BRPI0619656A2

BRPI0619656A2 - método para isolar um clone de célula única derivada de um cámbio vegetal, clone resultante, método de produção de substáncias vegetais biologicamente ativas e método de preservação de uma linha de célula vegetal

Info

Publication number: BRPI0619656A2
Application number: BRPI0619656-0A
Authority: BR
Inventors: Young Woo Jin
Original assignee: Unhwa
Priority date: 2005-10-31
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2011-10-11
Also published as: US20080194025A1; WO2007052876A1; CA2627533C; AU2006309568B2; KR20110004922A; KR101064519B1; RU2398874C2; JP2009513157A; AU2006309568A1; EP2386626A1; JP5211296B2; EP2386626B1; EP1951863B1; CN101297028A; KR20080029971A; US20110033903A1; CA2627533A1; BRPI0619656C1; JP6026209B2; EP1951863A1

Abstract

MéTODO PARA ISOLAR UM CLONE DE CéLULA úNICA DERIVADA DE UM CáMBIO VEGETAL, CLONE RESULTANTE, MéTODO DE PRODUçãO DE SUBSTáNCIAS VEGETAIS BIOLOGICAMENTE ATIVAS E MéTODO DE PRESERVAçãO DE UMA LINHA DE CéLULA VEGETAL. Método para minimizar a variação da produção e crescimento de células através do desenvolvimento de uma linha de células homogêneas. Para ser mais especifico, é o método de isolamento e proliferação de um cione de célula única a partir do câmbio para promover a estabilidade da produção de substâncias biologicamente ativas derivadas de vegetais, resolvendo os problemas de diminuição da produtividade e crescimento de células durante cultura de longo prazo.

Description

MÉTODO PARA ISOLAR OM CLONE DE CÉLULA UNICA DERIVADA DE UM CÂMBIO VEGETAL, CLONE RESULTANTE, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS VEGETAIS BIOLOGICAMENTE ATIVAS E MÉTODO DE PRESERVAÇÃO DE UMA LINHA DE CÉLULA VEGETAL

Campo Técnico

Os vegetais têm sido utilizados de forma muito importante não somente como o fornecimento de nossos alimentos, mas também como a fonte de uma ampla gama de substâncias químicas, incluindo produtos farmacêuticos, fragrâncias, cores, produtos químicos agrícolas e corantes etc. Os compostos biologicamente ativos produzidos a partir de vegetais são em sua maioria metabolitos secundários. Existe maior interesse nos metabolitos secundários, como alcalóide, alergene, aminoácido, antraquinona, agente antileucêmico, agente antimicrobiano, agente antitumoral, agente antiviral, enzima, flavonóides, inseticida, opiato, perfume, pigmento, vitamina, e polissacarídeo etc., pois a maioria funciona como substâncias fisiologicamente ativas. De acordo com Zhong (2002), existem aproximadamente 100.000 metabolitos vegetais secundários conhecidos e mais dé 25% dos medicamentos utilizados na prática são substâncias derivadas de vegetais. A cada ano, descobrem-se novos metabolitos secundários continuamente.

No método para a obtenção destes metabolitos, existem muitos problemas como síntese química difícil apesar dos recentes desenvolvimentos surpreendentes da química orgânica, demolição da natureza devido à exploração e poluição ambiental e mudanças do teor de metabolitos e aumento no custo de produção dependendo das condições de cultura, como estação, região e clima. Portanto, existem tentavas ativas em andamento para produzir metabolitos secundários através da técnica de cultura in vitro que tem as vantagens de controlar as apropriadas condições ambientais externas e produzir em larga escala mesmo em um espaço pequeno.

ANTECEDENTES

De acordo com a patente KR0130100, a produção de substâncias biologicamente ativas através da cultura de células vegetais tem mais vantagens do que a extração direta, da planta. Considera-se a cultura de células vegetais um ótimo método para a produção contínua não influenciada pelo ambiente e para a resolução de problemas pendentes como a destruição da ecologia.

Nail & Roberts (2004), contudo, indicaram um índice de crescimento lento e baixa produtividade da cultura de células vegetais referente à produção de metabolitos secundários. Para resolver este problema, existem estudos sobre a otimização do meio, condições de cultura, processo e elicitação para uma maior produtividade etc. (Zhong 2002). Na patente Internacional WO93/17121, utilizaram-se vários meios para a cultura de diversos Taxus a fim de aumentar o índice de crescimento das células e produtividade do paclitaxel. Com base nos resultados das experiências, condições de elicitação para a produção em massa de paclitaxel foi indicado. Apesar das melhoras na produção de valiosos metabolitos secundários, variabilidade ainda é um dos problemas mais importantes da produção de paclitaxel a partir do Taxus e outras valiosas substâncias derivadas de numerosos sistemas vegetais.

A produção de metabolitos secundários através de cultura de células vegetais em larga escala somente é comercialmente possível quando existe uma manutenção estável de crescimento rápido das células e elevada produção de metabolitos durante culturas de longo prazo. A capacidade das linhas de células produzirem metabolitos distintos não estáveis faz que as linhas de células percam sua produtividade inicial através de subculturas; não é exagero dizer que sucesso e fracasso dependem de como superamos esses problemas.

