BRPI0619688A2 - anticorpo anti-neuropilina-1 e uso do anticorpo anti-neuropilina-1 - Google Patents

Abstract

ANTICORPO ANTI-NEUROPILINA-1 E USO DO ANTICORPO ANTI-NEUROPILINA-1. A presente invenção refere-se a novos anticorpos anti-NRP1 e variantes destes, que possuem estrutura e características funcionais exclusivas. Também são fornecidos os usos dos anticorpos na pesquisa, diagnóstico e aplicações terapêuticas.

Description

"ANTICORPO ANTI-NEUROPILINA-1 E USO DO ANTICORPO ANTI- NEUROPILINA-1"

Este é um pedido não provisório reivindicando prioridade sob 35 USC 119(e) para os pedidos provisórios 60/734798, depositado em 8 e novembro de 2005 e 60/820561, depositado em 27 de julho de 2006, cujos conteúdos são integralmente incorporados ao presente como referência.

Campo Da Invenção

A presente invenção se refere geralmente às composições e métodos associados com as atividades da neuropilina (NRP). Mais particularmente, a invenção se refere a composições e métodos para modular a formação vascular e manutenção mediada pelo receptor neuropilina-1 (NRP1). A invenção também se relaciona aos métodos para a seleção de substâncias terapeuticamente úteis para prevenir ou tratar condições e doenças associadas com a angiogênese.

Antecedentes Da Invenção

O desenvolvimento de um sistema vascular é uma necessidade fundamental para muitos processos fisiológicos e patológicos. O crescimento ativo dos tecidos, tais como embriões e tumores exige suprimento adequado de sangue. Eles satisfazem esta necessidade produzindo fatores pró-angiogênese que promovem formação e manutenção de novos vasos sangüíneos via um processo geralmente referido como angiogênese. A formação vascular é um evento complexo, mas biologicamente ordenado que envolve todas ou muitas das seguintes etapas: a) Células endoteliais (ECs) se proliferam a partir de ECs existentes ou diferenciadas a partir de células progenitoras; b) ECs migram e se juntam para formar estruturas similares a um cordão; c) os cordões vasculares então se submetem à tubulogênese para formar vasos com um lúmen central d) os cordões ou vasos existentes enviam brotos para formar vasos secundários; e) o plexo vascular primitivo se submete também à reconstrução e transformação; e f) células periendoteliais são recrutadas para revestir os tubos endoteliais, fornecendo manutenção e funções de modulação para os vasos; tais células incluindo, pericitos para capilares pequenos, células musculares lisas para vasos maiores e células do miocárdio no coração. Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997); Hogan1 B. L. & Kolodziej1 P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002); Lubarsky1 B. & Krasnow, M. A. Cell. 112:19-28 (2003).

É agora bem estabelecido que a angiogênese está envolvida na patogênese de uma variedade de disfunções. Isto inclui tumores sólidos e metástases, arteriosclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica, doenças neovasculares intraoculares tal como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD)1 glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido da córnea transplantado e outros tecidos, artrite reumatóide e psoríase. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); e Garner A., "Vascular diseases", Em: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner 35 A., Klintworth GK1 eds., 2a Edição (Mareei Dekker, NY1 1994), páginas 1625-1710.

No caso de crescimento tumoral, a angiogênese parece ser crucial para a transição da hiperplasia para neoplasia, e para fornecer alimento para o crescimento e metástase do tumor. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). A neovascularização permite que as células tumorais adquiram uma vantagem no crescimento e autonomia proliferativa comparado às células normais. Um tumor usualmente se inicia como uma simples aberração celular que pode proliferar somente para um tamanho de poucos milímetros cúbicos devido à distância dos leitos capilares disponíveis, e pode ficar "dormente" sem crescimento adicional e disseminação por um longo período de tempo. Algumas células tumorais então trocam para o fenótipo angiogênico para ativar células endoteliais, que proliferam e amadurecem no interior dos capilares sangüíneos. Esses novos vasos sangüíneos formados não somente permitem o crescimento continuado do tumor primário, como também a disseminação e recolonização de células tumorais metastáticas. Conseqüentemente foi observada uma correlação entre a densidade dos microvasos nas seções de tumor e sobrevivência dos pacientes no câncer de mama, como também em diversos outros tumores. Weidner et al., N. Engl. J. Med 324:16 (1991); Horak et at., Lancet 340:1120-1124 (1992); Macchiarini et at., Lancet 340:145-146 (1992). O mecanismo preciso que controla a troca para angiogênese não é bem conhecido, mas acredita-se que a neovascularização da massa tumoral resulte da rede equilibrada de uma grande quantidade de estimuladores e inibidores da angiogênese (Folkman, 1995, Nat Med 1 (1):27-31).

O processo de desenvolvimento vascular é estreitamente regulado. Até hoje, um número significante de moléculas, a maioria de fatores secretados produzidos por células adjacentes, mostraram regular a diferenciação EC1 proliferação, migração e união das estruturas similares a cordões. Por exemplo, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi identificado como o fator chave envolvido no estímulo da angiogênese e na indução da permeabilidade vascular. Ferrara et at., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). A descoberta de que a perda de até mesmo um único alelo VEGF resulta na Ietalidade embrionária aponta para um papel insubstituível desempenhado por este fator no desenvolvimento e diferenciação do sistema vascular. Além disso, VEGF mostrou ser um mediador chave de neovascularização associada com tumores e disfunções intra-oculares. Ferrara et al., Endocr. Rev. acima. O mRNA de VEGF é superexpressado pela maioria dos tumores humanos examinados. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-159 (1993); Brown et at., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et at., CancerRes. 53:4727-4735 (1993); Mattern et at., Brit. J. Câncer 73:931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995).

Além disso, os níveis de concentração de VEGF nos fluidos oculares estão altamente correlacionados com a presença da proliferação ativa dos vasos sangüíneos em pacientes com diabetes e outras retinopatias relacionadas à isquemia. Aiello et at., N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994). Além disso, estudos demonstraram a localização do VEGF nas membranas neovasculares coroidais em pacientes afetados por AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-868 (1996).

Anticorpos que neutralizam anti-VEGF suprimem o crescimento de uma variedade de linhagens celulares tumorais humanas em camundongos nus (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstrom et al., CancerRes. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al., Câncer Res. 56:921-924 (1996)) e também inibem a angiogênese intra-ocular em modelos de disfunções isquêmicas da retina. Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996). Então, anticorpos monoclonais anti-VEGF ou outros Inihidares da ação de VEGF são candidatos promissores para o tratamento de tumores e várias disfunções neovasculares intra-ocular. Tais anticorpos estão descritos, por exemplo, na Patente EP 817.648 publicada em 14 de janeiro de 1998; e no documento W098/45331 e documento W098/45332, ambos publicados em 15 de outubro de 1998. Um dos anticorpos anti-VEGF, bevacizumab, foi aprovado pelo FDA para uso em combinação com um regime de quimioterapia para tratar câncer colorretal metastático (CRC) e câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC). E bevacizumab está sendo investigado em muitos testes clínicos em andamento para tratar vários indícios de câncer.

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, os neurônios enviam axônios similares a cabos que migram por longas distâncias com o objetivo de alcançar seus alvos. Ver revisão por Carmeliet e Tessier-Lavigne (2005) Nature 436:193-200. Na extremidade principal de um axônio em crescimento está uma estrutura sensorial, altamente móvel chamada cone de crescimento. Por meio de ciclos dinâmicos de extensão e retração das extensões filopodiais, o cone de crescimento continuamente percebe e estima a partir de uma miríade de pistas guias no seu meio espacial, e seleciona perfeitamente uma trilha correta para extensão em direção ao seu alvo final. Na última década, foram feitos progressos consideráveis no entendimento do mecanismo guia do axônio. Ver revisão por Dickson (2002) Science 298:1959-64. Pistas guias chegam em quatro variedades: atraentes e repelentes; que podem agir tanto em curta distância (isto é, associada à célula ou matriz) ou em longa distância (isto é, dispersável). Até agora, quatro famílias principais de moléculas guias de axônio foram identificadas: as netrinas, semaforinas, epinefrinas e fendas. Ver revisão por Huber et al (2003) Annu Rev Neurosci 26:509-63.

As semaforinas (Sema), também chamadas de colapsinas, pertencem a uma ampla família de proteínas secretadas filogeneticamente conservadas sssocisdas à rnsmbrana. Membros da farníü?. d?>s spmafnrinas são caoazes de mediar tanto eventos repulsivos de guia de axônio como atrativos durante o desenvolvimento neural. Raper (2000) Cun~ Opin Neurobiol 10:88-94. Mais de trinta semaforinas identificadas até agora compartilham um domínio Sema N-terminal de aproximadamente 500 aminoácidos. Membros semaforinas são classificados em oito subfamílias dependendo de suas similaridades estruturais e espécies de origem. Para mais detalhes sobre a nomenclatura unificada para semaforinas, ver Comitê de Nomenclatura de Semaforinas (1999) Cell 97:551-552.

A família neuropilina (NRP) compreende duas proteínas homólogas, neuropilina-1 (NRP1) e neuropilina-2 (NRP2). NRP1 foi identificada pela primeira vez como uma glicoproteína de transmembrana tipo I de 130-kDa expressa nos cones de crescimento dos axônios em crescimento. NRP2 foi subseqüentemente identificada por clonagem de expressão. Fujisawa e Kitsukawa (1998) CurrOpin Neurobiol 8:587-592. Descobriu-se que NRPs são receptores para um subconjunto de semaforinas, a classe 3 de semaforinas. Foi sugerido que NRPs funcionem como co-receptores de não sinalização junto com outra família de receptor semaforina, as plexinas.

Embora inicialmente descrito como um mediador guia de axônio, descobriu-se também que as NRPs desempenham um papel importante no desenvolvimento vascular. Carmeliet e Tessier-Lavigne (2005). Esta é identificada como uma isoforma específica de receptor VEGF, expressa em tumores e células endoteliais, sugerindo esforços consideráveis para entender o papel das NRPs na biologia vascular e tumoral. Soker et al (1998) Cell 92:735-745; Klagsbrun et al (2002) Adv Exp Med Biol 515:33-48. Estudos genéticos forneceram forte evidência de que Nrpl é necessário para a morfogênese vascular. A perda da função de Nrpl resulta na reconstrução e ramificação defeituosa, um fenótipo que pode ainda ser aumentado pela perda da função de Nrp2. Kawasaki et al. (1999) Development 126:4895-4902; Takashima et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:3657-3662. Estes resultados sugererr, que r.c inísis dc desenvolvimento Nrp l e Nrp2 nadem fpr funções sobrepostas. No entanto, a expressão de cada Nrp é depois separada no desenvolvimento, com Nrpl sendo expressa inicialmente nas artérias, e Nrp2 nas veias e vasos linfáticos. Yuan et al (2002) Development 129:47974806; Herzog et al. (2001) Mech Dev 109:115-119. De forma notável, a perda da função Nrp2 sozinha, especificamente prejudica o desenvolvimento linfático.

Como Nrp 1 é expresso em muitos outros tipos celulares durante o desenvolvimento, o papel de NRP1 vascular foi endereçado por meio da geração de um knock-out específico de EC, que resultou em defeitos vasculares similares àqueles vistos no alelo null. Gu et al. (2003) Dev Cell 5:45-57. De maneira interessante, este estudo também mostrou que Sema3A que se liga a NRP1 não é necessária para o desenvolvimento vascular. Em outro estudo, foram observados defeitos no guia de células de extremidade endoteliais no desenvolvimento do metencéfalo em embriões Nrpl KO Gerhardt et al. (2004) Dev Dyn 231:503-509.

Apesar de estudos extensivos no papel de NRP1 no desenvolvimento vascular, permanece duvidoso como NRP1 exerce sua função vascular exclusivamente pela via VEGF-VEGF Receptor 2 (VEGFR2), como um enhancer para ligação de VEGF a VEGFR2 e então para sinalização VEGFR2, ou por uma via de sinalização independente de VEGFR2, ou uma combinação de ambos.

Anticorpos monoclonais podem ser fabricados usando-se tecnologia de DNA recombinante. Foi feito uso freqüente de anticorpos monoclonais, especificamente aqueles derivados de roedores, no entanto anticorpos não humanos são freqüentemente antigênicos em humanos. A técnica tentou superar este problema pela construção de anticorpos "quiméricos" nos quais um domínio de ligação de antígeno não humano é acoplado a um domínio constante humano (Cabilly et al., Patente US. 4.816.567). O isotipo do domínio constante humano pode ser selecionado para fazer o anticorpo quimerico para participacao na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento. Em um esforço para solucionar as funções de ligação de antígeno dos anticorpos e para minimizar o uso de seqüências heterólogas nos anticorpos humanos, anticorpos humanizados foram gerados para vários antígenos, nos quais substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído nas regiões pela seqüência correspondente a partir de uma espécie não humana. Por exemplo, resíduos de roedores foram substituídos por segmentos correspondentes de um anticorpo humano. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da região determinante de complementaridade (CDR) e possivelmente alguns resíduos da região de estrutura (FR) são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. Jones etal. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann etal. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen etal. (1988) Science239:1534-1536.

Antes de administrar um anticorpo terapêutico a um humano, estudos pré-clinicos nos mamíferos não humanos são geralmente desejados para avaliar a eficácia e/ou toxicidade do anticorpo. De forma ideal, os anticorpos sujeitos a estes estudos são capazes de reconhecer e reagir com alta potência com antígenos endógenos alvo do animal hospedeiro, tal como um camundongo ou primata não humano.

A tecnologia de exposição por fago forneceu uma ferramenta poderosa para gerar e selecionar novas proteínas que se ligam a um ligante, tal como um antígeno. Usando-se a técnica de exposição por fago, amplas bibliotecas de variantes de proteína podem ser geradas e rapidamente classificadas para aquelas seqüências que se ligam a uma antígeno alvo com alta afinidade. Ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos variantes são unidos a uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína de revestimento viral, tal como a proteína gene III ou a proteína gene VIII. Foram desenvolvidos sistemas de exposição por fago monovalente onde a seqüência de áduu nüciéicü que codifica a proteína cl; polipsptídic-é unida a urna seqüência de ácido nucléico que codifica uma porção da proteína gene III (Bass, S. (1990) Pmteins 8:309; Lowman e Wells (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3:205). Em um sistema de exposição por fago monovalente, a fusão do gene é expressa em baixos níveis e as proteínas gene III tipo selvagem são também expressas de forma que a possibilidade de contaminação das partículas é retida. Métodos para gerar bibliotecas de polipeptídios e selecionar essas bibliotecas foram divulgados em muitas patentes (por exemplo, Patente US 5.723.286, Patente US 5.432.018, Patente US 5.580.717, Patente US 5.427.908 e Patente US 5.498.530).

A demonstração da expressão de peptídeos na superfície de fagos filamentosos e a expressão de fragmentos de anticorpos funcionais no periplasma de E. coli foi importante no desenvolvimento das bibliotecas de exposição por fago de anticorpo. (Smith et al. (1985) Science 228:1315; Skerra e Pluckthun (1988) Science 240:1038). Bibliotecas de anticorpos ou polipeptídeos de ligação de antígeno foram preparados de diversas maneiras pela alteração de um único gene pela inserção de seqüências aleatórias de DNA ou pela clonagem de uma família de genes relacionados. Métodos para exibição de anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno usando-se exibição por fago foram descritos nas Patentes US 5.750.373, US 5.733.743, US 5.837.242, US 5.969.108, US 6.172.197, US 5.580.717 e US 5.658.727. A biblioteca é então selecionada para expressão de proteínas de ligação de anticorpos ou antígeno com características desejadas.

A tecnologia de exibição por fago tem diversas vantagens sobre hibridoma convencional e métodos recombinantes para preparação de anticorpos com as características desejadas. Esta tecnologia permite o desenvolvimento de amplas bibliotecas de anticorpos com diversas seqüências em menor tempo e sem o uso de animais. A preparação de hibridomas ou preparação de anticorpos humanizados pode exigir facilmente diversos meses de preparacao. Alem disso, ja que nenhuma imunizacao e exigida, bibliotecas de anticorpo em fago podem ser geradas por antígenos que são tóxicos ou que têm baixa antigenicidade (Hogenboom (1988) Immunotechniques 4:1-20). Bibliotecas de anticorpo em fago podem também ser usadas para gerar e identificar novos anticorpos terapêuticos.

Bibliotecas de exibição por fago foram usadas para gerar anticorpos humanos a partir de seqüências de linhagem germe, humanas não imunizadas, imunizadas ou repertórios de Ig de célula virgem (Barbas & Burton (1996) Trends Biotech 14:230; Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13:3245; Vaughan et al. (1996) Nat Biotech. 14:309; Winter Patente EP 0368 684 B 1). Bibliotecas de ligação de antígeno virgens ou não imunes foram geradas usando-se uma variedade de tecidos linfóides. Algumas destas bibliotecas estão disponíveis comercialmente, tais como aquelas desenvolvidas por Cambridge Antibody Technology and Morphosys (Vaughan et al.(1996) Nature Biotech 14:309; Knappik et al. (1999) J. Moi Biol. 296:57). No entanto, muitas destas bibliotecas têm diversidade limitada.

A habilidade para identificar anticorpos de alta afinidade isolados a partir de uma biblioteca de fago é importante no isolamento de novos anticorpos para uso terapêutico. O isolamento de anticorpos de alta afinidade a partir de uma biblioteca é dependente do tamanho da biblioteca, da eficiência de produção em células bacterianas e da diversidade da biblioteca. Ver, por exemplo, Knappik et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57. O tamanho da biblioteca é diminuído pela ineficiência de produção devido ao dobramento impróprio da proteína de ligação de anticorpo ou antígeno e pela presença de códons stop. A expressão em células bacterianas pode ser inibida se o domínio de ligação de antígeno ou anticorpo não for propriamente dobrado. A expressão pode ser melhorada pela mutação de resíduos um após o outro na superfície da interface variável/constante, ou dos resíduos CDR selecionados. (Deng et al. (1994) J. Bioi. Chem. 269:9533, Uirich ei ai: (1335) FNA3, 32:11307-11311; Forsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:12430). A seqüência da região de estrutura é um fator para o fornecimento de dobramento apropriado quando as bibliotecas de anticorpo em fago são produzidas em células bacterianas.

A geração de uma biblioteca diversa de proteínas de ligação de anticorpos ou antígeno é também importante para o isolamento de anticorpos de alta afinidade. Bibliotecas com diversificação em CDRs limitadas foram geradas usando-se uma variedade de abordagens. Ver, por exemplo, Tomlinson (2000) Nature Biotech. 18:989-994. Regiões CDR3 são de interesse, em parte porque descobriu-se que elas freqüentemente participam na ligação de antígeno. Regiões CDR3 na cadeia pesada variam muito de tamanho, seqüência e conformação da estrutura.

Gerou-se também diversidade por regiões CDR aleatórias das cadeias variáveis pesada e leve usando-se todos os 20 aminoácidos em cada posição. Acreditou-se que o uso de todos os 20 aminoácidos resultaria em ampla diversidade de seqüências de anticorpos variantes e chance aumentada de identificação de novos anticorpos. (Barbas (1994) PNAS 91:3809; Yelton1 DE (1995) J. Immunology 155:1994; Jackson, J.R. (1995) J. Immunology 154:3310 e Hawkins, RE (1992) J. Mol. Biology 226:889). Descrição Resumida Da Invenção

A presente invenção fornece novos anticorpos anti-NRP1 capazes de modular pelo menos uma atividade biológica mediada por neuropilina. Preferivelmente, os anticorpos anti-NRP1 são anticorpos antagonistas capazes de inibir pelo menos uma atividade biológica mediada por neuropilina. Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos de geração de anticorpos anti-NRP1 a partir de uma biblioteca projetada de fago de anticorpo sintético humano, e nova função que bloqueia anticorpos anti-NRP1 gerados a partir desta. Os anticorpos anti-NRP1 da invenção caem dentro de duas classes, dependendo de onde eles se ligam em NRPI: anticorpos anti-NRP 1a (incluindo YVYS4.3 e variantes deste) são aqueles que se ligam aos domínios CUB (ala2) de NRP1; e anticorpos anti-NRP1B (incluindo YW107.4 e variantes destes) são aqueles que se ligam aos domínios do fator de coagulação V/VIII domains (blb2) deNRPI.

Em um aspecto, os anticorpos anti- NRP1A da invenção podem ser selecionados a partir de clones do anticorpo "YW64" como mostrado na Tabela III, que possui as seqüências CDR parciais e afinidades de ligação identificadas para o NRPIs murino e humano. O anticorpo anti-NRP1Ada invenção preferivelmente compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as seguintes seqüências CDR de aminoácidos: CDRL1 (RASQSISSYLA; SEQ ID NO:123), CDRL2 (GASSRAS; SEQ ID NO:124) e CDRL3 (QQYMSVPIT; SEQ ID NO: 125). Por exemplo, o anticorpo anti-NRP1A compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO:3. O anticorpo anti-NRP1A da invenção preferivelmente compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende as seguintes seqüências CDR de aminoácidos: CDRH1 (GFSFSSEPIS; SEQ ID NO: 126), CDRH2 (SSITGKNGYTYYADSVKG; SEQ ID NO: 127) e CDRH3 (WGKKVYGMDV; SEQ ID NO: 128). Por exemplo, o anticorpo anti-NRP1A compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-NRP1A da invenção é o anticorpo YW64.3 que compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO:3 e uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO.4.

Em outro aspecto, os anticorpos anti- NRP1B da invenção podem ser selecionados a partir de clones do anticorpo "YW107.4" como mostrado na Tabela IV, que possui as seqüências CDR parciais e afinidades de ligação identificadas para o Nrp1s murino e humano. O anticorpo anti-NRP1B da invenção preferivelmente compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as seguintes seqüências CDR de aminoácidos: CDRL1 (RÂSQYFSSYLA, SEQ ID NO: 12S), CDRL2 (GASSRAS; SEQ ID NO: 130) e CDRL3 (QQYLGSPPT; SEQ ID NO:131). Por exemplo, o anticorpo anti-NRP1B compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO:5. O anticorpo anti-NRP1B da invenção preferivelmente compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende as seguintes seqüências CDR de aminoácidos: CDRH1 (GFTFSSYAMS; SEQ ID NO:132), CDRH2 (SQISPAGGYTNYADSVKG; SEQ ID NO: 133) e CDRH3 (ELPYYRMSKVMDV; SEQ ID NO: 134). Por exemplo, o anticorpo anti-NRP1B compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:6. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-NRP1B da invenção é o anticorpo YW107.4.87 que compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO:5 e uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:6.

São também fornecidos pela presente invenção usos de anticorpos anti-NRP1 para tratar angiogênese associada à disfunções como câncer. Em uma realização preferida, os anticorpos anti-NRP1 da invenção são usados em combinação com um anticorpo anti-VEGF. Preferivelmente, o anticorpo anti-VEGF é capaz de se ligar ao mesmo epítopo VEGF da mesma forma que o anticorpo A4.6.1. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-VEGF é bevacizumab ou ranibizumab. Breve Descrição Das Figuras

Figura 1 ilustra as especificidades de ligação dos anticorpos anti-NRP1. (1A) Anticorpos anti-NRP1 se ligam especificamente ao NRP1 humano e murino. Especificidade de ligação de anticorpos anti-NRP1 YW64.3 e YW107.4 IgGs (10 ug/ml) foram avaliadas por teste de ligação aos poços revestidos por hNrpl, mNrp1, hNRP2, mNRP2, ErbB2-ECD, o BSA1 e IgGs ligados foram foram detectados pelos conjugados IgG HRP anti-humanos (anti-human IgG HRP). (1B) Análise FACS de anticorpos IgGs anti-NRP1 YW64.3 e YW107.4 mostrando capacidade de ligação do anticorpo à superfície celular da proteína NRP1 (HUVECs).

Figura 2 ilustra propriedades dc ligação do anticorpo gnti-MRPi YW107.4 e sua afinidade YW107.4.87 (anti- NRP1B). (2A) Análise cinética BIAcore do variante de afinidade madura YW107.4.87. (2B) Análise FACS de IgGs YW107.4 e YW107.4.87 mostrando capacidade de ligação melhorada à superfície celular da proteína NRP1 (HUVECs) pela variante YW107.4.87 de afinidade madura.

Figura 3 as seqüências da região variável de YW 64.3 (anti- NRP1A) e YW107.4.87 (anti-NRP1B), com as seqüências de h4D5 listadas como referência. A numeração é baseada no banco de dados de Kabat. As seqüências CDR estão na região caixa. (3A) Seqüências da região variável de cadeia leve para h4D5 (SEQ ID NO: 1), YW 64.3 (SEQ ID NO:3) e YW107.4.87 (SEQ ID NO:5). (3B) Seqüências da região variável de cadeia pesada para h4D5 (SEQ ID NO:2), YW 64.3 (SEQ ID NO:4) e YW107.4.87 (SEQ ID NO:6).

