuerpo marcado con fluorescencia. Las células no tratadas mostraron una formación normal del huso, mientras que las células que expresan MN tratadas mostraron fibras fragmentadas resultantes de la unión de tubulina con MMAE y la prevención de la formación del huso normal. No se observó actividad en las células que no expresan MN. Estos estudios confirmaron que el conjugado fármaco anticuerpo 3ee9/MMAE mata las células mediante alteración dirigida de la tubulina.
Ejemplo 12-Actividad in vivo del inmunoconjugado
Farmacología in vivo de 3ee9/MMAE contra ser humano con implante subcutáneo
Modelos de cáncer en xenoinjerto
3ee9/MMAE exhibe efectos antitumorales significativos y consistentes sobre el crecimiento de múltiples modelos tumorales en xenoinjerto humano en ratones atímicos cuado se administró por vía intravenosa según un programa intermitente. El efecto antitumoral in vivo de 3ee9/MMAE se analizó en 6 modelos de tumores en xenoinjerto humanos. Estos modelos se establecieron mediante implantación subcutánea de células tumorales humanas en ratones Ncr hembra atímicos (nu/nu) (Taconic, NY). Los modelos de xenoinjerto tumoral humano evaluados incluyeron el modelo de carcinoma de mama humano MaTu, modelos de carcinoma colorrectal (CCR) humano HT29 y Colo-205, modelo de carcinoma humano PC3MM2, modelo de CCR resustente a múltiples fármacos HCT-15 (P-gp) y el modelo pancreático humano MiaPaCa2. Se usó PBS como vehículo y se prepararon soluciones de dosis a diario. El volumen de dosificación fue de 0,1 ml/10g (10 ml/kg).
La longitud y la anchura de cada tumor se midieron usando un compás electrónico 2-3 veces a la semana y se calcularon los pesos de los tumores (mg) en base a la fórmula de [longitud (mm) x anchura ((mm)2)/2. Todos los datos, incluidas las observaciones diarias, obtenidos durante el curso del estudio se documentaron en el Sistema de Adquisición de Datos anti-tumoral (ADAS). La dosis máxima tolerada (DMT) se define como la dosis más alta que no produce más del 20% de letalidad y/p 20% de la pérdida de peso corporal neta. La inhibición del crecimiento tumoral (ICT) se calculó como (1-T/Cx100), donde T= pesos finales de los tumores un grupo tratado después de la última dosis y C= pesos finales de los tumores del grupo control después de la última dosis. Además, la eficacia antitumoral se midió como la incidencia de respuestas (o respondedores o regresiones) definida como tumores con ≤ 50 % de su tamaño inicial. Se requiere una duración mínima de 7 días para que una respuesta se considere duradera.
Eficacia de 3ee9/MMAE en el modelo de xenoinjerto MaTu
Las células MaTu de xenoinjerto de mama humano se mantuvieron como cultivos adherentes en medio RPMI suplementado con 10% de FBS. En ratones Ncr atímicos (de 8-12 semanas de edad) se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho51x 106 células en 0,1 ml de matrigel al 80%/HBSS al 20%. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de ! -180 mg (7 días) se inició el tratamiento. Se administró BAY 79 -4620 (3ee9-IC) una vez cada cuatro días (C4Dx3) a una dosis de 1,3 y 10 mg/kg. Los ratones control se trataron con PBS o con un anticuerpo monoclonal sin conjugar a una dosis de 10 mg/kg.
Se realizaron exploraciones diarias del estado de salud de cada animal. Cada grupo experimental estaba compuesto por 10 ratones y el volumen de dosis fue 0,1 ml/10 g de peso corporal. La longitud y la anchura de cada tumor se midió usando un compás electrónico 2-3 veces a la semana y se calcularon los pesos de los tumores (mg) en base a la fórmula de [longitud (mm) x anchura ((mm)2)/2. Se documentaron todos los datos, incluidas las observaciones diarias, obtenidos durante el curso del estudio. La inhibición del crecimiento tumoral (ICT) se calculó como 1T/Cx100, donde T= pesos finales de los tumores de un grupo tratado y C= pesos finales de los tumores del grupo control.
3ee9/MMAE fue bien tolerada a todas las dosis analizadas con todos los animales tratados sin que exhibieran una pérdida significativa de peso. La eficacia representativa de 3ee9/MMAE en el modelo tumoral MaTu se ilustra en la Figura 15. Los tumores de grupos control sin tratar y tratados con vehículo crecieron de forma progresiva en todos los animales. El tiempo de duplicación medio para los animales de los grupos control y tratados con vehículo fue de 11,2 días. Al final de las dosis, 3ee9/MMAE mostró una eficacia antitumoral sólida a todas las dosis analizadas. Más específicamente, BAY 79-4620 (3ee9-IC) dio 67,72 y 78 % de ICT a 1, 3 y 10 mg/kg, respectivamente. En comparación, el AcMo 3ee9 no conjugado no tenía ningún efecto significativo en la inhibición del crecimiento de este tumor-xenoinjerto de mama.
Tras la finalización de la pauta de dosificación predeterminada (C4Dx3), se determinó el efecto de 3ee9/MMAE
sobre el retraso del crecimiento tumoral y la regresión. Como se muestra en la Figura 15, el tratamiento de 3ee9/MMAE tuvo como resultado un retraso significativo del crecimiento tumoral y regresión. A la menor dosis estudiada (1 mg/kg), tras el cese del tratamiento los tumores permanecieron estables durante -2 semanas y comenzaron a remitir después. En general, el 30% de los tumores respondieron a este tratamiento de 1 mg/kg. En comparación, el 100% de los animales respondió cuando fue expuesto a 3 y 10 mg/kg. Cabe destacar que incluso tras -3 meses tras el cese del tratamiento, solo 3 y 1 tumores mostraron signos de volver a crecer en los grupos tratados con 3 y 10 mg/kg, respectivamente, lo que muestra que el 70 y el 90% de los animales permaneció sin tumor incluso transcurridos 90 días desde el cese del tratamiento.
La IgG1 monoclonal 1E4 conjugada con un fármaco citotóxico producía un efecto antitumoral significativo contra el xenoinjerto de mama humano, MaTu, cuando se administró la dosis a 30 mg/kg del inmunoconjugado, mientras que el anticuerpo sin conjugar no tenía ningún efecto (Figura 16). Otros experimentos usando el mismo protocolo pero sustituyendo las formas conjugadas del anticuerpo 1aa1 (Figura 17), 3ee9 y 5aa3 dieron resultados similares. Adicionalmente, cuando se usa la forma conjugada de 3ee9, se observaron efectos antitumorales en otros modelos de xenoinjerto humano derivado de varios tipos histológicos, incluidos modelos de xenoinjerto de cáncer colorrectal humano HT-29 y Colo-205, y PC3-mm2, un modelo de xenoinjerto de próstata humana. Estos datos indican la utilidad terapéutica de los anticuerpos dirigidos contra la proteína MN como vehículos para la liberación de fármaco en los tumores.