Na cultura de células vegetais, embora as células derivem de uma planta, a produtividade de metabolitos de cada linha de células é diferente e instável. Portanto, estabelecer as linhas de células que tenham elevada produtividade e estabilidade genética é mais importante do qualquer outra coisa. Linhas de células derivadas de células únicas e células múltiplas

As linhas de células vegetais derivadas de células únicas possuem menor variabilidade do que as linhas de células derivadas de células múltiplas; isto resulta em maior produtividade. Em invenções precedentes, utilizaram-se hastes, raízes, sementes, agulhas e folhas como os melhores explantes para a indução de linhas de células. Essas hastes, raízes, sementes, agulhas e folha são tecidos compostos de células com morfologia e funções distintas. Calo, linhas de células derivadas desses tecidos não é de um só tipo. Portanto, existem limitações nas tentativas para reduzir a variação de produtividade dos calos derivados dos tecidos que consistem de células múltiplas.

Agregação de células

Uma das características diferenciais da cultura de células vegetais é a agregação de células. De acordo com a patente 0364478, o diâmetro da célula vegetal é 30-300 μm que é aproximadamente 30 vezes maior do que a célula animal. Devido à tendência natural das paredes das células vegetais se aderirem umas às outras, não é possível obter uma suspensão que somente consiste de células únicas dispersas. A proporção e o tamanho dos agregados de células variem de acordo com a variedade do vegetal e o meio em que se realiza a cultura. Nail & Roberts indicaram que a agregação de células leva a uma diferença em ambiente local entre interior e exterior das células, que pode resultar em heterogeneidade de cultura e em última instância leva a mudanças no crescimento e metabolismo.

A finalidade da cultura em suspensão é a obtenção de células únicas puras. Para atingir este objetivo, utilizaram-se filtragem, maceração e cultura de protoplastos empregando enzima. Contudo, filtragem e maceração não propiciam células únicas puras completas. A técnica de cultura de protoplastos que elimina a parede celular é o método mais confiável para a geração de células únicas, mas a enzima utilizada para a cultura de protoplastos causa rompimentos ou danos à parede celular que resultam na mudança de fisiologia das células. Além disso, é possível armazenar metabolitos secundários hidrofóbicos, como paclitaxel, na parede celular, de modo que as mudanças na parede celular têm uma profunda relação com a produtividade.

Também, a agregação de células há muito tempo tem sido um dos principais obstáculos referente à medição precisa do crescimento celular em números e a ensaios bioquímicos de células individuais. De acordo com Nail & Roberts (2004), se a cultura de uma célula única for possível, fornecerá prontamente informações mais rápidas sobre o comportamento de unidades celulares na cultura como biossíntese, armazenagem, e degradação etc. de metabolitos secundários. Desdxferenciação

A linha de células desdiferenciadas, que é um calo, apresenta grande variabilidade na produção de metabolitos secundários devido à variação somaclonal. Calos derivados dos tecidos permanentes, como folhas, hastes, raízes e sementes, compostos das células com morfologia e funções distintas normalmente apresentam mudanças dramáticas mesmo em microambientes ligeiramente diferentes porque se trata de um meristema secundário formado através de desdiferenciação. Devido a essa sensibilidade, Hirasuna et al.(1996) investigaram para identificar as condições de cultura celular, especialmente da densidade inicial das células, temperatura e intervalo das subculturas, para mantê- las o mais precisas possível.

Escalonamento

A fim de produzir metabolitos secundários através da cultura de células vegetais para comercialização, o escalonamento é essencial. Aplicou-se um biorreator para produção em massa após a publicação de várias patentes e artigos, relatando a produção bem sucedida de metabolitos através da cultura de células em escala laboratorial. De acordo com a patente 0290004, a aplicação de um biorreator para produção em massa propicia um ambiente de cultura muito diferente do balão de vidro em escala laboratorial que resulta na diminuição do índice de crescimento e produtividade e na mudança nos metabolitos. Quando se aplica o biorreator para produção em massa, mudanças no índice de crescimento, produtividade e metabolitos tornaram-se problemas na comercialização de substâncias biologicamente ativas através da cultura de células. No escalonamento de cultura de células vegetais, recomenda-se o biorreator que recebe o ar através de energia externa ou o biorreator com agitador, considerando a eficiência de agitação e aeração.

Contudo, a viabilidade das células diminui abruptamente no biorreator porque células vegetais são fracas para cisalhamento. Portanto, é necessário um método para reduzir o cisalhamento. A causa da sensitividade ao cisalhamento da célula vegetal explica-se por seu grande tamanho, parede celular rígida, agregação e muito vacuolada (Yokoi, et al, 1993). Para resolver esses problemas no biorreator, pesquisou-se um biorreator que gerasse baixo cisalhamento no passado, controlando sua velocidade de agitação e modificando o tipo de agitador. Contudo, ainda traz resultados negativos, porque as linhas de células não puderam superar as diferenças do microambiente.