Figura 4 descreve o bloqueio da ligação de VEGF165 a NRP1 pelos anticorpos anti-NRP1.

Figura 5 descreve testes de quantificação de colapso DRG induzido por Sema3A (5A) e de colapso hipocampal induzido por Sema3F (5B). Anti-NRP1A mostra especificamente bloquear o colapso de cone de crescimento induzido por Sema3A de neurônios DRG1 mas não o colapso de cone de crescimento induzido por neurônios hipocampais. Figura 6 ilustra que os anticorpos anti-NRP1 são capazes de inibir migração HUVEC induzida por VEGF e germinação in vitro. (6A) Quantificação de teste de migração, (n = 6 para cada condição). *p = 0,00003; **p=9.9x10~11; Teste t do investigador. (6B) Quantificação de teste de brotamento de microesferas, (n = 12-14 microesferas por condição).

Figura 7 ilustra efeitos inibitórios in vivo do anticorpo anti-NRP1 na reconstrução vascular no desenvolvimento da retina de camundongo. (7A) Ilustração do desenvolvimento vascular a partir de pós-natal do dia 5 (P5) até P8. Extensão dos vasos em um padrão de concentração para a margem da reiina. O nervo otico da cabeça (ONH) élocalizado no centro da retina; (7B) A reconstrução vascular perto do ONH acontece entre P5 e P8; (7C) Ilustração do brotamento vascular nas camadas mais profundas da retina. Vasos prolongam brotos para as camadas plexiformes externas (OPL) e formam um plexo. Depois brotos aparecem entre as camadas NFL e OPL1 eventualmente fornecendo a camada plexiforme interior (IPL); (7D) Quantificação da densidade vascular; contagem total de pixel a partir de 12 imagens representativas de 4 retinas tratadas de cada condição. *p = 0,006; **p < 0.0001; Teste t do investigador; (7E) Quantificação da extensão vascular, medida a partir da distância de ONH até a margem do sistema de vasos sangüíneos, sobre a distância do ONH até a margem da retina em taça. 12 medidas representativas foram tiradas das 4 retinas tratadas.

Figura 8 descreve os efeitos dos anticorpos anti-NRP1 na permeabilidade vascular induzida por VEGF, proliferação HUVEC, fosforilação VEGFR2 e sinalização a jusante VEGFR2. (8A) Quantificação de testes de permeabilidade vascular de pele de camundongo. Os valores mostrados são a média de 6 experimentos diferentes (p=0,69 para anti- NRP1A, e p=0,989 para anti-NRP1B); (8B) Quantificação da proliferação de HUVEC na presença ou ausência de VEGF (n=5 para cada condição); (8C) nível de fosforilação VEGFR2 em HUVECs detectado por teste ELISA usando-se anticorpos que reconheceram VEGFR2 total ou fosforilado por tirosina. O nível de fosforilação em células tratadas anti-NRP1A não foi significantemente diferente a partir do grupo controle (p=0,133).

*p=0,00017; Teste t do investigador; (8D) Análise Immunoblot de Iisados HUVEC. As células foram tratadas com os anticorpos indicados seguido por incubação com VEGF.

Figura 9 ilustra efeitos de inibição de crescimento de tumor por anticorpos anti-NRP1 (tanto sozinho como em combinação com anti-VEGF) em vários rnodeios dê tumor de xenõenxeriG (SA-C) Gráíiss da média do volume de tumor de SK-MES-1, modelos de tumor H1299 e Fo5 respectivamente (9D) plano para Kaplan-Meier para o modelo de tumor SK-MES-1.

Figura 10 mostra efeitos vasculares pelos anticorpos anti-NRP1 (tanto sozinho como em combinação com anti-VEGF) em um modelo de tumor Fo5. (10A) Média da densidade vascular (medida por pulverização de lectina); contagem total de pixel de 3-4 tumores tratados de cada condição. (10B) Média de densidade do pericito (medido por coloração PDGFR β). (10C) Razão pericito/vascular que mede cobertura do pericito relativa.

Figura 11 ilustra efeito dependente de inibições NRP1 e VEGF na reconstrução vascular. 11A apresenta um modelo no qual a função NRP1 de bloqueio nos novos vasos formados inibe vasos a partir da reconstrução e subseqüente maturação, reconstituição dos vasos dependente de VEGF para sobrevivência. 11B mostra média da alteração da densidade vascular na retina de camundongos neonatal na presença de anti-NRP1B, anti-VEGF ou a combinação destes.

Descrição Detalhada Da Invenção

A presente invenção relaciona-se às novas composições e métodos para modular as atividades biológicas mediadas por NRP. Definições

"Neuropilina" ou NRP refere-se coletivamente à neuropilina-1 (NRP1), neuropilina-2 (NRP2) e suas isoformas e variantes, como descrito em Rossignol et al. (2000) Genomics 70:211-222. Neuropilinas são receptores não tirosina quinase de 120 a 130 kDa. Existem múltiplas variantes unidas e isoformas solúveis de NRP-1 e NRP-2. A estrutura básica de neuropilinas compreende cinco domínios: três domínios extracelulares (ala2, blb2 e c), um domínio de transmembrana e um domínio citoplasmático. O domínio ala2 é homólogo aos componentes complementares Clr e Cls (CUB)1 que geralmente contém quatro resíduos de cisteína que formam duas poniês bissülfetü. G domínio b!b2 c homólogo aos fatores de coagulação V e VIII. A porção central do domínio c é designada como MAM devido à sua homologia à meprina, proteínas A5 e receptores tirosina fosfatase μ. Os domínios ala2 e blb2 são responsáveis pela ligação do Iigante1 enquanto que o domínio c é crítico para homodimerização ou heterodimerização. Gu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:18069-76; He e Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-5 1.

"Atividade biológica mediada por neuropilina" refere-se em geral aos eventos fisiológicos e patológicos nos quais neuropilina-1 e/ou neuropilina- 2 desempenham um papel substancial. Exemplos não Iimitantes de tais atividades é o desenvolvimento do sistema nervoso embrionário durante o direcionamento de axônios ou regeneração de neurônios, angiogênese (incluindo modelação vascular), tumorgênese e metástase de tumores.

O termo "anticorpo" é usado no senso mais amplo e especificamente abriga anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.

O termo "anticorpo monoclonal" como utilizado no presente refere- se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto pela possível ocorrência natural de mutações que podem estar presentes em menores quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionado contra um único sítio antigênico.

Além disto, em contraste com preparações de anticorpo convencional (policlonal) que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anücõrpos, e não sendo construído como produção requerida do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos usando-se o método de hibridoma, descrito pela primeira vez por Kohler et al. (1975) Nature, 256:495, ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente US. 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de fago, usando-se as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Bioi 222:581-597, por exemplo.

Os anticorpos monoclonais no presente especificamente incluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), nos quais uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567, e Morrison et ai (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:685-6855). Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em algumas ocorrências, resíduos (FR) da região de estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disto, refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente irá também compreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct Biol. 2:593-596.

Um "anticorpo dependente da espécie" é aquele que tem uma forte afinidade de ligação para um antígeno de uma primeira espécie de mamífero em comparação àquela que tem para um homólogo deste antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente da espécie "especificamente se liga" a um antígeno humano (isto é, tem um valor de afinidade de ligação (Kd) de não mais do que aproximadamente 1 x 10"7 Μ, preferivelmente não mais do que aproximadamente 1 χ 10"8 M e mais preferivelmente não mais do que aproximadamente 1 χ 10"9 Μ), mas tem uma afinidade de ligação para um homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não humano que é menor do que pelo menos aproximadamente 50 vezes, ou pelo menos aproximadamente 500 vezes, ou pelo menos aproximadamente 1000 vezes, mais fraca do que sua afinidade de ligação para o antígeno humano. O anticorpo dependente da espécie pode ser qualquer um dos diversos tipos de anticorpo como definido acima, mas preferivelmente é um anticorpo humanizado ou humano.

Como usado no presente "anticorpo mutante" ou "anticorpo variante" refere-se a uma seqüência variante de amirioácido do snticcrpc dependente da espécie em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos do anticorpo dependente da espécie foram modificados. Tais mutantes necessariamente têm menos do que 100% de identidade de seqüência ou similaridade com o anticorpo dependente da espécie. Em uma realização preferida, o anticorpo mutante terá uma seqüência de aminoácido que possui pelo menos 75% de identidade de seqüência ou similaridade com a seqüência de aminoácido tanto do domínio variável de cadeia pesada como leve do anticorpo dependente da espécie, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% e mais preferivelmente pelo menos 95%. Identidade ou similaridade com relação a esta seqüência é definida no presente pedido como a porcentagem de resíduos de aminoácido na seqüência candidata que são idênticos (isto é, os mesmos resíduos) ou similares (isto é, resíduos de aminoácido do mesmo grupo baseado em propriedades comuns das cadeias laterais, ver abaixo) com os resíduos de anticorpo dependente da espécie, após alinhamento das seqüências e introdução de gaps, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de seqüência. Nenhum N-terminal, C-terminal, extensões internas, deleções ou inserções na seqüência do anticorpo fora do domínio variável devem ser construídas para afetar a identidade ou similaridade de seqüência. Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais que 95% por peso de anticorpo como determinado pelo método Lowry, e mais preferivelmente mais que 99% por peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos resíduos de N- terminal ou seqüência de aminoácido interna pelo uso de um seqüenciador de copo -giratório, ou (3) -para horricgcnsidads por FAGO-SD-S sob condições de redução ou não redução utilizando-se Coomassie blue ou, preferivelmente, silver stain. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

Como usado no presente, "domínio variável do anticorpo" refere- se às porções das cadeias leve e pesada das moléculas de anticorpo que incluem seqüências de aminoácidos de Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs, isto é, CDR1, CDR2 e CDR3) e Regiões de Estrutura (FRs). Vh refere-se ao domínio variável da cadeia pesada. Vl refere- se à cadeia leve. De acordo com os métodos usados nesta invenção, as posições de aminoácidos determinadas para CDRs e FRs podem ser definidas de acordo com Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991)). A numeração de aminoácidos dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno está também de acordo com aquela de Kabat.

Como usado no presente pedido, o termo "Regiões Determinantes de Complementaridade" (CDRs, isto é, CDR1, CDR2 e CDR3) refere-se aos resíduos de aminoácidos de um domínio variável de anticorpo na presença dos quais são necessários para ligação de antígeno. Cada domínio variável tipicamente tem três regiões CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Cada região determinante de complementaridade pode compreender resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" como definido por Kabat (isto é, aproximadamente resíduos 24-34 (L1), 50-56 (l_2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles rêsiduos de uma "alça hipervariável" (per exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2} e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Moi Biol. 196:901-917 (1987)). Em alguns casos, uma região determinante de complementaridade pode incluir aminoácidos tanto de uma região CDR definida de acordo com Kabat como uma região de alça hipervariável. Por exemplo, a CDRH1 da cadeia pesada do anticorpo 4D5 inclui aminoácidos 26 a 35.

"Região de estrutura" (em seguida "FR") são aqueles resíduos de domínio variável, exceto os resíduos CDR. Cada domínio variável tipicamente tem quatro regiões FRs identificadas como FR1, FR2, FR3 e FR4. Se as CDRs estão definidas de acordo com Kabat, os resíduos FR de cadeia leve estão posicionados aproximadamente nos resíduos 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), e 98- 107 (LCFR4) e os resíduos FR de cadeia pesada estão posicionados aproximadamente nos resíduos 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), e 103-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Se as CDRs compreendem resíduos de aminoácidos de alças hipervariáveis, os resíduos FR de cadeia leve estão posicionados aproximadamente nos resíduos 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), e 97-107 (LCFR4) e os resíduos FR de cadeia pesada estão posicionados aproximadamente nos resíduos 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), e 102-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Em alguns casos, quando a CDR compreende aminoácidos tanto de uma CDR como definido por Kabat e aqueles de uma alça hipervariável, os resíduos FR serão ajustados como conseqüência. Por exemplo, quando CDRH1 inclui aminoácidos H26-H35, os resíduos FR1 de cadeia pesada estão nas posições 1-25 e os resíduos FR2 estão nas posições 36-49.

Como usado no presente pedido, "conjunto de códon" refere-se a um conjunto de seqüências triplas de diferentes nucleotídeos usados para codificar aminoácidos variantes desejados. Um conjunto de oligonucleotídeos pode ser sinieíiiãclõ, por exemplo, pc!s síntese da fase snüda, incluindo seqüências que representem todas as possíveis combinações de triplas de nucleotídeos fornecidos pelo conjunto de códon e que irão codificar o grupo desejado de aminoácidos. Uma forma padrão de designação de códon é aquela do código IUB, que é conhecida na técnica e descrita no presente pedido. Um conjunto de códon é tipicamente representado por 3 letras maiúsculas em itálico, por exemplo, NNK1 NNS, XYZ1 DVK e similares. Um "conjunto de códon não aleatório", como usado no presente pedido, então se refere a um códon que codifica aminoácidos selecionados que preenchem parcialmente, preferivelmente completamente, o critério para seleção de aminoácido como descrito no presente pedido. A síntese de oligonucleotídeos com "degeneração" de nucleotídeos selecionados em certas posições é bem conhecida na técnica, por exemplo, a abordagem TRIM (Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86); Garrard & Henner (1993) Gene 128:103). Estes conjuntos de oligonucleotídeos que possuem certos conjuntos de códons podem ser sintetizados usando-se sintetizadores comerciais de ácido nucléico (disponíveis, por exemplo, pela Applied Biosystems, Foster City, CA), ou podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, pela Life Technologies, Rockville, MD) Dessa forma, um conjunto de nucleotídeos sintetizados que possui um conjunto específico de códon irá tipicamente incluir uma pluralidade de oligonucleotídeos com diferentes seqüências, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códon dentro da seqüência geral. Oligonucleotídeos, como usado de acordo com a presente invenção, possuem seqüências que permitem hibridização com um molde de ácido nucléico de domínio variável e também podem, mas não necessariamente, incluir sítios de enzimas de restrição úteis para, por exemplo, propósitos de clonagem.

Um fragmento "Fv" é um fragmento de anticorpo que contém um reconhecimento de antígeno completo e sítio de ligação. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável dé cãdela pesada e um dOminio variável de cadeia leve em estreita associação, que pode ser de natureza covalente, por exemplo, em scFv. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, as seis CDRs ou um subconjunto destas conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, até um único domínio variável (ou metade de uma Fv que compreende somente três CDRs específicas para um antígeno) possui a habilidade de reconhecer e se ligar a um antígeno, embora usualmente com afinidade mais baixa do que o sítio de ligação completo.

O fragmento "Fab" contém um domínio variável e constante da cadeia leve e um domínio variável e primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 compreende um par de fragmentos Fab que estão geralmente ligados covalentemente próximos às suas terminações carboxila por dobradiças cisteína entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos na técnica.

Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios Vh e Vl do anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídio Fv também compreende um Iigante polipeptídico entre os domínios Vh e Vl, que permite que scFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv, ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315 (1994).

O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo pequeno com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH e VL). Pelo uso de um Iigante que é muito curto para permitir pareamenío entre os dois domínios na mssms cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos estão descritos mais inteiramente em, por exemplo, patente EP 404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et ai (1993) Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90:6444-6448.

A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorpos descritos em Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10): 1057-1062). Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos seqüenciais (em tandem,) Fd (VhCh 1-Vh-ChI) que juntos com polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

Como usado no presente pedido, "bibliotecas" refere-se a uma pluralidade de anticorpos ou seqüências de fragmento de anticorpo (por exemplo, polipeptídios da invenção), ou ácidos nucléicos que codificam estas seqüências, as seqüências sendo diferentes na combinação de aminoácidos variantes que são introduzidos nestas seqüências de acordo com os métodos da invenção.

"Exibição por fago" é uma técnica pela qual polipeptídeos variantes são exibidos como proteínas de fusão para pelo menos uma porção da proteína de revestimento na superfície do fago, por exemplo, fago filamentoso, partículas. Uma utilidade da exibição por fago permanece no fato de que amplas bibliotecas de proteínas variantes randomizadas podem ser rapidamente e eficientemente classificadas para aquelas seqüências que se ligam a um antígeno alvo com alta afinidade. A exibição de peptídeos e bibliotecas de proteínas no fago foram usadas para seleção de milhões de polipeptídios para aqueles com propriedades de ligação específica. Métodos de exibição por fago polivalente foram usados para exibição de peptídeos aleatórios pequenos e proteínas pequenas por meio de fusões tanto para o gene III como gene VIII do fago filamentoso. Wells e Lowman (1992) Curr. Opin. struct. Biol 3:355-362, e referências citadas neste. Em uma exibição par fago monovalente, uma biblioteca de proteína ou peptídeo é unida a um gene III ou uma porção deste, e expressa em baixos níveis na presença da porção do gene III tipo selvagem, de forma que as partículas de fago exibam uma ou nenhuma cópia das proteínas de fusão. Efeitos de avidez são relativamente reduzidos para os fagos polivalentes, de forma que a seleção é com base na afinidade intrínseca do ligante, e os vetores fagomídios são usados, o que simplifica as manipulações no DNA. Lowman e Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216.

Um "fagomídio" é um vetor plasmídio que tem uma origem de replicação bacteriana, por exemplo, CoIEI, e uma cópia de uma região intergênica de um bacteriófago. O fagomídio pode ser usado em qualquer bacteriófago conhecido, incluindo bacteriófago filamentoso e bacteriófago lambdóide. O plasmídio geralmente também contém um marcador selecionável para resistência a antibiótico. Segmentos de DNA clonado nestes vetores podem ser propagados como plasmídios. Quando células que ancoram estes vetores são fornecidas com todos os genes necessários para a produção de partículas de fago, o modo de replicação do plasmídio altera a replicação de rolamento em círculo para gerar cópias de uma fita de DNA do plasmídio e empacotar partículas de fago. O fagomídio pode formar partículas de fago infecciosas ou não infecciosas. Este termo inclui fagomídios que contém um gene da proteína de revestimento de fago ou fragmento deste ligado a um gene do polipeptídeo heterólogo como um gene de fusão, de forma que o polipeptídeo heterólogo seja exibido na superfície da partícula de fago.

O termo "vetor fago" significa uma forma replicável de dupla fita de um bacteriófago que contém um gene heterólogo e com capacidade de replicação. O vetor fago tem uma origem de replicação de fago que permite replicação do fago e formação de partículas de fago. O fago é preferivelmente um bacteriófago íiiameníoso, tai corno um íayo ml 3, íl, íd, Pí3 ou üit. dsriysdc destes, ou um fago lambdóide, tal como Iambda1 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, etc., ou um derivado destes.

Como usado no presente pedido, "posição acessível solvente" refere- se a uma posição de um resíduo de aminoácido nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve de uma fonte de anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que é determinada baseada na estrutura, conjunto de estruturas e/ou estrutura modelada do fragmento de ligação do anticorpo ou antígeno, como potencialmente disponível para acessar solvente e/ou contatar com uma molécula, tal como um antígeno específico de anticorpo. Estas posições são tipicamente encontradas nas CDRs e no exterior da proteína. As posições acessíveis solventes de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, como definido no presente pedido, podem ser determinadas usando-se qualquer um de vários algoritmos conhecidos na técnica. Preferivelmente, posições acessíveis solventes são determinadas usando-se coordenadas de um modelo tridimensional de um anticorpo, preferivelmente usando-se um programa de computador, tal como programa Insightll (Accelrys, San Diego, CA). Posições acessíveis solventes podem também ser determinadas usando-se algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (1971) J. MoL Biol. 55, 379 e Connolly (1983) J. Appi Cryst. 16, 548). A determinação de posições acessíveis solventes pode ser realizada usando-se programa adequado para informação de proteína de modelação e informação estrutural tridimensional obtida a partir de um anticorpo. Programas de computador que podem ser utilizados para estes propósitos inclui SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates).

Geralmente e preferivelmente, onde um algoritmo (programa) requer um usuário de parâmetro de tamanho de entrada, o "tamanho" de uma sonda que é usada no cálculo é estabelecido em aproximadamente 1,4 Angstrom ou menor em rádio. Além disso, a determinação das regiões acessíveis solventes e os métodos de área usando o programa para computadores pessoais foram descritos por Pacios (1994) Comput. Cnen. ί 8(4): 377-36Ô.

Um "fator ou agente angiogênico" é um fator de crescimento que estimula o desenvolvimento dos vasos sangüíneos, por exemplo, promove a angiogênese, crescimento endotelial, estabilidade dos vasos sangüíneos, e/ou vasculogênese, etc. Por exemplo, fatores angiogênicos, incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, VEGF e membros da família VEGF, PIGF, família PDGF, fator hereditário de crescimento de fibroblasto (FGFs), Iigantes TIE (Angiopoietinas), efrinas, Del-I, fatores de crescimento de fibroblasto: ácidos (aFGF) e básicos (bFGF), Folistatina, fator estimulante de colônia de Granulócito (G-CSF), fator de crescimento de Hepatócito (HGF) /fator de dispersão (SF), lnterleucina-8 (IL-8), Leptina, M/d/c/ne.neuropilinas, fator de crescimento placentário, fator de crescimento endotelial derivado de plaqueta (PD-ECGF), fator de crescimento derivado de plaqueta , especialmente PDGF- BB ou PDGFR-beta, Pleiotrofina (PTN), Progranulina, Proliferina, Fator alfa de crescimento e transformação (TGF-alfa), Fator beta de crescimento e transformação(TGF-beta), Fator alfa de necrose tumoral (TNF-alfa), etc. Também incluiria fatores que aceleram a cicatrização de feridas, tais como hormônio do crescimento, fator I de crescimento similar a insulina (IGF-I)1 VIGF, fator de crescimento epidermal (EGF)1 CTGF e membros desta família, e TGF-alfa e TGF-beta. Ver1 por exemplo, Klagsbrun e D1Amore (1991) Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit e Detmar, Oncogenet 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo1 Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por exemplo, Tabela 1 listando fatores angiogênicos conhecidos); e Sato (2003) Int. J. Clin. OncoL 8:200-206.

Um "agente anti-angiogênese" ou "inibidor de angiogênese" refere-se a uma substância de peso molecular pequeno, um polinucleotídeo, um polipeptídeo, uma proteína isolada, uma proteína recombinante, um anticorpo, ou proteínas conjugadas ou de fusão destes, que inibe a angiogênese, vascuiogênese ou perrnticibiÍiuaue vascular, tanto dirstsmcntc como indiretamente. Deve ser entendido que os agentes anti-angiogênese incluem aqueles agentes que ligam e bloqueiam a atividade do fator angiogênico ou seu receptor. Por exemplo, um agente anti-angiogênese é um anticorpo ou outro antagonista para um agente angiogênico como definido acima, por exemplo, anticorpos para VEGF-A ou para os receptores VEGF-A (por exemplo, receptor KDR ou receptor Flt-1), inibidores anti-PDGFR tal como Gleevec™ (Imatinib Mesylate). Agentes anti-angiogênese também incluem inibidores de angiogênese nativos, por exemplo, endostatina, etc. Ver1 por exemplo, Klagsbrun e D1Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991); Streit e Detmar1 Oncogene, 22:3172-3179 (por exemplo, Tabela 3 listando terapia anti-angiogênica em melanoma maligno); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por exemplo, Tabela 2 listando fatores angiogênicos conhecidos); e Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (por exemplo, Tabela 1 listando fatores antiangiogênicos usados em testes clínicos).

O termo "VEGF" ou "VEGF-A" como usado no presente pedido refere- se ao fator de crescimento celular endotelial vascular humano de 165 aminoácidos e fatores de crescimento celular endotelial vascular humanos relacionados de 121, 189 e 206 aminoácidos, como descrito por Leung et al. (1989) Science 246:1306 e Houck et al. (1991) Mol. Endocrín, 5:1806, junto com as forma alélicas que ocorrem naturalmente e formas processadas destes. O termo "VEGF" também se refere aos VEGFs de espécies não humanas tal como camundongo, rato ou primata. Algumas vezes o VEGF de uma espécie específica é indicado por termos tais como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino, e etc. O termo "VEGF" é também usado para se referir a formas truncadas do polipeptídeo que compreende aminoácidos 8 a 109 ou 1 a 109 do fator de crescimento celular endotelial vascular humano de 165 aminoácidos. Referências para qualquer uma destas formas de VEGF podem sei identificadas no presente pedido per, por exemnln 'VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" ou "VEGF165." As posições de aminoácidos para um VEGF nativo "truncado" são numeradas como indicado na seqüência VEGF nativa indicada. Por exemplo, a posição 17 de aminoácido (metionina) no VEGF nativo truncado é também posição 17 (metionina) no VEGF nativo. O VEGF nativo truncado tem afinidade de ligação para os receptores KDR e Flt-1 comparável ao VEGF nativo.