Ejemplo 13. Determinación del índice terapéutico de 3ee9/MMAE en el modelo de xenoinjerto MaTu
La dosis máxima tolerada (DMT), la dosis mínima eficaz (DME) y el índice terapéutico (IT) de 3ee9/MMAE se determinó usando ratones portadores de tumor de xenoinjerto MaTu. El IT se define como la proporción de la DMT dividida por la DME. Se administró 3ee9/MMAE por vía intravenosa una vez cada cuatro días para un total de 2 inyecciones (C4Dx3)-Se administró 3ee9/MMAE a niveles de dosis de of 0,625, 1,25, 2,5, 5,0, 10, 30 y 60mg/kg. Los ratones control se trataron con PBS o un anticuerpo monoclonal sin conjugar a una dosis de 60 mg/kg. 3ee9/MMAE a dosis de 60 mg/kg parecían ser la DMT, ya que se produjo una letalidad del 10% y una pérdida de peso corporal de !20% en respuesta a este tratamiento. Los demás grupos de tratamiento fueron bien tolerados.
La actividad antitumoral de 3ee9/MMAE se presenta en la Figura 18. Al final de la dosificación, 3ee9/MMAE a una dosis de 0,625 y 1,24 mg/kg tuvo como resultado una inhibición del, 62% y 81%, respectivamente. Dosis de 2,5, 5, 10, 30 y 60 mg/kg tuvieron como resultado una inhibición mayor del crecimiento tumoral (~90%), comenzando la mayoría de los tumores a mostrar regresiones. En base a los datos observados, la DME de 3ee9/MMAE fue 0,625mg/kg. Tras la finalización del régimen de dosificación predeterminado (C4Dx3), se determinó el efecto de 3ee9/MMAE sobre el retraso del crecimiento tumoral y la regresión. No se observó regresión tumoral para la dosis de 0,625 mg/kg. En contraste con esto, el 80% de los animales exhibió regresiones tumorales en respuesta a 1,25 mg/kg. Además, a dosis de 2,5 mg/kg y mayores el 100% de los animales respondió al tratamiento. Se determinó que el índice terapéutico de 3ee9/MMAE era -96.
Ejemplo 14. Eficacia de 3ee9/MMAE en el modelo de xenoinjerto HT-29
En ratones con CCR humano se inocularon células HT-29 por vía subcutánea en el flanco derecho con 5x 106 células en 0,1 ml de HBSS. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de !120 mg (5 días) se inició el tratamiento. 3ee9/MMAE se administró i.v. una vez cada cuatro días (C4Dx3) a una dosis de 0,625, 1,25, 2,5, 5,0, 10 mg/kg. Los ratones control se trataron con PBS o un anticuerpo monoclonal no conjugado a una dosis de 10 mg/kg. Además, MMAE se evaluó como un fármaco libre a una dosis de 0,1, 0,2 y 1 mg/kg. Las dosis de 0,1 y 0,2 mg/Kg de MMAE representan cantidades equivalentes de este fármaco a las presentes en 5 y 10 mg/Kg de 3ee9/MMAE respectivamente.
3ee9/MMAE fue bien tolerada a todas las dosis analizadas con todos los animales tratados sin que exhibieran una pérdida significativa de peso. De un modo similar, dosis menores de MMAE, es decir 0,1 y 0,2 mg/kg, fueron bien toleradas con una pérdida mínima y no significativa de peso. No obstante, a la dosis superior de 1 mg/kg se observó un 50% de letalidad exhibiendo el resto de animales una gran pérdida de peso y, por tanto, se consideró tóxica.
La eficacia representativa de 3ee9/MMAE y MMAE libre en el modelo tumoral HT-29 se ilustra en la Figura 19. Los tumores de grupos control sin tratar y tratados con vehículo crecieron de forma progresiva en todos los animales. El tiempo de duplicación medio para los animales de los grupos control y tratados con vehículo fue de 6,4 días. Al final de las dosis, 3ee9/MMAE mostró una eficacia antitumoral sólida a todas las dosis analizadas. Más específicamente, 3ee9/MMAE a dosis de 0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 mg/kg dio una ICT 54, 72, 97, 100 y 100%, respectivamente. En comparación, la MMAE libre de 0,2 mg/kg tuvo como resultado una ICT del 60%, mientras que 0,1 mg/kg no tenía un efecto significativo en la inhibición del crecimiento de este modelo de xenoinjerto. En términos de respuestas tumorales, dosis de 3ee9/MMAE de 1,25 mg/kg tuvieron como resultado regresiones en un 20% de los animales. A dosis mayores, las respuestas tumorales fueron mucho mayores, de modo que la dosis de 2,5 mg/kg muestra regresiones en el 90% y las dosis de 5 y 10 mg/kg inducen respuestas del 100%. Por el contrario, la MMAE libre no indujo ninguna respuesta tumoral como se ha definido anteriormente.
El efecto antitumoral de 3ee9/MMAE también se evaluó en programas variables, es decir una vez a la semana para un total de dos dosis (C7Dx2, Figura 20) y una única dosis en el momento de la estadificación (CDx1, Figura 21). En ambos programas, se administraron dosis de 3ee9/MMAE de 0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 mg/kg. Con independencia del programa, 3ee9/MMAE fue altamente eficaz en la inhibición del crecimiento en este modelo de xenoinjerto de CCR.
La Tabla 2 siguiente resume la eficacia antitumoral de 3ee9/MMAE. La eficacia antitumoral fue muy similar a la que se observó para 3ee9/MMAE en el programa de C4Dx3, lo que indica que en los programas estudiados la eficacia antitumoral de 3ee9/MMAE parece ser independiente del programa.