Criopreservação

A criopreservação permite a manutenção de células durante um longo período, suspendendo a maioria do metabolismo das células na temperatura extremamente baixa. Significa a recuperação das células sem variação genética, de características e biossintética após criopreservação. Ao utilizar criopreservação, seria possível eliminar a perda de células por contaminações e minimizar a variação genética nas linhas de células continuas. Em cGMP, a preservação das linhas de células por um longo período é obrigatório para o fornecimento estável das matérias-primas. Normalmente, a células animais cultivadas poderiam passar por criopreservação durante vários anos, mas a técnica de criopreservação semelhante é muito mais desafiadora para células vegetais cultivadas. As células vegetais cultivadas são heterogêneas e apresentam diversidade na fisiologia e morfologia. Portanto, células vegetais em suspensão requerem muitos processos para criopreservação e criopreservação inadequada poderia causar variabilidade.

Fatores de condicionamento

Kim et al. (2000) demonstraram que é possível estimular a divisão de células se algum meio proveniente de culturas ativamente divisíveis fosse acrescentado às culturas que perderam a capacidade de dividir as células. Na produção de antocianina através da cultura em suspensão de rosas, a produtividade aumentou quando se acrescentou algum meio de cultura em suspensão de morango à cultura em suspensão de rosas. Assim, os fatores que foram produzidos e expelidos das células cultivadas para estimular o crescimento celular ou a produção dos metabolitos secundários denominam-se fatores de condicionamento. Porém, esses fatores de condicionamento não foram identificados concretamente e apenas existe alguma compreensão de fatores de condicionamento agindo como sinais químicos referentes ao crescimento das células e à produção de metabolitos. Também, existem poucos relatos sobre as substâncias potentes, como fosfatos e calmódio, que poderiam ser considerados fatores de condicionamento. É possível fornecer fatores de condicionamento através de meio condicionado ou células auxiliares.

Cultivo por Perfusão

Entre os métodos de cultura de células, existe um cultivo por lote envolvendo a inoculação conjunta da célula e o meio no começo e mais nenhum suplemento nutricional. Também, existe um cultivo contínuo, envolvendo o suplemento do novo meio à medida que o meio gasto, contendo metabolitos, é retirado simultaneamente a uma velocidade consistente durante o período de cultura para prevenir depleção nutricional.

0 cultivo por lote é difícil no nível comercial devido a sua baixa produtividade. Entre os métodos de cultura contínua, atualmente o cultivo por perfusão está atraindo muita atenção. Na cultura por perfusão, as células permanecem no biorreator, e fornece-se um novo meio à medida que o meio gasto, contendo metabolitos, é retirado simultaneamente.

De acordo com Zhang et al. (2000), elicitação é uma das maneiras mais eficientes de promover a produção de metabolitos secundários na cultura de células. A elicitação estimula a síntese de metabolitos secundários, mas induz a inibição do crescimento celular e a rápida diminuição na viabilidade das células. Portanto, a síntese de metabolitos secundários por elicitação poderia manter-se apenas por um curto período e é muito limitada. Como Wang et al. (2001) apresentaram, o cultivo por perfusão é uma estratégia para minimizar esses efeitos negativos por elicitação e maximizar a produtividade.

Wang et al. (2001) e Wu & Lin(2003) relataram o seguinte. Os metabolitos secundários, produzidos por elicitação, armazenam-se dentro da célula (vacúolo ou parede celular) ou liberados fora da célula (meio). Durante o processo de cultura, liberar os metabolitos secundários da célula e realizar sua remoção do meio poderia resultar em uma purificação mais fácil e poderia diminuir a provocação de inibição de biossíntese e degradação e conversão dos produtos.

Portanto, ao remover o meio gasto e fornecendo um novo meio, a secreção de metabolitos internos e externos poderia estender a viabilidade e biossíntese das células. E poderia aumentar notavelmente a produtividade.

A armazenagem e a secreção de metabolitos secundários apresentaram grandes diferenças dependendo das linhas de células. A linha de células de Taxus media (Wickremesinhe e Arteca 1994) não excretou nenhum.

Conseqüentemente, é necessário estabelecer a linha de células que possua uma extraordinária capacidade de secreção. Cultura de câmbio

0 câmbio é um meristema lateral localizado no lado lateral da planta. Nas plantas gimnosperma e dicotiledônea lenhosa, existe um crescimento hipertrófico devido à atividade continua do câmbio; como resultado, existem plantas gigantes com mais de 11.000 anos dos anéis de crescimento. Em genética, poderiam classificar-se os meristemas como meristema primário e secundário. O meristema primário representa o meristema que se forma durante embriogênese e participa no crescimento da planta após a germinação da semente. O meristema secundário representa o meristema formado por desdiferenciação do tecido permanente da planta. O câmbio é um meristema primário com continuidade meristemática derivada do câmbio sem a intervenção do permanente.

O crescimento desse meristema primário é indeterminado e poderia ser continuo em certas condições. Portanto, utilizou-se a cultura do câmbio para a rápida propagação em massa das células.

Nos estudos anteriores, prepararam-se explantes de câmbio como segue: após se remover a casca,

fizeram-se dois cortes longitudinais, aproximadamente 1 mm de profundidade a fim de atingir o xilema, na haste lenhosa a um

intervalo de 5 mm. Denominam esses explantes 'câmbio', constituído de parte do floema, câmbio e uma pequena lasca de xilema (Jouira et al., 1998).