Um "anticorpo anti-VEGF" é um anticorpo que se liga ao VEGF com suficiente afinidade e especificidade. Preferivelmente, o anticorpo anti-VEGF da invenção pode ser usado como um agente terapêutico no direcionamento e interferência em doenças ou condições em que a atividade VEGF está envolvida. Um anticorpo anti-VEGF usualmente não irá se ligar a outro VEGF homólogo tal como VEGF-B ou VEGF-C, nem a outros fatores de crescimento tais como P1GF, PDGF ou bFGF. Um anticorpo anti-VEGF preferido é um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epítopo do anticorpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1 produzido pelo hibridoma ATCC HB 10709. Mais preferivelmente o anticorpo anti-VEGF é um anticorpo monoclonal humanizado recombinante anti-VEGF gerado de acordo com Presta et al. (1997) Câncer Res. 57:4593-4599, incluindo mas não limitado ao anticorpo conhecido como bevacizumab (BV; Avastin™)

O anticorpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", também conhecido como "rhuMAb VEGF" ou "Avastin®", e um anticorpo monoclonal recombinante humanizado anti-VEGF gerado de acordo com Presta et al (1997) Câncer Res.

57:4593-4599. Compreende regiões de estrutura IgGI humana mutadas e regiões determinantes de complementaridade de ligação de antígeno do anticorpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 que bloqueia a ligação de VEGF humano aos seus receptores. Aproximadamente 93% da seqüência de aminoácido de Bevacizumab, incluindo a maioria das regiões de estrutura é derivada de lgGl humano, e aproximadamente 7% ds seqüência é derivada Ho anticorpo A4.6.1. murino. Bevacizumab tem um peso molecular de aproximadamente 149.000 daltons e é glicosilado.

Um "antagonista de VEGF" refere-se a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, anular, reduzir ou interferir nas atividades de VEGF incluindo sua ligação a um ou mais receptores VEGF Antagonistas de VEGF incluem anticorpos anti-VEGF e fragmentos de ligação de antígeno destes, moléculas receptoras e derivados que se ligam especificamente ao VEGF, dessa forma seqüestrando sua ligação para um ou mais receptores, anticorpos receptores anti-VEGF e antagonistas de receptores VEGF tal como inibidores de molécula pequena de VEGFR tirosina quinases.

"Tratamento" refere-se a ambos os tratamentos, terapêutico e profilático ou medidas preventivas. Aqueles com necessidade de tratamento incluem aqueles já com a doença, assim como aqueles em que a doença será prevenida.

Uma "disfunção" é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com o anticorpo. Por exemplo, mamíferos que sofrem ou necessitam de profilaxia contra angiogênese anormal (excessiva, inapropriada ou angiogênese não controlada) ou permeabilidade vascular. Isto inclui disfunções ou doenças crônicas e agudas incluindo aquelas condições patológicas que predispõe o mamífero para a disfunção em questão. Exemplos não Iimitantes de disfunções a serem tratadas no presente pedido incluem tumores malignos e benignos; não leucêmicos e linfóides malignos; neuronal, glial, astrocíticos, hipotalâmico e outros, glandular, de macrófago, epitelial, estromal e disfunções blastocélicas, e inflamatórias, angiogênicas e disfunções imunológicas.

Angiogênese anormal ocorre quando novos vasos sangüíneos crescem excessivamente, de forma insuficiente ou inapropriada (por exemplo, a localização, tempo ou princípio de angiogênese sendo indesejado a partir de um ponto de vista médico) em um estado doentio ou de forma que cause um estado doentio: Angiogêness cxcccsiva, inapropriada ou nâo mntrolada ocorre quando existe crescimento de novos vasos sangüíneos que contribuem para piorar o estado doentio ou causar um estado doentio, tal como câncer, especialmente tumores sólidos vascularizados e tumores metastáticos (incluindo câncer de cólon, pulmão (especialmente câncer de pulmão de célula pequena), ou câncer de próstata), doenças causadas por neovascularização ocular, especialmente cegueira diabética, retinopatias, retinopatia diabética primária ou degeneração macular relacionada à idade (AMD), psoríase, artrite psoriática, hemangioblastoma tal como hemangioma; doenças inflamatórias renais, tal como glomerulonefrite, especialmente glomerulonefrite mesangioproliferativa, síndrome urêmica hemolítica, neuropatia diabética ou nefroesclerose hipertensiva; várias doenças inflamatórias, tais como artrite, especialmente artrite reumatóide, doença infiamatória do intestino, psoríase, sarcoidose, arteriosclerose arterial e doenças que ocorrem após transplante, endometriose ou asma crônica e mais de outras 70 condições. Os novos vasos sangüíneos podem alimentar os tecidos doentes, destruir tecidos normais, e no caso do câncer, os novos vasos podem permitir que as células tumorais escapem pela circulação e se alojem em outros órgãos (metástase de tumor). A angiogênese insuficiente ocorre quando existe crescimento inadequado de vasos sangüíneos que contribuem para piorar um estado da doença, por exemplo, em doenças tais como doença de artéria coronária, derrame e retardamento na cicatrização de ferida. Além disso, úlceras, derrames e ataques do coração podem resultar na ausência de angiogênese normalmente necessária para cicatrização natural. A presente invenção contempla tratar aqueles pacientes que estão em risco de desenvolvimento das doenças mencionadas acima.

Outros pacientes que são candidatos para receber os anticorpos ou polipeptídeos desta invenção têm ou estão em risco de desenvolver, proliferação anormal de tecido fibrovascular, acne rosácea, síndrome de imunodeficiência adquirida, oclusão de artéria, queratite atópica, úlcera bacíeiiãna, doença de EechGts1 tumores nascidos do sangne, doença obstrutiva da carótida, neovascularização coroidal, inflamação crônica, descolamento crônico da retina, uveite crônica, vitrite crônica, uso excessivo de lentes de contato, rejeição de enxerto de córnea, neovascularização da córnea, neovascularização de enxerto da córnea, doença de Crohn, doença de Eales, queratoconjuntivite epidêmica, úlcera fúngica, infecções por Herpes simplex, infecções por Herpes zoster, síndrome de hiperviscosidade, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneração lipídica, doença de Lyme, queratólise marginal, úlcera de Mooren, infecções por Micobactéria exceto leprosa, miopia, doença neovascular ocular, escavação óptica, síndrome de Osler-Weber (Osler-Weber- Rendu, osteoartrite, doença de Pagets, pars planitis, penfigóide, filectenulose, poliarterite, complicações pós-laser, infecções por protozoários, pseudoxantoma elástico, queratite sica do pterígio, queratotomia radial, neovascularização da retina, retinopatia de prematuridade, fibroplasias retrolental, sarcóide, esclerite, anemia falciforme, síndrome de Sogrens, tumores sólidos, doença de Stargarts, doença de Steven, queratite límbica superior, sífilis, lúpus sistêmico, degeneração marginal de Terrien, toxoplasmose, trauma, tumores de sarcoma Ewing, tumores de neuroblastoma, tumores de osteosarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de rabdomiosarcoma, colite ulcerativa, oclusão venal (veno oclusiva), deficiência de vitamina A e sarcoidose de Wegener1 angiogênese indesejada associada com diabetes, doenças parasíticas, cicatrização de ferida anormal, hipertrofia pós cirurgia, ferimento ou trauma, inibição de crescimento capilar, inibição de ovulação e formação de corpo lúteo, inibição de implantação e inibição de desenvolvimento embrionário no útero.

Terapias anti-angiogênese são úteis no tratamento geral de rejeição de enxerto, inflamação pulmonar, síndrome nefrótica, pré-eclâmpsia, efusão pericardial, tal como aquela associada com pericardite, e efusão pleural, doenças e dfsfunçòes caracterizadas pe!ã permeabilidade vascular, por exemplo, edema associado com tumores no cérebro, ascites associadas com malignidades, síndrome de Meig, inflamação pulmonar, síndrome nefrótica, efusão pericardial, efusão pleural, permeabilidade associada com doenças cardiovasculares tais como condições após infarte do miocárdio e derrame e os similares.

Outras doenças dependentes de angiogênese de acordo com esta invenção incluem angiofibroma (sangramento anormal de vasos que são propensos ao sangramento), glaucoma neovascular (crescimento de vasos sangüíneos nos olhos), malformação arteriovenosa (comunicação anormal entre artérias e veias), fraturas sem união (fraturas que não curam), placas ateroscleróticas (endurecimento das artérias), granuloma piogênico (lesão comum da pele composta de vasos sangüíneos), escleroderma (uma forma de doença do tecido conjuntivo), hemangioma (tumor composto de vasos sangüíneos), tracoma (causa principal de cegueira no terceiro mundo), articulação hemofílica, adesão vascular e cicatrizes hipertróficas (formação anormal de cicatriz).

Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pela desregulação do crescimento celular. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem câncer de células escamosas, câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma do pulmão, e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago (incluindo câncer gastrointestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma uterino ou endometrial, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireóide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, como também Iinfoma de célula B (incluindo iiníoma nãu-Hüuykin de bsixc grau/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de célula clivada não pequena de alto grau; NHL de doença volumosa; Iinfoma de célula do manto; linfoma relacionado à AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de célula cabeluda; leucemia mieloblástica aguda; e disfunção Iinfoproliferativa pós-transplante (PTLD), como também proliferação vascular anormal associada com facomatoses, edema (tais como aqueles associados com tumores do cérebro), e síndrome de Meigs.

O termo "composição antineoplásíca" refere-se a uma composição útil no tratamento de câncer que compreende pelo menos um agente terapêutico ativo, por exemplo, "agente anticâncer". Exemplos de agentes terapêuticos (agentes anti-câncer) incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, agentes quimioterápicos, agentes inibidores do crescimento, agentes citotóxicos, agentes usados na radioterapia, agentes anti-angiogênese, agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina e outros agentes para tratar o câncer, tais como anticorpos anti-HER- 2, anticorpos anti-CD20, um antagonista receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, um inibidor tirosina quinase), inibidor HER1/EGFR (por exemplo, erlotinib (Tarceva™), inibidores do fator de crescimento derivado de plaquetas (por exemplo, Gleevec™ (lmatinib Mesylate)), um inibidor COX-2 (por exemplo, celecoxib), interferons, citocinas, antagonistas (por exemplo, que neutralizam anticorpos) que se ligam a um ou mais dos seguintes alvos, receptor(es) ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, B1yS, APRIL, BCMA ou VEGF, TRAIL/Apo2, e outros agentes químicos orgânicos e bioativos, etc. Combinações destes estão também incluídas na invenção.

O termo "agente citotóxico" como usado no presente refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. Ô termo tem a intenção de incluir isotopos radioativos (por exemplo, I131, I125, Y90 c Re186), agentes quimioterápicos, e toxinas tais como toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destas.

Um "agente quimioterápico" é um componente químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e CYTOXAN® ciclofosfamida; sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona), uma campotecina (incluindo o análogo sintético topotecan); briostatina, calistatina, CC- 1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelezina, carzelezina e bizelesina); criptopicinas (particularmente criptopicina 1 e criptopicina 8), dolastatina, duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB 1-TM 1); eleuterobina, pancratistatina, uma sarcodictina, espongistatina, mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosuréias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimustina; antibióticos, tais como antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicina omega II (ver, por exemplo, Agnew (1994) Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186); dinemicina, incluindo dinemicina A, bifosfonatos, tais como clodronato, uma esperamicina; como também cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos enedina cromoproteína relacionado), aclacinomisinas, actinomicinas, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5- oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMICINA® (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5- fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil, amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptínio; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidamina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitaerina; pentostatin; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina;tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology1 Princeton, NJ) ABRAXANE™ livre de cremofor, formulação de paclitaxel de nanopartícula de albumina projetada (engenheirada) (American Pharmaceutical Partners1 Sehaumberg1 Illinois) e TAXOTERE®, doxetaxel, Rhône- Poulenc Rorer1 Antony1 France), clorambueil; geneitabina GEMZAR™; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitomicin C; NAVELBINE®; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecan (Camptosar1 CPT-11) (incluindo o regime de tratamento de irinotecan com 5-FU e leuvocorin); inibidor RFS 2000 topoisomerase; difluorometilomitina (DMFO); retinóides tais como ácido retinóico; capecitabina; combretastatina, Ieucovorin (LV); oxaliplatina, incluindo a o regime de tratamento de oxaliplatina (FOLFOX); inibidores de PKC-alfa, Raf1 H-Ras1 EGFR (por exemplo, erlotinibina (Tarceva™)) e VEGF-A que reduz a proliferação celular e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivatives de qualquer um dos acima.

Também incluído nesta definição estão os agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação de hormônios em tumores, tais como anti-estrógeno e moduladores do receptor de estrógeno. (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX® tamoxifeno). raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, quinoxifeno, LY117018, onapristona e FARESTON® toremifeno, inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógeno nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutemida, MEGASE® acetato de megestrol, AROMASIN® exemestano, formestanie, fadrazola, RIVISOR® vorozola, FEMARA® letrozola, e ARIMIDEX® anastrazola , e anti-andrógenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, Ieuprolida e goserelina, assim como, troxacitabina (um análogo de 1-3 dioxalano nucleosídeo citosina), oligonucleotídeos antisense, particularmente aqueles que inibem expressão gênica nas vias de sinalização envolvidas na proliferação celular anormal, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras, ribozimas tal como inibidor de expressão de VEGF (por exemplo, ANGIOZYME® ribozima) e inibidor de expressão de HER2; vacinas tais como vacina de terapia gênica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2, inibidor topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; Vinorelabina e Esperamicinas (ver Patente US 4.675.187), e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um aos acima.

O termo "pró-droga" como usado neste pedido refere-se a uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxicas para células de tumor comparada com a droga parental e é capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida na forma parental mais ativa. Ver, por exemplo, Wilman (1986) "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375-382, 615° Encontro Belfast e Stella et al. (1985). "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et ai., (ed.), páginas 247-267, Humana Press. As pró-drogas desta invenção incluem, mas não são limitadas a, pró-drogas contendo fosfato, pró-drogas contendo tiofosfato, pró-drogas contendo sulfato, pró-drogas contendo peptídeo, pró-drogas D-aminoácido modificado, pró-drogas glicosiladas, pró-drogas contendo beta-lactama, pró- drogas contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituídas ou pró-drogas contendo fenilacetamida opcionalmente substituídas, pró-drogas 5- fluorocitosina e outras 5-fluorouridina que podem ser convertidas em drogas citotóxicas livres mais ativas. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas para uma forma pró-droga para uso nesta invenção incluem, mas não são limitadas para, aqueles agentes quimioterápicos descritos acima. Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é uma molécula de ácido nucléico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante com que ela é geralmente associada na fonte natural de ácido nucléico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucléico isolada é diferente da forma ou configuração que é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucléico são então distintas das moléculas de ácido nucléico que existem nas células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucléico isolada inclui uma molécula de ácido nucléico contida nas células que normalmente expressam o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácidc nucléicG está em um síüo do cromossomo diferente daquele das células naturais.

O termo "seqüências controle" refere-se à seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro específico. As seqüências controle que são adequadas para procariontes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio de ligação de ribossomo. Células eucariontes são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação, e enhancers.

Ácido nucléico está "operacionalmente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretório está operacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se este é expresso como uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou enhancer está operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação se afeta a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo está operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação se está posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, "operacionalmente ligado" significa que as seqüências de DNA sendo ligadas são adjacentes, e, no caso de um líder secretário, adjacentes e na fase de leitura. No entanto, enhancers não têm que ser adjacentes. A ligação é realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são usados de acordo com as práticas convencionais.

Como usado no presente pedido, as expressões "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" são usadas alternadamente e tais designações incluem progênie. Dessa forma, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula sujeito primaria e culturas derivadas a partir desta, sem considerar o numero de transferências. Entende-se também que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica no conteúdo do DNA, devido a mutações premeditadas ou acidentais. Progênies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica como selecionada para a célula transformada originalmente estão também incluídas. Onde diferentes designações são pretendidas, será claro a partir do contexto.

Modos Para Realizar A Invenção

Produção De Anticorpos Anti-NRPI

A presente invenção fornece novos anticorpos anti-NRP1. Métodos exemplares para geração de anticorpos estão descritos em maiores detalhes nas seções seguintes.

Os novos anticorpos anti-NRP1 são selecionados usando-se o antígeno NRP1 derivado de espécies de mamífero. Preferivelmente o antígeno é NRP1 humano (hNRP1). No entanto, NRPs de outras espécies, tais como NRP1 murino (mNRP1) podem também ser usados como antígeno alvo. Os antígenos NRP de diversas espécies de mamífero podem ser isolados a partir de fontes naturais. Em outras realizações, o antígeno é produzido de forma recombinante ou feito usando-se outros métodos sintéticos conhecidos na técnica. O anticorpo selecionado normalmente terá uma forte afinidade de ligação suficiente para o antígeno NRP1. Por exemplo, o anticorpo pode se ligar ao hNRP1 com um valor Kd de não mais que aproximadamente 5 nM, preferivelmente não mais que aproximadamente 2 nM, e mais preferivelmente não mais que aproximadamente 500pM. Afinidades de anticorpo podem ser determinadas pelo teste de ressonância plasmônica de superfície (tal como o teste BIAcore como descrito nos Exemplos); teste imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA); e testes de competição (por exemplo, RIA's), por exemplo.

Também, o anticorpo pode ser sujeito a outros testes de atividade biológica, por exemplo, com c objetivo dc svQüsr sua efetividade corno urr. terapêutico. Tais testes são conhecidos na técnica e dependem do antígeno alvo e uso pretendido para o anticorpo. Exemplos incluem o teste de inibição HUVEC (como descrito nos Exemplos abaixo); testes de inibição de crescimento de célula tumoral (como descrito no documento WO 89/06692, por exemplo); testes de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade mediada por complemento (CDC) (Patente US 5.500.362); e atividade agonística ou testes hematopoiéticos (ver documento WO 95/27062).

Para selecionar anticorpos que se ligam a um epítopo específico no antígeno de interesse, uma rotina de teste de interbloqueio tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser realizada. Alternativamente, o mapeamento do epítopo, por exemplo como descrito em Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394, pode ser realizado para determinar se o anticorpo se liga a um epítopo de interesse.

Geração De Novos Anticorpos Anh-NRPI A Partir De Bibliotecas De

Anticorpo Sintético Em Fago

Em uma realização preferida, a invenção fornece um método para geração e seleção de novos anticorpos anti-NRP1 usando-se uma única abordagem de exibição por fago. A abordagem envolve a geração de bibliotecas de anticorpo sintético em fago baseado em uma única estrutura molde, projeto com suficiente diversidade nos domínios variáveis, exibição de polipeptídios que possuem os domínios variáveis diversificados, seleção de candidatos com alta afinidade para atingir o antígeno NRP1, e isolamento dos anticorpos selecionados.

Detalhes de métodos de exibição por fago podem ser encontrados em, por exemplo, documento WO 03/102157 publicado em 11 de dezembro de 2003.

Em um aspecto, as bibliotecas de anticorpo usadas na invenção podem ser geradas por mutação do solvente acessível e/ou posições altamente diversas em pelo menos uma CDR de um dominio variavel do anticorpo. Algumas ou todas as CDRs podem ser mutadas usando-se métodos fornecidos no presente pedido. Em algumas realizações, pode ser preferível gerar bibliotecas diversas de anticorpo por mutação das posições em CDRH1, CDRH2 e CDRH3 para formar uma única biblioteca ou por posições mutantes em CDRL3 e CDRH3 para formar uma única biblioteca ou por posições mutantes em CDRL3 e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 para formar uma única biblioteca.

Uma biblioteca de domínios variáveis do anticorpo pode ser gerada, por exemplo, tendo mutações no solvente acessível e/ou posições altamente diversas CDRH1, CDRH2 e CDRH3. Outra biblioteca pode ser gerada tendo mutações em CDRL1, CDRL2 e CDRL3. Essas bibliotecas podem também ser usadas em conjunto com cada uma para gerar ligantes de afinidades desejadas. Por exemplo, após um ou mais ciclos de seleção de bibliotecas de cadeia pesada para ligação a um antígeno alvo, uma biblioteca de cadeia leve pode ser substituída pela população de ligantes de cadeia pesada para ciclos adicionais de seleção para aumentar a afinidade dos ligantes.

Preferivelmente, uma biblioteca é criada pela substituição de aminoácidos originais com aminoácidos variantes na região CDRH3 da região variável da seqüência de cadeia pesada. A biblioteca resultante pode conter uma pluralidade de seqüências de anticorpo, em que a diversidade da seqüência está primeiramente na região CDRH3 da seqüência de cadeia pesada.

Em um aspecto, a biblioteca é criada no contexto da seqüência 4D5 do anticorpo humanizado, ou da seqüência da estrutura de aminoácidos da seqüência 4D5 do anticorpo humanizado. Preferivelmente1 a biblioteca é criada pelo menos pela substituição dos resíduos 95-1 OOa da cadeia pesada com aminoácidos codificados pelo conjunto de códon DVK, em que o conjunto de códon DVK é usado para codificar um conjunto de aminoaciaos variantes para cauã uma destas posições. Um exemplo de um conjunto de oligonucleotídeos que é útil para criar estas substituições compreende a seqüência (DVK). Em algumas realizações, uma biblioteca é criada pela substituição dos resíduos 95-1 OOa por aminoácidos codificados tanto por conjuntos de códon DVK como NNK Um exemplo de um conjunto de oligonucleotídeos que é útil para criar estas substituições compreende a seqüência (DVK)6(NNK). Em outra realização, uma biblioteca é criada pelo menos pela substituição dos resíduos 95-100a por aminoácidos codificados tanto por conjuntos de códon DVK como NNK Um exemplo de um conjunto de oligonucleotídeos que é útil para criar estas substituições compreende a seqüência (DVK)5(NNK). Um exemplo de um conjunto de oligonucleotídeos que é útil para criar estas substituições compreende a seqüência (NNK)6. Outros exemplos de seqüências de oligonucleotídeo adequadas podem ser determinadas por um técnico no assunto de acordo com o critério descrito no presente pedido.

Em outra realização, projetos CDRH3 diferentes são utilizados para isolar Iigantes de alta afinidade e para isolar Iigantes para uma variedade de epítopos. A variação de comprimento de CDRH3 geradas nesta biblioteca é de 11 a 13 aminoácidos, embora comprimentos diferentes destes possam também ser gerados. A diversidade H3 pode ser expandida pelo uso de conjuntos de códons NNK, DVK e NVK, como também diversidade mais limitada a N e/ou C terminal.

A diversidade pode também ser gerada na CDRH1 e CDRH2. Os projetos de diversidades CDR-H1 e H2 seguem a estratégia de atingir repertórios de anticorpos naturais miméticos como descrito com modificações que focam a maior diversidade compatível à diversidade natural do que a do projeto anterior.

Para diversidade na CDRH3, múltiplas bibliotecas podem ser construídas separadamente com comprimentos diferentes de H3 e então combinadas para selecionar Iigantes para atingir antígenos. As múltiplas bibliotecas podem ser agrupadas e selecionadas usando-se seieçãu ue suporte sólido e métodos para seleção da solução como descrito previamente e no presente pedido abaixo. Estratégias de seleção múltipla podem ser empregadas. Por exemplo, uma variação envolve seleção do alvo ligado a um sólido, seguido pela seleção de um tag que pode estar presente no polipeptídeo de fusão (por exemplo, tag anti-gD) e seguido por outra seleção no alvo ligado ao sólido. Alternativamente, as bibliotecas podem ser primeiro selecionadas no alvo ligado a uma superfície sólida, e Iigantes eluídos são então selecionados usando-se solução fase de ligação com concentrações diminuídas do antígeno alvo. A utilização de combinações de métodos diferentes de seleção fornece minimização da seleção somente de seqüências altamente expressas e fornece seleção de diversos clones de alta afinidade diferentes.