Tabla 2
Eficacia antitumoral de 3ee9/MMAE
Compuesto
Dosis (mg/kg) Programa detratamiento %Inhibición (1-T/D)*100 (Día 18) Porcentaje deregresiones
Control
N/A N/A N/A 0
PBS
0 C4D x 3 -17 0
Ac 3ee9
10 C4D x 3 -11 0
3EE9IC
0,625 C4D x 3 54 0
3EE9IC
1,25 C4D x 3 72 2
3EE9IC
2,5 C4D x 3 97 9
3EE9IC
5 C4D x 3 100 10
3EE9IC
10 C4D x 3 100 10
3EE9IC
0,625 C7D x 2 48 0
3EE9IC
1,25 C7D x 2 71 0
3EE9IC
2,5 C7D x 2 92 4
3EE9IC
5 C7D x 2 96 7
3EE9IC
10 C7D x 2 100 10
3EE9IC
0,625 C1D x 1 42 0
3EE9IC
1,25 C1D x 1 48 0
3EE9IC
2,5 C1D x 1 93 5
3EE9IC
5 C1D x 1 98 8
3EE9IC
10 C1D x 1 100 10
MMAE
1 C4D x 3 Tóxico N/A
MMAE
0,1 C4D x 3 27 0
MMAE
0,2 C4D x 3 60 0
Ejemplo 15. Eficacia de 3ee9/MMAE en modelos de xenoinjerto PC3mm2 y Colo-205
La eficacia antitumoral de 3ee9/MMAE se evaluó después contra xenoinjertos tumorales de próstata humana (PC3mm2) y CCR (Colo-205). En ratones hembra NCr nulnu se implantó por vía subcutánea (s.c.) 5 x 106 células PC3mm2 o Colo-205. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 125-150 mg se inició el tratamiento. La salud general de los ratones se supervisó y registró a diario. Las dimensiones de los tumores y los pesos tumorales se registraron dos veces a la semana comenzando con el primer día de tratamiento.
En los estudios de PC3mm2 y Colo-205, 3ee9/MMAE se administró por vía intravenosa (i.v.) una vez cada 4 días para un total de 3 inyecciones (C4Dx3) a dosis de 1, 3, 10 y 30 mg/kg y 1,25, 2,5, 5 y 10 mg/kg, respectivamente. Como en otros estudios, 3ee9/MMAE fue bien tolerada a todas las dosis evaluadas. 3ee9/MMAE inhibió el crecimiento de tumores de próstata PC3MM2 establecidos cuando se administró a niveles de dosis de 10 y 30 mg/kg, mostrando el 100 % de los animales respuestas (Figura 22). A las dosis menores de 1 y 3 mg/kg, solo se observaron efectos moderados, dado que se observó una ICT de 45 a 50% al final de la dosificación. No obstante, el 20% de los animales sí mostró respuestas en el grupo de 3 mg/kg.
De un modo similar, en el modelo de xenoinjerto de CCR Colo-205, 3ee9/MMAE fue muy eficaz en la inhibición del crecimiento tumoral (Figura 23). Al final de la dosificación se observó una ICT >90 % para dosis de 5 y 10 mg/kg y se observó una ICT >70 % en respuesta a la dosis de 2,5 mg/kg. La dosis más baja, 1 mg/kg, de 3ee9/MMAE fue relativamente ineficaz contra este modelo de CCR. En términos de regresiones, dosis de 3ee9/MMAE de 5 y 10 mg/kg tuvieron como resultado respuestas del 40 y 80%, respectivamente.
Ejemplo 16. Eficacia de 3ee9/MMAE en el modelo de xenoinjerto HCT-15
Para estudiar el efecto de 3ee9/MMAE en un modelo de resistencia a múltiples fármacos se implantó en ratones hembra NCr nu/nu por vía subcutánea (s.c.) 5 x 106 células HCT-15. HCT-15 es una línea resistente a múltiples fármacos (MDR) que sobreexpresa la glicoproteína P (P-gp). Como tal, esta línea celular exhibe un fenotipo de resistencia a múltiples fármacos y es resistente a Taxol®, doxorrubicina y etopósido. 3ee9/MMAE, Taxol y Gemcitabina se administraron cuando los ratones tenían tumores establecidos con un peso medio de ~150 mg. La gemcitabina, un análogo pirimidínico que no es un sustrato de P-gp, se usó como control positivo. Como cabía esperar, la gemcitabina (120 mg/kg, i.p., CDx10) fue altamente activa en este modelo de MDR (Figura 24). Por el contrario, 3ee9/MMAE (siendo MMAE un sustrato conocido de P-gp) y Taxol® no pudo producir ningún efecto antitumoral significativo.
Ejemplo 17. Eficacia de 3ee9/MMAE en modelos de xenoinjerto huMN-MIAPaca2 y MIAPaca2
Para entender mejor la relación entre la expresión de MN y la eficacia antitumoral, se realizaron estudios de eficacia en xenoinjertos usando un modelo pancreático que expresa MN a niveles bajos, MIAPaCa2 y un modelo huMN-MIAPaCa2 que expresa niveles altos de MN. Esta última línea se obtuvo mediante ingeniería de la línea MIAPaCa2 para expresar de forma estable la MN. 3ee9/MMAE tuvo un efecto mínimo en la inhibición del crecimiento de esta línea MIAPaCa2 que expresa niveles bajos de MN (Figura 25). Dosis de 3ee9/MMAE de 10 mg/kg solo produjeron una ICT del 50%. Por el contrario, se observó una actividad antitumoral significativa para 3ee9/MMAE contra el modelo huMN-MIAPaCa2, donde, al final de la administración de las dosis, dosis de 2,5, 5 y 10 mg/kg dieron una ICT de 63, 82 y 94 %, respectivamente. Además, la dosis de 10 mg/kg indujo respuestas del 100%, lo que indica que hay un gran cambio de la sensibilidad al sobreexpresar niveles de MN en tumores.
Ejemplo 18. Combinación con Xeloda® en modelo de xenoinjerto Colo-205
Se investigó la viabilidad del uso de 3ee9/MMAE junto con otros agentes quimioterapéuticos para el cáncer. Xeloda® se usa como tratamiento de primera línea de pacientes con carcinoma colorrectal metastásico. Se evaluó la actividad y la tolerabilidad del tratamiento combinado usando 3ee9/MMAE y Xeloda®. 3ee9/MMAE se administró i.v. según un programa C4Dx3 y a niveles de dosis de 1,25, 2,5 y 10 mg/kg. Xeloda® se administró por vía oral una vez al día durante 9 días a niveles de dosis de 250 y 500 mg/kg. 3ee9/MMAE administrado solo a 2,5 y 10 mg/kg tuvo como resultado una inhibición sólida del crecimiento tumoral (ICT de 73 y 96 %, respectivamente) (Figura 26a). No obstante, el grupo tratado con 1,25 mg/kg de 3ee9/MMAE fue relativamente ineficaz, dando como resultado una ICT de solo el 31%. Xeloda® administrado solo a niveles de dosis de 250 y 500 mg/kg también produjo una ICT sólida del 78 y 86 %, respectivamente.