Pode afirmar-se sem receio que as células induzidas pelo método acima descrito não são a única origem de câmbio, mas de múltiplos tecidos, que se podem distinguir anatomicamente como floema, câmbio e xilema. Portanto, poderíamos indicar que o método acima mencionado não é a técnica ideal para separar apenas o câmbio elaboradamente dos vários tecidos que constituem as hastes. Tem-se procurado um método criativo para separar apenas o câmbio dos vários tecidos das hastes.

DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO

O Problema Técnico

O objetivo desta invenção é gerar o método para produzir um clone de célula única separando e cultivando apenas o câmbio a partir de um galho ou haste. Em outras palavras, o alvo desta invenção é resolver a variação na cultura de células vegetais e gerar um método de produção estável para substâncias vegetais biologicamente ativas, separando o câmbio puramente através da combinação dos métodos de separação química fisiológica e celular com o método anterior de separação física que utiliza o bisturi.

Outra finalidade desta invenção é separar e cultivar apenas o câmbio a partir do galho de Taxus e gerar o método de produção de paclitaxel. Solução Técnica

Para atingir os objetivos acima, em um aspecto, a presente invenção fornece um método para a isolação do clone de célula única derivada do câmbio vegetal, sendo o método seguinte: (a) preparação e, a seguir, esterilização do tecido vegetal; (b) coleta do tecido contendo câmbio proveniente do mencionado tecido vegetal esterilizado; (c) cultivar o mencionado tecido contendo câmbio e, induzindo, assim, uma camada de câmbio proliferada a partir de câmbio, e uma camada de calos derivada de regiões salvo o câmbio e proliferada em um formato irregular; e (d) coletar o clone de célula única, isolando a mencionada camada de câmbio da mencionada camada de calos.

De preferência, a etapa (c) compreende a cultura do mencionado tecido em um meio contendo auxina. E em uma concretização recomendada, o meio contém l~3mg/L da auxina.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um clone de célula única induzido a partir de câmbio vegetal, o clone de célula única possui as seguintes características: (a) acima de 90% de células em cultura em suspensão existem na forma de células únicas; (b) tendo vacúolos múltiplos morfologicamente; (c) crescendo mais rapidamente do que a linha de células derivada de regiões salvo o câmbio da mesma origem vegetal, e cultivando de modo estável por um longo período; (d) tendo baixa sensibilidade à tensão de cisalhamento no biorreator; e (e) sendo indiferenciado de forma inata.

De preferência, o vegetal é a espécie Taxus. E em uma concretização recomendada, o clone de célula única derivada do câmbio da espécie Taxus tem a capacidade de liberar paclitaxel 404-1077 vezes mais do que as linhas de células derivadas de regiões salvo o câmbio da mesma origem vegetal.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de substâncias biologicamente ativas derivadas de vegetais, o método compreendendo as etapas de: (a) produção das substâncias ativas cultivando o acima mencionado clone de célula única; e (b) coleta das mencionadas substâncias ativas. De preferência a cultura da etapa (a) compreende a remoção do meio utilizado na cultura do mencionado clone de célula única e, a seguir, o fornecimento de um novo meio.

Em uma concretização recomendada, o clone de célula única é o clone de célula única derivada do câmbio da espécie Taxus, e o composto é paclitaxel. Neste caso, o meio também pode conter um ou mais materiais selecionados a partir do grupo consistindo de metil jasmonato, quitosana e fenilalanina.

A presente adição à invenção fornece ainda um método para a preservação de uma linha de células vegetais, o método compreende a criopreservação do clone de células únicas derivadas do câmbio vegetal, que são isoladas através do método acima.

Sobre os Efeitos Vantajosos

De acordo com os métodos desta invenção, é possível cultivar um clone de célula única que possua a continuidade meristemática do meristema primário sem passar pela desdiferenciação ao separar precisamente apenas o câmbio a partir de vários tecidos de galhos ou hastes lenhosas. A linha de células desta invenção permite a produção estável de substâncias biologicamente ativas devido a uma menor mudança no índice de crescimento das células e ao padrão de crescimento durante a cultura de longo prazo. Também é ótimo para a produção em massa a nível comercial por causa de sua menor sensibilidade ao cisalhamento no biorreator em comparação com as linhas de células derivadas das técnicas anteriores devido à menor agregação e múltiplos vacúolos.

É possível estimular a ativação dos metabolitos suplementando os fatores de condicionamento a esta linha de células e pode estender-se a vitalidade e biossíntese das células à medida que as células liberarem uma quantidade significativa de produção no meio extracelular através de cultura por perfusão. Um elevado índice de recuperação após a criopreservação devido à capacidade de divisão e homogeneidade desta linha de células propicia o estabelecimento de um banco de células. Através desta invenção, foi confirmada uma relação estreita entre a homogeneidade das culturas e a variação dos metabolitos secundários; e o método desta invenção poderia desenvolver a estratégia para comercialização, pois controla e reduz a variabilidade de produção de diversas substâncias biologicamente ativas.

Descrição das Figuras

A Figura 1 é a parte separada durante a indução de um clone de célula única a partir do câmbio. A parte (A) representa uma macrografia da haste depois de 30 dias de cultura - o câmbio (flecha) está separado pelas células de calo derivadas do tecido consistindo de floema, cortex e epiderme. A parte (B) representa o clone de célula única derivada de câmbio após 35 dias de cultura. A parte (C) representa o calo derivado de tecido consistindo de floema, cortex e epiderme após 40 dias de cultura. A parte (D) representa o calo derivado de câmbio e agulha depois de 50 dias de cultura.