Ligantes de alta afinidade para o antígeno NRP1 alvo podem ser isolados a partir de bibliotecas. A diversidade Iimitante na região H1/H2 diminui a degeneração por aproximadamente 104 a 105 vezes e permitindo maior diversidade de H3 fornece mais Iigantes de alta afinidade. Utilizando bibliotecas com diferentes tipos de diversidade em CDRH3 (por exemplo, utilizando DVK ou NVT) fornece isolamento de Iigantes que podem se ligar a diferentes epítopos de um antígeno alvo. Dos Iigantes isolados das bibliotecas agrupadas como descrito acima, foi descoberto que a afinidade pode também ser melhorada pelo fornecimento de diversidade limitada na cadeia leve. A diversidade da cadeia leve é gerada nesta realização como segue na CDRL1: aminoácido na posição 28 é codificado por RDT; aminoácido na posição 29 é codificado por RKT; aminoácido na posição 30 é codificado por RVW; aminoácido na posição 31 é codificado por ANW; aminoácido na posição 32 é codificado por THT; opcionalmente, aminoácido na posição 33 é codificado por CTG ; na CDRL2. aminoácido na posição 50 é codificado por KBG; aminoácido na posição 53 é codificao por AVC; e opcionalmente, aminoacido na posicao 55 e codificado por GMA ; na CDRL3: aminoácido na posição 91 é codificado por TMT ou SRT um ambos; aminoácido na posição 92 é codificado por DMC; aminoácido na posição 93 é codificado por RVT; aminoácido na posição 94 é codificado por NHT; e aminoácido na posição 96 é codificado por TWT ou YKG ou ambos.

Em outra realização, é gerada uma biblioteca, ou bibliotecas com diversidade nas regiões CDRH1, CDRH2 e CDRH3. Nesta realização, a diversidade na CDRH3 é gerada usando-se uma variedade de comprimentos de regiões H3 e usando-se inicialmente os conjuntos de códons XYZ e NNK ou NNS. As bibliotecas podem ser formadas usando-se oligonucleotídeos individuais e agrupados, ou os oligonucleotídeos podem ser agrupados para formar um subconjunto de bibliotecas. As bibliotecas desta invenção podem ser selecionadas contra o alvo ligado ao sólido. Clones isolados de múltiplos tipos podem ser selecionados para especificidade e afinidade usando-se testes ELISA. Para especificidade, os clones podem ser selecionados contra os antígenos alvo desejados, como também para outros antígenos não alvos.

Esses Iigantes para o antígeno alvo NRP1 podem ser selecionados para afinidade na solução de ligação de competição de teste ELISA ou teste de competição de mancha. Ligantes de alta afinidade podem ser isolados a partir da biblioteca que utiliza conjuntos de códons XYZ preparados como descrito acima. Estes Iigantes podem rapidamente ser produzidos como anticorpos ou antígenos que se ligam a fragmentos com alto rendimento na cultura celular.

Em algumas realizações, pode ser desejável gerar bibliotecas com uma diversidade maior nos comprimentos da região CDRH3. Por exemplo, pode ser desejável gerar bibliotecas com regiões CDRH3 variando de aproximadamente 7 a 19 aminoácidos.

Ligantes de alta afinidade isolados de bibliotecas destas realizações são rapidamente produzidos em cultura celular bacteriana e eucaricnte ccrr. alto rendimenio. Gs vetores podem ser designados para remover seqüências rapidamente, tais como tags gD, seqüência componente de proteína de revestimento viral, e/ou adicionar seqüências na região constante para fornecer produção de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de ligação de antígeno com alto rendimento.

Uma biblioteca com mutações na CDRH3 pode ser combinada com uma biblioteca contendo versões variantes de outras CDRs, por exemplo, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 e/ou CDRH2. Dessa forma, por exemplo, em uma realização, uma biblioteca CDRH3 é combinada com uma biblioteca CDRL3 criada no contexto da seqüência do anticorpo 4D5 humanizado com aminoácidos variantes nas posições 28, 29, 30,31, e/ou 32 usando-se conjuntos de códons pré-determinados. Em outra realização, uma biblioteca com mutações na CDRH3 pode se combinada com uma biblioteca que compreende variantes de domínios variáveis de cadeia pesada CDRH1 e/ou CDRH2. Em uma realização, a biblioteca CDRH1 é criada com a seqüência do anticorpo humanizado 4D5 com aminoácidos variantes nas posições 28, 30, 31, 32 e 33. Uma biblioteca CDRH2 pode ser criada com a seqüência do anticorpo humanizado 4D5 com aminoácidos variantes nas posições 50, 52, 53, 54, 56 e 58 usando-se os conjuntos de códons pré-determinados. Anticorpos Anti-NRPI Mutantes

Os novos anticorpos anti-NRP1 gerados a partir de bibliotecas de fago podem também ser modificados para gerar anticorpos mutantes com propriedades físicas, químicas e/ou biológicas melhoradas sobre o anticorpo parental. Onde o teste usado é um teste de atividade biológica, o anticorpo mutante preferivelmente tem uma atividade biológica no teste de escolha que é pelo menos aproximadamente 10 vezes melhor, pelo menos aproximadamente 20 vezes melhor, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 50 vezes melhor, e algumas vezes pois menos apfGxirnâuãmenie 'tõo vezes ou 2üü vezes melhor, do que a atividade biológica do anticorpo parental nesse teste. Por exemplo, um anticorpo mutante anti-NRP1 preferivelmente tem uma afinidade de ligação para NRP1 que é pelo menos aproximadamente 10 vezes mais forte, pelo menos aproximadamente 20 vezes mais forte, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 50 vezes mais forte, e algumas vezes pelo menos aproximadamente 100 vezes ou 200 vezes mais forte, do que a atividade biológica do anticorpo parental nesse teste.

Para gerar o anticorpo mutante, uma ou mais alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) são introduzidas em uma ou mais regiões hipervariáveis do anticorpo parental. Alternativamente, ou além disso, uma ou mais alterações (por exemplo, substituições) dos resíduos da região de estrutura podem ser introduzidas no anticorpo parental em que isto resulta no aprimoramento da afinidade de ligação do anticorpo mutante para o antígeno da segunda espécie de mamífero. Exemplos de resíduos da região de estrutura para modificar incluem aqueles que não se ligam diretamente ao antígeno de forma covalente (Ami et al. (1986) Science 233:747-753); interagir com/efetuar a conformação de uma CDR (Chothia et al. (1987) J. Mol Biol. 196:901-917); e/ou participar na interface Vl - Vh (patente EP 239 400B1). Em certas realizações, a modificação de um ou mais destes resíduos da região de estrutura resulta em um aprimoramento da afinidade de ligação do anticorpo para o antígeno da segunda espécie de mamífero. Por exemplo, aproximadamente um a cerca de cinco resíduos de estrutura podem ser alterados nesta realização da invenção. Algumas vezes, isto pode ser suficiente para produzir um anticorpo mutante adequado para uso em testes pré-clínicos, até mesmo onde nenhum resíduo da região hipervariável tenha sido alterado. Normalmente, no entanto, o anticorpo mutante irá compreender alteração (ões) adicionais na região hipervariável.

Os resíduos da região hipervariável que são alterados podem ser modificados aleatoriamente, especialmente onde a afinidade de ligação inicial do anticorpo parental é tal que tais anticorpos mutantes produzidos aleatoriamente possam ser rapidamente selecionados.

Um procedimento útil para gerar tais anticorpos mutantes é chamado "mutagênese de varredura de alanina" (Cunningham e Wells (1989) Science 244:1081-1085). Nesta, um ou mais resíduos da região hipervariável são substituídos por resíduos de alanina ou polialanina para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno da segunda espécie de mamífero. Esses resíduos da região hipervariável que demonstram sensibilidade funcional para as substituições então são refinadas pela introdução, além disto, ou outras mutações no, ou para, os sítios de substituição. Consequentemente, enquanto o sítio para a introdução da variação de seqüência de aminoácido é pré-determinado, a natureza da mutação por si mesma não precisa ser pré-determinada. As mutações de ala produzidas são desta maneira selecionadas para suas atividades biológicas descritas no presente pedido.

Normalmente inicia-se com uma substituição conservativa tal como aquelas mostradas abaixo sob a denominação de "substituições preferidas". Se tais substituições resultam em uma troca na atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação), então mais trocas substanciais, denominadas "substituições exemplares" na tabela seguinte, ou como também descritas abaixo na referência para as classes de aminoácidos, são introduzidas e os produtos selecionados.

Substituições Preferidas

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Até mesmo modificações mais substanciais nas propriedades biológicas dos anticorpos são realizadas pela seleção de substituições que diferem significantemente em seus efeitos na manutenção (a) da estrutura do esqueleto do polipeptídio na área de substituição, por exemplo, como uma conformação folha ou helicoidal (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) da massa da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos baseados em propriedades comuns das cadeias laterais:

(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr, asn, gln;

(3) acídica: asp, glu;

(4) básica: his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: gly, pro; e

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas conferem troca de um membro de uma destas classes por outra classe.

Em outra realização, os sítios selecionados para modificação são submetidos à afinidade madura usando-se exibição porfago (ver acima).

Moléculas de ácido nucléico que codificam seqüências mutantes de aminoácido são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese de PCR e mutagênese cassette de um mutante preparado anteriormente ou uma versão não mutante do anticorpo parental. O método preferido para fabricação de mutantes é mutagênese sítio-dirigida (ver, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati Acad. Sei. USA 82:488).

Em certas realizações, o anticorpo mutante terá somente um único resíduo da região hipervariável substituído. Em outras realizações, dois ou mais resíduos da região hipervariável do anticorpo parental terá sido substituído, por exemplo, por aproximadamente duas para cerca de dez substituições da região hipervariável. Comumente1 o anticorpo mutante com propriedades biológicas melhoradas terá uma seqüência de aminoácido que possui pelo menos 75% de identidade de seqüência ou similaridade com a seqüência de aminoácido tanto do domínio variável de cadeia pesada como leve do anticorpo parental, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% e mais preferivelmente pelo menos 95%. Identidade ou similaridade com relação a esta seqüência é definida no presente pedido como a porcentagem de resíduos de aminoácido na seqüência candidata que são idênticos (isto é, os mesmos resíduos) ou similares (isto é, resíduos de aminoácido do mesmo grupo baseado em propriedades comuns das cadeias laterais, ver acima) com os resíduos do anticorpo parental, após alinhamento das seqüências e introdução de gaps, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de seqüência. Nenhum N- terminal, C-terminal, extensões internas, deleções ou inserções na seqüência do anticorpo fora do domínio variável devem ser construídas para afetar a identidade ou similaridade de seqüência.

Após a produção do anticorpo mutante, a atividade biológica dessa molécula, relativa ao anticorpo parental é determinada Como apontado acima, isto pode envolver determinação da afinidade de ligação e/ou outras atividades biológicas do anticorpo. Em uma realização preferida da invenção, um painel de anticorpos mutantes é preparado e selecionado para afinidade de ligação ao antígeno, tal como NRP1 ou um fragmento deste. Um ou mais mutantes do anticorpo selecionado para esta seleção inicial são opcionalmente sujeitos a um ou mais testes biológicos adicionais para confirmar se o(s) anticorpo(s) mutante(s) com afinidade de ligação aumentada é(são) realmente útil(eis), por exemplo, para estudos pré-clínicos.

O anticorpo mutante então selecionado pode ser sujeito a modificações adicionais, muitas vezes dependendo do uso pretendido do anticorpo. Tais modificações podem envolver alterações adicionais da seqüência de aminoácido, fusões para polipeptídio(s) heterólogo(s) e/ou modificações covalentes, tais como aquelas elaboradas abaixo. Com relação às alterações na seqüência de aminoácido, modificações exemplares são elaboradas acima. Por exemplo, qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo mutante também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir interligação anormal. De modo oposto, ligação(ões) cisteína pode ser adicionada ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv). Outro tipo de aminoácido mutante tem um padrão de glicosilação alterado. Isto pode ser alcançado pela deleção de um ou mais componentes carboidrato encontrados no anticorpo, e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. Glicosilação de anticorpos é tipicamente tanto N-Iigado como O-ligado. N-Iigado refere-se à conexão do componente carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são seqüências de reconhecimento para conexão enzimática do componente carboidrato para a cadeia lateral asparagina. Dessa forma, a presença de ambas seqüências de tripeptídeos em um polipeptídio cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-Iigado refere-se à conexão de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxi-aminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usados. A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada por alteração da seqüência de aminoácido, tal como aquela que contém uma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligado). A alteração pode também ser feita por adição de, ou substituição de, um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligado). Vetores, Células Hospedeiras E Métodos Recombinantes

O anticorpo anti-NRP1 da invenção pode ser produzido de forma recombinante, usando-se técnicas e materiais facilmente obtidos.

Para produção de um anticorpo anti-NRP1, o ácido nucléico que codifica é isolado e inserido em um vetor replicável para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA que codifica o anticorpo é prontamente isolado ou sintetizado usando-se procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligar-se especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinal, uma replicação de origem, um ou mais genes marcadores, um elemento enhancer, um promotor, e uma seqüência de terminação de transcrição.

(i) Componente Da Seqüência Sinal

O anticorpo da invenção pode ser produzido de forma recombinante não somente diretamente, mas também como uma fusão do polipeptídio com um polipeptídio heterólogo, que pode ser preferivelmente uma seqüência sinal ou outro polipeptídio que possui um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídio. A seqüência sinal heteróloga selecionada preferivelmente é uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariontes que não reconhecem e processam a seqüência sinal do anticorpo nativo, a seqüência sinal é substituída por uma seqüência sinal procarionte selecionada, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes enterotoxina Il estáveis ao calor. Para a secreção em levedura a seqüência sinal nativa pode ser substituída, por exemplo, por um líder invertase da levedura, líder fator α (incluindo Saccharomyces e líderes fator α Kluyvenomyces), ou líder fosfatase ácida, o líder glucoamilase C. albicans, ou o sinal descrito no documento WO 90/13646. Em expressão de células de mamíferos, a seqüência sinal de mamíferos assim como líderes secretórios virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis.

O DNA para tal região precursora é ligado no quadro de leitura para o DNA que codifica o anticorpo.

íii) Componente Origem De Replicacão Ambos, vetores de expressão e vetores de clonagem contêm uma seqüência de ácido nucléico que permite ao vetor replicar-se em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem, esta seqüência é aquela que permite ao vetor replicar-se independentemente do DNA cromossômico hospedeiro, e inclui origens de replicação ou seqüências replicantes independentes. Tais seqüências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídio pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídio 2μ é adequada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos. Geralmente, o componente origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamíferos (a origem SV40 pode tipicamente ser usada somente porque esta contém o promotor inicial). fui) Seleção Do Componente Gene

Vetores de expressão e clonagem podem conter uma seleção de gene, também designado como um marcador selecionável. Típica seleção de genes que codificam proteína que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) deficiências de complemento auxotrófico, ou (c) suprimento de nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica D-alanina racemase para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza uma droga para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que são sucessivamente transformadas com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência à droga e dessa forma sobrevive ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam as drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores de seleção adequados para as células de mamíferos são aqueles que são capazes de identificar células competentes para ocupar o ácido nucléico do anticorpo, tal como DHFR1 timidina quinase, metalotioneína-l e -II, preferivelmente genes da metalotioneína de primatas, adenosina deaminase, ornitina descarboxilase, etc.

Por exemplo, células transformadas com a seleção de genes DHFR são as primeiras identificadas por cultura de todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx)1 um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando o DHFR tipo selvagem é empregado é a linhagem celular ovariana de hamster Chinês (CHO) deficiente na atividade de DHFR.

Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiros tipo selvagem que contém DHFR endógeno) transformadas ou co- transformadas com seqüências de DNA que codificam o anticorpo, proteína DHFR tipo selvagem, e outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) pode ser selecionado por crescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418. Ver Patente US 4.965.199.

Uma seleção de gene adequada para uso em leveduras é o gene trp1, presente no plasmídio de levedura YRp7 (Stinchcomb et al. (1979) Nature 282:39). O gene írpl fornece um marcador de seleção para uma linhagem mutante desprovida da habilidade de crescimento em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 Jones1 Genetics, 85:12. A presença da lesão trpl no genoma da célula hospedeira de levedura então fornece um ambiente efetivo para detecção da transformação pelo crescimento na ausência de triptofano. De maneira similar, linhagens de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídios conhecidos que produzem o gene Leu2.

Além disso, vetores derivados do plasmídio pKD1 circular de 1,6 μm podem ser usados para transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para produção em grande escala de bezerro chymosin foi relatado por K.lactis. Van den Berg1 Bio/Technology, 8:135. Vetores de expressão multi cópias estáveis para secreção de soro de albumina humano recombinante maduro por linhagens industriais de Kluyveromyces foram também divulgados. Fleer et al. (1991) Bio/Technology 9:968-975.

(IV) Componente Promotor

Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmente ligado ao ácido nucléico do anticorpo. Promotores adequados para o uso em hospedeiros procariontes incluem o promotor phoA, β-lactamase e os sistemas promotores lactose, fosfatase alcalina, um sistema promotor triptofano (trp) e promotores híbridos tal como o promotor tac. No entanto, outros promotores bacterianos conhecidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianos também irão conter uma seqüência Shine-Dalgarno (S.D) operacionalmente ligada ao DNA que codifica o anticorpo.

Seqüências promotoras são conhecidas para eucariontes. Virtualmente todos os genes eucariontes têm uma região rica em AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra seqüência encontrada de 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariontes está uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli A à extremidade 3' da seqüência de codificação. Todas estas seqüências são adequadamente inseridas em vetores de expressão eucariontes.

Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso com leveduras hospedeiras para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveis que possuem vantagens adicionais de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, iso- citocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativa associada com metabolismo do nitrogênio, metalotioneina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose . Vetores e promotores adequados para uso na expressão em levedura estão também descritos na patente EP 73.657. Enhancers de levedura usados com promotores de levedura são também vantajosos.

Transcrição do anticorpo a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos de genomas de vírus tal como vírus polioma, vírus fowlpox, adenovírus (tal como Adenovirus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B e Vírus Simian 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, o promotor actina ou um promotor imunoglobulina, de promotores heat-shock, tais promotores fornecidos são compatíveis com os sistemas da célula hospedeira. Os promotores primários e terminador do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem de replicação viral SV40. O promotor primário imediato de um citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição Hindlll E. Um sistema para expressão de DNA em mamíferos hospedeiros usando-se o vírus papiloma bovino como um vetor é divulgado na patente US 4.419.446. Uma modificação deste sistema está descrita na patente US 4,601,978. Veja também Reyes et al. Nature 297:598-601 (1982) na expressão do cDNA de β-interferon humano em células de camundongo sob o controle de um promotor timidina quinase do vírus herpes simplex. Alternativamente, a terminação longa do vírus do sarcoma de Rous repetida pode ser usada como promotor.

(v) Componente Elemento Enhancer A transcrição do DNA que codifica o anticorpo desta invenção por eucariontes mais evoluídos é freqüentemente aumentada pela inserção de uma seqüência enhancer no vetor. Muitas seqüências enhancer são agora conhecidas por meio de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, poderá ser usado um enhancer a partir de um vírus de célula eucarionte. Exemplos incluem o enhancer SV40 no último lado da origem de replicação (bp 100-270), o enhancer do promotor inicial citomegalovírus, o enhancer polioma no último lado da replicação de origem e enhancers adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297:17-18 nos elementos enhancing para ativação de promotores eucariontes. O enhancer ρ ode ser unido no vetor na posição 5' ou 3' para a seqüência de codificação do anticorpo, mas é preferivelmente localizado em um sítio 5' do promotor.

(vi) Componente Terminação De Transcrição Vetores de expressão usados em célula hospedeiras eucariontes (leveduras, fungos, insetos, vegetais, animais, humanas ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) irão também conter seqüências necessárias para a terminação de transcrição e para estabilização do mRNA. Tais seqüências estão comumente disponíveis nas regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAs de eucariontes ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica o anticorpo. Um componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Ver documento WO 94/110026 e o vetor de expressão divulgado neste.

(VII) Seleção E Transformação De Células Hospedeiras

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de DNA nos vetores no presente incluem células procariontes, leveduras ou eucariontes superiores descritas acima. Procariontes adequados para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativo ou Gram- positivo, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por exemplo., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonellal por exemplo., Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo., Serratia marcescans, e Shigella, assim como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo., B. licheniformis 41P divulgadas em DD 266,710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras linhagens tal como E. coli Β, E. coli X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam também adequadas. Estes exemplos são mais ilustrativos do que limitantes.

Além disso, para procariontes, micróbios eucariontes tal como fungo filamentoso ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam o anticorpo. Saccharomyces cerevisiae, ou fermento comum de padaria, é o mais comumente usado entre os microorganismos hospedeiro eucariontes inferiores. No entanto, uma variedade de outros gêneros, espécies e linhagens são comumente disponíveis e úteis no presente, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces tais como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (Patente EP 402.226); Piehia pastoris (Patente EP 20.183,070); Candida; Trichoderma reesia (Patente EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyees tais como Schwanniomyees oeeidentalis; e fungos filamentosos tais como, por exemplo, hospedeiros Neurospora, Penieillium, Tolypocladium e aspergillus tais como A nidulans e A Niger.

Células hospedeiras adequadas para a expressão do anticorpo glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de inseto. Muitas linhagens baculovirais e variantes e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopietus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de linhagens virais para transfecção está publicamente disponível, por exemplo, variante L-1 de Autographa califomia NPV e linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV e tais vírus podem ser usados como o vírus no presente de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais de algodão, milho, soja, petúnia, tomate e tabaco podem ser também utilizadas como hospedeiros.

No entanto, o interesse em células de vertebrados tem aumentado, e a propagação de células na cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamíferos úteis são linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59); células de rim de filhotes de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células ovarianas de hamster Chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al.(1980), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather (1980), Biol. Reprod. 23:243-251); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humana (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humann (Hpn G2, HR 8065); tumor ma má ri o de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al. (1982) Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68); células MRC; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem descritos acima para produção de anticorpo e cultivadas em meio convencional de nutriente modificado como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

(viu) Cultura De Células Hospedeiras

As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo desta invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Modificado de Eagle de Dulbecco ((DMEM)1 Sigma) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham. et al. (1979) Meth. Enz. 58:44, Barnes et al. (1980) Anal. Biochem.102:255, Patentes US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195; ou na patente US Re. 30.985 podem ser usados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado como necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidermal), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como droga GENTAMYCINTM™), elementos traço (definido como componentes inorgânicos usualmente presentes na concentração final na taxa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário pode também ser incluído na concentrarão apropriada queseriamconhecidas para aqueles technicas no assunto. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para um técnico no assunto. fix) Purificação De Anticorpo

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasma ou diretamente secretado em um meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como um primeiro passo, o fragmento particulado, tanto das células hospedeiras como fragmentos lisados, é removido, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167 descreve um procedimento para isolar anticorpos que são secretados no espaço periplasmático de E.coli. Resumidamente, a pasta celular é derretida na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) por cerca de 30 minutos. Fragmentos celulares podem ser removidos por centrifugação. Onde o anticorpo é secretado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados usando-se um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer dos passos antecedentes para inibir proteólises e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes imprevistos.

A composição de anticorpo preparada das células pode ser purificada usando-se, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, e cromatografia por afinidade, com cromatografia por afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como um Iigante de afinidade depende da espécie e isótopos de qualquer imunoglobulina de domínio Fc que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser ussda para purificar anticorpos pus cão bsscsdss cm cadeias pesadas γ1, γ2, ou γ4 humana (Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13). A proteína G é recomendada para todos os isótopos de camundongo e para γ3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). (1986) EMBO J. 5:15671575). A matriz para a qual o Iigante de afinidade é anexado é mais freqüentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro poroso controlado ou poli(estireno-divinil)benzeno permitem velocidades de fluxo mais rápidas e tempos de processo mais curtos do que pode ser atingido com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABXTM™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas para purificação de proteína tais como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSETM™, cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), chromatofocusing, SDS-PAGE, precipitação em sulfato de amônia estão também disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Seguindo qualquer passo de purificação preliminar, a mistura que compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser sujeita a cromatografia de interação hidrofóbica em baixo pH, usando-se um tampão de elução com um pH entre aproximadamente 2,5 - 4,5, preferivelmente apresentada em baixas concentrações de sal (por exemplo, de aproximadamente 0 - 0,25 M de sal).

Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas do anticorpo são preparadas para armazenamento pela mistura do anticorpo que tem o grau desejado de purificação com veículos opcionais aceitáveis fisiologicamente, excipientes ou estabilizantes, (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formações íicfiíizadas cu cduçcos squcGss. Veículos aceitáveis, excipientes ou estabilizantes não tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzil; alcila parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídios de baixo peso molecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); polipeptídios, proteínas, tais como soro de albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais de contra íons tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexo proteína Zn); e/ou surfactantes não-iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

A formulação no presente pode também conter mais que um componente ativo como necessário para a indicação específica sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetem contrariamente um ao outro. Por exemplo, pode ser desejável fornecer também um agente imunossupressivo. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação nas quantidades que são efetivas para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos podem também ser capturados na microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, liposomas, mioroesferas de albumina, micrcsrr.ulsões, nancpartícuias e nanoeápsülas) õü em macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membrana de filtração estéril.