En términos de respuestas, el grupo tratado con 10 mg/kg de 3ee9/MMAE indujo una tasa de respuesta del 80%, mientras que el cero por ciento de los animales en ambos grupos de dosis de Xeloda mostró regresiones. Todos los grupos de tratamiento de combinación fueron bien tolerados y tuvieron como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral, así como tasas de respuesta. Datos cuantitativos que detallan la ICT y las respuestas tumorales combinando estos dos agentes se muestran en las Figuras 26a y 26b, así como en la Tabla 3, más adelante. A las dosis estudiadas, la actividad antitumoral de 3ee9/MMAE combinada con Xeloda® fuer muy superior a la de 3ee9/MMAE o Xeloda® administrados como agentes en monoterapia. Por último, con respecto a la tolerabilidad, la administración de estas sustancias terapéuticas fue bien tolerada sin reacciones adversas.
Tabla 3
Eficacia antitumoral de BAY 79-4620 (3ee9-IC) en combinación con Xeloda®
Tratamiento Programa Dosis mg/kg/i nj % de inhibición (T/C) (d 17) % Pérdida de peso (d 17)
% de regresiones
Sin tratar ---0.3 79-4620 (3ee9 cj) C4DX3; i.v. 1.25 30.6 0.5 79-4620 (3ee9 cj) C4DX3; i.v. 2.5 73 0.1 79-4620 (3ee9 cj) C4DX3; i.v. 10 96.2 0.9 Xeloda C1DX9; v.o. 250 78 -0.5 Xeloda C1DX9; v.o. 500 86.1 -5.6
0 0 0 80 0 0
Xeloda (250 mg/kg)
79-4620 (3ee9cj)+Xeloda C4DX3; i.v./C1 DX9; v.o. 1.25 92.1 -2 79-4620 (3ee9 cj)+Xeloda C4DX3; i.v./C1 DX9; v.o. 2.5 91.4 -0.9 79-4620 (3ee9 cj)+Xeloda C4DX3; i.v./C1 DX9; v.o. 10 97.5 -0.4
50 60 100
Xeloda (500 mg/kg)
79-4620 (3ee9 cj)+Xeloda C4DX3; i.v./C1 DX9; v.o. 1.25 94.2 -0.3 79-4620 (3ee9 cj)+Xeloda C4DX3; i.v./C1 DX9; v.o. 2.5 95.7 -3.2 79-4620 (3ee9 cj)+Xeloda C4DX3; i.v./C1 DX9; v.o. 10 97.3 -1.4
70 90 100

Ejemplo 19. Distribución in vivo/Localización del tumor del AcMo 3ee9 contra el modelo de cáncer dexenoinjerto humano implantado bilateralmente.
5 Para determinar la distribución in vivo y la localización del tumor del componente AcMo de 3ee9/MMAE, se realizaron estudios de imagen no invasivos in vivo usando el CRI Maestro™ en ratones que recibieron implantación bilateral de tumores que exhiben una expresión tanto alta como baja de MN. El sistema de imagen in vivo Maestro™ (CRI, Woburn, MA) con adquisición y análisis de múltiples espectros se ha diseñado para eliminar la autofluorescencia de fondo. Los AcMo 3ee9 of BAY 79-4620, M75 (monoclonal de ratón que reconoce MN) y la IgG
10 humana control se conjugaron con Alexa Fluor 750 (Invitrogen Cat# A20011) según las instrucciones de fabricante. La proporción Proteína/AF750(mol/mol) fue de 1/5,9 para 3ee9, 8,9 para la IgG humana y 6,0 para M75.
Doce días antes de la inyección de cada anticuerpo marcado con fluorescencia, en ratones Balb/C atímicos de Harlan se implantó MIAPaCa-2 (de baja expresión de MN; 7,5x106 células en 50% de Matrigel) por vía subcutánea en el flanco derecho y huMN-MIAPaCa2 (línea celular estable transfectada con MN; 5x106 células en 50% de 15 Matrigel) por vía subcutánea en el flanco derecho. El día 0 (12 días después del implante) se inyectaron 4 μg del anticuerpo conjugado en cada animal. La imagen se tomó el día 4, el día 5 y el día 10. Los datos se recogieron usando animales anestesiados (100 mg/kg de ketamina / 10 mg/kg de xilazina, i.p.) y se colocaron dentro del
sistema de imagen. Se adquirieron cubos (serie de imágenes) de imagen de múltiples espectros espaciándose las imágenes cada 10 nm a lo largo del intervalo de espectros de 680 a 950 nm, que cubría la gama de infrarrojos cercanos (NIR).
Cada imagen se expuso durante 5 segundos. Las imágenes coloreadas falsas se sintetizaron del cubo de espectros usando software Maestro y se escalaron a un brillo visible usando ImagePro Plus 6.0. El escalado fue idéntico a todas las imágenes, siendo la imagen más brillante ligeramente por debajo del nivel de saturación. Los anticuerpos marcados de un modo más fluorescente tendían a localizarlo en el hígado y la vejiga. Tras de 4 a 5 días, la mayoría de la señal disminuye desde el hígado y la vejiga y se estabiliza en el tumor. Las imágenes tomadas el día 5 dieron la proporción señal-fondo más alta (Figura 27.) Tras cinco días, se había generado muy poca señal a partir de los animales a los que se inyectó hIgG, lo que indica que no se había podido localizar hIgG en el tejido tumoral. Por el contrario, tanto M75 como 3ee9 se localizaban específicamente en tumores de expresión de MN alta (huMN-MIAPaCa2). No se observó localización alguna en tumores MIAPaCa2 que expresan niveles bajos de MN en los mismos animales.
Ejemplo 20-Mecanismo de acción in vivo
Para explorar el mecanismo de acción in vivo de 3ee9/MMAE, se implantaron tumores por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones con 5x106 células HT-29. Ocho días después, se trató a ratones atímicos portadores de tumores HT-29 con vehículo o con 3ee9/MMAE a 1,25 y 5 mg/kg (CDx1). Los tumores se recogieron y se fijaron en formalina 4 horas y 1, 3 y 5 horas tras la administración de 3ee9/MMAE. Después, las muestras se incluyeron en parafina, se seccionaron a 5 μm, se desparafinizaron y se tiñeron usando el protocolo estándar para inmunohistoquímica fluorescente de tejidos humanos usando anticuerpos de ratón: Anti-α/β-tubulina, Anti-fosfo-Histona H3 y ADN. Los cortes se observaron después con un microscopio de fluorescencia y se tomaron imágenes representativas a través de tres canales de colores diferentes.
3ee9/MMAE tuvo poco efecto en términos de afectar al mecanismo celular en las muestras de 4 h. No obstante, el día 1 había un número mayor de células en paro G2/M y claramente se observaron husos multipolares. Además, se pudo observar un nivel menor de tinción de tubulina. Estos efectos se amplificaron considerablemente en las muestras del día 3 y del día 5. De hecho, casi todas las células en el grupo de tratamiento con la dosis de 5 mg/kg de 3ee9/MMAE el día 5 estaban muy afectadas por el tratamiento (Figura 28). Estos datos indican claramente que 3ee9/MMAE afectaba al crecimiento de las células cancerosas mediante inhibición de tubulina, lo que conduce al cese de G2/M y apoptosis.