A Figura 2 mostra a taxa de crescimento expressa pela produção de biomassa total de três diferentes culturas de células derivadas do câmbio, embrião e agulha em 6 meses. O intervalo da subcultura variou entre 21 dias.

A Figura 3 é a imagem de agregação de células das culturas derivadas de dois tecidos diferentes (embrião ou agulha e câmbio). O tipo de célula agrega duas diferentes culturas de células T. cuspidata derivadas do embrião ou agulha (A, C) e câmbio (B, D). Legenda: A= agregado de células grandes, maiores que 1,5 χ IO2 μm.

B= população de células únicas e D= célula apresentando alta densidade de vacúolos.

A Figura 4 mostra o efeito da elicidação na produção de paclitaxel durante a cultura em suspensão de Taxus. Legenda: C = controle; Chi = 50 mg/L quitosana; Phe = 0,1 mM feilamina; MJ = 100 μπι metil jasmonato; Com = culturas combinadas elicitadas (50 mg/L quitosana, 0,1 mM feilamina e 100 μπι metil jasmonato)

A Figura 5 mostra o efeito de fatores de condicionamento na produção de paclitaxel durante a cultura em suspensão de Taxus. Elicidores (50 mg/L Chitosan, 0,1 mM Feilamina e 100 pm Metil Jasmonato) foram incorporados em culturas de 14 dias.

Realizações Preferenciais da Invenção

A seguir, apresentam-se exemplos práticos da invenção. O método de indução e proliferação de clone de célula única a partir do câmbio não é apenas utilizado no sistema de produção de paclitaxel, mas também pode ser utilizados em todo sistema de produção de metabolitos secundários vegetais. Os seguintes exemplos são oferecidos a titulo ilustrativo, não como limitação.

<Exemplo prático 1> Preparação de materiais vegetais e isolação de câmbio Colheram-se semente, agulha, galho do teixo. Após a colheita dos materiais, os mesmos foram depositados na solução de lOOmg/L de antioxidante, ácido ascórbico (L-ácido ascórbico, DUCHEFA, Holanda) imediatamente e transferidos e preservados. Sua superfície foi esterilizada considerando as características morfológicas e fisiológicas dos materiais.

Semente: Após esterilizar as sementes com etanol de 70% por um minuto, foram submersas em uma solução de Clorox 1% por 48 horas e lavadas de 3 a 4 times com água estéril. A seguir, separou-se o embrião da semente na solução de 0,5% PVP (poliviniIpirrolidona, DUCHEFA, Holanda) e 50mg/L de ácido ascórbico (L-ácido ascórbico, DUCHEFA, Holanda) , e 70mg/L de ácido cítrico (DUCHEFA, Holanda) e cultivado no meio de indução de calo.

(D Agulha e galho: Após 24 horas de tratamento com a solução contendo 1% Benomil (Dongbu Hannong Chemical, Coréia) + 1% Daconil (Dongbu Hannong Chemical, Coréia) + 1% sulfato de estreptomicina (DUCHEFA, Holanda) + 0,1% Cefotaxima sódica (DUCHEFA, Holanda), enxaguaram-se as agulhas e galhos com água corrente por 30 segundos para remover o restante das substâncias químicas e compostos fenólicos. Após os esterilizar com 70% etanol (DC Chemical, Coréia) por um minuto, 30% peróxido de hidrogênio (LG Chemical, Coréia) por 15 minutos, solução de 1% CLOROX por 15 minutos, solução de 3% CLOROX por 5 minutos em ordem, foram lavados 3 a 4 vezes com água destilada. Para prevenir a oxidação, as duas extremidades da agulha foram cortadas na solução de 0,5% PVP, 50mg/L ácido ascórbico e 70mg/L ácido citrico e cultivados no meio de indução de calo.

(2) Preparação de câmbio a partir do galho ou haste: Retendo o xilema que é a região central do galho ou haste com as pinças, descascaram-se tecidos da epiderme e córtex e floema, incluindo o câmbio. Colocaram-se esses tecidos descascados, contendo câmbio, sobre o meio; permitiu- se que o câmbio tocasse a superfície do meio.

<Exemplo prático 2> Indução de clone de célula única a partir do câmbio isolado

Após o 4o ao 1° dia da cultura, observou-se a divisão de células do câmbio e no 15° dia da cultura, o calo começou a formar-se a partir da camada consistindo do floema e córtex e epiderme que eram a parte superior do câmbio. No 30° dia da cultura, o câmbio começou a separar-se do tecido da camada superior que continha o floema e córtex e epiderme; após essas duas camada serem separada total e naturalmente, foram cultivadas individualmente em diferentes placas de petri (Figura 1).