Preparações de liberação contínua podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação contínua incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímeros ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolido), e ácido poli-D-(-)- 3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como acetato de etileno-vinil e ácido lático-ácido glicólico permitem liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Anticorpos quando encapsuladas permanecem no corpo por um longo tempo, eles podem desnaturar ou agregar como um resultado de exposição à umidade a 37°C, que resulta em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser desenvolvidas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto como sendo de formação de ligação S-S intermolecular através de intercâmbio tio-bissulfeto, a estabilização pode ser alcançada por modificação de resíduos sulfidril, soluções ácidas de liofilização, controle da umidade do conteudo, uso apropriado de aditivos, e desenvelvimento de composicoes de matriz de polímeroespecíficas.

Usos Terapêuticos

É contemplado que o anticorpo da presente invenção pode ser usado para tratar um mamífero. Em uma realização, o anticorpo é administrado a um mamífero não humano para os propósitos de se obter dados clínicos, por exemplo. Mamíferos não humanos exemplares a serem tratados incluem primatas não humanos, cachorros, gatos, roedores e outros mamíferos nos quais os estudos pré- clínicos são realizados. Tais mamíferos podem ser estabelecidos como modelos animais para uma doença a ser tratada com o anticorpo ou pode ser usado para estudo de toxicidade do anticorpo de interesse. Em cada uma destas realizações, estudos de dose escalonada podem ser realizados no mamífero. Onde o anticorpo é um anticorpo anti-NRP1, pode ser administrado a um hospedeiro roedor em um modelo de tumor sólido, por exemplo.

Além disso, ou como alternativa, o anticorpo é usado para tratar um humano, por exemplo, um paciente que sofre de uma doença ou disfunção, o qual poderia se beneficiar da administração do anticorpo.

A presente invenção engloba terapia anti-angiogênica de câncer, uma nova estratégia de tratamento de câncer voltada para a inibição do desenvolvimento de vasos sangüíneos de tumor, necessários para fornecer nutrientes para manter o crescimento do tumor. Devido a angiogênese estar envolvida tanto no crescimento do tumor primário como metástase, o tratamento angiogênico fornecido pela invenção é capaz de inibir o crescimento neoplástico do tumor no sítio primário, como também prevenir metástases de tumor nos locais secundários, permitindo então o ataque aos tumores por outra terapêutica. Exemplos de câncer a serem tratados no presente pedido incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem câncer de células escamosas, câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma do pulmão, e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago (incluindo câncer gastrointestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma uterino ou endometrial, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireóide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, como também linfoma de célula B (incluindo linfoma não-Hodgkin de baixo grau/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de célula clivada não pequena de alto grau; NHL de doença volumosa; linfoma de célula do manto; linfoma relacionado à AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de célula cabeluda; leucemia mieloblástica aguda; e disfunção Iinfoproliferativa pós-transplante (PTLD), como também proliferação vascular anormal associada com facomatoses, edema (tais como aqueles associados com tumores do cérebro), e síndrome de Meigs. Mais especificamente, cânceres que são receptivos ao tratamento pelos anticorpos da invenção incluem câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão de célula não pequena, Iinfoma não-Hodgkins (NHL), câncer de célula renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer pancreático, sarcoma de tecidos moles, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinóide, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer ovariano, mesotelioma, e mieloma múltiplo Mais preferivelmente, os métodos da invenção são usados para tratar câncer colorretal em um paciente humano.

É contemplado que quando usado para tratar várias doenças tais como tumores, os anticorpos da invencao podem ser combinados com outros agentes terapêuticos adequados para as mesmas doenças ou similares. Quando usados para tratar câncer, os anticorpos da presente invenção podem ser usados em combinação com terapias convencionais de câncer, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia ou combinações destas.

Em certos aspectos, outros agentes terapêuticos úteis para combinação de terapia de câncer com o anticorpo da invenção incluem outros agentes antiangiogênicos. Muitos agentes antiangiogênicos foram identificados e são conhecidos na técnica, incluindo aqueles listados por Carmeliet e Jain (2000).

Em um aspecto, o anticorpo da invenção é usado em combinação com um antagonista de VEGF ou um antagonista do receptor de VEGF, tais como anticorpos anti-VEGF, variantes VEGF, fragmentos de receptores VEGF solúveis, aptâmeros capazes de bloquear VEGF ou VEGFR, anticorpos que neutralizam anti-VEGFR, inibidores de VEGFR tirosina quinases e quaisquer combinações destes. Alternativamente, ou além disso, dois ou mais anticorpos anti-NRP1 podem ser co-administrados ao paciente. Em uma realização mais específica, o anticorpo anti-NRP1Aou anti-NRPB é usado em combinação com um anticorpo anti-VEGF para gerar efeitos aditivos ou sinérgicos. Anticorpos anti-VEGF preferidos incluem aqueles que se ligam ao mesmo epítopo como o anticorpo anti-hVEGF A4.6.1. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-VEGF é bevacizumab ou ranibizumab.

Em alguns aspectos, outros agentes terapêuticos úteis para combinação de terapia de tumor com o anticorpo da invenção incluem antagonistas de outros fatores que estão envolvidos no crescimento tumoral, tais como EGFR1 ErbB2 (também conhecido como Her2) ErbB3, ErbB4 ou TNF. Preferivelmente, o anticorpo anti-NRP1 da invenção pode ser usado em combinação com inibidores tirosina quinase do receptor de molécula pequena (RTKIs) que atingem um ou mais receptores tirosina quinase tais como receptores VE-GF-, rccsptcrss FGF1 receptores EGF e receptores PDQF Muitas moléculas pequenas terapêuticas RTKIs são conhecidas na técnica, incluindo, mas não limitadas a, vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC- 412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®), XL880, e CHIR-265.

O anticorpo anti-NRP1 da invenção, tanto sozinho como em combinação com um segundo agente terapêutico (tal como um anticorpo anti- VEGF) pode também ser usado em combinação com um ou mais agentes quimioterápicos. Uma variedade de agentes quimioterápicos pode ser usada nos métodos de tratamento combinado da invenção. Uma lista de agentes quimioterápicos exemplares e não Iimitantes contemplados é fornecida no presente pedido nas "Definições".

Quando o anticorpo anti-NRP1 é co-administrado com um segundo agente terapêutico, o segundo agente terapêutico pode ser administrado primeiro, seguido pelo anticorpo anti-NRP1. No entanto, administração simultânea ou administração do anticorpo anti-NRP1 primeiro é também contemplada. Dosagens adequadas para o segundo agente terapêutico são aquelas atualmente usadas e podem ser diminuídas devido a ação combinada (sinergia) do agente e anticorpo anti-NRP1.

Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada do anticorpo irá depender do tipo de doença a ser tratada, da severidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias, o histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e a discrição do médico. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente uma vez ou no decorrer de uma série de tratamentos.

Depending on the type and severity of the disease, about 1 pg/kg to 50 mg/kg (e.g. Dependendo do tipo e severidade da doenca cerca de 1 μg/kg a 50 mg/kg (por exemplo, 0,1 - 20 mg/kg) de anticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, para uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de aproximadamente 1pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento é prolongado até ocorrer uma desejada supressão dos sintomas da doença No entanto, outros regimes de dosagem podem ser funcionais. Em um aspecto preferido, o anticorpo da invenção é administrado a cada duas a três semanas, em uma variação de dosagem de aproximadamente 5mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg. Mais preferivelmente, tal regime de dosagem é usado em combinação com um regime quimioterápico como terapia de primeira linha para tratamento de câncer colorretal metastático. Em alguns aspectos, o regime quimioterápico envolve administração intermitente de dose alta tradicional. Em alguns outros aspectos, os agentes quimioterápicos são administrados usando-se doses menores e mais freqüentes sem intervalos programados ("quimioterapia metronômica"). O progresso desta terapia da invenção é facilmente monitorado por técnicas e testes convencionais. A composição do anticorpo será formulada, dosada e administrada em um modo consistente com as boas práticas médicas. Fatores para consideração neste contexto incluem a disfunção específica sendo tratada, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica individual do paciente, a causa da disfunção, o sítio de entrega do agente, o método de administração, o período de administração e outros fatores conhecidos pelo médico. A "quantidade terapeuticamente efetiva" do anticorpo a ser administrado será dirigida por tais considerações, e é a mínima quantidade necessária para prevenir, melhorar ou tratar uma doença ou disfunção. O anticorpo não precisa ser, mss s opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar a disfunção em questão. A quantidade efetiva de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, o tipo de disfunção ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Estes geralmente são usados na mesma dosagem e com rotas de administração como previamente mencionado ou cerca de 1 a 99% das dosagens até agora empregadas. Geralmente, alívio ou tratamento de uma doença ou disfunção envolve a diminuição de um ou mais sintomas ou problemas médicos associados com a doença ou disfunção. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente efetiva da droga pode acompanhar uma ou mais combinações dos seguintes: reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, diminuir até certo ponto e preferivelmente barrar) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir metástases de tumor; inibir, até certo ponto, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Até certo ponto a droga pode prevenir crescimento e/ou destruir células cancerosas existentes, podendo ser citostática e/ou citotóxica. Em algumas realizações, uma composição desta invenção pode ser usada para prevenir o princípio ou recorrência da doença ou disfunção em um sujeito ou mamífero. lisos Não Terapêuticos

Os anticorpos da invenção podem ser usados como agentes de purificação de afinidade. Neste processo, os anticorpos são imobilizados em uma fase sólida tal como resina Sephadex ou filtro de papel, usando-se métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado é contatado com uma amostra contendo o antígeno a ser purificado, e posteriormente o suporte é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material da amostra, exceto o antígeno a ser purificado, que é ligado ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão glicina, pH 5,0, que ira liberar o antigeno de anticorpo.

Os anticorpos desta invenção podem também ser úteis nos testes diagnósticos, por exemplo, para detectar a expressão de um antígeno de interesse em células específicas, tecidos ou soro.

Para aplicações de diagnóstico, o anticorpo tipicamente será marcado com um componente detectável. Diversas marcas estão disponíveis, as quais podem ser agrupadas nas seguintes categorias:

(a) Radioisótopos, tais como 35S1 14C1 125I, 3H e 131I. O anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo usando-se as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al. (1991) Ed.

Wiley-lnterscience, Nova York, Nova York, Pubs, por exemplo, e a radioatividade pode ser medida usando-se contagem cintilante.

(b) Marcadores fluorescentes como quelatos de raros-terra (quelatos európio) ou fluorescina e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, Lisamina, ficoeritrina e Texas Red estão disponíveis. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados ao anticorpo usando-se técnicas divulgadas em Current Protocols in Immunology, acima, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada usando-se um fluorímetro.

(c) Vários marcadores enzima-substrato estão disponíveis e a patente US 4.275.149 fornece uma revisão de alguns destes. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromatogênico que pode ser medida usando-se várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração de cor em um substrato que pode ser medido espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. Técnicas para quantificar uma alteração na fluorescência estão descritas acima. O substrato quimioluminescente torna-se eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz, a qual pode ser medida (usando-se um quimiouminometro, por exemple) ou doando energia a um receptor fluorescente. Exemplos de marcas enzimáticas incluem Iuciferases (por exemplo, Iuciferase de vagalume e Iuciferase de bactérias; Patente US 4.737.456), luciferina, 2,3-desidroftalazinedionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano silvestre (HRPO)1 fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarídeos oxidases (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfate desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similares. Técnicas para conjugar enzimas aos anticorpos estão descritas em O1SuIIivan et ai. (1981) Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nova York 73:147-166.

Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por

exemplo:

(i) Peroxidase de rábano silvestre (HRPO) com peroxidase hidrogenada como um substrato, em que a peroxidase hidrogenada oxida um precursor de cor (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou 3,3',5,5'- tetrametil benzidina hidrocloreto (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com para-Nitrofenil fosfato como substrato cromatogênico; e

(iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromatogênico (por exemplo, p-nitrofenil-3-D-galactosidase) ou substrato fluorogênico (por exemplo, 4-metilumbeliferil-p-D-galactosidase).

Diversas outras combinações enzima-substrato estão disponíveis para aqueles técnicos no assunto. Patentes US 4.275.149 e US 4.318.980.

Algumas vezes, o marcador é conjugado indiretamente com o anticorpo. Um técnico no assunto pode ter conhecimento de diversas técnicas para alcançar isto. Por exGrr.p!s7 c anticorpo pode ser conjugado com bioiina, ρ qualquer uma das três amplas categorias de marcadores mencionados acima pode ser conjugada com avidina ou vice-versa. Biotina liga-se seletivamente à avidina e dessa forma, o marcador pode ser conjugada com o anticorpo desta maneira indireta. Alternativamente, para alcançar conjugação indireta do marcador com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um pequeno hapteno (por exemplo, digoxina) e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima é conjugado com um anticorpo anti-hapteno (por exemplo, anticorpo anti-digoxina). Dessa forma, conjugação indireta do marcador com o anticorpo pode ser alcançada.

Em outra realização da invenção, o anticorpo não precisa ser marcado, e a presença deste pode ser detectada usando-se um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo.

Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de teste conhecido, tais como testes de ligação competitiva, testes sanduíche diretos e indiretos e testes de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, páginas.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Ensaios de ligação competitiva dependem da habilidade de um padrão marcado competir com a amostra de teste análise para ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. Essa quantidade de antígeno na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade padrão que se torna ligada aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade do padrão que se torna ligado, os anticorpos geralmente estão insolúveis antes ou depois da competição, de forma que o padrão e a análise que estão ligados aos anticorpos podem convenientemente ser separados do padrão e análise que permanecem não ligados.

Testes sanduíche envolvem o uso de dois anticorpos, cada um capaz dê se ligar a porções irnunogêriicsG diferentes, cj epítopo, da proteína a ser detectada. Em um teste sanduíche, a amostra de teste análise é ligada por um primeiro anticorpo que é imobilizado em um suporte sólido, e então um segundo anticorpo liga-se à análise, formando dessa forma um complexo tripartite insolúvel Ver, por exemplo, Patente US 4.376.110. O segundo anticorpo pode ser marcado com uma componente detectável (testes sanduíche direto) ou pode ser medido usando-se um anticorpo anti- imunoglobulina que é marcado com um componente detectável (teste sanduíche indireto). Por exemplo, um tipo de teste sanduíche é um teste ELISA, no caso do componente detectável ser uma enzima.

Para imunohistoquímica, a amostra de tumor pode ser fresca ou congelada ou pode estar embebida em parafina e fixada com um conservante tal como formalina, por exemplo.

Os anticorpos também podem ser usados para testes diagnósticos in vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado com um radionuclídeo (tal como 111In, "Tc, 14C, 131I1 125I1 3H1 32P ou 35S) ou um corante, de forma que o tumor possa ser localizado usando-se imunocintilografia.

Em uma realização, um método para detectar NRP1 em uma amostra biológica (por exemplo, tecido, sangue, soro, fluido espinhal) ou uma amostra biológica preparada pode compreender a etapa de contatar um anticorpo desta invenção com a amostra e observar o anticorpo anti-NRP1 ligado ao NRP1 na amostra ou determinar a quantidade do anticorpo anti- NRP1 ligado ao NRP1 na amostra. Em outra realização, um método para detectar NRP1 em um sujeito compreende a etapa de administrar um anticorpo desta invenção ao sujeito e observar o anticorpo anti-NRP1 ligado ao NRP1 no sujeito ou determinar a quantidade do anticorpo anti-NRP1 ligado ao NRP1 no sujeito (por exemplo, humano, camundongo, coelho, rato, etc.).

Kits De Diagnóstico

Como urna questão de convsr,;cnc:a, c anticorpo da presente invenção pode ser fornecido em um kit, isto é, uma combinação de reagentes embalados nas quantidades pré-determinadas com instruções para realização do teste diagnóstico. Quando o anticorpo é marcado com uma enzima, o kit irá incluir substratos e cofatores necessários pela enzima (por exemplo, um substrato precursor que fornece o cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, outros aditivos podem ser incluídos, tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e similares. As quantidades relativas de vários reagentes podem variar amplamente para fornecer concentrações na solução dos reagentes que substancialmente melhorem a sensibilidade do teste. Especificamente, os reagentes podem ser fornecidos como pó secos, usualmente liofilizados, incluindo excipientes, que na dissolução irão fornecer uma solução reagente que possui a concentração apropriada.

Artigos De Fabricação

Em outra realização da invenção, é fornecido um artigo de fabricação que contém materiais úteis para o tratamento das disfunções descritas acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados por uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O agente ativo na composição é o anticorpo. Um rótulo no recipiente, ou associado com o mesmo, indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. O artigo de fabricação pode, além disso, compreender um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, solução salina fosfato tamponada, solução de Ringer e solução dexírose. Este pode também incluir õüíros materiais -GGmere-iais· desejáveis -de ponto de vista do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas, e bulas com instruções para o uso.

Os exemplos seguintes têm a intenção de meramente ilustrar a prática da presente invenção e não são fornecidos com o objetivo de limitação. As divulgações de todas as patentes e literaturas cinetíficas citadas no presente pedido são integralmente incorporadas como referência.

Exemplos

Exemplo 1

Geração De Anticorpos Anti-NRPI

A. Geração De Bibliotecas De Anticorpo Em Fago

Uma variedade de métodos para geração de bibliotecas de anticorpo exibidas em fago ou exibidas usando-se outra tecnologia, é conhecida na técnica. Umas das vantagens destas bibliotecas, quando comparado às tecnologias de hibridoma convencionais, é que elas são bastante adequadas para gerar anticorpos funcionais entre espécies, porque elas permitem seleção in vitro e seleção sem a introdução de tolerância imune. Smith (1985) Science 228:1315-1317; Bradbury e Marks (2004) J Immunol Methods 290:29^9.

Em geral, dois tipos de bibliotecas de anticorpo combinatórias foram desenvolvidos, diferenciados pela fonte de repertórios. A maioria das bibliotecas até hoje são bibliotecas de anticorpos "naturais" que usam os repertórios naturais como fonte para a diversidade, onde os genes como RNA mensageiro de células imunes de humanos ou animais virgens ou imunizados são amplificados e clonados no vetor por exibição por fago ou outra tecnologia de exibição, tal como exibição por ribossomo ou levedura. Os anticorpos naturais usualmente têm múltiplas estruturas, que juntas com seqüências CDRs variáveis e a recombinação da cadeia leve e cadeia pesada constituíram a diversidade da biblioteca. O tamanho da biblioteca determina o desempenho das bibliotecas, já que os repertórios são em gerai maiôfês do que o tamanho da biblioteca. A biblioteca sintética, por outro lado, é um novo ramo da biblioteca onde a diversidade é designada e construída na biblioteca com DNA sintético. Estruturas simples ou múltiplas foram usadas. Para biblioteca de estrutura simples, a fonte da diversidade depende somente da degeneração do DNA sintético designado para criar as diversas alças CDR. Tanto o projeto de diversidade como o tamanho das bibliotecas são críticos para o desempenho da biblioteca, que pode ser medido pela afinidade dos anticorpos encontrados nas bibliotecas. Knappik et al. (2000) J Mol Biol 25 296:57-86; Sheets et al. (1998) Proc NatIAcad Sci USA 95: 6157-6162; de Haard et al. (1999), J. Bioi Chem. 274, 18218-18230.

Pela introdução de diversidade sintética nas posições expostas ao solvente dentro das regiões determinantes de complementaridade (CDRs), Lee et al. desenvolveu uma biblioteca de anticorpo sintética exibida por fago em uma estrutura humana simples (VLkappa i, VH,SUbgrupo m)· Sidhu et al. (2004) J Mol Biol 338:299-310; Lee et al. (2004) J Mol Biol 340:1073-1093; Carter et al. (1992) Proc Natl Aead Sei USA 89:4285-4289. Esta biblioteca "VH" foi exibida como um fragmento de ligação de antígeno (Fab'2) e usada para construir códons para imitar a diversidade natural observada na imunoglobulina humana. Lee et al. (2004) J. Immunol. Methods. 284:119-132.

Enquanto a biblioteca VH teve bom desempenho, como medido pela afinidade e função dos anticorpos derivados, modificações adicionais na biblioteca projetada podem ser desejáveis na geração de anticorpos funcionais de certos antígenos alvo de interesse. A recente disponibilidade de trinucleotídeos para síntese de oligonucleotídeos permite a habilidade de aumentar a diversidade de aminoácido sem aumentar a diversidade do DNA.

Uma nova biblioteca VHA/L foi então gerada como descrito acima, em que as posições altamente variáveis na CDR-L3 foram também diversificadas, já que CDR-H3 e CDR-L3 fornam a esfera interna do sítio de ligação de antigeno. Mian et al. (1991) J Mol Biol 217:133-15 1.

Materiais ε Métodos

O molde da biblioteca virgem VH/VL com CDR-L1, L2, L3, H1 e H2 consensos foi gerado usando-se mutagênese de oligonucleotídeo-dirigida no fagomídio pV0350-4 com códons stop na CDRH3 e exibidas de forma bivalente nas superfícies das partículas do bacateriófago M13. Lee et al. (2004) J. Mol Biol 340:1073-1093. Bibliotecas exibidas por fago foram construídas usando-se o método de mutagênese Kunkel como descrito (Kunkel et al. (1991) Methods Enzymol 204:125-139), com uma mistura de oligonucleotídeos mutagênicos projetados para introduzir mutações nos sítios designados CDR-L3, H1, H2 e H3 e reparar os códons stop CDR-H3. As reações de mutagênese (~10pg de DNA) foram eletroporadas em células E. coli SS320 1011 células), como descrito (Sidhu et al. (2004)).

Resultados

A biblioteca VH/VL aqui descrita utilizou o Herceptin® derivado de VLkappa I e VHSUbgroup mi na estrutura, como usado para biblioteca VH, que mostrou boa exposição em bacteriófago, boa expressão em E. coli, e que pode rapidamente ser convertida para uma IgG de comprimento total que tem boa expressão em células de mamíferos. Lee et al. (2004) J Mol Biol 340:1073-1093; Carter et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:42854289. As bibliotecas foram exibidas na superfície do fago como Fab (Fab'2) bivalente pela união à proteína P3 de revestimento de fago. Esta exibição bivalente teve a intenção de aumentar as afinidades de ligação aparentes para antígenos imobilizados e ajudar a melhorar a recuperação de clones de anticorpos de fago de rara ou baixa afinidade.

Para evitar potenciais influências inerentes às seqüências CDR derivadas do Herceptin® mantidas na cadeia leve da biblioteca VH1 seqüências CDR kappa ! ccnscncc foram introduzidas no molde para a biblioteca VH/VL. Resíduos CDR consenso são determinados pela seleção da maioria dos aminoácidos predominantes que existem nos anticorpos humanos naturais. Os códons stop previamente empregados na biblioteca VH para garantir mutagênese em todas as 3 CDRs1 foram substituídos de forma similar por seqüências subgrupo Ill consenso para CDR-H1 e CDR-H2. A seqüências consenso CDR representam os aminoácidos predominantes em cada posição. CDR-H3 desempenha um papel dominante no reconhecimento de antígeno, então diversos stop códons foram colocados na para garantir que clones de anticorpos funcionais das bibliotecas fossem diferentes entre si. Xu et al. (2000) Immunity 13: 37-45. A presença de seqüências CDR consenso humana era suposta permitir parcialmente variantes mutadas (nem todas as CDRs atingidas são alteradas) para ser exibida e permanecer potencialmente funcional na ligação. Desta forma o projeto VH/VL tem a vantagem de aumentar a razão dos clones de anticorpo em fago funcional na biblioteca. As seqüências CDR usadas foram SISSYL para CDR-L1 (posições 28-33), GASSRA para CDR-L2 (posições 50-55), YYSSPL para CDR-L3 (posições 91-96), FTFSSYAMS para CDR-H1 (posições 27-35), e RISPSGGSTY para CDR-H2 (posições 50-58), e WXXXRPXXMDY para CDR-H3 (posições 95-102, X é um códon stop) como mostrado na Tabela I A predominância de cada posição nos anticorpos humanos é também mostrada na Tabela I.