La Tabla 4 siguiente resume el perfil de comportamiento de 3ee9/MMAE.
Tabla 4
Perfil de 3ee9/MMAE
Ensayo
Resultado para 3ee9/MMAE
Afinidad (Kd)
3,6 nM
Unión celular (FACS): MN+/MN
+++/-
Internalización: MN+/MN
+++/-
Citotoxicidad: MN+/MN-(ec50)
50 nM/>1 μM
Inmunoprecipitación
específico
Ensayo
Resultado para 3ee9/MMAE
IHQ
específico
Distribución in vivo
normal
Actividad in vivo: MED
1 mg/kg
Actividad in vivo: MTD
60 mg/kg
Ejemplo 21. Construcción del vector de expresión, transfección, expresión y purificación de IgG anti-MNbasado en las regiones variables-CDR de las cadenas ligera y pesada de 3ee9 usando un sistema de expresión celular CHO estable
Construcción del vector de expresión 3ee9H+LpCMVUCOE8
Las regiones variables CDR de las cadenas kappa y pesada (SEC ID Nº: 126 y 125, respectivamente) del vector 3ee9pMORPHx9 (obtenido de acuerdo con los ejemplos 1-3) se insertaron en el vector H+LpattB (ML Laboratories) del siguiente modo. Para generar el vector 3ee9kappapAttB, en los sitios de las enzimas de restricción EcoRV -BsiWI de H+LpattB se insertó un fragmento de enzima de restricción EcoRV -BsiWI de aproximadamente 350 pares de bases de 3ee9pMORPHx9 (preparado de acuerdo con los ejemplos anteriores, por ejemplo los ejemplos 1-3). Después, el fragmento de las enzimas de restricción MfeI-BllpI de 350 pares de bases de 3ee9pMORPHx9 se insertó en los sitios de las enzimas de restricción EcoRI -BlpI de 3ee9kappapAttB para generar 3ee9H+LpattB. Las secuencias de codificación de las cadenas pesada y ligera de 3ee9 (SEC ID Nº: 126 y 125, respectivamente( se recombinaron después con pDONR221 (Invitrogen Cat.# 12536-017) usando la mezcla de enzimas Gateway BP Clonase II (Invitrogen Cat.# 11789-100) para generar el vector 3ee9H+LpENTR. El vector 3ee9H+LpCMVUCOEB se generó mediante recombinación entre 3ee9H+LpENTR y pCMV_UCOE8_DEST usando la mezcla de enzimas Gateway LR Clonase II (Invitrogen Cat.# 11791-100).
La construcción de pCMV_UCOE8_DEST fue la siguiente. El casete de conversión del vector Gateway (Invitrogen; cat# 11828-029) se insertó en el sitio SmaI de pCET906 para generar el vector pCET906_gw. El vector pCET906 se obtuvo de ML Laboratories y se describe completamente en Williams et. al., BMC Biotechnology, (2005), 5:17, que se incorpora en el presente documento por referencia. El fragmento de la enzima de restricción AgeI de aproximadamente 2.900 pares de bases de pCET906_gw se clonó después en el sitio AgeI de pCET1015 para generar pCMV_UCOE8_DEST. El vector pCET1015 también se obtuvo de ML Laboratories y se describe en Williams et al., supra. El vector pCMV_UCOE8_DEST se propagó en una cepa de E. coli resistente al gen de la toxina ccdB (p. ej., tal como los comercializados como “One Shot ccdB Survival T1 cells" from Invitrogen (nº cat. C7510-03)). En la Figura 29 se muestra la secuencia nucleotídica completa del inserto de 3ee9H+LpCMVUCOF8, es decir la secuencia completa de nucleótidos que codifica un anticuerpo IgG anti-MN humano que comprende las regiones variables CDR de las cadenas kappa y pesada de SEC ID Nº: 126 y 125, respectivamente, obtenidas del vector 3ee9pMORPHx9.
Aislamiento del clon celular 3ee9.25
Para transfectar las células CHO-S con el vector 3ee9H+LpCMVUCOE8, 60 μg de ADM se diluyó en 2 ml de CD CHO (invitrogen#10743-029) completo con L-glutamina 8mM y HT(invitrogen) y que carece de PenStrep. Después, se añadieron 2 ml de medio CD CHO completo a un matraz erlenmeyer de 250 ml. Después, al matraz se añadieron 150 μl de DMRIE-C (Invitrogen nº cat.10459-014) y se incubaron a TA durante 10 minutos. A continuación, el ADN diluido se mezcló con el DMRIE-C diluido, se lavó con 5% de CO2 y se incubó a TA durante 30 minutos. Durante la incubación se prepararon 4 ml de células CHO-S a 5x106 c/ml (2x107 de células totales) en medio CD CHO completo (sin P/S). Después de la incubación, las células se añadieron al matraz con complejo DNA-DMRIE-C y después se agitaron suavemente para mezclar. Después, el matraz se aclaró con 5% de CO2 y se agitó a 125 rpm a 37 ºC durante 4 horas. A continuación, al matraz se añadieron 32 ml de medio CD-CHO completo sin Pen Strep, se aclaró con 5% de CO2 y después se devolvieron al agitador (37 ºC) durante la noche. Tras 24 horas, se contaron las células, se centrifugaron y se resuspendieron en medio CD CHO completo más 5,5 ml/l de PenStrep con 20% de medio acondicionado y antibiótico (12,5 μg/ml de puromicina) a una densidad celular adecuada para sembrar en placas. Las células se sembraron a 100, 300, 900 y 2.700 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Las placas se incubaron después en un incubador de CO2 durante aproximadamente 3 semanas. Se tomaron precauciones para no alterar las placas.
Los clones individuales se expandieron de las placas con pocillos que contienen colonias únicas en menos del 20% de los pocillos en la placa. Las células se expandieron a placas de 24 pocillos no tratadas con tejido con 1 ml de medio selectivo por pocillo. Las células se incubaron durante aproximadamente 1 semana durante la cual se añadieron 500 μl de medio fresco según era necesario. La expresión de anticuerpos se investigó a una dilución única para eliminar los clones que no expresan. Los clones se analizaron mediante ELISA por duplicado usando una dilución a 1:5 (5 ul del sobrenadante en 95 ul de TBS/tween). Se eliminaron los clones que dieron una DO (densidad óptica) inferior a 0,1. Los clones positivos se expandieron en placas de 6 pocillos no tratadas con tejido. Después se sembraron 5 ml de células a 4x104 células/ml. Tras 4 días de incubación se determinó la expresión proteica mediante ELISA. Los clones se analizaron usando diluciones de 1:50, 1:100, 1:200 y 1:400. El clon 3ee9.25 exhibió la concentración de anticuerpo secretado más elevada. Las células 3ee9.25 se transfirieron a un matraz agitador erlenmeyer de 125 ml sembrando a 2x105 células/ml para adaptar las células al crecimiento en suspensión.