Para a finalidade de indução de células e calos, universalmente conhecidos como meio da cultura de tecidos e células vegetais poderiam utilizar-se: p.ex. mB5 (meio modificado do B5 de Gamberg) , MS (meio de Murashige & Skoog), WPM (Lloyed & McCown), SM (meio de schenk & Hildebrand), LP (Quoirin & Lepiovre). A aplicação de todos esses meios é possível. Poderiam suplementar-se vários aditivos e poderiam reduzir-se ou eliminar-se componentes do meio, conforme a necessidade. Entre eles, o meio mais adequado foi mB5. Os conteúdos de mB5 estão descritos na seguinte Tabela 1.

Tabela 1 - Meio de manutenção e indução de linhas de células em Taxus spp.

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Cultivaram-se as culturas no meio suplementado com um regulador de crescimento vegetal, auxina (l-3mg/L) no escuro a 25+l°C.

O câmbio estava composto de células homogêneas, portanto, sua divisão de células foi uniforme e a proliferação aconteceu na forma de um prato. Por outro lado, o tecido contendo o floema e córtex e epiderme proliferou de forma irregular porque existia (uma discrepância de divisão de células devido à composição de muitos tipos de células. Houve uma auto-separação da camada entre o câmbio e o tecido contendo floema e córtex e epiderme (Figura 1). O câmbio era homogêneo e o tecido, contendo floema e córtex e epiderme, era heterogêneo, então a auto-separação da camada parecia ser o resulto de diferentes taxas de divisão.

Após o 15° dia da cultura, formaram-se calos nos explantes de embrião e agulha compostos de células heterogêneas por diferenciação e esses calos proliferaram em formas irregulares devido à diferente taxa de divisão de várias células semelhante ao tecido contendo floema e córtex e epiderme. (Figura 1)

<Exemplo prático 3> Estabelecimento de cultura de longo prazo

Entre os calos, partes brancas e friáveis com bom índice de crescimento foram subcultivadas em um novo meio a cada 21 dias. O índice de crescimento das culturas derivadas de embrião e agulha era muito instável e às vezes apresentavam a tendência de tornarem-se marrão. Pelo contrário, o índice de crescimento das culturas derivadas de câmbio era rápido e não havia nenhuma mudança de cor das culturas. Portanto, foi possível selecionar as células estáveis.

Após seis meses da cultura, a maioria das culturas derivadas de embrião e agulha culturas tinham um cor amarela ou marrão claro e formação de agregação. As culturas derivadas de câmbio tinham uma cor branca amarelada e mantinham-se como células únicas ou pequenos agrupamentos de células. O índice de crescimento das culturas que viraram marrões e formaram agregação diminuiu e, eventualmente as culturas morreram por causa da substância química fenol que excretavam.

De acordo com este inventor, a manutenção e proliferação em massa das culturas derivadas de embrião e agulha tornaram-se difíceis após 6 meses, mas as culturas derivadas de câmbio mantinham-se estáveis por mais de 20 meses da cultura de longo prazo sem nenhuma variação no índice de crescimento das células, padrão de crescimento e nível de agregação (Figura 2). Em outras palavras, a variabilidade aparecia no padrão de crescimento, dependendo da homogeneidade e heterogeneidade dos materiais vegetais iniciais.

<Exemplo prático 4> Estabelecimento da cultura em suspensão células

As culturas derivadas de embrião e agulha e as culturas derivadas de câmbio foram cultivadas individualmente no balão de vidro contendo o meio líquido (Tabela 2).

Tabela 2

Tabela 2 - Meio de suspensão em Taxus ssp

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Cultivaram-se no agitador giratório de 100 rpm no escuro a 25±1°C. Com as duas semanas de intervalo de subculturas, permitiu-se que as culturas mantivessem um contínua alta vitalidade como fases exponencial de crescimento.

Mediu-se o nível de agregação que á a principal causa da variação da produtividade de células.

Mediu-se a quantificação do agregado celular com o microscópio biológico (CX31, Olympus, Japão). 0 resultado da experiência descrita acima está na Tabela 3.

Tabela 3

Tabela 3-0 tipo de agregados de células de culturas de longo prazo de Taxus

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Agregados de células grandes, tamanho maior do que 1,5 χ 103pm;

Agregados de células moderadas, 1 χ 103μm;

Agregados de células pequenas, 4 χ IO2 < tamanho < 1 x 103μm;

No caso de suspensão das culturas derivadas de embrião e agulha, aproximadamente 60% tinham tamanho de agregação maior do que 1.5 mm, porém na suspensão das culturas derivadas de câmbio, 90% das células foi cultivado como células únicas. <Exemplo prático 5> Escalonamento

As culturas derivadas de embrião e agulha foram cultivadas em um biorreator de circulação de ar de 3L (Sung-Won SciTech, Coréia) no escuro a 25±1C°.

No caso das culturas derivadas de embrião e agulha, houve grande variabilidade no tamanho e formato das células em comparação com a cultura em balão de vidro. O diâmetro da agregação de células cresceu até 2-3 mm, o que inibiu o fluxo dentro do biorreator e desenvolveu uma região não-misturada no biorreator. O anel de crescimento formado pelas células aderindo à parede interna do biorreator. As células no centro do anel de crescimento morreram após 20 dias, porque não se forneceu o meio de maneira eficiente. Eventualmente, as células mortas excretaram substâncias tóxicas e essas substâncias diminuíram a vitalidade de todas as células no biorreator. Por outro lado, a menor agregação das culturas derivadas de câmbio causou uma circulação de ar suave no biorreator; assim foi possível diminuir a quantidade de fornecimento de ar de 200 ml a 150 ml por minuto e a quantidade de bolhas desenvolvidas na superfície do meio reduziu-se bastante.