A diversidade na biblioteca VH/VL foi introduzida em um subconjunto de posições CDR baseado nas suas exposições ao solvente e/ou especialmente alta variabilidade entre seqüências de anticorpo naturais. As posições escolhidas para mutagênese e a diversidade que foi introduzida são mostradas na Tabela II. Por exemplo, na CDR-H1, as posições 27, 28, 30, 31, 32, 32 c 34 foram escolhidas para diversificar. Para o projeto da biblioteca VH/VL, códons de oligonucleotídeos ou trinucleotídeos degenerados foram usados para guiar a diversidade em cada posição de forma que a maioria dos aminoácidos predominantes estariam representados. Por exemplo, na CDR-H1 (posição 30), a serina representa aproximadamente 50% de diversidade natural, então a mistura de trinucleotídeo (X1) que tem ca. 52% de serina e 2,5% de outro aminoácido, exceto cisteína foi usada.

CDR-H3 e CDR-L3 formam o centro do sítio de ligação antígeno-anticorpo e mostram assim a mais alta freqüência de contatos de antígeno nos complexos anticorpo-antígeno estruturalmente conhecidos. Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883. Cinco resíduos na CDR-L3 (Tabela II) com a variabilidade maior foram randomizados. Geralmente CDR-H3 é mais diversa em termos de comprimento, seqüência e estrutura, e é componente chave da diversidade nos anticorpos naturais. Xu e Davis (2000) Immunity 13:37-45; Wu et al. (1993) Proteins 16:1-7. Então 12 sub-bibliotecas foram construídas com diferentes comprimentos de CDR-H3 variando de 9 a 20 aminoácidos. Combinadas, estas sub-bibliotecas cobrem aproximadamente 90% da variação de comprimento de CDR-H3 nos anticorpos naturais. Oligonucleotídeos que codificam CDR-H3 foram sintetizados usando-se códons de trinucleotídeos. Isto nos permitiu deletar facilmente a cisteína (rara na CDR-H3), e aumentar os níveis de glicina, tirosina e serina, e resíduos mais abundantes na CDR-H3. Mian et al. (1991) J Mol Biol 217:133-151. O códon X7, uma mistura de trinucleotídeos de aproximadamente 15,6% de cada uma da serina, tirosina e glicina, com 3,1% de cada um dos aminoácidos exceto cisteína, foi usada para cada posição na CDR-H3 (cálculo teórico para todas as misturas de trinucleotideos). Diferentes ccmbinaçoes de trinucleotídeos foram também usadas nas posições selecionadas de CDR-HI, H2, H3 e U. Como mostrado na Tabela II e Tabela I Suplementar, os Códons Xl a X6 têm uma alta porcentagem de serina, tirosina ou glicina. X1 tem 52,5% de serina, X2 tem 52,5% de tirosina, X3 tem 10% de tirosina, glicina ou serina, X4 tem 28,8% de glicina, X5 tem 19,2% de tirosina, glicina ou serina, e X6 tem 20% de tirosina ou serina, glicina ou serina, e X6 tem 20% de tirosina ou serina. A biblioteca de fago de anticorpo VH/VL foi estimada para ter aproximadamente 1010 variantes exibidas.

Tabela 1

Seqüência Consenso De CDR-L1. CDR-L2, CDR-L3. CDR-HI E CDR-H2 No

Molde Da Biblioteca VH/VL.

Resíduos CDR consenso são determinados pela seleção da maioria dos aminoácidos predominantes que existem nos anticorpos humanos naturais. A predominância (%) de cada resíduo nos anticorpos humanos em uma dada posição é mostrada, a qual é calculada a partir do alinhamento de aproximadamente 1600 seqüências de cadeia leve humanas e 3500 seqüências de cadeia pesada humanas no banco de dados de Kabat (Kabat et al. (1977), J. Bioi Chem. 252:6609-6616. <table>table see original document page 84</column></row><table> Tabela H

Diversidade Projetada De CDR-L3. CDR-H1. CDR-H2 E CDR-H3 Para Biblioteca VH/VL.

As posições CDR escolhidas para randomização na CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 são listadas com resíduos consenso no molde de biblioteca. A diversidade projetada é tanto um grupo de resíduos codificados por um códon degenerado montado (itálico) como 19 aminoácidos sem cisteína, codificados pela mistura de códons de trinucleotídeos (texto em negrito), de forma que a porcentagem de tipos de aminoácido codificados em cada posição estava próxima ou maior do que 50% de tipos de arnincácidcs encontrados no banco de dados. Para posições específicas, todos os 19 aminoácidos sem cisteína são introduzidos usando-se misturas de códons com diferentes influências para Tyr (Y)1 Gly (G) e Ser (S).

<table>table see original document page 85</column></row><table> <table>table see original document page 86</column></row><table>

Β. Geração De Anticorpos Anti-NRPI Monoclonais Derivados De Fago

Materiais ε Métodos Escolha De Biblioteca E Seleção Para Identificar Anticorpos Anti-NRPI

Construções de NRP1 humano e murino (1-641aa) foram clonadas em vetores de expressão de mamíferos e expressas em células CHO. Formas retiradas dos domínios NRP-1, ala2 e blb2, foram expressas em baculovírus. Imunoplacas Maxisorp NUNC de 96 poços foram revestidas durante a noite a 4°C com antígeno alvo (10 ug/ml) e foram bloqueadas por 1h em temperatura ambiente com tampão de bloqueio de fago PBST (PBS e 1% BSA e 0,05% Tween 20). As bibliotecas de anticorpo em fago foram adicionadas às placas de antígeno e incubadas durante a noite em temperatura ambiente. No dia seguinte as placas revestidas com antígeno foram lavadas 10 vezes com PBT (PBS com 0,05% T-20), e o fago ligado foi eluído com 50 mM de HCI e 500 mM de NaCI por 30 minutos e neutralizadas com igual volume de 1M Tris base pH 7,5. O fago recuperado foi amplificado em células E.coli XL-1 Blue. Durante os ciclos de seleção subseqüentes, a incubação do anticorpo em fago com as placas revestidas de antígeno, foi reduzida para 2-3 horas e a estringência da placa lavada foi aumentada gradualmente.

Afinidades De Ligação De Anticorpos Anti-NRPI . Especificidade E Análise Da Citometria De Fluxo

Valores IC50 de anticorpo em fago foram determinados usando-se ELISA de ligação em fago competitivo como descrito. Lee et al. (2004) J Mol Biol 340:1073-1093. As curvas de competição foram ajustadas com o programa de ajuste de regressão não linear de quatro parâmetros (Kaleidagraph, Synergy Software) para determinar os valores IC50 que foram então calculados como a concentração de antígeno no estágio de ligação da solução que inibiu 50% do anticorpo exibido em fago da ligação ao antígeno imobilizado.

Clones de interesse foram então rearranjados em IgGs por clonagem das regiões VL e VH de clones individuais no vetor LPG3 e LPG4 respectivamente (Carter et al. (1992) Pmc Natl Acad Sci USA 89:4285^289), expressos de forma transitória nas células de mamífero, e purificados com colunas de proteína A. Para determinações de ligação de afinidade de anti-NRP1 IgGs, medida de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) com um instrumento BIAcoreTM-3000 foi usada. Anti-NRPI IgGs foram acoplados para ativar chips biosensor CM5 para atingir aproximadamente 500 unidades de resposta (RU), seguido pelo bloqueio de grupos não reagidos com 1M etanolamina. Para medidas cinéticas, duas diluições consecutivas de Neuropilina (0,7 nM a 500 nM) são injetadas em tampão a 25°C a uma taxa de fluxo de 30 μΙ/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (kotf) foram calculadas usando-se um modelo de ligação Langmuir um para um simples (BIAcore Programa de Avaliação versão 3.2). A constante de equilíbrio de dissociação (kd) foi calculada como a razão IWkon.

Para testes de especificidade de ligação, 10 pg/ml de IgGs em tampão PBST foi incubado com 2 pg/ml de placas Maxisorp de 96 poços por pelo menos 1 hora, e as placas forma lavadas com tampão PBT. Os anticorpos ligados foram detectados com conjugados de anticorpo anti-humano HRP1 desenvolvido com substrato TMB por aproximadamente 5 minutos, suprimidos com 1M de H3PO4, e lidos em espectrofotometria a 450 nm.

Para análise de citometria de fluxo, células HUVEC foram separadas dos frascos de cultura de tecido com tampão de dissociação celular. As células dissociadas foram lavadas em PBS e resuspensas em PBS contendo 2% de Soro Fetal Bovino (tampão FACS). As células foram incubadas com 10 pg/ml de anticorpos anti-NRP1 ou anticorpo controle (anti-IgE) em tampão FACS no gelo por 30 minutos. As células foram então lavadas duas vezes em PBS, e coradas em tampão FACS com IgG anti-humano de cabra PE-Fab'2, o anticorpo Fc específico no gelo por 30 minutos. Seguindo duas lavagens com PBS, as células foram resuspensas em 200 μΙ de tampão FACS e analisadas por citometria de fluxo (calibre FACS, Benton Dickenson, Mountain View, CA) usando-se o programa Cell-Quest.

Resultados

As 12 sub-bibliotecas VH/VL foram individualmente panoramizadas contra células CHO expressas na proteína hNRP1 (ala2blb2)-Fc para o primeiro ciclo de seleção. Os fagos eluídos para cada sub-biblioteca foram amplificados e então combinados para o segundo ciclo de seleção. Já que hNRP1-Fc foi usado como antígeno, o fago agrupado foi pré-absorvido com o excesso de proteína de fusão irrelevante após o primeiro ciclo de panoramização para minimizar a recuperação de anticorpos anti-Fc de fago. Após o quarto ciclo de panoramização, 95 clones coletados aleatoriamente foram avaliados para a habilidade de se ligar especificamente a NRP1. Noventa por cento dos clones eram positivos para ligação a hNRP1 e 40% dos clones positivos se ligaram tanto a NRP1 humana como de murino.

Estes clones de fago foram seqüenciados e 10 clones exclusivos foram escolhidos para posterior caracterização. Todos se ligaram tanto à NRP1 humana como de murino com um IC5O abaixo de 70 nM no fago ELISA. Clone YW64.3 ligado a NRP1 humana e de murino com um IC50 de 0,5 e 3,4 nM, respectivamente (Tabela III). As seqüências dos clones refletem o projeto da biblioteca VH/VL com comprimentos variáveis de CDR-H3 e alterações variáveis distribuídas pela CDR-HI, H2 e L3 apesar de algumas seqüências CDR consenso do molde da biblioteca estarem retidas. Os clones 64.3 e 64.29 tiveram alterações em todas a 4 CDRs e também tiveram as melhores afinidades de ligação tanto para NRP1 humana como murino (Tabela III).

Tabela ill

Seqüências CDR Parciais E Afinidade De Ligação (Fago IC50) Para

Anticorpos Anti-NRPI

Somente seqüências de aminoácido CDR em posições aleatórias de 11 clones de fago diferentes inicialmente identificados da biblioteca VH/VL estão mostradas. As afinidades como valores IC50 para hNRP1 e mNRP1 foram medidas com fago ELISA competitivo.

<table>table see original document page 89</column></row><table> <table>table see original document page 90</column></row><table> Variações de domínios retirados de HNRP1 foram usadas para identificar o epítopo de ligação para estes clones e todos foram mapeados para o domínio a1a2 de hNRP1 Para selecionar os anticorpos em fago que se ligaram ao domínio blb2 de NRP1 e potencialmente bloquearam a ligação de VEGF1 nós demos início a um novo processo de panoramização usando-se hNRPI (b1b2)-His expressa em baculovírus como um antígeno imobilizado. Seguindo 4 ciclos de seleção, somente um único clone que se liga tanto à NRP1 humana como de murino, YW107.4 foi identificado. YW107.4 ligado a NRP1 humana e de murino com um IC50 de 6 e 38 nM no Fago ELISA (Tabela III).

Caracterização De Anti-NRPI IgG Selecionado

Clones anti-NRP1 selecionados da Tabela Ill foram rearranjados nos IgG1 humanos de comprimento total, expressos em células CHO e purificados para posterior caracterização. Os anticorpos anti-NRP1 em fago YW64.3 e YW107.4 ligados especificamente à NRPI humana e de murino não se ligaram à NRP-2, ErbB2-ECD ou BSA humana ou de murino. Figura 1A. Cada um dos outros oito anticorpos em fago mostraram especificidade similar. Por ressonância plasmônica de superfície, YW64.3 e YW107.4 IgG imobilizados não interagiram com estes antígenos nas concentrações acima de 500 nM. No entanto, tanto YW64.3 como YW107.4 se ligaram a NRP1 humana com um Kd de 0,9 a 5 nM, como também NRP1 de murino com um Kd de 7,8 e 11 nM, respectivamente. Embora estes anticorpos tenham sido selecionados usando-se antígeno imobilizado em placa, análise FACS demonstrou que todo IgGs purificado também se ligou à células HUVEC que expressam hNRPI de forma endógena (por exemplo, YW64.3 e YW107.4 mostrados na Figura 1B).

C. Afinidade De Maturação De Anticorpos Anti-NRPI

yW107.4 ligado ao domínio b1b2 de NRP1 humana e de murino com um IC5O de fago de 6 e 38 nM, respectivamente (Tabela III). Para melhorar a potência in vivo, este clone foi submetido à maturação de afinidade usando- se HRPI-His humana. Materiais ε Métodos Para gerar moldes de bibliotecas para maturação de afinidade do clone YW107.4, o zíper de Ieucina GCN4 do fagomídio parental foi primeiro removido usando-se mutagênese Kunkel para fornecer um formato de exibição FAB monovalente. Um códon stop foi incorporado na CDR-L3. Uma estratégia de randomização leve foi usada para maturação de afinidade, que introduziu uma taxa de mutação de aproximadamente 50% nas posições selecionadas por síntese de DNA mutagênico com misturas 70-10-10-10 de bases que favorecem os nucleotídeos tipo selvagem. Gallop et al. (1994), J. Med. Chem. 37:1233-1251. As três diferentes bibliotecas com combinações nas alças CDR1 randomização L1/L2/L3, L3/H1/H2 e L3/H3, foram geradas por meio de randomização leve de resíduos selecionados 28-32 da CDR-L1, 50 e 53-55 da CDR-L2, 91, 92, 93, 94 e 96 da CDR-L3, 28-35 de CDR-H1, 50-58 de CDR-H2, e 95-100 de CDR-H3

Para seleção de clones de afinidade madura, bibliotecas de fago foram sujeitas à seleção de placas para o primeiro ciclo e seguido por quatro ciclos de seleção de fase de solução como descrito. Lee et al. (2004) J Mol Biol 340:1073-1093. No primeiro ciclo de seleção de placas, três bibliotecas foram adicionadas separadamente à placa revestida de hNRPI por 1 h a 37°C. Depois disso, quatro ciclos de seleção de fase de solução foram realizados para aumentar a eficiência da seleção baseada na afinidade com estringência aumentada como segue: ciclo 2 (5 nM de hNRPI biotinilada), ciclo 3 (1nM de hNRPI biotinilada), ciclo 4 (0,5nM de hNRPI biotinilada e 250nM de hNRPI não biotinilada concorrentes a 37°C por 1h) e ciclo 5 (0,5nM de hNRPI biotinilada e 500nM de hNRPI não biotinilada concorrentes a 37°C por 3h). Durante o processo de seleção, a reação sem hNRPI biotinilada foi incluída e serviu como fago antecedente de ligação para cálculo do enriquecimento de cada ciclo de panoramização. Após cinco ciclos de panoramização de alto rendimento um único ponto competitivo de fago ELISA foi rapidamente selecionado para clones de alta afinidade como descrito. Sidhu et al. (2004) J Mol Biol 338:299-310. Clones com baixa taxa de absorbância a 450nm na presença de 5 nM de hNRP1 para aquela ausência de hNRP1 foram escolhidos para posterior caracterização.

Resultados

Três combinações de CDR diferentes, LI/L2/L3, L3/H1/H2 e L3/H3, foram atingidas para randomização usando-se estratégia de "randomização leve" que mantém uma seqüência de influência tipo selvagem, tal que aquelas posições selecionadas sejam mutadas somente 50% do tempo. Gallop et al. (1994), J. Med. Chem. 37:1233-1251. Para maturação de afinidade, Fab monovalente foi exibida em fago ao invés de FAB bivalente para reduzir potencial avidez durante a seleção. Códons stop foram introduzidos na CDR-L3 em cada sub-biblioteca. Estratégias de seleção off-rate (ver Métodos) foram empregadas para melhorar a afinidade de YW107.4, já que este já possuía uma constante de taxa associação relativamente alta. (2,2x10^5), mas a constante de taxa de dissociação (1,1x10"3) foi relativamente rápida (Tabela V).

No primeiro ciclo de seleção, todas as 3 bibliotecas CDR com randomização leve foram panoramizadas contra hNRP, imobilizada seguido por ciclos subseqüentes com uma seleção de fase de solução para limitar a concentração alvo e aumentar a seleção baseada na afinidade. A concentração de hNRP1 biotinilada foi gradualmente reduzida de 5 para 0,5 nM e um excesso de 500 vezes de hNRP1 não biotinilada foi adicionada para competir por ligantes off-rate rápidos. A mistura foi então incubada a 37°C por até 2h.

A biblioteca L1/L2/L3 mostrou enriquecimento significante após o ciclo 5. Noventa e seis clones foram colhidos aleatoriamente, sequenciados e então as afinidades classificadas. Vinte e três clones exclusivos foram selecionados e purificados para posterior caracterização. A maioria dos clones teve afinidade melhorada para hNRP1 como determinado por competição fago ELISA. De maneira surpreendente, a afinidade para mNRP1 foi também melhorada apesar de ter sido omitida do processo de seleção, sugerindo que os clones se ligaram a um epítopo conservado. Os clones selecionados tiveram 4 a 7 trocas nas 3 CDRs de cadeia leve; posições 28 e 30 na CDR-L1 tenderam a ser substituídas por Tirosina e Histidina1 respectivamente, enquanto que as posições 92, 93 e 96 na CDR-L3 eram mais diversas (Tabela IV).

Os clones com afinidade mais alta tanto para NRP1 humana como de murino (YW107.4.18, YW107.4.38, YW107.4.52, YW107.4.63, YW107.4.76a e YW107.4.87) foram rearranjados e expressos em anticorpos de comprimento total. Todas as 6 IgGs tiveram afinidade melhorada para hNRP1 e mantiveram bloqueio completo de ligação de VEGF-A. Afinidades para NRP1 humana e de murino variaram de 0,4 até 1,8 nM (Tabela V). A taxa de constante de dissociação de YW107.4.87 foi melhorada, levando a uma melhora geral na afinidade em aproximadamente 10 vezes tanto para NRP1 humana como de murino, nenhuma ligação foi observada para NRP2 humana ou de murino (Figura 2A). YW107.4.87 também mostrou ligação à superfície celular de NRP1 melhorada (Figura 2B).

Tabela IV

Seqüências CDR E Afinidade De Ligação (Fago IC50) Para Clones YW107.4 De Afinidade Melhorada

As seqüências de aminoácido deduzidas dos clones YW107.4 de afinidade madura nas posições CDR de cadeia randomizada são mostradas. Valores IC50 de FAB-fago de clone individual contra hNRP1 e mNRP1 de fago ELISA de competição foram usados para comparar a afinidade melhorada com o YW107.4. <table>table see original document page 95</column></row><table> <table>table see original document page 96</column></row><table>

TABELA V

ANALISE CINETICA DE LIGACAO DE OGGS ANTI-NRP1 A 25°C

As afinidades de ligação de IgGs anti-NRP1 foram medidas em instrumento BIAcore-3000 usando-se chip biosensor imobilizado com IgG com diluições de hNRP1 ou mNRPI plenas a 25°C (ver Materiais e Métodos). Cada medida tem um erro em Kd de aproximadamente ±25%.

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Exemplo 2

Atividades Biológicas De Anticorpos Anti-NRPI

As seqüências do anticorpo de YW64.3 e YW107.4.87 são mostradas na Figura 3. Para os propósitos deste pedido e nas descrições seguintes de atividades do anticorpo anti-NRP1, "YW64.3" e "anti NRPa" são usados altemadamente; e "YW107.4.87" e "anti-NRPB" são usados altemadamente.

Materiais ε Métodos

Culturas Celulares

HUVEC, HUAEC e HMVECs foram adquiridas da Cambrex e cultivadas em meio EGM-2 (Cambrex). As de células e tecido são mantidas a 37°C em incubador a 5% CO2,95% de umidade.

Testes DRG ε Colapso Hipocampal Testes de colapso em axônio de camundongos E12.5 DRG foram realizados como descrito em He e Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-751. Resumidamente, DRG explantados foram plaqueados placas de 8 câmaras revestidas de lâmininas (Nunc) e cultivadas em meio N3-F12 com 50 ng/ml de NGF durante a noite a 37°C em um incubador a 5% CO2, 95% de umidade. Semaforina-3A humana (Met-1 até Val-77 1) foi clonada no vetor de expressão pRK5 de eucarionte com um tag de fusão hexahistidina C-terminal. A proteína foi temporariamente expressa em células CHO e purificadas por cromatografia de afinidade NiNTA. O sequenciamento N-terminal foi usado para confirmar a proteína visível como uma banda de 90 kDa em um gel SDS-PAGE corado com Coomassie. Sema3A purificado foi adicionado a ~ 8 ng/ml na presença ou ausência de inibidores e os explantados foram incubados a 37°C por 30 min para induzir colapso. Para visualização, os cones de crescimento foram fixados a 4% de PFA e 15% de sacarose, corados com rodamina-faloidina (Molecular Probes) a 1:40 em PBS por 30 min, e então lavadas e montadas com Fluoromount G (Fisher). Para realizar o teste de colapso hipocampal, cérebros de camundongos E17 foram dissecados em PBS resfriado e seccionados horizontalmente em fatias finas de 250 pm usando-se um cortador de tecido (Mcllwain). O giro dentado foi também subdissecado a partir de cortes selecionados de hipocampo usando-se agulhas de tungstênio. Explantados foram plaqueados em placas de 8 câmaras revestidas de lâmininas (Nunc) e cultivadas em meio Neurobasal suplementado com B27 (Gibco Life Technologies) durante a noite a 37°C. Para induzir colapso, explantados foram incubados com o controle ou anticorpos anti-NRP1 (10 pg/ml) na presença de transfectado simulado ou meio condicionado de células COS transfectadas com Sema3F por 30 minutos a 37°C.

Teste De Migração Celular

Testes de migração celular foram realizados usando-se um teste de câmara Boyden modificada com o sistema de inserção de multipoço Falcon 24 com tamanho de poro de 8pm (BD Biosciences). As placas foram revestidas com 8 pg/ml de lâminina (Invitrogen) por 16 h a 37°C, em ambas as câmaras, superiores e inferiores. HUVECs (80-90% confluente) foram colhidos com tripsina, contados, centrifugados e resuspensos em EBM-2 com 0,1% BSA a uma concentração de 5 χ 105 células/ml. 10ΟμΙ de células foram adicionadas na câmara superior do sistema de trans-poços. Inibidores foram adicionados à câmara superior com as células, imediatamente antes da adição do estímulo à câmara inferior (10 ng/ml de VEGF em muitos casos), que continham 500 μΙ EBM-2 com 0,1% BSA. As placas foram então colocadas a 37°C durante a noite. Para cessar o teste, as células na face superior da membrana foram removidas usando-se uma haste de esponja e as células na face inferior foram fixadas com metanol e coradas com Cytox Green (Molecular Probes). O número de células migradas na face inferior da membrana foi contado usando- se microscópio fluorescente AxiPhot e os resultados foram analisados com o programa ImageJ (NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Teste De Crescimento De Microesferas Microesferas microcarreadoras Cytodex 3 revestidas com dextrano (Amersham Pharmacia) foram incubadas com subconfluente HUVECs a uma concentração de 400 células por microesfera em 1 ml de meio EGM-2, por 4 h a 37°C em um incubador a 5% CO2 com agitação leve a cada 20 min. As microesferas foram então transferidas para um frasco de cultura de tecido de 25- cm2 (BD Biosciences) e incubados em 5 ml de EGM-2 por 12-16 h a 37°C. As microesferas revestidas de HUVEC foram então lavadas três vezes com 1 ml de EGM-2 e resuspensas em 2,5pg/ml de fibrinogênio (Sigma) em PBS a uma densidade de 200 microesferas/ml. 0,5 ml da solução de fibrinogênio/microesferas foi transferida para um poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços contendo 0,625 unidade de trombina (Sigma) para induzir coagulação. A solução de fibrinogênio/microesferas foi incubada por 5 min em temperatura ambiente, e então por 20 min a 37°C em um incubador a 5% CO2. Após a coagulação ter sido completada , 1 ml de EGM-2 foi adicionado a cada poço e o coágulo foi equilibrado por 30 min a 37°C. O meio foi removido e 1 ml de células de fibroblasto da pele (Detroit 551) a uma concentração de 2000/ml em meio EGM-2 foram plaqueadas no topo do coágulo. Diferentes anticorpos foram então adicionados a cada poço e o teste foi monitorado por 8 dias com alteração de meio a cada 2-3 dias. Imagens de resolução de 10x das microesferas foram capturadas por um microscópio invertido, e círculos concêntricos espaçados a 100, 200 e 300 pm foram digitalmente desenhados ao redor da microesfera em cada imagem. O número de vasos cruzando cada linha foi contado e a média foi tirada a cada distância e condição.