Expresión de las IgG anti-MN
Las células CHO-S transfectadas se sembraron en un biorreactor Wave de 10 litros (Wave Biotech, 300 Franklin Square Drive, Somerset, New Jersey, 08873, EE.UU.) a 500.000 células/ml. Las células se cultivaron durante siete días en 50% de medio CD-CHO (Invitrogen 10743), 50 % de medio CHO Sigma número 5 (Sigma 0363), 1% de FCS, 1 x suplemento HT (Invitrogen 11067-030), penicilina/estreptomicina (Invitrogen 15140-122), L-glutamina 8 mM (Invitrogen 25030-081) y 12,5 μg/ml de puromicina (BD 631305) con el biorreactor en agitación a 25 rpm en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 ºC. Al final del periodo de fermentación se recogió el medio de cultivo gastado mediante centrifugación y se esterilizó mediante filtración (0,2 μM) antes de la purificación de IgG.
5 Purificación de las IgG anti-MN.
Normalmente, de 10 a 20 l del medio de cultivo celular que contiene IgG se concentraron de 2 a 5 veces usando Prep-Scale TFF-2 30 kD Cartridge (Millipore). Al medio concentrado se añadió tampón Tris-Cl 1M, a pH 7,5 hasta la concentración final de 50 mM. Después se añadió NaCl 5,0 M hasta una concentración final de 150 mM. El medio concentrado se cargó normalmente en una columna de 30 ml de Protein Sepharose equilibrada con PBS, a pH 7,4. 10 La columna se lavó con PBS a pH 7,4 que contiene 0,1% de Tween 20 y EDTA 1mM. Después, la columna se lavó con PBS y eluyó con tampón glicina 100 mM, pH 3,0. Tras la recolección, las fracciones se neutralizaron hasta un pH 7,5 con Tris-Cl 1M a pH 7,8. Las IgG purificadas se transfirieron a PBS mediante diálisis y se esterilizaron mediante filtración (0,2 μM). Las preparaciones de anticuerpo purificado finales se ajustaron a entre 1 y 5 mg/ml, exhibieron una pureza de ≥95% determinado mediante geles de SDS PAGE teñidos con azul de coomassie, tras lo 15 cual la proteína migró como dos bandas correspondientes a las cadenas pesadas de Mr = 50 kDa y las cadenas ligeras de Mr 25 kDa, tenía unos niveles de endotoxina inferiores a 1 UE/mg de proteína e inferiores a 10% del agregado proteico determinado mediante SEC HPLC. Asimismo, las preparaciones se sometieron a QC funcional para la unión a antígeno de MN mediante resonancia de plasmón superficial, la unión a células que expresan MN mediante FACS e internalización en las células que expresan MN determinado mediante imágenes automáticas 20 (Cellomics). Normalmente, una fermentación combinada de 20 l daba 1 gramo de proteína purificada con una recuperación global de 50 a 75%. La secuenciación en N-terminal de 255 pmol de la preparación final del anticuerpo 3ee9 de longitud completa usando un secuenciador ABI Procise 494 HT dio 368 pmol de la siguiente secuencia prevista para la cadena ligera kappa madura de: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT-RASQDINNYLSWYQQKP-. Esta es la misma que la secuencia en N-terminal correspondiente a la cadena ligera kappa v madura del AcMo 3ee9
25 (SEC ID Nº: 146). La cadena pesada no se detectó mediante secuenciación de Edman que muestra que su secuencia estaba bloqueada.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene un sitio de unión a antígeno dirigido específicamente contra una proteína MN, en el que el sitio de unión a antígeno comprende un conjunto de secuencias de CDR de cadena pesada seleccionadas del grupo constituido por:
    5 [3ee9] SEC ID Nº: 57, 63 y 70;
    y un conjunto de secuencias de CDR de cadena ligera seleccionadas del grupo constituido por:
    [3ee9] SEC ID Nº: 89, 93 y 97.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la proteína MN con una constante de disociación de 0,15 nM a 50 nM.
    10 3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en el que el anticuerpo es una IgG, preferentemente IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3; IgM; IgD; IgE; IgA; IgM; fragmento Fab; fragmento F(ab')2; fragmento scFv; fragmento Fv; un diacuerpo; anticuerpo lineal; anticuerpo monocatenario; anticuerpo biespecífico; anticuerpo quimérico o anticuerpo multiespecífico.
  3. 4.
    El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, estando el 15 anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado.
  4. 5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, estando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo conjugado con un agente citotóxico.
  5. 6.
    El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5, en el que el agente citotóxico se selecciona del grupo constituido por: monometilauristatina-E o un análogo funcional de la misma, monometilauristatina-F o 20 un análogo funcional de la misma, aplidina, azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicina, bortezomib, briostatina-1, busulfán, caliqueamicina, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucilo, cisplatino, irinotecán (CPT-I 1), SN-38, carboplatino, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, daunomicina glucurónido, daunorrubicina, dexametasona, dietilestilbestrol, doxorrubicina, doxorrubicina glucurónido, epirrubicina glucurónido, etinilestradiol, 25 estramustina, etopósido, etopósido glucurónido, etopósido fosfato, floxuridina (FUdR), 3',5'-O-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, fluorouracilo, fluoximesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, L-asparaginasa, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalán, mercaptopurina, 6mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomicina, mitotano, fenil butirato, prednisona,
    30 procarbazina, paclitaxel, pentostatina, PSI-341, semustina estreptozocina, tamoxifeno, taxanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, tenipósido, topotecán, mostaza de uracilo, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricina, abrina, ribonucleasa, onconasa, rapLRl, DNasa I, enterotoxina A de Staphylococcus, proteína antivírica de la hierba carmín, gelonina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas o combinaciones de los mismos.
    35 7. Una composición para usar en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer relacionado con MN, opcionalmente cuando el cáncer es un tumor de, o que se origina en, mama, tracto respiratorio, pulmón, cerebro, órganos reproductores, tracto digestivo, colon, tracto urinario, riñón, esófago, cuello uterino, ojo, hígado, piel, cabeza, cuelo, tiroides y paratiroides, comprendiendo la composición un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un agente anti-canceroso.