0 tempo de duplicação nas culturas derivadas de embrião e agulha no balão de vidro era de 12 dias, mas foi prolongado para 21 dias no biorreator. Por causa da formação do anel de crescimento e rápida diminuição da viabilidade das células devido à sensitividade ao cisalhamento pela agregação de células e parede celular rígida. O tempo de duplicação das culturas derivadas de câmbio era de 4 a 5 dias e não houve nenhuma diferença no balão de vidro e no biorreator, ao contrário foi encurtado no biorreator (Tabela 4). As culturas derivadas de câmbio formaram um anel de crescimento muito pequeno no biorreator e o anel de crescimento foi facilmente dissolvido agitando o meio com um simples estímulo. Ainda mais, não houve nenhuma diminuição na viabilidade das células devido à menor sensitividade ao cisalhamento pela agregação de células e múltiplos vacúolos.

Tabela 4

Tabela 4 - Relação entre padrões de tempo de duplicação e fonte de explantes em culturas de células de T. cuspidata em balão de vidro e biorreator

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<Exemplo prático 6> Elicidor

O elicidor controla o sinal molecular nas células vegetais e é amplamente utilizado para o aumento da produtividade metabolitos secundários. Após o tratamento com metil jasmonato como um elicidor e 10 outros tipos de elicidores, observamos que o metil jasmonato tinha um efeito positivo na produção de paclitaxel. Foi possível obter uma produtividade relativamente elevada de metabolitos através da combinação de metil jasmonato e outros elicidores. Especialmente, a produção de paclitaxel foi muito eficiente com os tratamentos de metil jasmonato, quitosana e fenilalanina (Figura 4).

<Exemplo prático 7> Fatores de condicionamento

Produzem-se os metabolitos secundários derivados de vegetais quando as células estão crescendo ou quando as células pararam de crescer. Portanto, culturas de duas fases são adequadas para a produção de metabolitos como paclitaxel cuja fase de crescimento de células e fase de produção de metabolitos são separadas. Na primeira fase, proliferaram-se células em larga escala, otimizando o crescimento das células e, na segunda fase, mudaram-se a condição de cultura pela otimização da produção de metabolitos.

As linhas de células com produtividade elevada de metabolitos secundários crescem mais lentamente e morrem mais rapidamente do que as linhas de células com baixa produtividade. Portanto, proliferação em massa é difícil e produção em massa dos metabolitos é impossível.

Nesta invenção, as linhas de células com a capacidade de baixa proliferação e elevada produção não foram utilizadas para a proliferação em grande escala, pelo contrário foram utilizadas como células auxiliares que possuem fatores de condicionamento para a produção de metabolitos secundários. Observamos a produção de paclitaxel após acrescentar as células auxiliares. Os resultados estão resumidos na figura 5.

<Exemplo prático 8> Cultura por Perfusão

No 14° dia de cultura, o elicidor foi tratado às culturas derivadas de embrião e agulha e derivadas de câmbio. A partir do ponto de elicitação, retirou-se o meio gasto em uma condição asséptica com pipeta a cada 5 dias e era fornecido com a mesma quantidade de meio novo simultaneamente. Após 4 5 dias da cultura de longo prazo, observaram-se a produção de paclitaxel na célula e o meio. 0 resultado foi resumido na Tabela 5.

Tabela 5

Tabela 5 - Produção de paclitaxel e liberação de células de T. cuspidata. em várias fontes de explantes e processos

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Dependendo das linhas de células, a liberação de paclitaxel da célula para o meio foi diferente. A capacidade de liberação das culturas derivadas de câmbio foi superior às culturas das técnicas anteriores. Além disso, a aplicação de cultura por perfusão facilitou liberação de metabolitos secundários ao meio. O aperfeiçoamento na liberação extracelular de metabolitos secundários através de clone de célula única derivado de câmbio trocando o meio periodicamente teve grande importância porque permitiu continua reciclagem da biomassa e purificação simples.

Em outras palavras, a troca periódica do meio na cultura de clone de célula única derivado de câmbio pode considerar-se um método estável de produzir valiosos metabolitos na cultura de longo prazo, porque previne a inibição de retroalimentação dos metabolitos acumulados na célula, degradação e conversão dos metabolitos no meio.

<Exemplo prático 9> Criopreservação No 6° ou 1° dia da cultura, células em suspensão forame precultivadas no meio contendo 0.16 M de manitol por 3 dias a temperatura ambiente e, a seguir, mantidas a 4°C por 3 horas. As células foram colhidas e colocadas em 4 ml de criovial que tinha o meio contendo 40% de etileno glicol (Sigma, EUA) e 30% de sorbitol (DUCHEFA,

Holanda) e cultivadas por 3 minutos a 4°C.