Análise FACS

HUVECs confluentes foram incubados com anticorpos anti-NRP1 ou controles 10 pg/ml por 5 min, 2h ou 20 h a 37°C em um incubador a 5% de CO2. Células foram colhidas com tampão de dissociação celular livre de enzima (Gibco), neutralizado com igual volume de tampão FACS (1 χ PBS1 2% FBS1 2 mM de EDTA, 0,1% de azida de sódio) e transferidos para as placas de teste de 96 poços de fundo em U Pro-bind (FaIcon) com 500.000 células por poço. Os pellets de célula foram coletados por centrifugação a 2k rpm, e resuspensos em 25 μl de tampão de coloração (tampão FACS com 5% de soro de camundongo normal, 2% de soro de rato normal e 10% 10 pg/ml de IgG humano) contendo anticorpo biotinilado apropriado a 1:100, seguido por 2h de incubação a 4°C. Anticorpos foram biotinilados usando-se o kit marcador de proteína mini-biotin-xx FIuoReporter (Molecular Probes). As células foram então lavadas duas vezes com tampão FACS, e incubadas em 25μl de tampão FACS contendo 1:1000 de estreptavidina-PE (BD Biosciences) por 20 min a 4°C. Finalmente, as células foram lavadas e resuspensas em tampão FACS, e analisadas com o sistema FacsCaIibur (BD Biosciences).

Teste De Adesão Celular

HUECs subconfluentes foram pré-incubados em 100μl de Meio 199 com anticorpos anti-NRP1 ou controle por 30 min a 37°C, depois plaqueados em placas de 96 poços de fundo liso NUNC maxisorp (eBioscience) revestidas com 1 Mg/ml de fibronectina (Roche) com 10.000 células por poço. As placas foram centrifugadas por 1 min com 140 g para sincronizar o contato de células com o substrato, e incubadas a 37°C por 30 min. As placas foram então lavadas 3 vezes com PBS1 congeladas a -80°C por duas horas. A densidade celular foi determinada com o kit CyQuant (Molecular Probes).

Teste Vascular Da Retina Neonatal De Camundongo Administrou-se via i.p.em camundongos CD1 neonatal diferentes anticorpos a uma concentração de 10 mg/kg. As injeções foram feitas no pós- natal dias 1 e 3 para estudos pós-natal dia 5 (P5), e nos dia 1, 3 e 5 para estudos P8. Os olhos foram coletados e fixados com 4% PFA em PBS por 16 h a 4°C, seguido por lavagens PBS. As retinas dissecadas forma bloqueadas com 10% de soro de camundongo em PBSt (PBS, 1% Triton X-100) por 3 h, depois incubadas durante a noite a 4°C com isolectina B4 (Bandeiraea simplicifolia·, Sigma) 25 pg/ml em PBLEC (1% Triton X-100, 0,1mM de CaCI2, 0,1 mM de MgCI2, 0,1 mM de MnCI2, em PBS pH 6,8). As retinas foram então lavadas 4 vezes em PBSt1 e incubadas com estreptavidina Alexa 488 (1:200; Molecular Probes) durante a noite a 4°C. Após a coloração ter sido completada, as retinas foram lavadas 4 vezes em PBStl pós-fixadas com 4% PFA em PBS, seguido por outras 4 lavagens em PBS. Imagens das retinas planas montadas foram capturadas por microscopia de fluorescência confocal.

Teste De Permeabilidade De Vasos Da Pele De Camundongo

Injetou-se 150μΙ de solução Evan1s blue 0,5% i.v. em fêmeas de camundongos C57BL6J de 5-7 semanas. A área das costas e costela dos animais foram raspadas para remover o pelo abaixo do pescoço e acima da bacia, e a área raspada foi dividida em 4 zonas para injeção. Uma hora após a injeção de Evan1s blue, 20 μΙ de PBS contendo BSA (7,5 pg/ml) ou hVEGF (7,5 pg/ml) com ou sem anticorpo (0,5 mg/ml) foram injetadas i.d. aleatoriamente em qualquer uma das quatro zonas, uma injeção para cada zona. Uma hora após a injeção i.d., os animais foram sacrificados e a pele contendo as 4 zonas foi retirada e dissecada. A imagem digital da pele foi capturada. Uma biópsia por punção da pele de 8 mm foi usada para cortar amostras da mesma área nos locais das injeções, e as amostras de pele foram incubadas na solução formamida a 55°C por 48h para extrair o corante Evan's blue dos tecidos. A absorbância da solução foi então medida com um espectrofotômetro a 605 nm.

Teste De Proliferação Celular A proliferação celular foi analisada com o kit ELISA de Proliferação Celular (Roche). Resumidamente, 90% de HUVECs confluentes foram coletadas e resuspensas em meio de teste (DMEM:F12 50:50, 1,5% FBS), e plaqueadas com 3.000 células por poço na placa de cultura de tecido de 96 poços (ViewPlate-96, Perkin Elmer) pré-revestida com 1% de gelatina. As células foram incubadas a 37°C por 16 h, transferidas para meio de teste fresco e incubadas por mais 8h. VEGF (20 ng/ml) e diferentes anticorpos foram adicionados à cultura e as células foram incubadas por 20h. A solução com marcador BrdU foi adicionada a uma concentração final de 10 mM e as células form incubadas por mais 24 h a 37°C. A incorporação BrdU foi determinada por imunoensaio de quimioluminescência.

Teste De Fosforilação De VEGFR2

O total de VEGFR2 e fosfo-VEGFR2 foi determinado com kits DuoSet IC ELISA (R&D). Resumidamente, HUVECs subconfluentes foram enxaguados com PBS e Iisados no tampão de Iise fornecido. Os Iisados celulares foram centrifugados a 14 kg por 5 min a 4°C, e o sobrenadante foi transferido para tubos de ensaio limpos. Testes ELISA foram realizados como direcionado.

Immunoblotting

HUVECs foram privadas de alimento por 16 h em EBM-2 com 0,2% FBS e 0,1% BSA, e então transferidas para EMB-2 com 0,1% BSA1 seguido por 90 min de incubação a 37°C. Anticorpos anti-NRP1 e controle foram adicionados a 50 μ/ml, e as células foram incubadas por 30 min a 37°C. As células foram estimuladas com VEGF (20 ng/ml) por 10 min a 37°C, lavadas duas vezes com PBS em gelo seco PBS e Iisadas em tampão de Iise contendo 20 mM de Tris 7,5, 150 mM de NaCI1 1% Triton X-100, coquetel I e Il inibidor de fosfatase (Sigma) e tablete inibidor completo de protease (Roche). Alíquotas de Iisado foram sujeitas à eletroforese em géis 4-20% Novex Tris-Glicina SDS (Invitrogen), seguido por eletrotransferência para membrana Invitrolon PVDF (Invitrogen). Os anticorpos primários usados neste estudo foram anti-Erk, antifosfo-Erk, anti-Akt, anti-fosfo-Akt, anti-p38, anti-fosfo-p38, anti-Src e anti- fosfo-Src (Tyr416), todos adquiridos da Cell Signaling Technology.

Resultados

A. Ações Seletivas De Anti-NRPIa E Anti-NRPIb Na Função Sema3A E Ligação VEGF, Respectivamente

Anticorpos anti-NRP1 foram testados para suas habilidades para bloquear ligação de VEGF165 à NRPI. Anti-NRPI8 bloqueou fortemente ligação VEGF à NRP1, apesar de anti-NRPIA não ter bloqueado (Figura 4). Estes resultados sugerem que os domínios CUB (a1-a2) de NRP1 não são necessariamente para ligação VEGF. Gu et al. (2002), J. Biol. Chem. 277,18069-18076.

Em seguida, anticorpos anti-NRP1 foram testados para seus efeitos na função Sema3A. Foi previamente sugerido que Sema3A e VEGF16S podem compartilhar domínios de ligação sobrepostos na região N-terminal do domínio b1, e dessa forma pode competir para ligação à NRP1. Gu et al. (2002) J Biol Chem 277:18069-18076; Miao et al. (1999) J Cell Biol 146:233- 242. Então perece possível que um único anti-NRP1 mAb poderia bloquear tanto ligação Sema3A como VEGF. Anticorpos anti-NRP1 mAbs desta invenção foram testados para suas habilidades para bloquear colapso do cone de crescimento do axônio induzido por Sema3. Gânglios da raiz dorsal (DRG) foram dissecados dos embriões de camundongos E12.5 e cultivados para estabelecer cones de crescimento de neurônio sensorial que foram responsivos ao colapso dependente de Sema3A/NRP1. He e Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-751. A adição de Sema3a a estas culturas ocasionou retração das estruturas ricas em actina dos cones de crescimento No entanto, se anti- NRPIa era adicionado aos poços ao mesmo tempo em que Sema3A, o colapso era completamente bloqueado. Em contraste, anti-NRPI8 não teve efeito no colapso induzido por Sema3A (Figura 5A).

Estes dois anticorpos têm então ações funcionalmente distintas: anti-NRPIA bloqueia função Sema3A, mas não interfere na ligação VEGF a NRPI; enquanto que anti-NRPIB bloqueia ligação VEGF a NRP1 sem efeito na função Sema3A. Estudos adicionais mostraram que nenhum anticorpo bloqueia o colapso dependente de Sema3F/NRP2 dos cones de crescimento hipocampal E17 (Figura 5B), consistente com a observação de que nenhum anticorpo se liga a NRP2. Os anticorpos fornecem então ferramentas seletivas para dissecar o papel de NRP1 na biologia vascular, e meios para seletivamente bloquear atividades NRP1.

B. Ambos Anti-NrpIa E Anti-Nrpib Reduzem Migração Celular Endotelial E Crescimento De Microesferas Dependentes De Vegfirs Oe anti-NRP1 mAbs da invenção foi testado na migração celular (EC) endotelial dirigida por VEGF. Usando-se um sistema de trans-poço, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram introduzidas na câmera superior, enquanto VEGF foi adicionado na câmara inferior para promover migração EC. ECs que migraram para a câmara inferior foram então fixadas, coradas e quantificadas (Figura 6A). Anticorpos anti-VEGF foram usados como controle positivo para bloquear migração EC dirigida por VEGF neste experimento e em experimentos subseqüentes (um anticorpo anti-VEGF reativo entre espécies, B20.4. 1, foi usado em todos os experimentos a menos que estabelecido de outra forma; Liang et al. (2006), J. BioL Chem. 281, 951-961. Anti-NRPI mAbs foram adicionados às células na câmara superior um pouco antes da adição de VEGF. De maneira interessante, tanto anti-NRPIA como anti-NRPI8 reduziram significantemente a migração celular endotelial, com anti-NRPIB fornecendo um forte bloqueio para a migração (Figura 6A).

Resultados similares foram obtidos usando-se dois outros tipos de linhagens EC, HUAECs e HAECs.

Para também dissecar o papel de NRP1 e anti-NRP1 mAbs nas funções EC mais complexas, um sistema in vitro de brotamento angiogênico foi empregado. Nakatsu et al. (2003) Microvasc Res 66:102-112. Neste teste, ECs revestidas nas microesferas germinaram em um período de 7 dias, resultando em múltiplas estruturas de vasos bem definidas projetadas de cada microesfera. A adição de anti-NRPI mAbs a estas culturas resultou na redução do comprimento dos vasos, e no caso do anti-NRP1B, um decréscimo no número de brotos também foi observado. Esta observação foi confirmada por quantificação (Figura 6B). Anti-VEGf foi usado como um controle positivo a bloqueou completamente o brotamento neste teste. Os resultados confirmaram fortes efeitos para cada anti-NRP1 mAb na redução da migração EC e crescimento dos vasos neste teste in vitro.

C. NRP1 é Necessário Para Reconstrução Vascular Na Retina De Camundongos

Fenótipos observados nos camundongos Nrpl knock-out são consistentes com um defeito na reconstrução vascular. Gu et al. (2003) Dev Cell 5:45-57; Kawasaki et al. (1999) Development 126:895-4902; Takashima et al. (2002) Proc NatIAcad Sei USA 99:3657-3662. Depois, o papel de NRP1 na reconstrução vascular foi testado pela análise dos efeitos do tratamento sistêmico com o anti-NRP1 mAbs no desenvolvimento da retina de camundongo, que é um modelo ideal para investigar os eventos estereotipados do brotamento vascular, reconstrução e maturação. Dorrell e Friedlander (2006) Prog Retin Eye Res 25:277-95. No nascimento, uma rede astrocítica está no lugar para guiar brotamento ECs da artéria central da retina localizada próximo da cabeça do nervo óptico (ONH). Após um dia de vida pós-natal (PI) o sistema de vasos sangüíneos da retina desenvolveu uma fenda morfogênica na camada de fibras nervosas (NFL), ficando superficial à camada de células gangliais, que começa a se estender em direção à margem da retina em um padrão concêntrico, atingindo até certo ponto por P5 (Figura 7A). Nos próximos três dias a fenda continua a se estender para a margem da retina, enquanto o plexo vascular mais próximo do ONH submete-se à reconstrução estereotipada, que consiste no estreitamento do plexo vascular e uma rede capilar refinada no NFL (Figura 7B), e brotamento de veias nas camadas mais profundas da retina (Figura 7C).

Anticorpos foram injetados em camundongos neonatal, iniciando em P1, seguido por injeções em dias alternados até que a retina fosse coletada em Põe P8. Para visualizar o sistema de vasos sangüíneos, as retinas foram coradas com isolectina B4 e comparadas. Enquanto a rede capilar refinada dos grupos controle IgG é bem estabelecida entre P5 e P8, esta reconstrução vascular é completamente inibida por ambos os anticorpos anti-NRP1 mAbs. Esta diferença foi quantificada pela comparação da densidade vascular das imagens representativas capturadas da rede vascular NFL nas regiões adjacentes ao ONH (Figura 7D). Devido ao tratamento com ambos anti-NRP1 mAb resultar em uma forte inibição da reconstrução vascular, a densidade vascular é significantemente maior nas retinas tratadas tanto com anti-NRP1A como anti-NRP1B quando comparado aos controles. De maneira interessante, o desenvolvimento da fenda continua a se estender nas retinas tratadas com ambos anti-NRP1 mAb, com somente uma leve inibição da extensão nos animais tratados com anti-NRP1B (Figure 7E). Isto sugere que o desenvolvimento da retina geralmente não é inibido, mas que existe, ao contrário, um bloqueio específico na reconstrução vascular quando tratado com ambos anti-NRP1 mAb.

Em contraste ao anti-NRP1 mAbs, o tratamento com anti-VEGF resultou na redução da densidade vascular da retina quando comparado ao controle (Figura 7D). Em um nível qualitativo, os vasos nas retinas tratadas com anti-VEGF tiveram uma complexidade em P8 reduzida, uma tendência está presente, mas menos óbvia em P5. Estes dados sugerem que o tratamento com anti-VEGF resultou tanto no bloqueio do brotamento inicial como na regressão vascular. De maneira interessante, a entrega sistêmica do anti-VEGF não reduziu significantemente a extensão da fenda vascular (Figura 7E). Isto é provavelmente uma conseqüência da fraca difusão do anticorpo para as células que se estendem para a extremidade, devido ao bloqueio dos lúmens dos vasos desta região externa. Gerhardt et al. (2003) J Cell Biol 161:1163-1177.

A avaliação de retinas P8 também permitiu investigação adicional dos efeitos do tratamento com anticorpo no brotamento angiogênico Entre P5 e P8, os vasos começaram a brotar a partir da rede vascular NFL para as camadas mais profundas, resultando na formação da rede vascular da camada plexiforme externa (OPL), que é superficial à camada nuclear externa e é o leito vascular mais profundo da retina (Figura 7C). Mais tarde no desenvolvimento, o brotamento a partir das colaterais que originaram a OPL resulta em um leito vascular intermediário, designado para a camada plexiforme interna (IPL). Imagens capturadas de OPL em P8 mostra uma inibição completa do brotamento por ambos os anti-NRP1 mAbs, e pelos tratamentos com anti-VEGF.

Os diferentes fenótipos observados nas retinas dos animais sistemicamente tratados tanto com anti-NRPIA como anti-NRPI8, quando comparado ao anti-VEGF, sugere que NRP1 pode regular a função EC por mecanismos, exceto aumento da sinalização VEGFR2. D. Bloqueio Da Função NRP1 Com Pouco Efeito Na Sinalização Vegfr2

Quando observado que NRP1 é necessário para migração de células endoteliais na resposta ao VEGF1 nós investigamos a necessidade de NRP1 na proliferação EC e permeabilidade vascular - as duas atividade celulares definidas induzidas pelo VEGF. Notadamente, o tratamento tanto com anti-NRP1A como anti-NRP1B não tiveram efeito na permeabilidade induzida por VEGF, enquanto que anti-VEGF forneceu um forte bloqueio (Figura 8A). Uma tendência similar foi observada quando testada para proliferação EC induzida por VEGF, com anti-NRP1A não mostrando bloqueio da proliferação, e anti-NRP1B somente com redução leve responsiva à dose (Figura 8B). Estes resultados apoiam previamente os dados publicados mostrando que o knockdown siRNA de NRP1 em ECs não efetua proliferação induzida por VEGF (Murga et al. (2005) Blood 105:1992-1999), e sugere que o papel primário de NRP1 nos comportamentos EC dirigidos por VEGF é mediar migração celular.

O efeito dos anticorpos anti-NRP1 na sinalização VEGFR2 foi estudado. VEGF se liga ao segundo e terceiro domínio extracelular IgG de VEGFR2, e ativa o receptor pelo acionamento da auto-fosforilação de diversos resíduos tirosina no domínio intracelular. Em contraste ao anti-VEGF, que bloqueou completamente a fosforilação VEGFR2 induzida por VEGF nas HUVECs, anti- NRPIa não alterou significantemente os níveis de fosforilação VEGFR2, enquanto que anti-NRPIB resultou somente em uma redução modesta (Figura 8C).

Ao invés de regular os níveis de fosforilação VEGFR2 diretamente, NRP1 pode agir para modular vias VEGFR2 específicas. Para endereçar esta possibilidade, o efeito do tratamento com anti-NRP1 nos eventos de sinalização a jusante mediada por VEGFR2 foi examinado. VEGFR2 mostrou induzir proliferação EC por meio da ativação das proteínas quinase Erk1/2 ativadas por mitógeno (Rousseau et al. (1997) Oncogene 15:2169-2177; Takahashi et al. Shibuya (1999) Oncogene 18:2221-2230), e regular sobrevivência EC e permeabilidade vascular através da via P13- quinase/Akt. Chen et al. (2005) Nat Med 11:1188-1196; Gerber et al. (1998) J Biol Chein 273:13313-13316; Six et al. (2002) FEBS Lett 532:6769. Consistente com a observação de que os tratamentos com anti-NRP1 mAb não alteraram de maneira significante a proliferação EC ou permeabilidade vascular induzida por VEGF, a incubação com anti-NRP1A e anti-NRP1B não afetou a fosforilação de Erk1/2 ou Akt induzida por VEGF. Po outro lado, a função de inibição de NRP1 com anticorpos anti-NRP1 reduziu fortemente a migração EC. É possível que NRP1 especificamente regule as vias VEGFR2 necessárias para a motilidade celular, tal como a via p38 MAP, que mostrou ser necessária para a reorganização de actina e migração celular dirigida por VEGF em ECs. Rousseau et al. (1997) Oncogene 15:2169-2177. Tratamentos com anti-NRP1A e anti-NRP1B levaram à uma leve redução no nível de fosforilação p38 nas HUVECs (Figura 8D), dando apoio a esta hipótese. No entanto, a leve diminuição na fosforilação p38 sozinha é improvável em contar com a forte redução que nós observamos nos testes de migração e brotamento como descrito nas seções anteriores (Figura 6), ou explicar a diferença qualitativa dos fenótipos observados entre os tratamentos com anti-NRP1 mAbs e anti- VEGF mAB nos experimentos de reconstrução vascular da retina (Figura 7).

Exemplo 3

Atividades Inibitórias De Tumor De Anticorpos Anti-NRPI

Materiais ε Métodos

As linhagens celulares humanas, H1299 e SK-MES-1 de carcinoma de célula não-pequena de pulmão foram obtidas da ATCC (Rockville, MD). Para SK-MES-1, cada fêmea HRLN de camundongo nu recebeu 1 mm3 de fragmento de tumor s.c. implantado na área da costela. Para H1299, 1x107 células tumorais foram injetadas s.c. na área da costela de fêmeas HRLN de camundongos nus. O crescimento do tumor foi monitorado duas vezes por semana por medidas de calibrador. Quando os tumores atingem uma média de tamanho de 80-120 mm3, os camundongos foram selecionados para fornecer grupos com média de tamanho de tumor quase idênticos, e o tratamento foi iniciado. Isto foi considerado dia 1 para cada estudo. Todos os tratamentos foram ajustados para 0,2 ml/20 g. Volume do Tumor (mm3)= Iargura2 χ comprimento/2. A porcentagem de inibição de crescimento de tumor (%TGI) = (média do volume do tumor do braço de tratamento - média do volume do tumor do braço de controle/ média do volume do tumor do braço controle) χ 100. %TGI é somente medida enquanto todos os animais permanecem nos seus estudos (para SK-MES-1 = dia 22; para H1299 = dia15). Tempo até o ponto final (TTE) = Iogio (volume do ponto final, mm3) - b / m; onde b é a intercepção e m é o declive da linha obtida por regressão linear dos dados de crescimento de tumor transformados em Iog. A porcentagem de atraso de crescimento de tumor (%TGD) = (média TTE para um braço de tratamento - média TTE para o braço controle / média do braço controle) χ 100.

Os camundongos foram anestesiados com Avertin (1,3% de tribromoetanol e 0,8% de álcool amil; SigmaAIdrich). Lectina de Lycopersicon esculentum marcada com F1TC (150 pg em 150 μΙ de 0,9% NaCI; Vector Laboratories) foi injetada i.v. 3 minutos antes da perfusão sistêmica. O sistema de vasos sangüíneos foi perfundido transcardialmente com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS por 2 a 3 min. Os tumores foram removidos e pós-fixados por imersão no mesmo fixador por 16h, seguido por uma incubação em sacarose 30% durante a noite para crioproteção, depois embebidos em OCT e congelados. As seções (30pm) foram cortadas e montadas em lâminas de vidro, reidratadas e bloqueadas em PBSt (PBS, 0,5% Triton X-100) com 5% de soro de cabra normal por 2h em temperatura ambiente. As seções foram incubadas durante a noite com anti-NRP18 (1:500) ou anti-camundongo 110

PDGFRp de rato (1:1000; clone APB5, eBioscience) a 4°C. As seções foram então lavadas 4 vezes em PBSt1 e incubadas com anticorpos secundários, Alexa 488 IgG anti-humana de cabra e Alexa 568 IgG anti-rato de cabra (1:200; Molecular Probes), por 4 h em temperatura ambiente. Após a coloração ter sido completada, as seções foram lavadas 4 vezes em PBSt1 pós-fixadas com 4% PFA em PBS, seguido por outras 4 lavagens em PBS. A solução de lavagem final foi removida, e 1-2 gotas de Fluoromount-G (Southern Biotech) foram adicionadas. Coberturas de vidro foram colocadas sobre as amostras e as imagens foram capturadas com um microscópio fluorescente Zeiss Axiophot.

Resultados

A via de bloqueio de VEGF provou reduzir a neovascularização em modelos de tumor de camundongo e em cânceres humanos. Ferrara e Kerbel (2005) Nature 438:967-974. No entanto, acredita-se que alguns tumores são menos dependentes de VEGF para formação de vasos, ou podem se tornar insensíveis às terapias anti-VEGF. Jain et al. (2006) Nat Clin Oncol 3:24-40; Kerbel et al. (2001) Câncer Metastasis Rev 20:79-86. Para determinar se o bloqueio NRP1 poderia aumentar a inibição do crescimento de tumor pelo bloqueio do VEGF, nós selecionamos diversos modelos de xenoenxerto conhecidos por exibir sensibilidade variada à terapia anti-VEGF. Já que VEGF estromal de camundongo, além do VEGF derivado de tumor mostraram impactar o crescimento de tumor, nós usamos anti-VEGF mAbs que reconhece tanto VEGF humano como de murino. Liang et al. (2006), J. BioL Chem. 281, 951-961.