    40 8. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el agente anti-canceroso se selecciona del grupo constituido por bleomicina, docetaxel (Taxotere), doxorrubicina, edatrexato, erlotinib (Tarceva), etopósido, finasterida (Proscar), flutamida (Eulexin), gemcitabina (Gemzar), genitinib (Iresa), acetato de goserelina (Zoladex), granisetrón (Kytril), imatinib (Gleevec), irinotecán (Campto/Camptosar), ondansetrón (Zofran), paclitaxel (Taxol), pegaspargasa (Oncaspar), pilocarpina clorhidrato (Salagen), porfímero sódico
    45 (Photofrin), interleucina-2 (Proleukin), rituximab (Rituxan), topotecán (Hycamtin), trastuzumab (Herceptin), Triapine, vincristina, tartrato de vinorelbina (Navelbine), angiostatina, bevacizumab (Avastin®), sorafenib (Nexavar®), baculostatina, canstatina, maspina, anticuerpos o péptidos anti-VEGF, anticuerpos o péptidos anti-factor de crecimiento placentario, anticuerpos anti-Flk-1, anticuerpos o péptidos anti-Fit-1, péptidos de laminina, péptidos de fibronectina, inhibidores del activador de plasminógeno, inhibidores de la
    50 metaloproteinasa tisular, interferones, interleucina 12, IP-IO, Gro-β, trombospondina, 2-metoxiestradiol, proteína relacionada con la proliferina, carboxiamidotriazol, CM101, Marimastat, polisulfato de pentosán, angiopoyetina 2, interferón alfa, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina 16K, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteína, TNP-470, endostatina, paclitaxel, acutina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor plaquetario 4 y minociclina.
    55 9. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  6. 10. Un anticuerpo IgG anti-MN codificado por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 153.
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Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI1545613T1 (sl) 2002-07-31 2011-11-30 Seattle Genetics Inc Avristatinski konjugati in njihova uporaba za zdravljenje raka avtoimunske bolezni ali infekcijskebolezni
US7498298B2 (en) 2003-11-06 2009-03-03 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
NZ583318A (en) 2007-07-16 2012-07-27 Genentech Inc Humanized anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
DK2474557T3 (da) 2007-07-16 2014-11-10 Genentech Inc Anti-CD79b-antistoffer og immunkonjugater og fremgangsmåder til anvendelse
TWI489993B (zh) 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
SG187517A1 (en) 2008-01-31 2013-02-28 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
CN103002911B (zh) 2008-09-26 2015-08-26 昂考梅德药品有限公司 卷曲蛋白结合药剂及其应用
US20140024050A1 (en) * 2009-03-10 2014-01-23 Abbott Laboratories Antibodies which detect pivkaii and methods of use thereof
EP2406284B9 (en) * 2009-03-10 2017-03-01 Biogen MA Inc. Anti-bcma antibodies
US8389689B2 (en) 2009-10-28 2013-03-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-GLP-1R antibodies and their uses
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
JP2011206049A (ja) 2010-03-08 2011-10-20 Sumio Sugano 壊死マーカー及びその用途
CA2794674A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
KR102023496B1 (ko) 2011-04-21 2019-09-20 시애틀 지네틱스, 인크. 신규 결합제-약물 콘주게이트 (adc) 및 그의 용도
AU2012351685A1 (en) 2011-12-14 2014-07-03 Seattle Genetics, Inc. FGFR antibody drug conjugates (ADCs) and the use thereof
PE20150159A1 (es) 2011-12-21 2015-02-08 Novartis Ag Composiciones y metodos para anticuerpos que actuan sobre el factor p
JP2016510411A (ja) 2013-02-04 2016-04-07 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｗｎｔ経路インヒビターによる処置の方法およびモニタリング
US8975290B2 (en) * 2013-03-01 2015-03-10 Colorado State University Research Foundation Methods and compositions for enhancing an immune response, blocking monocyte migration, amplifying vaccine immunity and inhibiting tumor growth and metastasis
CA2922439A1 (en) * 2013-08-29 2015-03-05 University Of Copenhagen Anti-adam12 antibodies for the treatment of cancer
PL3086814T3 (pl) 2013-12-23 2020-12-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Koniugaty środka wiążącego (ADC) z inhibitorami KSP
PT3262071T (pt) 2014-09-23 2020-06-16 H Hoffnabb La Roche Ag Métodos de utilização de imunoconjugados anti-cd79b
CN107635586B (zh) 2014-12-15 2021-09-24 拜耳医药股份有限公司 Ksp抑制剂与无糖基化抗-tweakr抗体的抗体-药物缀合物(adc)
RU2751512C2 (ru) 2015-06-22 2021-07-14 Байер Фарма Акциенгезельшафт Конъюгаты антитела и лекарственного средства (adc) и конъюгаты антитела и пролекарства (apdc), содержащие ферментативно расщепляемые группы
US11071788B2 (en) 2015-06-23 2021-07-27 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (KSP) inhibitors with antiB7H3-antibodies
WO2016207094A1 (de) 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-tweakr-antikörpern
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
AU2017236431A1 (en) 2016-03-24 2018-09-27 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
WO2017216028A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
JP7030811B2 (ja) 2016-12-21 2022-03-07 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤を有する特異的抗体－薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
CA3047491A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
JP7066714B2 (ja) 2016-12-21 2022-05-13 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト 酵素的に切断可能な基を有する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
JP2021512103A (ja) 2018-01-31 2021-05-13 バイエル アクチェンゲゼルシャフトＢａｙｅｒ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｎａｍｐｔ阻害剤を含む抗体薬物複合体（ａｄｃｓ）
JP2021527640A (ja) 2018-06-18 2021-10-14 バイエル アクチェンゲゼルシャフトＢａｙｅｒ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 酵素的に切断可能なリンカーおよび改善された活性プロファイルを有する、ｃｘｃｒ５に対して向けられるバインダー／活性薬剤複合体
BR112021007448A2 (pt) 2018-11-14 2021-10-26 Bayer Aktiengesellschaft Combinação farmacêutica de anticorpos anti-ceacam6 e anti-pd-1 ou anti-pd-l1 para o tratamento de câncer
JP7521163B2 (ja) 2018-12-19 2024-07-24 ドイチェス クレープスフォルシュングスツェントルム シュティフトゥング デス エッフェントリッヒェン レヒツ 抗ｃｅａｃａｍ６及びｔｉｍ３抗体の医薬組み合わせ
WO2021013693A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (adcs) with nampt inhibitors
AU2021205893A1 (en) 2020-01-08 2022-06-23 Synthis Therapeutics, Inc. ALK5 inhibitor conjugates and uses thereof