Células em suspensão tratadas com criopreservativos foram congeladas após as células permanecerem de molho em nitrogênio liquido. Para descongelamento, as células cultivadas no nitrogênio liquido por mais de 10 minutos foram descongeladas no banho de água de 40°C por 1-2 minutos. Para o re-crescimento das células, transferiram-se as células cryopreservadas para o meio de crescimento semi-sólido (Tabela 1) contendo 0,5 M sorbitol e aliviadas a temperatura ambiente por 30 minutos. Cultivaram- se as células no meio de crescimento semi-sólido contendo 0,1 M sorbitol crescimento meio por 24 horas. E então, cultivaram-se as células no meio de crescimento semi-sólido sem sorbitol por 24 horas, duas vezes. Avaliou-se a viabilidade das células.

<Exemplo prático 10> Análise do teor de paclitaxel

Após separar as células do meio das amostras recuperadas, analisaram-se os teores de paclitaxel. A massa das células foi medida após secar totalmente as células com um dissecador a vácuo (Sam Shin Glass, Coréia). Misturaram-se aproximadamente IOOmg (peso seco) das células com 4 ml de solução (1:1 v/v) de metanol (Sigma, EUA) e metil cloreto (Sigma, EUA) e foram extraídas através de um limpador ultra- sônico (Branson, EUA) por 3 vezes com intervalo de uma hora a temperatura ambiente. As células foram totalmente secas e extraídas várias vezes utilizando 4ml de metil cloreto. Uma camada de solvente orgânico foi seca a vácuo e o restante dissolvido em 1 ml de metanol. Do mesmo modo, o extrato dissolvido foi agitado por um limpador ultra-sônico. Então, após a centrifugação, removeu-se o tablete (8.000gX5 min).

O meio (l-5ml) separado da célula foi combinado com o mesmo volume de metil cloreto e foi extraído 3 vezes após agitações completas. Após o solvente orgânico ser aspirado a vácuo e totalmente seco, foi mais uma vez dissolvido em 0,5ml de metanol.

Utilizou-se HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance, Shiseido, Japão) para a análise do teor e produtos Sigma como substâncias de paclitaxel padrão. Manteve-se Capcell pak (C18, MGIIf 5um, 3f0mmX250mm, Shiseido,

Japão) a 40°C utilizando um forno, e combinaram-se água e acetonitrilo (Burdick & Jackson, EUA) (50:50, v/v) para a fase móvel e pingados regularmente com a velocidade de 0,5ml/min. Utilizou-se um detector UV-VIS (227nm, Shiseido, Japão). Aplicabilidade Industrial

Nesta invenção, adquirir um clone de célula única, um meristema primário que possui a continuidade meristemática sem desdiferenciação, separando câmbio puramente do galho ou haste resultou em maior produtividade devido à duplicação de tempo mais curto do que as linhas de células de técnicas anteriores. Também permitiu produtividade estável devido à menor mudança no crescimento de células e padrão de crescimento durante a cultura de longo prazo e escalamento foi possível por causa da menor agregação e múltiplos vacúolos das linhas de células. Essas linhas de células permitiram recuperação após criopreservação sem nenhuma variação genética.

Referências

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Claims

1. Método para isolar um clone de célula única derivada de um câmbio vegetal caracterizado por: a) Preparar e então esterilizar o tecido vegetal b) Coletar o tecido contendo câmbio de dito tecido vegetal, esterilizado. c) Fazer a cultura de dito tecido contendo câmbio e nele induzindo uma^ camada de câmbio proliferada do câmbio e uma camada de calo dejrivada de regiões exceto o câmbio, proliferada de forma irregular; e d) Coletar o clone da célula única isolando a dita camada de câmbio da dita camada de calo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o passo C compreender fazer a cultura de dito tecido em um meio contendo auxina.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o meio contém de 1 a 3mg/L de auxina.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a planta é do gênero Taxus.

5. Clone celular único derivado de câmbio vegetal, caracterizado por ter a seguintes características: a) Mais do que 90% das células na cultura em suspensão existem como células únicas. b) Têm múltiplos vacúolos morfologicamente. c) Crescem mais rapidamente que a linha de células derivadas de regiões que não o câmbio da mesma origem vegetal e fazem uma cultura estável por um longo tempo. d) Têm uma baixa sensitividade a tensão de cisalhamento. e) São não diferenciadas de forma inata.

6. Clone celular único de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do vegetal ser do gênero Taxus.

7. Clone celular único de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o clone celular único derivado do câmbio do gênero Taxus tem a capacidade de produzir paclitaxel 270-720 vezes mais do que as linhas de células derivadas de regiões exceto o câmbio para a mesma origem vegetal.

8. Método de produção de substâncias vegetais biologicamente ativas, caracterizado por compreender os passos de: (a) produzir as substâncias ativas da cultura do clone de célula única da reivindicação 5; e (b) coletar ditas substâncias ativas.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cultura do passo (a) compreende recuperar o meio utilizado na cultura do dito clone celular único e então proporcionar um novo meio.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o clone celular único é o clone celular único derivado do câmbio do gênero Taxus.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o clone celular único derivado do câmbio do gênero Taxus é produzido no meio contendo um ou mais materiais selecionados do grupo consistindo de metiljasmonato, fenilalanina, e quitosana.

12. Método de preservação de uma linha de célula vegetal caracterizado por compreender crio preservação de um clone de célula simples derivada de câmbio vegetal, isolada pelo método de qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.