Estes experimentos foram designados para testar o efeito do bloqueio de NRP1 sozinha e em combinação com anti-VEGF. Também foram incluídos agentes sozinhos anti-VEGF e anticorpo isotipo controle. SK-MES-1 é um modelo de xenoenxerto NSCLC que expressa primariamente NRP1 no tecido vascular e estromal com um nível intermediário de expressão em células tumorais. Neste modelo, anti-VEGF forneceu 52% de inibição de crescimento de tumor (TGI), o agente anti-NRP1B sozinho causou 37% de TGI, e anti- NRPIa não teve efeito significante no TGI (Figura 9A).

Visivelmente, o efeito aditivo foi observado quando ambos os anticorpos anti-NRP1 foram usados em combinação com anti-VEGF. como descrito na Figura 10A, anti-NRP1A usado em combinação com anti-VEGF aumentou o TGI em aproximadamente 52% para cerca de 70%; e anti-NRP1B usado em combinação com anti-VEGF aumentou o TGI em aproximadamente 77% (Figura 9A). Resultados similares foram obtidos no modelo de xenoenxerto H1299 NSCLC1 que também expressa NRP1 no tecido estromal e vascular em altos níveis, mas em uma menor extensão nas células tumorais. O agente anti-NRP1B sozinho mostrou 39% de TGI1 anti-VEGF mostrou 28% de TGI, e a combinação mostrou 51% de TGI (Figura 9C).

Animais no modelo SK-MES-1 receberam dose no dia 35 e depois no dia 60 para examinar o atraso no crescimento do tumor (os animais foram removidos do estudo quando o tamanho do tumor excedeu 1500 mm3; nenhum animal foi removido como resultado da toxicidade). O plot Kaplan-Meier mostrou um efeito significante de ambos os braços de combinação anti-NRP1 mAb no atraso do crescimento do tumor comparado com os braços com os agentes sozinhos. (Figura 9B). Medidas de atraso do crescimento do tumor (TGD) não mostrou atraso para agente anti NRP1A sozinho; 24% de TGD para anti-NRP1B; 60% de TGD para anti-VEGF; 93% de TGD para braço de combinação anti-NRP1A + anti-VEGF; e 96% para braço de combinação anti- NRPIb+ anti-VEGF.

Resultados similares a este vistos nos modelos NSCLC foram também observados em um modelo de câncer de mama de murino, designado fundador 5 (Fo5), em que os tumores gerados pela expressão de MMTV-Her2 transgênico foram dissecados e implantados em camundongos nus. Finkle et al. (2004) Clin Câncer Res 10:2499-2511. Neste modelo, NRP1 é primeiramente expresso nos vasos e estroma adjacentes, e anti-VEGF é novamente efetivo só parcialmente na redução do crescimento do tumor (Figura 9C). A inibição do crescimento foi similar àquela vista nos modelos NSCLC1 no entanto, para focar nas alterações histológicas no contexto do tratamento com anti-NRP1 e anti-VEGF, os animais foram coletados no mesmo dia no início do experimento (linha pontilhada; Figura 9C).

Usando-se o modelo Fo5 para estudos de histologia vascular, nós observamos que os tumores controle mostraram amplos vasos desorganizados que geralmente eram desprovidos de revestimento de pericito como determinado por PDGFR-β imunohistoquímica. O tratamento com anti-VEGF sozinho resultou em uma diminuição do diâmetro dos vasos e uma redução geral na densidade vascular. Além disso, a maioria, se não todos os vasos que permaneceram nos tumores tratados com anti-VEGF mostraram associação próxima de pericitos. Resultados similares foram observados com outros marcadores de pericito.

Os vasos dos tumores tratados com ambos os anti-NRP1 mAb sozinhos, pareceram similares na morfologia em relação aos vasos tratados com anti-NRP1 das retinas de camundongos neonatal, com vasos de aparência plana e desorganizados, mantendo uma aparência similar ao plexo. Por outro lado, similar aos vasos de tumor tratado controle, os tumores tratados com ambos os anti-NRP1 mAb também eram desprovidos de significante revestimento de pericito. De forma mais interessante, tumores que foram tratados com anti-VEGF e tanto anti-NRP1A como anti-NRP1B, mostraram um fenótipo combinado, com redução similar dos vasos para tumores tratados com anti-VEGF, mas com vasos de aparência menos refinada e desprovidos de associação próxima do pericito.

Estas observações morfológicas são correlacionadas com as mudanças quantificadas na densidade vascular. Como mostrado na Figura 10, o tratamento com ambos os anticorpos anti-NRP1 e anti-VEGF diminuiu a densidade vascular (1OA). Por outro lado, somente anti-VEGF pareceu aumentar a mancha de pericito nas amostras de pulmão testadas, quando comparado ao controle. Em geral, a razão pericito/vascular que mede o revestimento relativo do pericito mostra que tumores tratados com anti-VEGF tiveram a razão mais alta, que é reduzida pelo tratamento com anti-NRP1A e anti-NRP1B.

As descobertas de que anti-NRP1 (anti-NRP1A e anti-NRP1B) e anti-VEGF podem estar agindo no bloqueio de diferentes funções EC e/ou vias de sinalização, aumentou a possibilidade que estes anticorpos combinados nos modelos de tumor poderiam ter um efeito aditivo ou sinérgico na redução do crescimento do tumor. Realmente, um efeito aditivo profundo foi observado quando combinando anti-NRP1 com anti-VEGF (Figura 9). Especialmente no caso do anti-NRP1A, os resultados sugerem um efeito sinérgico ao invés de aditivo, visto que em modelos de tumor múltiplo a média do volume do tumor seguindo tratamento com o anti-NRP1A sozinho não foi diferente do controle, mas o anticorpo aumentou de forma significante a resposta do tumor quando combinado com anti-VEGF, comparado ao tratamento com anti-VEGF sozinho.

No caso de anti-NRP1B, o tratamento com o agente sozinho resultou em uma redução significante no crescimento do tumor. De forma interessante, estes efeitos são somente ligeiramente menos potentes do que anti-VEGF sozinho. No entanto, a redução no crescimento do tumor a partir da combinação dos braços para anti-NRP1B foi similar à combinação dos braços para anti-NRP1A. O efeito do agente anti-NRP1B sozinho pode ser devido à sua atividade inibitória relativamente forte na redução do brotamento e angiogênese in vivo, comparado ao anti-NRP1A. Por outro lado, ambos os anticorpos foram igualmente potentes no bloqueio da reconstrução vascular no teste de desenvolvimento da retina de camundongo e inibição da associação do pericito com os vasos no modelo de tumor Fo5. Foi proposto que a reconstrução vascular na retina ocorre na ausência de associações próximas do pericito, sugerindo que o pericito serve para estabilizar os vasos sangüíneos imaturos finalizando o período de plasticidade da reconstrução dos vasos. Benjamin et al. (1998) Development 125:1591-1598. Descobertas sobre esta invenção sugerem que NRP1 é necessária para este intrincado processo de reconstrução de vasos, que consiste na morfogênese do plexo vascular em finos capilares, seguido por posterior maturação.

A idéia de pericitos estabilizarem vasos de tumor, dessa forma causando resistência à terapia anti-VEGF como uma conseqüência dos vasos perderem sua dependência ao VEGF1 foi proposto e testado experimentalmente Bergers et al. (2003) J Clin Invest 111:1287-1295; Erber et al. (2004) Faseb J 18:338-340. Nestes estudos, foi observado que o bloqueio de ambas as funções de VEGF (ligante EC) e PDGF (ligante pericito) resulta na posterior ruptura do sistema vascular sangüíneo. Subseqüentemente, foi mostrado nos estudos de imagem que a função VEGF de bloqueio sozinha nos tumores resulta em uma quantidade significante de regressão vascular, mas os vasos remanescentes tornam-se "normalizados" com associações próxima do pericito, possivelmente uma conseqüência de vasos imaturos que passam por reconstrução vascular e maturação. Inai et al. (2004) Am J Pathol 165:35-52.

Baseado nas observações obtidas no desenvolvimento da retina pode-se postular que o bloqueio da função NRP1 em tumores também reduziria a reconstrução vascular dos vasos do tumor, subseqüentemente inibindo a maturação dos vasos, dessa forma, mantendo os vasos em um estado de dependência do VEGF. Isto sozinho pode não ter um efeito significante na redução de crescimento do tumor, mas muitos vasos de tumor já são inerentemente desorganizados. Baluk et al. (2005) Curr Opin Genet Dev 15:102- 111. Esta previsão é consistente com a observação de que, embora anti-NRP1A iniba fortemente a reconstrução vascular, nós não vimos um agente sozinho agir com este anticorpo na redução de crescimento do tumor. No entanto, foi especulado que o bloqueio da reconstrução vascular, e a subseqüente maturação, em combinação com uma terapia anti-VEGF pode tornar os vasos remanescentes mais suscetíveis à regressão. Os experimentos da presente invenção mostraram que os vasos permanecem nos tumores tratados tanto com anti-NRP1 mAb como em combinação com anti-VEGF realmente desprovido de associação de pericito. Estes resultados sugerem que o efeito aditivo que nós observamos no bloqueio de ambas as funções, NRP1 e VEGF podem aparecer como conseqüência da restituição dos vasos remanescentes em tumores tratados com anti-VEGF mais vulneráveis à regressão.

Baseado nos resultados obtidos no desenvolvimento da retina e modelos de tumor de xenoenxerto é postulado que a função de bloqueio de NRP1 nos novos vasos formados iniba os vasos a passarem por reconstrução e subseqüente maturação, assim tornando estes vasos mais dependentes do VEGF para sobrevivência (ver o modelo na Figura 11 A). Consistente com este modelo, nós observamos uma diminuição significante na densidade vascular do desenvolvimento da retina nos camundongos neonatal tratados com ambos, anti-NRP1B e anti-VEGF na metade da dose do agente sozinho (dose única = 10 mg/kg, dose combinada = 5 mg/kg de cada anticorpo). Ver Figura 11B, quando comparado à Figura 7D.

Além disso, é possível que NRP1 possa também ser necessária não só para funções endoteliais, mas também para o pericito. Foi relatado recentemente que bFGF induz regulação para cima de NRP1 nas células musculares lisas, resultando na habilidade de VEGF induzir migração celular do músculo liso. Liu et al. (2005) Cytokine 35 32:206-212. No presente experimento, a expressão de NRP1 foi vista em células musculares lisas em humanos, assim como nos pericitos de vários tumores humanos e de murinos (por exemplo, expressão de NRP1 estende-se por áreas adjacentes à coloração positiva de Iectina no modelo Fo5).

Em conclusão, os experimentos descritos no presente demonstram que o bloqueio da função NRP1 e VEGF nos modelos de tumor resulta em um efeito aditivo na redução de crescimento do tumor. Estão também apresentadas as evidências de que NRP1 pode também estar agindo por meio de mecanismos, exceto sinalização VEGFR2. Listagem De Seqüência

<110> GENENTECH, INC.

<120> ANTAGONISTAS DA NEUROPILINA

<130> P2291R1 PCT

<140> PCT/US2006/043516 <141> 11-08-2006

<150> US 60/734,798 <151> 08-11-2005

<150> US 60/820,561 <151> 27-07-2006

<160> 134

<210> 1 <211> 108 <212> PRT

<213> Seqüência ArtiticiaI <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 1

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Lys Ala Pro Lys 45

Gly Val Pro Ser 60

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Thr Lys Val Glu 105

Ile Lys Arg

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

15 10

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

20 25

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

35 40

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

50 55

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

65 70

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

80 85

Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly

95 100

<210> 2 <211> 120 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

20 25 30

Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr

95 100 105

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Tnr Leu vai Thi Val Ser Scr

110 115 120

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Tyr Met Ser Val Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg <210> 4 <211> 119 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

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Gly Ser Leu Arg Leu

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35

Glu Trp Val Ser Ser

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80

Thr Ala Val Tyr Tyr

95

Met Asp Val Trp Gly 110

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<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

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50 55 60

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

10 15

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25 30

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40 45

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55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Tnr Ser

70 75

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85 90

Cys Ala Arg Trp Gly Lys Lys Val Tyr Gly 100 105

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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Tyr Leu Gly Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Phc Thr FhG Ssr

20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Ser Gln Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

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95 100 105

Ser Lys Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120

Ser Ser

<210> 7 <211> 6 <212> PRT

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<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 7 Tyr Met Ser Val Pro Ile <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

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<400> 8 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu

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<223> Seqüência é Sintetizada

<4 00> 9 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu

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<223> Seqüência é Sintetizada

<4 00> 10 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

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5

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 12 Arg Tyr Ser Val Pro Ile

5

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<4 00> 13 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 14 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu

5

<210> 15 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 15 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu

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<210> 16 <211> 6 <212> PRT

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<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 16 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu

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<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 17 Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu

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<223> Seqüência é Sintetizada

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<223> Seqüência é Sintetizada

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Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

5

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<223> Seqüência é Sintetizada <400> 20

Tyr Ser Phe Ser Ser His Met Met

5

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<223> Seqüência é Sintetizada <400> 21

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT

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<223> Seqüência é Sintetizada <400> 22 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

5

<210> 23 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

^4nn> 23 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gln Leu

5

<210> 24 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 24

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

5

<210> 25 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 25 Phe Thr Phe Ser Gln Tyr Ser Ile

5

<210> 26 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 26 Phe Thr Phe Thr Ser Arg Thr Met

5

<210> 27 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Arificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 27 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

5

<210> 28 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência è Sintetxzada

<400> 28 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

5

<210> 29 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 29

Ser Ile Thr Gly Lys Asn Gly Tyr Tyr

5

<210> 30 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 30

Ser Ile Ala Gly Ser Gly Gly Tyr Tyr

5

<210> 31 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 31

Ser Ile Tyr Pro Pro Gly Gly Tyr Tyr

5

<210> 32 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 32

Thr Ile Ile Pro His Gly Gly Tyr Tyr

5

<210> 33 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

~<223> Seqüência é Sinire Li z.cida <400> 33

Trp Ile Ser Pro Leu Asn Gly Tyr Tyr

5

<210> 34 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 34

Ser Ile Phe Ser Gly Gly Tyr Tyr

5

<210> 35 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 35

Ser Ile Ser Arg Gly Asp Gly Tyr Tyr

5

<210> 36 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 36

Thr Ile Tyr Pro Phe Gly Gly Tyr Tyr

5

<210> 37 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 37 Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr

5

<210> 38 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22Q>

<223> Seqüêncxa é sintetizada <400> 38

Ser Ile Tyr Ser Thr Gly Gly Tyr Tyr

5

<210> 39 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 39

Gln Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Asn

5

<210> 40 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência ê Sintetizada <400> 40

Trp Gly Lys Lys Val Tyr Gly Met Asp Val

5 10

<210> 41 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 41

Trp Gly Gly Ser Asn Gly Ser Gly Phe Asp Tyr

5 10

<210> 42 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 42

Trp Gly Ser Arg Ser Pro Gly Met Asp Val

5 10

<210> 43 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência ê sintetizada <400> 43

Trp Ala Lys Arg Ser Tyr Gly Met Asp Val

5 10

<210> 44 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 44

Trp Gly Arg Arg Tyr Ile Gly Met Asp Val

5 10

<210> 45 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 45 Tyr Gly Asn His Val Met Asp Val

5

<210> 46 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 46 Trp Ala Gly Gly Ser Ala Met

5

<210> 47 <211> 14 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 47 Phe Gly Gln Ser Tyr Tyr Gly

5

<210> 48 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sinueti^adci

<400> 48 Trp Glu Ser Tyr Tyr Gly Met

5

<210> 49 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 49 Trp Gly Tyr Pro Gly Met Asp

5

<210> 50 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 50 Glu Leu Pro Tyr Tyr Arg Met

5

<210> 51 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

Asp Val

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Val 10

Asp Val

Val

Ser Lys Val Met Asp Val 10

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 51

Ser Ile Ser Ser Tyr

5

<210> 52 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 52 Tyr Ile Ser Ser Tyr

5

<210> 53 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 53 Tyr Ile Ser Ser Tyr

5

<210> 54 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 54 Tyr Ile Ser Ser Tyr

5

<210> 55 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 55 Tyr Ile Ser Ser Tyr

5

<210> 56 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 56 Tyr Ile Ser Ser Tyr

5

<210> 57 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 57 Tyr Ile Ser Ser Tyr

5

<210> 58 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22G>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 58 Arg Ile Ser Ser Tyr

5

<210> 59 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 59 Tyr Ile Ser Ser Tyr

5

<210> 60 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 60 Trp Ile His Ser Tyr

5

<210> 61 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 61 Arg Ile His Ser Tyr 5

<210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Seqüência é Sintetizada <400> 62

Tyr Ile His Ser Tyr 5

<210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Seqüência é Sintetizada

<400> 63

Pro Leu His Ser Tyr 5

<210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Seqüência é Sintetizada

<400> 64

Tyr Leu Ser Ser Tyr 5

<210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Seqüência é Sintetizada

<400> 65

Tyr Leu Ser Ser Tyr 5

<210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Seqüência é Sintetizada <400> 66

Tyr Phe Ser Ser Tyr

5

<210> 67 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 67 Tyr Phe Ser Ser Tyr

5

<210> 68 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 68 Tyr Phe Ser Ser Tyr

5

<210> 69 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 69 Leu Thr His Ser Tyr

5

<210> 70 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 70 Arg Thr His Ser Tyr

5

<210> 71 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 71 Tyr Thr His Ser Tyr

5

<210> 72 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 72 Tyr Thr His Ser Tyr

5

<210> 73 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 73 Trp Thr His Ser Tyr

5

<210> 74 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 74 Trp Val His Ser Tyr

5

<210> 75 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 75 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 76 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 76

Gly Ala Ser Arg Arg Ala

5

<210> 77 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 77 Gly Ala Ser Arg Arg Glu

5

<210> 78 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

o o rw

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 78 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 79 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 79 Gly Ala Ser Arg Arg Ala

5

<210> 80 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 80 Gly Ala Ser Ser Arg Glu

5

<210> 81 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 81 Gly Ala Ser Ser Gly Glu

5

<210> 82 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 82 Gly Ala Ser Arg Arg Glu

5

<210> 83 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 83 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 84 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 84 Gly Ala Ser Ser Ser Ala

5

<210> 85 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 85 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 86 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 86

Gly Ala Ser Arg Arg Ala

5

<210> 87 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 87 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 88 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 88 Gly Ala Ser Ser Ser Glu

5

<210> 89 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 89 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 90 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 90 Gly Ala Ser Thr His Glu

5

<210> 91 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 91

Gly Ala Ser Thr Leu Ala

5

<210> 92 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 92 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 93 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 93 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 94 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 94 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 95 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 95 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 96 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 96 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 97 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 97 Gly Ala Ser Arg Leu Glu

5

<210> 98 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 98 Gly Ala Ser Ser Arg Ala

5

<210> 99 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 99 Tyr Ser Ser Pro Leu

5

<210> 100 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 100 Ile Gly Ser Pro Ile 5

<210> 101 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 101 Leu Asn Ser Pro Leu

5

<210> 102 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 102 Ile Val Ser Pro Leu

5

<210> 103 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 103 Leu Arg Ser Pro His

5

<210> 104 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 104 Leu Ser Ser Pro Ile

5

<210> 105 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 105 Ile Ile Ser Pro Ile

5

<210> 106 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 106

Lys Leu Ser Pro Leu

5

<210> 107 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 107 Lys Ser Ser Pro Arg

5

<210> 108 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

✓ Av

4L* á. W ^

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 108 Tyr Ser Ser Pro Leu

5

<210> 109 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 109 Tyr Ile Ser Pro Leu

5

<210> 110 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 110 Tyr Gly Thr Pro His

5

<210> 111 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 111 Tyr Arg Ser Pro Leu

5

<210> 112 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 112 Ile Ser Val Pro Leu

5

<210> 113 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 113 Leu Arg Ser Pro Ile

5

<210> 114 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 114 Ile Arg Ser Pro Leu

5

<210> 115 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 115 Ile Arg Ser Pro Leu

5

<210> 116 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 116 Leu Gly Ser Pro Pro 5

<210> 117 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 117 Tyr Ser Ser Pro Leu 5

<210> 118 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial ^220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 118 Tyr Gly Ser Pro His

5

<210> 119 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 119 Tyr Ser Ser Pro Ile

5

<210> 120 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 120 Tyr Ser Ser Pro Val

5

<210> 121 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência Sintetizada <400> 121 Phe Ile Ser Pro His

5

<210> 122 <211> 5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 122 Tyr Gly Thr Pro Ile

5

<210> 123 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 123

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala

5 10

<210> 124 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 124 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser

5

<210> 125 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 125 Gln Gln Tyr Met Ser Val Pro Ile Thr

5

<210> 126 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 126

Gly Phe Ser Phe Ser Ser Glu Pro Ile Ser

5 10

<210> 127 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 127

Ser Ser Ile Thr Gly Lys Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 128 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 128

Trp Gly Lys Lys Val Tyr Gly Met Asp Val

5 10

<210> 129 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <400> 129

Arg Ala Ser Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr Leu Ala

5 10

<210> 130 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 130 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser

5

<210> 131 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 131 Gln Gln Tyr Leu Gly Ser Pro Pro Thr

5

<210> 132 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <4 00> 132

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

5 10

<210> 133 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada <4 00> 133

Ser Gln Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser 15 10 15

Val Lys Gly

<210> 134 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<400> 134

Glu Leu Pro Tyr Tyr Arg Met Ser Lys Val Met Asp Val

5 10

Claims (30)

1. ANTICORPO ANTI-NEUROPILINA-1 (NRP1), caracterizado pelo fato de que são capazes de inibir pelo menos uma atividade biológica mediada por neuropilina (NRP).

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é capaz de inibir a interação de NRP1 com semaforina.

3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é capaz de inibir a interação de NRP1 com fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).

4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga a NRP1 no domínio a1a2 e bloqueia ligação de NRP1 à semaforina, sem bloquear a ligação de NRP1 ao VEGF.

5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é capaz de inibir angiogênese mediada por NRP1.

6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as seguintes seqüências de aminoácidos da Região Determinante de Complementaridade (CDR): CDRL1 (RASQSISSYLA; SEQ ID NO: 123), CDRL2 (GASSRAS; SEQ ID NO: 124) e CDRL3 (QQYMSVPIT; SEQ ID NO: 125).

7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:3.

8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende as seguintes seqüências de aminoácidos de CDR: CDRH1 (GFSFSSEPIS; SEQ ID NO. 126), CDRH2 (SSITGKNGYTYYADSVKG; SEQ ID NO:127) e CDRH3 (WGKKVYGMDV; SEQ ID ΝΟ:128).

9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:4.

10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é o anticorpo YW64.3 que compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:3 e uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:4.

11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga ao NRP1 no domínio b1b2 e bloqueia ligação de NRP1 ao VEGF, sem bloquear a ligação de NRP1 à semaforina.

12. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende as seguintes seqüências de aminoácidos de CDR: CDRL1 (RASQYFSSYLA; SEQ ID NO: 129), CDRL2 (GASSRAS; SEQ ID N0:130) e CDRL3 (QQYLGSPPT; SEQ ID NO:131).

13. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:5.

14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende as seguintes seqüências de aminoácidos de CDR: CDRH1 (GFTFSSYAMS; SEQ ID NO:132), CDRH2 (SQISPAGGYTNYADSVKG; SEQ ID NO: 133) e CDRH3 (ELPYYRMSKVMDV; SEQ ID NO: 134).

15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:6.

16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é o anticorpo YW107.4.87 que compreende uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:5 e uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:6.

17. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de se ligar tanto ao NRP1 murino como NRP1 humano.

18. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

19. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

20. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo sintético.

21. USO DO ANTICORPO ANTI-NRP1, conforme descrito na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma disfunção associada com a angiogênese patológica.

22. USO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a disfunção é um câncer.

23. USO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste de câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão de célula não pequena, Iinfoma não-Hodgkins (NHL), câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer ovariano, mesotelioma, e mieloma múltiplo.

24. USO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o tratamento também compreende um segundo agente terapêutico.

25. USO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um agente selecionado do grupo que consiste de um agente antiangiogênico, uma composição antineoplásica, um agente quimioterápico e um agente citotóxico.

26. USO1 de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o agente antiangiogênico é um antagonista de VEGF.

27. USO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o antagonista de VEGF é um anticorpo anti-hVEGF.

28. USO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hVEGF é capaz de se ligar ao mesmo epítopo VEGF da mesma forma que o anticorpo A4.6.1.

29. USO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-hVEGF é bevacizumab ou ranibizumab.

30. USO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um inibidor do receptor tirosina quinase selecionado do grupo que consiste de vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC- 412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®), XL880, e CHIR-265.