WO2021193928A1 (ja) * 2020-03-27 2021-09-30 株式会社ＰｈｏｔｏＱ３ 腫瘍細胞を死滅させるための医薬
IL299827B1 (en) 2020-07-15 2026-04-01 Cerebral Therapeutics Inc A medical system that includes two access ports
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
CN113281513B (zh) * 2021-05-17 2024-05-28 上海执诚生物科技有限公司 一种mmp-3试剂盒及其制备方法和应用
US12605537B2 (en) 2022-02-15 2026-04-21 Biogen Ma Inc. Implantable medical device for use with or having recording electrode
TW202434305A (zh) 2022-11-17 2024-09-01 德商溫瑟克斯製藥公司 於腫瘤微環境中可裂解之抗體-藥物結合物
CN116444653B (zh) * 2023-03-09 2024-03-15 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一株阻断性非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用
CN121712526A (zh) 2023-06-13 2026-03-20 辛瑟斯治疗股份有限公司 抗cd5抗体及其用途
AU2024339683A1 (en) 2023-09-13 2026-03-26 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating, preventing and/or diagnosing cancer
CN118063606B (zh) * 2024-04-24 2024-07-05 江西赛基生物技术有限公司 一种抗thsd7a单克隆抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564830A (en) 1896-07-28 Sprocket-chain and wheel
US1399790A (en) 1919-09-25 1921-12-13 James J Phillips Winding means for spring-motors
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
CH652145A5 (de) 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4454106A (en) 1982-06-07 1984-06-12 Gansow Otto A Use of metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4831175A (en) 1986-09-05 1989-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
US4745181A (en) 1986-10-06 1988-05-17 Ciba Corning Diagnostics Corp. Polysubstituted aryl acridinium esters
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU667460B2 (en) 1990-10-05 1996-03-28 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
EP0557300B1 (en) 1990-10-29 1997-11-19 Chiron Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
US5773280A (en) 1992-03-20 1998-06-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Monoclonal antibody to a human MDR1 multidrug resistance gene product, and uses
IE921342A1 (en) 1991-04-26 1992-11-04 Surface Active Ltd Novel antibodies, and methods for their use
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5407653A (en) 1991-06-26 1995-04-18 Brigham And Women's Hospital Evaluation of the multidrug resistance phenotype
DE69232137T2 (de) 1991-11-25 2002-05-29 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP1306095A3 (en) 1992-03-05 2003-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5981711A (en) * 1992-03-11 1999-11-09 Institute Of Virology, Slovak Academy Of Sciences MN-specific antibodies and hybridomas
US5387676A (en) 1992-03-11 1995-02-07 Ciba Corning Diagnostics Corp. MN gene and protein
US6297041B1 (en) 1992-03-11 2001-10-02 Institute Of Virology, Slovak Academy Of Sciences MN gene and protein
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
US5395752A (en) 1993-03-19 1995-03-07 Ciba Corning Diagnostics Corp. Long emission wavelength chemiluminescent compounds and their use in test assays
JP3659261B2 (ja) 1994-10-20 2005-06-15 モルフォシス・アクチェンゲゼルシャフト 組換体タンパク質の多機能性複合体への標的化ヘテロ結合
AU725609C (en) 1995-08-18 2002-01-03 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
US6696248B1 (en) 1995-08-18 2004-02-24 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
SK40599A3 (en) 1996-09-26 2000-06-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody against human parathormone related peptides
SE9700384D0 (sv) 1997-02-04 1997-02-04 Biacore Ab Analytical method and apparatus
WO1998051329A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cachexia remedy
CA2297070A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
DK1030839T3 (da) 1997-11-10 2004-05-03 Searle & Co Anvendelse af alkylerede iminosukkere til behandling af multidrugresistens
US6200814B1 (en) 1998-01-20 2001-03-13 Biacore Ab Method and device for laminar flow on a sensing surface
US6696550B2 (en) 1998-07-23 2004-02-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
ATE482275T1 (de) 1999-07-02 2010-10-15 Morphosys Ag Erzeugung spezifischer bindungspartner die an von genomischen dns-fragmenten oder ests kodierten (poly)peptiden binden
ES2327382T3 (es) 1999-07-20 2009-10-29 Morphosys Ag Metodos para presentar (poli)peptidos/proteinas en particulas de bacteriofagos a traves de enlaces disulfuro.
IT1307309B1 (it) 1999-12-30 2001-10-30 Enea Ente Nuove Tec Peptidi stabilizzanti, polipeptidi ed anticorpi che li comprendono.
MXPA03006992A (es) * 2001-02-07 2003-11-18 Wilex Ag Linea de celulas hibridoma g250 y su uso para la produccion de anticuerpos monoclonales.
GB0124317D0 (en) 2001-10-10 2001-11-28 Celltech R&D Ltd Biological products
AR036833A1 (es) * 2001-10-18 2004-10-06 Bayer Corp Anticuerpos humanos que se unen a mn y tienen actividad neutralizante de la adhesion celular.
AU2002351208A1 (en) * 2001-12-03 2003-06-17 Abgenix, Inc. Antibodies against carbonic anhydrase IX (CA IX) tumor antigen
DE60225593T2 (de) 2001-12-21 2009-04-16 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Immobilisierung von bindungsstoffen
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
AU2003223186A1 (en) * 2002-05-23 2004-01-23 Bayer Healthcare SOLUBLE FORM OF CARBONIC ANHYDRASE IX (s-CA IX), ASSAYS TO DETECT s-CA IX AND CA IX's COEXPRESSION WITH HER-2/neu/c-erbB-2
US20040126379A1 (en) 2002-08-21 2004-07-01 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
EP1576010A4 (en) * 2002-08-23 2006-12-27 Chiron Corp THERAPEUTIC COMPOSITIONS AND METHODS FOR CANCER CHARACTERIZED BY EXPRESSION OF MN / CA IX ANTIGEN ASSOCIATED WITH TUMORS
JP2004170195A (ja) 2002-11-19 2004-06-17 Reverse Proteomics Research Institute Co Ltd タンパク質の固定化方法
CN102558352A (zh) * 2003-06-27 2012-07-11 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
CN1281753C (zh) * 2003-12-08 2006-10-25 陈志南 抗人大肠癌单克隆抗体CAb—1轻、重链可变区基因及其应用
SE0303319D0 (sv) 2003-12-10 2003-12-10 Biacore Ab Sample flow positioning method and analytical system using the method
EP1766398B1 (en) 2004-06-24 2011-01-05 GE Healthcare Bio-Sciences AB Method for detecting molecular surface interactions
SE0402476D0 (sv) 2004-10-13 2004-10-13 Biacore Ab Preparation and use of a reactive solid support surface

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